PT98687A - Novo processo para a deteccao de agentes patogenicos utilizando sondas de adn - Google Patents

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Description

"NOVO PROCESSO PARA A DETECÇÃO DE AGENTES PATOGÊNICOS UTILIZANDO SONDAS DE ADN" A malária ê causada por parasitas protozoários pertencentes ao género Plasmodium. 0 ciclo de vida dos parasitas decorre em duas fases: a fase assexuada, nos vertebrados e a fase sexuada no mosquito (geralmente do gênero Anofeles), As quatro espécies de Plasmodium responsáveis pela malária humana são o P. falciparum, o P. vivax e P. malariae e o P, ovale. Entre estas, as duas primeiras espécies são as mais comuns. 0 P, falciparum origina a forma de malária mais grave, que nalguns casos ê fatal. Para além disto, este parasita também desenvolve resistência aos fãrmacos anti-maláricos habitualmente utilizados. 0 método actual para o diagnostico da malária, consiste no exame de uma amostra de sangue. Este método ê trabalhoso e requer, também especialistas. Para além disto, um especialista em microscopia examina, no máximo, sessenta lâminas por dia. Também se pode fazer o diagnostico serolõgico mas, devido â persistência de anticorpos, não pode fazer-se a distinção entre as infecções correntes das infecções antigas (1), No entanto, na pesquisa de novas ensaios de diagnostico incluiu-se a possibilidade de se detectar ácidos nucleicos do pa rasita, como um indicativo da presença do parasita. Teoricamen te seria necessária para este ensaio uma quantidade de sangue muito pequena, (5—5Q ^il) que podia ser obtido a partir da punção de um dedo e que podia ser sensível e rápido. Podiam detec tar-se apenas 5Q parasitas, em 10 jil de sangue, por hibridiza ção de ácido nucleico (2), Podem analisar-se centenas de amos tras, num so dia, com alguma preparação inicial. Λ sensibilidade do ensaio torna possível a utilização do teste em bancos de sangue para o exame de sangue que se pretenda utilizar para transfusão.
Também se pode efectuar a hibridização do acido nucleico em amostras de tecido de insectos, tendo em vista a identificação da espécie de vector como um veículo. Esta informação poderá auxiliar na intensificação dos cálculos de controlo do vector no sentido de se limitar a disseminação geo gráfica da malária. Como alternativa, pode adoptar-se, em tais áreas, a quimioprofilaxia, podendo avaliar-se os efeitos desta estratégia utilizando a hibridização de acido nucleico. O pro cesso descrito neste pedido de patente de invenção proporciona um meio eficaz para se conseguir a detecção do parasita, utilizando técnicas de hibridização de ácido nucleico. O método de detecção descrito na presente invenção pode ser geralmente utilizado para se detectar a presença de agentes patogênicos, especialmente de agentes patogênicos sanguíneos, no sangue, tecidos, amostras e fluidos orgânicos de seres humanos, assim como de vertebrados e de invertebrados, de um modo geral, tais como gado e insectos.
Os referidos agentes patogénios podem consistir, por exemplo, em bactérias, vírus e parasitas, por exemplo, do gene ro Plasmodium, especialmente, p, falciparum e P, vivax* Podem referir-se, como mais exemplos de agentes patogênicos, a Shi-gella, por exemplo a Shigella flexneri, a Shigella desenteriae a Shigella sonnel e o Micobactêrium tuberculosis.
