PT95709B

PT95709B - Aparelho para a contagem e a determinacao de pelo menos uma subpopulacao leucocitaria

Info

Publication number: PT95709B
Application number: PT95709A
Authority: PT
Inventors: Didier Lefevre; Henri Champseix; Serge Champseix
Original assignee: Abx Sa
Priority date: 1989-10-27
Filing date: 1990-10-26
Publication date: 1998-07-31
Also published as: IE903847A1; KR910007483A; DE69017144D1; DE69017144T2; DK0425381T3; EP0425381A1; FR2653885B1; IE67378B1; JP3069795B2; CA2028474C; ATE118888T1; PT95709A; ES2071061T3; FI102324B1; FI102324B; US5138181A; CA2028474A1; EP0425381B1; JPH03170843A; ZA908601B

Description

APARELHO PARA A CONTAGEM E A DETERMINAÇÃO DE PELO MENOS UMA SUBPOPULAÇÃO LEUCOCITÁRIA”

A presente invenção tem por objecto a contagem e a análise de pelo menos uma subpopulação leucocitária e refere-se mais precisamente a um aparelho que assegura esta identificação por medição directa óptica e electrónica.

Independentemente dos processos manuais de contagem e de análise de uma subpopulação leucocitária, que consistem em visualizar no microscópio amostras de sangue espalhadas numa lâmina e previamente coloridas, há processos automáticos muito mais eficazes e precisos que permitem diferenciar simultaneamente vários tipos de populações sanguíneas. Conhecem-se essencialmente dois tipos de processos de análise: os processos de análise de dimensões por resistividade e os processos de análise óptica.

A análise e a contagem automática por resistividade baseiam-se no princípio de passagem de uma célula num campo eléctrico onde ê mantida uma corrente constante. A resistência que opõe esta célula no campo provoca um aumento da tensão necessária para manter constante a corrente, de acordo com a lei de Ohm. 0 impulso de tensão, gerado pela passagem desta célula, ê proporcional â resistência oposta, portanto ao seu volume, sem consideração da forma. A fim de determinar uma subpopulação leucocitária por este princípio, é necessário tratar previamente a amostra ί

-2de sangue por meio de agentes citoquímicos específicos que permitam a destruição parcial das células que não devem ser consideradas, isso a fim de obter uma discriminação de dimensões tão precisa como a exigida pela especificidade do tratamento.

processo de diferenciação mais correntemente usado com este princípio é o processo denominado Screening Leucocytaire, que permite obter uma aproximação da fórmula sanguínea em três populações: os linfócitos, as células mononucleadas e os granulócitos.

essencial da análise assenta na utilização de um reagente lítico de acção diferencial. Por meio deste reagente, as membranas dos leucócitos deixam escapar o conteúdo do citoplasma. As células que não têm grânulos contidos no seu citoplasma encontram-se portanto com a membrana citoplásmica revestindo o seu núcleo; os granulócitos, por sua vez, conservam uma parte do citosol, impedindo os seus grânulos parcialmente a sua fuga.

inconveniente principal deste processo reside no facto de que os leucócitos apenas são diferenciados pela sua dimensão final e a acção da lise sobre certas células, designadamente as eosinófilas e as basófilas, não é totalmente dominada, o que provoca frequentemente uma sobreposição parcial ou mesmo total das populações, que torna a diferenciação impossível ou muito aleatória.

Por outro lado, a análise e a contagem de uma subpopulação leucocitária pelos processos ópticos utilizam ou o princípio de medição de difracção óptica, ou o princípio de medição de den-

-3sidade óptica de uma célula, ou uma combinação das duas.

No primeiro caso, uma célula que atravessa um raio luminoso gera uma difracção da luz incidente, cuja intensidade em ângulos diferentes é função das dimensões da célula e da quantidade de luz absorvida por esta.

Um colector óptico que tem no seu centro um disco de fundo negro é colocado no alinhamento do trajecto óptico. A luz transmitida é detida pelo disco, enquanto a luz difractada ê recolhida num sensor fotossensível cuja resposta é proporcional à difracção da célula.

