PT96509A - Anticorpos recombinantes humanos anti-cd18 - Google Patents

Description

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iEivi^ESgil^O^OS^gSENHOS

Figura 1.= Iniciadores usadas para isolar DNA codificador da região variável da cadeia leve kapa murina e da região variável da cadeia pesada de "íg62a murina usando PCR»

Figura 2« Diagrama da estrutura de anticorpo e produtos de PCR da cadeia pesada e leve murina»

Figura 3» Sequência de aminoácidos de 1B4 para a região variável da cadeia pesada e regiões variáveis 1 e 2 da cadeia leve deduzidas da seqtrência de ácidos nuclsiccs dos cDNAs dona--·

Figura 4, OliqQdesoxinucleáiidos usados como iniciadores para a mutagénese por PCR a amplificação do molde da região variável da cadeia leve Rei de forma a inserir as CDRs de ÍB4 na região variável da cadeia leve Rei»

Figura 5= Estratégia de recombinaçSo com PCR usada na inserção de CDR na região variável da cadeia leve Rsi/ÍB4=

Figura 6» Esquema da inserção das regiões variável e constante da cadeia leve no vscfcor de expressão da cadeia leve»

Figura 7= 01igodesoKinucleótidos usados como iniciadores de PCR para gerar uma cadeia pesada de XgS4 encurtada» OligodesoKinucleétidos iniciadores usados em PCR para alterar o promotor da timidina-cinase <T!<> de forma a facilitar a expressão do gene de resistência à neomicins» OligodesoxinucleátidQS iniciadores usados em PCR para clonar a sequência do patenciadar de IgH. Qligcdesoxinucleótidos usados como iniciadores de PCR para gerar uma região constante da cadeia leva kapa humana» -X .--

Figura. 8= Estratégia de reeombinaçao com PCR usada na fusão da sequência sinal e intrénica humana com a região variável da cadeia pesada de 1B4=

Figura 9« Oligodesoxinucleótidos usados como iniciadores para a recombinação por PCR para fundir sequências sinal e intrénica humanas à região 'variável da cadeia pesada de ÍB4 =

Figura Esquema da construção do vsctor de expressão seleccionável pela neomicina.

Figura 11 „ Esquema da inserção da região variável da cadeia pesada 1B4 “quimérica.-1 e da. região constante da cadeia pesada de IgS4 humana encurtada no vector de expressão da cadeia pesa.cla

Figura 12, Níveis de expressão transitória* determinados por ELISA„ do anticorpo recombinante da cadeia pesada quimérica lB4scadeia leve Rei/1B4 em células CV1* COS 7 s 293,

Figura 13, Ensaio de ligação competitivo do íiAb murino 1B4 “quimérico55 recombinante/REI 1B4 (círculos) e de flAfo ΪΒ4 ídiamantes) para CD18 em PMNs humanos activados,

Figura 14, Composição da sequência de aminoácidos das regiões variáveis das cadeias pesada e leve humanas das quais foram usadas regiões estruturais para suportar CBRs de 1B4 murino.

Figura 15, Oligodssoxinucleétidos usados na construção da região variável da cadeia pesada 8al/lB4 e da região variável da cadeia pesada Jon/!B4 mais os necessários para fundir as sequências sinal e intrénica humanas a estas regiões variáveis.

Figura 16* Estratégia de recombinaçSo por PCR usada na inserção de CDE das regiSas variáveis da cadeia pesada GaI/iB4 s da cadeia pesada Jon/lB4=

Figura 17 = Sequtncia de DNA s ssqufncia de aminoácidos deducida determinada para a região variável da cadeia pesada 1.B4 iaurina.

Figura 18= Esquema da construção do vector de eKpressão ssleccionávsi por higromicina»

Figura 19= Esquema da inserção das regiSes variáveis da cadeia pesada 8al/lB4 e da cadeia pesada don/ÍB4 no vector de expressão de cadeias pesadas contendo a região constante da cadeia pesada de Ig84 encurtada»

Figura 20= Sumário das actividades ds ligação competi” tivas das construções MAu 1B4 murino e anticorpo recombinante anti-CDlB humano»

Figura 21= OligodssoKinucIeétidos usados na construção da região variável da cadeia leve Len/1B4 mais os necessários para fundir o sinal humano à região variável da cadeia leve Lsn=

Figura 22= Estratégia de recombinação por PCR usada na inserção em CDR da região variável da cadeia leve Len/1B4=

Figura 23= Esquema da inserção da região variável da cadeia leve de Lsn/1B4 num vector intermediário seguido da sua inserção no vector de eKpressão da cadeia leve» V ' -

Figura 24= Sequência de DNA e sequência de aminoácidos deduzida determinada para a região variável da cadeia leve 1 de J.B4 mu ri no»

Figura 25= Sequência de DMA e sequência de aminoácidos deduzida determinada para a região variável 2 da cadeia leve de 1B4»

Figura 2&= 01igodssoKinucleéiitíos usados na construção da região variável da cadeia pesada (mutante) de 8al~mi/iB4 mais os necessários para fundir o sinal humano à região variável da cadeia pesada Sal-mi»

Figura 27» Estratégia de recombinação por PCR usada na inserção em CDR da região variável da cadeia pesada (mutante) 13a 1 ·· m 1 /1B4.

Figura 28» Ensaio de ligação competitivo para UB4 murino nativo (diamantes) e para ÍB4 Sal/Rei humanizado (círculos) »

Figura 29» Ensaio de ligação competitivo do hlB4 recombinante Na^/Rei (estrelas fechadas) s hlB4 recombinante Gal/Rei (estrelas abertas)»

Figura 30 = Efeitos de iB4 murino nativo (estrelas) e de ÍB4 recombinante humanizado Bal/Rei (círculos) na ligação de PMMs humanos a monocamadas de células do sndotélio da veia umbilical humana in vitro»

Figura 31» Comparação de Sal/Rei H1B4 e de mlB4 em ensaios funcionais in vitro»

Figura 32= Localizaçles par micrascopia de imunofluores-cância da colaraçio de m!B4 e ds Bal/Rsi híB4 em sscçSss congeladas ds 5 pm ds tecidos de coelho*

Figura 33» Localização por micrascopia com dupla marcação por imuriof luorsseêncxa de Sal/Rei hlB4 s inlB4 em células de medula óssea da coelho*

Figura 34= Localização por imuno-microscopia slectróni-ca com dupla marcação de Bal/Rsi HÍB4 e de mlB4 em grânulos específicos de PHMs humanos*

Figura 35* Inibição dependente da dose por mlB4 s Sal/Esi hlB4 da acumulação de PMN induzida por C5a (1Θ& poales) na pela de coelho»

Figura 36« Inibição dependente da dose por sniB4 e Bal/Rsi H1B4 da s>;travasaçlo do plasma induzida por G5a C 1&& pmoles) na pele ds coelho»

Figura 37» Esquema da construção do sistema da expressão pB962 capaz d® produzir grandes quantidades de anticorpos recombiantes com CDRs de 1B4 inseridas»

Figura 38» Esquema da construção de sistemas de expressão p8968 e p39é9 capazes de produzir grandes quantidades de anticorpos recombinantes com CDRs de 1B4 inseridas»

Anticorpos monoeionais derivados de murganho sido utilizados como agentes terapêuticos ou de diagnóstico em numerosos estados patológicos humanos incluindo respostas

Inflamatórias agudas associadas a numerosas doenças* A adiminis-tração da anticorpos manoelonais murinos CmMftbs) como agentes terapêuticos no homem tem sido severamente limitada pelo desenvolvimento anticorpos no recipiente contra os antigénios ds murganho derivados do anticorpo monaclonal murino» Em tentativas para ultrapassar este problema os mnAhs foram restruturados por tecnologia de DMA recombinante de forma a decrescer a sua imuno-genicidade para humanos* As imunoglobulinas estio bem definidas química e biologicamente com as estruturas gerais ilustradas em Molecular Dell Biology, Darnell, Lodish, e Baltimore, Eds=, Scientific American Books, Inc», W = H = Frsamsns Ne^ York, NY (1996)* Inicialmente, isto envolveu a construção de anticorpos quiméricos, Morrison et a 1 *Proc» Matl» Acad» Sei» USA 81 s 6851-Ó855 11984)» Empregou-se tecnologia recombinante para substituir as regiões constantes das cadeias leve s pesada aiurinas pelas correspondentes regiões constantes humanas* Quando da expressão, tais quimeras de anticorpos entre espécies deram moléculas com as especifieidadss de ligação ao antigénio do anticorpo murino parental» As referências que se seguem descrevem ds uma forma geral a tecnologia de anticorpos quiméricosn Lobuglio et al» » Proc» NatI» Acad» Sei» USA Sós 422Φ-4224 <1989)^ Patente dos Estados Unidos 4,816,567g Publicação Internacional ΡυΤ MS WO 87/Θ2671, publicado em 7 de Maio de 1987p. Publicação da Patente Europeia N9 255,694, publicado em ív de Fevereiro ds 1988s Publicação de Patente Europeia WS 274,394 publicado em 13 de Julho ds 1988i Publicação de Patente Europeia M9 323,886, publicado em 12 ds Julho de 19895 Publicação Internacional PCI MS WO/89/00999, publicado em 9 de Fevereiro de 19895 Publicado de Patente Europeia MS 327,ΘΘ© publicado em 9 de Agosto, 1989§ Publicação de Patente Europeia M9 323,4Θ4, publicado em 16 de Agosto de 1989| s Publicação de Patente Europeia MS 332,424, publicada em 13 de Setembro, 1989» Β

A imunogenicidade dos anticorpos quiméricos pode ser ainda reduzida através da inserção de regiões hipervariávsis de roedores em estruturas de regiSes variáveis das cadeias leve e pesada humanas, danes et aic, Nature 32ís 522-525 (1986). Estas regiSes higervariáveis também foram designadas regiões determinantes da complementaridade CCDR)= A técnica envolve a substituição ou inserção recombinante de sequências CDR murinas especificas de antigénios pelas existentes dentro das regiões variáveis das cadeias leve e pesada genéricas humanas. Publicação de Pedido de Patente Europeia UQ. 239,400, publicado em 30 de Setembro de 1987* Nesta abordagem, pouca ou nenhuma atenção á prestada relativaments ás estruturas das regiSes variáveis CFRs) dentro das quais as CDRs murinas são colocadas» 0 presente invento mostra que as estruturas de suporte adequadas para as CDRs são vitais não só para a montagem das moléculas de anticorpos funcionais como também para a produção de moléculas de anticorpos com afinidades que permitam a administração de doses terapêuticas «cerca de O,1-1 mg/Kg;»

Estudos recentes por Queen et ah, Proc = NatI„ Acad, Sei=, USA 86 s 10029-10033 (1989) mostraram que as CDRs de um anticorpo monoclonal murino anti—Tac podem ser inseridas numa estrutura de suporte humana» As regiões estruturais variáveis humanas foram escolhidas de formai a. identificarem—se ao máximo com a sequência murina» Os autores também utiliçaram uns modelo da computador do mrlAb para identificar vários aminoácidos que, apesar de estarem fora das CDRs, estão suficientemente perto para inleraetuarem com as CDRs ou com o antigénio» Estes resíduos foram mutagenizados para darem o resíduo encontrado na sequência murina» 0 anticorpo com inserção anti-Tac tinha uma afinidade para o antigénio que era apenas cerca de 1/3 da do mMAb anti-Tac murino e a manutenção do carácter humano deste anticorpo era problemática» 9

A infiltração de leucócitos num sítio de inflamação está dependente da adesao dos leucócitos ao endotélio antes da s?Ktravasação= A ligação rápida dos leucócitos polimorfonucleares CPHW) ao endotélio e a diapedssis ocorre dentro de minutos após a introdução de um estimulo quimiotáfcico no tecido5 Cybulski et aL, Am. J» Pathol * 124 s 367 ii986>„ Esta sxtravasação rápida juarace depender da resposta dos PMNs aos quimioatraantss e da presença da família CDil/CDlB de glicoprotsinasna superfície dos leucócitos. A família das glicoprotaínas associadas aos PMfte são designadas integrinas de leucócitos e incluem LFA-1 (CD1la/CDÍS)5 Mac-l (CD1ib/CDÍS) e p!5©?95 (GDI ic/CDIS). Cada um destes hetsro-dímeros tem uma cadeia alfa única (CDil a? bf c) e uma cadeia beta-2 variante (C.DÍ8) . A estimulação de PMNs com vários factores quiffliotáticos provocou uma expressão aumentada das integrinas de leucócitos CCDllb/CDIS) levando a uma forte adesão a endotélio não estimulado in vitro. Harlan, Blood 65 s 513 (1985) e essencialmente toda a adesão induzida por quimioatraentes foi inibida pelo tratamento dos PMNs com mMAbs especificamente reactivos cqiií o complexo CD11/CD18, Harlan et aL, Blood 66s 167 (1985)s Ziiiimerman e Mclntyre J... Clin. Invest. 8J_s531 (1988)n Smith st a 1 „ J. Clin» Invest» 82s 1746 (1938)5 e Lo et a 1 c J . Εκρ. Med. 1695 1779 (1989), Leucócitos poliroorfonucleares de doentes com deficiência na adesão de leucócitos (LAD) não expressam CD18 e não se ligam a endotélio não estimulado in vitro* Harlan et al „,, Blood 66s 167 (1985)5 Lo et al, , J. Εκρ. Med. 1695 1779 (1989).

Foram descritos hibridomas merinos produtores de anticorpos monoclonais reactivos com a cadeia beta comum às integrinas Fiac—15 LFA—l s pi5® ,,95,. Os mMAbs foram designados 11‘4,,6®.ó =, TS1/18-;;H52 e ATCC TT.8 218. 0 1B4 é um anticorpo IqG'2 a foi preparado por Wright et aL, Proc» Mati. Acad» Sei. USA 8®s 5699-5703 (1983) 5 o 6Θ.3 é também IgG2a e foi preparado por Beatty et al.. J. Immunol. 131s2913-2918 <i983>9 TS1/18 é um

anticorpo IgSx a fai preparado por Sanchsc-riadrid et al - - J = Exp» iied» 15Bs Ι7Θ5-1Β03 (1983) , H52» um Mftb contra bata 2 CCD18) foi praparado por Hildreth a Orentas, Science 244·; 1075-1678 (1989) e ATCC TIB 21Q, uma kaps de IgS2a preparada por Bpringer et aL, J. Εκρ. Msd» 15θϋ 560-6Θ2 <1983)= Estes anticorpos parecem ser funcionalmente equivalentes e dão reacção crusada com a cadeia beta-2 encontrada em leucócitos humanos, de carneiro, porco, coelho e Cio mas nao com a cadeia beta—2 encontrada em leucócitos murinos s de rato=

SUMÁRIO DO INVENTO SSo divulgados imunoglobulina rscombinarste especifica-mente rsactiva com a integrina CD18 ou antigénio de leucócitos s métodos para a produção da imunoglobulina= Construções de DNA contendo as regiões determinantes da complementaridade (CDRs) de um anticorpo murino combinadas por via rscomhinants com as estruturas de regiões variáveis escolhidas das cadeias pesada e leve de um anticorpo humano» As construções são transfectadas para células hospedeiras eucarióticas capaces de expressarem as sequências de imunoglobulinas racombinantes„

