JPH0654698A - 組換え体ヒト抗−ｃｄ１８抗体 - Google Patents
組換え体ヒト抗−ｃｄ１８抗体Info
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- JPH0654698A JPH0654698A JP3216666A JP21666691A JPH0654698A JP H0654698 A JPH0654698 A JP H0654698A JP 3216666 A JP3216666 A JP 3216666A JP 21666691 A JP21666691 A JP 21666691A JP H0654698 A JPH0654698 A JP H0654698A
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- C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
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- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
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- C07K16/2845—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta2-subunit-containing molecules, e.g. CD11, CD18
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Abstract
(57)【要約】
〔目的〕白血球のＣＤ１８インテグリン又は抗原と特異
的に反応する組換え体免疫グロブリン及びこの免疫グロ
ブリンの生産方法の提供。 〔構成〕マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む
ＤＮＡ構築物をヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖両可変部の選択
された構造と組換え的に結合する。この構築物を組換え
体免疫グロブリン配列を発現することができる真核宿主
細胞に移入する。
的に反応する組換え体免疫グロブリン及びこの免疫グロ
ブリンの生産方法の提供。 〔構成〕マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む
ＤＮＡ構築物をヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖両可変部の選択
された構造と組換え的に結合する。この構築物を組換え
体免疫グロブリン配列を発現することができる真核宿主
細胞に移入する。
Description
【０００１】マウス由来モノクローナル抗体は、様々な
疾患に伴う急性炎症応答を含めた様々なヒト病状のため
の診断及び治療剤として利用されてきた。ヒトにおける
治療剤としてマウス由来モノクローナル抗体（ｍＭＡ
ｂ）の投与は、マウス由来モノクローナル抗体のマウス
抗原に対して受容者体内で抗体ができることによって著
しく制限された。この結果を回避する試みとして、ｍＭ
Ａｂがヒトにおけるそれらの免疫原性を減少させるよう
に組換えＤＮＡ技術で再構成された。免疫グロブリン
は、モレキュラー・セル・バイオロジー、ダーネル、ロ
ディッシュ及びバルチモア編集、サイエンティフィック
・アメリカン・ブックス社、Ｗ．Ｈ．フリーマン、ニュ
ーヨーク、ＮＹ、１９８６年〔Ｍolecular Ｃell Ｂiol
ogy, Ｄarnell, Ｌodish and Ｂaltimore, Ｅds., Ｓci
entific Ａmerican Ｂooks, Ｉnc.,Ｗ.Ｈ. Ｆreeman,
Ｎew Ｙork, ＮＹ（１９８６）〕に記載されている一般
構造とともに、化学的かつ生物学的に十分に規定されて
いる。まず、これにはキメラ抗体の作成を要した〔モリ
ソンら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８１巻、第６８５１
−６８５５頁、１９８４年（Ｍorrison et al., Ｐroc.
Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ，８１：６８５１−６８
５５（１９８４））〕。組換え技術を用いてマウスＨ及
びＬ鎖定常（不変）領域を対応ヒト定常領域で置き換え
た。これを発現させると、このような種間抗体キメラは
元のマウス抗体の抗原結合特異性を保有した分子であっ
た。下記参考文献はキメラ抗体技術について一般的に記
載している：ロブグリオ（Ｌobuglio）ら、プロシーデ
ィング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンスＵＳＡ、第８６巻、第４２２０−４２２４頁、１９
８９年；米国特許第４，８１６，５６７号；１９８７年
５月７日付で公開されたＰＣＴ国際公開第ＷＯ８７／２
６７１号；１９８８年２月１０日付で公開された欧州特
許公開第２５５，６９４号；１９８８年７月１３日付で
公開された欧州特許公開第２７４，３９４号；１９８９
年７月１２日付で公開された欧州特許公開第３２３，８
０６号；１９８９年２月９日付で公開されたＰＣＴ国際
公開第ＷＯ／９９９号；１９８９年８月９日付で公開さ
れた欧州特許公開第３２７，０００号；１９８９年８月
１６日付で公開された欧州特許公開第３２８，４０４
号；及び１９８９年９月１３日付で公開された欧州特許
公開第３３２，４２４号。
疾患に伴う急性炎症応答を含めた様々なヒト病状のため
の診断及び治療剤として利用されてきた。ヒトにおける
治療剤としてマウス由来モノクローナル抗体（ｍＭＡ
ｂ）の投与は、マウス由来モノクローナル抗体のマウス
抗原に対して受容者体内で抗体ができることによって著
しく制限された。この結果を回避する試みとして、ｍＭ
Ａｂがヒトにおけるそれらの免疫原性を減少させるよう
に組換えＤＮＡ技術で再構成された。免疫グロブリン
は、モレキュラー・セル・バイオロジー、ダーネル、ロ
ディッシュ及びバルチモア編集、サイエンティフィック
・アメリカン・ブックス社、Ｗ．Ｈ．フリーマン、ニュ
ーヨーク、ＮＹ、１９８６年〔Ｍolecular Ｃell Ｂiol
ogy, Ｄarnell, Ｌodish and Ｂaltimore, Ｅds., Ｓci
entific Ａmerican Ｂooks, Ｉnc.,Ｗ.Ｈ. Ｆreeman,
Ｎew Ｙork, ＮＹ（１９８６）〕に記載されている一般
構造とともに、化学的かつ生物学的に十分に規定されて
いる。まず、これにはキメラ抗体の作成を要した〔モリ
ソンら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８１巻、第６８５１
−６８５５頁、１９８４年（Ｍorrison et al., Ｐroc.
Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ，８１：６８５１−６８
５５（１９８４））〕。組換え技術を用いてマウスＨ及
びＬ鎖定常（不変）領域を対応ヒト定常領域で置き換え
た。これを発現させると、このような種間抗体キメラは
元のマウス抗体の抗原結合特異性を保有した分子であっ
た。下記参考文献はキメラ抗体技術について一般的に記
載している：ロブグリオ（Ｌobuglio）ら、プロシーデ
ィング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンスＵＳＡ、第８６巻、第４２２０−４２２４頁、１９
８９年；米国特許第４，８１６，５６７号；１９８７年
５月７日付で公開されたＰＣＴ国際公開第ＷＯ８７／２
６７１号；１９８８年２月１０日付で公開された欧州特
許公開第２５５，６９４号；１９８８年７月１３日付で
公開された欧州特許公開第２７４，３９４号；１９８９
年７月１２日付で公開された欧州特許公開第３２３，８
０６号；１９８９年２月９日付で公開されたＰＣＴ国際
公開第ＷＯ／９９９号；１９８９年８月９日付で公開さ
れた欧州特許公開第３２７，０００号；１９８９年８月
１６日付で公開された欧州特許公開第３２８，４０４
号；及び１９８９年９月１３日付で公開された欧州特許
公開第３３２，４２４号。
【０００２】キメラ抗体の免疫原性は、ヒトＬ及びＨ鎖
の可変領域枠組み構造中にげっ歯類超可変領域を移入す
ることで更に減少させることができる〔ジョーンズら、
ネーチャー、第３２１巻、第５２２−５２５頁、１９８
６年（Ｊones et al., Ｎature, ３２１：５２２−５２
５（１９８６））〕。これらの超可変領域は相補性決定
領域（ＣＤＲ）とも呼ばれている。この技術はヒト属の
Ｈ及びＬ鎖可変領域内に存在するＣＤＲを、抗原特異的
マウスＣＤＲ配列で置換又は組換え移入することを含む
（１９８７年９月３０日付で公開された欧州特許公開第
２３９，４００号）。このアプローチにおいては、マウ
スＣＤＲがはめこまれる可変領域枠組み構造（ＦＲ）に
関する関心はほとんど示されていない。本発明は、ＣＤ
Ｒに適した支持構造が機能性抗体分子のアセンブリーの
みならず、治療用量（約０．１〜１ｍｇ／ｋｇ）を投与
しうる結合活性のある抗体分子の産生に関してもきわめ
て重要あることを示している。
の可変領域枠組み構造中にげっ歯類超可変領域を移入す
ることで更に減少させることができる〔ジョーンズら、
ネーチャー、第３２１巻、第５２２−５２５頁、１９８
６年（Ｊones et al., Ｎature, ３２１：５２２−５２
５（１９８６））〕。これらの超可変領域は相補性決定
領域（ＣＤＲ）とも呼ばれている。この技術はヒト属の
Ｈ及びＬ鎖可変領域内に存在するＣＤＲを、抗原特異的
マウスＣＤＲ配列で置換又は組換え移入することを含む
（１９８７年９月３０日付で公開された欧州特許公開第
２３９，４００号）。このアプローチにおいては、マウ
スＣＤＲがはめこまれる可変領域枠組み構造（ＦＲ）に
関する関心はほとんど示されていない。本発明は、ＣＤ
Ｒに適した支持構造が機能性抗体分子のアセンブリーの
みならず、治療用量（約０．１〜１ｍｇ／ｋｇ）を投与
しうる結合活性のある抗体分子の産生に関してもきわめ
て重要あることを示している。
【０００３】クイーン（Ｑueen）ら、プロシーディング
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵ
ＳＡ、第８６巻、第１００２９−１００３３頁、１９８
９年による最近の研究では、マウス抗Ｔａｃモノクロー
ナル抗体のＣＤＲが、ヒト枠組み構造中に移入されるこ
とを示した。ヒト枠組み構造可変領域がネズミ配列との
同一性が最大になるように選択された。その著者らは、
ＣＤＲの外側だがＣＤＲ又は抗原と相互作用しうるほど
十分近いいくつかのアミノ酸を同定するためにｍＭＡｂ
のコンピューターモデルも利用した。これらの残基はマ
ウスの配列中でみられる残基に置換された。移入された
抗Ｔａｃ抗体はネズミ抗Ｔａｃ ｍＭＡｂの場合のわず
か約１／３にすぎない抗原との親和性を有しており、こ
の抗体にヒト性が維持されているかは疑問であった。
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵ
ＳＡ、第８６巻、第１００２９−１００３３頁、１９８
９年による最近の研究では、マウス抗Ｔａｃモノクロー
ナル抗体のＣＤＲが、ヒト枠組み構造中に移入されるこ
とを示した。ヒト枠組み構造可変領域がネズミ配列との
同一性が最大になるように選択された。その著者らは、
ＣＤＲの外側だがＣＤＲ又は抗原と相互作用しうるほど
十分近いいくつかのアミノ酸を同定するためにｍＭＡｂ
のコンピューターモデルも利用した。これらの残基はマ
ウスの配列中でみられる残基に置換された。移入された
抗Ｔａｃ抗体はネズミ抗Ｔａｃ ｍＭＡｂの場合のわず
か約１／３にすぎない抗原との親和性を有しており、こ
の抗体にヒト性が維持されているかは疑問であった。
【０００４】炎症部位への白血球浸潤は、遊走に先立
ち、内皮への白血球付着に依存している。内皮への多形
核白血球（ＰＭＮ）の急速結合及び漏出は組織内におけ
る走化性刺激の導入後数分以内に生じる〔シブルスキー
ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー、第１
２４巻、第３６７頁、１９８６年（Ｃybulski et al.,
Ａm. Ｊ. Ｐathol., １２４：３６７（１９８
６））〕。この急速な遊出は、化学的誘引物質に対する
ＰＭＮの応答及び白血球表面上における糖タンパク質Ｃ
Ｄ１１／ＣＤ１８群の存在に依存しているらしい。ＰＭ
Ｎに伴う糖タンパク質群は白血球インテグリンと呼ば
れ、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、Ｍａｃ−１
（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）及びｐ１５０，９５（ＣＤ１
１ｃ／ＣＤ１８）がある。これらヘテロ二量体の各々は
特有なα鎖（ＣＤ１１ａ，ｂ，ｃ）及び不変のβ−２鎖
（ＣＤ１８）を有している。様々な走化性因子によるＰ
ＭＮの刺激は、インビトロで非刺激内皮への強い付着を
促進する白血球インテグリン（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）
の発現を増加させ〔ハーラン、ブラッド、第６５巻、第
５１３頁、１９８５年（Ｈarlan, Ｂlood, ６５：５１
３（１９８５））〕、事実上すべての化学的誘引物質誘
導性付着は、ＣＤ１１／ＣＤ１８複合体と特異的に反応
するｍＭＡｂでＰＭＮを処理することにより阻害される
〔ハーランら、ブラッド、第６６巻、第１６７頁、１９
８５年；ジマーマン及びマッキンタイア、ジャーナル・
オブ・クリニカル・インベスティゲーション、第８１
巻、第５３１頁、１９８８年（Ｚimmerman and ＭcＩnt
yre, Ｊ. Ｃlin. Ｉnvest., ８１：５３１（１９８
８））；スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、ジャーナル・オブ・
クリニカル・インベスティゲーション、第８２巻、第１
７４６頁、１９８８年；及びローら、ジャーナル・オブ
・エクスペリメンタル・メディシン、第１６９巻、第１
７７９頁、１９８９年（Ｌo et al., Ｊ. Ｅxp. Ｍed.,
１６９：１７７９（１９８９））〕。白血球付着不全
（ＬＡＤ）の患者からの多形核白血球はＣＤ１８を発現
できず、しかもインビトロで非刺激内皮に結合できない
（ハーランら、ブラッド、第６６巻、第１６７頁、１９
８５年；ローら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタ
ル・メディシン、第１６９巻、第１７７９頁、１９８９
年）。
ち、内皮への白血球付着に依存している。内皮への多形
核白血球（ＰＭＮ）の急速結合及び漏出は組織内におけ
る走化性刺激の導入後数分以内に生じる〔シブルスキー
ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー、第１
２４巻、第３６７頁、１９８６年（Ｃybulski et al.,
Ａm. Ｊ. Ｐathol., １２４：３６７（１９８
６））〕。この急速な遊出は、化学的誘引物質に対する
ＰＭＮの応答及び白血球表面上における糖タンパク質Ｃ
Ｄ１１／ＣＤ１８群の存在に依存しているらしい。ＰＭ
Ｎに伴う糖タンパク質群は白血球インテグリンと呼ば
れ、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、Ｍａｃ−１
（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）及びｐ１５０，９５（ＣＤ１
１ｃ／ＣＤ１８）がある。これらヘテロ二量体の各々は
特有なα鎖（ＣＤ１１ａ，ｂ，ｃ）及び不変のβ−２鎖
（ＣＤ１８）を有している。様々な走化性因子によるＰ
ＭＮの刺激は、インビトロで非刺激内皮への強い付着を
促進する白血球インテグリン（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）
の発現を増加させ〔ハーラン、ブラッド、第６５巻、第
５１３頁、１９８５年（Ｈarlan, Ｂlood, ６５：５１
３（１９８５））〕、事実上すべての化学的誘引物質誘
導性付着は、ＣＤ１１／ＣＤ１８複合体と特異的に反応
するｍＭＡｂでＰＭＮを処理することにより阻害される
〔ハーランら、ブラッド、第６６巻、第１６７頁、１９
８５年；ジマーマン及びマッキンタイア、ジャーナル・
オブ・クリニカル・インベスティゲーション、第８１
巻、第５３１頁、１９８８年（Ｚimmerman and ＭcＩnt
yre, Ｊ. Ｃlin. Ｉnvest., ８１：５３１（１９８
８））；スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、ジャーナル・オブ・
クリニカル・インベスティゲーション、第８２巻、第１
７４６頁、１９８８年；及びローら、ジャーナル・オブ
・エクスペリメンタル・メディシン、第１６９巻、第１
７７９頁、１９８９年（Ｌo et al., Ｊ. Ｅxp. Ｍed.,
１６９：１７７９（１９８９））〕。白血球付着不全
（ＬＡＤ）の患者からの多形核白血球はＣＤ１８を発現
できず、しかもインビトロで非刺激内皮に結合できない
（ハーランら、ブラッド、第６６巻、第１６７頁、１９
８５年；ローら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタ
ル・メディシン、第１６９巻、第１７７９頁、１９８９
年）。
【０００５】Ｍａｃ−１、ＬＦＡ−１及びｐ１５０，９
５インテグリンに共通したβ類と反応するマウスハイブ
リドーマ産生モノクローナル抗体が報告されている。ｍ
ＭＡｂは１Ｂ４、６０．３、ＴＳ１／１８、Ｈ５２及び
ＡＴＣＣ ＴＩＢ２１８と命名されている。１Ｂ４はＩ
ｇＧ２ａ抗体であって、ライト（Ｗright）ら、（プロシ
ーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンスＵＳＡ、第８０巻、第５６９９−５７０３頁、
１９８３年）により製造され、６０．３もＩｇＧ２ａで
あってベティら（ジャーナル・オブ・イムノロジー、第
１３１巻、第２９１３−２９１８頁、１９８３年〔Ｂea
tty et al., Ｊ.Ｉmmunol., １３１：２９１３−２９１
８（１９８３）〕）により製造され、ＴＳ１／１８はＩ
ｇＧ１抗体であってサンチェス・マドリド（Ｓanchez-
Ｍadrid）ら、（ジャーナル・オブ・エクスペリメンタ
ル・メディシン、第１５８巻、第１７８５−１８０３
頁、１９８３年）により製造され、Ｈ５２はβ２（ＣＤ
１８）に対するＭＡｂであってヒルドレス及びオレンタ
ス（サイエンス、第２４４巻、第１０７５−１０７８
頁、１９８９年〔Ｈildreth and Ｏrentas, Ｓcience,
２４４：１０７５−１０７８（１９８９）〕）により製
造され、ＡＴＣＣ ＴＩＢ２１８はＩｇＧ２ａκであっ
てスプリンガー（Ｓpringer）ら（ジャーナル・オブ・
エクスペリメンタル・メディシン、第１５８巻、第５８
６−６０２頁、１９８３年）により製造された。これら
の抗体は機能的に同等のようであり、ヒト、ヒツジ、ブ
タ、ウサギ及びイヌ白血球にみられるβ−２鎖と交差反
応するが、但しマウス及びラット白血球にみられるβ−
２鎖とは交差反応しない。
５インテグリンに共通したβ類と反応するマウスハイブ
リドーマ産生モノクローナル抗体が報告されている。ｍ
ＭＡｂは１Ｂ４、６０．３、ＴＳ１／１８、Ｈ５２及び
ＡＴＣＣ ＴＩＢ２１８と命名されている。１Ｂ４はＩ
ｇＧ２ａ抗体であって、ライト（Ｗright）ら、（プロシ
ーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンスＵＳＡ、第８０巻、第５６９９−５７０３頁、
１９８３年）により製造され、６０．３もＩｇＧ２ａで
あってベティら（ジャーナル・オブ・イムノロジー、第
１３１巻、第２９１３−２９１８頁、１９８３年〔Ｂea
tty et al., Ｊ.Ｉmmunol., １３１：２９１３−２９１
８（１９８３）〕）により製造され、ＴＳ１／１８はＩ
ｇＧ１抗体であってサンチェス・マドリド（Ｓanchez-
Ｍadrid）ら、（ジャーナル・オブ・エクスペリメンタ
ル・メディシン、第１５８巻、第１７８５−１８０３
頁、１９８３年）により製造され、Ｈ５２はβ２（ＣＤ
１８）に対するＭＡｂであってヒルドレス及びオレンタ
ス（サイエンス、第２４４巻、第１０７５−１０７８
頁、１９８９年〔Ｈildreth and Ｏrentas, Ｓcience,
２４４：１０７５−１０７８（１９８９）〕）により製
造され、ＡＴＣＣ ＴＩＢ２１８はＩｇＧ２ａκであっ
てスプリンガー（Ｓpringer）ら（ジャーナル・オブ・
エクスペリメンタル・メディシン、第１５８巻、第５８
６−６０２頁、１９８３年）により製造された。これら
の抗体は機能的に同等のようであり、ヒト、ヒツジ、ブ
タ、ウサギ及びイヌ白血球にみられるβ−２鎖と交差反
応するが、但しマウス及びラット白血球にみられるβ−
２鎖とは交差反応しない。
【０００６】白血球のＣＤ１８インテグリン又は抗原と
特異的に反応する組換え体免疫グロブリン及びこの免疫
グロブリンの生産方法を開示する。マウス抗体の相補性
決定領域（ＣＤＲ）を含むＤＮＡ構築物をヒト抗体のＨ
鎖及びＬ鎖両可変部の選択された構造と組換え的に結合
する。この構築物を組換え体免疫グロブリン配列を発現
することができる真核宿主細胞に移入する。
特異的に反応する組換え体免疫グロブリン及びこの免疫
グロブリンの生産方法を開示する。マウス抗体の相補性
決定領域（ＣＤＲ）を含むＤＮＡ構築物をヒト抗体のＨ
鎖及びＬ鎖両可変部の選択された構造と組換え的に結合
する。この構築物を組換え体免疫グロブリン配列を発現
することができる真核宿主細胞に移入する。
【０００７】したがって、マウスＨ及びＬ鎖モノクロー
ナル抗体の相補性決定領域に関する新規なＤＮＡ配列を
提供することが本発明の目的である。本発明のもう１つ
の目的は、ＣＤ１８インテグリン及び白血球の抗原と免
疫学的に結合するネズミＨ及びＬ鎖モノクローナル抗体
の相補性決定領域に関する新規ＤＮＡ配列を提供するこ
とである。もう１つの目的は、組換え動物抗体に関する
新規ＤＮＡ配列を提供することである。もう１つの目的
は、組換え動物抗体に関するＤＮＡ配列を含んだベクタ
ーを提供することである。もう１つの目的は、組換え動
物抗体に関するＤＮＡ配列を含んだベクターで形質転換
された哺乳動物宿主を提供することである。動物組換え
抗体がヒト組換え抗体であることがもう１つの目的であ
る。もう１つの目的は、白血球インテグリンと結合する
組換えヒト免疫グロブリンを提供することである。もう
１つの目的は、組換えヒト免疫グロブリンの産生方法を
提供することである。もう１つの目的は組換え免疫グロ
ブリンの産生方法を提供することである。
ナル抗体の相補性決定領域に関する新規なＤＮＡ配列を
提供することが本発明の目的である。本発明のもう１つ
の目的は、ＣＤ１８インテグリン及び白血球の抗原と免
疫学的に結合するネズミＨ及びＬ鎖モノクローナル抗体
の相補性決定領域に関する新規ＤＮＡ配列を提供するこ
とである。もう１つの目的は、組換え動物抗体に関する
新規ＤＮＡ配列を提供することである。もう１つの目的
は、組換え動物抗体に関するＤＮＡ配列を含んだベクタ
ーを提供することである。もう１つの目的は、組換え動
物抗体に関するＤＮＡ配列を含んだベクターで形質転換
された哺乳動物宿主を提供することである。動物組換え
抗体がヒト組換え抗体であることがもう１つの目的であ
る。もう１つの目的は、白血球インテグリンと結合する
組換えヒト免疫グロブリンを提供することである。もう
１つの目的は、組換えヒト免疫グロブリンの産生方法を
提供することである。もう１つの目的は組換え免疫グロ
ブリンの産生方法を提供することである。
【０００８】本発明は、第１の動物由来の特異性が限定
されたモノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）
が、第１の動物の枠組み構造と高度の配列類似性を示し
かつ適切な抗原又はリガンドと反応しうる適切な配置で
ＣＤＲを呈示することができるヒトを含めた第２の動物
の可変Ｈ及びＬ鎖枠組み構造中に挿入された独特な組換
え由来抗体の組立及び発現のための方法及び手段に関す
る。挿入又は移入は生物技術業界で周知のプロセス、主
に組換えＤＮＡ技術により行われる。独特な枠組み構造
（ＦＲ）は、第１の動物の枠組み構造との構造的適合性
及び配列類似性に関して選択される。この予備選択は下
記基準の１以上：（ｉ）すべての公知のヒトＨ鎖可変
（ＶH）及びＬ鎖可変（ＶL）枠組み構造配列と、ＣＤＲ
を除いた動物モノクローナル抗体の枠組み構造配列との
配列適合性；（ii）かなりの注意を表面に露出しないア
ミノ酸残基の種間適合性に払う、（ｉ）で記載されるよ
うな配列適合性；（iii）オリジナル動物モノクローナ
ル抗体のモデルに代わりＣＤＲと比較したヒト枠組み構
造配列の三次及び四次構造モデル；（iv）選択動物モノ
クローナル抗体における枠組み構造配列に対応したＤＮ
ＡプローブによるヒトゲノムＤＮＡのスクリーニング、
の４つによっている。これらの基準及び下記操作はＬ及
びＨ鎖双方の動物ｍＭＡｂのＣＤＲをヒト枠組み構造中
に組込んだ組換えＤＮＡ配列を製造するために用いら
れ、しかる後これは動物モノクローナル抗体の抗原特異
性を有した組換えヒト抗体の発現用に哺乳動物細胞をト
ランスフェクトするため用いることができる。
されたモノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）
が、第１の動物の枠組み構造と高度の配列類似性を示し
かつ適切な抗原又はリガンドと反応しうる適切な配置で
ＣＤＲを呈示することができるヒトを含めた第２の動物
の可変Ｈ及びＬ鎖枠組み構造中に挿入された独特な組換
え由来抗体の組立及び発現のための方法及び手段に関す
る。挿入又は移入は生物技術業界で周知のプロセス、主
に組換えＤＮＡ技術により行われる。独特な枠組み構造
（ＦＲ）は、第１の動物の枠組み構造との構造的適合性
及び配列類似性に関して選択される。この予備選択は下
記基準の１以上：（ｉ）すべての公知のヒトＨ鎖可変
（ＶH）及びＬ鎖可変（ＶL）枠組み構造配列と、ＣＤＲ
を除いた動物モノクローナル抗体の枠組み構造配列との
配列適合性；（ii）かなりの注意を表面に露出しないア
ミノ酸残基の種間適合性に払う、（ｉ）で記載されるよ
うな配列適合性；（iii）オリジナル動物モノクローナ
ル抗体のモデルに代わりＣＤＲと比較したヒト枠組み構
造配列の三次及び四次構造モデル；（iv）選択動物モノ
クローナル抗体における枠組み構造配列に対応したＤＮ
ＡプローブによるヒトゲノムＤＮＡのスクリーニング、
の４つによっている。これらの基準及び下記操作はＬ及
びＨ鎖双方の動物ｍＭＡｂのＣＤＲをヒト枠組み構造中
に組込んだ組換えＤＮＡ配列を製造するために用いら
れ、しかる後これは動物モノクローナル抗体の抗原特異
性を有した組換えヒト抗体の発現用に哺乳動物細胞をト
ランスフェクトするため用いることができる。
【０００９】本発明は、（ｉ）ＣＤＲ及びＦＲ領域を含
んだ可変領域ドメインの変異誘発及びアセンブリー；
（ii）細胞内へのトランスフェクトで結合活性及び特異
性決定のために十分なタンパク質を分泌させる少なくと
も１つの可変領域を含んだ発現ベクターの製造；並びに
（iii）適切な細胞系内におけるＨ及びＬ鎖発現ベクタ
ーの同時増幅、の３つからなる、変異抗体を組立てかつ
発現させるための方法にも関する。
んだ可変領域ドメインの変異誘発及びアセンブリー；
（ii）細胞内へのトランスフェクトで結合活性及び特異
性決定のために十分なタンパク質を分泌させる少なくと
も１つの可変領域を含んだ発現ベクターの製造；並びに
（iii）適切な細胞系内におけるＨ及びＬ鎖発現ベクタ
ーの同時増幅、の３つからなる、変異抗体を組立てかつ
発現させるための方法にも関する。
【００１０】本発明は、得られる組換えヒト抗体がヒト
に投与された場合に免疫原性が弱いか又は非免疫原性で
あるように動物モノクローナル抗体からのＣＤＲをヒト
免疫グロブリン枠組み構造中に組込むための組換え方法
を提供する。好ましいことに、組換え免疫グロブリンは
治療目的で投与された場合に自己タンパク質として認識
されるであろう。この“ヒト化”方法は、それらがヒト
に投与された場合に弱い免疫原性であるか又は非免疫原
性であるため、組換え抗体を治療剤として有用なものに
する。さらに本発明は、適切な枠組み構造領域が（下記
のように）確認されうるならば、組換えヒトモノクロー
ナル抗体中へ、どのような動物モノクローナル抗体をも
組換え変換することを含むと考えられる。本発明はＬも
しくはＨ鎖又は完全免疫グロブリン及びそのいずれかの
保存的に修正された変異体として別々に又は組合された
ネズミＣＤＲ領域及びヒト枠組み構造領域のヌクレオチ
ド及びアミノ酸配列も含むと考えられる。動物モノクロ
ーナル抗体としては格別限定されず、ヒト白血球と結合
するバン・ブーヒス（Ｖan Ｖoorhis）ら、ジャーナル
・オブ・エクスペリメンタル・メディシン、第１５８
巻、第１２６−１４５頁、１９８３年で記載されたネズ
ミモノクローナル抗体及びアメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション（ＡＴＣＣ）で運営されるハイブリ
ドーマ・セル・バンク（Ｈybridoma Ｃell Ｂank）に寄
託されかつＡＴＣＣカタログ・オブ・セル・ラインズ
＆ ハイブリドーマズ（ＡＴＣＣ Ｃatalog of Ｃell Ｌ
ines ＆Ｈybridomas）、第６号、１９８８年で記載され
たハイブリドーマにより産生される適切なｍＭＡｂがあ
る。
に投与された場合に免疫原性が弱いか又は非免疫原性で
あるように動物モノクローナル抗体からのＣＤＲをヒト
免疫グロブリン枠組み構造中に組込むための組換え方法
を提供する。好ましいことに、組換え免疫グロブリンは
治療目的で投与された場合に自己タンパク質として認識
されるであろう。この“ヒト化”方法は、それらがヒト
に投与された場合に弱い免疫原性であるか又は非免疫原
性であるため、組換え抗体を治療剤として有用なものに
する。さらに本発明は、適切な枠組み構造領域が（下記
のように）確認されうるならば、組換えヒトモノクロー
ナル抗体中へ、どのような動物モノクローナル抗体をも
組換え変換することを含むと考えられる。本発明はＬも
しくはＨ鎖又は完全免疫グロブリン及びそのいずれかの
保存的に修正された変異体として別々に又は組合された
ネズミＣＤＲ領域及びヒト枠組み構造領域のヌクレオチ
ド及びアミノ酸配列も含むと考えられる。動物モノクロ
ーナル抗体としては格別限定されず、ヒト白血球と結合
するバン・ブーヒス（Ｖan Ｖoorhis）ら、ジャーナル
・オブ・エクスペリメンタル・メディシン、第１５８
巻、第１２６−１４５頁、１９８３年で記載されたネズ
ミモノクローナル抗体及びアメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション（ＡＴＣＣ）で運営されるハイブリ
ドーマ・セル・バンク（Ｈybridoma Ｃell Ｂank）に寄
託されかつＡＴＣＣカタログ・オブ・セル・ラインズ
＆ ハイブリドーマズ（ＡＴＣＣ Ｃatalog of Ｃell Ｌ
ines ＆Ｈybridomas）、第６号、１９８８年で記載され
たハイブリドーマにより産生される適切なｍＭＡｂがあ
る。
【００１１】動物モノクローナル抗体からのＣＤＲ配列
は下記のように誘導される。全ＲＮＡは、細胞溶解をグ
アニジニウムイソチオシアネートで行う標準的方法〔チ
ャグウィンら、バイオケミストリー、第１８巻、第５２
９４−５２９９頁、１９７９年（Ｃhirgwin et al., Ｂ
iochem., １８：５２９４−５２９９（１９７９））〕
を用いてネズミハイブリドーマ、例えばライトら、プロ
シーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンスＵＳＡ、第８０巻、第５６９９−５７０３
頁、１９８３年で記載された１Ｂ４ミエローマ細胞、ベ
ティら、ジャーナル・オブ・イムノロジー、第１３１
巻、第２９１３−２９１８頁、１９８３年で記載された
６０．３細胞、サンチェス−マドリドら、ジャーナル・
オブ・エクスペリメンタル・メディシン、第１５８巻、
第１７８５−１８０３頁、１９８３年で記載されたＴＳ
１／１８細胞並びに他の抗ＣＤ１８又はＣＤ１１モノク
ローナル抗体及びロイコサイト・タイピングＩＩＩ、ス
プリンガー・フェアラーク、ニューヨーク、１９８８年
〔Ｌeukocyte Ｔyping ＩＩＩ、Ｓpringer-Ｖerlag, Ｎ
ewＹork （１９８８）〕で記載されるようなハイブリド
ーマから抽出される。ネズミ１Ｂ４ｍＭＡｂは、開示さ
れた独特なプロセスで“ヒト化”されうる動物ＭＡｂの
主要例として用いられる。本発明にはいずれかの動物免
疫グロブリンからのヒト免疫グロブリンへの変換も含
む。更に、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）はκもしくはλ
Ｌ鎖を含んでいても又は下記Ｈ鎖イソタイプ（α、δ、
ε、γ及びμ）のいずれか１つであってもよいと考えら
れる。ネズミκＬ鎖可変領域及びＬ鎖不変ドメインの枠
組み構造１内の配列又はネズミＩｇＧ２ａＨ鎖可変領域
及びＨ鎖不変ＣＨ１ドメインの枠組み構造１内の配列を
表す縮重オリゴデオキシヌクレオチドプライマーの対
（図１）はアプライド・バイオシステム（Ａpplied Ｂi
osystem）３８１Ａ ＤＮＡシンセサイザーで合成し、濃
ＮＨ4ＯＨの処理で樹脂からはずし、ＮＡＰ−５カラム
からＨ2Ｏで溶出させて脱塩する。全ＲＮＡ約２μｇは
モロニー（Ｍoloney）ＭＬＶ逆転写酵素（ＢＲＬ）約２
００単位及びＨ又はＬ鎖に関する不変領域相補鎖プライ
マー約１０ｐｍｏｌを用いて約４２℃で約３０分間逆転
写させる。逆転写酵素は約９５℃で約５分間かけて熱不
活化し、ＰＣＲ緩衝液約１００μｌ中に各対合プライマ
ー約５０ｐｍｏｌ及びＴａｑポリメラーゼ２５単位を含
有した反応液を調製する。約４５サイクルの増幅（９４
℃で２分間；５５℃で２分間；７２℃で２分間）しかる
後予想４００＋塩基対（ｂｐ）ＤＮＡ断片（図２）のゲ
ル精製を行う。それらのＤＮＡは、ｐＳＰ７２〔プロメ
ガ（Ｐromega）〕のようなブラント末端化中間プラスミ
ドに組込んでサブクローニングする前に、Ｔ４ポリヌク
レオチドキナーゼを用いて末端をリン酸化する。凍結コ
ンピテント大腸菌を氷上で解凍し、１００μｌずつ湿潤
氷冷ポリプロピレン管内に分注した。結合混合物からの
ＤＮＡ（１〜１０ｎｇ）をこれらの管内に攪拌しながら
加え、混合液を氷上で３０分間インキュベートした。大
腸菌細胞はインキュベート下４２℃で４５秒間熱ショッ
クを与え、しかる後氷で２分間冷却した。室温Ｓ．Ｏ．
