PT95516A

PT95516A - Processo para a preparacao de derivados de 2',3'-didesoxi nucleosidos 6-substituidos

Info

Publication number: PT95516A
Application number: PT95516A
Authority: PT
Inventors: Thomas Anthony Krenitsky; George Walter Koszalka; Janet Litster Rideout; Charlene Louise Burns
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1989-10-06
Filing date: 1990-10-04
Publication date: 1991-08-14
Also published as: EP0421819A1; AU6386390A; CA2027052A1; AU637831B2; TW205044B; KR910007533A; JPH03188022A; HUT55028A; HU906358D0

Description

'i.

Descrição referente à patente de invenção de THE WELLCOME FUNDATION LIMITED, britânica, industrial e comercial, com sede em Unicom House, l60 Euston Road, London NW1 2BP, Inglaterra, (inventore s:

George Walter Koszalka, Char-lene Louise Burns, Thomas Anthoony Krenitsky e Janet Litster Rideout, residentes nos E.U.A.) para "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE DERIVADOS DE 2 *.31-DIDESQXI NUCLEOSIDOS 6-SUBSTITUÍDOS»

Descrição A presente invenção refere-se a 2’ ,3'-didesoxi«' -nucleosidos, 6-substitu£dos, aos seus derivados farmaceutica-raente aceitáveis e à sua utilização terapêutica, especialmente no tratamento de determinadas infeeçães víricas*

Um outro grupo de agentes patogénicos víricos, de consequências muito graves a nível mundial consiste no vírus da hepatite, especialmente os viros da hapatite B (EBV).Os efeitos clínicos da infecção por HEV, variam desde as cefalei-as, febre, mal estar, náuseas, vómitos, anorexia e dores abd<) minais. A replicação do vírus é, habitualmente controlada pela resposta imunitária, com um período de convalescença que dje mora semanas ou meses nos seres humanos, podendo a infecção ser mais grave e conduzir a doenças hepáticas crónicas, persistentes. Em "Virai Infeccions of Humans" (segunda Edição, Ed. 1 f *

^^roS^SSK2SEa> S5É

Evans, A.S. (1982) Plenum Publishing Corporation, New York), Capítulo 12, encontra-se descrita pormenorizadamente a etiologia das infecçães hepáticas a vírus. A especificação do Bedido de Patente Europeu No. 0206497 descreve determinados 2,3*âidesoxinucleotidos de purina incluindo 6-metiltiopurina-9-JS-2·,3,-didesoxi-rxbofu-ranosido e 6-metoxipurina-9-J3-D-2* ^'-didesoxi-ribofuranosi-do e a sua utilização no tratamento ou profilaxia das infec-çSes víricas. A Especificação do Pedido de Patente Europeu No. 0286425 descreve determinados 2·,3,-didesoxinueleosidos de purina 6-substituídos e a sua utilização no tratamento ou prc> filaxia das infecçães provocadas pelo Virus da Imunodeficiência humana (HIV).

Descobriu-se, agora, que os 2’,3'-didesoxinuc-leosidos 6-substituídos, descritos na Especificação do Pedido de Patente Europeu No. 0286425 são eficazes contra o vírus da hepatite B infecciosa. Descobriu-se, para além disso, que do terminados 2 *,3'-didesoxinucleosidos 6-substituídos encontram -se abrangidos no âmbito dos compostos largamente descritos na Especificação do Pedido de Patente Europeu No. 0286425,mas que não se encontram aí especificarnente descritos, possuem uma potente actividade contra o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), o agente etiolégico da AIDS (SIDA), assim como possuem actividades contra as infecçães provocadas pelo vírus da Hepatite B.

Podem representar-se os 2',3'-didesoxinucleosidos 6-substituídos anteriormente mencionados pela seguinte fórmula geral (i)

2 =

em que o radical Rj presenta halogéneo, (como por exemplo cloro), alcoxi C^-C^ (como por exemplo, propiloxi ou isopropoxi), eventualmente substituído por exemplo, por eicloalquilo C^-C^ (por exemplo ciclopropilmetoxi); cicloalcoxi C^-Cg (como, por exemplo, ci clobutiloxi ou ciclopentiloxi); ariloxi (como, por exemplo, feniloxi) ou arilalquilo (como por exemplo benzilo) ou aral-quiloxi (por exemplo benziloxi), no qual o referido arilo po de ser eventualmente substituído por alquilo inferior, hidro-xilo ou halogéneo; ou Rg representa um grupo heterocíclico contendo um átomo de oxigénio ou um ou dois átomos de azoto e de 3-7 átomos de carbono com eventuais pontes duplas no anel (por exemplo piperidino, pirrolidino ou furfurilo) contendo, eventualmente, um heteroátomo de enxofre e/ou de oxigénio e, eventualmente substituído no anel por um ou mais grupos alquilo inferior ou pelo átomo de halogéneo, cicloalquil C^-C^-tio, aralquiltio, no qual o radical imidazolilo pode ser substituído por um grupo alquilo inferior, e/ou substituído em C com nitro; ou o radieal R^ representa um grupo amino que pode ser mono ou di-substituído por alquilo C^-C^ (como por exemplo metilo ou etilo), alcoxi C^-Cg (como por exemplo meto-xi), hidroxialquilo C^-C^ (por exemplo hidroxietilo) e/ou eicloalquilo C^-Cg (por exemplo ciclopropilo ou ciclopenti-lo), arilo (por exemplo fenilo), aralquilo (por exemplo ben zilo) no qual o grupo arilo pode ser evantualmente substituído por grupos alquilo inferior, hidroxi ou halogéneo, alilo eventualmente substituído por mono ou di-alquilo ou alcoxi (por exemplo dimetilalilo); e o radical R^ representa hidrçj génio ou amino e os seus derivados farmaceuticamente aceitáveis, diferentes do composto de formula (i) na qual os rada R^ e R^ representam hidrogénio e o radical cais senta um grupo metoxi ou um grupo metiltio. R, repre-

De acordo com a presente invenção proporciona-—se a utilização de um composto com a formula (i) anterior ou de um seu derivado farmaceuticamente aceitável na prepra-çâo de uma formulação farmacêutica para o tratamento ou profi-• laxia de infecçães provocadas pelo virus da Hepatite B. * 3 «

\ - As referências anteriores a "alquilo inferior',' designam grupos que contêm 1 a 6 átomos de carbono, de preferência, grupos metilo ou etilo. As referências a halogóneo incluem cloro, bromo, iodo e flúor, sendo especialmente pre feridos o átomo de cloro e o átomo de iodo·

As classes de composto de fórmula (l) a que se dá especial preferência incluem aqueles em que os radicais R^, Rg e R^ representam, de um modo independente os seguintes grupos, designadamente representado o radical um gru po amino; representando o radical Rg um grupo amino mono ou di-substituído, como por exemplo um grupo amino mono e/ou di--substituído por um grupo alquilo C^-Cg e/ou um grupo ciclo-alquilo; ou um grupo alcoxi C^-Cg.

Os seguintes compostos constituem exemplos de compostos de fórmula (i)j 1· 6-N-piperidinoporina-9-β-D-2',3'-didesoxi-ribof uranosido 2, 6-cloropurina-9-J3-D-2',3'-didesoxi-ribofuranosido 3. 6-etilaminopurina-9-j3-D-2',3'-didesoxi-ribofuranosido kt 6-etilmetilamino-9-Jâ-D-2',3'-didesoxi-ribofuranosido 5. 6-iodopurina-9-β-D-2*,3'-didesoxi-ribofuranosido 6. 6-ciclopropilmetilaminopurina-9-j3-D-2',3'-didesoxi-ribofuranosido 7. 6-isopropilaminopurina-9-β -D-2 *,3'-didesoxi-ribofuranosido 8. Tiamiprina-9-β-D-2',3'-dide soxi-ribofuranosido 9. 2-amino-6-n-propoxipurina-9-v/® -D-2', 3 * -didesoxi-ribofuranosido 10· 6-etiltiopurina-9-v/3-D-2',31 -didesoxi-ribofuranosido 11. 2-amino-6-benziltiopurina-9- J3-B-2',31-didesoxi-ribofurano sido 12. 6-etoxipurina-9—β -D-2',3'-didesoxi-ribofuranosido • 13. 6-dimetilaminopurina-9-,/?-D-2' ,3’-didesoxi-ribofuranosido

6-hidroxietilaminopurina-9-J3-D-2',3'-didesoxi-ribofura-nosido 6-ciclopropxlaminopurina-9-J3-D-2· ,3'-didesoxi-ribofura-nosido 6-c±clopentilaminopur£na-9-β—D-2· , 3'-didesoxi-ribofura-nosido 2-amino-6-metoxipurina-9-,/3-D-2 ·, 31 -dide soxi-ribofura-nosido 6-n-propoxipurina-9-JÔ -D-2·, 3'-didesoxi-ribofuranosido 6-n-butoxipurina-9-J3 -D-2*,3’-didesoxi-ribofuranosido 6-ciclopropilometoxipurina-9-^ -D-2*,3'-didesoxi-ribo-furanosido 6-ciclopentoxipurina-9-J3 —D—2',31-didesoxi-ribofuranosido 6-ciclo-hexiloxipurina-9-J3 -D-2 *,3'-didesoxi-ribofuranosido 6-ciclobutilaminopurina-9-J$ -D-21,3’-didesoxi-ribofura-nosido 6-dietilaminopurina-9-Jà-D-2',31-didesoxi-ribofuranosido 6-pirrolidinopurina-9-J3 -D-2',31-didesoxi-ribofuranosido 6-morfolinoporina-9-β-D-2 · , 31-didesoxi-ribofuranosido 6-dimetilalilaminopurina-9-J3 -D-2*,3*-didesoxi-ribofuranosido 6-furfurilaminopurina-9--P -D-2·,3'-didesoxi-ribofuranosido 6-benzilmercaptopurina-9--^ -D-2', 31-didesoxi-ribofuranosido 6-anilinopurina-9-Jâ-D-2· , 3 *-didesoxi-ribofuranosido 2-amino-6-etoxipurina-9-J3-D-2', 3'-didesoxi-ribofuranosido 2,6,8-triaminopurina-9--D-2',3·-didesoxi-ribofuranosido * 5 «

( 33· 2-amino-6-benzilaminopurina-9-β-D-2' ,3»-didesoxi-ribofuranosido 34. 2-amino-6-ciclopropilaminopurina-9-J3-D-2 *,3'-didesoxi- -ribofuranosido 35· 2-amino-6-me tilajninopurina-9-.JJ -D-2' ,3'-didesoxi-ribofu ranosido 36, 6-benzilaminopurxna-9-J5 -D-2', 3'-didesoxi-ribofuranosido 37· 6-isopropoxipurina-9~J& -D-2',3 *-didesoxi-ribofuranosido 38. 6-propilaminopurina~9-v/? -D-2*, 31 -didesoxi-ribofuranosido 39· 6-ciclo-hexilamino-9-j3 -D-2',3'-didesoxi-ribofuranosido 4o· 6-metxlaminopurina-9“J^-D-2*,3*-didesoxi-ribofuranosido 41. 2-amino-6-(ciclopropxlmetilamino)purina-9-J^ -D-2*,3*- -dide soxi-ribo furano s ido

Os anteriores compostos 9, 3^ © 4l, são especialmente preferidos devido à sua actividade anti-HBV sur-preendentemente elevada. 0 composto 4l, isto é 2-amino-6-(ciclopropil metilamino)purina-9-,/3 -D-2*,3'-didesoxi-ribofuranosido e os seus derivados farmaceuticamente aceitáveis são compostos novos e representam mais um dos aspectos da presente invenção. A presente invenção também englobai a) os novos compostos anteriormente definidos para utilização na terapêutica médica, por exemplo no tratamento ou profilaxia das infecçães vxricas, por exemplo por retr£ virus humanos tais como as infecçães por HIV ou as infe£ çães por HEV; e b) formulaçães farmacêuticas que compreendam os novos compostos anteriormente definidos conjuntamente com, pelo me nos, um veículo farmaceuticamente aceitável.

Descobriu-se que o composto 4l possuía uma actividade excepcionalmente potente contra as infecções provoca- t

das por HBV e HXV.

Como exemplos de infecções retrovíricas que podem ser tratadas com os novos compostos anteriormente vete ridos, de acordo com a presente invenção, incluem as infec-ções retrovíricas humanas tais como as provocadas pelo Yirus da Imunodeficiência Humana (hIY) , por exemplo HIV-1 ou HIV-2 e o Virus Linfotrópico das células T (HLTV), por exem pio infecções por HTLY-I ou HTLV-II. Gs compostos de a-cordo com a presente invenção são especialmente úteis no tra tamento da AIDS (SIDA) e situações clínicas que lhe estão associadas tal como o complexo associado à AIDS (SIDA), (ARC), linfadenopatia progressiva generalizada (PGL), situa çSes neurológicas associadas à AIDS (SIDA), tais como escle-rose múltipla ou paraparesia tropical e, ainda, situações de positividade de anticorpos anti-HIV e positivas para HIV, tais como a púrpura trombocitopónica. Também se utilizam os compostos no tratamento de psoriase.

Descobriu-se que os compostos de acordo com a presente invenção são especialmente aplicáveis no tratamen to de infecções asintomáticas ou de doenças de seres humanos originadas ou associadas a retrovirus humanos.

Daqui em diante designar-se-ão os compostos de fórmula (i) e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis como os compostos da presente invenção.

Por "um derivado farmaceuticamente aceitável” designa-se qualquer sal, éster ou sal de tal éster, farmmaceu ticamente aceitáveis de um composto de acordo com a presente invenção ou de qualquer outro composto que, após administração ao paciente, seja capaz de proporcionar (directa ou in-directamente) o composto de acordo com a presente invenção ou um seu metabolito antivírico activo ou um seu resíduo.

Os ésteres preferenciais dos compostos da presente invençáo englobam os ésteres de ácido carboxílico nos quais o radical não carboxílico do agrupamento éster se selecciona entre grupos alquilo de cadeia linear ou ramifica . da, como por exemplo, grupos n-propilo, t-butilo, n-buti- * 7 »

_-C^)j ésteres sulfonados lo, alcoxialquilo (por exemplo metoximetilo), aralquilo (por exemplo benzilo), ariloxialquilo (por exemplo fenoximetilo), arilo (por exemplo fenilo eventualmente substituído por halo-géneo, alquilo C^-C^ ou alcoxi G tal como alquilo-sulfonilo ou aralquilo-sulfonilo (por exemplo metano-sulfonilo); ésteres de aminoácidos (como por exem pio L-valilo ou L-isoleucilo); e, ésteres de 5'-mono, di ou trifosfato.

No que se refere aos ésteres anteriormente rje feridos, salvo indicação em contrário, qualquer radical alquilo presente, contém de um modo vantajoso, de 1 a 18 átomos de carbono, especialmente de 1 a b átomos de carbono. Qualquer radical arilo arilo presente nestes ésteres compreende, de um modo vantajoso, um grupo fenilo.

Qualquer referencia aos compostos anteriormen te referidos inclui, também, a referência a um sal farmaceutá. camente aceitável.

Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos de acordo com a presente invenção e dos seus dje rivados, por exemplo, de uma base adequada, tais como os sais de metal alcalino (por exemplo sódio), de metal alca^ino-ter roso (como por exemplo magnésio) de amónio e de NXIj. (em que X representa alquilo C^-C^). Os sais farmaceuticamente aceitáveis de um átomo de hidrogénio ou de um grupo amino, incluem os sais de ácidos carboxílicos orgânicos tais como os á-cidos acético, láctico, tartárico, málico, isetiónico, lactobiónico e succínicoj os sais de ácidos orgânicos, sulfó nicos, tais como os ácidos metano-sulfónico, etano-sulfóni-co, benzeno-sulfónico e p-tolueno-sulfónico e de ácidos i-norgânicos tais como os ácidos clorídrico, sulfúrico, fosf£ rico e sulfâmico. Os sais farmaceuticamente aceitáveis de um composto com iam grupo hidroxi incluem o anião do referido com posto em combinação com um catião adequado tal como Na , NH^ e NX^ (em que X representa o grupo alquilo C^-C^·

Exemplos específicos de derivados farmaceuticamente aceitáveis de compostos de fórmula (i) que se podem = 8 = Λ

utilizar de acordo com a presente invenção incluem o sal de mono-sódio e os seguintes 5'-ésteres: monofosfato de di-sódio; difosfatos; acetato; 3-butil-butirato; octanoatoj palmitato; 3-cloro-benzoatoj *Mnetil-benzoato$ succinato de hidrogénio j pivalatoj propionatoj valerato e mesilato.

Podem empregar-se os compostos anteriores, de acordo com a presente invenção, e os seus derivados farmaceuti camente aceitáveis em combinação com outros agentes terapêuticos no tratamento e profilaxia das infecções e situações ante-riormente referidas. Podem administrar-se os compostos componentes de tal terapia combinada, simultaneamente, em formulações separadas ou combinadas, ou em diferentes alturas, por e-xemplo, sequencialmente de tal modo que se consiga um efeito combinado.

Podem administrar-se terapeuticamente, os com postos, de acordo com a presente invenção, aqui também designa dos ingrediente activo, de acordo com qualquer das vias adequa das incluindo as vias oral, reetal, nasal, tópica (incluindo a bucal e a sub-lingual), vaginal ou parenteral (incluindo a subcutânea, intramuscular, intravenosa e intradérmica. Verá. ficar-se-à, também, que a via preferencial variará, com a situação e idade do paciente, com a natureza da infecção e com a escolha do ingrediente activo.

De um modo geral, tuna dose adequada encontrar -se-à compreendida entre 3»0 e 120 mg por quilograma de peso corporal do paciente, por dia, de preferência entre 6 e 90 mg por quilograma do peso corporal, por dia, e, mais preferencial^ mente no intervalo compreendido entre 15 e 60 mg, por quilogra ma de peso corporal, por dia. A dose desejada apresenta-ee de modo preferencial como duas, três, quatro, cinco ou mais sub--doses administradas a intervalos adequados, ao longo do dia. Podem administrar-se estas sub-doses sob formas de dosagem uni tária, contendo, por exemplo, de 10 a 1500 mg, de preferência, de 20 a 1000 mg e, mais prefereneialmente entre cerca de 50 e 700 mg de ingrediente activo, por forma de dosagem unitária.

De um modo ideal, administrar-se-à o ingredi- 9 =

ente activo de modo a atingir-se concentrações plasmáticas em pico do ingrediente activo que se situam entre 1 e 75 /iM, e, preferencialmente, entre aproximadamente 2 e 50 ^uM, mais preferencialmente, entre aproximadamente 3 e 30 /íM. Pode atingir-se esta situação, por exemplo, por injecção intravenosa de uma solução entre 0,1 e 5$ do ingrediente activo, eventualmente, solução salina, ou por administração oral, por exem pio, sob a forma de um comprimido contendo aproximadamente en tre 1 e 100 mg/kg do ingrediente activo. Podem conservar-se os níveis sanguíneos desejados por infusão contínua, de modo a proporcionar entre 0,01 e 5,0 mg/kg/hora, aproximadamente ou por infusões intermitentes contendo entre aproximadamente 0,4 e aproximadamente 15 mg/kg do ingrediente activo.

Embora seja possível administrar-se apenas o ingrediente activo é preferível que este se apresente sob a forma de tuna formulação farmacêutica. As formulações da pre sente invenção compreendem, pelo menos um ingrediente activo, tal como anteriormente definido, conjuntamente com pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável e, eventualmente com outros agentes terapêuticos. Todos os veículos devem ser far maceuticamente aceitáveis no sentido de serem compatíveis com outros ingredientes de formulação e não prejudiciais para o paciente. As formulações incluem as que são adequadas para administração oral, rectal, nasal, tópica (incluindo a bucal e sub-lingual), vaginal, ou parenteral (incluindo a sub--cutânea, intramuscular, intravenosa e intradérmica)*Às for mulações podem apresentar-se, de um modo conveniente, sob a forma de dosagem unitária e podem ser preparadas de acordo com qualquer dos métodos bem conhecidos na especialidade farmacêutica. Tais métodos incluem o passo de associar o ingrediente activo com o veículo que é constituído por um ou mais ingredi entes acessórios. De um modo geral, preparam-se as formula ções efectuando, uniforme e intimamente, a associação do ingrediente activo com veículos líquidos ou em veículos sólidos finamente divididos ou com ambos e, moldando, se necessário, o produto.

As formulações da presente invenção, adequa- 10 « i

das para administração oral, podem apresentar-se sob a forma de unidades discretas tais como cápsulas, comprimidos, pílu las, contendo cada um deles uma quantidade previamente deter minada de ingrediente aetivo; como um pó ou grânulos; como uma solução ou suspensão num líquido aquoso ou.-iíão aquoso; ou como uma emulsão líquida de óleo-emágua ou como uma emulsão líquida de água-em-óleo. Também se pode apresentar o ingrediente aetivo sob a forma de um comprimido, de um eleetuário ou uma pasta.

Pode preparar-se um comprimido por compres» são ou moldagem, eventualmente com um ou mais ingredientes a cessórios. Podem preparar-se os comprimidos, comprimindo, num dispositivo adequado o ingrediente aetivo sob a forma de fluxo livre, como um pó ou grânulos, eventualmente misturado com um ligante (como por exemplo povidona, gelatina, hidro xipropilmetil-celulose, um lubrificante, um diluente inerte, um conservante, um agente de desintegração (por exemplo amido-glieolato de sódio, povidona ligada de modo retjL culado, carboximetil-celulose de sódio reticulada), um agen te aetivo de superfície ou um agente de dispersão. Podem fa bricar-se os comprimidos moldados num dispositivo adequado uma mistura de compostos reduzidos a pó, humectados com um diluente líquido inerte. Pode, eventualmente, revestir-se ou marcar-se os comprimidos e podem formular-se de modo a proporcionarem uma libertação lenta ou controlada do ingredi ente aetivo aí utilizado, por exemplo hidroxipropilmetil-ce lulose em proporçães variáveis, para se obter as caracterís-ticas de libertação desejadas. Bodem eventualmente prover--se os comprimidos com um revestimento entérico, para propor cionar a libertação em porçães do tracto gastro-intestinal diferentes do estômago. Isto torna-se particularmente vanta joso para os derivados dos núcleosidos púricos, uma vez que estes compostos são sensíveis à hidrólise ácida.

As formulaçães adequadas para administração tópica, na boca, incluem rebuçados, que compreendem o in grediente aetivo numa base aromatizante, habitualmente sacarose e, acácia ou goma acantina; pastilhas que compreendem o - 11 *

ingrediente activo numa base inerte tal como gelatina e glicerina ou sacarose e acácia; e elixires que compreendem o ingrediente activo num líquido adequado.

As formulações para administração por via rectal podem apresentar-se como um supositório com uma base adequada que consiste, por exemplo em manteiga de cacau ou num salicilato.

As formulações adequadas para administração vaginal, podem apresentar-se sob a forma de pessários, tampões, cremes, geles, pastas, espumas, aspersões, contendo em adição ao ingrediente activo veículos que se sabe, na especialidade serem os adequados.

As formulações adequadas para administração parenteral, incluem soluções injectáveis esterilizadas, iso-tónicas aquosas e não aquosas, que podem conter anti-oxidan-tes, tampões, bacteriostatos e solutos que tornam a formula Ção isotónica com o sangue do receptorj e suspensões esteri lizadas aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes. As formulações podem apresentar-se em recipientes vedados de dose única ou de multi--dose, por exemplo, ampolas e pequenos frascos e podem ser armazenadas depois de secas por congelamento (liofilizadas), necessitando, apenas da adição de um veículo líquido esterilizado, como por exemplo água para injecção, imediatamente antes de se utilizarem. Podem preparar-se soluções e suspen sões extemporâneas a partir de pós, grânulos e comprimidos, esterilizados de modo previamente descrito.

As formulações preferenciais de dose unitária são as que contêm uma dose diária ou unidade, uma sub-djo se diária, tal como anteriormente referido, ou uma fracção adequada de um ingrediente activo.

Os compostos, de acordo com a presente invenção, podem também apresentar-se, para utilização, sob a forma de formulações veterinárias, que se podem preparar por exemplo, de acordo com os métodos convencionais na especialidade . * 12

Deverá entender-se que para além dos ingredi entes especialmente referidos antes, as formulaçães da presen te invenção podem incluir outros agentes convencionais na especialidade, tendo em conta o tipo de formulação em questão; as adequadas para administração oral poderão incluir, por e-xemplo, agentes adicionais, como agentes edulcorantes, espes-santes e aromatizantes. A presente invenção inclui também, um procejs so para a preparação do composto de acordo com a presente invenção e dos seus derivados farmaceuticamente aceitáveis, que consiste emí A fazer reagir um composto de fórmula

(em que os radicais R^, R^ e R^ se encontram em concordância com o anteriormente definido ao símbolo A representa um grupo precursor do grupo hidroxi, ou de um grupo de um seu de> rivado farmaceuticamente aceitável) com um agente ou sob con-diçães favoráveis à conversão do referido grupo precursor no grupo desejado, correspondente; ou B) fazer reagir uma base púrica de fórmula B - H (III) (em que o símbolo B representa o radical púrico necessário = 13 =

_ de um composto de acordo com a presente Invenção). ou um seu equivalente funcional, com um composto que serve para introduzir o anel de ribofuranosilo desejado na posição 9 da base púrica de fórmula (lll)} e depois, ou em simultâneo, efectuar uma ou mais das seguintes eventuais eonversãesi (i) quando se forma um composto de fórmula (i), convertê--lo num seu derivado farmaeeuticamente aceitável, (ii) quando se forma um derivado farmaeeuticamente aceitável de um composto de fórmula (i), converter o referido derivado num composto de fórmula (i) ou num seu derivado diferente.

No processo anteriormente descrito, de acordo com a presente invenção, deverá ter-se em conta que os compostos precursores de fórmula (l) assim como os agentes e si tuaçães anteriormente mencionados seleccionar-se-ão entre os conhecidos na especialidade química de síntese nucleosídica. Adiante, efectuar-se-à a descrição de tais procedimentos de conversão, a título de esclarecimento e, deverá entender-se que podem modificar-se os referidos procedimentos de acordo com procedimentos convencionais dependendo do composto de fórmula (i) que se pretenda. De um modo particular, quando se descreve uma conversão que poderia de modo adverso originar a reacçâo indesejável de grupos lábeis, então dever-se-à proteger esses grupos de modo convencional, com subsequente remoção dos grupos de proteeção após ter-se completado a conversão.

No que se refere ao processo A), o símbolo A pode representar um grupo de proteeção hidroxi, como por e-xemplo um agrupamento éster do tipo referido anteriormente em relação à fórmula (l) especialmente acetoxi ou um grupo éter tal como um grupo trialquil-sililoxi, por exemplo t-butildi-metil-sililoxi ou um grupo aralcoxi, como por exemplo trife-nilmetoxi. Podem converter-se tais grupos, por exemplo por hi drólise do grupo hidroxi desejado ou, por transesterificação, • de um grupo éster alternativo. B Ik *

— No que se refere ao processo B), pode pre- parar-se, por exemplo, tratando com uma base púrica adequada de fórmula (lll) ou um seu sal ou derivado protegido, tal como por exemplo 3,-dcsoxitimidina na presença de um enzima de transferência de pentosilo, adequado» Pode converter-se um composto de fórmula (i) num fosfato farmaceuticamente aceitável ou noutro éster por reacção com, respectivamente um agente de fosforilação adequado, como por exemplo, POCl^ ou com um agente de esterificação adequado, como por exemplo um halo-gento ácido ou um anidrido» Pode converter-se o composto de fórmula (i) incluindo os seus ésteres, nos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, de acordo com os métodos convencionais, por exemplo, por tratamento com uma base adequada. Pode converter-se um éster ou um sal de um composto de fórmula (i) no composto da mesma família, por exemplo por hidrólise. ^ornecem-se os seguintes Exemplos apenas com fins ilustrativos não devendo de modo algum limitar o âmbi to da presente invenção. Os termos "ingrediente activo" tal como se utiliza nos Exemplos, designa um composto de fórmula (I) ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável.

Exemplo 1 6-N-piperidinopurina-9-J3 -2*«3*-didesoxi-ribofuranosido

Dissolveu-se 6-N-piperidinopurina (2,41 mmol, 0,5 g, Sigma Chemicals, St. Louis MO) em 10 ml de dim£ til-sulfóxido, com elevação da temperatura. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, adicionou-se 3'-desoxitimidina (3,62 mmol, 0,82 g) (Howitz, J.P. e outros, J. Org. Chem. 31. 205 (1966)) em simultâneo com 30 ml de fosfato de potássio tampão 10 mM com um pH de 6,8 contendo 0,04 $ de azida de po tássio.

Adicionou-se timidino-fosforilase (10 000 l.U.) e purina-nucleosido-fosforilase (20 000 l.U.) (Krenit-sky T.A. e outros, Biochemistry, 20, 3615» 1981 e Patente dos

Estados Unidos 381 3^*0 adsorvidas em 10 ml de celulose de • DEAE (Whatman) e, agitou-se a suspensão a 35°C. Decorridas 8 = 15 =

horas, filtrou-se a reacção, e aplicou-se o filtrado numa série de colunas acopladas. A coluna inicial continha resina sob a forma de hidróxido de AGI X2 (2,5 x 10 cm) enquanto que se encheu a segunda coluna com resina sah a forma Amberlite XAD-2 (2,5 x 20 cm). Após a aplicação das amostras, lavaram--se as colunas com um grande volume de água e eluiu-se 0 produto com metanol. Após remossão do solvente e redissolução em clorofórmio : metanol (9 * 1, v/v), efectuou-se uma outra cr£ matografia numa coluna contendo gel de sílica ( 5 x 20 cm). A fase móvel era constituída por clorofórmio : metanol (9 ϊ 1» v/v). Combinaram-se as fracç5es contendo o produto, dissolveram-se novamente em etanol e, filtraram-se através de um filtro de 0,22. Evaporou-se o etanol e dissolveu-se novamente o produto em água. Após liofilização, obteve-se 6-N-piperidinç> purina-9--2',3'-didesoxi-ribofuranosido (0,265 g) que se a-nalisou, verificando-se que se encontrava sob a forma de 0,1 hidrato que continha 0,3 equivalentes de etanol.

