PT96943B

PT96943B - Processo para a preparacao de analogos de rebecamicina e de composicoes farmac euticas que os contem

Info

Publication number: PT96943B
Application number: PT96943A
Authority: PT
Inventors: Kin Sing Lam; Daniel R Schroeder; Jacqueline Mattei; Salvatore Forenza; James A Matson
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1990-03-06
Filing date: 1991-03-05
Publication date: 1998-07-31
Also published as: ATE138926T1; US5468849A; HU910716D0; EP0450327A1; NO910855L; AU623050B2; HK181496A; NO910855D0; FI911047A0; JPH0789981A; DE69119964D1; HU211055B; NO179555C; CS9100586A2; FI102376B; FI911047A7; GR3020163T3; SG63555A1; IL97233A0; KR940005657B1

Description

PROC3SSO rARA A PREPARAÇAO DS ANÁLOGOS DE REBECAMICINA S DE COMPOSIÇOES FAR

MACtUTICAS QUE OS CONTEM”

1. Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a novos análogos de rebecamicina que possuem propriedades antineoplásicas.

2. Antecedentes

As patentes de invenção norte americanas K2s. Q.Q87.925 e b.552.8K2 referem um agente antitumoral designado por rebeca micina e seus derivados 5'-metil e 5'7',3,6-tetra-acetato e um processo para a preparação destes agentes mediante a cultura de uma. estirpe produtora de rebecamicina de Ho ca rd la aerocolonigenes., de preferencia Moçardia aerocqlqnigenes, ATCC 392¾ ^ou uma sua. mutante produtora de rebecamicina, num meio nutriente aquoso contendo fontes assimiláveis de carbono e de azoto sob condições aerobicas submersas, ate è produção de uma quantidade substancial de rebecamicina. Eecentemente a Hocardia â&EQCQl2UÍ&qn§,§. ATCC 39243 foi reclassificada como Saccharo.thrix aerocolonigenes, ATCC 39243 (Bush et al., Ci^Antibiqtics, 90:

6Ó8-678, (1937).

Resumo da Invenção

A presente invenção proporciona novos análogos do agen

te antitumoral designado rebecamicina (de fórmula geral I)

Formula I

Mais especificamente, proporcionam-se análogos de re becamicina de fórmulas . gelais II e III.

Fórmula II v · · ·

ζ

Formula III na qual e X₂, representam, cada um, independentemente, um átomo de flúor ou de hidrogénio, com a condição de Xj e X₂ uão representarem ambos, simultaneamente, um átomo de hidrogénio, âssim os seus sais de adição de ácido aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

Os compostos de fórmulas gerais.. II e III são produzidos suplementando-de as culturas de uma estirpe produtora de rebecamicina de Saccharothrãff aerocolonigenes com um análogo de triptofano apropriado.

Descrição dos Desenhos

Figura 1. representa o espectro de infravermelho para o composto de fórmula IV.

, Figura 2.

Figura 3.

Figura 4.

Figura 5.

Figura 6.

Figura 7.

Figura 8.

Figura 9·

Figura 10.

Figura 11.

Figura 12.

Figura 13.

Figura 14.

Figura 15.

representa 0 espectro de ressonância magnética nuclear protónica para o composto de fórmula IV. representa 0 espectro de ressonância magnética nuclear de carbono 13 para o composto de fórmula IV. representa 0 espectro de infravermelho para 0 composto de fórmula V.

representa 0 espectro de ressonância magnética nuclear protónica para o composto de fórmula V. fiepresenta 0 espectro de ressonância magnética nuclear de carbono 13 para 0 composto de fórmula V. representa 0 espectro de infravermelho para o composto de fórmula VIII.

representa 0 espectro de ressonância magnética nuclear protónica para o composto de fórmula VIII. representa 0 espectro de ressonância magnética nuclear de carbono 13 para 0 composto de fórmula VIII. representa 0 espectro de massa do composto de fórmula IV.

representa 0 espectro no ultravioleta do composto de /

fórmula IV.

representa o espectro de massa do composto de fórmu la V.

representa 0 espectro no ultravioleta do composto de fórmula V.

representa 0 espectro de massa do composto de fórmula VIII.

representa o espectro no ultravioleta do composto de fórmula VIII

Descrição Pormenorizada, da Presente Invenção í

As patentes de invenção norte americanas W 1+Λ87.925 e 4.552.842 descrevem a produção e isolamento do agente antitumoral designado por rebecamicina (de fórmula I)

Formula I composto citado anteriormente rebecamicina, e o com ponente principal da fermentação da estirpe produtora da febecamicina Saccharothrix aerocolonigenes.

Descobriu-se presentemente, de acordo com a presente invenção, que 0 processo de fermentação descrito nas patentes de invenção norte americanas Njãs 4.487.925 e 4.552.842 podem realizar-se na presença de certos análogos de triptofano para se produzirem novos análogos de rebecamicina com propriedades antitumorais valiosas. Os análogos de rebecamicina da presen te invenção apresentam as fórmulas gerais II e III.

Η ,Ν.

Formula II

. OCH₃

Formula III em que

Xj e Xr> representam um átomo de hidrogénio e flúor, com a condição de X^ e X^ não representarem simultaneamen te um átomo de hidrogénio $ assim,como como os seus sais de adição de ácido aceitáveis

X.