Ｃ．〔ハナハン、Ｄ、ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー、第１６６巻、第５５７頁、１９８３年
（Ｈanahan, Ｄ.,Ｊ. Ｍol.Ｂiol.,１６６：５５７、１
９８３）〕を加え、培養菌を２２５ｒｐｍ、３７℃で６
０分間振盪した。一部の培養菌は１００μｇ／ｍｌアン
ピシリン含有ＬＢ寒天プレート上に塗布し、これらのプ
レートはコロニー増殖させるため３７℃で一夜インキュ
ベートされた。これらのＰＣＲ増殖配列を発現する多数
のクローンを培養し、シークエナーゼ（Ｓequenase）並
びにＴ７及びＳＰ６特異的配列決定プライマーを用いて
ＤＮＡ配列決定を行った。マウスＩｇＧ２ａＨ鎖可変領
域を表すＤＮＡ配列が唯一つ得られたが、但しκＬ鎖可
変領域は２つクローン化群内に見出された（図３）。ど
ちらの配列が１Ｂ４ｍＭＡｂに属するか識別するため、
１Ｂ４ｍＭＡｂはジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元
され、精製されたＨ及びＬ鎖がアプライド・バイオシス
テムズ４７７Ａシークエンサーを用いてＮ末端アミノ酸
配列決定に付された。トリプシン及び臭化シアン切断ペ
プチドも配列決定される。
は下記のように誘導される。全ＲＮＡは、細胞溶解をグ
アニジニウムイソチオシアネートで行う標準的方法〔チ
ャグウィンら、バイオケミストリー、第１８巻、第５２
９４−５２９９頁、１９７９年（Ｃhirgwin et al., Ｂ
iochem., １８：５２９４−５２９９（１９７９））〕
を用いてネズミハイブリドーマ、例えばライトら、プロ
シーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンスＵＳＡ、第８０巻、第５６９９−５７０３
頁、１９８３年で記載された１Ｂ４ミエローマ細胞、ベ
ティら、ジャーナル・オブ・イムノロジー、第１３１
巻、第２９１３−２９１８頁、１９８３年で記載された
６０．３細胞、サンチェス−マドリドら、ジャーナル・
オブ・エクスペリメンタル・メディシン、第１５８巻、
第１７８５−１８０３頁、１９８３年で記載されたＴＳ
１／１８細胞並びに他の抗ＣＤ１８又はＣＤ１１モノク
ローナル抗体及びロイコサイト・タイピングＩＩＩ、ス
プリンガー・フェアラーク、ニューヨーク、１９８８年
〔Ｌeukocyte Ｔyping ＩＩＩ、Ｓpringer-Ｖerlag, Ｎ
ewＹork （１９８８）〕で記載されるようなハイブリド
ーマから抽出される。ネズミ１Ｂ４ｍＭＡｂは、開示さ
れた独特なプロセスで“ヒト化”されうる動物ＭＡｂの
主要例として用いられる。本発明にはいずれかの動物免
疫グロブリンからのヒト免疫グロブリンへの変換も含
む。更に、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）はκもしくはλ
Ｌ鎖を含んでいても又は下記Ｈ鎖イソタイプ（α、δ、
ε、γ及びμ）のいずれか１つであってもよいと考えら
れる。ネズミκＬ鎖可変領域及びＬ鎖不変ドメインの枠
組み構造１内の配列又はネズミＩｇＧ２ａＨ鎖可変領域
及びＨ鎖不変ＣＨ１ドメインの枠組み構造１内の配列を
表す縮重オリゴデオキシヌクレオチドプライマーの対
（図１）はアプライド・バイオシステム（Ａpplied Ｂi
osystem）３８１Ａ ＤＮＡシンセサイザーで合成し、濃
ＮＨ4ＯＨの処理で樹脂からはずし、ＮＡＰ−５カラム
からＨ2Ｏで溶出させて脱塩する。全ＲＮＡ約２μｇは
モロニー（Ｍoloney）ＭＬＶ逆転写酵素（ＢＲＬ）約２
００単位及びＨ又はＬ鎖に関する不変領域相補鎖プライ
マー約１０ｐｍｏｌを用いて約４２℃で約３０分間逆転
写させる。逆転写酵素は約９５℃で約５分間かけて熱不
活化し、ＰＣＲ緩衝液約１００μｌ中に各対合プライマ
ー約５０ｐｍｏｌ及びＴａｑポリメラーゼ２５単位を含
有した反応液を調製する。約４５サイクルの増幅（９４
℃で２分間；５５℃で２分間；７２℃で２分間）しかる
後予想４００＋塩基対（ｂｐ）ＤＮＡ断片（図２）のゲ
ル精製を行う。それらのＤＮＡは、ｐＳＰ７２〔プロメ
ガ（Ｐromega）〕のようなブラント末端化中間プラスミ
ドに組込んでサブクローニングする前に、Ｔ４ポリヌク
レオチドキナーゼを用いて末端をリン酸化する。凍結コ
ンピテント大腸菌を氷上で解凍し、１００μｌずつ湿潤
氷冷ポリプロピレン管内に分注した。結合混合物からの
ＤＮＡ（１〜１０ｎｇ）をこれらの管内に攪拌しながら
加え、混合液を氷上で３０分間インキュベートした。大
腸菌細胞はインキュベート下４２℃で４５秒間熱ショッ
クを与え、しかる後氷で２分間冷却した。室温Ｓ．Ｏ．
Ｃ．〔ハナハン、Ｄ、ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー、第１６６巻、第５５７頁、１９８３年
（Ｈanahan, Ｄ.,Ｊ. Ｍol.Ｂiol.,１６６：５５７、１
９８３）〕を加え、培養菌を２２５ｒｐｍ、３７℃で６
０分間振盪した。一部の培養菌は１００μｇ／ｍｌアン
ピシリン含有ＬＢ寒天プレート上に塗布し、これらのプ
レートはコロニー増殖させるため３７℃で一夜インキュ
ベートされた。これらのＰＣＲ増殖配列を発現する多数
のクローンを培養し、シークエナーゼ（Ｓequenase）並
びにＴ７及びＳＰ６特異的配列決定プライマーを用いて
ＤＮＡ配列決定を行った。マウスＩｇＧ２ａＨ鎖可変領
域を表すＤＮＡ配列が唯一つ得られたが、但しκＬ鎖可
変領域は２つクローン化群内に見出された（図３）。ど
ちらの配列が１Ｂ４ｍＭＡｂに属するか識別するため、
１Ｂ４ｍＭＡｂはジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元
され、精製されたＨ及びＬ鎖がアプライド・バイオシス
テムズ４７７Ａシークエンサーを用いてＮ末端アミノ酸
配列決定に付された。トリプシン及び臭化シアン切断ペ
プチドも配列決定される。
【００１２】ｍＭＡｂ １Ｂ４に特有な部分によるヒト
可変領域ＣＤＲの置き換えは下記の独特なプロセスを用
いて行われる。適切なヒト枠組み構造は前記基準を用い
て決定される。ＲＥＩ枠組み構造〔オーランジ（Ｏrlan
di）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８６巻、第３８３３
−３８３７頁、１９８９年；リーチマン（Ｒiechmann）
ら、ネーチャー、第３３２巻、第３２３−３２７頁、１
９８８年；欧州特許出願公開第２３９，４００号〕のよ
うなＬ鎖可変領域枠組み構造はそのリーダー及び３’イ
ントロン配列と共に中間ベクターｐＧＥＭ３Ｚ（プロメ
ガ）に組込んでサブクローニングされる。ポリメラーゼ
鎖反応（ＰＣＲ）増殖で４種のＤＮＡ断片を形成させる
ために必要なプライマーを代表する約８種のオリゴデオ
キシヌクレオチドプライマー（図４）が合成される。Ｍ
Ａｂ １Ｂ４Ｌ鎖ＣＤＲに対応する配列及び５’末端相
補性部分の少なくとも１５塩基が末端オリゴデオキシヌ
クレオチドプライマーを除くプライマー全部が組込まれ
た（図５参照）。適切なプライマー対各々約５０ｐｍｏ
ｌがＲＥＩ枠組み構造を表すプラスミドＤＮＡ約１０ｎ
ｇ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ約２．５単位と混合さ
れ、約３０サイクルのＰＣＲ増幅が行われた（前記サイ
クル時間）。アガロースゲル電気泳動で精製された４反
応の生成物の各ＤＮＡ断片約１０ｎｇは末端オリゴデオ
キシヌクレオチドプライマー（図４）及びＴａｑＤＮＡ
ポリメラーゼと共に混合され、混合断片がＰＣＲ増幅さ
れた（図５参照）。ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで制限
エンドヌクレアーゼ切断後、増幅されたＤＮＡはアガロ
ースゲル電気泳動で精製され、ヒトκＬ鎖不変領域を含
む中間ベクターｐＳＰ７２（プロメガ）の適合部位に組
込んでサブクローニングされる（図６参照）。ヒトＢ細
胞系〔ＧＭ０１０８Ａ：ＮＩＧＭＳヒューマン・ゲネテ
ィック・ミュータント・セル・レポジトリー（ＮＩＧＭ
Ｓ Ｈuman ＧeneticＭutant Ｃell Ｒepository）、イ
ンスティチュート・フォア・メディカル・リサーチ（Ｉ
nstitute for Ｍedical Ｒesearch）カムデン、ニュー
ジャージー州〕から精製されたゲノムＤＮＡ約１μｇが
κＬ鎖不変ドメイン、エキソン及びその３’非翻訳領域
の一部に関するスプライスアクセプターを含んだ約９２
０塩基対断片のＰＣＲ増幅用鋳型（図７）として用いら
れる。ＰＣＲ生成物はアガロースゲル電気泳動で精製さ
れ、ＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼで切断され、既にＢ
ａｍＨＩで直鎖化されたｐＳＰ７２に組込んでサブクロ
ーニングされる。ＲＥＩから誘導される１Ｂ４移入可変
領域及びヒトＤＮＡのＰＣＲ増幅で誘導されるヒトκ不
変領域を含んだｐＳＰ７２中間ベクターを表す個々のク
ローンが、移入Ｌ鎖可変領域のＤＮＡ配列を決定するた
めに用いられる。
可変領域ＣＤＲの置き換えは下記の独特なプロセスを用
いて行われる。適切なヒト枠組み構造は前記基準を用い
て決定される。ＲＥＩ枠組み構造〔オーランジ（Ｏrlan
di）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８６巻、第３８３３
−３８３７頁、１９８９年；リーチマン（Ｒiechmann）
ら、ネーチャー、第３３２巻、第３２３−３２７頁、１
９８８年；欧州特許出願公開第２３９，４００号〕のよ
うなＬ鎖可変領域枠組み構造はそのリーダー及び３’イ
ントロン配列と共に中間ベクターｐＧＥＭ３Ｚ（プロメ
ガ）に組込んでサブクローニングされる。ポリメラーゼ
鎖反応（ＰＣＲ）増殖で４種のＤＮＡ断片を形成させる
ために必要なプライマーを代表する約８種のオリゴデオ
キシヌクレオチドプライマー（図４）が合成される。Ｍ
Ａｂ １Ｂ４Ｌ鎖ＣＤＲに対応する配列及び５’末端相
補性部分の少なくとも１５塩基が末端オリゴデオキシヌ
クレオチドプライマーを除くプライマー全部が組込まれ
た（図５参照）。適切なプライマー対各々約５０ｐｍｏ
ｌがＲＥＩ枠組み構造を表すプラスミドＤＮＡ約１０ｎ
ｇ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ約２．５単位と混合さ
れ、約３０サイクルのＰＣＲ増幅が行われた（前記サイ
クル時間）。アガロースゲル電気泳動で精製された４反
応の生成物の各ＤＮＡ断片約１０ｎｇは末端オリゴデオ
キシヌクレオチドプライマー（図４）及びＴａｑＤＮＡ
ポリメラーゼと共に混合され、混合断片がＰＣＲ増幅さ
れた（図５参照）。ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで制限
エンドヌクレアーゼ切断後、増幅されたＤＮＡはアガロ
ースゲル電気泳動で精製され、ヒトκＬ鎖不変領域を含
む中間ベクターｐＳＰ７２（プロメガ）の適合部位に組
込んでサブクローニングされる（図６参照）。ヒトＢ細
胞系〔ＧＭ０１０８Ａ：ＮＩＧＭＳヒューマン・ゲネテ
ィック・ミュータント・セル・レポジトリー（ＮＩＧＭ
Ｓ Ｈuman ＧeneticＭutant Ｃell Ｒepository）、イ
ンスティチュート・フォア・メディカル・リサーチ（Ｉ
nstitute for Ｍedical Ｒesearch）カムデン、ニュー
ジャージー州〕から精製されたゲノムＤＮＡ約１μｇが
κＬ鎖不変ドメイン、エキソン及びその３’非翻訳領域
の一部に関するスプライスアクセプターを含んだ約９２
０塩基対断片のＰＣＲ増幅用鋳型（図７）として用いら
れる。ＰＣＲ生成物はアガロースゲル電気泳動で精製さ
れ、ＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼで切断され、既にＢ
ａｍＨＩで直鎖化されたｐＳＰ７２に組込んでサブクロ
ーニングされる。ＲＥＩから誘導される１Ｂ４移入可変
領域及びヒトＤＮＡのＰＣＲ増幅で誘導されるヒトκ不
変領域を含んだｐＳＰ７２中間ベクターを表す個々のク
ローンが、移入Ｌ鎖可変領域のＤＮＡ配列を決定するた
めに用いられる。
【００１３】組換え抗体のキメラＨ鎖部分は、フラナガ
ン（Ｆlanagan）及びラビッツ（Ｒabbits）、ネーチャ
ー、第３００巻、第７０９−７１３頁、１９８２年によ
りつくられたλライブラリーから入手したガンマγ４サ
ブタイプのヒト不変領域に融合されたマウス１Ｂ４Ｈ鎖
可変領域から誘導される。キメラＨ鎖の可変領域は、シ
グナル配列、マウスＨ鎖可変領域の一部及びイントロン
配列を表す３種のＤＮＡ断片から組立てられる（図
８）。ネズミ１Ｂ４ＣＤＲ配列を決定するため既に用い
られたＩｇＧ２ａＨ鎖可変領域を含むｐＳＰ７２中間ベ
クター又はＭ１３ＶＨＰＣＲ１（オーランジら、プロシ
ーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンスＵＳＡ、第８６巻、第３８３３−３８３７頁、
１９８９年）から得られるプラスミドＤＮＡ鋳型約１０
ｎｇのＰＣＲ増幅を行ってこれら３種のＤＮＡ断片を得
るために必要なプライマーを表すオリゴデオキシヌクレ
オチドプライマー対（図９）を合成する。シグナル断
片、可変領域断片及びイントロン含有断片の増幅は前記
のとおりであった。アガロースゲル精製生成物は各生成
物約１０ｎｇが末端オリゴデオキシヌクレオチドプライ
マー対（図９）と混合され、ＰＣＲ形成インビトロ組換
え鋳型が前記標準操作を用いて増幅される。ＢｇｌＩＩ
及びＢａｍＨＩ切断中間ベクターｐＳＰ７２に組込んで
サブクローニングするに先立ち、この組換え生成物は同
様に切断され、アガロースゲルで精製される。個々のク
ローンはシークエナーゼ並びにＴ７及びＳＰ６特異性配
列決定プライマーを用いてＤＮＡ配列決定に付され、１
つ（ｐ８９５０）を後の発現用に選択する。
ン（Ｆlanagan）及びラビッツ（Ｒabbits）、ネーチャ
ー、第３００巻、第７０９−７１３頁、１９８２年によ
りつくられたλライブラリーから入手したガンマγ４サ
ブタイプのヒト不変領域に融合されたマウス１Ｂ４Ｈ鎖
可変領域から誘導される。キメラＨ鎖の可変領域は、シ
グナル配列、マウスＨ鎖可変領域の一部及びイントロン
配列を表す３種のＤＮＡ断片から組立てられる（図
８）。ネズミ１Ｂ４ＣＤＲ配列を決定するため既に用い
られたＩｇＧ２ａＨ鎖可変領域を含むｐＳＰ７２中間ベ
クター又はＭ１３ＶＨＰＣＲ１（オーランジら、プロシ
ーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンスＵＳＡ、第８６巻、第３８３３−３８３７頁、
１９８９年）から得られるプラスミドＤＮＡ鋳型約１０
ｎｇのＰＣＲ増幅を行ってこれら３種のＤＮＡ断片を得
るために必要なプライマーを表すオリゴデオキシヌクレ
オチドプライマー対（図９）を合成する。シグナル断
片、可変領域断片及びイントロン含有断片の増幅は前記
のとおりであった。アガロースゲル精製生成物は各生成
物約１０ｎｇが末端オリゴデオキシヌクレオチドプライ
マー対（図９）と混合され、ＰＣＲ形成インビトロ組換
え鋳型が前記標準操作を用いて増幅される。ＢｇｌＩＩ
及びＢａｍＨＩ切断中間ベクターｐＳＰ７２に組込んで
サブクローニングするに先立ち、この組換え生成物は同
様に切断され、アガロースゲルで精製される。個々のク
ローンはシークエナーゼ並びにＴ７及びＳＰ６特異性配
列決定プライマーを用いてＤＮＡ配列決定に付され、１
つ（ｐ８９５０）を後の発現用に選択する。
【００１４】γ４Ｈ鎖不変領域は、プラスミドｐＡＴ８
４（フラナガン及びラビッツ、ネーチャー、第３００
巻、第７０９−７１３頁、１９８２年）から誘導される
約６．７ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ断片として中間ベクター
ｐＳＰ７２のＨｉｎｄＩＩＩ部位に組込んでサブクロー
ニングされる。次いでこのプラスミドは、γ４不変領域
の短小体を図７で示されたプライマー対とＰＣＲ増幅を
用いてサブクローニングする際の鋳型ＤＮＡとして用い
られる。真核細胞発現ベクターは下記のようにして組立
てられる。発現ベクターとは、適切な宿主内における遺
伝子のクローン化コピーの転写及びそれらｍＲＮＡの翻
訳に必要なＤＮＡ配列としてここでは定義される。この
ようなベクターは細菌、藍藻植物、植物細胞、酵母細
胞、昆虫細胞及び動物細胞のような様々な宿主において
真核細胞遺伝子を発現するために用いることができる。
免疫グロブリンはいくつかのウイルス系で発現させても
よい。特にデザインされたベクターによれば、細菌−酵
母又は細菌−動物細胞のような宿主間でＤＮＡをシャト
ル化することができる。適切に組立てられた発現ベクタ
ーは、宿主細胞内自己複製用の複製起点選択マーカー、
限定された数の有用な制限酵素部位、高コピー数保持能
及び強力プロモーターを含んでいるべきである。プロモ
ーターとは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させて
ＲＮＡ合成を開始させることのできるＤＮＡ配列として
定義される。強力プロモーターは高頻度でｍＲＮＡ合成
を開始させるものである。発現ベクターとしては格別限
定されず、クローニングベクター、修正クローニングベ
クター、特にデザインされたプラスミド又はウイルスが
ある。Ｈ鎖免疫グロブリン分子はネオマイシン（Ｇ４１
８）耐性マーカーを有するプラスミドから転写され、一
方Ｌ鎖免疫グロブリンはヒグロマイシンＢ耐性マーカー
を有するプラスミドから転写される。これらプラスミド
は薬物耐性部分を除き、同一である。
４（フラナガン及びラビッツ、ネーチャー、第３００
巻、第７０９−７１３頁、１９８２年）から誘導される
約６．７ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ断片として中間ベクター
ｐＳＰ７２のＨｉｎｄＩＩＩ部位に組込んでサブクロー
ニングされる。次いでこのプラスミドは、γ４不変領域
の短小体を図７で示されたプライマー対とＰＣＲ増幅を
用いてサブクローニングする際の鋳型ＤＮＡとして用い
られる。真核細胞発現ベクターは下記のようにして組立
てられる。発現ベクターとは、適切な宿主内における遺
伝子のクローン化コピーの転写及びそれらｍＲＮＡの翻
訳に必要なＤＮＡ配列としてここでは定義される。この
ようなベクターは細菌、藍藻植物、植物細胞、酵母細
胞、昆虫細胞及び動物細胞のような様々な宿主において
真核細胞遺伝子を発現するために用いることができる。
免疫グロブリンはいくつかのウイルス系で発現させても
よい。特にデザインされたベクターによれば、細菌−酵
母又は細菌−動物細胞のような宿主間でＤＮＡをシャト
ル化することができる。適切に組立てられた発現ベクタ
ーは、宿主細胞内自己複製用の複製起点選択マーカー、
限定された数の有用な制限酵素部位、高コピー数保持能
及び強力プロモーターを含んでいるべきである。プロモ
ーターとは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させて
ＲＮＡ合成を開始させることのできるＤＮＡ配列として
定義される。強力プロモーターは高頻度でｍＲＮＡ合成
を開始させるものである。発現ベクターとしては格別限
定されず、クローニングベクター、修正クローニングベ
クター、特にデザインされたプラスミド又はウイルスが
ある。Ｈ鎖免疫グロブリン分子はネオマイシン（Ｇ４１
８）耐性マーカーを有するプラスミドから転写され、一
方Ｌ鎖免疫グロブリンはヒグロマイシンＢ耐性マーカー
を有するプラスミドから転写される。これらプラスミド
は薬物耐性部分を除き、同一である。
【００１５】免疫グロブリン発現ベクターの好ましい原
種はｐＤ５〔バークナー及びシャープ、ヌクレイック・
アシッズ・リサーチ、第１３巻、第８４１−８５７頁、
１９８５年（Ｂerkner and Ｓharp, Ｎucl. Ａcids Ｒe
s., １３：８４１−８５７（１９８５））〕真核細胞発
現ベクターであるが、これはアデノウイルス複製起点、
ＳＶ４０エンハンサードメイン、アデノウイルス主要後
期プロモーター、アデノウイルス第２三分節系リーダ
ー、アデノウイルス第３リーダーからの５’スプライス
ドナー、免疫グロブリン座から誘導される３’スプライ
スアクセプター、ベクターの受容部に続くＢａｍＨＩ部
位におかれた多数クローニング部位及びＳＶ４０後期ポ
リアデニル化シグナルを含んでいる（図１０）。複製起
点はＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩによる切断で除去され、ｎ
ｅｏ選択マーカー遺伝子（ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ約
１．８ｋｂ断片としてプラスミドｐＣＭＶＩＥ−ＡＫ１
−ＤＨＦＲから誘導される）及びＩｇＨ鎖エンハンサー
（鋳型としてヒトＤＮＡ及びプライマー対として図７で
示されたオリゴデオキシヌクレオチドを用いたＰＣＲ増
幅断片をＢｇｌＩＩ及びＫｐｎＩで切断後に得られる）
を表す２断片で置き換えられる。得られる発現ベクター
はネオマイシン遺伝子の転写に関与するＴＫプロモータ
ーの小部分を欠くことがわかっている。これは図７で示
されるプライマー対を用いてＣＭＶＩＥ−ＡＫ１−ＤＨ
ＦＲ ＤＮＡから誘導される約０．１４ｋｂＰＣＲ増幅
断片をＥｃｏＲＩ部位への挿入することで置き換えられ
る。得られるＨ鎖発現ベクター（ｐ８９４１）は標準的
操作を用いて指定されたＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ部
位の除去により修正される。ヒグロマイシンＢ選択マー
カーを発現するベクターに変換させるため、ネオマイシ
ン耐性カセットを、最初ＥｃｏＲＩ切断、しかる後５’
突出部をＤＮＡポリメラーゼで補足し、次いでＳａｌＩ
で切断して除去する。約１．９ｋｂヒグロマイシンＢ発
現カセット、ＴＫプロモーター及びヒグロマイシンＢ遺
伝子に隣接するＴＫポリアデニル化シグナル〔グリッツ
及びデービス、ジーン、第２５巻、第１７９−１８８
頁、１９８１年（Ｇritz and Ｄavies, Ｇene ２５：１
７９−１８８（１９８１））のプラスミドｐＬ６９０に
おいて１．８ｋｂ ＢａｍＨＩ断片として得られる〕は
ＢａｍＨＩ切断によりプラスミドｐＡＬ２から取り出
し、中間ベクターｐＳＰ７２のＢａｍＨＩ部位に組込ん
でサブクローニングする。ヒグロマイシンＢカセットは
ＳｍａＩ及びＳａｌＩ切断によりこのベクターから取出
され、前記のようにブラント末端及びＳａｌＩ末端ＤＮ
Ａ断片を持つよう直鎖化された発現ベクターに組込んで
クローニングされる。
種はｐＤ５〔バークナー及びシャープ、ヌクレイック・
アシッズ・リサーチ、第１３巻、第８４１−８５７頁、
１９８５年（Ｂerkner and Ｓharp, Ｎucl. Ａcids Ｒe
s., １３：８４１−８５７（１９８５））〕真核細胞発
現ベクターであるが、これはアデノウイルス複製起点、
ＳＶ４０エンハンサードメイン、アデノウイルス主要後
期プロモーター、アデノウイルス第２三分節系リーダ
ー、アデノウイルス第３リーダーからの５’スプライス
ドナー、免疫グロブリン座から誘導される３’スプライ
スアクセプター、ベクターの受容部に続くＢａｍＨＩ部
位におかれた多数クローニング部位及びＳＶ４０後期ポ
リアデニル化シグナルを含んでいる（図１０）。複製起
点はＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩによる切断で除去され、ｎ
ｅｏ選択マーカー遺伝子（ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ約
１．８ｋｂ断片としてプラスミドｐＣＭＶＩＥ−ＡＫ１
−ＤＨＦＲから誘導される）及びＩｇＨ鎖エンハンサー
（鋳型としてヒトＤＮＡ及びプライマー対として図７で
示されたオリゴデオキシヌクレオチドを用いたＰＣＲ増
幅断片をＢｇｌＩＩ及びＫｐｎＩで切断後に得られる）
を表す２断片で置き換えられる。得られる発現ベクター
はネオマイシン遺伝子の転写に関与するＴＫプロモータ
ーの小部分を欠くことがわかっている。これは図７で示
されるプライマー対を用いてＣＭＶＩＥ−ＡＫ１−ＤＨ
ＦＲ ＤＮＡから誘導される約０．１４ｋｂＰＣＲ増幅
断片をＥｃｏＲＩ部位への挿入することで置き換えられ
る。得られるＨ鎖発現ベクター（ｐ８９４１）は標準的
操作を用いて指定されたＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ部
位の除去により修正される。ヒグロマイシンＢ選択マー
カーを発現するベクターに変換させるため、ネオマイシ
ン耐性カセットを、最初ＥｃｏＲＩ切断、しかる後５’
突出部をＤＮＡポリメラーゼで補足し、次いでＳａｌＩ
で切断して除去する。約１．９ｋｂヒグロマイシンＢ発
現カセット、ＴＫプロモーター及びヒグロマイシンＢ遺
伝子に隣接するＴＫポリアデニル化シグナル〔グリッツ
及びデービス、ジーン、第２５巻、第１７９−１８８
頁、１９８１年（Ｇritz and Ｄavies, Ｇene ２５：１
７９−１８８（１９８１））のプラスミドｐＬ６９０に
おいて１．８ｋｂ ＢａｍＨＩ断片として得られる〕は
ＢａｍＨＩ切断によりプラスミドｐＡＬ２から取り出
し、中間ベクターｐＳＰ７２のＢａｍＨＩ部位に組込ん
でサブクローニングする。ヒグロマイシンＢカセットは
ＳｍａＩ及びＳａｌＩ切断によりこのベクターから取出
され、前記のようにブラント末端及びＳａｌＩ末端ＤＮ
Ａ断片を持つよう直鎖化された発現ベクターに組込んで
クローニングされる。
【００１６】１Ｂ４ ＣＤＲ移入κＬ鎖の発現は、ｐＳ
Ｐ７２ベース中間クローニングベクター（ｐ８９５２）
からヒグロマイシンＢ選択真核細胞発現ベクターにこの
シストロンを移して行われる。ＳｐｅＩ及びＣｌａＩに
よるｐ８９５２のエンドヌクレアーゼ切断で得られる約
１．５ｋｂ ＤＮＡ断片は、アガロースゲル電気泳動で
精製され、２種の同制限酵素切断で既に直鎖化された発
現ベクターに結合され、アガロースゲルで精製される。
Ｈ鎖真核細胞発現ベクターは２ステップで組立てられる
（図１１参照）。最初に、マウス１Ｂ４ｋｂ断片の修正
Ｈ鎖可変領域を含むｐ８９５０ベクターをＢｇｌＩＩ及
びＢａｍＨＩで切断する。アガロースゲル精製した０．
７５ｋｂ断片は、ｐ８９４１ベクターのＢａｍＨＩ部位
に結合され、適正な向きでこの断片を含む組換えクロー
ンが同定される。このようなクローンの１つから得られ
たプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ切断で直鎖化し、ＰＣ
Ｒ増幅でプラスミドｐＡＴ８４から誘導されるヒトγ４
不変領域の短小体を表す１．７８ｋｂ ＢａｍＨＩ断片
と結合させる。適切な向きでこれらのインサートを含む
クローンを同定した後、プラスミドＤＮＡ（ｐ８９５３
と称されるＤＮＡ）を増殖させ、受容体哺乳動物細胞へ
のトランスフェクトのために精製する。ヒト化モノクロ
ーナル抗体発現用の宿主細胞としては格別限定されず、
２９３細胞のようなヒト細胞、ＣＯＳ−７及びＣＶ−１
Ｐのようなサル細胞並びにＣＨＯ及びＮＳＯのような他
の哺乳動物細胞がある。キメラＩｇＧ４Ｈ鎖及び１Ｂ４
ＣＤＲ移入κＬ鎖についてコードするプラスミド約１
０μｇを等量用いて標準的リン酸カルシウム法によって
ヒト２９３細胞、サル細胞ＣＯＳ−７及びＣＶ−１Ｐに
トランスフェクトさせる。培養上澄はヒトＩｇＧ４／κ
免疫グロブリンの分泌に関してトラッピングＥＬＩＳＡ
（下記）により調べられる。このＥＬＩＳＡアッセイは
ならし哺乳動物細胞増殖培地で発現されるヒト化１Ｂ４
組換え抗体の定量にも用いられる。イムロン−２（Ｉmm
ulon−２）〔ダイナテック・ラブス（Ｄynatech Ｌab
s）〕９６ウェルプレートは、約４℃の約０.１Ｍ Ｎａ
ＨＣＯ3緩衝液（ｐＨ８．２）中マウス抗ヒトκ鎖不変
ドメインモノクローナル抗体〔カタログ＃ＭＣ００９、
ザ・バインディング・サイト社（Ｔhe Ｂinding Ｓite,
Ｉnc.）、サンジェゴ、カリフォルニア州〕の溶液約５
μｇ／ｍｌで一夜被覆し、約０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3中
の約１％牛血清（ＢＳＡ）で約１時間約２５℃にてブロ
ックする。これ及び以後すべてのステップにおいて、洗
浄はリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で行われた。次いでウェル
に、組換え抗ＣＤ１８抗体含有ならし培地又はヒトＩｇ
Ｇ４ミエローマ血清（カタログ＃ＢＰ０２６、ザ・バイ
ンディング・サイト社）からプロテインＡセファロース
〔ファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Ｐharmacia
Ｆine Ｃhemicals）〕クロマトグラフィーにより精製さ
れた既定量のヒトＩｇＧ４κを加える。全サンプルは
０.０５％Ｔween ２０を含むＰＢＳで希釈し、約１００
μｌを３連で約３７℃で約１時間インキュベートする。
標準校正曲線を約１０〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲内の
ＩｇＧ４濃度を用いて作成する。結合されかつ十分にア
センブリーされたヒトＩｇＧ４（天然又は組換え１Ｂ４
ヒトＩｇＧ４構造体）は、約１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝
液（ＰＢＳ）中アルカリホスファターゼを結合したマウ
ス抗ヒトＩｇＧ４Ｆｃモノクローナル抗体〔カタログ＃
０５−３８２２、ザイムド・ラボラトリーズ社（Ｚymed
Ｌaboratories, Ｉnc）〕の１：５００希釈液約１００
μｌで検出される。約３７℃で約１時間のインキュベー
ト及び次いで洗浄の後に、結合複合体の量はすべてのサ
ンプルをｐＨ１０.３の０.１Ｍ ２，２’−アミノメチ
ルプロパンジオール緩衝液中ｐ−ニトロフェニルホスフ
ェートの１ｍｇ／ｍｌ溶液と共に約２５℃で約３０分間
インキュベートすることにより検出される。ウェルの吸
光度は４０５ｎｍにセットされたＵＶマックスＥＬＩＳ
Ａプレートリーダー〔モレキュラー・デバイセス（Ｍol
ecular Ｄevices）〕で読取る。トランスフェクトされ
た細胞の上澄液はすべて、様々な量でこの免疫グロブリ
ンを含有することがわかった（図１２）。トランスフェ
クトされた２９３細胞から分泌される抗体は、プロテイ
ンＡクロマトグラフィーにより単離された。前記トラッ
ピングＥＬＩＳＡで測定された組換えヒト抗ＣＤ１８抗
体の濃度は、活性化ヒトＰＭＮの表面上におけるＣＤ１
８リガンドへの放射線標識ネズミ１Ｂ４の結合と競合さ
せるために用いられる。様々な組換えヒト抗ＣＤ１８
（γ−ｈ−抗ＣＤ１８）抗体構築体の親和性は、刺激さ
れたヒト多形核白血球（ＰＭＮ）との競合的125Ｉ−１
Ｂ４可溶性結合アッセイを用いて調べられる。精製され
たネズミ抗ＣＤ１８モノクローナル抗体（５０μｇ）が
クロラミンＴを用いてヨウ素化され〔ハンター（Ｈunte
r）及びグリーンウッド（Ｇreenwood）、ネーチャー、
第１９４巻、第４９５−４９６頁、１９６２年〕、放射
線標識抗体はｐＨ０．１Ｍリン酸緩衝液で平衡化された
バイオ・シル（Ｂio−Ｓil）ＴＳＫ２５０〔バイオラッ
ド（Ｂiorad）〕ゲル濾過ＨＰＬＣカラム（１〜３００
×１０3ドルトンの範囲内でタンパク質を分別する）を
用いて精製される。溶出放射能はインライン検出器〔ベ
ックマンモデル１７０；ベックマン（Ｂeckman）〕でモ
ニターされ、全タンパク質がクラトス・スペクトロフロ
ー（Ｋratos Ｓpectroflow）７５７検出器（クラトス）
によりＯＤ280で測定される。ＯＤ280及び放射能トレー
シングが一致する単一125Ｉ−１Ｂ４ピークはサンプル
注入後約６分３０秒で特徴的に溶出する。生成物の比活
性は通常約１０μＣｉ／μｇタンパク質であり、カウン
トの９７〜９９％が１０％トリクロロ酢酸で沈降しう
る。この放射線標識抗体の結合性は不連続フィコール／
ハイパーク（Ｆicoll／Ｈypaque）勾配で精製され、
〔イングリッシュ及びアンダーソン、ジャーナル・オブ
・イムノロジカル・メソッズ、第５巻、第２４９−２５
５頁、１９７４年（Ｅnglish and Ａnderson, Ｊ.Ｉmmu
nol. Ｍethods, ５：２４９−２５５、１９７４）〕、
ミリスチン酸酢酸ホルボール約１００ｎｇ／ｍｌにより
約３７℃で約２０分間かけて活性化される（ローら、ジ
ャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン、第
１６９巻、第１７７９−１７９３頁、１９８９年）ヒト
ＰＭＮを用いて評価される。ＰＭＮ表面上のＣＤ１８分
子に関する抗体の結合活性を測定するため、約１×１０
5の活性化ＰＭＮを約２０ｍＭヘベス（ｐＨ７．２）、
約０．１４単位アプロチニン（シグマ・ケミカル社）及
び約２％ヒト血清アルブミン（結合緩衝液）含有ハンク
ス平衡塩溶液のような約１．３ｎｇ125Ｉ−１Ｂ４
（２．８×１０-11Ｍ）を含有した緩衝液中未標識１Ｂ
４抗体の濃度（約１０-7〜１０-15Ｍ）を増加させなが
ら約３００μｌの反応液容量中約４℃で約１時間一定攪
拌下でインキュベートする。細胞結合１Ｂ４は０．５Ｍ
スクロースクッションでの遠心（４８００×ｇ、３分
間）により未結合抗体から分離され、管はドライアイス
で凍結して、先端を切取り、ＬＫＢガンマカウンターで
計数される。125Ｉ−１Ｂ４抗体結合の阻害に関する抗
ＣＤ１８抗体のＩＣ50は４パラメーター適合プログラム
を用いて計算される〔ロドバードら、“医学におけるラ
ジオイムノアッセイ及び関連操作”、インターナショナ
ル・アトミック・エナジー・エージェンシー、ウィー
ン、第１巻、第４６９−５０４頁、１９７８年（Ｒodba
rd etal., Ｉn“Ｒadioimmunoassay and Ｒelated Ｐro
cedures in Ｍedicine”、Ｉnternational Ａtomic Ｅne
rgy Ａgency, Ｖienna, ｖoｌＩ、４６９−５０４、１
９７８）〕。ＣＤ１８リガンドに関する様々な組換えヒ
ト化抗ＣＤ１８（γ−ｈ−抗ＣＤ１８）抗体の親和性
は、ネズミ 125Ｉ−１Ｂ４抗体を用いかつトラッピング
ＥＬＩＳＡで測定されるように未標識γ−ｈ−抗ＣＤ１
８の量を増加させながら同様の方法で調べられる。結合
アッセイの結果は図１３で示され、キメラＨ鎖／移入Ｌ
鎖組換え１Ｂ４抗体の結合活性がマウス１Ｂ４モノクロ
ーナル抗体の場合とほぼ等しいことを示している。
Ｐ７２ベース中間クローニングベクター（ｐ８９５２）
からヒグロマイシンＢ選択真核細胞発現ベクターにこの
シストロンを移して行われる。ＳｐｅＩ及びＣｌａＩに
よるｐ８９５２のエンドヌクレアーゼ切断で得られる約
１．５ｋｂ ＤＮＡ断片は、アガロースゲル電気泳動で
精製され、２種の同制限酵素切断で既に直鎖化された発
現ベクターに結合され、アガロースゲルで精製される。
Ｈ鎖真核細胞発現ベクターは２ステップで組立てられる
（図１１参照）。最初に、マウス１Ｂ４ｋｂ断片の修正
Ｈ鎖可変領域を含むｐ８９５０ベクターをＢｇｌＩＩ及
びＢａｍＨＩで切断する。アガロースゲル精製した０．
