PT98864B - Processo para a purificacao cromatografica de insulinas - Google Patents
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• r e ! ···'·! de solvente organi.rua) A ca;'y<i de proteínas · ’ nesip i uaeo !: !.· t.-i Π I" O · π ι > M ι ·! ι 3M p/lO L de VO |..UI'|ltí da r ' ι 1 a u . .. ι i- p: o......1 * ·. de pt1 r i 3i.e, i rdn af-è agora : " ;i. u i ; . ut- ilisam haaqucrvtemen te os srd.ventos rciLi ti-vaim-adu;;. d ·ν i >. ··' ..... ......i ·!!''·''·· '· ' ι í i laboratório ( ac-etoniti' ilo) componei 1 tes tarnpao d i.· 1 '<'!!' itica 1 , i sa ..is 1 dl te tralq ui] amónia, su.[.tnnatos de ai· j ui lo , i . e: - a f 1 u 0 r.....a e e 10 n a , d; ! ι I Μ. a .....a.etãtn { i 2 2. Kroei,:i et · ι I Ί j:!ií ; .κι.. . ϋ d , (1.9:.19)., 49 d i ι . No osso da In ·· - i, '!! . oorit^ndo rn > <<.'. ;u· ί ι: > d .·!· · de ui! ι·.; ·. · · ·· ·. .· ·:· . ι forma de subotânci as semelhantes a insu l i.ne .. . · te e h r:· : nâo eonelusein α uma sepai apao prepa:''ativa a ah i. s f' .=; t e; :i.. a nn 111 e se ret v?; e α q uan t ;i. t!a d e , r e r: r i i mento > :l a componente p;- i.ne.i ..pa J.. e recupei-agào +:.0tal. ( J .. P ivo er !1 1113. Lntuok ! 1 :i 1: . mi 28B, (1983), 112.....119, Peter et al...... /3.
Chrom.. , 49()3 (1987j, 43 9' ' ! .
As insulinas provenientes de transfnr mações químicas previas, como p .. e . resultan tes de cisão cl· 1 esteres em meio fartemente ac i do ou de procescuc · 11. 1 mo · o d e I t; . i n } i d.! > a o .. > I e p: u e e s s o s d e p1; 1.. i i caça e fio r cri s taliãiçdu , nu ou tros semelhantes , contem na uni.nr parte d· · . 1 u 3 o ui p i j · t o s o o tu: n rn 1.1 α π t e s c ο 1 η 1 > γ o p; 1 e 1I a 1 i e s s e rn e I 11 ante 3 .. Podem . > : pui'·3..tiçadas por meio de r.vnmatooraf i.a do permutai 0 1 ...... a ta avos da sol ecoa o de determinados valores do p! i . 1 · i ' ' eaisbuin cíiterfTiças suisi.oi.en tes nas carpas e( ee triras í ! 18 4 129 38Vi).. A desvantagem doaste método reside no efeito de eluieao, e prir tanto nas percas de cornpoãhns Importantes ms sobi enadantes ciciando do tratamento das precipitardes, ee tempn;;;· de clolu rol ativa mente pru l..on ciados ou no lacto de 1 reouper'ação total, e portanto o rendimento, serem mai.s 1 · >· a 1 'de .
As separações prepar·"11 i.vas fO Ιριπ ser con seguidas em pi'" Lnf. ι p 10 através do aumenta do f :rin ! - jr j r|- j so 1 mí 1 , cia qu -11') 1 vi rU uJr·. ' em carq.i e do volurne de (-··' ! 11.t.'iiρ·- cjf π·-·.' o
f passa através da coluna.. As quantidades de solventes orgânicos necessárias situam.....se p.e„ para colunas com diâmetros >20 cm, na ordem dos rn^,. Os solventes utilizados para a l-IPLU analítica (p.e. acetonitrilo, DMF, metanol, dióxido, etc..) são toxicos, pelo que a aplicação destes métodos ã escala preparativa industrial exige dispendiosas medidas de pr o tecrçao.. 0 objectivo da presente invenção era o desenvolvimento de um processo para a purificação cromato-grática de insulina e derivados da insulina, o qual mantivesse inalterada a actividade biológica das insulinas, atingisse elevados graus de pureza com um único passo cro..... matogrático, conseguisse uma regeneração da fase estacionária de siiicagel sem procedimentos de enchimentos morosos e permitisse a utilização de solventes não tóxicos, tornando desta forma possivel urna produção preparativa â escala industrial..
Descobriu.....se agora urn processo que permite a purificação de insulina e derivados de insulina através de crornatografia sobre siiicagel modificada lipófila, com solventes aquosos, tarnponados, que contém solventes orgânicos rnisciveis com água,' caracterizado por nos solventes tarnponados se encontrarem dissolvidos ióes híbridos ou o pH do solvente se situar na proximidade do ponto isoeléctrico da insulina ou derivado de insulina a purificar e se encontrarem ioes híbridos..
Surpreendentemente, a presença de ioes híbridos ou a crornatografia com um pH do solvente situado na proximidade do ponto isoeléctrico da insulina ou derivado da insulina a purificar e a presença de ioes híbridos, resulta não sõ numa boa separação entre os compostos desejados e as impurezas, mas também a uma boa separação das proteínas da * fase estacionária (siiicagel modificada lipófila) .. és sepa~ .... 3 -
rações conseguidas permitem a pur i. f luaçeíu mesmo de soluções de insulinas; f orternente contaminadas curn componentes muito semelhantes a insulina, corno p.e. a separaçáo de A21.....desa- rnido.....insulina da insulina e de derivados da insulina. Para além disso, a fácil separaçáo das proteinas da fase solida permite atingir prolongados tempos de conservação do enc:hi~ mento das colunas, bem corno urna elevada taxa de recuperação total das insulinas. A presente invenção refere-se pois a urn processo para purificação de insulina e/ou derivados da insulina através de erornatografia sobre siiicagel modificada lipõfila, corn solventes aciuosos, tarnponados, ciue contêm sol..... ventes orgânicos rniscíveis corn agua, caracterizado por nos solventes tarnponados se encontrarem dissolvidos iões híbridos ou o pH do solvente se situar na proximidade do ponto isoeléctrico da insulina ou derivado de insulina a purificar e nele se encontrarem presentes iões híbridos.
Mo processo a que se refere a presente invenção podem ser utilizada® todas as insulinas, como p.e,. insulinas de todas as espécies de origem animal óu humanas, precurores da insulina, corno p.e. prõ--insulinas ou pré..... insulinas, ou insulinas recornbinarvtes ou derivados da insulina, expressos por rnicroorganisrnos geneticamente modificados. Para além disso, podem ser utilizados também derivados da insulina preparados p..e. através de derivatizaçáo quirnica ou enzirnática, p „ e. des Phe -Bl--insulina, insulina-β ceteno·- .....sulfonato, diarginina~insulina(B31, B32), monoarginina-insu- lina ou difenilalanina-insulina(B31, B32) (US 4 801 8S2) .. - 4 -
De preferência são utilizados os deriva.....
dos da insulina da formula geral I $ — -$ A2.1 Cadt· d., a A Asn - OH 1 1 (I)
B2 I_ Vai Cadeia B 1:329 .ys ]— R30.....Xn na qual:
Rl- · representa urn radical de um L-aminoácida geneticamente codificavel; X representa um grupo hidrõxi, um grupo orgânico fisiologi..... carnente tolerável, com carácter básico, com até 50 átomos de carbono, um L.....aminoácido geneticamente codificavel cuja função carboxilica terminal eventualmente presente se pode apresentar livre, sob a forma de função éster, sob a forma de função arn ida „ sob a for ma de lactona ou reduzida para CH2OH:; n representa 0 a 10; Y representa hidrogénio ou L-fenilalanina: e as cadeias A e B representam a sequência da insulina animal ou humana. hm especial são utilizados derivados da insulina da fórmula geral I, na qual: pd0 representa L.....alanina ou L-treonina; e X representa um ou rnais arninoácidos de entre o grupo L.....ar..... g i. n i n a, L—! 1. s i n a o u L—f e n i. 1 a 1 a n i n a,
As insulinas ou derivados da insulina podem ser utilizados tanto num estado relativarnente impuro, corno 'também numa forma previarnente purificada (p„e. por meio de cyomatografia sobre gele)„ Mesmo após múltiplas cristã..... ..... 5 ....
libações e bani bem após crornatograf ia ©obre geie, a .insulina apresenta ainda corno impurezas compostos semelhantes a insulina. como pesos moleculares muito idênticos, que no ©eu estado de carga, se distinguem uns dos outros e da insulina em caso de selecçao adequada do pH, mas que formam complexos corn a insulina (US 4 129 560), Exemplos de tais compostos sao as desarnido.....insulinas, ar gin in a-in sulin a e diarginina.....insulina, ésteres etílicos da insulina e outras..
Por silicagel modificada lipõfila compre-ende-se uma silicagel aplicada sobre uma matriz hidrôfoba.
Exemplo© de uma matriz hidrõfoba sao o© alcanos corn um corn..... primento da cadeia de 3 a 20 átomos de carbono,, Materiais preferido© como silicageles modificadas lipófilas sao por exemplo::
Nucleosil, firma Macherey 8; Magel:: materiais esféricos e nao esféricos corn diferentes dimensões do grão até 45 j.irn, dimensão dos poros de 100 A, modificados com 68 ou C18
Lichroprep, firma Merck:: materiais nao esféricos e esfé..... ricos com diferentes dimensões do grão até 40 jirn, dirnensao dos poros de 60-250 A, modificados com C8-C18:; Lichrospher Select B, firma Merck: material esférico com uma dimensão do grão até 25 j.im, modif icado corn 08:;
Waters Prep, modificado com 018, 50.....105 jjrn, não esférico, dimensão dos poros de 100 A;
Zorbax Prol.0, firma DuPont:: modificado com 08, 10 jirn, esférico, dimensão dos poros de 100 A;
Krornasil, firma EKA Nobel: modificado com 04, 08-018, até 16 jam, esférico, dimensão dos poros de 100, 150 ou 200 A. Iões híbridos são compostos que podem absorver protões ou também eliminã-los, i „ e.. „ formam catiÕes em solução ácida e aniões em solução alcalina, como p.e. at~ -arninoácidos, betai na ou derivados da betai na. Iões híbridos preferidos sao a glicina, glutamina ou betaina (N.....trimetil- -•glicina) .. Dá.....se especial preferência à glicina.. ..... 6 .....
