PT96272A - Processo para a producao homogenea de novos analogos da cadeia de factor b de crescimento derivado de plaquetas - Google Patents

Description

AMGEN INC. "Processo para a produção homogénea de novos análogos da cadeia de factor B de crescimento derivado de plaquetas" C£i-se que o factor do cescimento derivado das plaquetas humanas (PDGF) ê o principal factor do crsecimento mitogêni-co que se encontra presente no soro para as células do tecido conjuntivo. A actividade mitogênica do PDGF encontra-se bem decumen-tada em numerosos estudos em que se demonstrou que o PDGF afecta positivamente a mitogênese nas células do músculo liso arterial, nas linhas de células fibroblásticas e nas células da glia. Deuel e outros. J. Biol. Chem., 256 (17), 8896-8899 (1981) . See also, e.g., Heldin e outros, J. Cell Physiol., 105, 235 (1980) (brain glial cells); Raines e Ross, J. Biol. Chem., 257, 5154 (1982) (células do músculo liso arterial do macaco). Também se pensa que o PDGF ê um agente químico que atrai os fibroblastos, as células do músculo liso, os monÕcitos e os granulõcitos. Devido ã sua aparente capacidade para induzir a mitogênese no sítio da lesão do tecido conjuntivo e de atrair os fibroblastos para o sítio de tais lesões. Pensa-se que o PDGF possui uma utilização terapêutica es-pecificamente potencial na reparação de tecidos conjuntivos traumatizados ou lesados. O PDGF foi descrito, inicialmente, por Ross e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 71, 1207-1210 (1974), como um factor que se encontrava em todo o soro sanguíneo (mas não em soro pobre - 2 - em plaquetas) que é capaz de suportar o crescimento dos fibro-blastos em cultura. Isolou-se subsequentemente o PDGF a partir das plaquetas e do soro tendo-se identificado o PDGF primitivo não reduzido com uma proteína dimérica de 27-35 kd, de peso molecular. Descobriu-se que a redução do PDGF proporcionava duas ou mais'bandas mais pequenas nos geles, encontrando-se o peso molecular compreendido entre 10 e 18 kd. Pensou-se que estas bandas menores representassem duas sub-unidad.es monomérlcas menores-é diferentes, de pesos moleculares compreendidos entre, aproximadamente, 18 kd e 16 kd, designadas respectivamente pelas sub-unidades "A" e "B" ou alternativamente, como cadeia A de PDGF e cadeia B de PDGF. Descreveram-se as sequências aminoãcidas das duas sub-unidades de PDGF, tendo-se identificado a sequência aminoãcida da cadeia B de PDGF como possuindo mais do que 90% de homologia em relação à proteína prevista de v-sis, o oncogene contido no vírus do sarcoma simiano oncogénico (SSV). Doolittle e outros, - Science, 221, 275-276 (1983) , e Waterfield e outros, Nature, 304, 2810-2814 (1983) . Descobriu-se que a cadeia A possuía aproximadamente 60% de .homologia com a cadeia B.

Identificou-se posteriormente o PDGB3 descoberto nas plaquetas humanas como um produto de clivagem de 109 aminoãcidos de um polipêptido de precursor de 241 aminoãcidos codificado por c-sis a contraparte humana do gene v-sis. Johnsson e outros,

EMBO Journal, 3^{5) , 921-928 (1984) . Os dados de sequénciação de Johnsson e outros também confirmaram o elecado grau de homologia da sequência aminoãcida previsível para o produto genético v-sis, p28 , com a sequência minoãcida actual da cadeia B de PDGF. A homologia da cadeia B de PDGF para o gene v-sis inicia-se no amino-ãcido 67 de p28 , um resíduo de serina e continua por mais 109 3

aminoãcidos atê um resíduo de treonina no aminoãcido 175, (Johnsson et al ibid). A sequência homologa de 109 aminoãcidos também coincide com o produto de clivagem de 109 aminoãcidos de proteína precursora codificada por c-sisy que se crê ser a forma madura de PDGF nos seres humanos. A homologia com a proteína precursora codificada por c-sis inicia-se no aminoãcido 82 da proteína precursora de 241 aminoãcidos e contínua durante 109 aminoãcidos.

Crê-se que PDGF só ê biologicamente activo na sua forma dimêrica. Estes dímeros de PDGF biologicamente activos podem tomar a forma de um heterodímero PDGF-AB, de homodímero PDGF-BB ou de um homodímero PDGF-AA. Hannink e outros, Mol. Cell. Biol., 6_, 1304-1314 (1986). Cada sub-unidade monomêrica do dímero biologicamente activo, quer se trate de um monõmero de cadeia A ou de um monõmero de cadeia B, contém oito resíduos de cisteína. Alguns destes resíduos de cisteína formam ligações de dissulfeto inter--cadeias que conservam o dímero unido.

Utilizou-se a sequência homóloga v-sis de 109 aminoãcidos (PDGF B2.09^ ' içada por Johnsson e outros como sendo a forma madura de PDGF B, na tecnologia recombinante empregando leveduras e outros sistemas de células hospedeiras eucariõticas para se obter PDGF (rPDGF), (patente de invenção norte-americana N- 4 766 073 ("Murray e outros I"), células hospedeiras de levedura) . A utilização de uma sequência de côdico que codifica PDGF B109 ProPorci°na duas vantagens sobre a utilização da sequência completa que codifica c-sis : (1) a sequência codificante de 109 aminoãcidos facilita a produção recombinante de uma proteína tal como o PDGF B, devido ao facto de ser mais fácil de manipular do que a sequência que codifica c~sis que é mais longa; e r 4 -jr .¾ (2) a sequência de codificação de 109 aminoãcidos origina um produto recombinante que se encontra estruturalmente mais próximo da forma madura de PDGF B, e deste modo, pode necessitar de um tratamento menor pelo ser humano a ser tratado por um composto terapêutico que contenhaEPDGF B. Tem vindo a ser sugerido que a eliminação posterior dos aminoãcidos da extremidade carboxi e/ou da extremidade amino originam análogos de PDGF B mais pequenos e potencialmente activos que podem possuir uma utilidade terapêutica mais alargada (patente de invenção norte-americana n-4 845 075 ("Murray e outrosn>, mas a eficácia terapêutica dessas formas truncadas ainda não foi demonstrada.

Pode preparar-se o PDGF B-^^, de acordo com tecnologias recombinantes, utilizando um dos diversos materiais de partida para se efectuar a derivação das sequências de codificação necessárias. Pode-se, por exemplo, modificar o gene v-sis comummente disponível para se obter o gene c-sis que ê o correspondente humano e depois efectuar-se a transfecção da célula hospedeira desejada seguida da inserção de um codão de paragem no aminoãcido 110. De um modo alternativo, pode utilizar-se quer c-sis como material de partida ou sintetizar-se a sequência de codificação de 109 aminoãcidos. Também ê ainda possível utilizar uma combinação destes métodos, por exemplo, tal como descrito por Murray e outros I. Em qualquer dos casos, tem de ser colocado um codão de paragem no aminoãcido da posição 110 na sequência de cédigo..

Caso contrário, o sistema de replicação da célula hospedeira transferirá a instrução do codão do aminoãcido 109 até atingir um codão de paragem natural, produzindo uma proteína que contêm as sequências aminoãcidas da proteína restante codificada 5 :r&' .¾ por c-sis (se se utilizar um vector que englobe o gene c-sis) ou uma proteína codificada por um vector (se se utilizar um gene de síntese). A utilização de sistemas celulares hospedeiros eucarió-ticos altamente desenvolvidos para a produção recombinante de PDGF B resulta habitualmente na secreção. derPDGF B biologicamente activo em níveis relativamente baixos. No entanto, os sistemas de tratamento com estas células hospedeiras altamente evoluídas originam o homodímero de rPDGF B recombinante que se trata em qualquer das diversas vias pelos processos biológicos naturais da célula hospedeira, tais como por glicosilação e/ou clivagem proteo-lltica. Este facto é especialmente verídico no caso das células hospedeiras dos mamíferos. Como resultado, a composição precisa do produto recombinante não pode ser prevista com rigor ou, em muitos casos, controlada com rigor.

Por outro lado, os sistemas celulares hospedeiros proca-rióticos tais como a E. coli, produzem um produto de mais fácil controlo e definição devido ã perda relativa das vias de tratamento biológico que estão ocupados numa escala evolutiva menor por estas células hospedeiras. Os sistemas celulares hospedeiros procariõti-cos também produzem quantidades muito superiores do produto recombinante desejado. A desvantagem com os sistemas de expressão mais elevada reside no facto de, como reacção â obtenção de níveis superiores do produto recombinante, se. ter de isolar a proteína recombinante a partir dos corpos de inclusão. Isto torna necessário habitualmente a reactivação da proteína desnaturada no sentido de se originar um produto biologicamente activo. No entanto, os métodos recentemente desenvolvidos de reactivação tornaram mais desejável a produção de rPDGF B nos sistemas celulares hospedeiros de elevada 6 expressão. Por exemplo, os pedidos de patente de invenção norte--americana conjuntamente pendente com os n-s5cde série 451 e 485 que aqui se incorporam como referência, revelam um método para a reactivação de rPDGF desnaturado utilizando um agente bloqueddor para se formar o intermediário monomérico bloqueado. 0 pedido de patente internacional N- 90/04035, por outro lado, engloba uma proteína de fusão intermédia para efectuar a reactivação.

No entanto, verificou-se que a produção de PDGF B1Qg na E. coli, pelo menos nalguns casos, exibia, de modo surpreendente, um problema de "leitura através" do codão de paragem. Por outras palavras, o sistema de expressão da célula hospedeira podia ler, algumas vezes, através do codão de paragem na posição 110, expressando assim um produto mais longo do que o produto final PDGF B1Qg desejado. Por exemplo, quando o codão de paragem UGA se encontrava colocado na posição 110 do gene c-sis, descobriu-se que o amino-ãcido selenocisteina se encontrava inserido nesta posição durante a fase de "leitura através de". A inserção de selenocisteina durante a fase "leitura através de" dos codÕes de UGA naturais em diversas outras proteínas também foi referida. Zinoni e outros,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84, 3156-3160 (1987); Chambers e outros, EMBO J., 5, 1221-1227 (1986);Sukenaga e outros, Nucleic Acids Res. 15, 7178 (1987) . Também se observou uma "leitura através de" parcial, mas em menor extensão, quando os codões de paragem UAG ou UAA se encontravam colocados na posição 110 do gene c-sis. O problema de "leitura através de" origina que as células hospedeiras de E. cdli produzam uma mistura heterogénea.^ de PDGF B1Qg combinada com uma forma mais longa de PDFG B. Por sua vez, isto torna necessário um ou mais passos adicionais de separação no sentido de se obter um produto homogéneo. - 7 -

Com finalidades terapêuticas e comerciais, seria desejável obter, de um modo económico, quantidades significativas de uma forma de PDGF B homogénea fidedigna e biologicamente activa. A incapacidade de sistemas celulares hospedeiros procariõticos de elevada expressão para produzirem rPDGF B numa forma homogénea, aumenta de modo significativo os custos de se criar um produto homogéneo havendo ainda o custo adicional do(s) passo(s) de separação necessário.