７５ｋｂ断片は、ｐ８９４１ベクターのＢａｍＨＩ部位
に結合され、適正な向きでこの断片を含む組換えクロー
ンが同定される。このようなクローンの１つから得られ
たプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ切断で直鎖化し、ＰＣ
Ｒ増幅でプラスミドｐＡＴ８４から誘導されるヒトγ４
不変領域の短小体を表す１．７８ｋｂ ＢａｍＨＩ断片
と結合させる。適切な向きでこれらのインサートを含む
クローンを同定した後、プラスミドＤＮＡ（ｐ８９５３
と称されるＤＮＡ）を増殖させ、受容体哺乳動物細胞へ
のトランスフェクトのために精製する。ヒト化モノクロ
ーナル抗体発現用の宿主細胞としては格別限定されず、
２９３細胞のようなヒト細胞、ＣＯＳ−７及びＣＶ−１
Ｐのようなサル細胞並びにＣＨＯ及びＮＳＯのような他
の哺乳動物細胞がある。キメラＩｇＧ４Ｈ鎖及び１Ｂ４
ＣＤＲ移入κＬ鎖についてコードするプラスミド約１
０μｇを等量用いて標準的リン酸カルシウム法によって
ヒト２９３細胞、サル細胞ＣＯＳ−７及びＣＶ−１Ｐに
トランスフェクトさせる。培養上澄はヒトＩｇＧ４／κ
免疫グロブリンの分泌に関してトラッピングＥＬＩＳＡ
（下記）により調べられる。このＥＬＩＳＡアッセイは
ならし哺乳動物細胞増殖培地で発現されるヒト化１Ｂ４
組換え抗体の定量にも用いられる。イムロン−２（Ｉmm
ulon−２）〔ダイナテック・ラブス（Ｄynatech Ｌab
s）〕９６ウェルプレートは、約４℃の約０.１Ｍ Ｎａ
ＨＣＯ3緩衝液（ｐＨ８．２）中マウス抗ヒトκ鎖不変
ドメインモノクローナル抗体〔カタログ＃ＭＣ００９、
ザ・バインディング・サイト社（Ｔhe Ｂinding Ｓite,
Ｉnc.）、サンジェゴ、カリフォルニア州〕の溶液約５
μｇ／ｍｌで一夜被覆し、約０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3中
の約１％牛血清（ＢＳＡ）で約１時間約２５℃にてブロ
ックする。これ及び以後すべてのステップにおいて、洗
浄はリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で行われた。次いでウェル
に、組換え抗ＣＤ１８抗体含有ならし培地又はヒトＩｇ
Ｇ４ミエローマ血清（カタログ＃ＢＰ０２６、ザ・バイ
ンディング・サイト社）からプロテインＡセファロース
〔ファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Ｐharmacia
Ｆine Ｃhemicals）〕クロマトグラフィーにより精製さ
れた既定量のヒトＩｇＧ４κを加える。全サンプルは
０.０５％Ｔween ２０を含むＰＢＳで希釈し、約１００
μｌを３連で約３７℃で約１時間インキュベートする。
標準校正曲線を約１０〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲内の
ＩｇＧ４濃度を用いて作成する。結合されかつ十分にア
センブリーされたヒトＩｇＧ４（天然又は組換え１Ｂ４
ヒトＩｇＧ４構造体）は、約１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝
液（ＰＢＳ）中アルカリホスファターゼを結合したマウ
ス抗ヒトＩｇＧ４Ｆｃモノクローナル抗体〔カタログ＃
０５−３８２２、ザイムド・ラボラトリーズ社（Ｚymed
Ｌaboratories, Ｉnc）〕の１：５００希釈液約１００
μｌで検出される。約３７℃で約１時間のインキュベー
ト及び次いで洗浄の後に、結合複合体の量はすべてのサ
ンプルをｐＨ１０.３の０.１Ｍ ２，２’−アミノメチ
ルプロパンジオール緩衝液中ｐ−ニトロフェニルホスフ
ェートの１ｍｇ／ｍｌ溶液と共に約２５℃で約３０分間
インキュベートすることにより検出される。ウェルの吸
光度は４０５ｎｍにセットされたＵＶマックスＥＬＩＳ
Ａプレートリーダー〔モレキュラー・デバイセス（Ｍol
ecular Ｄevices）〕で読取る。トランスフェクトされ
た細胞の上澄液はすべて、様々な量でこの免疫グロブリ
ンを含有することがわかった（図１２）。トランスフェ
クトされた２９３細胞から分泌される抗体は、プロテイ
ンＡクロマトグラフィーにより単離された。前記トラッ
ピングＥＬＩＳＡで測定された組換えヒト抗ＣＤ１８抗
体の濃度は、活性化ヒトＰＭＮの表面上におけるＣＤ１
８リガンドへの放射線標識ネズミ１Ｂ４の結合と競合さ
せるために用いられる。様々な組換えヒト抗ＣＤ１８
（γ−ｈ−抗ＣＤ１８）抗体構築体の親和性は、刺激さ
れたヒト多形核白血球（ＰＭＮ）との競合的125Ｉ−１
Ｂ４可溶性結合アッセイを用いて調べられる。精製され
たネズミ抗ＣＤ１８モノクローナル抗体（５０μｇ）が
クロラミンＴを用いてヨウ素化され〔ハンター（Ｈunte
r）及びグリーンウッド（Ｇreenwood）、ネーチャー、
第１９４巻、第４９５−４９６頁、１９６２年〕、放射
線標識抗体はｐＨ０．１Ｍリン酸緩衝液で平衡化された
バイオ・シル（Ｂio−Ｓil）ＴＳＫ２５０〔バイオラッ
ド（Ｂiorad）〕ゲル濾過ＨＰＬＣカラム（１〜３００
×１０3ドルトンの範囲内でタンパク質を分別する）を
用いて精製される。溶出放射能はインライン検出器〔ベ
ックマンモデル１７０；ベックマン（Ｂeckman）〕でモ
ニターされ、全タンパク質がクラトス・スペクトロフロ
ー（Ｋratos Ｓpectroflow）７５７検出器（クラトス）
によりＯＤ280で測定される。ＯＤ280及び放射能トレー
シングが一致する単一125Ｉ−１Ｂ４ピークはサンプル
注入後約６分３０秒で特徴的に溶出する。生成物の比活
性は通常約１０μＣｉ／μｇタンパク質であり、カウン
トの９７〜９９％が１０％トリクロロ酢酸で沈降しう
る。この放射線標識抗体の結合性は不連続フィコール／
ハイパーク（Ｆicoll／Ｈypaque）勾配で精製され、
〔イングリッシュ及びアンダーソン、ジャーナル・オブ
・イムノロジカル・メソッズ、第５巻、第２４９−２５
５頁、１９７４年（Ｅnglish and Ａnderson, Ｊ.Ｉmmu
nol. Ｍethods, ５：２４９−２５５、１９７４）〕、
ミリスチン酸酢酸ホルボール約１００ｎｇ／ｍｌにより
約３７℃で約２０分間かけて活性化される（ローら、ジ
ャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン、第
１６９巻、第１７７９−１７９３頁、１９８９年）ヒト
ＰＭＮを用いて評価される。ＰＭＮ表面上のＣＤ１８分
子に関する抗体の結合活性を測定するため、約１×１０
5の活性化ＰＭＮを約２０ｍＭヘベス（ｐＨ７．２）、
約０．１４単位アプロチニン（シグマ・ケミカル社）及
び約２％ヒト血清アルブミン（結合緩衝液）含有ハンク
ス平衡塩溶液のような約１．３ｎｇ125Ｉ−１Ｂ４
（２．８×１０-11Ｍ）を含有した緩衝液中未標識１Ｂ
４抗体の濃度（約１０-7〜１０-15Ｍ）を増加させなが
ら約３００μｌの反応液容量中約４℃で約１時間一定攪
拌下でインキュベートする。細胞結合１Ｂ４は０．５Ｍ
スクロースクッションでの遠心（４８００×ｇ、３分
間）により未結合抗体から分離され、管はドライアイス
で凍結して、先端を切取り、ＬＫＢガンマカウンターで
計数される。125Ｉ−１Ｂ４抗体結合の阻害に関する抗
ＣＤ１８抗体のＩＣ50は４パラメーター適合プログラム
を用いて計算される〔ロドバードら、“医学におけるラ
ジオイムノアッセイ及び関連操作”、インターナショナ
ル・アトミック・エナジー・エージェンシー、ウィー
ン、第１巻、第４６９−５０４頁、１９７８年（Ｒodba
rd etal., Ｉn“Ｒadioimmunoassay and Ｒelated Ｐro
cedures in Ｍedicine”、Ｉnternational Ａtomic Ｅne
rgy Ａgency, Ｖienna, ｖoｌＩ、４６９−５０４、１
９７８）〕。ＣＤ１８リガンドに関する様々な組換えヒ
ト化抗ＣＤ１８（γ−ｈ−抗ＣＤ１８）抗体の親和性
は、ネズミ 125Ｉ−１Ｂ４抗体を用いかつトラッピング
ＥＬＩＳＡで測定されるように未標識γ−ｈ−抗ＣＤ１
８の量を増加させながら同様の方法で調べられる。結合
アッセイの結果は図１３で示され、キメラＨ鎖／移入Ｌ
鎖組換え１Ｂ４抗体の結合活性がマウス１Ｂ４モノクロ
ーナル抗体の場合とほぼ等しいことを示している。
【００１７】前記結果は、ヒトイソタイプを有する抗体
が第１の動物（マウス）Ｌ鎖枠組み構造からヒトκ定常
領域と融合された第２の動物（ヒト）Ｌ鎖枠組み構造へ
の抗原結合ドメインへ移転された後、キメラＨ鎖（ヒト
γ４不変ドメインに融合されたネズミＨ鎖可変領域）と
組合されると、抗原に関する結合活性の喪失なしに組換
え発現できることを示す。ヒトＲＥＩ Ｌ鎖枠組み構造
領域はネズミ１Ｂ４Ｌ鎖ＣＤＲの表現を変えることはな
い、及び／又は抗体結合活性に対するＬ鎖ＣＤＲの寄与
度が最少であることがこの結果から推論される。ネズミ
モノクローナル抗体内で見出されるもので置き換えられ
た相補性領域を含む組換えヒト抗体に関する多数の組立
て例では、リガンド又は抗原に関する結合活性が失われ
ている。このためこれらの変換は可能であるが、結合活
性維持に成功することは保証されない。下記操作は、厳
格な注意を枠組み構造領域に払った場合には、ＣＤＲド
メインを１９８７年９月３０日付で公開されたウインタ
ー（Ｗinter）の欧州特許公開第２３９，４００号で用
いられた“属性”枠組み構造へ、移転に伴う結合活性の
喪失なしに移すことができることを証明している。
が第１の動物（マウス）Ｌ鎖枠組み構造からヒトκ定常
領域と融合された第２の動物（ヒト）Ｌ鎖枠組み構造へ
の抗原結合ドメインへ移転された後、キメラＨ鎖（ヒト
γ４不変ドメインに融合されたネズミＨ鎖可変領域）と
組合されると、抗原に関する結合活性の喪失なしに組換
え発現できることを示す。ヒトＲＥＩ Ｌ鎖枠組み構造
領域はネズミ１Ｂ４Ｌ鎖ＣＤＲの表現を変えることはな
い、及び／又は抗体結合活性に対するＬ鎖ＣＤＲの寄与
度が最少であることがこの結果から推論される。ネズミ
モノクローナル抗体内で見出されるもので置き換えられ
た相補性領域を含む組換えヒト抗体に関する多数の組立
て例では、リガンド又は抗原に関する結合活性が失われ
ている。このためこれらの変換は可能であるが、結合活
性維持に成功することは保証されない。下記操作は、厳
格な注意を枠組み構造領域に払った場合には、ＣＤＲド
メインを１９８７年９月３０日付で公開されたウインタ
ー（Ｗinter）の欧州特許公開第２３９，４００号で用
いられた“属性”枠組み構造へ、移転に伴う結合活性の
喪失なしに移すことができることを証明している。
【００１８】例えばマウス１Ｂ４のＣＤＲと適合するヒ
ト枠組み構造配列を確認するため、ネズミ１Ｂ４の場合
と高度の配列類似性を有するヒト枠組み構造が調べられ
た。配列類似性は同一残基及び進化的保存アミノ酸置換
を用いて測定された。類似性研究はＣＤＲ配列が除去さ
れたネズミ１Ｂ４枠組み構造配列を用いて行われた。こ
の配列は、多数源から誘導されたヒト免疫グロブリン配
列のデータベースについて調べるために用いられた。高
度の配列類似性を有する配列は、ヒト化枠組み構造配列
としてのそれらの可能性に関して個別に試験された。特
別な注意が抗体表面上に位置又は露出されていない枠組
み構造残基に払われねばならないが、その理由はこれら
の残基がＣＤＲ支持骨格のパッキング上重要な役割を果
たすからである。天然ネズミ枠組み構造と最も類似した
構造をネズミＣＤＲに与えるヒト相同体が後のヒト化可
変領域組立てのために選択された（図１４参照）。本発
明において、移入用に選択されるＨ及びＬ鎖枠組み構造
配列は同一ヒト抗体から誘導されなくてもよいことに留
意すべきである。即ち、ヒト枠組み構造を選択するため
の前記基準を用いて、全集積ヒト核酸及びタンパク質デ
ータベースが望ましい適合配列に関して調査されてもよ
い。理想的なＬ鎖枠組み構造は１つの免疫グロブリン配
列に由来するであろうが、Ｈ鎖枠組み構造は他に由来し
てもよい。十分な類似性のヒト枠組み構造が編集された
配列と一致しない場合には、組換え技術を用いてヒトゲ
ノムＤＮＡから密接に関連した可変領域群を単離するこ
とが可能である。このため、縮重５’上流オリゴデオキ
シヌクレオチドプライマーは様々なヒトＦＲ１領域の各
アミノ末端内における保存配列からデザインされ、ヒト
構造体中に移したいと思うＣＤＲのネズミモノクローナ
ルから決定されるＦＲ３配列から形成される縮重３’下
流オリゴデオキシヌクレオチドプライマーと対合され
る。次いでこれらのプライマー対は、プライマー対で隣
接されるＤＮＡ配列をヒトゲノム鋳型からＰＣＲ増幅さ
せるために用いられる。次いで得られたＤＮＡはクロー
ニングされ、個々のものから誘導されるＤＮＡ配列は様
々なネズミ関連ヒト可変領域について表す。枠組み構造
残基における体細胞変異の少数化及びマウス及びヒト間
のアミノ酸配列保存は、このアプローチを可能にする。
ト枠組み構造配列を確認するため、ネズミ１Ｂ４の場合
と高度の配列類似性を有するヒト枠組み構造が調べられ
た。配列類似性は同一残基及び進化的保存アミノ酸置換
を用いて測定された。類似性研究はＣＤＲ配列が除去さ
れたネズミ１Ｂ４枠組み構造配列を用いて行われた。こ
の配列は、多数源から誘導されたヒト免疫グロブリン配
列のデータベースについて調べるために用いられた。高
度の配列類似性を有する配列は、ヒト化枠組み構造配列
としてのそれらの可能性に関して個別に試験された。特
別な注意が抗体表面上に位置又は露出されていない枠組
み構造残基に払われねばならないが、その理由はこれら
の残基がＣＤＲ支持骨格のパッキング上重要な役割を果
たすからである。天然ネズミ枠組み構造と最も類似した
構造をネズミＣＤＲに与えるヒト相同体が後のヒト化可
変領域組立てのために選択された（図１４参照）。本発
明において、移入用に選択されるＨ及びＬ鎖枠組み構造
配列は同一ヒト抗体から誘導されなくてもよいことに留
意すべきである。即ち、ヒト枠組み構造を選択するため
の前記基準を用いて、全集積ヒト核酸及びタンパク質デ
ータベースが望ましい適合配列に関して調査されてもよ
い。理想的なＬ鎖枠組み構造は１つの免疫グロブリン配
列に由来するであろうが、Ｈ鎖枠組み構造は他に由来し
てもよい。十分な類似性のヒト枠組み構造が編集された
配列と一致しない場合には、組換え技術を用いてヒトゲ
ノムＤＮＡから密接に関連した可変領域群を単離するこ
とが可能である。このため、縮重５’上流オリゴデオキ
シヌクレオチドプライマーは様々なヒトＦＲ１領域の各
アミノ末端内における保存配列からデザインされ、ヒト
構造体中に移したいと思うＣＤＲのネズミモノクローナ
ルから決定されるＦＲ３配列から形成される縮重３’下
流オリゴデオキシヌクレオチドプライマーと対合され
る。次いでこれらのプライマー対は、プライマー対で隣
接されるＤＮＡ配列をヒトゲノム鋳型からＰＣＲ増幅さ
せるために用いられる。次いで得られたＤＮＡはクロー
ニングされ、個々のものから誘導されるＤＮＡ配列は様
々なネズミ関連ヒト可変領域について表す。枠組み構造
残基における体細胞変異の少数化及びマウス及びヒト間
のアミノ酸配列保存は、このアプローチを可能にする。
【００１９】Ｈ及びＬ鎖可変ドメインがネズミモノクロ
ーナル抗体のＣＤＲ残基を含んで元のマウスモノクロー
ナル抗体の特異性及び結合活性を完全に保持した完全組
換えヒトＩｇＧ４抗体の組立てについて開示するもので
ある。ヒトκＬ鎖不変領域と融合されたＲＥＩのヒト配
列から誘導されるＣＤＲ移入Ｌ鎖枠組み構造の組立てに
ついても前記されている。
ーナル抗体のＣＤＲ残基を含んで元のマウスモノクロー
ナル抗体の特異性及び結合活性を完全に保持した完全組
換えヒトＩｇＧ４抗体の組立てについて開示するもので
ある。ヒトκＬ鎖不変領域と融合されたＲＥＩのヒト配
列から誘導されるＣＤＲ移入Ｌ鎖枠組み構造の組立てに
ついても前記されている。
【００２０】ＣＤＲ配列を欠くマウス可変領域枠組み構
造配列は、完全ヒト可変領域配列のデータベースを調べ
るために用いられる。次いでネズミ枠組み構造領域と最
も類似したヒト配列がネズミ枠組み構造領域とそれらの
配列同一性及び類似性の双方を調べるため個別に分析さ
れる。ネズミ１Ｂ４の場合にこれらの配列としては格別
限定されないが、ネズミ１Ｂ４Ｈ鎖配列と高度の類似性
及び同一性双方に基づき選択されるＧａｌ及びＪｏｎが
ある。ＧａｌＦＲはネズミ１Ｂ４と８５％類似及び７９
％同一であることが示され、一方ＪｏｎＦＲは１Ｂ４と
８８％類似及び７５％同一であることが示された。これ
らの値は進化的保存アミノ酸置換のデイホフ類似性マト
リックスに基づいている〔Ｒ．Ｍ．シュワルツ、Ｍ．
Ｏ．デイホフ、タンパク質配列及び構造のアトラス、
Ｍ．Ｏ．デイホフ編集（ナショナル・バイオメディカル
・リサーチ・ファンデーション、ワシントンＤＣ、１９
７９年）（Ｒ．Ｍ．Ｓchwartz, Ｍ．Ｏ．Ｄayhoff, in
Ａtlas of Ｐrotein sequenceand structure, Ｍ．Ｏ．
Ｄayhoff, Ｅds. （Ｎational Ｂiomedical Ｒesearch
Ｆoundation, Ｗashington, ＤＣ, １９７９））〕（図
１４参照）。これら枠組み構造の各々との関係でネズミ
Ｈ鎖ＣＤＲについてコードする組換えＤＮＡを製造する
ため、下記操作が行われる。
造配列は、完全ヒト可変領域配列のデータベースを調べ
るために用いられる。次いでネズミ枠組み構造領域と最
も類似したヒト配列がネズミ枠組み構造領域とそれらの
配列同一性及び類似性の双方を調べるため個別に分析さ
れる。ネズミ１Ｂ４の場合にこれらの配列としては格別
限定されないが、ネズミ１Ｂ４Ｈ鎖配列と高度の類似性
及び同一性双方に基づき選択されるＧａｌ及びＪｏｎが
ある。ＧａｌＦＲはネズミ１Ｂ４と８５％類似及び７９
％同一であることが示され、一方ＪｏｎＦＲは１Ｂ４と
８８％類似及び７５％同一であることが示された。これ
らの値は進化的保存アミノ酸置換のデイホフ類似性マト
リックスに基づいている〔Ｒ．Ｍ．シュワルツ、Ｍ．
Ｏ．デイホフ、タンパク質配列及び構造のアトラス、
Ｍ．Ｏ．デイホフ編集（ナショナル・バイオメディカル
・リサーチ・ファンデーション、ワシントンＤＣ、１９
７９年）（Ｒ．Ｍ．Ｓchwartz, Ｍ．Ｏ．Ｄayhoff, in
Ａtlas of Ｐrotein sequenceand structure, Ｍ．Ｏ．
Ｄayhoff, Ｅds. （Ｎational Ｂiomedical Ｒesearch
Ｆoundation, Ｗashington, ＤＣ, １９７９））〕（図
１４参照）。これら枠組み構造の各々との関係でネズミ
Ｈ鎖ＣＤＲについてコードする組換えＤＮＡを製造する
ため、下記操作が行われる。
【００２１】２組の４種長鎖オリゴデオキシヌクレオチ
ドが合成される。各組が組合された場合、それらは１Ｂ
４Ｈ鎖ＣＤＲ及び選択されたヒトＨ鎖可変領域枠組み構
造についてコードする。一組４つのオリゴデオキシヌク
レオチド各約１ｐｍｏｌがＴａｑポリメラーゼ及び各末
端増幅オリゴデオキシヌクレオチド約５０ｐｍｏｌとの
ＰＣＲ反応で組立てられる（図１５、図１６）。一本鎖
オリゴデオキシヌクレオチドの相補的末端により、ポリ
メラーゼ鎖反応の重合−変性−重合サイクルで組合せ配
列の形成しかる後増幅を行う。約２５サイクルの増幅
後、組合された０．４ｋｂ断片がアガロースゲルから電
気泳動で精製される。並行して、シグナルペプチドにつ
いてコードするアミノ末端配列、枠組み構造４について
コードするカルボキシ末端配列、スプライスドナー及び
イントロン配列を表す２種のＤＮＡ断片がオリゴデオキ
シヌクレオチドプライマー対（図１５）及びプラスミド
ＤＮＡ鋳型Ｍ１３ＶＨＰＣＲ１含有ＮＥＷＭ（前記）を
用いて増幅される。これら２種の断片が前記のようにア
ガロースゲル精製され、各々約１０ｎｇが増幅された移
入可変領域断片、Ｔａｑポリメラーゼ、各末端プライマ
ー（図１５）約５０ｐｍｏｌと混合され、混合物がＰＣ
Ｒ増幅された。得られた０．８５ｋｂ断片は制限酵素Ｓ
ｐｅＩ及びＢａｍＨＩで切断される。アガロースゲル電
気泳動後、精製されたＤＮＡ断片はキメラ可変領域の代
わりにＨ鎖発現ベクターｐ８９５８（図１１参照）に結
合される。この方法で、移入ネズミＣＤＲを含有した２
種の独特なＨ鎖枠組み構造（Ｊｏｎ／１Ｂ４及びＧａｌ
／１Ｂ４）が組立てられる。各完全移入Ｈ鎖発現ベクタ
ープラスミドは完全移入ＲＥＩ／１Ｂ４Ｌ鎖発現ベクタ
ープラスミドと共に２９３細胞に同時トランスフェクト
され、組換えヒト抗体はならし培地中に存在する。Ｇａ
ｌ／１Ｂ４：ＲＥＩ／１Ｂ４ヘテロ二量体ヒト（十分に
ヒト化された）組換え抗体はプロテインＡクロマトグラ
フィーにより単離される。活性化ヒトＰＭＮの表面に現
れるＣＤ１８リガンドに関するこの抗体の結合活性は、
前記キメラ／移入抗体及び１Ｂ４ネズミモノクローナル
親抗体の場合と比較される。図２０は、各ヘテロ二量体
抗体が同組の６ＣＤＲを含むけれども、それらがリガン
ドに関して同一の結合活性を示さないことを示してい
る。このため、抗体分子の結合活性はＣＤＲが導入され
る可変領域枠組み構造に依存している。親ネズミモノク
ローナル抗体は約０．５ｎＭのＩＣ50を示し、一方Ｇａ
ｌ／Ｒｅｉヘテロ二量体は約１．６ｎＭのＩＣ50を有す
る。
ドが合成される。各組が組合された場合、それらは１Ｂ
４Ｈ鎖ＣＤＲ及び選択されたヒトＨ鎖可変領域枠組み構
造についてコードする。一組４つのオリゴデオキシヌク
レオチド各約１ｐｍｏｌがＴａｑポリメラーゼ及び各末
端増幅オリゴデオキシヌクレオチド約５０ｐｍｏｌとの
ＰＣＲ反応で組立てられる（図１５、図１６）。一本鎖
オリゴデオキシヌクレオチドの相補的末端により、ポリ
メラーゼ鎖反応の重合−変性−重合サイクルで組合せ配
列の形成しかる後増幅を行う。約２５サイクルの増幅
後、組合された０．４ｋｂ断片がアガロースゲルから電
気泳動で精製される。並行して、シグナルペプチドにつ
いてコードするアミノ末端配列、枠組み構造４について
コードするカルボキシ末端配列、スプライスドナー及び
イントロン配列を表す２種のＤＮＡ断片がオリゴデオキ
シヌクレオチドプライマー対（図１５）及びプラスミド
ＤＮＡ鋳型Ｍ１３ＶＨＰＣＲ１含有ＮＥＷＭ（前記）を
用いて増幅される。これら２種の断片が前記のようにア
ガロースゲル精製され、各々約１０ｎｇが増幅された移
入可変領域断片、Ｔａｑポリメラーゼ、各末端プライマ
ー（図１５）約５０ｐｍｏｌと混合され、混合物がＰＣ
Ｒ増幅された。得られた０．８５ｋｂ断片は制限酵素Ｓ
ｐｅＩ及びＢａｍＨＩで切断される。アガロースゲル電
気泳動後、精製されたＤＮＡ断片はキメラ可変領域の代
わりにＨ鎖発現ベクターｐ８９５８（図１１参照）に結
合される。この方法で、移入ネズミＣＤＲを含有した２
種の独特なＨ鎖枠組み構造（Ｊｏｎ／１Ｂ４及びＧａｌ
／１Ｂ４）が組立てられる。各完全移入Ｈ鎖発現ベクタ
ープラスミドは完全移入ＲＥＩ／１Ｂ４Ｌ鎖発現ベクタ
ープラスミドと共に２９３細胞に同時トランスフェクト
され、組換えヒト抗体はならし培地中に存在する。Ｇａ
ｌ／１Ｂ４：ＲＥＩ／１Ｂ４ヘテロ二量体ヒト（十分に
ヒト化された）組換え抗体はプロテインＡクロマトグラ
フィーにより単離される。活性化ヒトＰＭＮの表面に現
れるＣＤ１８リガンドに関するこの抗体の結合活性は、
前記キメラ／移入抗体及び１Ｂ４ネズミモノクローナル
親抗体の場合と比較される。図２０は、各ヘテロ二量体
抗体が同組の６ＣＤＲを含むけれども、それらがリガン
ドに関して同一の結合活性を示さないことを示してい
る。このため、抗体分子の結合活性はＣＤＲが導入され
る可変領域枠組み構造に依存している。親ネズミモノク
ローナル抗体は約０．５ｎＭのＩＣ50を示し、一方Ｇａ
ｌ／Ｒｅｉヘテロ二量体は約１．６ｎＭのＩＣ50を有す
る。
【００２２】Ｇａｌ／ＲＥＩ移入ヘテロ二量体の高結合
活性に対するＨ及びＬ鎖可変領域の相対的寄与度を調べ
るため、１Ｂ４ＣＤＲ配列を含む第二Ｌ鎖及びＨ鎖枠組
み構造が組立てられた。Ｌｅｎ及び変異Ｇａｌ又はＧａ
ｌ−Ｍ１と命名されるこれらの枠組み構造が、ネズミ１
Ｂ４のＬ鎖ＦＲ及びＨ鎖ＦＲとそれらの高度な類似性の
ためにヒト免疫グロブリンデータベースから選択された
（図１４）。ＬｅｎＦＲはネズミ１Ｂ４と比較した場合
に９０％の類似性及び８１％の同一性を示す。ＣＤ１８
抗原又はレセプターと特異的に結合する得られた組換え
抗体は組換えヒト抗ＣＤ１８抗体（γ−ｈ−抗ＣＤ１８
Ａｂ）と称される。
活性に対するＨ及びＬ鎖可変領域の相対的寄与度を調べ
るため、１Ｂ４ＣＤＲ配列を含む第二Ｌ鎖及びＨ鎖枠組
み構造が組立てられた。Ｌｅｎ及び変異Ｇａｌ又はＧａ
ｌ−Ｍ１と命名されるこれらの枠組み構造が、ネズミ１
Ｂ４のＬ鎖ＦＲ及びＨ鎖ＦＲとそれらの高度な類似性の
ためにヒト免疫グロブリンデータベースから選択された
（図１４）。ＬｅｎＦＲはネズミ１Ｂ４と比較した場合
に９０％の類似性及び８１％の同一性を示す。ＣＤ１８
抗原又はレセプターと特異的に結合する得られた組換え
抗体は組換えヒト抗ＣＤ１８抗体（γ−ｈ−抗ＣＤ１８
Ａｂ）と称される。
【００２３】本発明は更に、細胞の流入後に炎症を起こ
す組織領域もしくは器官又は炎症部位への表面上でＣＤ
１８抗原（白血球インテグリン、β−２サブユニット）
を発現しうる白血球の流入又は移動の阻害方法にも関す
る。本発明の方法の標的でもある炎症は、グラム陽性及
びグラム陰性細菌、寄生虫並びに真菌のような病原微生
物での感染に起因する。その応答はウイルス及び外傷又
は心筋梗塞もしくは発作後の再灌流のような非感染源、
外来抗原の免疫応答並びに自己免疫応答によって誘導さ
れてもよい。
す組織領域もしくは器官又は炎症部位への表面上でＣＤ
１８抗原（白血球インテグリン、β−２サブユニット）
を発現しうる白血球の流入又は移動の阻害方法にも関す
る。本発明の方法の標的でもある炎症は、グラム陽性及
びグラム陰性細菌、寄生虫並びに真菌のような病原微生
物での感染に起因する。その応答はウイルス及び外傷又
は心筋梗塞もしくは発作後の再灌流のような非感染源、
外来抗原の免疫応答並びに自己免疫応答によって誘導さ
れてもよい。
【００２４】組換えヒト抗ＣＤ１８抗体は、肺、中枢神
経系、腎臓、関節、心内膜、心膜、目、耳、皮膚、胃腸
管及び泌尿器系における炎症の治療に有用である。組換
えヒト抗ＣＤ１８抗体が治療剤として有用である症状と
しては格別限定されず、活性感染がいずれかの体部位に
存在する髄膜炎のような感染疾患；抗原沈着で起きる慢
性又は急性二次炎症のような症状；脳炎、関節炎、ブド
ウ膜炎、大腸炎、糸球体腎炎、皮膚炎、乾癬並びに敗血
症及び／又は外傷に伴う呼吸窮迫症候群のような他の症
状がある。組換えヒト抗ＣＤ１８抗体に応答する他の炎
症疾患としては格別限定されず、急性及び遅延性過敏
症、移植片対宿主疾患のようなＴ細胞及び／又はマクロ
ファージ付着／認識を伴う免疫障害及び症状；悪性貧血
のような一次自己免疫症状；Ｉ型真正糖尿病のような感
染関連自己免疫症状；リウマチ様関節炎時の発赤；多発
性硬化症のような白血球漏出を伴う疾患；前記のある二
次感染状態を含めた抗原−抗体複合体媒介疾患；免疫抑
制；移植拒絶がある。成人呼吸窮迫症候群及び再灌流障
害のような毒性ショック又は外傷に基づく炎症症状；白
血球悪液質及び移動に基づく症状も本発明の範囲内に含
まれる。本発明は、組織内への色素又は画像増強剤の導
入時に白血球の侵入を妨げ、化学療法の場合に治療剤を
選択的に導入させ又は患者からの白血球回収を高めるた
めの内皮の医原的着手のような診断及び治療目的で白血
球−内皮結合の阻害にも適用可能である。
経系、腎臓、関節、心内膜、心膜、目、耳、皮膚、胃腸
管及び泌尿器系における炎症の治療に有用である。組換
えヒト抗ＣＤ１８抗体が治療剤として有用である症状と
しては格別限定されず、活性感染がいずれかの体部位に
存在する髄膜炎のような感染疾患；抗原沈着で起きる慢
性又は急性二次炎症のような症状；脳炎、関節炎、ブド
ウ膜炎、大腸炎、糸球体腎炎、皮膚炎、乾癬並びに敗血
症及び／又は外傷に伴う呼吸窮迫症候群のような他の症
状がある。組換えヒト抗ＣＤ１８抗体に応答する他の炎
症疾患としては格別限定されず、急性及び遅延性過敏
症、移植片対宿主疾患のようなＴ細胞及び／又はマクロ
ファージ付着／認識を伴う免疫障害及び症状；悪性貧血
のような一次自己免疫症状；Ｉ型真正糖尿病のような感
染関連自己免疫症状；リウマチ様関節炎時の発赤；多発
性硬化症のような白血球漏出を伴う疾患；前記のある二
次感染状態を含めた抗原−抗体複合体媒介疾患；免疫抑
制；移植拒絶がある。成人呼吸窮迫症候群及び再灌流障
害のような毒性ショック又は外傷に基づく炎症症状；白
血球悪液質及び移動に基づく症状も本発明の範囲内に含
まれる。本発明は、組織内への色素又は画像増強剤の導
入時に白血球の侵入を妨げ、化学療法の場合に治療剤を
選択的に導入させ又は患者からの白血球回収を高めるた
めの内皮の医原的着手のような診断及び治療目的で白血
球−内皮結合の阻害にも適用可能である。
【００２５】組換えヒト抗ＣＤ１８抗体又はその活性断
片は前記疾患を治療するために用いることができる。活
性断片としては、ＣＤ１８抗原と結合しうるＦ（ａ
ｂ’）2、Ｆａｂ及び他のいずれかの断片がある。組換
えヒト抗ＣＤ１８抗体は非感染病状のため単独で投与し
ても又は前記理由から感染疾患のため抗生物質もしくは
他の抗感染剤と組合せてもよい。投与剤は通常生理学上
許容される媒体又は製剤キャリア中に抗体及び他の物質
を含有している。このような生理学上許容される媒体又
は製剤キャリアとしては格別限定されず、生理塩水、リ
ン酸緩衝液、リン酸緩衝液グルコース、緩衝液その他が
ある。抗体及びいずれかの抗感染剤は、静脈内、筋肉
内、皮下及び腹腔内注射又はデリバリーを含めた非経口
経路で投与される。投薬形中における抗体及び混合物の
量は治療される具体的病状に依存している。投薬形で用
いられる組換えヒト抗ＣＤ１８抗体の量は約１〜約１０
００ｍｇの範囲内であるが、約１０〜約１００ｍｇの範
囲が好ましい。抗体は治療医で決定されるように毎日又
は毎日よりも少なく投与される。下記実施例は本発明に
ついて説明するが、しかしながら本発明をそれに限定す
るわけではない。
片は前記疾患を治療するために用いることができる。活
性断片としては、ＣＤ１８抗原と結合しうるＦ（ａ
ｂ’）2、Ｆａｂ及び他のいずれかの断片がある。組換
えヒト抗ＣＤ１８抗体は非感染病状のため単独で投与し
ても又は前記理由から感染疾患のため抗生物質もしくは
他の抗感染剤と組合せてもよい。投与剤は通常生理学上
許容される媒体又は製剤キャリア中に抗体及び他の物質
を含有している。このような生理学上許容される媒体又
は製剤キャリアとしては格別限定されず、生理塩水、リ
ン酸緩衝液、リン酸緩衝液グルコース、緩衝液その他が
ある。抗体及びいずれかの抗感染剤は、静脈内、筋肉
内、皮下及び腹腔内注射又はデリバリーを含めた非経口
経路で投与される。投薬形中における抗体及び混合物の
量は治療される具体的病状に依存している。投薬形で用
いられる組換えヒト抗ＣＤ１８抗体の量は約１〜約１０
００ｍｇの範囲内であるが、約１０〜約１００ｍｇの範
囲が好ましい。抗体は治療医で決定されるように毎日又
は毎日よりも少なく投与される。下記実施例は本発明に
ついて説明するが、しかしながら本発明をそれに限定す
るわけではない。
【００２６】実施例１ 移入／キメラ組換え抗体の製造 Ｌ鎖の可変ドメインがヒトＬ鎖の枠組み構造領域及びマ
ウスＬ鎖のＣＤＲを含み、Ｈ鎖の可変ドメインがネズミ
Ｈ鎖から完全に誘導される抗体を産生した。Ｌ鎖枠組み
構造領域は、結晶構造が決定されたヒトミエローマタン
パク質ＲＥＩ（オーランジら、プロシーディング・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、
第８６巻、第３８３３−３８３７頁、１９８９年；リー
チマンら、ネーチャー、第３３２巻、第３２３−３２７
頁、１９８８年；欧州特許出願公開第２３９，４００
号）から誘導した。ＣＤ１８（ＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１
及びｐ１５０．９５を含む白血球インテグリンβ−２群
のβサブユニット）と結合するネズミモノクローナル抗
体１Ｂ４からのＣＤＲ配列は下記のようにして誘導し
た。１Ｂ４モノクローナル抗体を産する１Ｂ４と命名さ
れたハイブリドーマはブタペスト条約に従い１２３０１
パークローン、ドライブ、ロックビル、メリーランド州
２０８５２の国際寄託機関：アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションに寄託された。生死判別は１９８
９年６月６日に調べられ、ハイブリドーマはＨＢ１０１
６４と命名された。過去の実験ではこの抗体をκＬ鎖の
あるＩｇＧ２ａと決定した（ライトら、プロシーディン
グ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
ＵＳＡ、第８０巻、第５６９９−５７０３頁、１９８３
年）。全ＲＮＡは細胞溶解をグアニジニウムイソチオシ
アネートで行う標準的方法を用いて１Ｂ４ミエローマ細
胞から抽出した（チャグウィンら、バイオケミストリ
ー、第１８巻、第５２９４−５２９９頁、１９７９
年）。ネズミκＬ鎖可変領域及びκＬ鎖不変ドメインの
枠組み構造１内の配列又はネズミＩｇＧ２ａＨ鎖可変領
域及びＨドメインの枠組み構造１内の配列を表す縮重オ
リゴヌクレオチドプライマーの組（図１）は、アプライ
ド・バイオシステム３８１Ａ ＤＮＡシンセサイザーで
標準ホスホラミジト操作により合成した。樹脂からのオ
リゴデオキシヌクレオチド（オリゴ）の除去は、製造業
者から勧められるように、濃ＮＨ4ＯＨでの処理しかる
後（オリゴが鎖長４５塩基以下である場合）Ｈ2Ｏ溶出
によるＮＡＰ−５カラム（ファルマシア）での脱塩又は
（オリゴが鎖長４５塩基以上である場合）２０％アセト
ニトリル溶出によるＯＰＣカラム（アプライド・バイオ
システムズ社）の使用によって行った。全ＲＮＡ（２μ
ｇ）をｐＨ８．３の５０ｍＭトリスＨＣｌ、７５ｍＭ
ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＤＴＴ及びＲ
ＮＡ ｓｉｎ（ファルマシア）２０単位含有緩衝液（最
終容量２０μｌ）中においてモロニーＭＬＶ逆転写酵素
（２００単位、ＢＲＬ）及びＨ又はＬ鎖を表す不変領域
相補鎖プライマー１０ｐｍｏｌを用い４２℃で３０分間
逆転写した。逆転写酵素を（９５℃、５分間）熱不活化
し、ＰＣＲ緩衝液（ｐＨ８．３の１０ｍＭトリスＨＣ
ｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．
０１％ゼラチン、２００μＭ各ｄＮＴＰ）１００μｌ中
に各対合プライマー５０ｐｍｏｌ及びＴａｑポリメラー
ゼ〔パーキン、エルマー／セタス（Ｐerkin Ｅlmer／Ｃ
etus）〕２．５単位を含有する反応液に調製した。ポリ
メラーゼ鎖反応（ＯＣＲ）増幅は、サイキら、サイエン
ス、第２３０巻、第１３５０−１３５４頁、１９８５年
及びその他〔ムリスら、コールド・スプリング・ハーバ
ー・シンポシア・オン・クアンテーティブ・バイオロジ
ー、第５１巻、第２６３−２７３頁、１９８６年（Ｍul
lis et al., Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｓymp. Ｑuant.
