PT99582A

PT99582A - Metodo de inibicao das interaccoes entre proteinas de adesao a celulas e hidratos de carbono

Info

Publication number: PT99582A
Application number: PT99582A
Authority: PT
Inventors: Brian Seed; Gerd Walz
Original assignee: Gen Hospital Corp
Priority date: 1990-11-23
Filing date: 1991-11-22
Publication date: 1992-10-30
Also published as: BR9106995A; CA2097617A1; MC2324A1; FI932336A7; US6156881A; HUT64476A; IE914075A1; US6613746B1; HU9301510D0; JP2000325092A; NO931864L; US5723583A; EP0640129A4; FI932336A0; US5858983A; WO1992009293A1; CZ96893A3; NZ240646A; NO931864D0; EP0640129A1

Description

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25 30 35 6¾ . 159 Ref: 00786 067 PT1 MGH-0445.0 -Portugal

MÉTODO DE INIBIÇÃO DAS INTERACÇÕES ENTRE PROTEÍNAS DE ADESÃO A CÉLULAS E HIDRATOS DE CARBONO

Fundamento do Invento A presente invenção refere-se à interfe rência terapêutica nas interaeções entre as proteínas de a-desão celular e os seus ligantes carbo-hidratos. A ELAM-1 é uma proteína de adesão que faz parte da membrana. Possui um domínio extracelular que nclui um segmento N- terminal relacionado com a lectina, uma repetição relacionada com o factor de crescimento epidér mico e múltiplos motivos proteicos reguladores do complemento (Bevillacqua e al., Science 243 : 1160, 1989; Stoolman e al., Cell 56 : 907, 1989). A ELAM-1 é especificamente expressa na superfície das células endoteliais activadas pelas citoquinas IL-1 e pelo factor de necrose tumoral (FNT) (Bevilacqua e al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84;9238, 1987), ou pela Substância P, hormona péptida (Matis e al., Invest. Dermatol. 94 : 492, 1990). Medeia a adesão das células mielóides (por exemplo, granulócitos neutró-filos) às células endoteliais activadas pela citoquina Bevilacqua e al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84^ : 9238, 1987). Foi sugerido que a ELAM-1 se encontre envolvida na regulação dos eventos inflamatórios e imunológicos na interface do sangue e da parede dos vasos sanguíneos (Bevilacqua e al., Science 243 : 1160, 1989).

Resumo do Invento 0 invento descreve, de um modo geral, -2-

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Ref: 00786 067 PT1 MGH-0445.0 - Portugal um método para inibir a ligação de uma célula portadora de uma proteúa de adesão celular, a uma molécula ou eélula por tadora de um determinante earbohidrato específico para a molécula de adesão celular. 0 método envolve fazer contactar a célula portadora da proteína de adesão celular, com uma molécula ou célula portadora do determinante carbohidra-to específico para a molécula de adesão celular. O método envolve fazer contactar a célula portadora da proteína de adesão celular com uma molécula inibidora portadora de deter minante earbohidrato.

Numa forma de realização preferida, a proteína de adesão celular é uma selectina ,tal como a ELAM--1 ; o determinante hidrato decarbono é sialil-Lex; o determinante sialil-Lex pode ser encadeado em N ou encadeado em 0; a molécula inibidora contém múltiplos determinantes sialil-Le $ a molécula inibidora é uma proteína, preferivelmente glicoproteína ^-ácido ou um anticorpo, preferivel mente IgG1; a molécula inibidora inclui uma ou*mais das localizações de adição de glicano encadeados em N de uma glicoproteína <x,-|-ácida; e a molécula inibidora é solúvel. Num aspecto relacionado, o invento apre senta um método para a redução da inflamação no paciente hu mano, que envolve a administração ao paciente de uma quanti- ' dade terapeuticamente eficaz de uma molécula orgânica portadora de um determinante sialil-Lex. 30

Em formas de realização preferidas, a molécula orgânica contém múltiplos determinantes sialil-LeX; o determinante sialil-Lex é encadeado ou em N ou em 0; a molécula orgânica é uma proteína, de preferência, glicoproteína c^-j-ácida ou um anticorpo, preferivelmente, IgG1 j e a molécula orgânica é solúvel.

Num outro aspecto relacionado, o invento apresenta um método de identificação de uma molécula inibitória que bloqueia uma interaeção entre uma célula porta- l -3- 1 5 10

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dora de ELAK-1 e uma segunda célula cu proteína. 0 método envolve o pôr-se a célula portadora de ELAM-1 em contacto com uma molécula inibidora candidata e com a segunda célula ou proteína, permitindo a formação de um complexo de afinidade entre a célula portadora de ELAM-1 e a segunda célula ou proteína e identificando a molécula inibidora como uma molécula que diminui a formação do complexo de afi nidade. Preferivelmente, a segunda célula ou proteína é portadora de um determinante sialil-Le . Ainda num outro aspecto relacionado,o invento apresenta um método para inibir a fixação do prime^ ro membro de um par de ligação específico a um segundo mem bro do par de ligação específico, que envolve o pôr-se em contacto com o primeiro membro com um anticorpo que é específico para o primeiro membro e que se encontra ligado covalentemente a uma porção hidrato de carbono que interfere com a capacidade do anticorpo para fixar o complemento e fazer ligação no receptor Fc .

Em formas de realização preferidas, o primeiro membro é uma proteína e o segundo membro é também ma proteína; o anticorpo está covalentemente ligado a múltiplas porções hidrato de carbono; a porção hidrato de carbono é um determinante sialil-LeX; e o determinante sia X * lil-Le e encadeado ou em N ou em 0; e o anticorpo inclui uma ou mais localizações de adição do glicano encadeado em N de uma glieoproteína ácida. Num outro aspecto, o invento apresenta uma molécula orgânica em forma livre à qual se encontra ligado de forma covante um determinante hidrato de carbono específico para uma proteína de adesão celular.

Em formas de realização preferidas, a proteína de adesão celular é uma selectina, preferivelmente ELAM-1; o determinante hidrato de carbono é sialil-Lex; o -4- 1 1 5

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Reft 00786 067 PT1 MGH - 0445.0 - Portugal sialil Le esta ligado em N- ou em 0-; a molécula orga-niea é uma proteína, preferivelmente, gliccproteína ácida ou um anticorpo, preferivelmente IgG1; a presença do determinante hidrato de carbono no anticorpo, interfere com a capacidade do anticorpo para fixar o complemento e fazer ligações no receptor Fc; a molécula orgânica inclu: um ou mais das localizações de adição de glieano ligado em N- da glicoproteína -ácida; e a molécula orgânica é portadora de múltiplos determinantes hidrates de carbono. 0 invento descreve ainda ácido nucleico purificado que codifica um anticorpo que contém localizações para a fixação de um determinante hidrato de carbono que é específico para uma proteína de adesão celular; um vetor que inclui tal ácido nucleico, e uma célula recombi-ante que cinlui um tal vector.

Finalmente, o invento descreve um método para a obtenção de uma molécula portadora a que um hidrato de carbono específico para uma proteína de adesão ce lular está fixado covalentemente, o qual envolve o contae·· to da molécula portadora com uca enzima capaz de fixar o determinante hidrato de carbono à proteína.

Em formas de realização preferidas, o contacto dá-se numa célula viva; a célula é uma célula eucariótica e de preferência uma célula de mamífero; a célula é, uma célula recombinante que contém ADN que codifica o enzima; e o enzima é uma o<;(1 ,3)fucosiltransfera-se.

