PT96451A

PT96451A - Processo para a preparacao do antibiotico alisamicina e de composicoes farmaceuticas que o contem

Info

Publication number: PT96451A
Application number: PT96451A
Authority: PT
Inventors: Christopher Milton Math Franco; Erra Koteswara Vijayakumar; Sugata Chatterjee; Binal Naresh Ganguli; Jurgen Blumbach; Herbert Kogler; Hans-Wolfram Fehlhaber
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1990-01-12
Filing date: 1991-01-10
Publication date: 1991-10-15
Also published as: KR910014509A; IL96921A0; NO910135L; NZ236734A; CA2034101A1; US5114967A; FI910139A7; EP0436935A1; JPH0515385A; AU634331B2; ZA91227B; NO910135D0; FI910139A0; FI910139L; IE910094A1; AU6925291A

Description

Descrição referente à patente de invenção de HOECHST AKTIEN-GESELLSCHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D--6230 Frankfurt am Main, República Federal Alemã(inventores: Dr. Christopher Milton Mathew Franco,Dr. Erra Koteswara Satya Vijayakumar, Dr. Sugata Chat-terjee, Dr. Bimal Naresh Gangu-li, Dr. Jurgen Blumbach, residentes na índia e Dr. Herbert Kogler e Dr. Hans-Wolfram Fehlhaber, residentes na República Federal Al.einã), para "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DO ANTIBIÓTICO ALISAMICINA E...DJB COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ftUF. O CONTÊM".

Descrição A presente invenção refere-se a novos antibióticos designados por "Alisamicina", a um processo para a sua preparação com uma nova estirpe de microrganismos pertencentes a espécie "streptomices", de uma cultura com o número HIL Y-88, 31582, seus mutantes e variantes, e a sua utilização como fármaco terapêutico.

A Alasamicina é um composto de fórmula I = 1 = 9'

Isolou-se a estirpe Str. sp. Y-88,31582 a partir de. solo recolhido em Alibag, Maharashtra, índia. Essa estirpe foi depositada de acordo com as condições'do tratado de Budapeste com o "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Brauns-chweig" em 4 de Outubro de 1989 (DSM No. 5559). Ê possível conter variantes e mutantes da cultura número HIL Y-88,31582 recorrendo a um processo conhecido em que se utiliza o mutageno, tal como a N-metil-N-nitro-N-nitroso-guanidina ou a radiação ultra violeta. 0 micro organismo Str. sp. Y-88,31582 pertence à ordem dos Actinomycetales, família dos Streptomycetaceae, e género Streptomices.

Admite-se que a estirpe Str. sp. Y-88,31582 seja uma estirpe nova uma vez que difere das estirpes conhecidas em algumas das suas características morfológicas, culturais e fisiológicas.

Admite-se ainda que seja uma estirpe nova devido ao facto de produzir um novo composto antibiótico designado por Alisamicina ao qual se referira a memória descritiva que 2 fs se segue.

Conforme é evidente em conformidade com a memória descritiva pormenorizada da presente invenção, a Alisami- I cina da presente invenção pertence a classe de antibióticos Ma-

I j numicina, mas difere de todos os membros conhecidos desta cias- í se tais como Manumicina (J. Antibiotics 40, 1530-1554, 1987), i

Asucamicina (J. Amer. Chem. Soc. 101, 3402-3404, 1979), Cola- bomicina (J. Antibiotics 41, 1178-1195, 1988), U-54407 (J. An tibiotics 36, 950-956, 1983) e U-62162 (J. Antibiotics 35, 556-560, 1982). i

Os novos antibióticos da presente invenção, são activos in vitro contra diversas bactérias gram-positivas, I leveduras e fungos. Em consequência, podem ser utilizados como j fármacos terapêuticos em medicina humana e veterinária e também | nas técnicas de nutrição de animais.

De acordo com a presente invenção proporciona-se ainda um processo para isolar a estirpe Str. sp. Y--88,31582 a partir de solo utilizando um meio nutriente com um pH compreendido entre 6,5 e 8,5, utilizando um método conhecido.

