PT94882B

PT94882B - Processo para a preparacao de arginina deiminase e de um agente anti-canceroso contendo esta enzima como ingrediente activo

Info

Publication number: PT94882B
Application number: PT94882A
Authority: PT
Inventors: Haruo Takaku; Kaoru Miyazaki; Miho Aoshima
Original assignee: Japan Energy Corp
Priority date: 1989-08-02
Filing date: 1990-08-01
Publication date: 1997-07-31
Also published as: DK0414007T3; EP0414007B1; FI903826A7; CA2022177C; EP0414007A3; NO903398L; DE69020979T2; CA2022177A1; NO903398D0; ES2078277T3; EP0414007A2; ATE125295T1; PT94882A; DE69020979D1; IE902771A1; FI903826A0; NO178734C; US5474928A; JPH03164173A; IE62120B1

Description

presente invente diz respeite a uma nova arginina dezmxna—-e — a um invento refere-se, processo para a sua preparação. Q presente além disso, a um agente anti-canceroso contendo esta arqinina deiminase como ingrediente activo.

Descrição das técnicas- relacionadas- com o invento

Recentemente tem-se vindo a prestar cada vez mais o cancro usaneo enzimas atenção às novas tentativas para curar com base na necessidade de alimentação Por outras palavras, tenta-se inibir o crescimento das, ou necrotizar as, células cancerosas decompondo o alimento de que as mesmas necessitam e excluindo, -assim, a fonte de alimento ao alcance dessas mesmas células cancerosas. Entre estas enzimas anti—tumorais são conhecidas a L—asparaginase (EC 3,5,1,1) Ever Nature, 229, 168(1971)3 e a arginase (EC 3 = 5,3,1) CBr, J, Câncer, 19, 379(1963)3, No entanto, a L-asparaginase é eficaz apenas para certos tipos de cancro tais como a leucemia e o linfoma maligno visto compreenderem um pequeno número de cancros dependentes da L-asparaginase, enquanto a arginase não revela qualquer actividade anti-cancerosa in vivo, embora demonstre actividades inibidoras em relação a uma grande variedade de células cancerosas in vitro CBr, 3. Câncer, 3®, 5® (1974)3,

Além disso, embora se .tivessem colhido informações de que a arginina deiminase se podia obter do micoplasma e de outros microrganismos CJ, Biol, Chem, r»_t ; a CT / -*·- »·*· s λ t ¹ · s · c t 170/ / ₅ lOiC1 / * C-â. L \ 4 k,’ /4 *y Õ. ;? i-i-ώυ \ i?UQí 5 lGlQa :

25®, 4580-4583 (1975), Arch,

Biochem, Biophys, 69, 186-19/ (195/), etc.3, não se fizeram quaisquer referências quanto à actividade anti-cancerosa desta fc?fÍí£.LÍuâ»

Constitui um objecto do presente invento apresentar uma nova arginina deiminase. Um outro objecto é fornecer um método para produzir esta nova arginina deiminase a partir do micoplasiisa, Além disso, o outro objecto do presente invento é o de fornecer um agente anti-canceroso contendo arginina deiminase como ingrediente activo.

Os inventores do presente invento procederam a pesquizas em relação a muitos novos tipos de arginina deiminase tíerivável de Pseudomonas, Streptococcus, micoplasma s outros microrganismos. Como resultada disso, chegou-se ao presente invento, ao ter—se descoberto que um extracto de célula de micoplasma nha arginina deiminase. revelando possuir o seu pH óptimo da gama fisiológica, demonstrando uma elevada estabilidade e, por consequência, apresentando uma forte actividade inibidora do crescimento das células cancerosas.

contr

A arginina deiminase íEC 3»5»3.ó.) é uma enzima que hidroliza o grupo amidino da L—arginina em L-citrulina e amónia, sendo designada pelo nome geral de arginina di—hidrolase, arginina desimina.se, ou guanidinodesiminase. A L-citrulina. resultante é decomposta em ornitina e fosfato de carbamoilo, e este fosfato de carbamoilo é ainda decomposto em amónia e água. Neste processo produz-se a ATP. Por outras palavras, a arginina deiminase é uma enzima envolvida no primeiro passo do percurso que conduz à produção ds ATP em conexão com o metabolismo dos grupos amidina da arginina nas bactéria e nas leveduras.

A arginina deiminase do presente inventa possui seguintes propriedades fisico-quimit

smòn xa _?

Cb) pH óptimos ό,ΰ - 7,5

Cc) pH estáveis 4,5 -· 9,0

Cd) Temperatura óptima s cerca de 5©°C Ce) Valor Km ; cerca ds 0,2 mM

C f)	Ponto isoeléctrico Cpl	> -	cerca de 4,7
Cg)	Peso molecular s cerca	de	45»000
	Cpor electroforese	de	gel de SDS-poliacrilamida)
	cerca	ds	90=000
	Cpor CLAP com filtr	açãi	o de gel)

C h)

Sequência ds Ser-VaI-Phe— aminoácidos ds N—terminal s jX—Ser-Ly s-Phe-Ly s-tí 1 y— 11 e—Hx.s

Val-Tyr

-Ser—S1 u*

Pí 5í'~Q Xϊ ϊÃ.i iΆ DD p’f~tdbc-cdn ^;_õr ÍHVSn uD uSíBCtJinpr*Sfc.*r)Díz? ct sequência de aminoácidos apresentada na Figura 4=

A arginina dsiminase do presente invento é preparada a partir do micoplasma pelo método seguintes