No segundo caso, uma célula que atravessa um raio luminoso, gera uma absorvância da luz incidente. A luz transmitida é filtrada para o comprimento de onda correspondente à coloração da célula, é depois recolhida num sensor fotossensível cuja resposta é proporcional à luz absorvida no comprimento de onda sepecifiçado.

Estando a difracção celular ligada à absorvância da célula, bem como à sua forma, as medições de volume continuam aleatórias, em especial no que se refere aos leucócitos, sendo necessário tornar artificialmente esféricas as células a medir. Nota-se também que uma célula de grandes dimensões muito colorida será vista menor do que as suas dimensões reais.

Utilizam-se combinações destes princípios para se obter, para uma mesma célula, valores de difracção e de intensidade de coloraçao ou valores de difracção com comprimentos de onda diferentes, ou ainda, valores de difracção a ângulos diferentes. Por «ί-*»

-4- Ζ Λ intermédio de meios citoquímicos específicos obtêm-se uma discriminação celular.

Os aparelhos que utilizam estes princípios padecem de uma grande sensibilidade do alinhamento óptico que torna as medidas de difracção com uma estabilidade relativa. Numerosos factores fragilizam igualmente a medição tais como, em especial, a sujidade da cuba de leitura e a sensibilidade das partes ópticas às poeiras atmosféricas, à temperatura e à higrometria do local. Além disso, a elevada tecnicidade necessária num conjunto óptico eficaz tornam o custo do aparelho pouco atraente.

A presente invenção tem pois por objecto um aparelho que evita os inconvenientes inerentes aos aparelhos que aplicam os processos atrás mencionados e que permite a identificação, a contagem e/ou a análise de pelo menos uma subpopulação leucocitária e, em particular, as polinucleares eosinófilas.

Assim, o objecto da presente invenção consiste num aparelho para a contagem e a determinação de pelo menos uma subpopulação leucocitária que utiliza pelo menos em parte um processo de análise e de contagem por resistividade baseado no princípio de passagem de uma célula num campo eléctrico, no qual é mantida uma corrente constante, que fornece um sinal que é interpretado com vista a obter uma informação sobre o volume da célula que atravessa este campo e utilizando pelo menos em parte um processo óptico que consiste em fazer passar uma célula num raio luminoso e em recolher num leitor óptico a luz absorvida pela célula para fornecer um sinal, interpretado com vista a obter uma infor/

-5inação sobre a absorvência da célula, compreendendo o aparelho essencialmente uma caixa para a injecçâo do fluxo de amostra a analisar, no interior de uma cuba de medição, a qual ê atravessada por um feixe luminoso, recolhido por um sensor, sendo o fluxo de amostra envolvido hidrodinamicamente no interior da cuba por pelo menos um líquido de ligação ou de envolvimento sob pressão, injectado na cuba por pelo menos uma conduta de alimentação, sendo no referido aparelho os eléctrodos para as medições de resistividade da subpopulação leucocitária elementos constitutivos da caixa de injecçâo, e segundo o qual se prevêm circuitos de preparação e de alimentação dos fluxos de amostra e de líquidos de envolvimento, a montante da caixa de injecçâo, enquanto se preveem, a jusante da caixa de injecçâo, unidades de recolha e de tratamento dos sinais fornecidos pelo sensor óptico e pelos referidos eléctrodos, sendo as informações tratadas por um calculador e restituídas graficamente e/ou numericamente.

Segundo uma caracteristica da presente invenção, monta-se um injector externo no interior da caixa, que termina por um furo calibrado, que estabelece a ligação entre a câmara interior e o referido injector com a cuba, para a emissão de um primeiro líquido de envolvimento.

Vantajosamente, forma-se uma câmara anular entre uma parte cónica do injector exterior e uma fase interior da caixa; essa câmara comunica com a cuba de medição e é alimentada com fluido sob pressão pelo menos por uma conduta.

