JPS617469A

JPS617469A - 分子遺伝プロ−ブ及びその形成方法及び検査方法及び分子遺伝プロ−ブを使用する方法

Info

Publication number: JPS617469A
Application number: JP59112156A
Authority: JP
Inventors: マツクス　ヘルツベルク
Original assignee: Orgenics Ltd
Current assignee: Orgenics Ltd
Priority date: 1983-05-31
Filing date: 1984-05-31
Publication date: 1986-01-14
Anticipated expiration: 2010-05-15
Also published as: EP0128018A3; ATE78301T1; DE3485811T2; EP0128018A2; EP0128018B1; DE3485811D1; JPH0743376B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（１）　発明の分野本発明は、遺伝子用分子プローブ、および、それらのプ
ローブがＤＮＡやＲＮＡ基の検定技術の一部に使用され
るであろう方法に関する。

より詳しくは１本発明の遺伝子用分子プローブは以下検
定技術に特に有益である。例えば、ビールス遺伝子１遺
伝子のシーケンス（順序）、たとえば酵素用コード等の
遺伝子の生成物等が、その存在が定量的に分析されると
ころの複合表示エージェントと存在が疑核酸５ｕｓｐｅ
ｃｔ＋存在するかどうか判らない、つまり存在がうすう
す感じられる核酸を含む、疑サンプルに存在することを
検査する技術である。

（２）　研究の背景と議論の適切な題材についての記述本発明は、ビールス性遺伝子の存在、遺伝子の順位、す
べての遺伝子の生成物、たとえば、酵素のコードの分析
技術を備えたものである。

簡易にキットとして実行するのに特に有益である。

特殊な病原菌の存在の分析を可能ならしめるのに適した
キットでは、特別な技術が要求され、また、存在をうす
うす感じられる病原菌に特別な核酸の存在を感しとるこ
とによる操作についても同様である。

明らかに、それらの技術は正確なだけでな（。

最小限の操作の実施についても望ましく、更に実験室の
専門技術室のみならず、工場での反応分析の双方に有効
的である。

ＤＮＡＪ？３ＲＮＡについて、徴候が判然とする以上よ
り病原菌を探知する技術として使用されて来たところの
分析原理である。

それらの技術は、ある組織のあるビールスの存在を決定
したいと望むところのビールス性菌の病原菌の分析に使
用するために興味をそそるものである。

本技術は、プローブＤＮＡがハイブリッド化させること
のできる疑ビールス性ＤＮＡとハイブリッドする技術を
用いることにより特殊なビールス性ＤＮＡとＲＮＡの存
在を分析することであり。

ビールス性ＤＮＡは、ラジオアイソトープ的にタッグ付
けされ、試験標本に加えられる。

！！標準的な計量とイメージ技術は、疑ＤＮＡの総量と
存在の定量分析の後に用いられるであろう。

そのような技術は、　ｔｌ、ｓ、Ｐ　４，３５８，５３
５　ＦａＩｋａｗ等に広く開示されている。その中で、
変性されたＤＮＡ（またはＲＮＡ）は、ラベル付された
片　ＤＮＡ　（ＲＮＡ）プローブと接触されている。特
殊な修飾技術も開示されている。プローブは、修飾ＤＮ
Ａとハイブリッド化するよう選択される。スクリーン技
術は、スクリーンするビールス（生殖ヘルペス、特定的
に述べた）菌類、原生動物、カビ等に使用するのに適し
ている。

使用されるラベルは、一般に放射性核種であることが示
唆される。しかしこの発明は、探知目的のために特にプ
ローブにバインドされる抗体を用いやすい場合があるこ
とについて言及する。

その例について、抗体それ自身が標識を付される。リス
トされたラベルには、放射性ラベルと配位子を含む、そ
れは、ラベルされた抗体、螢光。

化学ルミネッセンス、酵素、ラベル付された配位子とリ
ンクの特殊ペア要素として作用する抗体等の特殊な綴り
要素として作用する。

ヨーロッパ特許願Ｎ０００６２２８６ば、肝炎Ｂビール
スのヌクレイン酸のバイア′リッドの探知するためのテ
ストキットと方法を開示する。再び、ハイブリッドプロ
ーブは、シンチレーション計数技術で検定されるものに
使用される。

ロシア特許６４９，７５１は、ＤＮＡを微生物から精製
することにより微生物と同定し照合金株からのＤＮＡと
微生物的に交配することにより確認する方法を開示する
。ＤＮＡは放射性チミンによりラベル付される。

それらの欠点の一つは、プローブの準備期間中に放射性
物質を扱わねばならず、これは明らかに不満足な状態で
ある。

米特許４，３０２，２０４　（ウオールエトオール）と
４．１３９，３４６　（ラハニイエントオール）は、と
もにＲＮＡとＩ）　Ｎ　Ａストランドがハイブリッド技
術の一部として標識付けられたプローブをハイブリッド
化されるハイブリット技術が開示されている。

ＤＮＡそれ自体は、考えられるスクリーン技術の目的の
抗原としては、満足すべきものではないと特筆すべきこ
とである。ウィルスＤＮＡの抗体反応は、しばしば不充
分であり、抗原として使用できるようにするには不十分
なだけ特定されていない。

ＤＮＡの修飾と修飾された抗原を抗体反応を引き出すた
めに用いることは周知の技術である。

［修飾されたまたヌクレオチド用の抗体：核酸の単離と
特徴化（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ｆ
ｏｒ　Ｍｏｄｉｆｉ−ｅｄ　Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ）
　Ｊと題されたＭｕｎｎｓとＬｉｓｚｅｗｓｋｉの核酸
研究と分子生物学の進歩、第２４巻１０４頁−３６５頁
（１９８０）の論文は、修飾構成要素に特有である抗体
について論じている。

１９７８年刊Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋　　１７巻１
８９６〜１９０１頁「アルキル化Ｄ　Ａ　Ｎにおける０
６−メチルグアニンのイムノロジカル検出（Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ　０６−Ｍ
ｅｔｈｙｌｑｕａｎｉｎｅ　ｉｎ　Ａｌｋｙｌａｔｅｄ
　ＤＮＡ）　　Ｊブリスコ著は、アルキル化ＤＮＡを直
接バインドする。

０６−メチルグアニンに特効ある抗体の使用の可能性に
ついて述べている。

これらの抗体を用いる放射性免疫システムは。

ＤＮＡをある種のアルキル化エージェントとして扱って
、０６−メチルグアニンを探知するのに有益なアプロー
チである上述べている。

１９７９年刊ｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ　Ｖｏｌ、
１Ｂ、　Ｐ、１３２８〜１３３２は、“Ｎ−アセトン−
Ｎ−アセチル−２−螢光性アミノにより修飾されたＤＮ
Ａの抗体反応”について記述する。

これらの抗体は非修飾型よりも修飾ＤＮＡに反応する。

１９６９年刊ｒＮａｔｕｒｅＪ　Ｖｏｌ、２２３＋　Ｊ
ｕｌｙ、１２．　Ｌｅｖｅｌｅｓによる“ニトロソアミ
ンとニトロソサマイドのムタジュニイシイティとカルジ
ノジエンシイへのジオキシグアノシンの０６−アルキル
化の可能な関係”は、核酸を修飾するＮ−エチル−Ｎ−
ニトロツウリアのような生物的アルキル化、エージェン
トを使うことを論じている。

かくして、核酸基のエチレーションを含む修飾は認識さ
れた現象であるが、この原理を雑種形成に関係して有効
な検定技術の一部として用いることの利点は、最大限定
までには一般的に以前には理解されあるいは用いられて
いることはなかった。

事実、雑種形成は、１つの検定工程において修飾される
ことと関係して少なくとも１例では示唆されているがこ
の工程は２個の技術を最大利用となるように結合し、制
限定された用途のみをもつ極めて難しい検定を行う結果
となる。

しかし、そのような技術は、ヨーロッパ出＠Ｓ。

Ｎ　、　８２３２２８２４　、９の内に見られる。　（
１９８２年１１月１３日刊）少なくとも、炭素３原子（
たとえば“′ビオチン”の半分を共有結合することによ
ってプリシまたはプリミジン基の修飾について論じてお
り、その化合物が二重ストランドＲＮＡ、二重ＤＮＡ。

ＤＮＡ−ＲＮＡ複合体に複合した場合に、ポリペプチソ
ドの検知できる合成を検知できる。

バイオチンを含んだプローブのポリペプチソドディテク
ターは、アビチン（ａｖｉｄｉｎ）　＋ストレプタヒデ
ン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）またはアンチバイオチ
ン（ａｎｔ−４ｂｉｏｔｉｎ　）等の免疫上の物質であ
る。バイオチン状のプローブに対する望ましいプロティ
ンはアンチパイオンの免疫的物質である。この抗体は過
酸化物のような酵素でタッグされ得る。第３０頁、第３
７行目から第３１頁１〜１４行目に抗体のビオチン構成
物の使用について述べている。３３頁に図があり、ビオ
チンやハプテンの探知に抗体を使うことが述べである。

　ＩｇＧ過酸化物の例は、酵素探５１１１システムの抗
体タッグについて述べる。第３４頁２５〜３７行目と第
３５頁１〜２行目に３問題のヌクレオチドシーカンスの
存在を探知するために修飾ヌクレオチドのシーカンスの
利用方法について記述する。

この一般原案は、ビールス、ハタテリア、菌。

原生寄生虫等の核酸シーケンスの探知に応用され得る。

上述した如く、この技術は限定された用途であるととも
に極端にやっかいである。この技術を用いると、テンプ
レート核酸のニュークレース処理が１つのストランドに
おいて９間隙をニックしあるいは開けるために用いられ
る。ビオチンの代用基は２重合を使ってＤＮＡに挿入さ
れる。修飾ＤＮＡは、アンチビオチンと複合し、アンチ
ビオチン−酵素−ＤＮＡ複合体に酵素でタッグ付される
。

二重ストランドＤＮＡは９次に裂れ、そして、複数スト
ランドは、プローブとして使用することできる。そのよ
うな技術は、二重ストランドの形成においてのみ修飾が
ＤＮＡに生じることを要求する。修飾された単一ストラ
ンドは、二重ストランドの核酸に含まれる有機体のハイ
ブリッドにのみ用いることができる。すなわち、単スト
ランドＲＡＮビールスのような物質は２本願の中で提案
された方法を使っては修飾または探知方法はできない。

さらにこのシステムは、ヌクレアーゼやポリメラーゼの
ような追加的試薬とビオチン基を前もって合成すること
が必要である。これらの物質の用途は、技術の複雑さを
加えるのみならず高度の純粋さを要求される。また、修
飾された核酸チェーンの切断、再生に用いる酵素は、キ
ット試薬を作るには２時間と費用を必要とし、また、こ
の技術が診断キットに用いられるための価値を減する。

その特許の６２〜６３頁は、加えてポリヌクレオチドの
鎖状重合体の修飾について開示する。水銀塩を用い、水
銀化誘導体は形成される。水銀化誘導体は、　Ｋ　２　
ＰｄＣｌ　ｍの存在下でそれ自身修飾または。

リンクアーム反応端子作用群あるいは修飾と反応する。

かくして、少なくとも２つ、それでなけれは３ステツプ
が修飾を行うために要求される。

そのような工程は、不満足である。なぜなら。

それぞれのステップの間に洗浄が必要だからである。水
銀を用いることは、大きな欠点がある。なぜなら、この
工程を内位添加のために二重ストランドシススムに対し
て使用できなくするからである。更に、論述したように
、リンクアームは、その半分を加える位置のために必要
である。リンクアームの必要としない技術の方がより満
足すべきものである。更に、刊行された技術では、−個
の基に１つのアームを付けるのみであるが１時として１
つの基に複数のアームの付加が要求される。

