PT99632B - Processo para a preparacao de uma substancia de ligacao de trombina - Google Patents

Processo para a preparacao de uma substancia de ligacao de trombina Download PDF

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Description

Domínio da Invenção:
A presente invenção refere-se a uma nova substância de ligação de trombina, a um fragmento de ADN que codifica para a sequência de ácidos aminados da referida substância de ligação de trombina, a um vector recombinante que con tém o referido fragmento de ADN, a uma célula transformada que incorpora o referido vector recombinante, a uma composição anti coagulante que contém a referida substância de ligação de trombina e que possui uma actividade de inibição da agregação de plaquetas e a um processo para a preparação da referida substân cia de ligação de trombina.
Descrição da técnica anterior;
Tem sido realizado um trabalho conside1 rável referente à função que a trombina desempenha como enzima proteolítica no mecanismo de regulação da coagulação do sangue e conseguiu-se elucidar o mecanismo da coagulação do sangue na sua maior parte.
Na literatura descreve-se como a trombi na activa a proteína C, que segundo esta descrição actua sobre os sistemas fibrinolítico e anticoagulante, e como existe uma determinada substância em extractos de tecidos de pulmão de coe lho que funciona como coenzima para o mecanismo de activação. Esta substância foi designada trombomodulina [N.L. Esmon et al., J. Biological Chemistry, 257, (2), 859-864 (1982)].
N. Aoki et al. descreveram como uma trombomodulina separada a partir de placenta humana com um peso molecular de cerca de 71 000 sob condições não redutoras possuic características semelhantes às da trombomodulina descrita por Esmon et al. [Thromb. Res., 37, 353-364 (1985)].
I. Maruyama et al. compararam as activi dade da trombomodulina humana separada a partir de placenta humana com um peso molecular de cerca de 75 000 com as actividades da trombomodulina de coelho acima mencionada. Estes autores afirmam que as duas trombomodulinas são equivalentes no que se refere à actividade [J. Clin. Invest., 75, 987-991 (1985)].
H. Ishii et al. descreveram como o pias? ma humano e a urina humana continham substâncias com as mesmas actividades da trombomodulina e afirmam que os pesos moleculares destas substâncias eram de 63 000 e 54 000 [J. Clin. Invest 76, 2178-2181 (1985)].
Os inventores da presente invenção tinham descoberto anteriormente dois tipos de substâncias de liga ção da trombina em urina humana. Estas substâncias são diferentes das anteriormente mencionadas e possuem pesos moleculares mais baixos, de cerca de 39 000 e 31 000 sob condições não redu toras. Os inventores da presente invenção depositaram um pedido de Patente destas substâncias (Patente Japonesa aberta a exame público (kokai) NS. 146898/1988).
Para além disso, os inventores da presente invenção separaram dois tipos de substâncias de ligação de trombina (A) e (B) a partir de urina humana e do caldo de
uma cultura de células derivadas de tecidos humanos, e estabele ceram um processo para a produção de grandes quantidades destas substâncias de ligação de trombina de modo estável. Os inventores da presente invenção depositaram anteriormente os pedidos de Patente sobre as substâncias de ligação de trombina e sobre os processos para a sua obtenção (Publicação de Patente Europeia NO. 455 681).
Os inventores da presente invenção obti veram uma substância de ligação de trombina derivada de urina humana usando uma técnica de ADN recombinante (r-UTM) e depositaram um pedido de Patente sobre este processo (Pedido de Paten te Japonesa N6. 5446/1991) .
É sabido que a trombomodulina de pulmão de coelho faz aumentar a actividade da antitrombina III [K. T. Preissner et al., J. Biological Chemistry, 265, 4915-4922 (1990)]. Esta actividade não é no entanto comum ã trombomodulina de bovino [Η. V. Jakubowski et al., J. Biological Chemistry, 261, 3876 (1986)], e a trombomodulina de placenta humana inibe a actividade da antitrombina III [K. Hirahara et al., Thrombo. Res., 57, 117-126 (1990)].
Para além disso, são conhecidas da técnica duas trombomodulinas solúveis produzidas por técnicas de manipulação genética. Sabe-se que uma faz aumentar a actividade da antitrombina III e a outra não possui esta capacidade [K. Nawa et al., Biochem. Biophys. Res., 171, 729-737 (1990)]. Sabe -se que estas trombomodulinas, no entanto, inibem a coagulação da trombina em plaquetas, o que constitui uma função importante no sistema de coagulação do sangue, mas que não possuem qualquer efeito de coagulação da ADP [N. L. Esmon, J. Biological Chemistry, 261, 12238-12242 (1983)].
A promoção da actividade de inibição da antitrombina III e da agregação das plaquetas em trombomodulinas humanas e noutras substâncias de ligação de trombina tem s_i do por conseguinte um objectivo de investigação.
SUMÃRIO DA INVENÇÃO
Em vista desta situação, os inventores ft
da presente invenção levaram a efeito investigações profundas a verificarem que um transformante preparado pela transformação de uma célula hospedeira com um vector recombinante no qual se encontra combinado um fragmento de ADN obtido por combinação de um fragmento de ADN especifico na extremidade 31 de um fragmento de ADN que codifica para uma substância de ligação de trombi na derivada de urina humana pode produzir uma substância de ligação de trombina derivada de urina humana com capacidade para fazer aumentar a actividade da antitrombina III e de inibir a agregação de plaquetas.
Deste modo, um objectivo da presente in venção é proporcionar uma nova substância de ligação de trombina que possui a sequência de ácidos aminados seguinte (seguidamente referida como Sequência A), um fragmento de ADN que poss sui uma sequência de nucleótidos que codifica para a Sequência A, um vector recombinante que incorpora o referido fragmento de ADN e um vector replicável e uma célula transformada que incorpora o referido vector recombinante.
<Sequência A>
AlaProAlaGluProGlnProGlyGlySerGlnCysValGluHIsAspCysPheAlaLeu
TyrProGlyProAlaThrPheLeuAsnAlaSerGlnlleCysAspGlyLeuArgGlyHis
LeuMetThrValArgSerSerValAlaAlaAspValIleSerLeuLeuLeuAsnGlyAsp
GlyGlyValGlyArgArgArgLeuTrplleGlyLeuGlnLeuProProGlyCysGlyAsp
ProLysArgLeuGlyProLeuArgGlyPheGlnTrpValThrGlyAspAsnAsnThrSer
TyrSerArgTrpAlaArgLeuAspLeuAsnGlyAlaProLeuCysGlyProLeuCysVal
AlaValSerAlaAlaGluAlaThrValProSerGluProIleTrpGluGluGlnGlnCys
GluValLysAlaAspGlyPheLeuCysGluPheHisPheProAlaThrCysArgProLeu
AlaValGluProGlyAlaAlaAlaAlaAlaValSerlleThrTyrGlyThrProPheAla
AlaArgGlyAlaAspPheGlnAlaLeuProValGlySerSerAlaAlaValAlaProLeu
GlyLeuGlnLeuMetCysThrAlaProProGlyAlaValGlnGlyHisTrpAlaArgGlu
AlaProGlyAlaTrpAspCysSerValGluAsnGlyGlyCysGluHisAlaCysAsnAla
IleProGlyAlaProArgCysGlnCysProAlaGlyAlaAlaLeuGlnAlaAspGlyArg
SerCysThrAlaSerAlaThrGlnSerCysAsnAspLeuCysGluHisPheCysValPro
AsnProAspGlnProGlySerTyrSerCysMetCysGluThrGlyTyrArgLeuAlaAla
AspGlnHisArgCysGluAspValAspAspCysIleLeuGluProSerProCysProGln
ArgCysValAsnThrGlnGlyGlyPheGluCysHisCysTyrProAsnTyrAspLeuVal . AspGlyGluCysValGluProValAspProCysPheArgAlaAsnCysGluTyrGlnCys 1 GlnProLeuAsnGlnThrSerTyrLeuCysValCysAlaGluGlyPheAlaProIlePro
HisGluProHisArgCysGlnMetPheCysAsnGlnThrAlaCysProAlaAspCysAsp ProAsnThrGlnAlaSerCysGluCysProGluGlyTyrlleLeuAspAspGlyPhelle CysThrAspIleAspGluCysGluAsnGlyGlyPheCysSerGlyValCysHisAsnLeu ProGlyThrPheGluCysIleCysGlyProAspSerAlaLeuValArgHisIleGlyThr AspCysAspSerGlyLysValAspXl X2 Yl SerGlySerGlyY2, em gue XI e X2 representam ácidos aminados acídicos e Yl e Y2 representam ácidos aminados arbitrários.
Outro objecto da presente invenção ê constituído por uma composição anticoagulante que contém a referida substância de ligação de trombina e que apresenta uma actividade de inibição da agregação das plaquetas.
Ainda um outro objecto da presente invenção é constituído por um processo para a preparação da refe rida substância de ligação de trombina.
Outros objectos, características e vantagens da presente invenção poderão ser compreendidos facilmente a partir da descrição que se segue.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 é um esquema que ilustra a estrutura dos vectores de expressão pCDM-GAG-UTMl e pCDM-GAG-UTM2 da presente invenção.
A Figura 2 é um esquema que ilustra a estrutura do vector de expressão pBPV-GAG-UTMl da presente in venção.
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO E DAS
FORMAS DE CONCRETIZAÇÃO PREFERIDAS
A substância de ligação de trombina da presente invenção pode ser preparada, por exemplo, de acordo com o processo seguinte. Em primeiro lugar prepara-se um ADN matriz por corte de um ADN genómico de placenta humana com uma endonuclense de restrição adequada. Procede-se a uma busca no ADN matriz usando, como sonda, um ADN iniciador sintetizado com referência a uma sequência nucleotídica de um gene humano de trom bomodulina conhecido [Shirai, T. et al., J. Biochem, 103, 281-285 (1988)]. 0 ADN produzido deste modo é fragmentado com uma endonuclease de restrição adequada e os fragmentos de ADN assim obtidos são ligados com um vector de clonagem a fim de transfor5
mar o microorganismo. Extrai-se um ADN plasmídico do transformante e trata-se com uma endonuclease de restrição a fim de pro duzir um fragmento de ADN que contém 1404 bases e que codifica para a substância de ligação de trombina derivada de urina huma na. INsere-se um oligonucleótido com uma sequência nucleotídica que codifica para a sequência de ácidos aminados xiX2Yl^erG^y_ SerGlyY2 fragmento de ADN, obtendo-se deste modo um fragmento de ADN que contém o fragmento de ADN da presente invenção.
São exemplos típicos de fragmentos de ADN da presente invenção os fragmentos que contém uma sequência nucleotídica apresentada em SEQ ID NS. 3 e em SEQ ID NQ. 4. Os fragmentos de ADN da presente invenção, no entanto, não se limitam a estes. Quaisquer fragmentos de ADN com capacidade para codificar para uma sequên cia de ácidos aminados que constitui a substância de ligação de trombina objecto da presente invenção, isto é, a sequência A, de preferência representada pela SEQ ID NS. 1 ou pela SEQ ID NQ. 2, consideram-se incluídos na presente invenção.
A construção do vector recombinante que contém o fragmento de ADN da presente invenção pode ser efectua da por ligação do fragmento de ADN da presente invenção com um vector de expressão replicável.
Para vectores de expressão podem usar-se vectores de qualquer origem, por exemplo procarióticos (como seja de E. coli), de leveduras, de vírus de insectos, de vírus de vertebrados, etc., desde que sejam replicáveis.
A fim de assegurar uma produção eficaz da substância de ligação de trombina, é desejável que o vector de expressão recombinante seja construído a partir das sequências nucleotídicas (1) a (7) seguintes segundo esta ordem em di recção a jusante da transcrição.
(1) uma sequência nucleotídica que actue como promotor.
(2) uma sequência nucleotídica que funcione como local de ligação de ribossoma.
(3) uma sequência nucleotídica que actue como codão de início.
(4) uma sequência nucleotídica que codi. fique para um peptídeo de sinal.
(5) uma sequência nucleotídica que cod_i fique para a sequência de ácidos aminados (A).
(6) uma sequência nucleotídica que actue como codão de paragem.
(7) uma sequência nucleotídica que actue como um sinal de adição de poli A.
De preferência usa-se para vector um ADN plasmídico, por exemplo um plasmídeo que se possa multiplicar por si próprio, por exemplo em E. coli como microorganismo hospedeiro e que possa expressar o gene inserido por transforma ção de células de mamífero. Um ADN plasmídico como o descrito contém sequências nucleotídicas necessárias para que o plasmídeo se multiplique em E. coli, como uma sequência nucleotídica que actue como replicador da série de plasmídeos ColEI, uma sequência nucleotídica que actue como promotor em células de mamí fero, um gene que funcione como marcador de selecção do E. coli transformado e um gene que funcione como marcador de selecção das células de mamífero transformadas. Numa forma de concretiza ção preferida, inclui ainda uma sequência nucleotídica de repl_i cação, como por exemplo as sequências SV40 ori, polioma ori ou HSV ori, que funcionam em células de mamífero. Os promotores considerados preferidos são por exemplo os promotores de citome galovírus, SV40, vírus de polioma, vírus do papiloma bovino, adenovírus, etc.; retrovírus LTR, por exemplo MMTV; um promotor de gene da metalotioneína e semelhantes. São exemplos de marcadores de selecção de E. coli os genes de resistência à ampicilj. na, os genes de resistência à kanamicina, os genes de resistência à tetraciclina, os genes de resistência ao cloramfenicol e semelhantes. São exemplos de marcadores de selecção de células de mamífero os genes de resistência à neomicina, os genes de re sistência ã higromicina B, os genes de quinase de timidina, os genes da redutase de di-hidrofolato, os genes da transferase de xantina-guanina-fosforribosilo e semelhantes. Estes genes podem ser usados quer isoladamente quer em combinação de dois ou mais.
