PT94761B - Processo para a preparacao de muteinas da eritropoetina humana e de composicoes farmaceuticas que as contem - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO < DA PATENTE DE INVENÇÃO N.° 94 761 REQUERENTE: BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, alemã com sede em D-3550 Marburg, Alemanha Ocidental. EPÍGRAFE: "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE MUTEÍNAS DA ERI-TROPOETINA HUMANA E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE AS CONTÊM" INVENTORES: Dr. Mathias Fibi, Dr. Gerd Zettlmeissl e Dr. Hans Kíipper.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883. República Federal Alemã em 20 de Julho de 1989, sob o n3.P 39 23 963-2. INPI. MOD. 113 R F 16732 “r^rawíK·.·,.,^

Descrição referente à patente de invenção de BEHRINGWERKE AKTIEN-GESELLSCHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D-3550 Marburg, Alemanha Ocidental, (inventores: Dr. Mathias Fibi, Dr. Gerd Zettlmeissl e Dr. Hans Kupper, residentes na Alemanha Ocidental), para "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE MPTEÍNAS DA ERI-TROPOETINA HUMANA E DE COMPOSI-COES FARMACÊUTICAS QUE AS CON-TÕ4".

Descrição O presente pedido de patente refere-se a muteínas da eritropoietina humana (EPO), que se preparam com o auxílio de técnicas recombinantes de ADN e que possuem propriedades vantajosas em relação a eritropoetina humana do tipo natural. A eritropoietina humana madura é uma glicoproteína com o peso molecular de 34 - 38 kD. A proteína madura consiste em cento e sessenta e seis aminoácidos (AS) e a parte dos radicais gllcosito do peso molecular corresponde a cerca de 402 (Jacobs e col. (1985), Nature 313, 806 - 809 í Dordal e col. (1985), Endocrinology 116, 2293 - 2299). A função biológica de EPO consiste em garantir a preparação de eritrócitos. A EPO estimula os processos não só de diferenciação, mas também de subdivisão de células precursoras eritróldes. 0 gene para a eritropoietina humana pode ser Isolado de um banco de genes de fígado de fetos e caracterizado e, des- E.I, 1

de 1985f existem à disposição para a realização de ensaios de tecnologia genética (Jacobs e col., a.a.O·). A eritropoietina pode ser expressa em células animais com o auxílio de técnicas recombinantes de ADH e possibilita, entre outras, a terapia da anemia renal. As primeiras experiências terapêuticas com EPO do tipo natural mostraram que a quota de êxito nos pacientes tratados é na realidade alta mas mostraram também que se atingiram pressOes sanguíneas e viscosidades do sangue com valores parci-almente limitativos. Assim, verificou-se o aumento do hemató-crito, da hemoglobina e do número de células precursoras (formação explosiva de células evitréides unitárias BFU-E) muito drástico em muitos pacientes em que era desejado, verificando--se um aumento, mais moderado. Em outros pacientes, o aumento foi demasiado pequeno e foi desejável atingir um aumento mais nítido dos valores dos teores no sangue. Uma elevação não fisiológica da dose em pequeno número de pacientes é contra-indica-da por causa das reacçOes imunes que podem provocar. As terapias durante longos períodos de tempo sSo portanto difíceis ou devem na realidade ser evitadas.

As diferentes reacçOes dos pacientes devem-se com elevada'probabilidade às respectivas capacidades individuais de regular a presença de EPO. A EPO tem, portanto, em diferentes pacientes individuais, diferentes resultados na terapia.

Na actividade da interacção da hormona com o organismo, tem uma especial importância, conjuntamente com a estrutura da parte de proteína, também a estrutura das unidades de açúcar presentes na molécula. Por exemplo, a EPO des-sializada não a-presenta qualquer actividade depois da aplicação em animais. No entanto, ela liga-se ainda ao receptor e estimula a formação de células percursoras. A perda de actividade ”in vivo" de assialo-EPO pode j esclarecer-se pelo facto de esta ser acessível por intermédio de receptores com especificidade para os radicais de galactosi-lo que são acessíveis em EPO des-sializada que se elimina no fígado. A própria EPO completamente desglicosllada apresenta "in vltro" ainda actividade de ligação com as células pretendi- - 2 -

" das mas separam-se "in vivo" mais rapidamente nos rins através de um mecanismo ainda conhecido.

Os sítios de ligação de EPO com o receptor não são portanto alterados por glicosilação. A actividade diminuída í "in vivo" significa no entanto que a glicosilação e a sialila-ção completa no transporte pelo sangue são de grande importân- i; j cia para a estabilidade e para a velocidade de eliminação do ! sistema. j A EPO de tipo natural até agora empregada para fins terapêuticos produz em muitos pacientes um aumento de pressão do sangue, o que constitui um inconveniente na terapia. Pode a-dmitir-se que a EPO está ligada com a regulação da pressão sanguínea. Portanto, é desejável ter à disposição proteínas com actividade fisiológica da EPO que não possuem essas propriedades negativas mas que estimulem como esta a diferenciação e a taxa de distribuição de células precursoras de eritrócitos.