発明の要約本願発明の目的は、抗体特定を安価に行う検定とスクリ
ーン技術を提供するもので、そのための試薬は簡単に合
成反応でき、単ストランドまたは二重ストランドの双方
の有機体から核酸を純度に対してあまり注意を払うこと
なく検定する際に広い用途を有する。

更なる目的は１強い抗原を用い、すなわち強も一抗体反
応がもたらされ疑核酸に対するプローブのハイブリッド
は実質的に妨害することのない技術を提供するものであ
る。

他の目的は、もし、それらの物質に露されることを最小
限にしたいと望むなら、放射性核種の使用を避ける技術
を提供する。

この発明の他の目的によると、プローブ形成技術であっ
て修飾エージェントの１工程追加を含み。

水銀を使用せず、核酸の単−基に１つ以上の修飾の追加
を可能とするものである。

この発明の目的は、この発明の検定方法によって達成さ
れ、この発明においては、疑サンプル内の疑核酸の存在
と量とが決定される。

この発明は、これらはもし存在すれば疑核酸とハイブリ
ッド化しハイブリッド複合物を形成し。

修飾核酸は核酸基の第１段階修飾によって形成されるよ
うに選択された修飾核酸と疑サンプルとを接触させるａ
）段階と、少なくとも前記修飾核酸の修飾部分と混合化
しハイブリッド錯体を形成するように選択された標識抗
体と前記修飾核酸とを接触させるｂ）段階と、前記疑核
酸の存在あるいは存在量の表示として前記標識抗体の存
在及びまたは存在量を測定するＣ）段階からなる疑サン
プル中の疑核酸の存在あるいは存在量を検査する方法に
よって達成される。その技術を使うことにより、単一ス
トランドを二重ストランドを含む有機体から、核酸がそ
うでなければ要求されるかもしれない高純度でなくとも
、検定されるかも知れない。

また、そのような技術を用いることにより放射性でない
標識は選択されるかもしれず、それは。

放射性物質を扱うことを避けたいと望む状況で簡易に使
えるようにする。標識は、酵素自体であるかもしれず、
または、たとえばそれ自身酵素とハイブリッド化する２
次抗体から一次抗体である。

この技術の特別な利点は酵素または、他の型の核酸操作
技術を用いることなく、ＤＮＡまたはＲＮＡプローブそ
れ自身、直接修飾できることである。

特にヌクレアーゼとポリメラーゼの使用は、明確に避け
られるであろう。

プローブそれ自体は、単一ストランドから二重ストラン
ドで、それは、少なくとも部分的に変性されている。プ
ローブの基本的要求は、修飾されたときに疑核酸とハイ
ブリッド化可能であることである。

ＤＮＡまたはＲＮＡの特別な修飾は、核酸塩基の修飾を
含み、特に好ましい具体例は塩基のアルキル化である。

アルキル化は、アルキルニトロソリアのようなアルキル
化合物を用いることにより行われるかもしれず、そして
さらに特別には、メチル、エチルまたはプロピルニトロ
ソリア化合物を用いる。特に好ましい具体例の１つでの
アルキル化合物は、Ｎ−エチルーニトロソーユリアであ
る。まったく他のアルキル化化合物は９発明の範囲を外
れることなく実質的に同様な抗体反応をひき出し、他の
アルキル化化合物が用いられることは極めて明らかであ
る。クアニジンの。６の−のアルキル化が望ましい。し
かし、特定の化合物が用いられるかによって他の位置も
また用いられる。

Ｂｒ１ｓｃｏｅ等をみよ、上記参照。すなわちこの発明
に従って用いられる追加的修飾反応の例として用いられ
る。この論文の開示は参考引用としてこの出願の中に加
えられる。

本発明の別の具体例では修飾スルホン化の形成が行われ
る。このようなスルホン化技術ば＾０Ｍ。

Ｐｏｖｅｒｅｎｎｙ等Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ、　１６　ｐｐ３１３−３１６＋　
Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｌｔｄ、＋　１９７
９　”　ＤＮＡ光像解析への免疫化学的アプローチＩ”
に開示されている。

ニトロソ化、ニトロソフェニール化等の付加反応修飾の
別のタイプもまた本発明の範囲から外れることなしに使
用される。

本発明の技術は疑サンプル中の核酸の存在をテストする
キットにおける使用に容易に役に立つ。

このようなキットはもし存在すればハイブリッド錯体を
形成するように疑核酸とハイブリッド化するように選択
された修飾核酸プローブの貯蔵物を含む。修飾核酸自体
はプローブ核酸の塩基の修飾によって形成される。ハイ
ブリッド錯体を形成するように疑サンプルと修飾核酸を
接触させるための手段が与えられる。修飾核酸の少なく
とも修飾部分と複合化するように選択された抗体の貯蔵
物が与えられる。抗体は抗体の存在も知らせるに適した
標識エージェントで標識化される。

キットはさらに修飾核酸と標識抗体を接触させる手段と
、疑ヌクレオチドの存在あるいは存在量の素子として標
識の存在およびまたは存在量を測定する手段とを含んで
いる。

本発明の検定のような検定において与えられるところの
容易性のためにプローブそれ自体本発明の一形態を形成
している。このようなプローブは少なくとも１つの修飾
塩基を含む単一あるいは部分的に変性した二重ストラン
ドのＤＮＡまたはＲＮＡ分子遺伝プローブである。水銀
あるいはリンクアームの使用なしに一段階付加でＤＮＡ
あるいはＲＮＡに接触されている間に塩基は修飾される
。

プローブはさらにコンブレメンタリＤＮＡあるいはＲＮ
Ａストランドとハイブリッド化するに適している。ハイ
ブリッドそれ自体は公知疑核酸であり、最近の刊行物で
はたとえばコーロソパ特許出イドを含む有機体から核酸
存在およびまたは存在量を検定することにおける特殊な
応用を見出す。

発明に従って、検定された核酸は少なくともは塩基、特
に少なくとも５０塩基を有する。単一ストランドの核酸
を含む有機体から核酸を検定する場合。

ハイブリッドは変性なしに直接行われうる。

細胞内のＤＮＡの検定に先立って、その細胞を分割しな
ければならない。これを達成するには基本分割技術を用
いることもできるし、もし良りれば、　　ＰＡＬＭ咋等
のＵ、Ｓ、、Ｐ、Ｎ４３５８５３５記載のタイプの分割
技術は寒天上の数群体によって同定し２分割および変性
溶液を含む物質試験チューブ内にそれらを移動し、熔解
変性した中身をニトロセルロースまたは活性紙のどちら
かの上に移すことを含む。

二重ストランドの核酸を含む有機体から核酸を検定する
場合には、核酸の予備分割（変性）は少なくとも部分的
に単一ストランドに精製することを要求される。その技
術は知られているが本発明の一部分を形成するものでは
ない。たとえばこの技術としてはＪ、Ｐ、５ｔｅｒｒ＋
＋　Ｒ，Ｈａｎｄ　Ｗｅｎｓｉｎｋ　Ｐ、Ｃ。

（１９８０）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　
７，２１１５−２１３６に明らかにされている。

疑核酸物質は溶液中に浮遊されている間、あるいはサス
ペンダーまたはたとえばセルロースやフィルタペーパ等
の固体号ブストレートに固定されているときに検定され
る。検定の第１ステツプは検定される物質にできるだけ
特定されたテストプローブに疑核酸をハイブリッド化す
ることが含まれる。かくして２本発明のプローブは少な
くとも１０特に５０塩基を有する核酸であることが望ま
れる。

このプローブ自体はＤＮＡあるいはＲＮＡの核酸の単一
のストランドあるいは部分的に変性された二重ストラン
ドを構成し、ＤＮＡまたはＲＮＡは動物の組織から抽出
されるかあるいは人造され。

両方の技術はよく知られており、たとえば、　Ｋｒ１ｓ
ｔ等　（１９８１）　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　
八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ　　ＵＳＡ、７８．２７７２−２
７７６に開示されている。

核酸ストランドにおけるニソキングあるいは必要としな
い１段階技術により、ハイブリッドに先立ってプローブ
それ自体は修飾される。プローブの代わりに単一または
２つの要素または部分的に２つの要素が変形する間直接
に変形される。

種々の修飾は、修飾されたプローブを与えるために行わ
れる。修飾技術の目的は、効果的な抗原であるプローブ
を与えることであり、この目的を達成するいかなる修飾
もプローブの使用される構成ステップをじゃまし、ある
いは実質的に妨害することのないことが十分提供される
。

かくして１本発明によれば、修飾された複合体は、おそ
らく、アリカリ基を置換され、アリカリ基を含み３個ま
たはそれ以下あるいは３個またはそれ以上の炭素原子を
有し、スルホン基、ニトロ基、ニトロフェノール基のよ
うな核酸修飾可能基から選択される複合体である。

他の多くの修飾エージェントもまた使用されるかもしれ
ない。特にＮ−メチルニトロソリア、Ｎ−エチルニトロ
ソリア、Ｎ−プロピルニトロソリア、Ｎ−ブチルニトロ
ソリアは、アルカリ化エージェントとして使用されると
考えられるが、Ｎ−エチルニトロソリアが望ましい。こ
の型のアルカリ化技術は知られており１９８０年り、　
Ｒｅ１ｄｅｌ　ｐｕｂｌｉｓｈ−ｉｎｇ　Ｃｏ、刊のＣ
ａｒｃｉｎｏｇｅｎ　Ｐｕｎｄａｍｅｔａｌ　Ｍｅｃｈ
ａｎｉｓｍａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ　Ｅｆｆ
ｅｃｔｓの２０７−２１８頁の免疫探知においてＭ、　
Ｆ、　Ｒａｊｅｍｓｋｙ等により開示されている。

しかしながら、これらの技術はハイブリ、ソド化検定の
一部として以前に使われたことはなかった。

これらの化合物とアリカリ化する際に置換は、核酸の種
々の位置で発生する。

スルホン酸グループを備えた複合体は、２硫化物、また
は同構成のたとえば、　Ｐｏｖｅｒｒｅｎｎｙ等に示さ
れるＯ−メチル・ハイドロキシラミン等の同等の複合体
を含み、それは１つのスルホン化技術を開示する。

スルホン化は、核酸の６号ア５，６−ジハイドロ、　　
４−　ｍｅ　−Ｌｈｏｘｙ　ａｍｉｎｏｐｙｒｉｍｉｄ
ｏｎ　−２の位置で起きる。複合体は、ニトロソ基とニ
トロフェニール基と他の付加反応によって修飾される修
飾化合物が同様に用いられる。

上述リストしたタイプの化合物を付加することによって
一度修飾されるとＮ＝Ｏ基とニトロフェニル群と他の付
加反応に用いられるであろう修正複合体を同様に備えて
いる。プローブの交配に通し、交配の生じる条件での存
在を感しるところのサンプルと接触する。

この接触は９種々の技術、液−液接触、基質接触等様々
のものが用いられる。

この接触技術ば、　Ｐ、Ｓ、）−マス著＋　Ｐｒｏｃ＋
　ＮａＬｅ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃ＋、　１９８０．５２０１〜５２０５
に例示されている。

参照技術によれば、ＤＮＡ、ＲＮＡの存在は。

セロルールで添えられており、たとえばろ紙の一片のよ
うに。

特にセルロース、ニトロセルロースフィルターは、多孔
質或いは多孔質ではないかも知れない。

そのような物質は、　ＮＥＷ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃ
ｌｅａｒ　ａｓ　Ｇｅｒ＋ｅエン）゛でタッグ付される
。ラベリングエージェントには酵素、酵素−抗体の複合
体、放射性クノグド抗体、酵素等が用いられる。放射性
物質の使用を避けるため、ＥＩＡまたはリンクシステム
が接合に用いられる。例えば色彩分析技術とともに。