Por "proteína de adesão celular" enten-de-se uma proteína presente na superfície da célula em algum provento da sua existência in vivo, a qual media uma interaeção específica com uma proteína (por exemplo, uma proteína portadora de um ligante hidrato de carbono) na superfície de uma segunda célula. Por "determinante hidra- -5- Í 1 5

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! to de carbono" entende-se uma porção que contém um ou mais grupos hidrato de carbono, a qual se encontra presenta na superfície de uma célula (em algum momento da sua existência in vivo) e que interactua de uma maneira específica com uma proteína, por exemplo, uma protena de adesão celular, por exemplo, sobre a superfície de uma segunda célula. Por "selectina" entende-se um membro de uma família de moléculas de adesão celular que são estruturalmente ca-racterizadas pela presença de um domínio semelhante à lec-tina, um domínio semelhante ao faetor de crescimento epidérmico , uma série de sequências ricas em cisteina, um t transmembranoso e uma pequena cauda citoplásmica. Por "inflamação" entende-se um processo patológico que consister em reacções citológicas e histológicas que ocorrem nos vasos sanguíneos afectados e nos tecidos adjacentes, em resposta a uma agressão ou estímulo anormal provocado por um agente físico, químico ou biológico. Por "par específico de fixação" entende-se qualquer par de moléculas, que inclua um primeiro e um segundo membros, que tenham uma a-fnidade específica um pelo outro. Exemplos de pares de fixação específicos incluem receptores e ligantes, por exemplo, moléculas de adesão celular e os seus ligantes hidra-tos de carbono. Por "ácido nucleico purificado" entende--se ácido nucleico que está separado de outras sequências com as quais está naturalmente associado. Por "ligado em N-" entende-se fixado ao azoto amido de um resíduo aspara-gna de uma proteína. Por "ligado em 0-" entende-se fixado ao oxigénio do grupo hidroxilo de um resíduo de serina treonina ou hidroxilisina de uma proteína. Descrição de Formas de Realização Preferidas

Primeiramente será feita uma breve descrição dos desenhos.

Desenhos A Fig. 1 representa a sequência da IgG1 -6- 1 5 10

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30 64.159 Ref: 00786 067 ΡΤ1 MGH - 0445.0 - Portugal e mutações designadas para criarem localizações de adição de glicano ligado em N-. A Fig. 2 representa um gráfico que mostra a capacidade de fixação de anticorpos e<-ElAM-1 a uma série de sub-fragmentos ELAM-1 e proteínas de fusão ELAM-1; A Fig. 3 é uma representação de uma es_ trutura de domínio de uma proteína de fusão ELAK-1 -IgG1; A Fig. 4 é um gráfico que mostra o grau de fixação de uma série de linhas de células de mamí feros a uma proteína de fusão ELAM-1-IgG1; A Fig. 5 é um gráfico que mostra o grau de fixação de uma série de linhas de células de mamíferos a anticorpos dirigidos contra as moléculas da super fície celular, CD15, CD63 ou sialil Lex; A Fig. 6 é um gráfico que mostra a fixação de células mielóides tratadas com neuramldase ao ELAM-1 ou anticorpo oc— CD 15;

A Fig. 7 é um gráfico que mostra a i-nibição da adesão ELAM-1 - célula portadora por um anti- X corpo c<^-sialil-Le ; A Fig. 8 é um gráfico que mostra o e-feito do determinante sialil-Le derivado do líquido am-niónico sobre a fixação de células mielóides à ELAM-1; A Fig. 9 é um gráfico que apresenta a capacidade da glicoproteína oç ^-ácida fucosilada para fixar o ELAM-1 in vitro; A Fig. 10 é um gráfico que apresenta o efeito de IL-1 e do IL-8 na expressão à superfície da célula do sialil-Le ; e A Fig. 11 é um gráfico que mostra o e-feito do IL-1 e do IL-8 sobre a adesão das células mielóides à ELAM-1. -7- 35

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Anticorpo portador de multilos determinantes sialil-Le—

Numa forma de realização, o invento apresenta um anticorpo portador ée uma ou mais cadeias laterais de hidratos de carbono, que mascaram a porção CH2 da moléeula de imunoglobulina e assim inibe a fixação de complemento e a ligação ao receptor Fc· Tais anticorpos são úteis para romper interacções indesejáveis entre células e proteínas ou, geralmente, para romper uma interac-ção entre quaisquer duas moléculas, uma das quais é portadora de um determinante especificamente reconhecido por um anticorpo. Dado que as porções hidrato de carbono bloqueiam o domínio da imunoglobulina que desencadeia a fixação de complemento e a fixação ao receptor Fc, tais anticorpos não promovem os efeitos secundários indesejáveis (isto é, os que resultam da fixação do complemento e da ligação ao receptor F ) frequentemente associados com os tratamentos baseados em anticorpos. Preferivelmente, os grupos hidratos de carbono não só servem para inibir indesejáveis fixação do complemento e ligação ao receptor F , mas também desempenham a função de inibir competitivamente uma interacção ligante hidrato de carbono-proteína de adesão celular. Onde os hidratos de carbono desempenham esta função, o anticorpo não serve geralmente qualquer função com origem na sua especificidade, mas apenas srve como portador para os grupos de hidratos de carbono, encontra--se descrita abaixo uma dessas moléculas, em que a cadeia lateral de hidratos de carbono inclui o determinante sia-lil-Lex. 0 sialil-Lex actua normalmente para facilitar a interacção entre as células que o transportam (p. ex: neutrófilos) e células que são portadoras da proteína ELAM-1 (por exemplo, céluasl endofceliais , por exemplo as que forram as paredes dos vasos sanguíneos). A ruptura dessa interacção tem aplicações terapêuticas, por exemplo na minimização de inflamações, tais como as que ocorrem -o- 35

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Refs 00786 067 PT1 MGH - 0445.0 - Portugal a seguir a lesões nos tecidos, por exemplo, no infarte do miocárdio, ou que é caraeterística de doenças tais como psoríase ou artrite reumatóide. A molécula IgGI , na sua forma nascente não é portadora de nnhumas cadeias laterais de sialil-Lex. Dado que é bem conhecido que os pontos de adição de glica-no encadeado em N são: N X S/T (onde N é asparagina, S é serina, T é treonina e X é qualquer amino-ácido excepto prolina) , criou-se uma molécula que inclui diversas dessas localizações para fixação de cadeias laterais de sia-lil-Le . A inspecção da sequencia IgG1 (Fig. 1) revela pelo menos cinco localizações em que pontos de adição de glicano encadeado em N podem ser introduzidos na molécula em localizações vantajosas, onde a capacidade de fixação de complemento e a ligação do receptor F_ serão prejudica-das pelo processo. Essas localizações (isto é, começando nos resíduos de amino-ácidos 274, 287, 295, 322 e 335), embora sejam localizações preferidas de adição .do glicano encadeado em N, não são as únicas candidatas; outras localizações úteis podem ser identificadas e incorporadas na sequência IgG1 utilizando-se,como orientação, os seguintes critérios: (1) as localizações estão, preferivelmente, localizadasna região CH2 da molécula de imunoglobulina, isto é, na porção da molécula, responsável pela fixação de complemento e pela ligação ao receptor F_; (2) as locali-

O zações encontram-se situadas em regiões da sequência, que se prevê pela sua natureza hidrófila, estarem presentes no exterior da molécula de imunoglobulina e portanto acessível aos enzimas responsáveis pela fixação das cadeias laterais de hidratos de carbono; (3) as localizações encontram—se situadas numa região que é minimamente disrup-tiva para uma sequência amino-ácida primária e, portanto,a estrutura amino-ácida secundária prevista. Por exemplo,uma localização de ocorrência natural, que difere de uma localização de adição de glicano encadeado em N por um único