Constitui um dos objectivos da presente invenção proporcionar um produto rPDGF B homogéneo, altamente expresso, que seja biologicamente activo e que se assemelhe estreitamente ao PDGF B natural.

Sumário da presente invenção

De acordo com a presente invenção, proporcionam-se novos análogos de rPDGF B. Também se proporciona um método para a produção homogénea de quantidades significativas destes novos análogos. 0 método da presente invenção utiliza uma nova sequência de código em que o codão de paragem se encontra colocado no gene c-sis ou outra sequência que codifica uma proteína precursora de PDGF B, ou seus análogos, numa posição que corresponde a uma localização próxima do aminoãcido 111 e que se estende até aproxi-madamente o aminoãcido 160. 0 método da presente invenção origina a produção de quantidades homogéneas, relativamente grandes, de análogos de rPDGF B, a partir de células hospedeiras de elevada expressão tais como as da E. coli. Os análogos de rPDGF B produzidos, de acordo com o método da presente invenção, apresentam uma actividade biológica comparável ã exibida pelo PDGF B natural. 8

Breve descrição das figuras A fig. 1 consiste num diagrama dos dados de sequencia-ção dos aminoãcidos derivados da analise de rPDGF B de um mamífero . A fig. 2 consiste num gele de electroforese corado com azul brilhante de Coomassie que indica a migração relativa de rPDGF B dos mamíferos em comparação com rPDGF 2^.09 e rPDGF BH9 da E. coli. A fig. 3 consiste num diagrama de sequência de codificação que se utilizou para se expressar rPDGF B-^g no vector de expressão pCFM1156 de E. colitalcaro se indica no exemplo 1. A fig. 4 consiste num gele de electroforese corado com azul brilhante de Coomassie em que se indica a migração de rPDGF B119 Β· coli a partir de diversos lotes produzidos de acordo com a presente invenção. A fig. 5 consiste num gráfico que mostra a actividade mitogênica de rPDGF-^g produzido na E. coli, que se reactivou, de acordo com a presente invenção. A fig. 6 representa um gráfico em que se indica a actividade quimiotãctica sobre os fibroblastos de rPDGF B-^g produzido na E. coli que se reactivou, de acordo com a presente invenção. A fig. 7 representa um gráfico em que se indica a actividade quimiotãctica sobre monõcitos de rPDGF B-^g produzido na E. coli que se reactivou de acordo com a presente invenção. A fig. 8 demonstra a actividade de um monõmero de PDGF B11g comparada com a do homodímero .de PDGF Blig. •V. 9

Descrição pormenorizada da presente invenção A presente invenção proporciona novos análogos de rPDGF B. Estes análogos são constituídos pelos aminoãcidos que estendem por 110 a 159 em comprimento e que possuem a mesma sequência amino-ãcida que a porção de proteína precursora de PDGF B1Qg ou do análogo da proteína precursora de PDGF B^gg. Os análogos podem encontra-se sob a forma de monõmeros e/ou de dímeros. A presente invenção também proporciona um método para a produção homogénea de quantidades comercialmente úteis destes novos análogos de rPDGF B a partir de sistemas de células hospedeiras de elevada expressão tais como E. coli. Leva-se a efeito o método da presente invenção por transfecção ou transformação de uma célula hospedeira seleccionada com uma nova sequência de código. A nova sequência de código utiliza o gene c-sis ou outra sequência para a proteína precursora de PDGF B^Qg ou dos seus análogos em que um codão de paragem se encontra colocado numa posição correspondente a aproximadamente o aminoãcido 111 a aproximadamente o aminoãcido 160.

No sentido de auxiliar uma melhor compreensão da presente invenção, os termos seguintes, utilizados na presente invenção, têm os significados definidos adiante.

Salvo indicação em contrário, PDGF B consiste em qualquer combinação de monõmeros e/ou dímeros de PDGF B, incluindo os seus análogos, reduzidos ou não reduzidos, biologicamente activos ou inactivos, recombinantes ou quaisquer outros. O termo "PDGF B" refere-se especificamente a análogos de PDGF B que possuam uma ou mais modificações no número e/ou na identidade de sequência amino-ãcidas naturais de PDGF B^gg. Os análogos de PDGF B são biologica- 10 κ y ή' mente activos ou capazes de se tornarem biologicamente activos de acordo com técnicas de reactivação ou de outras manipulações mecânicas idênticas.

Os termos "monõmero de PDGF" e "PDGF monomêrico" referem-se a uma única molécula monomérica de PDGF que não se encontra ligada por uma ligação dissulfureto a qualquer outra molécula de PDGF. Considerar-se-â que "PDGF reduzido" sera necessariamente a forma monomérica de PDGF.

Os termos "dimero de PDGF" ou "PDGF dimérico" referem--se a uma molécula de PDGF que compreende duas sub-unidades mono-mêricas de PDGF que se encontram ligadas uma à outra por uma ligação dissulfureto. O termo "dimero de PDGF biologicamente activo" refere--se a uma forma dimeri&a 'de PDGF.. que possui substancialmente a mesma actividade mitogénica e/ou a mesma actividade quimiotáctica do PDGF natural. O termo "monõmero de PDGF biologicamente activo" refere--se a PDGF monomêrico que possui uma actividade mitogénica específica de pelo menos cerca de milésima parte da actividade mito-gênica específica do PDGF dimérico natural. O termo "conformação biologicamento activa", tal como se utiliza na presente invenção, refere-se â conformação de um dimero de PDGF biologicamente activo ou de um monõmero de PDGF biologicamente activo.

"Proteína precursora" refere-se à proteína precursora modificada por c-sis de 241 aminoãcidos, de PDGF A expressão "análogo de proteína precursora" refere-se a uma proteína precursora que possui uma ou mais modificações no número e/ou identidade de sequências aminoãcidas, de 241 aminoãci- - 11 - _ <··*9 dos, codificados pelos genes c-sis. Análogos de proteínas precursoras, tal como proteínas precursoras, são codificados por sequências que codificam as proteínas precursoras.

Tal como se utiliza na presente invenção, os termos "sequência que codifica a proteína precursora" refere-se ao gene c-sis ou a qualquer sequência de código que codifique a proteína precursora de PDGF codificada por c-sis, de 241 aminoãcidos ou os seus análogos. Apesar da sequência que codifica a proteína precursora poder possuir uma ou mais modificações no número e/ou identidade dos codÕes no gene c-sis natural, a sequência que codifica a proteína precursora: (1) ê capaz de se hibridizar com o gene c-sis; ou (2) mas para a degenerescência do código genético teria de se hibridizar com o gene c-sis e/ou antes de (1). Habitualmente, a sequência que codifica a proteína precursora conterá co-dões prefenciais para expressão no sistema de células hospedeiras seleccionado.

De acordo com o sistema de numeração aqui utilizado, designa-se como aminoãcido número 1 a serina amino terminal de PDGF B das plaquetas maduras, tal como foi determinado por Johnsson e outros, ibid:. Esta posição corresponde ao resíduo 82 da proteína precursora de aminoãcido 241. Os aminoãcidos que precedem a serina número 1 na proteína precursora codificada por c-sis, encontram-se designados por números negativos. Os aminoãcidos que se encontram a seguir â serina número 1, encontram-se numerados sequencialmente de tal modo que o aminoãcido número 241 da proteína precursora ê designado como aminoãcido 160.

Ê preferível obter-se o PDGF B homogéneo da presente invenção a partir de células hospedeiras procarióticas de elevada expressão uma vez que este se assemelharia estreitamente ao PDGF B 12 natural dos mamíferos. No sentido de se identificar os sítios preferenciais, potencialmente alternativos, para colocação do codão de paragem na sequência que codifica a proteína precursora, para inserção numa célula hospedeira procariõtica, inseriu-se em primeiro lugar o gene c-sis do aminoãcido 241 num vector de expressão que se utilizou para se efectuar a transfecção das células do ovário do "hamster" chinês (CHO). Depois, purificaram-se os produtos proteicos segregados resultantes e separaram-se croma-tograficamente para se determinar os pontos extremos da extremidade carboxi das proteínas, tal como foram tratadas pelas células CHO. Descobriu-se, tal como se descreverá mais pormenorizadamente nos exemplos que se seguirão, que as duas proteínas predominantes de PDGF B segregadas pelas células CHO, foram terminadas após o aminoãcido 109 e após o aminoãcido 119. Para além disso, trataram--se pelo menos dois outros análogos de PDGF B por clivagem profeeolí-tica numa..extensão que se encontrava compreendida a seguir, apro-ximadamente, ao aminoãcido 126 até a seguir, aproximadamente, ao aminoãcido 136. Com base nos sítios prováveis de clivagem proteolí-tica, calculou-se que as extremidades carboxi destes dois análogos adicionais de PDGF terminavam apés os resíduos de arginina; isto é, próximo dos aminoãcidos 126, 130, 133, 135 ou 136.

De um modo preferencial, leva-se a efeito o método da presente invenção transfectando ou transformando uma célula hospedeira com uma sequência que codifica uma proteína precursora em que se colocou um 'ccdão de paragem numa determinada posição da sequência que codifica a proteína precursora que se estende aproximadamente do aminoãcido 111 atê ao aminoãcido 137, aproximadamente.

De um modo a que se dá maior preferência, colocou-se o codão de paragem numa posição compreendida entre aproximadamente o amino-

ácido 120 e aproximadamente o aminoácido 137. De um modo 'ainda a que se dã maior preferência, colocou-se o codão de paragem numa posição seleccionada entre o grupo que consiste no aminoácido 120; aminoácido 127, aminoácido 131, aminoácido 134, aminoácido 136 e aminoácido 137. De um modo especialmente preferencial, utilizou-se uma sequência de codificação que utiliza o codão de paragem no aminoácido na posição 120 para se levar a efeito o método da presente invenção. O método da presente invenção origina a produção de um novo análogo de PDGF B que possui um comprimento de cerca de 110 a cerca de 159 aminoãcidos. O posicionamento preferencial para o codão de paragem origina a produção de PDGF .

Pode efectuar-se, geralmente, o método da presente invenção utilizando uma modificação de qualquer um dos vários métodos para a produção recombinante de PDGF B conhecida na especialidade. Pode-se, por exemplo, modificar em primeiro lugar o gene v-sis no sentido de se obter o correspondente humano de c-sis ou pode-se utilizar c-sis como material de partida e depois trans-fectar a célula hospedeira desejada seguindo-se a colocação de um codão de paragem em qualquer das posições aminoãcidas que se estendem de 111 a 160. De preferência, o codão de paragem encontrar-se-â colocado na sequência que codifica a proteína precursora c-sis ou a proteína precursora modificada v-sis por mutagénese comandada de um sítio de um codão pré-existente.