ＥＴＡの基本技術で、増幅は同様に用いられる。

発明の（糺れた一点は、修正されたプローブは。

特に良い抗原であり１発明の目的はラベリングエージェ
ントとして、抗体または複合抗原を用いることである。

抗体は、　　Ｄｏｖｃｒｎｎｙまたはミューラー、Ｒ，
アダムスキー著ＩＡＲＣ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｒｂ
ｌ、３９　Ｐａｇ、４６３〜４７９等で開示した基本技
術で得ることができる。

酵素は、：ｌ−ロソパ出願Ｓ、Ｎ、８０３０３４％、７
．１９８１年７月２１日発行、Ｐ５２〜５９．６１〜６
４に開示された。

Ｂ−ガラクトシダス２　ヒアルロニダーゼ、アルカリホ
スファクーゼ等が用いられる。

そして、おそらく抗体と公知技術で複合されるであろう
。本発明は実施例により開示されるであろう。

例■ 感染した細胞内のＳＶ４０シーケンスの探知（この例は
現実に行われた）ａ）ＣＶ−１細胞はＳＶ４０ビールスに感染され。

さらに１６時間培養された。細胞はトリプシナイズされ
、最終的に１０００の細胞のオーダーでのカウントを得
るためにリン酸塩バッファ溶液に希釈された。このサス
ペンシコンはＳ、Ｌａｖｉ＆　Ｓ、［１ｔｋｉｎ、　Ｃ
ａ−ｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ　２　（１９８１）　Ｐ
、４１７〜４２３及びＧａ１ｌＪ、Ｇｙ＆Ｐａｒｄｕｅ
　Ｍ、Ｌ、　　（１９６９）、　Ｐ、ＮＡＳ　６３　Ｐ
、３７８〜３８３に記述されているようにニトロセルロ
ースフィルタ及び変性ＤＮＡで濾過された。Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔバッファ（Ｄｅｎｈａｒｄｔ　Ｄ、Ｔ、　　”コ
ンプレメンタリーＤＮＡの探知用のメンブランフィルタ
技術″１９６６Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　
Ｒｅｓ、　Ｃｏｍ、２３６４］　〜６４６　）で６７℃
４時間予備培養を行った後、３回濃縮され。

フィルタは下記に示すエチルニトロソウレアでのアルキ
ル化により修飾された５Ｖ４０Ｄ’ＮＡ７容量に対し５
マイクログラム／ｍｌだけでなく１００マイクログラム
／ｍｌの濃度での変性ｃａｌｆ　ｔｈｙｍｕｓ　ＤＮＡ
　（ＳＩ’ＧＭＡ　）担体を含む同一のバッファに接触
された。

ｂ）ＳＶ４０ＤＮＡのアルキル化Ｒ，Ｍｕｌｌｅｒ　＆　　Ｒａｊｅｗｓｋｙ　Ｍ、Ｐ、
　（１９７８）　Ｎａｔｕｒｆｏ−ｒｓｃｈ　３３ＣＰ
　Ｐ、８９７〜９０１に記述された方法に従ってＮ−エ
チルニトロソウレアを使用してエチル化した純粋の５Ｖ
４０ＤＮＡ、エタノール沈澱によって沈澱されたＤＮＡ
は再沈澱によって２回洗浄され、凍結乾燥される。この
物質は分子プローブを構成する。

Ｃ）抗体形成エチル化ＤＮＡに対する抗体は上記のように処理された
ｃａｌｆ　ｔｈｙｍｕｓ　ＤＮＡを使用することによっ
て形成される。水酸化アルミニウム及びフロイント補助
剤の添加とともにウサギの皮下及び後足へのエチル化ｃ
ａ、ｌｆ　ｔｈｙｍｕｓ　ＤＮＡ　（２５０〜１０’Ｏ
Ｏマイクログラム／ｍ１）の繰り返し注入によって抗体
形成は行われる。これはブースターの注入によって抗体
の濃度が十分となるまで繰り返される。代わりにモノク
ロナル抗体が使われる。

ｄ）特殊抗体の分離２時間の培養後、非修飾ＤＡＮに直接結合した抗体に対
してＤＮＡ１ｌｉ似の手段が使用される。結合されてい
ないタンパク質はエチル基を含むアフィニティ力ラムを
通過し溶出される。

ｅ）ＳＶ４０シーケンスのデモンストレーションＬａｖ
ｉ等（１９８１）　５ｕｐｒａに記述された修飾プロー
ブでのハイブリッド手段でａ）のように準備されたフィ
ルターはｂ）のように準備されたプローブにさらされる
。ハイブリッド手段が終了した後。

フィルタはタンパ質溶液（１０％ノーマル、不活性血清
）で培養され、塩溶液で洗浄され、ｃ）のような非エチ
ル化ＤＮＡ抗体の混合物で３７０℃２時間でおおわれる
。フィルタは洗浄され、やぎの免疫グロブリンを利用し
た市販のプルオキンダーゼにさらされ８色反応が標準手
順によって発生する。

着色反応の現れは５Ｖ４０ＤＮＡの存在を示し。

その程度はそのシーケンスの量を示している。

次の例はまだ行っていないが実施を行う目的である。

例■ ゲル電気泳動及びプロッティングの特殊遺伝子の同定用
の修飾分子プローブの使用遺伝子（例えばグロビン）を含む原形質によって輸送さ
れてきたＥ、Ｃｏ１１バクテリアからのＤＮＡは束縛酵
素によって切断され、　５ｏｎｔｈｅｒｎ　Ｅ、Ｍ、　
　（１９７５）　Ｊ、Ｍｏｌ　Ｂｉｏ１９８．５０３−
５１７のように電気泳動処置がされ転位する。

同一の原形質は例１ｂで示したようにアルキル化あるい
はスルホン化で別々に処理され、修飾分子プローブを構
成する。修飾分子プローブとＤＮＡ断片とのハイブリッ
ドは５ｏｕｔｈｅｒｎ　Ｅ、Ｍ、　　（１９７５）　ｄ
ｕｐｒａのようになされる。

ハイブリッド後３例■のような抗体は色反応を得るため
に使用され処理される。グロビン遺伝子の部分を含むバ
ンドのみが修飾分子プローブと結合し、結果として着色
反応を生しさせるために抗体と結合する。この同じ手段
は細胞遺伝子にも使用され、原形質に限定されない。同
様にこの手段はプロカリヨウティック細胞に限定されず
、核細胞にも応用される。

例■ ハタテリア群体の同定寒天プレート上のバクテリア群体はプロッティングによ
ってニトロセルロースフィルタあるいは活性紙上へ移さ
れ＋　Ｇａ１ｌ　Ｊ、Ｇ、　＆　Ｐａｒｄｕｅ　Ｍ、！
。

（１９６９）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ｗａｓｈｉｎｔｏｎ６３３７８−３８
３に記述されているように少数の“プリント”が得られ
処理される。ＤＮＡ断片からなる修飾分子プローブは例
１ｂのようにして形成される。修飾分子プローブの各々
はバクテリア群体の分離した゛プリント”上のハイブリ
ッドに適用され２例■のような抗体反応のために処理さ
れる。

バクテリア群体の種類の直接同定が可能な公知の修飾分
子プローブを補う遺伝子を有するバクテリア群体に対応
する箇所にのみ着色反応が現れる。

例■ 混合物中の特定のＤＮＡの存在の同定ＤＭＳＯの添加により分化しヘモグロビンを生成するＦ
ｒ１ｅｎｄ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　１１１胞がこの実験で
使用される。

シトプラズミノクＲＮＡは分離因子の添加後異なる回に
分離され、　Ａｌｗｉｎｅ　Ｊ、Ｃ，、Ｋｅｍｐ　Ｄ、
　５ｔａｒｋＧ　　　（１９７７）　　Ｐｒｏｃ、　　
Ｎａｔ、　　八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　Ｕ、Ｓ、７４
．　５３５０〜５３５４の記述の様に活性紙上に固定さ
れる。グロビン遺伝子の全であるいは部分を含む原形質
及び例１ｂのように修飾されたものはこれらのスポット
に対するハイブリッドによって使用、され９例■のよう
な抗体反応や着色反応として処理される。

着色の強度は分離の異なる段階での細胞のシトブラズム
内に存在するグロビンメツセンジャ＝ＲＮＡの量の直接
表示である。

例■ ２つの遺伝子を区別するための二重修飾の使用例Ｉのよ
うに、　ＨｅｒｐｅｓビールスタイプＩかＨｅｒ−ｐｅ
ｓビールスタイプＨのいずれかの存在が疑われる細胞あ
るいはこれらの遺伝子が存在しないと思われる細胞がニ
トロセルロースフィルターで処理される。これらの細胞
は患者（臨床サンプル）するいは培養細胞（研究サンプ
ル）から取り出される。２つの修飾分子プローブが使用
される。

Ｈｅｒｐｅｓ　Ｉ　：　ＨｅｒｐｅｓＩ［Ｄ　Ｎ　Ａと
ハイブリッドされていないＨｅｒｐｅｓ　Ｉ　Ｄ　Ｎ　Ａの断片を含む原形質は例
■ようにしてエチルニトロソウレアにより修飾される。

修飾への抗体はウサギ中で起こる。

Ｈｅｒ−ｐｅｓＴｌ　：　Ｈｅｒｐｅｓ　Ｉ　Ｄ　Ｎ　
ＡとハイブリッドされていないＨｅｒｐｅｓｌｌ　Ｄ　Ｎ　Ａの断片を含む原形質はＰ
ｏｖｅｒｅｎｎｙ等（１９７９）のようにスルホン化に
よって修飾される。スルホン化された核酸に対する抗体
はヤギ中で起こる。

２つの修飾分子プローブの混合物は例１ａに記述した様
にハイブリッド用の疑サンプルに接触される。

２つの“セコンド”抗体は今使用される。

ａ）正確な生地が存在している時緑色を生成するベルオ
キシターゼに連結したアンチラビットイシュノグロプリ
ン（ＡＢＴＳ）（２２’アジノージー３−エチルヘンチ
アゾリンスルフオニツク酸）ｂ）正確な生地が存在して
いる時青色を与えるヘークガラクトシダーゼに連結した
アンチゴートイシュノグロプリン（Ｘｇａｌ）の２つの
抗体の混合物ばアンチボートかアンチラビットの何れが
ハイブリッド分子に付着しているかを決定するのに使わ
れる。その可能性は最終生成物の色によって区別される
。　完全反応後の緑色の存在は細胞内に１ｌｅｒｐｅｓ
　Ｉ遺転子が存在していることを示す。

完全反応後の青色の存在は細胞内にＨｅｒｐｅｓ　Ｉ［
遺伝子が存在していることを示す。２色の存在は２つの
遺伝子の存在を示す。着色反応がないことは組織内に２
つの遺伝子が存在していないことを示す。