A incorporação do fragmento de ADN da presente invenção nos vectores referidos pode ser efectuada por corte do ADN que contém o fragmento de ADN com uma endonuclease de restrição adequada, opcionalmente com adição de um adaptador adequado, e por combinação do fragmento obtido com o vector cor tado por uma endonuclease de restrição adequada. As endonucleases que podem ser usadas para este fim são, por exemplo, Eco RI, Sph I, Pst I, Hind III, Bam HI, Xho I, Xba I, Ban III, Sma I, Nco I e semelhantes. Podem também ser usadas enzimas de modi^ ficação de nucleótidos como a exonuclease III, Bal31, nuclease SI, exonuclease VII, nuclease de Pheseolus aureus, polimerase de ADN e semelhantes. Como adaptadores pode usar-se um adaptador de Eco RI, um adaptador de Sma I, um adaptador de Nco I, um adaptador de Bam HI, um adaptador de Xho I, um adaptador de Hind III, um adaptador de Pst I, um adaptador de Sph I, um adajo tador de Xbal I ou semelhantes.
As células transformadas que podem produzir de modo eficaz o vector recombinante e/ou a substância de ligação de trombina da presente invenção podem ser obtidas por introdução do vector de expressão recombinante obtido pelo méto do referido em células hospedeiras por meio do método das células competentes, pelo método dos protoplastos, pelo método da coprecipitação com fosfato de cãlcio, pelo método da electroporação, pelo método de DEAE-dextrano, pelo método da lipofectina ou por métodos equivalentes. São usados de preferência como células hospedeiras para a obtenção de transformantes organismos unicelulares como bactérias e leveduras, culturas de células de insectos, culturas de células de vertebrados e semelhantes. São usados de preferência para células hospedeiras de E. coli vários mutantes da estripe E. coli K12, por exemplo HB101, C600K, JM101, JM103, JM105, JM109, MV1034, MV1184, MC1061/P3 e semelhantes. São exemplos preferidos de células de mamífero células COS, células CHO, células L, células C127, células NIH3T3, célu las HeLa e semelhantes.
A substância de ligação de trombina pode ser obtida por cultura do transformante obtido deste modo, seguida de extracção e separação a partir das células cultivadas ou do caldo de cultura. Podem ser usados vários meios naturais ou artificiais para a cultura das células transformadas.
Os meios contêm de preferência fontes de carbono como por exemplo açúcares, álcoois e sais de ácidos orgânicos; fontes de azo to como por exemplo misturas proteicas, ácidos aminados e sais
de amónio; e sais inorgânicos. Para além disso, podem de preferência incluir-se vitaminas e antibióticos correspondentes aos genes marcadores de selecção. Se o vector é do tipo cuja express são pode ser regulada, é necessário adicionar um procedimento para induzir a expressão no decurso da cultura. Terminada a cu^ tura, centrifuga-se o caldo de cultura a fim de separar o líqui do das células. Nos casos em que a substância de ligação de trombina se acumula nas células, destroiem-se estas por meio de congelação-descongelação, tratamento com ultra-sons, passagem por uma prensa francesa, tratamento enzimãtico, ou por métodos equivalentes, e dissolve-se a substância de ligação de trombina usando EDTA, agentes tensio-activos, ureia, cloridrato de guanj. dina ou agentes equivalentes.
É possível obter uma substância de liga ção de trombina purificada submetendo o líquido da cultura ou o extracto celular que contém a substância de ligação de trombina preparada conforme descrito a uma cromatografia em coluna. Pode usar-se cromatografia de permuta iónica ou cromatografia de afi nidade, por exemplo usando o anticorpo monoclonal descrito na Patente Japonesa aberta a exame público (kokai) Ne. 45398/1989, cromatografia de filtração por gel, ou métodos equivalentes, tanto separadamente como em combinação. Entre as substâncias de ligação de trombina deste modo obtidas as que possuem a sequência de ãcidos aminados da SEQ ID NQ. 1 ou a SEQ ID NQ. 2 apresentam as seguintes características.
(1) Sequência de ãcidos aminados:
Com base na sequência nucleotídica dos fragmentos de ADN, considera-se que a sequência de ãcidos amina dos é a apresentada em SEQ ID NQs. 1 e 2.
(2) Peso molecular:
000 a 100 000 determinado por electoforese em gel de SDS-poliacrilamida sob condições não redutoras .
(3) Ponto isoeléctrico:
pH 3 a 4 determinado pelo método de electoforese isoeléctrica usando anfolite.
(4) Análise de açúcares:
A partir do peso molecular considera-se
que se encontram dois ou mais açúcares ligados às substâncias de ligação de trombina. Com base na sequência de ácidos aminados, considera-se que um dos açúcares é um polissacárido acídico ligado a Ser (474).
(5) Acções:
Possui actividade antitrombina.
Aumenta a actividade da antitrombina III
Possui uma actividade de inibição da agregação das plaquetas.
Como exemplos típicos de composições que contêm a substância de ligação de trombina da presente invenção como agente anticoagulante podem referir-se preparados injectáveis. Uma forma preferida destas preparados injectáveis é um pó liofilizado que se pode dissolver em ãgua destilada ou em salina fisiológica cada vez que se pretende proceder ã administração. 0 modo preferível de administrar o preparado é a injecção intravenosa.
Se bem que a dosagem dependa dos sintomas do paciente, do peso corporal e de outras circunstâncias, pode referir-se como preferida a dose de 10 ug/kg a 10 mg/kg. A substância de ligação de trombina da presente invenção não induz qualquer anormalidade com a dose entre os limites referidos. É uma substância muito segura.
Outras características da presente invenção tornar-se-ão evidentes no decurso da descrição que se se gue das formas de concretização exemplares que se destinam a elucidar mais completamente a presente invenção sem limitar o seu âmbito.
EXEMPLOS
Exemplo 1 <Clonagem do gene da substância de ligação de trombi na>
Sintetizaram-se os iniciadores ηθ. 1 com a sequência SEQ ID N°. 5 e iniciador n°. 2 com a sequência SEQ ID ΝΘ. 6 usando um sintetizador de ADN (ABI modelo 381A) com referência à sequência nucleotídica do gene da trombomoduli na humana [Shirai, T et al., J. Biochem, 103, 281-285 (1988)].
Preparou-se uma matriz de ADN por digestão de um ADN genómico de placenta humana (um produto da firma Clonetech Co.) com Bam Hl. Efectuou-se a amplificação do gene na solução de reacção da seguinte formulação usando um sistema Quick Thermo (modelo QTS-10M: marca registada, fabricada por Japan Genetic Co.) pela repetição de 30 ciclos de incubação? um ciclo era constituído por uma incubação a 94QC durante 2 minutos, a 50QC durante 3 mi nutos e a 72QC durante 4 minutos. Após a reacção, tomou-se uma amostra de uma porção do produto da reacção a fim de confirmar a amplificação da banda de ADN pretendido por meio de electoforese em gel de agarose.
Solução de reacção
Ãgua destilada 71 μΐ
Solução tampão * 10 μΐ
Solução mista de dNTP (2,5 mM) 8 μΐ
Iniciador nQ. 1 (20 μΜ) 5 μΐ
Iniciador nQ. 2 (20 μΜ) 5 μΐ
ADN matriz (1 pg/ml) 1 ul
AmpliTaq (5 unidades/μΐ) 0,5 μΐ * Solução tampão: cloreto de potássio 0,1 M tampão de tris»HCl 0,1 M (pH 8,3)
0,1% de gelatina cloreto de magnésio 15 mM
Recolheu-se ADN da solução de reacção por meio de precipitação com etanol, digeriu-se com Xho I e Knp Ie submeteu-se a electoforese em gel de agarose a fim de obter fragmentos Xho Ι-Κηρ I de 1,57 kb. Em separado, digeriu-se o vector para clonagem pUC118 [Vieira, J. e Messing, J., Methods Enzymol. 153, 3-11 (1987)] e digeriu-se com Hind II, ligou-se com o adaptador Xho I e digeriu-se ainda com Xho I e Knp I a fim de obter fragmentos do vector por electoforese em gel de agarose. Ligaram-se os fragmentos de vectores e os fragmentos Xho Ι-Κηρ I de 1,57 kb e transformou-se E. coli MV1034 [Vieira, J. e Messing, J., Methods Enzymol., 153, 3-11 (1987)] com o ADN ligado.
Estraíu-se ADN plasmídico do transformante obtido deste modo e digeriu-se com endonuclease de restri. ção. Deste modo, seleccionaram-se 6 clones que continham um
plasmídeo no qual se encontrava inserido o fragmento Xho I-Knp I de 1,57 kb derivado do gene da trombomodulina.
A determinação de sequências nucleotídi cas dos fragmentos inseridos em clones obtidos conforme descrito revelou 1 a 3 locais mutados em cada fragmento. Em seguida os seguintes fragmentos: fragmento Xho I-Sma I de 0,31 kb do clone 2, fragmento Sma I-Mlu I de 0,65 kb do clone 1 e fragmento Mlu Ι-Κρη I de 0,62 kb do clone 4, todos sem locais mutados, foram recombinados com o fragmento de vector anteriormente refe rido, a fim de se obter o plasmídeo pUCTM/XHO-KPN que contém um fragmento inserido do gene da trombomodulina humana com a sequência correcta.
Exemplo 2 Construção do vector para a expressão da substância de ligação de trombina
A fim de combinar um local de adição de glicosaminoglicano com a Asp na extremidade C-terminal da sequência de ácidos aminados da substância de ligação de trombina derivada de urina humana, sintetizaram-se os adaptadores $1 a $6 com as sequências de SEQ ID NQs. 7 a 12, respectivamente, e fosforilaram-se todas as extremidades 5'.
Digeriu-se o plasmídeo pUCTM/XHO com Xho I e Κρη I a fim de preparar um fragmento Xho Ι-Κρη I de 1,57 kb derivado de um gene da trombomodulina humana. Ligou-se este fragmento de 1,57 kb com o vector de expressão de células de mamífero CDM8 (um produto da firma Invitrogen Co.) que tinha sido digerido com Xho I e desfosforilado em conjunto com os adaptadores $1, $2, $3 e $4. Também se ligou o fragmento de 1,57 kb com o vector CDM8 digerido com Xho I e desfosforilado com os adaptadores $1, $2, $5 e $6. TRansformou-se E. coli MC1061/P3 [Seed, B. e Aruffo, A., Proc. Natl. Acad. Sei. USA,
84, 3365-3369 (1987)] com os ADNs ligados. Extrairam-se os ADNs plasmídicos dos transformantes preparados conforme descrito e digeriram-se com endunucleases de restrição a fim de confirmar a direcção e o local da inserção. Separaram-se por corte fragmentos de 1,68 kb que continham o fragmento de ADN da presente . invenção com Xho I a partir de 8 clones que apresentaram a di1 recção correcta da inserção e o mapa de restrição por endonu12 cleases também correcto. Verificou-se que as sequências nucleotídicas de todos os clones tinham a sequência de SEQ ID N°. 13 ou 14, confirmando que os vectores de expressão estavam construídos correctamente.
Os vectores de expressão da presente in venção obtidos conforme descrito foram designados pCDM-GAG-UTMl e pCDM-GAG-UTM2 (Figura 1), e o transformante que continha os vectores foram designados E. coli MC1061/P3 (pCDM-GAG-UTMl) e E. coli MC1061/P3 (pCDM-GAG-UTM2).
Exemplo 3 Expressão da substância de ligação de trombina pelas células de mamífero em cultura
Transfectaram-se células COS7 com pCDM-GAG-UTMl ou pCDM-GAG-UTM2 pelo método de DEAE-dextrano [Seed,
B. e Aruffo, A., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84, 3365-3369 5 (1987)]. Inocularam-se 5x10 células numa placa de cultura de 60 mm de diâmetro e, no dia seguinte, aspirou-se o meio de cultura e substituiu-se por 2 ml de meio essencial mínimo de Dulbecco modificado (DMEM) contendo 10% de soro Nu. Adicionaram-se 10 ug (1 ug/ul) de pCDM-GAG-UTMl ou pCDM-GAG-UTM2 a 100 ul de uma solução de DEAE-dextrano a 10 mg/ml (peso molecular médio:
5x10 , um produto da firma Pharmacia) em PBS, e adicionou-se a solução resultante a líquido da cultura das células juntamente com 10 ul de cloroquina 20 mM. Após cultivar durante 4 horas a 37SC, aspirou-se o meio de cultura e adicionaram-se 2 ml de DMSO a 10% (dissolvido em PBS). Deixou-se a mistura em repouso â temperatura ambiente durante 2 minutos. Após remoção da solução de DMSO por aspiração, adicionaram-se 3 ml de DMEM contendo 10% de FCS e cultivou-se a mistura a 37QC durante 24 horas. Substituiu-se o meio de cultura por DMEM que não continha FCS e em seguida continuou-se a cultura durante mais 48 horas. Após terminada a cultura, recolheu-se o sobrenadante.