Um meio nutriente utilizado para isolar o micro organismo a partir do solo e constituído por fontes de carbono e de azoto, sais nutrientes inorgânicos e agentes solidi-ficantes. As fontes de carbono podem ser, por exemplo, a glicose o amido, a dextrina, o glicerol, a sacarose ou os melaços. As fontes de azoto podem ser, por exemplo, a peptona, o extracto de levedura, o extracto de carne, a caseína do extrato de malte ou os amino-ácidos tais como argila ou a aspara-gina. 0 agente solidificante pode ser, por exemplo, o ágar. Os sais nutrientes inorgânicos podem ser, por .exêsaplo, os sais de sódio, de potáasio, de magnésio, de cálcio, de ferro, de zinco, de manganês, de cobre, de fósforo ou de enxofre .

Os microrganismos da presente invenção carac-terizam-se por micelios aereos incolores alongados a partir de micélius de substrato ramificado. Os esporos são formados em 3 cadeias lineares na parte superior dos micélius aéreos represen tativos da secção "Rectiflexiblis". Não foram observados esporos enrolados ou ascosporos. As cadeias de esporos maduros contêm mais de 30 esporos cada uma. Tomando como base as carac terísticas culturais e morfológicas do microrganismo em diversos meios de ágar e também uma análise das paredes celulares que demonstrou a presença de ácido LL-diaminopimelico, identificou-se o organismo produtor como sendo Streptomices sp.

J É evidente para os especialistas na matéria que a presente invenção não fica limitada ao organismo particu-í lar anteriormente especificado, englobando também os mutantes e variantes espontâneos e artificiais derivados desse microrganismo, os quais sejam capazes de produzir um novo antibiótico Alisamicina.

De acordo com a presente invenção proporciona-se também um processo para a produção de Alisamicina, consistindo esse processo em cultivar a estirpe Str. sp. Y-88,31581 por fermentação para valores de pH compreendidos entre 6,0 e 9,0, de preferência compreendidos entre 6 e 7, e uma temperatu- o ο Λ ra compreendida entre 18 -40 C,de preferencia compreendida en-o o , tre 20 e 37 C, sob condições aerobicas num meio nutriente que contenha fontes de carbono e de azoto, sais inorgânicos nutrientes e elementos raros, isolando-se depois o composto a partir do caldo de cultura por um processo conhecido tal como agora descrito.

As fontes de carbono utilizadas num meio nutriente para a produção de novos antibióticos, podem ser, por exemplo, a glicose, o amido, a dextrina, o glicerol, a sacarose, os melaços ou óleos. As fontes de azoto utilizadas no meio nutriente para a produção dos novos antibióticos, podem ser, por exemplo, a farinha de soja, o extrato de levedura, o extrato de carne, o extrato de malte, licor de infusão de cereais, peptona, gelatina ou caseina. Os sais inorgânicos nutrientes utilizados no meio nutriente para a produção dos no- vos antibióticos podem ser, por exemplo, o cloreto de sódio, o [ sulfato de magnésio, o sulfato de amónio ou o carbonato de 4 cálcio. Como elementos raros pode utilizar-se por exemplo, fer ro, manganês, cobre, zinco ou cobalto.

De preferência cultiva-se estirpes Str. sp. Y-88,31582 a uma temperatura próxima de e para um pH com um valor próximo de 7,0. Preferencialmente interrompe-se a fer mentação decorridas 23-48 h. o que corresponde aos rendimentos máximos compostos obtidos. De preferência a fermentação pode ser do tipo submergido. 0 processo de fermentação e a formação dos novos compostos antibióticos podem ser controladosppela actividade anti-bacteriana do fundo da cultura e dos correspon* dentes micelius por contraste com a estirpe Staphylococcus au-reus 209 P em meio de ágar e por cromatografia de camada fina sobre placas de gel de sílica e utilizando o acetato de etilo como solvente de processamento.