同様の決定法は２つ以上の修飾分子プローブで行われ、
ボディ流動体及び組織の両者のテストに使用される。

本発明は特別の手段、物質、方法を参照しながら記述さ
れているが１本発明はこれらに限定されずクレームの範
囲内においてあらゆる同等物に及ぶことは理解されよう
。

手続補正書昭和５９年８月３１日昭和５９年　特許側　第１１２１５６号２、発明の名称分子遺伝プローブ及びその形成方法及び検査方法事件と
の関係　　　特許出願人住所　イスラエル国　ヤブネ　７０６５０ピーオーボツ
クス３６０名称　オルジェニソクス　リミテッド代表者　　マックス　へルツベルグ４、代理人　◎１００童（０３）　５９１−８７１６住
所　　東京都千代田区有楽町１−４−１明　　　　細　
　　　書１、発明の名称分子遺伝プローブ及びその形成方法及び検査方法及び分
子遺伝プローブを使用する方法２、特許請求の範囲（１）もし存在すれば疑核酸とハイブリッドしハイブリ
ッド複合物を形成し、　（ｖｆ飾核酸は核酸基の第１段
階修飾によって形成されるように選択された修飾核酸と
疑ザンプルとを接触させるａ）段階と、少なくとも前記
修飾核酸の修飾部分と複合化しハイブリッド錯体を形成
するように選択された標識抗体と前記修飾核酸とを接触
させるｂ）段階と、前記疑核酸の存在あるい存在量の表
示として前記標識抗体の存在及びまたは存在量を測定す
る。

Ｃ）段階からなる疑サンプル中の疑核酸の存在あるいは
存在量を検査する方法。

（２）　前記修飾核酸と前記疑サンプルが接触した後に
前記修飾核酸と前記標識抗体を接触させることよりなる
特許請求の範囲第１項記載の方法。

（３）　前記修飾核酸は少なくとも１０塩基を有してい
る特許請求の範囲第１項記載の方法。

（４）　前記修飾核酸は少なくとも５０塩基を有してい
る特許請求の範囲第３項記載の方法。

（５）　前記疑核酸は少なくとも１０塩基を有する遺伝
子シーケンスからなる特許請求の範囲第１項記載の方法
。

（６）　前記疑核酸は少なくとも１０塩基を有する遺伝
子生成物よりなる特許請求の範囲第５項記載の方法。

（７）　前記疑核酸は酵素のコードである特許請求の範
囲第１項記載の方法。

（８）　前記核酸はバイラルＤＮＡである特許請求の範
囲第１項記載の方法。

（９）　前記疑核酸はバイラルヘルペスＤＮＡである特
許請求の範囲第８項記載の方法。

（１０）　　前記修飾核酸はアルキル化によって修飾さ
れる特許請求の範囲第１項記載の方法。

（１１）　　前記修飾核酸はＯ−６グアニジンのアルキ
ル化によって修飾される特許請求の範囲第１０項記載の
方法。

（１２）　　前記修飾核酸はブチル化される特許請求の
範囲第１１項記載の方法。

（１３）　　前記修飾核酸はエチル化される特許請求の
範囲第１２項記載の方法。

（１４）　　前記修飾核酸はスルホン化によって修飾さ
れる特許請求の範囲第１項記載の方法。

（１５）　　前記修飾核酸はニトロソ化によって修飾さ
れる特許請求の範囲第１項記載の方法。

（１６）　　前記修飾核酸はニトロフェニル化によって
形成される特許請求の範囲第１項記載の方法。

（１７）　　前記標識抗体は色反応を与えるように選択
された酵素で標識化されるｂ）段階を行うことよりなる
特許請求の範囲第１項記載の方法。

（１８）　　前記酵素はベルオキシダーセ、ベータガラ
クトシダーゼラクトシダーゼ、ヒアルロニダーゼあるい
はアルカリフォスフェクーゼの一群から選択される特許
請求の範囲第１７項記載の方法。

（１９）　　前記修飾核酸は付加反応によって形成され
る特許請求の範囲第１項記載の方法。

（２０）　　前記疑核酸は単一ストラントＲＮＡである
特許請求の範囲第１項記載の方法。

（２１）　　前記疑核酸は通常二重ストランドであり。

ａ）段階に従って前記修飾核酸と接触するに先立って少
なくとも部分的に変性される特許請求の範囲第１項記載
の方法。

（２２）　　水銀の使用なしに疑核酸とハイブリッド化
し修飾核酸を形成出来る核酸を修飾するａ）段階と、ハ
イブリッド錯体を形成するように疑サンプルを前記修飾
核酸と接触させるｂ）段階と、少なくとも前記修飾核酸
の修飾部分と複合化し、少なくとも前記抗体の１つが前
記修飾核酸と複合化するように選択された抗体と前記修
飾核酸を接触させるＣ）段階と、前記抗体の存在を知ら
せるに適したエージェントで前記抗体を標識化するｄ）
段階と、前記疑核酸の存在あるいは存在量の表示として
、前記標識の存在及び／または存在量を測定するｅ）段
階からなる疑サンプル中の疑核酸の存在あるいは存在量
を検査する方法。

（２３）　　　ｃ）段階に従って前記修飾核酸を前記抗
体に接触させるに先立って前記修飾核酸を前記疑サンプ
ルに接触させることよりなる特許請求の範囲第２２項記
載の方法。

（２４）　　前記核酸はアルキル化によって修飾する特
許請求の範囲第２２項記載の方法。

（２５）　　メチル、エチルあるいはプロピルニトロソ
ウレアのグループから選択された化合物で前記核酸をア
ルキル化する特許請求の範囲第２４項記載の方法。

（２６）　　もし存在すれば疑核酸とハイブリッド化し
、ハイブリッド錯体を形成し、修飾核酸は前記核酸の１
段階修飾によって形成されるように選択された修飾核酸
と疑サンプルとを接触させるａ）段階と、少なくとも前
記修飾核酸の修飾部分と複合化し、前記ハイブリッド錯
体の存在を表示するに選択された同定物質と前記修飾核
酸を接触させるｂ）段階と、前記疑核酸の存在あるいは
存在量の表示として前記同定物質の存在及びまたは存在
量を測定するＣ）段階からなる疑サンプル中の疑核酸の
存在あるいは存在量を検査する方法。

（２７）　　前記修飾核酸と前記抗体を接触させるに先
立って前記ハイブリッド錯体を形成するように前記修飾
核酸と前記疑サンプルとを接触させる特許請求の範囲第
２６項記載の方法。

（２日）　　もし存在すれば疑核酸とハイブリッド化し
ハイブリッド錯体を形成し、修飾核酸は酵素作用なしに
形成されるように選択された修飾核酸と前記疑サンプル
とを接触させるａ）段階と、少なくとも前記修飾核酸の
修飾部分とハイブリッドするように選択された標識物質
と前記修飾核酸を接触させるｂ）段階と、前記疑核酸の
存在あるいは存在量の表示として前記標識物質の存在及
び／または存在量を測定するＣ）段階よりなる疑サンプ
ル中の疑核酸の存在あるいは存在量を検査する方法。

（２９）　　前記修飾核酸と前記標識物質を接触させる
に先立って前記ハイブリッド錯体を形成するように前記
修飾核酸と前記疑サンプルを接触させる特許請求の範囲
第２８項記載の方法。

（３０）　　もし存在すれば疑核酸とハイブリッド化し
ハイブリッド錯体を形成し、修飾核酸は結合部なしに複
合化する修飾物質を有するように選択された修飾核酸と
疑サンプルを接触させるａ）段階を、少なくとも前記修
飾ｉ亥酸の修飾部分と複合化するように選択された標識
物質と前記修飾核酸を接触させるｂ）段階と、前記疑核
酸の存在あるいは存在量の表示として前記標識物質の存
在及びまたは存在量を測定するＣ）段階からなる疑ザン
ブル中の疑核酸の存在あるいは存在量を検査する方法。

（３１）　　前記修飾核酸と前記標識物質を接触させる
に先立って前記ハイブリッド錯体を形成するように前記
修飾核酸と前記疑サンプルを接触させる特許請求の範囲
第３０項記載の方法。

（３２）　　修飾核酸を形成するように前記核酸基の部
分に付加し、酵素作用なしに前記疑核酸とハイブリッド
する二重ストランド核酸を修飾するａ）段階と、前記疑
サンプルと前記（ＩＩ飾核酸を接触させるｂ）段階と、
少なくとも前記修飾核酸の修飾部分と複合化するように
選択された標識物質と前記修飾核酸を接触させるＣ）段
階と、前記疑核酸の存在あるい存在量の表示として前記
標識物質の存在及び／または存在量を測定するｄ）段階
からなる疑サンプル中の疑核酸の存在あるいは存在量を
検査する方法。

（３３）　　前記修飾核酸と前記標識物質を接触させる
に先立って前記ハイブリッド錯体を形成するように前記
修飾核酸と前記疑サンプルを接触させる特許請求の範囲
第３２項記載の方法。

（３４）　　もし存在すれば、疑核酸とハイブリッド化
しハイブリッド錯体を形成し、修飾核酸は前記核酸基の
１段階修飾によって形成されるように選択された修飾核
酸の貯蔵物ａ）と、前記ハイブリッド錯体を形成するた
めの前記疑サンプルと前記修飾核酸とを接触させる手段
ｂ）と、少なくとも前記修飾核酸の修飾部分と複合化し
前記抗体は前記抗体の存在を知らせるに通した標識物質
で標識化されるように選択された抗体の貯蔵物Ｃ）と。

前記修飾核酸と前記標識抗体を接触させる手段ｄ）と、
前記疑ヌクレオチドの存在あるいは存在量の表示として
前記標識抗体の存在及び／または存在量を測定する手段
ｅ）からなる疑サンプル中の核酸の存在を確認するため
の装置。

（３５）　　Ｄ　Ｎ　Ａと接触する間に１段階付加によ
って修飾される少なくとも１つの修飾された塩基からな
り、コンプレメンタリーＤＮＡストランドとハイブリッ
ドするに適した単一ストランドのＤＮＡ分子遺伝プロー
ブ。

（３６）　　特許請求の範囲第３５項の分子遺伝プロー
ブと複合化するように形成された標識抗体。

（３７）　　ＲＮＡと接触する間に１段階付加によって
修飾される少なくとも１つの修飾された塩基からなり、
コンプレメンタリーＤＮＡあるいはＲＮＡストランドと
ハイブリッド化するに通した単一ストランドのＲＮＡ分
子遺伝プローブ。

（３８）　　特許請求の範囲第３７項？分子遺伝プロー
ブと複合化するように形成された標識抗体。

（３９）　　疑ポリヌクレオチドとハイブリッド出来る
修飾されたポリヌクレオチドを形成するために一段階で
ポリヌクレオチドの塩基上の部分に付加するステップよ
りなる修飾分子遺伝プローブを形成する方法。

（４０）　　疑ポリヌクレオチドとハイプリ・ノド化で
きる修飾されたポリヌクレオチドを形成するために水銀
を使用することなしにポリヌクレオチドの塩基上の部分
に付加するステップよりなる修飾分子遺伝プローブを形
成する方法。

（４１）　　酵素作用なしに修飾された二重ストランド
を形成するために前記二重ストランドのポリヌクレオチ
ドの塩基の部分に及び修飾遺伝プローブを形成するため
に少なくとも部分的に変性された前記修飾二重ストラン
ドポリヌクレオチドの塩基の部分に付加するステップよ
りなる修飾分子遺伝プローブを形成する方法。

（４２）　　結合部なしに塩基に直接付加される特徴部
分によって修飾される少なくとも１つの塩基を含み、コ
ンプレメンタリポリヌクレオチドとハイブリッドするに
適した単一ストランドの分子遺伝プローブ。

（４３）　　修飾核酸の各々はハイブリッド錯体を形成
するために疑核酸の同一性により前記疑核酸とハイブリ
ッドするように選択され、多数の前記修飾核酸と疑サン
プルを接触させるａ）段階と、ハイブリッド錯体を形成
するために前記修飾核酸の各々の少なくとも修飾部分と
複合化するように選択された標識抗体の複合物と前記修
飾核酸を接触させるｂ）段階と、少なくとも１つの前記
疑核酸の存在あるいは存在量の表示として前記標識抗体
の存在及びまたは存在量を測定するＣ）段階よりなる疑
サンプル中の疑核酸の存在あるいは存在量を検査する方
法。