Análise Calculado para ci5H21N5°2 C2H6° *

Calculado i C, 58,74; H, 7,27; N, 21,96 Encontrado: C, 58,86} H, 7,14; N, 2182 BMN í 8,36 (s, 1 H, Hg), 8,19 (s, 1 H, Hg), 6,23 (dd, 1 H, H^, 5,01 (t, 1 H J = 5,5**, 0H5,), 4,12 (m, 3 H, Hv CHg), 3,52 (m, 2 H, H^), 2,37 (m, 2 H, H2,), 2,04 (m, 2 H, Ey ), l,6l (l, 6 H, 3 CHg).

Exemplo 2 6-cloropurina-9- β-2* ^-didesoxi-ribofuranosido

Efectuou-se a síntese de 6-cloropurina-9--β-D-2·,3’-didesoxi-ribofuranosido tal como se descreveu no Exemplo 1 com excepção de se ter dissolvido o composto 6-clc> ropurina (Sigma Chemicals, St. Louis Mo) em 5 ml de dimetil-formamida e 5ml de dimetoxietano.

Após filtração dos sólidos, reduziu-se o = l6 =

filtrado para 5 ml sob vácuo e, depois, dissolveu-se em 100 ml de água. Efectuou-se a cromatografia deste material numa coluna de 2,5 x 20 cm contendo resina XAD-2. Após lavagem desta coluna com 500 ml de água, eluiu-se o produto com metanol. Combinaram-se as fracçães contendo o produto e adicionou-se 20 ml de gel de sílica seco. Removeram-se todos os solventes sob vácuo. Aplicou-se o gel de sílica seco no topo de uma coluna de gel de sílica equilibrada com clorofórmio : metanol (9 · 1» v/v). Combinaram-se as fracçães contendo produto isentas de desoxitimidina e, após remoção do solvente sob vácuo dissol-veu-se o resíduo com etanol, filtrou-se, depois, dissolveu-se em água e liofilizou-se. Purificou-se depois este material por cromatografia, numa coluna contendo resina Polygosil C^g em metanol : água (8 : 2, v/v). Após remoção do solvente sob vácuo, dissolveu-se o produto em água e liofilizou-se proporcionando 0,199 g de 6-cloropurina-9-;Q-D-2’ ,3*-didesoxi-rib<> furanosido (p.f. « 100°C. Cálise Calculado para C^QÍí^ClN^Qg :

Calculado : C, 47,16*, H, M5i N, 22,005 Cl, 13,92 Encontrado: C, 47,105 H, 4,35! N, 21,9^J Cl, 13,86

Exemplo 3 6-etilaminopurina-9-j3 -D-21.3‘-didesoxi-ribofuranosido

Combinou-se 6-etil-aminopurina (preparada por substituição nucleofílica do grupo cloro de 6-cloropuri-na (Sigma Chemicals, St. Louis Mo) pelo grupo amino de etil-amina) (2,69 mmol, 0,5 g) e 3‘-desoxitimidina (Horwitz, J.P. e outros J. Org. Chem. 31» 205 (1966) (3*37 mmoles, 0,75 g) com 50 ml de tampão fosfato de potássio 10 mH com um pH de 6,8, contendo 48 fo de azida de potássio. Adicionou-se timidino-fosforilase purificada (400 I.U.) e purina-nucleosi-do-fosforilase (700 I.U.) e agitou-se a suspensão a 37°C. D<s corridas 48 horas adicionaram-se mais 700 unidades de purina--nucleosido-fosforilase e 400 unidades de timidino-fosforila-4 se e, agitou-se a reacção a 37°C. Decorridos cinco dias fil- = 17 = ) hj|. «*

trou-se a mistura de reacção e apliçou-se o filtrado numa colji na contendo resina sob a forma de hidróxido de AG-1 X2 (2,5 x x 10 cm), Eluiu-se o produto lavando com água e efectuou-se a sua cromatografia sobre ;resina Amberlite XAD-2 (2,5x20cm). Após aplicação da amostra, lavou-se esta coluna com um grande volume de água. Eluiu-se o produto com metanol. Após remoção do solvente, dissolveu-se, novamente, o produto em água e acetona e, depois, liofilizou-se proporcionando 0,299 g de 6--etilaminopurina^-JS-D-a*,3'-didesoxi-ribofuranosido que se analisou, verificando-se que continha 0,2 água e 0,1 acetona, (p.f. = >30°C, /Jtf20°C « 29,^5°C (0,5, DMF) .

Análise Calculada para 0,2 H^O 0,1 C3H60 : Calculada s C, 54,17} H, 6,64; N, 25,68 Encontradas C, 54,13} H, 6,69 } N, 25,75

Exemplo 4 6-etilmetilaminopurina-9-P-D-21«3*-didesoxi-ribofuranosido 0 procedimento de síntese de 6-etilmetilami-nopórina-9-jB-0-2',3*-didesoxi-ribofuranosido, foi idêntico ao do Exemplo 2. Piltrou-se a reacção e, aplicou-se o filtrado nu ma coluna Dowex-l-hidróxido (2,5 x 10 cm). Eluiu-se o produto com 90 i> de uma mistura de metanol/água (v/v) e cromatogra-fou-se sobre resina Amberlite XAD-2 (2,5 x 20 cm) após remoção do solvente em ~5 ml e redissolução em água (100 ml). A-pós aplicação da amostra, lavou-se a coluna com um grande volu me de água e eluiu-se o produto com uma mistura etanol/água a 95 Í> (v/v). Combinaram-se as fracçães contendo o produto e a-dicionou-se 20 ml de gel de sílica. Removeram-se todos os solventes no vácuo. Aplicou-se o gel de sílica seco no topo de uma coluna de gel de sílica (4,8 x 20 cm) equilibrada com uma mistura de clorofórmio/metanol (98 * 2 $, v/v), Combinaram--se as fracçSes contendo o produto e, após remoção do solvente sob vácuo, dissolveram-se em primeiro lugar em etanol e fil , traram-se. Após remoção do solvente, dissolveram-se, novamen-

S 18 B 1

vamente, em água, liofilizou-se a solução que proporcionou 0,3g de 6-etilmetilamino-9-/J-D-2 *,3 *-didesoxi-ribofuranosil-purina que se analisou, verificando-se que se encontrava sob a forma de um 0,05 hidrato (p .f. •C 30°C) • Análise Calculado para c!3 H19N5°2 ' 0,05 H20 : Calculado : C, 56 ,12| H, 6,92$ N, 25,17 Encontrado : C, 56 ,12( H, 6,94? N, 25,14 RMNí J 8,36 (s , 1 H, Hg), 8,19 (s, 1 H, H2) , 6.23 (dd, 1 Η, Ηχ, ) 9 5,05 (t, 1H, J « 5 ,58, 0H5‘ ), *,o. (m, 1, H, H^, ) 9 4,08 (m, 2 H, CH2) , 3,51 ( m, 2 H, H5'), 3,33 (s, 3 H, CH3), 2,4l (m , 2 H, H2 2,03 (m, 2 H, : «3, ), 1,14 (t, 3H, J * 7,01, ch3).

Exemplo 5 6-iodopurina-9-P-D-21.31-didesoxi-ribofuranosido

Combinou-se 6-iodopurina (0,624 g, 2$k m-moles, Sigma Chemicals, St, Louis MO) e 3,-desoxitimidina 0,71 g» 3»13 mmoles) (Horwitz, J, P, e outros J, Org. Chem, 31« 205 (1966) com 700 ml de tampão fosfato de potássio 10 mM, a pH 6,8, contendo 0,04 $ de azida de potássio. Adicionou-se timidino-fosforilase purificada (2 000 I.U,) e purina-nucleos^ do-fosforilase purificada (7 000 I.U.) (Krenitsky e outros, Bio chemistry, 20, 3615, 1981 ® Patente dos Estados Unidos 4 381 344) ® agitou-se a suspensão a 37°0. Decorridas 48 horas filtrou-se a mistura de reacção e secou-se o filtrado no vácuo. Dissolveu-se o resíduo, resultante, em etanol/água a 95 $ (v/v) e após adição de ^20 ml de gel de sílica, removeu-se o solvente sob vácuo. Aplicou-se sílica seca no topo de uma coluna de gel de sílica (2,8 x 50 cm) e eluiu-se o produto com clorofór-mio/metanol (95 í 5» v/v), Combinaram-se as fracçães que continham apenas o produto e removeu-se o solvente sob vácuo, Dis-solveram-se novamente em etanol e filtraram-se através de um • filtro 0,22, Após a remoção da maior parte do etanol e adição = 19 = ‘Λ?

de -25 ml de água, liofilizou-se o material, o que proporcionou 0,88 g 6-±odopurina-9- -D-2·,3'-didesoxi-ribofuranosido que se analizou, verificando-se que se encontrava sob a forma de um 0,2 hidrato (p.f. = 15l-153°C).

Análise Calculado para 4°2 °,2 H20 t Calculado t C, 35,15» H, 3,46; N, 15,77 Encontrado $ C, 35,31; H, 3,31? N, 15,83

Exemplo 6 6-ciclopropilmetilaminopurina-9- -D-2* «S^didesoxi-ribofura-nosido

Preparou-se 6-ciclopropilmetilaminopurina por substituição nucleofxlica do grupo cloro de 6-eloropurina (Sigma Chemicals, St, Louis MO) pelo grupo amino de ciclopro-pilmetilamina (Karl Industries, Aurora, OH),

Dissolveu-se 6-ciclopropilmetilaminopurina (2,64 mmoles), (0,50 g) em 5 ml de dimetilformamida. Após arrefecimento ate à temperatura ambiente, adicionou-se 3»-desoxi; timidina (3,88 mmol, 0,90 g) (Horwitz, J. P. e outros, J. Org, Chem. 205 (1966) conjuntamente com 30 ml de tampão fosfato de potássio 10 mM com um pH de 6,8, contendo 0,04 $ de azida de potássio. Adicionou-se timidinofosforilase (10 000 I«U.) e purina-nucleosido-fosforilase (20 000 I.U.) (Krenitsky T.A, e outros, Biochemistry 20, 3615, 1981 e Patente dos Estados

Unidos 4 381 344 adsorvidas em 10 ml de celulose DEAE (What-man) e, agitou-se a suspensão a 35°C. Decorridas 8 horas fil-trou-se a mistura de reacção e, aplicou-se o filtrado numa série de colunas acopladas. A coluna inicial continha resina AG1-—X2 (forma OH), 2,5 x 10 cm, enquanto que a segunda coluna con tinha resina Amberlite, 2,5 x 20 cm. Após ter-se aplicado a amostra, lavaram-se as colunas com 500 ml de água e eluiu-se o produto com metanol. Depois efectuou-se a cromatografia ultra— -rápida do produto, numa coluna de gel de sílica, 5 x 20 cm, com uma mistura de clorofórmio s metanol (9 s 1, v/v). Removeu -se o solvente no vácuo e transferiu-se o produto, sob a forma 20 *

de uma goma em acetona para uma ampola, A liofilização proporcionou 0,588 g de 6-ciclopropilmetilaminopurina-9-.3-D-2‘,3»--didesoxi-ribof uranosido que se analisou, verificando-se que continha 0,15 equivalentes de água e 0,15 equivalentes de acje tona.

Análise Calculada para C^tL^N^Og 0,15 HgO 0,15 C^H^O :

Calculado : 0, 57,715 H, 6,77; N, 23,29 Encontrado : C, 57,73; H, 6,94; N, 23,39

Exemplo 7 6-isopropilaminopurina-9- B-D-21,3<-didesoxi-ribofuranosido

Efectuou-se a síntese de 6-isopropilaminopu-rina-9- $-D-2*,3*-didesoxi-ribofuranosido tal como se descreveu no Exemplo 1, com excepçâo de se ter dissolvido o composto 6-i-sopropilaminopurina(preparada a partir de 6-cloropurina,(Sigma Chemicals, St, Louis, MO) e de isopropilamina) em 5 ml de dime-tilformamida e em 5 ml d® dimetilsulfóxido.

Após liofilização, analizou-se 6-isopropila-minopurina^-jS-D-S1,3,-didesoxi-ribofuranosido (0,502 g) , veri ficando-se que se encontrava sob a forma de um 0,2 hidrato (p.f. = 55-57°C).

Análise Calculada para C-^H^N^Og 0,2 H^O í

Calculado ·. C, 55,585 H, 6,96} N, 24,93 Encontrado : C, 55,54; H, 6,96? N, 25,01

Exemplo 8

Tiamiprina-9-£-D-2 *,3 *-didesoxi-ribofuranosido

Dissolveu-se Tiamiprina (Burroughs Wellcome Co, Research Triangle Park NC) (0,5 g) em 2,5 ml de dimetil-sulfóxido e em 15 ml de dimetoxietano e combinou-se com 3'-de-soxitimidina (0,8 g) (Horwitz), (J.P. e outros, J. Org. Chem. 31, 205 (1966)) em 30 ml de tampão fosfato de potássio 30 mM - 21 * > com um pH de 6,8. Adicionou-se timidino-fosforilase (l6 000 I. U.) e purina-nucleosido-fosforilase (70 000 I,U») (Krenitsky T.A. e outros, Biochemistry 20. 3615, 19^1 e Patente dos Es tados Unidos 4 381 344) e, agitou-se a suspensão a 35°C. Decor ridas 96 horas filtrou-se a mistura de reacção e, reduziu-se o volume no vácuo até se obter um xarope. Adicionou-se água (25 ml) e guardou-se a solução durante a noite a 3°C. Recolheu-se o precipitado por diltração, efectuou-se a sua suspensão em 5 ml de dimetilformamida e, filtrou-se. Adicionou-se ao filtrado 15 ml de etanol e, armazenou-se a solução a -20°C. Decorridos 5 dias recolheram-se os sólidos por filtração, dissolveram-se em 65 $ de uma mistura de metanol/água v/v) e cromatografaram--se sobre resina sob a forma de hidróxido de AG-1 X2. Eluiu--se o produto com uma mistura de metanol/água a 65 $ v/v).Após remoção do solvente no vácuo, dissolveram-se os sólidos numa mistura de 20 ml de clorofórmio/metanol (9 5 l) e efectuou-se a sua cromatografia sobre gel de sílica ( 3 x 50 cm) equilibrada com uma mistura de clorofórmio/metanol (9 i 1, v/v). Combi-naram-se as fracçães contendo o produto e removeu-se o solvente no vácuo. Removeu-se o gel de sílica residual, do produto, por dissolução numa mistura de etanol/água a 95 f<>$ (v/v) e, filtran do através de um filtro 0,22. Evaporou-se o etanol e adicionaram-se rv/· 200 ml de água. Liofilizou-se a suspensão resultante proporcionando 0,056 g de tiamiprina-9-/? -D-2' ,3’-didesoxi-ribc> furanosido que se analisou, verificando-se que se encontrava sob a forma de um 0,4 hidrato e que continha 0,7 equivalentes de metanol (mp - 130°C, fusão parcial a 110°C).