OBJECTIVO DO IMVENTQ

Constitui pois um objectivo do presente invento proporcionar novas sequências de DMA para as regiões determinantes da complementaridade das cadeias pesada e leve do anticorpo monoclo-nal murino» Um outro objectivo do invento é proporcionar novas sequências de DMA para as regiões determinantes de complementaridade das cadeias pesada e leve do anticorpo mcnoclanal murino que se ligam imunológicamsnte á integrina CD18 ou antigénio de leucócitos» Um outro objectivo ê proporcionar novas sequências de DMA para anticorpo animal recomhinanta» Um outro objectivo é proporcionar um vector contendo a sequência 'de DMA do anticorpo animal recombinante» Ura outro objeetivo é proporcionar um hospedeiro mamífero transformado cora ura vector contendo a sequência de DNA para o anticorpo animal recombinante» é ainda um objeetivo -que o anticorpo animal recombinante seja anticorpo recorabinante huraa.no» Ura outro objeetivo è proporcionar iraunoglobulina recom-binante humana que se liga à integrina de leucócitos» Ura outro objeetivo é proporcionar ura processo para fazer iraunoglobulina recombinante humana» Um outro objeetivo é proporcionar um processo para a produção de imunoglobulinas recorabinantes. ,rb.......imanto O presente invento está relacionado com métodos e meios para a construção e expressão de anticorpos únicos obtidos por via recombinante em que as regiões determinantes da complementaridade <CDRs> de um primeiro anticorpo monoclonal animal de espscificitíade definida são inseridas nas estruturas variáveis das cadeias leve e pesada de um segundo animal incluindo o homems que apresentam um elevado grau de semelhança das sequências relativ-amente ès estruturas do primeiro animal e apresentara as CDRs na configuração adequada para reagirera cora o antigénio ou ligando adequado» A inserção ou enxerto é realisada por processos-bera conhecidos em biotecnologia? principalmente tecnologia de DNA recombinante» As estruturas únicas íFRs) são selsccionadas relativaments à sua compatibilidade estrutural e semelhança de sequências com as estruturas do primeiro animal» Esta prê-selec— ção está dependente de ura ou raais dos- seguintes critérios? <i) emparelhamento de sequências de todas as sequências estruturais variáveis da cadeia leve (Vj > e da cadeia pesada {V,,) humanas cora as sequências estruturais, do anticorpo monoclonal animal do qual foram removidas as CDRs2 Cii) emparelhamento de sequências como descrito em <i> mas cora siqnificante atenção relativamente ao * 12

emparalhamsnto entre espécies dos resíduas de aminoàcidos expostos na superfície? <iii) modelo estrutural terciário e quaternário das sequências estruturais humanas com CDRs nos respeciivos sítios para comparação com modelos do anticorpo monoclonal animai original;! e (iv) despiste de DNA genómico humano com sondas de DMA correspondendo ás sequências estruturais no anticorpo monoclonal animal escolhido» Estes critérios e os processos que se seguem foram usados paira preparar sequências de DMA recombinante que incorporam as CDRs do mMftb animal» cadeias leve e pesada? em estruturas humanas que podem ser usadas para transfectar células de mamífero para a expressão do anticorpo humano recombiante com a especificidade de antigénioo tio anticorpo monoclonal animal» 0 presente invento compreende ainda um método para a construção e expressão do anticorpo alterado compreendendo:·; mutagénsse e montagem tios domínios da região variável incluindo regiões CDRs e FRss <ix) preparação de um vector de expressão incluindo pelo menos uma região variável que quando da transfec-çSo em células resulta na secreção de proteína suficiente para determinações de afinidade e especificidade^ e íii) co-smplifica-ção dos vedores da expressão das cadeias leve e pesada nas linhas celulares adequadas» 0 presente invento proporciona métodos recombinantes para a incorporação de CDRs de anticorpos monoclonais animais nas estruturas da imunoglobulina humana de forma a que o anticorpo humano recombinante resultante seja pouco ímunogénico ou não imunogénico quando administrado em humanos» De preferencias as imunoglobulinas recombinantes serão reconhecidas como auto-proteínas quando administradas para fins terapêuticos» Este método de !!humsr?isacão” tornará os anticorpos recombinantes úteis como agentes terapêuticas pais serio fracaments imunogénicos ou não imunogênicos quando administrados a humanos» 0 invento inclui t

ainda a conversão reconibinante de qualquer anticorpo monoclonal animal num anticorpo monoclonal humano recombinante onde pode ser identificada uma região estrutural adequada (canto descrita abaixo)= Pretende-se que d presente invento inclua as sequências de nuclsótidos e de aminoácidos das regiões CDR raurinas e as regiSes estruturais humanas separadamente ou combinadas como uma cadeia leve ou pesada ou uma imunoglobulina Intacta quaisquer variantes suas modificadas de forma conservada» Os monoclonais animais podem incluir mas não estão limitados aos anticorpos monoclonais murinos descritos por Van voorhis st__alJ B Exp»

Med» 158s 126-145 (1983) que se ligam a leucócitos humanos e aos mílAbs adequados produzidos por hibridosnas depositados no Hybridoma Call Bank mantido pela American Type Cultura Collection (ATCO s descrito no ATCC Catalcg of Cell Lines & Hybridomass N9 ó, 1988=

As sequências CDR do anticorpo monoclonal animal foram obtidas como se seque * Extraiu-se RNA total dos hibridosnas nsurinos, por exemplo as células de mieloma ÍB4 descritas por Wriqht et al., Proc:= Natl» ficad* Sei» USA 8§j 5699-57Θ3 (1983)=, as células 6ô = 3 descritas por Beatty et ah, J = lusmunol ,= 131 2913-2918 (1983)s as células TS1/8 descritas por Sanchez Madrid st al«« Jn Exp» Med- 1Ξ8s 1785-1803 (1983) e outros anticorpos monoclonais anti-CDS ou CD11 e hibridocnas como descrito em Lsukocyte Typing III? Springer-Verlagf New York (1988)? usando métodos convencionais envolvendo solubilização celular com isotiocianato de guanidina (Chirgwin et ah, Biochem» jjBs 5294-—5299 Γ19793) . 0 mMftb murino 1134 será usado como principal exemplo de um Mftb animal que pode ser l!humanizado" pelo processo original divulgado» 0 invento pretende incluir a conversão de qualquer imunoglobulina animal numa imunoglobulína humana» Pretende-se ainda que a imunoglobulina (Ig) humana possa conter cadeias leves kapa ou lambda ou podem ser qualquer um dos

isotipos de cadeias pesadas que se seguem (alfa, deita, epsilon, gama s mu). Pares de oiigodesoxinucieótidos iniciadores degenerados (Figura 1) representando sequências dentro da estrutura i da região variável da cadeia leve kapa murina e domínio constante da cadeia leve ou sequências dentro da estrutura i da região variável da cadeia pesada de IgB2a murina s da domínio constante CHí da cadeia pesada foram sintetizados num sintetizador de DMA da Applied Biosystem 383.A, removidos da resina por tratamento com NH..OH concentrado e retirada a sal numa coluna NftP-5 eluida com s Η.?0« RNA total 5 cerca de 2 ug, foi sujeito a transcrição reversa durante cerca de 3® min a cerca de 42°C usando transcriptass reversa de liolonsy MLVS cerca de 2©© unidades (BRL) e cerca de 1® pmoles iniciadores de cadeia complementar da região constante tanto para a cadeia pesada como para a leve. A transcriptass reversa foi inactivada pelo calor, cerca cie 95*C durante cerca de 5 min e as rsacções foram ajustadas para conterem cerca de iô© μΐ ds tampão PCR, cerca de 5® pmoles cie cada uma dos iniciadoras dos pares e 25 unidades de polimersse Taq» Cerca de 45 ciclos de amplificação (2% 94°0ξ 2?? 55°Cp 2? 72*0 foram seguidos por purificação em gel dos fragmentos da DMA de 4®® pares de bases ípb) esperados (Figura 2). Antes das subclonsgens destes DNAs num plasmídso intermediário de extremos cerses tal como pSP72 íPramega) eles foram fosforilados nos extremos usando polinucleó-tido-cinase da T4» E. cpli competentes congeladas foram descongeladas em galo e distribuídas quantidades de i©® μΐ por tubos de palipropileno malhados arrefecidos em gelo. G DWA (i~l© ng) da mistura de ligação foi distribuído coai agitação por estes tubos s incubado em gelo durante msis 3© minutos. As células de E. coll foram sujeitas a choque térmica por incubação a 42*0 durante 45 segundos, depois arrefecidas durante 2 minutos em gelo. Adicionou-se SOC <Hanahan? D., J„ Mo!» Biol» 16ós 557, 1983) à temperatura ambiente e as culturas foram agitadas a 225 rpm a 37°C durante 6© minutos. Pequenas quantidades das culturas foram 15

espalhadas em placas de agar LB contenda 1Θ© jig/ml de ampicilina e estas placas foram incubadas durante a noite a 37*C para permitir o crecirnenta ds colónias» Vários clonss representando estas sequências amplificadas por PCR foram cultivadas e submeti-

P das a determinações da sequência ds DMA usando Sequenase e iniciadores de sequenciação específicos de T7 s de SP6» Obteve-se uma sequência de DMA única representando uma região variável da cadeia pesada de lgS2a raurina, mas duas regiões variáveis da cadeia leva kapa estão representadas dentro da população clonada (Figura 3)» Para distinguir quais as sequências pertencentes ao mMAb i845 o sHAb 1B4 foi reduzido com ditiotreitol (DTT) e as cadeias pesada e leve purificadas foram sujeitas a sequenciação de aminoácidos M-terminal usando o ssquenciatíor Applied Biosystems 477A» Foram também sequenciados os peptídeos tripticos e digeridos com brometo de cianogénio» A substituição de CDRs da região variável humana com as exclusivas do raHAb 1B4 foi conseguida utilizando os processos originais que se sequem» Determinou-se uma estrutura humana adequada utilizando os critérios atrás descritos» Uma estrutura da região variável da cadeia leve tal como a estrutura REI (Orlandi? et al., Proc» Natl. Acad. Sei* USA Sòs 3833-3837 C198935 Riechmann et al»? Nsture 332s 323-327 119883 § Pedido de Patente Europeia» Publicação M2 23954ΘΘ)? com o seu iider e sequências intrónicas 35 foi subclonada r?o vector intermediário PBEM3Z (Promega>» Cerca de oito oligodesoí-cinucleótidos iniciadores (Figura 4) foram sintetizados representando os iniciadores necessários para gerar quatro fragmentos de DMA por amplificação com a reacçlo em cadeia com polimerase» Todas as sequências de CDRs da cadeia leve correspondendo ao HAb 1B4 foram incorporadas nas aligodesoKinucleótidos iniciadores excepto os terminais e pelo menos 15 bases de complementaridade terminal 5S (ver Figura 5)« 0 par de iniciadores adequados? cerca de 5Θ pmoles de cada?

foi combinado com csrca de 1Θ ng de DMA do plasmídeo rsprssantan··· do a estrutura REI 5 csrca de 2=,5 unidades ds DNA-polimerase Taq s realizados cerca de trinta (3Θ) ciclos de amplificação PCR (períodos de ciclos como atrás)„ Os produtos das quatro reacçSes» purificados por sleciroforsss ein gel ds agaross foram combinados3 cerca ds 1$ ng de cada urn dos fragmentos de DMAr= juntamente com oligodssoxinueleótidos iniciadores terminais (Figura 4) s DMA-po~ limersse Taq e ds fragmentos combinados foram amplificados em PCR (ver Figura 5)« Após digestão com as endormcleases de restrição HindiII s Xhal o DMA amplificado foi purificado por elsctroforese em gel de agarose e subclonado em sítios compatíveis de um vector intermediário p5P72 ÍProntegaS que contem a região constante da cadeia leve kapa humana (ver Figura 6)» DMA genómico,, cerca ds 1 pg, purificado a partir de uma linha de células B humanas (8Si@l©SAs MI8I1S Humars Genetic Mutant Cell Repository,, Institute for Medicai Ressarciu Camden? MJ) foi usado como molde para amplificação em PCR (Figura 7) de um fragmento com aproximadamen-te 92® pares de bases contendo o aceitador ds “splicing" do domínio constante da cadeia leve kapa, o exão e uma fracção da sua região 3? não traduzida» 0 produto de PCR foi purificado por electroforese em gel de agarose, digerido com a endonuclease BamHl e subclonado em p5P72 previamenie linearizado com BsmHI= Os clonss individuais representando o vector intermediário pST72 contendo a região variável enxertada de ÍB4 derivada de REI e a regilo constante kapa humana obtida por amplificação de DMA humano em PCR foram usados para determinar a sequSncis de DMA da região variável da cadeia leve inserida»

A fracçSo de cadeia pesada quimérica do anticorpo recombinante foi obtida a partir da região variável da cadeia pesada de 1B4 murino fundida com s região constante humana de um suhtioo gama 4 obtido a partir de uma biblioteca em lambda construída por Flanagan e Eabhiis, Nature 3ΘΘa 709-713 (1982K A Λ ·

XV

* *' S região variável da cadeia pesada quimérica foi construída a partir de três fragmentos de DNA representando uma sequência sinal,, uma fracção da região variável da cadeia pesada murina e uma sequência intrónica (Figura 8)= Os pares de oligormcleó tidos iniciadores (Figura 9) foram sintetizados representando os iniciadores necessários para gerar por amplificação em PCR estes três fragmentos de DNA partindo de cerca de 1« ng de moldes de DNA de plasmideo obtido a partir de M13VHPCR1 (Orlandi et aL, Proc. Nati. Acad, Sei» USA Bès 3833-3837 E19893) ou do vsctor intermediário pST72 contendo a região variável da cadeia pesada de IgG2a anteriormente usado para determinar a sequência CDR de 1B4 murina. A amplificaçgo do fragmento sinal, fragmento da região variável e fragmento contendo intrão foi como descrito atrás» Os produtos purificadas em gel de agsrose foram combinados., cerca da i€> ng cie cada produto,, com pares de de oliqodeso-xinucleótidos terminais (Figura 9) e o molde de PCR gerado in vitro recombinado foi ampliado usando os processos convencionais descritos atrás» Antes da suhclonaçjem num vsctor intermediário pSP72 digerido com BglII e BamHI este produto recombinado foi digerido de forma semelhante e purificado em gel de agarose» Clanes individuais foram submetidos a determinação da sequência do DNA usando Sequenase"' e iniciadores de sequenciaçlo específicos de T7 e de SP» e um foi escolhido ίρ895θ> para subsequente expressão. A região constante da cadeia pesada de gama 4 foi subclonada como um fragmento Hindi II da é>57 Kb derivado do plasmideo pAT84 (Flanagan and RabDitts* Nature 3ΘΘε 709-713 C19823) no sitio HindiII do vector intermediário pSP72. Este plasmideo foi então usado como DNA molde a partir do qual uma versão encurtada da região constante gama 4 foi subclonada usando amplificação PCR e os pares da iniciadores indicadas na Figura 7» Os vectorss de exressão eucarióticos forais construídos -/: 18

como descrito abaixo» Os vectores de expressão são definidos aqui como sequências de DMA que são necessárias para a transcrição de cópias cismadas de genes e a tradução dos seus mRMAs num hospedeiro adequado,. Tais vectores podem ser usados para expressar genes sucarióticos numa variedade de hospedeiros tais como bactérias., aiqas acuis, células vegetais., células de insectos e células animais» As imunoglobulinas podem ser também expressas numa série de sistemas virais» São especial mente adequados os vectores que permitem o vai-vem do DNA entre hospedeiros tais como bactéria-levedura ou bactéria-célula animal» Um vsctor de expressão atiequadsinente construído deverá oonters uma origem de replicaçSo para replicaçSo autónoma em células hospedeiras» marcas salsctivas, um número limitado de sítios de restrição úteis, um potencial para um número de cópias elevado e promotores fortes» Um promotor é definido como uma sequência de DMA que dirige a RNA-polimerase para se ligar a DNA e iniciar a síntese de RNA» Um promotor forte é um que provoca uma elevada frequência de iniciação da síntese de mRNAs» Os vectores de expressão podem incluir, mas não estão limitados a vectores de dosagem, vectores de dosagem modificados, plasmídeos ou vírus especialmente projectaclos» A molécula da cadeia pesada de imunoglobulina foi transcrita a partir de um plasmídeo portador da marca de resistência à neomicina (6418) enquanto que a cadeia leve da imune™ globulina foi transcrita a partir de um plasmideo portador da marca de resistência à higromieina 8» Com excepçlo da frscçlo de resistência è droga destes plasmídeos eles são idênticos um ao outro» 0 progenitor preferido dos vectores de expressão de imunoglobulina á o vector de expressão em eucariotas pDS (Berkner and Sharp, Mucl. Acicís Rss= 13s 841-857 £19853) que contem a origem de replicaçSo dos adenovírus = α domínio potsnciador do SV4©, o principal promotor tardio dos adenovírus, o líder

tripartida da adenavírus tipo 2S um sitia dador ds "splicinq” 3" do terceiro líder dos adenovírus s um sítio aceitador de splicing derivado de um locus de imunoglohulina? um sitio de clonagem múltipla colocado no sitio BamHl e o sinal ds poliadsnilaçSo tardio do SV4© (Figura 1®)= A origem de rsplicação foi removida por digestão com Eco RI e Kpnl e substituída por dois fragmentos representando o gene da marca selecionàvel neo (derivado do plasmídeo pCMVIE-AKl-DHFR como um fragmento de 1,8 Kh EcoRI/BamHI) e o potenciador da cadeia pesada ds Ig (obtido como fragmento amplificado por POR usando DMA humano como molde e os oligodesoMinucleótidos apresentados na Figura 7 como par de iniciadores,. apóis a sua digestão com Bgll e Kpnl).. 0 vector de expressão resultante nSo possui uma pequena fracçSío do promotor de TK responsável pela transcrição do gene da neomicina„ Este foi substituído pela inserção no sitio EeoRI de um fragmento amplificado por PCR de 14 Kh derivado do DNA de CHVIE--AK1-DHFR usando o par de iniciadores apresentado na Figura 7. 0 vector da expressão da cadeia pesada resultante (p8941) foi modificado por remoção dos sítios HindiII e Xhal indicados usando processos convencionais. Para converter este vector numa marca selsccioná··-vel por higromicina B3 a cassete ds resistência à neomicina foi removida por digerindo primeiro com EcoRl e depois por preenchendo com DMA-polimerass os extremos salientes 55 depois digestão subsequente com Bali» A cassete de expressão da higromicina B com cerca ds l39 Kb3 o promotor TK e o sinal ds poliadenilação de TK flanqueando o gene da higromicina. (obtido como um fragmento BamHl da ís8 Kb no plasmídeo pL6903 6ritz and Davies, Gene 25s 179—IBS C19SJ.3) foi removido do plasmídeo pftL—2 por digestão com BamHl e subclonado no sitio BamHl do vector intermediária pSP72, A cassete da higromicina B foi removida deste vector por digestão com Smal e Sall e clanada na vector ds expressão linearizado como descrito atrás para criar um fragmento de DNA tendo um extremo cerse e um extra ..o Sall, A expressão da cadeia leve kapa com CDR de ÍB4 inserida foi conseguida pr transferencia deste cistrlo do vector de clonagem intarmediário Cp8?52> baseado em oSP72 para o vector de expressão sucariéiico seleccionável pela higromicina B (ver Fugura 6),, Um fragmento de DMA com cerca de 1,5 kb resultante da digestão do p8952 com as endonucleases Spel e Ciai foi purificado por slectroforess em gel de agarcse e ligada ao vector de expressão que foi previamente linearizado, seguido de digestão com as mesmas duas encimas ds restrição e purificado em gel. 0 vector de expressão eucariético da cadeia pesada foi construído em dois passos (ver Figura li 5= Primeiro, o vector p895® contendo a região variável da cadeia pesada modificada do fragmento 1B4 murino foi digerido com Bgl II e BamHI* 0 fragmento de Θ,75 Kb purificado em gel de agarose foi ligado ao sítio BamHI do vector p8941 e os clones recorri h inanias contendo este fragmento na orientação correcta foram identificados* 0 DMA de plasmideo de um desses clones foi linearizado por digestão com Bam Hl a ligado a um fragmento BamHI de 1,78 Kb representando uma verslo curta da região constante gama 4 humana,, derivada do plasmideo pAT84 por amplificação com PCR... Após identificação dos clones contendo estas inserções na orientação adequada, os DNAs de plasmideo (um que é referido como p8953) foram cultivados e purificados para transfecção ds células recipientes de mamífero» Células hospedei-ras para a expressão de anticorpos monoc. lonais humanizados incluem mas não estão limitados a células humanas tais como células 293, células de macaco tais como COB—7 s CV—ÍP e outras células de mamífero tais como CHO a MSO*