0 ponto isoeléctrico (PIE) de urna insulina ou de um derivado da insulina representa o pH da solução de insulinano qual o numero de cargas catiònicas e de eargas aniònicas da insulina dissolvida ê igual a zero. por exemplo, o PIE da insulina do porco situa.....se entre pl-l b,3 3 U4 (li. Neurabh, |<.. Bailey, Protein Hormones, VoJ.....1.1/A, Fhe
Proteins, pag.. 636).. Corn a expressão "na proximidade do ponto isueléctr ico são preferi., dos em 'especial valores do pli situados cerca de 1, unidade do pli acima ou abaixo do PIE da insulina a purificar. Dê-se especial preferência aos valores do pli situados até 0,5 unidades do pli acima ou abaixo do Pli:::...
Os meios da eluição contem um composto tampão, por fornia a manter constante; o seu pli. Compostos tampão adequados são conhecidos da' literatura, p.e. fosfates, sais alcalinos ou de terras alcalinas, tais corno citrato de sódio ou acetato de potássio, citrato de amónia, acetato de amónia» sulfato de amónia ou cloreto de amónia. Para alèrn disso, os eluentes contêm solventes orgânicos rnisciveis com agua, como p.e., álcoois, cetonas, acetato de rnet 1.1.o, dioxano, dimetil.....sulfóxido ou acetonitrilo. Dá-se preferência ao© álcoois, tais corno o n..... ou iso—propanol, metanol, ébano! uu acetato de metilo. A concentração dos solventes orgânicos rnisciveis com água situa-se entre 1 o 90%, de preferência entre 10 © 60%, e em especial, entre 1.0 e 35% „ A concentração dos compostos tampão situa-se entre 1 rnMol/i e 2Moi./i., relativamente â ègua como solvente, de preferência entre 2b mlvlo!/1 e | Mo 1/1« A concentração dos ibes híbridos pode variar dentro de limites bastante alargados. Quantidades v a n t a j o s a s s i t u a rn..... se entre 10 rnMoi/i e 1 Mol/i, reiativamente á água corna solvente, de preferenciei entre 20 rnlvlo..!../.1 © 500 rnMol/l..
*· A temperatura durante a cromaWafla situa-se entre U»U e blO»C. de preferência entrp 1B„R . 30.c, e em especial entre 1S<>C e 20«C. A pressSo durante a crornatografia mantém-se praticamente constante. A cromato-grafia pode ser realizada com pressões diferentes, p.e. a crornatografia pode ser realizada com urna Pressão de 5.....400 bar, em especial de 20 a 100 bar. A carga das colunas, a crornatografia e eluiçao das insulina© e derivados da insulina faz-se pelos processos técnicos usuais conhecidos,, A carga da coluna com a solução de insulina a purificar faz-se de preferência com soluçoes tampão aquosas alcoólicas ou só aquosas. A solução de insulina tem urna percentagem de proteínas situado ern 1 e 10%, de preferência de 3%. A eluiçao das insulinas de acordo com a presente invenção faz.....se com uma concentração constante dos compostos tarnpao (isocratico) ou também corn modificação da percentagem de solvente orgânico miscivei. corn água presente na solução tarnpao,. A alteração da percentagem de solvente orgânico faz-se de forma que a concentração do solvente orgânico utilizado aumente em função do volume de eluiçao, de preferência de acordo com urna relação linear,, A separação da insulina dos eluados após a crornatografia faz-se através de precipitação corn zinco ou através de cristalização.. Se desejável, pode previamente evaporar.....se grande parte do solvente da solução por meio de destilação no vácuo, ou a sua concentração pode ser reduzida através de diluição com água. De qualquer forma, a concentração de solvente antes da cristalização deve situar..... se nos 10% ou abaixo deste valor, por forma a manter o teor de proteína no sobrenadam te 1 !d0 rng/1.. Os pr eoipi Lados de insulina assim obtidos podem ser isolados por rneio de decantação , centrifugação ou filtração, e depois secos. - 8 .....
a que se 0 Processo a que se refere a presente invenção é adequado na o para a cromatografia ana.liti.ca, mas também para a crornatografia preparativa, em especial, se o processo a que se refere a presente invenção fôr realizado corn urn aparelho de HPLC preparativa. P°r "crornatografia preparativa" entende -se um processo de purif j caçgc, qu0 tem por objectivo a obtenção de composto© puros e não apenas a sua analise. A quantidade de composto puro pode variar dentro de limites alargados, p.e. de 1 mg a 50 kg, de preferência entre 50 mg e 15 kg.
Nos exemplos seguintes descreve.....se em pormenor o processo a que se refere a presente invenção. As indicações de percentagens referem-se ao peso, salvo indi..... cação em contrário.. EXEMPLO 1
Tampão A:: sulfato de amónia 0,2IVI, glicina 0,1M, citrato de sõdio 0,05M, ph 5,5 , purarnen te aquoso Tarnpao B:: sulfato de arnõnia 0,1IVI, glicina 0,1M, citrato de sódio 0,05M, ph 5,5, ãgua/n.....propanol na proporção de 1::1; A b s o rv e n t e:: N u o 1. e o s i 1. C1.8, 1.5 ···· 25 ji rn, e s f é r i. c o, d imensa o d o s poros 100A, Firma Macherey & Magel, Dtiren; Dimensões da coluna:: 40 mm x 250 mm, A carga da coluna faz se com 3,5 g de insulina humana (Hl) obtida a partir da cisão com ácido t r i f 1 u o r.....a c é t i c o d e e s t e r / é t e r d i. - 'ter t.. ·- b u t i I. ::i.. c o d e “L n s u 1.1. n a humana.....B30 ..... com um teor de proteína de 79,1%.. A eluiçao da insulina faz.....se misturando as soluções A e B num sistema misturador com bornba de alta pressão adequado, de modo a produzir um gradiente de propanol de 14 a 20%.. A eluiçao da - 9 ····
insulina *az.....se corn aprox. 17,5% de prapann"| passados 23 minutos, bornbanddo corn 46 rnl/rnin..
Após fraccionamento e isolamento da insulina humana cristalizada (III) obtém í ’> t-t? i_ i_ i f] o o rn μ t..i £> b ο ο ο ι π 3?% de proteínas, corn urn rendimento de 88,5# da fracçao principal, e urn rendimento de 7,5% na fraeção secundária, com um teor de proteína de 85,7%.. A recuperação total é, pois, de 96,0% da insulina introduzida. EXEMPLO 2 I arnpáo A: sulfato de amónia 0,1M, glicina 0jip|i citrato de so d i o 0,025M, ph 5,5, pur a rn e n t e aq uos o; I arnpáo B: sulfato de amónia 0,05M, glicina 0,1M, citrato de sódio 0,02.5H, ph 5,5, agua/n.....propanol na proporção de 1:: 1.
Absorventedslucleosil C18.....P, 15.....25 jjiti, esférico, dimensão dos poros 100A, Firma Macherey & Nagel Dimensões da coluna:: 40 rnrn x 250 mm. A coluna é carregada corn 7,0 g de insuli..... na humana (III) (teor de proteína 86,1%), obtida a partir da cisão de éster do éster/éter di.....tert.--buti.lico de insulina hurnana, sob a forma de urna soluç:ao a 3% ern tampão de glicina 0,1H/HG1, ph 2,8, corn o auxilio de bomfoa de alta pressão. Ern seguida procede.....se â eluição corn as soluções tampão acima descritas, sob pressão, corn gradiente de n.....propanol. Ao longo de 60 minutos, a concentração de propanol aumenta de 14 para 17,5%. Após fraccionamento e isolamento peio processo acima indicado, obtém-se um composto corn 98,?% C|© proteínas. 0 rendimento da insulina humana purificada e cie 91% da insulina introduzida.. EXEMPLO 3
Tampão A:: sulfato de amónia 0,UvU glxcxna 0,1M, citrato de * sódio 0,025M, Ph 5,5, puramente aquoso; - 10
I arnpão B ;; sulfato de amónia 0,05M, glicina 0,1.IVI, citrato de sódio 0,025M, ph Ei,5., á g u a / n ·-· p r o p a η o 1 n a p r o p o r ç a o de 1:1;
Absorvente::Lichr:i..sp|--,er Select B, C8, 15-25 jjrn, dimensão dos poros 60AFirma Merck Dimensões da coluna:: 50 mm x 250 mm. A coluna é carregada com uma soluiçao de 10g de mistura de peacção da urnarnidaçao (?) de insulina de porco com tri.psi.na, dissolvida em 200 rnl de tarnplo de glicina 01M/HC1, pH 2,8. Ao longo de 120 mi.ru.itos, com um fluxo de 40 ml/min e urna subida da concentração de propanol de 14 para 30%, sáo eiuidas as diferentes componentes proteicas„ Após cristalizaria o ou precipitação e secagem obtêm-se como fracção principal, êster/éter di.....tert.......butiltreoninico de insulina humana.....1330 com urna pureza de >97%, com urn rendimento de 93% r e 1 a t i v a rn e n t e é i n s u 1 i n a i n t r o cl u z i d a .. EXEMPLO 4 I arnpão A:: cloreto de sódio 0,XM, glicina 0,1M, acetato de sódio 0„025M, ph 5,5, puramente aquoso:; I arnpao B: cloreto de sódio 0,05M, glicina 0,1M, acetato de sódio 0,025M, ph 5,5, água/n.....propanol na proporção de 1:1;
Absorvente: Zornax Prol0, C8, 10 j.rrn, Firrna DuPont;
Dimensões da coluna: 5 crn x 25 crn.. São carregados na coluna 7,5g de Hl obtida a partir da cisão com acido trifluoK—acético de és ter /é ter di.•••tert. -butiltreoninico de insulina humana~B30, em .100 ml soiução de glicina 0,1M/HC1, por meio de urna bombd, e elU;-[c|oS com urn fluxo de 80 rnl/rnin. A concentração do tampão 8 Ementa ao longo de 80 minutos de 18 para 25%. 8 lempu de (Rt) é de aproxirnadarnente 37 minutos. Da C /Sr -*'Uo isolararn-se apôs cristalização e secagem 36,8% de Hl relativarnente á quantidade introduzida, corn uma 11 -
2,2% de Hl com pureza de >97%, e a fracçao secundária contém uma pureza <50%.. EXEMPLO 5
Tarnpao A:: sulfato de sódio 0,2M, glicina 0,1M, acetato de arnõnia 0,03M, ph 5,5, acetato de me tilo a 10%; Tampão 13:: sulfato de sódio 0,05M, glicina 0,1M, acetato de amónia 0,03lvl, ph 5,5, acetato de me til o a 10%:; Absorvente:: Krornasil C8, 1.3 j.im, dimensão dos poros 100A, F'irrna EKA Nobel;
Dimensões da coluna:: 5 cm x 25 crn.