（４４）　　ｂ）段階に先立って前記修飾核酸を初めに
非標識抗体と接触させることよりなる特許請求の範囲第
１項記載の方法。

３、発明の詳細な説明（１）　発明の分野本発明は、遺伝子用分子プローブ、および、それらのプ
ローブがＤＮＡやＲＮ八への検定技術の一部に使用され
るであろう方法に関する。

より詳しくは２本発明の遺伝子用分子プローブは以下検
定技術に特に有益である。例えば、ビールス性遺伝子の
存在、遺伝子のシーケンス（順序）。

たとえば酵素用コード等の遺伝子の生成物等が。

プローブとハイブリッドされ、その存在が定量的に分析
される標識エージェントと複合化されるところの存在す
るかどうか判らない、つまり存在がうすうす感じられる
核酸を含む疑サンプルに、存在することを検査する技術
である。

（２）　研究の背景とＩＩ論の適切な題材についての記
述本発明は、ビールス性遺伝子の存在、遺伝子の順位、す
べての遺伝子の生成物、たとえば、酵素のコードに関す
る分析技術を備えたものである。

それ′らの技術は、明らかな診断上の価値を有し。

また、限られた実験室的技術のみ有する研究者によって
、簡易に実行されるようにキットとして実行するのに特
に有益である。キットに好適で、特殊な病原菌の存在の
分析を可能ならしめ１特殊なもので、また、存在をうす
うす感じられる病原菌に特有な核酸の存在を検知するこ
とによって動作するような技術についての特別の要求が
ある。明らかに、それらの技術は正確なだけでなく、最
小限の操作を行う必要もまたあることが、実験室の験室
の専門技術室のみならず、検査に使用される試薬の製造
に際しても望ましい。

その検定の原理はＤＮＡやＲＮＡの検出に基づかれるこ
とが望ましい。なぜならそのような技術は徴候が判然と
しない時であっても病気を探知する技術として使用され
て来たからである。それらの技術は、ある組織中にある
ビールスの存在を決定したいと望むところのビールス性
病気において用いられる病原菌の検定において特別に興
味をそそるものである。

この技術それ自体は、疑ビールス性ＤＮＡとハイブリッ
ド化できるプローブＤＮＡが、ラジオアイソトープ的に
タッグ付けされ、試験標本に加えられるハイブリッド化
技術を用いることによって特定のビールス性ＤＮＡとＲ
ＮＡの存在を検定するために存在している。標準的な計
数とイメージング技術は、疑ＤＮＡの存在と総量の定量
分析に用いられるであろう。

そのような技術は＋　Ｆａｌｋｏｗ等のＵ、Ｓ、Ｐ　４
，３５８，５３５に広（開示されている。その中で、変
性された疑ＤＮＡ　（またはＲＮＡ）は、標識化された
単一ストランドのＤＮＡ　（ＲＮＡ）プローブと接触さ
れている。特殊な変性技術も開示されている。プローブ
は変性疑ＤＮＡとハイブリッド化するよう選択される。

スクリーン技術は、スクリーンするビールス（特に生殖
ヘルペスがあげられる）菌類。

原生動物、カビ等に使用するのに適している。と言われ
ている。使用される標識は、一般に放射性核種であるこ
とが示唆される。しかしながらこの発明は、探知目的の
ために特にプローブにバインドされる抗体を用いやすい
場合があることについて言及する。その例について、抗
体それ自身が標識を付される。リストされた標識には、
放射性標識と配位子を含む、それは、標識を付された抗
体。

螢光、化学ルミネッセンス、酵素、標識を付された配位
子との特殊結合ペア要素として作用する抗体等に対して
の特殊な結合要素として作用する。

ヨーロッパ特許＠　Ｎｏ、　００６２２８６は、肝炎Ｂ
ビールスのヌクレイン酸のハイブリットの探知するため
のテストキットと方法を開示する。再び、ハイブリッド
プローブは、シンチレーション計数技術で検定されるも
のに使用される。

ロシア特許６４９，７５１は、ＤＮＡを微生物から精製
することにより微生物と同定し照合金株からのＤＮＡと
微生物的に交配することにより確認する方法を開示する
。ＤＮＡは放射性チミンにより標識化される。

それらの欠点の一つば、プローブの準備期間中に放射性
物質を扱わねばならず、これは明らかに不満足な状態で
ある。これらの技術に現れる他の欠点はそのような酵素
的なプロセスが必要である備品を相対的に複雑にしてい
ることである。　　−米特許４，３０２．２０４　（ウ
オール等）と４，１３９，３４６（ラバニイ等）は、と
もにＲＮＡとＤＮＡストランドがハ・イブリッド技術の
一部として標識付けられたプローブをハイブリッド化さ
れるハイブリッド技術を開示している。

ＤＮＡそれ自体は、考えられるスクリーン技術の目的の
抗原としては、ｔ’ｓ足すべきものではないと特筆すべ
きことである。ウィルスＩ）ＮＡの抗体反応は、しばし
ば不充分であり、抗原として使用できるようにするには
不十分なだけ特定されていない。

ＤＮへの修飾と修飾された抗原を抗体反応を引き出すた
めに用いることは周知の技術である。

「修飾されたヌクレオチド用の抗体：核酸の単離と特徴
化のための免疫化学的なアプローチ」と題されたＭｕｎ
ｎｓとＬｉｓｚｅｗｓｋｉの核酸研究と分子生物学の進
歩、第２４巻１０９頁−１６５頁（１９８０年）の論文
は、修飾構成要素に特有である抗体について論じている
。

Ｂｒ１ｓｃｏｅ等による１９７８年刊Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ、第１７巻１８９６〜１９０１頁「アルキル化
ＤＡＮにおける０６−メチルグアニンのイムノロジカル
検出（Ｔｍｍｕｎｏ−１ｏｇｉｃａｌ　Ｄｅｔｅｃｔｉ
ｏｎ　ｏｆ　０６−Ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ　ｉｎ
＾１ｋｙｌａｔｅｄ　ＤＮＡ）　Ｊは、アルキル化ＤＮ
Ａを直接バインドする０６−メチルグアニンに特効ある
抗体の使用の可能性について述べている。これらの抗体
を用いる放射性免疫システムは、ＤＮＡをある種のアル
キル化エージェントとして扱って。

０６−メチルグアニンを探知するのに有益な′アプロー
チである上述べている。

Ｓａｇｅ等による１９７９年刊ｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙＪ第１８巻１３２８〜１３３２頁「発癌性−Ｎ−
アセトキシ−Ｎ−アセチル−２−アミノフルオレンによ
り修飾されたＤＮＡの抗体反応」は、Ｎ−アセトキシ−
Ｎ−アセチル−２−アミノフルオレンで修飾されたＤＮ
Ａの抗体反応について記述している。これらの抗体は非
修飾型よりも修飾ＤＮＡτこ反応する。

Ｌｏｖｅｌｅｓｓによる１９６９年刊ｒ　Ｎａｔｕｒｅ
Ｊ第２２３巻。

Ｊｕｌｙ、１２ｒニトロソアミンとニトロソアミドのム
タジュニイシイティとカルジノジエンシイへのジオキシ
グアノシンの０６−アルキル化の可能な関係」は、核酸
基を修飾するＮ−エチル−Ｎ−ニトロツウリアのような
生物的アルキル化エージェントを使うことを論じている
。

かくして、核酸基のエチル化を含む修飾は認識された現
象であるが、この原理を雑種形成に関係して有効な検定
技術の一部として用いることの利点は、最大限定までに
は一般的に以前には理解されあるいは用いられているこ
とはなかった。事実。

雑種形成は、１つの検定工程において修飾されることと
関係して少なくとも１例では示唆されているが、この工
程は２個の技術を最大利用となるように結合し、制限定
された用途のみをもつ極めて雑しい検定を行う結果とな
る。

しかし、そのような技術はコーロソバ出＠Ｓ、Ｎ。

８２３２１８２４、９の内に見られる（１９８２年１１
月１３日刊）。

３ケの炭素原子（たとえば“ビオチン″）の少なくとも
半分を共有結合することによってプリンまたはピリミジ
ン基の修飾について論じており、その化合物が二重スト
ランドＲＮＡ、二重ＤＮＡ。

ＤＮＡ＝ＲＮＡハイブリッドに結合した場合に。

ポリペプチドの検知できる複合を形成できる。ビオチン
を含んだプローブのポリペプチドディテクターは、アビ
ジン、ストレプトアビジンまたはアンチビオチンイムノ
グロブリンであろう。特にビオチン状のプローブに対す
る望ましいプロテインはアンチビオチンイムノグロブリ
ンである。この抗体は過酸化物のような酵素でタッグさ
れ得る。

第３０頁第３７行目から第３１頁１〜１４行目に抗体の
ビオチン構成物の使用について述べている。第３３頁に
図があり、ビオチンやハプテンの探知に抗体を使うこと
が述べである。ＩｇＧ−ベルオキシターゼの例は、酵素
探知システＬの抗体タッグについて述べている。第３４
頁２５〜３７行目と第３５頁１〜２行目に１問題のヌク
レオチドシーカンスの存在を探知するために修飾ヌクレ
オチドの利用方法について記述する。この一般原案は、
臨床の試料においてビールス、ハタテリア、菌、原生寄
生虫等の核酸シーケンスの探知に応用され得る。

上述した如く、この技術は限定された用途だけ。

であるとともに極端にやっかいである。この技術を用い
ると、テンプレート核酸の二二−クレース処理が１つの
ストランドにおいて２間隙を二、りしあるいは開けるた
めに用いられる。ビオチンの代用基はポリメラーゼを使
ってＤＮＡに挿入される。修飾ＤＮＡは、アンチビオチ
ンと複合し、アンチビオチン−酵素−ＤＮＡ複合体に酵
素でタッグ付される。二重ストランドＤＮＡは次に裂れ
。

そして複合されたストランドはプローブとして使用する
ことできる。そのような技術は、二重ストランドの形成
においてのみ修飾がＤＮＡに生じることを要求する。修
飾された単一ストランドは。

二重ストランドの核酸を含む有機体のハイブリッドにの
み用いることができる。すなわち、単一ストラン）”　
ＲＡ　Ｎビールスのような物質は本願の中で提案された
方法の使用で修飾または探知することはできない。

さらにこのシステムは、ヌクレアーゼやポリメラーゼの
ような追加的試薬とビオチン基を前もって合成すること
が必要である。これらの物質の用途は、技術の複雑さを
加えるのみならず高度の純粋さもまた要求される。また
、修飾された核酸チェーンの切断、再生に用いる酵素の
使用は、キット試薬を作るには９時間と費用を必要とし
、また。

この技術が診断キットに用いられるための価値を減する
。

その特許の第６２〜６３頁は、加えてポリヌクレオチド
の鎮状重合体の修飾について開示する。水銀塩を用い、
水銀化誘導体は形成される。水銀化誘導体は、に２Ｐｄ
Ｃ１ａの存在下で、リンクアームおよび反応端子作用群
あるいはそれ自身修飾と反応する。かくして、少なくと
も２つ、それでなけれは３つのステップが修飾を行うた
めに要求される。

そのような工程は不満足である。なぜなら、それぞれの
ステップの間に洗浄が必要だからである。

水銀を用いることは大きな欠点がある。なぜなら１この
工程を内位添加のために二重ストランドシステムに対し
て使用できなくするからである。更に。

論述したように、リンクアームは、その半分を加える位
置のために必要である。リンクアームの必゛要としない
技術の方がより満足すべきものである。

更に、刊行された技術では、一つの基に１つのアームを
付けるのみであるが５時として１゛つの基に複数のアー
ムの付加が要求される。

発明の要約本願発明の目的は、抗体特定を安価に行う検定とスクリ
ーン技術を提供するもので、そのための試薬は簡単に合
成反応でき、単一ストランドまたは二重ストランドの双
方の有機体から核酸を純度に対してあまり注意を払うこ
となく検定する際に広い用途を有する。

