PT98444B

PT98444B - Processo para a preparacao de um novo antibiotico, balimicina, e de composicoes farmaceuticas que o contem

Info

Publication number: PT98444B
Application number: PT98444A
Authority: PT
Inventors: Erra Koteswara Vijayakumar; Sugata Chatterjee; Jurgen Blumbach; Herbert Kogler; Hans-Wolfram Fehlhaber; Suresh Rudra Nadkarni; Mahesh Vithalbhai Patel; Kalyanapuram Rajagopal Desikan; Bimal Naresh Ganguli
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1990-07-27
Filing date: 1991-07-25
Publication date: 1999-01-29
Also published as: IL98958A0; HRP940710A2; CZ282296B6; FI101402B; JP3119680B2; JPH04261200A; NO912931D0; HUT61606A; GR3025433T3; DK0468504T3; EP0468504A1; CS233491A3; EP0468504B1; IE912643A1; KR100221687B1; NZ239130A; CY2114B1; KR920002795A; RU2043418C1; FI101402B1

Description

Descrição referente à patente de invenção de HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D-6230 Frankfurt am Main 80,República Federal Alemã, (inventores: Dr. Suresh Rudra Nadkarni, Dr. Sugata Chatterjee, Dr. Mahesh Vithalbhai Patel, Kalyanapuram Rajagopalan Desikan, Dr. Erra Koteswara Satya Vijayakumar, Dr. Bimal Naresch Ganguli e Dr. Jurgen Blumbach, residentes na índia e Dr. Hans-Wolfram Fehlhaber e Dr. Herbert Kogler residentes na Alemanha), para: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM NOVO ANTIBIÓTICO, BALIMICINA, E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE O CONTÊM.

DESCRIÇÃO

A presente invenção refere-se a um novo antibiótico glicopeptídico chamado balimicina originário de uma cultura de de Actinomycetes número Hoechst índia Limited Y-86.21022. A balimicina pode ser descrita como um antibiótico antibacteriano pertencente à classe dos glicopeptídeos. Os antibióticos glicopeptídicos são antibióticos de banda estreita que actuam principalmente contra bactérias Gram positivas. A sua actividade contra estirpes de S. aureus resistentes a meticilina (MRSA) torna-os fármacos valiosos no tratamento de infecções provocadas por MRSA. São também úteis como promotores do crescimento no campo veterinário. Os antibióticos glicopeptídicos estão descritos em l

Topics in Antibiotic Chemistry, Vol. 5, página 119 (1989). Journal of Antibiotics, Vol. 38, página 561 (1985). Journal of Antibiotics, Vol. 40, página 924 (1987) , Journal of Organic Chemistry, Vol. 54, página 983 (1989).

No entanto, a balimicina agui descrita difere de todos os antibióticos glicopeptidicos conhecidos pela sua fórmula molecular e deste modo constitui o objecto da presente invenção. Adicionalmente uma busca on-line dos Chemical Abstracts realizada com as chaves de busca do peso molecular e da fórmula molecular confirma a novidade do composto.

O microorganismo, com o N² de cultu ra Hoechst índia Limited Y-86,21022, doravante designado por Y-86,21022 usado para a produção de balimicina foi isolado a partir de uma amostra de solo recolhida na floresta Thamu, Himalaias, índia. 0 microorganismo Y-86,21022, pertence à ordem Actinomycetales. 0 microorganismo Y-86,21022 foi depositado na Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen sob as condições do Tratado de Budapeste em 6 de Abril de 1990 e recebeu o NS DSM 5908.

Um aspecto adicional da presente in venção consiste proporcionar um processo para a produção do novo antibiótico balimicina a partir da cultura NS Hoechst índia Limited Y-86,21022 ou dos seus mutantes e variantes. 0 referido processo compreende o cultivo da cultura Y-86,21022 ou dos seus mutantes e variantes sob condições aerõbicas num meio nutriente que contem fontes de carbono e nitrogénio, sais inorgânicos nutrientes e elementos vestigiais e o isolamento e purificação do referido antibiótico a partir do caldo de cultura. As fontes de carbono podem ser amido, glucose, sucrose, dextrina, frutose, melaço, glicerol, lactose ou galactose. A fonte de carbono preferida é o glicerol. As fontes de nitrogénio podem ser farinha de soja, farinha de amendoim, extracto de levedura,extracto de carne, peptona, extracto de malte, licor de maceração de milho, ge latina ou ácidos casamlnicos. A fonte de nitrogénio preferida é constituída por farinha de soja. Os sais inorgânicos nutrientes podem ser hidrogeno-fosfato de sódio, hidrogeno2