Qualquer- micoplasma tendo a capacidade de produzir a arginina dexmxnass do presente invento pode ser usado» Estes tipos de micoplasma incluem o M„ arginini, H= hominis, M» salivarium, M. gallinarum ε M» orais» A estirpe mais adequada ê o M.

rr arg xn ini ECcstálogu IFO nS 14-4/6, Catálogo AsCC n“2 2383-Catáloqo NCTC

-í2 Í0129) fornecida pelo Institute ou of í*ermentacxon¹¹, Osaka, AiCc ou McTc»

No presente invento, o micoplasma atrás mencionado é cultivado num meio liquido a que se adicionou arginina, a uma temperatura ds cerca de

37or>

durante um ou vários dias, numa situação de facultativa presença de adiciona-se repouso.

e pooe s oxigénio arginina

Este micoplasma é er cultivado em con . Usa-se ue caldo ao mexo a uma razã

uma bactéria anaeró dições anaerobxcas ou de carne PPLQ ou outro o de Ι-ΙΟ g por litro bia mexo _a

Efectuada a cultura suspensas numa solução tampão de tampão fosfato s são separ precipitados são removidos at ou por um método semelhante obtida como uma extracção d

como, por exemp1o , processo de purificação por crome de filtração por gel, cromatogr; grafia de afinidade e outras. 0 na deimina.se com as propriedades das» as e depois uma solução adas por sonicação^ finalmente, ds ravés de separação por centrifugação . A solução sobrenadante é assim e células, ous é submetida a um tografia tal como cromatografia fia de permuta tónica, cromato— resultado é obter—se uma arginxfísico-químicas atrãs mencionaA arginin diferente dos tipos em vária literatura Quadro I.

deiminase do presente invento é claramente ;S arginina dsintinase conhecidos, referidos da especialidade, tal como se pode ver no

Çuadro I

Referência.	(Presente invento)	J.B.C. 252,2615 -2620 (1987)	J.B.C. 241,2228 -2236 (1966)	J.B.C. 250,4580 -4583 (1975)	Archives of Biochemi stry and Biophysics69,186197 (1957)
Fonte	M. arg in i n i	M. a r t li -	M.homi-	Pseudo-	St repto- coceus faecali s
	r i t i d i s	η i s	monas put ida
Peso Molecular	45,000 (SDS-PAGE) 9,000 '(filtração c/gel CLAP)	49,000 (SDSPAGE )	78,300	54,000 (SDS- PAGE )	desconhecido
Ponto isoeléc- trico 1	'·/ 4.7	7.0	desco- nhecido	6.13	desconhecido
km	0.2mM	4//M	0.1-0.4 mM	0.2mM	0.15mM
Vmax	50u/mg	18u/mg	5 3u/mg	58.8u/mg	41u/mg
pH óptimo	8.7-7.5	Desconhe eido	6.5-8.7	6.0	6.8
Aminoác ide na extremi dade N	Ser	Ala	desconhe- cido	desco- nhecido	desconhecido

Por outra lado, a pesqui; entre &. sequência de·- aminoácidos das arginina deíminase do presente invento e as proteínas registadas na base de dados do computador. mas chegou-se à conclusão de que nenhuma proteína tinha uma sequência de aminoácidos semelhante à que foi obtida no presente invento. Por estes motivos, concluiu-se que a arginina deíminase do presente inventa é uma nova arginina. deiminase.

Além disso, fez-se uma tentativa no presente invento de clonar o gene da arginina deiminase do M. arqiníni a partir do DMA do genoma do M. arginini,. Analisando a sequência do DMA do gene cionado, determinou-se uma sequência de nucleótidos codificando s. arginina deiminase, tal como ê ilustrado na Figura 4. Concluiu—se, deste modo, que a arginina deiminase do presente invento continha 4@9 aminoácidos e um peso molecular de 46375, praticamente idêntica ao peso molecular das proteínas obtido por slectroforese de gel SDS-poliacrilamida.

Tal como o indicam as experiências ds 1 a 6, a arqinina deiminase do presente invento revela um efeito excelente no prolongamento da vida dos ratos portadores de células cancerosas tais como cédulas de leucemia, células de fibra—sarcoma.

ceiuias de carcinoma do cólon e outras. Por este motivo, é evidente que a arginina deiminase do presente invento é eficaz no tratamento de uma variedade de tumores, em especial, de tumores malignos em seres humanos.

A actividade da arginina deiminase pode ser determinada , ao usar o método referido 501-510 (1976)1 e medindo a o método de Archibald EJ.

nsíaiuo mal que kicí proouza cicruiina por Fenske et al. E«3. Bacteriol. 126-, quantidade da produção obtida usando

Biol. Chem. Í56. 121—142

C1944)3

Λ \

Especificamente, adicionam-se 20 μI de uma solução arginina deíminase a 1,0 ml de arginina 10 mM Ed; tampão fosfata 0,1 ri de pH íol v

ução	de
Á. La Cv	num
que	se
r escçâo
• áci	.dos

s.o 1 oluçát:

Em sequida, são adicionado;

(Η^80₄ s H^PO₄ = í s 3) reactiya resultante 25μ1 de uma solução aquosa de diacetilmono-oxima a -3%, aquecendo—se a 100°C durante 20 minutos numa, situação protegida da luz, deixando—se a arrefecer à temperatura ambiente durante 30 minutos e medindo-se depois quantitativamente a quantidade de citrulina através das medição da absorção a 490 nm» A actividade da. arginina. deimina.se produzindo í pmol de citrulina num minuto é definida como 1 unidade..