Com o auxilio de tampão de glicina 0,1IVI/|-IC1, 'são carregados na coluna 8g de insulina de bovino por litro de volume da coluna, equilibrada com 30% de tampão B„ A concentração do tampão 13 aumenta ao longo de 90 mi riu tos para 80% (=18% de acetato de me til o) .. A insulina de bovino ê eluxda após 65 minutas com urna pureza de >97,5% na fracçao principal, (rendimento de 63,5%), e é precipitada com cloreto de zinco após diluição com água.. A recuperação total. é de 92,5%.. EXEMPLO 6
Tampão A:: sulfato de amónia 0„1M, glicina 0,111, acetato de sódio 0,025M, ph 5,5, n.....propanol a 5%;
Tampão Eh: sulfato de amónia 0,05M, glicina 0,1M, acetato de sódio 0,025M, ρh 5,5, ãgua/n propanol na proporção de 1:1;
Absorvente: Krornasil C8, 13 j.irn, dimensão dos poros 100A, Firma EKA Nabal:;
Dimensões da coluna:: 5 cm x 25 crn,. A coluna é carregada com 4g (=8 g/1) de insulina humana obtida a partir da cisão com ácido trifluor-- a c é t i o o d e é s t e r / ê t e r d i.....t e r t.....b u t i 11 r e o n i n i c o d e i n s u 1 i n a hurnana-1330, com uma pureza de aproxirnadarnente 92%.. Com urn - 12 .....
gradiente de 18 para 25% de tarnpg0 β formado ao longo de 90 minutos, a insulina humana © ©] u::j c|a ap6s 45 minutos com uma pureza de >97% na fracçao Pr-incipal (rendimento 91,8%) e 80,5% na fracçao secundária (rendimento 4,7%).. EXEMPLO 7 I arnpáo A: sul í a Lu de amónia 0"L[v| ^ glicina 0,111, acetato de sódio 0,026M, ph 5,5^ n.....propanol a 10%;
Tampão 8: sulfato de amónia 00SIV1glicina 0,1M, acetato de sódio 0,025’Μ, Ph 5,5 > agua/n propanol na proporçáo de 1:1;
Absorvente:Krornasii. U8, 13 jarn, dimensão dos poros 10®A, Firma EKA Nobel
Dimensões da coluna: 1.0 cm x 40 Crn„ A coluna é carregada com 18 g de insulina de porco em 1·*8 1 de tampão de? glicina 0,1 ΙΊ/HCl, pH 3,0, com
n.....propanol a 5%, 0 gradiente evoluiu de? 9% de tampão B (<1.3,8% de n propanol) para 11% de tampão B (=14,4% de rv '-•propanol) ao longo de 70 minutos.. A insulina de porco é ei. ui d a apos 50 minutos com urn teor de proteínas de >98% na fruccão Princ::Ípai (rendimento 89%).. A recuperação total foi de 38,8% C|a quantidade utilizada. EXEMPLO 8 I ampà'o A:: cloreto de amónia 0,2M, glicina 0,1M, citrato de sódio 0,025M, n-propanol a 5%, ph 5,5;
Tampão 13; corno o tampão A, mas com adição de 50% de n— -propanol;
Absorvente; Kromasil C8, 13 jim, dimensão dos poros 100A, Firma EKA Nobel;
Dimensões da coluna: 50 rnrn x 250 mm.
Dissolver 4,0 g de insulina humana prepa-' rada por técnica genética (teor de proteina 89,5%) em tampão de glicin^ 0^i|v|v ph 3,0, sob a forma de solução proteica a - 13
2%, e carregar a coluna com o auxilio de urna bornba de alta pressão.. A eluição è feita através de urn gradiente linear de 13% para 16% de n-prapanol, ao longo de 70 minutos, com um fluxo de 80 m 1 /min Apõs fraccionarnen to e orista 1 izaçao obtém-se na fracçao principal uma insulina humana com um teor de proteina de 98%, ® com um rendimento de 93%. A recuperação bobai é de 98% relativamente è quantidade introduzida.. EXEMPLO 9
Tampão A:: sulfato de amónia 0,2IVI, glicina 0,1M, citrato de a rn ó n i a 0,025M, e t a η o 1 a 5 %, p h 5,5 Tampão B:: como o tampão A, mas com adição de 50% de ©tanol; Absorvente:: Krornasii C8, 10 j.nn, dimensão dos poros 100A, Firma ΙΞΚΑ Mo bei, Suécia :;
Dimensões da coluna:: 50 mm x 250 mm.
Dissolver 4,5 g de insulina humana preparada por técnica genética (teor de proteina 86,2%) ern 250 ml de tampão de glicina de pH 3,0, e carregar a coluna com o auxilio de bornba.. Para crornatografia das proteínas, produzir com o auxilio de duas bornbas de alta pressão, um gradiente linear a partir dos dois tampões A e B. A eluição faz-se ao longo de 100 minutos, com uma concentração de etanol de 33% e com um fluxo constante de 80 ml/rnin.. Após fraccionarnento e cristalização obtêm.....se na fracçao principal uma insulina humana corn um teor de proteina de 96%, e com uma taxa de recuperação total de 93% relativamente à quantidade de composto introduzida EXEMPLO 10
Tarnpao A:: cloreto de amónia 0,2M, glicina 0„1M, citrato de sódio 0,02511, acetato de rnetilo a 1.0%, ph 5,5; Tampão B: concentração salina idêntica à do tampão A, mas corn adição de 20% de acetato de rnetilo:; . Absorvente:; Krornasil 08, 10 j.irn, dimensão dos poros 100A, Firma EKA Mobel.Suécia “ - 14 -
Para a crornatografiadissolver 4,6 9 cie insulina humana bruta., proveniente cio tratamento cie urna insulina preparada por técnica genética, 200 ml de tampão de glicina aquoso, e depois introduzir nurna coluna de HPLL com 50x250 mm., com o auxiliei de bornba. Previamente, equilibrar o material da coluna através da mistura dos tampões A e 6 com o auxilio de duas bombas de alta pressão, por forma a obter urna concentração de acetato de rnetílo de 13% de acetato de rnetilo.. Após a introdução, proceder à eluição cia insulina humana através · de um gradiente linear de 13% para 1de acetato de rnetilo ao longo de 90 minutos,, 0 isolamento do composto principal, faz.....se por rneio de cristalização a partir da solução cie eluição. Obtêm.....se assim 3,8 g de insulina humana com um teor de proteína de 98%.. A taxa de recuperaç:áo total ê cie 90% relativamente a quantidade de composto introduzida,. / EXEMPLO 11
Tampão A;; sulfato de amónia 0,2M, betaina 0,1Μ, acido cítrico 0,05M, ph 5,5, com MaOH (somente aquoso); tampão B:: sulfato de arnónia 0,l.lvL betaina 0,1IVI, acido cítrico 0,05M, ph 5,5, com MaOH (água/isopropanol 1:1);
Absorvente:Nucleosil 018, 15-25 jirn, esférico, 100A;
Dimensões da coluna:: 40 mrn x 250 mm.
Fluxo 45 ml/rnin. A coluna é carregada com 3 g de insulina humana (teor de proteína 79%), obtida a partir da cisão de éster/êter di-tert,......butílico de insulina humana, sob a forma de uma solução a 3% em tampão de betaina 0,1M/HC1, pH 3,0, corn o auxilio de urna bornba de alta pressão. Lrn seguida procede.....se à eluição isocrática com o sistema tarnpao acima descrito, com 44% de tampão B, 0 tempo de retenção é de aproximadamente 35 minutos.. Após fraecionarnento obtém.....©e na
fracçao principal 98,1% de insulina humana, com um rendimento de 80,5%.. A recuperação total é de 90,5%.. EXEMPLO 12
Tampão A:: sulfato de amónia 0„1M, ácido glutaminico 0,111, ácido cítrico 0,0511, ph 5,5, com Na OH (somente aquoso) ;
Tampão B :: sulfato de amónia 0,1. Ivl, ã c 1. d o g 1 u t a rn £ n i c o 0,111, • ácido cítrico 0,0511, · plH 5,5, com MaOI-1· (á g u a / i s o p r o p a η ο 1 1:: 1) :;
Absorvente ::Nucleosil C18---P, 15.....25 j.im , esférico, 100A:;
Dimensões da coluna:: 50 rnrn x 250 mm„
Fluxo 60 rnl/min .. A coluna é carregada com 6 g de insulina humana (teor de proteína 73%), obtida a partir da cisão de éster do éster/éter di-tert.-butílico de insulina humana, sol::) a forma de uma solução a 3% em ácido acético 0,111, pH 3,0, com o auxilio de uma bornba de alta pressão,. Em seguida procede.....se à eluição com o sistema tampão acima descrito, com um gradiente de 25%.....28% de tampão B.. 0 tempo de retençrão é de aproxirnadarnente 25 minutos.. Após fraccionamento obtém.....se na fracçao principal. 98,6% de insulina humana, com um rendimento de 65%. A recuperação total é de 88,5%. EXEMPLO 13
Tampão Â: sulfato de arnõnia 0,1511, ácido trietil.....arnina 0,111, pH 6,5 com ácido sulfurico (somente aquoso);
I" a rn p á o B :: s u 1 f a t o d e a rn ò n i. a 0,0 811, t r i e t i 1 · a rn 1 n a 0,0 511, p I I 5,5, corn acido sulfurico (água/2.....propanol 1:1);
Ab s orve n t e:: N u c 1 e o si 1. C18 P, 15 ···· 25 j.r rn, e s f é r 1 c o , 10 0 A ;
Dimensões da coluna:: 50 mm x 250 rnrn..
Fluxo 60 rnl/rnin ..
Depois de carregar a coluna com 5 g de insulina humana obtida a partir da cisão corn ácido trifluor..... 16
acético do éster/éter di.....tert.. -butiltreonínico de insulina humana, sob a forma de uma solução a 3%, eluir com um gradiente de tampão B entre 32% e 42%.. 0 tempo dfô retenção é de 40 minutos.. Após fraocionamento © cristalização obtém.....se na fracção principal 72%, com urn grau de pureza de 92,7%.. A recuperação total é de 76% da c|uantidade introduzida. EXEMPLO 14
Tampão A:: ácido cítrico 0,1M. ®ulf*to de arnõnia 0,2M, pH 2,ϋ, com ãc.....Ldu t.....Luridi iuu (somente aquoso);
Tampao B: ácido cítrico 0,Uvl, sulfato de arn5n:;i a 0,;;f.|v|PH 2, b, c o rn a c i d o '.....I·· o r í d y i c u (a g u a / n.....p r 0 p a ,··, 0 χ 11)
Absorvente:Nucleosil C18, firma Macher©y & Nagel;
Dirnenscíes da coluna: 40 mm x 250 mrn.