3^'

-fosfato de potássio, cloreto de sódio, cloreto de cálcio, carbonato de cálcio, nitrato de potássio, sulfato de amónio ou sulfato de magnésio. Dos elementos vestigiais podem ser sais de ferro, manganésio, cobre, zinco, ou cobalto ou outros metais pesados.

cultivo da cultura N2 Y-86,21022 de preferência levado a cabo a temperaturas entre 28 e 32QC e a um pH entre 6,0 e 8,0. Em particular a cultura N^e y-86,21022 e cultivada a 292C (+ l^c) e a um pH de cerca de 7,0.

A fermentação é levada a cabo de preferência durante 60 ou 72 horas sob condições de submersão em balões cónicos ou então em fermentadores de laboratório. Se desejado, pode ser usado nos fermentadores um agente anti-espuma tal como o Desmophen ^<R) (Polyols, Bayer-AG-Leverkusen,Alemanha Ocidental). 0 progresso da fermentação e a formação do composto de acordo com a presente invenção podem ser detectados por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e pela medida da bioactividade do caldo de cultura contra espécies de Staphylococci pelo método conhecido do ensaio da difusão em placa de agar microbiano. A cul tura preferida e o Staphylococcus aureus 3 066 que se sabe ser resistente à Meticilina, um antibiótico beta-lactâmico referenciado na literatura.

A balimicina pode por exemplo ser isolada a partir do caldo de cultura por adsorção directa em absorventes adequados tais como carbono activado, Diaion HP-20 (resina de alta porosidade baseada num copolímero de poliestireno-divinilbenzeno-Mitsubishi Chemical Industries, Japan) ou Amberlite XAD (resina porosa baseada num ester de ácido poliestireno-acrílico-Rohm & Haas Co.,E.U.A.). O adsorvente preferido é Diaion HP-20. A balimicina pode ser eluída destes adsorventes pelo uso de fases móveis tais como água, metanol, acetona,acetonitrilo ou suas combinações adequadas. Os eluentes preferidos são metanol aquoso ou acetona.

As supramencionadas fracções eluídas aetivas que contêm balimicina podem ser concentradas e podem ser ainda purificados de diversas formas. Por exemplo, processo de readsorção e eluição com carvão vegetal activado, Amberlite XAD-4 e 7, Dialon HP-20; filtração por gel com Sephadex LH-20·, ou geis de série G (Pharmacia Fine Chemicals AB, Suécia) usando como eluentes água, metanol, acetona ou suas combinações apropriadas; cromatografia de permuta iónica com IRC-50 (H⁺) numa gama de pH de 6,5 a 8,5 usando HCl 0,1 N como eluente; ou cromatografia líquida de pressão média (MPLC) em adsorventes apropriados com sílica, sílica modificada tal como sílica de fase inversa, por exemplo síli ca octadecildimetilsililada (RP-18) usando metanol aquoso ou acetonitrilo contendo um aditivo adequado tal como sal ou ácido, como eluente.

A balimicina pode ser convertida de uma forma conhecida nos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, com ácidos orgânicos e inorgânicos tais como HCl, H₂SO₄, ácido cítrico, ãcido láctico, ãcido succínico, ãcido acético e ãcido trifluoroacético.

As propriedades físico-químicas e espectrais da balimicina são apresentadas no Quadro 1, em baixo

Propriedades físico-químicas e espectrais da balimicina (sob a forma do seu sal trifluoroacetato) ^{* 18}

Natureza

Tipo químico

Solubilidade

P.f.

[ 0< ]²²D

Cromatografia liquida de alta pressão (HPLC) Tempo de Retenção

Fórmula Molecular

UVmak (H₂0) ¹H NMR (400 MHz D₂O, 300 K)

Pó branco

Glicopeptídeo básico da classe vancomicina

Água, dimetilsulfóxido >300SC (decomposição)

-23,2+29 (C=5, H₂O)

4,2 minutos, 4x(250+30)mm 10 μ ODS-Hipersil coluna, eluente % acetonitrilo em água contendo 0,1 % de TFA, taxa de fluxo 2 ml/minuto, detecção 220 nm, velocidade do papel 10 mm/ /minuto, Figura 1 dos desenhos anexos