Se desejado, pode utilizar-se o agente anti-

(D -espumante tal como "Desmophen (um poliéter de cadeia linear com base em óxido de propileno da Bayer Ag. , Leverkusen) num meio nutriente durante a fermentação da cultura. A Alisamicina pode ser obtida a partir do cal do de cultura, por exemplo, por extracção com um solvente imis-cível com a água depois de se ter ajustado o pH para um valor compreendido entre 6,5 e 7,5. Os solventes utilizáveis podem ser o acetato de etilo ou o clorofórmio; de preferência utili-za-se o acetato de etilo e é preferível que o pH tenha o valor de 7,0. 0 extrato do solvente é concentrado para se remover esse solvente e depois submete-se a cromatografia. Tambéms se pode obter a Alisamicina a partir do caldo de cultura por absorção directa com absorventes adequados tais como a "Amber-(§) lite w XAD-4 ou 7" (resina absorvente porosa à base de polis-tireno ou de ésteres de ácido acrílico- Rohm and Haas Co., (b) U.S.A. "Diaion w HP 20) resina absorvente de elevada porosidade à base de um polímero de polistireno/divinil-benzeno, Mitsubishi Chemical Industries, Japan; o absorvente preferido / (s) é a "Diaion“/ HP-20" . A eluição do composto de azacordo com a presente invenção efectua-se a partir do absorvente utilizando fases móveis adequadas.,tais como o metanol ou a acetona, qual- 5 quer delas isoladamente em combinação uma com a outra ou combinadas com a água e os produtos da eluição são depois submetidos a evaporação até à secagem. 0 eluente preferido é o etanol. Os produtos activos da eluição assim obtidos são reunidos e concentrados. Os produtos de eluição concentrados ou extratos an-teriormente referidos contendo "Alisamicina" ainda podem ser purificados por diversas vias. Por exemplo, recorrendo a processos de reabsorção e eluição com bcarbono activadof "Amber- /g\ (5) lite ^ XAD-4 pou 7" e "Diaion HP-20" filtração em gel com o gel "Sephadexw LH-20" (Pharmacia Fine- Chemicals AB, Suécia) e seus equivalentes cromatografia por absorção sobre alumina e gel de sílica, podendo todos estes processos ser combinados convenientemente com melhor purificação. Além disso, pode recorrer-se a utilização da cromatografia de camada fina, da cro-matografia em líquido deppressão média e de pressão elevada com absorventes adequados tais como o gel de sílica e o gel de sílica C-18 modificado com sistemas solventes adeqaudos. Por outro lado, também se obtêm bons resultados recorrendo a croma-tografia em contra-corrente com um sistema solvente bifásico. De preferência utiliza-se normalmente a cromatografia sobre gel de sílica utilizando o acetato de etilo e o clorofórmio como solventes de eluição. Existe outro processo de purificação que pode ser utilizado isoladamente ou em combinação com os processos de purificação referidos antes, que se baseia na solubilidade diferencial da Alisamicina em solventes orgânicos. Os extratos ou produtos de eluição concentrados anteriormente referidos contendo Alisamicina podem ser precipitados com hexa-no, repetitivamente por um processo conhecido. Também se pode precipitar a Alisamicina a partir de metanol/água (99:1) para remoção das impurezas. Finalmente a Alisamicina pode cristalizar num solvente adequado ou numa mistura de solventes. 0 solvente preferencial é o acetonitrilo. A Alisamicina é um pó cristalino amarelo té-nuo, é fracamente solúvel em água, em metanol, em hexano e em éter de petróleo, é razoavelmente solúvel em acetonitrilo, em cloreto de metileno, em acetato de etilo e em clorofórmio. É bastante solúvel em propileno-glicol e em dimetil-sulfóxido. 6

Esse composto funde a uma temperatura superior a 2502C com decomposição.

Nos sistemas de cromatografia de camada fina (CCF) adiante referidos a Alisamicina apresentou os seguintes valores Rf:

Placa de CCF: placa pré-revestida de gel de sílica: Artigo No. 5554 da E. Merck, Darmstadt.