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amino-ácido, será preferível a uma localização que exija duas alterações na sequência amino-ácida. Além é preferível criar uma localização de adição de glicanc encadeado em N por meio da substituição dos amino-ácidos de carga ou polaridade semelhantes (por exemplo, substituição de um amino-ácido sem carga por outro). Uma ou mais substituições de localizações de adição de glicano encadeado em N podem ser efectuadas dentro da sequência de codificação da IgG1 ; tais sequências (isto é, as que codificam uma molécula de anticorpo à qual se encontram ligadas porções sialil-Lex são denominadas IgG1-sialil-Lex ou IgG1-Lex. Uma molécula IgGl particular, portado-ra de porções sialil-Le é produzida como segue. 0 gene da IgG1 encontra-se à disposição do público e a sua sequência está representada na Fig. 1 (ID.SEQ K2 : 1). 0 gene é mutagenizado por meio de métodos estandardizados de mutagenese in vitro dirigida à localização a fim de se introduzir uma ou mais localizações de adição de glicano encadeado em N (por exemplo, as descritas acima e represen tadas acima da sequência que ocorre naturalmente na Fig.1; ID.SEQ N2 :2). 0 gene é entrão introduzido num vector de signado para expressar a proteína numa célula eueariótica (ver, por exemplo, os factores descritos em Gillies e al. -Patente U.S. 4.663-281, aqui incorporada como referência). A célula hospedeira eueariótica é, de preferência, uma célula de mamífero (por exemplo, uma célula CH0 ou lec11) e o vector de expressão que contém a sequência de codificação mutada IgG1-Le é introduzida na célula hospedeira por transfecção temporária ou estável utilizando--se técnicas estandardizadas. Tais células hospedeiras são igualmente transfectadas (temporária ou estavelmente) com um vector capaz de expressar uma oc.(1,3)fueosiltrans-ferase capaz de fixar os grupos sialil-Le à molécula do anticorpo nas localizações de glicosilação. O gene c<f( 1,3) fucosiltransferase pode ser expresso a partir ce um factor

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distinto do que codifica a IgG1-Le , ou ambos os genes podem ser transportados por e expressos a partir de, um vec-tor comum. As células de mamíferos são hospedeiras parti-cularmente úteis para a síntese de IgG1-Le , porque propor^ cionam tcdos os percursores necessários para a produção de sialil-LeX.

Um ADNc de 1 ,3-fucosiltransferase está descrito em Lowe e al., (Cell 63. : 475, 1990). 0 en zima cCÍ 1 ,3 )fucosiltransferase , codificado por esse ADNc, reconhece uma molécula percursora sialilada e adiciona uma porção de fucose encadeada em c<(1,3)- ou em <*(1,4) a cadeias laterais de N-acetilglucosamina. 0 determinante sialil-Le é caracterizado por um encadeamento em (1,3) e como tal, o enzima << (1,3)fucosiltransferase de Lowe (supra) produz simultaneamente as desejadas moléculas sia-lil-Lex modificadas e produtos portadores de fucose encadeada em «<(1,4) que, embora não sejam activos na ligação ao ELAM-1 , não interferem coe a acção das moléculas modi- X ficadas com sialil-Le , nem produzem outros efeitos secun dários indesejados. A produção de IgG1-sialil-Lex seria mais eficiente, no entanto, se fosse utilizado um (1,3) fucosiltransferase que talizasse exclusivamente os encadea mentos da fucose c<(1,3). Tal enzima de mamífero existe e o seu ADNc pode por isso ser isolado como segue. Uma biblioteca de ADNc, preparada a partir de ADNc que é isolado de uma linha de células mielóides (por exemplo, HL--60), é introduzido num vector de expressão de célula de mamífero tal como ^H3M (ver Simmons e al., Nature 331: s624, 1988; Aruffo e Seed, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 ; 8573} 1987) e transfeetado numa linha de células de mamíferos, preferivelmente células COS7 (conforme descrito em Seed e Aruffi, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:3365, 1987). C clone de ADNc apropriado é isolado pelo processo de imuno-selecção descrito em Arrufo e Seed, supra; -11- 35

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Seed e Aruffo, supra; e pedido de Patente U.S. 379.076, aqui incorporados como referência, As células trasnfecta-das são colhidas e incubadas com anticorpos ncnoclonais PM-81 (anti-CD15; Medarex, West Lebanon, NE), FMC13 (anti-CD15; Sera-Lab/Accurate Chemical and Scientific, Westbury, NY), MC-1 (anti-CD15; Sera-Lab. Kestbury, NY) e VIM8 (anti-CD65). A seguir á incubação (por exemplo durante 1 hora), células são separadas do anticorpo livre por centrifugação através de uma almofada de Ficoll a 2% em PBS e deixadas assentar em pratos de plástico revestidos com anticorpos de cabra purificados quando a afinidade com a IgM do rato (conforme descrito abaixo}. As células aderentes são reconhidas e um sobrenadante Hiri contendo ADN episomático é preparado. 0 ADN sobrenadante Hirt purificado é transformado (por exemplo, por meio de electropo-ração) para o interior de E.coli (preferivelmente, E.Coli MC106l/p3) por meio de técnicas estandardizadas e colónias resistentes às ampieilina e tetraciclina seleecionadas por métodos estandardizados. As colónias resistentes aos antibióticos são então juntas e os plasmídeos ampliados (por exemplo, a seguir à adição de hidroeloreto de espectinomi-cina durante uma noite). A cultura resultante é convertida para esferoplastos e os esferoplastos fundidos a células C0S7 por processos estandardizados (ver, por exemplo Seed e Aruffo, supra) . As células são deixadas incubar (preferivelmente 2 a 3 dias) e são expostas a anticorpos, conforme descrito acima. Preferivelmente, são executados dois ciclos de fusão de esferoplastos e "pannxng” (isto é, o processo acima descrito) e as células resultantes do último ciclo de "panning” são recolhidas e o ADN do seu plasmídeo preparado. Este ADNc codifica um enzima, isto é,um cç(1,3)fucosiltransferase, que dirige o aparecimento dos desejados determinantes CD15 e CD65, isto I, o de-termnante sialil-Le . âs células hospedeiras que expressam

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Refs 00786 067 PT1 MGH - 0445.0 - Portugal ^ (1 ,3)fucosiltransferase e IgG1-Le (e que assim produz uma molécula IgG1 portadora dedeterminantes sialil-Lex) são produzidas por métodos estandardizados e a proteína IgG1-Le e purificada a partir de um lisato celular baseado na sua afinidade para a coluna da Proteína A ou qualquer outra técnica estandardizada de isolamento e purifica ção de anticorpos.

Uso

Para se administrar um tal composto a um paciente, a IgG1-Le farmacologicamente pura é suspensa num veículo aceitável, por exemplo, soro fisiológico e é dada intravenosamente ao paciente , numa só dose ou em doses múltiplas. Optimamente, é fornecida uma quantidade sufici-ente de IgG1-Le , para saturar todos os pontos de fixação de ELAM-1 numa célula endotelial. tipicamente, isso pode ser conseguido com deses de o,1 mg/kg ou maiores. A dosagem preferida situa-se entre os limites de 0,1-2,0 mg/kg.

Outras moléculas portadoras, por exemplo, glicoproteína -ácida modificadát com sialil-Lex (^-AGP-LeX, abaixo descrita) serão geralmente produzidas conforme aqui descrito e serão administradas intravenosamente aos pacientes, conforme acima descrito (isto é, preferível mente, numa dosagem suficiente para saturar todas as locali_ zaçês de fixação de ELAM-1 das células, por exemplo, a 0,1 mg/kg ou mais).