No que deiminase, nao se conhecem caso·:

•es peita elevada, toxicidade tia arginina de ratos mortos devido a uma.

administração não excedendo 1 mg/rato de arginina. deimins.se, por via oral ou rncravenosa., efeccuada nas caiudai.» miem disso, a dissecação dos animais a que foi administrado o produto não revelou irregularidades nos seus órgãos, o que serviu para confirmar o elevado grau de segurança, da arginina. deiminase»

A arginina deiminase do presente invento pode ser admnistrada. por injecção (injecção hipodérmica, injecção intavenO'S-5. DLl injSCçáD 1 f o r mu I a ç S e s f arma, c eu t i c a. s is sgr etc) numa variedade de preparações e Pode ser utilizada em combinação com farmaceuticos, veículos ou adjuvantes.

Uma variedade de formas de preparação são possíveis, tais como formas em suspensão, fluídicas, emulsões, ampolas e outras formas de injecção» D agente do presente invento pode ser preparado por meios conhecidos para, preparações farmacêuticas.

	Como a. dosagem	de	arginina deimina.se do	presen ts
ii iventu	varia de acordo com	com	as variações individuais	, condi~
ç 8es d a	doença e seme1han	tes 3	a arginina deim.ina.se	pode ser
admnistr	ada eis quantidades	desds	i 0,1-100 mg/1 Kg de peso	corporal

por dia.» lesenbos

A Figura í mostra, uís cromatog rama ds filtração com gsl ds ubi extracto ds células ds H- arqinini do presente invento» A Figura. 2 é um cromatog rama de permuta, de iões das suas fracções 42-52 s a Figura 3 é um cromatograma de afinidade das iracçoes

O0A Figura 4 mostra, a sequência completa, de aminoácidos da arginina deisinass s a sequência nucleotídíca que codifica enzima.» As Figuras 5 a 8 mostram a sequência, nucleotídica e correspondente sequência de aminoácidos dos oligonucleotídeos usados como sonda»

Descrição detalhada dos modos de realização preferidos

Apresentam-se a seguir exemplos do presente invente

Exemplo 1

Preparação da. arginina. deimina.se

Cl> Cultura de M» arqinini lnoculou-se uma estirpe de ri» qinini (Catálogo IFQ nS

144/6) obtida do Institute of Fermentation líquido Ccomposto por 21 g de caldo PPLO p/v L-arginina, 200 ml ds soro de cavalo, 100 de Osaka num meio CV CDifco), 10 g da ml de extracto ds

10· levedura recentemente preparado, 5 ml fenol a. 0.,4% e 700 ml de água destil

7,03·, e cultivou—se num

ncubador uuíb Cu ds uma solução vermelha, de ida5 e ajustou-se o pH para

-’C Uura.n Le dois dias numa situação de repousai.z.i Separação e purificação da srgimns oeimmase (A) Preparação ds um extracto de células de M. arqinini

Separaram—ss 2 g de células de K» arqinini centrifugan— do 2 litros do meio líquido obtido ds acordo com o passo Cl) acima referido, a 7.000 rpm durante 2® minutos. Estas células de

M._aro in in i foram suspensas era 30 ml de tampão de fosfato 10 mM com um pH ds 7.0= As células contidas nesta suspensão foram então separadas por sonicaçSo a a matéria insolúvel foi removida por separação centrífuga. Finalmente, o sobrenadante resultante foi obtido como um extracto de células de M. arqinini.

CB) Purificação da arginina deiminase

A arginina deiminase foi purificada a partir de um extracto de células de K. arqinini obtido no passo CA) acima referido, aplicando os seguintes três tipos de cromatografia.

I) Cromatografia de filtração com gel □ extracto de células de M. arqinini atrás referida fax submetido a cromatografia de filtração com gel nas condições que se seguem, usando Cellulofine 6CL-2000m CChisso Corporation!s %-

Dimensão da coluna Volume do gels Taxa do fluxo -s Volume d-a fracção* Eluente:

' . Τ' V ^v . ' ϋ₉ό X 90 CU» 480 ml 24 ml/hora ó mc ad a tampão de fosfato de potássio 10 nM ípH 7,0) ₅cloreto de sódio

-y fi absorção a 28€> nM e a actividade de cada fracção da arginina deiminase assim obtida foram medidas- pelos métodos atrás mencionados, e os resultados foram os que se podem ver na Figura 1. Concluiu-se que a arginina deiminase estava contida nas f r acçSes 42—52» ii) Cromatografia de permuta de iSes

Ah- í rscçSss obtidas no passo i > ac ima retendo foram dializadas durante 24 horas contra um tampão fosfato 10nM. Em seguida, a solução dializada interna foi submetida a cromatografia de permuta de iSes nas condiçSes que ss seguem, DEAE-Toyopearl íToso Co.3 usando φ'

Dimensão da coluna

Volume do gel'»

Taxa, do fluxo s Volume da fracçãos Eluente:

A absorção a 2S0 nM e s aci arginina deiminase assim obtida foram Bisncionados, s os resultados foram os

6Θ ml/hora ml cada tampão de fosfata de potássio 10 nM ( pH 7 ₃ O}₅ + (gradiente linear de cloreto de sódio de 0 a 0,5 M ividade medidas que se

1, Concluiu—ss que a arginina deiminase de cada fracção pelos métodos a podem ver na Fi estava contida trás gura nas fracçSes 42-52.

Por outras palavras, as fracçSes dializadas contendo a arginina deiminase foram adicionadas à coluna DEAE-Toyopearl equilibrada com o mesmo tampão que foi usado na diálise a fim de absorver a arginina deiminase, e recolheram-se 10 ml de cada fracção por eluição usando um cloreto de sódio de 0 ΙΊ a 0,5 gradiente linear da concentração d© M no tampão a uma taxa de fluxo de ml/hora.

nm e

Tal como no actividade da passo i) acima referido, a absorção a arginina deiminase de cada fracção foram medidas s os resultados mostrados na higura 2, arginina deiminase estava contida nas fracçSes

Concluiu-se que a >0-53,

Iii> Cromatografia nidade 'V

Ç.