Análise Calculado para C^H^SN gV4 H2° °>7 CH4° • • Calculado : C, 4l,84; H,4,68; s, 7,6o; N, 26,55 Encontrado : C, 41,93; H, 4,43; S, 7,48; N, 26,34

Exemplo 9 2-amino-6-n-propoxjpurina-9-β-D-21«3,-didesoxi-ribofuranosido

Combinou-se 2-amino-6-n-propoxipurina (prepa rada por substituição nucleofílica do grupo cloro de 2-amino- 22 »

-6-cloropurina (Aldrich Chemical, Co., Milwaukee W,l) pelo ani-ao alcoxi formado entre o hidreto de sódio e propanol) (θ,21 g) e 3'-desoxitimidina (0,29 g) (Horwitz, J.P. e outros, J. Org. Chem. 31, 205 (1966), em 100 ml de fosfato de potássio, a pH 6,8 com 0,04 $> de azida de potássio. Adicionou-se timidino-fos. forilase (1200 I.U.) e purina-nucleosido-fosforilase (8400 I. U.) (Krenitsky, T.A. e outros, Biochemistry 20. 3615, 1981, e Patente dos Estados Unidos 4 381 444), purificadas e, agitou--se a suspensão a 35°C. Decorridas 48 horas, filtrou-se a reac ção e efectuou-se a cromatografia do filtrado numa coluna contendo resina sob a forma de hidróxido de AG-1 X2 (2x5 cm), Eluiu-se o produto com uma mistura de metanol/água a 90 Io (v/v). Removeu-se o produto com uma mistura de metanol/água a 90 $· Re moveu-se o solvente no vácuo e, dissolveu-se o resíduo em metanol. Adicionou-se 10 ml de sílica seca e, removeu-se o metanol sob vácuo. Aplicou-se o gel de sílica seco, numa coluna de gel de sílica (2,5 x 30 cm) equilibrada com uma mistura de cloro-fórmio/metanol (9 í 1, v/v), Este foi também o solvente de e-luiçâo. Combinaram-se as fracçSes que continham apenas o produ to e removeu-se o solvente no vácuo* Removeu-se o gel de sílica residual e, secou—se o produto tal como se descreveu no Exemplo 8. Obtiveram-se deste modo, 0,132 g de 2-amino-6-n-propo-x±purxna-9-£$-D-21 ,3’-didesoxi-ribofuranosido que se analisou, verificando-se que se encontrava sob a forma de um 0,2 hidrato (pf * 70°C).

Análise Calculado para : C^H^N^O^ °»2 *

Calculado ϊ C, 52,91? H, 6,56? N 23,73 Encontrado s C, 52,52? H, 6,62? N 23,49

Exemplo 10 6-etiltiopurjna-9~ /β-Ρ-2»,3f-didesoxi-ribofuranosido

Efectuou-se uma suspensão de 6-etiltiopuri-na (5,5 mmoles, 1 g) que se obteve da Sigma Chemical Co., St. Louis MO e de 3,**desoxitimidina (4,47 mmoles) (Horwitz, J.P. * 23 *

e outros, J. Org. Chem. 31, 205 (1966)) em 50 ml de uma solução de fosfato de potássio 15 mM com um pH de 7«2, Adicionou--se timidino-fosforilase (7 890 I.U.) e purina-nucleosido-fosforilase (1980 I.U.) (lírenitsky T.A. e outros, Biochemis try 20. 3615» 1981 e Patente dos Estados Unidos 4 381 344) purificadas e agitou-se a suspensão a 35°C. Decorridas 144 ho ras filtrou-se a mistura de reacção e armazenou-se o filtrado a -20°C. Após descongelamento, ajustou-se o filtrado para pH 10,7 com hidróxido de amónio e efectuou-se a sua cromatogra-fia numa coluna que continha resina Dowex-l-formato (2,5 x x 8 cm)· Eluiu-se esta coluna com uma mistura de n-propanol/ /água a 30 ήα (v/v). Combinaram-se as fracçães contendo o produto e removeu-se o solvente no vácuo. Dissolveu-se o resíduo numa mistura de n-propanol/água a 30 (v/v) e efectuou-se a sua cromatografia numa coluna contendo BioRad P-2 (5 x 90 cm). Eluiu-se o produto a partir de uma coluna, com n-propanol/água a 30 c/o (v/v) . Combinaram-se as fracçães contendo o produto e removeu-se o solvente sob vácuo, o que proporcionou 0,427 g de 6-etiltiopurina-9- /3-D-21,31-didesoxi-ribofuranosido que se analisou, verificando-se que se encontrava sob a forma de um 0,5 hidrato.

Análise Calculado para ^12^1(^1^2^H2° *

Calculado : C, 4-9,81} H, 5,92} N, 19,36} s, 11,44 Encontrado s C, 49,63} H, 5,95? N, 19,28} s, 11,06 Dados de RMN í £ 8,71 (s,1H, h8), 8,67 (s, 1H, tí2) , 6.33 (t» 1H, ^0, 4,1 (m, 2H, ÒH, V> , 3,4- 3,6 (m, 2H, 5’CH2,) 1,8- -2,4 (m, 4H , 2· e 3’CH2), 1, 5* (t, 3H, ch3).

Exemplo 11 2-amino-6-benziltiopurina-9-^-D-2».3l-ritofuranosido

Dissolveu-se 2-araino-6-benziltiopurina (l,9 mmoles, 0,5 g) que se obtiveram de Sigma Chemicals Co, St. Louis, Mo, e S^desoxitimidina (2,0 mmoles, 0,543 g) (Horwitz - Zk ~

J.P. e outros J. Org, Chem. 31 205 (1966)) em 20 ml de tampão fosfato de potássio 10 mM, a pH 7» contendo 0,04 $ de azida de potássio. Adicionou-se timidino-fosforilase (2 9000 I.U.) (Krenitsky T.A. e outros, Biochemistry 20. 3615, 1981 e Paten te dos Estados Unidos 4 381 344), purificadas e, agitou-se a suspensão a 35°0. Decorridos 3 dias, adicionou-se 8o ml de tampão fosfato de potássio 10 mM, a pH 7· Um dia depois, fil^ trou-se a reacção. Dissolveu-se o filtrado numa mistura de me tanol/água a 90 (v/v) e efectuou-se a cromatografia do fil trado numa coluna de 2,5 x 10 cm contendo Doex-l-hidróxido. Eluiu-se o produto a partir da coluna com uma mistura de meta— nol/água a 90 fo (v/v). Combinaram-se as fracçães contendo o produto e, após liofilização obteve-se 0,086 g de 2-amino-6--benziltiopurina-9- |3-D-2*,3 *-didesoxi-ribofuranosido.

Análise Calculado para : C, 57,13; H, 5,36; N, 19,59; S, 8,97 Encontrados C, 57,02; H, 5,39; K, 19,51; S, 8,89

Dados de RMN : é 8,18 (s, 1 H, Hg), 7,3 (m, 5 Η, φ ), 6,6 (s, 2H, NH2), 6,08 (dd, 1 Hlf)f 4,93 (l, 1 H, 5' OH), 4,45 (1, 2H, CH2), 4,08 (m, 1H, H^'), 3,43-3,65 (m, 2 H, 5' CH2), 2,0 (m, 2 H, 3' CH2).

Exemplo 12 6-etoxi-purina-9-/S -D-21.3*-didesoxi-ribofuranosido

Efectuou-se uma suspensão de 6-etoxipurina (3,0 mmoles, 0,5 g í Sigma Chemicals, Co., St. Louis, Mo) e 3«-desoxitimidina (3,3 mmoles, 0,75 g) (Horwitz, J.P. e outros, J. Org. Chem. 31, 205, (1966)) em 25 ml de tampão fos fato de potássio 10 mM, a pH 6,8 e, contendo 0,04 Gja de azida de potássio. Adicionou-se timidino-fosforilase (800 I.U.) e purina-nucleosido-fosforilase (l 200 I.U.) (Krenitski T, A.e outros, Biochemistry. 20. 3615, 1981 e Patente dos Estados

Unidos 4 381 344), purificadas, e agitou-se a suspensão a 35°C. * 25 ~

Decorridas 24 horas, adicionou-se 85 ml de tampão fosfato 10 mM a pH 6,8 e agitou-se a reacção durante um período adicional de cinco dias a 35°C. Removeu-se o precipitado da reacção por filtração e efectuou-se a cromatografia numa coluna de 2,5xl0cm contendo Dowex-l-hidróxido. Eluiu-se o produto com uma mistura de metanol/água a 90 Í° (v)v) e» combinaram-se as fracçães contendo o produto. Após remoção do solvente no vácuo, dis-solveu-se o material numa mistura de n-propanol/água a 30 $> (v/v) e cromatografou-se numa coluna de 5 x 90 cm, contendo resina BioRad P-2. Agregaram-se as fracçães contendo o produ to e após liofilização proporcionaram 0,225 g de 6-etoxipuri, na-9-/3-D-2*,3,-didesoxi-ribofuranosido que se analisou, verificando-se que se encontrava sob a forma de um 0,15 hidrato.

Análise Calculada para C.«H.„NK0o 0,15Ho0 :C, 53,98} H, 6,15} lj 17 5 ^ Λ N, 20,98

Encontrado í C, 5^,05} H, 6,15} N, 20,88

Dados de RMN: ef 8,06 (s, 1 H, Hg), 8,5 (s, 1H, H2), 6,3 (dd, 1 H, Hlt), 4,97 (t, 1 H, 5» 0H), 4,6 (m, 2 H, -CH,,-) , 4,1 (m, 1 H, Hv), 3,53 (m, 2 H, 5* CH,,) , 2,03 (m, 2 H, 3» CH.,), 1,4 (t, 3 H, ch3).

Exemplo 13 6-dime tilaminopurina-9-β-D-2 *.3 *-didesoxi-ribofuraposido

Efectuou-se uma suspensão de 6-dimetilamino-purina (6,13 mmoles, 1 g, Sigma Chemical Cp., St. Louis, Mo) e de 3,-desoxitimidina (4,44 mmoles, 1 g) (Horwitz), (J.P. e outros, J. Org. Chem. 31, 205 (l966) em 50 ml de uma solução de fosfato de potássio 10 mM, a pH 7,0 e que continha 0,04 fo de azida de potássio. Adicionou-se timidino-fosforilase (2 000 X. U.) e purina-nucleosido-fosforilase (3 000 I.U.) (Krenitsky T.A. e outros, Biochemistry. 20, 3615, 1981 e Patente dos Es tados Unidos 4 38I purificadas e, agitou-se a suspensão a 35°C. Decorridas 120 horas, filtrou-se a reacção e cromatogra ! fou-se o filtrado numa coluna contendo resina Dewex-l-hidróxi = 26 =

do (2,5 x 8 cm) utilizando como eluente uma mistura de metanol e água a 90 f> (v/v). Combinaram-se as fracçSes contendo o pr£ duto, e removeu-se o solvente sob vácuo. Dissolveu-se o resíduo em 25 ml de n-propanol/água a 30 f> (v/v) e, cromatografou-se numa coluna contendo BrioRad P-2 (5 x 90 cm). Eluiu-se o produto com uma mistura de n-propanol/água a 30 fo (v/v). Com-binaram-se as fracçães contendo o produto e, removeu-se o solvente no vácuo. Dissolveu-se o resíduo em 30 ml de água desio-nizada e efectuou-se a sua cromatografia numa coluna contendo resina Sepgadex G-10 (5 x 90 cm). Utilizou-se água como eluente. Combinaram-se as fracçães adequadas e, após liofiliza-çâo obteve-se 6-dimetilaminopurina-9-p-D-2',3‘-didesoxi-rib£ furanosido que se analisou, verificando-se que se encontrava sob a forma de um 0,3 hidrato (p.f. * l62°C). Análise Calculado para C12H17N5°20· 3H2G C, 53,64; H, 6,60; N 26,06 Encontrado í c, 53,63; H, 6,63; N, 25,8

Exemplo 14 6-hidroxietilaminopurina-9-β-D-2 *«3'-didesoxi-ribofuranosido

Efectuou-se uma suspensão de 6-hidroxietila-minopurina (2,8 mmoles, 0,5 Sigma Chemical Co. St. Louis,M0) e de 3’-desoxitimidina (3,30 mmoles, 0,78 g) (Horwitz J.P, e outros J. Org. Chem, 31, 205, (1966) em 75 ml de um tampão fosfato de potássio 10 mM, a pH 6,8, contendo 0,04 f> de azi-da de potássio. Adicionou-se timidino-fosforilase (400 I.U.) e purina-nucleosido-fosforilase (700 I.U.) (Krenitsky T.A. e outros, Biochemistry. 20. 3615, 1981 e Patente dos Estados

Unidos 4 381 344), purificadas e, agitou-se a suspensão a 35°C. Decorridos 8 dias adicionou-se 6θΟ I.U. de timidino-fosi forilase e 1050 I.U. de purina-nucleosido-fosforilase. Decor rido mais um dia, filtrou-se a mistura de reacção, e aplicou--se o filtrado numa coluna de 2,5 x 10 cm contendo Dowex-l-hi dróxido. Eluiu-se o produto com metanol. Combinaram-se as fracçães contendo o produto e evaporaram-se sob vácuo, depois, = 27 =

aplicou-se o resíduo e eluiu-se a partir de uma coluna de gel de sílica de 2,5 x 50 cm, sob pressão, com uma mistura de cio rofórmio/metanol (8:2). Combinaram-se as fracçães contendo o produto e, após liofilizaçâo obteve-se ó-hidroxietilaminç^ purina-9-β -D-2',3*-didesoxi-ribofuranosido que se analisou, verificando-se que se encontrava sob a forma de um 0,65 hidrato (p.f. = 153°C).