Rf da

EtOAc

CHC12:MeOH

Alisamicina |! 0,51 0,44

Nos resultados analíticos da cromatografia em líquido de elevada pressão (CLEP) efeetuada utilizando as condições a seguir referidas obteve-se o valor RT=3,5 minutos S Carregamento da coluna: ODS-Hipersil -10 yu, 4x3(30 + 100) mm

Debito Detecção Solvente 1,0 ml/min 22 0 nm CH^CN : 0,1% de ácido trifluoro-acé-tico em água (55 : 45)

Dados espectroscópicos da Alisamicina 1. UV (CH3OH): max = 276 nm (log = 4,67) e 316 nm (log - 4.57) 2, IV (KBr) : ver a Figura 1 3. RMN-1H (400 MHz, CDC13): Quadro A e Figura 2 4. rmn-13c (67,5 MHz, CDC13: Quadro B e Figura 3 5. Formula molecular: C29H32N 2°7 confirmada por espectromatria dem massa po BAR de elevada resolução

(matriz de álcool 3-nitrobenzílico,referência polietileno-glicol); M + H+ (ião) medido: m/z 521.228; calculado 521.229 para 12C2 *

Quadro A: sinais de RMN-^H da alisamicina (400 MHz, CDC12/ 30°C; desvios químicos em ppm em relação ao TMS = 0)

Desvio químico Multiplicidade Correspondência _________________(emparelhamentos em Hz)___estrutural________

1,13 (2H) m 7' -H ax + 111 -H ax 1,18 m 9' -H ax 1,28 (2H) m 8' -H ax + 10' -H ax 1,67 m 9 * —H eq 1,73 ( 2H) m 8 1 -H eq + 10 ' -H eq 1,76 ( 2H) m 7 ' -H eq + 111 -H eq 2,10 m 6 1 -H ax 2,53 ( 2H) m 5«-H2 2,61 ( 2 H) m 4 " ” H 2 2,83 lr 4-OH 3,65 d (3,6) 6-H 3,70 dd (2,6 + 3,6) 5-H 5,84. d (14,8) 2 ' -H 5,86 dd (14,5 + |0,3) 7-H 6,05 d (14,7) 12-H 6,12 m 5 '-H 6,12 dd (10,5 + 15,5) 4 ' -H 6,42 ddd (11,2+14,8+0,3) 10-H = 8 =

Quadro A (continuação)

Correspondência estrutural

Desvio químico Multiplicidade (emparelhamentos em Hz)

6,58 dd (11,3 + 14,5) 8-H 6,58 dd (14,8 + 11,3) 9-H 7,22 ddm (14,8 + lo,5) 3 ' -H 7,32 dd (11,2 + 14,7) 11-H 7,40 d (2,6) 3-H 7,54 s NH 7,58 s NH 13,52 s 3 "-OH 9

13

Quadro B: sinais de RMN- C da Alisamicina o , (67,5 MHz, CDC1-, 30 C; desvios químicos em 3 13 ppm e relação ao sinal do CDCl^ = 77,0 ppm)

Correspondência

Desvio químico Multiplicidade estrutural 25,65 t C- 4 " 25,80 (2C) t C-8 ' + C-10· 26,00 t C-9 ' 32,14 t C— 5 " 32,25 (2C) t C-7' + C-ll' 41,13 d C-6 ' 52,93 d C-5 57,41 d C-6 71,20 s C-4 115,01 s C-2" 120,95 d Ί 121,59 d 3 C-4', C-5' 125,52 d ~| 126,36 d J - C-9, C-10 128,08 s C-2 131,58 d 131,74 d -C-2', C-12 136,29 d C-8 139,52 d C-7 143,45 d 144,16 d C-3·, C-ll 150,76 d C-3 10

Quadro B: (continuação)

Correspondência

Desvio químico Multiplicidade estrutural 165,16 s 165,48 s - C-l', C-13 174,15 s C-3 " 188,63 s C-l" 197,39 s C-l A Alisamicina é activa contra bactérias gram-posL | tivas e gram-negativas. Ao ser testado pelo método das cavidades de agar em meio de ensaio antibiótico e através do método de diluição em agar de Mueller-Hinton (MIC) demonstrou uma ac-tividade que se encontra enumerada no quadro I seguinte:

Quadro I

Organismo de ensaio diâmetro de zona (mm) MIC {pg/ml) 500 /ig/ml 3 2 yug/ml 1. Staphilococcus aureus 209 p 2. Staphylococcus aureus 20424 3. Staphylococcus aureus E88 4. Streptococcus faecalis UD8b 5. Streptococcus faecalis

Eder 26 18,5 1,6 25 19 3,2 27 14 6,4 16 13 ^50

c·

Quadro I {continuação)

Organismo de ensaio Diâmetro 50 0 yig/ml de zona (mm) MIC 3 2 ya g/ml (flg/ml 6 . Streptococcus faecalis 23241 22 13 6,4 7. Escherichia coli 9632 - - 50 8. Candida albicans 10 - 50 9. Pericularia oryzae 15 11 50 10 Botrytis cinerea 47 20 - 50 Para além da actividade anti-bacteriana desco- briu-se que a Alisamicina possui também actividades anti-tumor e anti-parasítica.