Ｂiol.,５１：２６３−２７３（１９８６））；ダワサ
キ及びワング、ＰＣＴテクノロジー、ＤＮＡ増幅に関す
る原理及び適用、エーリッヒ編集、ストックトン・プレ
ス、ニューヨーク、第８９−９７頁、１９８９年（Ｄaw
asaki and Ｗang, ＰＣＲ Ｔechnology, Ｐrinciples a
nd Ａpplications for ＤＮＡ Ａmplification, Ｅrlic
h,Ｅds., Ｓtockton Ｐress, ＮＹ, ｐｐ.８９−９７
（１９８９））；タング（Ｔｕｎｇ）ら、前掲、第９９
−１０４頁、１９８９年〕で記載されるようにして本質
的に行った。ＤＮＡサーマル・サイクラー（ＤＮＡ Ｔh
ermal Ｃycler）（パーキン・エルマー・セタス・イン
ストルメンツ）で４５サイクルの増幅（９４℃で２分
間；５５℃で２分間；７２℃で２分間）を行い、しかる
後予想４００＋塩基対（ｂｐ）ＤＮＡ断片（図２）をゲ
ル精製した。ＤＮＡをブラント末端化中間プラスミド
（ｐＳＰ７２、プロメガ）に組込んでサブクローニング
する前に、それらをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ〔ベ
ーリンガー・マンハイム（Ｂoehringer Ｍannheim）〕
で末端リン酸化した。凍結コンピテント大腸菌を氷上で
解凍し、１００μｌずつ湿潤氷冷ポリプロピレン管内に
分配した。結合混合物からのＤＮＡ（１〜１０ｎｇ）を
これらの管内に攪拌しながら加え、混合液を氷上で３０
分間インキュベートした。大腸菌細胞をインキュベート
下４２℃で４５秒間熱ショックさせ、しかる後氷で２分
間冷却した。室温Ｓ．Ｏ．Ｃ．（ハナハン、Ｄ., ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、第１６６
巻、第５５７頁、１９８３年）を加え、培養物を２２５
ｒｐｍ、３７℃で６０分間振盪した。一部の培養物を１
００μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ寒天プレート上に
拡散し、これらのプレートを３７℃で一夜インキュベー
トして、コロニー増殖させた。
ウスＬ鎖のＣＤＲを含み、Ｈ鎖の可変ドメインがネズミ
Ｈ鎖から完全に誘導される抗体を産生した。Ｌ鎖枠組み
構造領域は、結晶構造が決定されたヒトミエローマタン
パク質ＲＥＩ（オーランジら、プロシーディング・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ、
第８６巻、第３８３３−３８３７頁、１９８９年；リー
チマンら、ネーチャー、第３３２巻、第３２３−３２７
頁、１９８８年；欧州特許出願公開第２３９，４００
号）から誘導した。ＣＤ１８（ＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１
及びｐ１５０．９５を含む白血球インテグリンβ−２群
のβサブユニット）と結合するネズミモノクローナル抗
体１Ｂ４からのＣＤＲ配列は下記のようにして誘導し
た。１Ｂ４モノクローナル抗体を産する１Ｂ４と命名さ
れたハイブリドーマはブタペスト条約に従い１２３０１
パークローン、ドライブ、ロックビル、メリーランド州
２０８５２の国際寄託機関：アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションに寄託された。生死判別は１９８
９年６月６日に調べられ、ハイブリドーマはＨＢ１０１
６４と命名された。過去の実験ではこの抗体をκＬ鎖の
あるＩｇＧ２ａと決定した（ライトら、プロシーディン
グ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
ＵＳＡ、第８０巻、第５６９９−５７０３頁、１９８３
年）。全ＲＮＡは細胞溶解をグアニジニウムイソチオシ
アネートで行う標準的方法を用いて１Ｂ４ミエローマ細
胞から抽出した（チャグウィンら、バイオケミストリ
ー、第１８巻、第５２９４−５２９９頁、１９７９
年）。ネズミκＬ鎖可変領域及びκＬ鎖不変ドメインの
枠組み構造１内の配列又はネズミＩｇＧ２ａＨ鎖可変領
域及びＨドメインの枠組み構造１内の配列を表す縮重オ
リゴヌクレオチドプライマーの組（図１）は、アプライ
ド・バイオシステム３８１Ａ ＤＮＡシンセサイザーで
標準ホスホラミジト操作により合成した。樹脂からのオ
リゴデオキシヌクレオチド（オリゴ）の除去は、製造業
者から勧められるように、濃ＮＨ4ＯＨでの処理しかる
後（オリゴが鎖長４５塩基以下である場合）Ｈ2Ｏ溶出
によるＮＡＰ−５カラム（ファルマシア）での脱塩又は
（オリゴが鎖長４５塩基以上である場合）２０％アセト
ニトリル溶出によるＯＰＣカラム（アプライド・バイオ
システムズ社）の使用によって行った。全ＲＮＡ（２μ
ｇ）をｐＨ８．３の５０ｍＭトリスＨＣｌ、７５ｍＭ
ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＤＴＴ及びＲ
ＮＡ ｓｉｎ（ファルマシア）２０単位含有緩衝液（最
終容量２０μｌ）中においてモロニーＭＬＶ逆転写酵素
（２００単位、ＢＲＬ）及びＨ又はＬ鎖を表す不変領域
相補鎖プライマー１０ｐｍｏｌを用い４２℃で３０分間
逆転写した。逆転写酵素を（９５℃、５分間）熱不活化
し、ＰＣＲ緩衝液（ｐＨ８．３の１０ｍＭトリスＨＣ
ｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．
０１％ゼラチン、２００μＭ各ｄＮＴＰ）１００μｌ中
に各対合プライマー５０ｐｍｏｌ及びＴａｑポリメラー
ゼ〔パーキン、エルマー／セタス（Ｐerkin Ｅlmer／Ｃ
etus）〕２．５単位を含有する反応液に調製した。ポリ
メラーゼ鎖反応（ＯＣＲ）増幅は、サイキら、サイエン
ス、第２３０巻、第１３５０−１３５４頁、１９８５年
及びその他〔ムリスら、コールド・スプリング・ハーバ
ー・シンポシア・オン・クアンテーティブ・バイオロジ
ー、第５１巻、第２６３−２７３頁、１９８６年（Ｍul
lis et al., Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｓymp. Ｑuant.
Ｂiol.,５１：２６３−２７３（１９８６））；ダワサ
キ及びワング、ＰＣＴテクノロジー、ＤＮＡ増幅に関す
る原理及び適用、エーリッヒ編集、ストックトン・プレ
ス、ニューヨーク、第８９−９７頁、１９８９年（Ｄaw
asaki and Ｗang, ＰＣＲ Ｔechnology, Ｐrinciples a
nd Ａpplications for ＤＮＡ Ａmplification, Ｅrlic
h,Ｅds., Ｓtockton Ｐress, ＮＹ, ｐｐ.８９−９７
（１９８９））；タング（Ｔｕｎｇ）ら、前掲、第９９
−１０４頁、１９８９年〕で記載されるようにして本質
的に行った。ＤＮＡサーマル・サイクラー（ＤＮＡ Ｔh
ermal Ｃycler）（パーキン・エルマー・セタス・イン
ストルメンツ）で４５サイクルの増幅（９４℃で２分
間；５５℃で２分間；７２℃で２分間）を行い、しかる
後予想４００＋塩基対（ｂｐ）ＤＮＡ断片（図２）をゲ
ル精製した。ＤＮＡをブラント末端化中間プラスミド
（ｐＳＰ７２、プロメガ）に組込んでサブクローニング
する前に、それらをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ〔ベ
ーリンガー・マンハイム（Ｂoehringer Ｍannheim）〕
で末端リン酸化した。凍結コンピテント大腸菌を氷上で
解凍し、１００μｌずつ湿潤氷冷ポリプロピレン管内に
分配した。結合混合物からのＤＮＡ（１〜１０ｎｇ）を
これらの管内に攪拌しながら加え、混合液を氷上で３０
分間インキュベートした。大腸菌細胞をインキュベート
下４２℃で４５秒間熱ショックさせ、しかる後氷で２分
間冷却した。室温Ｓ．Ｏ．Ｃ．（ハナハン、Ｄ., ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、第１６６
巻、第５５７頁、１９８３年）を加え、培養物を２２５
ｒｐｍ、３７℃で６０分間振盪した。一部の培養物を１
００μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ寒天プレート上に
拡散し、これらのプレートを３７℃で一夜インキュベー
トして、コロニー増殖させた。
【００２７】これらのＰＣＲ増幅配列を表す多数のクロ
ーンを記載操作〔マニアティスら、分子クローニング、
実験マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニュー
ヨーク、１９８２年（Ｍaniatis et al., Ｍolecular
Ｃloning, Ａ Ｌaboratory Ｍanual, Ｃold ＳpringＨa
rbor Ｌaboratory, Ｃold Ｓpring Ｈarbor, ＮＹ, １
９８２）〕により増殖された５０μｇ／ｍｌアンピシリ
ン含有ＬＢ寒天プレート上のＤＨ５形質転換大腸菌から
単離し、プラスミドＤＮＡをバーンボイン（Ｂirnboi
n）及びドリー（Ｄoly）、ヌクレイック・アシッズ・リ
サーチ、第７巻、第１５１５頁、１９７９年のＤＮＡ製
造操作で細菌から抽出し、二本鎖プラスミドＤＮＡを製
造業者により勧められるプロトコールでシークエナーゼ
〔ユナイテッド・ステーツ・バイオケミカルズ（Ｕnite
d Ｓtates Ｂiochemicals）〕並びにＴ７及びＳＰ６特
異的配列決定プライマー（ベーリンガー・マンハイム）
を用いてＤＮＡ配列決定に付した。ネズミＩｇＧ２ａＨ
鎖可変領域を表す独特なＤＮＡ配列を得たが、但し２つ
のκＬ鎖可変領域がクローン化群内で示された（図
３）。どちらの配列が１Ｂ４ ＭＡｂに属するか識別す
るため、１Ｂ４ ＭＡｂをＤＴＴで還元し、精製された
Ｌ鎖をアプライド・バイオシステムズ４７７Ａシークエ
ンサーでＮ末端アミノ酸配列決定に付した。アミノ酸残
基の長さはｃＤＮＡから予想される１Ｂ４Ｌ鎖−１配列
内でみられるｍＭＡｂ １Ｂ４と同一であったが、１Ｂ
４ Ｌ鎖−２（図２５）がＭＡｂ １Ｂ４ Ｌ鎖の現実
的配列であると思われた。これはＬ鎖−１分子の決定さ
れたＤＮＡ配列（図２４）と一致し、それが結果的にペ
プチド鎖終結となる変異をＣＤＲ３／ＦＲ４領域中に含
むサブグループＩＩＩのネズミκＬ鎖可変領域を表すこ
とを示唆している。
ーンを記載操作〔マニアティスら、分子クローニング、
実験マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニュー
ヨーク、１９８２年（Ｍaniatis et al., Ｍolecular
Ｃloning, Ａ Ｌaboratory Ｍanual, Ｃold ＳpringＨa
rbor Ｌaboratory, Ｃold Ｓpring Ｈarbor, ＮＹ, １
９８２）〕により増殖された５０μｇ／ｍｌアンピシリ
ン含有ＬＢ寒天プレート上のＤＨ５形質転換大腸菌から
単離し、プラスミドＤＮＡをバーンボイン（Ｂirnboi
n）及びドリー（Ｄoly）、ヌクレイック・アシッズ・リ
サーチ、第７巻、第１５１５頁、１９７９年のＤＮＡ製
造操作で細菌から抽出し、二本鎖プラスミドＤＮＡを製
造業者により勧められるプロトコールでシークエナーゼ
〔ユナイテッド・ステーツ・バイオケミカルズ（Ｕnite
d Ｓtates Ｂiochemicals）〕並びにＴ７及びＳＰ６特
異的配列決定プライマー（ベーリンガー・マンハイム）
を用いてＤＮＡ配列決定に付した。ネズミＩｇＧ２ａＨ
鎖可変領域を表す独特なＤＮＡ配列を得たが、但し２つ
のκＬ鎖可変領域がクローン化群内で示された（図
３）。どちらの配列が１Ｂ４ ＭＡｂに属するか識別す
るため、１Ｂ４ ＭＡｂをＤＴＴで還元し、精製された
Ｌ鎖をアプライド・バイオシステムズ４７７Ａシークエ
ンサーでＮ末端アミノ酸配列決定に付した。アミノ酸残
基の長さはｃＤＮＡから予想される１Ｂ４Ｌ鎖−１配列
内でみられるｍＭＡｂ １Ｂ４と同一であったが、１Ｂ
４ Ｌ鎖−２（図２５）がＭＡｂ １Ｂ４ Ｌ鎖の現実
的配列であると思われた。これはＬ鎖−１分子の決定さ
れたＤＮＡ配列（図２４）と一致し、それが結果的にペ
プチド鎖終結となる変異をＣＤＲ３／ＦＲ４領域中に含
むサブグループＩＩＩのネズミκＬ鎖可変領域を表すこ
とを示唆している。
【００２８】ＭＡｂ １Ｂ４に独特なものによるヒトＲ
ＥＩ可変領域ＣＤＲの置き換えは下記のようにして生じ
た。ＲＥＩ枠組み構造（Ｍ１３ベクターＭ１３ＶＫＰＣ
Ｒ１のＲＦ形として得られる；オーランジら、プロシー
ディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンスＵＳＡ、第８６巻、第８３３頁、１９８９年）を
そのシグナルペプチドリーダー及びイントロン配列と共
にＮＥＷ又はＮＥＷＭＨ鎖可変領域枠組み構造（Ｍ１３
ベクターＭ１３ＶＨＰＣＲ１の形で得られる；オーラン
ジら、前掲）のまま中間ベクターｐＧＥＭ３Ｚ（プロメ
ガ）に組込んでサブクローニングした。ＰＣＲ増幅で４
種のＤＮＡ断片を形成させるために必要なプライマーを
表す８種のオリゴデオキシヌクレオチド（図４）を合成
した。ｍＭＡｂ １Ｂ４ Ｌ鎖ＣＤＲに対応する配列及
び５’末端相補性の少なくとも１５塩基を末端オリゴデ
オキシヌクレオチド以外のすべてに組込んだ（図５参
照）。適切なプライマー対（各５０ｐｍｏｌ）をＲＥＩ
枠組み構造含有プラスミドＤＮＡ１０ｎｇ、Ｔａｑ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ２．５単位、ＰＣＲ反応成分及び緩衝
液と混合し、約３０サイクルのＰＣＲ増幅を行った（前
記のようなサイクル時間）。アガロースゲル電気泳動で
精製された４反応の生成物（各ＤＮＡ断片１０ｎｇ）を
末端オリゴデオキシヌクレオチドプライマー対（アンプ
リファイア）（図４）、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、
ＰＣＲ反応成分及び緩衝液と共に混合し、しかる後組換
え断片を前記のように３０サイクルにわたり増幅させた
（図５参照）。ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで制限エン
ドヌクレアーゼ切断後、増幅されたＤＮＡをアガロース
ゲルから精製し、下記のようにして得たヒトκＬ鎖不変
領域を含む中間ベクターｐＳＰ７２（プロメガ）のこれ
ら同一部位に組込んでサブクローニングした。ヒトＢ細
胞系（ＧＭ０１０１８Ａ；ＮＩＧＭＳヒューマン・ゲネ
ティック・ミュータント・セル・レポジトリー、インス
ティチュート・フォア・メディカル・リサーチ、カムデ
ン、Ｎ．Ｊ．０８１０３）から精製されたＤＮＡ（１μ
ｇ）を図７で記載されたオリゴデオキシヌクレオチドプ
ライマーに関する鋳型として用い、ヒトκＬ鎖不変ドメ
イン、エキソン及びその３’非翻訳領域の一部に関する
スプライスアクセプターを含んだ９２０塩基対断片をＰ
ＣＲ増幅させた〔ＰＣＲプライマー対選択はヒーター
（Ｈieter）ら、セル、第２２巻、第１９７−２０７
頁、１９８０年で記載されたκ不変領域配列に基づき選
択された〕。ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動で
精製し、ＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼで切断し、既に
ＢａｍＨＩで直鎖化されたｐＳＰ７２（プロメガ）に組
込んでサブクローニングした。
ＥＩ可変領域ＣＤＲの置き換えは下記のようにして生じ
た。ＲＥＩ枠組み構造（Ｍ１３ベクターＭ１３ＶＫＰＣ
Ｒ１のＲＦ形として得られる；オーランジら、プロシー
ディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンスＵＳＡ、第８６巻、第８３３頁、１９８９年）を
そのシグナルペプチドリーダー及びイントロン配列と共
にＮＥＷ又はＮＥＷＭＨ鎖可変領域枠組み構造（Ｍ１３
ベクターＭ１３ＶＨＰＣＲ１の形で得られる；オーラン
ジら、前掲）のまま中間ベクターｐＧＥＭ３Ｚ（プロメ
ガ）に組込んでサブクローニングした。ＰＣＲ増幅で４
種のＤＮＡ断片を形成させるために必要なプライマーを
表す８種のオリゴデオキシヌクレオチド（図４）を合成
した。ｍＭＡｂ １Ｂ４ Ｌ鎖ＣＤＲに対応する配列及
び５’末端相補性の少なくとも１５塩基を末端オリゴデ
オキシヌクレオチド以外のすべてに組込んだ（図５参
照）。適切なプライマー対（各５０ｐｍｏｌ）をＲＥＩ
枠組み構造含有プラスミドＤＮＡ１０ｎｇ、Ｔａｑ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ２．５単位、ＰＣＲ反応成分及び緩衝
液と混合し、約３０サイクルのＰＣＲ増幅を行った（前
記のようなサイクル時間）。アガロースゲル電気泳動で
精製された４反応の生成物（各ＤＮＡ断片１０ｎｇ）を
末端オリゴデオキシヌクレオチドプライマー対（アンプ
リファイア）（図４）、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、
ＰＣＲ反応成分及び緩衝液と共に混合し、しかる後組換
え断片を前記のように３０サイクルにわたり増幅させた
（図５参照）。ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで制限エン
ドヌクレアーゼ切断後、増幅されたＤＮＡをアガロース
ゲルから精製し、下記のようにして得たヒトκＬ鎖不変
領域を含む中間ベクターｐＳＰ７２（プロメガ）のこれ
ら同一部位に組込んでサブクローニングした。ヒトＢ細
胞系（ＧＭ０１０１８Ａ；ＮＩＧＭＳヒューマン・ゲネ
ティック・ミュータント・セル・レポジトリー、インス
ティチュート・フォア・メディカル・リサーチ、カムデ
ン、Ｎ．Ｊ．０８１０３）から精製されたＤＮＡ（１μ
ｇ）を図７で記載されたオリゴデオキシヌクレオチドプ
ライマーに関する鋳型として用い、ヒトκＬ鎖不変ドメ
イン、エキソン及びその３’非翻訳領域の一部に関する
スプライスアクセプターを含んだ９２０塩基対断片をＰ
ＣＲ増幅させた〔ＰＣＲプライマー対選択はヒーター
（Ｈieter）ら、セル、第２２巻、第１９７−２０７
頁、１９８０年で記載されたκ不変領域配列に基づき選
択された〕。ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動で
精製し、ＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼで切断し、既に
ＢａｍＨＩで直鎖化されたｐＳＰ７２（プロメガ）に組
込んでサブクローニングした。
【００２９】ＲＥＩから誘導される１Ｂ４移入Ｌ鎖可変
領域及びヒトＤＮＡのＰＣＲ増幅で誘導されるヒトκ不
変領域を双方含んだｐＳＰ７２中間ベクターを表す個々
のクローン（ｐ８９８２）を用いて、移入Ｌ鎖可変領域
のＤＮＡ配列を調べた。組換え抗体のキメラＨ鎖部分は
フラナガン及びラビッツ、ネーチャー、第３００巻、第
７０９−７１２頁、１９８２年により組立てられたλラ
イブラリーから得られるγ４サブタイプのヒト不変領域
に融合されたネズミ１Ｂ４Ｈ鎖可変領域から誘導した。
キメラＨ鎖の可変領域はシグナル配列、ネズミ１Ｂ４Ｈ
鎖可変領域の一部及びイントロン配列を表す３種のＤＮ
Ａ断片から組立てた（図８）。ネズミ１Ｂ４ＣＤＲ配列
を決定するため既に用いられたＩｇＧ２ａＨ鎖領域を含
むｐＳＰ７２中間ベクター又はＮＥＷ Ｈ鎖可変領域
（Ｍ１３ＶＨＰＣＲ１）のいずれかを含んだプラスミド
ＤＮＡ鋳型１０ｎｇからＰＣＲ増幅によりこれら３種の
ＤＮＡ断片を得るために必要なプライマーを表すオリゴ
デオキシヌクレオチドプライマー対（図９）を合成し
た。２２５ｂｐシグナル断片、３５０ｂｐ可変領域断片
及び２３０ｂｐイントロン含有断片の増幅は前記のよう
に行った。アガロースゲル精製生成物（各生成物１０ｎ
ｇ）を末端プライマー対（図９）と混合し、１Ｂ４移入
ＲＥＩＬ鎖可変領域を含む断片を組換えるために前記さ
れた標準操作を用いてＰＣＲ形成インビトロ組換え鋳型
を増幅させた。ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩ切断中間ベク
ター（ｐＳＰ７２）（プロメガ）に組込んでサブクロー
ニングする前、この組換え生成物を同様に切断し、アガ
ロースゲル精製した。ＤＮＡを個別的細菌クローンの増
殖後に得て、再組立て可変領域及びその隣接ドメインの
配列を調べるためシークエナーゼ並びにＴ７及びＳＰ６
特異性配列決定プライマーを用いてＤＮＡ配列決定に付
した。
領域及びヒトＤＮＡのＰＣＲ増幅で誘導されるヒトκ不
変領域を双方含んだｐＳＰ７２中間ベクターを表す個々
のクローン（ｐ８９８２）を用いて、移入Ｌ鎖可変領域
のＤＮＡ配列を調べた。組換え抗体のキメラＨ鎖部分は
フラナガン及びラビッツ、ネーチャー、第３００巻、第
７０９−７１２頁、１９８２年により組立てられたλラ
イブラリーから得られるγ４サブタイプのヒト不変領域
に融合されたネズミ１Ｂ４Ｈ鎖可変領域から誘導した。
キメラＨ鎖の可変領域はシグナル配列、ネズミ１Ｂ４Ｈ
鎖可変領域の一部及びイントロン配列を表す３種のＤＮ
Ａ断片から組立てた（図８）。ネズミ１Ｂ４ＣＤＲ配列
を決定するため既に用いられたＩｇＧ２ａＨ鎖領域を含
むｐＳＰ７２中間ベクター又はＮＥＷ Ｈ鎖可変領域
（Ｍ１３ＶＨＰＣＲ１）のいずれかを含んだプラスミド
ＤＮＡ鋳型１０ｎｇからＰＣＲ増幅によりこれら３種の
ＤＮＡ断片を得るために必要なプライマーを表すオリゴ
デオキシヌクレオチドプライマー対（図９）を合成し
た。２２５ｂｐシグナル断片、３５０ｂｐ可変領域断片
及び２３０ｂｐイントロン含有断片の増幅は前記のよう
に行った。アガロースゲル精製生成物（各生成物１０ｎ
ｇ）を末端プライマー対（図９）と混合し、１Ｂ４移入
ＲＥＩＬ鎖可変領域を含む断片を組換えるために前記さ
れた標準操作を用いてＰＣＲ形成インビトロ組換え鋳型
を増幅させた。ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩ切断中間ベク
ター（ｐＳＰ７２）（プロメガ）に組込んでサブクロー
ニングする前、この組換え生成物を同様に切断し、アガ
ロースゲル精製した。ＤＮＡを個別的細菌クローンの増
殖後に得て、再組立て可変領域及びその隣接ドメインの
配列を調べるためシークエナーゼ並びにＴ７及びＳＰ６
特異性配列決定プライマーを用いてＤＮＡ配列決定に付
した。
【００３０】γ４Ｈ鎖不定領域をプラスミドｐＡＴ８４
（フラナガン及びラビッツ、前掲）から誘導される６．
７ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ断片として中間ベクターｐＳＰ
７２（プロメガ）のＨｉｎｄＩＩＩ部位に組込んでサブ
クローニングした。次いでこのプラスミドを鋳型ＤＮＡ
として用い、そこからγ４不変領域の短鎖体を前記標準
ＰＣＲ増幅操作及び図７で示されたプライマー対を用い
て得た。真核細胞発現ベクターは下記のように、即ちＨ
鎖免疫グロブリン分子がネオマイシン（Ｇ４１８）耐性
マーカー〔ロススタイン（Ｒothstein）及びレズニコフ
（Ｒeznikoff）、セル、第２３巻、第１９１−１９９
頁、１９８１年〕を有するプラスミドから転写され、一
方Ｌ鎖免疫グロブリンがヒグロマイシンＢ耐性マーカー
（グリッツ及びデービス、ジーン、第２５巻、第１７９
−１８８頁、１９８３年）を有するプラスミドから転写
されるように組立てた。これらプラスミドの薬物耐性部
分を除き、それらは同一である。免疫グロブリン発現ベ
クターの原種はｐＤ５真核細胞発現ベクター（バークナ
ー及びシャープ、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、
第１３巻、第８４１−８５７頁、１９８５年）であった
が、これはアデノウイルス複製源、ＳＶ４０エンハンサ
ードメイン、アデノウイルス主要後期プロモーター、ア
デノウイルス２三分節系リーダー、アデノウイルス第三
リーダーからの５’スプライスドナー、免疫グロブリン
座から誘導される３’スプライスアクセプター、多数ク
ローニング部位及びＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナ
ルを含んでいた（図１０）。複製源をＥｃｏＲＩ及びＫ
ｐｎＩによる切断で除去し、ｎｅｏ選択マーカー遺伝子
〔ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ １．８ｋｂ断片としてプラ
スミドｐＣＭＶＩＥ−ＡＫ１−ＤＨＦＲ（シルバークラ
ングら、動物細胞技術の現代的アプローチ、スパイアら
編集、バターワース、Ｕ．Ｋ．，１９８７年（Ｓilberk
lang et al., ＭodernＡpproaches to Ａnimal Ｃell
Ｔechnology, Ｅd. Ｓpier et al., Ｂutterworth,
Ｕ．Ｋ．，１９８７））から誘導される〕及びＩｇＨ鎖
エンハンサー〔前記標準操作、鋳型としてヒトＤＮＡ及
び図７で示されたオリゴヌクレオチドプライマー対を用
いてＰＣＲ増幅断片としてそのＢｇｌＩＩ及びＫｐｎＩ
切断後に得られる）を表す２断片で置き換えた。得られ
た発現ベクターはネオマイシン遺伝子の転写に関与する
ＴＫプロモーターの小部分を欠くことがわかった。これ
は図７でも示されるプライマー対を用いてＣＭＶＩＥ−
ＡＫ１−ＤＨＦＲＤＮＡから誘導される０.１４ｋｂ Ｐ
ＣＲ増幅断片のＥｃｏＲＩ部位への挿入で置き換えた。
次いで得られたＨ鎖発現ベクターを指示ＨｉｎｄＩＩＩ
及びＸｂａＩ部位の除去により修正した。このネオマイ
シン選択ベクター（ｐ８９４１）をヒグロマイシンＢ選
択マーカーを発現するベクター（ｐ８９４２）に変換す
るため（図１０）、ネオマイシン耐性カセットを最初Ｅ
ｃｏＲＩ切断、しかる後５’突出部のＤＮＡポリメラー
ゼ補足、次いでＳａｌＩ切断により除去した。１．９ｋ
ｂヒグロマイシンＢ発現カセット（プラスミドｐＬＧ９
０における１．９ｋｂ ＢａｍＨＩ断片としてグリッツ
及びデービス、ジーン、第２５巻、第１７９−１８８
頁、１９８３年から得られるＴＫプロモーター及びヒグ
ロマイシンＢ遺伝子に隣接するＴＫポリアデニル化シグ
ナル）をＢａｍＨＩ切断でプラスミドｐＡＬ−２から除
去し、中間ベクターｐＳＰ７２（プロメガ）のＢａｍＨ
Ｉ部位に組込んでサブクローニングした。ヒグロマイシ
ンＢカセットをＳｍａＩ及びＳａｌＩ切断でこのベクタ
ーから除去し、前記のように直鎖化された発現ベクター
に組込んでクローニングし、ブラント末端及びＳａｌＩ
末端ＤＮＡ断片を得た。
（フラナガン及びラビッツ、前掲）から誘導される６．
７ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ断片として中間ベクターｐＳＰ
７２（プロメガ）のＨｉｎｄＩＩＩ部位に組込んでサブ
クローニングした。次いでこのプラスミドを鋳型ＤＮＡ
として用い、そこからγ４不変領域の短鎖体を前記標準
ＰＣＲ増幅操作及び図７で示されたプライマー対を用い
て得た。真核細胞発現ベクターは下記のように、即ちＨ
鎖免疫グロブリン分子がネオマイシン（Ｇ４１８）耐性
マーカー〔ロススタイン（Ｒothstein）及びレズニコフ
（Ｒeznikoff）、セル、第２３巻、第１９１−１９９
頁、１９８１年〕を有するプラスミドから転写され、一
方Ｌ鎖免疫グロブリンがヒグロマイシンＢ耐性マーカー
（グリッツ及びデービス、ジーン、第２５巻、第１７９
−１８８頁、１９８３年）を有するプラスミドから転写
されるように組立てた。これらプラスミドの薬物耐性部
分を除き、それらは同一である。免疫グロブリン発現ベ
クターの原種はｐＤ５真核細胞発現ベクター（バークナ
ー及びシャープ、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、
第１３巻、第８４１−８５７頁、１９８５年）であった
が、これはアデノウイルス複製源、ＳＶ４０エンハンサ
ードメイン、アデノウイルス主要後期プロモーター、ア
デノウイルス２三分節系リーダー、アデノウイルス第三
リーダーからの５’スプライスドナー、免疫グロブリン
座から誘導される３’スプライスアクセプター、多数ク
ローニング部位及びＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナ
ルを含んでいた（図１０）。複製源をＥｃｏＲＩ及びＫ
ｐｎＩによる切断で除去し、ｎｅｏ選択マーカー遺伝子
〔ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ １．８ｋｂ断片としてプラ
スミドｐＣＭＶＩＥ−ＡＫ１−ＤＨＦＲ（シルバークラ
ングら、動物細胞技術の現代的アプローチ、スパイアら
編集、バターワース、Ｕ．Ｋ．，１９８７年（Ｓilberk
lang et al., ＭodernＡpproaches to Ａnimal Ｃell
Ｔechnology, Ｅd. Ｓpier et al., Ｂutterworth,
Ｕ．Ｋ．，１９８７））から誘導される〕及びＩｇＨ鎖
エンハンサー〔前記標準操作、鋳型としてヒトＤＮＡ及
び図７で示されたオリゴヌクレオチドプライマー対を用
いてＰＣＲ増幅断片としてそのＢｇｌＩＩ及びＫｐｎＩ
切断後に得られる）を表す２断片で置き換えた。得られ
た発現ベクターはネオマイシン遺伝子の転写に関与する
ＴＫプロモーターの小部分を欠くことがわかった。これ
は図７でも示されるプライマー対を用いてＣＭＶＩＥ−
ＡＫ１−ＤＨＦＲＤＮＡから誘導される０.１４ｋｂ Ｐ
ＣＲ増幅断片のＥｃｏＲＩ部位への挿入で置き換えた。
次いで得られたＨ鎖発現ベクターを指示ＨｉｎｄＩＩＩ
及びＸｂａＩ部位の除去により修正した。このネオマイ
シン選択ベクター（ｐ８９４１）をヒグロマイシンＢ選
択マーカーを発現するベクター（ｐ８９４２）に変換す
るため（図１０）、ネオマイシン耐性カセットを最初Ｅ
ｃｏＲＩ切断、しかる後５’突出部のＤＮＡポリメラー
ゼ補足、次いでＳａｌＩ切断により除去した。１．９ｋ
ｂヒグロマイシンＢ発現カセット（プラスミドｐＬＧ９
０における１．９ｋｂ ＢａｍＨＩ断片としてグリッツ
及びデービス、ジーン、第２５巻、第１７９−１８８
頁、１９８３年から得られるＴＫプロモーター及びヒグ
ロマイシンＢ遺伝子に隣接するＴＫポリアデニル化シグ
ナル）をＢａｍＨＩ切断でプラスミドｐＡＬ−２から除
去し、中間ベクターｐＳＰ７２（プロメガ）のＢａｍＨ
Ｉ部位に組込んでサブクローニングした。ヒグロマイシ
ンＢカセットをＳｍａＩ及びＳａｌＩ切断でこのベクタ
ーから除去し、前記のように直鎖化された発現ベクター
に組込んでクローニングし、ブラント末端及びＳａｌＩ
末端ＤＮＡ断片を得た。