De um modo alternativo, pode-se sintetizar a sequência que codifica a proteína precursora ou cortar em primeiro lugar o gene c-sis ou o gene v-sis modificado, no sítio de restrição apropriado próximo da extremidade carboxi e depois reconstruir a extremidade carboxi da sequência que codifica a proteína precursora com a desejada posição final (de aproximadamente 111 a aproximadamente 14 160) utilizando codões preferenciais para o vector e sistemas celulares hospedeiros especiais. Também se pode cortar o gene c-sis ou o gene v-sis modificado no sitio de restrição apropriado próximo da extremidade amino sendo a extremidade amino reconstruída a partir da posição de iniciação desejada (de preferência a partir do aminoãcido 1). Utilizando novamente codões para os sistemas celulares hospedeiros e vectores seleccionados. Quer se utilizem materiais de partida naturais ou de síntese ou uma combinação dos mesmos, deve colocar-se um codão de paragem após o aminoãcido desejado da extremidade carboxi da sequência que codifica a proteína precursora; isto i, em qualquer uma das posições aminoãcidas compreendidas entre aproximadamente 111 e aproximadamente 160.

No método preferencial para se levar a efeito o objectivo da presente invenção, modifica-se o gene v-sis no sentido de se obter o gene c-sis, após o que, ou concorrentemente, se coloca um codão de paragem na localização desejada do gene modificado, de acordo com a presente invenção. Insere-se então a sequência que codifica a proteína precursora de c-sis contendo o codão de paragem e, depois, inserida no vector que se utiliza para se efectuar a transfecção da célula hospedeira procariótica.

Preferencialmente, a sequência que codifica a proteína precursora, que se utiliza no método da presente invenção, consiste no análogo do gene c-sis» Pode construir-se a sequência que codifica a proteína precursora análoga de c-sis de modo a conter codões preferenciais para expressão na célula hospedeira de E. coli. Pode obter-se o análogo do gene c-sis por mutagênese comandada de um sítio e a ligação do gene c-sis com extremidades carboxi e amino de síntese seguindo-se-lhe a clivagem proteolítica das extremidades existentes nos sítios de clivagem proteolítica adequados. 0 gene v-sis proporciona um excelente material de partida para se obter uma sequência que codifica a proteína precursora para utilização na presente invenção. Por exemplo, na região que codifica os aminoãcidos de 1-119, existem apenas cinco amino-ãcidos diferentes entre a proteína codificada pelo gene v-sis e a proteína precursora de PDGF B^gg codificada pelo gene c-sis. Dois destes cinco aminoãcidos, no gene v-sis, podem ser alterados de acordo com técnicas de mutagênese in vitro, para criar uma sequência de ADN que codifique uma proteína na qual os dois aminoãcidos são iguais aos resíduos correspondentes da proteína precursora de PDGF B^gg. Podem utilizar-se numerosos métodos para se efectuar a mutagênese in vitro do ADN, introduzindo as alterações desejadas nos codões 101 e 107. Estes métodos são bem conhecidos dos especialistas. Por exemplo, o método de Eckstein e colaboradores (Taylor e outros, Nucl. Acids Res., 13, 8764-8785 (1985); Nakamaye e Eckstein, Nucl. Acids Res., 14, 9679-9698 (1986)), tal como se descreve no livro de instruções do conjunto de Amersham (Arlington Heights, Illinois) "Oligonucleotide-Directed In Vitro Mutagenesis System" e especialmente util^ na conversão do resíduo de isoleucina do aminoãcido 101 num resíduo de treonirta e do resíduo de alanina do aminoãcido 107 num resíduo de prolina. A seguir â mutagênese in vitro dos aminoãcidos 101 e 107, pode-se dqgois cortar o ADNalterado cfe v-s is na extremidade amino no enzima de restrição BglII, que corta numa posição correspondente ao aminoãcido 24. Pode restaurar-se a porção a montante do gene, incluindo os primeiros 24 aminoãcidos, por ligação do ADN de v-sis que sofreu uma mutagênese cortado com BglII a jusante, com o fragmento de ADN de síntese que codifica: (1) um codão ATG de iniciação de transferência; (2) um resíduo de serina no aminoãcido 1; e (3) a parte restante dos primeiros 24 aminoãcidos da proteína precursora codificada por c-sis. Deste modo, duas das outras três variantes aminoãcidas, isto é, o resíduo de serina no aminoãcido 6 e o resíduo de valina no aminoãcido 7, converter-se-ão nas formas de PDGF B humano (respectivamente treonina e isoleucina) eliminando-se os aminoãcidos precursores a montante codificados por v-sis. 0 corte da extremidade carboxi de modo idêntico, possibilita a substituição, da extremidade carboxi por um fragmento de síntese que altera simultaneamente o aminoãcido 114 e substitui o aminoãcido 120 por um codão de paragem. De um modo preferencial, corta-se o ADN de v-sis que foi submetido a uma mutação, com o enzima de restrição Smal, que efectua o corte numa posição correspondente ao aminoãcido 112. Depois pode ligar-se o fragmento de ADN de síntese que codifica os aminoãcidos de 112 a 119 da proteína precursora de PDGF B^g e um codão de paragem de tranferência na posição 120, com o ADN de v-sis submetido a mutação e cortado por Smal. Este ADN de síntese também codifica o resíduo de glicina em vez de codificar o resíduo de treonina, no aminoãcido 114, realizando a conversão da quinta variante aminoãcida no aminoãcido correspondente na proteína precursora, de PDGF B^g. A construção final de ADN desta sequência que codifica a proteína precursora, codifica os aminoãcidos 1-119 de PDGF B e de um resíduo de metionina adicional na extremidade N. Depois pode ligar-se este gene de PDGF B^g a um vector de expressão adequado tal como pCFMH56, e depois, transformã-lo ou transfectã-lo num sistema celular hospedeiro adequado, de preferência um sistema pro-cariõtico tal como uma célula hospedeira de E. coli, eliminando-se a metionina da extremidade N, in vivo, a seguir â síntese na célula hospedeira. (Ê possível que algumas estirpes de E. coli não sejam / “ 17 .% capazes de eliminar a metionina da extremidade N, produzindo desse modo um produto recombinante que contém um resíduo aminoãcido adicional na extremidade amino).

Os sistemas de expressão preferenciais para a produção homogénea de análogos de rPDGF B da presente invenção compreendem sistemas de culturas de células procariõticas, de preferência E. coli. Para além dos sistemas específicos de expressão aqui descritos, a presente invenção também contempla outros sistemas e inclui, por exemplo, mas não se limita, a modificações dos sítios para clivagem de protease e/ou de uma sequência principal alternada para aumentar o nível de produção das células hospedeiras dos análogos de rPDGF da presente invenção.

Podem isolar-se, reactivar e purificar os novos análogos de rPDGF B da presente invenção, a partir da pasta das culturas celulares hospedeiras resultantes da utilização de qualquer um dos vários métodos conhecidos na especialidade. Um método preferencial para a reactivação encontra-se descrito no anteriormente referido pedido de patente de invenção americana com o n- de série 451 485 e outras que aqui se inclui como ponto de referência.

De acordo com o método preferncial de reactivação, utiliza-se um agente de bloqueio de dissulfureto para se originar um produto intermédio de dissulfureto monomêrico misto, de tal modo que os grupos sulfidrilo livres de rPDGF reduzido monomêrico, não reactivado, sejam bloqueados. Esta operação evita que os grupos sulfidrilo de rPDGF reduzido formem prematuramente ligações dissulfureto durante o isolamento e a purificação. Ao mesmo tempo, esta modificação também torna o intermediário de rPDGF solúvel em soluções aquosas. Como consequência desta solubilidade, podem utilizar--se as forças presentes num meio aquoso seleccionado para aliciar 18 >Ί ο intermediário monomêrico bloqueado a adquirir a sua conformação biologicamente activa, após o que pode ocorrer o desbloqueamento. 0 desbloqueamento origina, habitualmente, a formação de uma forma dimérica PDGF em que a estrutura dimérica se encontra "travada" no local pela formação das desejadas ligações dissulfureto intra-cadeias e intercadeias.

De um modo surpreendente, descobriu-se que o análogo de rPDGF B monomêrico bloqueado da presente invenção apresentava actividade biológica apesar de ser necessária uma quantidade significa tivamen.te superior do monõmero para se atingir a actividade máxima observada para o dlmero correspondente de PDGF (isto ê, a actividade especifica do monõmero era inferior ã do dímero). Não 1 credível que PDGF exista naturalmente numa forma monomérica e por isso nao foi isolado da natureza. Pôs-se a hipótese de que a forma dimérica de PDGF fosse necessária para a actividade biológica, com base em modelos correntes de mecanismo em que se sabe que PDGF transmite um sinal através da interacção com PDGF dos receptores da superfície celular. 0 modelo predominante para a interacção necessária com os receptores da superfície celular sugere que ê necessário que dois receptores de PDGF interactuem um com o outro no sentido de transmitir o sinal. Isto origina uma reacção mutua designada por fosfo-rilação cruzada; isto é, cada um dos receptores catalisa a adição de um grupo fosfato ao outro receptor. Crê-se que cada sub-unidade monomérica de um dímero de PDGF se ligue a uma única molécula recep-tora ligando assim doisreceptores um ao outro e permitindo a fosfo-rilação cruzada, algumas vezes referida como dimerização do receptor .. Williams , Science, 243, 1564-1570 (1989); Hammacher e outros, EMBO, 8, 2489-2495 (1989). 19 -

Como consequência, embora tenha sido sugerido que a forma monomirica de PDGF pode, nalguns casos, apresentar actividade biológica (pedido de patente de invenção internacional N- 89/04460) não foi atê agora demonstrado que existisse qualquer actividade deste tipo. Para além disso, não foi ainda explicado o facto de um monõmero poder induzir a necessária dimerização do receptor.