- sob o ponto de vista farmacêutico.

exemplo preferido dos compostos da presente invenção e o composto de fórmula geral IV :

Formula IV

Outro composto preferido da presente invenção é o composto com a fórmula geral V;

Ainda outro exemplo de compostos preferidos da presente invenção é o composto que apresenta a fórmula de estrutura VIs ί>

Formula VI

Ainda outro exemplo preferido dos compostos desta inven ção é o composto com a fdrmula de estrutura VII:

Formula VII

E ainda um outro exemplo de compostos preferidos da presente invenção é o composto de fdrmula de estrutura VIII:

• et

Formula VIU

Outro exemplo preferido de compostos da presente invenção ó o composto que apresenta a fórmula de estrutura IX;

Formula IX

Outro exemplo preferido de compostos da presente invenção e o composto que apresenta a fórmula de estrutura X:

• * ·

-η ís

Ainda outro exemplo preferido dos presentes compostos desta invenção ê o composto com a fórmula de estrutura XI:

Formula XI

No presente processo o análogo do triptofano á adicio nado ao meio de fermentação da rebecamicina e incorporado durante a fermentação na estrutura da rebecamicina criando assim um análogo de rebecamicina correspondente. A descrição'’ mais pormenorizada do processo é fornecida em seguida nos exemplos ilustrativos.

Preparação dos Antibióticos

Os compostos de fórmula IV-XI são produzidos por cultura de estirpe produtora de rebecamicina de Saccharothrix aerocolonigenes, com DL-^-fluorotriptofano, DL-5-fluorotripto fano, DL-6-fluorotriptofano ou DL-7-fluorotriptofano. 0 orga nismo produtor preferido e uma nova estirpe de Saccharothrix aerocolonigenes, previamente designada como Nocardia aerocolonigenes, estirpe C38.383-KK2, (ATCC 392^3), na patente de in venção norte americana ^.^87.925. Recentemente foi reclassica da esta estirpe como Sac.charothrix aerocolonigenes (Bush et ^&1·} J· Antibiotics 40: 668-678, 1987) e e designada aqui como C38.383-RK2, (ATCC 392^3 de Saccharothrix aerocolonigenes. Esta estirpe foi isolada a partir de uma amostra de sol recolhida no Panamó. Na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, foi depositada uma cultura biologicamente pura da estirpe C38.383-RK2 e adicionada à sua colecção perma nente de microorganismos, sob a designação ATCC 392^+3. Esta cultura, designada como G38.383-RK2, foi mantida também como uma cultura adormecida em tubo liofilizado e ampolas cr&ogenicas, em Bristol-Myers Squibb Co. Pharmaceutical Research and Development Division Culture Collection, 5 Research Parkway, Wallingford, Connecticut 06M-92.

Os estudos taxonómicos da estirpe C38.383-RK2 (ATCC 392^3) forem descritos pormenorizadamente nas patentes de in12 venção norte-americanas 4.487.925 e em J, Antibiotics 40:

668-678, 1987. A estirpe foi classificada como uma nova estirpe de Saccharothrix aerocolonigenes.

Deve entender-se, que a presente invenção, não se M mite ao uso de a estirpe particular preferida ATCC 39243 ou a organismos correspondendo totalmente ã sua descrição. Entende-se especialmente incluir outras estirpes produtoras de rebecamicina ou mutantes do organismo descrito que podem ser produzidos por meios convencionais, tais como raios-X, ra diação ultravioleta, tratamento com mostarda nitrogenada, ex posição a fagos e outros.

Na prática do presente processo, cultivou-se uma estir pe produtora de rebecamicina de Saccharothrix aerocolonigenes, apresentando as características que identificam a estirpe C38.383-RK2 (ATCC 39243), ou uma sua mutante ou variante num meio aquoso nutriente convencional suplementado com o análogo de triptofano apropriado. Para a produção optimizada dos compostos de fórmula VI e X, o meio deve ser suplementado com DL-4-fluorotriptofano. Para â obtenção optimizada dos compostos de fórmu la IV e IX, deve suplementar-se o meio com DL-5-fluorotriptofa no. Para a produção optimizada dos compostos de fórmulas V e VIII, deve suplementar-se o meio com DL-6-fluorotriptofano.

Para a produção óptima dos compostos de fórmula VII e XI, o meio deve suplementar-se com DL-7-fluorotriptofano. 0 organismo desenvolve-se num meio nutriente contendo fontes nutricionais c£ nhecidas apropriadas para actinomicetos. Assim, o organismo desenvolveu-se num meio nutriente contendo uma fonte assimilável de carbono tal como a sacarose, lactose, glucose, ramnose, frutose, glicerol ou amido solúvel. O meio deve também conter >4

β uma fonte de azoto assimilável, tal como, farinha de peixe, peptona, farinha de amendoim, farinha de algodão, amido de mi lho líquido, aminoácidos ou sais de amónio. Podem-se ainda incorporar sais inorgânicos nutrientes num meio de modo a for necerem sódio, potássio, amónio, cálcio, fosfato, sulfato, ni trato, carbonato e outros iões. Se apropriado, adicionam-se ao meio .oligoelementos tais como o cobre, manganesio, ferro, zinco, etc. ou podem estar presentes como impurezas de outros constituintes do meio. As condições de preferência utilizadas são aêróbicas submersas, para a produção de grandes quantidades de antibiótico, embora que q para’ a· produção de quantidades pequenas se possam utilizar culturas superficiais e frascos. Os processos gerais utilizados para a cultura de outros actinomicetos são aplicáveis à presente invenção.

Pode efectuar-se a produção dos antibióticos da presen te invenção a qualquer temperatura desde que conduza a um cres_ cimento satisfatório do organismo produtor, como por exemplo desde 18 ate 39°C e de um modo conveniente realiza-se a uma temperatura de cerca de 28°C. A fermentação pode realizar-se em frascos ou em fermentadores de laboratório ou industriais de capacidade variável.