Embora, os exemplos específicos do presente pedido se refiram ao P. falciparum, devera ter-se em consideração que o método de detecção aplicasse, de um modo geral, tal como anteriormente se referiu,
TÉCNICA ANTERIOR
Actualmente, utiliza—se a hibridização de acido nuclei co (ADN e ARN), em diversos diagnósticos clínicos. Inicialmente utilizava-se nesta tecnologia sondas marcadas radioactiva-mente. Apesar da sensibilidade do diagnostico no procedimento radioactivo ser satisfatória, este método não ê popular nos la boratôrios clínicos devido às precauções e regulamentação que ê necessário observar quando se manuseiam materiais radioacti-vos. Existia por isso uma necessidade premente de uma detecção não radioactiva, no campo da detecção dos agentes patogênicos, por hibridização de ácido nucleico. Um dos métodos mais populares de detecção não isotõpica baseia-se na incorporação en-zimãtica de biotina ou fotoquímica (3) nas sondas de ácido nucleico (4). Os híbridos que ligam as sondas de biotina marca das podem deste modo, ser facilmente detectados com complexos de avidina ou de estreptavidina e de enzimas adequados como a fosfatase ou a peroxidase. Embora os métodos não isotópicos anteriormente referidos possam ser atractivos, não são ainda populares. Continuam por resolver alguns problemas importantes. Os problemas principais referem-se ao contexto colorido e ao estado de pureza do ADN alvo, A maioria dos diagnósticos basea dos em ADN são feitos em membranas filtrantes (de nitrocelulo-se ou de nylon). Os fluidos orgânicos como o sangue, que se pretendem ensaiar para se efectuar o despiste de agentes pato- gênicos, quando colocados directamente sobre a membrana filtrante para imobilizar o ADN, deixam uma marca colorida indelével que torna o subsequente desenvolvimento da cor, apôs hi bridização, quase impossível. Deste modo, a única alternativa possível consiste em efectuar manchas de ADN puro obtido a partir de agentes patogênicos que se encontram presentes nos tecidos e fluidos orgânicos. Uma vez que o isolamento do ADN envolve um procedimento que inclui a centrifugação e a precipitação, isto reduz muitas vezes a possibilidade de se efectuar um diagnóstico de amostras múltiplas. Para se levar a efeito um procedimento preferencial de diagnóstico baseado na hibri-dização de ácido nucleico, são essenciais as seguintes condições :
CONDIÇÕES ESSENCIAIS PARA SE LEVAR A EFEITO UM BOM PROCEDIMENTO DE DIAGNÓSTICO DE AMOSTRAS MÚLTIPLAS BASEADO EM ADN 1. Deverá basear-se numa detecção não radioactiva 2. Deverá utilizar pequenas quantidades de sangue (uma gota, por punção dum dedo). 3. A maioria dos componentes utilizados no conjunto de diagnôs_ tico deverão conservar-se estáveis â temperatura ambiente. 4. Deverá evitar a micropipetação exacta de componentes individuais. 5. Deverá evitar os passos de centrifugação e precipitação. 6. Deverá requerer um treino mínimo para a operação ser bem sucedida.
De acordo com a presente invenção, proporciona-se um processo de detecção que obedece a todos estes critérios.
A presente invenção resume-se através das seguintes clausulas; 1. Um fragmento de ADN de cordão simples (f63), carac-terizado por possuir a seguinte sequência; AGGTCTTAACATGACTAACTAAGGTCTTAACTTAACTMCTTAGGTCTTACTTTAACTAAACT ou o seu cordão complementar ou as suas variantes hibridizãveis com f63 ou o seu cordão complementar ou sequências de cordão duplo correspondentes. Considera-se preferencial utilizar o ADN de cordão simples. 2. Um fragmento de ADN, tal como foi definida na clâu-sula 1, ou um seu segmento contíguo caracterizado por possuir um comprimento superior a, pelo menos, 20 bases ou 20 pares de bases e, especialmente AGGTCTTAACATGACTAACTA. 3. Um fragmento de ADN de acordo com as clausulas 1 ou 2, caracterizado por se apresentar sob a forma de um cordão simples. 4. Uma sonda de hibridização, caracterizada pelo facto de ser constituída por um fragmento de ADN tal como definido nas cláusulas 1 e 2. 5« Uma sonda de hibridização de acordo com a cláusula 4, caracterizada pelo facto de ser ' marcada por um grupo susceptí vel de ser detectado colorimètricamente. A natureza deste grupo não ê crítica para a presente invenção. 6. Uma sonda de hibridização de acordo com a cláusula 5, caracterizada pelo facto de o grupo marcado para detecção colo rimétrica consistir em biotina, A biotina constitui um grupo de referência preferencial.