J66^H73?¹2^9°24 determinada por espectrometria de massa FAB de alta resolução (M+H⁺ medido m/z 1446,4204. Calculado m/z 1446,4205 para

12p Ιττ 35ρ-ι 14vr 10(i \ ^C66 ^H74 ^C12 ^N9 °24^

208, 285 nm

Figura 2 dos desenhos anexos

A balimicina e os seus sais fisiologicamente tolerados podem ser administrados, por exemplo, oralmente, intramuscularmente ou por via intravenosa. Os pro dutos farmacêuticos que contêm a balimicina como substância activa são também objecto da presente invenção. Podem ser preparados por mistura do composto referido com um ou mais adjuvantes e/ou excipientes farmacologicamente tolerados tais como, por exemplo, diluentes, emulsionantes, lubrificantes, aromas, corantes ou substâncias tampão, e convertidos numa forma farmaceuticamente aceitável tal como, por exemplo, comprimidos, comprimidos revestidos, cápsulas, ou uma suspensão ou solução adequada para administração parenteral. Exemplos de adjuvantes e/ou excipientes que podem ser mencionados são goma adragante, lactose, talco, agar-agar, poliglicois, etanol e água. São adequadas e preferidas para administração parenteral as suspensões ou soluções em água. Também é possível administrar a substância activa como tal, sem veículos ou diluentes, numa forma adequada, por exemplo em cápsulas.

São doses adequadas do composto da presente invenção ou dos seus sais de adição de ácido fisiologicamente tolerados cerca de 0,1 a 2 0 g/dia, de preferência 0,5 a 4 g/dia, para um adulto de peso corporal de cerca de 60 kg.

É possível administrar doses simples, ou, em geral, doses múltiplas, sendo possível que a do-se simples contenha a substância activa numa quantidade de cerca de 50 a 4000 mg, de preferência de cerca de 500 a 2000 mg.

A corrente invenção é adicionalmente caracterizada pelos seguintes exemplos e pelo conteúdo das reivindicações da patente.

EXEMPLO 1

Isolamento da cultura Y-86,21022 a partir do solo (a) Composição do meio nutriente de isolamento

Amido de milho	10,0 g
Caseína	1,0 g
Peptona	1,0 g
Extracto de levedura	1,0 g
k₂hpo₄	0,5 g
Pó de agar	13,0 g
Água desmineralizada	1,0 1
PH	7,5

(b) Depósito do solo e isolamento.

lOg de solo recolhido na floresta de Thamu, Himalaias, índia, foram adicionados a 90 ml de água desmineralizada esterilizada num balão de Erlenmeyer de 250 ml que foi agitado durante duas horas num agitador rotativo (22 0 rpm) . A supramencionada suspensão de solo foi então diluída em série por passos de 10 upto(10^-5). Des de a última diluição, foi colocado 1 ml da suspensão no centro de uma placa de Petri de vidro estéril (15 cm de diâmetro), e foi-lhe adicionado aproximadamente 50 ml de meio de isolamento acima referido suplementado com 25 gg/ml de anfotericina B como agente anti-fungico e arrefecido a 45^eC sendo a placa feita rodar cuidadosamente. A mistura de suspensão do solo e meio foi deixada assentar e incubada a 28 2C (+ 12C) durante 7 dias. A placa de Petri foi periodicamente observada e a cultura N2 Y-86,21022 foi isolada de entre os microorganismos em crescimento.

EXEMPLO 2

Manutenção da cultura Y-86,21022

Composição do meio de manutenção

A cultura NQ Y-86,21022 foi mantida no seguinte meio

Extracto de Malte	. . .	10,0	g
Extracto de fermento	• · ·	4,0	g
Glucose	. . .	4,0	g
Pó de agar	. . .	13,0	g
Água desmineralizada	. . .	1,0	Litro
pH	...	7,0

Após dissolução completa dos ingredientes por aquecimen to, foi distribuído em tubos de ensaio e em seguida esterilizado a 1212C durante 20 minutos. Os tubos de ensaio foram arrefecidos e deixados solidificar numa posição oblíqua. As cunhas de agar foram riscadas com o produto da cultura Ns Y-86,21022 por uma ansa de arame e foram incubadas a 28SC (+ isc) até ser observado um bom crescimento. As culturas que registaram um bom cres cimento foram armazenadas no frigorifico a + 8^ec.