この発明の更なる目的は１強い抗原を用い、すなわち強
い抗体反応がもたらされ疑核酸に対するプローブのハイ
ブリッドは実質的に妨害することのない技術を提供する
ものである。

この発明の他の目的は、もし、それらの物質に露される
ことを最小限にしたいと望むなら、放射性核種の使用を
避ける技術を提供する。

この発明の更に他の目的によると、プローブ形成技術で
あって修飾エージェントの１工程追加を含み、水銀を使
用せず、核酸の単−基に１つ以上の修飾エージェントの
追加を可能とするものである。

この発明の目的は、この発明の検定方法によって達成さ
れ、この発明においては、疑サンプル内の疑核酸の存在
と量とが決定される。この発明は。

これらはもし存在すれば疑核酸とハイブリッド化しハイ
ブリッド複合物を形成し、修飾核酸は核酸基の第１段階
修飾によって形成されるように選択された修飾核酸と疑
サンプルとを接触させるａ）段階と。

少なくとも前記修飾核酸の修飾部分と混合化しハイブリ
ッド錯体を形成するように選択された標識抗体と前記修
飾核酸とを接触させるｂ）段階と。

前記疑核酸の存在あるいは存在量の表示として前記標識
抗体の存在及び／または存在量を測定するＣ）段階。

からなる疑サンプル中の疑核酸の存在あるいは存在量を
検査する方法によって達成される。

その技術を使うことにより、二重ストランドと同様に単
一ストランドＤＮＡおよびＲＮＡを含む有機体から、核
酸がそうでなければ要求されるかもしれない高純度でな
い状況下で、検定されるかも知れない。

放射性物質を扱うことを避けたいと望む状況で簡易に使
えるようにする。標識は、酵素直接であるかもしれず、
または、たとえばそれ自身酵素と複合化する１次抗体に
対する２次抗体である。

この技術の特別な利点は酵素的なまたは、他の型の核酸
操作技術を用いることなく、ＤＮＡまたはＲＮＡプロー
ブそれ自身、直接修飾できることである。特にヌクレア
ーゼとポリメラーゼの使用は明確に避けられるであろう
。

プローブそれ自体は、単一ストランドか二重ストランド
で、それは少なくとも部分的に変性されている。プロー
ブの基本的要求は修飾されたときに疑核酸とハイブリッ
ド化可能であることである。

ＤＮＡまたはＲＮＡの特別な修飾は核酸基の修飾を含め
、特に１つの好ましい具体例は塩基のアルキル化である
。アルキル化はアルキルニトロツウリアのようなアルキ
ル化合物を用いることにより行われるかもしれず、そし
てさらに特別には。

メチル、エチルまたはプロピルニトロソリア化合物を用
いる。特に好ましい具体例の１つでのアルキル化合物は
、Ｎ−エチル−ニトロソーラリアである。発明の範囲を
外れることなく実質的に同様な方法で、＠似な抗体反応
をひき出す他のアルキル化化合物が用いられることは極
めて明らかである。特定の化合物が用いられることによ
って他の位置もまたアルキル化されるけれども、グアニ
ジンの０６の位置のアルキル化が望ましい。Ｂｒ１ｓｃ
ｏｅ等をみよ、上記参照。すなわちこの発明に従って用
いられる追加的修飾反応の例として用いられる。

この論文の開示は参考引用としてこの出願の中に加えら
れる。

本発明の別の具体例では、修飾スルホン化の形成が行わ
れる。このようなスルホン化技術はＡ、　Ｍ。

Ｐｏｖｅｒｅｎｎｙ等によるＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ等１６巻３１３−３１６１頁’、　　
ＰｅｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓ＋　Ｌｔｄ、＋　１９７９
刊の“’ＤＮＡ構造解析への免疫化学的アプローチ−■
”に開示されている。

ニトロソ化、ニトロフェニル化等の付加反応修飾の別の
タイプもまた本発明の範囲かり外れることなしに使用さ
れる。

このようなキットはもし存在すればハイブリッド錯体を
形成するように疑核酸とハイブリッド化するように選択
された修飾核酸プローブの貯蔵物を含む。修飾核酸自体
はプローブ核酸の塩基の修飾によって形成される。ハイ
ブリッド錯体を形成するように疑サンプルと修飾核酸を
接触させるための手段が与えられる。修飾核酸の少なく
とも修飾部分と複合化するように選択された抗体の貯蔵
物が与えられる。抗体は抗体の存在も知らせるに適した
標識エージェントで標識化される。キットはさらに修飾
核酸と標識抗体を接触させる手段と。

疑ヌクレオチドの存在あるいは存在量の素子として標識
の存在および／または存在量を測定する手段とを含んで
いる。

本発明の検定のような検定において与えられるところの
容易性のためにプローブそれ自体は本発明の一形態を形
成している。このようなプローブは少なくとも１つの修
飾基を含む単一あるいは部分的に変性した二重ストラン
ドのＤＮＡまたはＲＮＡ分子遺伝プローブである。水銀
あるいばリンクアームの使用なしに一段階付加でＤＮＡ
あるいはＲＮＡに接触されている間に塩基は修飾される
。

プローブはさらにコンブレメンタリＤＮＡあるいはＲＮ
Ａストランドとハイブリッド化するに適している。ハイ
ブリッドそれ自体は公知疑核酸であり、多くの刊行物で
はたとえばヨーロッパ特許出１１８２１０２６７３．９
　（Ｏｃｔｏｂｅｒ１３．１９８２　）の第７頁に記述
されている。もちろん、この発明のプローブはこの発明
に従って標識エージェントとして特別に使用することを
見い出した抗体を作るために抗原として働く。プローブ
それ自体は、それが単一あるいは二重ストランドである
間、もしくはここに開示されているような修飾技術が使
われているときに部分的に変性している間に修飾される
。

好適の具体例の記述本例発明はＤＮＡやＲＮＡの様な単一または二重ストラ
ンドの核酸あるいはこれらのヌクレオタイドを含む有機
体から核酸存在および／または存在量を検定することに
おける特殊な応用を見出す。

発明に従って検定された核酸は少なくとも１０塩基。

むしろ少なくとも５０塩基を有する。単一ストランドの
核酸を含む有機体から核酸を検定する場合。

ハイブリ・７ド化は変性なしに直接行われうる。

細胞内のＤＮＡの検定に先立って、その細胞を分割しな
ければならない。これを達成するために。

基本分割技術を用いることもできるし、または。

もし良ければ、　　ＦＡＬＫ叶等のＵ、Ｓ、　Ｐ、Ｎ４
３５８５３５記載のタイプの分割技術を用いることがで
きる。

この発明に従って交互の分割技術は、寒天上の数群体に
よって同定し１分割および変性溶液を含む分割試験チュ
ーブ内にそれらを移動し９分割し溶解変性した中身をニ
トロセルロースまたは活性紙のどちらかの上に移すこと
を含む。

二重ストランドめ核酸を含む有機体から核酸を検定する
場合には、核酸の予備分割（変性）は少なくとも部分的
に単一ストランドに精製することを要求される。その技
術は知られているが本発明の一部分を形成するものでは
ない。たとえばこの技術の例としてはＪ、Ｐ、５ｔｅｒ
ｎ、　Ｒ，）ｌ　ａｎｄ　Ｗｅｎｓｉｎｋ。

Ｐ、Ｃ，（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　　
Ｒｅｓ、７．２１１５−２１３６に明らかにされている
。

疑核酸物質は溶液中に浮遊されている間、あるいはサス
ペンダーまたは、たとえばセルロースやフィルタペーパ
等の固体サブストレートに固定されているときに検・定
される。検定の第１ステツプは検定される物質にできる
だけ特定されたテストプローブに疑核酸をハイブリッド
化することが含まれる。かくして１本発明のプローブは
少なくとも１０むしろ５０塩基を有する核酸であること
が望まれる。

このプローブ自体はＤＮＡあるいはＲＮＡの核酸の単一
のストランドあるいは部分的に変性され・た二重ストラ
ンドを構成し、ＤＮＡまたはＲＮＡは動物の組織から抽
出されるかあるいは人造され。

両方の技術はよく知られており、たとえば、　　Ｋｒ１
ｓｔ等（１９８１）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃ、、ＵＳへ、　７８．２７７２〜２７７６に
開示されている。

核酸ストランドにおけるニソキングあるいは酵素作用を
必要としない１段階技術により、ハイブリッド化に先立
ってプローブそれ自体は修飾される。その代りにプロー
ブが単一または２重のストランドである間、直接的に修
飾されるか、または部分的に変性された二重ストランド
の変性部分が修飾される。

種々の修飾は、修飾されたプローブを与えるために行わ
れる。修飾技術の目的は、幼木的な抗原であるプローブ
を与えることであり、この目的を達成するいかなる修飾
もプローブの使用されるハイブリッド化ステップをじゃ
まし、あるいは実質的に妨害することのないならば満足
すべきものである。かくして２本発明によれば、修飾さ
れた複合体は、おそらく、アルキル基を置換され、アル
キル基を含み３個またはそれ以下あるいは３個またはそ
れ以上の炭素原子を有し、スルホン基、二　。

トロソ基、ニトロフェノール基のような核酸修飾可能基
から選択される複合体である。他の多くの修飾エージェ
ントもまた使用されるかもしれない。

特にＮ−メチルニトロツウリア、Ｎ−エチルニトロソウ
リア、Ｎ−プロピルニトロツウリア、Ｎ−ブチルニトロ
ツウリアは、アルカリ化エージェントとして使用される
と考えられるが、Ｎ−エチルニトロツウリアが望ましい
。この型のアルキル化技術は知られており１９８０年り
、　Ｒｅ１ｄｅｌ　ＰｕｂｌｊｓｈｉｎｇＣｏ、刊のＣ
ａｒｃｉｎｏｇｅｎ　Ｆｕｎｄａｍｅｔａｌ　Ｍｅｃｈ
ａｎｉｓｍ　ａｎｄＥｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ　Ｅｆｆ
ｃｔｓの第２０７−２１８頁の免疫探知においてＭ、Ｆ
、Ｒａｊｅｗｓｋｙ等により開示されている。

しかしながら、これらの技術はバイブリソｌ’化検定の
一部として以前に使われたことはなかった。

これらの化合物とアルキル化する際に置換は核酸の種々
の位置で発生する。

スルホン基を備えた複合体は、２亜硫酸塩、または同構
成のたとえば、　ＰｏｖｅｒｅｎｎＶ等に示されるＯ−
メチルハイトロキシルアミン等の同等の複合体を含み、
それは１つのスルホン化技術を開示する。スルホン化は
、核酸の６　スルホ　５，６ジハイドロ　４−メトキシ
アミノピリミドン−２の位置で起きる。

複合体は、ニトロソ基とニトロフェニル基と付加反応に
よって修飾される他の化合物が同様に用いられる。

上述リストしたタイプの化合物を付加することによって
一度修飾されるとプローブはハイブリッド化に適し、ハ
イブリッド化を許す条件での疑サンプルと接触する。

この接触は３種々の技術、液−液接触、同様に基質接触
等積々のものが用いられる。この接触技術は、　　Ｐ、
Ｓ、Ｔｈｏｍａｓ著、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ。