Fez-se passar o meio de cultura obtido pelo processo anterior através de uma coluna de 1 ml de Sepharo se 4B (2 mg de IgG/ml de resina) que se tinha combinado com um anticorpo monoclonal A-73 (Patente Japonesa aberta a exame público (kokai) NQ. 45398/1989? 2 ml de IgG/ml de resina). Lavou-se a coluna com (1) 2 ml de tampão de tris-HCl 0,02 M (pH 7,4)
contendo NaCl 1 M, (2) 20 ml de tampão de tris-HCl 0,02 M (pH
7.4) contendo NaCl 1 M e 0,05% de Tween 20, e (3) 5 ml de tampão de tris-HCl 0,02 M (pH 7,4) contendo NaCl 1 M, e em seguida eluiu-se com 5 ml de tampão de tris-HCl 0,02 M (pH 7,4) contendo tiocianato de sódio 2 M, EDTA 5 mM e NaCl 1 M. Dialisou-se o eluído contra tampão de acetato 50 mM contendo NaCl 0,1 M (pH
4.5) e aplicou-se sobre uma coluna de Sepharose Mono-Q. Lavou-se a coluna com o mesmo tampão e eluiu-se com um gradiente linear de NaCl de 0,1 a 2 M em tampão de acetato 50 mM (pH 4,5), obtendo-se substâncias de ligação de trombina purificadas (r-GAG-UTM1 e r-GAG-UTM2).
Exemplo 4 <Expressão da substância de ligação de trombina pelas células de mamífero cultivadas>
Transfectaram-se células CHO«K1 com pCDM-GAG-UTMl pelo método do fosfato de cálcio [Gorman, C.,
DNA Cloning IRL Press, INglaterra, vol. 2, 143-190 (1985)]. Inocularam-se 5x10 células CHO-Kl numa capsula de Petri de 10 cm e, no dia seguinte, mudou-se o meio de cultura (meio Ham F12 contendo 10% de FCS, seguidamente referido abreviadamente por Meio). Após 4 (quatro) horas, adicionou-se um coprecipitado de ADN e fosfato de cálcio. O coprecipitado usado nesta experiência foi preparado do seguinte modo. Dissolveram-se 20 pg de pCDM-GAG-UTMl e 100 ng de gene resistente a neomicina em 450 pl de tampão de tris-HCl 1 mM (pH 8,0) - EDTA 0,1 mM e misturou-se com 50 pl de cloreto de cálcio 2,5 M. Adicionou-se gota a gota a mistura a 500 pl da seguinte solução: HEPES 50 mM (pH 7,12) - NaCl 280 mM - hidrogenofosfato de sódio 1,5 mM, e após deixar em repouso adicionou-se a solução ao meio de cultura das células para cultivar durante 24 horas. Substituiu-se o meio por um meio fresco e continuou-se a cultura durante mais 24 horas, depois do que se substituiu o meio por um meio selectivo contendo 400 pg/ml de G418. Após duas semanas, transferiram-se as colónias produzidas para uma placa de 24 alvéolos e cultivaram-se em contínuo até confluência. Recuperou-se o sobrenadante do caj. do da cultura. Analisou-se quantitativamente a substância de M , gação de trombina segregada (r-GAG-UTMl) a fim de seleccionar 1 os clones responsáveis pela produção mais elevada. O clone se- 14 I
leccionado foi ainda submetido a nova clonagem pelo método da diluição limitante. As células transformadas obtidas deste modo foram designadas CHO-GUTM 1-8 e foram depositadas no Instituto de Investigação de Fermentação, Agência de Ciência e Tecnologia Industrial (FERM P-3260).
Cultivou-se a célula transformada
CHO-GUTM 1-8 em meio UC202 (um produto da firma Nissui Pharma2 ceutical Co.) contendo 1% de FCS num balao de 225 cm ate se ob ter a confluência, depois do que se substituiu o meio por 50 ml de meio UC202 que não continha FCS. Após uma semana, recolheu-se o sobrenadante da cultura e adicionou-se a mesma quantidade de meio fresco sem FCS. Depois de manter a cultura durante mais uma semana, recolheu-se o sobrenadante da cultura e confirmou-se que este continha 3 a 4 ug/ml de substância de ligação de trombina que tinha sido segregada para o meio.
A substância de ligação de trombina purificada foi obtida de acordo com o mesmo procedimento da última parte do Exemplo 3.
Exemplo 4-b <Construção de um vector para a expressão da sub£3 tância de ligação de trombina e expressão da substância por meio de uma cultura de células de mamífero>
Digeriu-se o vector pCDM-GAG-UTMl com Xho I a fim de preparar um fragmento de 1,7 kb de ADNc de trmbomodulina humana modificada solúvel contendo um local a que se encontra ligado glicosaminoglicano. Em separado, digeriu-se um vector de expressão de células de mamífero pBPV (um produto da companhia Pharmacia Co.) com Xho I, desfosforilou-se e ligou -se com o fragmento de ADNc usando ligase de ADN T4 para transformar E. coli HB101 (produto de TAKARA SHUZO K.K.). Extraíram-se os ADNs dos transformantes preparados como descrito e digeriram-se com endonucleases a fim de confirmar a direcção e o lo cal da inserção. Seleccionaram-se clones que apresentavam a direcção e o local correctos. O vector de expressão da presente invenção construído deste modo foi designado por pBPV-GAG-UTMl (Fig. 2) e o transformante que contêm o vector foi designado por
E. COli ΗΒ 101 (pBPV-GAG-UTMl).
De um modo semelhante ao descrito no Exemplo 4 transfectaram-se células de rato C127 com o vector pBPV-GAG-UTMl por meio do método do fosfato de cálcio. Inocula5 ram-se 8 x 10 células numa placa de Petn de 10 cm e, no dia seguinte, mudou-se o meio de cultura (Meio Mínimo de Eagle mod^i ficado por Dulbecco (meio DMEM) contendo 10% de FCS). Quatro ho ras mais tarde, adicionou-se um coprecipitado de ADN e fosfato de cálcio. O coprecipitado utilizado foi preparado do seguinte modo. Dissolveu-se o plasmídeo contendo 20 microgramas de pBPV-GAG-UTMl e 100 ng de um gene de resistência à neomicina em 450 microlitros de um tampão de tris-HCl 1 mM (pH 8,0) e EDTA 0,1 mM e misturou-se com 50 microlitros de cloreto de cálcio 2,5 M. Adicionou-se a mistura gota a gota a 500 microlitros de uma solução de HEPES 50 mM (pH 7,12), NaCl 280 mM e hidrogenofosfato de sódio 1,5 mM, e após deixar em repouso durante 30 minutos ã temperatura ambiente adicionou-se a solução ao meio de cultura das células para cultivar durante 24 horas. Substituiu-se o meio por meio DMEM fresco e continuou-se a cultura durante mais 24 horas, e em seguida substituiu-se o meio por um meio DMEM a que se adicionara 5% de FCS e contendo 400 pg/ml de G418. Após 10 dias transferiram-se as colónias obtidas para uma placa de 24 alvéolos e continuou-se a cultura até confluência. Recolheu-se o sobrenadante do caldo de cultura. Analisou-se quantitativamen te a substância de ligação de trombina segregada a fim de se se leccionar os clones que davam a produção mais elevada. Em segui da procedeu-se ã clonagem dos clones seleccionados pelo método da diluição limitante.
As células Cl27 transformadas selec cionadas foram postas em cultura em meio DMEM com 5% de FCS adi_ 2 cionados numa garrafa de rolamento de 1750 cm até confluência e em seguida substituiu-se o meio por 500 ml de meio DMEM com 1% de FCS adicionado. Após uma semana, recolheu-se o sobrenadan te da cultura e confirmou-se que continha 2 pg/ml de substância de ligação de trombina que tinha sido segregada para o meio.
Obtiveram-se cerca de 800 ug de uma substância de ligação de trombina purificada (r-GAG-UTMl) de acordo com um procedimento análogo ao da última parte de Exem16 pio 3.
Exemplo 5 <Caracteristicas da substância de ligação de trombina >
Efectuou-se a SDS-PAGE de acordo com o método de Laemmli (Nature, 227, 680-685) sobre as substân cias de ligação de trombina purificadas. Transferiu-se a proteí na para uma membrana de PVDF de acordo com o método de Matsudai_ ra [J. Biol. Chem., 262 (21), 10035-10038]. Fez-se em seguida reagir a membrana de PVDF em tampão de tris-HCl 0,05 M (TBS) contendo 0,1% de albumina de soro de bovino e NaCl 0,1 M à temperatura ambiente durante duas horas. Após descarregar a solução, lavou-se bem o resíduo com TBS-Tween 20 a 0,05%, fez-se reagir com anticorpo monoclonal A-60 conjugado com peroxidase de rábano bastardo em solução de TBS-Tween 20 a 0,05% ã temperatura ambiente durante uma hora. Descarregou-se a solução, lavou-se bem o resíduo com Tween 20 a 0,05%-TBS e colocou-se em 50 ml de tampão de ácido acético (pH 5,0) contendo 5 mg de 3-amino -9-etilcarbazolo a 25 μΐ de peróxido de hidrogénio para coloração a fim de confirmar uma banda larga que ê caracteristica de aductos de glicosaminoglicano.
Exemplo 6
Trataram-se concentrações de 0,1 pg/ /ml de cada uma das substâncias de ligação de trombina da presen te invenção r-UTM e r-GAG-UTMl e 2 com 5 pl de condroitinase (10 mU, um produto da firma Seikagaku Kogyo K.K.) a 375 C duran te 40 minutos. Efectuou-se uma análise por marcha imunológica de modo idêntico ao descrito no Exemplo 5 a fim de confirmar a presença de ligações covalentes de glicosaminoglicano do tipo de sulfato de condroitina nas substâncias de ligação de trombina da presente invenção.
Exemplo 7 <Actividade anti-coagulante>
Misturaram-se concentrações de 2,5
pg/ml de cada uma das substâncias de ligação de trombina da pre sente invenção r-UTM e r-GAG-UTMl e 2 com fibrinogénio humano (2,5 mg/ml) e antitrombina III humana (0 ou 250 pg/ml) e disso^L veu-se em solução de CaCl2 5 mM. Adicionou-se trombina de bovino (0,5 U/ml) âs soluções a fim de medir o tempo de coagulação. Os resultados são apresentados no Quadro 1.
QUADRO 1
Branco (s) r-UTM (s) r-GAG-UTMl (s) r-GAG-UTM2 (s)
ATUI (-) 43,3 61,8 77,2 80,1
ATUI (+) 49,5 80,8 >400 >400
O Quadro 1 demonstra que as substân cias de ligação de trombina da presente invenção atrasam a coagulação sanguínea por se combinarem com a trombina. Verifica-se também uma promoção notável da actividade anti-coagulante das substâncias de ligação de trombina pela presença de antitrombina III.
Exemplo 8 Actividade anti-coagulante
Misturaram-se r-UTM (9 a 90 nM), r-GAG-UTM1 ou r-GAG-UTM2 da substância de ligação de trombina da presente invenção (9 a 90 nM), dissolvidas numa solução de fibrinogénio de bovino (1 mg/ml) em tampão de tris-HCl 20 mM (pH 7,4) contendo NaCl 0,15 M, com trombina de bovino (18 nM) a fim de medir o tempo necessário para a coagulação. Determinaram-se as concentrações de 50% de inibição (IC^g) a partir da curva de calibração preparada usando trombina de bovino em várias concen trações. Os resultados são apresentados no Quadro 2.
- 18 QUADRO 2
IC5Q (nM) r-UTM 80 r-GAG-UTMl 16 r-GAG-UTM2 15
Exemplo 9 < Actividade anti-coagulante >
Misturaram-se as substâncias da pre sente invenção (17 nM) ou r-UTM (17 nM) dissolvidas numa solução de fibrinogênio de bovino (1 mg/ml) em tampão de tris-HCl 20 mM (pH 7,4) contendo NaCl 0,15 M com trombina de bovino (18 nM) a fim de medir o tempo necessário para a coagulação. Os resultados são apresentados no Quadro 3.
QUADRO 3
tempo de coagulação (s)
Branco 28,1
r-UTM 29,6
r-GAG-UTMl 300,0
r-GAG-UTM2 295,3
Exemplo 10 <Actividade de inibição da agregação das plaquetas>
A 8 ul de uma solução de uma substân cia da presente invenção (10~6 a IO-8 M) e plasma rico em plaque tas (PRP)(200 μΐ), preparado a partir de sangue recolhido a partir da veia da orelha de coelho, adicionaram-se 2 μΜ de difosfatc de adenosina (ADP) a fim de medir a agregação das plaquetas. A concentração de inibição de 50%, isto é, a concentração dos com19
postos da presente invenção necessária para inibir a agregação da ADP, determinada com base na curva de calibração que foi pre
- - -7 parada usando ADP a varias concentrações, foi de 2x10 M para r-GAG-UTMl e de 2,1χ1θ7 M para r-GAG-UTM2, a substância r-UTM não apresentou qualquer actividade de inibição da agregação nas -6 -8 concentrações ensaiadas (de 10 a 10 ) .
Exemplo 11 <Alterações na concentração sangurnea>
Inseriu-se um cateter na veia femural direita de uma ratazana Wistar (macho) sob anestesia e atra vés do cateter administrou-se rapidamente 1 mg/ml.kg dos composs tos ensaiados, r-GAG-UTMl e r-UTM. Misturaram-se com heparina amostras de sangue de 0,1 ml cada recolhidas antes da administração e 1,3, 6, 10, 20, 30, 60 e 120 minutos apõs a administra ção e utilizaram-se como amostras para a determinação da concen tração sanguínea. A medição da concentração sanguínea foi efectuada de acordo com o método de sanduíche de ELISA usando um an ticorpo monoclonal de ligação de trombina anti-humano. Verificou-se que ambos os compostos ensaiados podiam ser analisados com o modelo de um compartimento. Os resultados são apresentados no quadro seguinte.