Análise Calculado para C12H17N5°3G*^H2° *

Calculado Encontrado C, 49,53; H, 6,34; N, 24,07 C, 49,85; H, 6,07í N, 23,70

Exemplo 15 6-ciclopropilaminopurina-9-/^ -D-21.3^didesoxifuranosido

Dissolveu-se 6-ciclopropilaminopurina (pre parada a partir de 6-cloropurina (Sigma Chemicals, St. Louis MO) e de ciclopropilamina) 2,86 mmoles, 0,5 g) e 3'”desoxi tiinidina (4,30 mmoles, 1 g) (tíorwitz J.P. e outros J. Org. Chem. 31, 205 (1966)), em 10 ml de uma mistura de dimetil- sulfóxido: N*,Ν’-dimetilformamida de 1 : 1 3, diluiu-se, de pois, com 30 ml de tampão de fosfato de potássio 10 mH, a pH 6,8, contendo 0,04 fo de azida de potássio. Adicionou-se timidino-fosforilase (lO 000 I.U.) e purina-nucleosido-fosf£ rilase (20 000 I.U.) (Krenitsky T.A. e outros, Biochemistry 20, 3615, 1981 e Patente dos Estados Unidos 4 381 344),pu rifiçadas adsorvidas em 10 ml de resina DEAE (Whatman) e agi tou-se a suspensão a 35°C. Decorridos 8 dias, filtrou-se a mistura de reacção, e aplicou-se o filtrado numa série de colunas acopladas, a coluna inicial continha Dowex-l-hidróxido (2,5 x 10 cm) enquanto que a segunda coluna se encontrava cheia de resina Amberlite XA-2 (2,5 x 20 cm). Após a aplicação da amostra, lavaram-se as colunas com um abundante volume de água e eluiu—se o produto com metanol. Combinaram-se as fracçães que continham o produto e, após liofilizaçâo obte ve-se 0,54 g de 6-ciclopropilaminopurina-9-/3-D-2,,3,-dide-soxi-ribofuranosido que se analisou, verificando-se que se * 28 *

Análise Calculado para C^^H^^N^020,55 HgO :

Calculado í C, 54,75} H, 6,40$ N, 24,55 Encontrado s C, 5^»67} H, 6,43; N, 24,57

Exemplo 16 6-ciclopentilaminopurina-/8-P-21.31-didesoxi-ribofuranosido

Dissolveu-se 6-ciclopentilaminopurina (preparada a partir de 6-cloropurina (Sigma Chemicals, St.Louis MO) e de ciclopentilamina) (2,49 nmioles, 0,506 g) de N,N--dimetilformamida e 5 ml de dimetilsulfóxido. Adicionou-se 3’-desoxitimidina (3»94 tnmoles, 0,84 g) (Horwitz J.P. e ou tros J. Org. Chem. 31» 205 (1966)) conjuntamente com 30ml de tampão fosfato de potássio 10 mM, a pH 6,8 e 0,4 $ de a-zida de potássio. Ajustou-se o pH para 6,8 com ácido acético. Adicionou-se à mistura de reacção timidino-fosforilase (10 000 I.U.) e purina-nucleosido-fosforilase (20 000 I.U.) (Krenitsky T.A. e outros, Biochemistry. 20. 3615* 1981 e Pa tente dos Estados Unidos 4 381 344), purificadas e ligadas a DEAE-celulose (Uhatman) . Agitou-se a suspensão a 35°C» durante 8 horas, filtrou-se e armazenou-se o filtrado durante a noite a -20°C. Após descongelamento, aplicou-se o filtrado numa coluna de 2,5 x 10 oí contendo resina Dowex-2 (2,5 x 20 cm)· Eluiu-se o produto com água. Combinaram-se as fracçSes contendo o produto e efectuou-se a sua cromatografia numa coluna contendo resina XAD-2 (2,5 x 20 cm). Eluiu-se este produto com 350 ml de água seguindo-se-lhe metanol. Combina ram-se as fracçães contendo o produto, e removeu-se o metanol sob vácuo. Dissolveu-se o resíduo em água e, após liofiliza-ção, obteve-se 0,459 g de 6-ciclopentilaminopurina-/3-D-3*, 3'-didesoxi-ribofuranosido que se analisou verificando-se que se encontrava sob a forma de um 0,05 hidrato (p.f. « 88°C, *29 =

°15H21N 5020,05 H20 c, 59,21} H, 6,69} N, 23,02 C, 59,24, H, 7,05} N, 22,95

Análise Calculada para

Calculada : Encontrado í

Exemplo 17 2-amino-6-metoxipurina-9-/9 -0-2*.31-didesoxi-ribofuranosido

Dissolveu-se 2-amino-6-metoxipurina (3,0 mmoles, 0,5 g, preparada a partir de 2-amino-6-cloropurina (Aldrich Chemical Co. Milwaukee Wl) e metanol) e 3'-desoxi-timidina (4,5 mmoles, 1 g) (Horwitz J.P, e outros J. Org. Chem. 31, 205 (1966)), em 10 ml de uma mistura de dimetil-sulfóxido : N’ ,N1 -dimetilformamida de 1 : 1 e, diluiu-se, dje pois, com 30 ml de tampão fosfato de potássio 10 mM com um pH de 6,8 e contendo 0,04 fo de azida de potássio. Adicionou-se timidino-fosforilase (10 000 I.U.) e purina-nucleosido-fosfo rilase (20 000 I.U.) (Krenitsky T.A. e outros, Biochemistry. 20. 3615, I98I e Patente dos Estados Unidos 4 38I 344), pu rifiçadas, adsorvidas em resina DEAE e agitou-se a suspensão a 35°C. Decorridas 8 horas, filtrou-se a mistura de reacção, e, aplicou-se o filtrado numa coluna de 2,5 x 10 cm, contendo Bowex-l-hidróxido. Agregaram-se as fracçSes contendo o produto e reduziram-se para um volume de 70 ml. Aplicou-se esta amostra numa coluna de 2,5 x 20 cm cheia de resina Am-berlite XAD-2. Lavou-se a coluna com um grande volume de á-gua e eluiu-se o produto com metanol. Combinaram-se as frae-çães contendo o produto e, após liofilização obteve-se 2-ami no-6-metoxipurina-9-/3-D-2*,3'-didesoxi-ribofuranosido.

Analise Calculada para } Calculada : C, 49,81} H, 5,70} Encontrada : C, 49,70} H, 5,72} N, 26,40 N, 26,34

Exemplo 18 6-n-propoxipurina-9-i6 -D-21.3 ^didesoxi-ribofuranosido

Dissolveu-se 6-n-propoxipurina (0,5 g, 2,8 = 30 =

mmoles, Sigma Chemicals. St, Louis, MO) e 3*-desoxitimidina (0,96 g, 4,2 mmoles) (Horwitz, J.P, e outros J. Org.Chem. 31, 205 (1996) em 5 ml d© dimetilsulfóxido e 5 ml de dimetil-formamida. Adicionou-se 30 ml de tampão fosfato de potássio 10 mM, a pH 6,8, contendo 0,04 % de azida de putássio e puri na-núcleosido-fosforilase (20 000 I.U.) e timidino-fosforiia se (10 000 I.U.) (Krenitsky, T.A. e outros, Biochemistry. 20, 3615, I98I e Patente dos Estados Unidos 4 381 344) puri ficadas, adsorvidas em 10 ml de resina DEAE-celulose e, agitou-se a reacção durante 35°C, durante 7 horas. Removeu-se a resina por centrifugação e aplicou-se o sobrenadante numa coluna de AG1-X2 (forma 0H), de 2,5 x 10 cm, ligada a uma colu na de XAD-2, de 2,5 x 20 cm. Lavaram-se as colunas com 500 ml de água e eluiu-se o produto com etanol. Submeteu-se o produto a cromatografia ultra-rápida numa coluna de gel de sí lica, de 3 x 50 cm, com clorofórmio S metanol (9 : 1, v/v). A liofilização proporcionou 0,554 g de 6-n-propoxipurina-9-/fc--D-2‘,3*-didesoxi-ribofuranosido que se analisou, verificando^ -se que se encontrava sob a forma de um 0,3 hidrato.

Análise Calculado para C^U-^gN 4°3° ,3H20 Calculado : C, 55,04} H, 6,61} N, 19,75 Encontrado : C, 55,05? H, 6,61} N, 19,72

Exemplo 19 6-n-butoxipurina-9- /^-D-2 *,31-didesoxi-ribofuranosido 6-n-butoxipurina (0,5 g, 2,6 mmoles, Sigma Chemicals, St. Louis, MO) e 3'-desoxitimidina (0,70 g, 3,1 mmoles) (Horwitz J.P. e outros, J. Org. ^hem. 31, 205 (1966)) em 1000 ml de fosfato de potássio tampão 10 mM, a pH 6,8, contendo 0,04 fo de azida de potássio. Adicionou-se purina--nucleosido-fosforilase (3 500 I.U.) e timidino fosforilase (800 I.U.) (Krenitsky, T.A. e outros, Biochemistry. 20. 3615, 1981 e Patente dos Estados Unidos 4 381 344) purificadas, e agitou-se a solução a 32°C. Decorridos 7 dias filtrou-se a reacção e aplicou-se o filtrado numa coluna conten = 31 *

do AGI-X2 (forma OH) de 2,5 x 10 cm. Eluiu-se o produto com uma solução aquosa de metanol a 90 f0· Removeu-se o solvente no vácuo a partir do produto e efectuou-se a cromatografia ul tra-rápida do produto numa coluna de gel de sílica de 2,5 x x 80 cm, com uma mistura de clorofórmio í metanol (8 : 2,v/v). Dissolveu-se o produto em água e aplicou-se numa coluna conten do XAD-2 de 2,5 x 20 cm. Lavou-se a coluna com 500 ml de á-gua e, depois, dissolveu-se com metanol. A liofilização proporcionou 0,276 g de 6-n-butoxipurina-yâ-D-2',3,-didesoxi--ribofuranosido (p.f. 55°c)·

Análise Calculada para °ΐΑθΝΛ Calculado : C, 57,52? H, 6,90; N, 19,17 Encontrado : C, 57,86; H, 7,29; N, 18,83

Exemplo 20 6-oiolopropilmetoxipurina-9->e -D-21,3 *-didesoxi-ribofuranosido

Preparou-se 6-cloropropilmetoxipurina por substituição nucleofílica do grupo cloro de 6-cloropurina (Sigma Chemical Co,, St, Louis MO) pelo anião alcoxi formado entre hidreto de sódio e álcool ciclopropilmetílico.

Fez-se reagir 6-ciclopropilmetoxipurina (0,505 g, 26,5 mmoles) e 2',3'-didesoxitimidina (0,908 g, k0,l mmoles) (Horwitz e outros, J. Org. Chem., 31» 205 (1966) e efectuou—se a sua cromatografia sobre AGI—X2 (forma 0H e XAD-2 tal como se descreveu no Exemplo 18. Efectuou-se a cro. matografia ultra-rápida das fracçSes contendo o produto, numa coluna de gel de sílica, de 3 x 50 cm, com acetonitrilo : água (98 } 2, v/v). A liofilização proporcionou 0,^96 g de 6-ci-clopropilmetoxipurina-9-yô -D-2*,31-didesoxi-ribofuranosido.

Análise Calculada para cikHi8N4°3

Calculado t C, 57,92; H, 6,25» N, 19,30 Encontrado s C, 57»99» H, 6,28; N, 19,27 = 32 =

Exemplo 21 6-ciclopentiloxipurina-9-^ -D-21 ^-didesoxi-ribofuranosido

Preparou-se 6-ciclopentiloxipurina por substituição nucleofílica do grupo cloro de 6-cloropurina (Sigma Chemicals Co., St. Louis, 31, 205 (1966)) pelo anião alcoxi formado entre hidreto de sódio e ciclopentanol. Fez-se reagir 6-ciclopentiloxipurina (θ,5θ6 g, 2,48 mmoles) e 3f-desoxiti midina (0,856 g, 3,78 mmoles) (Horwitz J. P, e outros J. Org. Chem. 31, 205 (1966)) e efectuou-se a sua cromatografia sobre AG1-X2 (forma OH) e XAD-2 tal como se descreveu no Exemplo 18. Removeu-se o solvente no vácuo a partir das fracçSes contendo o produto e efectuou-se a cromatografia ultra-rápida do resíduo numa coluna de gel de sílica, 3 x 50 cm, com clorofórmio i meta nol (95 í 5, v/v). A liofilizaçâo proporcionou 0,358 g de 6--ciclopentiloxi-purina-9-/ô -D-2‘,3'-didesoxi-ribofuranosido que se analisou, verificando-se que se encontrava eob a forma de um 0,15 hidrato.

Análise Calculada para C15H20N 4°3 0,15H20 Calculado : C, 58,68j H, 6,66; N, 18,25 Encontrado : G, 58,6l5 H, 6,53? 1825

Exemplo 22 6-ciclo-hexiloxipurina-9-/& -D-2*,3'-didesoxi-ribofuranosido

Preparou-se 6-ciclo-hexiloxipurina por substituição nucleofílica do grupo cloro de 6-cloropurina (sigma Chemical Co,, St. Louis MO) pelo anião alcoxi formado sobre hidreto de sódio e ciclo-hexanol.

Efectuou-se a cromatografia de 6-ciclo-hexiloxipurina (0,50 g, 2,29 mmoles) e 3*-desoxitimidina (o,776g 3,4-2 mmoles) (Horwits J.P. e outros J. Org. Chem. 31, 205 (1966)) sobre AG1-X2 (forma OH e XAD-2 tal como se descreveu no Exemplo 18, com excepção de se ter utilizado 10 ml de glima = 33 =

em adição a 5 ml de dimetil-sulfóxido e 5 ml de N,N-dimetil-formamida, e um total de 70 ml de tampão fosfato de potássio a pH 6,8, contendo 0,04 $ de azida de potássio. A liofiliza çâo proporcionou 0,102 g de 6-ciclo-hexiloxipurina que se analisou, verificando—se que se encontrava sob a forma de um 0,2 hidrato.

Análise Calculada para εΐ6Η22Κ1,03 °-2H2° Calculado $ C, 59,69} H, 7,01} N, 17,4o Encontrado : C, 59,69? h, 6,93; N, 17,27

Exemplo 23 6-ciclobutilaminopurina-9- /3 -P-21.3 *-didesoxi-ribofuranosido

Preparou-se 6-ciclopurina por substituição nucleofílica do grupo cloro de 6-cloropurina (Sigma Chemical Co., St, Louis MO) pelo grupo amino de ciclobutila-mina.

Fez-se reagir 6-ciclobutilaminopurina (0,510 g, 2,62 mmoles) e 3’-desoxitimidina (0,896 g, 3,96 mmoles) (Horwitz J.P. e outros, J. Org. Chem. 31, 205, (1966)) e efectuou-se a sua cromatografia em ÂG1-X2 (forma' OH) e XAD-2 tal como se descreveu no Exemplo 18, Removeu--se o solvente das fracçães contendo o produto e efectuou-se a cromatografia ultra-rápida do resíduo numa coluna de gel de sílica de 3 x 50 cm, com uma mistura de clorofórmio : metanol (9 t 1 v/v). A liofilizaçâo proporcionou 0,524 g de 6-cicl£ butilaminopurina-9-/3-D-2’,3'-didesoxi-ribofuranosido (p.f. 96-98°C).

Análise Calculada para ^^3.9^5^2

Calculada : C, 58,12; H, 6,62} N, 24,20

Encontrada ϊ C, 58,19? H, 6,65? N, 24,16

Exemplo 24 6-dietilaminopurina-9-B-D-2 *,3 *-didesoxi-ribofuranosido

Preparou-se 6-dietilaminopurina por subs^ = 34 =

tituição nucleofílica do grupo cloro de 6-cloropurxna (Sigma Chemical Co., St. Louis MO) pelo grupo amino ou dietilamina.

Fez-se reagir 6-dietilaminopurina (0,246 g, 1,28 mmoles) e 3,-desoxitimidina (0,463 g, 2,04 mmoles) (Horwitz J.P, e outros Org. Chem., 31» 205 (1966) e efectuou -se a cromatografia sobre ÂG1-X2 (forma OIl) e XAD-2, tal co> mo se descreveu no Exemplo 18. Removeu-se o solvente no vácuo numa coluna de gel de sílica de 5 x 20 cm com uma mistura de clorofórmio : metanol (9 s 1» v/v). Removeu-se o solvente no vácuo, a partir das fracçSes que continhma o produto e efectuou-se a cromatografia ultra-rápida do resíduo numa cc> luna de gel de sílica de 5 x 20 cm, com uma mistura de cloro fórmio/metanol (9 ! 1, v/v). Removeu-se o solvente no vácuo partir das fracçSes que continham o produto e efectuou-se a cromatografia ultra-rápida do produto numa segunda coluna de gel de sílica de 2,5 x 50 cm com acetato de etilo. Transferiu-se o produto sob a forma de uma goma, em acetona, para um frasco e liofilizou-se para proporcionar 0,98 g de 6-dietil aminopurina-9-β-D-2',3'-didesoxi-ribofuranosido que se anali sou, verificando-se que c©ntxnha 0,25 equivalentes de água e 0,20 equivalentes de cetona. cl4H2lN5°2 °»2C3H6° °>25H2o , 57,03; H, 7, Mi N, 22,78 , 57,02; H, 7j »39; N, 22,72

Análise Calculada para

Calculado s C Encontrado : C

Exemplo 25 6- pirrolidinopurina-9- S-T>-21.31 -dxdesoxx-rxbofuranosido

Preparou-se 6-pxrrolxdxnopurxna por substituição nucleofílica do grupo cloro de 6-cloro-purxna pelo grupo amino da pirrolidina.