KS ir^LUOSs CCLiU-ãz- nu foram dialisadas durante 24 horas contr potássio. Depoisj a solução dializada qrafia de afinidade, nas condições que -Sepharosa 4B CPharmacia Co.3

Dimensão da coluna Vo1ume do ge1s Taxa do fluxo s Volume da fracçãos Eluentes

Por outr a rg ίn ina deiminase

passo ii) atrás referido a um tampão de fosfato de . foi submetida a cromatose seguem_? usando Arginina·

2,2 x IO cm •ύΰ jTi X ml/'nora 8 ml cada tampão de fosfato de potássio 10 ni’-1 (pH 7 _s ô 5 ! + (gradiente linear de cloreto de sódio de 0 a 13 © M palavras, as fracções dializadas foram adicionadas a uma coluna d<

intendo a Arg in ina~ —Sepharuse equilibrada com u mserao dié.Iise a fim de absorver a arginina ml de cada fracçao por eluição nas linear de 0ΙΊ a 1,0M da concentração de a uma taxa de fluxo de 50 ml/hora.

Tal como no passo ii) atrás absorção a 280 nm e a actividade da fracção foram medidas e os resultad Figura 3« Concluiu-se que a arginina nas fracções 71—81, tampão que foi usado na deiminase, recolhendo-se 8 conoiçoes de um gradiente cloreto de sódio no tampão referido, a capacidade de arginina deiminase de cada os foram apresentados na deiminase estavas contida iv) Elsctroforese de gel SDS-poliacrilamida

As fracções 71-81 obtidas no passa iii) atrás referida foram analisadas por electroforese de gel SDS-poliacrilamida de método referido por Laemmli et al. tNafure. 727, &

âCurtiO COta o

680—685 (19/0)1. A purificação da arqlnina deiminase foi confirmada, dado que se pôde observar, a um peso molecular de 45.00®, uma faixa única.

CC) Propriedades físico-químicas da arginina deiminase

Efectuaram-se as seguintes medidas com a solução de encimas obtida no passo (B) iii) atrás referidos

i) pH óptimo, temperatura óptima, pH estável o temperatura es táve1

A gama óptima do pH foi de 6,0-7, pH, quando tratada a 4°C durante 24 horas, τ actividade mais elevada, foi obtida numa gama de temperaturas de 45 a 55-C, e quanto à estabilidade reíativamente á temperatura, a perdeu-se completamente com o tratamento a. 95°C gssis estável do roi de 4,0-9,0.

actividade durante b minutos ou a 6®°C durante 3ú minutos.

ii) Especificidade do substratí

A arginina deiminase hidrolisou a L—arginina para produzir L-citrulina e amónia.

iii) P«s-O molwcu 1 ar

A medição através de electroforese de gel SDS-poliacrilamida indicou a um peso molecular de aproximadamente 45.©0® „

C'ão de gel , usando TS-K S.s®®0SW_v, ETosoCo. 3 Λ L.

molecular de aproximadamente 90»®®®» indicou um peso iv) Ponto isoelêctrico

Medição do ponto isoelêctrico através do método- de electrofocagem indicou um ponto isoelêctrico de aproximadamente ~7 / B na nM

Através da ’â<ii”SS os valores e 5® U/mçj.

análise do gráfico Lineweaverde Km ε Vmsx como sendo₅ rsspsc

Burk determit i vamen te _s ®₅ 2 vil A sequência de aminoácidos da extremidade—N foi determinada com o auxilio de um sequenciador peptídico EApplied Biosystem Co.3 tal como- a seguir se indicas

Ser-Val-Pbe-Asp-Set—Lys—Phe—Lys—G 1 y—11 e -Hi s-Va1-Tyr-Ser-B1uvxi) Actividade biológica

A at* igxnXita deiminase em relação ao crescimento de indicou exercer um excelente efi ratos- cancerosos in viva, revelou uma actividade inibi-d células cancerosas in vitro., sito no prolongamento das vidas ora iSiíipl c

Cl) Prep ação de DNA genómico do micoplasma

M.arqinini CCatálogo IFO η·2 144763 foi lisado cem SDS? e tratado depois? primeiro com protinase K e? em seguida? com RNase ft« Seguidamente? a solução foi extraída com fenol e depois com clorofórmio; preparou-se finalmente o DNA genómico dialisando a camada aquosa resultante contra ácido tris-clorídrico Í0nr1 CpH 8?0) em EDTA InN» (25 Preparação da biblioteca de genes.do micoplasma

DMA genómico do micoplasma preparado no passo (15 atrás referido foi digerido por enzimas de restrição apropriadas» Em seguida? foi inserido num vector de plasmídeo pUC19 EToyobo Co»3 e finalmente este vector foi Introduzido na E.coli HB101 Cobtida através da Takara Shuzo Co.l a fim de fornecer a biblioteca de genes do micoplasma» (35 Esquema e síntese dos oligonucleótidos hibridação sonda