QUADRO 4
r-GAG-UTMl (n=3) r-UTM (n=5)
fc/2 (min) 75,2 + 0,8 45,4 + 2,6
AUC (min.pg/ml) 1380 + 61 872 + 64
Conforme se ilustrou anteriormente as substâncias de ligação de trombina da presente invenção promovem uma actividade antitrombina III e inibem a agregação das plaquetas e possuem uma actividade anti-trombina própria. Deste modo, estas substâncias são úteis como componentes eficazes de agentes anticoagulantes. Para além disso, as substâncias de ligação de trombina da presente invenção podem ser produzidas de * modo económico em grande escala
É óbvio que são possíveis numerosas modificações e variações da presente invenção â luz dos ensinamentos anteriores. Deverá entender-se por conseguinte que de acordo com o âmbito das reivindicações em anexo a presente invenção pode ser praticada de modos diferentes dos especificamen te descritos na presente memória.
LISTAGENS DE SEQUÊNCIAS
1. SEQ ID NQ. 1
2. Comprimento da sequência: 476
3. Tipo de sequência: ácidos aminados
4. Topologia da sequência: linear
5. Espécie: proteína
6. Sequência
Ala Pro Ala Glu Pro 5 Gin Pro Gly Gly Ser 10 Gin Cys Vai Glu His 15 Asp
Cys Phe Ala Leu 20 Tyr Pro Gly Pro Ala 25 Thr Phe Leu Asn Ala 30 Ser Gin
Ile Cys Asp 35 Gly Leu Arg Gly His 40 Leu Met Thr Vai Arg 45 Ser Ser Vai
Ala Ala 50 Asp Vai Ile Ser Leu 55 Leu Leu Asn Gly Asp 60 Gly Gly Vai Gly
Arg 65 Arg Arg Leu Trp Ile 70 Gly Leu Gin Leu Pro 75 Pro Gly Cys Gly Asp 80
Pro Lys Arg Leu Gly 85 Pro Leu Arg Gly Phe 90 Gin Trp Vai Thr Gly 95 Asp
Asn Asn Thr Ser 100 Tyr Ser Arg Trp Ala 105 Arg Leu Asp Leu Asn 110 Gly Ala
Pro Leu Cys 115 Gly Pro Leu Cys Vai 120 Ala Vai Ser Ala Ala 125 Glu Ala Thr
Vai Pro 130 Ser Glu Pro Ile Trp 135 Glu Glu Gin Gin Cys 140 Glu Vai Lys Ala
Asp 145 Gly Phe Leu Cys Glu 150 Phe His Phe Pro Ala 155 Thr Cys Arg Pro Leu 160
Ala Vai Glu Pro Gly 165 Ala Ala Ala Ala Ala 170 Vai Ser Ile Thr Tyr 175 Gly
Thr Pro Phe Ala 180 Ala Arg Gly Ala Asp 185 Phe Gin Ala Leu Pro 190 Vai Gly
Ser Ser Ala 195 Ala Vai Ala Pro Leu 200 Gly Leu Gin Leu Met 205 Cys Thr Ala
Pro Pro Gly 210 Ala Vai Gin Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala
215 220
Trp Asp Cys Ser Vai Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala
225 230 235 240
Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gin Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gin
245 250 255
Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gin Ser Cys Asn Asp
260 265 270
Leu Cys Glu His Phe Cys Vai Pro Asn Pro Asp Gin Pro Gly Ser Tyr
275 280 285
Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gin His Arg
290 295 300
Cys Glu Asp Vai Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gin
305 310 315 320
Arg Cys Vai Asn Thr Gin Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn
325 330 335
Tyr Asp Leu Vai Asp Gly Glu Cys Vai Glu Pro Vai Asp Pro Cys Phe
340 345 350
Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gin Cys Gin Pro Leu Asn Gin Thr Ser Tyr
355 360 365
Leu Cys Vai Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His
370 375 380
Arg Cys Gin Met Phe Cys Asn Gin Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp
385 390 395 400
Pro Asn Thr Gin Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp
405 410 415
Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe
420 425 430
Cys Ser Gly Vai Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys
435 440 445
Gly Pro Asp Ser Ala Leu Vai Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser
450 455 460
Gly Lys Vai Asp Glu Asp Tyr Ser Gly Ser Gly Glu
465 470 475
1. SEQ ID Ne. 2
2. Comprimento da sequência: 476
3. Tipo de sequência: ácidos aminados
4. Topologia da sequência: linear
5. Espécie: proteína
6. Sequência
Ala Pro Ala Glu Pro Gin Pro Gly Gly Ser Gin Cys Vai Glu His Asp 5 10 15
Cys Phe Ala Leu 20 Tyr Pro Gly Pro Ala 25 Thr Phe Leu Asn Ala 30 Ser Gin
Ile Cys Asp 35 Gly Leu Arg Gly His 40 Leu Met Thr Vai Arg 45 Ser Ser Vai
Ala Ala 50 Asp Vai Ile Ser Leu 55 Leu Leu Asn Gly Asp 60 Gly Gly Vai Gly
Arg 65 Arg Arg Leu Trp Ile 70 Gly Leu Gin Leu Pro 75 Pro Gly Cys Gly Asp 80
Pro Lys Arg Leu Gly 85 Pro Leu Arg Gly Phe 90 Gin Trp Vai Thr Gly 95 Asp
Asn Asn Thr Ser 100 Tyr Ser Arg Trp Ala 105 Arg Leu Asp Leu Asn 110 Gly Ala
Pro Leu Cys 115 Gly Pro Leu Cys Vai 120 Ala Vai Ser Ala Ala 125 Glu Ala Thr
Vai Pro 130 Ser Glu Pro Ile Trp 135 Glu Glu Gin Gin Cys 140 Glu Vai Lys Ala
Asp 145 Gly Phe Leu Cys Glu 150 Phe His Phe Pro Ala 155 Thr Cys Arg Pro Leu 160
Ala Vai Glu Pro Gly 165 Ala Ala Ala Ala Ala 170 Vai Ser Ile Thr Tyr 175 Gly
Thr Pro Phe Ala 180 Ala Arg Gly Ala Asp 185 Phe Gin Ala Leu Pro 190 Vai Gly
Ser Ser Ala 195 Ala Vai Ala Pro Leu 200 Gly Leu Gin Leu Met 205 Cys Thr Ala
Pro Pro 210 Gly Ala Vai Gin Gly 215 His Trp Ala Arg Glu 220 Ala Pro Gly Ala
Trp 225 Asp Cys Ser Vai Glu 230 Asn Gly Gly Cys Glu 235 His Ala Cys Asn Ala 240
Ile Pro Gly Ala Pro 245 Arg Cys Gin Cys Pro 250 Ala Gly Ala Ala Leu 255 Gin
Ala Asp Gly Arg 260 Ser Cys Thr Ala Ser 265 Ala Thr Gin Ser Cys 270 Asn Asp
Leu Cys Glu 275 His Phe Cys Vai Pro 280 Asn Pro Asp Gin Pro 285 Gly Ser Tyr
Ser Cys 290 Met Cys Glu Thr Gly 295 Tyr Arg Leu Ala Ala 300 Asp Gin His Arg
Cys 305 Glu Asp Vai Asp Asp 310 Cys Ile Leu Glu Pro 315 Ser Pro Cys Pro Gin 320
Arg Cys Vai Asn Thr 325 Gin Gly Gly Phe Glu 330 Cys His Cys Tyr Pro 335 Asn
Tyr Asp Leu Vai 340 Asp Gly Glu Cys Vai 345 Glu Pro Vai Asp Pro 350 Cys Phe
Arg 1 » • Ala Asn 355 Cys Glu Tyr Gin Cys 360 Gin Pro Leu Asn Gin 365 Thr Ser Tyr
Leu Cys Vai Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His
370 375 380
Arg Cys Gin Met Phe Cys Asn Gin Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp
385 390 395 400
Pro Asn Thr Gin Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp
405 410 415
Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe
420 425 430
Cys Ser Gly Vai Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys
435 440 445
Gly Pro Asp Ser Ala Leu Vai Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser
450 455 460
Gly Lys Vai Asp Asp Glu Ala Ser Gly Ser Gly Asp
465 470 475
1. SEQ ID Νθ. 3
2. Comprimento da sequência: 1428
3. Tipo de sequência: ácido nucleico
4. Tipo de cadeias: cadeia simples
5. Topologia da sequência: linear
6. Espécie: ADNc a ARNm
7. Sequência
GCACCCGCAG AGCCGCAGCC GGGTGGCAGC CAGTGCGTCG AGCACGACTG CTTCGCGCTC 60
TACCCGGGCC CCGCGACCTT CCTCAATGCC AGTCAGATCT GCGACGGACT GCGGGGCCAC 120
CTAATGACAG TGCGCTCCTC GGTGGCTGCC GATGTCATTT GGTTGGTAGT GAAGGGGGAG 180
GGCGGCGTTG GCCGCCGGCG CCTCTGGATC GGCCTGCAGC TGCCACCCGG GTGCGGCGAC 240
CCCAAGCGCC TCGGGCCCCT GCGCGGCTTC CAGTGGGTTA CGGGAGACAA CAACACCAGC 300
TATAGCAGGT GGGCACGGCT CGACCTCAAT GGGGCTCCCC TCTGCGGCCC GTTGTGCGTC 360
GCTGTCTCCG CTGCTGAGGC CACTGTGCCC AGCGAGCCGA TCTGGGAGGA GCAGCAGTGC 420
GAAGTGAAGG CCGATGGCTT CCTCTGCGAG TTCCACTTCC CAGCCACCTG CAGGCCACTG 480
GCTGTGGAGC CCGGCGCCGC GGCTGCCGCC GTCTCGATCA CCTACGGCAC CCCGTTCGCG 540
GCCCGCGGAG CGGACTTCCA GGCGCTGCCG GTGGGCAGCT CCGCCGCGGT GGCTCCCCTC 600
GGCTTACAGC TAATGTGCAC CGCGCCGCCC GGAGCGGTCC AGGGGCACTG GGCCAGGGAG 660
GCGCCGGGCG CTTGGGACTG CAGCGTGGAG AACGGCGGCT GCGAGCACGC GTGCAATGCG 720
ATCCCTGGGG CTCCCCGCTG CCAGTGCCCA GCCGGCGCCG CCCTGCAGGC AGACGGGCGC 780
TCCTGCACCG CATCCGCGAC GCAGTCCTGC AACGACCTCT GCGAGCACTT CTGCGTTCCC 840
AACCCCGACC AGCCGGGCTC CTACTCGTGC ATGTGCGAGA CCGGCTAGCC GCTGGCGGCC 900
GACCAACACC GGTGCGAGGA CGTGGATGAC TGCATACTGG AGCCCAGTCC GTGTCCGCAG 960
CGCTGTGICA ACACACAGGG TGGCTTCGAG TGCCACTGCT ACCCTAACTA CGACCTGGTG 1020
GACGGCGAGT GTGTGGAGCC CGTGGACCCG TGCTTCAGAG CCAACTGCGA GTACCAGTGC 1080
CAGCCCCTGA ACCAAACTAG CTACCTCTGC GTCTGCGCCG AGGGCTTCGC GCCCATTCCC 1140
CACGAGCCGC ACAGGTGCCA GATGTTTTGC AACCAGACTG CCTGTCCAGC CGACTGCGAC 1200
CCCAACACCC AGGCTAGCTG TGAGTGCCCT GAAGGCTACA TCCTGGACGA CGGTTTCATC 1260
TGCACGGACA TCGACGAGTG CGAAAACGGC GGCTTCTGCT CCGGGGTGTG CCACAACCTC 1320
CCCGGTACCT TCGAGTGCAT CTGCGGGCCC GACTCGGCCC TTGTCCACCA CATTGGCACC 1380
GACTGTGACT CCGGCAAGGT GGACGAGGAC TATAGCGGCT CTGGCGAG 1428
1. SEQ ID N°. 4
2. Comprimento da sequência: 1428
3. Tipo de sequência: acido nucleico
4. Tipo de cadeias: cadeia dupla
5. Topologia da sequência: linear
6. Espécie: ADNc de ARNm
7. Sequência
GCACCCGCAG AGCCGCAGCC GGGTGGCAGC TACCCGGGCC CCGCGACCTT CCTCAATGCC CTAATGACAG TGCGCTCCTC GGTGGCTGCC GGCGGCGTTG GCCGCCGGCG CCTCTGGATC CCCAAGCGCC TCGGGCCCCT GCGCGGCTTC TATAGCAGGT GGGCACGGCT CGACCTCAAT GCTGTCTCCG CTGCTGAGGC CACTGTGCCC GAAGTGAAGG CCGATGGCTT CCTCTGCGAG GCTGTGGAGC CCGGCGCCGC GGCTGCCGCC GCCCGCGGAG CGGACTTCCA GGCGCTGCCG GGCTTACAGC TAATGTGCAC CGCGCCGCCC GCGCCGGGCG CTTGGGACTG CAGCGTGGAG ATCCCTGGGG CTCCCCGCTG CCAGTGCCCA TCCTGCACCG CATCCGCGAC GCAGTCCTGC AACCCCGACC AGCCGGGCTG CTACTCGTGC GACCAACACC GGTGCGAGGA CGTGGATGAC CGCTGTGTCA ACACACAGGG TGGCTTCGAG GACGGCGAGT GTGTGGAGCC CGTGGACCCG CAGCCCCTGA ACCAAACTAG CTACCTCTGC CACGAGCCGC ACAGGTGCCA GATGTTTTGC CCCAACACCC AGGCTAGCTG TGAGTGCCCT TGCACGGACA TCGACGAGTG CGAAAACGGC CCCGGTACCT TCGAGTGCAT CTGCGGGCCC GACTGTGACT CCGGCAAGGT CGACGACGAG
GAGTGCGTCG AGCACGACTG CTTCGCGCTC 60
AGTCAGATCT GCGACGGACT GCGGGGCCAC 120
GATGTCATTT CCTTGCTACT GAACGGCGAC 180
GGCCTGCAGC TGCCACCCGG CTGCGGCGAC 240
CAGTGGGTTA CGGGAGACAA CAACACCAGC 300
GGGGCTCCCC TCTGCGGCCC GTTGTGCGTC 360
AGCGAGCCGA TCTGGGAGGA GCAGCAGTGC 420
TTCCACTTCC CAGCCACCTG CAGGCCACTG 480
GTCTCGATAC CCTACGGCAC CCCGTTCGCG 540
GTGGGCAGCT CCGCCGCGGT GGCTCCCCTC 600
GGAGCGGTGC AGGGGCACTG GGCCAGGGAG 660
AACGGCGGCT GCGAGCACGC GTGCAATGCG 720