Quantidades iguais, cerca ds 1© fjg, dos plasmideos codificadores da cadeia pesada quimérica de Ig64 e a cadeia lave kapa com CDR de ÍB4 inserida foram usados para transfectar, pelos processos convencionais de precipitação com fosfato ds cálcio, células humanas 293 e células de macaco COS-7 e CV-1P» Os

sobrenadanies de cultura foram testados por ELISA (descrito abaixo) quanto è secreção de imunoglobulina IgS4/kapa humano» Este ensaio de ELISA foi também empregue para a quantificação das quantidades de um anticorpo recomtainante 1B4 humanizado expresso em meio condicionado de crescimento de células de mamífero»

Placas Immunolon-2 (Dynatech Labs») de 96 cavidades foram revestidas durante a noite com uma solução de aproximada-mente 5pg/ml de anticorpo monoclonal de ratinho anti-domínio constante da cadeia fcapa humana ícat. #1Ί0ΘΘ95 The Binding Si te, Inc., =, San Diego» CA> em tampão NaHCO^. cerca de θ5 iM (pH 8„25 a aproximadaments 4°C e bloqueado com cerca de 1% de albumina sérica bovina ÍBSA) em NaHCQ_ cerca ds ©?ϋ1 durante cerca de 1 hora aproximadamente 25 °C» Após este e todos os passos subsequentes s a lavagem foi realizada com tampão de fosfatos salino (PBS) .= Os poços foram então inoculados com meio condicionado contenda anticorpo anti-CBÍS recomfoinante ou com quantidades predeterminadas de ígS4/kapa humano purificada por cromatografia em proteína A-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals) a partir de soro de mieloma de ig84 humano (cat» # BP©26? The Binding Site5 Inc»), Todas as amostras foram díluidas em PBS contendo Tween-2© cerca de ©,05%Amostras ds cerca de 100 μΐ foram incubadas durante cerca de 1 h a cerca de 37°C em triplicado e fizeram-se curvas de cal coração com padrões usando concentrações de IgG4 variando entre cerca de 1© ng/ml e cerca de 1ΘΘ ng/ml« IgS4 ligada e totalmente montada (construções nativas ou recambinantes de ÍB4-IgG4) foram detestadas com amostras ds cerca de 1ΘΘ gl de uma diluição de ír,5Ô© de anticorpo monoclonal de ratinho anti Fc de Ig84 humano conjugado com fosfatase alcalina (cat#®5-3822? Zymed Laboratories;, Inc, ) em tampão de fosfatos salino (PBS) contendo cerca de 1% de BSA» Após incubação durante cerca de i hora a cerca de 37°C e subsequente lavagem as quantidades de conjugado ligado foram detectadas por incubação ds todas as ,ν -X' ' amostras com uma solução de 1 mg/ml de p-nitrofeni1 fosfato em tampão 2*2 ?aiBÍnometil-propanedioi ©„1 Η,, pH 1Θ?3 durante cerca de 3# minutos a cerca de 25 °C. A ahsorvância das cavidades foi determinada com um leitor de placas de ELISA UV MAX (Molecular Devices) marcado para 4Θ5 nm. Observou-se que todos os sobrena-dantes das células transfectadas continham esta imunogiobulina? se bem que em quantidades variáveis (Figura 12)= 0 anticorpo secretsdo pelas células 293 transfectadas foi isolado por croma-tografia em proteína A e a concentração dos anticorpos recombi-nantss anti-CDiS humano foram determinados por ELISA como descrito atrás e usado para competir com a ligação de 184 murino marcado radioactivamente ao ligando CMS na superfície da PMNs humanos activados» As afinidades das várias construções de anticorpo recombinante anti~CD18 humano (r-h-anti-CD18>foram determinadas usando um ensaio ds ligação competitivo da “"'"1-184 solãvel com leucócitos polimorfooucleares humanos estimulados (PMWs)„ 0 anticorpo monoclonal murino purificado anti-CD18 (5Θ pg> foi iodinado usando cloramina T (Hunter e Bresnwood, Nature 194 s 495-496., 1962) s o anticorpo marcado radíoactivamente purificado usando uma coluna de HPLC para filtração em gel

Bio-Sil TSK250 (Biorad) (a qual fracciona proteínas na qama ds λ 1-3¾½) h Hõ~ dal tons) equilibrado em tampão fosfato pH /„©„ A radioactividatíe do efluente foi controlada com um detector em linha CBsckman Modelo 170j Beckman) e a proteína total medida nuim. com um detector Kratos Spectroflow 757 (KraiosK Um pico isolado de “*"*1-1134 composto por picos coincidentes de & de radioactividade slui caracterásticamente aos seis minutos5 3u segundos após injseção da amostra» A aotividade especifica do produto á geralmente cerca de 10pCi/pg ds proteína e 97-99% das contagens são precipitáveis com -ácido tricloroacético a 1Θ%» A ligação deste anticorpo marcada foi testada em PMMs humanos purificados num gradiente descontínuo de Ficoll/Hypaque (English and Andersong L Immunoi» Methods 5 = 249-255s 1974) e activados

com cerca de 1&Θ ng/ml da miristata-acstato da forbol durante cerca de 2Φ minutos a cerca de 37°C (Lo et ai», J= Εκρ« fted = 169;1779-1793« 1989)= Para determinar a afinidade dos anticorpos s para moléculas de CD18 na superfície de PríN, cerca de 1 x 1Θ PMNs activados foram incubados num tampao tal como solução salina equiforada os Hanks cantando cerca de 2& mrl Hepes (pH 7,2) cerca de 0=14 unidades de aprotinina (Sigma Chemical Co> e albumina do soro humano a cerca de 2% (tampão de ligação) contendo cerca de 1'~?!™ ·~ t 1 1=3 ng ds “"'‘7--1B4 (2 = 8 κ 1« ~ M> na presença de concentrações

crescentes de anticorpo 1B4 não marcado (cerca de 1Θ a 1Θ M) num volume de reacçãc de cerca de 3Θ6 μΐ durante aproximadamente lha cerca de 4°C com agitação constante= 1B4 ligados às células foi separado do anticorpo naSo ligado por centrifugação através de uflsa almofada de sacarose Θ55Μ (4 88© x g5 3 minutos)§ os tubas foram congelados em neve carbónica e os fundos cortados e conta." dos num contador gama LKB = A Ido anticorpo an ti-CD 18 para a inibição da ligação do anticorpo 1^1-184 foi calculada usando um programa adaptado a quatro parâmetros (Rodbard et al»3 Em "Radioimmunoassay and Related Procedures in Medicine”, International Atcsmic Energy Agency, Visnna, VoI = 1= 469-504, 1978)= A afinidade dos vários anticorpos recombinantes humanizados anti-—CD18 <s—h-anti—CD18) para o ligando CD18 foi determinado de forma semelhante usando anticorpo ”‘i-!'íí~lB4 e aumentando as quantidades, como determinado pela ELISA, de r-h-antiCD18= Os resultados dos ensaios de ligação estão apresentados na Figura 13 e indicaram que a afinidade do anticorpo 1B4 recombinante de cadeia pesada quimérica/cadeia leve enxertada é aoroximadaniente a do anticorpo monoclonal murino 1B4„ Os resultados descritos atrás mostram que um anticorpo com isotipo humano pode ser expresso de forma recombinante após a transferência dos- domínios de ligação ao antigénio de uma estrutura de cadeia leve Cmurina) ds um primeiro animal para uma estrutura de cadeia leve de um segundo animal (humano) fundida com uma região constante kaps humana. 24

quando combinado com uma cadeia pesada quimérica (região variável da cadeia pesada murina fundida com um domínio constante de gama 4 humana) sem perda de afinidade para o antigênio» Deste resultado pode deduzir-se que a região estrutural da cadeia leve REI humana não altera a apresentação das CDRs da cadeia leve murina de 1B4 e/ou a contribuição das CDRs da cadeia leve para a afinidade do anticorpo é mínima» Muitos dos exemplos da construção ds anticorpos recombinantes humanos contendo regiões de complementaridade substituídas pelas encontradas em anticorpos monoclonais murinos resultaram na perda de afinidade para o ligando ou antigènio» Assim» se bem que estas transmutações sejam possíveis, não é assegurada a manutenção da afinidade» Ds processos descritos abaixo demonstram que quando se considera estrietamsnte as regiões estruturais, os domínios CDR podem ser transferidos para aquelas estruturas sem a perda ds afinidade que acompanha a sus transferencia para estruturas “genéricas” empregues por Winter. Publicação do Pedido de Patente Europeia UQ 239,40©, publicado em 3Θ de Setembro de 1987=

Para identificar sequências estruturais humanas compa-tivsis com as CDRs por exemplo de 1B4 snutrino, foram identifiçadas estruturas huimanas com um elevado grau de semelhança das sequências relativamante às do 1B4 merino= A semelhança de sequências foi medida usando resíduos idênticos assim como substituições de aminoácidos conservativas» Estudas- semelhantes foram realizados usando a sequência estrutural murina de 1B4 da qual foram removidas as sequências CDR= Esta sequência foi usada para fazer a despiste de uma base ds dados tíe sequências de imunoglobulina humana derivadas de múltiplas fontes» Sequências com um elevado grau de semelhança de sequências foram examinadas individualmente quanto ao seu potsncila como sequências estruturais humanizantes» Deve ser dada especial atenção aos resíduos estruturais que não estão situados ou expostos na superfície do anticorpo uma vez que estes resíduos desempenharão um papel critica na arranjo do enrolamento que suporta CDR» Desta forma? o homóloga humana proporcionando as CDRs murinas com a estrutura mais semelhante è. sua estrutura murina nativa foi selsccionado para subsequente construção da região variável humanizada (ver Figura 14) = Deve-se notar que no presente invento as sequências estruturais das cadeias leve s pesada escolhidas para a inserção não necessitam de derivar do mesmo anticorpo humano,. Ou seja? usando o mesmo critério referido para escolher estruturas humanas todas as bases de dados de ácidos nucleicos e proteínas humanas acumuladas podem ser investigadas relativamente a sequências semelhantes ás com interesse» A estrutura de cadeia leve ideal pode derivar de uma sequência de imunoglobulina enquanto que a a estrutura da cadeia pesada pode derivar de outra» Caso não se consiga identificar estruturas humanas com suficiente semelhança a partir de sequências compiladas,, é possível isolar a partir de DMA genómico humano um grupo de regiões variáveis estreitamento relacionadas usando tecnologia de DMA recombinante. Assim,, pode-se projeetar um oliqodsso;·;inucleótido iniciador degenerado 55 a .montante a partir das sequências conservadas dentro do extremo amina de cada uma das várias regiSes F-Ri humanas e emparelhar-se com um oliga— desoxinucleótido iniciador degenerado 3? a jusante determinado a partir da sequência FR3 obtida a partir do monoclonal murino cujas CDRs se pretende transferir para um contexto humano» Estes pares de iniciadores são então usados para amplificar em PCR a partir de um molde genómico humano as sequências da DMA que estão flanqueadas pelo par de iniciadores» Os DNAs resultantes podem ser então clonados e a sequência de DNA derivada a partir de membros individuais descreverão várias regiões variáveis humanas relacionadas com murinas» A probabilidade de mutações somáticas nos resíduos estruturais e a conservação da sequência de aminoécidos entre murganho e humano tornam possível esta abordagem» I λ

έ divulgada a construção de ura anticorpo IgS4 humano recombinanie completo* cujos domínios variáveis das cadeias pesada e leva confim os resíduos CDR do anticorpo monoclonal murina, com retenção completa da especificidade e afinidade rfo anticorpo monoclonal murino parental. Descreve-se a construção da estrutura da cadeia Isvs enxertada com CDR derivada da sequincia humana de REI fundida com uma regitio constante da cadeia leve kapa humana, A sequincia da estrutura da região variável siurins, sem sequências CDR, fai usada para examinar uma base da dados ds sequências completas da região variável humana, As sequências humanas mais semelhantes à região estrutural murina foram então analisadas individualmente para determinar a sus identidade de sequências e semelhança com a região estrutural murina, Mo caso de 1B4 murino estas sequências incluem mas não estão limitadas a Sal e Jon, escolhidas devida aos seus elevados- graus ds semelhança © identidade com a sequência da cadeia pesada de 1B4 murino. Mostrou-se que FR Sal é 85% semelhante e 79% idêntica a 1B4 murino, enquanto que se mostrou que FR don é 88% semelhante e 75% idêntica a 1B4, Estes valores baseiam-se na matrix de semelhanças de Dayhoff de substituições de aminoácidos evolutivamente conservados <R, H, 8ch?*iartc5 M,0, Dayhoff 5 em "Atlas of Protein sequen-ce and structura li,0, Dayhoff, Eds, (National Biomedical Research Foundations DC C19793) (ver Figura 14) „ rara preparar um DMA recombinante codificador das CDRs da cadeia pesada murina no contexto de cada uma destas partes estruturais reali^aram-se os processos que se seguem,

Sintetisaram-se duas séries de quatro longos oligodeso-xinucleótidos. Quando cada série á combinada, elas codificam as CDRs da cadeia pesada de 1B4 e a estrutura da região variável da cadeia pesada humana. Os quatro oligodesoxinuclsótidos de uma

série? cerca de 1 pmole ds cadas foram combinados numa rsacção de F:’CR com polimerase Taq e cerca ds 5Φ pmolss de cada um dos oligodesaxinucleétidos ds amplificação terminal (Figura 15s Figura 16) = Dsvido aos entremos complementares dos oligodssoxinu"· cleétidos ds cadsia simples3 os ciclos de polimerização-desnatu-raçSo-polimsrizaçlQ da reacção em cadeia com polimerase resultam na formação s subsequente amplificação das sequências combinadas» Após cerca de 25 ciclos de amplificação o fragmento combinado de £ís4 Kh foi purificado por electroforess em gel ds agarose = Paralslamsntsp dois fragmentos de DNA representando sequências aminp-terminais corfificadoras do peptídeo sinal s as sequências carboxi-terminais codificadoras da estrutura 4P sequências dadora ds !!splícing5í e sequências intrónicas foram amplificados usando pares de oligodescxinucleótidos iniciadoras (Figura Í5> s o DMA molde de plasmideo contendo NEW!Í5 HÍ3VHPCRÍ (descrito atrás),, Estes dois fragmentos foram purificados em gel de agarose,, coma atrás? e cerca de 1Θ ng de cada um foram combinados com cerca ds 1Θ ng do fragmentei da região variável enxertada amplificada^ polimerase Taq 3 cerca de 5Θ pmoles de cada um dos iniciadores terminais (Figura 15) s a mistura foi amplificada em PCR = 0 Fragmento resultante de 0?85 Kh foi digerido com as encimas de restrição Bpe I s BamHl» Apés electroforese em gel de aqros-e,, o fragmento de DNA purificado foi ligado ao vector de expressão da cadeia pesada,, p89SS (ver Figura 11>P em ve-c da região variável quimérica», Desta formas foram construídas duas estruturas ds cadeia pesada únicas contendo as CDRs sturinas enxertadas (Jon/lB4 e Gal/1B4>« Cada um dos plasmídeos vectores de expressão da cadeia pesada totalmente enxertada foi cotransfsetado com o plasmideo vector de expressão da cadeia leve REI/184 totalmente enxertado em células 293 e o anticorpo humano recombinante apareceu no meio condicionado» 0 anticorpo recombinante humano (totalmente humanizado) haterodimârico Bal/lB4sREI/lB4 foi isolado por cramatografia em proteína A» A afinidade deste anticorpo para o ligando CDIS apresentado na superfície de PMMs humanos activados foi comparada com a descrita acima b com o anticorpo monoelonal murino 184 parental» A Figura 20 mostra que apesar de cada anticorpo heteradimérico conter a mesma série de seis CDRs, eles não apresentam afinidade idêntica para o ligando» Assims a afinidade de uma molécula de anticorpo baseia-se na estrutura da região variável na qual estão inseridas CDRs» 0 anticorpo monoelonal murino parental apresentou um IC,_..-3 da aproximadamente 0,5 nM enquanto que o heterodimero Bal/Rei tem um 'IC^ de aproximadamente 1,6 nM»