Keferiu-se previamente que o DNA do micoplasma contém apenas uma. pequena quantidade de SC CProc» Natl» Acad» Sei», 84, í66-169 C198753» Com base nestes dados? desenhou-se um oligonucleótodo com 24 bases (uma mistura de 4 tipos? ver Figuras 5 a 8 no que respeita as suas sequências5 a partir da sequência N—terminal de aminoãcidos da arginina deiminase e sintetizou—se com o auxílio de um sintetizador ds DNA Emodelo ABI 308 B3, í45 Separação por meio de hibridação de colónias mtstizado no passo referido foi rotulado com 32ρ e usado como sonda para da biblioteca ds genes do micoplasma produzida no Isolaram-se assim os clones positivos» a separação passo (2)„

□ DMA do plasmídeo foi preparado a partir dos clones obtidos no passo í4) atrás referido s o fragmento de DNA a ser hibridado com a sonda foi integrado no MKí3mpí9 EToyobo Co.-3,. Usando o método de dideoxi, determinou—ss a sequência de núcleo— tídeos para amb-as as estirpes de genes danadas» Os resultados são -apresentados n-a Figura 4«

M.arginini	C v s?	Figu
reconhecido	t» ínJxFíO	um
Natl- Acad»	wL X B tj	QO Qi. sj

Uma grelha de leitura aberta 1230 bp_g incluindo uma sequência de nucleotídeos que codificava o hl—terminal foi encontrada no gene clonado₅ uma sequência de 30 aminoácidos da arginina deiminase e os genes 1227 bp a seguir ao codão de iniciação ATS foram identificados como o gene d-a arginina deiminase do 43 - Como se sabe que o codão 7GA é ião de triptofano no micoplasma EProc82 =, 2306—2309 (198333_s os codões T8A existentes sm 5 poscçSes diferentes nos genes de arginms deiminase foram considerados como sendo codões de triptofano₅ e a análise foi efectuada com base na suposição de que existiam apenas dois codSes terminais, TAA e ΤΘΑ»

O peso molecular derivado da totalidade dos 409 aminoácidos era de 46375_? o que é quase igual ao peso molecular obtido através da electroforese de proteínas de gel SDS-políeerilamida»

Exemplo 3

Preparação de uma formulação de arginina deiminase

As fracções /1—81 obtidas no Exempla 1 passo (23 iii) foram dialisadas durante 24 horas com uma salmoura (PBS) CpH 7-4) ití-

tampanada com fosfato e o produto dializado foi diluído com PBS numa sedução de 0,2-2,0 mg/ml» Em seguida, a sedução foi esterilizada por filtração com um filtro de 0₅2pm_? para se preparar uma composição de arginina deiminase do tipo solução aquosa.

Exemplo 4

Expressão da arginina deiminase por meio de trsnsíormsnte

Cl) Produção do gene mutante

De acordo com o método Kunkel EProc. Natl. Acad» Sei. USA5 82, 488 (1985), efectuou—-se uma mutação pontual para substituir todos os 5 codSes TGA do gene da arginina deiminase (mostrado na Figura 4) por codSes T8S que são codSes de triptofano da E» coli, usando 5 tipos diferentes de oligonucleotídeos como iniciadores. Geguzosmente, sexeccionaram se clones em que foram substituídos todos os 5 codSes TGA por codSes TBB pelo método de hibridação de placa usando o oligonucleotídeo como sonda. Os clones seleccionados foram sequenciados a fim de se ter a. certeza de que todos os 5 codSes TGA tinham sido substituídos pelos codSes TBB.

C2) Preparação da arginina deiminase expressando o vector

Preparou-se o plasmideo pAD 12 inserindo no sitio Sac do plasmideo pVC 19, genes contendo os genes estruturais, e genes reguladores a montante dos mesmos, dos genes mutantes da arginina deiminase obtida no passo (i) atrás referido. Descobriu-se que o plasmideo resultante pAD 12 tinha uma. sequência promotora do micop-lasma srginini arginine deiminase, e sequência de bases do pftD 12 indicou a presença de uma análise da uma sequência consensual (SD,

Λ í

- ;·'·Α

10_? sequência —35} do promotor prouariotico cexuiar»

Assim, foi considerado possível que o plasmideo pAD li servisse como vector expressando a arginina deiminase da E» coli.

(3) Cultura de transformantes e preparação de extracto celular pAD Í2 preparado introduzido na E» coli HB 101 no passo (25 atrás referido foi (Takara Shuzo Co»), e o transformante resultante foi cultivado durante a noite a 37em o ml do meio Í_B (IX de Bacto Tryptone (BIFCO Co»), 0,5X de extracto de levedura Bacto CDIFCO Co»), ®₅2X de glucose, 1,0X de NaCl, pH 7,53. Adicionou-se em seguida 1 ml do meio de cultura a 250 ml do meio L.B para se cultivar durante a noite a 37°C» As células recolhidas da cultura por centrifugação foram lavadas duas vezes com soro fisiológico e foram suspensas em ml de tampão de fosfato de potássio 0,1M (pH 7,0). As células foram depois separadas por sonicação e o sobrenadants, depois da remoção das matérias insolúveis por centrifugação, foi obtido sob a forma de extracto celular» Q mesmo processo foi repetido para se preparar um extracto celular da E» colí HB 101 retendo o pUC 19 que não continha os genes da arginina deiminase» Este extracto como controlo» (4) Medição da actividads da arginina deiminase citrulina obtida foi medida pelo método atrás mencionado

D extracto celular HB 101 retendo pAD Í2 e o extracto celular HB 101 retendo pUC 19 (controlo), ambos obtidos no passo (3), foram diluídos 10 vezes por meio de um tampão de fosfato de potássio 0,íM CpH 7»€O, incubando—ss 10 μΐ de cada solução resultante a 37°C durante 5 horas» Em seguida, a quantidade de A quantidade de expressão de arginina pAD 12 foi calculada a partir da citrulina obtida no HB 101 retendo pUC 19. O resultado indicou 1=2 arginina deiminase para cada 250 ml

diferença da quantidade de pAD 12 e a do HB 101 retendo unidades de actividade de de meio LB.