１９８０、５２０１〜５２０５に例示されている。好適
技術によれば、疑ＤＮＡ、疑ＲＮＡは、たとえばろ紙の
一片のようなセルロースで支持固定されている。

特にセルロース、ニトロセルロースフィルタの支持紙は
用いられる。そして、それは多孔質或いは多孔質でばな
いかも知れない。そのような物質は、　ＮＥＷ　Ｅｎｇ
ｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　ａｓ　Ｇｅｎｅ　’　５ｃ
ｒｅｅｎでハイブリッド移動膜として手に入れることが
できる。

穴のないプラスチックのような他の保持部材もまた使わ
れるかも知れない。プローブは次にサポート上に吊られ
たいかなる疑ＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリッド化させる
ためにサポートに接触される。これは単にその中に分配
されたプローブを有するゲルＲろ紙を適用することによ
って管現象を通して達成される。

ハイブリッド後とハイブリッド化合物がろ紙上にある間
、ハイブリッド化合物は、検定を可能とする検識エージ
ェントでクノグ付される。

検識エージェントには酵素、酵素−抗体の複合体、放射
性タソグド抗体あるいは、酵素等が用いられる。放射性
物質の使用を避けるため、ＥＩＡまたは同様のシステム
が例えば色彩分析技術と関連して用いられる。一般的な
ＥＩＡの技術は、゛増幅及び同様のものが用いられる。

発明の優れた点は、修飾されたプローブは、特に良い抗
原であり、。

発明の目的としてはラベリングエージェントは。

抗体または酵素と混成したものであることが望ましい。

　抗体は、　ＰｏｖｅｒｅｎｎｙまたはＭｕｌｌｅｒ、
　Ｒ。

ＡｄａｍｋｉｅｗｉｃｚとＭ、Ｆ、Ｒａｊｅｗｓｋｙ著
ＩＡＲＣ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂ１．３９巻等４６
３〜４７９頁等で開示した基本技術で得ることができる
。酵素は、ヨーロッパ出願Ｓ。

Ｎ、８０３０３４０５．７．１９８１年７月２１日発行
の第５２〜５９頁第６１〜６４頁に開示された。ベルオ
キシクーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ヒアルロニダーゼ
、アルカリホスファターゼ等が用いられる。そして酵素
はおそらく抗体と公知技術で混成されるであろう。

本発明を実施例により説明する。

例　　■ 感染した細胞内のＳＶ　４０シーケンスの探知（この例
は現実に行われた）ａ）ＣＶ−１細胞はＳＶ４０ビールスに感染され、さら
に１６時間培養された。細胞はトリプシン化され。

最終的に１０００の細胞のオーダーでのカウントを得る
ためにリン酸塩バッファ溶液に希釈された。このサスペ
ンションはＳ、Ｌａｖｉ＆　Ｓ、Ｅｔｋｉｎ、　Ｃａ−
ｒｃｊｎｏｇｅｎｅｓｉｓ　２　（１９８１）の第４１
’７〜４２３頁及びＧａ１ｌ　Ｊ、Ｇ。

＆　　Ｐａｒｄｕｅ　Ｍ、］、　（１９６９）　　Ｐ、
　　ＮＡＳ　６３の第３７８〜３８３頁に記述されてい
るようにニトロセルロースフィルタ及び変性ＤＮＡで濾
過された。Ｄｅｎｈａｒｄｔバッフｙ　　（Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔ　Ｄ、Ｔ、　　”コンプレメンタリーＤＮＡの探
知用のメンブランフィルタ技術”１９６６年刊Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、　　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　Ｒｅｓ、　　Ｃｏｍ
、　　２３の第　６４１〜６４６頁）で６７℃、４時間
予備培養を行った後、３回濃縮され１フイルタは下記に
示すエチルニトロソウレアでのアルキル化により修飾さ
れたＳＶ　４０　ＤＮＡの７容量に対し５マイクログラ
ム／ｍｌだけでなく１００マイクログラム／ｍｌの濃度
での変性ｃａｌｆ　ｔｈｙｍｕｓ　ＤＮＡ　（ＳＩＧＭ
Ａ　）担体を含む同一のバッファに接触された。

ｂ　）　ＳＶ　４０　ＤＮＡのアルキル化Ｒ，Ｍｕｌｌ
ｅｒ　＆　Ｒａｊｅｗｓｋｙ　Ｍ、Ｆ、　（１９７Ｂ）
　Ｎａｔｕｒ−ｆｏｒｓｃｈ　３３Ｃの第８９７〜９０
１頁に記述された方法に従ってＮ−エチルニトロソウレ
アを使用してエチル化した純粋のＳＶ　４０　ＤＮＡお
よびエタノール沈澱によって沈澱されたＤＮ’Ａは再沈
澱によって２回洗浄され、凍結乾燥される。この物質は
分子プローブを構成する。

Ｃ）抗体形成エチル化ＤＮＡに対する抗体は上記のようにエチル化で
処理されたｃａｌｆ　ｔｈｙｍｕｓ　ＤＮＡを使用する
ことによって形成される。水酸化アルミニウム及びＦｒ
ｅｕｎｄ補助剤の添加とともにウサギの皮下及び後足へ
のエチル化ｃ、ａ１ｆ　ｔｈｙｍｕｓ　ＤＮＡ　　（２
５０〜１０００マイクログラム／ｍｌ）の繰り返し注入
によって抗体形成は行われる。これはブースターの注入
によって抗体の濃度が十分となるまで繰り返される。

代わりにモノクロナル抗体が使われる。

ｄ）特殊抗体の分離２時間の培養後、非修飾ＤＡＮに直接結合した抗体に対
してＤＮＡ［似の手段が使用される。結合されていない
プロティンはエチル基を含むアフィニティ力ラムを通過
し溶出される。

ｅ）ＳＶ４０シーケンスのデモンストレーションＬａｖ
ｉ等（１９８１）　５ｕｐｒａに記述された修飾プロー
ブでのハイブリッド手段でａ）のように準備されたフィ
ルターはｂ）のように準備されたプローブにさらされる
。ハイブリッド手段が終了した後、フィルタはタンパ質
溶液（１０％ノーマル、不活性血清）で培養され、塩溶
液で洗浄され、ｃ）のような非エチル化ＤＮＡ抗体の混
合物で３７０°Ｃ２時間でおおわれる。フィルタは洗浄
され、やぎの免疫グロブリンを利用した市販のプルオキ
ンダーゼにさらされ１色反応が標準手順によって発生す
る。

着色反応の現ればＳＶ　４０　ＤＮＡの存在を示し、そ
の程度はそのシーケンスの量を示している。

次の例はまだ行っていないが実施を行う目的である。

例■ 遺伝子（例えばグロビン）を含む原形質によって輸送さ
れてきたＥ、Ｇｏｌ＋バクテリアからのＤＮＡは束縛酵
素によって切断され、　５ｏｕｔｈｅｒｎ　Ｅ、Ｍ。

１９７５、刊のＪ、Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　９８＋第５０３
−５１７頁のように電気泳動処置がされ転位する。

同一の原形質は例１ｂで示したようにアルキル化あるい
はスルホン化で別々に処理され、修飾分子プローブを構
成する。

修飾分子プローブとＤＮＡ断片とのハイブリッドば５ｏ
ｕｔｈｅｒｎ　Ｅ、Ｍ、　　（１９７５）　５ｕｐｒａ
のようになされる。

ハイブリッド後９例１ｃのような抗体は色反応を得るた
めに使用され処理される。グロビン遺伝子の部分を含む
バンドのみが修飾分子プローブと結合し、結果として着
色反応を生じさせるために抗体と結合する。この同じ手
段は細胞遺伝子にも使用され、原形質に限定されない。

同様にこの手段はプロカリョウテインク細胞に限定され
ず、核細胞にも応用される。

例■ バクテリア解体の同定寒天プレート上のバクテリア解体はプロッティングによ
ってニトロセルロースフィルタあるいは活性紙上へ移さ
れ、　Ｇａ１ｌ　Ｊ、Ｇ、　＆　Ｐａｒｄｕｅ　Ｍ、Ｌ
。

（１９６９）　　のＰｒｏｃ、　　Ｎａｔ、　　八ｃａ
ｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＩＪ、　　Ｓ、　　Ｗａｓｈｉｎ
ｔｏｎ６３３７Ｂ−３８３に記述されているように少数
の“プリント”が得られ処理される。ＤＮＡ断片からな
る修飾分子プローブは例１ｂのようにして形成される。

修飾分子プローブの各々はバクテリア解体の分離した“
プリント”上のハイブリッドに適用され２例Ｉのような
抗体反応のために処理される。

バクテリア解体の種類の直接同定が可能な公知の修飾分
子プローブを補う遺伝子を有するバクテリア解体に対応
する箇所にのみ着色反応が現れる。

例■ 混合物中の特定のＤＮＡの存在の同定ＤＭＳＯの添加により分化しヘモグロビンを生成するＦ
ｒ１ｅｎｄ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ細胞がこの実験で使用さ
れる。

シトプラズミ’７りＲＮＡは分離因子の添加後異なる回
に分離され、八１ｗ１ｎｅ　、＋、ｃ、ｌ　Ｋｅｍｐ　
Ｄ、　５ｔａｒｋＧ　　　（１９７７）　　Ｐｒｏｃ、
　　Ｎａｔ、　　八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　Ｕ、Ｓ、
　　７４．　５３５０〜５３５４の記述の様に活性紙上
に固定される。グロビン遺伝子の全であるいは部分を含
む原形質及び例Ｉｂのように修飾されたものはこれらの
スポットに対するハイブリッドによって使用され２例Ｉ
のような抗体反応や着色反応として処理される。

着色の強度は分離の異なる段階での細胞のシトプラズム
内に存在するグロビンメソセンジャーＲＮＡの量の直接
表示である。

例■ ２つの遺伝子を区別するための二重修飾の使用例Ｉのよ
うに、　　ＨｅｒｐｅｓビールスタイプＩか１１ｅｒｐ
ｅｓビールスタイプ■のいずれかの存在が疑われ−る細
胞あるいはこれらの遺伝子が存在しないと思われる細胞
がニトロセルロースフィルターで処理される。これらの
細胞は患者（臨床サンプル）あるいは培養細胞（研究サ
ンプル）から取り出される。２つの修飾分子プローブが
使用される。

Ｈｅｒｐｅｓ　Ｉ　：　ｌ１ｅｒｐｅｓｌｌ　Ｄ　Ｎ　
ＡとハイブリッドされていないＨｅｒｐｅｓ　Ｉ　Ｄ　
Ｎ　Ａの断片を含む原形質は例Ｉのようにしてエチルニ
トロソウレアにより修飾される。修飾への抗体はウサギ
中で起こる。

ＨｅｒｐｅｓＨ：　Ｈｐｒｐｅｓ　Ｉ　Ｄ　Ｎ　Ａとハ
イブリッドされていないＨｅｒｐｅｓｌｌ　Ｄ　Ｎ　Ａの断片を含む原形質はＰ
ｏｖｅｒｅｎｎｙ等（１９７９）のようにスルホン化に
よって修飾される。スルホン化された核酸に対する抗体
はヤギ中で起こる。

２つの修飾分子プローブの混合物は例Ｔａに記述した様
にハイブリッド用の疑サンプルに接触される。

２つのパセコンド”抗体がここで使用される。

ａ）正確な生地が存在している時緑色を生成するベルオ
キシターゼに連結したアンチラビットイムノグロブリン
（ＡＢＴＳ）（２２’アジノージー３−エチル（ベンシ
アゾリンスルフオニツク酸）ｂ）正確な生地が存在して
いる時青色を与えるベータガラクトシダーゼラクトシダ
ーゼに連結したアンチゴートムノグロプリン（Ｘ　ｇａ
ｌ　）。

２つの抗体の混合物はアンチボートかアンチラビットの
何れがハイブリッド分子に付着しているかを決定するの
に使われる。その可能性は最終生成物の色によって区別
される。完全反応後の緑色の存在は細胞内に　　１ｌｅ
ｒｐｅｓ　Ｉ遺伝子が存在していることを示す。