De acordo com uma outra característica particular da pre-6sente invenção, monta-se um injector interior no interior do injector exterior, tendo um orifício de injecção de fluido sob pressão proveniente de uma conduta que desemboca numa câmara interior ao referido injector exterior no alinhamento do orifício calibrado.

A presente invenção prevê também paredes de vidro de um lado e do outro da cuba de medição, as quais são enquadradas por, de um lado, uma lâmpada e, do outro, por um sensor que recebe o feixe emitido pela lâmpada e focado por elementos ópticos, que atravessou o fluxo envolvido da solução a analisar, que passa na cuba.

Por outro lado, os eléctrodos de medição de resistividade são constituídos, por um lado, pela peça terminal da conduta de evacuação do fluxo envolvido de solução que sai da cuba e, por outro lado, pelo injector interior da solução a analisar.

A interpretação dos resultados fornecidos pelo aparelho é vantajosamente obtida segundo a presente invenção pelo facto de as informações provenientes das medidas de resistividade serem restituídas numa curva de distribuição de tamanhos que permite localizar entre um limiar inferior e um limiar superior a população principal de leucócitos, separando os estromas e as plaquetas, bem como as partículas de dimensões muito grandes.

Igualmente, as informações provenientes das medidas ópticas sã© restituídas por uma curva de distribuição das absorvências que permite localizar entre um limiar inferior e um limiar superior a absorvência dos leucócitos, separando as populações

-7- A de células pouco absorventes bem como as populações de células de absorção intensa.

Além disso, parece também ser vantajoso que as informações provenientes das medidas de resistividade e das medidas ópticas possamt ser restituídas numa representação gráfica e matricial, permitindo visualizar contornos representativos da distribuição das populações.

Outras características e vantagens da presente invenção serão melhor compreendidas na leitura da descrição que vai seguir-se com referência aos desenhos anexos, cujas figuras representam:

A fig.l·1,uma vista em corte da caixa de injecção;

A fig. 2, uma vista esquemática dos circuitos de preparação e de tratamento associados ao aparelho;

A fig. 3, uma curva de distribuição das dimensões dos leucócitos analisados;

A fig. 4, uma curva de distribuição das absorvências dos leucócitos analisados; e

A fig. 5, uma representação gráfica matricial dos contornos representativos da distribuição das populações.

aparelho representado na fig. 1 compreende uma caixa de injecção (1) de forma genericamente cilíndrica, cuja parte superior apresenta um perfil cónico (2). 0 orifício (3) da caixa (1) está tapado em pelo menos duas faces opostas, por paredes de vidro (4), entre as quais está colocada uma cuba de medição (5) que comunica pela sua parte inferior com a caixa de injecção e

-8desemboca na sua parte superior numa conduta de evacuação (6).

Um tampão (7), aplicado nas paredes de vidro (4), mantêm a cuba (5) e serve igualmente de suporte à peça terminal ou bocal (8) da conduta de evacuação.

No interior da caixa de injecção (1) está montado, de maneira estanque, devido a juntas tóricas (9), um injector exterior (10) cuja extremidade superior (11) de forma cónica desemboca na base da cuba de medição (5). Esse injector termina por um orifício calibrado (12), por exemplo uma pedra com um furo, que estabelece a comunicação da câmara interior (18) do referido injector com a cuba (5). Notar-se-á que entre a face interior da parte cónica (2) da caixa de injecção e a face exterior da extremidade cónica (11) do inj ector (10) se encontra uma câmara anular (13) que comunica igualmente com a cuba de medição. Esta câmara (13) ê alimentada com fluido sob pressão por uma conduta (14).

No interior do injector exterior (10) está montado de maneira estanque, devido a juntas tóricas (15), um injector interior (16), cuja extremidade superior (17), também de forma cónica, se estende para a câmara interior (18) do injector exterior (10), por baixo do orifício calibrado (12). A câmara (16) é, por sua vez, alimentada com fluido sob pressão por uma conduta (19). Do mesmo modo, o injector interior é atravessado por uma conduta (20) que permite a injecção de fluido sob pressão pelo orifício (21) do referido injector, no alinhamento do orifício calibrado (12). As duas paredes de vidro (4) são enquadradas por, de um lado, uma lâmpada (22) e, do outro lado, um sensor (23), de modo

-9tal que ο feixe luminoso (24) emitido pela lâmpada e focado por um projector óptico apropriado (25) atravessa estas paredes e a cuba de medição (5) e é recolhido pelo sensor depois da passagem através de um outro sistema óptico (26).