EXEMPLO 3

Fermentação da cultura Y-86,21022 em balões de agitação

Composição do meio de inoculação 1

Glucose ... 15,0 g

Farinha de soja ... 15,0 g

Licor de maceração de milho ... 5,0 g

CaCOg ... 2,0 g

Água desmineralizada ... 1000 ml pH ...7,0

Este meio de inoculação foi distribuída em parcelas de 80 ml em balões de Erlenmeyer de 500 ml e esterilizado em autoclave durante 20 minutos. Os balões foram arrefecidos até à temperatura ambiente e cada balão foi então inoculado com uma ansa da cultura bem crescida acima mencionada do Exemplo 2 e foram agitados num agitador de rotação durante 72 horas a 240 rpm a 29sc ( + isc) para se chegar à cultura de inoculação.

Composição do meio de produção

Glicerol

Farinha de soja

CaCO₃

NaCl

CoCl₂

Água desmineralizada pH

15,0 g 10,0 g i,o g 5,0 g

0,001 g 1000 ml

7,0

O meio de produção foi distribuído em parcelas de 60 ml em balões de Erlenmeyer de 500 ml e esterilizado em autoclave a 121^c durante 20 minutos. Os balões foram arrefecidos e em seguida inoculados com a supramencionada cultura de inoculação (1% v/v).

A fermentação foi levada a cabo num agitador orbital a 240 rpm e à temperatura de 292C (+ l^C) drante 68 horas.

A produção do antibiótico foi determinada por HPLC e pe lo teste da bioactividade contra S, aureus 3066 usando o método de difusão do alvéolo de uma forma conhecida. Após a colheita, o caldo de cultura foi centrifugado e a balimicina foi isolada a partir do filtrado de cultura e purificada conforme é descrito no Exemplo 4.

EXEMPLO 4

Cultivo da cultura Y-86,21022 em fermentadores

Preparação da cultura de inoculação em balões cónicos meio de inoculação do Exemplo 3 foi distribuído em parcelas de 160 ml em balões de Erlenmeyer de 1 1 esterilizado em autoclave durante 20 minutos. A cultura de inoculação foi cultivada nestes balões conforme é descrito no Exemplo 3.

Fermentação em larga escala

Composição do meio de produção

Glicerol

Farinha de soja

CaCOg

NaCl

Água desmineralizada PH

15, o g 10, o g

1,0 g 5,0 g

... 1000 ml

6,8

100 litros do meio de produção num fermentador Marubishi de 150 litros juntamente com 3 0 ml de Desmophen como anti-espuma foram esterilizados in situ durante 24 minutos a 1212c, arrefecidos a 29ec + isc e inoculados com 3 litros da cultura de inoculação acima referida.

A fermentação foi realizada com os seguintes parâme tros:

Temperatura ... 292c (+ 0,52c)

Agitação . . . 110-12 0 rpm

Ventilação . .. 8 0-100 epm

Tempo de colheita ... 69-72 h

A produção do antibiótico foi controlada pela bioactivi dade contra S. aureus 3066. Quando se interrompeu a fer mentação, o pH do caldo de cultura era de 6,0 a 7,0. O caldo de cultura foi centrifugado após a colheita e o antibiótico balimicina foi isolado e purificado a partir do filtrado de cultura conforme é descrito em seguida.

Isolamento e purificação da balimicina

Cerca de 100 1 do caldo recolhido, conforme obtido no Exemplo 4, foram separados do micélio por centrifugação. O filtrado do caldo resultante (80 1, pH 6,5) foi feito passar por uma coluna de 5 1 de Diaion HP-20, em água. A coluna foi lavada com 40 1 de água desmineralizada, sendo as lavagens seguintes incolores. A coluna foi então lavada com 8 1 de NaCl aquoso 1 M seguido de 10 1 de água desmineralizada. Este processo foi repetido uma vez. A coluna foi então lavada com 9 1 de MeOH

a 30% em água e finalmente eiuída com 51 1 de MeOH a 75% em água recolhidos em fracções com a dimensão de 1 1. A presença da balimicina nestas fracções foi controlada pela sua actividade contra Staphylococcus aureus 3066 que é um organismo resistente à meticilina. As fracções activas combinadas foram concentradas sob vácuo a uma temperatura de 40 a 45QC para aproximadamente 1 1 que foi então liofilízado para dar origem a 38 g de balimicina impura sob a forma de pó.