GCCGGCGCCG CCCTGCAGGC AGACGGGGCG 780
AACGACCTCT GCGAGCACTT CTGCGTTCCC 840
ATGTGCGAGA CCGGCTACCG GCTGGCGGCC 900
TGCATACTGG AGCCCAGTCC GTGTCCGCAG 960
TGCCACTGCT ACCCTAACTA CGACCTGGTG 1020
TGCTTCAGAG CCAACTGCGA GTACCAGTGC 1080
GTCTGCGCCG AGGGCTTCGC GCCCATTCCC 1140
AACCAGACTG CCTGTCCAGC CGACTGCGAC 1200
GAAGGCTACA TCCTGGACGA CGGTTTCATC 1260
GGCTTCTGCT CCGGGGTGTG CCACAACCTC 1320
GACTCGGCCC TTGTCCGCCA CATTGGCACC 1380
GCCAGCGGCT CTGGCGAC 1428
1. SEQ ID NQ. 5
2. Comprimento da sequência: 21
3. Tipo de sequência: ácido nucleico
4. Tipo de cadeias: cadeia simples
5. Topologia da sequência: linear
6. Espécie: outro ácido nucleico, ADN sintetizado
7. Sequência
AGGGCCGGGC ACTTATAAAC T
1. SEQ ID NQ. 6
2. Comprimento da sequência: 21
3. Tipo de sequência: ácido nucleico
4. Tipo de cadeia: cadeia simples
5. Topologia da sequência: linear
6. Espécie: outro ácido nucleico, ADN sintetizado
7. Sequência
CCCAGTGGTC CAGTGACGTC A
1. SEQ ID NQ. 7
2. Comprimento da sequência: 39
3. Tipo de sequência: ácido nucleico
4. Tipo de cadeias: cadeia simples
5. Topologia da sequência: linear
6. Espécie: outro ácido nucleico, ADN sintetizado
7. Sequência
CTTCGAGTGC ATCTGCGGGC CCGACTCGGC CCTTGTCCG
1. SEQ ID NQ. 8
2. Comprimento da sequência: 49
3. Tipo de sequência: ácido nucleico
4. Tipo de cadeias: cadeia simples
5. Topologia da sequência: linear
6. Espécie: outro ácido nucleico, ADN sintetizado
7. Sequência
ATGTGGCGGA CAAGGGCCGA GTCGGGCCCG CAGATGCACT CGAAGGTAC
1. SEQ ID NQ. 9
2. Comprimento da sequência: 65
3. Tipo de sequência: ãcido nucleico
4. Tipo de cadeias: cadeia simples
5. Topologia da sequência: linear
6. Espécie: outro ácido nucleico, ADN sintetizado
7. Sequência
CCACATTGGC ACCGACTGTG ACTCCGGCAA GGTGGACGAG GACTATAGCG GCTCTGGCGA GTGAC 65
1. SEQ ID NQ. 10
2. Comprimento da sequência: 63
3. Tipo de sequência: ãcido nucleico
4. Tipo de cadeias: cadeia simples
5. Topologia da sequência: linear
6. Espécie: outro ãcido nucleico, ADN sintetizado
7. Sequência
TCGAGTCACT CGCCAGAGCC GCTATAGTCC TCGTCCACCT TGCCGGAGTC ACAGTCGGTG 6D CCA 63
1. SEQ ID NQ. 11
2. Comprimento da sequência: 65
3. Tipo de sequência: ãcido nucleico
4. Tipo de cadeias: cadeia simples
5. Topologia da sequência: linear
6. Espécie: outro ácido nucleico, ADN sintetizado
7. Sequência
CCACATTGGC ACCGACTGTG ACTCCGGCAA GGCGGACGAC GAGGCCAGCG GCTCTGGCGA 60 CTGAC 65
1. SEQ ID NQ. 12
2. Comprimento da sequência: 63
3. Tipo de sequência: ãcido nucleico
4. Tipo de cadeias: cadeia simples
5. Topologia da sequência: linear
6. Espécie: outro ãcido nucleico, ADN sintetizado
7. Sequência
TCGAGTGAGT CGCCAGAGCC GCTGGCCTCG TCGTCGACCT TGCCGGAGTC ACAGTCGGTG 60 CCA 63
1. SEQ ID N2. 13
2. Comprimento da sequência: 1680
3. Tipo de sequência: ácido nucleico
4. Tipo de cadeias: cadeia dupla
5. Topologia da sequência: linear
6. Espécie: ADNc a ARNm
7. Características da sequência
Símbolo que designa a característica: peptídeo sig Locais: 190, 243
Método para a determinação da característica: S Símbolo que designa a característica: peptídeo mat Locais: 244, 1671
Método para a determinação da característica: S
8. Sequência
CTCGAGCCCT GGCCGATCCG CATGTCAGAG GCTGCCTGGC AGGGGCTGCG CGCAGCGGCA 60
AGAAGTGTCT GGGCTGGGAC GGACAGGAGA GGCTGTCGCC ATCGGCGTCC TGTGCCCCTC 120
TGCTCCGGCA CGGCCCTGTC GCAGTGCCCG CGCTTTCCCC GGCGCCTGCA CGCGGCGCGC 180
CTGGGTAAC ATG CTT GGG GTC CTG GTC CTT GGC GCG CTG GCC CTG GCC GGC 231
Met Leu Gly Vai Leu Vai Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly
-18 -15 -10 -5
CTG GGG TTC CCC GCA CCC GCA GAG CCG CAG CCG GGT GGC AGC CAG TGC 279
Leu Gly Phe Pro Ala 1 Pro Ala Glu Pro 5 Gin Pro Gly Gly Ser 10 Gin Cys
GTC GAG CAC GAC TGC TTC GCG CTC TAC CCG GGC CCC GCG ACC TTC CTC 327
Vai Glu His 15 Asp Cys Phe Ala Leu 20 Tyr Pro Gly Pro Ala 25 Thr Phe Leu
AAT GCC AGT CAG ATC TGC GAC GGA CTG CGG GGC CAC CTA ATG ACA GTG 375
Asn Ala 30 Ser Gin Ile Cys Asp 35 Gly Leu Arg Gly His 40 Leu Met Thr Vai
CGG TCC TCG GTG GCT GCC GAT GTC ATT TCC TTG CTA CTG AAC GGC GAC 423
Arg 45 Ser Ser Vai Ala Ala Asp 50 Vai Ile Ser Leu 55 Leu Leu Asn Gly Asp 60
GGC GGC GTT GGC CGC CGG CGC CTC TGG ATC GGC CTG CAG CTG CCA CCC 471
Gly Gly Vai Gly Arg Arg Arg 65 Leu Trp Ile 70 Gly Leu Gin Leu Pro 75 Pro
GGC TGC GGC GAC CCC AAG CGC CTC GGG CCC CTG CGC GGC TTC CAG TGG 519
Gly Cys Gly Asp Pro Lys Arg 80 Leu Gly 85 Pro Leu Arg Gly Phe 90 Gin Trp
GTT ACG GGA Gly 95 GAC AAC AAC ACC Thr AGC TAT AGC AGG TGG GCA CGG CTC GAC 567
Vai Thr Asp Asn Asn Ser 100 Tyr Ser Arg Trp Ala 105 Arg Leu Asp
CTC AAT GGG GCT CCC CTC TGC GGC CCG TTG TGC GTC GCT GTC TCC GCT 615
Leu Asn Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Vai Ala Vai Ser Ala
110 115 120
GCT GAG GCC ACT GTG CCC AGC GAG CCG ATC TGG GAG GAG CAG CAG TGC 663
Ala Glu Ala Thr Vai Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gin Gin Cys
125 130 135 140
GAA GTG AAG GCC GAT GGC TTC CTC TGC GAG TTC CAC TTC CCA GCC ACC 711
Glu Vai Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr
145 150 155
TGC AGG CCA CTG GCT GTG GAG CCC GGC GCC GCG GCT GCC GCC GTC TCG 759
Cys Arg Pro Leu Ala Vai Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Vai Ser
160 165 170
ATC ACC TAC GGC ACC CCG TTC GCG GCC CGC GGA GCG GAC TTC CAG GCG 807
Ile Thr Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gin Ala
175 180 185
CTG CCG GTG GGC AGC TCC GCC GCG GTG GCT CCC CTC GGC TTA CAG CTA 855
Leu Pro Vai Gly Ser Ser Ala Ala Vai Ala Pro Leu Gly Leu Gin Leu
190 195 200
ATG TGC ACC GCG CCG CCC GGA GCG GTC CAG GGG CAC TGG GCC AGG GAG 903
Met Cys Thr Ala Pro Pro Gly Ala Vai Gin Gly His Trp Ala Arg Glu
205 210 215 220
GCG CCG GGC GCT TGG GAC TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC 951
Ala Pro Gly Ala Trp Asp Cys Ser Vai Glu Asn Gly Gly Cys Glu His
225 230 235
GCG TGC AAT GCG ATC CCT GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC 999
Ala Cys Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gin Cys Pro Ala Gly
240 245 250
GCC GCC CTG CAG GCA GAC GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG 1047
Ala Ala Leu Gin Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gin
255 260 265
TCC TGC AAC GAC CTC TGC GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG 1095
Ser Cys Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Vai Pro Asn Pro Asp Gin
270 275 280
CCG GGC TCC TAC TCG TGC ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC 1143
Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala
285 290 295 300
GAC CAA CAC CGG TGC GAG GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT 1191
Asp Gin His Arg Cys Glu Asp Vai Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser
305 310 315
CCG TGT CCG CAG CGC TGT GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC 1239
Pro Cys Pro Gin Arg Cys Vai Asn Thr Gin Gly Gly Phe Glu Cys His
320 325 330
TGC TAC CCT AAC TAC GAC CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG 1287
Cys Tyr Pro Asn Tyr Asp Leu Vai Asp Gly Glu Cys Vai Glu Pro Vai
335 340 345
GAC CCG TGC TTC AGA GCC Arg Ala
Asp Pro Cys Phe
350
CAA ACT AGC TAC CTC TGC
Gin 365 Thr Ser Tyr Leu Cys 370
CAC GAG CCG CAC AGG TGC
His Glu Pro His Arg Cys 385
GCC GAC TGC GAC CCC AAC
Ala Asp Cys Asp 400 Pro Asn
TAC ATC CTG GAC GAC GGT
Tyr Ile Leu 415 Asp Asp Gly
AAC GGC GGC TTC TGC TCC
Asn Gly Gly 430 Phe Cys Ser
GAG TGC ATC TGC GGG CCC
Glu 445 Cys Ile Cys Gly Pro 450
GAC TGT GAC TCC GGC AAG
Asp Cys Asp Ser Gly Lys 465
TGACTCGAG
AAC TGC GAG TAC CAG TGC
Asn 355 Cys Glu Tyr Gin Cys 360
GTC TGC GCC GAG GGC TTC
Vai Cys Ala Glu Gly 375 Phe
CAG ATG TTT TGC AAC CAG
Gin Met Phe Cys 390 Asn Gin
ACC CAG GCT AGC TGT GAG
Thr Gin Ala 405 Ser Cys Glu
TTC ATC TGC ACG GAC ATC
Phe Ile 420 Cys Thr Asp Ile
GGG GTG TGC CAC AAC CTC
Gly 435 Vai Cys His Asn Leu 440
GAC TCG GCC CTT GTC CGC
Asp Ser Ala Leu Vai 455 Arg
GTG GAC GAG GAC TAT AGC
Vai Asp Glu Asp 470 Tyr Ser
Gin Pro Leu Asn
GCG CCC ATT CCC 1383 Ala Pro Ile Pro
380
ACT GCC TGT CCA 1431 Thr Ala Cys Pro
395
TGC CCT GAA GGC 1479 Cys Pro Glu Gly
410
GAC GAG TGC GAA 1527
Asp Glu Cys Glu
425
CCC GGT ACC TTC 1575
Pro Gly Thr Phe
CAC ATT GGC ACC 1623
His Ile Gly Thr
460
GGC TCT GGC GAG 1671 Gly Ser Gly Glu
475
1680
1. SEQ ID N2. 14
2. Comprimento da sequência: 1680
3. Tipo de sequência: ácido nucleico
4. Tipo de cadeias: Cadeia dupla
5. Topologia da sequência: linear
6. Espécie: ADNc a ARNm
7. Caracteristicas da sequência
Símbolo que designa a característica: peptídeo sig Locais: 190, 243
Método para a determinação da característica: S Símbolo que designa a característica: peptídeo mat Locais: 244, 1671
Método para a determinação da característica: S
8. Sequência
CTCGAGCCCT GGCCGATCCG CATGTCAGAG GCTGCCTCGC AGGGGCTGCG CGCAGCGGCA 60
AGAAGTGTCT GGGCTGGGAC GGACAGGAGA GGCTGTCGCC ATCGGCGTCC TGTGCCCCTC 120
TGCTCCGGCA CGGCCCTGTC GCAGTGCCCG CGCTTTCCCC GGCGCCTGCA CGCGGCGCGC 180
- 30 231
CTGGGTAAC ATG CTT GGG GTC CTG GTC CTT GGC GCG CTG GCC CTG GCC GGC Met Leu Gly Vai Leu Vai Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly
-18 -15 -10 -5
CTG GGG TTC CCC GCA CCC GCA GAG CCG CAG CCG GGT GGC AGC CAG TGC 279
Leu Gly Phe Pro Ala 1 Pro Ala Glu Pro 5 Gin Pro Gly Gly Ser 10 Gin Cys
GTC GAG CAC GAC TGC TTC GCG CTC TAC CCG GGC CCC GCG ACC TTC CTC 327
Vai Glu His 15 Asp Cys Phe Ala Leu 20 Tyr Pro Gly Pro Ala 25 Thr Phe Leu
ΔΑΤ GCC AGT CAG ATC TGC GAC GGA CTG CGG GGC CAC CTA ATG ACA GTG 375