Fluxo 45 ml/rnin..
Depois de carregar a coluna com 3 g de insulina humana obtida a partir da cisão com ácido trifluor™ acético de éster/éter di-tert.-butiltreonínico de insulina humana, sob a forma de uma solução a 3% ern tampão de glicina 0,1M, pH 3,0, eluir com um gradiente de tampão 13 entre 34% & 35%.. 0 tempo de retenção é de 45 minutos.. Apos fracciona..... mento, cristalização e secagem isolam-se na fracção principal 57% da quantidade introduzida, com um grau de pureza de 94,8%, e 16% na fracção secundária (grau de pureza 84%).. EXEMPLO 15
Tampão A: ácido cítrico 0,1M, sulfato de arnõnia 0,2M, pll 3.5, com ácido clorídrico (somente aquoso);
Tampao B: ácido cítrico 0,1M, sulfato de amónia 0,1M, pH 3.5, c o rn ácicl o c 1 o r i d r i c o (ãgua/n.....prapanol 1:: 1);
Absorvente;Nucleosil C18, Firma Macherey & Nagel;
Dirnenscíes da coluna: 40 mrn x 250 mm.
Fluxo 45 rnl/rnin „
- 17
Carregar a coluna como no exemplo 14. 0 tempo de retenção é de aproximadamente 40 minutos.. Após fraccionarnento, cristalização e secagem isolam.....se na fracção principal 51% da quantidade introduzida, com um grau de pureza de 97,5%, e 4% na fracção secundária (grau de pureza 68%) . EXEMPLO 16
Tampão A:: Tris 0,1M, glicina 0„1M, cloreto de arnonia 0,1M, pH 8,5, com ácido clorídrico (somente aquoso); Tampao B:: Tris 0,'I.M, glicina 0,1M, cloreto de amónia 0,1M, pH 8,5, com á cido c1or ídrico (água/n propaηo1 1:1):
Absorvente: Kromasil 08, 13 j.im, 100A:;
Dimensões da coluna:: 50 rnrn x 250 mm.
Fluxo 60 rnl/rnin .
Carregar a coluna equilibrada com 33% de tampão B, com 8 g de insulina humanei obtida a partir da cisão com ácido trifluor-acético (ver exemplo 14), sob a forma de urna solução a 3% em tampão Tris 0,1.11, pH 8,5. A eluição faz..... se passados aproximadamente 35 minutos. Após fraccionarnento e cristalização obtêm-se na fracção principal insulina humana a 96,6%, com um rendimento de 86%. A recuperação total foi de 95%. EXEMPLO 17
Tampao A; cloreto de amónia 0,1M, ácido cítrico 0,02511, pt-l 5.5, com amoníaco, n.....propanol 5 vol.....%;
Tampao 13:: cloreto de arnonia 0,1M, ácido cítrico 0,025M, pH 5.5, com amoníaco, n.....propanol 50 vol-%;
Absorvente:: Krornasi 1. 08 , 13 jirn, 100A;
Dimensões da coluna:: 50 mm x 250 mm.
Fluxo 60 rnl/rnin „ - 18
Carregar a coluna corno acima descrito com 6 g de insulina humana obtida a partir da cisão corn ácido trifluor.....acético (ver exemplo 14).. Eluir a insulina com um gradiente de 21% para 25% de tampão 8, ao longo de 60 minutos, com um tempo de retnção de 40 minutos,. A fracçao principal contém 91% da quantidade introduzida, com uma pureza de 97,5%.. A recuperação total foi de 96%.. EXEMPLO 18
Tampão A:: cloreto de potássio 0,llvi, ácido cítrico 0,025lvi, phl 5.5, com l< 01-1, n p r o p a η ο 1 5 v o 1 % 'Tampão B: cloreto de potássio 0,1M, ácido cítrico 0.025M, phl 5.5, com K0Η , n propanol 50 vo 1 %
Absorven te;; Kr ornasi.1. G8 , 13 j.irn, 100A Dimensões da coluna:: 50 mm x 250 mm..
Fluxo 60 rnl/rnin..
Carregar a coluna e estabelecer o gra- diente corno η o exemplo 17.. i ¾ eluição faz.....se passadas 35 minuto®.. A fracçao prin cipal contém 90% da quantidade de insulina humana introduzida, com urna pureza de 96,5%.. A recuperaç:ao total foi de 93%.. EXEMPLO 19 a 24
Mos exemplos 1.9 a 24, a cromatografia foi realizada nas mesmas condições do exemplo 14. Apenas os tampões ou as quantidades de ioes híbridos foram alterados.. EXEMPLO 19
Tampão A: sulfato de amónia 0,15M, t ri et il.—a mi na 0,1M, pll 7.0, com a cido su1fúrico:;
1" a rn p a o B :: s u I. f a t o d e a rn õ n i. a 0,0 8 M , t r 1. e 11.1. a rn i na 0,0 5 Μ, p H 7.0, com ácido sulfúrico; ·
Resultados::95,2% de pureza na fracçao principal; 67% de rond 1.rnento na fracção prinoipa 1.. 19
EXEMPLO 20
Tampões como no exemplo 16, mas sern glicina 0,1M. I·? es u 1t a d os: 96,1 % d e p ureza n a f r a c ç a o p r i n c 1. p a I.; 6 5 % cl e rendimento na íVaoçao principal e 25% na fracçao secundária„ EXEMPLO 21
TarnpÕes como no exemplo 15, adicionalmente com glicina 0,1M.
Resultados96% de pureza na fracção principal; 66% de rendimento na fracção principal e 6% na fracçao secundária.. EXEMPLO 22
Iarnpáo A;: cloreto de amónia 0,1M, ácido cítrico 0,025M, pH 4,5, com amoníaco, 5 vol-% n-propanol, glicina-betaina 0,'LM;
Tampão B: como o tampão A, mas com 50 vol.....% n.....propanol;
Resultados::98,1% de pureza na fracção principal; 88% de rendimento na fracção principal e 8% na fracção secundária; EXEMPLO 23
Tampões como no exemplo 22, mas pH 5,4 e corn glicina 0,1M ern lugar de glicina-betaína.
Resultados:97,9% de pureza na fracção principal; 92% de . rendimento na' fracçrao principal e 8% na fracçao secundária.. EXEMPLO 24
Tampões como no exemplo 13, mas pH 6,0 e adicionalmente corn glicina 0,1M.
Resultados:: 94,3% de pureza na fracção pri.nci.pal; 77% de rendimento na fracção principal e 13% na fracção secundária.. 20
Ma tabela 1 são apresentados os valores do rendimento e grau de pureza das insulinas ern função do pH e/ou do teor de iões híbridos no solvente de eluiçao..
Tabela 1 PH IÕes Pureza Rendimento Exemplo híbridos Frac.. princ.. Frac.. princ.. Frac.. sec.. n 9 2,5 94,8 57 16 14 3,5 .... 9?, 5 51. 4 15 6,5 ... 92, ? 72 4 13 7,0 95,2 67 ... 19 8,5 96,1 65 25 20 5,5 ..... 97,5 91 5 17 5,5 96,5 90 3 18 3 „ 5 Gly 96 „ 0 66 6 21 4,5 Glicina..... .....betaina 98,1 88 6 22 5,4 Gly 97,9 92 8 23 5,5 Gly 98,0 93 5 8 6,0 Gly 94,3 77 13 24 8,5 Gly 96,6 86 9 16 R ΙΞ I V I M D I C A Ç □ E S - 1§ .....
Processo para a purificação da insulina e/ou derivados da insulina através de crornato.grafia sobre silicagel modificada lipõfila, com solvente© aquosos tarnponados que contêm solventes orgânicos misciveis com água, caracterizado por nos solventes tarnponados se encontrarem dissolventes iões híbridos, ou por o pH da mistura dos solventes se situar na proximidade do ponto isoeléctrico da insulina ou derivado da insulina a purificar e se encontrarem presentes i. Õ e s h £ b r i d o s .. - 21
Claims (4)
11 e s o .i ι: u · r e i ι > r ι · η ί e · i p abe n b e > 11invenção de I h ι· ' '.Η' I All I il:::.Nf ib '··’’ · I I '? .Ί :Ι ΙΛΙ · 1 ι I i >ni. ί , indus brial e co mer ciai..., eom sode em |J 628M i ; o ή:· am í-ton 86 . Popiibllea bodorai A I o in d , ( ± n e η i o: - c D r.. bs 1 n e r bolhas di., D:·'.. , i,.ç| Unçor o br..
I.eonurd bm i- ·.·>' len bes na Pepu bl i.ca Federa! Alema j , para ΙΊ-'ΙΝΊ ' .....
SO PAPA A PURLFIOAPAO OPOPAíU.....
GRAP1CA bP TMSb!.....LIMAS..
A presente invei iodo ι eí es e.....se a nm ι >; ο· o · · ί para a purttieuçdo de insulina e/ou derivados da ansuPinu I. aves de croma bo> ι: ο ί ι ·/;.···· · . ·. i . I ieaqe i modiíleuda bi.poí i La.. '*,!!! . Ο I V'. I ! b'· · '. -.eia-.a· 'α·:Γ 1 ·! l· IO / : ,.(10 COP beífl a b · . / ripp ni.eos m i. soi.vç ι . ι agua., carácterixudo por i:v soL’/ent'?s ορα ia ' · se encontrarem disso l vidos ides hi brides e/ou o pH lio ι ·'·Ό .·..· Se Gl.bitus i 1 ·. · ' ,d·!.' .·· do ponta i . · · · li ·. · · d insulina ou derivado de insuLina a i<«.ι; 1 i iiars.
Entre os métodos una .Li t icns de (··:? conhecida α pui ι isi.oaoao de insulinas ou · sois 11.1 i. nsu ί.Ί.ηα sobre ·. α : . Ί mudit.icudns l.ipot ι I os (. : ovor sed phuse j ., e tem s i do ubilisada com l'nb desde L muibos anos na cromabnt ir a bia liquida de aita pressão Í.HFL li) ( Wb Weli.udeo eb .: 1...... J .. I s| ,, ι sin . er | ., (1.986) , 857.....9b7 ) .. A escala una i. i.t ia:a , a··, aplicadas quantidades de proteínas da ordem dos ç s. ·· iima co I una dc aoo , vidro ou pias taco elieiu com .9----, rnod ι i ι ι ι-'o, e em seguida Ir eLuldas a. a di um 1 luxo da mi.ebura de solventes (na maior par te dos casos, solucoes bampcnadas uciaias., aquosas,, com uma concenbracao constante ou .1 • cι .- i t Ρ- ..;ι 11.'·-·!'· ί-.ι ι u · < ί·. ί ι i ι < ι . Λ ι -j·!. i !t · ι <! o .. 11... 11 neste ι · ι -.t ι bastante i..n f ei ι 3M g/ιη i ·.- -ο l.ume da coluna,.