Dissolveu-se 6-pxrrolidxnopurxna (0,500 g, 2,64 mmoles) e 3-desoxxtxmxdxna (0,901 g, 3,98 mmoles) (Hor· witz J.P. e outros J. Org. Chem. 31, 205 (1966) em 5 ml de . sulfóxido de metxlo e 5 rol de N,N-dimetilformamida. Adicionou -se trinta ml de tampão de fosfato de sódio, a pH 6,8 conten- * 35 -

do 0,04 fó de azida de potássio e purina-nucleosido-fosfori-lase purificada (20 000 I.U.) e timidino-fosforilase (lO 000 I.U.) (íírenitsky, T.A. e outros Bioohemistry. 20, 3615,1981 e Patente dos Estados Unidos 4 381 3^*0 purificada, adsorvi-das sobre 10 ml de resina DEÂE-celulose e, agitou-se a reac-ção a 35°C durante 7 horas. Removeu-se a resina por centrifu gaçâo e, aplicou-se o sobrenadante numa coluna de AG1-X2 (for ma OH) , de 2,5 x 10 chi acoplada a uma coluna de XAD-2, de 2,5 x 20 cm. Lavaram-se as colunas com 500 ml de água e elu-iu-se o produto com metanol. A liofilizaçSo proporcionou 0,385 g de 6-pirrolidinopurina-9-/3-D-21,3»-didesoxi-ribofu-ranosido que se analisou, verificando-se que se encontrava sob a forma de um 0,05 hidrato (p.f. 158-159°0).

Análise Calculada para ci4hi0»05¾0

Calculado í C, 57,94; H, 6,63í N, 24,13

Encontrado : C, 57,92$ H, 6,67$ N, 24,11

Exemplo 26 6-morfolinopurina-9-j®-E-2* .31 -didesoxi-ribofuranosido

Preparou-se 6-morfolinopurina por substitui ção nucleofílica do grupo cloro de 6-cloropurina (Sigma Chemicals Co. St, Louis MO) pelo grupo amino de morfolina.

Fez-se reagir 6-morfolinopurina (0,501 g, 2,44 mmoles) e 3'-desoxitimidina (0,842 g, 3,72 mmoles) (Hor witz J.P. e outros J. Org. Chemistry, 31, 205, (1966)) e efe£ tuou-se a sua cromatografia sobre AG1-X2 (forma OH) e XAD-2 tal como se descreveu no Exemplo 18. A liofilização proporcionou 0,292 g de 6-morfolinopurina-9-/3 -D-2«,3'-didesoxi--ribofuranosido que se analisou, verificando-se que se encontrava sob a forma de um 0,2 hidrato (p.f. 97°C).

Encontrado :

Análise Calculada para t

Calculado í C, cl4H19N5°3 °»20H 2° 54,43$ H, 6,33; N, 22,67 54,48$ H, 6,28$ N, 22,51 C, = 34 =

Exemplo 27 6-v.Y-dimetilalilaminopurina-9-ft -D-2* ^'-djdesoxi-ribofura-nosido

Fez-se reagir 6-y,y,-dimetilalilaininopurina (0,500 g, 2 ,46 mmoles, Sigma Chemicals, St, L-ouis, MO) e 3*--desoxitimidina (0,752 g, 3,32 mmoles) (Horwitz J.P, e outros J. Org, Chem, 31, 205 (19^6)) e efectuou-se a crornato-grafia sobre AG1-X2 (forma OH) tal como se descreveu no Exem pio 18, Removeu-se o solvente no vácuo a partir das fracçSes contendo o produto e, efectuou-se a cromatografia ultra-rápida do produto numa coluna de gel de sílica, de 3 x 50 cm, com clorofórmio : metanol (95 í 5, v/v). Depois, aplicaram-se as fracçSes contendo o produto a uma coluna XAD-2, de 2,5 x x 20 cm, e eluiu-se com metanol. Transferiu-se o produto sob a forma de uma goma, em cetona, para um frasco proporcionando a liofilizaçâo 0,335 g de 6-y,y-dimetilalilaminopurina-9-y^* -D-2',3'-didesoxi-ribofuranosido que se analisou, verificando_ -se que continha 0,45 equivalentes de água e equivalentes de acetona 0,20 acetona.

Análise Calculada para C^H^NçjOg 0,45 H^O 0,2C^H^0

Calculado t C, 57,99; H, 7,21; N, 21,68 Encontrado : C, 57,77; H, 6,91; N, 21,4l

Exemplo 28 6-furfirulaminopurina-9-/3 -D-21,31-didesoxi-ribofuranosido

Pez-se reagir 6-furfurilaminopurina (0,502 g, 2,33 mmoles, Sigma Chemicals, St, Louis, MO) e 31 -des_o xitimidina (0,754 g, 3,33 mmoles) (Horwitz J.P, e outros J, Org, Chem,, 31, 205, (1966)) e efectuou-se a cromatografia sobre AG1-X2 (forma OH) e XAD-2 tal como se descreveu no Exemplo 18, Removeu-se o solvente no vácuo a partir das fracçSes contendo o produto e efectuou-se a cromatografia ul =35=

tra-rápida do resíduo, sobre gel de sílica, 5 x 50 cm com clorofórmio : metanol (9 s 1* v/v). A liofilização proporcionou 0,303 g de 6-furfurilaminopurina-9-β-D-21,31-didesoxi-ribofu ranosido que se analisou, verificando-se que se encontrava sob a forma de um 0,2 hidrato.

Análise Calculada para °15H17N 503 0,2Hg0 Calculado s 0, 56, *+9; H, 5,50; N, 21,96 Encontrado í C, 56,50, H, 5,53? N, 21,97

Exemplo 29 6-benzilmercaptopurina-9-β-D-21.31-didesoxi-ribofuranosido

Fez-se reagir 6-benzilmercaptopurina (0,501 g, 2,07 mmoles, Sigma, Chemicals, St. Louis, MO) e 3'-desoxi timidina (ot70b g, 3,11 mmoles) (Horwitz J.P» e outros J.Org. Chem,, 31, 205, (1966)) e efectuou-se a sua cromatografia so bre AG1-X2 (forma OH), tal como se descreveu no Exemplo 18, com excepção de se ter utilizado 10 ml de glima para dissolver a base púrica. Removeu-se o solvente no vácuo, a partir das fracçSes que continham o produto,,e efectuou-se a croraatogra-fia ultra-rápida do produto numa coluna de gel de sílica, de 3x5 cm, com uma mistura de clorofórmio s metanol (95 * 5, v/v). Transferiu-se o produto, em etanol para um frasco e a liofilização proporcionou 0,30*5- g de 6-benzilmercaptopurina--9-yô-D-2* ,3'-didesoxi-ribofuranosido que se analisou, verifl. cando-se que continha 0,05 equivalentes de água e 0,05 equiva lentes de etanol (p.f. 8l-83°C).

Análise Calculada para C^^H^gN^O^S Ο,ΟΰΗ^Ο 0,050^^0

Calculado : C, 59,^3; Η, 5,37í N, 16,21; S, 9.28 Encontrado í C, 59,^9} H, 5,38; N, 16,32; S, 9,30

Exemplo 30 6-anilinopurlna-9-/3-D-21«3t-didesoxi-ribo- furanosido

Fez-se reagir 6-anilinopurina (0,500 g, - 36 =

2,37 mmoles, Sigma Chemicals, St. Louis, MO) e 3,-desoxitimi-dina (0,752 g, 3*32 mmoles) (Horwitz J.P. e outros, J. Org. Chem., 31» 205 (1966)) e efectuou-se a cromatografia sobre AGI -X2 (forma OH), tal como se descreveu no Exemplo 18. Removeu--se o solvente no vácuo, a partir das fracçSes que continham o produto e efectuou-se a cromatografia ultra-rápida do resíduo numa coluna de gel de sílica, de 2,5 x 50 cm, com clorofórmioí «metanol (95 í 5» v/v). A liofilização proporcionou 0,470 g de 6-anilinopurina-9-β-D-2 ’, 31 -didesoxi-ribofuranosido que se analisou, verificando-se que se encontrava sob a forma de um 0,05 hidrato (p.f. 170-172°C).

Análise Calculada para °16ΗΐΆ°2 0.05¾0

Calculado : C, 61,55; H, 5>52; N, 22,43 Encontrado í C, 61,57; Η, 5,55} N, 22,43

Exemplo 31 2-amino~6-etoxjpurina-9-./3 -D-21.3 * -didesoxi-ribofuranosido

Fez-se reagir 2-amino-6-etoxipurina (0,5 g, 2,8 mmoles) que se preparou por substituição nucleofílica do grupo cloro de 2-amino-6-cloropurina (Aldrich Chemical Co. Milwaukee Wl) pelo anião formado entre hidreto de sódio e eta nol) e 3»-desoxitimidina (0,950 g, 4,19 mmoles) (Horwitz J. P. e outros J. Org, Chem., 31, 205 (1966)) e, efectuou-se a cromatografia sobre AG1-X2 (forma OH) e XAD-2, tal como se dejs creveu no Exemplo 18. Removeu-se o solvente no vácuo e efec-tuou-se a cromatografia ultra-rápida, do resíduo, numa coluna de gel de sílica, de 5 x 20 cm, com uma mistura de clorofórmio «metanol (9 « 1, v/v). A liofilização proporcionou 2-amino--6-etoxipurina-9-/3-D-21,3'-didesoxi-ribofuranosido que se ana lisou verificando-se que se encontrava sob a forma de um 0,3 hidrato (p.f. 150°C, fusão parcial a 65°C).

Análise Calculada para « 7^5^3

Calculado : Encontrado : 0, 50,63; H, 6,23} N, 24,60 C, 50,77} H, 6,21} N, 24,63 - 37

2,6«8-triaminopurina-9-ig -D-2·.3·-didesoxi-ribofuranosido

Fez-se reagir 2,6,8-triaminopurina (0,500g, 3,0 mmoles), (Davies, R. e outros, Biochem. Biophys, Acta, 564(3), 448, I979) © 3 *-didesoxitimidina (l,02 g, 4,50 mmo- les) (Horwitz J.P. e outros J. Org. Chem., 31, 205 (1966)) e efectuou-se a sua cromatografia sobre AG1-X2 (foram OH) e XAD -2, tal como se descreveu no Exemplo 18. A liofilização proporcionou 0,148 g de 2,6,8-triaminopurina-9-/^-0-2‘,3,",(iide-soxi-ribofuranosido que se analisou, verificando-se que continha 0,7 equivalentes de metanol (p.f. 154°C).

Cnálise Calculada para C^R^N^O^ 0,70Η^0

Calculado s C, 44,76; H, 6,24; N, 34,08 Encontrado í C, 44,51? H, 5,95? N, 33,78

Exemplo 33 2-amino-6-benzilaminopurina-9~73 -D-21.3*-didesoxi-ribofurano-sido

Fez-se reagir 2-amino-é-benzilaminopurina (0,2 g, 0,8 mmoles) que se preparou por substituição nucleo-fxlica do grupo cloro de 2-amino-6-cloropurina (Aldrich. Che mical Co., Milwaukee ¥l) pelo grupo benzilamino) e 3'-deso-xitimidina (0,282 g, 1,2 mmoles) (Horwitz J.P. e outros J. Org. Chem., 31, 205 (1966)) e efectuou-se a sua cromatogra- fia sobre AG1-X2 (forma OH) e XAD-2, tal como se descreveu no Exemplo 18, com excepção de se terem utilizado pequenas quantidades de purina-nucleosido-fosforilase (10 000 I.U.) e de timidino-fosforilase (5 000 I.U.). A liofilização proporcionou 0,182 g de 2-amino-6-benzilaminopurina-9-^-D-2·,3’--didesoxi-ribofuranosido que se analisou, verificando-se que continha 0,60 equivalentes de metanol (p.f. 92-94°C). = 38 =

Análise Calculada para

Calculado : Encontrado : C17H20N6°2 0t60CHk0 C, 58,78$ H, 6,28$ N, C, 58,60, H, 6,06$ N, 23,37 23,^3

Exemplo 34 2-amino-6-ciclopropilaminopurina-9- β-D-21 .31-didesoxi--ribo furano s ido

Fez-se reagir 2-amino-6-ciclopropilaminopu rina (0,495 g, 2,1 mmoles) que se preparou por substituição nucleofxlica do grupo cloro de 2-amino-6-cloropurina (Aldri che Chemical Co. Milwaukee Wl) ciclopropilamina) e 3 »-deso-xitimidina (O,73 g, 3,2 mmoles) (Horwitz J.P. e outros J. Org. Chem. 31, 205 (19^6) e efectuou-se a sua cromatografia, sobre AG1-X2 (forma OH) e XAD-2, tal como se descreveu no Exemplo 18. A liofilização proporcionou 0,419 g de 2-amino--6-ciclopropilaminopurina-9-β-Ώ-2*,3’-didesoxi-ribofuranosido que se analisou como um 0,3 hidrato (p.f. = 82-84°C).

Análise Calculada para C13H18N6°2 0,3H2o Calculado : C, 52,80$ E, 6,34$ N, 28, ,42 Encontrado : C, 52,83$ H, 6,35; 00 ,44

Exemplo 35 2-amino-6-metilaminopurina-9- /3-0-2« <3,-didesoxi-ribofura-nosido

Efectuou-se uma suspensão de 2-amino-6-me-tilaminopurina (0,5 g» 3 mmoles, que se preparou por substi tuição nucleofxlica do grupo cloro de 2-amino-cloropurina (Aldrich Chemical Co. Milwaukee ¥l) por metilamina) e 31-de-soxitimidina (0,893 St 3,9 mmoles) (Horwitz J.P. e outros J. Org. Chem. 31, 205 <19^6)) em 100 ml de tampão de fosfato de potássio, 10 mM, a pH 6,8 contendo 0,04 fo de azida de potássio. Adicionou-se purina-nucleosido-fosforilase purifica- = 39 *

da x2 880 I.U,) e timidino-fosforilase (l 200 I.U.) (Erenit-sky, T,A. e outros Biochemistry, 20, 3615, 1981 e Patente dos Estados Unidos 4 3&1 344) purificada, e agitou-se a reacção a 33°C, durante 72 horas. Aplicou-se o produto numa coluna de AG1-X2 (forma OH) de 2,5 x 10 cm e eluiu-se o produto com uma solução aquosa de metanol, a 90 $· Removeu-se o solvente no vácuo e efectuou-se a cromatografia ultra-rápida do produto numa coluna de gel de sílica, de 2,5 x 30 cm, com clor£ fórmio : metanol (97 : 3, ;v/v). A liofilização proporcio nou 0,3 g de 2-amino-6-metilaminopurina-9-J3 -D-2',31-dide-soxi-ribofuranosido que se analisou, verificando-se que se encontrava sob a forma de um 0,4 hidrato (p.f. 93°0, fusão parcial a 75°c).