Para determinar a contribuição relativa das regiões variáveis das cadeias pesada e leve para a maior afinidade do heterodísiero enxertado Ga 1 /REI, construíram—se segundas estruturas de cadeias pesada e leve contendo as sequências CDR 1B4» Estas estruturas, designadas Len e mutanie Bal ou Bal-lil foram escolhidas da base de dados da imunaglabulina humana devido ao seu. elevado grau de semelhança relativamente à cadeia leve FR e á cadeia pesada FR de 1B4 murino CFigura 14)» A FR Len mostra uma semelhança de 9®% e uma identidade de 81% quando comparado com 1B4 murino» Os anticorpos recombina.nt.es resultantes que se ligam especificamente ao antigénio ou receptor CD1B foram designados anticorpos rscombinant.es humanos anti~CD18 <r-h-anti-CE* 18 Abs) »

Este invento está ainda relacionado com um método de inibição do influxo ou migração de leucócitos capasse de expressarem o antigénio CD18 (inteqrina de leucócitos, subunidade heta-25 na sua superfície num local de inflamação ou numa área de tecido ou orgao que ficará inflamada após um influxo das células» A inflamação que é o alvo do método do presente invento pode resultar cie uma infecção com um microorganismo patogénico como sejam bactérias çjram-positiyas e gram-negativas, parasitas e fungos» Ã resposta pode também ser induaitía por vírus e meios nlc

infscciosos tais como trauma ou reperfusão após efarte do miocár-dio ou choques respostas imunes a antigénio estranho e respostas auto-imunes*

Os anticorpos humanos recombinantes anti-CDlS são úteis no tratamento de inflamação dos pulmões,, sistema nervoso central3 rins* articulações,, endocárdio* pericárdio,, olhos* ouvidas,, pele* iracta gastrointestinal e sistema urogenitai* Qs casos de doenças em que os anticorpos humanos recombinantes anti-CDIS sSo úteis como agentes terapêuticos incluem mas não estão limitados as doenças infscciosas sempre que verifique uma infseção activa em qualquer sitio do corpo,, tal como meningite? condições tais comam inflamações crónicas ou agudas secundárias causadas por depósito de antigénio? e outros estados tais como encetaiite.5 artrite? uveite? colite? glomerulonefrite? dermatite? psoriase? e sindrome da tíistrofia respiratória associada a sepsis ε/ou trauma* Outras doenças inflamatórias que podem responder ao anticorpo humano recombinante anti-CDIS incluem3 mas não estão limitadas a perturbações imunes e estados que envolvam ligação/rsconhecimento a células T e/ou macrófagoss tais como hipersensibilidade aguda e retardadas doença de transplante vs. hospedeiro? estados auto--imunes primários tais como anemia perniciosa? infseção relacionada com estados auto-imunes tais como diabetes melitus Tipo I? .ardor durante a artrite reumatóide? doenças que envolvem diapedesis de leucócitos,, tais como esclsrose múltipla? doenças mediadas por complexos antigénio—anticorpo incluindo certos estados de intenções secundárias referidos atrás? imuno-supres-são? a rejeição de transplantes* Estadas inflamatórios devidos a choque tóxico ou trauma tais como sindrome da distrofia respiratória em adultos e danificações causadas por reperfusão? e estados de doenças devidos a discrasias de leucócitos e metas— tases,, estio incluídos dentro do âmbito deste invento*

Q presente invento é também aplicável è inibição de de ligação de leucócitos ao sndotélio para fins de diagnóstico s terapêuticos? tais como abertura iatrogénica do endotéiío para evitar o ingresso de leucócitos durante o ingresso de um corante ou poteneiador de imagnes num tecida ou para permitir a entrada selectiva de uma droga terap@uti.ca no caso ds quimioterapia^ ou para aumentar a colheita de leucócitos de doentes»

Anticorpos humanos rscombinantes anti-CDiB ou um seu fragmento a.ctivo podem ser usados para tratar as doenças atrás referidas» Uai ingrediente activo incluirá F(sb5)23 Fab e qualquer outro fragmento que se possa ligar so antigénio CDÍ8» Os anticorpos anti-CDiS humanos recombinantss podem ser administrados sózínhos para o caso de doenças não infscciosas ou combinados com antibióticos ou outro agentes anti-infscciosos para o tratamento de doenças infecciosas por razões discutidas atrás» A administração incluirá de um modo geral os anticorpos e outras substâncias num meio fisiológicamente aceitável ou num veiculo farmacâutico» Tal meio fisiológicamente aceitável ou veículos farmacêuticos incluem? mas não estão limitados a* soro fisiológico,, tampões de fosfatos salinoss glucose tamponada com fosfatos salinos* soro fisiológico tsmponado e similares» Os anticorpos e qualquer agente anii—infeccioso serão administrados por vias parenterais que incluem injecção ou libertação intravenosa» intramusculars subcutânea s intraperitoneal A quantidade dos anticorpos e a mistura na forma de dosagem está dependente do estado de doença particular a ser tratado» A quantidade do anticorpo anti~CD18 rscombinante humano ui 1 içado numa forma da dosagem poda variar entre cerca ds 1 e cerca ds i ΘΦΘ mg* sendo preferida uma gama entre cerca de lô mg e cerca da 10© mg» Os anticorpos podem ser administrados

diariamente ou menos frequentemante conforme determinado pelo

Os skempios gus se ssqusíT! ilustram o orsesnie invento sem, no entanto.·; o limitar. s

X' í Λ \ EXEMPLO í

PREPARAÇÃO DE UM ANTICORPO RECOMBINAMTE EMXERTABG/QUIMéRICO

Produziu~se um anticorpo em qus o domínio variável da cadeia leve compreende as regiões estruturais ds uma cadeia leve humana s as CDRs ds uma cadeia leve ds murganho, enquanto qus o domínio variável da cadeia pesada deriva totalmente de uma cadeia pesada murina. As regiões estruturais da cadeia leve foram derivadas de uma proteína REI de mieloma humano (Orlandi, st sl», Proc» Nail„ Acad» Sei, USA 6ès 3833-3837 0 9893 = Riechmann et al* 5 Mature 332s 323-327 E1988jg Pedido de Patente Europeia, Publicaçlo NQ 239,4ΘΘ) para a qual foi determinada a estrutura cristalográfica» As sequências CDRs do anticorpo monoclonal rourino 1B4 que se liga a CD18 (a subunidade beta da família beta-2 de inteqrinas de leucócitos que incluis LFft-i, Mac-1 e ρί5Θ=95> foram obtidas como se segue» 0 hibridoma designado 1B4 qus produc o anticorpo monoclonal 1B4 foi depositado de acordo com o Tratado de Budapeste na Autoridade Depositária Internacionais American Type Culture Colleciion, i230i Parklswn õrive, Rockville, MD, 2Θ852» A viabilidade foi determinada em 6 de Junho de 1989 e o hibridoma foi designado HB 1 ® 164,, Experiências anteriores determinaram qus este anticorpo é uma IgG2s com uma cadeia leve kapa <Wright et al», Proc. Natl. Acad» Sei» USA 5Θ? 5699-57Θ3 C19831)» RWA total foi extraído de células de mieloma ΪΒ4 usando métodos convencionais envolvendo solubilisaçlo celular com isotioeianato ds guanídinio (Chirg^in et al»=; Biochsm» 18¾ 5294-5:299 E19791), Séries ds oligonucleótidos iniciadores degenerados (Figura 1) representando sequências dentro da estruturas 1 da regiSo variável da cadeia, leve kapa s do domínio constante da - 33 -

χ V cadeia leve kapa murinas ou as que estão dentro da estrutura 1 da região variável da cadeia pesada de lgS2 s do domínio CHi constante da cadeia pesada foram sintetizados pelos processos com íosforamidsto convencionais num sintetizador de DMA da Applied Biosystem 381A» A remoçSo dos oligodesaxinucleótidos (oligos) da resina foi conseguida por tratamento com !μΗλΟΗ concentrado seguido de remoção da sal numa coluna NAP-5 <Pharmacia) com eluiçlo com H„0 (quando os oligos eram <45 bases de comprimento) ou. pela utilização ds uma coluna OPC (Applied Biosystems Inc) com eluição com 2®% de acetonitrilo (quando os oligos eram >45 bases de comprimento) conforme recomendado pelos fabrieantes* 0 RMA total (2pg) foi sujeito à acção de transcriptase reversa durante 30s a 42°C usando transcriptase reversa de MLV Moloney (2Θ® unidades, BRL) s 1® pmoles dos iniciadores da cadeia complementar da região constante representando cadeia leve ou pesada num tampão (volume final ds 2® μΐ) contendo 5® nM Tris-HCl, pH 8,3, 75 mM KC13 3 mM rigCl.-,, 1® nsM DTTe 2® unidades de RNAsina •ál (Pharmacia)» A transcriptase reversa foi inactivada pelo calor C95°C, 5·') e as reacçSes foram ajustadas para conterem em 1®® μ 1 de tampão PCR (1® mH Tris-HCl, pH 8,3, 5® mri KC1, 1,5 mM HgCl^5 ®S®1% ds gelatina, tíHTP 2Θ® μΜ cada), 5Θ pmoles de cada par de iniciadores e 2,5 unidades de poiimerase Taq (Perkin Elmer/Cetus)» A ampliação por reaeção em cadeia com poiimerase (PCR) foi realizada essencialmente como descritom par Saiki et a1,» Science 23®s Í350-13S4 (1985) s outros (Mullis et al,, Cold Spring Harbar Symp» Biol» 51. s 263-273 £19863, Dawasaki e Wang, PCR Technology, Principies and Applications for DMA Amplification, Erlieh, Ed=, Btockton Press, WY, pp = 89-97 £19893, Tung et al = = ihid = pp» 99-i®4 C19391)= Quarenta e cinco ciclos de amplificação por um DMA Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus Instruments) C2?, 94°Cs 25, 55°C; 2372°C) foram seguidos de purificação em gel dos dos fragmentos ds 4®® pb ípb) esperados (Figura 2)* Antes da subcionagem dos DNAs num plasmideo

intermediário de -entremos cerces ípSP72, Promega) eles foram fosforilados ierminalmente usando polinucleátido-cinase de T4 (Boehringer riannheim), E« coli competentes congeladas foram descongeladas em gelo e amostras de μΐ foram distribuídas por tubos de polipropileno arrefecidos em gelo., DMA <1 — 1© nq > da mistura de ligação foi distribuído com agitação por estes tubos e a mistura foi incubada em gelo durante 3Θ minutos. As células de

E._coli foram submetidas a choque térmico por incubação a 42°C durante 45° segundos, depois arrefecidas em gelo durante 2 minutos. Adicionou-se 3.0,0. íHanahan, B=, 3, Mol. Biol. 166s í 19833) à temperatura ambiente s as culturas foram agitadas a. 225 RPíi a 37°C durante 66 minutos. Amostras das culturas foram espalhadas em placas de agar LB contando 1&& pg/ml de ampici1ina e estas- placas foram incubadas- durante a noite a 37°C para permitir o crescimento de colónias. Múltiplos clones representando estas sequências -amplificadas por PCR foram isolados a partir de E, coli DH5 transformadas semeadas em placas de agar LB contendo 5® yq/ml de ampici— 1 ina,; crescidas por processos descritos <Maníatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Sp-ring Harbor Laboratory 5 Cold Spring Harbor, NY, 1982), os DNAs de plasmideo foram extraídos das bactérias usando os processos de preparação de DMA de Birnboin e Doly Mucleic Acid Res. 7s 1515 <1979) s os DMAs de plasmideo de cadeia dupla foram submetidos a determinações de

P sequências de DNA usando Sequenase (United States Biochemicals) e iniciadores de sequenciaçlo específicos de 17 e SPé (Boehringer M-annheim) usando os protoclos recomendados pelo fabricante. Obteve—se uma sequência de DNA única representando uma região variável da cadeia pesada merina de IgG2a, mas duas regiões variáveis da cadeia leve kapa estavam representadas dentro da população clonada (Figura 3), Para distinguir qual a sequência que pertencia ao MAb 1B4, o MAb 1B4 foi reduzido com DTT e as

caosias leves purificadas foram sujeitas s sequenciaçãa ds aminoácidos N--terminal usando o sequenciador Applied Biosystems 477A„ Se bem que segmentos de resíduas de aminoácidGS fossem idfnticos aos do mHAh 1B4 observados dentro da sequência 1 da cadeia leve de 1B4 prevista a partir do cDMA, verificou-se que a cadeia 2 leve de 1B4 (Figura 25) é de- facto a sequência da cadeia leve do ?iAb 1B4= Isto é consistente com a sequência de DNA determinada para a molécula da. cadeia leve 1 (Figura 24) o que sugere que eia representa uma região variável da cadeia lave kapa murina do subgrupo 111 contendo uma mutação na região CDR3/FR4 cuja sequência é a terminação da cadeia pepiídica» A substituição de CBRs da região variável de REI humano pelas únicas do MAb 1B4 deu-se como se segue= A estrutura REI (obtida como forma rF do vector Hi3? M13V!<PCR1? Orlandi et al » , Proc» Natl» Acad, Sci= USA 86s 3833 (1989),, com o seu líder do peptídeo sinal e sequências inirónicas, foi subclonada no vector intermediário pSEH3Z (Promega) r, tal como foi a estrutura da regiio variável da cadeia pesada NEW ou NEWH (obtido a partir do vector de M135 M13VHPCR1S Orlandi st al„ supra) Sinteti2sram~se oito oligodeso;-;inuc le-ótidos (Figura 4) representando os iniciadores necessários para gerar por amplificação de PCR quatro fragmentos de DNA» As sequências correspondendo às CDEs da cadeia leve do íiíMhq 1B4 e pela menos 15 bases de complementaridade terminai 55 (ver Figura 5) foram incorporadas em todos os oli-godesoMinuclsótidos excepto nos terminais» 0 par de iniciadores adequados (5© pmolss de cada) foi combinado com 1Θ ng de DNA do plasmídeo contendo a estrutura de REI? 2,5 unidades da DNA—po— limerase TaqP componentes da reacçlo PCR a tampão e rsalisados trinta (30) ciclos da amplificação PCR (períodos dos ciclos como atrás)» Ds produtos das quatro reacçõess purificados por electro-forese em gel ds agarose? foram combinados (1© ng de cada fragmento de DNA) juntamenta com um par de oligodesoninucleótidos

iniciadores terminais (amplificador) (Figura 4>s DNA---pol imersos Taq,, componentes da reaeção PCR e tampão e os fragmentos resultantes recombinadas foram amplifiçados,, como descrito atrás9 durante trinta ciclos (ver Figura 5)= Após digestão com as endonucleases de restrição HindiII e Xbal o DMA amplificado foi purificado a partir de um gel de agarose e subclonado nestes mesmos sítios de um vsctor intermediária pSP72 (Promega) que continha a região constante da cadeia leve kapa humana? obtido como se -segue» DMA Cl μα) purificado a partir de uma linha de células 8 humanas (ΒΜΘίΘΙΒΑ^ NIBriS Humana Benetic Mutant Cell Repositoryj Institute for Medicai Research;, Csmden? N«J« Θ81Θ3) foi usado como molde para os oligodesoKinucleótidos iniciadores descritos na Figura 7 para amplificar em PCR um fragmento de 92Θ pares de bases contendo o aceitador de "splicing" do domínio constante da cadeia leve kapa humana5 o exão e uma fracção da sua região 3* não traduzida (par da iniciadores para PCR selsccionado com base na sequência da região constante kapa descrita por Hieter et al.. Cell 22 s 197-207 E19803)» 0 produto de PCR foi purificado por electroforess em gel de agarose·, digerido com a endonuclease EamHI a subclonado em pSP72 íPromega) previamente linearizado com BamHI«

Os clanes individuais Cp8982> representando o vector intermediário pSP72 contendo a região variável da cadeia leve enxertada de ΪΒ4 derivada de REI e a região constante kapa humana obtida por amplificação em PCR de DMA humano foram usados para verificar a sequência de DMA da região variável da cadeia leve enxertada» A fracção da cadeia pesada quimérica do anticorpo recombinante foi obtida a partir da região variável da cadeia pesada de 1B4 murino fundida, com a região constante humana do subtipo 4 gama obtido a partir de uma biblioteca em lambda construída por Flanagsn and Rahbiis,, Nature 3Θ05 709-713 (1982)» i