7. Uma sonda de hibridização de acordo com a cláusula 5/ caracterizada pelo facto de o grupo marcado ser susçeptível de se detectar colorimétrica consistir num grupo de referência cromofórico. 8. Processo para a detecção de um agente patogenico pre sente no sangue ou em outros fluidos orgânicos do corpo, carac terizado pelos passos seguintes: a) Lise de uma amostra de sangue em uma solução contendo cloridrato de guanidina (GuHCl), lauril-sarcosina de sódio (SLS) e Triton-X-100« b) Desnaturação do ADN presente na referida amostra de sangue, de um modo adequado, por aquecimento e efectuando a solução de hibridização na presença de uma sonda de hibridização, que se hibridiza com o ADN do referido agente patogenico. c) Captura dos híbridos formados no passo 8 b) na placa de microtitulação revestida com uma sonda de hibridização que possui uma sequência nucleotídica susceptível de se hibri-dizar com o mesmo cordão de ADN genõmico a que se liga a sonda de hibridização utilizada no passo 8b). De acordo com um aspecto preferencial, especialmente para a detecção do P,falci-parum, a sequência nucleotídica utilizada para cobrir a placa de microtitulação ê idêntica à sequência da sonda de hibridização utilizada no passo 8 b). d) Lavagem da placa de microtitulação com uma solução que englobe Solução Salina de Citrato Normalizada (SSC), dode-cil-sulfato de sódio (SDS) e Triton-X-100, e) Detecção da presença de híbridos por métodos colorimê tricôs, 9. Um método de acordo com a cláusula 8, em que a sonda de hibridização se encontra em concordância com o definido nas clausulas 2 e 3. De acordo coiri um aspecto preferencial, utilizasse a presente invenção na detecção de espécies de plasmõ-dio, 10. Método de acordo com as clausulas 8 e 9, em que a concentração final dos reagentes no passo 8 (a) ê a seguinte;
a) Cloridrato de guanidina; entre 1,0 M e 3,0 M b) Lauril-sarcosina de sõdio; entre 0,2% e 0,5% P/v c) Triton-X-100 ; entre 0,2% e 0,5%, v/v
Os intervalos acima referidos são aqueles que se con sideram preferenciais. 11. Método de acordo com as clausulas 8 e 9, caracteri-zado pelo facto de as concentrações finais no passo 8 e) se-
rem as seguintes: a) Solução Salina de Citrato Normalizada -0,5X -2,5 X SSC b) Triton-X-100 -0,2% -0,5% V/V c) Dodecil-sulfato de sódio -0,2% -0,5% P/V
Os intervalos preferenciais são os anteriormente re feridos. 12, Método de acordo com a clausula 8-1, caracterizado pe lo facto de se utilizar a solução de lise tanto como agente de solubilidade como solução de hibridização, 13, Método de acordo com as clausulas 8 a 12, caracterizado pelo facto de se utilizar 2 x SSC para remover os híbridos não específicos, 14, Método de acordo com as clausulas 8 e 14, caracteriza do pelo facto de se utilizar Triton-X-IQQ e SDS para remover o material de coloração proveniente do sangue, 15, Método de acordo com as cláusulas 8 a 14, caracteriza do pelo facto de o agente patogénico ser o P, falciparum. 16. Método de acordo com as clausulas 8 a 14, caracteri-zado pelo facto de o agente patogénico ser o P. vivax» 17, Método de acordo com as cláusulas 8 a 14, caracteri-zado pelo facto de o agente patogénico ser a Shigella, 18. Método de acordo com as cláusulas 8 a 14, caracteri-zado pelo facto do agente patogénico ser o Micobacterium tuber culosis. 19« Conjunto de diagnostico para detecção de uma dada sequência nucleotxdica numa sequência polinucleotidica alvo, com base em métodos de acordo com as cláusulas 8 a 18.