Análise Calculada para ^n^ig^ô o2 o,4h2o Calculado ϊ C, 48,66} H, 6,24} N, 30,93 Encontrado : C, 48,57} H, 6,27} N, 30,77

Exemplo 36 2-amino-6-n-propoxipurina-9-/3 -D-2*.31-didesoxi-ribofuranosido

Efectuou-se uma suspensão de 2-amino-6-n--propoxipurina (o,21 g, 1,1 mmoles, que se preparou por substituição nucleofílica do grupo cloro de 2-amino-cloropu-rina (Aldrich Chemical Co., Milwaukee ¥l), pelo anião alcoxi formado entre o hidreto de sódio e n-propanol) e 3’-desoxi. timidina (0,293 g, 1,3 mmoles) (Horvitz J.P, e outros J. Org, Chem. 31, 205 (19^6)) em 10 ml de tampão de fosfato de potássio, 10 mM, a pH 7»0 contendo 0,04 $ de azida de potássio, Adicionou-se purina-nucleosido-fosforilase purificada (2 8880 I.U.) e timidino-fosforilase purificada (l 200 I.U.) (lírenitsky, T.A, e outros Biochemistry, 20, 3^15» 19§1 e Pa tente dos Estados Unidos 4 381 344) purificada, e agitou-se a reacção a 33°C» durante 48 horas. Aplicou-se a mistura de reacção numa coluna de AG1-X2 (forma 0H) de 2,5 x 5 cm e e-luiu-se com uma solução aquosa de metanol, a 90 /á. Removeu- = 40 - i

-se o solvente no vácuo e efectuou-se a cromatografia ultra-rá pida do resíduo numa coluna de gel de sílica, de 2,5 x 30 cm, com clorofórmio : metanol (9 í 1, v/v). A liofilização proporcionou 0,132 g de 2-amino-6-n-propoxipurina-9- β-D-2 *,3' — -didesoxi-ribofuranosido que se analisou, verificando-se que se encontrava sob a forma de um 0,2 hidrato (p.f. 70°C).

Análise Calculada para N503 0,2H20

Calculado : C, 52,59; H, 6,59; N, 23,59 Encontrado : C, 52,52; H, 6,62; N, 24,49

Exemplo 37 6-benzilaminopurina-9-,/& -D-21.31-didesoxi-ribofuranosido

Efectuou-se uma suspensão de 6-benzilamino-purina (l,0 g, 4,44 mmoles, (Sigma Chemicals, St. Louis, IiO) e de 31-desoxltimidina (l,0 g 4,4 mmoles) (Horwitz J.P. e ou tros J. Org. Chem. 31, 205 (1966)) em 50 ml de tampão fosfa to de potássio, 15 mM, a pH 7,2 e timidina-fosforilãse purifi cada (7 900 I.U.) (Erenitsky, T.A. e outros Biochemistry, 20 3615, 1981 e Patente dos Estados Unidos 4 381 344) e agitou-se a reacçâo a 25°C. Decorrida uma hora, adicionou-se 6 ml de d.i glima e agitou-se a mistura de reacção a 37°C, durante 6 dias. Ajustou-se o filtrado de reacção para pH 10,5 com hidróxido de amónio, aplicoti-se numa coluna de AG1-X2 (forma formatada) de 2,5 x 6 cm e eluiu-se o produto com uma solução aquosa de pro-panol, a 30 fo. Depois, efectuou-se a cromatografia do produto numa coluna P2, de 2,5 x 90 cm, eluiu-se com uma solução aquo sa de propanol a 30 fo e, a liofilização proporcionou 0,063 g, de 6-benzilarninopurina-9-J3 -D-21 ,3' -didesoxi-ribofuranosido que se analisou, verificando-se que se encontrava sob a forma de um 0,5 hidrato (p.f. 65°C).

Análise Calculada para C17H19N5°2 0,5H2°

Calculado : C, 61,06; H, 6,03; N, 20,94

Encontrado : C, 61,29; H, 6,21; N, 20,69 - 4l =

Exemplo 38 6-iso-propoxipurina-9-/Q -D-2*,3,-didesoxi-ribofuranosido

Fez-se reagir 6-iso-propoxipurina (0,5 g, 2,8 mmoles, Sigma Chemicals, St. Louis, MO) e 31-desoxitimi dina (0,95 g, 4,2 mmoles) (ilorwitz, J.P. e outros J, Org. Chem. 31» 205, (1966)) e efectuou-se a sua cromatografia sobre AG1-X2 (forma OH) e XAD-2, tal como se descreveu no E-xemplo 18, Removeu-se o solvente no vácuo, a partir das fra_c çães que continham o produto e dissolveu-se o resíduo numa sç> lução aqtiosa de propanol a 30 , a cromatografia numa coluna G10, de 5 x 90 cm, dissolvida com uma solução aquosa de propa nol, a 30 /0, proporcionou uma goma que se transferiu em aceto. na, para um frasco de liofilxzação. A liofilização proporcxç) nou 0,313 g de isopropoxipurina-9-,/3 -D-2’ ,3'-didesoxi-ribofu ranosido que se analisou, verificando-se que se apresentava sob a forma de 0,2 equivalentes de água e 0,2 equivalentes de acetona (p.f. 75°C·)·

Análise Calculada para ^13^18^4^3 Oj^C^HgO 0,2Η?0

Calculado i C, 55,65; H, 6,73; N, 19,09 Encontrado : C, 55,65; H, 6,59; N, 19,12

Exemplo 39 6-n-propilaminopurina-9-B -D-2 ^31-didesoxi-ribofuranosido

Fez-se reagir 6-n-propilaminopurina (0,500 g 2,8l mmoles, Sigma Chemicals, St. Louis, MO) e 3*-desoxitimi dina (0,957 g» 4,26 mmoles) (Horwitz, J. P. e outros J.Org. Chem. 31, 205, (1966)) e efectuou-se a sua cromatografia sobre AG1-X2 (forma OH) e XAD-2, tal como se descreveu no E-xemplo 18, exceptuando o facto de se ter substituído os 5ml de sulfoxido de dimetilo por mais 5 ml de N,N-dimetilformamida. Removeu-se o solvente no vácuo, a partir das fracçães que continham o produto e efectuou-se a cromatografia ultra-rápida do resíduo numa coluna de gel de sílica de ^ 3 x 50 cm, com cl£

roférmio s metanol (9 ϊ 1, v/v) . A liofilização proporcionou 0,499 g de 6-n-propilaminopurina-9-/3 -D-2*,3'-didesoxi-ribo-furanosido que se analisou, verificando-se que se encontrava sob a forma de um 0,7 hidrato.

Análise Calculada para 5°2 0»7H2° Calculado í C, 53,85; H, 7,09} N, 24,15 Encontrado s C, 53,93» H, 7,08} N, 24,18

Exemplo 40 6-ciclo-hexilaminoyur±na-9--D-2♦«3 *-didesoxi-ribofuranosido

Preparou-se 6-ciclo-hexilaminopurina por substituição nucleofxlica do grupo cloro de 6-cloropurina por ciclohexilarnina.

Dissolveu-se β-ciclo-hexilaminopurina (l,0 g 5 mmoles) e 3,-d.esoxitimidina (2,07 g, 9,1 mmoles) (Horwitz J.P. e outros, J. Org. Chem., 31» 205 (1966)) em 25 ml de éter 2-metoxietílico e 500 ml de tampão fosfato de potássio 10 niM a pH 7»2, Adicionou-se purina-nucleosido-fosforilase purificada (5 000 I.U.) e timidino-fosforilase (3850 I.U.) (lírenit-sky T.A. e outros, Biochemistry, 20, 3615, 1981 e Patente dos Estados Unidos 4 381 344) e agitou-se a reacção a 37°C,du rante 7 dias. Aplicou-se a mistura de reacção numa coluna de XAD-2 e lavou-se extensivamente com água. Eluiu-se o produto com metanol em solução aquosa, a 90 Í°· Agregaram-se as fracçSes que absorvial UV e aplicaram-se numa coluna de AG1--X2 (forma OH), 2 x 12 cm e eluiu-se o produto com uma solução aquosa de metanol, a 30 $>. Efectuou-se, depois a cromatografia do produto numa coluna P-2 de 2,5 x 90 cm e numa coluna G-10 de 2,5 x 90 cm e eluiu-se cada uma das colunas com uma solução aquosa de propanol a 30 A liofilizaçâo proporcionou 0,093g de 6-c±clo-h.exilaminopurina-9-,/8 -D-21,31 -didesoxi-ribofurano-sido (p.f. 70-72°C). * 43 =

^SSSSSBSmsassi • ÍSJif-.Xr.r.Íra· »

Análise Calculada para ci6H23^5®2 N, 22,07 N, 21,91*·

Calculado : C, 60,55$ H, 7,30; Encontrado : C, 60,37$ H, 7,39$

Exemplo 4l 6-metilaminopurina-9- /3-Ό-21,31 -didesoxi-rxbofuranosido

Efectuou-se uma suspensão de 6-metilaminopu rina (4,31 tnmoles, 1 g) , que se obteve de Sigma Chemical Co. St. Louis, MO e 3*^β5θχχΐχππ.άχηη (4,40 mmoles, 1 g) (Horwitz J.P. e outros, J. Org. Chem. 31, 205 (1966)) em 50 ml de tampão fosfato de potássio 10 mM, a pH 7, e, 0,04 fo de azida de potássio. Adicionou-se timidino-fosforilase (2 000 X.XJ.) purificada e purina-nucleosido-fosforilase purificada (2 400 I. U.) (Krenitsky T.A. e outros, Biocheraistry,20, 3615, 1981 e Patente dos Estados Unidos k 381 344) e agitou-se a suspensão a 35°C. Decorridos três dias armazenou-se a reacção a 20°C.Após descongelamento, filtrou-se a mistura de reacção e aplicou-se o filtrado numa coluna de 2,5 x 10 cm contendo Dowex -1-hidro-xido. Eluiu-se o produto da coluna com uma mistura de metanol/ água a 890 % (v/v). Combinaram-se as fracçães contendo o produto e removeu-se o solvente no vácuo. Cromatografou-se es te material duas vezes, numa coluna de 5 x 90 cm contendo Resi. na BioRad P-2, com uma mistura de n-propanol/água a 30 /ó(v/v). Agregaram-se as fracçães que continham o produto e, após liofá. lização obteve-se 0,319 g de 6-metilaminopurina-9-/^-D-2',3'--didesoxi-ribofuranosido, que se analisou, verificando-se que se encontrava sob a forma de um 0,1 hidrato.

Análise Calculada para C^^H^^N^O^O.IH^O í

Calculada ! C, 52,62; H, 6,10; N, 27,89 Encontrada : C, 52,75$ H, 6,16; N, 28,01 Dados de RMN:cΓ 8,3¾ (s , 1 Hg), 8 ,12 (s, 1 H, H2), 7,72 (1, 1 II, NH), 6,23 (dd, 1 H, Hl ·), 5,06 (t, 1 H, 5' OH),

S W S 4,10 (m, 1 H, py) 3,53-3,69 (Μ, 1 Η 5' CH2), 3,45-3,55 (m, III, 5' CH2), 2,95 (1, 3H, CH3), 2,40 (m, 2H, 2'CH2) e 2,07 (m, 2 H, 3* CH2).

Exemplo 42 2-amino-ó-(ciclopropilroetilamino)purina-9- β -D-21 .31 -didesoxi--ribofuranosido

Efectuou-se uma suspensão de 6-(ciclopropil. metilamino)purina (0,022 mmoles, 0,5 g) e de 31 -desoxitimidjL na (0,0032 moles, 0,73 g) em 10 ml de dimetilformamida/dime-tilsulfóxido (l s 1, v/v) e 50 ml de tampão de fosfato de potássio, a pH 6,8 que continha 0,04 $ de azida de potássio. A-dicionou-se timidino-fosforilase e purina-núcleosido-fosfori-lase (10,7 ml) imobilizadas, e, misturou-se a suspensão num ba nho de agitação, a 37°C. Monitorizou-se a reacção por TLC (gel de sílica CHCl^ : MeOII (9 i l). Decorridas 24 horas,fil traram-se os sólidos, que se colocaram à parte diltxiu-se o fil trado até 300 ml com água. Efectuou-se a cromatografia acop-pàando uma coluna contendo resina AGl-X2-hidróxido (2,5 x7cm) a uma coluna contendo resina XAD-2 (2,5 x 7 cm) a uma coluna contendo resina XAD-2 (2,5 x 11 cm). Após aplicação da amostra, lavaram-se as resinas com 1 litro de água. Aluiu-se o pr£ duto com uma mistura de metanol/água, a 90 (v/v). Efectuou- -se depois a cromatografia numa coluna de gel de sílica (5x30 cm). A fase móvel era constituída por uma mistura de clorofór mio/metanol (98 í 2, v/v). Combinaram-se as fracçães contendo o produto e após liofilisação obteve-se 0,17 g que se analisou como uma goma contendo 0,9 equivalentes de água (24 fo): pf <£^25°C; agregaram-se as fracções contendo TLC Rf 0,83 e, após liofilização obteve-se 0,391 g de 6-metilaminopurina-9--/3-2·,3'-didesoxi-ribofuranosido que se analisou, verifican-do-se que se encontrava sob a forma de um 0,1 hidrato. o (gel de sílica, CHCly CiLjQE/9 : 1)5 [ος]= -27?2° (c - - 0,5, BMP); UV ^max ($χ 103) a pH 7, 287 nm (22,5), = 45 = * i

263 nm (13,9)} a pH 13,287 nm (21,3), 263 nm (l3,l).

Análise Calculada para C^H20Ng020.9H?0 t

Calculado s C, 52,46? H, 6,85? N 26,22.

Encontrado : C, 52,60; Η, 6,75» N, 26,15.

Dados de RM í XH-RMN (200 MHz, DKSOdg) :^7,95 (s, 1H, Hg), 6,05 (m, 1H, H^), 5,79 U, 2H, NHg), 4,99 (t, 1H, J * 5,57 Hz, 5' oh), 4,04 (m, 1H, H^,), 3,53 (m, 2H, 5‘ CIi2), 3,23 (s, 3H, CH3), 3,21 (m, 1H, CH) , 2,3 (m, 2H, 2· CHg) , 2,0 (m, 2H, 3' CH2), e 0,80 e 0,65 (2 miltipletos, 2H e 2H, 2--CH2).