Π- p: - i-·. . b -· pi i; ,i -- agora
Ut i · i !í!i ι I - -qU-. Ί i ·' -'Ίιι- !'. t·. - Os · ·· i ;a··.· tes ..... |--'·?..1,11,1,'·/<11ϊκ-·η te i ι-.·· ..... -í j, :-.1-.----. -i labor ator :·· (· t· -· t-.r-,ι,; i compon- >! i t-»;s · aaa cl· tetra Lquci.J am-: uri a , -/.3-1-: ' de a !· ;ui I - - .. liera fluor..... - · ·’·, t; ι i b i--.....aue ta tf! ( E P .. i’: - - i 1
45 111).. Mo õaso da m --1...1 II- a et . 4 .. th: - ms. . ag ., 11.1 :·-.-ΙΊ ‘ .i. , .... -.,0,- .'· de mi ·..··' a · substâncias semelhantes a insulina, •o i ..1 · : nao a uma separação o: ego a cs a!. i. s 1 a t o i ι a no 111 e se rei e ; ·. - a g u a n b i · ί a d e , r - -11 -. I i :· n' · - :l a iiiii'-· η i. -i 11· - o- -:s e ,.--..-.4- total ( J ., P ivi er , P ii :ld , ||! ; el . . t I : h! - ·. ι ii . 288, (1988), 1.12 119, Peter et al 4, hl ι; ι nu .. , 498, (.1987), 43 52),.
As insulinas proven i entes de translor maccies e· |.-r-···.·-ι -r -.orno p .. e . :-..!?-· de ci.sàu de
-a.-·-..- em iii- i.e toí temen te .:--.2 ou de ρ:a·--- · ι ·.- a:-·.- d e i t; . ι n ); ·-- ·, -! · i da - a o .. -1 e ο : o o e s s o s ci e ρ 1.11 ι ί i o a - a ο ρ - s r ο ι si s · 1 , ou outros semelhantes, contem na maior 0--1:-- te • . · : O ·. O III p O· t - IS O O li O o Kl I l. a |-1t e ·. I o III p r O p i O f ί s d e s · e Kl e i I) i. i 3 · · s .. Podem . -pur.ris cadas por mei o de cromatogra í s.a de oo-mu ta i-ai .·..·. através cia seleceão de determinados valores do 14 i .
- - - eo1 . t.un di. í er en - aa i leien tes nas - - e ( eo tr teus í ! 18
4 129 589).. A desvantagem deste método reside no .-4-4 de cd.ui.0a0 , e por tan to nas · . de compos tos Impor len tes ims sobronadantes quando cio tratamento das prees.ps.iaedes, nus tempos dc- i ia 1 · ol a f ivamen te prolongados ou no lacto cie a ι' .· .s toi . e - l-i o ronds.morif o, serem macs ι edusi.dos .
, - iu 1 -, ι -- em
ÁS .-1:.----1-.p r i, n - -1:11. o a t: a -,· e s gcs-·: : ir-- podem ccm do aumento > i- j ciso
--1,-.. da quantidade em --:-1- e cio · ·-, d.ume de ,s gue passa através da coluna.. As quantidades de solventes orgânicos necessárias situarn.....se p.e. para co 1 unas com diâ.....
metros >20 cm, na ordem dos ιϊ/Os solventes utilizados para a Η ΡI... 0 a n a 1 i 1i o a (p.e. a ce t o n i t r i 1 o , DMF , meta η o 1, diò xid o , etc..) sao tóxicos, pelo que a aplicação destes métodos á escala preparativa industrial exige dispendiosas medidas de protecção..
0 objectivo da presente invenção era o desenvolvimento de um processo para a purificação cromato.....
gráfica de insulina e derivados da insulina, o qual manti.....
vesse inalterada a actividade biológica das insulinas, atingisse elevados graus de pureza com um único passo cro.....
matográfico, conseguisse uma regeneração da fase estacionária de si11cagel sem procedimentos de enchimentos morosos e permitisse a utilização de solventes não tóxicos, tornando desta forma possível uma produção preparativa à escala industrial..
Descobriu.....se agora um prooesso que permite a purificação de insulina e derivados de Insulina através de cromatografia sobre silicagel modificada lipófila, com solventes aquosos, tampenados, que contêm solventes orgâ.....
nicos misoivois oom água,' caracterizado por nos solventes tainponados se encontrarem dissolvidos iões híbridos ou o pH do solvente se situar na proximidade do ponto isoeléctrieo da insulina ou derivado de insulina a purificar e se encontrarem ices híbridos..
Surpreendenternente, a presença de ices híbridos ou a cromatografia com um pH do solvente situado na proximidade do ponto isoeléctrieo da insulina ou derivado da insulina a purificar e a presença de ioes híbridos, resulta nao só numa boa separação entre os compostos desejados e as impurezas, mas também a uma boa separação das proteínas da fase estacionãria (si 1 icage 1 modifiçada 1 ipÕfila). As sepa.....
rações conseguidas permitem a purificação mesmo de soluções de insulinas fortemente contaminadas com componentes muito semelhantes à insulina, como p. e.. a separação de A21.....desa.....
mido.....insulina da insulina e de derivados da insulina. Para além disso, a fácil separação das proteínas da fase sólida permite atingir prolongados tempos de conservação do enchi.....
mento das colunas, bem como uma elevada taxa de recuperação t o t a I. das i n s u 1 i nas.
A presente invenção refere.....se pois a urn processo para purificação de insulina e/ou derivados da insulina através de cromatografia sobre silicagel modificada
1 i p õ f i 1 acom s o 1 v e n t e s a q u o s o s, t a rn ρ o n a d o s, q u e con t ê rn s α 1 ventes orgânicos miscíveis com água, caracterizado por nos solventes tarnponados se encontrarem dissolvidos ioes hibri.....
dos ou o pH do solvente se situar na proximidade do ponto isoeléctrico da insulina ou derivado de insulina a purificar e nele se encontrarem presentes ioes híbridos..
Mo processa a que se refere a presente invenção podem ser utilizadas todas as insulinas, corno p.. e.. insulinas de todas as espécies de origem animal ou humanas, p r e c u r o res d a i n s u 1 i n a, c o rn o p.. e.. p r ó - i n s ra 1 inas ou ρ r é.....
insulinas, ou insulinas recombinantes ou derivados da insulina, expressos por microorganismos geneticamente modificados. Para além disso, podern ser utilizados também derivados da insulina preparados p.e. através de derivatização química ou enzimática, p.. e.. des.....Phe.....131.....insulina, insulina-β.....ceteno.....
.....s u 1 f o n a t o, d i arg i n i n a.....i n s u 1 i n a (1331, 1332), rn ο η o a r g i n i n a - i n s u.....
li na ou dif enil alanina.....insulina( B31, 1332) (US 4 601 952)..
De preferência sao utilizados os deriva dos da insulina da fórmula gerai I
A21 íacleia A
-,Asn
OH
CD
B2.
Vai Cadeia tí
1329
Lys [— R30.....>Ç, na qual::
rO0 repre8enta um radioal de um L-arninoácido geneticamente codifioávelz
X representa um grupo hidroxi, um grupo orgânico fisiologi.....
camente tolerável, com caracter básica, com atê 80 átomos de carbono, um L.....aminoácido geneticamente codifioável cuja função earboxilica terminal eventualmente presente se pode apresentar livre, sob a forma de função ester, sob a forma de função amida, sob a forrna de lactona ou reduzida para CΗ 2OH;
n representa 0 a 10;
Y representa hidrogénio ou L.....fenilalanina; e as cadeias A e B representam a sequência da insulina animal ou humana.,
Ern especial são utilizados derivados da insulina da fôrmula geral I, na qual:
R30 representa L.....alanina ou L-treonina; e
X representa um ou mais aminoácidos de entre o grupo L......ar.....
ginina , L-lisina ou L.....fenilalanina ..
As insulinas ou derivados da insulina podem ser utilizados tanto num estado relativamente impuro, como tambern numa forma previamente purificada (p..e. por meio de cromatograf ia sobre gele) Mesmo após múltiplas cristã.....
lizaçoes e também após cromatograf ia sobre gele, a insulina apresenta ainda coma impurezas campostos semelhantes à insulina, corno pesos moleculares muito idênticos, que no seu estado de carga, se distinguem uns dos outros . e da insulina em caso de selecção adequada do pl-l, mas que formam complexos com a insulina (US 4 129 560) .. Exemplos de tais compostos sao as desarnida.....insulinas, arginina.....insulina e diarginina.....insu1 i na, ésteres et i 1 i o os da i n s u 1 i n a e o u t r a s..
Ρ o r s i 1 i o a g e 1 rn o d i f i c a d a 1 i p ó f i I a compreende-se urna silicagel aplicada sobre urna matriz hidrõfoha..
Exemplos de urna matriz hidrõfoha sao os alcanos com urn corn.....
prirnento da cadeia de 3 a 20 átomos de carbono,. Materiais preferidos como silicageles modificadas lipôfilas sao por exemplo::
Nucleosil, firma Macherey & Nagel.:: materiais esféricos e nao esféricos oom diferentes dimensões do grão até 45 j.rm, dimensão dos poros de 100 A, modificados oom C8 ou C18;
Lichroprep, firma Merck: materiais nao esféricos e esfé.....
ricos com diferentes dimensões do grão até 40 j.irn, dimensão dos poros de 60.....250 A, modificados corn C8-C18;
Lichrospher Select 13, firma Merck:: material esférico com uma dimensão do grão até 25 j.irn, modificado com C8
Waters Prep, modificado com C18, 50.....105 jirn, não esférico, dirnensao dos poros de 100 A;
Zorbax Pr oL0, firma DuPont:: modificado com C8, 10 jirn, esférico, dirnensao dos poros de 100 A;
Krornasil, firma EKA Nobel: modificado com 64, 68.....613, até
16 jam, esférico, dimensão dos poros de 100, 150 ou 200 A..
Iões híbridos são compostos que podem absorver protões ou também eliminá-los, i.e,., formam catioes em solução ácida e anioes ern solução alcalina, corno p.e. at~
.....aminoácidos, betaina ou derivados da betaina. Iões híbridos preferidos sao a glicina, glutamina ou betaina (N.....trimetil·····
.....glicina).. Dá.....se especial preferência à glicina..