Embora se tenha observado que eram necessárias quantidades substancialmente superiores de análogos monoméricos de rPDGF B, da presente invenção para exibirem a actividade biológica máxima observada conseguida com as formas dimêricas correspondentes, também se descobriu que estes monómeros eram de facto capazes de atingir um nível de "super-actividade" isto é, uma actividade, pelo menos, aproximadamente 3 a 3,5 vezes superior â actividade atingida com qualquer quantidade do dímero. A aplicação terapêutica dos análogos diméricos de rPDGF B biologicamente activos e/ou dos análogos de rPDGF B monoméricos biologicamente activos da presente invenção pode ser utilizada no tratamento de diversos tipos de ferimentos de espécies de mamíferos pelos médicos e/ou veterinários. A quantidade de PDGF biologicamente activo utilizada em tais tratamentos dependerá, como ê evidente, da gravidade do ferimento a ser tratado, da via de administração escolhida e da actividade específica ou pureza^de PDGF .e,, será.determinado pelo médico ou veterinário assistentes. A expressão quantidade "terapeuticamente eficaz de PDGF" refere-se â quantidade de PDGF, na ausência de outros factores de crescimento aplicados exo-genamente, que se determinou produzir uma resposta terapêutica num mamífero. O especialista determinará facilmente as tais quantidades terapeuticamente eficazes. As quantidades terapeuticamente eficazes de análogos de rPDGF B para o tratamento tota- e parcial de ferimen- r 20 -tos das camadas dériiiicas encontram-se descritas no pedido de patente de invenção norte-americana pendente,,série N2 362 622 que aqui se indica como referência.

Pode administrar-se o PDGF, produzido de acordo com a presente invenção, segundo qualquer uma das vias adequadas para o ferimento ou situação que se pretende tratar. As situações que se podem especialmente tratar com a aplicação ou aplicações terapêuticas de PDGF incluem as feridas expostas da derme anteriormente referidas, os ferimentos incisivos da derme e os ferimentos incisivos gastrointestinais. Também se pode utilizar PDGF na cicratiza-ção de ossos, cartilagens, tendões, ligamentos e epitélio (como por exemplo revestimento intestinal, revestimento gástrico) e reparações da glia.

De um modo preferencial, aplica-se PDGF por via exógena sobre o ferimento. A aplicação exógena pode efectuar-se mediante uma única aplicação ou dose ou por uma dose repetida a determinados intervalos múltiplos. As composições para aplicação de PDGF da presente invenção por via exogéna, são facilmente determinadas pelos especialistas. O especialista deverá ter em consideração que a via preferencial poderá variar com o ferimento ou situação que se pretenda tratar. Embora seja possível administrar PDGF como composto puro ou substancialmente puro, ê preferível utilizá-lo sob a forma de uma preparação ou formulação farmacêutica.

As formulações da presente invenção quer para utilização a nível veterinário quer para utilização em seres humanos, consistem numa quantidade terapeuticamente eficaz de PDGF, tal como anteriormente se descreveu. Conjuntamente com um ou mais veículos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico e eventualmente de outros ingredientes terapêuticos. 0(s) veículo (s) tem de ser '^aceitável". 21 no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não ser perigoso para o receptor. De um modo desejável, a formulação não incluirá agentes oxidantes ou redutores e outras substâncias com as quais se sabe que os piptidos são incompatíveis . As formulações podem apresentar-se de um modo conveniente numa forma de dosagem unitária e podem ser preparadas de acordo com quaisquer, métodos conhecidos na especialidade. Todos os métodos incluem um passo que consiste em colocar em associação o ingrediente activo com o veículo que ê constituído por um ou mais ingredientes acessórios. Geralmente preparam-se as formulações associando uniforme e intimamente o PDGP com os veículos líquidos ou os veículos sólidos finamente divididos ou ambos.

Proporcionam-se os exemplos que se seguem com a finalidade de auxiliar a uma melhor compreensão da presente invenção, encontrando-se o âmbito da mesma indicado nas reivindicações em anexo. Considera-se que se podem efectuar modificações nos procedimentos indicados, sem alterar o espírito da presente invenção.

Exemplo 1

Purificação e separação de rPDGF B produzido em CHO

Efectuou-se a clonagem do gene c-sis que continha um codão de paragem natural no aminoácido 161 e expressou-se em células CHO, tal como se descreveu detalhadamente no pedido de patente internacional N- PCT/US88/0070, tendo-se purificado e separado o rPDGF B resultante tal como se indica a seguir.

Purificou-se o rPDGF B a partir dos meios condicionados de células CHO-pDSVE/C-sis de mamíferos em quatro passos e depois concentrou-se e diafiltrou-se. No primeiro passo, adicionou-se uma forte resina de permuta de catiões "Biocryl BPA-2100" ao meio condicionado filtrado a um nível de 0,125% (vol. 10% suspensão/vol. meio). Após agitação para permitir a ligação da proteína de rPDGF B â resina, recuperou-se o complexo produto-resina por centrifugação de fluxo contínuo. Depois lavou-se o agregado com aproxima-damente 8 volumes (relativamente ao peso seco do agregado) de um tampão que consistia em etanol a 10%/Tris HCL 10 rnM, a pH 7,7 e recuperou-se por centrifugação. Efectuou-se uma nova suspensão do agregado em dois volumes do mesmo tampão após o que se adicionou um volume equivalente de etanol a 95%. Armazenou-se esta suspensão a -20°C e + 10°C antes de se efectuar o tratamento posterior.

Centrifugou-se a suspensão resinosa e efectuou-se uma nova suspensão do agregado em NaCl 0,1 Μ/Tris HCl 20 mM, a pH 7,7 a uma temperatura ambiente controlada. Após ter-se obtido uma suspensão, adicionou-se N-lauroilsarcosina de sódio a 10% (p/v) para se obter uma concentração final de 10% (p/v). Depois agitou-se a suspensão durante pelo menos trinta minutos, após o que se submeteu esta suspensão a uma centrifugação para se separar a resina (sedimento) do produto (agora sob a forma de sobrenadante). Depois re-extriu-se a resina tal como anteriormente referido utilizando um terço do volume de agente de extracção, N-lauroilsarcosina de sódio, para se obter qualquer produto residual que tivesse ficado absorvido no agregado após a primeira extracção.

Trouxeram-se os sobrenadantes agregados a partir dos passos de extracção da resina ate a um pH 2,7 + 0,1 com ácido clorídrico (HCl). Depois adicionou-se 1,05 volumes de etanol a 95% e eliminou-se um leve precipitado por centrifugação.

Aplicou-se o sobrenadante dos passos anteriores a uma i; - 23 - coluna de sulfoxietil-(SE)-celulose previamente equilibrada com etanol a 50%/HCl 5 mM. A um pH ácido, a N-lauroilsarcosina encontrava-se descarregada e deste modo passou através da coluna enquanto que o produto rPDGF B, sendo catiõnico, se ligou â matriz da coluna. Lavou-se a coluna com uma mistura de etanol a 50%/HCl 5 mM para se eliminar a N-lauroilsarcosina residual e depois com NaPO^ 20 mM, a um pH 7,5, para se trazer o pH até ao pH neutro e finalmente com Tris.HCl 10 mM, a um pH 7,7. Eluiu-se o produto rPDGF B com uma mistura de NaCl 0,5 m/Tris HCl 10 mM, a pH 7,7.

Adicionaram-se dois volumes e meio de água para injecção, â solução de rPDGF B, seguindo-se-lhe dois volumes e meio de (NH^^SO^ 3,0 M. Depois aplicou-se o produto a uma coluna "Phenyl--Sepharose®" (Pharmacia, Uppsala, Suécia) previamente equilibrada com etanol a 5%/(NH^)2SO^ 1,25 M/ NaPO^ 50 mM, a pH 7,5. Apôs ter-se carregado a coluna com o produto, lavou-se a coluna com o ultimo tampão. Eluiu-se o produto rPDGF B a partir da coluna utilizando um gradiente linear decrescente em sulfato de amónio e gradiente linear crescente em etanol. 0 tampão inicial era idêntico ao tampão de lavagem e o tampão de limite era constituído por etanol a 30%/NaPO4 50 mM, a pH 7,5. Analisaram-se as fracções desta coluna por SDS-PAGE em condições não redutoras. Agregaram-se as fracções que continham o produto isento de outras proteínas con-taminantes.

Trouxeram-se as fracções agregadas a partir do passo anterior até um pH de 4,0 + 0,1 com HCl IN e depois concentraram-se (r) numa membrana de ultrafiltração "Amicon YMV'—'10" (Amicon Inc.,

Danvers, Massachusetts) para uma absorvância de 280 nm (1 cm de nível claro) de aproximadamente 0,6. Depois diafiltrou-se o produto com pelo menos quatro volumes de uma mistura de acetato de amónio

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10 mM/NaC 10,,15 M, a pH 4,0. Depois diluiu-se a solução de produto com esta solução a uma absorvância de 280 nm (1 cm de nível claro) de 0,24 + 0,04 que ê equivalente a 0,5 mg de rPDGF B/ml.

Exemplo 2

Determinação da estrutura primária de rPDGF B segregado pelas células CHO

No sentido de se determinarem as posições nas quais as células dos mamíferos processavam os 241 aminoãcidos da proteína precursora codificada por c-sis para PDGF B^gg, analisou-se a estrutura do produto proteico recombinante processado e segregado, por electroforese analítica sobre gel e por sequenciação de proteínas .

Análise da sequência aminoácida

Determinou-se a sequência aminoácida de rPDGF B purificada e partir dos meios condicionados das células CHO-pDSVE/c-sis por combinação de uma análise sequencial de rPDGF B intacto e por uma análise sequencial das proteases peptídicas de SV8 e triptidas obtidas por digestão de rPDGF B reduzido que se tinha derivado com 4-vinil-piridina. Efectuaram-se as determinações sequenciais utilizando sequenciadores 470A e 477A (Applied Biosystems, Inc., Foster City, Califórnia). Os resultados encontram-se resumidos adiante e na fig. 1.

Efectuou-se a sequenciação rPDGF B intacto durante 26 ciclos. A maior sequência que se identificou através desta análise /-25- ./ r inicia-se no aminoácido 1 de aPDGF B e encontra-se indicada nas linhas superiores designadas por "PDGF total" na fig. 1. Esta sequência corresponde â sequência esperada para rPDGF B a partir da sequência de ADN. A preparação utilizada para este processo de sequenciação não foi alquilada pelo que a cisteína no ciclo 16 podia não ser detectada. A cisteína não alquilada não i facilmente identificada numa análise de sequenciação. Observaram-se sequências menores que correspondiam a fragmentos que se iniciavam nos aminoãcidos 33 e 80 da sequência de rPDGF B. Estas sequências amino terminais menores eram semelhantes ãs observadas nas plaquetas dos seres humanos (Johnsson e outros, ibid) e deviam-se a clivagens internas produzidas durante o tratamento de proteína.

Isolaram-se fragmentos peptídicos a seguir â separação da tripsina e das digestões de protease de SV-80 de rPDGF B que se tinham reduzido e alquilado com 4-vinil-piridina. A redução foi necessária devido ao facto de rPDGF B não reduzido não ser digerível pela protease da tripsina ou de SV-8. A alquilação com 4-vinil-piridina permitiu a detecçao de cisternas pelos sequencia-dores. A combinação da análise da sequência amino terminal de rPDGF B total e da análise da sequência amino terminal dos pep-tidos trípticos e de SV-8 confirmaram a sequência da proteína totalmente até ao resíduo 118. Utilizou-se a análise sequencial car-boxi terminal com carboxipeptidase P para se confirmarem os resíduos de 117 a 119. Os dados indicaram que a forma principal da preparação da proteína de rPDGF B a partir de células CHO de mamíferos era 'idêntica aos 119 resíduos aminoãcidos indicados na fig. 1.