A região variável da cadeia pesada quimérica fai construída a partir de três fragmentos de DMA representando uma sequência sinal? uma frscçlo da região variável da cadeia pesada de 1B4 murino e uma sequência intrónica (Figura 8)= Sintetizaram--se pares de oligodesDxinucleóíidos iniciadores (Figura 9) representando os iniciadores necessários para gerar por amplificação de PCR estes três fragmentos de DMA a partir de i® ng de DMA molda de plasmideo contendo a região variável da cadeia pesada NEW <nl3VHPCRi> ou um vector intermediário pSP72 contendo a regilo tía cadeia pesada da IgB2aP préviamante usada para determinar a sequência CDR de ÍB4 murino» A amplificação do fragmento sinal de 225 pb^ fragmento da região variável de 35® pb e o fragmento contendo o irttrão de 23® pb foi realizada coma descrito atrás» Os produtos purificados em gel de agarose foram combinados <1® ng de cada produto) com pares da iniciadores terminais (Figura 9) e o molde rscombinado in vitro gerado por PCR foi amplificado usando o processo convencional descrito atrás para recombinaçlo dos fragmentos compreendendo a região variável da cadeia leve REI enxertada com 1B4= Antes da subclonagem num vector intermediário ípSP725 Promega) digerido com BglIX s com BamHI» este produto rscombinado foi digerido de forma semelhante e purificado em gel de agarose» 0 DNh foi obtido após crecimsnto de ciones bacteriarios individuais e submetido a sequenciação do p DMA usando Sequenase!' e iniciadores de sequenciação específicos de T7 e de SP3 para verificar a sequência, da região variável reconstruída s os seus domínios flanqueantes. A região constante da cadeia pesada gama 4 foi subolo-nada como um fragmento Hindi II ds 657 Kh derivado do plasmideo pAT84 (Flanagan and Rafaitts,, supra) no sitio HindiII do vector intermediário pSP72 (Promega)» Este plasmideo <p8947) foi então usado como DMA nsolde a partir do qual uma versão encurtada da região constante da gama 4 foi obtida usando os processos

convencionais de smplificaçSo por PCR descrito atrás e os pares de iniciadores indicados na Figura 7„ Construiram-se vectorss de expressão eucarióticos como descrito abaixo de tal forma que a molécula da cadeia pesada de imunoglobulina foi transcrita a partir de um plasmideo portador da marca de resistência è neomi-cina (8418) (Rothstein and Rezníkoff, Dell 23 2 191-199 E19813), enquanto que a cadeia leve de imunoglohulina foi transcrita a partir de um plasmideo portador da marca de resistência à higro-micina B (Britz and Davies? 8ens 25s 179-188 £19833), Com excep--ção da fracçSo ds resistência a drogas estes plasmídsos sSo idênticos* 0 progenitor dos vectores de exprsssSo de imunoglobuli-nas foi o vsctor de expressão eucaclético pD5 (Berkner and Sharp3 Nucl* Acids F;ss, i_3s 841-857 E19853) o qual contem a origem de replicação dos adenovirus5 o domínio potenciador do SV4#5 o principal promotor tardio dos adenovírus3 o líder tripartido do adenovírus 2P um dador de !!splicing!l 55 do terceiro líder e um aceitador de Eisplicingn 3? derivada de um locus de imunoglobu-lins, um sítio ds clonagsm múltipla e o sinal de poliadenilação tardio do Sv4® (Figura 1¾)* A origem de replicaçSo foi removida por digestão com EcoRI -e Kpnl e substituída por dois fragmentos representando o gene da marca sslsccionávsl nso (derivado do plasmideo pCMVIE~AKl— BHFR ÍSilbsrklang et al „Modern Approsches to Animal Cell Technology3 Ed, Spier et al ,, Butterworths U,K, E19873) como um fragmento EcoRI/BamHI de 138 Kb) s o psstenciador da cadeia pesada de Ig (obtido como um fragmento amplificado por PCR usando processos convencionais descritos atrás e DMA humano como moldes o par ds oligonucleótidos iniciadores está apresentado na Figura 7) após a sua digestão com BglII s Kpnl, Encontrou-~se que o vsctor ds expressão resultante não possui um pequena fracçSo do promotor TK responsável pela transcrição da gene da nsomicina, Este foi substituído pela inserção no sítio EcoRI da 39 r.

um fragmento de ®?Í4 l<b amplificado por PCR derivado do DMA ds CliViE-AKl-DHFR usando o par tíe iniciadores também apresentado na Figura 7» 0 vector de expressão da cadeia pesada resultante foi subsequentemente modificado por remoção dos sitios HindIII e Xb&I« Para converter este vector ssleccionâvel pela neomicina (p8941) num que expresse a marca, seleccionável hiqromicina B <p8942) <Figura ίθ) a cassete de resistência à neomicina foi removida por digestão primeiro com EcoRI seguido de preenchimento com BMA-polimerase do extremo protuberante 5% depois digestão com Sail„ A cassete ds expressão de higroraicina B de 1=9 Kb promotor TK e sinal de pal iader? ilação TK flanqueando o gene da higromicina B obtido de Gritz and Daviss= Sene 25s 179-ÍS8 (1983) como o fragmento BamHI de i39 Kb no plasmídeo (ρί_.Β9θ}3 foi removido do plasmideo pAL-2 por digestão BamHI e subclonado no sitio BamHI do vector intermediário pSP72 (Promega)* A cassete da bigromicina B foi removida deste vector por digestão com Smal e Sall e clonado no vector tíe expressão linearizado como descrito atrás para criar um fragmento de DMA com um extremo cerse e com um extremo Sall* A expressão da cadeia leve kapa enxertada com CDR de 1B4 foi conseguida por transferência deste cistrão da sua posição dentro do vector intermediário pSP72 para o vector ds expressão eucarióticu seleccionável pela higromicina B (Figura 18)= Um fragmento de DMA de 1«5 Kb resultante da digestão de p89‘32 com as endonucleases Spel e Ciai foi purificado por electroforese em gel de agarose e ligado no vector de expressão \p8942) que foi previamerite linearizado por digestão com as mesmas duas enzimas ds restrição e purificado em gel de agarose» 0 vector de expressão da cadeia pesada eucarístico (pB958> foi construido em dois passos (Figura 11)= Primeiro^ p894? contendo a região variável da cadeia pesada modificada, do

1Β4 murino foi digerido com BglII e BamHI* 0 fragmento de Θ?8 !<h purificado sm gel foi de agarose foi ligado no sitio BamHI do vecíor p894í e os recombinantes contendo este fragmento na orientação corrscta foram identifiçados* Utn desses plasmideos foi linearizado por digestão com BamHI s ligado com o fragmento BamHI de 1P8 Kb representando um versão encurtada da região constante gama 4 humana derivada do plasmídec? pS947 por amplificação da PCR como descrito atrás* Após identificação dos clones contendo estas inserções na orientação adequada os DNAs de plasmideos foram amplificados (Maniatis et al„, supra) e purificados para trans-fecção de células de mamífero recipientes (Maniatis et aL, supra5 Birnboin and Doly» supra*

Quantidades iguais Π.Θ pg) dos plasmideos codificadores da cadeia pesada quimérica Ig64 e da cadeia leve kapa enxertada com CDR de 1B4 foram transfectados pelos processos convencionais de precipitação com fosfata de cálcio para células humanas 293 s para células de macaco COS-7 e CV-IP* Os sobrenadantes de cultura foram testados por ELISA (descrito abaixo) relativamente à secreção de imunoglobulina humana IgG4/kapa*

Foi optimizada uma ELISA para a quantificação das quantidades de um anticorpo recombinante 1B4 expresso e.m meio condicionado de crescimento de células de mamífero* Placas Immunolon-2 (Dynatach Labs*) de 96 cavidades farsm revestidas durante a noite com uma solução de 5 pg/mi de anticorpo monoclo— nal de murganho anti-domínio constante da cadeia kapa humano (cal. #Μ0©Θ9? The Binding Sits* Inc», San Diegos CA) em tampão NaHCG^ í)slrl í pH 8;J2) a 4C'C s bloqueado com 1% de albumina do soro bovina íBSA) em 8 * 1M NaHCO- durante i hora a 25°C* Após este e em todos os passos subsequentes,; as lavagens foram realizadas tampão de fosfatos salino <PBS)* As cavidades foram então inoculadas com meio condicionado contendo anticorpo recombinante

anti-CDIS ou com quantidades pré-determinadas de IgS4/kapa humana purificada por cromatografia em proteína A Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals) a partir de soro de mieioma contendo IgG4 humano Ceat.: #BP026, The Binding Sitss Inc = > Todas as amostras foram diluídas em PBS contendo Θ ? €>5% Tween-2®» Amostras de gl foraa* incubadas durante 1 hora a 37 *C em triplicado e consíruiram-se curvas de caiibração com padrões usando concentrações de IgB4 variando entre 1Θ ng/ml e 1®Θ nq/ml» IgB4 humano ligado s total-mente montado (construções nativas ou. recombinantes de 1B4—Ig84 humano) foi detestado amostras de ΙβΘμΙ de uma diluição de Ιϊ5Θ® de anticorpo morioclonal de murganho anti-Fc tís Ig84 humano conjugado com fosfatas® alcalina Cc&t #Θ5-3822? Zymed Labratories, Inc») em tanípão de fosfatos salino (PBS? contendo 1% de BSft.·. Após incubação durante lha 37°C e subsequente lavagem., as quantidades de conjugado ligada foram detectadas por incubação de todas as amostras com uma solução de 1 mg/ml de p-nitrofeni1— fosfato sm tampão β,,ΙΜ 2?2!!5mino-metilprDpanediol s pH 10..3.= durante 3® min a 25°C» A afosorvlncia das cavidades foi determinada com um leitor de placas de ELISA Liv Hax (fiolecular Devices) acertado para 4®5 nm« Encontrou-se que todos os sobrenadantes contam esta imunoçIobuIina? ainda que em quantidades variáveis (Figura 12). 0 anticorpo secrstado pelas células 293 transfec-tadas foi concentrado por cromatografia em proteína A e as concentrações dos anticorpos recombinantes anti-CDIS determinadas pela ELISA· descrita atrás., foram usadas para competir com a ligação de 1B4 murino marcado radioactivamente ao ligando CD18 na superfície de PliHs humanos activados= As afinidades de várias construções da anticorpos r-h-anti-CD18 foram determinadas usando um ensaia de ligação competitivo de solúvel com leucócitos polimorfonucleares CPMNs) humanos estimulados.. 0 anticorpo monoclonal murino anti-CDIS (5® pq> foi iodinado usando cloramina T (Huntsr, khrh e Sreenwoad p F.. C.. .·, Nature 194 s 495-496,, 1962)., e o anticorpo marcada radioactivamente purificado usando uma coluna

de filtração em gel para HPLC Bio-Sil iSKíti® (Biorad, Richmond, a CA> ta qual fraccxona proteínas na gama 0e i-3®® x 1Θ" dal tons) equilibrada em tampão de fosfatos β,ΙΜ, ρΗ 7,®» A radioactividade do efluente foi controlada com um detsctor ligado ao sistema CBsckman modelo 1702 Beckman, Fullerton» CA) e a proteína total medida a 00„«Λ com um detsctor Kratos Spectrofloia 757 <!<ra tos, 125 '

Manwah, hLu,?» Um único pica de “ '"I-iB# composto par picas °·'~· e de radioactividade elui caracteristica- mente aos é minutos e 3# segundos após a injeccão da amostra» A actividade especifica do produto é geralmente cerca de 1® μΟχ/μο de proteína e 97-99% das contagens foram precipitáveis com 10% de ácido tricloroacético» A ligação deste anticorpo marcado radioso-tivamente foi testada em PMNs humanos purificados num gradiente descontinuo de Ficol 1/Hypaque CEnglish e Anderson» J„ Imoiunol» Methods 5s 249-255, 1974) e sctivadoE com 1Θ® mg/ml de miristato de forbol durante 2® minutos a 37 °C íLo et a1»„ J = Exp» lied» 169u 1779-1793, 1989)» Para determinar a afinidade dos anticorpos para moléculas de CD18 na superfície de PMNs» cerca de 1 x 1®^ PfiNs activados foram incubados num tampão tal como uma solução equilibrada de sais de Hank contendo 2® mfl Hepes ípH 7,2?, ®,Í4 unidades da aprotinina (Sigma Chemical Co»> e 2% de albumina de soro “f humano < tamplo de ligação) contenda 1,3 ng de ¢2,8 x 1® Vi) na presença de concentrações crescentes de anticorpo 1B4 -7 -.<*{ não marcado Ci® ' a 1® M> num volume de reacção de 3®® μΐ durante i hora a 4°C com agitação constante» ÍB4 ligado às células foi separado do anticorpo não ligado por centrifugação através de uma almofada de sacarose ®,5M (4 8Θ® a g, 3 minutos)p os tubos foram congelados em neve carbónica e as pontas curtadas e contadas num contador gama LKB. 0 IC^..-,. do anticorpo anti~GDi8 para a inibição da ligação do anticorpo "' 1-184 foi calculado usando um programa de adaptação de quatro parâmetros (Rodbard, iiunson and DeLean, em !íRadioimmunoassay and Relates Frocedurss in Medicine”, International Atomic Energy ftgency, Vierma, vol I,

469--:204, 1.978) = A afinidade dos vários anticorpos r-h-snti-CDÍ8 para o ligando CDÍS foi determinado de forma semelhante usando 125 anticorpo murino e quantidades crescentes, conforme determinado pela ELISA de r--h~sntiCD18 nlo marcado» Qs resultados dos ensaios de ligação estão apresentados na Figura 13 e indicam que a afinidade do anticorpo 1B4 recomhinante cadeia pesada quimérica/cadeia leve enxertada (círculos) é aproximadamente a do anticorpo monoclonal murino 1B4 (estrelas)„

FsFMP? Π

PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS RECDÍ1BIMANTES Ig64 HUMANOS TOTALMENTE ENXERTADOS

Esta exemplo mostra a produção de anticorpos IgS4 humanos recombinantesg cujos domínios variáveis coníim os resíduos CDR do anticorpo monoclonal murino 1B4» A construção da estrutura da cadeia, leve enxertada com CDR derivada da sequência humana de REI fundida com uma região constante da cadeia leve kapa humana foi descrita no exemplo anterior (Exemplo 1) = 0 componente da cadeia pesada especifico de 1B4 do anticorpo recambinante foi construído a partir da região constante da cadeia pesada de IgS4? descrito no Exemplo 15 fundida com uma sequência da estrutura da região variável da cadeia pesada humana prá-selsccionada na qual foram transplantados resíduos de CDR de 1B4. A cadeia pesada mlB4 do MAb 1B4 murino foi primeiro analisada para determinar a posição precisa das sequências CDR» Estas foram determinadas por comparação visual das séries de dados encontradas em Kahat? Wu5 Reid~Millsr5 Perry e Bottesman? ''Sequences of proteins of immunological interest”« <US Dept Health and Human Services» Bsthesda5 ND? 1987)» Uma vez determinadas as fronteiras dos CDRs estas sequências foram removidas para deixar as FRs /narinas sozinhas. Esta sequência foi então usada para fazer uma pesquisa da base de dados de i/nunoglobulinas humanas derivada da saída '22 da base de dados PIR CSsorgs et al«. „ Nucl» ftcids Res» 14s 11-16 (1989))= A pesquisa de sequências foi realizada usando o sistema de pesquisa Profile do pacote de análise de sequências GCB (Devereux et aL. Nuc= Acids Rss= 12; 387-395 119843)., A matrix usada para comparações da semelhanças foi a matrix de distâncias evolutivas de Dayhoff, e/n !!Atlas of

W

Protein ssquenca and structure M» 0= Dsyhoff» aíR Atlas of Protein sequence and structure" H»D = Dayhoff,, Eds» CWational Biomedical Research Foundation s Washington - DC» 1979)5 = Em adição-;i a matrix ds distâncias estruturais de Risler (Risler st ai»„ J„ Mol« Biol,, 2Φ4s 1019-1029 l19883) foi usada para gerar d perfil de sequências inurinas, & qs resultados destas pesquisas foram consideradas relativamente aos obtidos usando a ínatrix Dayhoff* fi utilização do sistema de pesquisa de perfis permitiu também a avaliação dos resíduos específicos dentro da FR murina que são importantes com base em vários critérios» As sequências que repetidamente mostraram os níveis mais altos de semelhança de sequências nas pesquisas de bases de dadas foram em seguida analisadas usando uma campa-ração da pares com as FRs da 1B4 mu ri no ,, Mesta -análise usou-se o programa Gap do pacote 8CG pois ele produz uma medida exacta da semelhança e identidade de sequências partilhadas pelas duas sequências» Este método foi usado para selecsionar as sequências humanas Gal e Jon,, os quais partilham uma semelhança de 85% e de 88% e identidades de 79% e 75% com 1B4 murir>os respsetivamenta (Figura 14) » Para preparar um DMA recombinante representando as CDRs da cadeia pesada de ΪΒ4 dentro de cada uma destas estruturas realisaram-se os seguintes processos» 8intetizaram~ss duas séries de quatro oligonuclsótidos longos» Quando cada uma das séries foi combinada elas codificaram a fracçSo da cadeia pesada correspondendo á regiSo variável murina de 1B4 presente na cadeia pesada quimérica expressa no Exemplo 1» Os quatro oligonuclsótidos de cada série (Figura 15,, Figura 1 fc) = 1 pmols de cada= foram combinados numa reacçlo PCR convencional com 2?5 unidades de polimerase de Taq e 5Θ pmoles de cada oligodesoxinuclsótido de amplificação terminal (Figura 15» Figura 16)» Devido aos extremos complementares dos oligonucleóti— dos de cadeia simples» os ciclos de pQliínerizsção-dasnaturaçlD--polimsrização da reacçlo em cadeia com polimerass resultam na

formação e subsequente amplificação das sequências combinadas. Após 25 ciclos de amplificação o fragmento combinado de ©54 !<h foi purificada por electroforese e extraído do gel de agarosa. ParalelamentSj dois fragmentos de DNA representando sequências amino-terminais codificadaras do peptideo sinal s sequências carboxi-terminais codificadoras da estrutura 4? dador de !ísqlicingi! e sequências intrónicas foram amplificadas usando pares de oligodesoxinucleótidos iniciadores (Figura 15) e o DNA molde do plasmideo H13VHPCR1 descrito no Exemplo I. Estes dois fragmentos de DNA foram purificados por electroforese em gel de agarass coma atrás e I© nq de cada um foram combinadas com 1© ng do fragmento da rsgiio variável amplificada, 2 = 5 unidades de polimerase Taq. 5© pmoles dos iniciadores terminais (Figura 15) e a mistura foi amplificada por 25 ciclos de PCR. D fragmento resultante de ®?8 !<h foi digerido com as encimas de restrição Spe! e BamHI (Sal) e HindiII e BamHI (.Jon). Após electroforese em gel de agsrose, o fragmento de DNA purificado foi ligado no vector de expressão da cadeia pesada, pB95B;i em vez da região variável quimérica (Figura 11). Desta forma foram construídas duas estruturas de cadeia pesada únicas contendo CDRs de 1B4 enxertadas ClB4/Jon e lB4/8al>. Cada plasmideo vector de expressão da cadeia pesada totalmente enxertada juntamente com o plasmideo vector de expressão (Exemplo 1) da cadeia leve 1B4/REI totalmente enxertada foram usados para transformar células 293 e o anticorpo presente no meio condicionado foi isolado por croma-tografia em proteína fi, A afinidade de 1B4 reeombinaníe humanizado ChlB45 destes dois anticorpos para o ligando CD18 apresentado na superfície de PMNs activados foi comparado com a do anticorpo quiméríco/enxertado descrito no Exemplo 1. A Figura 2© mostra que apesar de cada anticorpo hsterodimèrico conter a mesma série de seis CDRss elas nlo apresentam afinidade idêntica para α ligando. Assim·., as propriedades biológicas de uma molécula de anticorpo : ,νΓ Ν' (is»,, a sua afinidade) baseiam-se significativa-mente na estrutura da reqião variável que suporta as ansas de CDR=