0 ponto isoeléctrlco (PIE) cie uma insu.....
lina ou de um derivado da insulina representa o pH da solução de insulina, no qual o número de cargas cationicas e de cargas aniónicas da insulina dissolvida é igual a zero., por exe rn ρ 1 ο, ο ΡIE d a i n s u 1 i n a d ο ρ o r c o s i t u a.....se e n t r e ρ H 5,3 3
5,4 (H. Neurath, K.. Bailey, Protein Hormones, Vol.. II/A, The Proteins, pág.. 636).. Com a expressão na proximidade do ponto isoeléctrlco sao preferidos em -especial valores do pH situados cerca de 1 unidade do pH acima ou abaixo do PIE da insulina a purificar. Dá.....se especial preferência aos valores do pH situados até 0,5 unidades do pH acima ou abaixo do PIE.
Os meios de eluiçáo contêm um composto tampão, por forma a manter constante o seu pH„ Compostos t a mρ a o adequados sã o co n h ec idos d a 1 i t e r a t ur a , ρ. e.. f o sf a t os, sais alcalinos ou de terras alcalinas, tais como citrato de sódio ou acetato de potássio, citrato de amónia, acetato de amónia, sulfato de amónia ou cloreto de amónia. Para além disso, os eluentes contêm solventes orgânicas rnisciveis com água, o orno ρ.. e., álcoois, cetonas, a c e t a t o d e rn e t i 1 o, d i o x a η o, dimetil.....sulf óxido ou acetonitrilo.. Dá.....se preferência aos álcoois, tais corno o n..... ou iso.....propanol, metanol, etanol ou acetato de metilo,,
A concentração dos solventes orgânicos rnisciveis com água situa-se entre 1 e 90%, de preferência entre 10 e 60%, e em especial entre 10 e 35%. A concentração dos compostos tarnpao situa.....se entre 1 rnivlol/l © 2Mol/l, relativamente á água como solvente, de preferência entre 25 mMol/l e 1 Mol/1.. A concentração dos iões híbridas pode variar dentro de lirnites bastante alargados.. Quantidades vantajosas situam.....se entre 10 rnMol/1 e 1 Mol/1, relativamente à água como solvente, de preferência entre 20 rnMol/1 e 500 rnMol/1...
A temperatura durante a cromatografia situa.....se entre 0°C e 50°C, de preferência entre 15°C e 30 °C, e em especial entre 15°C e 20°C„ A pressão durante a cromatograf ia mantém-se pratica mente constante.. A cromato.....
grafia pode ser realizada com pressões diferentes, p.. e.. a cromatografia pode ser realizada com uma pressão de 5.....400 bar, em especial de 20 a 100 bar
A carga das colunas, a cromatografia e eluição das insulinas e derivados da insulina faz.....se pelos processos técnicos usuais conhecidos. A carga da coluna com a solução de insulina a purificar faz.....se de preferência com soluções tampão aquosas alcoólicas ou só aquosas.. A solução de insulina tem uma percentagem de proteínas situado em 1 e 10%, de preferência de 3%..
A eluição das insulinas de acordo corn a presente invenção faz.....se com uma concentração constante dos compostos tampão (isocrático) ou também com modificação da percentagem de solvente orgânico miscível corn água presente na solução tampão.. A alteração da percentagem de solvente orgânico faz-se de forma que a concentração do solvente orgânico utilizado aumente em função do volume de eluição, de preferência de acordo com uma relação linear,.
A separação da insulina dos eluados após a cromatografia faz.....se através de precipitação com zinco ou através de cristalização.. Se desejável, pode previamente evaporar.....se grande parte do solvente da solução por meio de destilação no vacuo, ou α sua concentração pode ser reduzida através de diluição corn água. De qualquer forma, a concentração de solvente antes da cristalização deve situar.....
se nos 10% ou abaixo deste valor, por forma a manter o teor de proteina no sobrenadante < 50 rng/1.. Os precipitados de insulina assim obtidos podem ser isolados por meio de decan.....
tação, centrifugação ou filtração, e depois secos..
- 8 .....
0 processo a que se refere a presente invenção é adequado nao so para a cromatografia analítica, mas também para a cromatografia preparativa, em especial se o processo a que se refere a presente invenção fôr realizado com um aparelho de HPLC preparativa..
Por cromatografia preparativa entende.....
se um processo de purificação que tem por objectivo a obtenção de compostos puros e nao apenas a sua análise. A quantidade de composto puro pode variar dentro de limites alargados, p.e. de 1 rng a 50 kg, de preferência entre 50 mg e 15 l<g.
Nos exemplos seguintes descreve.....se em pormenor o processo a que se refere a presente invenção.. As indicações de percentagens referem.....se ao peso, salvo indi.....
cação em contrário..
EXEMPLO 1
Tampão A:: sulfato de amónia . 0,2M, glicina 0,.1.11, citrato de sõdi o 0,05Μ, pli 5,5, puramente aquoso;
Tampão B:: sulfato de amónia 0,111, glicina 0,111, citrato de sõdio 0,0511, ph 5,5, água/n propanol na proporção de 1.:: 1;
A b s o r v e n t e: M u c 1 e o s i 1 C1.8, 15 ····· 25 j.i rn, e s f é r i c o, d imensa o d o s poros 100A, Firma Macherey & Nagel, Duren;
Dimensões da coluna:; 40 mm x 250 rnrn„
A carga da coluna faz se com 3,5 g de insulina humana (HI) obtida a partir da cisão com áoido t r i f 1. u o r.....a c. é t i c o d e é s t e r / é t e r d i - ter t.. ~ b u t x 1 i o o d e x n s u 1 i n a humana.....1330 ..... com um teor de proteína de 79,1%. A eluiçao da insulina faz.....se misturando as soluções A e B num sistema misturador com bomba de alta pressão adequado, de modo a produzir um gradiente de propanol de 14 a 20%.. A eluiçao da
-insulina faz-se com aprox. 17,5% de propanol, passados 23 minutos, bornbanddo oom 46’ ml/min..
Após fraccionamento e isolamento da insulina humana cristalizada (HI) obtém.....se um composto com
97% de proteínas, com um rendimento de 88,5% da fracção principal, e um rendimento de 7,5% na fracção secundaria, com um teor de proteína de 85,7%. A recuperação total é, pois, de 96,0% d a i n s u 1 i n a i n t r o d u z i d a..
EXEMPLO 2
Tampão A;: sulfato de amónia 0,1M, glicina 0,1M, citrato de s ó d i o 0,025Μ, p h 5,5, pura rn ente aquoso;
Tampa o B:: s u 1 f a t o .de a rn õ n i a 0,0 5 Μ, glicina 0,1Μ, c i t r a t o d e sódio 0,025M, ph 5,5, água/n.....propanol na proporção de 1:: 1:;
Absorvente : Nucleosil C18.....P, 15.....25 jirn , esférico, dimensão dos poros 100A, Firma Macherey & Nagel;
Dimensões da coluna:: 40 rnrn x 250 rnrn..
A coluna é carregada com 7,0 g de insuli.....
na humana (HI) (teor de proteína 86,1%), obtida a partir da cisão de éster do és ter/éter di.....tert..-butilico de insulina humana, sob a forma de uma solução a 3% em tampão de glicina 0,1M/HC1, pll 2,3, com o auxilio de bomha de alta pressão. Em seguida procede.....se â eluição com as soluções tampão acima descritas, sob pressão, com gradiente de n.....propanol.. Ao longo de 80 minutos, a concentração de propanol aumenta de 14 para 17,5%. Após fraccionamento e isolamento pelo processo a cirna i n d i c a d ο , o b t é rn · s e u rn c o rn ρ o s t o c o rn 98,7% de ρ r o t e i nas.. D rendimento da insulina humana purificada é de 91% da insulina introduzida..
EXEMPLO 3
Tarnpao A:: sulfato de amónia 0,1M, glicina 0,1M, citrato de sódio 0,025M, ph 5,5, purarnente aquoso;
EXEMPLO 4 'larnpão A::
Tampão 13::
Tampão B: sulfato de amónia 0,05M, glicina 0,1.M, citrato de sadio 0,025Μ, ph 5,5, ãgua/n.....propaηα1 na prορorçao de 1:: 1;
Absorvente:: Lichrispher Select B, C8 , 15-25 pm, dimensão dos poros 60A , Firma Merck
Dimensões da coluna:: 50 mm x 250 mm,.
A coluna é carregada com uma solução de
10g de mistura de reacção da urnarnidação (?) de insulina de porco com tripsina, dissolvida em 200 ml de tampão de glicina 0,1M/HC1, pH 2,8.. Ao Longo de 120 minutas, com urn fluxo de 40 ml/rnin e uma subida da concentração de propanol de 14 para 30%, são eluidas as diferentes componentes proteicas„ Apos cristalização ou precipitação e secagem obtêm-se como fraeção p r i n c i p a 1 é s t e r / é t e r cl ::i.......t e r t.......b u t i 11 r e o n i n i c o de insulina humana.....B30 corn uma pureza de >97%, com um rendimento de 93% r e 1 a t i v a rn e n t e â i n s u I i n a i n t r o d u z i d a ..
cloreto de sõdio 0,1M, glicina 0,1M, acetato de s o d io 0,025Μ, ph 5,5, ρuramen te aquoso; cloreto de sõdio 0,05M, glicina 0,1M, acetato de sódio 0,025M, ph 5,5, ãgua/n.....propanol na proporção de 1:1;
A b s o r v e n t e: Ζ o r n a χ P r o 10, C 8, 10 j.r rn, I- i r rn a D u Ρ o n t:;
Dimensões da coluna:: 5 cm x 25 cm..
São carregados na coluna 7,5g de Hl obtida a partir da cisão oom ãcido trifluor.....acético de é s t e r / é t e r d i - tert.......b u t i 1 tre o n i n i c o d e i n s u 1 :i na h u rn an a™ B 30, ern 100 rnl de solução de glicina 0,1M/HC1, por meio de urna bornba, e eluidos corn urn fluxo de 80 ml/rnin „ A concentração do tarnpao B aumenta ao longo de 60 minutos de 18 para 25%.. 0 tempo cie retenção (Rt) é de aproximadamente 37 minutos,. Da fraeção principal isolaram-se após cristalização e secagem
96,8% de Hl relativarnente à quantidade introduzida, com uma
- 1.1. -· pureza de >97%, e a fracção secundária contém 2,2% de HI cam urna pureza <50%.