Electroforese analítica sobre gel

Efectuou-se a electroforese do produto de rPDGF B purificado a partir de meio condicionado de células CHO-pDVSE/c-sis de mamíferos, tal como se descreveu no exemplo 1, sobre um gel SDS-poliacrilamida a 12%. Esta técnica permite o calculo da extensão dos polipêptidos de tamanho desconhecido quando se efectua a sua comparação com proteínas normalizadas adequadas de tamanho conhecido. Efectuou-se a electroforese da proteína de rPDGF B (10 jxg) produzida pelas células CHO-pDSVE/c-sis quer antes quer após a redução e depois corou-se o gel com azul brilhante de Coomassie. Como se pode verificar na fig. 2, pistas 1 e 2, esta proteína migrou de um modo consideravelmente mais rápido apés a redução. A análise da amostra reduzida também revelou a presença de quatro bandas principais. O padrão ê consistente com a estrutura de rPDGF B não reduzido no qual os monémeros de rPDGF B de quatro comprimentos diferentes se encontravam emparelhados em dímeros de dissulfureto.

No sentido de se obter uma determinação rigorosa dos tamanhos dos quatro monémeros de rPDGF B segregados pelas células CHO-pDSVE/c-sis, compararam-se as mobilidades electroforêticas destes polipêptidos com as de duas proteínas rPDGF B de tamanho conhecido designadamente rPDGF B ^ e rPDGF Bllg que se produziram utilizando o sistema de expressão bacteriano. Estas proteínas de rPDGF B produzidas utilizando sistemas bacterianos obtiveram-se tal como se descreveu no exemplo 3, com excepção de em Um dos casos se ter utilizado uma sequência de código que utilizava um codão de paragem no aminoãcido na posição 110, para se efectuar a trans-fecção da célula hospedeira bacteriana. Devido à presença de um 9- 27 „ // # problema de leitura através de um codão de paragem no ultimo caso, foi necessário separar as proteínas recombinantes resultantes (PDGF B;Lgc)e PDGF B^q) me-*-° condicionado. As duas proteínas de rPDGF B produzidas em sistemas bacterianos escolhidos para serem utilizadas como padrões contra o produto recombinante dos mamíferos foram especialmente construídas para terminar na extremidade carboxilo com os aminoãcidos 109 e 119, com base na análise sequencial de PDGF B das plaquetas humanas (Johnsson e outros, ibid) e de rPDGF B das células CHO-pDSVE/c-sis (anterior-mente descrito). A análise de sequência aminoãcida efectuou-se tal como se indica no exemplo 2, e confirmou-se que estas duas proteínas produzidas em sistemas bacterianos consistiam nos resíduos de 1-109 e de 1-119, respectivamente, de sequência aminoácida da proteína precursora de PDGF b^qq· Tal como se indica na fig. 2, pistas 2-4, o polipêptido de migração mais rápida na amostra de rPDGF B reduzido dos mamíferos (CHO-pDSVE/c-sis) migrou conjuntamente com a E. coli rPDGF normalizada, enquanto que o polipêptido que a seguir migrou mais rapidamente na amostra de mamíferos migrou conjuntamente com a E. coli rPDGF B^g normalizada. Os dois polipépti-dos de migração mais lenta nas amostras dos mamíferos migraram em posições consistentes com extensões de 5 a 20 aminoãcidos do que com a forma de 119 aminoãcidos. Os resíduos aminoãcidos básicos são muitas vezes o sitio de clivagens proteolíticas. A observação das sequências aminoácidas da proteína precursora de PDGF B-^gg de 241 aminoãcidos revelou aminoãcidos básicos nas posições 126, 130, 133, 135 e 136. A clivagem em qualquer uma destas posições proporcionaria análogos de PDGF B que possuiriam de 7 a 17 aminoãcidos de extensão em vez da forma de 119 aminoãcidos. 28 A sequência aminoãcida e a análise electroforêtica em gel indicaram conjuntamente que o rPDGF B segregado pelas células hospedeiras dos mamíferos (CHO-pDSVE/c-sis) era uma mistura de dímeros derivados de quatro monómeros, cada um dos quais possuía uma extremidade amino constituída pela serina numero 1 da sequência de proteínas de PDGF B^gg. 0 mais abundante dos quatro poli-péptidos possuía uma extremidade carboxi que terminava na arginina número 119. Um dos outros destes polipéptidos possuía uma extremidade carboxi que consistia na treonina número 109. Os restantes dois polipéptidos terminavam na extremidade carboxilo com um amino-ãcido prolongando-se por mais 5 a 20 aminoãcidos do que a forma de 119 aminoãcidos muito provavelmente na arginina 126, arginina 130, arginina 133, arginina 135 ou arginina 136.

Exemplo 3

Produção de rPDGF B-^g

Construiu-se uma sequência que codifica a proteína precursora que codifica PDGF B-^g, indicada na fig. 3, utilizando o gene v-sis como material inicial.

Conversão dos aminoãcidos 101 e 107

Digeriu-se 1 jig do plasmídeo pC60, um clono do genoma retrovírico do vírus do sarcoma simiano (Wong-Staal e outros, Science, 213, 226-228 (1981), com endonucleases Sall e Xbal tendo--se depois purificado o fragmento resultante de 1183 pares de bases por separação electroforêtica num gel de agarose a uma tempe- 29- r tf ratura inferior ao ponto de fusão, de acordo com os procedimentos descritos por Maniatis e outros, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982). Depois excisou-se o fragmento purificado do gel. Ao mesmo tempo, também se digeriu 0,2jxg de ADN de Ml3mpl9 com Sall e Xbal, isolando-se de modo idêntico á grande banda de 7245 pares de bases a partir de um gel a uma temperatura inferior ao ponto de fusão. Fundiram-se os fragmentos excisados a 65°C e depois arrefeceram-se até 37°C. Misturou-se e ligou-se a totalidade do gel can o fragmento Ml3mpl9 de 7245 pares de bases e um quarto do gel ccrn o fragmento v-sis de 1183 pares de bases, de acordo com Struhl, Biotechniques, 3, 452-453 (1985).

Transformou-se o ADN ligado na E.ooli K12 estirpe TG1 e seleccionou-se uma placa línpida que se desenvolveu num líquido de cultura. Confirmou-se a presença do fragmento v-sis de 1183 pares de bases em Ml3mpl9 por preparação da forma RF do ADN do bacteriôfago e por análise do mapa de restrição. Messing e outros, Nucl. Acids Res., 9, 309-321 (1981).

Desenvolveu-se o bacteriôfago Ml3mpl9/v-sis assim obtido numa cultura líquida e isolou-se o ADN de codão único. Messing e outros, ibid. Utilizou-se este ADN como uma matriz para a mutaginese in vitro dirigida de um oligonucleõtido para converter os aminoãcidos dos resíduos 101 a 107 nos aminoãcidos correspondentes de PDGF B. Isto ê, converteu-se o codão ATA que codifica a ísoleucina 101 em ACA (que codifica a treonina) e o codão CGT que codifica a alanina 107 foi convertido em TCC (que codifica a prolina).

Complementar!zou-se 10 jxg de ADN de codão simples M13mpl9/v-sis ccrn 8 pmol de um oligonucleõtido fosforilado que possuía a sequência: 5 GGTCACAGGCCGTGCAGCTGCCACTGTCTCACAC 3'

Esta sequência ê homóloga dos nucleõtidos 4283 e 4316 do gene v-sis (sistema de numeração de Devare e outros, ibid). As bases sublinhadas do oligonucleõtido evidenciam as alterações de v-sis para a sequência de PDGF humano. Iniciou-se a síntese do ADN no oligonucleõtido mutante, sintetizando-se o cordão mutante com- pleto com o fragmento "klenow" de ADN polimerase I de E. coli utilizando trifosfatos de tionucleõtidos seguidos da ligação com ADN T4 ligase. Eliminaram-se quaisquer vestígios de ADN de cordão simples da matriz de M13mpl8/v-sis por filtração sobre filtros de nitrocelulose. 0 cordão não mutante foi cortado por encubação com endonucleases de restrição III. Depois re-polimerizou-se o cordão não mutante cortado com trifosfatos de desoxinucleõtidos utilizando o cordão mutante como matriz. Como resultado, ambos os cordões de ADN do produto final continham as mutações desejadas. Transformou-se o ADN na E. coli K12 estirpe TGl. Seleccionaram-se as placas, desenvolveram-se numa cultura líquida e isolou-se o ADN de cordão simples. Efectuou-se a sequenciação do ADN de acordo com o método de Sanger e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 5463--5467 (1977) para se confirmar a obtenção dos mutantes desejados.

Conversão dos aminoãcidos 6 e 7

No passo seguinte, a porção da extremidade 5' do gene v-sis que foi submetido a mutação foi substituída por um fragmento de ADN de síntese que alterou os aminoãcidos 6 e 7 de v-sis para as formas de PDGF B humano. Este fragmento de síntese também proporcionou um codão ATG de iniciação de transferência imediatamente precedido do codao para a serina 1 de PDGF B humano assim como proporcionou sequências para a ligação aos ribossomas de E. coli e um sítio de restrição para ligação no interior do vector de expressão de E. coli desejado (descrito adiante). Ligou-se o fragmento de ADN de síntese ao sítio BglII localizado no nucleõtido 4061 do gene v-sis (sistema de numeração de Devare e outros, ibid).

Devido ao facto do sítio BglII que se encontra presente no vector 31 '· .asSJf* jí M13mpl9 poder vir a complicar e interferir neste passo, moveu-se o gene v-sis submetido a mutação para o vector plasmídico comercialmente disponível pUC18, que não contém um sítio BglII. Efectuou--se a restrição do ADN mutante de RN de M13mpl9/v-sis com Sall e BamHl e isolou-se o fragmento resultante de 1193 pares de bases por electroforese utilizando um gel de agarose de baixo ponto de fusão. Ligou-se este fragmento ao plasmideo pUC18 que também tinha sido submetido a restrição com Sall e BamHl. Transformou-se o ADN ligado na E. coli K12 da estirpe DH5 comercialmente disponível e seleccionaram-se os transformantes por crescimento na presença de ampicilina. Seleccionaram-se as colónias, desenvolveram-se em cultura liquida e analisou-se o ADN plasmídico isolado por mapa de restrição quanto â presença da inserção v-sis.