A solução de leucócitos a analisar é injectada pela conduta central (20) e escapa-se pelo orifício (21) para a câmara (18). Simultaneamente, injecta-se pela conduta (19) um líquido sob pressão, designado por líquido de ligação ou envolvimento, que efectua o envolvimento da solução numa manga hidrodinâmica, para o orifício calibrado (12). O fluxo ligado hidrodinamicamente proveniente desta primeira ligação atravessa portanto o orifício calibrado (12) e fica então submetido a uma segunda ligação realizada por injecção de líquido sob pressão pela conduta (14) sendo orientado no interior da câmara anular (13). Este fluxo dirigido desemboca pelo orifício (3) na cuba de medição (5), atravessada, perpendicularmente ao fluxo, por um feixe luminoso (24), concentrado e focado sobre o fluxo de solução de leucócitos. A circulação dos fluxos no conjunto de medição faz-se de baixo para cima, segundo um eixo vertical, evitando-se assim a estagnação de eventuais bolhas. 0 facto de se utilizar assim uma ligação hidrodinâmica dupla apresenta um certo número de vantagens.

A primeira ligação realiza uma centragem perfeita do fluxo de células num orifício de contagem e interdita, devido à finura do fluxo realizado e à relação de diluição, a passagem coincidente de várias células. Os fenómenos de deformação das células devidos aos efeitos dos bordos, bem como ao ricochete das célu/ y

-10las na zona de sensibilidade do orifício de contagem, são igualmente eliminados.

A segunda ligação hidrodinâmica envolve o fluxo que sai do orifício e mantém-no concêntrico e estabilizado durante todo o trajecto na cuba óptica, permitindo assim uma ou varias leituras sob ângulos diferentes e em níveis diferentes.

Esta segunda ligação permite utilizar uma cuba de leitura óptica com uma passagem interior grande que elimina as turbulências dos efeitos de bordo e o risco de conspurcação, que teria como consequência tornar o fluxo instável e a qualidade óptica medíocre.

O facto de utilizar uma cuba de grandes dimensões elimina igualmente a velocidade do fluxo nestas paredes; sendo essa velocidade reduzida, a erosão das paredes de vidro - que pode constatar-se a longo prazo nas cubas ópticas capilares nas quais a velocidade da envolvente deve ser igual à velocidade do fluxo - é diminuída.

A acumulação destas características, adicionada ao facto de o posicionamento do fluxo ser realizado pelo posicionamento do orifício de contagem, torna o alinhamento do feixe óptico sobre o fluxo extremamente estável. Uma desmontagem da cuba não justifica de modo algum uma regulação óptica depois da remontagem.

A contagem e a detecção do volume são asseguradas por medidas de resistividade. Para isso, aplica-se uma corrente aos terminais de dois eléctrodos situados de um lado e do outro do orifício (12), designadamente um ânodo, constituído pela peça

terminal (8) da conduta de evacuação, e um cátodo, constituído pelo injector interior (16). A contagem dos leucócitos ê feita quando da passagem da solução no orifício calibrado (12); cada célula que passa no orifício provoca um aumento da resistividade do meio situado entre os eléctrodos (8,16), criando assim um impulso de tensão proporcional ao volume do leucócito.