Uma outra acção secundária de EPO, que se verifica em alguns pacientes, é a estimulação dos megacariócitos para a formação de trombócitos. Nesse caso, portanto, existe o perigo de tromboses durante a terapia com EPO e a terapia tem muitas | vezes de ser abandonada. Desejavelmente, é conveniente conseguir uma maior especificidade da eritropoetina empregada. A invenção tem como objectivo proporcionar muteínas j :| da EPO. Estas muteínas devem possuir uma elevada ou uma atenuada actividade biológica ( = estimulação da formação de eritrócitos) para possibilitar o tratamento individual dos pacientes.

As acçCes secundárias indesejáveis, como, por exemplo, o aumento da pressão do sangue, não devem ter lugar ou apenas em proporção reduzida. A requerente descobriu que a região da extremidade de carboxilo (amlnoácido 130 até ao aminoácido 166) contém uma posição de ligação no receptor de EPO. As supressCes nesta região originam a diminuição ou mesmo a perda da actividade biológica, as inserçOes de aminoácldos carregados positivamente originam o • aumento da actividade biológica ( = estimulação da formação de - 3 -

" Ή, £> eritrócitos a partir de células precursoras). A Requerente descobriu ainda que, na região dos aminoácidos 130 a 160 (maia exactamente, na zona dos aminoácidos 142 a 149), existe uma ho-mologia com a angiotensina II. As alterações desta região influenciam a actlvldade do aumento da pressão sanguínea da EPO.

Adicionalmente, a Requerente descobriu que a diminuição da glicosilação origina uma maior estimulação da formação ! de eritrócitos. ij A presente invenção refere-se, por consequência, às seguintes muteínas de EPO humanat 1) muteínas da eritropoietina humana caracterizadas pelo facto de, em comparação com a eritropoietina de tipo natural, possuírem pelo menos uma supressão de aminoácidos e/ou uma inserção de aminoácidos ou uma troca nos grupos dos aminoácidos 10 - 55, 70 - 85 e 130 - 166 e/ou a substituição de pelo menos um dos grupos Asn N-gllcosados por um aminoácido não glicosilável e/ou a substituição de Ser126 por Thr ou Gly, de modo que possuem uma ou mais propriedades alteradas em | relação à EPO de tipo natural, nomeadamente, a) estimulação de células precursoras de eritróides, b) valores dos tempos de semi-transformação in vivo, c) elevação da pressão do sangue, d) estimulação de megacariócitos e de outras células precursoras da linha não eritróide, e) actividades secundárias, por exemplo, aparecimento de dores de cabeça; e f) ligação ao receptor de EPO. i 2) São especialmente incluídas as muteínas que possuem uma inserção na zona da extremidade de carboxilo dos aminoácidos 130 a 166. São ainda preferidas as muteínas que têm Arg^g substituída por Oly^gg ou um ou mais aminoácidos adicionais na extremidade de carboxilo colocadas na posição 166, de - 4 -

preferência, aminoácidos básicos. 3) São ainda especialmente preferidas as muteínas que têm pelo j menos uma troca de aminoácidos na região dos aminoácidos ! 130 a 166j 4) SSo ainda preferidas as muteínas indicadas em 1), com troca | de serina na posiç&o 126 por treonina ou glicina e com a troca de pelo menos uma posição de asparagina glicosilada por glutamina, com excepção de Asn38.

Como já se disse, a presente invenção refere-se também a muteínas de EPO que possuem várias ou todas as mutaçGes j anteriormente mencionadas simultaneamente.

Finalmente, a invenção refere-se a composiçGes farmacêuticas que contêm pelo menos uma das muteínas anteriormente referidas, assim como a sua utilização na terapia que tem como finalidade o aumento ou a diminuição do número e da qualidade I dos eritrócitos, especialmente no tratamento de anemias renais. A invenção é por fim descrita nos Exemplos e reivindicada nas Reivindicações da patente. EXEMPLOS | I. Preparação de Mutantes de EPO (Métodos Gerais)

1) Síntese de oligonucleútidos específicos de EPO

Prepararam-se oligonucleótidos de mutagénese e primários de sequenciamento de acordo com o método do triéster de fosfato (Letsinger, (1975), J. Amer. Chem. Coc., 97, 3278 e dto. (1976), J. Amer. Chem. Soc. 98, 3655). Na Tabela 2, indicam-se exemplos dos nucleótidos de mutagénese utilizados. 2) Clonagem do cADN de EPO no sistema vector de mutagénese A partir do vector pEPO 782 MT BPV (pCES, EP-A-267 | 678), isolou-se o fragmento EcoRI-BamHI com 102*1 pares de bases 5

que contem a sequencia que codifica EPO e na posição 3' a par-: tir dele um fragmento SV40 ADR com o sinal de poli-adenilação 1 do último antigene mais importante SV40 (Figura 1).