Efectuou-se a restrição do ADN mutante de pUCl8/v-sis com HindiII que corta a região de poli-ligação de pUC18 imediatamente a montante da inserção v-sis submetida a mutação e com BglII que corta o ADN de v-sis num nucleotido 4061 (sistema de numeração de Devare e outros, ibid) que corresponde ao aminoãcido número 24 da proteína madura. O grande fragmento de 3565 pares de bases resultante desta reacção foi isolado por electroforese num gel de agarose de baixo ponto de fusão. Ligou-se este fragmento a um fragmento de ADN de síntese de cordão duplo com a seguinte seqência: 5'AGCTTCTAGAAGGAGGAATAACATATGTCTCTGGGTTCGTTAACCATTGCG-3' AGATCTTCCTCCTTATTGTATACAGAGACCCAAGCAATTGGTAACGC- -GAACCGGCTATGATTGCCGAGTGCAAGACACGAACCGAGGTGTTCGA 3' -CTTGGCCGATACTAACGGCTCACGTTCTGTGCTTGGCTCCACAAGCTCTAG 5'

Este fragmento de ADN de síntese contêm uma extremidade "coesiva" HindiII na sua extremidade a montante (a esquerda) e uma extremidade "coesiva" BglII na sua extremidade a jusante (â direita). Para alem disso, encontra-se presente no sítio Xbal (TCTAGA) no ADN de síntese imediatamente a montante da extremidade "coesiva" Hindlll que permite a restrição subsequente com Xbal para ligação no sitio Xbal de um vector de expressão descrito adiante. Transformou-se o ADN ligado na E. coli K12 estirpe DH5 sendo os transformantes seleccionados por crescimento num meio contendo am-picilina. Analisaram-se os ADNs plasmídicos das colonias resultantes por mapas de restrição quanto â presença do fragmento de ADN de síntese. Nesta altura, a construção pUCl8/v-sis que contem o gene v-sis submetido a mutação, com os aminoãcidos 6, 7, 101 e 107 foi alterada para a forma de PDGF B humano e a sua extremidade 5' foi alterada para o início de transferência com um codão de ATG imediatamente antes da serina 1.

Conversão do aminoãcido 114 e colocação do codão de paragem no aminoãcido 120

No passo seguinte, o codão para o aminoãcido 114 foi alterado de ACT para GGT, originando a substituição da glicina por treonina no produto da proteína final. Para além disso, o codão numero 120, segundo o qual GCC codifica a alanina em v-sis, foi alterado para TAA, um codão de terminal de transferência. A proteína resultante desta construção termina com arginina no resíduo 119. Ambas as alterações foram levadas a efeito numa fase por inserção de um fragmento de ADN de síntese a seguir ao sítio Smal localizado no codão número 112. 33

Efectuou-se a restrição do ADN mutante de pUC18/v-sis anteriormente gerado com Smal, que corta no nucleòtido 4324 na sequência de v-sis (sistema de numeração de Devare e outros ibid) e com EcoRl, que corta na região de poli-ligação de pUCl8 imediata-menta a jusante da inserção de v-sis. Eliminou-se um pequeno fragmento (510 pares de base) entre os sítios Smal e EcoRl, que codificam a porção C-terminal da proteína v-sis e uma sequência não transferida da extremidade 3', por electroforese sobre um gel de agarose de baixo ponto de fusão. Ligou-se o grande fragmento (de cerca de 335.0. pares de base"s). a um fragmento 'de ADN de síntese que possuia a seguinte sequência: 5 ' GGGGGGTT'CCXAGCAGCAGCGATAAG 3 · 3 * CCCCCCAAGGGTCCTCGTCGCTATTCTTAA 5' O codao GG-T' que codifica o novo resíduo de glicina na posição 114 e o codão da extremidade TAA introduzido na posição 120 encontram-se sublinhados nas sequências anteriores. Este fragmento de ADN de síntese contêm uma extremidade complementar na sua extremidade a montante (â esquerda) para ligação da extremidade complementar criada por restrição da sequência mutante de v-sis com Smal e uma extremidade coesiva EcoRl na sua extremidade a jusante (direita) da extremidade EcoRl criada por restrição da região de pol-ligação de pUCl8 com EcoRl. Transformou-se o ADN ligado no interior deE. coli 'K^estirpe DH5 sendo os transformantes seleccionados por desenvolvimento num meio contendo ampicilina. Analisaram-se os ADNs plasmídicos das colónias resultantes quanto à presença do fragmento de ADN de síntese por mapa de restrição. 119 /- 34 - ?

Expressão de PDGF B

Na fase final eliminou-se a forma completa do gene v-sis mutado a partir de pUC18 e ligou-se no vector de expressão de . . E. coli pCFM1156. Preparou-se o plasmídeo pCFM115É/EL -a pártiir do plasmldeo conhecido pCFM836. A preparação do plasmídeo pCFM836 encontra-se descrita na patente de invenção norte-americana n- 4 710 473 incorporando-se aqui como referência as porções mais relevantes da memória descritiva, especialmente os exemplos de 1 a 7. Para se preparar a pCFMH56 a partir de pCFM836, cortaram-se os dois sítios de restrição endógena Ndel, complementarizaram-se as extremidades expostas com polimerase T4 e ligaram-se as extremidades complementarizadas ãs extremidades complementares. Dèpois efectuou-se a digestão do plasmídeo resultante com Ciai e com Kpnl e substituiu-se o fragmento de ADN excisado com um ADN oligonucleotídico com a seguinte sequência:

Ciai Kpnl 5'CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC3' 3' TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC 5' O vector pCFM1156, contém uma região de inserção para os genes estranhos entre um sítio Xbal a montante e um de entre diversos sítios de restrição a jusante. Neste caso, utilizou-se o sítio a jusante EcoRl. Efectuou-se a restrição do ADN mutante de pUCl8/v-sis anteriormente gerado com Xbal e com EcoRl, sendo o pequeno fragmento de 383 pares de bases isolado por electroforese sobre gel de agarose de baixo ponto de fusão. Ligou-se este fragmento ao ADN de pCFMll56 que também havia sido submetido a restrição com Xbal e com EcoRl. O ADN ligado foi transformado no interior 35 da E. coli Kl2 de estirpe FM5 (ATCC $ 67545) , sendo os trans-formantes seleccionados por crescimento num meio contendo canami-cina. Analisaram-se os ADNs plasmídicos das colónias resultantes quanto â presença do fragmento de ADN inserido por mapa de restrição . 0 plasmídeo de expressão final continha uma sequên cia de ADN inserida que codificava uma proteína que se iniciava com uma metionina de iniciação, seguida dos aminoãcidos de 1-119 da sequência da cadeia de PDGF B humano. As células hospedeiras procarióticas de E. coli eliminaram a metionina N-terminal após a síntese, pelo que a proteína final produzida correspondia aos aminoãcidos de 1-119 de PDGF B humano.

Confirmou-se a expressão da proteína de PDGF B de 119 aminoãcidos por crescimento das células bacterianas contendo o plasmídeo de expressão a 28°-30°C ati se atingir a densidade õpti-ca desejada da cultura e depois desenvolvendo a cultura a 42°C durante vãrias horas. Tomaram-se amostras das células de cultura antes de se aumentar a temperatura para 42°C e em diversas alturas depois disso. Observou-se por análiseéLectroforêtica sobre gel de SDS-policrilamida das proteínas bacterianas que uma banda predominante de pso molecular aparente de 14,6 kd se encontrava presente nas células bacterianas induzidas pela temperatura mas não nas células bacterianas previamente induzidas. Esta proteína encontrava-se presente no nível de aproximadamente 25-40 mg por litro de cultura bacteriana desenvolvida a uma densidade õptica de 600 nm de 1,0. ./- 36 f /1

Exemplo 4

Confirmação da Estrutura Primária de E. coll rPDGF B·^g

No sentido de se confirmar a sequência aminoãcida esperada e a homogeneidade de PDGF B^g Pr°duzido na E. coli, purificou-se o produto recombinante de tris lotes diferentes a partir dos corpos de inclusão utilizando técnicas conhecidas, mais pormenorizadamente descritas no exemplo 5 e depois analisaram-se por electroforese analítica sobre gel e por sequenciação de proteínas.

Análise da Sequência Aminoãcida

Efectuou-se a análise da sequência aminoãcida tal como se descreveu no exemplo '2. Esta análise confirmou que rPDGF Bllg das células hospedeiras de E. coli apresentavam a sequência esperada, tal como se indica na fig. 1.

Electroforese Analítica sobre Gel

Submeteu-se rPDGF B^ig de E. coli purificado, do exemplo 3, a uma análise SDS-PAGE em condições redutoras (2-mercaptoetanol a 5% com aquecimento) e não reduzidas (sem aquecimento). Efectuou--se, geralmente, a análise electroforêtica tal como se descreveu no exemplo 2, com excepção de se ter tratado as amostras num gel de poliacrilamida de tris a 27%, associado a padrões de peso molecular obtidos de "Bio Rad Laboratories" (Richmond, Califórnia). A fig. 4 indica os resultados para os lotes 1, 2 e 3 a seguir ã coloração com Azul Brilhante de Coomassie. Com amostras as únicas bandas detectadas foram as atribuíveis a de 3 a 24 jig E. coli rPDGF B2.19* Em conãições não redutoras observou-se uma banda de aproximadamente 30 000 pm. Após redução, observou-se uma banda com um peso molecular aparente de aproximadamente 15 000.

Exemplo 5

Reactivação do Homodímero da Cadeia B de rPDGF a partir dos Corpos de Inclusão de E. coli utilizando Glutationa como Agente de Bloqueamento

Eliminou-se para reactivação aproximadamente 1,5 a 1,6 kg de pasta de E. coli recolhida (isto ê, concentrada) do exemplo 3, contendo rPDGF Ef'ectuou-se a suspensão da pasta de E. coli em 9 volumes (v/p) de ácido etileno-diamino-tetracêtico (EDTA) dissodico 20 mM, mantendo-se a temperatura a 4°C. Efectuou-se a lise da pasta celular suspensa utilizando um homogenizador "Menton--Gaulin" a uma pressão de 14 000 psi e a uma temperatura de 12°C. Centrifugou-se imediatamente o lisado a 3 600 x G durante 60 minutos a 4°C e deitou-se fora o sobrenadante guardando-se os sedimento contendo rPDGF dos corpos de inclusão.

Efectuou-se a suspensão do sedimento em 14 volumes (v/p) de ureia 8,5 M, glicina 0,1 M, a um pH de 3,0 e agitou-se durante 30 minutos. Entretanto drenou-se uma resina de cromatografia "SE Sepharose"® (Pharmacia) colocando a resina comercialmente disponível num funil de vidro sinterizado para o efeito, permitindo que a resina escoasse por acção da gravidade, lavando a resina com agua desionizada e permitindo que a resina escoasse novamente ou permitindo novamente a drenagem da resina. Com agitação contínua do agre- 38 gado submetido a uma nova suspensão, adicionou-se 2,4 kg da resina drenada â suspensão do agregado. Parou-se a agitação durante 30 minutos. Deixou-se a resina depositar-se e deitou-se fora o sobre-nadante. Adicionou-se â resina depositada cinco litros de ureia 8,5 M e de glicina 0,1 M, a um pH de 3,5. Agitou-se a mistura durante mais 5 minutos deixando-se novamente a resina depositar-se e deitou-se fora o sobrenadante.