A detecção óptiea, isto é, a determinação da intensidade da absorção dos leucócitos é medida por meio do feixe luminoso (24) que atravessa a cuba (5) perpendicularmente ao fluxo a analisar. O feixe luminoso ê realizado por meio da lâmpada (22), cuja energia luminosa, que passa através de um filtro de comprimento de onda correspondente à absorção da célula, é, depois de uma janela, concentrada sobre um diafragma por detrás do qual está colocado o conjunto projector óptico (25), focado sobre o fluxo de solução de leucócitos. A imagem da janela luminosa atravessada pelo fluxo da solução, passa por um colimador, é depois projectada por outro sistema óptico colector (26) sobre um fotodíodo (23), a cujos terminais está ligado um amplificador.

Cada leucócito que atravessa o feixe luminoso provoca uma redução da intensidade luminosa medida no fotodíodo, proporcional à intensidade da sua absorção. Isso traduz-se por um impulso eléctrico nos terminais do amplificador, cuja amplitude é, por sua vez, proporcional à densidade óptiea do leucócito.

orifício calibrado (12) encontra-se, como se pode ver na fig. 1, ligeiramente desviado do feixe luminoso (24), que atravessa a cuba.

-12Notar-se-á que esta distância que separa o orifício (12) do ponto de focagem de medição óptica gera um desfasamento temporal dos impulsos resistivos e ópticos.

A constância deste desfasamento é controlada e permite pôr em evidência a menor queda de eficácia do dispositivo hidráulico.

As microbolhas são naturalmente eliminadas da contagem pela resistência ao fluxo vertical que opõe a bolha de ar, gerando assim um desfasamento nas contagens resistivas e ópticas maior do que o desfasamento normal gerado por uma célula.

Para ser tida em conta, uma célula sanguínea deve, antes da medição óptica, ser medida de maneira resistiva por uma passagem no orifício calibrado (12). Assim, as eventuais partículas contidas na manga líquida injectada depois do orifício de contagem não podem ser tidas em conta, por não terem gerado qualquer impulso resistivo.

Antes de proceder às injecções de sangue no aparelho atrás descrito, convém preparar a amostra de sangue a analisar, de modo a obter uma solução que contenha principalmente os leucócitos na sua forma mais natural possível. Se for necessário, as células podem ser coloridas especificamente por um meio citoquímico determinado.

Na fig. 2 representaram-se os circuitos de tratamento associados ao aparelho da fig. 1. Esquematizaram-se a caixa (1) e o seu conjunto óptico associado constituído pela lâmpada (22), o projector óptico (25), o sistema óptico colector (26) e o fo-

<» todíodo de recepção (23). 0 sangue admitido na caixa (1) pela conduta (20), bem como os fluidos de envolvimento na manga líquida admitidos pelas condutas (14) e (19) sofrem uma preparação e provêm de um conjunto de distribuição hidráulico (27), por sua vez alimentado por uma amostra de sangue proveniente de uma unidade (28) de mistura e de aquecimento. Os eléctrodos localizados na caixa (1) fornecem sinais proporcionais ao volume dos leucócitos recebidos num circuito analógico (29) de mdição de resistividade, sendo os sinais convertidos num valor digital numa unidade (30) de tratamento digital das informações. O fotodíodo (23), por sua vez, fornece sinais proporcionais à densidade óptica dos leucócitos recebidos num circuito analógico (31) de medição de absorvência, sendo esses sinais igualmente tratados na unidade (30), que fornece em seguida resultados gráficos (32) ou num éricos (33). O conjunto dos sinais de uma mesma amostra é tratado por meio de um calculador para determinar o número de leucócitos contados num tempo pré-estabelecido, bem como valores relativos de volume e de densidade óptica para cada um deles.

Quando a solução de sangue tratado passa no aparelho de medição (1), cada célula provoca alternadamente um impulso proporcional à sua dimensão, quando passa no orifício calibrado (12), depois um impulso proporcional à sua absorvência, quando da sua passagem no feixe luminoso (24). Para uma mesma célula, memorizam-se um valor de volume e um valor de absorvência e os resultados totais dos volumes e das absorvências são distribuídos segundo um histograma.

Numa curva de distribuição das dimensões apresentada a título de exemplo na fig. 3, na qual se representam em ordenadas as quantidades e em abscissas o volume, nota-se a presença de três populações distintas. A populaçao mais à esquerda, portanto a das partículas de pequenas dimensões, é considerada como sem o ruído de fundo constituído principalmente por estromas, resultantes da hemólise, e por plaquetas.