EXEMPLO 5
Tarnpao A: sulfato de sodio 0,2M, glicina 0,1M, acetato de arnõnia 0,03M, ph 5,5, acetato de metilo a 10%;
Tarnpao 13:: sulfato de sódio 0,0511, glicina 0,1M, acetato de amónia 0,03M, ph 5,5, acetato de metilo a 10%;
Absorvente:: Krornasil C8, 13 j.irn, dimensão dos poros 100A, Firma EKA Nobel;
Dimensões da coluna:: 5 cm x 25 cm.
Com o auxilio de tarnpao de glicina 0,1ΙΊ/ΙIC3., 'sao carregados na coluna 8g de insulina de bovino por litro de volume da coluna, equilibrada com 30% de tarnpao 13., A concentração do tampão 13 aumenta ao longo de 90 minutos para 80% (=18% de acetato de metilo) .. A insulina de bovino ê eluída após 65 minutas cam urna pureza de >97,5% na fracção principal (rendimento de 63,5%), e é precipitada com cloreto de zinco após diluição corn água.. A recuperação total é de 92,5%..
EXEMPLO 6
Tarnpao A:: sulfato de amónia 0,1.M, glicina 0,111, acetato de sódio 0,025M, ph 5,5, n.....propanol a 5%;
Tampão B: sulfato de amónia 0,05M, glicina 0,1M, acetato de s ó d i o 0,025Μ, ρ h 5,5, â g u a / n.....propanol ria ρ r o porção de 1::1;
Absorvente:: Krornasil C8, 13 jjtrn, dimensão dos poros 100A, Firma EKA Nobel:;
Dimensões da coluna:: 5 cm x 25 cm.
A coluna é carregada com 4g (=8 g/1) de insulina humana obtida a partir da cisão com ácido trifluora c e t i c o d e é s t e r / é t e r d i.....t e r t.......b u t i 11 r e o n i n i c o d e i n s u 1 i n a
Humana-1330, com urna pureza de aproximadamente 92%.. Corn urn ····· 12 .....
gradiente de 18 para 25% de tampão 13 formado ao longo de 90 minutos, a insulina hurnana é eluida após 45 minutos com uma pureza de >97% na fracção principal (rendimento 91,9%) e 80,5% na f r a c ç a o secundaria (rendi rn e n t o 4,7%).
EXEMPLO 7
Tampão A: sulfato de amónia 0,1M, glicina 0, IM, acetato de s õ di o 0,026Μ, ph 5,5, n.....propano1 a 10%;
Tampão B:: sulfato de amónia 0,05M, glicina 0,11'Ί, acetato de sodio 0,025Μ, ph 5,5, ãgua/n.....prop aη o1 na prορorção de 1:: 1;
A b s o r v e n t e:: K r o rn a s i 1 C 8, 13 j.i rn, d i rn en são dos poros 10 0 A , F i r rn a EKA Nobel;
Dimensões da coluna:: 10 crn x 40 crn.
A coluna é carregada com 1.8 g de insulina de porco ern 1,8 1 de tarnpao de glicina 0,1 M/HC1, pH 3,0, com
n.....pr o panol a 5%.. 0 gradiente evoluiu de 9% de tarnpao B (=13,8% de n-propanol) para 11% de tampão B (=14,4% de n.....
--•propanol) ao longo de 70 minutos, eluida após 50 minutos com um teoria racçao principal (rendimento 89%). de 96,8% d a q u a n t i d a d e u t 1 1 i z a d a..
A insulina de porco é de proteínas de >98% na A re cu per'a çao total foi
EXEMPLO 8
Tampão A:: cloreto de amónia 0,2ΙΊ, glicina 0.1M, citrato de sódio 0,025M, n.....propanol a 5%, ph 5,5;
Tampão B:: como o tampão A, mas corn adição de 50% de n.....propanol:;
Absorvente:Krornasil C8, 13 j.irn, dimensão dos poros 100A, Firrna EKA Nobel:;
Dimensões da coluna:: 50 rnrn x 250 mm.
Dissolver 4,0 g de insulina hurnana preparada por técnica genética (teor de proteína 89,5%) em tampão de glicina 0,IM, pH 3,0, sob a forma de solução proteica a
2%, e carregar a coluna eorn o auxilio de uma bomba de alta pressão. A eluição é feita através de um gradiente linear de 13% para 16% de n~propanol, ao longo de 70 minutos, oom um f 1 u x o d e 80 rn 1 / rn i n A p ó s f r a c c i o n a rn e n t o e c r i s t a 1 i z. a ç; a o obtérn-se na fracção principal urna insulina hurnana eorn urn teor de proteína de 98%, e eorn urn rendimento de 93%.. A recuperação •total é de 98% relativamente â quantidade introduzida..
EXEMPLO 9
T a rn pão A:: su 1 fab o d e a rn õ n i a 0,2 Μ, g 1 i c ina 0,1Μ, c i trato d e amónia 0,025M, etanol a 5%, ph 5,5;
Tampão B: corno o tampão A, mas eorn adição de 50% de etanol; Absorvente:: Kr ornasil. C8 , 10 μιη, dimensão dos poros 100A , Firma
EKA No bei, Suécia
Dimensões da coluna:: 50 rnrn x 250 mm.
Dissolver 4,5 g de insulina humana pre.....
p ara d a ρ o r técnica genet i c a ('teor d e p r o t e i ri a 88,2%) em 250 rnl de tampão de glicina de pH 3,0, e carregar a coluna oom o auxilio de bornba.. Para cromatograf ia das proteínas, produzir com o auxilio de duas bornbas de alta pressão, urn gradiente linear a partir dos dois tampões A e B.. A eluição faz.....se ao longo de 100 minutos, eorn urna concentração de etanol. de 33% e eorn urn fluxo constante de 80 ml/rnin.. Após fraccion amento e cristalização obtérn.....se na fracção principal, urna insulina humana eorn um teor de proteína de 98%, e eorn urna taxa de re.....
cuperaçao total de 93% relativarnente à quantidade de composto introduzida,.
EXEMPLO 10
Tampão A:: cloreto de arnónia 0,2M, glicina 0,1.11, citrato de sódio 0,02511, acetato de rnetilo a 10%, ph 5,5;
Tampão B: concentração salina idêntica a do tampão A, mas eorn adição de 20% de acetato de rnetilo;
Absorvente:: Kr ornasil. G3, 10 jirn, dimensão dos poros 100 A, Firma
EKA Nobe 1., Suécia :;
···· 1.4· ···
Para a cromatografia, dissolver 4,8 g de insulina humana bruta, proveniente do tratamento de urna insulina preparada por técnica genética, 200 ml de tarnpao de g 1 icin a aquoso, e depois in t r o d uzir numa coluna de ΗPI.... C c o rn 80x250 mm, com o auxílio de bomba.. Previamente, equilibrar o material da coluna através da mistura dos tampões A e B corn o auxilio de duas bombas de alta pressão, por forma a obter uma concentração de acetato de metilo de 13% de acetato de metilo.. Após a introdução, proceder à eluiçao da insulina humana através · de urn gradiente linear de 13% para 17% de acetato de metilo ao longo de 90 minutos.. 0 isolamento do composto principal faz.....se por meio de cristalização a partir da solução de eluiçao.. Obtêm se assim 3,8 g de insulina humana com um teor de proteína de 98%.. A taxa de recuperação total é de 90% relativamente â quantidade de composto introduzida..
EXEMPLO 11
T a rn p a o As u 1 f a t o d e a rn ό n i a 0,2 Μ, b e t a i na 0,1Μ, á c i d o cítrico 0,05M, ph 5,5, corn NaOH (somente aquoso);
T a rn p ã o B:: su 1 f a t o d e a rn ό n 1 a 0,1 lvt, b e t a I ria 0,1. Μ, á c i d o e ..i, t r i c o 0,0 5 lvl, p h 5,5, c o rn NaOl-l (água/ i s o p r ο p a η o 1
1::1)
Absorvente:: Nucleosil 018, 15.....25 j.irn, esférico, X00A:;
Dimensões da coluna:: 40 mrn x 250 rnrn..
Fluxo 45 rn-l../rnin ..
A coluna é carregada com 3 g de insulina humana (teor de proteína 79%), obtida a partir da cisão de éster/éter di.....tert......butilico de insulina humana, sob a forma de urna solução a 3% em tampão de betaina 0,1M/HC1, pH 3,0, com o auxilio de urna bornba de alta pressão, Ern seguida pro.....
cede.....se à eluiçao isocrática com o sistema tarnpao acima descrito, corn 44% de tarnpao 13. 0 ternpo de retenção é de aproximadamente 35 minutos. Após fraccionamento obtêm.....se na
-ι i~;
τ- fracção principal 98,1% de insulina humana, corn um rendimento de 80,5%. A recuperação total é de 90,5%.
EXEMPLO 12
(á g u a / i s o p repa η o 1 1:1):;
Absorvente:Nucleosil C18-P, 15.....25 jirn, esférico, 100A;
Dimensões da coluna:: 50 rnrn x 250 mm.
Fluxo 60 ml/min„
A coluna é carregada com 6 g de insulina humana (teor de proteína 73%), obtida a partir da cisão de éster do éster/éter di-~tert..--butilieo de insulina humana, sob a forma de urna solução a 3% ern ácido acético 0,111, pH 3,0, com o auxilio de uma bomba de alta pressãoEm seguida procede.....se â eluição com o sistema tampa o acima descrito, com um gradiente de 25%.....28% de tampão 13.. 0 tempo de retenção é de aproximadamente 25 minutos.. Apos fraccionamento obtém.....se na fracção principal 98,6% de insulina humana., com um rendimento de 65%. A recuperação total é de 88,5%.
EXEMPLO 13
Tampão A:: sulfato de arnõnia 0,15M, ácido trietil.....amina 0,1M, pll 6,5 com ácido sulfúrico (somente aquoso);
Γ a rn p ã o 13 :: s u 1 f a t o d e a rn b n i a 0,0 8 Μ, t r i e t i 1 - a m i n a 0,0 5 Μ, ρ I-I
5,5, com ácido sulfúrico (água/2.....propanol 1:1);
A b s o r v e n t e:: M u c 1 e o s i 1 C18.....Ρ, 15 ···· 2 5 j.i rn, e s f é r i c ο , 10 0 A :;
Dimensões da coluna:: 50 mm x 250 rnrn.
Fluxo 60 rnl/min ..
Depois de carregar a coluna com 5 g de insulina humana obtida a partir da cisão corn ácido trif luor.....