Seguidamente ilustrar-seá a presente invenção a-través de exemplos os quais não devem ser considerados como mli mitativos.

Isolamento da estirpe Streptomices sp. Y-88,31582 através do solo. (a) Preparação do meio de isolamento.

Meio 1: Glicose ... 1,0 g

Glicerol ... 1,0 g L-arginina ... 0,3 g K2HP04 ... 0,3 g

MgS04· 7H2 --- 0,2 g

NaCl ... 0,3 g

Extracto de levedura... 2,0 g 12

FeS04. 7H20 CuSO ..5H 0 4 2 ZnSO..7H 0 4 2 MnS04.7H20 Ágar 10,0 mg 1 mg 1 mg 1 mg 15,0 g

Água destilada PH 1 litro 6 f 5 jí Meio 2: 1

Glucose L-asparagina K2Hp°4 MgS04.7H20 Extracto de solo Ágar Água destilada PH 2.0 g 1.0 g 0,5 g 0,5 g 2 00 ml 15,0 g 80 0 ml8.0

Meio 3 : 10,0 g 0,3 g 2,0 g 2,0 g 2,0 g 0,05 g 0,02 g 0,01 g 15,0 g 1 1; 7,2- 7,

Amido

Caseina kno3

NaCl k2hpo4

MgS04.7H20 CaC03

FeS04.7H2 O Ágar

Água destilada PH

Esterilizou-se o meio à temperatura de 121 13 durante 30 minutos. Em todos os casos o meio esterilizado foi , o arrefecido para a temperatura de 45 Ce vertido em placas de Petri e deixou-se solidificar. (b) Preparação da suspensão de solo

Com 1 g de solo preparou-se uma suspensão de: água destilada e agitou-se muito bem. Deixou-se o solo sedimentar e utilizou-se o fluído sobrenadante para inocular simuiL taneamente cada um dos meios de isolamento anteriormente referi dos. I i (c) Inoculação do meio de isolamento

Utilizou-se 1 ml de suspensão de solo e procedeu -se a inoculaçãe das Placas de Petri contendo 50 ml de qualquer dos meios de isolamento de nutrientes anteriormente referidos. (d) Isolamento da estirpe Streptomices sp. Y-88,31582

Utilizou-se placas de [Petri inoculadas as quais; foram incubadas a temperatura de 30°C durante 10 dias e depois isolou-se a estirpe sp. Y-88,31582 entre os microrganismos em desenvolvimento.

Exemplo II

Preparação de uma cultura de estirpe Streptomices sp. Y-88,31582 para a produção de Alisamicina por fermentação .

Manteve-se a estirpe Streptomices sp. Y-88,31582 em extrato de levedura/extrato de malte com a composição seguin te:

Extracto de malte • · · 10,0 g extracto de levedura • « · 4,0 g Glucose • « * 4,0 g Água • · · 15,0 g Água destilada • · · 1 litro PH • · · 7,0 14

f.

Pez-se a distribuição do meio por tubos de ensaio e procedeu-se a esterilização à temperatura de 121°C durante 30 minutos. Os tubos foram depois arrefecidos em posição inclinada para a preparação de planos inclinados de ágar. Esses planos inclinados foram inoculados com a cultura e fez- i \ O , | -se a incubação a temperatura de 28 C durante um período de Ιοί -15 dias, momento em que se observou bom crescimento e boa es-porulação. Utilizou-se uma suspensão de esporos, provenientes de um plano inclinado, em água destilada para inocular 5 baldes ; de Erlenmeyer com a capacidade de 500 ml contendo cada um deles 100 ml do meio de cultura inoculado.