As outras duas populações da direita são consideradas como sendo a totalidade dos leucócitos da amostra analisada. Numa curva de distribuição das absorvências, apresentada também a título de exemplo na fig. 4, obtém-se uma primeira população à esquerda constituída por células pouco ou fracamente absorventes, uma segunda população central constituída por células com absorvência média, e uma terceira populaçao mais à direita constituída por células de grande absorvência.

Numa representação gráfica matricial apresentada também a título de exemplo na fig. 5, observa-se a repartição das populações segundo as dimensões no eixo dos X e segundo a absorvência no eixo dos Y. Esta representação permite o estudo dos leucócitos por um sistema de programação de taxonomia, permitindo o posicionamento de limiares a separação de pelo menos uma população de leucócitos, representando (Bdf) os ruídos de fundo (estromas mais plaquetas):

L : Linfócitos

M : Monócitos

PN : Polinucleares neutrófilos

-15PE : Polinucleares eosinófilos

PB : Polinucleares basófilos

A presente invenção não se limita às formas de realização descritas nem a este tipo de análises. Em especial, pode encarar-se, substituindo o filtro óptico por uma roda de filtros, a leitura das colorações múltiplas permitindo a análise de outros tipos celulares.

Além disso, falou-se anteriormente de uma cuba de medição óptica. De acordo com uma variante de realização será possível medir a difracção luminosa de uma célula que atravessa esta cuba, se um ou vários sensores forem colocados dispostos focalizados sobre a cuba, no alinhamento de um raio luminoso que atravessa esta última. As informações recolhidas, conforme se meça a difracção total ou as difracções segundo vários ângulos, permitem a determinação ou das dimensões relativas da célula ou, no caso de duas medições de difracção segundo dois ângulos diferentes, da dimensão e da densidade óptica relativa.

Em variante, seria possível também realizar uma medição citofluorescente, colocando um conjunto detector focado na cuba de medição, a 90° de um feixe de raios laser que a atravessa, devendo o conjunto de preparação da amostra ser adaptado para obter a fluorescência celular pretendida. As medidas assim obtidas permitem avaliar o volume da célula, por resistividade, e a sua fluorescência.

Numa outra variante, e sempre de acordo com o princípio do conjunto de medição, a corrente aplicada aos eléctrodos e cir-16culando no orifício de contagem pode ser uma corrente de alta frequência gue permite obter, de acordo com a forma dos impulsos recolhidos, uma identificação da composição interna da célula, ou seja a dimensão relativa do núcleo, mais denso do que o invólucro externo (citoplasma) da célula.