Podem ser usadas IgG1-sialil-Lex ou

X c^1-AGP—sialil-Le , num exemplo, para o tratamento de um paciente que sofreu um ataque de coração. A seguir a um tal trauma, as células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos expressão ELAM-1 nas suas superfícies e, sem tratamento, neutrófilos portadores de sialil-Lex nas suas superfícies, fixam -se a tais células endoteliais portadoras de ELAM-1, contribuindo para a inflamação. 0 trata- -13-

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¾ mento com uma molécula portadora de sialil-Le' atenuaria a inflamação ao inibir competitivamente a interacçSo entre os neutrófilos invasores e as células endoteliais dos vasos sanguíneos na vizinhança do coração. Compostos tais como IgG1-sialil-Le ou ος.-1-AGP-sialil-Le podem também ser usados, conforme descrito acima, para o tratamento de doenças caracterizadas por estados inflamatórios crónicos, por exemplo, artrite reumatóide, psoriase ou penthigus vulgaris.

Informação Experimental Foi demonstrado que determinantes sia-lil-Lewis X (sialil-Le interactuam com a ELAK-1 e facilitam a fixação às células endoteliais portadoras de ELAM-1 por meio das experiências que se seguem. Estes exemplos são apresentados para ilustrar, não limitar, o invento.

Reconhecimento do determinante Sialil-Lex pela ELAM-1

Os domínios ELAK-1 necessários para a actividade fixadora dos granulócitos foram localizados utilizando-se dois anticorpos monoclonais anti-ELAM-1: H18/7, que efectivamente bloqueia a adesão de leucócitos ao endotélio activado, e H4/18 que não o faz (Pober e al., J. Immunol. 136 : 1680, 1986; Bevilacqua e al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84_ : 9238, 1987). 0 comprimento total da ELAM-1 foi expresso a partir do ADNc transportado sobre o plasmídeo, pELAM-1 (Bevilacqua e al., Science 243:1160, 1989). As delecçoes do carboxil terminal do ADNc da ELAM--1 , foram criadas por reacção de cadeia de polimerase para produzir as proteínas representadas na Fig. 2. As sequên cias iniciadoras para as deleçSes PCR foram designadas com base na sequência ELAM-1 de comprimento total de Bevilacqua e al. (Science 243 : 1160, 1989)* Uma vez gerados, os fragmentos de ADNc da ELAK -1 foram então fundi- -14- 35 1 1

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 dos, por técnicas estandardizadas, às porções codificadoras transmenbrana e intra-celulares de um âDKc de CD7 (isto é, nucleótidos 501 a 1236 do ADNc do CD7 descrito em Aruffo e Seed, EMB0. J 6 : 3313, 1987). Plasmídeos portadores das fusões resultantes foram transfeetados nas células C0S. A reactividade aos anticorpos monoclonais foi determinada por meio de microscopia de imunofluorescência indirecta de células fixadas, permeabilizadas pelo método de Aruffo e al., Cell 6_1_ : 1303, 1990.Os resultados desta análise estão representados na Pig. 2 e são representativos de transfecções de três a seis isolados independentes das construções representadas. A Fig. 2 indica que a fixação de H18/7 exigia os domínios do segmento relacionado com a lectina mais os domínios da repetição EGF, enquanto que a reactividade da H4/18 exigia, além disso, os primeiros três elementos de repetição da proteína reguladora do complemento. L indica o segmento relacionado com a lectina ; EGF indica o elemento repetido* relacionado com a EGF 5 e CRI-CR6 indicam elementcsi da proteína reguladora do complemento. I 25 30

Para definir melhor ponto de fixação para H18/7, um fragmento foi trocado entre o ADNc da ELAM--1 e o fragmento equivalente do ADNc de Leu8 relacionado . (LECCAM-1) (descrito em Camerini e al., Nature 3H2 : 78, 1989). Quimeras Leu8 (LECCAM-1 )/ELAM-1 foram criadas por meio da restrição de intercâmbio de fragmentos de uma localização Bg1II conservada dentro do domínio lectina (ist é, nos nucleótidos 454 e 475 das sequências ADNc do ELAM-1 e do Leu8, respectivamente). Conforme representado a Fig. 2, H18/7 está fixado a um determinante antigénico localizado principalmente nos primeiros 15% do domínio da lectina da ELAM-1. Juntamente com 0 resultado acima (isto é, que tanto o domínio semelhante à lectina como o da repetição EGF foram necessários para a fixação da H18/7 a ELAM-1 truncada) sugere que o elemento de repe-

35 1 5

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Morf, 71 - 20.000 «κ. - W/Ofl 20 I 25 30

Ref: 00786 067 PT! MGH - 0445.0 - Pcrtugal /\

tição relacionado com EGF pode representar um papel na for mação da estrutura do domínio da lectina.

Para estudar as possíveis interacçdes lectina-hidrato de carbono sugerida pelo mapa da epítope, uma quimera solúvel da proteína da ELAM-i foi preparada pela fusão de um fragmento de ADNc que codifica o domínio extracelular do ELAM-1 um fragmento genómieo que codifica a charneira, isto é, os domínios CH2 e CHS, da IgG1 humana (Aruffo e al., Cell 6J_ : 1303, 1990; Fig. 3). A quimera ELAM-1-IgG1 foi preparada como segue. Oligonucleótidos sintéticos com a sequência: CGGAATTCC AGTACTACTCACCTGGTCCGCCGATGGTCTCCGGGC (ID. SEQ N2 3) e CCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATT (ID SEQ. N2 4), e correspondentes, respectivamente, à união dador/termo carboxil da ELAM-1 e a uma localização no vectGi a montante do ADKe introduzido, foram preparados por técnicas estandardizadas. Reacção de cadeia de polimerase com esses oligonucleótidos e o plasmídeo de expressão do ADNc da ELAM-1, pELAK-1 , como suporte, forneceu um fragmento de 1800 bp que foi digerido com Xhol e EeoRI e sub-clo-nado no vector de expressão digerido Xhol/EcoRI tf H3M (A-ruffo e Seed, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 : 8573, 1987). 0 fragmento sub-clonado foi libertado por digestão com Xhol e Seal e ligado ao plasmídeo de expressão da IgG1 digerido por Xhol/Seal, descrito em Aruffo e al. Cell 6V: : 1303, 1990. A construção resultante foi transfectada para o interior das células C0S (conforme descrito em Seed e Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sei. 8¾ : 3365, 1987) e a desejada proteína de fusão, denominada ELAM-Rg, foi recuperada de um sobrenadante por adsorção e a eluição de uma agarose de proteína A, conforme descrito em Aruffo e al., (Cell 61_ 1303, 1990). A construção inicial e a ver são subsequente em que a maioria do segmento amplificado PCR (isto é, nueleótidos 1 a 1464 da sequência ELAM 1) foi -16- 35 3 54.159 fj \j! í 2 ué .mi

Hefs 00786 067 PT1 MGH - 0445,0 -Portugal substituída por um intercâmbio de fragmento de restrição homólogo (para evitar mutações potenciais introduzidas durante a amplificação) mostraram uma actividade fixadora idntica. A proteína solúvel apareceu sob a forma de díme-ros encadeados em dissulfito, presumivelmente medidos pela região charneira dos resíduos de cisteína, responsáveis pelas ligações entre as cadeias pesadas das imuno-globulinas activas.