Conseguiu-se efectuar o isolamento do fragmento separando o plasmídio com a endonuclease de restrição EcoRI e pre-! encheram-se as extremidades pendentes com o auxílio do fragmen-I to de Klenow da ADN-polimerase I, de modo que se obteve uma extremidade embotada. 0 plasmídio assim tratado foi seguidamente cortado com a enzima de restrição BamHI e o fragmento de ADN acima descrito pôde ser isolado por eluição a partir de gel de agarose (Maniatis e col. (1982), Molecular Cloning - A Labora-tory Manual, Cold Spring Harbor, Nova Iorque). 0 fragmento foi em seguida clonado controladamente no poli-ligador do vector de mutagénese pMac 5-8 (Figura 1) com Smal-BamRI. Esta construção do tipo natural de EPO foi designada pMcEl. 3) Mutagénese

Na preparação dos mutantes (Tabela 1), foram inseridos oligonucleótidos sintéticos que continham a mutação (Tabela 2) através de uma assim chamada molécula híbrida de ADN "de dupla folga" no sistema de vector de mutagénese (Morinaga e col., Bio Technology (1984), 7, 636 - 639; Kramer e col., Nucl. Acids Res. 198, 12, 9441 - 9456). Para esse efeito, isolou-se ADN de cadela única do vector de mutagénese pMcEl, que foi transformado na estirpe WK6 de E. coli, de acordo com métodos convencionais. Cortou-se o ADN do plasmídio de pMa 5-8 com EcoRI-BamHI no polillgador e eluíu-se o ADN linearizado (3,8 kb) num gel de agarose (Maniatis e col., referência acima citada).

Para a preparação de um ADN de "folga dupla", aque-ceu-se a 100°C 0,1 picomole do fragmento de cadeia dupla (proveniente de pMa 5-8) (Figura 1) e 0,5 picomole de ADN de cadeia única (pMcEl) (Figura 1) em Tris-HCl 12,5 mM, pH 7,5 ♦ KC1 190 mM (volume final = 40 miorolitros) durante quatro minutos e * em seguida, incubou-se a 65°C durante dez minutos. Para a ani- - 6 -

| bridização do ollgonucleótldo de rautagénese, aqueceram-se δ rai-crolitros da solução de hibrldlzação mencionada com ή - 8 pico-moles (2 microlitros) do ollgonucleétldo fosforilado enzimáti-co, durante cinco minutos a 65°C e, em seguida, arrefeceu-se lentamente até à temperatura ambiente.

Depois de se adicionarem 24 microlitros de HgO» ** ®í-crolitros 10 x tampão de "enchimento" (625 mM de KC1, 275 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 150 mH de MgClg, 20 mM de DTT, 0,5 mM de ATP e 0,25 mM de cada um dos quatro NTP), 1 microlitro de T4-ADN-

I -ligase (5 U/microlitro) e 1 microlitro de fragmento de Klenow da ADN-polimerase I (1 U/microlitro), segulu-se a incubação à temperatura ambiente durante quarenta e cinco minutos. Em seguida, transformaram-se 5 microlitros da mistura em mutante WK6 (mutS215 t Tn10). A mistura global de transformação foi multiplicada numa cultura com saoudimento em meio de LB + 50 microgramas/ml de ampicilina (10 ml) durante a noite, a 37°C. A partir da mistura global, purificou-se o ADH-plasmídio de acordo com os métodos usuais (Maniatis e col., referência acima citada).

Transformaram-se aproximadamente 20 nanogramas do plasmídio purificado em bactérias WK6 e em seguida foram selec-clonadae em placas com LB com 50 microgramas/ml de ampicilina. Analisaram-se vários destes mutantes, primeiramente de maneira grosseira por meio de uma reacção de sequenciamento (específica a C, T, A ou G) relativamente à mutação pretendida. Os clones positivos foram ensaiados por análise de sequencimento detalhada na zona da mutagénese (F. Sanger e col. (1977), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463 - 5467). Os plasmídios que continham as sequências de EPO modificadas foram designados pMaE2, pMaE3... pMaEn (Figura 3).

4) Construção de um vector de expressão para EPO e mutantes de EPO

Preparou-se o vector de expressão pABLl (Figura 2) eliminando, a partir do vector de expressão pAB 3-1 (Zettlmels-sl e col. (1988), Behring Inst. Mitt. 82, 26 - 34), o fragmento - 7 -

i! que codifica antitrombina III, assim como o fragmento com o sí-i tio de poli-adenilaçâo precoce de SV40 por corte com as enzimas de restrição HindII e BamHI e substituíu-se por um poli-ligador com a seguinte sequência 5'ggatccccgggtaccgagctcgaattcatcgatatctagatctcgagctcgcgaaagctt3'