Para determinar a contribuição relativa da região variável da cadeia leve para o aumento de afinidade do hstero-di-mero Gal/REI enxertada construiu-se unia segunda estrutura de cadeia leve contenda as sequências CDR de 184» A estrutura Lsn da cadeia leve foi identificada como uma sequência estrutural dadora com base na sua seiecçao a partir da base de dados» Lsn foi identificada usando a sequência estrutural da cadeia leve de 184,,-com CDRs removidas com base na identificação visual das CDRs quando comparado com Kabat (supra)3 para fazer pesquisa na base de dados de imunoglobulina humana,, A metodologia da pesquisa foi semelhante à descrita para as FRs da cadeia pesada» Mostrou-se por análise de Bap que Len é 90% semelhante e 81% idêntico ao FR da cadeia leve isurina de 184= Pensa-se que Len é uma escolha mais acertada para D enxerto de CDRs da cadeia leve do que REI» com base nos seus níveis mais elevados de semelhança e identidade com 1B4 comparado com REI <82% de semelhança s 65% de identidade) (ver Figura 14)=, Uma série de cinco oligodssoxinuclsótidos longos (Figura 21) representando a estrutura da cadeia leve Len com sequências CDR específicas de ÍB4 e sequências intrénicas foram sintetizados usando 2P5 unidades de polimsrase Taqe 5® pmoles de cada um dos oligadssoxinueleótidos iniciadores de amplificação terminais e combinados por PCR? como descrito atrás para as estruturas Jon e Gal (Figura 22)» Apés 25 ciclos de amplificação do fragmento de DMA combinado de ®s6 Kb foi purificado por electrotorese em gel de agarose. Paralelamente,, um fragmento de DMA representando o peptídeo sinal amino-terminal foi amplificado usando um par de oligodesoMinucleótidos iniciadores (Figura 21) e o DMA molde do plasmídao 1113vHPCRl como descrito no Exemplo 1 „ Este fragmento de DMA foi também purificado por electrotorese em gel de agarose» Estes dois fragmentos de DMA foram colocadas juntos5 iô ng da cadas com 2.,5 unidades de polimerase Taq = 5® pmoles de oiigodesoxinucleátidos iniciadores terminais (Figura 21) e toda a mistura foi sujeita a 25 ciclos de amplificação em PCR* 0 fragmento de DNA resultante de €*,8 Kb foi digerido com as enzimas de restrição Spel e Xbal purificada após electroforese em gel de agarose e ligado ao vector intermediário pSP72/REl 1B4 que foi digerida com as mesmas duas enzimas de restrição e purificado por electroforese para se separar do fragmento de DNA libertado contenda a região variável REI/1B4 (ver Figura 23)= A região variável da cadeia leve e a região constante kapa combinadas dentro de um clone com a sequência verificada Íp8967> foram skcisadas por digestão com as encimas de restrição Spel e Clal e este fragmento de DNA de 1,5 Kb purificado por electroforese em gel de agarose foi clonado no vector de εκpressão da cadeia leve p8953? após este Ultima plasmidea ser purificado por electrofors-se para se separar da sua inserção REI/ÍB4/cadeia leve kapa após digestão com as encimas de restrição Spel e Clal= Os DNAs do vector de expressão da cadeia pesada Bal/1B4 totalmente enxertada com CDR e do vector de expressão da cadeia leve Len/iB4 ou RE 1/1B4 enxertado com CDRs {1® p.g de cada) foram usados para cotransfectar células 293 e o anticorpo presente no meio condicionado 48 horas asais tarde foi isolado por cromatografia em proteina Sepharose» A afinidade destes dois anticorpos recombi~ nantes para o ligando CD1S presente na superfície de PMMs humanos acfcivados foi determinada e comparada com a da íiAb 1B4 murino (Figura 2®)» As diferenças de afinidade entre os dois anticorpos reconsbinantes humanizados 1B4 para o ligando3 conforme medido pelas suas ICg^s, revelou que uma comparação dos valores de p entre Bal/Rei e Bal/Lsn é estatisticamente significativa por um teste t de student mas os desvios padrões de ambos as Mabs sobrepoem-se (ver Figura 2Θ) = Assim, se bem que- as sequências estruturais da região variável da cadeia leve Len, relativamente às estruturas da cadeia leve REI, mostrem mais resíduos idênticos , .- ; . \ e mais resíduas semelhantes quando alinhadas com as estruturas 1B4 murinasj isto tem pouco,, se tiver algum,, impacto nas interseções anticorpo/antigénio n^edidas pela afinidade» A comparação da presumível estrutura tridimensional destas duas regiSes variáveis da cadeia leve (REI e Len) indica que o vestígio de carbono alfa das CDRs de 1B4 residentes nestas estruturas são sobrepc-nlveis,, novamente sugerindo que ambas as estruturas suportara de forma idêntica as CDRs no espaço» Será que a região variável da cadeia pesada de 1B4 desempenha um papel mais importante na afinidade do anticorpo para o seu ligando» Para abordar esta questão s também para investigar o papel de um pequeno número de sequências-estruturais da região variável de cadeias pesadas,, foram realizadas modificações da molécula Sal/1334 totalmente enxertada»

Tris resíduos dentro da região variável da cadeia pesada de Gsl/ÍB4 foram escolhidos para mutagenizaçMo de forma a esta ficar idêntica às suas contrapartes na estrutura 1B4 murina (ver Figura 14)» Para se conseguir a mutação de três resíduos bera separados foram realizados simuitãneamente os processos que se seguem» Sintetizaram-se quatro pares de oligodesoxinucleótidos iniciadores (Figura 26) que incorporam as alterações de desoxinu-cleétidos necessárias para mutagenizar os resíduos de aminoâcidos situados em FR1.-= FR2 s FR4 do molde de DNA 8al/iB4= Neste caso,, as reacçSes em cadeia com polimerass necessárias para produzir quatro fragmentos de DMA sohrsponíveis foram amplificadas de forma a gerar principalmente DNAs de cadeia simples representando os dois fragmentos de DNA de fora5 enquanto que os dois fragmentos de DMA ds dentro foram amplificados de forma a produzir DNAs de cadeia dupla» Esta abordagem tíe combinação de quatro DNAs amplificados foi facilitada pela modificação acima s quando combinado com a utilização de o!igodesoxinucleétidas iniciadores de amplificação terminais que são únicos para os resíduos encontrados apenas nos fragmentos de DNA de fora amplificados,, exclui

a necessidade de purificar os produtos de PCR entra a primeira s a segunda volta de amplificaçao» Assim» usa-se PCR assimétrica para amplificar os dois fragmentos de DMA terminais,, Sãa combinados no processo de amplificação PCR convencional 5® pmoles de iniciador #3i e ©r,5 pmoles de iniciador #S2 (Figura 26) ou 5® emoles de iniciador #12 e ®s5 emoles de iniciador #62 (figura 26) e o DMA molde de plasmídeo contendo Sal/1B4 < i® ng/reacção/? 2?5 unidades de poliaiere.se Taq e os restantes componentes convencionais da reacçSo. Os dois fragmentos de DMA internos foram amplificados usando os processos convencionais que incluem a presença de 5# amoles de cada um dos oligodesoxinucleótidos iniciadores* 2,5 unidades de polimerase Taq e o mesmo DMA molde e os componentes de reacção descritos atrás* Após 25 ciclos de amplificação (como descrito anieriormente) as reacçSes foram ajustadas para conterem i ml de H,_0 e foram colocadas individualmsnte numa cassete Centricon 1®® (Atíiicon,, Danvers., MA), centrifugadas durante 3® minutos a 35®® x g a 4C‘C e o material retido foi rsssuspenso em mais mais 1 ml de H.J3 e repetida a csntrifLigação = 0 retentato final foi ressuspenso em ίθβμΐ de H^u* Cada um dos quatro produtos de reacção foi combinado íl μΐ de cada solução de DMA retido),, adicionados os componentes convencionais* 2S5 unidades de polimerase Taq e 5® pmoles dos iniciadores de amplificação recombinaçlo por PCR (Figura 26) e a reacção foi sujeita a 25 ciclos» Q fragmento de DMA resultante de ®3S Kh foi extraido com fenol3 concentrado por precipitação com etsnol e digerido com as ensimas de restrição Spel e BamHI» Após purificação deste fragmento de DMA de @,8 Kh por electroforese em gel de agarose ele foi clanada no vecicsr de expressão da cadeia pesada p8958? após este último plasmídeo ser purificado por electroforese para se separar da sua inserção da região variável da cadeia pesada (3aX/lB4 libertada por digestão com as enzimas de restrição Bpel e BamHI* 0 DMA do plasmídeo de expressão da cadeia pesada Sal/184 totalmente enxertada com CBRs juntamente com o DMA do plasmídeo Ί " ~ r~

de expressão da cadeia leva KEI/1B4 total mente enxertada com UDNs (10μπ de cada DMA) ou coro o DMA do plasroídeo de expressão da cadeia leve L.sn/íB4 totalmente enxertado com CDRs foram usadas para cotransfectar células 293= Os anticorpos resultantes presentes no meio condicionado 48 horas roais tarde foram isolados par cromaiograíia em proteína A Sepharose e sujeitos a medições da afinidade» Independente da origem da estrutura da região variável da cadeia Ieves a afinidade medida para CD18 na superfície de PHNs humanos estivados dos dois anticorpos é práticamente id@nti.ca» Movamente o papel das estruturas da região variável da cadeia leve á praticamente idêntico* Novamente o papel das estruturas da região variável da cadeia leve parece ser mínimo» A afinidade da estrutura Sal mutagenizada íGal/Rei mutagenizada» Figura 20)é siqnificativamente melhorada relativamente ao suporte estrutural da cadeia pesada Sal não mutagenizada (Sal/Rei na Figura ΞΘ) e a sua afinidade é quase equivalente á do mlB4 nativo <Figura Ξβ> = Concluiu-se que um ou roais dos três resíduos mutage-nizados contribui para a apresentação dos CDRs (sítios de liqaçlo ao antigénio), assim a escolha da estrutura de suporte adequada é critica para uma humanização óptima dos anticorpos recombinan.tes» De facto5 parece que a estrutura de suporte roais perto dos CDRs dita o arranjo estrutural final dos CDRs e portanto a capacidade de ligação ao antigènio» Comparações adicionais das estruturas da cadeia pesada revelam diferenças apreciáveis entre as de New e ãon au Sal quando os resíduos de "empacotamento" são examinados (Figura 14)» Os resíduos de empacotamento conforme são aqui usados são definidos coroo resíduos internos ou não expostos à superfície da estrutura que pode estar envolvida nas forças dentro das cadeias ou entre cadeias» Estes resíduos de empacota™ mento estão associados com as regiões estruturais adjacentes aos CDRs e estão envolvidos na orientação correcta dos CDRs para interseção com a substância que induziu a formação do anticorpo» Apenas 27 dos 41 resíduos internos de Nei*j condizem coro os

SISTEMAS DE EXPRESSÃO MELHORADOS

Este exemplo nsostra sistemas de expressão empregues para prduzir grandes quantidades de anticorpos rseombinantes IB4 enxertadas com CDRs coma discutido no exemplo 2= 0 primeira sistema de expressão .aplicável a muitas células de mamífero utiliza as características extracromossómicas de plasmídeos com DMA baseado em EBMA-l/oriP (Vates et al«$ Mature 313s812!; 1985)» Tal vscter, pREP3 descrita por Hasnbor ©t s.L (Proc= Matl,, Acacl» Sei» USA 85n 4Θ1Θ;; 1P3S)? contendo a cassete de seleeção pela higromicina B e a L..TR do vírus do Sarcoma de Eous <RSV) para a transcrição do gene com interesse foi modificado conforme divulgado» A LTB de RSvs assim como o sinal de adição de poli A, foi removido por digestão do DMA do plasmideo pREP3 com Sali e Xbal seguido de purificação em gel de agarose da fragmento ds 93Θ2 Kb sem promotor» 0 DMA do plasmideo pBSmcs (ver Figura 1®> f. contendo o principal promotor tardio do adenovírus5 um sitio de clonagem múltipla © sinal de adição de poli A do SV40 foi usado como molde para a amplificação por POR das sequências que começam com a potenciador do SV4® s terminando com o sinal ds poliadsnilaçãodo SV4#» Mo processa de amplificaçãa os sítios das enzimas da restrição Xbal e Sali foram apensos aos extremos dos produtos através da sua incorporação em oligotíesoxinuclaótidos iniciadores sintéticos para PCR» 0 produto amplificado por PCR esperado de l32é Kb foi purificado em gel de agarose após a sua digestão com as enzimas de restrição Xbal © Sali e ligado ao vector base EBNA/oriP de 9?@2 Kb» 0 plasmideo resultante <p8914> constitui um vector versátil para a expressão em mamíferos no qual podem ser ligados a cassete de expressão da cadeia leve ou pesada contidos dentro do plasmideo p8958 (ver Figura Í9> ou p8953 (ver Figura 54

6) 5 respecfcivamen te π 0 piasmídeo ρ3914 foi também g mol.de para a verslo do promotor HIVLTR do vector base EBNA/oriP.. Para mudar para o promotor HIVLTR o DMA do piasmidaa p8914 fai digerido com BamHT. e XbaX, 0 esqueleto de 9.,35 Kh sem o promotor foi purificado por elecferoforese em gel de agarose., 0 promotor HIVLTR., desde o resíduo --ÍÍ7 até +80 (conforme encontrado no vector pCD23 contendo esta fracçSo de LTR do HíV-l? <Cullen5 Cell 4és 973 E19863) foi amplificado por POR a partir do piasmídeo pCD23 usando aligodesoxinuclsóiidos iniciadores que ligaram aos extremos do produto sítios de restrição Spel e Bell* Após digestlo com do produto tís PCR com ô„24 Kb com estas últimas enzimas o fragmento foi purificado em gel de agarose e ligado ao fragmento de DMA de 9535 Kb sem promotor descrita atrás. 0 piasmídeo p8962 assim construído foi também o recipiente da cassete da cadeia leve e pesada (Figura 37)= Para conseguir isto o DMA do piasmídeo p8962 foi digerido dentro deste sítio de clonagem múltipla com No11 e Xbal de forma a linearizar a DMA. 0 DMA vector de expressão de 955 Kb linearizado foi ligado è cassete de 2=,5 Kb da cadeia pesada obtida por purificação sm gel de agarose do DMA de p89&0 digerido com Motl e Spel ou à cassete de 1,5 Kb da cadeia leve obtida da forma semelhante após digestão do DMA de p8953 com Notl e Spel. Estes vectores de expressão construídos baseados em EBNA/oriP, p8969 e p8968, (Figura 38) foram cotransfectados para células CV1P (células de rim de macacog Figge et ai», Cell 52s 713 l19ê?83> que expressam constitutivamente a proteína TAT de HiV-1 devido a terem sido anteriorments transfectadas com o piasmídeo pMLTAI (Siekeviiz st a1„3 Science 23Ss Í575 £19873)= Os clones celulares que cresceram em meio DMEH contendo 10% de soro de vitela racem-nascida inactivado pelo calor, 2Dô pg/ml de 8418 e 10© (jg/ml de higromicina B foram colhidos usando cilindros de clonagem (Fishney9 Inc, Culture of Animal CsllSj Alan R = Lisss Inc, Ne^ York., 1983) e expandidos individualmente» Os clones foram despistados relativamente à secreção da anticorpo

recombinante usando α ensaio de ELISA antsriorsssn te descrita,. Vários clones de células foram expandidos e determinados os seus níveis de secreção ds anticorpos como estando na gama de 75 ng ~ 2uq de anticorpo por 96 horas de meio condicionante de culturas em placas de 6 cavidades,, 0 mais produtivo destes clones foi eventualmente adaptado para crescer em microveículos (cyledeK 3 e cultisphsre GL) e produziu aproximadamente 1ΘΘ mg/ml de anticorpo recombinante cada 3 dias de colheita em meio sem soro a uma densidade celular de i—2 x Ιβ5- células por ml„ ÍHÍMPL0_4 ACTIVIDADE m VITRQ DE ANTICORPOS HUMANOS RECOMBIMANTES ΑΝΤΙ-CD18