【００３１】１Ｂ４ ＣＤＲ移入κＬ鎖の発現は、ｐＳ
Ｐ７２中間ベクター内の位置からヒグロマイシンＢ選択
真核細胞発現ベクターにこのシストロンを移すことで行
った（図１８）。ＳｐｅＩ及びＣｌａＩによるｐ８９５
２のエンドヌクレアーゼ切断で得られる１．５ｋｂＤＮ
Ａ断片をアガロースゲル電気泳動で精製し、２種の同制
限酵素切断で既に直鎖化された発現ベクター（ｐ８９４
２）に結合し、アガロースゲル精製した。Ｈ鎖真核細胞
発現ベクター（ｐ８９５８）を２ステップで組立てた
（図１１）。最初に、ネズミ１Ｂ４の修正Ｈ鎖可変領域
を含むｐ８９４９をＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩで切断し
た。アガロースゲル精製０．８ｋｂ断片をｐ８９４１ベ
クターのＢａｍＨＩ部位に結合させ、適正な向きでこの
断片を含む組換え体を同定した。１つのこのようなプラ
スミドをＢａｍＨＩ切断で直鎖化し、前記のようにＰＣ
Ｒ増幅でプラスミドｐ８９４７から誘導されるヒトγ４
不変領域の短鎖体を表す１．８ｋｂ ＢａｍＨＩ断片と
結合させた。適切な向きでこれらのインサートを含むク
ローンの同定後、プラスミドＤＮＡを増殖させ（マニア
ティスら、前掲）、受容体哺乳動物細胞へのトランスフ
ェクトのために精製した（マニアティスら、前掲；バー
ビオン及びドリー、前掲）。
Ｐ７２中間ベクター内の位置からヒグロマイシンＢ選択
真核細胞発現ベクターにこのシストロンを移すことで行
った（図１８）。ＳｐｅＩ及びＣｌａＩによるｐ８９５
２のエンドヌクレアーゼ切断で得られる１．５ｋｂＤＮ
Ａ断片をアガロースゲル電気泳動で精製し、２種の同制
限酵素切断で既に直鎖化された発現ベクター（ｐ８９４
２）に結合し、アガロースゲル精製した。Ｈ鎖真核細胞
発現ベクター（ｐ８９５８）を２ステップで組立てた
（図１１）。最初に、ネズミ１Ｂ４の修正Ｈ鎖可変領域
を含むｐ８９４９をＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩで切断し
た。アガロースゲル精製０．８ｋｂ断片をｐ８９４１ベ
クターのＢａｍＨＩ部位に結合させ、適正な向きでこの
断片を含む組換え体を同定した。１つのこのようなプラ
スミドをＢａｍＨＩ切断で直鎖化し、前記のようにＰＣ
Ｒ増幅でプラスミドｐ８９４７から誘導されるヒトγ４
不変領域の短鎖体を表す１．８ｋｂ ＢａｍＨＩ断片と
結合させた。適切な向きでこれらのインサートを含むク
ローンの同定後、プラスミドＤＮＡを増殖させ（マニア
ティスら、前掲）、受容体哺乳動物細胞へのトランスフ
ェクトのために精製した（マニアティスら、前掲；バー
ビオン及びドリー、前掲）。
【００３２】キメラＩｇＧ４ Ｈ鎖及び１Ｂ４ ＣＤＲ
移入κＬ鎖についてコードするプラスミドを等量（１０
μｇ）で標準的リン酸カルシウム沈降操作によりヒト２
９３細胞、サル細胞ＣＯＳ−７及びＣＶ−１Ｐにトラン
スフェクトした。培養上澄液をヒトＩｇＧ４／κ免疫グ
ロブリンの分泌に関してトラッピングＥＬＩＳＡ（下
記）で調べた。ＥＬＩＳＡはならし哺乳動物細胞増殖培
地で発現される１Ｂ４組換え抗体の定量に関して用い
た。イムロン−２（ダイナテック・ラブス）９６ウエル
プレートを４℃の０.１Ｍ ＮａＨＣＯ3緩衝液（ｐＨ
８．２）中マウス抗ヒトκ鎖不変ドメインモノクローナ
ル抗体（カタログ＃ＭＣ００９、ザ・バインディング・
サイト社、サンジエゴ、カリフォルニア州）の溶液５μ
ｇ／ｍｌで一夜被覆し、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3中の１
％牛血清（ＢＳＡ）で１時間２５℃にて遮断した。この
及び続くすべてのステップ後に、洗浄をリン酸緩衝液
（ＰＢＳ）で行った。次いでウェルを組換え抗ＣＤ１８
抗体含有ならし培地又はヒトＩｇＧ４ミエローマ血清
（カタログ＃ＢＰ０２６、ザ・バインディング・サイト
社）からプロテインＡセファロース（ファルマシア・フ
ァイン・ケミカルズ）クロマトグラフィーで精製された
既定量のヒトＩｇＧ４／κで接種する。すべてのサンプ
ルを０．０５％ツイーン２０含有ＰＢＳで希釈する。１
００μｌずつ３回にわたり３７℃で１時間インキュベー
トし、１０〜１００ｎｇ／ｍｌ範囲のＩｇＧ４濃度を用
いて標準校正曲線を作成する。結合されかつ十分にアセ
ンブリーされたヒトＩｇＧ４（天然又は組換え１Ｂ４ヒ
トＩｇＧ４構造体）を１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液（Ｐ
ＢＳ）中アルカリホスファターゼと複合化されたマウス
抗ヒトＩｇＧ４ Ｆｃモノクローナル抗体（カタログ＃
０５−３８２２、ザイムド・ラボラトリーズ社）の１：
５００希釈液１００μｌで検出する。３７℃で１時間イ
ンキュベート及び次いで洗浄の後に、結合複合体の量
は、すべてのサンプルをｐＨ１０．３の０．１Ｍ ２，
２’−アミノメチルプロパンジオール緩衝液中ｐ−ニト
ロフェニルホスフェートの１ｍｇ／ｍｌ溶液と共に２５
℃で３０分間インキュベートすることにより検出する。
ウェルの吸光度を４０５ｎｍにセットされたＵＶマック
スＥＬＩＳＡプレートリーダー（モレキュラー・デバイ
セス）で読取る。トランスフェクトされた細胞からのす
べての上澄液は、様々な量でこの免疫グロブリンを含有
することがわかった（図１２）。トランスフェクトされ
た２９３細胞から分泌される抗体をプロテインＡクロマ
トグラフィーで濃縮し、前記トラッピングＥＬＩＳＡで
測定された組換えヒト抗ＣＤ１８抗体の濃度を用いて、
活性化ヒトＰＭＮの表面上におけるＣＤ１８リガンドへ
の放射線標識ネズミ１Ｂ４の結合と競合させる。様々な
γ−ｈ−抗ＣＤ１８抗体構造体の親和性は、刺激化ヒト
多形核白血球（ＰＭＮ）との競合的125Ｉ−１Ｂ４可溶
性結合アッセイを用いて調べる。精製されたネズミ抗Ｃ
Ｄ１８モノクローナル抗体（５０μｇ）をクロラミンＴ
でヨウ素化し（ハンター、Ｗ．Ｍ．及びグリーンウッ
ド、Ｆ．Ｃ．，ネーチャー、第１９４巻、第４９５−４
９６頁、１９６２年）、放射線標識抗体をｐＨ７．０の
０．１Ｍリン酸緩衝液で平衡化されたバイオシルＴＳＫ
２５０（バイオラッド、リッチモンド、カリフォルニア
州）ゲル濾過ＨＰＬＣカラム（１〜３００×１０3ドル
トンの範囲内でタンパク質を分別する）で精製する。溶
出放射能をインライン検出器（ベックマンモデル１７
０；ベックマン、フラートン、カリフォルニア州）でモ
ニターし、全タンパク質をクラトス・スペクトロフロー
７５７検出器〔クラトス、マーワー（Ｍahwah）、ニュ
ージャージー州〕によりＯＤ280で測定する。同時ＯＤ
280及び放射能トレーシングからなる単一125Ｉ−１Ｂ４
ピークはサンプル注入後６分３０秒で特徴的に溶出す
る。生成物の比活性は通常約１０μＣｉ／μｇタンパク
質であり、カウントの９７〜９９％は１０％トリクロロ
酢酸で沈降しうる。この放射線標識抗体の結合性を不連
続フィコール／ハイパーク勾配で精製されたヒトＰＭＮ
で評価し（イングリッシュ及びアンダーソン、ジャーナ
ル・オブ・イムノロジー・メソッズ、第５巻、第２４９
−２５５頁、１９７４年）、ミリスチン酸ホルボール１
００ｍｇ／ｍｌにより３７℃で２０分間かけて活性化す
る（ローら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・
メディシン、第１６９巻、第１７７９−１７９３頁、１
９８９年）。ＰＭＮ表面上のＣＤ１８分子に関する抗体
の結合活性を測定するため、約１×１０5の活性化ＰＭ
Ｎを２０ｍＭヘペス（ｐＨ７．２）、０．１４単位アプ
ロチニン（シグマ・ケミカル社）及び２％ヒト血清アル
ブミン（結合緩衝液）含有ハンクス平衡塩溶液のような
１．３ｎｇ125Ｉ−１Ｂ４（２．８×１０-11Ｍ）を含有
した緩衝液中未標識１Ｂ４抗体の濃度（１０-7〜１０
-15Ｍ）を増加させながら３００μｌの反応液容量中４
℃で１時間一定攪拌下でインキュベートする。細胞結合
１Ｂ４を０．５Ｍスクロースクッションでの遠心（４８
００×ｇ、３分間）により未結合抗体から分離し、管を
ドライアイスで凍結し、先端を切取り、ＬＫＢガンマカ
ウンターで計数する。125Ｉ−１Ｂ４抗体結合の阻害に
関する抗ＣＤ１８抗体のＩＣ50を４パラメーター適合プ
ログラムで計算する〔ロドバード、マンソン（Ｍunso
n）及びデリーン（ＤeＬean）、“医学におけるラジオ
イムノアッセイ及び関連操作”、インターナショナル・
アトミック・エナジー・エージェンシー、ウィーン、第
１巻、第４６９−５０４頁、１９７８年〕。ＣＤ１８リ
ガンドに関する様々なγ−ｈ−抗ＣＤ１８抗体の親和性
は、ネズミ125Ｉ−１Ｂ４抗体を用いかつトラッピング
ＥＬＩＳＡで測定されるように未標識γ−ｈ−抗ＣＤ１
８の量を増加させながら同様の方法で調べた。結合アッ
セイの結果は図１３で示され、キメラＨ鎖／移入Ｌ鎖組
換え１Ｂ４抗体の結合活性（○）がネズミ１Ｂ４モノク
ローナル抗体の場合（◇）とほぼ等しいことを示してい
る。
移入κＬ鎖についてコードするプラスミドを等量（１０
μｇ）で標準的リン酸カルシウム沈降操作によりヒト２
９３細胞、サル細胞ＣＯＳ−７及びＣＶ−１Ｐにトラン
スフェクトした。培養上澄液をヒトＩｇＧ４／κ免疫グ
ロブリンの分泌に関してトラッピングＥＬＩＳＡ（下
記）で調べた。ＥＬＩＳＡはならし哺乳動物細胞増殖培
地で発現される１Ｂ４組換え抗体の定量に関して用い
た。イムロン−２（ダイナテック・ラブス）９６ウエル
プレートを４℃の０.１Ｍ ＮａＨＣＯ3緩衝液（ｐＨ
８．２）中マウス抗ヒトκ鎖不変ドメインモノクローナ
ル抗体（カタログ＃ＭＣ００９、ザ・バインディング・
サイト社、サンジエゴ、カリフォルニア州）の溶液５μ
ｇ／ｍｌで一夜被覆し、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3中の１
％牛血清（ＢＳＡ）で１時間２５℃にて遮断した。この
及び続くすべてのステップ後に、洗浄をリン酸緩衝液
（ＰＢＳ）で行った。次いでウェルを組換え抗ＣＤ１８
抗体含有ならし培地又はヒトＩｇＧ４ミエローマ血清
（カタログ＃ＢＰ０２６、ザ・バインディング・サイト
社）からプロテインＡセファロース（ファルマシア・フ
ァイン・ケミカルズ）クロマトグラフィーで精製された
既定量のヒトＩｇＧ４／κで接種する。すべてのサンプ
ルを０．０５％ツイーン２０含有ＰＢＳで希釈する。１
００μｌずつ３回にわたり３７℃で１時間インキュベー
トし、１０〜１００ｎｇ／ｍｌ範囲のＩｇＧ４濃度を用
いて標準校正曲線を作成する。結合されかつ十分にアセ
ンブリーされたヒトＩｇＧ４（天然又は組換え１Ｂ４ヒ
トＩｇＧ４構造体）を１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液（Ｐ
ＢＳ）中アルカリホスファターゼと複合化されたマウス
抗ヒトＩｇＧ４ Ｆｃモノクローナル抗体（カタログ＃
０５−３８２２、ザイムド・ラボラトリーズ社）の１：
５００希釈液１００μｌで検出する。３７℃で１時間イ
ンキュベート及び次いで洗浄の後に、結合複合体の量
は、すべてのサンプルをｐＨ１０．３の０．１Ｍ ２，
２’−アミノメチルプロパンジオール緩衝液中ｐ−ニト
ロフェニルホスフェートの１ｍｇ／ｍｌ溶液と共に２５
℃で３０分間インキュベートすることにより検出する。
ウェルの吸光度を４０５ｎｍにセットされたＵＶマック
スＥＬＩＳＡプレートリーダー（モレキュラー・デバイ
セス）で読取る。トランスフェクトされた細胞からのす
べての上澄液は、様々な量でこの免疫グロブリンを含有
することがわかった（図１２）。トランスフェクトされ
た２９３細胞から分泌される抗体をプロテインＡクロマ
トグラフィーで濃縮し、前記トラッピングＥＬＩＳＡで
測定された組換えヒト抗ＣＤ１８抗体の濃度を用いて、
活性化ヒトＰＭＮの表面上におけるＣＤ１８リガンドへ
の放射線標識ネズミ１Ｂ４の結合と競合させる。様々な
γ−ｈ−抗ＣＤ１８抗体構造体の親和性は、刺激化ヒト
多形核白血球（ＰＭＮ）との競合的125Ｉ−１Ｂ４可溶
性結合アッセイを用いて調べる。精製されたネズミ抗Ｃ
Ｄ１８モノクローナル抗体（５０μｇ）をクロラミンＴ
でヨウ素化し（ハンター、Ｗ．Ｍ．及びグリーンウッ
ド、Ｆ．Ｃ．，ネーチャー、第１９４巻、第４９５−４
９６頁、１９６２年）、放射線標識抗体をｐＨ７．０の
０．１Ｍリン酸緩衝液で平衡化されたバイオシルＴＳＫ
２５０（バイオラッド、リッチモンド、カリフォルニア
州）ゲル濾過ＨＰＬＣカラム（１〜３００×１０3ドル
トンの範囲内でタンパク質を分別する）で精製する。溶
出放射能をインライン検出器（ベックマンモデル１７
０；ベックマン、フラートン、カリフォルニア州）でモ
ニターし、全タンパク質をクラトス・スペクトロフロー
７５７検出器〔クラトス、マーワー（Ｍahwah）、ニュ
ージャージー州〕によりＯＤ280で測定する。同時ＯＤ
280及び放射能トレーシングからなる単一125Ｉ−１Ｂ４
ピークはサンプル注入後６分３０秒で特徴的に溶出す
る。生成物の比活性は通常約１０μＣｉ／μｇタンパク
質であり、カウントの９７〜９９％は１０％トリクロロ
酢酸で沈降しうる。この放射線標識抗体の結合性を不連
続フィコール／ハイパーク勾配で精製されたヒトＰＭＮ
で評価し（イングリッシュ及びアンダーソン、ジャーナ
ル・オブ・イムノロジー・メソッズ、第５巻、第２４９
−２５５頁、１９７４年）、ミリスチン酸ホルボール１
００ｍｇ／ｍｌにより３７℃で２０分間かけて活性化す
る（ローら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・
メディシン、第１６９巻、第１７７９−１７９３頁、１
９８９年）。ＰＭＮ表面上のＣＤ１８分子に関する抗体
の結合活性を測定するため、約１×１０5の活性化ＰＭ
Ｎを２０ｍＭヘペス（ｐＨ７．２）、０．１４単位アプ
ロチニン（シグマ・ケミカル社）及び２％ヒト血清アル
ブミン（結合緩衝液）含有ハンクス平衡塩溶液のような
１．３ｎｇ125Ｉ−１Ｂ４（２．８×１０-11Ｍ）を含有
した緩衝液中未標識１Ｂ４抗体の濃度（１０-7〜１０
-15Ｍ）を増加させながら３００μｌの反応液容量中４
℃で１時間一定攪拌下でインキュベートする。細胞結合
１Ｂ４を０．５Ｍスクロースクッションでの遠心（４８
００×ｇ、３分間）により未結合抗体から分離し、管を
ドライアイスで凍結し、先端を切取り、ＬＫＢガンマカ
ウンターで計数する。125Ｉ−１Ｂ４抗体結合の阻害に
関する抗ＣＤ１８抗体のＩＣ50を４パラメーター適合プ
ログラムで計算する〔ロドバード、マンソン（Ｍunso
n）及びデリーン（ＤeＬean）、“医学におけるラジオ
イムノアッセイ及び関連操作”、インターナショナル・
アトミック・エナジー・エージェンシー、ウィーン、第
１巻、第４６９−５０４頁、１９７８年〕。ＣＤ１８リ
ガンドに関する様々なγ−ｈ−抗ＣＤ１８抗体の親和性
は、ネズミ125Ｉ−１Ｂ４抗体を用いかつトラッピング
ＥＬＩＳＡで測定されるように未標識γ−ｈ−抗ＣＤ１
８の量を増加させながら同様の方法で調べた。結合アッ
セイの結果は図１３で示され、キメラＨ鎖／移入Ｌ鎖組
換え１Ｂ４抗体の結合活性（○）がネズミ１Ｂ４モノク
ローナル抗体の場合（◇）とほぼ等しいことを示してい
る。
【００３３】実施例２ 完全移植組換えヒトＩｇＧ４抗体の製造 この実施例は、組換えヒトＩｇＧ４抗体の生成について
示し、この抗体の可変ドメインは、マウスのモノクロー
ナル抗体１Ｂ４のＣＤＲ残基を含む。ヒトカッパＬ鎖不
変部と融合したＲＥＩのヒト配列から誘導されたＣＤＲ
移植Ｌ鎖骨格の構成は、前期実施例（実施例１）に記載
された。組換え抗体の１Ｂ４−特異的Ｈ鎖成分は、１Ｂ
４ ＣＤＲ残基が移植される前もって選択されたヒトＨ
鎖可変部骨格配列へ融合された実施例１記載のＩｇＧ４
Ｈ鎖不変部から構築された。マウス１Ｂ４ ＭＡｂ ｍ１
Ｂ４ Ｈ鎖は、初め、ＣＤＲ配列の正確な位置を決定す
るために分析された。これらは、カバト、ウ、レイド−
ミラー、ペリー及びゴッテスマン（Ｋabat, Ｗu, Ｒeid
-Ｍiller, Ｐerry, and Ｇottesman）、免疫学における
たんぱく質の配列、（ユーエス デプト ヘルス及びヒュ
ウーマンサービス、ベセスダ（ＵＳ Ｄept Ｈealth and
Ｈuman Ｓervices, Ｂethesda）ＭＤ、１９８７）にお
いて見出だされる一連のデータとの視覚による比較によ
り決定された。いったん、ＣＤＲの境界が決定される
と、これらの配列は除去され、マウスＦＲ単独を残置し
た。これらの配列は、次いで、ＰＩＲデータベースのリ
リーズ２２（ジョージ等、ヌクル．アシズレス．（Ｇeo
rge et al.，Ｎucl. Ａcids Ｒes．）１４：１１−１６
（１９８６））から主に得られるヒト免疫グロブリンデ
ータベースに照会するために使用された。配列調査は、
ＧＣＧ配列分析パッケージのプロフィール調査システム
（デバークス等、ヌク．（Nuc.）アシズ レス．１２：
３８７−３９５（１９８４））を用いて行われた。相似
比較のために使用されたマトリックスは、デイホフ エ
ボリューショナリー ディスタンス マトリックス（Ｄay
hoff evolutionary distance matrix）アール．エム．
シュワルツ、エム．オー．デイホフ、イン アトラス オ
ブ プロテインシークエンス アンド ストラクチャー
（Ｒ．Ｍ．Ｓchwartz，Ｍ．Ｏ．Ｄayhoff，in Ａtlas o
f Ｐrotein sequence and structure）エム．オー．デ
イホフ、エズ．（Ｅds．）（ナショナル バイオメディ
カル レサーチ ファンデーション（Ｎational Ｂiomedi
cal Ｒeseach Ｆoundation）ワシントン，ＤＣ，１９７
９））であった。加えて、リスラー構造ディスタンス
マトリックス（リスラー等、ジェー．モル．バイオル．
（Ｊ．Ｍol．Ｂiol．）２０４：１０１９−１０２９
（１９８８））は、マウス配列プロフィールを生成する
ために使用され、及び、この照会での調査の結果が、デ
イホフ マトリックスを用いてもたらされたそれらと考
察された。プロフィール調査システムを用いることによ
って、種々の基準に基づいて重要であると思われる、マ
ウスＦＲ中の特異的残基についての評価も可能とした。
データベース照会において最も高レベルの配列相似性を
繰り返して示した配列を、マウス１Ｂ４のＦＲとの一対
での比較により分析した。ＧＣＧパッケージのプログラ
ムＧａｐは、それが、２つの配列間の配列類似性及び同
一性のいずれについても正確な測定を可能とすることか
ら、この分析のために使用される。この方法は、マウス
１Ｂ４と、類似性８５％及び８８％及び同一性７９％及
び７５％でそれぞれ共有するヒト配列Ｇａｌ及びＪｏｎ
（第１４図）を選択するために使用される。これらの骨
格中に１Ｂ４Ｈ鎖ＣＤＲを有する組換えＤＮＡの製造の
ために以下の方法が用いられた。
示し、この抗体の可変ドメインは、マウスのモノクロー
ナル抗体１Ｂ４のＣＤＲ残基を含む。ヒトカッパＬ鎖不
変部と融合したＲＥＩのヒト配列から誘導されたＣＤＲ
移植Ｌ鎖骨格の構成は、前期実施例（実施例１）に記載
された。組換え抗体の１Ｂ４−特異的Ｈ鎖成分は、１Ｂ
４ ＣＤＲ残基が移植される前もって選択されたヒトＨ
鎖可変部骨格配列へ融合された実施例１記載のＩｇＧ４
Ｈ鎖不変部から構築された。マウス１Ｂ４ ＭＡｂ ｍ１
Ｂ４ Ｈ鎖は、初め、ＣＤＲ配列の正確な位置を決定す
るために分析された。これらは、カバト、ウ、レイド−
ミラー、ペリー及びゴッテスマン（Ｋabat, Ｗu, Ｒeid
-Ｍiller, Ｐerry, and Ｇottesman）、免疫学における
たんぱく質の配列、（ユーエス デプト ヘルス及びヒュ
ウーマンサービス、ベセスダ（ＵＳ Ｄept Ｈealth and
Ｈuman Ｓervices, Ｂethesda）ＭＤ、１９８７）にお
いて見出だされる一連のデータとの視覚による比較によ
り決定された。いったん、ＣＤＲの境界が決定される
と、これらの配列は除去され、マウスＦＲ単独を残置し
た。これらの配列は、次いで、ＰＩＲデータベースのリ
リーズ２２（ジョージ等、ヌクル．アシズレス．（Ｇeo
rge et al.，Ｎucl. Ａcids Ｒes．）１４：１１−１６
（１９８６））から主に得られるヒト免疫グロブリンデ
ータベースに照会するために使用された。配列調査は、
ＧＣＧ配列分析パッケージのプロフィール調査システム
（デバークス等、ヌク．（Nuc.）アシズ レス．１２：
３８７−３９５（１９８４））を用いて行われた。相似
比較のために使用されたマトリックスは、デイホフ エ
ボリューショナリー ディスタンス マトリックス（Ｄay
hoff evolutionary distance matrix）アール．エム．
シュワルツ、エム．オー．デイホフ、イン アトラス オ
ブ プロテインシークエンス アンド ストラクチャー
（Ｒ．Ｍ．Ｓchwartz，Ｍ．Ｏ．Ｄayhoff，in Ａtlas o
f Ｐrotein sequence and structure）エム．オー．デ
イホフ、エズ．（Ｅds．）（ナショナル バイオメディ
カル レサーチ ファンデーション（Ｎational Ｂiomedi
cal Ｒeseach Ｆoundation）ワシントン，ＤＣ，１９７
９））であった。加えて、リスラー構造ディスタンス
マトリックス（リスラー等、ジェー．モル．バイオル．
（Ｊ．Ｍol．Ｂiol．）２０４：１０１９−１０２９
（１９８８））は、マウス配列プロフィールを生成する
ために使用され、及び、この照会での調査の結果が、デ
イホフ マトリックスを用いてもたらされたそれらと考
察された。プロフィール調査システムを用いることによ
って、種々の基準に基づいて重要であると思われる、マ
ウスＦＲ中の特異的残基についての評価も可能とした。
データベース照会において最も高レベルの配列相似性を
繰り返して示した配列を、マウス１Ｂ４のＦＲとの一対
での比較により分析した。ＧＣＧパッケージのプログラ
ムＧａｐは、それが、２つの配列間の配列類似性及び同
一性のいずれについても正確な測定を可能とすることか
ら、この分析のために使用される。この方法は、マウス
１Ｂ４と、類似性８５％及び８８％及び同一性７９％及
び７５％でそれぞれ共有するヒト配列Ｇａｌ及びＪｏｎ
（第１４図）を選択するために使用される。これらの骨
格中に１Ｂ４Ｈ鎖ＣＤＲを有する組換えＤＮＡの製造の
ために以下の方法が用いられた。
【００３４】４つの長鎖オリゴヌクレオチドの２組を合
成した。各組を結合させた場合、それらは、実施例１に
おいて発現されたキメラＨ鎖中に存在するマウス１Ｂ４
可変部に対応するＨ鎖部をエンコードした。各組の４つ
のオリゴヌクレオチド各１ピコモルを、Ｔａｇポリメラ
ーゼ２．５単位及び各末端増幅オリゴデスオキシヌクレ
オチド５０ピコモルと、標準ＰＣＲ反応より結合させた
（第１５図、第１６図）。一本鎖オリゴヌクレオチドの
相補末端の働きにより、ポリメラーゼ鎖反応の重合−変
質−重合サイクルは、結合配列の形成及びそれにつづく
増幅をもたらす。２５サイクルの増幅の後、結合０．４
ｋｂ断片は、電気泳動により精製され、アガロースゲル
抽出された。同時に、シグナルペプチドをコードするア
ミノ末端配列及び骨格４をコードするカルボキシ末端配
列を有する２つのＤＮＡ断片、スプライスドナー及びイ
ントロン配列を、オリゴデオキシヌクレオチドプライマ
ーペアー（第１５図）及び実施例１に記載されたＭ１３
ＶＨＰＣＲ１プラスミドＤＮＡ鋳型を用いて増幅した。
これら２つのＤＮＡ断片を上記のごとくアガロースゲル
電気泳動により精製し、これらのそれぞれ１０ｎｇを、
増幅可変部断片１０ｎｇ、Ｔａｑポリメラーゼ２．５単
位、末端プライマー５０ピコモルと結合し、混合物をＰ
ＣＲ２５サイクルにより増幅した（第１５図）。得られ
た０．８ｋｂ断片を、制限酵素ＳｐｅＩ及びＢａｍＨ１
（Ｇａｌ）及びＨｉｎｄIII及びＢａｍＨ１（Ｊｏｎ）
で消化した。アガロースゲル電気泳動の後精製されたＤ
ＮＡ断片を、キメラ可変部に代えてＨ鎖発現ベクターｐ
８９５８へ結紮した（第１１図）。この方法において、
移植１Ｂ４ＣＤＲを含む２つの独特なＨ鎖骨格（１Ｂ４
／Ｊｏｎ及び１Ｂ４／Ｇａｌ）を構築した。各完全移植
Ｈ鎖発現ベクタープラスミドを、完全移植１Ｂ４／ＲＥ
Ｉ Ｌ鎖発現ベクター（実施例１）プラスミドとともに
２９３細胞へトランスフェクトし、調整培地中に存在す
る抗体をたんぱく質Ａクロマトグラフィーにより単離し
た。活性化ヒトＰＭＮ表面に表わされるＣＤ１８リガン
ドに対するこれら２つの抗体の組換え人体適合化１Ｂ４
（ｈ１Ｂ４）結合活性を、実施例１記載のキメラ／移植
抗体の結合活性と比較した。第２０図は、各ヘテロ−二
量体抗体が６つのＣＤＲの同一のセットを含むとはい
え、それらはリガンドに対する一致した結合活性を表わ
さないことを示している。従って、抗体分子の生物学的
特性（すなわち、その結合活性）は、ＣＤＲループを支
える可変部骨格構造に依存する。
成した。各組を結合させた場合、それらは、実施例１に
おいて発現されたキメラＨ鎖中に存在するマウス１Ｂ４
可変部に対応するＨ鎖部をエンコードした。各組の４つ
のオリゴヌクレオチド各１ピコモルを、Ｔａｇポリメラ
ーゼ２．５単位及び各末端増幅オリゴデスオキシヌクレ
オチド５０ピコモルと、標準ＰＣＲ反応より結合させた
（第１５図、第１６図）。一本鎖オリゴヌクレオチドの
相補末端の働きにより、ポリメラーゼ鎖反応の重合−変
質−重合サイクルは、結合配列の形成及びそれにつづく
増幅をもたらす。２５サイクルの増幅の後、結合０．４
ｋｂ断片は、電気泳動により精製され、アガロースゲル
抽出された。同時に、シグナルペプチドをコードするア
ミノ末端配列及び骨格４をコードするカルボキシ末端配
列を有する２つのＤＮＡ断片、スプライスドナー及びイ
ントロン配列を、オリゴデオキシヌクレオチドプライマ
ーペアー（第１５図）及び実施例１に記載されたＭ１３
ＶＨＰＣＲ１プラスミドＤＮＡ鋳型を用いて増幅した。
これら２つのＤＮＡ断片を上記のごとくアガロースゲル
電気泳動により精製し、これらのそれぞれ１０ｎｇを、
増幅可変部断片１０ｎｇ、Ｔａｑポリメラーゼ２．５単
位、末端プライマー５０ピコモルと結合し、混合物をＰ
ＣＲ２５サイクルにより増幅した（第１５図）。得られ
た０．８ｋｂ断片を、制限酵素ＳｐｅＩ及びＢａｍＨ１
（Ｇａｌ）及びＨｉｎｄIII及びＢａｍＨ１（Ｊｏｎ）
で消化した。アガロースゲル電気泳動の後精製されたＤ
ＮＡ断片を、キメラ可変部に代えてＨ鎖発現ベクターｐ
８９５８へ結紮した（第１１図）。この方法において、
移植１Ｂ４ＣＤＲを含む２つの独特なＨ鎖骨格（１Ｂ４
／Ｊｏｎ及び１Ｂ４／Ｇａｌ）を構築した。各完全移植
Ｈ鎖発現ベクタープラスミドを、完全移植１Ｂ４／ＲＥ
Ｉ Ｌ鎖発現ベクター（実施例１）プラスミドとともに
２９３細胞へトランスフェクトし、調整培地中に存在す
る抗体をたんぱく質Ａクロマトグラフィーにより単離し
た。活性化ヒトＰＭＮ表面に表わされるＣＤ１８リガン
ドに対するこれら２つの抗体の組換え人体適合化１Ｂ４
（ｈ１Ｂ４）結合活性を、実施例１記載のキメラ／移植
抗体の結合活性と比較した。第２０図は、各ヘテロ−二
量体抗体が６つのＣＤＲの同一のセットを含むとはい
え、それらはリガンドに対する一致した結合活性を表わ
さないことを示している。従って、抗体分子の生物学的
特性（すなわち、その結合活性）は、ＣＤＲループを支
える可変部骨格構造に依存する。
【００３５】Ｇａｌ／ＲＥＩ移植ヘテロ−二量体の増大
された結合活性に対するＬ鎖可変部の相対的寄与を決定
するために、第２のＬ鎖骨格を、１Ｂ４ＣＤＲ配列を含
んで構築した。Ｌ鎖骨格Ｌｅｎを、データベースからの
選択に基づいてドナー骨格配列として同定した。Ｌｅｎ
を、カバト（Ｋabat）と比較された場合のＣＤＲの視覚
的同定に基づいて除去されたＣＤＲ（上記）とともに、
マウス１Ｂ４ Ｌ鎖骨格配列を用いて同定し、ヒト免疫
グロビンデータベースに照会した。照会の方法は、Ｈ鎖
ＦＲについて記載されたそれと同様である。Ｌｅｎは、
Ｇａｐ分析により、マウス１Ｂ４ Ｌ鎖ＦＲと９０％類
似及び８１％同一であることが示された。ＲＥＩ（８２
％類似及び６５％同一）と比較して高レベルの１Ｂ４に
対する類似性及び同一性を示すことに基づけば、Ｌｅｎ
は、ＲＥＩよりもＬ鎖ＣＤＲの移植のためにより良き選
択であると考えられた（第１４図参照）。１Ｂ４特異的
ＣＤＲ配列及びイントロン配列とともにＬｅｎ Ｌ鎖骨
格を表わす５つの長鎖オリゴデキシヌクレオチドのセッ
ト（第２１図）を、Ｔａｑポリメラーゼ２．５単位及び
各末端増幅オリゴデオキシヌクレオチドプライマー５０
ピコモルを用いて合成し、Ｊｏｎ及びＧａｌ骨格（第２
２図）について上記されたように、ＰＣＲにより結し
た。２５サイクル増幅の後、結合それた０．６ｋｂ Ｄ
ＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動により精製した。
並行して、アミノ末端シグナルペプチドを有するＤＮＡ
断片を、実施例１に記載されたように、オリゴデオキシ
ヌクレオチドプライマーペアー（第２１図）及びＭ１３
ＶＨＰＣＲ１プラスミドＤＮＡ鋳型を用いて増幅させ
た。この断片も、アガロースゲル電気泳動により精製し
た。これら２つのＤＮＡ断片の各１０ｎｇを、Ｔａｑポ
リメラーゼ２．５単位、末端オリゴデオキシヌクレオチ
ドプライマー（第２１図）５０ピコモルとともに置き、
全混合物を、２５サイクルＰＣＲ増幅にさらす。得られ
た０．８ｋｂ ＤＮＡ断片を、制限酵素ＳｐｅＩ及びＸ
ｂａＩにより消化し、アガロースゲル電気泳動により精
製し、及び同じ２つの制限酵素により消化され、ＤＮＡ
断片を含む遊離ＲＥＩ／１Ｂ４可変部から電気泳動によ
り精製されたｐＳＰ７２／ＲＥＩ １Ｂ４中間体ベクタ
ーへ結紮する（第２３図参照）。配列照合クローン（ｐ
８９６７）中の結合Ｌ鎖可変部及びカッパ不変部を、制
限酵素ＳｐｅＩ及びＣｌａＩによる消化により切り取
り、このアガロースゲル電気泳動により精製された１．
５ｋｂのＤＮＡ断片を、Ｌ鎖発現ベクターｐ８９５３へ
クローンする。この後、後者のプラスミドを、ＳｐｅＩ
及びＣｌａＩ制限酵素での消化後、ＲＥＩ／１Ｂ４／カ
ッパＬ鎖挿入物から精製する。完全ＣＤＲ移植Ｇａｌ／
１Ｂ４ Ｈ鎖発現ベクター及び完全ＣＤＲ移植Ｌｅｎ／
１Ｂ４又はＲＥＩ／１Ｂ４ Ｌ鎖発現ベクター（各１０
ｕｇ）をともに２９３細細へトランスフェクトし、調整
培地中に存在する抗体を、４８時間後たんぱく質Ａセフ
ァロースクロマトグラフィーにより単離する。活性化ヒ
トＰＭＮ表面に存在するＣＤ１８リガンドに対するこれ
ら２つの組換え抗体の結合活性が決定され、マウス１Ｂ
４ＭＡｂのそれと比較される（第２０図）。リガンドに
対する２つの人体適合化１Ｂ４組換え抗体間の、ＩＣ50
により測定された相違は、Ｇａｌ／Ｒｅｉ及びＧａｌ／
Ｌｅｎ間のＰ値の対照が、Ｍａｂ双方の標準偏差がオー