Asn Ala 30 Ser Gin Ile Cys Asp 35 Gly Leu Arg Gly His 40 Leu Met Thr Vai
CGC TCC TCG GTG GCT GCC GAT GTC ATT ICC TTG CTA CTG AAC GGC GCA 423
Arg 45 Ser Ser Vai Ala Ala 50 Asp Vai Ile Ser Leu 55 Leu Leu Asn Gly Asp 60
GGC GGC GTT GGC CGC CGG CGC CTC TGG ATC GGC CTG CAG CTG CCA CCC 471
Gly Gly Vai Gly Arg Arg Arg 65 Leu Trp Ile 70 Gly Leu Gin Leu Pro 75 Pro
GGC TGC GGC GAC CCC AAG CGC CTC GGG CCC CTG CGC GGC TTC CAG TGG 519
Gly Cys Gly Asp 80 Pro Lys Arg Leu Gly 85 Pro Leu Arg Gly Phe 90 Gin Trp
GTT ACG GGA GAC AAC AAC ACC AGC TAT AGC AGG TGG GCA CGG CTC GAC 567
Vai Thr Gly Asp 95 Asn Asn Thr Ser Tyr 100 Ser Arg Trp Ala Arg 105 Leu Asp
CTC ΔΔΤ GGG GCT CCC CTC TGC GGC CCG TTG TGC GTC GCT GTC TCC GCT 615
Leu Asn 110 Gly Ala Pro Leu Cys 115 Gly Pro Leu Cys Vai 120 Ala Vai Ser Ala
GCT GAG GCC ACT GTG CCC AGC GAG CCG ATC TGG GAG GAG CAG CAG TGC 663
Ala 125 Glu Ala Thr Vai Pro 130 Ser Glu Pro Ile Trp 135 Glu Glu Gin Gin Cys 140
GAA GTG AAG GCC GAT GGC TTC CTC TGC GAG TTC CAC TTC CCA GCC ACC 711
Glu Vai Lys Ala Asp 145 Gly Phe Leu Cys Glu 150 Phe His Phe Pro Ala 155 Thr
TGC AGG CCA CTG GCT GTG GAG CCC GGC GCC GCG GCT GCC GCC GTC TCG 759
Cys Arg Pro Leu 160 Ala Vai Glu Pro Gly 165 Ala Ala Ala Ala Ala 170 Vai Ser
ATC ACC TAC GGC ACC CCG TTC GCG GCC CGC GGA GCG GAC TTC CAG GCG 807
Ile Thr Tyr 175 Gly Thr Pro Phe Ala 180 Ala Arg Gly Ala Asp 185 Phe Gin Ala
CTG CCG GTG GGC AGC TCC GCC GCG GTG GCT CCC CTC GGC TTA CAG CTA 855
Leu Pro 190 Vai Gly Ser Ser Ala 195 Ala Vai Ala Pro Leu 200 Gly Leu Gin Leu
ATG TGC ACC GCG CCG CCC GGA GCG GTC CAG GGG CAC TGG GCC AGG GAG 903
Met 205 Cys Thr Ala Pro Pro 210 Gly Ala Vai Gin Gly 215 His Trp Ala Arg Glu
GCG CCG GGC GCT TGG GAC TGC AGC GTG GAG AAC GGC GGC TGC GAG CAC 951
Ala Pro Gly Ala Trp 225 Asp Cys Ser Vai Glu 230 Asn Gly Gly Cys Glu 235 His
GCG TGC ΔΑΤ GCG ATC CCT GGG GCT CCC CGC TGC CAG TGC CCA GCC GGC
Ala Cys Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gin Cys Pro Ala Gly
240 245 250
GCC GCC CTG CAG GCA GAC GGG CGC TCC TGC ACC GCA TCC GCG ACG CAG
Ala Ala Leu Gin Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gin
255 260 265
TCC TGC AAC GAC CTC TGC GAG CAC TTC TGC GTT CCC AAC CCC GAC CAG
Ser Cys Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Vai Pro Asn Pro Asp Gin
270 275 280
GCG GGC TCC TAC TCG TGC ATG TGC GAG ACC GGC TAC CGG CTG GCG GCC
Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala
285 290 295 300
GAC CAA CAC CGG TGC GAG GAC GTG GAT GAC TGC ATA CTG GAG CCC AGT
Asp Gin His Arg Cys Glu Asp Vai Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser
305 310 315
CCG TGT CCG CAG CGC TGT GTC AAC ACA CAG GGT GGC TTC GAG TGC CAC
Pro Cys Pro Gin Arg Cys Vai Asn Thr Gin Gly Gly Phe Glu Cys His
320 325 330
TGC TAC CCT AAC TAC GAC CTG GTG GAC GGC GAG TGT GTG GAG CCC GTG
Cys Tyr Pro Asn Tyr Asp Leu Vai Asp Gly Glu Cys Vai Glu Pro Vai
335 340 345
GAC CCG TGC TTC AGA GCC AAC TGC GAG TAC CAG TGC CAG CCC CTG AAC
Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gin Cys Gin Pro Leu Asn
350 355 360
CAA ACT AGC TAC CTC TGC GTC TGC GCC GAG GGC TTC GCG CCC ATT CCC
Gin Thr Ser Tyr Leu Cys Vai Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro
365 370 375 380
CAC GAG CCG CAC AGG TGC CAG ATG TTT TGC AAC CAG ACT GCC TGT GCA
His Glu Pro His Arg Cys Gin Met Phe Cys Asn Gin Thr Ala Cys Pro
385 390 395
GCC GAC TGC GAC CCC AAC ACC CAG GCT AGC TGT GAG TGC CCT GAA GGC
Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gin Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly
400 405 410
TAC ATC CTG GAC GAC GGT TTC ATC TGC ACG GAC ATC GAC GAG TGC GAA
Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu
415 420 425
AAC GGC GGC TTC TGC TCC GGG GTG TGC CAC AAC CTC CCC GGT ACC TTC
Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Vai Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe
430 435 440
GAG TGC ATC TGC GGG CCC GAC TCG GCC CTT GTC CGC CAC ATT GGC ACC
Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Vai Arg His Ile Gly Thr
445 450 455 460
GAC TGT GAC TCC GGC AAG GTC GAC GAC GAG GCC AGC GGC TCT GGC GAC
Asp Cys Asp Ser Gly Lys Vai Asp Asp Glu Ala Ser Gly Ser Gly Asp
465
470
475
999
1047
1095
1143
1191
1239
1287
1335
1383
1431
1479
1527
1575
1623
1671
TGACTCGAG
1680

Claims (1)

  1. Processo para a preparação de uma substância de ligação de trombina com a seguinte sequência de ácidos aminados.
    AlaProAlaGluProGlnProGlyGlySerGlnCysValGluHisAspCysPheAlaLeuTyr ProGlyProAlaThrPheLeuAsnAlaSerGlnlleCysAspGlyLeuArgGlyHisLeuMet ThrValArgSerSerValAlaAlaAspValIleSerLeuLeuLeuAsnGlyAspGlyGlyVal GlyArgArgArgLeuTrpIleGlyLeuGlnLeuProProGlyCysGlyAspProLysArgLeu GlyProLeuArgGlyPheGlnTrpValThrGlyAspAsnAsnThrSerTyrSerArgTrpAla ArgLeuAspLeuAsnGlyAlaProLeuCysGlyProLeuCysValAlaValSerAlaAlaGlu AlaThrValProSerGluProIleTrpGluGluGlnGlnGlnCysGluValLysAlaAspGly PheLeuCysGluPheHisPheProAlaThrCysArgProLeuAlaValGluProGlyAlaAla AlaAlaAlaValSerlleThrTyrGlyThrProPheAlaAlaArgGlyAlaAspPheGlnAla LeuProValGlySerSerAlaAlaValAlaProLeuGlyLeuGlnLeuMetCysThrAlaPro ProGlyAlaValGlnGlyHisTrpAlaArgGluAlaProGlyAlaTrpAspCysSerValGlu AsnGlyGlyCysGluHisAlaCysAsnAlalleProGlyAlaProArgCysGlnCysProAla GlyAlaAlaLeuGlnAlaAspGlyArgSerCysThrAlaSerAlaThrGlnSerCysAsnAsp LeuCysGluHisPheCysValProAsnProAspGlnProGlySerTyrSerCysMetCysGlu ThrGlyTyrArgLeuAlaAlaAspGlnHisArgCysGluAspValAspAspCysIleLeuGlu ProSerProCysProGlnArgCysValAsnThrGlnGlyGlyPheGluCysHisCysTyrPro AsnTyrAspLeuValAspGlyGluCysValGluProValAspProCysPheArgAlaAsnCys GluTyrGlnCysGlnProLeuAsnGlnThrSerTyrLeuCysValCysAlaGluGlyPheAla ProIleProHisGluProHisArgCysGlnMetPheCysAsnGlnThrAlaCysProAlaAsp CysAspProAsnThrGlnAlaSerCysGluCysProGluGlyTyrlleLeuAspAspGlyPhe IleCysThrAspIleAspGluCysGluAsnGlyGlyPheCysSerGlyValCysHisAsnLeu ProGlyThrPheGluCysIleCysGlyProAspSerAlaLeuValArgHisIleGlyThrAsp CysAspSerGlyLysValAspXl X2 Yl SerGlySerGlyY2, em que XI e X2 representam ácidos aminados acídicos e Yl e Y2 re presentam quaisquer ácidos aminados arbitrários, caracterizado por:
    cultivar-se uma célula transformada que contém um vector re combinante que contém um vector replicável e um fragmento de ADN que possui uma sequência nucleotídica que codifica para a referi da sequência de ácidos aminados e separar os polipeptídeos produzidos pelas células cultiva das.
    - 2ã Processo de acordo com a reivindica· ção 1, caracterizado por se obter uma substância de ligação de trombina em que XI é Glu, X2 é Asp, Y1 é Tyr e Y2 ê Glu.
    - 3§ Processo de acordo com a reivindica· ção 1, caracterizado por se obter uma substância de ligação de trombina em gue XI é Asp, X2 é Glu, Y1 é Ala e Y2 ê Asp.
    - 4§ Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por se obter uma substância de ligação de trombina que é um polipeptídeo glicosilado.
    - 5§ Processo para a preparação de um fragmento de ADN que codifica para a sequência de ácidos aminados seguinte,
    AlaProAlaGluProGlnProGlyGlySerGlnCysValGluHisAspCysPheAlaLeuTyr
    ProGlyProAlaThrPheLeuAsnAlaSerGlnlleCysAspGlyLeuArgGlyHisLeuMet
    ThrValArgSerSerValAlaAlaAspValIleSerLeuLeuLeuAsnGlyAspGlyGlyVal
    GlyArgArgArgLeuTrpIleGlyLeuGlnLeuProProGlyCysGlyAspProLysArgLeu
    GlyProLeuArgGlyPheGlnTrpValThrGlyAspAsnAsnThrSerTyrSerArgTrpAla
    ArgLeuAspLeuAsnGlyAlaProLeuCysGlyProLeuCysValAlaValSerAlaAlaGlu
    AlaThrValProSerGluProIleTrpGluGluGlnGlnCysGluValLysAlaAspGlyPhe
    LeuCysGluPheHisPheProAlaThrCysArgProLeuAlaValGluProGlyAlaAlaAla
    AlaAlaValSerlleThrTyrGlyThrProPheAlaAlaArgGlyAlaAspPheGlnAlaLeu
    ProValGlySerSerAlaAlaValAlaProLeuGlyLeuGlnLeuMetCysThrAlaProPro
    GlyAlaValGlnGlyHisTrpAlaArgGluAlaProGlyAlaTrpAspCysSerValGluAsn
    GlyGlyCysGluHisAlaCysAsnAlalleProGlyAlaProArgCysGlnCysProAlaGly AlaAlaLeuGlnAlaAspGlyArgSerCysThrAlaSerAlaThrGlnSerCysAsnAspLeu CysGluHisPheCysValProAsnProAspGlnProGlySerTyrSerCysMetCysGluThr GlyTyrArgLeuAlaAlaAspGlnHisArgCysGluAspValAspAspCysIleLeuGluPro SerProCysProGlnArgCysValAsnThrGlnGlyGlyPheGluCysHisCysTyrProAsn TyrAspLeuValAspGlyGluCysValGluProValAspProCysPheArgAlaAsnCysGlu TyrGlnCysGlnProLeuAsnGlnThrSerTyrLeuCysValCysAlaGluGlyPheAlaPro IleProHisGluProHisArgCysGlnMetPheCysAsnGlnThrAlaCysProAlaAspCys AspProAsnThrGlnAlaSerCysGluCysProGluGlyTyrlleLeuAspAspGlyPhelle CysThrAspIleAspGluCysGluAsnGlyGlyGlyPheCysSerGlyValCysHisAsnLeu ProGlyThrPheGluCysIleCysGlyProAspSerAlaLeuValArgHisIleGlyThrAsp CysAspSerGlyLysValAspXl X2 Yl SerGlySerGlyY2, em que XI e X2 representam ácidos aminados acídicos e Yl e Y2 representam quaisquer ácidos aminados arbitrários, caracterizado por compreender as seguintes fases:
    preparar um ADN matriz por corte de um genoma de placenta humana com uma endonuclease de restrição, seleccionar o ADN matriz usando como sonda um ADN iniciador sintético que contém uma sequência de bases de um gene huma no conhecido de trombomodulina, fragmentar o ADN obtido com uma endonuclease de restrição adequada, ligar os fragmentos de ADN obtidos com um vector de clona gem, transformar um microorganismo adequado, extrair do transformante um ADN plasmídico, tratar o ADN plasmídico com uma endonuclease de restrição separar um fragmento de ADN que codifica para a substância de ligação da trombina e inserir neste fragmento um oligonucleótido que codifica para a sequência de ácidos aminados x]i X2YiSerGlySerGlyY2 r em que XI, X2, Yl e Y2 possuem os significados anteriormente de finidos.