Para ausuentar a precisão das determinações de afinidades o ensaio ds ligação competitivo de IB4 do Exemplo 2 fai modificada cama se ssgueTsnto mIB4 (5# pg) coma hIB4 Cdo Exemplo 3) foram iodinados usando cloramina T s IgS marcado radioactiva— mente purificada numa coluna de HPLC de filtração em gel Bio-Sil

__ _ _ _ TC í8K2b# (Biorad) que fracciona proteínas na gama ds pr-ó## x I0W daltons» A radioactividade efluente foi cntrolada com um contador-gama em linha #17# ÍBeckman* Fullsrton? CA). a proteína total foi detectada por ahsorvlncia a 28Θ nm com um detector Kratos Spectraflow 757 <Kratos? Mahwah, MJ) e a coluna foi equilibrada com tampão de fosfatas #5iri <pH 7S#>» Um pico simétrico de ahsorvância coincidente com radioactividade observou-se regular-mente a 6 min» 3# seg» após injseção da amostra (o tempo de retenção característico de IgG neste sistema)» A actividade específica do produto foi geralments 1# mCi/mg para mlB4 ou 7# mCi/mg para hlB4p 96-98% das contagens eram precijoitáveis por ácido tricloroacético em ambos os casas» SDS-PASE e auto-radia— •j 2~! grafia de anticorpo marcado com “ “I mostrou que ltí4 permanece intacto após marcação radioactiva» Usando estas sondas marcadas radicactivamente estabeleceu-se um ensaio de ligação de em suspensão para determinar a afinidade de m!B4 ou da r-h-anti--CD18 íh 1B4) para. CD18 expresso na superfície de leucócitos» Colheu-se sangue venoso humano fresco para heparina (!»# unida-de/ml)» Os PnfNs foram purificados num gradiente de Ficall/Hypaque e activados com 1## ng/ml ds acetato miristato de forbol em solução salina equilibrada de Hanks contendo 2# mM Hepes (pH 7,;2)3 ©„14 unidades de Aprotinina e 2% da albumina do soro humano (tampão de ligação) durante 2Θ min -a 37°Cp a viabilidade foi sempre >95%por exclusão com azul tripano após activsção com PMA,

Após lavagem com tampão de ligação? pequenas quantidades de 1 x e " ~ i -( i os í©'“ p|vs|iJS estimulados incubados em cerca de 2-4 x 10"“ M .......I-1B4 na presença de concentrações crescentes de 1B4 murino ou humani- -1=, ~~7 _ sado não marcado ícercs de í© ““ a 1© M) em volumes de 3©© ml em duplicado ou triplicado durante 1 hora a 4°C com agitação constante» As concentrações de 1.B4 purificado e iotíinado ou de anticorpo não marcada adicionado como um competidor foram determinadas por absorção de II»V» usando uma E.-,pft de 1?35 para mIB4, 1,25 para 8al/Rei hlB4 mutante e 1,3€> para todas as outras construçSes de hIB4 Edeterminado pela fórmula E = ACEcys) + ACEtryp) + A(Eiyr) onde A = g número ds resíduas de cada aminoá-cidog Bill e von Hippslg Anal» Biocheffi,,, 182s 319-328., í989f a de mIB4 e de Bal/Rei HÍB4 foram também verificados oor análise quantitativa de aminoáeidos e espectroscopia diferencial

í VS por UVj» Após marcação, o 1B4 ligado às células foi separado do anticorpo não ligado pondo por baixo da cada amostra de PKNs25© μΐ de sacarose €>*5 li s centrifugação <4 8©© x g» 3 min,)| os tubas foram congelados em neve carbónica e as ραπtas cortadas e contadas com um contador gama LKlrf, A quantidade de 125 -3.B4 ligado a PnNs para cada concentração de Igfcj competidora não marcada foi expressa como a media de CPU por 1 x IQT PliNs (± SEM), ICe-^s para a inibição da ligação de foram calculados usando um programa de quatro parâmetros CuFiiter!5p Rodtaard;, Hunson e Delears em "Radioiuiunoassay and Related rrocsdures in Medicine51, International fttomic Energy Agency5 Vienna,, vol I, 4à9-5©4p 1978), Os resultados de ligação estão ilustrados nas Figuras Í3? 2©-;i 28 e 29 (valores de p são do teste t de Hstudent“3» Estes dados indicam ques 1) a afinidade de Sal/Rai híB4 para Ρ5ΊΝ CD1B é quase comparável á da do mIB4 (cerca de 2-3 vezes mais fraco) ii 2) as afinidades de Jon/Rei e de Mew/Rei são ainda mais fracas do que a de Bal/Rei numa ordem que está inver— samente relacionada com o seu grau de homologia relativamente às estruturas de 3) a afinidade de Bal/Len é quase equivalente

â afinidade tíe Cal/Reip ε 4) d mutante Gal/Rai e a construção ssnii-quisnérica possuem afinidades aparente-mente comparáveis para o 1B4 nativo = IWIB1ÇS0 DA LIBAçSO DE PMM A MONOCAWADAS DE CÉLULAS EWDOTELIAIS DA VEIA UMBILICAL HUMANA <HUVEC>.

Para atingir os tecidas e provocar danos inflaatórios3 os PMNs devera passar para fora da corrente sanguínea» Esta migração transendoteliai depende da interseção de reeeptorss contendo CD18 de PílMs com ligandos na superfície a dentro do endotélio humano» Uma expressão directa deste processo reflete-se pela ligação de PMWs tratados com acionistas à superfície vascular» Para demonstrar que Sal/Rei hlB4 â um potencial agente anti-inflamatório para usar era doenças humanas, determinámos se esta construção inibe a adesão de hPMNs estimulados com PMA a monacamadas de células endoieliais humanas quiesesntes» Células sndotsliais da veia umbilical humana (HUVECS) foram cultivadas em frascos T-75 revestidos com Vitrogen í©© (Collagen Corp», Pala Alto, CA) diluído a isl© com PBS e seco sobre o substrato» 0 meio de cultura foi MCDB i©7 suplementado com 15% de FCS, 9© mg/ml de hsparina C8IBC0) a 15© ma/ml de mitogénio endotelial (Biomedical Technologies5 Inc»)p as células foram incubadas em 2,,5% de CQ^ e 97,5% de ar, As culturas (passagens 4-8) foram dissociadas com tripsína/EDTA s as HUvECs semeadas em placas de microtitulação de 96 cavidades (Gostar) previamente revestidas com uma solução de 5 pg/ml de fibronectina do plasma humano purificada em bicarbonato ©S1M (pH 853>s estas microcul turss foram usadas para ensaios de ligação quando atingem a confluência» PMNs humanos foram purificados a partir de sangue periférico como descrito atrás» Para medir a sua ligação a monocamadas de HUVEC por microscopia de fluorescência, PliMs foram marcados com o corante vital fluorescente 1 -‘í ?-diactadecil-353335 53s~tetrametillindocarbo-cianina

<Diϊ > (Molecular Probes5 Inc,), PfiMs foram incubados numa solução sonicada de 25 mg/ínl de Dil em tampão de ligação durante W min.: a 37°C=, lavados e depois activados com 5®~1Θ© ng/ml tíe PiiAou PDB durante i® min, a 37*0, (Estes PiliMs marcados com dil foram testados no ensaio de ligação competitivo com J.B4 para verificar que os saua recsptores CDÍ8 eram reconhecidos por hXB4§ as IC^s estavam na gama esperada para PMNs não marcados), Amostras de PnMs (em quadriplicado) foram pré-iratatias com concentrações crescentes de Sal/Rei hiB4 ou do MAb testemunha 0!<rl~i (associa-se com o componente GDiib do receptor CR3 mas não inibe a ligação do ligando), A incubação foi realizada durante 15 min, a 4°C com agitação constante s as células colocadas em microcavidades contenda HUvEC (5® ®ΘΘ~1@Θ &ΒΘ PMNs/cavidade), Dsixou-ss os PfíMs sedimentarem durante 5 min» a 4°0 e depois incubaram-se durante 15 fflin a 37°C para permitir a ocorrência de uma adeslo firme. Os PHNs não aderentes foram removidos e as culturas ficadas por lavagem suave com 1% formaldeído em PBS <4 lavagens com uma mui tipipeta Eppendorf Plus B), As cavidades foram cheias com uma solução da 5% de n-propiIgalato em glieerol e os PriMs aderentes contados cora uma ampliação de 19Sx com iluminação de rodamina usando um microscópio de fluorsscfncia invertido Nikon Diaphat adaptado com um sistema de autofocagem, um porta lâminas motorizado e uma clínsra de vídeo (Vidicon #8451) ligado a um analisador de imagens Modelo 3ΘΘΘ ilmage Technology· Corp,? Ds-er parks MV) e a um comutador IBM PCKT, 0 número mâdio de PMNs aderentes foi determinado para cada concentração de íiab testada <±SEM> e obtidas curvas de inibição mais IC^-s usando o programa "Fifcter" (Rodhard st al, supra)§ os resultados foram normalizados, Gs resultados destas experiências estão apresentados na Figura 3® e na Figura 31, Tanto Bal/Rei hlB4 como m!B4 produziram curvas de inibição sigmoidais congruentes com IC^s quase equivalentes <4-8 nM) que não foram significativamente diferentes do teste t de nstadeni"= A IgG testemunha OKrí-i não iniba a aderência de PnNs,

Assim» Sal/Rei hIB4 inibe a adesio de hPMNs activados a monocama-das de células endoteliais da veia umbilical humana no mesmo grau que o nativo num ensaio tis adesio in vitro homotípico quantitativos ilustrando actividade anti-inflamatória»

INIBIÇÃO DE CITÓLISE MEDIADA POR CTL A morte celular dirigida por linfécitos T citoióKicos ÍCTL) é um componente importante da rejeição ds enxertos após transplante ds tecidos ou de orgias» Uma vez que a ligação e morte de células alvo é um aeontecimento de adesividade entre células dependente de CD18? determinámos se Ga1/REI h!B4 inibe a lise celular mediada por CTL humanos» Células CTL Q---31 humanas foram cultivadas em RPMI Ιό4Θ suplementado com 1Θ1 ds soro de vitela e 3ô unidades/ml ds IL-2 recomfainante humana» Para induzir o estado diferenciado,, fragmentos de células 1infoblastéides humanas foram adicionados ao meio durante 6-7 dias» As células JY foram propagadas como atrás encepto a ausência de IL—2 e também serviram como alvos para as células Q~3i» Para comparar os efeitos do ®ÍB4 e de Bsl/Rei hiB4 na morte celular,, células Q“31 foram incubadas em meio com várias cancsntrações de anticorpo durante 3Θ min» a 25°C antes da adiçlo das células alvo» Para quantificar a citólise, as células alvo JY foram marcadas com ~~'Cr e misturadas com células sfectoras em várias proporções de EsT de 8;í a 29Ssl a 37°C» Após 4 horas3 a percentagem de ’“‘^Cr libertado para o maio de cultura para cada concentração de anticorpos foi determinado (em triplicado) como um índice de morte celular»- As curvas de morte celular que foram geradas simultaneamente com várias concentraçSes de mIB4 (testemunha mD!<M--l) ou. Sal/Rei hiB4 (testemunha hIgB4> foram utilizadas para cacular IC^^s (Figura 31)» Tanto Sal/Rei H1B4 como miB4 inibiranm a lise de células JY no mesmo grau» Em cada um dos casos a IC,~* média foi igual a cerca de 2 nri 1B4 e as curvas de inibição para

ambos os anticorpos foram sobrsponiveis» Estes resultados indicam que Bal/Rei ÍB4 pode evitar a rejeição de tecidos e orgãos transp1an tados * ESPECIFICIDADE DE TECIDO E CELULAR DE BAL/REI HhB4 0 processo da humanização poderá originar propriedades de ligação anormais que possam causar a assoeisção de hlB4 e acumulação em locais inesperados de tecidos, células e seus organelos·, com consequências tóxicas* Para avaliar se as propriedades da ligação de 6al/Rsi hlB4 foram alteradas, comparámos a localização por imunofluorescência microscópica (IF) e por microscopia electrónica (IEM) de Bal/Rei hlB4 e de mlB4 nativo em vários tecidos de coelho e em PMNs humanos, células U-937 e fibroblastos»

COLORAÇKO POR IF DE TECIDOS E CÉLULAS

Coelhos brancos da Mova Zelândia machos saudáveis de 2 Kg foram sujeitos a eutanásia, retirados blocos de tecidos de aproximadamenis 1,© x ©,i x ©,5 οτι'-’, imersos em meio de montagem OCT írliles) e congelados rápidamente em Freon 22 (Dupont) arrefecido em azoto liquido a Obtiveram-se amostras a partir dos seguintes orgãoss medula óssea, cérebro, rim, intestino grosso, fígado, pulmões, nódulos linfáticos, miocárdio, estômago, músculo estriado íperna) e baço e guardou-se a ~S©°C= Mo dia de uma exoerisnoia, secções de 5pm de tecido congelado foram cortadas com um eriostato a -2©°C colocadas em lâminas- de vidro revestidas com poli—L-lisina e secas ao ar a 25As secções foram imediatamente imunocoradas sem fixação para evitar a desnaturação dos antigénios CD18» para inibir ligação inespecifi— ca as lâminas foram lavadas com tampão ©, iri Tris-HCl <pH 7,8) e incubadas com o sobrenadante clarificado de uma solução de 5% de

leite saí pé desnatado (Carnation) em 0.1% de BSA, @51% de NaN^ e tampão ds fosfates ©,in, pH 7,8 durante 1 hora a 25C‘C» lados os passos de coloração subsequentes foram também realizados durante 1 hora a 25°C com lavagens intermitentes em @,:í!í Tris-HCl <pH 8,,7) » Para experiências ds marcação simples, as secções foram coradas com uma solução de 2Θμα/ο1 de anticorpo primário (mIB4, Bal/Rsi hIB4 ou testemunha h!gS4) em tampão de coloração 10,1% de leite em pé desnatada, 0,l%ds B3A, e tampão de fosfatos Θ,ίΜ <pH 7,8)3« Os anticorpos lavados foram dstsetados indirsc™ lamente com uma solução de 25pg/ml de imunoglobulina de cabra anti-IgG ds murganho purificada por afinidade s conjugada com isotiocianato de fluorssceina ou imunoglobulina de cabra anti-Ig6 humana conjugado com FITO ÍKirkegaartí e Perry, Inc«) em tampão da coloração» Em experiências ds dupla coloração as amostras foram imunomarcadas com uma mistura de anticorpos primárias <1 ug/ml de i»:íB4 s 1 pg/ml de hiB4 em tampão ds coloração oentrifugado a 12ΦΘ0 >íç! durante Í5 min=>, seguido de uma solução de dstecção clarificada com mistura ds anticorpos 25 pg/ml ds imunoglobulina de cabra anti-XgS humana purificada por afinidade e conjugada com isotiocianato de fluorssceina e 25 pg/ml de imunoglobulina de cabra anti-IgG de murganho purificada por afinidade e conjugada com isotiocianato de rodamina (Kirksgaardand Psrry, Inc») em tampão de coloração!» As testemunhas para as experiências de dupla ínarcação foram soluções clarificadas de uma mistura de mlB4 mais h!gG4 (í pg/ml de cada anticorpo) ou mlB4» Gal/Rsi h!B4 e hlgtí4 dissolvido sésinho a 1 g/ml de Jg*3 em tampão de coloração. As IgBs foram localizadas nas secções com a solução de dstecção de anticorpos mistos descrita atrás» As lamelas foram montadas em lâminas com uma solução de 5% de n-propilgalato em 9Θ% ds glice— rol e 10% de Na-bicarbonato 1,0M e as secções estudadas com um Zsiss Photomicroscope ϊII equipado com combinações de iluminação de epifluorsscêneis & filtro ds interfsrêncis com rodamina» Fizeram-se fotomicrografias com lentes objectivas de imersão em óleo neafluar Zeiss de íéx & 4Φχ usando filme de alta velocidade Ilford HP~5 a velocidades de ίό€?Θ--63@6 ASA.

Os padrões de coloração IF de Sal/Rei híB4 e mlB4 em coelhos estio resumidos na Figura 32. Marcação específica CDiQ-positiva por 1F para Ig8s 1B4 recombinantes e nativas foi observada em tecidas que se sabe terem leucócitos. Mão se observou diferença detectável na distribuição ou intensidade de IF com Gal/Rei hiB4 versus mlB4 e tecidas testemunha tratados com hlq84 ou tampão foram sempre negativos. De longe5 secções de medula óssea apresentaram a coloração CD18 mais intensa com ambas as espécies de 184¾ 79% destas células apresentaram marcação cito-plásmica» Os leucócitos do baço e os nódulos linfáticos foram coradas mais irregularmente e com mais baixa intensidade. Nos pulmões e num grau menor nos glomérulos dos rins foi dstectada uma população conspícua de leucócitos residentes. Surpreendente-mente,, não foi observada coloração de CD1S nas células micra— gliais do cérebro ou nas células Kupffer do fígado. A titulaçãc? da solução de anticorpo primário indicou que uma solução de 1.® yg/ml da hlB4 ou de mIB4 foi a concentração mínima dos anticorpos necessárias para se obter coloração IF máxima de secções de medula óssea.