A combinação das variantes expostas atrás permite obter para um fluxo de células que atravessa a cuba de medição, simultaneamente o volume global de cada célula, associado à sua densidade óptica e/ou à sua fluorescência, bem como informações sobre a sua composição interna, designadamente a dimensão relativa do seu núcleo e/ou a sua forma relativa ou a sua regularidade.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1.- Aparelho para a contagem e a determinação de pelo menos uma subpopulação leucocitária. que utiliza, pelo menos, em parte, um processo de análise e de contagem por resistividade baseado no princípio de passagem de uma célula num campo elêctrico onde ê mantida uma corrente constante que fornece um sinal, interpretado com vista, a obter uma informação sobre o volume da célula que atravessa este campo, e utilizando, pelo me nos em perte, um processo óptico que consiste em fazer passar uma célula num raio luminoso e em recolher num colector óptico a luz absorvida pela célula para fornecer um sinal, interpreta do com vista a obter uma informação sobre a absorvência da célula, compreendendo o referido aparelho, essencialmente uma cai xa para a injecção do fluxo de amostra a analisar no interior de uma cuba de medição, que ê atravessada por um feixe luminoso recolhido por um sensor, caracterizado por o fluxo de amostra ser ligado hidrodinamicamente no . interior da cuba por dois líquidos de ligação sob-pressão injectados na cuba por duas condutas de alimentação separadas (14,19), envolvendo a segunda ligação ao primeiro fluxo ligado, por os eléctrodos para, as medições de re, sistividade da subpopulação leucocitária.serem elementos consti tutivos (8,16) da caixa de injecção e por se preverem circuitos de preparação e de alimentação dos fluxos de amostra e líquidos de ligação a montante da caixa de injecção,. enquanto as unidades de recolha e de tratamento (29,30,31) dos sinais fornecidos pelo sensor óptico e os referidos eléctrodos são previstos a montante da caixa de injecção,. sendo as informações tratadas por um calculador e restituídas graficamente e/ou numericamente.
2. - Aparelho de acordo com a reivindicação 1, caracteri, zado por se montar uma tubeira exterior de injecção (10), que termina por- um orifício calibrado (12), no interior da caixa (1) , e faz a câmara interior (18) da referida tubeira comunicar com a cuba (5) para a emissão do primeiro.líquido de ligação.
3. - Aparelho de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o orifício calibrado (12) estar deslocado do feixe luminoso (24) que atravessa a cuba (5).
4. - Aparelho de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se formar uma câmara anular (13) entre uma parte cónica (11) da tubeira exterior de injecção (10) e uma face inte rior da caixa (1) , por esta câmara comunicar com a cuba de medi ção (5) e ser alimentada com fluido sob pressão por uma conduta (14), para a emissão do segundo liquido de ligação.
5. - Aparelho de acordo com as reivindicações 1 e 2, ca racterizado por se montar uma tubeira interior de injecção (16) no interior da tubeira exterior- (10), a qual tem um orifício (21) de injecção de fluido sob. pressão, proveniente de uma condu ta (20) que.desemboca numa câmara (18) interior â referida tubeira exterior na direcção do oríficio. calibrado (12) .
6. - Aparelho de acordo com a reivindicação 1, que utiliza uma cuba de medição enquadrada por, de um. lado, uma lâmpara e, do outro lado, um sensor que recebe o feixe luminoso emitido pela lâmpada e focado por elementos ópticos, caracterizado por a cuba de medição (5) apresentar uma larga passagem interior para que. o fluxo duplamente ligado se mantenha concêntrico e estabilizado durante todo o seu trajecto na cuba.
7. - Aparelho de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se colocar um conjunto sensor focado sobre a cuba de medição (5), a 90° de um raio laser que o atravessa, com vista a realizar uma medição de citofluorescência.

-208. - Aparelho de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os eléctrodos de medição de resistividade serem cons. tituídos, por um lado, pela peça terminal (
8) da conduta de eva cuação (6) do fluxo ligado de solução que sai da cuba (5) , formando o ânodo e, por outro lado, pela tubeira interior de injec ção (16) da solução a analisar, que forma o cátodo.
9. - Aparelho de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o líquido a analisar e os fluidos de ligação provirem de um conjunto de distribuição hidráulico (27) alimentado por uma amostra proveniente de uma unidade (28) de mistura e de aque cimento.
10. - Aparelho de acordo com- a reivindicação 1, caracterizado. por as informações provenientes das medições de resistivi dade serem restituídas numa curva de repartição dos volumes que permite localizar entre pelo menos um limiar inferior e um limiar superior a população, principal de leucócitos, separando os estromas e as plaquetas, bem como as partículas de dimensão muito grande.
11. - Aparelho de acordo com a. reivindicação 1, caracterizado por as informações provenientes das medições ópticas serem restituídas numa curva de repartição das absorvâncias que permite localizar entre um limiar inferior e um limiar superior ζ .ο -21a absorvância dos leucócitos eliminando as populações de células pouco absorventes bem como as populações de células de absorvência intensa.
12.- Aparelho de acordo com as reivindicações 1, 10 e 11, caracterizado por as informações provenientes das medições de resistividade e das medições ópticas serem restituídas numa repre sentação gráfica em matriz, permitindo visualizar contornos repre sentativos da repartição das populações.