Depois adicionou-se à resina depositada cinco litros de ureia 8,5 M e de ácido fosfórico 20 mM, a um pH de 3,0. Agitou-se novamente a mistura resultante durante cinco minutos, deixando novamente a resina depositar-se e deitando fora o sobrenadante. Adicionou-se â resina depositada um segundo volume de 5 litros de ureia 8,5 M e de ácido fosfórico 20 mM, a um pH de 3,0. Submeteu-se esta mistura com agitação a vácuo igual a635 mm de mercúrio durante 30 minutos. Interrompeu-se ò vácuo e tratou-se a mistura com ditrio-teitol (DTT) 5 mM, ajustando-se o pH para 7,7 com hidróxido de sódio (NaOH) 10 M. Restaurou-se o vácuo e agitou-se a mistura durante 30 minutos. Ainda em vácuo, com agitação discontínua deixou-se a resina depositar e deitou-se fora 90% do sobrenadante. Misturou-se imediatamente a resina com o líquido residual e verteu-se numa coluna de 25 cm de diâmetro (coluna em lotes) com o adaptador de fluxo ligado e carregou-se a resina a 100 cm/hora durante 10 minutos com ureia 8,5 M, fosfato de sódio (^2^0^) 20 mM, a um pH de 7,7 que tinha sido e estava a ser aspergido com azoto gasoso (tampão A). Baixou-se o adaptador de fluxo para a superfície da resina e lavou--se a coluna com mais tampão A a um debito de 25 cm/hora ate que a absorvência do efluente a 280 nm fosse constante.

Efectuou-se então a conecção entre o orifício de descarga da coluna em lotes com o orifício de admissão de uma segunda coluna r 39 -de 25 cm x 20 cm (coluna de resolução) cheia com sefarose SE''-» (Pharmacia) recentemente preparada e equilibrada com tampão A.

Depois efectuou-se a resolução das colunas em lotes e de resolução a um debito de 25 cm/hora com um gradiente linear de 80 litros de tampão A a 100% a tampão B a 100% (ureia 8,5 M, Na2HPO^ 20 mM, NaCl 0,4 M a pH 7,7) que se tinha aspergido e continuava a aspergir com azoto gasoso. Agregaram-se imediatamente as fracçÕes adequadas e colocaram-se em vácuo ã medida que se retiravam da coluna. O rendimento foi de 0,45 a 0,90 g por litro de caldo de fermentação .

Diluiu-se a solução desnaturada contendo rPDGF se necessário, a uma absorvância que se situava entre 0,4 e 0,5 D.O. Depois efectuou-se uma solução de proteínas monoméricas 0,1 M em glutationa oxidada e ajustou-se o pH para 8,0 com NaOH 10 M. Colocou-se novamente a solução em vácuo e agitou-se durante 18 a 24 horas. Interrompeu-se o vácuo e diminuiu-se o pH do intermediário actualmente derivado de sulfureto misturado com rPDGF monomêrico para 3,0 com HCl. Concentrou-se a solução resultante para metade do volume inicial e depois diafiltrou-se em primeiro lugar contra quatro volumes de ureia 8,5 M, ácido acético 0,1 M seguindo-se-lhe depois quatro volumes de ácido acético 0,1 M utilizando uma mem-brana de ultrafiltraçao "Amicon YMv-> 10" (Amicon INC., Danvers, Massachusetts). A concentração final da proteína encontrava-se 1 o. situada entre 1,5 e 2,0 mg/ml (Ejn = 0,46) com uma pureza de /.ον nm rPDGF-S-S-G ^ 85% e um rendimento que se situava entre 0,45 e 0,90 g por litro de caldo de fermentação.

Efectuou-se a reactivação por diluição da solução de rPDGF-S-S-G para 0,1 mg/ml com Tris 20 mM. Adicionou-se subsequentemente cisteína 1M em ácido acético 0,1 M a esta solução, até ./- 40 - a uma concentração final de 1 mM e ajustou-se o pH para 8,0 com NaOH. Deixou-se a solução em agitação durante 16 horas no sentido de se desbloquear o intermediário rPDGF-S-S-G monomêrico e de se dar inicio ã formação das ligações dissulfureto intercadeia e in-tracadeia do produto final dimérico desejado e depois tratou-se com ácido acético 0,1 M. 0 rendimento foi de 0,32 a 0,63 g por litro de caldo de fermentação.

Carregou-se a solução dimêrica de rPDGF reactivado a um débito de 100 cm/hora, numa coluna de 11,3 x 5 cm de vidro po- 2 roso controlado (CFG, pg-350-400, 96 M /gv. diâmetro medio dos poros 382 £, Sigma Cheniical Company, St. Louis, Missouri) , equilibrada com glicina 0,05 M, a um pH de 3,5 (tampão C) ou com glicina 0,05 M, NaCl 0,4 M, a um pH de 3,5 (tampão D). A seguir ao carregamento da solução pés-oxidação de rPDGF na coluna, lavou-se a coluna com tampão de equilíbrio a um débito de 40 cm/hora. O homo-dimero de rPDGF purificado eluiu-se então a partir da coluna novamente a um débito de 40 cm/hora, por aplicação de um gradiente inicial de 5 litros quer com tampão C quer com tampão D e terminando com guanidina-HCl 2M em tampão C ou ureia 8 M em tampão D.

Agregaram-se as fracções adequadas do homodímero rPDGF B119' ® rendimento situou-se entre 0,25 e 0,5 g por litro de caldo de fermentação.

Exemplo 6

Actividade Mitogénica do Homodímero da Cadeia B de rPDGF reactivado

Ensaiou-se o homodímero rPDGF B 119 reactivado do exemplo 41 5 quanto à sua actividade mitogênica, de acordo com um ensaio de incorporação de timidina, utilizando células de rim de ratazana normal, Clone 49F, ATCC Φ CRL-157Ç/CRNK) ..de'’ acordo com" 'a' modificação do método descrito por Pierce e outros; "J. Exp. Med., 176"; (1988) p.974,987, utilizando rPDGF B de mamíferos a partir de células de CHO como um padrão. Desenvolveram-se as células NRK num meio de crescimento (FBS-DMEM) que consistia em: (1) Meio de Eagle CDMEM) Modificado por Duibecco contendo lg/li- tro de glicose, uma solução de penicilina/estreptomicina a 1% em (peso /v) (100 x 10,00 unidades de penicilina, 10.000 ^ig de estrep- tomicina/ml) e uma solução de L-glutamina a 1% (v/v) a 100 X, 200 mM; e (2) Soro de feto de BCvino a 7,5% SFB (Whitaker MA Bioproducts, Walkersville, Maryland).

Colocaram-se as células em placas de microtitulação de 24 tubos a uma densidade de 2 x 10^ cêlulas/tubo de SFB-DMEM. Decorridos 5 dias, aspirou-se o meio SFB-DMEM e substituiu-se por 1 ml de DMEM sem SFB no sentido de "submeter" as células a um regime de fome de modo a que elas pudessem responder de um modo mais marcado apés exposição a PDGF. Incubaram-se as células neste meio durante 24 horas após o que se adicionou a cada tubo 50 jil de uma amostra contendo PDGF. Apés mais 18 horas de incubação, aspirou-se a amostra contendo PDGF e substituiu-se por 1 ml de meio de marcação que consistia em DMEM, SFB a 5% e 2 JiCl/ml de 3H-timidina. Incubaram-se as placas durante um período adicional de 1 hora a 37°C. Separaram-se as células a partir dos tubos em triplicado com uma solução de sacarose/EDTA e recolheram-se com um aparelho de micro recolha automatizado sobre superfícies de filtros de fibra de vidro. Fixaram-se as células sobre essas superfícies com etanol 42 / ··. e, apôs lavagem, efectuou-se a contagem desses filtros com um contador de cintilação. 0 valor médio dos tubos de controlo que não tinham recebido PDGF foi subtraido das contagens médias triplas de cada amostra experimental. Efectuou-se o diagrama logarítmico da concentração de PDGF em ng/ml em função de cpm incorporada por cada amostra. Indicam-se os resultados no quadro 5. Estes resultados demonstram que o rPDGF b-q9 reactivado do exemplo 5 possuia substancialmente a mesma actividade mitogênica de rPDGF B das células hospedeiras eucariôticas CHO.

Exemplo 7

Actividade Quimiotãctica do Homodímero da Cadeia B de rPDGF Reactivado

Ensaiou-se o homodímero rPDGF B119 reactivado do exemplo 5 quanto â sua actividade quimiotãctica sobre os fibroblastos e monõcitos de acordo essencialmente com o método descrito em Sénior e outros, J. Cell. Biol., 96, 382-385 (1983); Duel e outros J.

Clin. Invest., 69, 1046-1049 (1982). Ensaiou-se o rPDGF do exemplo 4 em câmaras "Boyden", tal como descrito nos artigos em referência, utilizando rPDGF B de mamíferos obtidos a partir de células CHO como padrão. Neste ensaio, as células m-igraram através do filtro de uma outra câmara sèm o agente quimiotãctico, para outra câmara com o agente quimiotãctico. Decorrido um dado período de tempo, efectuou-se a contagem do número de células num campo microscópico com o apoio de um agente quimio-captor.

Obtiveram-se os fibroblastos a partir de amostras de espêci- 43 mes cirúrgicos da;peLeide adultos normais. Efectuou-se a cultura das células num meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), enriquecido com L-glutamina 2 mM, aminoãcidos não essenciais e soro de feto de bovino a 10% (KC Biological, Inc., Lenexa Kansas). Utilizaram-se as células para ensaios após seis passagens. Obtiveram--se as células mononucleares do sangue humano (monécitos) utilizando gradientes de "Ficoll/Hypaque" e suspendendo-as em DMEM en-riquecido com albumina humana a 2% â densidade de 2,5 x 10 células por ml.