Quando se utiliza um tanque de fermentarão á adequado produzir um inóculo vegetativo num caldo nutritivo, mediante inoculação de um pequeno volume do meio de cultura com uma cul tura inclinada, ou conservada pelo frio ou uma cultura liofili zada do organismo produtor. Após a obtenção de um inóculo viá vel e activo, por este meio, transfere-se assepticamente este para o tanque de fermentação, cheio com um meio de produção pa

Sí

. ra grande escala do antibiótico da presente invenção. 0 meio em que o inóculo vegetativo se desenvolveu pode ser igual ou di ferente do que se utiliza no tanque desde que se proporcione um bom crescimento do organismo produtor e ainda suplementado com o fluorotriptofano apropriado. A agitação do meio pode ser pro porcionada por um agitador mecânico. Se apropriado, podem adicionar-se agentes anti-espuma como a banha ou óleo de silicone. A produção de antibiótico ê controlada por cromatografia líquida de alta resolução ou por umoensaio biológico convencional.

Em geral, alcança-se uma óptima produção dos antibióticos da presente invenção, após incubação durante cerca de seis dias.

Pode realizar-se o isolamento e purificação dos deriva dos obtidos deste modo por processos cromatograficos convencio na is.

Propriedades físicas e Químicas

Os Compostos de fórmulas IV, V e VIII têm as seguintes propriedades físicas e químicas:

Composto de fórmula IV

Descrição: Sólido amorfo amarelo claro f órmula Molecular t ^C26^19^2^3°7 Peso Molecular: 523.45^

Espectro de Massa: Bspectrómetro Kratos MS 25 Mass.

FABMS 52M- (Μ + H) ⁺ , 361 (M-162, perda de glucose).

Espectro Ultravioleta: Espectrofotómetro, díodo Hewlett Packard 8MA. Concentração 1,0 mgAOO ml MeOH.

Heutrol ^max nm (Ε 1 %/Y cm); 1+05, 322(457), 288, 277, 259, 230(31+8).

Espectro Infravermelho; Espectrometro Perkin-Elmer 1800 FTIR. Pastilha de KBr (cm¹); 3340, 2915, 1752, 1708, 1Ó28,

1591, 1484, 11+62, 1392, 1331, 1292, 121+7, 1191, 1U2, 1081,

1052, 947, 904, 795, 762, 752, 752, 511.

360 MHz: Espectrometro Bruker Model AM-3000.

Soma de competição carbono-protão, 5*™* Dissolvente DMSO-d^. Deslocamentos químicos observados (ppm); 11,78 (s,lH), 11,23 (s,lH), 8,85 (dd,lH), 8,77 (dd,lH), 3,01 (dd,lH), 7,68 (dd,lH), 7,46 (m,2H), 6,29 (d,lH), 6,12 (t,lH), 5,45 (d,lH), 5,17 (d,lH), 4,95 (d,lH), 4,07 (d,lH), 3,95 (m,2H), 3,81 (d,lH), 3,59

11Hz: Espectrometro Bruker Kodel AM-3000. Espectro de protão'não açoplado, Sonda de competição carbono-protão 5 mm. Dissolvente DMSO-d^. Deslocamentos químicos observados (ppm): 170,9, 170,8, 157,0(d), 157,0(d), 138,6, 137,2, 130,7, 129,2, 121,7(d), 121,4(d), 121,3, 119,6, 116,6,

115,1, 115,0(d), 114,6(d), 113,3(d), 113,2(d), 109, l(d), 109, l(d), 84,8, 78,7, 76,5, 73,2, 67,6, 58,3.

Solubilidade; Solúvel em DMSO, DMF, THF, acetona,

EtOAc, MeOH.

Cromatografia em camada fina (valores de R„)· Fase norim—imi«*!— Iim—t-·—ΙΊΙΙΙ··Γΐιιι·^—fm-.ium mm- u— h—:aw— —nn>-m— 4—y—11—-a—,!—^·»···ιΐ—iiu-w-r—rtilw»»·» -a—-u**—ii»iiaji>j—niiiiili—> mw Φ *“ vzl, fa* fa/ -h mal (gel de sílica 60) $ EtoAc; 0,10. EtoAc-MeOH (9:1 v/v): 0,41 > Fase Inversa (C'_l8) $ 0,lM HH^OAc-MeOH-CH CN (2;4;4 v/v); 2x6 7.

* Composto de Fómula V

Descrição: Sólido amorfo amarelo claro

Fórmula molecular: C_nzH-, _nFJ\^T-,0,-,

Peso Molecular: 523.^5^+

Μ*·»—'11«· liliTiHllil I Ιι»Ι'ιΙ«Ι—iiliM· II HH ΙΙΊΗ» i»l>, I iii. IfH *

Espectro de Massa; Sspectrómetro de Massa Kratos MS 25.

FABMS 52^ (M + H)+ 361 (M-1Ó2, perda de glucose).

Espectro,. Ultravioleta; Espectrõmetro, díodo, Hewlett Packard 3^52A. Concentração 1,0 mgAOO ml MeOH. J^Max neutro nm (S 1 M/lcm): 398(60), 316(6^+0), 280(259), 256(313),

226(526), 20U(^97).

Espectro Infravermelho:; Espectrõmetro Perkin-Elmer lôOO FTIR. Pastilha de KBr (cm^-1): 332¼ 2927, 17^5, 1701, 1623,

1580, li+91, 1*+71, 1^52, 11+12, I38U, I33O, 1233, 1172, 1116, 1075, 101+8, 1016, 963, 916, 829, 76¼ 7k5, 61+6, 635, 617, 1+98, 1+90.

^H-RMN, .360 MHz; Espectrõmetro Bruker Model AM-3000.

Sonda competitiva carbono-protão, 5 mm. Dissolvente d^-DMSO. Deslocamentos químicos observados (ppm): 11,77 (s,lH), 11,18 (s,lH), 9,12 (dd,lH), 9,05 (dd,lH), 7,θ5 (dd,lH), 7,1+3 (dd,lH),

7,23 (t,2H), 6,26 (d.,lH), 6,21+ (ε,ΙΗ), 5,31 (d,lH), 5,0*+ (d,lH), 3,98 (m,2H), 3,87 (rn,lH), 3,66 (s,2H).