PRINCÍPIO DE ADN BASEADO NA HIBRIDIZAÇÃO EM SANDUÍCHE
Antecedentes
No processo não radioactivo, o modo final para detec ção residia no desenvolvimento de uma cor solúvel ou insolúvel, dependendo da natureza do substracto utilizado na reacção catalisada quer pela fosfatase alcalina, quer pela perõxidase de rábano. Deste modo,, ê essencial remover o material cromático residual do ADN alvo, assim como inactivar o enzima endógeno, Nesta situação, ê pouco prático utilizar-se as manchas de sangue directamente sobre o filtro da membrana (tal como no caso da hibridização radioactiva), uma vez que seria praticamen-te impossível remover-se os corantes do sangue residual. Para se ultrapassar este problema, utilizou-se uma placa de micro-titulação associada â hibridização em sanduíche, cujo princípio base se descreve a seguir;
Demonstrou-se anteriormente que uma das caracterís-ticas do genoma do P, falciparum, residia no facto de conter -9- uma repetição de 21 pares de bases que se encontrava presente em serie, numa grande região do genoma (5-6), A fracção do ge-noma representada por esta sequência repetida ê de aproximada-mente 1%, Comparações efectuadas entre diversos clones contendo esta sequência repetida, indicaram uma sequência de repetição de consenso com 21 pares de bases. Com base nesta sequência de consenso, concebeu-se e construiu-se uma sonda oligonu-cleotídica de 63 meros (daqui em diante designada por f63), Consiste em três oligonucleotidos de 23 meros em serie, que se encontram representados no seu expoente máximo nas sequências de repetição do ADN do P. falciparum (Fig.l). A utilização preferencial de ADN de cordão simples como uma sonda e o seu comprimento jã referido, baseia-se nas seguintes razões; 0 ADN de cordão simples ê superior ao ADN de cordão duplo como sonda, devido ao facto de se hibridizar apenas com o ADN alvo. No caso do ADN de cordão duplo, existe uma maior probabilidade de auto-hibridização, o que reduz, assim, a concentração efectiva da sonda, necessária para se ligar ao ADN alvo. Estes factos demonstram claramente a superioridade da sonda de cordão simples, uma vez que sendo necessária uma quantidade de sonda muito menor, para hibridização, o seu custo ê bastante mais re duzido. Entre os diversos métodos disponíveis para a produção de ADN de cordão simples, o mais conveniente consiste na síntese de oligonucleotidos.
Para detecção de agentes parogénicos diferentes de P, falciparum, deve conceber-se uma sonda de ADN óptima que se encontre repetida no ADN do agente patogênico. Esta sonda de hibridização pode ser então utilizada, de acordo com um protocolo idêntico ao da hibridização em sanduíche, que se fornece a seguir, especificamente para o P» falciparurru -10-
Cr
Fornecesse adiante o protocolo base da hibridização em sanduíche. (Também indicado pictorialmente na Fig.2)«
Fluxograma para diagnostico não radioactivo de infec ção de P. Falciparum no sangue humano por hibridização em sanduíche.
Adicionar uma gota da amostra de sangue (50jil) proveniente da punção de um dedo, num pequeno tubo de plástico contendo solução de lise e sonda bio-f63
Fase 1 i) mexer bem ii) aquecer num banho de agua em ebulição durante dois minutos iii) deixar â temperatura ambiente durante um período mínimo de quatro horas
híbrido ADN do paraslta-sonda bio-f63 Ver Fig.l Placa A
Fase 2 i) Transferir a mistura do tubo, da fase 1 para tubos em placas de microtitulação previa mente revestidos com sonda f-63 não marcada (Ver Fig.l, Placa B) ii) deixar em repouso à temperatura ambiente durante a noite híbrido capturado (Ver Fig. 1, placa C) -11- i) lavar os tubos da placa de mi crotitulação da fase 2, com 2 x SSC contendo 0,2% de SDS e Q,2% de Triton x 100 ii) repetir o procedimento de lavagem quatro vezes, deixando em cada uma das vezes permane cer em tampao de lavagem duran te 5 minutos iii) deixar em cada um dos tubos solução APB-1 durante 30 minutos, â temperatura ambiente. iv) adicionar uma gota de APB-1 contendo estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina. v) deixar em repouso, â temperatura ambiente, durante 30 minutos. vi) Deitar fora a solução dos tubos. vii) Deixar a solução APB-1 (sem BSA) em cada um dos tubos durante 5 minutos e pôr de parte a solução. viii) Repetir quatro vezes a operação anterior.
0 híbrido capturado esta pronto para de’' tecção por calorimetria
Fig. 1 Placa D ix) x) xi) xii)
Lavar cada um dos tubos com solução APB-2.
Adicionar substrato enzi mãtico em solução APB-2,
Deixar repousar â temperatura ambiente durante, pelo menos 120 minutos.
Fazer a leitura da absor-vência a 410 nm num leitor de placas de microti tulação.