Composição do meio de cultura inoculado

Glucose • · · 15,0 g Farinha de soja • · · 15,0 g Licor de infusão de cereais • · · 5,0 g CaCOg ♦ · · 2,0 g NaCl • · · 5,0 g Água destilada ♦ · · 1 litro pH • · · 6,5 Distribuiu-se o meio anterior em quantidade de 100 ml por balões de Erlenmeyer com a capacidade de 500 ml * o e fez-se a esterilização a temperatura de 121 C durante 30 minutos. Deixou-se os frascos arrefecer e inoculou-se com uma suspensão de esporos ou com bujões de micelius e agitou-se a ^ o o 240 r.p.m. durante 72 h. a temperatura de 27 (+ 1 C) num agi tador centrífugo com um diâmetro de 37,5 mm. Utilizou-se a colheita resultante para inocular 200 balões com a capacidade de 500 ml contendo cada um deles 100 ml de um meio de cultura de produção a 2-4 % (v/v). 15

Composição do meio de produção

Sacarose • · · 2 0,0 g CaC03 « · · 2,5 g kno3 • · · 1,0 g k2hpo4 • · · 0,5 g M|S04.7H20 • · · 0,5 g NaCl • · · 0,5 g Água destilada • · · 0,5 g pH • · · 7,0 i Efectuou-se a fermentação à temperatura de o _ o 27 C (+ 1 C) utilizando um agitador centrífugo a 240 r.p.m., com o diâmetro de 37,5 mm. Depois de interrompida a fermentação decorridas 40-44 horas, verificou-se que o diâmetro da zo | na de inibição em relação à estirpe Staphylococcus aureus 209 i ; P era de 20 mm, tendo-se feito o teste do filtrado da cultura pelo método das cavidades de ágar (6 mm de diâmetro) e constatou-se que o valor do pH do fluido da cultura variava entre 7,1 e 7,3. 0 volume celular carregado foi de 20 % (v/v). Submeteu-se a centrifugação o caldo de cultura recolhido contendo o antibiótico para se efectuar a separação dos micelius e o fluido da cultura e depois efectuou-se o processamento conforme descrito no exemplo IV.

Exemplo 3

Preparação de uma cultura da estirpe Strepto-mices sp. Y-88,31582 para a produção de Alisamicina por fermen tação .

Repetiu-se o procedimento do exemplo II com as diferenças seguintes: 0 desenvolvimento da estirpe Str. sp. Y-* -88,31582 foi efectuado em meio de agar com a composição se- 16 guinte: 1

Amido (solúvel) • · · 10,0 g k2hpo4 • · · 1,0 g Mgso, 4 • · · 1,0 g NaCl ... 1,0 - g lHH4)2S02 • · · 2,0 9 CaCo^ • · · 2,0 g FeSC>4.7H20 ... 0, lmg MnCl2.4H20 • * · 0,1 mg ZnSC>4.7H20 • · · 0,1 mg Ágar • e · 15,0 g Água destilada • · · 1 li PH • · · 7,2

A composição do meio de cultura inoculadoe e o meio de cultura de produção foram idênticos aos do exemplo II

Adicionou-se 2 ml de agente anti-espumante desmofene. Colocou-se 10 litros de um meio de produção num. fermentador com a capacidade de 15 litros. Esterilizou-seo o meio por acção directa e indirecta de vapor durante 20 minutos X o a temperatura de 121 C. Deixou-se o fermentador arrefecer e fez-se a inoculação com uma cultura adequada (9 % v/v). Efec- x o o tuou-se a fermentação a temperatura de 27 C (+ 1 C) sob condições de agitação a 150 r.p.m. com arejamento com um débito de 10 litros por minuto. Depois de interrompida a fermentação decorridas 23-27 h. ajustou-se o valor do pH da cultura para 7,3 e verificou-se que o diâmetro da zona de inibição em relação à estirpe Staphylococcus aureus 209 P era de 21 mm ao fazer -se o teste do filtrado da cultura pelo método das cavidades de agar (6 mm de diâmetro). 0 volume celular carregado foi de 15 %. Efectuou-se o processamento do caldo de cultura conforme . descrito no exemplo V. 17 r.