Exemplo 43 2-amino-6-sec-butoxipurina-9-β -D-21«3 * -didesoxi-ribofurano-sido

Di s s o1veu-se 2-aminõ-6-se c-butoxipurina (o,5 St 2,4 mraoles) em 10 ml de dimetilformamida e dimetilsul fóxido (l í l). Adicionou-se 2’,3*-desoxitimidina (0,65 g, 2,89 mmoles), 30 ml de tampão de fosfato de potássio 10 mH a pH 6,8 e purina-nucleosido-fosíorilase (20 000 I.U.) e timidi no-fosforilase (10 000 I.U.) imobilizadas sobre DEAE-celulose e, agitou-se a solução a 37°C, durante 2 dias. Efectuou-se a cromatografia do filtrado, numa coluna de AGI X2 (hidróxido), 2,5 x 9 cm, seguindo-se-lhe uma coluna de XAD-2 (2,5 x 15cm). Após aplicação das amostras, fez-se passar um litro de água através das colunas. Eluiu-se o produto com uma mistura de me^ tanol/água a 90 $. Combinaram-se as fracçães que continham o produto e removeu-se o solvente sob vácuo. Depois efectuou-se a cromatografia do resíduo numa coluna de gel- de sílica (5 x x 20 cm) com uma fase móvel de metanol/água (9 í l). Seguiu-se a esta operação, a cromatografia numa coluna Sephadex G10 (5 x 90 cm) em n-propanol a 30 $. Após combinação das fracçães = 46 =

Formulação B mg/comprimido mg/comprimido (a) Ingrediente activo 250 250 (b) Lactose 150 - (c) Ávicel PH 101 ÓO 26 (d) Povidona B.P. 15 9 (e) Amido-glicolato de sódio 20 12 (f) Estearato de magnésio 5 —1 500 300

Formulação C BEÍ comprimido

Ingrediente activo Lactose Amido 100

Povidona Estearato de magnésio 200 5054359

Prepararam-se as formulações D e E que se seguem, por compressão directa da mistura de ingredientes. A lactose, da formulação B, e do tipo da compressão directa (Dairy Cresty - "Separox"). Formulação D mg/comprimido

Ingrediente activo Amido Pré-gelatinizado 250 150 400 = 48 =

Formulação S mg/comprimido 250 150 100 500

Ingrediente activo Lactose Avicel

Formulação F (Formulação de Libertação Controlada)

Preparou-se a formulação por granulação a húmido dos ingredientes (a seguir) com uma solução de povidona da adição de estearato de magnésio e compressão. mg/comprimido (a) Ingrediente activo (b) Hidroxipropilmetilcelu lose (Methocel K4M Premium) (c) Lactose B.P. (d) Povidona B.P. (e) Estearato de magnésio 500 112 53 28 7 700 Á libertação do fármaco efectuou-se durante um período de 6-8 horas e encontrava-se completa após 12 horas,

Exemplo 45

Formulaçães em Cápsulas Formulação A

Preparou-se a formulação para cápsulas, misturando os ingredientes da Formulação D, do Exemplo 44, anterior, « 49 as )¾ % e introduzindo a mesma numa cápsula de gelatina dura constituí da por duas partes. Preparou-se a formulação B, (infra), de modo idêntico.

Formulação B mg/cápsula (a) Ingrediente activo 250 (b) Lactose B.P. 143 (c) Amido-giicolato de sódio 25 (d) Estearato de magnésio _2 420 Formulação C mg/cápsula (a) Ingrediente activo 250 (b) Macrogol *1-000 B.P. 350 600

Prepararam-se as cápsulas da formulação C fundido Macrogol k 000 BP, dispersando o ingrediente activo no produto fundido e introduzindo esse produto fundido numa cápsu la de gelatina dura constituída por duas peças.

Formulação D mg/cápsula

Ingrediente activo Lecitina dleo araquídico Prepararam- 250 100 100 450 se as cápsulas da Formulação D efeçj = 50 =

tuando a dispersão do ingrediente activo em lecitina e óleo ara quídico e introduzindo a dispersão em cápsulas de gelatina, elas tica, macia.

Formulação E (Cápsula de Libertação Controlada)

Prepararam-se as seguintes formulações em cápsula, de libertação controlada, extrudindo os ingredientes a, b e c, numa extrusora, seguindo-se a esferonização e secagem do extrudido. Depois, revestiram-se os agregados secos com uma membrana de libertação (d) e introduziram-se numa cápsula de ge latina dura, constituída por duas peças. mg/cápsula (a) Ingrediente activo 250 O) Celulose microcristalina 125 (c) Lactose B.P. 125 (c) Etil-Celulose 13 513

Exemplo 46

Formulações Xn.jectáveis Formulação A

Ingrediente activo 0,200 g

Solução de ácido clorídrico, 0,1M, ou Solução de hidróxido de sódio, Q,1M a.b. para pH 4,0 a 7,0 água esterilizada a.b. para 10 ml

Dissolveu-se o ingrediente activo na maior parte de água (35°C--40OC) e ajustou-se o pH de modo a situar--se entre 4,0 e 7,0 com ácido clorídrico ou com hidróxido de 51 *

\ sódio, conforme adequado. Depois prefez-se o lote até ao volu me com água e filtrou-se através de um filtro microporoso este rilizado para dentro de pequenos frascos de vidro de cor âmbar esterilizados, de 10 ml (tipo l) e vedaram-se com tampas e cin tas esterilizadas.

Formulação B

Ingrediente activo 0,125 g

Tampão fosfato a pH 7» isento de hidrogénio q.b. para 25 ml

Exemplo 47

In.jecçSes Intramusculares

Ingrediente activo 0,20 g Álcool benzílico 0,10 g

Glicofurol 75 1,45 g Água para injecção q.b. para 3,00 ml

Dissolveu-se o ingrediente activo em glicofurol. Depois adicionou-se e dissolveu-se o álcool benzílico e, adicionou-se água até 3 ml. Depois, filtrou-se a mistura a- traves de um filtro microporoso, frascos de vidro de cor âmbar de

Exemplo 48 Xaropes

Ingrediente activo Solução de sorbitol Glicerol

Benzoato de sódio

Aromatizante, pera 17.42.31^9 Água purificada q.b, para esterilizado e vedou-se em 3 ml, esterilizados (tipo l). 0,25 g 1,50 g 2.00 g 0,005 g 0,0125 ml 5.00 ml * 52 -

*

Dissolveu-se o ingrediente activo numa mistura de glicerol e na maior parte da água purificada. Depois, a dicionou-se à solução uma solução aquosa de benzoato de sódio, seguindo-se a adição de uma solução de sorbitol e, finalmente, de aromatizantes. Perfez-se o volume com água purificada e me-xeu-se bem.

Exemplo 49

Supositórios mg/supositório 25O 1770 2020

Ingrediente activo (63 m)*

Gordura Pesada, BP (¥itepsol H15 - Dynamit NoBel)

Fundiu-se um quinto de Xíitepsol H15 numa panela de pressão, a uma temperatura máxima de 45°C. Fez-se passar o ingrediente activo através de um crivo de 200 me, adicionou--se à base fundida, mexendo sempre, utilizando um Silverson e-quipado com uma cabeça cortante até se obter uma dispersão homogénea. Conservando a mistura a 45°0, adicionou-se à suspensão o restante ¥itepsol Hl 5 e agitou-se até se assegurar a homogeneidade da mistura. Passou-se toda a suspensão através de um crivo de aço inoxidável de 250 m, e, deixou-se arrefecer até 40°C, agitando continuamente. A uma temperatura entre 38 e 40°cJ introduziu-se 2,02 g de mistura no interior de moldes plásticos de 2 ml. Deixaram-se arrefeceroos supositórios até à temperatura ambiente.

Exemplo 50 Pessários mg/pessário 250

Ingrediente activo (63 m)

λ

Pessários (Continuação) mg/pessários 25O Dextrose anidra 3 80 Amido de batata 363 Estearato de magnésio _1 1000

Misturaram-se, directamente, os ingredientes anteriormente referidos, e prepararam-se os pessários por com pressão directa da mistura resultante.

ACTIVIDADE ANTIVÍRICA

A. Actividade Antivírica contra o Yxrus (HBV) da Hepatite B

Demonstrou-se que a linha celular produtora de HBV humana de HepG2, 2,2,15, descrita e caracterizada por Sells e outros, PNAS 8k s 1005, 1987 e J. Virol. 62 : 2836, 1988, partilhava muitas das características dos hepatócitos cro nicamente infectados por HBV, é infecciosa, tal como se demonstrou pela sua capacidade para originar doenças em chimpanzés. Utilizou-se esta linha celular, in vitro para se identificarem os compostos com actividade anti-HBV.

Para se ensaiarem os compostos quanto à sua actividade antivírica, trataram-se com os composto 50-200/fUM, culturas em monocamadas, durante dez dias. Ao terceiro, sexto e décimo dias, recolheram-se os meios sobrenadantes contendo viriães de ADN (partículas de Dane), trataram-se com proteínas K (l mg/ml) e dodecil-sulfato de sódio (l fo) com iguais volumes de fenol, seguindo de clorofórmio e, depois, efectuou--se a sua precipitação com acetato de amónio e propanol. Dijs solveu-se o ADN precipitado e recolheu-se sobre nitrocelulose utilizando o procedimento de Scheicher e Shurll (s & S, 10

Claims

Optical Ave., Keene, NH 03431» Publication =1=700, 1987) e tratou-se tal como descrito por Southern, J. Mol. Biol, 98: : 503» 1975· Hecolheram-se as células, obteve-se o ADN in tracelular por lise com isotiocianato. Manipulou-se o ADN intracelular de modo idêntico ao do ADN extracelular. Após precipitação com acetato de amónio e propanol, dissolveu-se o ADN intracelular precipitado, cortou-se com a enconuelease de restrição, HindIII, aplicou-se sobre gel de agarose e, depois tratou-se tal como descrito por Southern para se determinar a quantidade de formas de replicação intermédias. Determinou-se o efeito antivírico do fármaco medindo, pelo menos, 100 vezes uma redução na quantidade de par ticulas de Dane extrudidas, no meio de cultura e um decréscimo idêntico nas formas intermédias de replicação intracelulares. 0 composto do Exemplo 42, designadamente, 2--amino-6-(ciclopropilmetilamino)purina-9-^8-3-2',31-didesoxi--ribofuranosido, demonstrou possuir uma poderosa capacidade i-nibidora de HBV a 100 joM, B. Actividade Antivírica Contra o Vírus de Imunodeficiência Humana Adquirida (HIV) Determinou-se a actividade anti-HIV, de acordo com o método de Averett, D.R,, J. Virol, Methods, 23 263--276 (1989). 0 composto do Exemplo 42, nomeadamente, 2-amino- -6-(ciclopropilmetilamino)purina-9-/S -D-21,31-didesoxi-ribofura nosido, possuía uma C1^Q média de 17»7 uM, (n - l) contra HIV-1 e, de 13,3 /aM (n = 6), contra. HIY-2. REIVINDICAÇÕES - IS - Processo para a preparação de um composto de = 55 = fórmula (i)

(I) g), aleoxiÍG^-Cg), e/ou ciclo- em que R^ representa um átomo de hidrogénio ou um grupo ami-no; e Rp representa halogéneo, alcoxi (C^-Cg) opcionalmente substituído por ciolo-alquilo (C^-C^); ciclo-alquiloxi (C^--Cg); ariloxi, aralquilo ou aralquiloxi nos quais o grupo ari-lo pode opcionalmente ser substituído cora alquilo inferior, hidroxi ou halogéneo; ciclo-alquilo (C^-Cg)-tio; alquilíC^-Cg) -tio; aril-tio ou aralquil-tio nos quais o radical arilo pode opcionalmente ser substituído com alquilo inferior, hidroxi ou halogéneo; ou Rg representa um grupo heterocíclico contendo um átomo de oxigénio ou um ou dois átomos de azoto, e 3 a 7 átomos de carbono com duplas ligaç6‘es opcionais no anel contendo opcionalmente um hetero-átomo de enxofre e/ou oxigénio e opcionalmente substituído no anel por um ou mais grupos de alqui lo inferior, hidroxi ou átomos de halogéneo, grupos ciclo-alquilo (C^-C^)-tio, aralquil-tio no qual o grupo arilo pode ser substituído por alquilo inferior, hidroxi ou halogéneo; ou representa um grupo imidazolil-tio no qual o radical imidazoli-lo pode ser substituído com alquilo inferior e/ou C-substituí-do com nitro; ou representa um grupo amino que é mono- ου di-substituído por alquilo (C^-C alquilo(C^-Cg), arilo, aralquilo no qual o radical arilo pode opcionalmente ser substituído por alquilo inferior, hidroxi ou halogéneo, alilo opcionalmente substituído por grupos mono • 56 “

* e R^ representa hidrogénio ou amino; e di-alquilo ou alcoxi; seus derivados farmaceuticamente aceitáveis, diferentes de ura composto de fórmula X na qual R^ e representam hidrogé nio e representa um grupo metoxi ou metil-tio, caracteriza do por: a) se fazer reagir um composto de fórmula geral (li)

(em que R^, R^ e R^ são como definido anteriormente e A representa uni grupo precursor para o grupo hidroxi) , com um agen te ou sob condições para converter o referido grupo precursor no grupo desejado; ou b) se fazer reagir uma base de purina de fórmula (III) B - Η (III) em que B é uma base de purina como anteriormente, em que R^, e são como definido anteriormente ou no seu equivalente funcional, com um composto que serve para introduzir o anel di-desoxi-ribofuranosilo na posição 9 de base de purina da fórmula (ill); e depois, ou simultaneamente, se efectuar uma ou mais das seguintes conversões opcionais: i) quando se forma um composto relacionado desejado, se con verter o referido composto num seu derivado farmaceuti- 57 = *

camente desejado, ii) quando se forma um derivado farmaceuticamente aceitável do composto relacionado desejado, se converter o referi do derivado no composto relacionado, ou um seu derivado diferente; e se converter subsequentemente o referido composto de fórmula (i) ou um seu derivado farmacêutica mente aceitável numa composição farmacêutica para o tra tamento ou profilaxia de uma infecção virai da hepatite--B. - 25 - Processo para a preparação de 2-amirio-6--(ciclo-propil-metil-amino)purina-9-β -D-r±bofuranosido e seus derivados farmaceuticamente aceitáveis, caracterizado por a) se fazer reagir um composto de fórmula (li)

(em que R^ representa amino, representa ciclo-propil-me- til-amino, R^ representa hidrogénio e A representa um precursor para o grupo hidroxi), com um agente ou sob condiçães para converter o referido grupo precursor no grupo desejado, ou b) se fazer reagir uma base de purina de fórmula (ill) B - H (Hl) em que B r2 es3 é uma base de purina como anteriormente em que R^, são como definido anteriormente ou um seu equivalente 58 *

* po precursor no grupo desejado} ou b) fazer-se reagir uma base de purina de fórmula (lll) B - H ou um seu equivalente funcional, com um composto que serve para introduzir o anel didesoxi-ribof uranosilo na posição 9 de uma base de purina da fórmula (lll)} e depois, ou simultaneamente, se efectuar uma ou mais das seguintes conversões opcionais% i) quando se forma um composto relacionado desejado, se converter o referido composto num seu derivado farmaceutica-mente desejado. ii) quando se forma um derivado farmaceuticamente aceitável do composto relacionado desejado, se converter o referido derivado no composto relacionado, ou um seu derivado diferente; e se converter subsequentemente o referido composto de fórmula (i) ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável numa composição farmacêutica para o tratamento ou profilaxia de uma infecção virai da hepatite B. t « 9 funcional, com um composto que serve para introduzir o anel di-desoxi-ribofuranosilo na posição 9 da base de purina de fórmula (ill)í e depois, ou simultaneamente, se efectuar uma ou mais das conversães opcionais seguintes; i) quando se forma o composto relacionado desejado, se converter o referido composto num seu derivado farmacêutica mente aceitável} ii) quando se reforma um derivado farmaceuticamente aceitável do composto relacionado desejado, se converter o referido derivado num composto relacionado, ou um seu derivado diferente , A requerente reivindica a prioridade do pedido norte-americano apresentado em 6 de Outubro de 1989, sob o N número de série 417,989· Lisboa, h de Outubro de 1990

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