バラップしているがスチューデントの対応のない、ｔ−
検定により統計的に有意であることが明らかである。従
ってＲＥＩ Ｌ鎖骨格に対するＬｅｎ Ｌ鎖可変部骨格配
列が、マウス１Ｂ４骨格と並べられた場合、より同一な
残基及びより類似な残基を示すとはいえ、それは、結合
活性により測定された抗体／抗原相互作用において、も
しあったとしてもわずかなインパクトがあるにすぎな
い。これら２つのＬ鎖可変部（ＲＥＩ及びＬｅｎ）の推
定の３次元構造の比較は、これらの骨格中に存在する１
Ｂ４ＣＤＲのアルファー炭素トレースが、重複的である
ことを示し、さらに、いずれの骨格も一致してスペース
にＣＤＲを支持することを示唆するものである。１Ｂ４
Ｈ鎖可変部は、そのリガンドに対する抗体の結合活性
において、より重要な役割を果たすのか？この質問に答
えるため、及び小数のＨ鎖可変部骨格配列の役割を調査
するために、Ｇａｌ／１Ｂ４完全増幅分子の修正が行わ
れる。
された結合活性に対するＬ鎖可変部の相対的寄与を決定
するために、第２のＬ鎖骨格を、１Ｂ４ＣＤＲ配列を含
んで構築した。Ｌ鎖骨格Ｌｅｎを、データベースからの
選択に基づいてドナー骨格配列として同定した。Ｌｅｎ
を、カバト（Ｋabat）と比較された場合のＣＤＲの視覚
的同定に基づいて除去されたＣＤＲ（上記）とともに、
マウス１Ｂ４ Ｌ鎖骨格配列を用いて同定し、ヒト免疫
グロビンデータベースに照会した。照会の方法は、Ｈ鎖
ＦＲについて記載されたそれと同様である。Ｌｅｎは、
Ｇａｐ分析により、マウス１Ｂ４ Ｌ鎖ＦＲと９０％類
似及び８１％同一であることが示された。ＲＥＩ（８２
％類似及び６５％同一）と比較して高レベルの１Ｂ４に
対する類似性及び同一性を示すことに基づけば、Ｌｅｎ
は、ＲＥＩよりもＬ鎖ＣＤＲの移植のためにより良き選
択であると考えられた（第１４図参照）。１Ｂ４特異的
ＣＤＲ配列及びイントロン配列とともにＬｅｎ Ｌ鎖骨
格を表わす５つの長鎖オリゴデキシヌクレオチドのセッ
ト（第２１図）を、Ｔａｑポリメラーゼ２．５単位及び
各末端増幅オリゴデオキシヌクレオチドプライマー５０
ピコモルを用いて合成し、Ｊｏｎ及びＧａｌ骨格（第２
２図）について上記されたように、ＰＣＲにより結し
た。２５サイクル増幅の後、結合それた０．６ｋｂ Ｄ
ＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動により精製した。
並行して、アミノ末端シグナルペプチドを有するＤＮＡ
断片を、実施例１に記載されたように、オリゴデオキシ
ヌクレオチドプライマーペアー（第２１図）及びＭ１３
ＶＨＰＣＲ１プラスミドＤＮＡ鋳型を用いて増幅させ
た。この断片も、アガロースゲル電気泳動により精製し
た。これら２つのＤＮＡ断片の各１０ｎｇを、Ｔａｑポ
リメラーゼ２．５単位、末端オリゴデオキシヌクレオチ
ドプライマー（第２１図）５０ピコモルとともに置き、
全混合物を、２５サイクルＰＣＲ増幅にさらす。得られ
た０．８ｋｂ ＤＮＡ断片を、制限酵素ＳｐｅＩ及びＸ
ｂａＩにより消化し、アガロースゲル電気泳動により精
製し、及び同じ２つの制限酵素により消化され、ＤＮＡ
断片を含む遊離ＲＥＩ／１Ｂ４可変部から電気泳動によ
り精製されたｐＳＰ７２／ＲＥＩ １Ｂ４中間体ベクタ
ーへ結紮する（第２３図参照）。配列照合クローン（ｐ
８９６７）中の結合Ｌ鎖可変部及びカッパ不変部を、制
限酵素ＳｐｅＩ及びＣｌａＩによる消化により切り取
り、このアガロースゲル電気泳動により精製された１．
５ｋｂのＤＮＡ断片を、Ｌ鎖発現ベクターｐ８９５３へ
クローンする。この後、後者のプラスミドを、ＳｐｅＩ
及びＣｌａＩ制限酵素での消化後、ＲＥＩ／１Ｂ４／カ
ッパＬ鎖挿入物から精製する。完全ＣＤＲ移植Ｇａｌ／
１Ｂ４ Ｈ鎖発現ベクター及び完全ＣＤＲ移植Ｌｅｎ／
１Ｂ４又はＲＥＩ／１Ｂ４ Ｌ鎖発現ベクター（各１０
ｕｇ）をともに２９３細細へトランスフェクトし、調整
培地中に存在する抗体を、４８時間後たんぱく質Ａセフ
ァロースクロマトグラフィーにより単離する。活性化ヒ
トＰＭＮ表面に存在するＣＤ１８リガンドに対するこれ
ら２つの組換え抗体の結合活性が決定され、マウス１Ｂ
４ＭＡｂのそれと比較される（第２０図）。リガンドに
対する２つの人体適合化１Ｂ４組換え抗体間の、ＩＣ50
により測定された相違は、Ｇａｌ／Ｒｅｉ及びＧａｌ／
Ｌｅｎ間のＰ値の対照が、Ｍａｂ双方の標準偏差がオー
バラップしているがスチューデントの対応のない、ｔ−
検定により統計的に有意であることが明らかである。従
ってＲＥＩ Ｌ鎖骨格に対するＬｅｎ Ｌ鎖可変部骨格配
列が、マウス１Ｂ４骨格と並べられた場合、より同一な
残基及びより類似な残基を示すとはいえ、それは、結合
活性により測定された抗体／抗原相互作用において、も
しあったとしてもわずかなインパクトがあるにすぎな
い。これら２つのＬ鎖可変部（ＲＥＩ及びＬｅｎ）の推
定の３次元構造の比較は、これらの骨格中に存在する１
Ｂ４ＣＤＲのアルファー炭素トレースが、重複的である
ことを示し、さらに、いずれの骨格も一致してスペース
にＣＤＲを支持することを示唆するものである。１Ｂ４
Ｈ鎖可変部は、そのリガンドに対する抗体の結合活性
において、より重要な役割を果たすのか？この質問に答
えるため、及び小数のＨ鎖可変部骨格配列の役割を調査
するために、Ｇａｌ／１Ｂ４完全増幅分子の修正が行わ
れる。
【００３６】Ｇａｌ／１Ｂ４のＨ鎖可変部中の３つの残
基を、それらがマウス１Ｂ４骨格におけるカウンターパ
ートと同一になるように突然変異させるために選択され
る（第１４図参照）。３つのウエルに分けられた残基を
同時に突然変異させるために、以下の方法が行われる。
Ｇａｌ／１Ｂ４ＤＮＡ鋳型のＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ４
に位置されたアミノ酸残基を突然変異させるために必要
なデオキシヌクレオチド変質体を組み込む、４つのオリ
ゴデキシヌクレオチドプライマ対（第２６図）を合成す
る。この場合、４つのオーバーラップＤＮＡ断片を生成
するために必要なポリメラーゼ鎖反応物が、外側の２つ
のＤＮＡ断片を表わす一本鎖ＤＮＡを第一に生ずる方法
により増幅され、一方、内側の２つのＤＮＡ断片が、二
本鎖ＤＮＡを生成するように増幅された。４つの増幅さ
れたＤＮＡを結合させるこのアプローチは、上記修正に
より促進され、外側の増幅ＤＮＡ断片においてのみ見い
出される残基に対して独特な末端増幅オリゴデオキシヌ
クレオチドプライマーの使用と合体させた場合、増幅の
第１及び第２循環の間のＰＣＲ生成物を精製する必要性
をなくする。従って、不対象ＰＣＲが、２つの末端ＤＮ
Ａ断片を増幅するために使用される。標準ＰＣＲ増幅反
応において結合されたものは、プライマー＃Ｓ１、５０
ピコモル及びプライマー＃Ｇ２（第２６図）０．５ピコ
モル又はプライマー＃Ｉ２、５０ピコモル及びプライマ
ー＃Ｇ２（第２６図）０．５ピコモル及びプラスミドＤ
ＮＡ鋳型を含むＧａｌ／１Ｂ４（１０ｎｇ／反応）、Ｔ
ａｑポリメラーゼ２．５単位及び残りの標準反応成分で
ある。２つの内部ＤＮＡ断片は、各オリゴデオキシヌク
レオチドプライマー５０ピコモル、Ｔａｑポリメラーゼ
２．５単位及び同一の鋳型ＤＮＡ及び上記反応成分の存
在下、標準法を用いて増幅される。上述のごとき２５サ
イクル増幅の後、反応物をＨ2Ｏ １ｍｌに含ませ、各々
をセントリコン（Ｃentricon）１００カートリッジ（ア
ミコン、ダンバース（Ａmicon，Ｄanvers）、ＭＡ）中
に置き、４℃、３５００ｘｇで３０分遠心し、リテンテ
ート（retentate）を、別のＨ2Ｏ １ｍｌに再懸濁さ
せ、遠心をくり返す。最終リテンテートをＨ2Ｏ １００
μｌに再懸濁させる。４つの反応生成物の各々を合体し
（維持されたＤＮＡ溶液の各々１μｌ）、標準成分（Ｔ
ａｑポリメラーゼ２．５単位及びＰＣＲ組換え増幅プラ
イマー（第２６図）５０ピコモル）を加え、反応を２５
サイクル行なう。得られた０．８ｋｂ ＤＮＡ断片をフ
ェノール抽出し、エタノール沈殿により濃縮し、Ｓｐｅ
Ｉ及びＢａｍ Ｈ１制限酵素で消化する。アガロースゲ
ル電気泳動による、この０．８ｋｂ ＤＮＡ断片の精製
の後、それを、Ｈ鎖発現ベクターｐ８９５８にクローン
し、その後後者のプラスミドを、ＳｐｅＩ及びＢａｍ
Ｈ１制限酵素での消化により遊離されたＧａｌ／１Ｂ４
Ｈ鎖可変部挿入物から電気泳動により精製する。完全
ＣＤＲ増幅Ｇａｌ−ｍ１／１Ｂ４ Ｈ鎖発現プラスミド
ＤＮＡを、完全ＣＤＲ増幅ＲＥＩ／１Ｂ４ Ｌ鎖発現プ
ラスミドＤＮＡ又は完全ＣＤＲ増幅Ｌｅｎ／１Ｂ４ Ｌ
鎖発現プラスミドＤＮＡとともに（ＤＮＡ各１０ｕ
ｇ）、２９３細胞へトランスフェクトする。４８時間
後、調整培地中に存在する得られた抗体を、たんぱく質
Ａセファロースクロマトグラフィーにより単離し、結合
活性が測定される。Ｌ鎖可変部骨格の起源とはかかわり
なく、２つの抗体の、活性化ヒトＰＭＮ表面上のＣＤ１
８に対する測定された結合活性は、ほとんど同一であ
る。さらに、Ｌ鎖可変部骨格の役割もまたごく小さいも
のであると考えられる。変異化Ｇａｌ骨格（変異化Ｇａ
ｌ／Ｒｅｉ、第２０図）の結合活性は、非変異化Ｇａｌ
Ｈ鎖骨格（Ｇａｌ／Ｒｅｉ、第２０図）に対して著し
く改善され、その結合活性は、天然ｍ１Ｂ４のそれとほ
とんど等しい（第２０図）。変異化された３つの残基の
１つ以上が、ＣＤＲ（抗原結合部位）の能力発現に貢献
し、従って好ましい骨格選択は、組換え抗体の最適な人
体適合化のために重要であることが結論づけられる。実
際、ＣＤＲに最も近接する骨格が、ＣＤＲの最終構造配
置を決定し、それ故に抗原結合活性をも決定することは
明らかである。Ｈ鎖骨格をさらに比較することにより、
パッキング残基が試験された場合、Ｎｅｗ及びＪｏｎ又
はＧａｌのＨ鎖骨格の間の主な相違が明らかとなる（第
１４図）。ここに使用されたパッキング残基とは、鎖内
（intrastrand）力又は、中間鎖（interstrand）力にか
かわり得る構造の内部又は非表面露出残基と定義する。
これらのパッキング残基は、ＣＤＲ近傍の骨格領域と結
合され、抗体形成を誘導する物質との相互作用のための
ＣＤＲの好ましい配向にかかわる。Ｎｅｗの４１の内部
残基のうち２７のみがマウス１Ｂ４骨格における対応す
る残基と共通する。これはヒトＧａｌ骨格による４１残
基中３８の共通性とは対照をなす。骨格２を絡結するこ
れら残基に対する最も良好なバリエーションの領域の位
置づけは、Ｇａｌ支持抗体とＪｏｎ支持抗体の間の相違
を説明し得る。骨格２のこの領域は、これらの２つが異
なる場合及びＧａｌ−Ｍ１がＧａｌから異なる場合のも
のである。
基を、それらがマウス１Ｂ４骨格におけるカウンターパ
ートと同一になるように突然変異させるために選択され
る（第１４図参照）。３つのウエルに分けられた残基を
同時に突然変異させるために、以下の方法が行われる。
Ｇａｌ／１Ｂ４ＤＮＡ鋳型のＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ４
に位置されたアミノ酸残基を突然変異させるために必要
なデオキシヌクレオチド変質体を組み込む、４つのオリ
ゴデキシヌクレオチドプライマ対（第２６図）を合成す
る。この場合、４つのオーバーラップＤＮＡ断片を生成
するために必要なポリメラーゼ鎖反応物が、外側の２つ
のＤＮＡ断片を表わす一本鎖ＤＮＡを第一に生ずる方法
により増幅され、一方、内側の２つのＤＮＡ断片が、二
本鎖ＤＮＡを生成するように増幅された。４つの増幅さ
れたＤＮＡを結合させるこのアプローチは、上記修正に
より促進され、外側の増幅ＤＮＡ断片においてのみ見い
出される残基に対して独特な末端増幅オリゴデオキシヌ
クレオチドプライマーの使用と合体させた場合、増幅の
第１及び第２循環の間のＰＣＲ生成物を精製する必要性
をなくする。従って、不対象ＰＣＲが、２つの末端ＤＮ
Ａ断片を増幅するために使用される。標準ＰＣＲ増幅反
応において結合されたものは、プライマー＃Ｓ１、５０
ピコモル及びプライマー＃Ｇ２（第２６図）０．５ピコ
モル又はプライマー＃Ｉ２、５０ピコモル及びプライマ
ー＃Ｇ２（第２６図）０．５ピコモル及びプラスミドＤ
ＮＡ鋳型を含むＧａｌ／１Ｂ４（１０ｎｇ／反応）、Ｔ
ａｑポリメラーゼ２．５単位及び残りの標準反応成分で
ある。２つの内部ＤＮＡ断片は、各オリゴデオキシヌク
レオチドプライマー５０ピコモル、Ｔａｑポリメラーゼ
２．５単位及び同一の鋳型ＤＮＡ及び上記反応成分の存
在下、標準法を用いて増幅される。上述のごとき２５サ
イクル増幅の後、反応物をＨ2Ｏ １ｍｌに含ませ、各々
をセントリコン（Ｃentricon）１００カートリッジ（ア
ミコン、ダンバース（Ａmicon，Ｄanvers）、ＭＡ）中
に置き、４℃、３５００ｘｇで３０分遠心し、リテンテ
ート（retentate）を、別のＨ2Ｏ １ｍｌに再懸濁さ
せ、遠心をくり返す。最終リテンテートをＨ2Ｏ １００
μｌに再懸濁させる。４つの反応生成物の各々を合体し
（維持されたＤＮＡ溶液の各々１μｌ）、標準成分（Ｔ
ａｑポリメラーゼ２．５単位及びＰＣＲ組換え増幅プラ
イマー（第２６図）５０ピコモル）を加え、反応を２５
サイクル行なう。得られた０．８ｋｂ ＤＮＡ断片をフ
ェノール抽出し、エタノール沈殿により濃縮し、Ｓｐｅ
Ｉ及びＢａｍ Ｈ１制限酵素で消化する。アガロースゲ
ル電気泳動による、この０．８ｋｂ ＤＮＡ断片の精製
の後、それを、Ｈ鎖発現ベクターｐ８９５８にクローン
し、その後後者のプラスミドを、ＳｐｅＩ及びＢａｍ
Ｈ１制限酵素での消化により遊離されたＧａｌ／１Ｂ４
Ｈ鎖可変部挿入物から電気泳動により精製する。完全
ＣＤＲ増幅Ｇａｌ−ｍ１／１Ｂ４ Ｈ鎖発現プラスミド
ＤＮＡを、完全ＣＤＲ増幅ＲＥＩ／１Ｂ４ Ｌ鎖発現プ
ラスミドＤＮＡ又は完全ＣＤＲ増幅Ｌｅｎ／１Ｂ４ Ｌ
鎖発現プラスミドＤＮＡとともに（ＤＮＡ各１０ｕ
ｇ）、２９３細胞へトランスフェクトする。４８時間
後、調整培地中に存在する得られた抗体を、たんぱく質
Ａセファロースクロマトグラフィーにより単離し、結合
活性が測定される。Ｌ鎖可変部骨格の起源とはかかわり
なく、２つの抗体の、活性化ヒトＰＭＮ表面上のＣＤ１
８に対する測定された結合活性は、ほとんど同一であ
る。さらに、Ｌ鎖可変部骨格の役割もまたごく小さいも
のであると考えられる。変異化Ｇａｌ骨格（変異化Ｇａ
ｌ／Ｒｅｉ、第２０図）の結合活性は、非変異化Ｇａｌ
Ｈ鎖骨格（Ｇａｌ／Ｒｅｉ、第２０図）に対して著し
く改善され、その結合活性は、天然ｍ１Ｂ４のそれとほ
とんど等しい（第２０図）。変異化された３つの残基の
１つ以上が、ＣＤＲ（抗原結合部位）の能力発現に貢献
し、従って好ましい骨格選択は、組換え抗体の最適な人
体適合化のために重要であることが結論づけられる。実
際、ＣＤＲに最も近接する骨格が、ＣＤＲの最終構造配
置を決定し、それ故に抗原結合活性をも決定することは
明らかである。Ｈ鎖骨格をさらに比較することにより、
パッキング残基が試験された場合、Ｎｅｗ及びＪｏｎ又
はＧａｌのＨ鎖骨格の間の主な相違が明らかとなる（第
１４図）。ここに使用されたパッキング残基とは、鎖内
（intrastrand）力又は、中間鎖（interstrand）力にか
かわり得る構造の内部又は非表面露出残基と定義する。
これらのパッキング残基は、ＣＤＲ近傍の骨格領域と結
合され、抗体形成を誘導する物質との相互作用のための
ＣＤＲの好ましい配向にかかわる。Ｎｅｗの４１の内部
残基のうち２７のみがマウス１Ｂ４骨格における対応す
る残基と共通する。これはヒトＧａｌ骨格による４１残
基中３８の共通性とは対照をなす。骨格２を絡結するこ
れら残基に対する最も良好なバリエーションの領域の位
置づけは、Ｇａｌ支持抗体とＪｏｎ支持抗体の間の相違
を説明し得る。骨格２のこの領域は、これらの２つが異
なる場合及びＧａｌ−Ｍ１がＧａｌから異なる場合のも
のである。
【００３７】実施例３ 高められた発現システム この実施例は、実施例に記載の組換えＣＤＲ増幅１Ｂ４
抗体を大量に生成するために使用される発現システムを
示す。多くの哺乳類細胞に対して適切な第１の発現シス
テムは、ＥＢＮＡ−１／ｏｒｉＰベースＤＮＡプラスミ
ドの染色体外での特徴づけに利用できる（ヤテス等（Ｙ
ates et al.，）、ネイチャー：３／３：８１２、１９
８５）。ハイグロマイシンＢ選択カセットを含む、そう
いったベクター、すなわち、ハムバー等（Ｈamber et a
l.，）、プロク．ナトル．アカド．サイ．（Ｐroc．Ｎa
tl．Ａcad．Ｓci.）、ＵＳＡ、８５：４０１０、１９８
８）に記載のｐＲＥＰ３及び、重要とされる遺伝子の転
写のためのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲを、記
載されるごとく修飾した。ポリＡ付加シグナル同様にＲ
ＳＶＬＴＲも、ＳａｌＩ及びＸｂａＩでのｐＲＥＰ３プ
ラスミドＤＮＡの消化により除去され、次いで９．０２
ｋｂのプロモーターのない断片のアガロースゲル精製が
行われた。アデノウイルスの主な終期プロモーター、多
重クローニング部位及びＳＶ４０ポリＡ付加ジグナルを
含むプラスミドｐＤ５ｍｃｓからのＤＮＡ（第１０図参
照）を、ＳＶ４０エンハンサで始まり、ＳＶ４０ポリＡ
付加シグナルで終わるこれらの配列のＰＣＲ増幅のため
の鋳型として使用した。増幅過程において、ＸｂａＩ及
びＳａｌＩ制限酵素部位が、合成ＰＣＲオリゴデオキシ
ヌクレオチドプライマーへのそれらの組み込みにより生
成物末端に追加された。予期された１．２６ｋｂ ＰＣ
Ｒ増幅生成物を、ＸｂａＩ及びＳａｌＩ制限酵素での消
化の後アガロースゲル精製し、９．０２ｋｂ ＥＢＮＡ
／ｏｒｉＰバックボーンベクターへ結紮された。得られ
たプラスミドは、それぞれプラスミドｐ８９５８（第１
９図参照）又はｐ８９５３（第６図参照）に包含された
Ｈ鎖又はＬ鎖発現カセットのいずれかと結紮できる多用
途哺乳類発現ベクターより構成されている。ｐ８９１４
プラスミドもＥＤＮＡ／ｏｒｉＰバックボーンベクター
のＨＩＶＬＴＲプロモーター翻訳のための鋳型である。
ＨＩＶＬＴＲプロモーターへ乗り換えるために、ｐ８９
１４プラスミドＤＮＡは、ＢａｍＨ１及びＸｂａ１で消
化された。９．３５ｋｂのプロモーターのないバックボ
ーンは、アガロースゲル電気泳動により精製した。残基
−１１７から＋８０のＨＩＶＬＴＲ（ＨＩＶ−１ＬＴＲ
のこの部位を含むベクターｐＣＤ２３に見い出された
（カレン（Ｃullen）、セル４６：９７３〔１９８
６〕））は、ＳｐｅＩ及びＢｃｌＩ制限部位を生成物末
端に付加したオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを
用いるプラスミドｐＣＤ２３からＰＣＲ増幅された。得
られた０．２４ｋｂ ＰＣＲ生成物を後者の酵素で消化
した後、断片をアガロースゲルにより精製し、上記９．
３５ｋｂＤＮＡプロモーターなしＤＮＡ断片へ結紮し
た。構築されたｐ８９６２プラスミドもまた、Ｈ鎖及び
Ｌ鎖カセット（第３７図）を受容できる。これを行うた
めにｐ８９６２プラスミドＤＮＡを、ＤＮＡを線状化す
るために、ＮｏｔＩ及びＸｂａＩを用いて、多重クロー
ニング部位内で消化した。９．５ｋｂ線状発現ベクター
ＤＮＡを、ＮｏｔＩ及びＳｐｅＩ消化ｐ８９６０ＤＮＡ
のアガロースゲル精製により得られた２．５ｋｂ Ｈ鎖
カセットか又は、ＮｏｔＩ及びＳｐｅＩでのｐ８９５３
ＤＮＡの消化により同様に得られた１．５ｋｂ Ｌ鎖カ
セットへ結紮した。これらの構築されたＥＢＮＡ／ｏｒ
ｉＰベース発現ベクターｐ８９６９及びｐ８９６８（第
３８図）は、プラスミドｐＭＬＴＡＴ（シェケビッツ
（Ｓiekevitz）等、サイエンス２３８：１５７５〔１９
８７〕）で前もってトランスフェクトされていることに
よりＨＩＶ−１ＴＡＴたんぱく質を構造的に発現するＣ
ＶＩＰ（サル腎臓細胞、フィゲ（Ｆigge）等、セル５
２：７１３〔１９８８〕）へ、共にトランスフェクトさ
れた。１０％熱不活性化新生子牛血清を含むＤＭＥＭメ
ジューム中に生じた細胞クローン、Ｇ４１８２００μｇ
／ｍｌ及びハイグロマイシン（hygromycin）Ｂ１００μ
ｇ／ｍｌをクローニングシリンダー（フィシュニー，イ
ン，カルチャー オブ アニマル セル，アラン アール．
リス，インク．（Ｆishney，Ｉn，Ｃulture of Ａnimal
Ｃells，Ａlan Ｒ．Ｌiss，Ｉnc．）ニューヨーク、１
９８３）を用いて選択され、個々に発展された。クロー
ンを、前記ＥＬＩＳＡアッセイを用いて組換え抗体の分
泌のためにスクリーニングした。集合的細胞クローンを
進展させ、それらの抗体分泌レベルが、６ウエルプレー
ト培養のメジューム条件で９６時間あたり７５μｇ−２
μｇの抗体のセル（ther）範囲であることが決定され
た。これらのクローンの大部分の生成物は、結果採用さ
れマイクロキャリアー（シレデックス（cyledex）３及
びカルティスフェアー（cultisphere）ＧＬ）上で生長
し、細胞密度１〜２×１０6 セル／ｍｌで血清なしメジ
ュームにおいて、３日ごとのハーベストにより、組換え
抗体約１００ｍｇ／Ｌを生成した。
抗体を大量に生成するために使用される発現システムを
示す。多くの哺乳類細胞に対して適切な第１の発現シス
テムは、ＥＢＮＡ−１／ｏｒｉＰベースＤＮＡプラスミ
ドの染色体外での特徴づけに利用できる（ヤテス等（Ｙ
ates et al.，）、ネイチャー：３／３：８１２、１９
８５）。ハイグロマイシンＢ選択カセットを含む、そう
いったベクター、すなわち、ハムバー等（Ｈamber et a
l.，）、プロク．ナトル．アカド．サイ．（Ｐroc．Ｎa
tl．Ａcad．Ｓci.）、ＵＳＡ、８５：４０１０、１９８
８）に記載のｐＲＥＰ３及び、重要とされる遺伝子の転
写のためのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲを、記
載されるごとく修飾した。ポリＡ付加シグナル同様にＲ
ＳＶＬＴＲも、ＳａｌＩ及びＸｂａＩでのｐＲＥＰ３プ
ラスミドＤＮＡの消化により除去され、次いで９．０２
ｋｂのプロモーターのない断片のアガロースゲル精製が
行われた。アデノウイルスの主な終期プロモーター、多
重クローニング部位及びＳＶ４０ポリＡ付加ジグナルを
含むプラスミドｐＤ５ｍｃｓからのＤＮＡ（第１０図参
照）を、ＳＶ４０エンハンサで始まり、ＳＶ４０ポリＡ
付加シグナルで終わるこれらの配列のＰＣＲ増幅のため
の鋳型として使用した。増幅過程において、ＸｂａＩ及
びＳａｌＩ制限酵素部位が、合成ＰＣＲオリゴデオキシ
ヌクレオチドプライマーへのそれらの組み込みにより生
成物末端に追加された。予期された１．２６ｋｂ ＰＣ
Ｒ増幅生成物を、ＸｂａＩ及びＳａｌＩ制限酵素での消
化の後アガロースゲル精製し、９．０２ｋｂ ＥＢＮＡ
／ｏｒｉＰバックボーンベクターへ結紮された。得られ
たプラスミドは、それぞれプラスミドｐ８９５８（第１
９図参照）又はｐ８９５３（第６図参照）に包含された
Ｈ鎖又はＬ鎖発現カセットのいずれかと結紮できる多用
途哺乳類発現ベクターより構成されている。ｐ８９１４
プラスミドもＥＤＮＡ／ｏｒｉＰバックボーンベクター
のＨＩＶＬＴＲプロモーター翻訳のための鋳型である。
ＨＩＶＬＴＲプロモーターへ乗り換えるために、ｐ８９
１４プラスミドＤＮＡは、ＢａｍＨ１及びＸｂａ１で消
化された。９．３５ｋｂのプロモーターのないバックボ
ーンは、アガロースゲル電気泳動により精製した。残基
−１１７から＋８０のＨＩＶＬＴＲ（ＨＩＶ−１ＬＴＲ
のこの部位を含むベクターｐＣＤ２３に見い出された
（カレン（Ｃullen）、セル４６：９７３〔１９８
６〕））は、ＳｐｅＩ及びＢｃｌＩ制限部位を生成物末
端に付加したオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを
用いるプラスミドｐＣＤ２３からＰＣＲ増幅された。得
られた０．２４ｋｂ ＰＣＲ生成物を後者の酵素で消化
した後、断片をアガロースゲルにより精製し、上記９．
３５ｋｂＤＮＡプロモーターなしＤＮＡ断片へ結紮し
た。構築されたｐ８９６２プラスミドもまた、Ｈ鎖及び
Ｌ鎖カセット（第３７図）を受容できる。これを行うた
めにｐ８９６２プラスミドＤＮＡを、ＤＮＡを線状化す
るために、ＮｏｔＩ及びＸｂａＩを用いて、多重クロー
ニング部位内で消化した。９．５ｋｂ線状発現ベクター
ＤＮＡを、ＮｏｔＩ及びＳｐｅＩ消化ｐ８９６０ＤＮＡ
のアガロースゲル精製により得られた２．５ｋｂ Ｈ鎖
カセットか又は、ＮｏｔＩ及びＳｐｅＩでのｐ８９５３
ＤＮＡの消化により同様に得られた１．５ｋｂ Ｌ鎖カ
セットへ結紮した。これらの構築されたＥＢＮＡ／ｏｒ
ｉＰベース発現ベクターｐ８９６９及びｐ８９６８（第
３８図）は、プラスミドｐＭＬＴＡＴ（シェケビッツ
（Ｓiekevitz）等、サイエンス２３８：１５７５〔１９
８７〕）で前もってトランスフェクトされていることに
よりＨＩＶ−１ＴＡＴたんぱく質を構造的に発現するＣ
ＶＩＰ（サル腎臓細胞、フィゲ（Ｆigge）等、セル５
２：７１３〔１９８８〕）へ、共にトランスフェクトさ
れた。１０％熱不活性化新生子牛血清を含むＤＭＥＭメ
ジューム中に生じた細胞クローン、Ｇ４１８２００μｇ
／ｍｌ及びハイグロマイシン（hygromycin）Ｂ１００μ
ｇ／ｍｌをクローニングシリンダー（フィシュニー，イ
ン，カルチャー オブ アニマル セル，アラン アール．
リス，インク．（Ｆishney，Ｉn，Ｃulture of Ａnimal
Ｃells，Ａlan Ｒ．Ｌiss，Ｉnc．）ニューヨーク、１
９８３）を用いて選択され、個々に発展された。クロー
ンを、前記ＥＬＩＳＡアッセイを用いて組換え抗体の分
泌のためにスクリーニングした。集合的細胞クローンを
進展させ、それらの抗体分泌レベルが、６ウエルプレー
ト培養のメジューム条件で９６時間あたり７５μｇ−２
μｇの抗体のセル（ther）範囲であることが決定され
た。これらのクローンの大部分の生成物は、結果採用さ
れマイクロキャリアー（シレデックス（cyledex）３及
びカルティスフェアー（cultisphere）ＧＬ）上で生長
し、細胞密度１〜２×１０6 セル／ｍｌで血清なしメジ
ュームにおいて、３日ごとのハーベストにより、組換え
抗体約１００ｍｇ／Ｌを生成した。
【００３８】実施例４ 組換えヒト抗−ＣＤ１８抗体のインビトロ活性 結合活性決定の精度を上げるために、実施例２のＩＢ４
競合結合アッセイを以上のごとく修正した。ｍＩＢ４
（５０μｇ）及びｈＩＢ４（実施例３からの）のいずれ
もが、クロラミン−Ｔ及び、５〜３００×１０3 ダルト
ンの範囲でたんぱく質を分画するバイオ−シル（Ｂio−
Ｓil）ＴＳＫ２５０（バイオラッド）ゲルロ過ＨＰＬＣ
カラムにより精製された放射線標識ＩｇＧを用いてヨウ
素化された。放出放射活性を、ベックマン＃１７０イン
−ラインガンマカウンター（ベックマン、フラートン
（Ｆullerton）、ＣＡ）を用いてモニターし、全たんぱ
く質を、クラトス スペクトロフロー（Ｋratos Ｓpect
oflow）７５７検出器（クラトス、マーワー（Ｍahwah）
ＮＪ）を用いて２８０ｎｍの吸光度により検出し、カラ
ムを０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で平衡化
した。一致した吸光度及び放射活性トレースの単一の対
称ピークが、サンプル注入後６分３０秒で常に観察され
た（このシステムにおけるＩｇＧの保持時間特性）。生
成物の特異活性は通常ｍ１Ｂ４については１０ｍＣｉ／
ｍｇ又はｈ１Ｂ４については７０ｍＣｉ／ｍｇであり、
カウントの９６〜９８％は、いずれかのケースにおいて
トリクロロ酢酸沈殿性であった。125Ｉ標識抗体のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーは、放射線標
識後に１Ｂ４が影響を受けていないことを示した。これ
らの放射線標識プローブを用いて、競合125Ｉ−１Ｂ４
懸濁結合アッセイが、白血球表面で発現したＣＤ１８に
対するｍ１Ｂ４又はγ−ｈ−抗ＣＤ１８（ｈ１Ｂ４）の
結合活性を決定するために行われた。ヒト静脈血が直ち
にヘパリン（１．０単位／ｍｌ）中に集められた。ＰＭ
Ｎを、フィコール／ヒパクー（Ｆicoll／Ｈypaque）勾
配において精製し、２０ｍＭヘペス（Ｈepes）（ｐＨ
７．２）を含むハンクス均衡塩類溶液中ホルボールミリ
スチル酸アセテート１００ｎｇ／ｍｌ、アプロチニン
０．１４単位及び２％ヒト血清アルブミン（結合バッフ
ァー）で３７℃２０分活性化した。生存率は、ＰＭＡ活
性化の後のトリパンブルー排除により常に＞９５％であ
った。結合バッファーで洗浄後、１×１０5 刺激ＰＭＮ
の分別物を、２つの部分又は３つの部分から成る３００
ｍｌ容量中非標識マウス又は人間適合化１Ｂ４（約１０
-15〜１０-7Ｍ）の増加する濃度の存在下約２〜４×１
０- 11Ｍ125Ｉ−１Ｂ４中で、１時間４℃で一定の振動を
加えつつインキュベートした。精製された放射性ヨウ素
化１Ｂ４又は競合体として加えられた非標識抗体の濃度
は、ｍＩＢ４については１．３５、突然変異体Ｇａｌ／
Ｒｅｉｈ１Ｂ４については１．２５及び他の全てのｈＩ
Ｂ４については１．３０の構成のＥ280を用いてＵ．
Ｖ．吸収により決定された。〔式Ｅ＝Ａ（Ｅｃｙｓ）＋
Ａ（Ｅｔｒｙｐ）＋Ａ（Ｅｔｙｒ）により決定された。
ここでＡは、各アミノ酸残基の数である（ギル及びフォ
ン ヒペル アナル．バイオケム．（Ｇill and von Ｈ
ippel，Ａnal．Ｂiochem．）１８２：３１９〜３２８、
１９８９）。ｍＩＢ４及びＧａｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４の
Ｅ280もまた、質量アミノ酸分析及び異なるＵ．Ｖ．分
光により立証された。〕標識化の後、細胞へ結合した
125Ｉ−１Ｂ４を、０．５Ｍサッカロース２５０ｕｌで
ＰＭＮの各分別物を支持し、遠心（４，８００ｘｇ、３
分）することにより非結合抗体から分離した。チューブ
は、ドライアイス上で凍結され、先端が切り取られ、Ｌ
ＫＢガンマカウンターでカウントされた。精製された非
標識競合体ＩｇＧの各濃度に対するＰＭＮ−結合125Ｉ
−１Ｂ４の量は、１×１０5ＰＭＮ当たりの平均ＣＰＭ
（±ＳＥＭ）として表わされた。125Ｉ−１Ｂ４結合抑
制のためのＩＣ50は、４つのパラメータープログラムを
用いて計算された（“フィッター”（Ｆitter）；ロド
バード，ムンソン（Ｒodbard，Ｍunson）及びデレーン
（Ｄelean）（“医薬におけるラジオイムノアッセイ及
び関連法”において）、インターナショナル アトミッ
ク エネルギー エージェンシー、ウイーン、１巻、４６
９〜５０４、１９７８）。結合アッセイの結果は、第１
３、２０、２８、２９図において説明される。（Ｐ値
は、スチューデント アンペアードｔ−検定からのもの
である。）これらのデータは、１）ＰＭＮＣＤ１８に対
するＧａｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４の結合活性がｍ１Ｂ４の