Além d isso ₅ os resultados do teste rei a ti anticancerosos da arginina deiminase do presente apresentados nas experiências que se seguem§ vo aos efeitos i n vento foram

Experiência . hfeito^-~- aíitxca.iiu.^roso^· da arginina deiminase Experiência 1 s Método usando estirpes cultivadas de células cancerosas humanas

Primeiro? inocularam-se 1 x ÍO’ células de cada tipo de :élu.las cancerosas humanas numa mícroolaca com c a v ι o a o e s de soro contendo i₅0 ml de meio DME com um soro contendo í fetal de bovino e a preparação de arginina deiminase obtida no passo atrás referido foi adicionada a este meio numa quantidade tal que a concentração desta preparação no meio era de 5 ng/ml ou 10 ng/ml. Seguidamente? cultivando num incubador de C0_o a 5Z a 37°C durante 3 dias, contou-se o número de células cancerosas usando um contador automático de células (Coultor counter) CCoultor Co.3. Como controlo adicionou—ss a mesma quantidade de PBS ao meio em lugar da preparação de arqinina deiminase. actividade inibidora do crescimento de células cancerosas indicada em termos do número tíe células cancerosas em

H foi s.mostras, relativamente ao número correspondente para o controla que foi estabelecido como sendo de 100. Os resultados são apresentados no Quadro

Tipo de células	No. ε <2 ds 5 ng/ml	ie células ? controlo·) 10 ng/ml
Células cancerosas figado humano (HLE)	16,7	63/
Células ds fibro-sarcoma maligno humano CB32)	20, í	10,3
Células cancerosas, do carcinoma esc arnoso human o (Cask i)	3 i, &	22,9
Células cancerosas do carcinoma escamoso humano (HSC-4)	δζ~7 Λ ’—· ? q T	41 ,S
Células do melanoma maligno humano CVMRC)	41,7	23 ₃ 4
Células do carcinoma nasofa— ringico humano <KB)	«•7»1	46,9
Células do carcinoma pulmonar hu mano C A549)	47 7	45,8

Experiência 2s Método usando células de leucemia L1210 de rato

Utilizou-se no teste um total de 21 ratos machos CDF„ X \BALB/c fero, x BBA/B aascj de 7 semanas e transplantaram—se por via i.p» 1 x 10 células de células de leucemia L.Í210 para cada rato. Em seguida.;, seleccionaram—se ao acaso 9 ratos como qrupo de controlo, dividindo-se os outros em 2 grupos» As preparações de arginina deiminase atrás mencionadas foram cronicamente Injectadas por via i.p», diariamente_? durante 8 dias₅ aos grupos a serem testados. Aos animais do grupo de controlo foi administrado PBS»

b.x psri’énc ia o

Utilisou-se no teste um total de 27 ratos machos CuF CBALB/c fem, x DBA/B masc.) de 7 semanas e transplantaram-se cada rato. Em seguida, selecctonaram-se ao acaso 9 grupo de controlo, dividindo-se os outros em 2 preparações de arginina deiminase atrás mencionadas por

1-,=( r- ~ « como

4<=.

r a >_o '= grupos, κ foram cronidiarlamente, durante 10 dias, aos grupos a serem testados, Aos animais do grupo de controlo foi administrado PBS, : emente mjectaoas por via i

-3___ «í .

Experiência 4 s Método usando células de rato Colon 26

C a r u 1 t í orna O O *_ ά I on u e machos CDb,

Utilizou—se no teste um total de 25 rat <BALB/c fem, x DBA/B masc.l de 7 semanas e transplantaram-se por via i,p, í x 10“ células ds células ds carcinoma do cólon Colon 26 para cada rato. Em seguida, seleccionaram-se ao acaso 9 ratos como grupo de controlo, dividindo-se os outros em 2 grupos. As preparações de arginina deiminase atrás mencionadas foram cronicamente xnjectadas por via x,p., diariamente, durante 10 dias, aos grupos a serem testados. Aos animais do grupo de controlo foi administrado PBS,

Experiência 5 ; Método usando o sarcoma 180 ds rato

Utilizou-se no teste um total de 24 ratos machos ICR de 7 semanas e transplantaram-se por via ' ” células de sarcoma 1B0 para cada rato,

-se ao acaso 8 ratos como qrupo de x = p» ϊ x 10“ uêlulas dbí Em seguida, seleccionaramcon tro1o, d i v id indo-se os ΐ·

outros em 2 grupas. As preparações de arginina deiminase atrás mencionadas foram cronicamente injectadas por via i.p», diariamente, durante 14 dias» aos grupos a serem testado do grupo de controlo foi administrado PBS»

Aos animais

Experiência 6 s Método usando hepatoma ascítico MH Í34 de rato

Utilisou-se no teste um total ratos macnos ,p. í x IO⁶

C3H/HeN de 7 semanas e transplantaram-se por via células de hepatoma ascítico MH 134 para cada rato» Em seguida.

se1ecc ion a ram-se ao acaso dividindo—se os outros em ratos como grupo de grupos» As preparações de arginina deiminase atrás mencionadas foram cronicamente injectadas por via i»p«, diariamente, durante 14 dias, aos grupos a serem testados» Aos animais do grupo de controlo foi administrado PBS» efexto anticanceroso foi indicado em termos de percentagem CT/C X) do número médio de dias vividos pelos grupos submetidos ao teste comparado com o dos grupos de controlo» Os resultados obtidos nas Experiências 2 a 6 são apresentados nos