C¹³-M, 90.. MHz; Espectrõmetro Bruker Model AM-3000. Espectro do protão não acoplado. Sonda competitiva carbono-pro tão, 5 mm. Dissolvente d^-DMSO. Deslocamentos químicos observados (ppm); 170,8, 170,7, l6l,8Xd), l6l,8(d), l>+3,2(d), lkl,5(d), 130,1, 128,7, 126,0(d), 125,9(d), 120,9, 119,3, 118,2,

118,1, 117,7, 116,5, 108,8(d), 108,6(a), 98,90), 98,3(d>., iZ

. 84,7, 78,6, 76,5, 73,1, 67,5, 58,3

Solubilidade; Solúvel em DMSO, DMF, THF, MeOH, acetona,' EtOAc.

Cromatografia em Cemada. Fina, (valores de R^): Fase normal (gel de sílica 60); EtoAc: 0,40. EtoAc-MeQH (9:1 v/v);

0,6S: Fase invertida (C_l8); O,1M HH^OAô-MeOH-CH^CN (2:4:4; v/v): 0,60·

Composto de Fórmula VIII

Descrição; Sólido amorfo amarelo claro

Fórmiala Molecular: ^27^21^2^3^7

Peso Molecular: 537.481

Espectro. .de Massa; Espeétrómétro dé Massa Kratos -MS 257 EABMS '538 (M + H)⁺, 361 (M-I76, perda de 4-0-metilglucose).

Espectro Ultravioleta: Espectrofotómetro, díodo, Hewlett Packard 8452A. Concentração 1,2 mg/100 ml MeOH.^Max Neutro nm (Ε 1 $Acm); 398(103),316(1050, 280(387), 256(454), 228(780).

Espectro. Infravermelho: Espectóinetro Perkin-Elmer 1800 FT1R. Pastilha de KBr (cm-¹); 3324, 2938, 1747, 1703, 1623, 1580,

1491, 1471, 1452, 1412, 1384, 1330, 1233, 1172, 1140, 1116, 1087, 1054, 963; 918;, 828, 764, 649, 635, £l8, 498.

hXrmH, 360 MHz: IspectoornetTO Bruker Model AMi-3000.

) ' Sonda competitiva carbono-protão, 5 mm· Dissolvente dg-DMSO.

Deslocamentos químicos observados (ppm): 11,77 (s,lH), 11,18 (s,lH), 9,12(dd,lH), 9,05 (dd,lH), 7,88 (dd,lH), 7,^1 (dd,lH),

7,23 (m,2H)., 6,25 (d,lH), 6,24 (ã,lH), 5,3^ <dd,lH), 5,31 (d,lH),

. 5,0M- (d,lH), 3,97 (m,2H), 3,60-3,95 (m,Mí).

C^^-RMN, 90 MHz: Espectrómetro Bruker Model AM-3000. ‘ Espectro de protão não acoplado. Sonda competitiva carbono-protão, 5 mm. Dissolvente d^-DKSO. Deslocamentos químicos observados (ppm): 170,8, 170,7, l6l,8(d), lól,7(d), 14-3,l(d), 14-1,5(d), 130,1, 128,7, 126,0(d), 125,9(d), 120,9, 119,4-,118,2,

118,1, 117,7, 116,5, 108,8(d), 108,6(d), 98,7(d), 98,3<d),

84-,4-, 77,2, 77,2, 76,2, 73,2, 59,9, 5â,5 PPm.

Solubilidade: Solúvel em DMSO, DMF, THF, acetona, EtOAc,

MeOH.

Cromatografia em Camada Fina (valores de Rp): Fase normal (gel de sílica 60).; . EtoAc: 0,72. EtoAc-MeOH (9:1 v/v)í

0,89. Fase inversa (C_lg); 0,lM NH^OAc-MeOH-CH^CN (2:4:4-: ív/v) 0,59.

Propriedades Biológicas;

Os compostos representativos da presente invenção foram testados em murganhos com leucemia ?3θθ transplantados afim de determinar a actividade antitumoral inivivo (Quadros 1-3)· Implantaram-se os murganhos CDF^ por via intraperitoneal com 10^ células de leucemia P388 obtidas de murganhos dadores DBA/2 portadores desta leucemia murina transplantóvel. Os murganhos leucémicos CDF-^ foram tratados por via intraperitoneal com solução de cloreto de sódio, nos murganhos que constituem 0 controlo ou com doses dos compostos de fórmulas IV, V e VIII uma vez no dia 1 após a inoculação do tumor. Observaram-se estes animais diariamente e registaram-se as mortes. Ascite-

rações de peso corporal médias, (do dia da implantação da leu cernia até ao dia do último tratamento), foram determinadas em todos os grupos como um meio reflector da toxicidade do fárma co·.À incidência de sobrevivência nos murganhos de cada gru po no dia 5 apés a implantação do tumor, registou-se como um meio adicional da avaliação da toxicidade da substância. Não se considerou qualquer resultado terapêutico como significati vo se no dia 5 tinha morrido mais que um murganho em cada gru po de tratamento. Cada grupo de tratamento era constituído por 4 a 6 murganhos; os grupos de controlo abrangiam 10 murganhos. Também se registou o número de murganhos, se existente, sobre viventes no dia 30, (último dia da experiência).

Avaliou-se a eficácia terapêutica determinando-se o tempo de sobrevivência média dos murganhos tratados com o com posto de férmula IV, V e VIII e comparando com os tempos de sobrevivência média de os murganhos constituindo o contrôlo paralelo. Esta comparação fez-se, dividindo o tempo de sobre vivência média, dos primeiros pelo tempo de sobrevivência média dos últimos e multiplicando por 100 para derivar um parâmetro designado como valor percentual de T/C. Considerou-se uma percentagem de T/C de 125 $ como um aumento signi ficativo da sobrevivência, e, portanto, um resultado activo.