Para se determinar se as células mielói-des fixavam a ELAM-1 solúvel, pratos de plástico previamen te revestidos com anticorpos de cabra anti IgG humana, foram incubados com sobrenadantes expressando ELAM-Rg. Estas experiências foram executadas conforme segue. Granulo eitos humanos foram isolados de sangue completo heparini-zado, acabado de obter, por meio de centrifugação através de Ficoll/diatriazoato de sódio (Mono-Poly Resolving Médium, Flow Laboratories, McLean, VA) durante 20 min. a 800 x g. Linhas de células foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC) e foram mantidas em IMDM com soro fetal bovino a 10 %, conforme descrito em Aruffo e Seed (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 : 8573, 1987). A adesão à ELAM-Rg foi efectuada em pratos de cultura bacteriana (Falcon 1008, Beeton-Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) em que se deixara absorver anticorpo de IgG anti-humana de cabra purificada quanto a afinidade (Organon Teknika/Cap-pel, Malvern PA) a 10 /Ug/ml em 50 mM Tris-HCl, pH 9,5 durante pelo menos uma hora. As localizações fixadoras de proteína restantes foram então bloqueadas numa incubação de um dia para o outro, com 1 mg/ml de albumina do soro bovino em Solução Salina Tamponada com Fosfato 8pbs; 137 mM NaCl, 2,7 mM KC1, 4,3 mM NagHPO^.7¾J, 1,4 mM , pH 7,3)· Pratos lavados com PBS, revestidos com células (10^ células) durante 10 minutos a 22° foras incubados com ELAM-Rg ( 1 /ug/ml) durante 30 minutos a 22° e 1 5

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Mod. 71 - 20.000 βκ. - 90/08 20 25 30 64.159 Ref: 00786 067 PT1 MGH - 0445.0 - Portugal

% lavados tres vezes com PBS. As células aderentes por unidade de área de prato foram enumeradas com a ajuda de um rectículo ocular e classificadas coe: segue: 100 células, * +++++; 103-75 células, ++++; 75-50 células, +++; 50-25 céulas, ++; e 25-10 células, +, Todos os valores representavam a média de determinações em triplicado. 0 plástico tratado adquiriu a capacidade específica de fixar granulócitos bem como as linhas de células mielóides HL60 e THP1 (Fig. 4). Verificou-se que outras linhas de células, tanto de origem hematopoiética (isto é, 11937 e HSB-2) como de origem não hematopoiética (isto é, WIDR) se fixavam também ao plástico revestido com ELAM-1 (Fig. 4). Pratos revestidos com proteína de fusão CD8 (Aruffo e al. , Cell 6l_ : 1303, 1990) mostraram uma afi_ nidade negligenciável (para granulócitos ou qualquer das linhas de células testadas (Eevilacqua e al., Proc. Natl. Aead. Sei. USA 84 : 9238, 1987)).

Para relacionar a actividade fixadora com o fenótipo da superfície, diversos anticorpos monoclo-nais que reconhecem antigénios hidratos de carbono conhe eidos de grnulócitos foram observados quanto à reactivida-de com os tipos de células acima. 5x10 células foram incubadas com os seguintes anticorpos (como ascites a uma diluição de 1 : 250, ou como anticorpo purificado a 4/ug/ml): PM81 (anti-CB15; Medarex, W. Lebanon, NH; Bali e al., J. Immunol. 130 : 2937, 1983), CSLEX-1 (anti--sialil-Le^; Fukushima e al., Câncer Res. 4_4 : 5279, 1984); ou VIM2 (anti-CD65; Macher e al., J. Biol. Chem. 263 : 10186, 1988), seguidas por um anticorpo de cabra conjugado de fluoresceína IgG + IgA + IgM de rato (Organon Teknika/Cappel, Malvern, PA).

Os resultados estão representados na Fig 5. Pontos dispersos representam o controlo negativo (sem anticorpo primário); pontos densos, anti-CD15 mAb; linha

35

£*5.159

Eefs 00786 067 PT1 KGΗ - 0445.0 - Portugal eheia, anti-CD63 mAB; e linha tracejada, anti-sialil-Le mAB. A linha U937 aqui utilizada não tinha determinantes sialil-Le , ao contrario da linha de células apresentada U937 testada por Terasaki e colaboradores (Fukushima e al., Câncer Res. 4_4 ; 5279, 1984). Uma observação inicial mostrou que o potencial de adesão da ELAM-1 se relacionava eom a presença do determinante CD15 (isto é, Lex, ou lacto--N-fucpentaose III; Gooi e al., Nature 292; 156, H 9 81 ;

Huang e al., Blood 6l_ : 1020, 1983; Magnan e al., Ârch. Biochem, Biophys . 233; 501 , 1984; Gooi e al., Eur. J.

Immunol. 1_4 : 1089, 1984), mas não com os determinantes assoiados com CD17 (Lactosil ceramida; Symington e al., J. Biol. Chem 259 ·. 6008, 1984, CD65 3 3 (VI NeuAcIII FuncnorLcn0se6Cer; Macher e al., J. Biol. Chem. 263 : 10186 , 1988) ou sulfatidas (Fredman e al., Biochem. J. 251 : 17, 1988).

Para testar melhor a relação entre o potencial de adesão da ELAM-1 e a presença de CD15, células portadoras de CD15 foram tratadas com neuraminidase, um en zima conhecido por clivar os grupos sialilo terminais. Ce lulas HL60 (10D/placa) foram incubadas em 50 ul de 0,15M NaCl, 4mM CaCl2, pH 5,5, durante 1 hora a 372 em presença ou na ausência de 41,5 mU de neuraminidase (de Yibrio cholerae, tipo II, Sigma, St. Louis, M0). As células foram lavadas três vezes com PBS e a aderência aos pratos, tanto revestidos com ELAM-Rg comqfcom PM-81 , foi registada conforme descrito acima. Os pratos foram revestidos eom ELAM--Rg conforme descrito acima.e com-.anticorpo PM-8-1 purifica do .a IQiUg/ml.-em 50 mM de Tris-HCl pH 9,5. Os ensaios de aderência foram executados conforme acima descrito. Os re sultados mostrados na Fig. 6 são expressos como percentagem de controlo e foram calculados a partir da média + desvio padrão , para a média das determinações tríplices em três experiências independentes. 64.159

Ref: 00786 067 PT1 MGH - 0445.0 - Portugal Ιββ .FEV.1992 A Fig. 6 indica que a relação do potencial de adesão da ELAM-1 com a presença de CD15 foi imperfeita porque a digestão das células com a neuraminidase aboliu a ligação à E-LAM-1 mas aumentou a fixação aos anticorpos anti-CD15 imobilizados.

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Mod. 71 -20.000 ex. - 90/08 20 J 25 30 A associação com o CB15 e a sensibilidade à neuramidase sugeria que a forma sialilada do antigénio hidrato de carbono CD15 podia representar o ligante fisiológico da ELAM-1. Para testar essa ideia, foi ensaiado anticorpo monoclonal CSLEX1 quanto à sua capcidade para ini_ bir a adesão de células HL60 à ELAM-Rg. 10^ células HL60 foram incubadas com CSLEX1 (1:50 em PBS) durante 30 minutos sobre gelo, depois reticuladas com anticorpo de cabra purificado quanto à afinidade anti IgK de rato (Organon Teknika/Cappel, Malvern, PA) a 20 ug/nl em PBS durante 30 min. e fixado com 2% de formaldeído em PBS durante 20 mi-utos a 222. As células foram lavadas três vezes em PBS/ /1? de glicina e incubadas em pratos revestidos *de ELAM-1--Rg conforme descrito acima. Os dados apresentados (apresentados como percentagens de controlo) na Fig. 7 representam a média + desvio padrão de determinações tríplices em três experiências independentes. A Figura 7 indica que existe aí uma correspondência muito boa entre a densidade de superfície do sialil-LeX e escalonamento do número de células fixadas por unidade de área do plástico revestido com ELAM-Rg.Além disso, o anticorpo anti-silail-Lex imitiu completamente a adesão de células mielóides à ELAM-1, enquanto que os anticorpos anti-CD65 e anti-CD15 não tinham, sob idênticas condições, nenhuma actividade. A epitope hidrato de carbono reconhecida pelo anticorpo CSLEX1 foi indicada comc sendo NeuNacc(2--3Gal/? 1-4(Fueç£ l-3)GfcMôj31-3Gal, baseada em motivos comuns a glicolípidos estruturalmente earaeterizados com os quais; 5 -20- 35 1 1