Quadro 3 (L1210)

Grupo	Média No.dias vividos	T/C(%)
Controls	(N=9)	8.4+0.7	(100)
0.25mg/rato	(N=6)	9.3+0,5	111
0·5 mg/rato	(N=6)	10.3± 1.4	126

Quadro 4 (Método A)

Grupo	Média No.dias vividos	T/C(%)
Con t ro 1 o	(N=9)	10.6+1.6	(100) .
0 .1 mg /rato	(N=9)	10.7+0.7	101
0.5 mg/ rato'	(N=9)	12.6+1.7	118

Quadro 5 (Colon 26)

Grupo	Média No.dias vividos	T/C(%)
Cont ro1 o	(N=9)	11.1+1.3	(100)
0.1 mg/ rato	(N=8)	11.9+1.4	107
0.5 mg/ rato	(N=8)	21.8+4.6	196

,v.

Quadro 6 (Sarcoma 180)

Grupo	Média No.dias vividos	T/C(%)
Control₀(N=8)	21.3 ± 9.9	(100)
0.04 mg/_rato(N= 8 )	35.3 ± 13.3	166
0 · 2 mg/pato (θ)	48.4 ± 9.0	228

( MH 134 )

Grupo	Média No.dias vividos	T/C{%)
Controlo(N=10)	25.0 ± 6.7	100
0.04 mg/_rato (N=8)	> 75	>300
0.2 mg/rato (N=8)	> 75	>300

Claims

..seo. RE Σ VINDICAcSES is — Processo cs.racterizado por para se obter a nova arginina deiminase, coca as seguintes propriedades (a 5 Es pec i f i c i d ade funciona 1 e de substra lO s Hidralisa os gr U DOS 3iTll dino d a L—arg x nina em L—citrul ΐΞΙΓίΊοΠ Í. â 3 ( b) pH óptimas 6, & - 7,3 < c) pH estáveis 4, 5 - 9,0 í d) Temperatura ópt J. a í~ Í~ rca de 5 £3 °C (e) Valor Km 5 cerc a de €5,2 : mH (f) Ponto i soe1éc tr XCQ (pI) s cer ca de 4, “7 í q) Peso molecular ; cerca de 45 = ÇrtiALA (par slectr ofarese de gel de SDS- •poli acrilamida) cerca Hg „ 000 (por L-LAP c ora filtr •ação d e gel) e <h) Sequência de amino-âcidos de N-terminal Se r—Va1—Phe—Asp~Ser-Lys-Phe—Lys~81y—11e—His-Va1-Tyr~ -Ser-GIu $- por cultivo do micoplasma capaz de decompor a arginina 1 produto da cultura ser tratado por um processo da extrao separação e purificação para obter a nova arginina deiminase. 2â — Processo de acordo com a reivindicação 1 caracte-rizado por se ρreparar a nova arginina deiminase que contem a sequência de aminoácidos apresentada na seguinte Fiqura. V V

Fig. 4 TCT GTA TTT GAC AGT AAA TTT AAA GGA ATT CAC GTT TAT TCA GAA ATT 48 Ser Vai Phe Asp Ser Lys Phe Lys Gly I le His Vai Tyr Ser Glu I le 1 5 10 15 GGT GAA TTA GAA TCA. GTT CTA GTT CAC GAA CCA GGA CGC GAA ATT GAC 96 Gly Glu Leu Glu Ser Vai Leu Vai His Glu Pro Gly Arg Glu I le Asp 20 25 30 TAT ATT ACA CCA GCT AGA CTA GAT GAA TTA TTA TTC TCA GCT ATC TTA 144 Tyr I le Thr Pro Ala Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala I le Leu 35 40 45 GAA AGC CAC GAT GCT AGA AAA GAA CAC AAA CAA TTC GTA GCA GAA TTA 192 Glu Ser His Asp Ala Arg Lys Glu His Lys Gin Phe Vai Ala Glu Leu 50 55 60 AAA GCA A AC GAC ATC AAT GTT GTT GAA TTA ATT GAT TTA GTT GCT GAA 240 Lys Ala Asn Asp I le Asn Vai Vai Glu Leu I le Asp Leu Vai Ala Glu 65 70 75 80 ACA TAT GAT TTA GCA TCA CAA GAA GCT AAA GAC AAA TTA ATC GAA GAA 288 Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Gin Glu Ala Lys Asp Lys Leu I le Glu Glu 85 90 95 TTT TTA GAA GAC TCA GAA CCA GTT CTA TCA GAA GAA CAC AAA GTA GTT 336 Phe Leu Glu Asp Ser Glu Pro Vai Leu Ser Glu Glu His Lys Vai Vai 100 105 110 GTA AGA AAC TTC TTA AAA GCT AAA AAA ACA TCA AGA GAA TTA GTA GAA 384 Vai Arg Asn Phe Leu Lys Ala Lys Lys Thr Ser Arg Glu Leu Vai Glu 115 120 125 ATC ATG ATG GCA GGG ATC ACA AAA TAC GAT TTA GGT ATC GAA GCA GAT 432 I le Met Met Ala Gly I le Thr Lys Tyr Asp Leu Gly I le Glu Ala Asp 130 135 140