BamHI EcoRI Saci HindIII

Os fragmentos do sistema vector de mutagénese que foram cortados com EcoRI-BamHI antes (Elt EPO do tipo natural) ou depois da mutagénese (E2-En, mutantes de EPO), puderam igualmente ser em seguida clonados no vector de expressão pABLl igualmente nos sítios de corte com EcoRI-BamHI do poliligador. Os plasmídios de expressão de EPO resultantes foram designados pABElt pABE2... pABEn (Figura 2). 5) Transfecção de células de animais e selecção dupla Células BHK21 (de rim de cricetos recém-nascidos) (ATCCCCL10) foram transfectadas com os vectores de expressão pABEl, pABE2... pABEn que codifioam EPO (Figura 2). Para a transfecção, cultivaram-se as células emnmeio de Dulbecco modi-! ficado por Earle" (DMEM), que continha 10$ de soro de feto de vitela. As células com a confluência de 50 - 70% foram transfectadas com o auxílio de um método de fosfato de cálcio modificado (Graham e van der Eb (1973), Virology 52, 456 - 467). 0 vector de expressão foi cotransfectado com o plas-mídio pSV2 dhfr (Lee e col. (1981), Nature (Londres) 294, 228 -- 232), que contém um gene (dhfr) de di-hidrofolato-redutase de rato exprimivel em células animais e com o plasmídio pRMHl40 (Hudiak e col. (1982), Cell 31» 137 - 146), que contém resistência a geneticina exprimível em células animais. 0 sistema permite uma dupla selecção com metotrexato (1 mM) e geneticina (G418, 400 microgramas/ml) e possibilita uma amplificação do AON do plasmídio integrado no genoma celular (Zettlmelssl e col., loc. cit.). fe SSSSSSá* >í .-'V- ?2g^&£&szzx»

6) Comprovaçgo imunológica da presença de EPO e de muteinas de EPO em células que exprimem sobrenadantes de cultura

Preparaçgo de anti-soros contra EPO

Prepararam-se anticorpos contra EPO purificada em coelhos. Para este efeito, ligou-se EPO com o auxílio de dial-deído glutárico ao "limpeto chave” hemocianina (KLH), emulsionou-se com agentes auxiliares e procedeu-se à imunizaçgo utilizando-os sob a forma de produto emulsionado. A obtenção do soro realizou-se de acordo com os métodos usuais.

Ensaios de rádio-imunidade para a determinaçgo de Eritropoieti-na

Este ensaio serve para a determinaçgo comprovativa de EPO recombinante em sobrenadantes de cultura de células ou em amostras de diferentes fases intermédias da purificaçgo da hormona. Baseia-se nas variantes de anticorpos duplos do ensaio de rádio-imunidade competitivo (C. N. Hales, P. J. Randle (1983), Biochem., J. 88, 137).

Incubaram-se durante vinte e quatro horas a 4°c amostras ou material de referência de EPO e de antl-soro de coelho anti-EPO conjuntamente com uma quantidade predeterminada de I e, em seguida, para a separaçgo de EPO ligada ao an ticorpo, com IgG de cabra-anticoelho, durante dezoito horas a 4°C.

Centrifugou-se o precipitado, lavou-se duas vezes com 500 microlitros de tampgo de cada vez e mediu-se no canal gama de um espectrémetro gama automático. O sistema continha soro normal de coelho reunido para o reforço do precipitado. A ava-liaçgo realizou-se por comparaçgo com uma série de diluiçOes do material de referência por meio de curvas de calibraçgo em que se representa graficamente a ligaçgo percentual da radioactivi-dade em funçgo do logaritmo decimal da concentraçgo do material de referência.

Obteve-se a 12^I EPO a partir de EPO purificada por - 9 -

| marcação com lodo radioactlvo de acordo com o método de duas I fases de cloramina T (F. Tejedor, J· P. G. Ballesta (1982), Anal. Biochem. 127, 143 - 149) e eliminou-se o iodeto não inserido por cromatografia em gel. Diluíu-se previamente o anti-so-ro EPO na proporção de 1 t 3300 e a IgG anti-coelho cento e cinquenta vezes. Como material de referência, serviu um padrflo laboratorial de EPO humana recombinante, cujo teor de proteína foi determinado de acordo com o método de BCA (P. K. Smith (1985), Anal. Biochem. 150, 76 - 85). A utilização do anti-soro contra a molécula global de EPO garantiu também a demonstração da existência das muteínas de EPO.

Ensaio de imunidade com enzimas para identificação de clones de células que produzem EPO

Para a realização de ensaios rápidos (não é necessária qualquer diluição) das linhas de células que produzem EPO, desenvolveu-se um sistema de ensaio ELISA-ponto-mancha. Aspiraram-se para nitrocelulose 200 microlitros de sobrenadante de cultura. Os filtros foram saturados durante trinta minutos a 37°C com 0,5$ de BSA em PBS com o pH igual a 7,0 e, em seguida, incubaram-se durante a noite com anti-soro de coelho anti-EPO diluído 1 t 1000. Depois de se lavar com PBS contendo 0,05% de Tween, realizou-se a incubação durante duas horas com anti-soro de Ig de cabra-anticoelho que está acoplado com fosfatase alcalina. Depois de se lavar com 0,05$ de Tween em PBS, pH 7,0 e 0,2 M de Tris-HCl de pH 9,5, assim como 1 M de Tris-HCl, pH 9,5 adicionam-se os substratos azul de cloreto de 4-nitrotetrazólio hidratado e sal de p-toluidina de 5-bromo-4-cloro-hidroxilfos-fato. Depois de vinte minutos, interrompe-se a reacçâo por adição de água. 0 ensaio é apropriado para a detecçâo de quantidades de EPO maiores do que 100 ng de EPO/ml. Como material de referência, serve EPO recombinante purificada proveniente de células C127 (EP-A-267 678).