O material impuro acima referido foi então sujeito em três lotes de 10 g cada a cromatografia líquida de média pressão (MPLC) em RP-18 embalado numa coluna de vidro de 6,5 x 55 cm com um volume de leito de 1,2 1. A coluna foi eiuída com 2 1 de água contendo 0,1 % de áci do trifluoroacético (TFA),seguindo-se eluição com aceto nitrilo a 5 % (41), acetonitrilo a 7,5 % (91) e acetonitrilo a 10 % (24,5 1) em ãgua contendo 0,1 % de TFA. A balimicina foi eiuída em fracções de acetonitrilo a 10% que foram recolhidas em fracções de 500 ml e controladas pela actividade antibiótica in vitro. As fracções activas combinadas foram concentradas sob alto vácuo a 40sc e em seguida liofilizadas para proporcionar 2,1 g de balimicina com a forma de um pó amarelo pálido. Três processos destes deram origem a um total de 6,3 g de balimicina semi-pura a partir dos 30 g de material impuro.

Os 6,3 g da balimicina semi-pura obtidos deste modo foram finalmente purificados ao serem sujeitos, em três lotes de 2,1 g cada, a MPLC em RP-18 numa coluna de vidro de 6,0 x 45 mm com um volume de leito de 500 ml. A coluna foi lavada com 1 1 de ãgua contendo 0,1 % de TFA seguida de 2 1 e 1,5 1 de acetonitrilo a5%ea7,5% respectivamente em água contendo 0,1 % de TFA. A balimicina foi eiuída em acetonitrilo a 10% em água con tendo 0,1 % de TFA, as reacções de 250 ml cada foram controladas por um detector de UV trabalhando a 220 nm e por uma análise de antibiótico in vitro. Um total de 8 1 de fracções activas foram concentradas sob alto váll

cuo a 402C, seguindo-se liofilização para dar origem a 600 mg de balimicina sob a forma de um sal trifluoroacetato sob a forma de pó branco. A partir dos 6,3 g de balimicina, semi-pura, obtiveram-se 1,8 g de balimicina pura

Propriedades biológicas da balimicina

A actividade antibacteriano da balimicina como valores de MIC necessários para inibir o crescimento de diversas bactérias é apresentada no Quadro II.

QUADRO 11

Combinações inibitórias mínimas (MIC) de trifluoroacetato de balimicina

Organismo de ensaio		MIC (Mg/ml)
S.aureus 209 P		0,39
S.aureus (MethR)		0,39
S.aureus 3066 (MethR)		0,78
S.aureus E 690 (MethR)		0,39
Streptococcus faecalis ATCC	29212	1,56
S. faec. D 21777		0,78
S. faec. D Endococcen		0,78
S. faecium D-59		1,56
S. faecium D-65		0,78
Staph. epidermidis 178		1,56
S. epi. 825		3,12
S. epi. 823 (Teicoplanin^R)		12,5
Staph. haemolyticus 712		1,56
S. haemo 809 (Teicoplanin^R)		6,25
E. coli 9632		>100
P. vulgaris		>100
Ps. aeruginosa		>100

Claims

REIVINDICAÇÕES

- lã Processo para a preparação de balimicina, um composto de fórmula molecular C₆₆H₇₃C1₂N₉O₂₄, caracterizado por se cultivar a espécie Actinomycete Y-86,21022 (DSM 5908) ou mutantes e/ou variantes desta sob condições aeróbicas num meio nutriente que contém fontes de carbono e de azoto, sais nutrientes inorgânicos e elementos vestigiais e se isolar e purificar o composto a partir do caldo de cultura do modo habitual.

- 2â Processo de acordo com a reivindica ção 1 caracterizado por a cultura ser efectuada a uma tempe ratura entre cerca de 28 a 32 sc e a um pH entre cerca de 6 e

8.

_ ₃a _

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2 caracterizado por a cultura ser efectuada à temperatura de 29ac (+ 1SC) e a um pH de cerca de 7,0.

- 4ã Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3 caracterizado por a fermentação durar 68 a 72 horas.

- 5§ Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 caracterizado por a fermentação ser efectuada sob a forma de uma fermentação submersa.

- 6§ Processo para a preparação de uma composição farmacêutica que contém um composto produzido de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5 caracterizado por o referido composto ser misturado com adjuvantes e/ou excipientes habituais para a preparação de composições farma cêuticas e a mistura ser transformada numa forma adequada para administração.

A requerente reivindica as priorida des dos pedidos da patente europeus apresentados em 27 de Julho de 1990, sob o Ns 90114471.7 e em 17 de Outubro de 1990 sob ο N2. 90119883.8.