Experifncias de dupla coloração com IF foram realizadas para determinar se os antigénios reconhecidos por Gal/Rei hlB4 e m!B4 está localizada nas mesmas células. Crio-secções de medula óssea,; baço ou nódulo linfático foram sujeitas a dupla marcação cDffi misturas de Sal/Rei H1B4 e íiilB4n Conforme ilustrado na Figura 33 para medula óssea,, todas as células que foram coradas positi— vaments com mIB4 foram também marcadas com Sal/Rei hlB4. Nos grupos testemunha, a coloração com Gal/Rei hIB4 ídetectada com óptica para fluoresceína) foi sspscificamente eliminada por substituição de HIgG4 por hiB4 na mistura de anticorpos 4 -

·, l ' primários? mantendo ao mesmo tempo a marcação com mlB4 (visualizado com filtros para rodamina),, Com o controle oposto? a remoção de mÍB4 da mistura de anticorpos primários eliminou a marcação com rodamina? mas não teve efeito na coloração com fluorescsírsa gerada por 8a1/Rei híB4„ Esta calocalização de ÍB4 foi portanto muito muito especifica,:

Estes dados indicam que 1B4 nativo e 1B4 humanizado Sal/Rei estavam localizados nas mesmas células (leucócitos) e apresentaram especificidade s intensidade de coloração idêntica em vários tecidos ds coelho» Os níveis mais elevados de marcação com CDiB foram observados nos tecidos que continham grandes números de leucócitos? com a medula óssea apresentando a coloração mais intensa,. Portanto? o nosso processo de humanização não alterou a espscificidads ds 1B4 IçjG detectável ao nível da resolução do microscópio óplico»

COLORAÇÃO XEM DE 0R8ANEL0S DE CÉLULAS HUHANAS

Experiências de dupla marcação em microscopia eleetró-nica foram conduzidas para comparar a especificidade da Gal/Rei hlB4 e de ®1B4 na resolução a nível subcelular/supramolecular. Ds antigénios CD18 foram localizados em grânulos específicos de hPHNs e em monécitos via IEM com 60 „3 (um outro Mab que reconhece CDlSs Singer et al.. J. Cell Bial,, 109s3169-3182 C19893)» Portanto? determinámos se Gal/Rei hlB4 e ml 84 estavam codistri-buidos nestes grânulos. PrlNs humanos foram isolados a partir ds sangue venoso como descrito abaixo e preparados para IEM via uma modificação de um método publicada (Singer st al»5 supra)» Resumidaments? os PMNs foram fixados com uma solução de 3?5% de paraformaldeido e β?®5% de glutaraldeida em 03lm Na-cscodilato (pH 7?2>? Θ?1π sucrose e uma mistura ds inibidores de protsases de larga espectro» A fixação foi realizada sob irradiação de

V micro-ondas até as células atingirem 45°C í~45 ssg=>? seguida de paragem com um excesso de tampão a 4°C» Os sedimentos celulares foram embebidos em 7% de acrilamida, infiltrados com sacarose 2,3M em fosfato θ,,ΙΜ CpH 752>s congelados em propano liquido <~19@00 e cortados em crio-secções ultrafinas <~8Θ nm)« as amostras foram sujeitas a marcação dupla com Bal/Rei hlB4 e mlB4 usando conjugados de oiro coloidal s proteína A de 5 nm e de ΙΦ nm CJansen Life Products) como descrito e analisado a 29 ΘΘΘκ com um microscópio electrénico ds transmissão JEQL ΙΘΘΟΧ* Um resumo dos resultados de imunocoloração para PMMs está apresentado na Figura 34,·. Tanto Sal/Rei híB4 como mí84 foram também localizados dentro de uma população de grânulos citoplasmáticos em células U-937 {uma linha mielomonocítica humana), mas não em fibroblastos de pu1mão humanos (IMR-9©). Estas observações sugerem fortemente qus a especificidade da ligação de Sal/Rei 1B4 é comparável à do mIB4 na resolução supramolecular»

EXEMPLO 5

ACTIVIBADE IN VIvO BE ANTICORPOS HU11ANDS RECOMBIWANTES ΑΝΤΙ-CDIS

As potências in vivo de ÍB4 murina <mlB4> e cie I.B4 humanizada (h!B4) (Exemplas 2 e 4) foram comparadas no coelho avaliando a sua capacidade para inibir a inflamação dérmica, manifestada como acumulação de PMN s extravasação do plasma» induzida por administração intradérmica de C5a» 0 pelo dorsal de coelhos fêmea da Nova Zelândia C2-2»5

Kg) foi barbeado pelo menos 24 horas antes da axperilncia» Os coelhos foram anestesiados com uma injscção intramuscular de _ 12“*

Ketamine Hui (6Θ mg) e Xylazine (D mg> = C “li-albumina sérica bovina (1© uCi) foi injsctado na veia marginal de orelha como uma marca de extravasaçao do plasma» Srupos de animais foram então tratados com soro fisiológico,; miB4 administrado por via intravenosa a 0^075 0^21 ou 0S7 mg/Kg ou hlB4 administrado por via intravenosa a 1 s 0?3 ou í mg/Kg 15 minutos antes do inicio da inflamação dèrmica em 4 sítios do dorso» Três horas mais tarde» retirou-se unta amostra de sangue (1 ml) e centrifugou—se Cg3 3 min η 2®°C) para preparar plasma sem células que foi aspirado e guardado» Os animais foram então sujeitos a eutanásia com aproxi-matiamente 75Θ gl ds Socumb CSodium Pentobarbital 309 mg/ml em álcool isopropílico) s os sítios das injecçõesforam retirados 1 usando um punção de biápsia de 6 mm» A radioactividads Cl""'"!) presente nas amostras de pele e noplasma sem células (5Θ μΐ) foi quantificado usando um contador gama» Por referência à ratíioacti-vidade específica do plasma sem células., o grau ds extravasação do plasma foi expresso como μΐ de equivalentes da plasma por biópsia de 6 mm»» A biópsia da pele foi então homogenizada em 5 ml de 0»07 de brometo de hexadeciltrimetilamónio (HTAB) usando um

hompgenizatíor polviron» Adicionou-se clorofórmio (1 ml} à amostra,; a qual foi vortexsda e centrifugada <1600 gj 15 min,-. § 2Φ°ϋ>» Quatro amostras <5<? μΐ) do sobranadante aquoso foram adicionadas ás cavidades numa placa cie 96 cavidades para medição da activida-de do mieloperoKidase (HPO) como um indica do conteúdo da PrlNs» Cavidades em duplicada da placa de 96 cavidades receberes 20Θ ml da tampão «KH^PO^ 44 mci§ K^HPO„ 6 mM; Ho0o ®,ΘΦ15%ι pH 6,Θ> sócinho (funda) e cavidades em duplicado receberam tampão contendo substrato de MPG (3s 53-dícnetoKÍbsncidina diidrocloretoj 36Φ pg/ml>» Deiκou—se prosseguir as reacçSes durante 15 min» à temperatura ambiente e a actividads de MPO foi medida como uma alteração na absorvância a 45Θ nm medido num especfofotémet r o de leitura de placas» Por referência cam uma curva padrão construída usando quantidades conhecidas de PMN de coelho em ΗΪΑΒ» foi calculado a grau de acumulação de PliN em cada biópsia de pele» A injecção de C5s na pele de coelhos prá-tratados com soro fisiológico produsiu um aumenta significativo na acumulação de Pl¥!Ns (Figura 35) e entravasação do plasma (Figura 36) comparado com os sitios da pele injectados com soro fisiológico» Em animais pré—tratados com miB4 au H1B4 houve uma inibição relacionada com s. dose da acuou 1 ação de PMWs- (Figura 35) e sxtravasaçãc! de plasma (Figura 36)» Ambos os anticorpos tinham potência comparável conforme indicado pelso valores de Ε0(_Λ para inibição de PMWs e e^travasação do plasma que eram de aproxiamdamente ©;!xS mg/Kg para miB4 e hlB4»

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES!

   seu fragmento3 ca c a ρ b. z d s 5s liga r tos sb1ecc ionadas - Anticorpo recombínante humano acterisado por o anticorpo ou í células que expressem integrina· do grupo constituído por LFft- anti-UDiS ou ragmento ser ; de leucõci-•i,, Mac--Í ou D « pl 2§:n - Anticorpo recombínante humano an ti-CD 18 ou seu fragmento, caracterizado por o anticorpo ou fragmento ser capas de se ligar a células que expressem a subunidade integrina CD18. óâ. - Anticorpo recombinante humano anti—CD1B ou seu f ragmen to , C cl Γ 3 C c.0 r i z âd o por o arv CXCuf -po ou f ragmsn to ser capa ?. de se I i gar a 1 sucèc i t.os e evitar que 03 1eucóci tos entrem numa lesão xnt lamatór ia = ΛΛ — ~S*3 a Process o para a preparação de uma imunoglo— bulina humana rscombl nante3 c a rac te r i z ad o po r se incorporar na r e f erida i muηo ig 1 obu 1 ina uma 03¾. r*L£ X.IÀ ra €23' 3 -3 €3 3' jL -5 í pesada humana e regiões determinantes da complementaridade murina, uma estrutura de cadeia leve humana e regiões determinantes de complementaridade em gutó a t-sTerxda xmunoglobulina humana e capas de se xigar a uma integrina CD18 humana. ga de aminoácidos da — Processo par egiSo variável a preparação de uma. sequência da cadeia leve de :lB4 murino. caraLtef isado μυΓ s»e cuit. sequências adequadas s sede DísiA* de modo a obter—sí arem os vários cionss representando as •ubmeterem a determinações da sequência uma sequência como se mostra na ‘rxçu— ra o;

   CADEIA LEVE—1 DE 1B4 ' t - Asd He Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Vai Ser Leu Glv Gin Aro Ala Thr He Ser Tyr [Rrq Rio Ser Lys Ser Uel Ser Thr Ser £JUl. Tyr Sei Tyr Met Eli] Im Asn Gin Gin Lvs Pro Glv Gin Pro Pro Arg Leu Leu He Tvr [Leu Uai Ser Rsn Leu Glu Serl Glv Vai Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asd Phe Thr Leu Asn Uê His Pro Vai Glu Glu Glu Asd Ala Alâ. Thr Tvr Tvr Cvs fGIn His ile Rrg £lii Leu Thr] Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys ter DE a B4 CADEIA LEVE Asd Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Vai Ser Leu Glv Gin Aro Ala Thr Ile Ser Cvs fflrg Ria Ser Glu Ser Uol Rsd Ser Tyr Gly Bsn Ser Phe Met His] Trp Tyr Gin Gin Lvs Pro Glv Gin Pro Pro Lys leu Leu Ile Tyr fflrq JR.Lb Ser Rsn leu Glu Serl Glv Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arq Th.r Asd Phe Thr Leu Thr ile Asn Pro Vai Glu Ala Asd Asd Vai Ala Thr Tvr Tvr Cvs [Gin Gin Ser flsn Gtu flsp Pro Leu] Thr Phe Gly Ala Gly ThrJ.ys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp... ÔS „ ssso de acordo coat Reivindicação 5," ia d-e DMA 5 que é região variável uudiΓics~ d a c ad eia caracterizada por se obter uma sequãn d ora da. sequWneia de aminoa.cidos da leve de !.B4 murino. aminoác ido c arac ter 1 sequãncias 7S« — Processo para a produção de uma * da regxão variável da cadeia pesada de •GO por se cultivarem os vários clonss reor adequadas e se submeterem a determinações sequência de 1B4 murino5 'esen tando as da ssqufncia ~-cf uma 5=equ'e'sic: de i?NAs de modo a r-a 3 s como se mostra na Fiq li L-ADEIA PESADA AspVVal Lvs Leu Vai Glu Ser Glv Glv Asp Leu Vai LvsIpi; Gly G<V Serie.» Lvs Leu Ser Cvs Ala Ala Ser Glv Phe Thr Phe Ser ÍRsd Tyr T^r Met Ser] Trp Vai Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Vai Ala [Rle lie fisp Rsn Rsp Gly Gly Ser lie Ser Tyr Pro Rsp Thr Uol Lys Gly] Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tvr Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg [Gin Gly flrg Leu Rrg Rrg Rsp Tyr Phe Rsp Tyr] Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Vai Ser Ser Ala Lys Thr.... caracterizado por dora da ssqufncia s obter uma de aminoáci d© SLordu í-Lííifi a Reivindicaçso sequa F1CÍ.S ds DIMAp que é codifica dos d -5 PfôÇjjLâC va< "iável da cadei- leve de 1Eí4 murino. 8? carac cadora d 9a„ - Processo de acordo cocB as Reiv indicações 5 > izado por ss obter uma SOQLiSnc X5. de DNAs que ώ codifi· .nticorpo recombinan te humano anti —CD18 d e qualquer um- das Reivindicações 1 a 3. a 85 caracb ficadora. da lfdâE — Processo de acordo com as· Reivindicaç rxzado por s-e obter uma sequdncia de J3MA5 que ε imu.noglobulina recomhinante humana de acordo O? coui- m Reivindicação 4»

   1 lã „ — Processo para a ob tenção de um vec CSF0C Γ1 Z -ífi ú U por se incluir no referido vector equfncia D «v »'t ds sc ordo com a Reivindicação 9» Í2â „ - Processo para a obtenção de um vec caracfceri zado por se i n c 1 u. i r η o r e f e rido vector H 3 equfncia DNA de acordo o a Reivindicação l®t Í3ã« “ Hospedeiro mamífero., caracterizado por ter sido transfectado peio vector de acordo com a Reivindicação li contendo a sequfncia de DNA codificadora do anticorpo recambioante humano anti-CDiS* sido tran sequfncia i4ã* ~ Hosped fectada pala vect de DNA codificador riro mamífero? caracterizado por ter :<r da Reivindicação 12 contenda a 5. de imunoglobulina humana recombi- nante» i RH i. W— P Processo para a pCfc? pâ r" ?TiÇMo de anti-CD18 recombinante humano3 caracterizado por compresnder H C ultura do hospedeiro mamífero transformado de acordo com a sofa condições adequadas ã expressão do ant Reivindicação 1ã corpo anti-CDIS recombinante humano e a recuperação d o referido processa levado a cabo de nantes da complementaridade ÍCDR_) monoclonal do hospedeiro de esoecific o referido anticorpop sendo modo que as regiões determi-de um primeiro anticorpo idade definida sejam inseri— das nas estrutur *H3* variáveis das cauexas 1 eve e pesada ·—íí-1 \ tj que apresen tem um elevado grau de sem elbanca das sequências — rela . tivamente âs es ;fcruturas da primeiro animal e apr Ο 3-3:Π ΌΖΐ!» Θ.3 L·D!-'·!_ na configuração adequada para respirem ccsm o an.tlqénio e Ϊigando adequado» i6ãa ~ Processo para a preparação ds anti-CD18 recombinsnte humano, caraeterizado por compreender a cultura do a- f ormado cia auurdu * ss à expre- SSâo i de recuperação do rsfe. ixcaçâo 14 sob condições adequadas à expressão de anticorpo anti~CD'x8 recoíi o referido processo levado a cabo de modo que as regiões de terra i· ementaridade <CDH_) de um pr i ms i ro anticorpo »spedeiro de · bs pec i f i c i. d ad e d e f i n ida sejam inseri— •as variáveis das cadeias leve e pesada do homem, um elevado grau de semelhança das sequfncias ; estruturas do primeiro animal © â sts-s??"* t:ern 5¾-*·*. ação adequad Θ·. |3Sf~**S t’"i5 ciQ Λ. f~0iTt COlD O -iriíl "t.Í.QSn XO 0 O 1iganda adequado» •s ^ ¾ _ Processo par a a prepav «ação de uma composi— ção farmacêutica capaz ds reduzir ou inibir a m f l amação, carac te· rizada por se inclui r na referida c o®posiçSo uma q uantidade eficaz na inibição da inflamação do anticorpo anti-Cu18 recombi-nante humano de acordo com as Reivindicações 1 a 3 e um veículo f armac 5utico» 18â= — Método para prevenção ou redução de inflamação, caracterizado par compreender a administração a um paciente necessitado de tal tratamento de tuna quantidade eficaz na inibição da inflamação do anticorpo recombinante humano anti-CD18 de acordo com a Reivindicação 16, sendo a gama de dosagem de csr C«â ds 1 mg a cerca de 100! 19â = - An ticoí acordo i com qual quer u ma das por D anti Lcorpo reagir es 1 eu. cóc i tos LhF- 15 Mac -1 e pi· ~ac Le r i z ad o s \' leitura cls cad· nela se inser ífsurinòS; sendo ridade específ 2Θ§ = ~ Processa para a obtenção- de uma grelha de eia pesada recombinante humana;i caracterisado por irem regiões determinantes de complementaridade as referidas regiões determinantes de complementa” icas para a integrina CD18 humana. de uma grelha tie aracterx sado por complementaridade -s de complementa- 22â. - Processo para a obtenção leitura de cadeia leve recombinante humana.-, c nela se inserirem regiões determinantes de murinaSj sendo as referidas regiões determinar*tí ridade especificas para a integrina CD18 humana, Janeiro de 1991

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