7) Demonstração da presença da actlvldade biológica de EPO e de muteinas de EPO em sobrenadantes de cultura transfectadas e de células que segregam estavelmente

Blo-ensalo win vivo"

Ratos da estirpe NMRI da criação de animais da Beh-ringwerke AG (Marburgo, República Federal da Alemanha) foram distribuídos por grupos aleatoriamente e foram lnjectados in-traperitonealmente com duas injeeçCes por dia durante cinco dias seguidos com doses diversas de EPO ou de muteinas de EPO. Animais de controlo foram tratados com PBS, meio de cultura das células ou sobrenadantes de cultura de células obtido com células de BHK. Como material de referência, serviu EPO recombinan-te purificada proveniente de células C127 (EP-A-267 678).

Realizaram-se ensaios hematológicos em vários momentos entre o dia 0 e o dia 22 depois da injecção da primeira dose de EPO. Eles referiram-se à determinação do hematócrito, do teor de hemoglobina e do número de reticulócitos existentes em sangue periférico.

Bio-ensaio "in vitro"

Ratos do sexo feminino da estirpe NMHI foram injecta-dos em dois dias consecutivos com hipoclorito de fenil-hidrazi-na (60 mg/ml). Quarenta e oito horas depois da última injecção, retiraram-se os baços e preparou-se uma suspensão de células individuais. A partir desta enriqueceram-se as células precursoras eritróides através de um gradiente de Ficoll (D * 1,077). Reuniu-se a interfase do gradiente, lavou-se por duas vezes com 20 ml de PBS, ressuspendeu-se em DMEM e contaram-se as células. Diluíram-se amostras de EPO e de muteína de EPO e adicionaram--se 20 microlitros de cada diluição com 80 microlitros de suspensão de células de baço numa placa de microtitulação (3 x 10^ células por reentrância). Depois de vinte e duas horas de incubação em atmosfera húmida e com 5% de CO2, adicionou-se a cada • reentrância 1 jzCl de metil-^H-timidina em 20 microlitros de 11 .1 Λ'· .1 Λ'· asas 1 a ·**

DMEM. Marcaram-se as células durante três horas e mediu-se a inserção de com um contador de cintilação de líquidos TRI--CARB 6660 (Krystal e col., J. Exp. Hematol. 11, 649). Os materiais de referência foram PBS, meio e EPO recombinante purificada proveniente de células C127 (EP-A-267 678).

I

I 8) Isolamento de olones de células que produzem EPO e muteínas de EPO de clones mistos de células BHK transfectadas

Clones mistos de BHK, que foram obtidos a partir de uma piscina de 80 - 100 clones individuais depois de transfec-ç3o e de selecção dupla, foram ensaiados por ensaio de imunidade e de bio-ensaio relativamente â segregação de EPO ou de muteínas de EPO.

Os clones mistos positivos produziram 100 nanogramas a 1 micrograma de EPO ou de muteína de EPO. Depois da clonagem por um processo de diluição-limite, puderam obter-se clones de células individuais que produziram entre 1 e 10 microgramas de EPO ou de muteína de EPO.

Os clones mistos, que produziram menos EPO ou muteína de EPO, puderam ser levados à produção de EPO comparável mediante selecção de amplificação com metotrexato. A actividade biológica In vitro (calibração por meio de RIA ou ELISA) é comparável a partir destas preparaçCes não purificadas com a actividade das fracçdes de EPO purificadas (100 U/micrograma - 200 U/micrograma). As muteínas apresentam in vivo uma actividade biológica diferente em comparação com rhuEPO-WT (Figuras 3 e 4.

Para se produzirem maiores quantidades de sobrenadan-te de células de cultura, expandiram-se os clones individuais até poderem ser cultivados em frascos orbitais. 0 desenvolvimento das células realizou-se em meio que contém soro (DMEM) até â confluência. Em seguida, foram mudadas para meio isento de soro (DMEM). Os sobrenadantes de cultura foram recolhidos depois de três dias de cultura em meio isento de soro. Os clones de células mistas que produziram menos EPO ou muteína de EPO puderam ser levados a uma produção de EPO comparável mediante selecção de amplificação com metotrexato. 12

II. Muteínas especiais (para as designaçCes, veja-se a Tabela 1) 1. Muteína EPO 3

Com a finalidade de se obter muteína de eritropoeíti-na que é apenas ligeiramente alterada e, por consequência, possui propriedades biológicas muito parecidas com as de EPO de tipo natural, permutou-se a arginina 166 da extremidade de car-boxi por glicina.