    - 63 Processo de acordo com a reivindica ção 5, caracterizado por se obter um fragmento de ADN em que XI é Glu, X2 é Asp, Y1 ê Tyr e Y2 é Glu
    - 7§ Processo de acordo com a reivindica ção 5, caracterizado por se obter um fragmento de ADN em que XI é Asp, X2 é Glu, Y1 é Ala e Y2 é Asp.
    - 8â Processo de acordo com a reivindica ção 5, caracterizado por se obter um fragmento de ADN que tem a seguinte sequência nucleotídica,
    GCACCCGCAG AGCCGCAGCC GGGTGGCAGC CAGTGCGTCG AGCACGACTG CTTCGCGCTC 60 TACCCGGGCC CCGCGACCTT CCTCAATGCC AGTCAGATCT GCGACGGACT GCGGGGCCAC 120 GTAATGACAG TGCGCTCCTC GGTGGCTGCC GATGTCATTT CCTTGCTACT GAACGGCGAC 180 GGCGGCGTTG GCCGCCGGCG CCTCTGGATC GGCCTGCAGC TGCCACCCGG CTGCGGCGAC 240 CCCAAGCGCC TCGGGCCCCT GCGCGGCTTC CAGTGGGTTA CGGGAGACAA CAACACCAGC 300 TATAGCAGGT GGGCACGGCT CGACCTCAAT GGGGCTCCCC TCTGCGGCCC GTTGTGCGTC 360 GCTGTCTCCG CTGCTGAGGC CACTGTGCCC AGCGAGCCGA TCTGGGAGGA GCAGCAGTGC 420 GAAGTGAAGG CCGATGGGTT CCTCTGCGAG TTCCACTTCC CAGCCACCTG CAGGCCACTG 480 GCTGTGGAGC CCGGCGCCGC GGCTGCCGCC GTGTCGATCA CCTACGGCAC CCCGTTCGCG 540 GCCCGCGGAG CGGACTTCCA GGCGCTGCCG GTGGGAGCTC CCGCCGCGGT GGCTCCCCTC 600 GGCTTACAGC TAATGTGCAC CGCGCCGCCC GGAGCGGTCC AGGGGCACTG GGCCAGGGAG 660 GCGCCGGGCG CTTGGGACTG CAGCGTGGAG AACGGCGGCT GCGAGCACGC GTGCAATGCG 720 ATCCCTGGGG CTCCCCGCTG CCAGTGCCCA GCCGGCGCCG CCCTGCAGGC AGACGGGCGC 780 TCCTGCACCG CATCCGCGAC GCAGTCCTGC AACGACCTCT GCGAGCACTT CTGCGTTCCC 840 AACCCCGACC AGCCGGGCTC CTACTCGTGC ATGTGCGAGA CCGGCCTACC GCTGGCGGCC 900 GACCAACACC GGTGCGAGGA CGTGGATGAC TGCATACTGG AGCCCAGTCC GTGTCCGCAG 960 CGCTGTGTCA ACACACAGGG TGGCTTCGAG TGCCACTGCT ACCCTAACTA CGACCTGGTG 1020 GACGGCGAGT GTGTGGAGCC CGTGGACCCG TGCTTGAGAG CCAACTGCGA GTACCAGTGC 1080 CAGCCCCTGA ACCAAACTAG CTACCTCTGC GTCTGCGCCG AGGGCTTCGC GCCCATTCCC 1140 CACGAGCCGC ACAGGTGCCA GATGTTTTGC AACCAGACTG CCTGTCCAGC CGACTGCGAC 1200 CCCAACACCC AGGCTAGCTG TGAGTGCCCT GAAGGCTACA TCCTGGACGA CGGTTTCATC 1260 TGCACGGACA TCGACGAGTG CGAAAACGGC GGCTTCTGCT CCGGGGTGTG CCACAACCTC 1320 CCCGGTACCT TCGAGTGCAT CTGCGGGCCC GACTCGGCCC TTGTGCGCCA CATTGGCACC 1380 GACTGTGACT CCGGCAAGGT GGACGAGGAC TATAGCGGCT CTGGCGAG 1428
    - 9ã Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por se obter um fragmento de ADN que tem a seguinte sequência nu cleotidica,
    GCACCCGCAG AGCCGCAGCC GGGTGGCAGC CAGTGCGTCG AGCACGACTG CTTCGCGCTC 60 TACCCGGGCC CCGCGACCTT CCTCAATGCC AGTCAGATCT GCGACGGACT GCGGGGCCAC 120 CTAATGACAG TGCGCTCCTC GGTGGCTGCC GATGTCATTT CCTTGCTACT GAACGGCGAC 180 GGCGGCGTTG GCCGCCGGCG CCTCTGGATG GGCCTGCAGC TGCCACCCGG CTGCGGCGAC 240 CCCAAGCGCC TCGGGCCCCT GCGCGGCTTC CAGTGGGTTA CGGGAGACAA CAACACCAGC 300 TATAGCAGGT GGGCACGGCT CGACCTCAAT GGGGCTCCCC TCTGCGGCCC GTTGTGCGTC 360 GCTGTCTCCG CTGCTGAGGC CACTGTGCCC AGCGAGCCGA TCTGGGAGGA GCAGCAGTGC 420 GAAGTGAAGG CCGATGGCTT CCTCTGCGAG TTCCACTTCC CAGCCACCTG CAGGCCACTG 480 GCTGTGGAGC CCGGCGCCGC GGCTGCCGCC GTCTCGATCA CCTACGGCAC CCCGTTCGCG 540 GCCCGCGGAG CGGACTTCCA GGCGTCGCCG GTGGGCAGCT CCGCCGCGGT GGCTCCCCTC 600 GGCTTACAGC TAATGTGCAC CGCGCCGCCC GGAGCGGTCC AGGGGCACTG GGCCAGGGAG 660 GCGCCGGGCG CTTGGGACTG CAGCGTGGAG AACGGCGGCT GCGAGCACGC GTGCAATGCG 720 ATCCCTGGGG CTCCCCGCTG CCAGTGCCCA GCCGGCGCCG CCCTGCAGGC AGACGGGCGC 780 TCCTGCACCG CATCCGCGAC GCAGTCCTGC AACGACCTCT GCGAGCACTT CTGCGTTCCC 840 AACCCCGACC AGCCGGGCTC CTACTCGTGC ATGTGCGAGA CCGGCTACCG GCTGGCGGCC 900 GACCAACACC GGTGCGAGGA CGTGGATGAC TGCATACTGG AGCCCAGTCC GTGTCCGCAG 960 CGCTGTGTCA ACACACAGGG TGGCTTCGAG TGCCACTGCT ACCCTAACTA CGACCTGGTG 1020 GACGGCGAGT GTGTGGAGCC CGTGGACCCG TGCTTCAGAG CCAACTGCGA GTACCAGTGC 1080 CAGCCCCTGA AGCAAACTAG CTACCTCTGC GTCTGCGCCG AGGGCTTCGC GCCCATTCCC 1140 CACGAGCCGC ACAGGTGCCA GATGTTTTGC AACCAGACTG CCTGTCCAGC CGACTGCGAC 1200 CCCAACACCC AGGCTAGCTG TGAGTGCCCT GAAGGCTACA TCCTGGACGA CGGTTTCATC 1260 TGCACGGACA TCGACGAGTG CGAAAACGGC GGCTTCTGCT CCGGGGTGTG CCACAACCTC 1320 CCCGGTACCT TCGAGTGCAT CTGCGGGCCC GACTCGGCCC TTGTCCGCCA CATTGGCACC 1380 GACTGTGACT CCGGCAAGGT CGACGACGAG GCCAGCGGCT CTGGCGAC 1428
    - 10ê Processo para a preparaçao de um vector recom binante, caracterizado por se incorporar um vector replicãvel e um fragmento de ADN que possui uma sequência nucleotidica que codifica para a sequência de ácidos aminados,
    AlaProAlaGluProGlnProGlyGlySerGlnCysValGluHisAspCysPheAlaLeuTyrProGlyProAla
    ThrPheLeuAsnAlaSerGlnlleCysAspGlyLeuArgGlyHisLeuMetThrValArgSer SerValAlaAlaAspValIleSerLeuLeuLeuAsnGlyAspGlyGlyValGlyArgArgArg LeuTrpIleGlyLeuGlnLeuProProGlyCysGlyAspProLysArgLeuGlyProLeuArg GlyPheGlnTrpValThrGlyAspAsnAsnThrSerTyrSerArgTrpAlaArgLeuAspLeu AsnGlyAlaProLeuCysGlyProLeuCysValAlaValSerAlaAlaGluAlaThrValPro SerGluProlleTrpGluGluGlnGlnCysGluValLysAlaAspGlyPheLeuCysGluPhe HisPheProAlaThrCysArgProLeuAlaValGluProGlyAlaAlaAlaAlaAlaValSer IleThrTyrGlyThrProPheAlaAlaArgGlyAlaAspPheGlnAlaLeuProValGlySer SerAlaAlaValAlaProLeuGlyLeuGlnLeuMetCysThrAlaProProGlyAlaValGln GlyHisTrpAlaArgGluAlaProGlyAlaTrpAspCysSerValGluAsnGlyGlyCysGlu HisAlaCysAsnAlalleProGlyAlaProArgCysGlnCysProAlaGlyAlaAlaLeuGln AlaAspGlyArgSerCysThrAlaSerAlaThrGlnSerCysAsnAspLeuCysGluHisPhe CysValProAsnProAspGlnProGlySerTyrSerCysMetCysGluThrGlyTyrArgLeu AlaAlaAspGlnHisArgCysGluAspValAspAspCysIleLeuGluProSerProCysPro GlnArgCysValAsnThrGlnGlyGlyPheGluCysHisCysTyrProAsnTyrAspLeuVal AspGlyGluCysValGluProValAspProCysPheArgAlaAsnCysGluTyrGlnCysGln ProLeuAsnGlnThrSerTyrLeuCySAlaGluGlyPheAlaProlleProHi sGluProHi s ArgCysGlnMetPheCysAsnGlnThrAlaCysProAlaAspCysAspProAsnThrGlnAla SerCysGluCysProGluGlyTyrlleLeuAspAspGlyPhelleCysThrAspIleAspGlu CysGluAsnGlyGlyPheCysSerGlyValCysHisAsnLeuProGlyThrPheGluCysIle CysGlyProAspSerAlaLeuValArgHisIleGlyThrAspCysAspSerGlyLysValAsp XI X2 Y1 SerGlySerGlyY2, em que XI e X2 representam ácidos aminados acídicos e Y1 e Y2 representam quaisquer ácidos aminados arbitrários.
    - llê Processo para a preparação de um ve tor recombinante, caracterizado por se incorporarem as sequências nucleotídicas (1) a (7) pela ordem indicada a jusante na direcção da transcrição, (1) uma sequência nucleotídica que actua como promotor, (2) uma sequência nucleotídica que funciona como um local de ligação de ribossoma, (3) uma sequência nucleotídica que actua como codão de iní cio, (4) uma sequência nucleotídica que codifica para um peptídeo de sinal, (5) uma sequência nucleotídica que cia de ácidos aminados seguinte, (6) uma sequência nucleotídica que actua como codão de ter minação, (7) uma sequência nucleotídica que actua como sinal de adi. ção de poli A.
    AlaProAlaGluProGlnProGlyGlySerGlnCysValGluHisAspCysPheAlaLauTyr ProGlyProAlaThrPheLeuAsnAlaSerGlnlleCysAspGlyLeuArgGlyHisLeuMet ThrValArgSerSerValAlaAlaAspValIleSerLeuLeuAsnGlyAspGlyGlyValGly ArgArgArgLeuTrpIleGlyLeuGlnLeuProProGlyCysGlyAspProLysArgLeuGly ProLeuArgGlyPheGlnTrpValThrGlyAspAsnAsnThrSerTyrSerArgTrpAlaArg LeuAspLeuAsnGlyAlaProLeuCysGlyProLeuCysValAlaValSerAlaAlaGluAla ThrValProSerGluProIleTrpGluGluGlnGlnCysGluValLysAlaAspGlyPheLeu CysGluPheHisPheProAlaThrCysArgProLeuAlaValGluProGlyAlaAlaAlaAla AlaValSerlleThrTyrGlyThrProPheAlaAlaArgGlyAlaAspPheGlnAlaLeuPro ValGlySerSerAlaAlaValAlaProLeuGlyLeuGlnLeuMetCysThrAlaProProGly AlaValGlnGlyHisTrpAlaArgGluAlaProGlyAlaTrpAspCysSerValGluAsnGly GlyCysGluHisAlaCysAsnAlalleProGlyAlaProArgCysGlnCysProAlaGlyAla AlaLeuGlnAlaAspGlyArgSerCysThrAlaSerAlaThrGlnSerCysAsnAspLeuCys GluHisPheCysValProAsnProAspGlnProGlySerTyrSerCysMetCysGluThrGly TyrArgLeuAlaAlaAspGlnHisArgCysGluAspValAspAspCysIleLeuGluProSer ProCysProGlnArgCysValAsnThrGlnGlyGlyPheGluCysHisCysTyrProAsnTyr AspLeuValAspGlyGluCysValGluProValAspProCysPheArgAlaAsnCysGluTyr GlnCysGlnProLeuAsnGlnThrSerTyrLeuCysValCysAlaGluGlyPheAlaProIle ProHisGluProHisArgCysGlnMetPheCysAsnGlnThrAlaCysProAlaAspCysAsp ProAsnThrGlnAlaSerCysGluCysProGluGlyTyrlleLeuAspAspGlyPhelleCys ThrAspIleAspGluCysGluAsnGlyGlyPheCysSerGlyValCysHisAsnLeuProGly ThrPheGluCysIleCysGlyProAspSerAlaLeuValArgHisIleGlyThrAspCysAsp SerGlyLysValAspXl X2 Yl SerGlySerGlyY2, em que XI e X2 representam ácidos aminados acídicos e Yl e Y2 representam quaisquer ácidos aminados arbitrários.