Fase 5 Còr com valores de absorvência su periores a 0,2, revelam a presença de ADN de parasita
Analise dos resultados do ensaio A ausência de ADN de parasita proporciona um valor de absorvência inferior a 0,1. O sucesso deste método depende do facto do ADN do P. falcipa rum permanecer praticamente indegradãvel durante o processo. Na -13-
solução da fase de hibridizaçao o f63 biotinilado ligasse ao ADN do p. falciparum e poderá prosseguir até encontrar-se completo, sendo a taxa de hibridizaçHo da solução muito mais rápida, em comparação com o ADN alvo imobilizado, A eficácia da hi bridização de captura e directamente proporcional ao comprimen to do ADN do P, falciparum. Como limite extremo pode verificar 'se que o ADN do plasmodio falciparum se encontra totalmente não degradado, pelo que uma pequena quantidade de 0,03¾ de hibridizaçao de captura pode provocar a rotura do complexo hibri do.
No caso de outros agentes patogênicos, a eficácia da hibridizaçao de captura dependerá do número de vezes que a son da se repete no genoma do agente patogenico.
Protocolo para detecção não isotópica de ADN de P. falciparum em amostras de sangue 1. Preparação da sonda;
Sonda para revestimento das placas de microtitulação; sintetizou-se o oligonucleõtido de 63 mero (f63) utilizando um sintetizador automático de ADN (Applied Biosystems 34QA),
Sonda marcada para detecção de híbridos; fez-se a biotinilação de f63 por fotobiotinilação utilizando acetato de fotobiotina, de acordo com procedimentos ja publicados, 2, Revestimento das placas de microtitulação;
Revestiram-se todos os tubos das placas de microtitulação (Dynatech, cloreto de polivinilo) com quantidades variáveis (1 yxg a 10 ng) de f63 num volume de 50^1, contendo MgCl2 0,1 M. Efectuou-se o revestimento durante a noite e a -14- seguir a este procedimento expos-se a placa de microtitulaçao a uma lâmpada de XJV germicida (40 watts) a uma distância de 10 cmr durante 5 minutos, para imobilizar o ADN. Pôs-se de parte o conteúdo dos tubos e lavaram-se os tubos com tampão 2 x SSC. Bloquearam-se os sítios desocupados de cada um dos tubos efec-tuando-se a pré-hibridização num tampão (200 ^il/tubo) contendo 2 x SSC, 5X Denhardts, 0,5% de Triton-X-100, 0,5% de SDS e 50 ^ig/ml de ADN de esperma de salmão, Efectuou-se a pré-hibridi-zaçio durante 4 a 6 horas, â temperatura ambiente. Podem arma zenar-se as placas revestidas nesta fase, â temperatura ambien te, 3, Recolha de amostras de sangue e hibridização da solução;
Recolheram-se as amostras de sangue (alíquotas de 50 ^il), a partir da punção de um dedo, directamente, em 50 jil de uma solução contendo cloridrato de guanidina 4M (Gu HC1), 0,5% de lauril-sarcosina de sodio (SLS) e 0,5% de Triton X-100, Esta solução também continha 5 ng de sonda oligonucleotídica (f-63 biotinilada). Aqueceu-se esta mistura, durante 5 minutos a 95°C e conservou-se, depois, â temperatura ambiente, durante 4-6 horas, para dar lugar â hibridização da solução. 4, Hibridização por captura;
Apos ter. ocorrido a hibridização da solução, transferiu-se o conteúdo dos tubos de Eppendorf para os tubos da placa de microtitulaçao que haviam sido previamente revestidos com f-63 não marcado, Deixou-se processar esta hibridiza-çio em sanduíche, (captura) durante 24 horas. Durante esta fa se, a hibridização ocorreu entre o f-63 que revestia a placa e os restantes sítios complementares disponíveis no híbrido. -15 0 híbrido consiste num longo pedaço de ADN alvo, portador de f-63 biotinilado, em determinadas localizações, deixando para trãs outros sítios complementares, (Ver Fig. 2). 5, Desenvolvimento da Côr;
Apõs se ter completado a hibridização em sanduíche, pôsv-se de parte o conteúdo dos tubos da placa de microtitula-ção e lavaram-se quatro vezes os tubos com uma solução conten do 2 x SSC, SDS a 0,2% e 0,2% de Triton-X-100, durante cinco minutos, cada um deles, â temperatura ambiente. Durante esta lavagem de pós-hibridização, removeram-se todos os materiais corados localizados por detrãs do híbrido em sanduíche. Bloquearam-se então os tubos com A.P. 7,5. que consiste numa so-çao contendo cloreto de sódio 1M, Tris-HCl 100 nM, a pH 7,5, cloreto de magnésio 2 mM, 0,05% de Triton-X-100 e 3% de ASB, durante 30 minutos, â temperatura ambiente.