Numa análise de estrutura subsequente, pôde verificar-se que a arginina 166 mesmo assim falta em EPO recombinante bem assim como em EPO do tipo natural que se isolou a partir de urina de modo que, na realidade, a EPO fisiologicamente activa é uma des-Arg-166 EPO (Μ. A. Recny e col. (1987), J. Biol. Che. 262, (35), 17156 -17163). A muteína EPO 3 possui o mesmo comportamento em gel de SDS-poliacrilamida (gel de SDS-PA) que EPO de tipo natural (3¾ - 38 KD) e no bio-ensaio in vivo possui propriedades funcionais que nôo sSo diferentes das da molécula do tipo natural (Figuras 3 e 4). Todos os clones mistos produziram a muteína e foi possível isolar um clone único que produziu 7,5 microgra-mas/ml/10^ células/vinte e quatro horas. As velocidades de expressão dos diferentes clones de células eram essencialmente maiores em comparação com os clones de células que produzem EPO de tipo natural. 2. Muteína EPO 7

Eliminou-se o sítio de N-glicosilação em Asn 24 por troca com Gin 24. A mutante demonstrou, no ensaio em gel de SDS-PA, o mesmo comportamento que a EPO de tipo natural entre 34 e 38 KD. 0 ensaio biológico in vivo demonstra um aumento de estimulação do desenvolvimento de reticulócitos (Figuras 3 e 4). Todos os clones mistos EPO 7 produziram muteína e puderam ser Isolados clones individuais que produziram até 3,1 micrograma/ ml/10^ células/vinte e quatro horas.

HCMKI II 0r

Muteína EPO 10 A EPO possui também um sítio de O-glicosilação no aminoácido Ser 126. Quando se substitui a Ser 126 por Thr 126, no ensaio com gel de SDS-PA, aparecem várias bandas que possuem i

todas um peso molecular menos (30 KDa até 25 KDa) do que a EPO I A ^ autentica. Isto pode para um modelo de glicosilação heteroge-neo. Não obstante a treonina poder ser igualmente 0-glicosila-! da; este exemplo mostra, no entanto, outra eritropoietina autêntica 0-glicosilada diferente da serina. A estimulação in vivo do crescimento dos reticulóci-tos, assim como o aumento de hematócritos e do teor de hemoglobina sSo aumentados nos exemplos antes referidos (Figuras 3 e *0. No estudo cinético mostra-se, no entanto, como o reservatório de reticulócitos I despejado mais rapidamente do que por meio de EPO ou as outras muteínas. Os clones mistos transfec-tantes produziram muteína EPO 10 e foi possível isolarem-se clones individuais que se seccionaram até 2,8 microgramas/ml/ 10 células/vinte e quatro horas para o meio. 4. Muteínas EPO 44a, 44b e 45 A EPO possui, na zona dos aminoácidos 142 a 149, uma i homologia com a angiotensina II. A angiotensina forma-se no organismo através do sistema de renina-angiotensina e provoca uma

I vasoconstricçSo que origina o aumento da pressão do sangue. Por troca dos aminoácidos desta região, preparam-se muteínas que não provocam aumento da pressão sanguínea e, portanto, podem ser também empregadas em pacientes com hipertonia. Além disso, desaparecem também as secçCes secundárias provocadas pelo aumento da pressão do sangue, tais como dores de cabeça. 5. Muteínas 2b, 2c, 2dl, 2d2, 2e, 2f, 4a, 4b, 5a, 5b, 6a e 6b

As adiçOes de aminoácidos básicos ca região terminal de carboxilo aumentam a actividade biológica de EPO (aumento da formação de reticulócitos in vivo; aumento do esvaziamento do . reservatório de reticulócitos). As supressOes originam a acti-* vidade diminuída de EPO. - 14 -

Tabela 1 1 EPO 1 Arg 166 (tipo) terminal 2 EPO 2a Supressão da extremida- 1 amino -, Asp 165 de de C ácido 3 EPO 2b « tt 2 " , Gly 164 4 EPO 2c tt tt 3 η , THr 163 5 EPO 2dl tt tt ή n , Arg 162 6 EPO 2d2 m n 1) tt , Arg 162 + Ala 163 7 EPO 2e tt ff ç fi , Cys 161 8 EPO 2f tt tt 6 " f Ala 160 9 EPO 3 ] Permuta na extremidade de C Arg 166- Gly 166 10 EPO 4a : Inserção na extremidade Arg 166 + Arg 167 11 EPO 4b n de < " n n + Arg 167 + Ala 168 12 EPO 5a n tt tt + Arg+Lys+Arg 169 13 EPO 5b n ff ff + Arg+Lys+Arg+Ala 170 14 EPO 6a w ff ff + poly Lys 167-176 15 EPO 6b η tt tt + poly Lys 167-176·»- Ala 177 16 EPO 7 Glicosilaçáo Asn 24 - Gin 24 17 EPO 9 n Asn 83 - Gin 83 18 EPO 10a tt Ser 126 - Thr 126 19 EPO 10b n Ser 126 - Gly 126 20 EPO 42a Permuta Tyr 15 - Phe 15 21 EPO 42b n Tyr 15 - Ala 15 22 EPO 43a w Tyr 49 - Phe 49 23 EPO 4; b n Tyr 49 - Ala 49 24 EPO 44a n Tyr 145 - Phe 145 25 EPO 44b It Tyr 145 - Ala 145 26 EPO 45 tt Arg 143 - Ala 143 27 EPO 46a n Tyr 156 - Phe 156 28 EPO 46b tt Tyr 156 - Ala 156 29 EPO 47 tt Arg 76/ Gin 78 - Ala 76/ Ala 78 30 EPO 48 t* Arg 76 - Ala 76 31 EPO 49 tt Gin 78 - Ala 78 15 - οη