-·· 16 .....
acético do éster/éter di.....tert.. -butiltreonínico de insulina humana, sob a forma de uma solução a 3%, eluir com um gradiente de tampão B entre 32% e 42%., 0 tempo de retenção é de 40 minutos,, Apõs fraecionarnento e cristalização obtém.....se na fracção principal 72%, com um grau de pureza de 92,7%., A recuperação total é de 76% da quantidade introduzida,.
EXEMPLO 14
Tampão A:: ãcido citrico 0,1Μ, sulfato de amόnia 0,2Μ, ρH
2,5, c o i n á c i d o c 1 or i d r' i c o (somente aquoso);
Tarnpao B:: ãcido cit rico 0, ΙΙ’Ί, sulfato de amónia 0,1M, pH
2,5, c o m a c i d o c I o r i d r i c o (agua/ n.....p r o p a η ο I 1:: 1.) ;
Absorvente:: Nucleosil C18, Firma Macherey & Nagel;
Dimensões da coluna: 40 mm x 250 rnrn.
Fluxo 45 ml/min..
Depois de carregar a coluna com 3 g de insulina humana obtida a partir da cisão com ácido trifluor.....
acético de é s t e r / é t e r di tert ..- buti 11reoninico de insulina humana, sob a forma de uma solução a 3% em tampão de glicina 0,1M, pH 3,0, eluir com um gradiente de tampão 13 entre 34% e
35%,. 0 tempo de retenção é de 45 minutos,, Após fracciona.....
mento, cristalização e secagem isolam-se na fracção principal 57% da quantidade introduzida, com um grau de pureza de 94,8%, e 16% na fracção secundária (grau de pureza 84%)„
EXEMPLO 15
Tampão A:; ácido cítrico 0,1M, sulfato de amónia 0,2M, pH
3,5, oo m á cido c1oridrico (somente aquoso);
Tampão 13:: ácido cítrico 0,1M, sulfato de amónia 0,1M, pH
3,5, c o m á c i d o c 1 o r í d r i c o (á g u a / n.....propanol 1:: 1)
Absorvente:: Nucleosi 1 C18 » Firma Macherey & Mage 1;
Dimensões da coluna:: 40 rnrn x 250- rnrn..
Fluxo 45 ml/min,.
_L f
Carregar a coluna como no exemplo 14.. 0 tempo cie retenção é de a p r o x 1 m a d a rn e n t e 40 rn i n u t o s, Após fraccionamento, cristalização e secagem isolam.....se na fracção principal 51% da quantidade introduzida, com um grau de pureza de 97,5%, e 4% na fracção secundária (grau de pureza 68%) .
EXEMPLO 16
Tampão A:: Tris 0,1.14, glicina 0,114, cloreto de amónia 0,114, pH 8,5, oorn ácido clorídrico (somente aquoso);
Tampão B: Tris 0,114, glicina 0,114, cloreto de amónia 0,114, ρ H 8,5, c o rn á c i d o c 1 o r í d r i c o (água/ n p r o p a η o 1
1:1)
A b s o r v e n t e:: K r o rn a s i 1 C 8, 13 j.r rn, 10 0 A;
Dimensões da coluna: 50 rnrn x 250 rnrn..
Fluxo 60 rrrl../rnin ..
Carregar a coluna equilibrada com 33% de tampão 13, com 8 g de insulina hurnana obtida a partir da cisão oom ácido trif luor.....acético (ver exemplo 1.4), sob a forrna de urna solução a 3% ern tampão Tris 0,114, pH 8,5.. A eluição faz.....
se passados aproximadamente 35 minutos.. Após fraccionamento e cristalização obtêm.....se na fracção principal insulina humana a
96,6%, com urn rendimento de 88%.. A recuperação total foi de 95%..
EXEMPLO 17
Tarnpáo A: cloreto de arnõnia 0,1.14, acido cítrico
5,5, corn arnoniaco, n.....propanol 5 vol.....%;;
Tampão B:: c 1 o r e t o de a rn õ n i a 0,1.14, ãci d o c i t r i c o
5,5, c o rn a rn o n i a c ο, n.....p r ο ρ a η o 1. 50 ν o 1 · - % ;
A b so r v e n t e:: K κ o rn a s i 1 C 8 , 13 j.i rn, 1.0 0 A
Dimensões da coluna:: 50 rnrn x 250 rnrn.
Fluxo 60 ml/min.
0,02514, pH
0,02514, pH
1.8
Carregar a coluna corno acima descrito com 6 g cie insulina humana obtida a partir da cisão com ácido trifluor.....acético (ver exemplo 14).. Eluir a insulina oom um gradiente de 21% para 25% de tarnpao B, ao longo de 60 minutos, oom um tempo de retnção de 40 minutos,. A fracção principal contém 91% da quantidade introduzida, com uma pureza de 97,5%,. A recuperação total foi de 96%..
EXEMPLO 18
Tampão A:: cloreto de potássio 0,1M, ácido cítrico 0,025M, pH
5,5, com l< 011, n.....p r o p a η o 1 5 vol......%
Tarnpao B:: cloreto de potássio 0,1M, ácido cítrico 0.025M, pH
5,5, c o rn K 0 Η, n.....p r o p a η o 1 50 ν o 1......%
A b s o r v e n t e;; l< r o rn a s i 1. 6 8, 13 j.i rn, 10 0 A;
Dimensões da coluna:: 50 min x 250 mm..
Fluxo 80 rnl/rnin..
Carregar a coluna e estabelecer o gradiente corno no exemplo 1?.. A eluição faz.....se passadas 35 minutos.. A fracção principal contém 90% da quantidade de insulina humana introduzida, corn urna pureza de 98,5%.. A recuperação total foi. de 93%..
EXEMPLO 19 a 24
Mos exemplos 1.9 a 24, a cromatografia foi realizada nas mesmas condições do exemplo 14.. Apenas os tampões ou as quantidades de ioes híbridos foram alterados..
EXEMPLO 19
Tampão A: sulfato de amónia 0,15M, trietil—amina 0,LM, pil 7,0, c o rn a c i d o s u I. f ú r i c o;
T a rn p a o 13:: s u 1 f a t o d e a rn õ n i a 0,0 8 Μ, t r i e t i 1 a rn i na 0,0 5 Μ, p H
7,0, com ácido sulfúrico; ·
Resultados:: 95,2% de pureza na fracção principal; 67% de rendirnento na fracção p r i n eipai..
EXEMPLO 20
Tarnpoes corno no exemplo 16, mas sem glicina 0,1M.
R es u1t a d o s:96,1% de pureza na fra cçao principa1; 65% de rendimento na fracção principal e 25% na fracção secundária„
EXEMPLO 21
Tarnpoes como no exemplo 15, adicional— rnente corn glicina 0,1MResultados:96% de pureza na fracção principal; 66% de rendimento na fracção principal e 6% na fracção secundária..
EXEMPLO 22
Tampão A;: cloreto de amónia 0,1 M, ácido cítrico 0.025M, pH
4,5, c o m a rn o n i a c o, 5 ν o 1 - % n ·· p r ο ρ a η o 1, g 1 ieina·™ betaina 0,1M;
Tampão B:: como o tampão A, mas com 50 vol.....% n.....propanol;
R e s u 11 a d o s:: 9 8,1 % d e pureza na f r a c ç ao p r i n c i p a 1; 68% de rendimento na fracção principal e 6% na fracção secundária;
EXEMPLO 23
Tampões como no exemplo 22, mas pH 5,4 e corn glicina 0,1M ern lugar de glicina—betaína.
Resultados:97,9% de pureza na fracção principal; 92% de rendimento na' fracção principal e 8% na fracção secundária..
EXEMPLO 24
Tampões como no exemplo 13, mas pH 6,0 e adicionalmente corn glicina 0,1M.
Resultados:: 94,3% de pureza na fracção principal; 77% de rendimento na fracção principal e 13% na fracção secundária..
- 20 -·
EXEMPLO 25
Na tabela 1 são apresentados os valores do rendimento e grau de pureza das insulinas em função do pll e/ou do teor de iões híbridos no solvente de eluiçao..
Tabela1
R Ε I V I N D I C A C 0 E S
- 1Ê .....
Processo para a purificação da insulina e/ou derivados da insulina através de cromatografia sobre silicagel modificada lipõfila, oom solventes aquosos tamponados que contêm solventes orgânicos miscíveis com ãgua, caracterizado por nos solventes tamponados se encontrarem dissolventes iões híbridos, ou por o pH da mistura dos solventes se situar na proximidade do ponto isoeléctrico da insulina ou derivado da insulina a purificar e se encontrarem presentes i Õ e s h í b r i d o s..
·· 24 .....
Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o pH da mistura de solventes se situar até 1 unidade de pH a cirna ou abaixo do ponto iso eléctrico da insulina ou derivado da insulina a purificar..
..... 3â .....
Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o pH da mistura de solventes se situar até 0,5 unidades de pH acima ou abaixo do ponto isoeléetrico..
- 44 -·
Processo de acordo corn uma ou mais das reivindicações 1 a 3, caracterizado por se utilizarem como iões híbridos alfa—aminoácidos ou betainas..
..... 5ã ···
Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por se utilizar corno ião híbrido glicina,· ãcido g 1 u t a rn i η i c o ou g I. ::i. c i n a.....beta I na..
..... Gã .....
Processo de acordo corn uma ou mais das reivindicações 1 a 5, caracterizado por se utilizarem derivados da insulina da fórmula I
A21
Cadeia A
Asn ΰΙ· (D
p30.
Xn *
â.
na qual::
r80 representa um radical cie um L.....aminoácido geneticamente codif icâvel
X representa um grupo hidroxi, um grupo orgânico fisiologi.....
camente tolerável, oom carácter básico, com até 50 átomos de carbono, urn L.....aminoácido geneticamente codificãvel cuja função oarboxilica terminal eventualmente presente se pode apresentar livre, sob a forrna de função éster, sob a forrna de função amida, sob a forma de lactona ou r e d u z i d a p ara CI· j 2O H ;
n representa 0 a 10;
Y representa hidrogénio ou L.....fenil.....alanina e as cadeias A e B representam a sequência da insulina animal ou humana..
- .....
Processo de acorda com a reivindicação 6, carac t e r i z ad ο ρ o r n a formu1a 1: r30 representar L......alanina ou L.....treonina e
X representar um ou mais L.....aminoácidos do grupo L.....arginina,
L.....lisina o u I.........f e n i 1 -· a 1 a n i n a..
......89 ·Processo de acordo oom uma ou mais reivindicações 1 a ?, caracterizado por se utilizar um aparelho de cromatografia liquida de alta pressão preparativa.
A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente alemão apresentado em 5 de Setembro de 1990, sob o n9 P 40 28 120..5..
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