Detectaram-se, então os híbridos em sanduíche utili- zando, por exemplo, o conjugado estreptavidina-fosfatase alca lina. Adicionou-se o conjugado estreptavidina-fosfatase alca-
ao
solução (tampão A.P. 7,5 contendo o conjugado de estreptavidi-na^fosfatase alcalina) a cada um dos tubos e prolongou-se o período de incubação por mais 30 minutos, â temperatura ambien te. Removeu-se o conjugado não ligado, em excesso, lavando qua tro vezes, cada uma delas durante cinco minutos, â temperatura ambiente, com tampão Α,Ρ, 7,5. sem BSA,
Finalmente lavaram-se os tubos com A,P, 9,5 (tampão de incubação do substrato contendo Tris-Cl 100 mM, a pH 9,5, cloreto de sÔdio 100 míí e cloreto de magnésio 50 mM), Adicio- -16-
C nou-se 50 jil de substrato de fosfato de p-nitrofenilo ao A,P. 9,5, numa concentração, de 1 mg/ml e adicionou—se 50 jil desta solução a cada um dos tubos, 0 desenvolvimento cromático decorreu num período compreendido entre 6 e 12 horas, Registou--se a absorvência (a 410 nm) utilizando um leitor de placas adequado (como por exemplo um leitor de placas Dynatech),
No quadro que se segue, indicam-se os resultados do ensaio. RESULTADOS: QUADRO 1 - DADOS DE HIBRIDIZAÇÃO DE f-63 (Absorvência a 410· nm)
Quantidade de ADN Quantidade de f63 que reveste as do parasita ADN T9/1061 . placas de microbactêrias 1 500 ng 100 ng 10 ng 500 ng superior superior superior superior 250 ng II II II II 125 ng fl II rr II 63 ng II II II II 31 ng II II II II 16 ng Ff II II 1,524 7,5 ng 1,511 1,242 1,373 0,929 1 /1^ 0,291 0,295 0,263 0,214 de ADN Human o 1 T9/106 representa um clone de P. falciparum resistente â clo-roquina.
Nota; Nas amostras de seres humanos, 50^il de sangue possui, cerca de 50 ng de ADN do parasita (P, falciparum) se a infecção for de aproximadamente 1%, 0 termo "superior" indica uma densidade ôptica superior a 2,0.
LEGENDA DAS FIGURAS; A fig. 1 mostra o oligo f-63 que foi concebido a partir da sequência de consenso repetida (21 bases repetidas) de P, falciparum.
Legenda da figura 2; A: Hibridização da solução B: Tubo de microtitulação revestido com a sonda £--63, C: Hibridização por captura, D: Captura de híbridos após lavagem e leitura do desenvolvimento cromático. A fig, 3 indica: A: ADN f-63 biotinilado B: ADN genõmico de P. falciparum C: ADN de f-63
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Claims (22)

1 REIVINDICAÇÕES 1.- Fragmento de ADN (£63) de cordão simples, caracteriza-do pelo facto de possuir a sequência seguinte: aggtcttaacatgactaactaággtcttaacttaactaacttaggtcttactttaactaaact ou os seus cordões complementares ou as suas variantes hibridizá-veis com £63 ou os seus cordões complementares, ou a sequência de cordão duplo correspondente.
2.- Fragmento de ADN tal como definida na reivindicação 1 ou um seu segmento contíguo, caracterizado pelo facto de possuir pelo menos mais do que 20 bases ou pares de bases de comprimento e, de um modo mais particular AGGTCTTAACATGACTAACTA. 2 %
3. - Fragmento de ADN de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se apresentar sob a forma de um cordão simples.