ÍTEV.I992I 5¾.159 fiefí 00T86 067 PT1 MGH - 0445.0 - Portugal 5

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 o anticorpo reage (Fukushima e al., Câncer Res. 4^4 : 5279, 1984). A análise dos lactosaminoglicanos fucosilados dos granulócitos neutrófilos revelou que ambos os deter-manantes Le {CD 15) e sialil-Le estão predominantemente representados em glicanos ligados a asparagina tetra-an-tenária cujas linhas individuais são constituídas a partir de cadeias poli(N-acetilactosamina) portadoras de substituições de fucose encadeadas em ε^(1,3) (Fukuda e al., J. Biol. Chem. 259 : 10925, 1984; Spooncer e al. , J. Biol. Chem. 259 : 4792, 1984). Provas celológicas apoiam a existência do determinante sialil dimérico Lex também nos granulócitos (Fukusfei e al., J. Biol.Chem, 259 : 10511, 1984; Fukushi e al., Câncer Res. 45^ : 3711 , 1985). Como tal, o resíduo no lado redutor do grupo sialil—Lex é galactose em todas as estruturas de granulócitos até aqui identificadas. Embora o anticorpo CSLEX1 bloqueie a fixação, a estrutura reconhecida pelo ALAM-1 poderá ser mais complexa do que a estrutura reconhecida pelo CSLEX1 . Para estabelecer a estrutura mínima do glicano para a fixação do ELAM-1 , glicanos quimicamente caractrerizados portado-res de determinantes dialil-Le foram avaliados quanto ao reconhecimento do ELAM-1 . J 25

0 líquido amniónico é uam fonte de de-X 30 terminante sialil-Le bem definida que se encontra num contexto muito diferente da superfície da célula granuló-cita. 0 hidrato de carbono portador de sialil-Lex de muci^ nas amniéticas junta-se em -6 a uma N-acetilgalactosa-mina 3-substituída, que por sua vez está directamente li gada à espinha dorsal polipéptida por intermédio de encadeamento em 0 à serina ou treonina (Hanisch e al., Carbo-hydr. Res. 178 : 29, 1988). Determinantes sialil-Lex derivados de líquido amniótico foram ensaiados quanto à sua capacidade para bloquearem a fixação de células mie-lóides ao ELAM-1 imobilizado. 0 líquido amniótico humano (LAH) foi ou usado sem purificação, fraccionado por ultra —A * — 85 1 64.159

Ref: 00786 067 PT1 MGH - 0445.0 - Portugal 5

// ' í!

-filtração centrífuga (100KBal de corte nominal} Centricor 100, Amicon, Danvers MA), ou fraccionado, após extrac-ção com fenol, por meio de cromatografia de exclusão dimensional (Sephacryl S-300 HR) em cloreto de guanidino 4M (pelo método de Hanisch e al., Carbohydr. Res. 178 : 29, 1988) para fornecer mucinas purificadas. Tais mucinas foram usadas a uma concentração de proteínas de aproximada-mente 150 /ug/ml. A fixação ao plástico revestido com ELAM-Rg foi executada conforme descrito acima. Os resultados (expressos como percentagem de controlo) representados na Fig. 8 são a média de determinações tríplices em duas experiências independentes. 15

Mod. 71 - 20.000 «. - 90/08 20

25 30 A Fig. 8 indica que, a despeito da dis-semelhança entre os glicanos dos granulocitos e as mucinas do líquido amniótico, mucinas purificadas do líquido amniótico, bem como sob a forma de líquido amniótico não fraccionado (que parece conter toda a sua actividade na fraçção de alto peso molecular rica em mucina), bloqueavam eficazmente a fixação das células mielóides à ELAM-1 imobilizada. Outra fonte de determinantes sialil-Le é a glicoproteína do ácido <<1 (oc1-AGP) (Biou e al., Bio-chim. Biophys. Acta.913 : 308, 1987, Wieruszeskki e al., ' FEBS Lett . 238 : 390, 1988). A análise química da 1- -AGP humana revelou que a fueose se encontra presente numa fracção menor de glicanos encadeados em N (Schmid e al., Biochim. Biophys. Acta 492 : 291, 1977; Fournet e al., Biochemistry V7 : 5206, 1978), mas que a proteína asialo bloqueia pelo menos parcialmente a fixação de anticorpos anti-CD15 (Gooi e al., Eur. J. Immunol. 1j^ : 306, 1983; Tetteroo e al. , Eur. J. Immunol. 14 : 1089, 1984). Uma modesta redução (35 + 9 $) na fixação de células HL6G ao ELAM-1 (adsorvi-do no plástico) foi conseguido com 200 ug/ml da proteína. 35 -22-

64,159

Hefx 00786 067 PT1 KGH - 0445.0 - Portugal

Produção in vitro de uma molécula de sialil-Le

Para ampliar esses resultados, 1-AGP enzimaticamente fucosilado foi preparado in vitro. A bio-síntese do determinante sialil-LeX é controlada por uma od(1,3) fucosiltransferase específica (Campbell e al.,

Cell 35_ : 303, 19823; Campbell e al., J. Biol Chem. 259 : 11208, 1984), que adiciona fucose à porção N-acetilglu-cosamina da acetillactosamina N terminal no seu aduzido 3-sialilo; sabe-se que uma <X(1,3) fucosiltransferase específica genética e bioquimicamente distinta apenas adiciona fucose ao percursor asialilo (Prieels e al. , Eur. J. Biochem. 130 : 347, 1983: Muramatsu e al.,

Eur. J. Biochem. 157 : 71 , 1986). Sabe-se que uma terceira fucosiltransferase forma, simultaneamente, encadeamentos C< (1 ,3) e 0^(1,4), aparentemente com substratos não silali lados (Prieels e al., J. Biol. Chem. 256 : 10456, 1981 ; Lowe e al., infra). A biosíntese do determinante sialil--Le prossegue por meio de sialilacção sequencial, seguida por fucosilação, dado que a (<(2,3) sialiltrasnferase não consegue reconhecer a acetillactosamina N terminal fu-cosilada que é 0 CD15 (Holmes e al., J. Biol. Chem. 261 : : 3737, 1986). A glicoproteína a^-ácida é um bom substrato para a ^ (1,3)fucosiltransferase do líquido amniótico (por exemplo, Hanisch e al., Carbohydr. Res. 178 : 23,

X 1988) , um enzima que forma sialil-Le a partir dos percursores sialilados e não sialilados, respectivamente. A fucosiltransferase do líquido aminió-ico foi isolada por cromatografia de afinidade e avaliada quanto à sua capacidade para converter a 1-AGP num ligante para o ELAM-1 como segue. A o< (1,3)fucosiltransfe rase foi isolada do líquido amniótico concentrado por meio de cromatografia com fetuína-agarose conforme ante-riormente descrito em Hanisch e al. (Carbohydr. Res. 178 : * 23, 1988 ) e Mitsakos e al., (Biol. Chem. Hoppe-Seyler 10