No quadro 1 apresenta-se, o composto de formula IV relativamente â leucemia Ρ3θθ com doses variando entre 10 e 90 mgAg. 0 melhor resultado alcançado correspondeu â dose de 30 mg/kg e consiste num valor percentual T/C de 1/5 /· Não se detectou toxicidade mesmo para a dose mais alta testada (90 mgAg).

ç·

Como se apresenta no Quadro 2, o composto de fórmula V é activo sobre a leucemia P388 com doses variando en£re 0,8» e 102,A mg/kg. Alcançou-se o melhor resultado com uma dose de 102,A mg/kg correspondendo a um valor percentual de T/C de 178 Não se detectou toxicidade mesmo para a dose mais alta testada (102,4 mgAg).

Como se apresenta no Quadro 3, 0 composto de fórmula VIII é activo sobre a leucemia P388 com doses que variam entre 0,8 e 102,4 mg/kg. Obteve-se o melhor resultado com a dose de 51,2 mg/kg que correspondeu a um valor percentual T/C de 206 Ainda que na dose mais alta testada (102,4 mg/kg), não se observou toxicidade.

Quadro 1

Efeito do composto de fórmula IV sobre leucemia^a P388 (dia 1 de tratamento)

Dose, ip. (mg/kg/inj.)

Controlo

Tempos de sobre vivência Media (Dias)

16.5

17.5

14.5 10,0

% T/C	de peso Media (g)
i$e	-0,9
175	0,6
145	0,7
100

Alteração

N2 de murganhos
vivos	nos
Dia 5	Dia 30
4Λ	0/4
4Λ	0/4
A/A	0Λ
10A0	0/10

z ^aImplantaram-se 10° células de leucemia P388 nos ciou-se o tratamento com o composto de fórmula IV murganhos e ini um dia depois.

Os controlos receberam injecções de solução de cloreto de sódio.

Quadro 2

Efeito do composto de fórmula V sobre leucemia^a P388 (dia 1 de tratamento)

Dose, ip.	Tempos de sobrevivência	%	Alteração de peso	K^Q de murganhos vivos no
.(mg/kg/inj.)	Média (Dias)	T/C	Média (g)	Dia 5_	Dia 30
102,4	16,0	178	-0,1	6/6	0/6
51,2	15,0	167	-0,2	6/6	0/6
25,6	Vt-,5	161	-0,2	6/6	0/6
12,8	15,0	167	0,8	6/6	0/6
6,4	15,0	167	-1,1	6/6	0/6
3,2	14,0	156	0,0	6/6	0/6
1,6	14,0	156	-0,7	6/6	0/6
0,8	13,0	144	0,1	6/6	0/6
Controlo	9,0	100	1,3	10/10	0/10

a 6

Implanta.ram-se 10 células de leucemia Ρ3θδ, dos murganhos e iniciou-se 0 tratamento com o composto de fórmula VI dia de pois. Os murganhos controlo receberam injecções de solução de cloreto de sódio.

Qua22

Quadro 3

Efeito do composto de fórmula. VIII em leucemia⁸P388 (dial de tratamento) <r atar v<tM 1 »tt <44 tu) tu» Λ34Λ AK· -a ‘Tempos de sobreAlteração N2 de murganhos

Dose, ip.	vivência		de peso	Vivos	... nos
(mg/kg/inj.)	Média (Dias)	T/C	Média (g)	Dia 5	Dia
———«—-
102,4	1M	161	0,2	6/6	0/6
51,2	18,5	206	0,3	6/6	0/6
25,6	14,0	156	=0,1	6/6	0/6
12,8	1^,5	l6l	--0,1	6/6	0/6
6,4	16,0	178	0,1	6/6	0/6
3,2	16,5	I83	-0,3	6/6	0/6
1,6	14,0	156	-0,1	6/6	0/6
0,8	14,0	156	-0,4	6/6	0/6
Controlo	9,0	100	1,3	10/10	0/10

9. 6

Implantaram-se 10 células de leucemia P388 nos murganhos e inlciou-se 0 tratamento com 0 composto de fórmula VIII um dia depois. Os murganhos que constituíam o controlo foram.injecta dos com solução de cloreto de sódio.

A presente invenção abrange no seu âmbito composições farmacêuticas que contêm uma quantidade inibidora de tumor eficaz de um análogo de rebecamicina. da presente invenção ou um seu sal de adição de ácido aceitável sob 0 ponto de vista farmacêutico, associado com um veículo inerte aceitável em farmácia ou com um diluente.

fi

De acordo com outro aspecto di&síta indica-se um método para a terapêutica de um animal (de preferência um mámí fero), hospedeiro, portador de tumor maligno, que consiste em administrar-lhe uma dose inibidora de tumor eficaz do antibiótico da presente invenção ou-de um seu sal de adição de ácido aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

Exemplos de composições apropriadas incluem as composi ções sólidas para a administração oral tais como comprimidos, cápsulas, pirulas, pós e grânulos, composições líquidas para ad ministração oral tais como soluções, suspensões, xaropes e elixires e preparações para administração parentérica tais como as soluções estéreis, suspensões ou emulsões. Pode também ..preparar·—se uma forma de composição sólida estéril que se dissolve em água esterilizada, solução fisiológica de cloreto de sódio ou outro meio injectável estéril, no momento da utilização.