Λ CAC GAA TTA ATC GTT GAC CCA ATG CCA AAC CTA TAC TTC ACA CGT *GAC*' .'480 llis Glu Leu Ile Vai Asp Pro Het Pro Asn Leu Tyr Phe TJir Arg Asp 145 150 155 160 CCA TTT GCA TCA GTA GGT AAT GGT GTA ACA ATC CAC TAC ATG CGT TAC 528 Pro Phe Ala Ser Vai Gly Asn Gly Vai Thr Ile llis Tyr Ket Arg Tyr 165 170 175 ΑΛΑ GTT AGA CAA CGT GAA ACA TTA TTC TCA AGA TTT GTA TTC TCA AAT 576 Lys Vai Arg Gin Arg Glu Thr Leu Phe Ser Arg Phe Vai Phe Ser Asn 180 185 190 CAC CCT A A A CTA ATT AAC ACT CCA TGA TAC TAC GAC CCT TCA CTA AAA 624 llis Pro Lys leu lie Asn Thr Pro T rp Tyr Tyr Asp Pro Ser Leu Lys 195 200 205 TTA TCA ATC GAA GGT GGG GAC GTA TTT ATC TAC AAC AAT GAC ACA TTA Leu Ser Ile Glu Gly Gly Asp Vai Phe Ile Tyr Asn Asn Asp Thr Leu 210 215 220 GTA GTT GGT GTT TCT GAA AGA ACT GAC TTA CAA ACA GTT ACT TTA TTA Vai Vai Gly Vai Ser Glu Arg Thr Asp Leu Gin Thr Vai Thr Leu Leu 225 230 235 240 GCT AAA AAC ATT GTT GCT AAT AAA GAA TGT GAA TTC AAA CGT ATT GTT Ala Lys Asn Ile Vai Ala Asn Lys Glu Cys Glu Phe Lys Arg Ile Vai 245 250 255 GCA ATT AAC GTT CCA AAA TGA ACA AAC TTA ATG CAC TTA GAC ACA TGA Ala Ile Asn Vai Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met llis Leu Asp Thr Trp 260 265 270 CTA ACA ATG TTA GAC A AG GAC AAA TTC CTA TAC TCA CCA ATC GCT AAT Leu Thr Met Leu Asp Lys Asp Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Ile Ala Asn 275 280 285 GAC GTA TTT AAA TTC TGA GAT TAT GAC TTA GTA AAC GGT GCA GCA GAA Asp Vai Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Vai Asn Gly Gly AI a Glu 290 295 300 ¥ *ί

CCA CAA CCA GTT GAA AAC GGA TTA CCT Pro Gin Pro Vai Glu Asn Gly Leu Pro 305 310 ATC ATT AAC AAA AAA CCA GTT TTA ATT Ile Ile Asn Lys Lys Pro Vai Leu Ile 325 TCA CAA ATG GAA ATC GAA AGA GAA ACA Ser Gin Met Glu Ile Glu Arg Glu Thr 340 345 TTA GCA ATT AGA CCA GGT GTT GTA ATT Leu Ala Ile Arg Pro Gly Vai Vai Ile 355 360 ACA AAC GCT GCT CTA GAA GCT GCA GGC Thr Asn Ala Ala Leu Glu Ala Ala Gly 370 375 GGT AAC CAA TTA TCA TTA GGT ATG GGT Gly Asn Gin Leu Ser Leu Gly Met Gly 385 390 CCT TTA TCA CGT AAA GAT GTT AAG TGA Pro Leu Ser Arg Lys Asp Vai Lys Trp CTA GAA GGA TTA TTA CAA TCA 960 Leu Glu Gly Leu Leu Gin Ser 315 320 CCT ATC GCA GGT GAA GGT GCT 1008 Pro Ile Ala Gly Glu Gly Ala 330 335 CAC TTC GAT GGT ACA AAC TAC 1056 i His Phe Asp Gly Thr Asn Tyr 350 GGT TAC TCA CGT AAC GAA AAA 1104 Gly Tyr Ser Arg Asn Glu Lys 365 ATT AAA GTT CTT CCA TTC CAC 1152 Ile Lys Vai Leu Pro Phe His 380 AAC GCT CGT TGT ATG TCA ATG 1200 Asn Ala Arg Cys Het Ser Met 395 400 405 1227 %" **§·' ΛΙ} Π 7», 1 ' 'U/v' % \ Φ' --- Ί. síSí - 1 V* Γ " ~ to : gc. ·* - c x „* -·&- ··.,' H ; $ ? Cl Processa gimna por o para a preparação da nova ar deiminase ds acordo com a Reivindicação 15 xaracterizario micoplasma capaz da decompor a arqinina ser um H arqinini B — Processo para a Fr eparaçSo de um agente an ti “’C ·β.Π€!β? Γ*0150 ϊ? caracteri zatío por conter como ir iqredienb £ activo uma tí t Q Ji í 1J. i 1 ct deiminase com 5 CC pr o p r i ed ad es físico· ~ Q U í ííi X C 3. '3 descritas nas Reivindicações i ou.
2, sendo a dosagem para humanos adultos de cerca 1 a 1&Θ mg/íKg ds peso corporal„ 5§ — Processo para a preparação de DMA caracter i zado por se incluir uma sequência de polipeptídeo compreendendo a argi ϊ í IAC I t-O t X O OLi U Li lina deiminase e Codΐ í iLcl -Lí nus também i íca sequência am in oàc i dos apresentad a rsivmd x c ac ao da nova arginina as descr ‘itas na tivarem microrga- o uNA descrito na separada B pUfitl deimina.se reivintíic nisnios tr Reivindic cada para 6s - Processo para a preparação com as propriedades físico—químic ação i ou lí!3 caracterízado por se cul ansformados por um plasmldeo incluindo líç-:.1-.o e por ο ρϊ ϋοιιιο oa cuitura ser , se obter a nova arqinina deiminase» de hqd~· Lo de 199©

RUA VICTOR CORDON, 10-A 3,fi 1200 LISBOA