完全反応後の青色の存在は細胞内にｌ１ｅｒｐｅｓＩＩ
遺伝子が存在していることを示す。２色の存在は２つの
遺伝子の存在を示す。着色反応がないことは組織内に２
つの遺伝子が存在していないことを示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）もし存在すれば疑核酸とハイブリッドしハイブリ
ッド複合物を形成し、修飾核酸は核酸基の第１段階修飾
によって形成されるように選択された修飾核酸と疑サン
プルとを接触させるａ）段階と、少なくとも前記修飾核
酸の修飾部分と複合化しハイブリッド錯体を形成するよ
うに選択された標識抗体と前記修飾核酸とを接触させる
ｂ）段階と、前記疑核酸の存在あるい存在量の表示とし
て前記標識抗体の存在及びまたは存在量を測定するｃ）
段階からなる疑サンプル中の疑核酸の存在あるいは存在
量を検査する方法。
（２）前記修飾核酸と前記疑サンプルが接触した後に前
記修飾核酸と前記標識抗体を接触させることよりなる特
許請求の範囲第１項記載の方法。
（３）前記修飾核酸は少なくとも１０塩基を有している
特許請求の範囲第１項記載の方法。
（４）前記修飾核酸は少なくとも５０塩基を有している
特許請求の範囲第３項記載の方法。
（５）前記疑核酸は少なくとも１０塩基を有する遺伝子
シーケンスからなる特許請求の範囲第１項記載の方法。
（６）前記疑核酸は少なくとも１０塩基を有する遺伝子
生成物よりなる特許請求の範囲第５項記載の方法。
（７）前記疑核酸は酵素のコードである特許請求の範囲
第１項記載の方法。
（８）前記核酸はバイラルＤＮＡである特許請求の範囲
第１項記載の方法。
（９）前記疑核酸はバイラルヘルペスＤＮＡである特許
請求の範囲第８項記載の方法。
（１０）前記修飾核酸はアルキル化によって修飾される
特許請求の範囲第１項記載の方法。
（１１）前記修飾核酸は０−６グアニジンのアルキニ化
によって修飾される特許請求の範囲第１０項記載の方法
。
（１２）前記修飾核酸はブチル化される特許請求の範囲
第１１項記載の方法。
（１３）前記修飾核酸はエチル化される特許請求の範囲
第１２項記載の方法。
（１４）前記修飾核酸はスルホン化によって修飾される
特許請求の範囲第１項記載の方法。
（１５）前記修飾核酸はニトロソ化によって修飾される
特許請求の範囲第１項記載の方法。
（１６）前記修飾核酸はニトロフェニル化によって形成
される特許請求の範囲第１項記載の方法。
（１７）前記標識抗体は色反応を与えるように選択され
た酵素で標識化されるｂ）段階を行うことよりなる特許
請求の範囲第１項記載の方法。
（１８）前記酵素はペルオキシダーゼ、ベータガラクト
シダーゼ、ハイアルロニダーゼあるいはアルカリフォス
フェターゼの一群から選択される特許請求の範囲第１７
項記載の方法。
（１９）前記修飾核酸は付加反応によって形成される特
許請求の範囲第１項記載の方法。
（２０）前記疑核酸はシングルストランディッドＲＮＡ
である特許請求の範囲第１項記載の方法。
（２１）前記疑核酸は通常ダブルストランディッドであ
り、ａ）段階に従って前記修飾核酸と接触するに先立っ
て少なくとも部分的に変性される特許請求の範囲第１項
記載の方法。
（２２）水銀の使用なしに疑核酸とハイブリッド化し修
飾核酸を形成出来る核酸を修飾するａ）段階と、ハイブ
リッド錯体を形成するように疑サンプルを前記修飾核酸
と接触させるｂ）段階と、少なくとも前記修飾核酸の修
飾部分と複合化し、少なくとも前記抗体の１つが前記修
飾核酸と複合化するように選択された抗体と前記修飾核
酸を接触させるｃ）段階と、前記抗体の存在を知らせる
に適したエージェントで前記抗体を標識化するｄ）段階
と、前記疑核酸の存在あるいは存在量の表示として、前
記標識の存在及びまたは存在量を測定するｅ）段階から
なる疑サンプル中の疑核酸の存在あるいは存在量を検査
する方法。
（２３）ｃ）段階に従って前記修飾核酸を前記抗体に接
触させるに先立って前記修飾核酸を前記疑サンプルに接
触させることよりなる特許請求の範囲第２２項記載の方
法。
（２４）前記核酸はアルキル化によって修飾する特許請
求の範囲第２２項記載の方法。
（２５）メチル、エチルあるいはプロピルニトロソウレ
アのグループから選択された化合物で前記核酸をアルキ
ル化する特許請求の範囲第２４項記載の方法。
（２６）もし存在すれば疑核酸とハイブリッド化し、ハ
イブリッド錯体を形成し、修飾核酸は前記核酸の１段階
修飾によって形成されるように選択された修飾核酸と疑
サンプルとを接触させるａ）段階と、少なくとも前記修
飾核酸の修飾部分と複合化し、前記ハイブリッド錯体の
存在を表示するに選択された同定物質と前記修飾核酸を
接触させるｂ）段階と、前記疑核酸の存在あるいは存在
量の表示として前記同定物質の存在及びまたは存在量を
測定するｃ）段階からなる疑サンプル中の疑核酸の存在
あるいは存在量を検査する方法。
（２７）前記修飾核酸と前記抗体を接触させるに先立っ
て前記ハイブリッド錯体を形成するように前記修飾核酸
と前記疑サンプルとを接触させる特許請求の範囲第２６
項記載の方法。
（２８）もし存在すれば疑核酸とハイブリッド化しハイ
ブリッド錯体を形成し、修飾核酸は酵素作用なしに形成
されるように選択された修飾核酸と前記疑サンプルとを
接触させるａ）段階と、少なくとも前記修飾核酸の修飾
部分とハイブリッドするように選択された標識物質と前
記修飾核酸を接触させるｂ）段階と、前記疑核酸の存在
あるいは存在量の表示として前記標識物質の存在及びま
たは存在量を測定するｃ）段階よりなる疑サンプル中の
疑核酸の存在あるいは存在量を検査する方法。
（２９）前記修飾核酸と前記標識物質を接触させるに先
立って前記ハイブリッド錯体を形成するように前記修飾
核酸と前記疑サンプルを接触させる特許請求の範囲第２
８項記載の方法。
（３０）もし存在すれば疑核酸とハイブリッド化しハイ
ブリッド錯体を形成し、修飾核酸は結合部なしに複合化
する修飾物質を有するように選択された修飾核酸と疑サ
ンプルを接触させるａ）段階を、少なくとも前記修飾核
酸の修飾部分と複合化するように選択された標識物質と
前記修飾核酸を接触させるｂ）段階と、前記疑核酸の存
在あるいは存在量の表示として前記標識物質の存在及び
または存在量を測定するｃ）段階からなる疑サンプル中
の疑核酸の存在あるいは存在量を検査する方法。
（３１）前記修飾核酸と前記標識物質を接触させるに先
立って前記ハイブリッド錯体を形成するように前記修飾
核酸と前記疑サンプルを接触させる特許請求の範囲第３
０項記載の方法。
（３２）修飾核酸を形成するように前記核酸基の部分に
付加し、酵素作用なしに前記疑核酸とハイブリッドする
ダブルストランディッド核酸を修飾するａ）段階と、前
記疑サンプルと前記修飾核酸を接触させるｂ）段階と、
少なくとも前記修飾核酸の修飾部分と複合化するように
選択された標識物質と前記修飾核酸を接触させるｃ）段
階と、前記疑核酸の存在あるい存在量の表示として前記
標識物質の存在及びまたは存在量を測定するｄ）段階か
らなる疑サンプル中の疑核酸の存在あるいは存在量を検
査する方法。
（３３）前記修飾核酸と前記標識物質を接触させるに先
立って前記ハイブリッド錯体を形成するように前記修飾
核酸と前記疑サンプルを接触させる特許請求の範囲第３
２項記載の方法。
（３４）もし存在すれば、疑核酸とハイブリッド化しハ
イブリッド錯体を形成し、修飾核酸は前記核酸基の１段
階修飾によって形成されるように選択された修飾核酸の
貯蔵物ａ）と、前記ハイブリッド錯体を形成するための
前記疑サンプルと前記修飾核酸とを接触させる手段ｂ）
と、少なくとも前記修飾核酸の修飾部分と複合化し前記
抗体は前記抗体の存在を知らせるに適した標識物質で標
識化されるように選択された抗体の貯蔵物ｃ）と、前記
修飾核酸と前記標識抗体を接触させる手段ｄ）と、前記
疑ヌクレオチドの存在あるいは存在量の表示として前記
標識抗体の存在及びまたは存在量を測定する手段ｅ）か
らなる疑サンプル中の核酸の存在を確認するための装置
。
（３５）ＤＮＡと接触する間に１段階付加によって修飾
される少なくとも１つの修飾された塩基からなり、コン
プレメンタリーＤＮＡストランドとハイブリッドするに
適した単一ストランドのＤＮＡ分子遺伝プローブ。
（３６）特許請求の範囲第３５項の分子遺伝プローブと
複合化するように形成された標識抗体。
（３７）ＲＮＡと接触する間に１段階付加によって修飾
される少なくとも１つの修飾された塩基からなり、コン
プレメンタリーＤＮＡあるいはＲＮＡストランドとハイ
ブリッド化するに適した単一ストランドのＲＮＡ分子遺
伝プローブ。
（３８）特許請求の範囲第３７項の分子遺伝プローブと
複合化するように形成された標識抗体。
（３９）疑ポリヌクレオチドとハイブリッド出来る修飾
されたポリヌクレオチドを形成するために一段階でポリ
ヌクレオチドの塩基上の部分に付加するステップよりな
る修飾分子遺伝プローブを形成する方法。
（４０）疑ポリヌクレオチドとハイブリッド化できる修
飾されたポリヌクレオチドを形成するために水銀を使用
することなしにポリヌクレオチドの塩基上の部分に付加
するステップよりなる修飾分子遺伝プローブを形成する
方法。
（４１）酵素作用なしに修飾された二重ストランドを形
成するために前記二重ストランドのポリヌクレオチドの
塩基の部分に及び修飾遺伝プローブを形成するために少
なくとも部分的に変性された前記修飾二重ストランドポ
リヌクレオチドの塩基の部分に付加するステップよりな
る修飾分子遺伝プローブを形成する方法。
（４２）結合部なしに塩基に直接付加される特徴部分に
よって修飾される少なくとも１つの塩基を含み、コンプ
レメンタリポリヌクレオチドとハイブリッドするに適し
た単一ストランドの分子遺伝プローブ。
（４３）修飾核酸の各々はハイブリッド錯体を形成する
ために疑核酸の同一性により前記疑核酸とハイブリッド
するように選択され、多数の前記修飾核酸と疑サンプル
を接触させるａ）段階と、ハイブリッド錯体を形成する
ために前記修飾核酸の各々の少なくとも修飾部分と複合化するように選択された標識抗体の複合物と前記
修飾核酸を接触させるｂ）段階と、少なくとも１つの前
記疑核酸の存在あるいは存在量の表示として前記標識抗
体の存在及びまたは存在量を測定するｃ）段階よりなる
疑サンプル中の疑核酸の存在あるいは存在量を検査する
方法。
（４４）ｂ）段階に先立って前記修飾核酸を初めに非標
識抗体と接触させることよりなる特許請求の範囲第１項
記載の方法。