4. - Sonda de hibridização, caracterizada pelo facto de ser constituída por um fragmento de ADN tal como definido nas reivindicações 1 e 2.
5. - Sonda de hibridização de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo facto de se encontrar marcada por um grupo susceptível de ser detectado colorimetricamente.
6. - Sonda de hibridização de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo facto de o grupo marcado e susceptível de sei detectado colorimetricamente consistir em biotina.
7. - Sonda de hibridização de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo facto de o grupo marcado e susceptível de ser detectado colorimetricamente consistir num grupo cromofórico.
8. - Método para a detecção de um agente patogénico presente no sangue ou em outros fluidos orgânicos do corpo, caracterizado pelos seguintes passos: a) lise de uma amostra de sangue em uma solução contendo GuHCl, SLS e Triton-X-100. b) desnaturação do ADN presente na referida amostra de sangue 3
e preparação de uma solução de hibridização, na presença de uma sonda de hibridização que se hibridiza com o ADN do referido agente potogénico. c) captura dos híbridos formados no passo 8 (b) na referida placa de microtitulação coberta com uma sonda de hibridização que possui uma sequência nucleótidica susceptível de se hibri-dizar com o mesmo cordão de ADN genómico a que se liga a sonda de hibridização, utilizada no passo 8 (b). d) lavagem da placa de microtitulação com uma solução constituída por SSC, SDS e Triton-x-100. e) detecção da presença de híbridos por métodos colorimétri- cos.
9. - Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de se efectuar o passo de desnaturação 8 (b) mediante aquecimento.
10. - Método de acordo com as reivindicações 8 e 9, caracteri zado pelo facto de a sonda de hibridização utilizada no revestimento da placa de microtitulação possuir a mesma sequência nucleó-tídica da sonda de hibridização utilizada no passo 8 (b).
11. - Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de a sonda de hibridização utilizada ser tal como % definida nas reivindicações 2 e 3.
12. - Método de acordo com as reivindicações 8 a 11, ca-racterizado pelo facto de as concentrações finais dos reagentes no passo 8 (a) serem as seguintes: a) cloridrato de guadina : entre 1,0 M - 3,0 M b) lauril-sarcosina de sódio : entre 0,2% - 0,5%, P/V c) Triton-x-100 : entre 0,2% - 0,5%, V/V
13. - Método de acordo com as reivindicações 8 e 12, caracte-rizado pelo facto de as. concentrações finais no passo 8 (e) serem as seguintes: a) Solução salina normalizada de citrato - 0,5 X 2,5 X SSC b) Triton-x-100 -0,2% - 0,5% V/V c) dodecil-sulfato de sódio - 0,2% - 0,5% P/V
14. - Método de acordo com as reivindicações 8 a 13, ca-racterizaao pelo facto de se utilizar a solução de lise como agente solubilizante e como solução de hibridização.
15. - Método de acordo com as reivindicações 8 a 14, ca-racterizado pelo facto de se utilizar 2X SSC para remover os híbri dos nao específicos.
16.- Método de acordo com as reivindicações 8 a 15, caracte-rizado pelo facto de se utilizar Triton-x-100 e SDS para remover o material de coloração originado a partir do -.sangue.
17. - Método de acordo com as reivindicações 8 a 16, ca-racterizado pelo facto de o agente patogéníco ser P. falciparum.
18. - Método de acordo com as reivindicações 8 a 16, ca-racterizado pelo facto de o agente patogéníco ser o P. vivax.
19. - Método de acordo com as reivindicações 8 a 16, ca-racterizado pelo facto de o agente patogéníco ser Shigella.
20. - Método de acordo com as reivindicações 8 a 16, ca- racterizado pelo facto de o agente patogéníco ser Mycobacterium tuberculosis.
21.- Método de acordo com as reivindicações 8 a 16, ca- racterizado pelo facto de o agente patogéníco consistir num agente patogéníco sanguíneo
22.- Conjunto de diagnóstico para a detecção de uma dada sequência nucleotídica numa sequência polinucleotídica alvo, ca-racterizado pelo facto de se basear em métodos de acordo com as reivindicações 8 a 21, ©Agente Oficial da Propriedade Industrial
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