それとほとんど一致する（約２〜３倍弱い）。２）Ｊｏ
ｎ／Ｒｅｉ及びＮｅｗ／Ｒｅｉの結合活性が、ｍ１Ｂ４
骨格に対する相同性の程度と反比例して相互に関連する
配列におけるＧａｌ／Ｒｅｉの結合活性よりもさらに弱
い。３）Ｇａｌ／Ｌｅｎの結合活性がＧａｌ／Ｒｅｉの
それとほとんど等しい。及び４）突然変異Ｇａｌ／Ｒｅ
ｉ及び部分的キメラ構成物が、天然１Ｂ４と明らかに共
通の親和性を有することを示している。
競合結合アッセイを以上のごとく修正した。ｍＩＢ４
（５０μｇ）及びｈＩＢ４（実施例３からの）のいずれ
もが、クロラミン−Ｔ及び、５〜３００×１０3 ダルト
ンの範囲でたんぱく質を分画するバイオ−シル（Ｂio−
Ｓil）ＴＳＫ２５０（バイオラッド）ゲルロ過ＨＰＬＣ
カラムにより精製された放射線標識ＩｇＧを用いてヨウ
素化された。放出放射活性を、ベックマン＃１７０イン
−ラインガンマカウンター（ベックマン、フラートン
（Ｆullerton）、ＣＡ）を用いてモニターし、全たんぱ
く質を、クラトス スペクトロフロー（Ｋratos Ｓpect
oflow）７５７検出器（クラトス、マーワー（Ｍahwah）
ＮＪ）を用いて２８０ｎｍの吸光度により検出し、カラ
ムを０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で平衡化
した。一致した吸光度及び放射活性トレースの単一の対
称ピークが、サンプル注入後６分３０秒で常に観察され
た（このシステムにおけるＩｇＧの保持時間特性）。生
成物の特異活性は通常ｍ１Ｂ４については１０ｍＣｉ／
ｍｇ又はｈ１Ｂ４については７０ｍＣｉ／ｍｇであり、
カウントの９６〜９８％は、いずれかのケースにおいて
トリクロロ酢酸沈殿性であった。125Ｉ標識抗体のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーは、放射線標
識後に１Ｂ４が影響を受けていないことを示した。これ
らの放射線標識プローブを用いて、競合125Ｉ−１Ｂ４
懸濁結合アッセイが、白血球表面で発現したＣＤ１８に
対するｍ１Ｂ４又はγ−ｈ−抗ＣＤ１８（ｈ１Ｂ４）の
結合活性を決定するために行われた。ヒト静脈血が直ち
にヘパリン（１．０単位／ｍｌ）中に集められた。ＰＭ
Ｎを、フィコール／ヒパクー（Ｆicoll／Ｈypaque）勾
配において精製し、２０ｍＭヘペス（Ｈepes）（ｐＨ
７．２）を含むハンクス均衡塩類溶液中ホルボールミリ
スチル酸アセテート１００ｎｇ／ｍｌ、アプロチニン
０．１４単位及び２％ヒト血清アルブミン（結合バッフ
ァー）で３７℃２０分活性化した。生存率は、ＰＭＡ活
性化の後のトリパンブルー排除により常に＞９５％であ
った。結合バッファーで洗浄後、１×１０5 刺激ＰＭＮ
の分別物を、２つの部分又は３つの部分から成る３００
ｍｌ容量中非標識マウス又は人間適合化１Ｂ４（約１０
-15〜１０-7Ｍ）の増加する濃度の存在下約２〜４×１
０- 11Ｍ125Ｉ−１Ｂ４中で、１時間４℃で一定の振動を
加えつつインキュベートした。精製された放射性ヨウ素
化１Ｂ４又は競合体として加えられた非標識抗体の濃度
は、ｍＩＢ４については１．３５、突然変異体Ｇａｌ／
Ｒｅｉｈ１Ｂ４については１．２５及び他の全てのｈＩ
Ｂ４については１．３０の構成のＥ280を用いてＵ．
Ｖ．吸収により決定された。〔式Ｅ＝Ａ（Ｅｃｙｓ）＋
Ａ（Ｅｔｒｙｐ）＋Ａ（Ｅｔｙｒ）により決定された。
ここでＡは、各アミノ酸残基の数である（ギル及びフォ
ン ヒペル アナル．バイオケム．（Ｇill and von Ｈ
ippel，Ａnal．Ｂiochem．）１８２：３１９〜３２８、
１９８９）。ｍＩＢ４及びＧａｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４の
Ｅ280もまた、質量アミノ酸分析及び異なるＵ．Ｖ．分
光により立証された。〕標識化の後、細胞へ結合した
125Ｉ−１Ｂ４を、０．５Ｍサッカロース２５０ｕｌで
ＰＭＮの各分別物を支持し、遠心（４，８００ｘｇ、３
分）することにより非結合抗体から分離した。チューブ
は、ドライアイス上で凍結され、先端が切り取られ、Ｌ
ＫＢガンマカウンターでカウントされた。精製された非
標識競合体ＩｇＧの各濃度に対するＰＭＮ−結合125Ｉ
−１Ｂ４の量は、１×１０5ＰＭＮ当たりの平均ＣＰＭ
（±ＳＥＭ）として表わされた。125Ｉ−１Ｂ４結合抑
制のためのＩＣ50は、４つのパラメータープログラムを
用いて計算された（“フィッター”（Ｆitter）；ロド
バード，ムンソン（Ｒodbard，Ｍunson）及びデレーン
（Ｄelean）（“医薬におけるラジオイムノアッセイ及
び関連法”において）、インターナショナル アトミッ
ク エネルギー エージェンシー、ウイーン、１巻、４６
９〜５０４、１９７８）。結合アッセイの結果は、第１
３、２０、２８、２９図において説明される。（Ｐ値
は、スチューデント アンペアードｔ−検定からのもの
である。）これらのデータは、１）ＰＭＮＣＤ１８に対
するＧａｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４の結合活性がｍ１Ｂ４の
それとほとんど一致する（約２〜３倍弱い）。２）Ｊｏ
ｎ／Ｒｅｉ及びＮｅｗ／Ｒｅｉの結合活性が、ｍ１Ｂ４
骨格に対する相同性の程度と反比例して相互に関連する
配列におけるＧａｌ／Ｒｅｉの結合活性よりもさらに弱
い。３）Ｇａｌ／Ｌｅｎの結合活性がＧａｌ／Ｒｅｉの
それとほとんど等しい。及び４）突然変異Ｇａｌ／Ｒｅ
ｉ及び部分的キメラ構成物が、天然１Ｂ４と明らかに共
通の親和性を有することを示している。
【００３９】ヒトへそ静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）単層
にに対するＰＭＮ付着の抑制 組織部へ達するため、及び炎症性損傷を生じるために、
ＰＭＮは血流外に出されなければならない。このトラン
ス内皮移動は、ヒト内皮細胞上又は内のリガンドと、Ｐ
ＭＮＣＤ１８含有レセプターとの相互作用に依存する。
このプロセスの直接の表現は、血管表面への拮抗処理Ｐ
ＭＮの結合により反映される。Ｇａｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ
４がヒトの病気のための使用に期待される抗炎症剤であ
ることを実証するために、我は、この構成物が鎮静ヒト
内皮細胞単層へのＰＭＡ−刺激ｈＰＭＮの付着を抑制す
るか否かを決定した。ヒトへそ静脈内皮細胞（ＨＵＶＥ
Ｃ）は、ＰＢＳで１：１０に希釈され、基板上で乾燥さ
れたビトロジエン１００（Ｖitrogen）（コラーゲンコ
ープ.，パロアルト，（Ｃollagen Ｃorp.，Ｐalo Ａlt
o，）（Ａ）でコートされたＴ−７５フラスコ中で生長
された。培養メジュームは、１５％ＦＣＳ、ペパリン９
０ｍｇ／ｍｌ（ギブコ）及び内皮マイトジエン１５０ｍ
ｇ／ｍｌ（バイオメディカル テクノロージーズ，イン
ク．）で補足されたＭＣＤＢ１０７であった。細胞は
２．５％ＣＯ2及び９７．５％エアー下においてインキ
ュベートされた。培養物（継代４〜８回）をトリプシン
／ＥＤＴＡで分離し、ＨＵＶＥＣを、０．１Ｍ炭酸水素
塩（ｐＨ８．３）中精製されたヒトプラズマフィブロネ
クチンの０．５μｇ／ｍｌ溶液で前もってコートされた
９６−ウエルマイクロタイタープレート（コスター（Ｃ
ostar））にまいた。これらのマイクロ培養物は、融合
に達すると同時に結合アッセイのために使用された。ヒ
トＰＭＮを、上記のごとく末梢血から精製した。螢光顕
微鏡によりＨＵＶＥＣ単層へのそれらの結合を測定する
ために、ＰＭＮを生体螢光染料１'，１'−ジオクタデシ
ル−３，３，３'，３'−テトラメチルインドカルボシア
ニン（ＤｉＩ）（モレキュラープローブス インク）で
標識した。ＰＭＮを結合バッファー中ＤｉＩの２５ｍｇ
／ｍｌ超音波処理溶液中で３７℃で１０分インキュベー
トし、洗浄し、次いでＰＭＡ又はＰＤＢ５０〜１００ｎ
ｇ／ｍｌで３７℃１０分活性化した。（これらのＤｉＩ
標識ＰＭＮは、それらのＣＤ１８レセプターがｈ１Ｂ４
により認識されることを立証するために、競合１Ｂ４結
合アッセイによりテストされた。ＩＣ50は非標識ＰＭＮ
について予期された範囲内であった。）ＰＭＮ分別物
（４分割）を、Ｇａｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４、ｍ１Ｂ４又
はコントロールＭａｂＯＫＭ−１（ＣＲ３レセプターの
ＣＤ１１６成分と結合するが、リガンド結合を抑制しな
い）のいずれかの濃度を増加させつつ調製した。インキ
ュベーションを、一定に振動させながら４℃で１５分行
ない、細胞をＨＵＶＥＣ単層を有するマイクロウエル中
に置いた（５０，０００〜１００，０００ＰＭＮ／ウエ
ル）。ＰＭＮを４℃で５分鎮静させ、次いで３７℃で１
５分インキュベートし強く付着させた。非結合ＰＭＮを
除去し、培養物をＰＢＳ中１％ホルムアルデヒドで穏や
かに洗浄することにより固定させた（エッペンドルフ
プラス８マルチチップ ピペットで４回洗浄）。ウエル
をグリセロール中５％ｎ−プロピル泡食子酸塩溶液で満
たし結合ＰＭＮを、オートフォーカス装置を具備する自
動化ニコンダイアフォト（Ｄiaphot）反転螢光顕微鏡、
特注動力化ステージ及び３０００型イメージアナライザ
ーコーポ.，デールパーク，ＮＹ）及びＩＢＭ ＰＣＸＴ
コンピューターと連結したビデオカメラ（ビディコン
（Ｖidicon）＃８４５１）を用いてローダミンイルミネ
ーション下で１９５×でカウントされた。付着ＰＭＮの
平均数を、テストされたＭａｂの各濃度について決定し
（ＩＳＥＭ）、抑制曲線プラスＩＣ50が“フィッター”
プログラム（ロドバード等、スープラ．（ｓｕｐｒ
ａ．））で生成された。データは標準化された。これら
の実験の結果は、第３０、３１図に示される。Ｇａｌ／
Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４及びｍ１Ｂ４のいずれもが、スチュー
デントアンペアードｔ検定により、問題とならない程の
相異であるほとんど等しいＩＣ50（４〜８ｎＭ）と一致
したＳ字形抑制曲線を形成した。従って、Ｇａｌ／Ｒｅ
ｉ ｈ１Ｂ４は、定量的同型インビトロ付着アッセイに
おいて、天然ｍ１Ｂ４と同程度までヒトへそ静脈内皮細
胞単層への活性化ｈＰＭＮの付着を抑制し、これは抗炎
症活性を明らかにするものである。
にに対するＰＭＮ付着の抑制 組織部へ達するため、及び炎症性損傷を生じるために、
ＰＭＮは血流外に出されなければならない。このトラン
ス内皮移動は、ヒト内皮細胞上又は内のリガンドと、Ｐ
ＭＮＣＤ１８含有レセプターとの相互作用に依存する。
このプロセスの直接の表現は、血管表面への拮抗処理Ｐ
ＭＮの結合により反映される。Ｇａｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ
４がヒトの病気のための使用に期待される抗炎症剤であ
ることを実証するために、我は、この構成物が鎮静ヒト
内皮細胞単層へのＰＭＡ−刺激ｈＰＭＮの付着を抑制す
るか否かを決定した。ヒトへそ静脈内皮細胞（ＨＵＶＥ
Ｃ）は、ＰＢＳで１：１０に希釈され、基板上で乾燥さ
れたビトロジエン１００（Ｖitrogen）（コラーゲンコ
ープ.，パロアルト，（Ｃollagen Ｃorp.，Ｐalo Ａlt
o，）（Ａ）でコートされたＴ−７５フラスコ中で生長
された。培養メジュームは、１５％ＦＣＳ、ペパリン９
０ｍｇ／ｍｌ（ギブコ）及び内皮マイトジエン１５０ｍ
ｇ／ｍｌ（バイオメディカル テクノロージーズ，イン
ク．）で補足されたＭＣＤＢ１０７であった。細胞は
２．５％ＣＯ2及び９７．５％エアー下においてインキ
ュベートされた。培養物（継代４〜８回）をトリプシン
／ＥＤＴＡで分離し、ＨＵＶＥＣを、０．１Ｍ炭酸水素
塩（ｐＨ８．３）中精製されたヒトプラズマフィブロネ
クチンの０．５μｇ／ｍｌ溶液で前もってコートされた
９６−ウエルマイクロタイタープレート（コスター（Ｃ
ostar））にまいた。これらのマイクロ培養物は、融合
に達すると同時に結合アッセイのために使用された。ヒ
トＰＭＮを、上記のごとく末梢血から精製した。螢光顕
微鏡によりＨＵＶＥＣ単層へのそれらの結合を測定する
ために、ＰＭＮを生体螢光染料１'，１'−ジオクタデシ
ル−３，３，３'，３'−テトラメチルインドカルボシア
ニン（ＤｉＩ）（モレキュラープローブス インク）で
標識した。ＰＭＮを結合バッファー中ＤｉＩの２５ｍｇ
／ｍｌ超音波処理溶液中で３７℃で１０分インキュベー
トし、洗浄し、次いでＰＭＡ又はＰＤＢ５０〜１００ｎ
ｇ／ｍｌで３７℃１０分活性化した。（これらのＤｉＩ
標識ＰＭＮは、それらのＣＤ１８レセプターがｈ１Ｂ４
により認識されることを立証するために、競合１Ｂ４結
合アッセイによりテストされた。ＩＣ50は非標識ＰＭＮ
について予期された範囲内であった。）ＰＭＮ分別物
（４分割）を、Ｇａｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４、ｍ１Ｂ４又
はコントロールＭａｂＯＫＭ−１（ＣＲ３レセプターの
ＣＤ１１６成分と結合するが、リガンド結合を抑制しな
い）のいずれかの濃度を増加させつつ調製した。インキ
ュベーションを、一定に振動させながら４℃で１５分行
ない、細胞をＨＵＶＥＣ単層を有するマイクロウエル中
に置いた（５０，０００〜１００，０００ＰＭＮ／ウエ
ル）。ＰＭＮを４℃で５分鎮静させ、次いで３７℃で１
５分インキュベートし強く付着させた。非結合ＰＭＮを
除去し、培養物をＰＢＳ中１％ホルムアルデヒドで穏や
かに洗浄することにより固定させた（エッペンドルフ
プラス８マルチチップ ピペットで４回洗浄）。ウエル
をグリセロール中５％ｎ−プロピル泡食子酸塩溶液で満
たし結合ＰＭＮを、オートフォーカス装置を具備する自
動化ニコンダイアフォト（Ｄiaphot）反転螢光顕微鏡、
特注動力化ステージ及び３０００型イメージアナライザ
ーコーポ.，デールパーク，ＮＹ）及びＩＢＭ ＰＣＸＴ
コンピューターと連結したビデオカメラ（ビディコン
（Ｖidicon）＃８４５１）を用いてローダミンイルミネ
ーション下で１９５×でカウントされた。付着ＰＭＮの
平均数を、テストされたＭａｂの各濃度について決定し
（ＩＳＥＭ）、抑制曲線プラスＩＣ50が“フィッター”
プログラム（ロドバード等、スープラ．（ｓｕｐｒ
ａ．））で生成された。データは標準化された。これら
の実験の結果は、第３０、３１図に示される。Ｇａｌ／
Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４及びｍ１Ｂ４のいずれもが、スチュー
デントアンペアードｔ検定により、問題とならない程の
相異であるほとんど等しいＩＣ50（４〜８ｎＭ）と一致
したＳ字形抑制曲線を形成した。従って、Ｇａｌ／Ｒｅ
ｉ ｈ１Ｂ４は、定量的同型インビトロ付着アッセイに
おいて、天然ｍ１Ｂ４と同程度までヒトへそ静脈内皮細
胞単層への活性化ｈＰＭＮの付着を抑制し、これは抗炎
症活性を明らかにするものである。
【００４０】ＣＴＬ介在細胞融解の抑制 細胞毒性Ｔ−リンパ球（ＣＴＬ）が誘導した細胞殺傷
は、組織又は器官移植後の拒絶反応の重要な要素であ
る。標的細胞への付着又は殺傷がＣＤ１８依存細胞間付
着行為であることから、我々は、Ｇａｌ／Ｒｅｉ ｈ１
Ｂ４がヒトＣＴＬ−介在細胞融解を抑制するか否かを決
定した。ヒトＱ−３１ＣＴＬ細胞を、１０％子牛血清及
び組換えヒトＩＬ−２（３０単位／ｍｌ）で補足された
ＲＰＭＩ１６４０中で培養した。分化状態を誘導するた
めに、照射を受けたＪＹヒトリンパ芽球細胞の断片を６
〜７日培地に加えた。ＪＹ細胞をＩＬ−２を除いて上記
のごとく増殖させ、Ｑ３１細胞に対する標的としても使
用した。細胞殺傷におけるｍ１Ｂ４及びＧａｌ／Ｒｅｉ
ｈ１Ｂ４の効果を比較するために、Ｑ−３１細胞を、
標的細胞を加える前に、２５℃で３０分種々の抗体濃度
の培地で培養された。細胞融解を定量するために、ＪＹ
細胞を51Ｃｒで標識し、８：１から２５：１の間の種々
のＥ：Ｔ比でのエフェクター細胞と３７℃で混合した。
４時間後、抗体の各濃度の培地へ遊離された51Ｃｒのパ
ーセントが細胞殺傷の指針として決定された（３分割に
おいて）。ｍ１Ｂ４（ｍＯＫＭ−１コントロール）又は
Ｇａｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４（ｈＩｇＧ４コントロール）
の種々の濃度で同時に形成された細胞殺傷曲線は、ＩＣ
50を計算するために利用された（第３１図）。Ｇａｌ／
Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４及び１Ｂ４のいずれもが、同定度にＪ
Ｙ細胞融解を抑制した。各ケースにおいて、平均ＩＣ50
は、約２ｎＭ １Ｂ４と等しく、両抗体の抑制曲線は重
ね合わされるものであった。これらの結果は、Ｇａｌ／
Ｒｅｉ １Ｂ４が、移植組織及び器官の拒絶反応を防止
することができることを示している。
は、組織又は器官移植後の拒絶反応の重要な要素であ
る。標的細胞への付着又は殺傷がＣＤ１８依存細胞間付
着行為であることから、我々は、Ｇａｌ／Ｒｅｉ ｈ１
Ｂ４がヒトＣＴＬ−介在細胞融解を抑制するか否かを決
定した。ヒトＱ−３１ＣＴＬ細胞を、１０％子牛血清及
び組換えヒトＩＬ−２（３０単位／ｍｌ）で補足された
ＲＰＭＩ１６４０中で培養した。分化状態を誘導するた
めに、照射を受けたＪＹヒトリンパ芽球細胞の断片を６
〜７日培地に加えた。ＪＹ細胞をＩＬ−２を除いて上記
のごとく増殖させ、Ｑ３１細胞に対する標的としても使
用した。細胞殺傷におけるｍ１Ｂ４及びＧａｌ／Ｒｅｉ
ｈ１Ｂ４の効果を比較するために、Ｑ−３１細胞を、
標的細胞を加える前に、２５℃で３０分種々の抗体濃度
の培地で培養された。細胞融解を定量するために、ＪＹ
細胞を51Ｃｒで標識し、８：１から２５：１の間の種々
のＥ：Ｔ比でのエフェクター細胞と３７℃で混合した。
４時間後、抗体の各濃度の培地へ遊離された51Ｃｒのパ
ーセントが細胞殺傷の指針として決定された（３分割に
おいて）。ｍ１Ｂ４（ｍＯＫＭ−１コントロール）又は
Ｇａｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４（ｈＩｇＧ４コントロール）
の種々の濃度で同時に形成された細胞殺傷曲線は、ＩＣ
50を計算するために利用された（第３１図）。Ｇａｌ／
Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４及び１Ｂ４のいずれもが、同定度にＪ
Ｙ細胞融解を抑制した。各ケースにおいて、平均ＩＣ50
は、約２ｎＭ １Ｂ４と等しく、両抗体の抑制曲線は重
ね合わされるものであった。これらの結果は、Ｇａｌ／
Ｒｅｉ １Ｂ４が、移植組織及び器官の拒絶反応を防止
することができることを示している。
【００４１】Ｇａｌ／Ｒｅｉ ＨｈＢ４の組織及び細胞
特異性 人間適合化過程は、組織、細胞、それらの細胞小器官へ
の結合、及びそれらの予期せぬ部位への堆積をｈ１Ｂ４
にもたらす異常結合特性を、毒性の結果とともに生ず
る。Ｇａｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４の結合特性が変えられる
のか否かを確かめるために、我は、種々のウサギ組織、
及びヒトＰＭＮ、Ｕ−９３７細胞及び繊維芽細胞におけ
る、Ｇａｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４及び天然ｍ１Ｂ４の免疫
螢光顕微鏡的（ＩＦ）及び免疫電子顕微鏡的（ＩＥＭ）
位置づけを比較した。
特異性 人間適合化過程は、組織、細胞、それらの細胞小器官へ
の結合、及びそれらの予期せぬ部位への堆積をｈ１Ｂ４
にもたらす異常結合特性を、毒性の結果とともに生ず
る。Ｇａｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４の結合特性が変えられる
のか否かを確かめるために、我は、種々のウサギ組織、
及びヒトＰＭＮ、Ｕ−９３７細胞及び繊維芽細胞におけ
る、Ｇａｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４及び天然ｍ１Ｂ４の免疫
螢光顕微鏡的（ＩＦ）及び免疫電子顕微鏡的（ＩＥＭ）
位置づけを比較した。
【００４２】組織及び細胞のＩＦ着色 健康な２ｋｇオスニュージーランド白ウサギを安楽死さ
せ、約１．０×１．０×０．５ｃｍ3組織片を摘出し、
ＯＣＴマウンティングメジューム（ミレス（Ｍiles））
に沈め、〜−１５０℃での液体窒素冷却フレオン（Ｆre
on）２２（デュポン）中で迅速に凍結させた。サンプル
を、以下の器官から得た。それらは、骨髄、大脳、腎
臓、大腸、肝臓、肺、リンパ節、心筋層、胃、線条筋
（ｌｅｇ）及び脾臓である。サンプルは−８０℃で保存
された。実験日に、５μｍの凍結組織片を低温保持装置
を用いて−２０℃でカットし、ポリＬ−リシンでコート
されたガラススライド上に置き２５℃で風乾した。その
片を、ＣＤ１８抗原の変性を回避するために固定せず
に、直ちに免疫着色した。非特異的結合を抑制するため
に、スライドを、０．１Ｍトリス−ＨＣｌバッファー
（ｐＨ７．８）で洗浄し、０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｎ
ａＮ3及び０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．８）中
５％脂肪不在ドライミルク（カーネーション）の溶液の
清澄上清とともに２５℃で１時間培養した。次に来る着
色工程もすべて、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
８）で断続的に洗浄しながら２５℃１時間で行われた。
単一標識実験において、片を、着色バッファー〔０．１
％脂肪不在ドライミルク、０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｎ
ａＮ3及び０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．８）〕
中プライマリー抗体（ｍ１Ｂ４、Ｇａｌ／Ｒｅｉ ｈ１
Ｂ４又はｈＩｇＧ４コントロール）の２０μｇ／ｍｌ溶
液で着色された。結合抗体を、フルキレセインイソチオ
シアネート結合親和精製ヤギ抗マウスＩｇＧ又はヤギ抗
ヒトＩｇＧＦＩＴＣ結合体（キルケガード及びペリ，イ
ンク．（Ｋirkegaard and Ｐerry，Ｉnc．）の着色バッ
ファー中２５μｇ／ｍｌ溶液を用いて間接的に検出し
た。二重着色実験においては、標本を、プライマリー抗
体（１２，０００×ｇで１５分遠心された着色バッファ
ー中１μｇ／ｍｌ ｍ１Ｂ４及び１μｇ／ｍｌ ｈ１Ｂ
４）の混合物で、次いで清澄混合抗体検出溶液〔着色バ
ッファー中２５μｇ／ｍｌフルオレセインイソチオシア
ネート結合親和精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ及び２５μｇ／ｍ
ｌローダミンイソチオシアネート結合親和精製ヤギ抗マ
ウスＩｇＧ（キルケガード及びプリー，インク．）〕で
免疫標識した。２重標識実験のためのコントロールは、
混合ｍ１Ｂ４プラスｈＩｇＧ４（各抗体１μｇ／ｍｌ）
又はｍ１Ｂ４、Ｇａｌ／Ｒｅｉｈ１Ｂ４及びｈＩｇＧ４
（着色バッファー中ＩｇＧ１μｇ／ｍｌでのみ溶解され
た）の清澄溶液であった。ＩｇＧを上記混合抗体検出溶
液とともに切片上に位置づけた。カバーガラスを、５％
ｎ−プロピル現食子酸塩（９０％グリセロール中）及び
１０％１．０ＭＮａ−炭酸水素塩の溶液とともにスライ
ド上に設け、切片を、エピ螢光照明及び、フルオレセイ
ン及びローダミン干渉フィルター複合物を備えるツァイ
ス顕微鏡写真機により調査した。顕微鏡写真は、１６０
０〜６３００ＡＳＡの感度のイルフォードＨＰ−５ハイ
スピードフィルムを用いて、ファイスネオフルアー（ne
ofluar）オイル沈浸対物レンズ１６×又４０×で得た。
せ、約１．０×１．０×０．５ｃｍ3組織片を摘出し、
ＯＣＴマウンティングメジューム（ミレス（Ｍiles））
に沈め、〜−１５０℃での液体窒素冷却フレオン（Ｆre
on）２２（デュポン）中で迅速に凍結させた。サンプル
を、以下の器官から得た。それらは、骨髄、大脳、腎
臓、大腸、肝臓、肺、リンパ節、心筋層、胃、線条筋
（ｌｅｇ）及び脾臓である。サンプルは−８０℃で保存
された。実験日に、５μｍの凍結組織片を低温保持装置
を用いて−２０℃でカットし、ポリＬ−リシンでコート
されたガラススライド上に置き２５℃で風乾した。その
片を、ＣＤ１８抗原の変性を回避するために固定せず
に、直ちに免疫着色した。非特異的結合を抑制するため
に、スライドを、０．１Ｍトリス−ＨＣｌバッファー
（ｐＨ７．８）で洗浄し、０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｎ
ａＮ3及び０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．８）中
５％脂肪不在ドライミルク（カーネーション）の溶液の
清澄上清とともに２５℃で１時間培養した。次に来る着
色工程もすべて、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
８）で断続的に洗浄しながら２５℃１時間で行われた。
単一標識実験において、片を、着色バッファー〔０．１
％脂肪不在ドライミルク、０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｎ
ａＮ3及び０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．８）〕
中プライマリー抗体（ｍ１Ｂ４、Ｇａｌ／Ｒｅｉ ｈ１
Ｂ４又はｈＩｇＧ４コントロール）の２０μｇ／ｍｌ溶
液で着色された。結合抗体を、フルキレセインイソチオ
シアネート結合親和精製ヤギ抗マウスＩｇＧ又はヤギ抗
ヒトＩｇＧＦＩＴＣ結合体（キルケガード及びペリ，イ
ンク．（Ｋirkegaard and Ｐerry，Ｉnc．）の着色バッ
ファー中２５μｇ／ｍｌ溶液を用いて間接的に検出し
た。二重着色実験においては、標本を、プライマリー抗
体（１２，０００×ｇで１５分遠心された着色バッファ
ー中１μｇ／ｍｌ ｍ１Ｂ４及び１μｇ／ｍｌ ｈ１Ｂ
４）の混合物で、次いで清澄混合抗体検出溶液〔着色バ
ッファー中２５μｇ／ｍｌフルオレセインイソチオシア
ネート結合親和精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ及び２５μｇ／ｍ
ｌローダミンイソチオシアネート結合親和精製ヤギ抗マ
ウスＩｇＧ（キルケガード及びプリー，インク．）〕で
免疫標識した。２重標識実験のためのコントロールは、
混合ｍ１Ｂ４プラスｈＩｇＧ４（各抗体１μｇ／ｍｌ）
又はｍ１Ｂ４、Ｇａｌ／Ｒｅｉｈ１Ｂ４及びｈＩｇＧ４
（着色バッファー中ＩｇＧ１μｇ／ｍｌでのみ溶解され
た）の清澄溶液であった。ＩｇＧを上記混合抗体検出溶
液とともに切片上に位置づけた。カバーガラスを、５％
ｎ−プロピル現食子酸塩（９０％グリセロール中）及び
１０％１．０ＭＮａ−炭酸水素塩の溶液とともにスライ
ド上に設け、切片を、エピ螢光照明及び、フルオレセイ
ン及びローダミン干渉フィルター複合物を備えるツァイ
ス顕微鏡写真機により調査した。顕微鏡写真は、１６０
０〜６３００ＡＳＡの感度のイルフォードＨＰ−５ハイ
スピードフィルムを用いて、ファイスネオフルアー（ne
ofluar）オイル沈浸対物レンズ１６×又４０×で得た。
【００４３】ウサギにおけるＧａｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４
及びｍ１Ｂ４のＩＦ着色パターンは、第３２図に要約さ
れている。組換え及び天然の１Ｂ４ＩｇＧのいずれにつ
いての特異的ＣＤ１８−ポジティブＩＦ標識は、白血球
を含むことが知られている組織において観察された。Ｇ
ａｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４に対するｍ１Ｂ４の関係で観察
されたＩＦ分布又は強度においては、検出可能な差違は
なくｈＩｇＧ４又はバッファーで処理されたコントロー
ル組織は常にネガティブであった。骨髄切片は、ＩＢ４
のいずれの種類についてもとびぬけて高濃度のＣＤ１８
着色を与え、これらの細胞の７９％が細胞質標識を示し
た。脾臓及びリンパ節の白血球はより不規則により低度
に染色された。内在白血球の顕著な集団は肺において検
出され、腎糸球体においてはより少ない程度に検出され
た。意外なことに、大脳の小膠細胞又は肝臓のカプファ
ー（Ｋupffer）細胞において見られるＣＤ１８着色はな
かった。他の組織は全く染色されなかった。プライマリ
ー抗体溶液の力価は、ｈ１Ｂ４又はｍ１Ｂ４の１．０μ
ｇ／ｍｌ溶液が骨髄切片の最大ＩＦ染色を得るために要
求されるいずれかの抗体の最少濃度であることを示し
た。
及びｍ１Ｂ４のＩＦ着色パターンは、第３２図に要約さ
れている。組換え及び天然の１Ｂ４ＩｇＧのいずれにつ
いての特異的ＣＤ１８−ポジティブＩＦ標識は、白血球
を含むことが知られている組織において観察された。Ｇ
ａｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４に対するｍ１Ｂ４の関係で観察
されたＩＦ分布又は強度においては、検出可能な差違は
なくｈＩｇＧ４又はバッファーで処理されたコントロー
ル組織は常にネガティブであった。骨髄切片は、ＩＢ４
のいずれの種類についてもとびぬけて高濃度のＣＤ１８
着色を与え、これらの細胞の７９％が細胞質標識を示し
た。脾臓及びリンパ節の白血球はより不規則により低度
に染色された。内在白血球の顕著な集団は肺において検
出され、腎糸球体においてはより少ない程度に検出され
た。意外なことに、大脳の小膠細胞又は肝臓のカプファ
ー（Ｋupffer）細胞において見られるＣＤ１８着色はな
かった。他の組織は全く染色されなかった。プライマリ
ー抗体溶液の力価は、ｈ１Ｂ４又はｍ１Ｂ４の１．０μ
ｇ／ｍｌ溶液が骨髄切片の最大ＩＦ染色を得るために要
求されるいずれかの抗体の最少濃度であることを示し
た。
【００４４】Ｇａｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４及びｍ１Ｂ４に
より認識された抗原が同一細胞中に位置付けされるか否
かを決定するために２重ＩＦ染色実験を行った。骨髄、
脾臓、又はリンパ節の低温切片を、Ｇａｌ／Ｒｅｉ ｈ
１Ｂ４及びｍ１Ｂ４の混合物で２重標識した。骨髄につ
いて第３３図において説明されているように、ｍＩＢ４
でポジティブに染色されたすべての細胞も、Ｇａｌ／Ｒ
ｅｉ ｈ１Ｂ４で標識された。コントロールグループに