Deve entender-se que as doses reais preferidas de análo gos de rebecamicina. desta invenção, variarão de acordo com o composto utilizado, com a composição particular, com o modo de aplicação e sítio, com o hospedeiro e com a doença a tratar. D_evem ter-se em consideração numerosos factores que modificam a acção do fármaco, o que os técnicos entenderão, tais como idade, massa··.corporal, sexo, dieta, tempo de administração, taxa de excreção, situação do hospedeiro, associação de fármacos,reacções de sensibilidade e gravidade da doença. Pode realizar-se a administração de forma contínua ou periodicamente com o máximo da dose tolerada. As taxas de aplicação óptimas para um dado conjunto de condições podem ser facilmente determinadas pelos técnicos, usando testes de determinação-da dosagem apropriados.

A presente invenção é ilustrada através dos exemplos seguintes que não são considerados como limitantes do seu âmbito.

Exemplo 1

Preparação de uma cultura conservada pelo frio de Saccharothrix aerocolonigenes, estirpe c38.38-3-RK2 (ÀTCC (ATCC 3925+3)

Manteve-se a estirpe Ο3θ·3θ3~ύ&2 de Saccharothrix aerocolonigenes conservada pelo frio em cultura, à temperatun—ι»1Ίι·ι>»ι*Ιιμμ;»·ι«<·ί>ιι»»ιμ>'<ι—«— *

Λ O ra de -80 C, num congelador de temperatura ultra baixa Revco. Para preparar uma cultura conservada pelo frio, transferiu-se a estirpe Ο3δ.3θ3“ΚΚζ em tubos de ensaio para agar extracto de malte-levedura, inclinada, suplementado com carbonato de cál cio com a composição seguinte dextrose dxtracto de levedura extracto de malte

CaCO.

agar água desionizada

4,0 g 5+,0 g 10 g

1,5 g 15 g

q. b. ρ. 1 litro agar inclinado foi incubado à temperatura de 28°C por um período entre /-10 dias. Preparou-se a cultura vegetati va por transferencia do crescimento superficial da cultura inclinada para um frasco Erlenmeyer contendo 100 ml de meio vegetativo estéril composto por;

Cerelose (produtos de milho) 30 g

Pharmamedia (Traders Oil Mill Co) 10 g

Nutrisqy (Archer Daniels Midland Co) 10 g

CaCO^ 3 g água desionizada q. b. ρ. 1 litro

Incubou-se esta cultura vegetativa à temperatura de 28°C durante 48 horas num agitador rotativo com 250 voltas/mi nuto. Misturou-se a cultura vegetativa com igual volume de solução de protecção pelo frio constituída por

Sacarose glicerol água desionizada cl 00 g

200 g

q. b. ρ. 1 litro

Transferiram-se porções de 4 ml desta mistura para os tubos oriQgánicos estéreis com a capacidade de 5 ml (Corning) e congelaram-se num banho de neve carbónica-acetona. As culturas vegetativas congeladas foram em seguida conservadas à temperatura, de -80°C num congelador de temperatura ultra baixa. Revco.

Exemplo 2

Preparação de cultura vegetativa de Saccharothrix aerocolonigenes estirpe C38.383-RK2 (ATCC 3924-3)

Preparou-se a cultura vegetativa por transferência de 4- ml ,de cultura crioconservada para um balão Erlenmeyer de 500 ml contendo 100 ml de meio vegetativo esteril com a compo sição igual à do melo vegetativo descrito no exemplo 1, Incu ¹ bou-se esta cultura vegetativa à, temperatura de 28°C durante 48 horas num agitador rotativo a 250 voltas/minuto. „

Exemplo 3

Preparaçao do composto de fórmula IV

Inocularam-se 3 nil de cultura vegetativa obtida no exemplo 2, em frascos Brlenmeyer de 5θθ ml contendo cada um 100 ml de meio de produção constituído por;

Amido estaclipse J-UB (A. B. Staley) 10 g fosfato monopotássico 2 g sulfato de magnésio 1 g

L-treonina - 2,5 g

CaCO₃ 2 g água desionizada - q. b. ρ. 1 litro

Incubou-se a cultura de produção à temperatura de 28°C num conjunto de agitador rotativo a 250 voltas/minuto. Após 48 horas de fermentação adicionou-se à cultura DL-5-fluorotriq tofano até uma concentração final de 1 mg/ml. Manteve-se a cultura em incubação à temperatura de 28°C com a agitação de 250 voltas/minuto, durante mais 4 dias. A produção do composto de fórmula IV foi controlada por HPLC. A produção óptima do composto de fórmula IV, a uma concentração de 23-32 mg/ml, foi obtida de um modo geral, aos 6 dias de fermentação (isto é, 4 dias após a adição de DL-5-í‘luorotriptofano).

^Sxem•w

Exemplo 4

Inocularam-se 3 ml de cultura vegetativa obtida no exemplo 2 em frascos de Erlenmeyer de 500 ml cada, contendo .100 ml de meio de produção com a composição descrita no exemplo 3· Incubou-se a cultura de produção s. temperatura de 28°C num agitador rotativo a 250 voltas/minuto. Decorridas 48 horas de fermentação adicionou-se ã cultura DL-6-fluorotriptofano até à obtenção de uma concentração de 1 mg/ml. Manteve-se a cultura em incubação à temperatura de 28°C e com a agitação de 250 voltas/minuto por mais 4 dias. Controlou-se a produção dos compostos de formulas V e VIII por HPLC.

De um modo geral, aos 6 dias de fermentação, obteve-se uma pro dução óptima dos compostos V e VIII (isto ó, 4 dias após a adi ção de DL-6-fluorotriptofano), com uma concentração de 3^-5θyhg/ml e 31“^²Jig/ml respectivamente.

Exemplo 5

Isolamento e purificação dos compostos de fórmulas Ί, V e VIII.

a) Metodologia geral

Os dissolventes não são redestilados antes de utiliza ção. 0 metanol, acetona, acetato de etilo, éter, isopropílico, clorofórmio, tetrahidrofurano, éter etílico e hexano tinham o

grau reagente ACS . A água para HPLC é a. água desionizad'a localmente num sistema Barnstead Nanopura II. 0 tetrahidro fura.no, o metanol e o acetonitrilo para HPLC utilizado tinham o grau de dissolventes de HPLC, B. & J. Brand. 0 acetato de amónio era o grau HPLC, Fisher.