J 15

Mod. 71 · 20.000 ex. - 20/08 20 25 30 35 64.159 Ref: 00786 06? PT1 MGH - 0445.0 - Portugal Λ.ΜΑ g .14. 369 : 661 , 1988). 0,8/aCi de GDP'"C-fucose (225 Ci/mole)e 100/ug de 1-AGP ( Sigma, St. Louis, KC) foram adicionados a uma mistura de reacção contendo 25 ml·! de Tris-HCl pH 7,0 2 35 mM MgCl e 1 mH ATP num volume final de 120 /Al. A reacção foi deixada continuar durante 24 hor-as a 37°, altura - 14 em que aproximadamente 10% da fucose marcada com C tinham sido incorporados no material insolúvel em TCA. 0 marcador não incorporado foi removido per meio de ultrafil-tração centrífuga (Centricon 10, Amiecn, Danvers, MA). 20 /ul de uma diluição de 1:5 do material marcado, ou 10>ul de uma diluição 1:5 de uma mistura de reacção constituída de forma semelhante mas sem fucose marcada com GDP, foi absorvida em pratos de plástico (conforme descrito acima) ou em placas côncavas de microtitulação 96 (Falcon 3911, Becton Dickinson, Oxnard, CA). Ls concavidades foram incubadas a 22° com ELAM-Rg ou CES-Rg a 1 ,ug/ml durante 1 hora, lavadas com FBS e incubadas com anticorpo de cabra anti IgG humano radio-iodado (Du?ont/NEN, Boston, MA) durante mais uma hora. A seguir à lavagem, a fixação do anticorpo marcado foi medida num contador de raios gama Os resultados representados na Fig. 9 são expressos como a média + desvio padrão de determinações quádruplas e são representativos de duas experiências independentes. A Fig. 9 mostra que o <^1 -AGP incubado com fucosiltransferase, na presença de GDP-fucose, fixou significativamente mais ELAM-Rg do que o fizeram c<:1-AGP apenas, ou o<1AGP incubada com enzima na ausência deGDP--fucose. Os glicanos fucosilados de asialo--cc -AGP transportam a estrutura terminal Gal/^(1-4)-Fuc^-(1-3)GlcNAc/3 (1-4)Man, enquanto que os terminais são fucc-silados da asialoproteína são constituídos pelo grupo K--acetillactosamina juntos em j3(1-4), ou Cxl (1 —6) a manose (Fournet e al., Biocfcemistry 17. ~ 5206, 1978). As-

-24- >

15

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 i 25 30 -159

Eefs 00786 067 PT1 K3H - 0445.0 - Portugal

t X sim nenhum dos determinantes pré-existentes de silail-Le de oc 1 - AGP nem qualquer dos aduzidos potenciais de fueosil à N-acetilglucosamina podem juntar-se à galactose. Estes resultados, juntamente com a inibição da fixação da ELAM-1 pelos glicanos de mucina encadeados em 0, indica que o agru pamento sialil-Lex, em si mesmo, tem uma afinidade apreciável para o ELAM-1. Fica por determinar, no entanto, se una fixação de ELAM-1 quantitativamente mais forte poderá ser promovida por resíduos vizinhos dos determinantes sia-lil-Le em granulócitos ou por factores estéricos que afec tem a sua acessibilidade. O IL-8 bloqueia a adesão da célula mielóide à FLAM-1

Foi descrito que a libertação de IL--8 de células endoteliais tratadas com IL-1 faz com que os granulócitos percam a sua capacidade para se fixarem ao endotélio induzido pelo IL-1 (Gimbrone e al., Science 246: s 1601 , 1989)· 0 efeito de IL-1 e IL-8 sobre a expressão do antigénio da superfície do sialil-Le foi determinada como segue. Granulócitos foram incubados com IL-1 β (10ng/ /ml; Peptro Tech. Rock Hill, NJ) ou IL-8 (25 ng/ml; Pepro Tech, Rock Hill, NJ) durante 20 minutos a 37°, lavado três ' vezes e incubado com um anticorpo monoclonal a CD15 (PM--81), CD65 (VIM2) ou sialil-Lex (CSLEX1) (acima descritos), em gelo. Os resultados na Fig. 10 são dados como intensidade de fluorescência média relativa (IFM) determinada por citometria de fluxo, como percentagem da IFM dos granulócitos incubados em paralelo sem citoquinas e são re-resentativos de quatro experiências. A Fig. 10 mostra que nem o IL-1 nem o 11-8 provocaram uma redução substancial na expressão do sialil-Le da superfície da célula. 35

Para testar a capacidade dos sobre -25- 1 1

64.159

Ref: 00786 067 PT1 MGH - 0445.0 - Portugal 5

10 J 15

Mod. 71 - 20.000 βκ. · 90/08 20 nadantes colhidos dos granulócitos expostos ao IL-8 para blo quearem a fixação à ELAM-1 , os granulócitos (5 x 10 /ml) foram incubados com IL-1 ou IL-8 (nas concentrações acima) durante 1 hora a 37°. 0s sobrenadantes foram escolhidos após centrifugação e incubados com pratos revestidos com ELAM-Rg. Células foram adicionadas passados 30 minutos e a fixação foi determinada conforme acima descrito. A Imuno--adsorção foi executada com 40 ul de esferas de agarose com Proteína-A (Sigma, St. Louis. MO) a que 10/jg de IgM anti--rato de coelho purificada quanto à afinidade, seguidos de 5 ul de ascites de CSLEX1. Esferas de controlo foram preparadas de forma semelhante mas não foram incubadas com CSLEX1 . As esferas foram lavadas com PBS e incubadas comc os sobrenadantes durante 1 hora a 4o. Os resultados são apresentados na Fig. 11 e são expressos como percentagem de células fixadas, relativamente ao número fixado na presença de sobrenadantes de granulócitos incubado.s sem cito quina bas mesmas condições. Os dados representados são a média + desvio padrão de determinações tríplices em três experiências independentes. J 25 A Fig. 11 mostra que os sobrenadantes escolhidos de culturas de granulócitos tratados com IL-8, mas não IL-1 , bloqueavam a adesão de células HL60 a ELAM-1 imobilizada e a inibição da fixação poderia ser es-pecificamente invertida por adsorção dos sobrenadantes com CSLEX de fase sólida, mas não apenas com a matriz de imuno -adsorção. 30

Outras Formas de Realização

Outras formas de realização enquadram-se no âmbito das reivindicações. Por esemplo, o invento abrange qualquer anticorpo eom capacidade diminuída para fixar o complemente e fazer ligações no receptor F_

V como resultado de agregação de cadeias laterais de hidratos -?n_

6¾.159

Refs .00786 067 PT1 MGH - 0445.0 - Portugal de carbono; conforme descrito acima, estes incluem anticorpos úteis pela sua especificidade imunológica (por exemplo, MY904 , Todd e al., Patente U.S. N2 4.840.793) cue inibem competitivamente as interacções célula-célula, tem como an ti-corpos que são usados apenas como transportadores para os grupos hidratos de carbono terapêuticos. Dado que os locais de adição de glicano encadeado em N são bem conhecidos como sendo: Asparagina (N), X, Serina (S) cu Treonina (T), onde X indica qualquer resíduo excepto a prclina, um técnico do ramo pode desenhar uma molécula com qualquer número de tais localizações e assim qualquer número de cadeias laterais de hidratos de carbono. Localizações de gli cosilação são incorporados na sequência do antiecrpo, por exemplo, por mutagénese dirigida para a localização in vitro.