οη ο - ο οη to t>0 as ο ο οto 60 60<ϋ ο60 Ρ Ο Ο Ρ60 Ρ Ο ο ο ο Ρ60 Ρ ο Ρ ο ο Ρ60 Ρ ο ο ο ο Ρ60 Ρ Ο Ρ Ρ Ρ ο m ο Ρ Ρ οη οη ο Ρ Ρ α3 60 Ρ ο C\J — ο ο 60 ο Ρ οη ο ο 03 Ρ Ρ <0 60 60 Ο Ρ ο rH te ο 60 60 60 ο Ρ Φ m ο 03 0) Ρ Ρ Ρ m Ρ 60 Ο ο Ο Ρ ο 03 ο 60 60 60 Ο ο Ρ ο Η ο 03 Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ ο οη 60 Ο C Ο 60 Ρ ο 60 60 60 ο ο Ρ ο Ρ 60 ο te 03 Ρ Ρ Ρ Ο Ρ Ρ 01 ο οη Ο Ο (0 60 ο Ρ ο ο 60 60 ο Ρ Ρ ο ο Ρ to 60 ο • Ρ Ρ ο Ο 60 Ρ Ρ Ρ 03 ο οη οη ·- Ο 60 ο ο Ρ Ρ ο ο ο 60 οη ο Ρ ο ο 60 ο ο ο 60 to ο ο Ρ Ο 60 ΙΟ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ 03 ο οη ο ο 60 ο Ρ Ρ Ο Ρ Ρ to ο ο 60 60 ο οη Ρ ο 60 60 Ρ ο ο Ρ ο 60 60 ο 60 ο Ο 60 Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ ο Ρ Ρ 03 ο α3 ο ο ο J ο ο Ρ Ρ Ρ ο 60 ο ο 60 ο Ρ ο ο ο Ρ Ρ Ρ ο ο ο Ρ ο 60 60 60 ο ο 60 Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ ο ο Ρ Ρ 03 Ρ ο ο Ρ ο ο Ρ ο Ρ Ρ Ρ ο to ο ο ο 60 Ρ 60 Ρ Ρ Ρ Ρ ο ο 60 ο Ρ ο 60 ο to ο Ο Ρ ο Ρ ο Ρ ο Ρ ο ο Ρ Ρ ο «3 ο Ο ο to ο 60 Ρ 60 ο Ρ ο 60 ο ο ο 60 Ο Ρ to Ρ 60 ο 60 Ρ 60 ο Ρ ο 60 to 60 03 03 03 03 (Ο 03 03 (0 03 03 03 03 03 03 01 Ο ο ο ο Ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ 60 to 60 to 60 to 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 to 60 10 60 60 60 60 60 60 60 60 to 60 60 Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ρ Ο ο Ο ο Ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο Ο ο Ο ο Ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο 03 m ο3 01 <0 03 03 03 03 03 α3 03 01 03 03 Ο ο Ο ο Ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο te te te te te te te te te te ·» te te te ιη ιη ΙΛ ιη ιη ιη ιη ιη ιη ιη ιη ιη ιη ιη ιη rH (Μ 01 03 03 Ρ 03 χ> ο ο Ό φ «-Ι οη λ· ·=Γ ιη ιη νο νο (Μ CVJ (Μ <Μ <Μ osi οιι ο ο ο Ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο ο Pu Pu CU α. α. CU ο. Pu Pu 0* »4 CU PU PU Οι Μ Μ ω Η Μ Μ Μ Η Μ Μ Η W Μ Μ ω - 16 - j jj

no no P CVJ 60 60 60 60 cd 60 60 H 60 60 Φ m <d cd P 60 60 cd - o 60 60 H on o P P 60 o O o bo P P o to as a p cd o o O o to 60 cn on O cd O O 60 o O O o o on on 60 o to 60 o o O o 60 60 P 43 o o -P cd P O O o cd cd o to 60 O 43 43 cd cd 60 60 cd O O o 43 43 P P o O o o 43 43 O o t* to cd o cd cd -P Λ cd <0 «d o as cd cd 60 o o cd 60 cd cd 60 cd 60 60 60 (0 to to P cd cd cd cd cd cd o to 60 to 60 60 60 cd o o 60 60 60 cd cd cd to 43 60 P P <d cd o o 60 -P 60 60 o o 60 to o O cd cd o o to 60 o 60 60 to 43 43 cd cd o 60 60 60 o O o o 60 O O O o o o o in ΙΛ ΙΛ Lf> ir> ITt in ΙΓι cd p cd P cd P t— <r> o o <M tM m nn *" 33- 33" =r 33 O o o o o o o o (X, a· CL. 04 o< 04 04 O· w u to w w ω W w

m nn o o m 60 «o nn m on cd cd o o • o to 60 P P nn cd 60 60 P P 60 o O o o 60 60 43 43 to 60 cd cd o O cd cd 60 o cd <d o o cd o 60 to cd o cd 60 cd o cd o 60 O cd o cd 60 o 60 cd 60 P P 60 O cd cd 60 60 P O 60 60 P P o o 60 60 o o cd 60 43 43 o o 60 O 4> 43 o o cd o a) cd o o P 60 cd cd P P 60 60 cd cd o o cd 60 60 60 o 60 60 cd 60 60 60 60 to o in in in LTl in in

cd P cd £3 33- 33- in in P b- 33- 33- 3T 33“ 33- 33* o o o o O o 04 04 04 04 04 04 w W W W U EPO 48 5'ggoctggcccgccaggac 3'EPO 49 5«cagggccgogccccgcagg 3f 17