    - 12â Processo para a transformação de uma célula caracterizado por se introduzir um vector recombinan te que contém um vector replicável e um fragmento de ADN que possui uma sequência nucleotídica que codifica para a seguinte sequência de ácidos aminados,
    AlaProAlaGluProGlnProGlyGlySerGlnCysValGluHisAspCysPheAlaLeuTyr ProGlyProAlaThrPheLeuAsnAlaSerGlnlleCysAspGlyLeuArgGlyHisLeuMet ThrValArgSerSerValAlaAlaAspValIleSerLeuLeuLeuAsnGlyAspGlyGlyVal GlyArgArgArgLeuTrpIleGlyLeuGlnLeuProProGlyCysGlyAspProLysArgLeu GlyProLeuArgGlyPheGlnTrpValThrGlyAspAsnAsnThrSerTyrSerArgTrpAla ArgLeuAspLeuAsnGlyAlaProLeuCysGlyProLeuCysValAlaValSerAlaAlaGlu AlaThrValProSerGluProIleTrpGluGluGlnGlnCysGluValLysAlaAspGlyPhe LeuCysGluPheHisPheProAlaThrCysArgProLeuAlaValGluProGlyAlaAlaAla AlaAlaValSerlleThrTyrGlyThrProPheAlaAlaArgGlyAlaAspPheGlnAlaLeu ProValGlySerSerAlaAlaValAlaProLeuGlyLeuGlnLeuMetCysThrAlaProPro GlyAlaValGlnGlyHisTrpAlaArgGluAlaProGlyAlaTrpAspCysSerValGluAsn GlyGlyCysGluHisAlaCysAsnAlalleProGlyAlaProArgCysGlnCysProAlaGly AlaAlaLeuGlnAlaAspGlyArgSerCysThrAlaSerAlaThrGlnSerCysAsnAspLeu CysGluHisPheCysValProAsnProAspGlnProGlySerTyrSerCysMetCysGluThr GlyTyrArgLeuAlaAlaAspGlnHisArgCysGluAspValAspAspCysIleLeuGluPro SerProCysProGlnArgCysValAsnThrGlnGlyGlyPheGluCysHisCysTyrProAsn TyrAspLeuValAspGlyGluCysValGluProValAspProCysPheArgAlaAsnCysGlu TyrGlnCysProGlyThrPheGluCysIleCysGlyProAspSerAlaLeuValArgHisIle GlyThrAspCysAspSerGlyLysValAspXl X2 Yl SerGlySerGlyY2, em que XI e X2 representam ácidos aminados acídicos e Yl e Y2 representam quaisquer ácidos aminados arbitrários.
    - 13ã Processo para a preparação de uma composição anticoagulante, caracterizado por se incorporar como substância activa uma substância de ligação da trombina com a seguinte sequência de ácidos aminados,
    AlaProAlaGluProGlnProGlyGlySerGlnCysValGluHisAspCysPheAlaLeuTyr
    ProGlyProAlaThrPheLeuAsnAlaSerGlnlleCysAspGlyLeuArgGlyHisLeuMet
    ThrValArgSerSerValAlaAlaAspValIleSerLeuLeuLeuAsnGlyAspGlyGlyVal
    GlyArgArgArgLeuTrpIleGlyLeuGlnLeuProProGlyCysGlyAspProLysArgLeu
    GlyProLeuArgGlyPheGlnTrpValThrGlyAspAsnAsnThrSerTyrSerArgTrpAla
    ArgLeuAspLeuAsnGlyAlaProLeuCysGlyProLeuCysValAlaValSerAlaAlaGlu
    AlaThrValProSerGluProIleTrpGluGluGlnGlnCysGluValLysAlaAspGlyPhe
    LeuCysGluPheHisPheProAlaThrCysArgProLeuAlaValGluProGlyAlaAlaAla AlaAlaValSerlleThrTyrGlyThrProPheAlaAlaArgGlyAlaAspPheGlnAlaLeu ProValGlySerSerAlaAlaValAlaProLeuGlyLeuGlnLeuMetCysThrAlaProPro GlyAlaValGlnGlyHisTrpAlaArgGluAlaProGlyAlaTrpAspCysSerValGluAsn GlyGlyCysGluHisAlaCysAsnAlalleProGlyAlaProArgCysGlnCysProAlaGly AlaAlaLeuGlnAlaAspGlyArgSerCysThrAlaSerAlaThrGlnSerCysAsnAspLeu CysGluHisPheCysValProAsnProAspGlnProGlySerTyrSerCysMetCysGluThr GlyTyrArgLeuAlaAlaAspGlnHisArgCysGluAspValAspCysIleLeuGluProSer ProCysProGlnArgCysValAsnThrGlnGlyGlyPheGluCysHisCysTyrProAsnTyr AspLeuValAspGlyGluCysValGluProValAspProCysPheArgAlaAsnCysGluTyr GlnCysGlnProLeuAsnGlnThrSerTyrLeuCysValCysAlaGluGlyPheAlaProIle ProHisGluProHisArgCysGlnMetPheCysAsnGlnThrAlaCysProAlaAspCysAsp ProAsnThrGlnAlaSerCysGluCysProGluGlyTyrlleLeuAspAspGlyPhelleCys ThrAspIleAspGluCysGluAsnGlyGlyPheCysSerGlyValCysHisAsnLeuProGly ThrPheGluCysIleCysGlyProAspSerAlaLeuValArgHisIleGlyThrAspCysAsp SerGlyLysValAspXl X2 Yl SerGlySerGlyY2, em que XI e X2 representam ácidos aminados acídicos e Yl e Y2 representam quaisquer ácidos aminados arbitrários quando preparada de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, em conjun to com uma substância veicular farmaceuticamente aceitável.
    - 14s Processo para a preparação de uma composição útil para a inibição da agregação das plaquetas carac terizado por se incorporar como substância activa uma substância de ligação da trombina com a seguinte sequência de ácidos aminados,
    AlaProAlaGluProGlnProGlyGlySerGlnCysValGluHisAspCysPheAlaLeuTyr
    ProGlyProAlaThrPheLeuAsnAlaSerGlnlleCysAspGlyLeuArgGlyHisLeuMet
    ThrValArgSerSerValAlaAlaAspValIleSerLeuLeuLeuAsnGlyAspGlyGlyVal
    GlyArgArgArgLeuTrpIleGlyLeuGlnLeuProProGlyCysGlyAspProLysArgLeu
    GlyProLeuArgGlyPheGlnTrpValThrGlyAspAsnAsnThrSerTyrSerArgTrpAla
    ArgLeuAspLeuAsnGlyAlaProLeuCysGlyProLeuCysValAlaValSerAlaAlaGlu
    AlaThrValProSerGluProIleTrpGluGlnGlnCysGluValLysAlaAspGlyPheLeu
    CysGluPheHisPheProAlaThrCysArgProLeuAlaValGluProGlyAlaAlaAlaAla
    AlaValSerlleThrTyrGlyThrProPheAlaAlaArgGlyAlaAspPheGlnAlaLeuPro
    ValGlySerSerAlaAlaValAlaProLeuGlyLeuGlnLeuMetCysThrAlaProProGly
    AlaValGlnGlyHisTrpAlaArgGluAlaProGlyAlaTrpAspCysSerValGluAsnGly GlyCysGluHisAlaCysAsnAlalleProGlyAlaProArgCysGlnCysProAlaGlyAla AlaLeuGlnAlaAspGlyArgSerCysThrAlaSerAlaThrGlnSerCysAsnAspLeuCys GluHisPheCysValProAsnProAspGlnProGlySerTyrSerCysMetCysGluThrGly TyrArgLeuAlaAlaASpGlnHisArgCysGluAspValAspValAspAspCysIleLeuGlu ProSerProCysProGlnArgCysValAsnThrGlnGlyGlyPheGluCysHisCysTyrPro AsnTyrAspLeuValAspGlyGluCysValGluProValAspProCysPheArgAlaAsnCys GluTyrGlnCysGlnProLeuAsnGlnThrSerTyrLeuCysValCysAlaGluGlyPheAla ProIleProHisGluProHisArgCysGlnMetPheCysAsnGlnThrAlaCysProAlaAsp CysAspProAsnThrGlnAlaSerCysGluCysProGluGlyTyrlleLeuAspAspGlyPhe IleCysThrAspIleAspGluCysGluAsnGlyGlyPheCysSerGlyValCysHisAsnLeu ProGlyThrPheGluCysIleCysGlyProAspSerAlaLeuValArgHisIleGlyThrAsp CysAspSerGlyLysValAspXl X2 ¥1 SerGlySerGlyY2, em que XI e X2 representam ácidos aminados acídicos e Y1 e Y2 representam quaisquer ácidos aminados arbitrários quando preparada de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, em conjun to com uma substância veicular farmaceuticamente aceitável.
    A requerente reivindica as priorida des dos pedidos japoneses apresentados em 30 de Novembro de 1990 e em 25 de Fevereiro de 1991, sob os nQs. 335720/1990 e 30271/1991, respectivamente.
    Lisboa, 28 de Novembro de 1991.
    RESUMO
    PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA SUBSTÂNCIA
    DE LIGAÇÃO DE TROMBINA
    A invenção refere-se a um processo para a preparação de uma substância de ligação de trombina com a seguinte sequência de ácidos aminados,
    AlaProAlaGluProGlnProGlyGlySerGlnCysValGluHisAspCysPheAlaLeu TyrProGlyProAlaThrPheLeuAsnAlaSerGlnlleCysAspGlyLeuArgGlyHis LeuMetThrValArgSerSerValAlaAlaAspValIleSerLeuLeuLeuAsnGlyAsp GlyGlyValGlyArgArgArgLeuTrpIleGlyLeuGlnLeuProProGlyCysGlyAsp ProLysArgLeuGlyProLeuArgGlyPheGlnTrpValThrGlyAspAsnAsnThrSer TyrSerArgTrpAlaArgLeuAspLeuAsnGlyAlaProLeuCysGlyProLeuCysVal AlaValSerAlaAlaGluAlaThrValProSerGluProIleTrpGluGluGlnGlnCys GluValLysAlaAspGlyPheLeuCysGluPheHisPheProAlaThrCysArgProLeu AlaValGluProGlyAlaAlaAlaAlaAlaValSerlleThrTyrGlyThrProPheAla AlaArgGlyAlaAspPheGlnAlaLeuProValGlySerSerAlaAlaValAlaProLeu GlyLeuGlnLeuMetCysThrAlaProProGlyAlaValGlnGlyHisTrpAlaArgGlu AlaProGlyAlaTrpAspCysSerValGluAsnGlyGlyCysGluHisAlaCysAsnAla IleProGlyAlaProArgCysGlnCysProAlaGlyAlaAlaLeuGlnAlaAspGlyArg SerCysThrAlaSerAlaThrGlnSerCysAsnAspLeuCysGluHisPheCysValPro AsnProAspGlnProGlySerTyrSerCysMetCysGluThrGlyTyrArgLeuAlaAla AspGlnHisArgCysGluAspValAspAspCysIleLeuGluProSerProCysProGln ArgCysValAsnThrGlnGlyGIyPheGluCysHisCysTyrProAsnTyrAspLeuVal AspGlyGluCysValGluProValAspProCysPheArgAlaAsnCysGluTyrGlnCys GlnProLeuAsnGlnThrSerTyrLeuCysValCysAlaGluGlyPheAlaProIlePro HisGluProHisArgCysGlnMetPheCysAsnGlnThrAlaCysProAlaAspCysAsp ProAsnThrGlnAlaSerCysGluCysProGluGlyTyrlleLeuAspAspGlyPhelle CysThrAspIleAspGluCysGluAsnGlyGlyPheCysSerGlyValCysHisAsnLeu ProGlyThrPheGluCysIleCysGlyProAspSerAlaLeuValArgHisIleGlyThr AspCysAspSerGlyLysValAspXl X2 Yl SerGlySerGlyY2, em que XI e X2 representam ácidos aminados acídicos e Yl e Y2 representam quaisquer ácidos aminados arbitrários, que compreen de cultivar-se uma célula transformada que contém um vector recombinante que contém um vector replicável e um fragmento de (
    ADN que possui uma sequência nucleotídica que codifica para a referida sequência de ácidos aminados e separar os polipeptídeos produzidos pelas células cultivadas.
    A substância de acordo com a invenção é útil como ingrediente activo de composições farmacêuticas anti-coagulantes.
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