Exemplo IV

Isolamento e purificação da Alisamicina extraiu-se duas vezes cerca de 16 litros de filtrado de cultura tal como obtido no Exemplo II, utilizando de cada vez 10 litros de acetato de etilo e ajustando o valor de pH para 7,0. Procedeu-se à eliminação das camadas aquosas e submeteu-se à j evaporação os extractos de acetato de etilo combinados, sob ! condições de vácuo até à secagem. Dissolveu-se este extrato impuro numa quantidade mínima de acetato de etilo e provocou-se a precipitação com hexano. Repetiu-se o procedimento duasvve-zes para se obter um pó seco (0,5 g). Dissolveu-se novamente esse pó numa quantidade mínima de acetato de etilo e adicio-no nou-se-lhé cerca de 50 ml de metanol. Depois adicionou-sec cerca de o, 5 ml de água duplamente destilada e deixou-se a solu- .. o Ção em repouso durante 16 horas a temperatura de -20 C. Dis-solveu-se o precipitado resultante em acetonitrilo. Concentrou-se a solução de acetonitrilo até à saturação e manteve-se o , a temperatura de -20 C durante um período de 48 horas. Obteve-se deste modo 150 mg de Alisamicina cristalina pura.

Exemplo V

Isolamento e purificação da Alisamicina

Juntou-se os filtrados de cultura de dois lotes do fermentador, conforme descrito no exemplo III, para se obter um volume de 17 litros. Efectuou-se a extracção duas ve-szes utilizando de cada vez 10 litros de acetato de etilo, para um valor de pH 7,0. Concentrou-se o extracto de acetato de etilo até à secagem para proporcionar 4,5 g de composto impuro. Dissolveu-se esse composto impuro numa quantidade mínima de acetato de etilo e provocou-se a precipitação com hexano. Repetiu-se este procedimento três vezes para se obter um pó seco (1,2 g) o qual foi carregado numa coluna de vidro com • as dimensões de 8 por 15 cm e empacotado numa coluna com 400 g 18

Claims

de gel de sílica (malha 100-200). Fez-se a eluição da Alisami-cina utilizando clorofórmio/acetato de etilo com um gradiente variável entre (70:30) e (65:35). Procedeu-se a concentração dos produtos activos de eluição (1,5 litros) contendo a Alisami cina, até à secagem (0,42 g) e depois dissolveu-se numa quantidade mínima de acetato de etilo tendo-se adicionado cerca de 50 ml de metanol. Depois adicionou-se cerca de 0,5 ml de água duplamente destilada a essa solução metanolica e manteve-sea a solução à temperatura de -20°C durante um período mínimo de 16 horas. Dissolveu-se o precipitado resultante numa quantidade mínima de acetato de etilo e depois adicionou-se 50 ml de aceto tnitrilo. Manteve-se a solução de acetonitrilo à temperatura o f f de -20 C durante um período mmimo de 48 horas. Obteve-seddes te modo uma quantidade de 110 mg de Alisamicina cristalina pura de cor amarelada. =^bivindicaç5bs~ - lã - Processo para a preparação de alisamicina de

19 caracterizado por se fazer uma cultura de actinomicetes Y--8831582 (DSM 5559) sob condições aeróbicas num meio nutrien te que contem fontes de carbono, de azoto, sais inorgânicos nutrientes e elementos raros. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se efectuar a cultura a uma temperatura compre- o endida entre 18 e 40 C. - 33 Processo de acordo com a reivindicação 1, ou 2 caracterizado por se efectuar a cultura a um pH compreendido entre 6 e 9. - 43 - Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações anteriores, caracterizado por se efectuar a cultura a o o uma temperatura de 27 C (+1 C) e a um pH de cerca de 7. - 53 - Processo de acordo'cum uma ou mais das reivindicações anteriores, caracterizado por se efectuar a cultura durante um período superior a 23 horas. - 63 - Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações anteriores caracterizado por se efectuar a cultura como uma cultura submersa. - 73 - Processo para a preparação de uma composiçã * farmacêutica, caracterizado por se incorporar como ingrediente 20 activo um composto de fórmula I quando preparado de acordo com as reivindicações anteriores em associação com veículos e/ou auxiliares habituais numa forma adequada para administração a um paciente. A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente europeia apresentado em 12 de Janeiro de 1990 sob o No. 90100591.8. Lisboa, 10 de Janeiro de 1991.

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