Anticorpos não fixadores do complemento e não fazendo ligaçõs nos receptores Fq seriam usados para fins diferentes do tratamento de inflamação. Por exemplo, um tal anticorpo dirigido contra GPIIb-IIa pode ser usado para inibir a agregação de plaquetas e por isso seria útil para o tratamento do infarte do miocárdio. Anticorpos anti proteínas, tais como fibrina ou uma das proteínas da cascata da coagulação, seriam úteis para inibir a formação trombólica. Em geral, qualquer anticorpo (incluindo, sem limitação, anti-Mo-1 e anti-CDIt) proposto ou que se demonstrou que tem uma utilidade terapêutica, pode ser melhorado por meio da adição de porções de hidratos de carbono que mascarem a capacidade do anticorpo para fixar o complemento e fazer uma ligação no receptor F .Esta característica seria particularmente importante, por exem pio, para proteínas de fusão de imunoglobulina (por exemplo, uma proteína de fusão 1-AGP-IgG1). Neste caso, uma proteína que interessa é fundida (por exemplo geneticamente) a uma molécula de imunoglobulina para aumentar a meia vida da proteína no soro. Dado que estas proteínas de 27-

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Mod. 75 - 20.000 m. - 90103 20

25 30 64.159 Ref: 00786 067 PT1 MGH - 0445-0 - Portugal

fusão têm uma vida prolongada no paciente, são mais passíveis de ser reconhecidas como antigénios estranhos e é por isso particularmente útil para essas proteínas evita rem os sistemas de ligação ao receptor Fc e de fixação co complemento do paciente.

Com a finalidade de bloquear as in teracções entre células ou proteínas, qualquer outra molé cuia transportadora apropriada pode ser utilizada. Geralmente preferem-se as proteínas devido às suas meias vidas relativamente longas no soro . UMa classe de proteínas transportadoras são as proteínas do soro tais como albumina (por exemplo, albumina do soro bovino ou albumina do soro feumano), transferina, ou oc-2 macroglobulina. As proteínas transportadoras podem conter localizações de adição de glicano endógenas ou podem ser introduzidas localizações na sequência ADN da proteína transportadora (conforme descrito acima), por exemplo pormutagénese dirigida à localização. A molécula transportadora pode, menos preferível mente, ser um lípido. Num exemplo, o lípido, om uma ou mais porções hidrato de carbono apenas (por exemplo, determinantes sialil-Lex) , é administrado sob a forma de li-posoma à parede da célula alvo (por exemplo, uma parede de célula alvo (por exemplo, uma parede de célula endote-lial). 0 liposoma pode bloquear uma interacção de célula ou proteína ou pode ser usado para administrar um medicamento ao seu ponto de acção apropriado. Para além da ELAM-1 , as moléculas de adesão celular podem ser inibidas por ligação de porções de reconhecimento de hidratos de carbono apropriadas a uma molécula transportadora, conforme descrito acima. Tais moléculas de adesão celular podem incluir, sem a elas se limitarem, LFA-1 , LFA-3, ICAM-1 , FÂDGEM, Mel--14, LAM-1, uma caderina, CAM celular ou una N-CAM. Outros glieanos podem ser ligados incluindo, sem a eles -28- 35 1 5 10 > 15

Mod. 71 - 20.000 βχ. - 90/08 20 J 25 30 6½.159 Eef: 00786 067 PT1 KGH - 0445.0 - Portugal se limitarem, qualquer glicano encadeado em N glicano encadeado em 0, GMP-140, Leu8 e glicanos de fosfato de m fcsfatidil inositol. Em casos em que o sinal de adição de glicano é conhecido, pode ser introduzido na sequência de ABI* de uma molécula orgânica portadora conforme descrito acima. Alternativamente, se a localização precisa não for, conhecida, mas tiver sido definida a região geral de tal local de adição nalguma molécula de ocorrência natural, um fragmento de ADN (da sequência que codifica a molécula de ocorrência natural) que inclua essa região pode ser clonado na sequência do ADN da desejada molécula portadora (por exemplo, uma sequência de codificação IgGl- ou odl--AGP). A produção de moléculas transportadoras portadoras de porções hidrato de carbono pode ser executada numa célula, preferivelmente uma célula eucarió-tica diferente da levedura. Células de mamíferos, por exemplo linhas de células de mamíferos, fornecem hospedeiras particularmente adequadas. Geralmente, estas células sintetizam as moléculas percursoras necessárias e produzem ou podem ser trabalhadas para produzir os enzimas responsáveis pela fixação do hidrato de carbono. Para a ligação dos determinantes sialil-Lex, linhas de células de mamífe v ros tais como CH0 e lecec11 são particularmente adequadas. Alternativamente, porções hidrato de carbono podem ser liga das a uma molécula portadora in vitro, isto é, extra-ce-lularmente. Num exemplo, oc-( 1,3-fucosiltransferase seria ligada a um suporte sólido (por exemplo, uma coluna) e a desejada molécula veículo passada para lá do enzima fixado fucosiltransferase, sob condições que facilitam a ligação de grupos sialil-Le a sua localização apropriada ou molécula portadora.Lisboa, 2I.FH.W2

ΊΗΕ GEMEPJL HOSPrEfi CDRPOPATIOH

Claims

1 J 10 15 Mod. 71 20.000 «κ. · 90/08

64.159 Ref: 00786 067 PT1 MGH - 0445.0 - Portugal REIVIDICAÇÕES =

1 — - Método para a identificação de uma molécula inibidora que bloqueia uma interacção rntre uma célula portadora ELAM-1 e uma segunda célula ou proteína, caracterizado pelo facto de se pôr a referida célula portadora ELAM-1 em contacto com uma molécula inibidora candidata e com a referida segunda célula ou proteína, se permitir a formação de um complexo de afinidade entre a referida célula portadora ELAM--1 e a referida segunda célula ou proteína, e se identificar a referida molécula inibidora como uma célula que diminui a formação do referido complexo de afinidade. 2® - Método de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo facto de a segunda célula ou * X proteína ser portadora de um determinante sialil-Le . 3â - Anticorpo para utilização no tratamento de uma doença caracterizado pela fixação de um primeiro membro de um par fixador específico a um segundo membro do referido par fixador específico num paciente, sendo o referido anticorpo específico para o referido primeiro membro sendo ligado covalentemente a uma porção hidrato de carbono que interfere com a referida capacidade do anticorpo para fixar completamerite e ligar um receptor F . 4§ - Anticorpo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o referido primeiro membro ser uma proteína.

51 - Anticorpo de acordo com a rei-

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64.159 Refs 00786 067 PT1 MGB - 0445·0 - Portugal vindicação 3, caracterizado pelo facto de o referido segundo membro ser uma proteína. 6ã - Anticorpo de acordo com a rei vindicação 3, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo se encontrar ligado covalentemente a múltiplas porções dos hidratos de carbono referidos. 7¾ - Anticorpo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a referida porção hidrato de carbono ser um determinante sialil-Lex . 8¾ - Anticorpo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de o referido determinante sialil-Lex ser ligado na posição N. 9§ - Anticorpo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de o determinan-te sialil-Le ser ligado na posição 0. 10¾ - Anticorpo de acordo com a reivindicação 3» caracterizado pelo facto de o referido anticorpo compreender um ou mais dos sítios N ligados de adição de glicano da glicoproteína ácida. 11¾ - Método para a construção de uma molécula transportadora à qual um hidrato de carbono específico para a proteína de adesão à célula se encontra ligado covalentemente, caracterizado por se pôr em contacto a molécula veículo com um enzima capaz de ligar a referida proteína ao referido hidrato de carbono determinante. 12¾ - Método de acordo com a reivindicação 11 , caracterizado pelo facto de o referido contacto se dar numa célula viva.

64.159 Ref: 00786 067 PT1 MGH - 0445-0 - Portugal 13- - Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de a referida célula ser eucariótica. 14^ - Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de a referida célula ser mamífera. 15ê - Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de a referida célula ser uma célula recombinante que contem ADN que codifica 0 referido enzima. 16S - Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto de o referido enzima ser uma (1 ,3)fucosiltransferase . Lisboa ,21. FEV. 1992 Por THE GENERAL HOSPITAL CORPORATION

Adjunto c'o ΔΟΓ! Eng.° Vasco i.eite Arco da Conceição. 3-1.° “ 1100 USBOA