Realizou-se a fase normal de cromatografia em camada fina (ccf), sobre gel de sílica 60, placas F—25*+ (SM Reagents, Cat. N^õ 57^5, 5 ^x 10 cm, por 0,25 π® de espessuzta). A fase inversa da ccf foi realizada com placas Whatman MKC-^g (Cat.

NS ^803-110, espessura 0,2 mm).. Desenvolveram-se as placas em g

vasos cilíndricos Whatman com tampas e 10 ml de eluente. Os análogos de rebecamicina apresentaram-se visíveis sob a forma de zpnas amarelas em zonas de brilho normal ou em zonas fluorescentes amarelas com nm ou 366 nm à luz ultravioleta: Adicionaram-se em todos os caldos Dicalite (velocidade plus) comò auxiliar de filtração. Após uma agitação rápida filtraram-se os caldos em grandes funis de Buchner ou numa unidade de filtração centrífuga Folhurst Centerslung Centrifugal Filter Unit (modelo 1B15, Ametek, Inc.) Desprezaram-se os fil trados. A rede de micélio foi agitada em tetrahidrofurano ou em misturas de tetrahidrofurano-acetona durante 1 hora, filtra da e a Dicalite ainda foi limpa com acetona ate não apresentar mais fluorescência amarela à luz ultravioleta. Os filtrados reunidos foram concentrados sob pressão reduzida para se obterem os extractos não purificados.

Um aparelho de cromatografia líquida sob vácuo consistiu num funil Buchner (Kontes, Art. NS Κ-95^10θ) contendo um áisco de vidro selado, uma ligação lateral para vácuo e uma *

t* •e ‘ junta inferior 2UA0 para ligação aos frascos receptores. Inicialmente os dissolventes polares com menor eluição, passâ ram pela acção do vácuo ©ara formarem leitos absorventes de uma altura de 5 cm muito compactados. As amostras foram previa mente absorvidas num absorvente e aplicadas aos funis sob a fôr ma de pastas ou sob a forma de uma solução de solvente polar com menor eluição.

As fases de gradiente obtidas tinham volumes previamente determinados de eluente de polaridade crescente constituindo as fracções. 0 funil foi aspirado apos cada volume de eluente. Coneentraram-se as fracções e reuniram-se com base na análise por ccf.

aparelho para cromatografia de exclusão consistia no seguinte: Uma coluna Glenco (2,5 I.D. x 100 cm) equipada com teflon e placas resistentes a dissolventes; bomba Fluid Metering, Inc. FMI laboratorial, (modelo RP-G150)5 o reservato rio de vidro Glenco (500 ml); colector de fracções Isco Model 328. As colunas foram carregadas com pasta de Sefadex LH-20 (Pharmacia), previamente embebidas em dissolvente de eluição.

dissolvente foi distribuído de uma forma descendente através da coluna com um débito controlado pela bomba.

Utilizaram-se os componentes seguintes para formar um sistema de HPLC semi·*preparativo: bomba Waters Associates Model 590 Solvent Deliver^· System; detector de comprimento de onda varia^vel Knauer model 8/5 Registador de gráfico Waters Associates modelo SR-20ⁱf; coluna Whatman Partisil 10 ODS-3 (10 mm x 50 cm); tubagem de aço inoxidável 316 com diâmetro in-

terno de 0,23 mm).

b) Isolamento e purificação do composto de fórmula IV

Filtrou-se o caldo total (5 litros) por Dicalite e extraiu-se a rede de micélio por agitação em tetrahidrofurano (2 litros), durante 1 hora. Após posterior filtração e nova lavagem com tetrahidrofurano (1 litro), reuniram-se os filtra dos que se concentraram sob pressão reduzida para se obter

4.5 g de extracto não purificado. Adsorveu-se o extracto em

6.5 g de Lichroprep Si, gel de sílica 6o (SM Science, Art. 9336, 15-25 micra) e aplicou-se a um funil de 60 mm para cromatografia líquida por vácuo, contendo mais 24,5 g de gel de sílica. A fase do gradiente acetato de etilo-hexano foi realizada (com 200 ml por volume), seguida de 200 ml de THF pa ra lavagem. A lavagem com tetrahidrofurano (156 mg) foi dissolvida com 4 ml de THF' e aplicada a uma coluna contendo l60 g de Sefadex LH-20 equilibrada com tetrahidrofurano (altu ra 90 cm, volume 430 ml de leito). Débito 3,75 ml/minuto.

Como se pode determinar visualmente, aluiu uma banda amarela principal, (62 mg) no primeiro quarto do segundo volume de coluna. Realizou-se a purificação final por cromatografia de alta resolução de fase inversa (C^g) com um débito de 4 ml/mi nuto (0,1 M NH^OAc-THF (60-40). Fez-se s detecção a 32 nm.

A eluição aos 39 minutos forneceu 0 análogo principal (23 mg) designado como composto de fórmula IV,

c)

Isolamento e purificação dos compostos de fórmulas V e VIII.

Filtrou-se o caldo total (2 litros) através de um filtro auxiliar de Dicalite. Após agitação da rede micelar em tetrahidrofurano (2 litros) durante 45 minutos, filtrou-se e lavou-se com um volume adicional de tetrahidrofurano (1,5 li tros). Concentrou-se o filtrado sob pressão reduzida para se obterem 3,39 g do extracto não purificado. Este extracto foi triturado com cinco vezes 50 ml de tetrahidrofurano, volumes estes que se reuniram e concentraram para se obterem 0,74 g de resíduo solúvel em tetrahidrofurano. Esta massa continha o conjunto dos materiais de fluorescência amarela. 0 material solúvel em tetrahidrofurano foi absorvido em 2 g de gel de sílica H (Merck, 10-40 micra) e aplicada num funil de cromatografia líquida por vácuo de 30 ml contendo mais 11 g de gel de sílica Η. A fase do gradiente constituída por hexano/acetato de etilo foi realizada com volumes de 100 ml de eluente.