Legendas das Figuras 3a - c A actividade das muteínas de EPO foi ensaiada in vivOi Determinaram-se os valores da hemoglobina e de hematócrito e o número de reticulocitos de ratos NMRI, que foram tratados com os sobrenadantes concentrados obtidos'na cultura de células obtidos com muteína de EPO. As determinações realizaram-se no dia 10 depois do tratamento. Como controlos, utilizou-se EPO de tipo natural purificada, proveniente de células de rato C127i (EPO pura).

Hb = hemoglobina; HK = hematócrito; Re = número de reticulóci-tos.

Legenda das Figuras 4a-c e 5a-c

VariaçSo dos valores da hemoglobina e do hematócritp, assim como do número de reticulocitos de ratos NMRI depois de tratamento com EPO e muteínas de EPO. Injectou-se EPO purificada (EPO pura) ou sobrenadantes de cultura concentrados que continham as mesmas quantidades de muteína de EPO no dia 0 a ratos NMRI nSo tratados e determinaram-se os valores da hemoglobina e de hematócrito, assim como o número de reticulocitos. As diversas determinações realizaram-se a partir do dia 5 depois do tratamento até vários intervalos de tempo até ao dia 16.

Hb = hemoglobina; HK = hematócrito; Re = número de reticulóci-tos. 18 -

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES - 1« - ' i Processo para a preparação de uma muteína da eritropoetina humana, que em comparação com a eritropoetina do tipo natural têm pelo menos uma falta de aminoácidos (AS) na região dos aminoácidos 130 - 162 e/ou uma inserção de aminoáci-dos ou uma permuta de aminoácidos (com a excepção da troca de tirosina por fenilalanina) na região dos aminoácidos 130 - 166 do terminal de carboxl e/ou uma permuta de pelo menos um dos grupos Asn N-glicosilado por um aminoácido (AS) não glicosilado e/ou uma substituição de Ser 126 por Thr ou Gly, de maneira que i possui uma ou mais propriedades alteradas em relação â EPO do tipo natural relativamente a a) estimulação de células precursoras eritróides, b) tempo de semi-transformaçâo in vivo, c) aumento da pressão do sangue, d) estimulação de megacariécitos e de outras células precursoras da linha de não eritróides, e) aparecimento de dores de cabeça e f) ligação receptor de EPO, caracterizado por se introduzir num vector de expressão c-ADN que codifica esta muteína e se introduzir este vector numa célula que pode exprimir a correspondente muteína, se multiplicar esta célula e se recuperar a muteína exprimida. - 2« - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se empregar uma célula de origem animal como célula. - 3« - Processo de acordo com a reivindicação 1, ca-.* racterizado por se obter uma muteína que contém inserido um - 19 - aminoácido adicional na extremidade de carboxi. A requerente reivindica a prioridade do pedi do alemSo apresentado em 20 de Julho de 1989, sob o nc P 39 23 963.2. Lisboa, 19 de Julho de 1990. 0 AUEXIL da 1’IiOPSIEDADL LXDUSTHUL

   20 ^ ....... g RESUMO "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE MUTEÍNAS DA ERITROPOETINA HUMANA E DE COMPOSIÇÕES FARMACfiUTICAS QUE AS CONTfiM" A invençSo refere-se a um processo para a preparação de uma muteína da eritropoetina humana que em comparação com a eritropoetina do tipo natural têm pelo menos uma falta de aminoácidos (AS) na região dos aminoácidos 130 - 162 e/ou uma inserçSo de aminoácidos ou uma permuta de aminoácidos (com a excepção da troca de tirosina por fenilalanina) na região dos aminoácidos 130 - 166 do terminal de carboxi e/ou uma permuta de pelo menos um dos grupos Asn N-glicosilado por um aminoácido (AS) não glicosilado e/ou uma substituição de Ser 126 por Thr ou Gly, de maneira que possui uma ou mais propriedades alteradas em relação à EPO do tipo natural relativamente a a) estimulação de células precursoras eritróides, b) tempo de semi-transformação in vivo, c) aumento da pressão do sangue, d) estimulação de megacariócitos e de outras células precursoras da linha de não eritróides, e) aparecimento de dores de cabeça, e f) ligação receptor de EPO, | que compreende introduzir-se num vector de expressão c-ADN que codifica esta muteína e introduzir-se este vector numa célula que pode exprimir a correspondente muteína, multiplicar-se esta célula e recuperar-se a muteína exprimida.