おいては、Ｇａｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４着色（フルオレセ
インオプティクス（optics）の下で検出された）は、ｍ
１Ｂ４標識（ローダミンフィルターで視覚化された）を
保持しながら、プライマリー抗体混合物中のｈ１Ｂ４の
代りにｈＩｇＧ４を用いることにより特異的に除かれ
た。逆のコントロールに関しては、プライマリー抗体の
混合物からのｍ１Ｂ４の除去が、ローダミン標識を除く
ことになったが、Ｇａｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４により生じ
たフルオレセインにおいては有効でない。これらの１Ｂ
４の同一部位への位置付けの結果は、高い特異性を示し
た。これらのデータは、天然及びＧａｌ／Ｒｅｉ人間適
合化１Ｂ４が、同一細胞（白血球）に位置づけられ、種
々のウサギ組織において同一の染色特異性及び強度を示
すことを指摘した。高レベルのＣＤ１８標識が、最も強
濃度の染色を与える骨髄とともに、多量の白血球を含む
これらの組織において観察された。従って、我々の人間
適合化工程は、軽顕微鏡分析レベルで検出可能な１Ｂ４
ＩｇＧの特異性を変えていない。
より認識された抗原が同一細胞中に位置付けされるか否
かを決定するために２重ＩＦ染色実験を行った。骨髄、
脾臓、又はリンパ節の低温切片を、Ｇａｌ／Ｒｅｉ ｈ
１Ｂ４及びｍ１Ｂ４の混合物で２重標識した。骨髄につ
いて第３３図において説明されているように、ｍＩＢ４
でポジティブに染色されたすべての細胞も、Ｇａｌ／Ｒ
ｅｉ ｈ１Ｂ４で標識された。コントロールグループに
おいては、Ｇａｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４着色（フルオレセ
インオプティクス（optics）の下で検出された）は、ｍ
１Ｂ４標識（ローダミンフィルターで視覚化された）を
保持しながら、プライマリー抗体混合物中のｈ１Ｂ４の
代りにｈＩｇＧ４を用いることにより特異的に除かれ
た。逆のコントロールに関しては、プライマリー抗体の
混合物からのｍ１Ｂ４の除去が、ローダミン標識を除く
ことになったが、Ｇａｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４により生じ
たフルオレセインにおいては有効でない。これらの１Ｂ
４の同一部位への位置付けの結果は、高い特異性を示し
た。これらのデータは、天然及びＧａｌ／Ｒｅｉ人間適
合化１Ｂ４が、同一細胞（白血球）に位置づけられ、種
々のウサギ組織において同一の染色特異性及び強度を示
すことを指摘した。高レベルのＣＤ１８標識が、最も強
濃度の染色を与える骨髄とともに、多量の白血球を含む
これらの組織において観察された。従って、我々の人間
適合化工程は、軽顕微鏡分析レベルで検出可能な１Ｂ４
ＩｇＧの特異性を変えていない。
【００４５】ヒト細胞小器官のＩＥＭ染色 ２重ラベル免疫電子顕微鏡実験が、亜細胞／超分子分析
レベルでのＧａｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４及びｍ１Ｂ４の特
異性を比較するために行われた。ＣＤ１８抗原を、６
０．３をともなうＩＥＭによりｈＰＭＮ及び単核細胞の
特異的細粒へ位置付けられた。（ＣＤ１８を認識する他
のマブ（Ｍａｂ）；シグナー等、ジェー．セル バイオ
ル．（Ｓinger et al.，Ｊ．Ｃell Ｂiol．）１０９：
３１６９〜３１８２〔１９８９〕）従って我々は、Ｇａ
ｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４及びｍ１Ｂ４が共にこれらの細粒
に分布されるか否かを決定した。ヒトＰＭＮは、上記の
ごとく静脈血から単離され、公表された方法（シンガー
等、スープラ）の変形によりＩＥＭ用に調製された。簡
単にいえば、ＰＭＮは、０．１Ｍ Ｎａ−カコジル酸塩
（ｐＨ７．２）中３．５％パラホルムアルデヒド及び
０．０５％グルタルアルデヒドの溶液、０．１Ｍサッカ
ロース及び広域スペクトルプロテアーゼ抑制体を用いて
固定された。固定は、細胞が４５℃（〜４５秒）に達す
るまでマイクロ波照射の下で行われ、次いで過剰のバッ
ファーを用いて４℃で急冷した。細胞ペレットを７％ア
クリルアミドに埋め込み、０．１Ｍリン酸塩（ｐＨ７．
２）中２．３Ｍサッカロースで浸透させ、液体プロパン
中に凍結させ、超涛（〜８０ｎｍ）低温切片へカットし
た。標本を、前記のごとき５ｎｍ及び１０ｎｍたんぱく
質Ａコロイド金結合体（シャンセンライフサイエンスプ
ロダクツ）を用いてＧａｌ／Ｒｅｉｈ１Ｂ４及びｍ１Ｂ
４で２重標識し、ＪＥＯＬ１００ＣＸ透過型電子顕鏡を
用いて２９，０００×で分析した。ＰＭＮについての免
疫染色の概要は、第３４図に示される。Ｇａｌ／Ｒｅｉ
ｈ１Ｂ４及びｍ１Ｂ４のいずれもが、特異的細粒中に
共に位置した。ネガティブコントロールは、コロイド金
プローブが交差反応非特異的であることを示した。さら
に、Ｇａｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４及びｍ１Ｂ４はまた、Ｕ
−９３７細胞（ヒト ミエロモノサイティック ライン
（myelomonocytic line））の細胞質細粒の群中に共に
位置付けされたが、ヒト肺繊維芽細胞（ＩＭＲ−９０）
においては位置付けられなかった。これらの観察は、Ｇ
ａｌ／Ｒｅｉ１Ｂ４の結合特性が、超分子分析でのｍ１
Ｂ４のそれに匹敵することを強く示唆する。
レベルでのＧａｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４及びｍ１Ｂ４の特
異性を比較するために行われた。ＣＤ１８抗原を、６
０．３をともなうＩＥＭによりｈＰＭＮ及び単核細胞の
特異的細粒へ位置付けられた。（ＣＤ１８を認識する他
のマブ（Ｍａｂ）；シグナー等、ジェー．セル バイオ
ル．（Ｓinger et al.，Ｊ．Ｃell Ｂiol．）１０９：
３１６９〜３１８２〔１９８９〕）従って我々は、Ｇａ
ｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４及びｍ１Ｂ４が共にこれらの細粒
に分布されるか否かを決定した。ヒトＰＭＮは、上記の
ごとく静脈血から単離され、公表された方法（シンガー
等、スープラ）の変形によりＩＥＭ用に調製された。簡
単にいえば、ＰＭＮは、０．１Ｍ Ｎａ−カコジル酸塩
（ｐＨ７．２）中３．５％パラホルムアルデヒド及び
０．０５％グルタルアルデヒドの溶液、０．１Ｍサッカ
ロース及び広域スペクトルプロテアーゼ抑制体を用いて
固定された。固定は、細胞が４５℃（〜４５秒）に達す
るまでマイクロ波照射の下で行われ、次いで過剰のバッ
ファーを用いて４℃で急冷した。細胞ペレットを７％ア
クリルアミドに埋め込み、０．１Ｍリン酸塩（ｐＨ７．
２）中２．３Ｍサッカロースで浸透させ、液体プロパン
中に凍結させ、超涛（〜８０ｎｍ）低温切片へカットし
た。標本を、前記のごとき５ｎｍ及び１０ｎｍたんぱく
質Ａコロイド金結合体（シャンセンライフサイエンスプ
ロダクツ）を用いてＧａｌ／Ｒｅｉｈ１Ｂ４及びｍ１Ｂ
４で２重標識し、ＪＥＯＬ１００ＣＸ透過型電子顕鏡を
用いて２９，０００×で分析した。ＰＭＮについての免
疫染色の概要は、第３４図に示される。Ｇａｌ／Ｒｅｉ
ｈ１Ｂ４及びｍ１Ｂ４のいずれもが、特異的細粒中に
共に位置した。ネガティブコントロールは、コロイド金
プローブが交差反応非特異的であることを示した。さら
に、Ｇａｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４及びｍ１Ｂ４はまた、Ｕ
−９３７細胞（ヒト ミエロモノサイティック ライン
（myelomonocytic line））の細胞質細粒の群中に共に
位置付けされたが、ヒト肺繊維芽細胞（ＩＭＲ−９０）
においては位置付けられなかった。これらの観察は、Ｇ
ａｌ／Ｒｅｉ１Ｂ４の結合特性が、超分子分析でのｍ１
Ｂ４のそれに匹敵することを強く示唆する。
【００４６】実施例５ 組換えヒト抗ＣＤ１８抗体のインビボ活性 マウス１Ｂ４（ｍ１Ｂ４）及び人間適合化１Ｂ４（ｈ１
Ｂ４）（実施例２及び４）のインビボでの効果は、Ｃ５
ａの内皮投与により引き出された皮膚炎、ＰＭＮ集積と
しての顕在性及びプラズマ浸出を抑制する能力を評価す
ることによりウサギにおいて比較された。メス ニュー
ジーランド白ウサギ（２〜２．５ｋｇ）の背の毛が、実
験前少なくとも２４時間でそられた。ウサギは、ケタミ
ン（Ｋetamine）ＨＣｌ（６０ｍｇ）及びキシラジン
（Ｘylazine）（５ｍｇ）の筋肉内注射で麻酔された。
〔125Ｉ〕−ウシ血清アルブミン（１０μＣｉ）を、プ
ラズマ管外遊出のマーカーとして、末端耳静脈へ注射さ
れた。動物群が、次いで塩水で処理され、ｍ１Ｂ４が
０．０７、０．２１又は０．７ｍｇ／ｋｇで静注され
又、ｈ１Ｂ４が０．１、０．３又は１ｍｇ／ｋｇで静注
された。これらは、皮膚炎病の開好前１５分に行われ
た。その後、５０μｌ容量におけるヒト組換えＣ５ａ
（１００ピコモル）、又は塩水、を背部における４反復
部位に皮内注射された。３時間後、血液サンプル（１ｍ
ｌ）を得、遠心（８０００ｇ、３分、２０℃）し、吸引
し保持されたセルフリープラズマを調製した。次いで動
物を、約７５０μｌのソクンブ（Ｓocumb）（４０％イ
ソプロピルアルコール中ナトリウムペントバルビタール
３８９ｍｇ／ｍｌ）で安楽死させ、注射部位を、６ｍｍ
バイオプシーパンチで削り取った。皮膚サンプル及びセ
ルフリープラズマ（５０μｌ）に存在する放射線活性
（〔125Ｉ〕）を、ガンマカウンターを用いて定量し
た。セルフリープラズマの特異的放射線活性を参考すれ
ば、プラズマ管外遊出の程度が、６ｍｍバイオプシ当た
りμｌプラズマ当量として表現される。皮膚バイオプシ
ーは次いで、ポリトロンホモジナイザーを用いて、０．
５％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｈ
ＴＡＢ）５ｍｌ中でホモジナイズされた。クロロホルム
（１ｍｌ）をサンプルへ加え、うず状に攪拌され遠心さ
れた（１６００ｇ、１５分、２０℃）。水性上清の４分
割（５０μｌ）を、ＰＭＮ含有の指針として、ミエロペ
ルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性の測定のために、９６ウ
ェルプレートのウェルに加えた。９６ウェルプレートの
対のウェルは、２００ｍｌバッファー（ＫＨ2ＰＯ4，４
４ｍＭ；Ｋ2ＨＰＯ4，６ｍＭ；Ｈ2Ｏ2 ０．００１５
％；ｐＨ６．０）のみを受け（バックグランド）、対の
ウェルは、ＭＰＯ基質（３’，３−ジメトキシベンジジ
ンジヒドロクロリド、３６０μｇ／ｍｌ）を含むバッフ
ァーを受けた。反応を室温で１５分進め、ＭＰＯ活性
を、分光光度計を読み取ることで、プレートにおいて測
定された４５０ｎｍでの吸光度の変化として測定した。
ＨＴＡＢ中既知量のウサギＰＭＮを用いて構成された標
準曲線を参考として、各皮膚バイオプシーにおけるＰＭ
Ｎ集積の程度が評価された。塩水で前処理されたウサギ
皮膚へのＣ５ａの注射は、塩水で注射された皮膚部位と
比較して、ＰＭＮ集積（第３５図）及びプラズマ管外遊
出（第３６図）において著しい増大をもたらした。ｍ１
Ｂ４又はｈ１Ｂ４のいずれかで前処理された動物におい
ては、ＰＭＮ集積（第３５図）及びプラズマ管外遊出
（第３６図）いずれについても投与量に関連して抑制し
た。両抗体とも、ＰＭＮ集積及びプラズマ管外遊出の抑
制について評価されたＥＤ50（ｍ１Ｂ４及びｈ１Ｂ４の
いずれについても約０．１５ｍｇ／ｋｇ）により示され
るように、共通の有効性を有した。
Ｂ４）（実施例２及び４）のインビボでの効果は、Ｃ５
ａの内皮投与により引き出された皮膚炎、ＰＭＮ集積と
しての顕在性及びプラズマ浸出を抑制する能力を評価す
ることによりウサギにおいて比較された。メス ニュー
ジーランド白ウサギ（２〜２．５ｋｇ）の背の毛が、実
験前少なくとも２４時間でそられた。ウサギは、ケタミ
ン（Ｋetamine）ＨＣｌ（６０ｍｇ）及びキシラジン
（Ｘylazine）（５ｍｇ）の筋肉内注射で麻酔された。
〔125Ｉ〕−ウシ血清アルブミン（１０μＣｉ）を、プ
ラズマ管外遊出のマーカーとして、末端耳静脈へ注射さ
れた。動物群が、次いで塩水で処理され、ｍ１Ｂ４が
０．０７、０．２１又は０．７ｍｇ／ｋｇで静注され
又、ｈ１Ｂ４が０．１、０．３又は１ｍｇ／ｋｇで静注
された。これらは、皮膚炎病の開好前１５分に行われ
た。その後、５０μｌ容量におけるヒト組換えＣ５ａ
（１００ピコモル）、又は塩水、を背部における４反復
部位に皮内注射された。３時間後、血液サンプル（１ｍ
ｌ）を得、遠心（８０００ｇ、３分、２０℃）し、吸引
し保持されたセルフリープラズマを調製した。次いで動
物を、約７５０μｌのソクンブ（Ｓocumb）（４０％イ
ソプロピルアルコール中ナトリウムペントバルビタール
３８９ｍｇ／ｍｌ）で安楽死させ、注射部位を、６ｍｍ
バイオプシーパンチで削り取った。皮膚サンプル及びセ
ルフリープラズマ（５０μｌ）に存在する放射線活性
（〔125Ｉ〕）を、ガンマカウンターを用いて定量し
た。セルフリープラズマの特異的放射線活性を参考すれ
ば、プラズマ管外遊出の程度が、６ｍｍバイオプシ当た
りμｌプラズマ当量として表現される。皮膚バイオプシ
ーは次いで、ポリトロンホモジナイザーを用いて、０．
５％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｈ
ＴＡＢ）５ｍｌ中でホモジナイズされた。クロロホルム
（１ｍｌ）をサンプルへ加え、うず状に攪拌され遠心さ
れた（１６００ｇ、１５分、２０℃）。水性上清の４分
割（５０μｌ）を、ＰＭＮ含有の指針として、ミエロペ
ルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性の測定のために、９６ウ
ェルプレートのウェルに加えた。９６ウェルプレートの
対のウェルは、２００ｍｌバッファー（ＫＨ2ＰＯ4，４
４ｍＭ；Ｋ2ＨＰＯ4，６ｍＭ；Ｈ2Ｏ2 ０．００１５
％；ｐＨ６．０）のみを受け（バックグランド）、対の
ウェルは、ＭＰＯ基質（３’，３−ジメトキシベンジジ
ンジヒドロクロリド、３６０μｇ／ｍｌ）を含むバッフ
ァーを受けた。反応を室温で１５分進め、ＭＰＯ活性
を、分光光度計を読み取ることで、プレートにおいて測
定された４５０ｎｍでの吸光度の変化として測定した。
ＨＴＡＢ中既知量のウサギＰＭＮを用いて構成された標
準曲線を参考として、各皮膚バイオプシーにおけるＰＭ
Ｎ集積の程度が評価された。塩水で前処理されたウサギ
皮膚へのＣ５ａの注射は、塩水で注射された皮膚部位と
比較して、ＰＭＮ集積（第３５図）及びプラズマ管外遊
出（第３６図）において著しい増大をもたらした。ｍ１
Ｂ４又はｈ１Ｂ４のいずれかで前処理された動物におい
ては、ＰＭＮ集積（第３５図）及びプラズマ管外遊出
（第３６図）いずれについても投与量に関連して抑制し
た。両抗体とも、ＰＭＮ集積及びプラズマ管外遊出の抑
制について評価されたＥＤ50（ｍ１Ｂ４及びｈ１Ｂ４の
いずれについても約０．１５ｍｇ／ｋｇ）により示され
るように、共通の有効性を有した。
【図１】図１はＰＣＲを用いてマウスカッパーＬ鎖可変
領域及びマウスＩｇＧ２ａＨ鎖可変領域についてコード
するＤＮＡを単離するために用いられるプライマーの配
列を示す図である。
領域及びマウスＩｇＧ２ａＨ鎖可変領域についてコード
するＤＮＡを単離するために用いられるプライマーの配
列を示す図である。
【図２】図２はマウスＨ及びＬ鎖の抗体構造及びＰＣＲ
生成物の模式図である。
生成物の模式図である。
【図３】図３はクローン化ｃＤＮＡの核酸配列から推測
されるＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域１及び２に関する
１Ｂ４アミノ酸配列を示す図である。
されるＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域１及び２に関する
１Ｂ４アミノ酸配列を示す図である。
【図４】図４は１Ｂ４のＣＤＲをＲｅｉ Ｌ鎖可変領域
に移入するためＲｅｉ Ｌ鎖可変領域鋳型のＰＣＲ変異
誘発及び増幅用のプライマーとして用いられるオリゴデ
オキシヌクレオチド配列を示す図である。
に移入するためＲｅｉ Ｌ鎖可変領域鋳型のＰＣＲ変異
誘発及び増幅用のプライマーとして用いられるオリゴデ
オキシヌクレオチド配列を示す図である。
【図５】図５はＲｅｉ／１Ｂ４Ｌ鎖可変領域のＣＤＲ移
入に用いられるＰＣＲ組換え法を示す図である。
入に用いられるＰＣＲ組換え法を示す図である。
【図６】図６はＬ鎖発現ベクターへのＬ鎖可変及び定常
領域の挿入概略を示す図である。
領域の挿入概略を示す図である。
【図７】図７は短小化ＩｇＧ４Ｈ鎖を得るためのＰＣＲ
プライマーとして用いられるオリゴデオキシヌクレオチ
ド、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターを組換処理
してネオマイシン耐性遺伝子の発現を促進させるための
ＰＣＲで用いられるオリゴデオキシヌクレオチドプライ
マー、ＩｇＨエンハンサー配列をクローニングするため
のＰＤＲで用いられるオリゴデオキシヌクレオチドプラ
イマー、ヒトカッパーＬ鎖不変領域を得るためにＰＣＲ
プライマーとして用いられるオリゴデオキシヌクレオチ
ドの配列を示す図である。
プライマーとして用いられるオリゴデオキシヌクレオチ
ド、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターを組換処理
してネオマイシン耐性遺伝子の発現を促進させるための
ＰＣＲで用いられるオリゴデオキシヌクレオチドプライ
マー、ＩｇＨエンハンサー配列をクローニングするため
のＰＤＲで用いられるオリゴデオキシヌクレオチドプラ
イマー、ヒトカッパーＬ鎖不変領域を得るためにＰＣＲ
プライマーとして用いられるオリゴデオキシヌクレオチ
ドの配列を示す図である。
【図８】図８は１Ｂ４Ｈ鎖可変領域へのヒトシグナル及
びイントロン配列の融合に用いられるＰＣＲ組換法戦略
を示す図である。
びイントロン配列の融合に用いられるＰＣＲ組換法戦略
を示す図である。
【図９】図９はヒトシグナル及びイントロン配列を１Ｂ
４Ｈ鎖可変領域に融合させるＰＣＲ組換えに関してプラ
イマーとして用いられるオリゴデオキシヌクレオチドを
示す図である。
４Ｈ鎖可変領域に融合させるＰＣＲ組換えに関してプラ
イマーとして用いられるオリゴデオキシヌクレオチドを
示す図である。
【図１０】図１０はネオマイシン選択発現ベクターの組
立て概略を示す図である。
立て概略を示す図である。
【図１１】図１１：Ｈ鎖発現ベクターの“キメラ”１Ｂ
４Ｈ鎖可変領域及び短小化ヒトＩｇＧ４Ｈ鎖定常領域の
挿入概略を示す図である。
４Ｈ鎖可変領域及び短小化ヒトＩｇＧ４Ｈ鎖定常領域の
挿入概略を示す図である。
【図１２】図１２はＣＶ１、ＣＯＳ７及び２９３細胞に
おける〔１Ｂ４キメラＨ鎖：移入Ｒｅｉ／１Ｂ４Ｌ〕鎖
組換え抗体の一過性発現レベルを、トラッピングＥＬＩ
ＳＡで測定した結果を示す図である。
おける〔１Ｂ４キメラＨ鎖：移入Ｒｅｉ／１Ｂ４Ｌ〕鎖
組換え抗体の一過性発現レベルを、トラッピングＥＬＩ
ＳＡで測定した結果を示す図である。
【図１３】図１３は活性化ヒトＰＭＮ上のＣＤ１８に対
する組換え“キメラ”／ＲＥＩ１Ｂ４（○）及び天然マ
ウス１Ｂ４ Ｍａｂ（◇）の競合的結合アッセイを示す
図である。
する組換え“キメラ”／ＲＥＩ１Ｂ４（○）及び天然マ
ウス１Ｂ４ Ｍａｂ（◇）の競合的結合アッセイを示す
図である。
【図１４】図１４はその枠組み構造領域がネズミ１Ｂ４
ＣＤＲを支持するために用いられるヒトＨ及びＬ鎖可
変領域のアミノ酸配列組成を示す図である。
ＣＤＲを支持するために用いられるヒトＨ及びＬ鎖可
変領域のアミノ酸配列組成を示す図である。
【図１５】図１５はＧａｌ／１Ｂ４Ｈ鎖可変領域Ｊｏｎ
／１Ｂ４Ｈ鎖可変領域並びにヒトシグナル及びイントロ
ン配列をこれらの領域に融合させるために必要な領域の
組立てに用いられるオリゴデオキシヌクレオチド配列を
示す図である。
／１Ｂ４Ｈ鎖可変領域並びにヒトシグナル及びイントロ
ン配列をこれらの領域に融合させるために必要な領域の
組立てに用いられるオリゴデオキシヌクレオチド配列を
示す図である。
【図１６】図１６はＧａｌ／１Ｂ４Ｈ鎖及びＪｏｎ／１
Ｂ４Ｈ鎖可変領域のＣＤＲ移入に用いられるＰＣＲ組換
え法戦略を示す図である。
Ｂ４Ｈ鎖可変領域のＣＤＲ移入に用いられるＰＣＲ組換
え法戦略を示す図である。
【図１７】図１７はネズミ１Ｂ４Ｈ鎖可変領域に関して
決定されたＤＮＡ配列及び演繹されたアミノ酸配列を示
す図である。
決定されたＤＮＡ配列及び演繹されたアミノ酸配列を示
す図である。
【図１８】図１８はヒグロマイシン選択発現ベクターの
組立て概略を示す図である。
組立て概略を示す図である。
【図１９】図１９は短小化ＩｇＧ４Ｈ鎖定常領域含有Ｈ
鎖発現ベクターへの、Ｇａｌ／１Ｂ４Ｈ鎖及びＪｏｎ／
１Ｂ４Ｈ鎖可変領域の挿入概略を示す図である。
鎖発現ベクターへの、Ｇａｌ／１Ｂ４Ｈ鎖及びＪｏｎ／
１Ｂ４Ｈ鎖可変領域の挿入概略を示す図である。
【図２０】図２０はマウスＭＡｂ １Ｂ４及び組換えヒ
ト抗ＣＤ１８抗体構築体の競合的結合活性をまとめて示
す図である。
ト抗ＣＤ１８抗体構築体の競合的結合活性をまとめて示
す図である。
【図２１】図２１はＬｅｎ／１Ｂ４Ｌ鎖可変領域及びヒ
トシグナルをＬｅｎ Ｌ鎖可変領域と融合させるために
必要な領域の組立てに用いられるオリゴデオキシヌクレ
オチド配列を示す図である。
トシグナルをＬｅｎ Ｌ鎖可変領域と融合させるために
必要な領域の組立てに用いられるオリゴデオキシヌクレ
オチド配列を示す図である。
【図２２】図２２はＬｅｎ／１Ｂ４Ｌ鎖可変領域のＣＤ
Ｒ移入に用いられるＰＣＲ組換え法戦略を示す図であ
る。
Ｒ移入に用いられるＰＣＲ組換え法戦略を示す図であ
る。
【図２３】図２３は中間ベクターへのＬｅｎ／１Ｂ４Ｌ
鎖可変領域の挿入、ついでＬ鎖発現ベクターへのその挿
入の概略を示す図である。
鎖可変領域の挿入、ついでＬ鎖発現ベクターへのその挿
入の概略を示す図である。
【図２４】図２４はマウス１Ｂ４Ｌ鎖−１可変領域に関
して決定されたＤＮＡ配列及び演繹されたアミノ酸配列
を示す図である。
して決定されたＤＮＡ配列及び演繹されたアミノ酸配列
を示す図である。
【図２５】図２５はネズミ１Ｂ４Ｌ鎖−２可変領域に関
して決定されたＤＮＡ配列及び演繹されたアミノ酸配
列。
して決定されたＤＮＡ配列及び演繹されたアミノ酸配
列。
【図２６】図２６はＧａｌ−ｍ１／１Ｂ４（変異体）Ｈ
鎖可変領域、及びヒトシグナルをＧａｌ−ｍｌ Ｈ鎖可
変領域と融合させるために必要な領域の組立てに用いら
れるオリゴデオキシヌクレオチドを示す図である。
鎖可変領域、及びヒトシグナルをＧａｌ−ｍｌ Ｈ鎖可
変領域と融合させるために必要な領域の組立てに用いら
れるオリゴデオキシヌクレオチドを示す図である。
【図２７】図２７はＧａｌ−ｍ１／１Ｂ４（変異体）Ｈ
鎖可変領域のＣＤＲ移入に用いられるＰＣＲ組換え法戦
略を示す図である。
鎖可変領域のＣＤＲ移入に用いられるＰＣＲ組換え法戦
略を示す図である。
【図２８】図２８は天然マウス１Ｂ４（◇）及びＧａｌ
／Ｒｅｉヒト化１Ｂ４（○）の競合的結合アッセイの結
果を示す図である。
／Ｒｅｉヒト化１Ｂ４（○）の競合的結合アッセイの結
果を示す図である。
【図２９】図２９はＮｅｗ／Ｒｅｉ組換えｈ１Ｂ４
（◆）及びＧａｌ／Ｒｅｉ組換えｈ１Ｂ４（◇）の競合
的結合アッセイの結果を示す図である。
（◆）及びＧａｌ／Ｒｅｉ組換えｈ１Ｂ４（◇）の競合
的結合アッセイの結果を示す図である。
【図３０】図３０はヒト臍帯血管内皮細胞単層へのヒト
ＰＭＮのインビトロ付着に関する天然マウス１Ｂ４
（◇）及びＧａｌ／Ｒｅｉ組換えヒト化１Ｂ４（○）の
効果を示す図である。
ＰＭＮのインビトロ付着に関する天然マウス１Ｂ４
（◇）及びＧａｌ／Ｒｅｉ組換えヒト化１Ｂ４（○）の
効果を示す図である。
【図３１】図３１はインビトロ機能アッセイにおけるＧ
ａｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４及びｍ１Ｂ４の比較を示す図で
ある。
ａｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４及びｍ１Ｂ４の比較を示す図で
ある。
【図３２】図３２はウサギ組織の５μｍ凍結片における
ｍ１Ｂ４及びＧａｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４染色の免疫ケイ
光顕微鏡観察による局在性を示す図である。
ｍ１Ｂ４及びＧａｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４染色の免疫ケイ
光顕微鏡観察による局在性を示す図である。
【図３３】図３３はウサギ骨髄細胞におけるＧａｌ／Ｒ
ｅｉ ｈ１Ｂ４及びｍ１Ｂ４の二重標識免疫ケイ光顕微
鏡観察による局在性を示す図である。
ｅｉ ｈ１Ｂ４及びｍ１Ｂ４の二重標識免疫ケイ光顕微
鏡観察による局在性を示す図である。
【図３４】図３４はヒトＰＭＮの特殊顆粒におけるＧａ
ｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４及びｍ１Ｂ４の二重標識免疫電気
顕微鏡観察による局在性を示す図である。
ｌ／Ｒｅｉ ｈ１Ｂ４及びｍ１Ｂ４の二重標識免疫電気
顕微鏡観察による局在性を示す図である。
【図３５】図３５はウサギ皮膚におけるＣ５ａ（１００
ｐｍｏｌ）誘導ＰＭＮ集合がｍ１Ｂ４及びＧａｌ／Ｒｅ
ｉ ｈ１Ｂ４による用量依存性阻害を示す図である。
ｐｍｏｌ）誘導ＰＭＮ集合がｍ１Ｂ４及びＧａｌ／Ｒｅ
ｉ ｈ１Ｂ４による用量依存性阻害を示す図である。
【図３６】図３６はウサギ皮膚におけるＣ５ａ（１００
ｐｍｏｌ）誘導血漿遊出のｍ１Ｂ４及びＧａｌ／Ｒｅｉ
ｈ１Ｂ４による用量依存性阻害を示す図である。
ｐｍｏｌ）誘導血漿遊出のｍ１Ｂ４及びＧａｌ／Ｒｅｉ
ｈ１Ｂ４による用量依存性阻害を示す図である。
【図３７】図３７は多量の組換えＣＤＲ移入１Ｂ４抗体
を産生しうる発現系ｐ８９６２の組立て概略を示す図で
ある。
を産生しうる発現系ｐ８９６２の組立て概略を示す図で
ある。
【図３８】図３８は多量の組換えＣＤＲ移入１Ｂ４抗体
を産生しうる発現系ｐ８９６８及びｐ８９６９の組立て
概略を示す図である。
を産生しうる発現系ｐ８９６８及びｐ８９６９の組立て
概略を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/62 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ジョージ イー．マーク，ザ サード アメリカ合衆国，08550 ニュージャーシ ィ，プリンストン ジャンクション，リッ チモンド コート ４ (72)発明者 ジョン エー．シュミット アメリカ合衆国，08812 ニュージャーシ ィ，グリーン ブルック，フェアウェイ ドライヴ 19 (72)発明者 アーウィン アイ．シンガー アメリカ合衆国，07747 ニュージャーシ ィ，マタワン，レイクリッジ ドライヴ 18
Claims (22)
- 【請求項１】 組換え体ヒト抗−ＣＤ１８抗体又はその
活性断片。 - 【請求項２】 ＬＦＡ−１ Ｍａｃ−１又はｐ１５０，
９５からなる群から選択される細胞発現白血球インテグ
リンに結合することができる請求項１記載の組換え体ヒ
ト抗−ＣＤ１８抗体又はその断片。 - 【請求項３】 細胞発現ＣＤ１８インテグリンサブユニ
ットに結合することができる請求項１記載の組換え体ヒ
ト抗−ＣＤ１８抗体又はその断片。 - 【請求項４】 白血球に結合し、この白血球が炎症病巣
に入らないように予防することができる請求項１記載の
組換え体ヒト抗−ＣＤ１８抗体又はその断片。 - 【請求項５】 ヒトＣＤ１８インテグリンに結合するこ
とができるヒトＨ鎖構造とマウス相補性決定領域、ヒト
Ｌ鎖構造とマウス相補性決定領域を包含している組換え
体ヒト免疫グロブリン。 - 【請求項６】 図３に示されるマウス１Ｂ４Ｌ鎖可変部
アミノ酸配列。 - 【請求項７】 請求項６記載のマウス１Ｂ４Ｌ鎖可変部
アミノ酸配列をコードしているＤＮＡ配列。 - 【請求項８】 図３に示されるマウス１Ｂ４Ｈ鎖可変部
アミノ酸配列。 - 【請求項９】 請求項８記載のマウス１Ｂ４Ｌ鎖可変部
アミノ酸配列をコードしているＤＮＡ配列。 - 【請求項１０】 請求項１記載の組換え体ヒト抗−ＣＤ
１８抗体をコードしているＤＮＡ配列。 - 【請求項１１】 請求項５記載の組換え体ヒト免疫グロ
ブリンをコードしているＤＮＡ配列。 - 【請求項１２】 請求項１０記載のＤＮＡ配列を含むベ
クター。 - 【請求項１３】 請求項１１記載のＤＮＡ配列を含むベ
クター。 - 【請求項１４】 組換え体ヒト抗−ＣＤ１８抗体をコー
ドしているＤＮＡ配列を含む請求項１２記載のベクター
によって移入された哺乳類宿主。 - 【請求項１５】 組換え体ヒト免疫グロブリンをコード
しているＤＮＡ配列を含む請求項１３記載のベクターに
よって移入された哺乳類宿主。 - 【請求項１６】 組換え体ヒト抗−ＣＤ１８抗体の発現
に適した条件下で請求項１４記載の形質転換哺乳類宿主
を培養し、該抗体を回収することを特徴とする組換え体
ヒト抗−ＣＤ１８の製造方法。 - 【請求項１７】 組換え体ヒト抗−ＣＤ１８抗体の発現
に適した条件下で請求項１５記載の形質転換哺乳類宿主
を培養し、該抗体を回収することを特徴とする組換え体
ヒト抗−ＣＤ１８の製造方法。 - 【請求項１８】 請求項１記載の組換え体ヒト抗−ＣＤ
１８抗体の有効な炎症抑制量及び医薬担体を包含してい
る炎症修復又は抑制医薬組成物。 - 【請求項１９】 請求項１７記載の組換え体ヒト抗−Ｃ
Ｄ１８抗体の有効な炎症抑制量を治療を必要としている
患者に投与することを特徴とする炎症の予防又は修復方
法。 - 【請求項２０】 白血球インテグリンＬＡＦ−１、Ｍａ
ｃ−１及びｐ１５０，９５と特異的に反応する請求項１
記載の組換え体ヒト抗−ＣＤ１８抗体。 - 【請求項２１】 ヒトＣＤ１８インテグリンに特異的で
あるマウス相補性決定領域がつながれている組換え体ヒ
トＨ鎖構造。 - 【請求項２２】 ヒトＣＤ１８インテグリンに特異的で
あるマウス相補性決定領域がつながれている組換え体ヒ
トＬ鎖構造。
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-
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|---|---|---|---|
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