Deste modo separaram-se distintamente os dois análogos principais de rebecamicina. A zona amarela de menor polaridade (141 mg) eluiu com hexano-acetato de etilo (1:1) e o análogo mais polar (105 mg) com hexano-acetato de etilo (1:3).

análogo mais polar, (105 mg) foi dissolvido· em 2 ml de tetrahidrofurano e aplicado a uma coluna contendo 160 g de Sephadex LH-20 (altura do leito 90 cm e volume 430 ml) previamente embebida com tetrahidrofurano. 0 débito foi de 4 ml/minuto. A principal banda amarela eluiu com volumes de

1,25 como se pôde visualizar, para se obterem (77 mg) do composto de fórmula V.

análogo de menor polaridade, proveniente da cromato grafia líquida sob vácuo (141 mg) foi dissolvido em 2 ml de metanol e aplicado numa coluna contendo 110 g de Sephadex LH-20 previamente embebida em metanol (altura do leito 80 cm, volume 400 ml). 0 débito foi de 3,5 ml/minuto. A zona principal amarela eluiu no fim do quarto volume de coluna para se obterem (70 mg) do composto de fórmula VIII.

Reit» la geral

Claims

REIVINDICAÇÕES

1-- Processo para a preparação de compostos de fórmuK

H

HC

OC-h

Μ *' (II) em que

X- e. Χ_η representam, cada um, independentemente, um ãtomo de hidrogénio ou de flúor, com a condição de X^ e X₂ não. representarem simultaneamente um· ãtomo de hidrogénio, e dos seus sais de adição de ãcido aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico,..caracterizado pelo facto de.se cultivar uma estirpe de Saccharothrix aerocoionigenes produtora de rebecamirJ».

cina em um-meio nutriente aquoso na presença de um anãlogo de triptofano até à obtenção de uma quantidade substancial do análogo de rebecamicina pretendido, e separação do mesmo anãlogo, a partir do meio de cultura, sob uma forma muito pura.
2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de se utilizar como estirpe produtora de rebe camicina a Saccharothrix aerocoionigenes ATCC 39243.

Λ

1» ij

Ç
3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de se utilizar como análogo do triptofano o DL-4-fluorotriptofano.
4. - Processo de acordo com a reivindicação. 1, caracte rizado pelo facto de se utilizar como análogo do triptofano o DL-
5-fluorotriptofano.

• 5.- Processo de acordo.com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de se utilizar como análogo do triptofano o DL-6-fluorotriptofano.
6. - Processo de acordo com a reivindicação 1,- caracte rizado pelo facto de se utilizar como análogo' do triptofano o DL-7-fluorotriptofano.
7. - Processo'de acordo com a reivindicação 1, par-a a preparação, do composto de fórmula caracterizado pelo facto, de se utilizar o análogo de triptofano correspondente.
8.- Processo.de acordo com a reivindicação 1, para a preparação do composto de fórmula caracterizado pelo facto.de se utilizar· o análogo de triptofano correspondente.
9.- Processo de· acordo com a reivindicação 1, para a preparação do composto de fórmula caracterizado pelo facto de se utilizar o análogo de triptofano correspondente.
10.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação do composto de fórmula caracterizado pelo facto de se utilizar o análogo de triptofano correspondente.
11.— .Processo de acordo- com a reivindicação 1, para a preparação do composto de fórmula >

caracterizado pelo facto de se utilizar o análogo de triptofano correspondente
12.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação do composto de fórmula caracterizado pelo facto de se.utilizar o análogo de triptofano correspondente
13.— Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação do composto de fórmula caracterizado pelo facto de se utilizar o análogo de triptofano correspondente.
14.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação do composto de fórmula caracterizado pelo facto de se utilizar o análogo de triptofano correspondente.
15.- Processo para a preparação de composições farmacêuticas apropriadas, para o tratamento de tumores sensíveis a análogos de rebecamicina, caracterizado pelo facto de se misturar, como ingrediente activo, uma quantidade efica2- de um compos. to de fórmula geral I ou II, preparado pelo processo de acordo com a reivindicação 1, com um veículo ou excipiente não tóxico aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

o Aflent» Oficial da Prepriedade Industrial /TV

-40RESUMO

PROCESSO PARA A PREPARAÇAO DE ANÁLOGOS DE REBECAMICINA E DE COM posiçOes farmacêuticas que OS CONTÊM

Descreve-se um processo para a .preparação de compostos de fórmula geral e dos seus sais de adição de ãcido aceitáveis sob o ponto de vis ta farmacêutico que consiste em cultivar uma estirpe de Saccharothrix ·. .aerocolonigenes produtora de rebecamicina em um meio nutriente- aquoso na presença de um análogo de triptofano e em separar do meio de cultura o derivado de rebecamicina obtido sob uma forma muito pura.

Estes compostos exibem propriedades antitumorais.

Ciíirial ria t^remri •ΤϊαΤϊ» InSiioíríaf

3000 2000 1600 1200 800

100 ppm ppm sr ο*

Ll

4000 3000 2000 1600 1200

001

I *

FIG.5 ppm

N

O

Ll

4000 3000 2000 1600 1200 800 400 f

001 uudd ο

Γ tLO

Ο

ΤΟ

190 ISO 170 160 150 140 130 120 110 100 ppm c\j

Λ

FIG. 10

1-Γ—Γ

FIG. II η =