Determinou-se a quimiotaxia num aparelho de tubos multi--cegos que possuiam 30 tubos. Utilizou-se a técnica da membrana dupla, utilizando uma membrana de policarbonato (Nucleopore Corpo-ration, Pleasanton, Califórnia) com poros de 8 ^Lim (fibroblastos) ou poros de 5 ^im (monócitos) no topo de uma membrana de nitrato de celulose (Millipore Corporation, Bedford, Massachusetts) que possuia poros de 0,45^um, para se separar cada tubo num compartimento superior e num compartimento inferior. Encheu-se o compartimento inferior com uma solução de PDGF a ser ensaiada ou com meio de controlo, cobrindo-se depois com membranas, de acordo com a ordem apropriada, após o que se adicionouao compartimento superior uma suspensão celular contendo fibroblastos ou monócitos. Após o preenchimento de ambos os compartimentos dos tubos, colocou-se o aparelho de quimiotaxia numa incubadora humidificada a 37°C numa atmosfera de diõxido de carbono a 5%/95% de ar durante 6 horas. Depois abriu-se o aparelho e eliminou-se cada par de membranas e corou-se .

Determinou-se a migração celular por contagem sob auto--amplificação de energia (400 vezes) das células que se tinham movido para a interface entre as duas membranas e aquelas que se ti- 44

nham movido para a membrana inferior. Contaram-se cinco campos de alta energia (cae) por par de membrana. Expressou-se a migração celular com um numero líquido de células que migraram por cae, isto é, o número de células por cae menos o número de célur las cae: que migraram como resposta ao meio de controlo.

Na fig. 6 indicam-se os resultados para o ensaio de quimiotaxia para os fibroblastos e na fig. 7 encontram-se os resultados para 0 ensaio de quimiotaxia para os monócitos. Estes resultados indicam que o rPDGF B-^g reactivado do exemplo 5 possui substancialmente a mesma actividade quimiotãctica que o rPDGF B das células hospedeiras eucariõticas CHO.

Exemplo 8

Comparação das Actividades Mitogénicas do Homodímero PDGF ^^ Reactivado e do Monómero PDGF B^^g Reactivado

Ensaiou-se a actividade mitogênica do intermediário rPDGF ^119 monom^r;*-co bloqueado do exemplo 5, tal como se indica no exerapló 6, utilizando o homodímero rPDGF B-^g (também do exemplo 5) como padrão. De um modc 'surpreendente,, a forma monomêrica do análogo de rPDGF B^g da presente invenção exibiu uma actividade mitogênica embora ele se assuma muito mais como monómero do que dímero (500 a 1 000 vezes mais) para tingir a mesma actividade máxima atingível com o homodímero rPDGF Bllg. De um modo ainda mais surpreendente, a actividade máxima que se poderia atingir com a forma monomêrica era 3 a 3,5 vezes superior àquela que se poderia atingir com qualquer quantidade do homodímero : PDGF B^g correspondente.

De um modo específico, ensaiou-se a actividade mitogê- -/45 - nica do monõmero rPDGF B119-S-S-G ("mB-g") em células NRK, tal como se indica no exemplo 6, utilizando o homodímero de controlo PDGF ("BB") como padrão. Indicam-se os resultados na fig. 8. Embora se possa observar a actividade máxima atingível pelo dímero no pico a cerca de 30 cpm x 10 (apos ter atingido a concentração de cerca de 4 ng/ml), a forma monomérica necessitava de 500-1000 ng/ml para atingir uma actividade comparável. No entanto, mesmo a concentrações mais elevadas, a actividade do monõmero excedia largamente a7 actividade máxima observada para o dímero.

Claims (34)

1. R Ε I V I NDICAÇÕES 1. - Processo para a produção de análogos da cadeia de factor B de crescimento derivado de plaquetas, caracterizado pelo facto de se transformar ou transfectar uma célula hospedeira com uma sequência que codifica uma proteína precursora em que se coloca um codão de interrupção numa posição na referida sequência que codifica a proteína precursora entre cerca do aminoácido 111 e cerca do aminoácido 160. s
2. 2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a célula hospedeira ser uma célula hospedei -47- ra procariotica.
3. 3.- Processo de acordo com a reivindicação 2, carac-terizado pelo facto de o codão de interrupção estar colocado numa posição entre cerca do aminoácido.111 e cerca do aminoáci do 137.
4. 4.- Processo.de acordo com a reivindicação 3, carac-terizado pelo facto de o codão de interrupção estar colocado numa.posição entre cerca do aminoácido 120 e cerca do aminoáci do 137.
5. 5.- Processo de acordo com a reivindicação 4, carac-terizado pelo facto de o- codão de interrupção estar colocado numa posição imediatamente a seguir.a um codão para um resíduo de arginina.
6. 6. - Processo.de acordo com a reivindicação 5, carácter izado pelo facto de o .referido codão de interrupção estar colocado numa posição seleccionada entre o grupo constituído por aminoácido 120, aminoácido .127, aminoácido 131, aminoácido 134, aminoácido 136 e aminoácido 137.
7. 7. - Processo de acordo com a reivindicação 6, carac-terizado pelo facto de o referido codão de interrupção estar 48- ** · .¾ colocado na posição do aminoãcido 120.
8. 8. - Processo de acordo com a reivindicação 7, carácter izado pelo facto de a sequência que. codifica a proteína pre cussora ser o gene c-sis.
9. 9. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac-terizado pelo.facto de se obter uma proteína recombinante que possui uma sequência de aminoácidos homogénea substancialmente idêntica a uma porção da sequência de aminoácidos da proteína precussora PDGF. B^g e a qual, quando redobrada, tem substancial \ mente a mesma actividade biológica da PDGF B^g que ocorre naturalmente, terminando a proteína . recombinante numa posição compreendida entre cerca do aminoãcido 110 e cerca do aminoãcido 159.
10. 10. - Processo de acordo com a reivindicação 9, carac-terizado pelo facto de a proteína recombinante terminar numa po sição entre cerca do aminoãcido 110 e cerca do aminoãcido 136.
11. 11. - Processo de acordo com a reivindicação 10, carac terizado pelo facto de a referida proteína recombinante terminar numa posição entre cerca do aminoãcido 119 e cerca do amino-ácido 136.
12. 12.- Processo de acordo.com a reivindicação 11, cara£ terizado pelo facto de a referida proteína recombinante terminar numa posição seleccionada entre o grupo constituído pelo aminoácido 119, aminoãcido 126, aminoácido 130, aminoácido 133, aminoacido 135 e aminoácido 136.
13. 13. - Processo de acordo terizado pelo facto, de a referida nar no aminoácido 119.
14. 14. - Processo· de acordo terizado pelo facto de a referida a sequência de aminoãcidos de 1 a com a reivindicação 12, carac proteína recombinante termi- com a reivindicação 13, carac proteína recombinante possuir 119 ilustrada a seguir 10 30 50 1 CTAGAAGGAGGAATAACATATGTC?C7GGGTTCG7TAACCA?7GCGGAACCGGCTA7GAT —•τ——————r TTCCTCCTTATTGTATACAGAGACCCAAGCAArTGGTAACGCCTTGGCCGATACTA MetSerLeuGlySerLeuTirlleAIaGluProAlaMetll ου 61 121 70 90 110 * * · · · · TGCCGAGTGCAAGACACGAACCGAGGTGTTCGAGATCTCCCGGCGCCTCATCGACCGCAC ----------—------------------r-----------------—---------- ACGGCTCACGTTCTGTGCTTGGCTCCACAAGCTCTAGAGGGCCGCGGAGTAGCTGGCGTG eAlaGluCysLysThrÀrgThrGluValPheGluIleSerÀrçArglieuIleAspArçTh 14 130 150 170 »·«·«» CAATGCCAACTTCCTGGTGTGGCCGCCCTGCGTGGAGGTGCAGCGCTGCTCCGGCTGTTG ISO GTTACGGTTGAAGGACCACACCGGCGGGACGCACCTCCACGTCGCGACGAGGCCGACAAC · rÀsnAlaAsnPheLeuValTrpProProCysValGluValGlaArgCysSerGlyCysCy 5 34 ISO 210 230 • · · · · · CAACAACCGCAACGTGCAGTGCCGGCCCACCCAAGTGCAGCTGCGGCCAGTCCAGGTGAG 181 +---------+---------+---------------------!----------- GTTGTTGGCGTTGCACGTCACGGCCGGGTGG^TTCACGTCGACGCCGGTCAGGTCCACTC sAsnAsnArgAsnValGlnCysArgProT&rGlnValGlaLeuÀrçPrcValGlnValAr 54 250 270 290 «····· AAAGATCGAGATTGTGCGGAAGAAGCCAATCTTTAAGAAGGCCACGGTGACGCTGGAGGA 241 3CC ---------—--+-----—-------------------+----------r TTTCTAGCTCTAAC ACGC CTTCTTCGGTTAGAAATTCTTCCGGTGC CACTGCGAC CTC CT gLysIleGluIleValArgLysLysProIlePheLysLysAlaThrValThrleuGluAa 74 '310 330 350 • · · · · CCACCTGCCATG CAAGTGTGAGACAGTGGCAGCTGCACGGCCTGTGACCCGAAGCCCGGG 301 ---- i----------- +-------—r ggtggacgttacgttcacactctgtcaccgtcgacgtgccggacactggacttccggccc pHislatfilaCysLyaCyaGluThrValAiaAlaAIaArgProValTlirArgSerPrcGl 94 370 380 • · gggttcccaggagcagcgataag ---------+---------+--- C C C AAGGGTC CTC GTC GCTATTÇTTAA yGlySerGlnGluGlaArg 114 119 361
15. 15. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de se obter uma proteína recombinante mo-nomérica que possui uma sequência de aminoácidos homogénea substancialmente idêntica a uma porção da sequência de aminoácidos da proteína precursora PDGF B1QS e a qual, quando redobra da, apresenta pelo menos um milésimo da actividade específica mitogénica da EDGF B^Qg que ocorre naturalmente, terminando a referida proteína recombinante numa posição entre cerca do ami noácido 110 e cerca do aminoácido 159.
16. 16. - Processo de acordo com a reivindicação 15, carac terizado pelo facto de a referida proteína recombinante terminar numa posição entre cerca do aminoácido 110 e cerca do amino ácido 136.
17. 17.- Processo de acordo com a reivindicação 16, carac terizado pelo facto de a referida proteína recombinante terminar numa posição entre cerca do aminoácido 119 e cerca do amino ácido 136.
18. 18.- Processo de acordo com a reivindicação 17, carac terizado pelo facto de a referida proteína recombinante terminar numa posição seleccionada entre o grupo constituído pelo aminoácido 119, aminoácido 126, aminoácido 130, aminoácido 133, aminoácido 135 e aminoácido 136. / -52- *
19. 19. - Processo de acordo com a reivindicação 18, carac terizado pelo facto de a referida proteína recombinante terminar no aminoácido 119.
20. 20. - Processo de acordo com a reivindicação 19, carac terizada pelo facto de a referida proteína recombinante possuir a sequência de aminoácidos 1 a 119 indicada na reivindicação 14.
21. 21. - Processo para a preparação de uma sequência que codifica a proteína precursora para utilização na expressão de segurança numa célula hospedeira de um análogo do factor B de crescimento derivado de plaquetas recombinantes, caracterizado pelo facto de se colocar um codão de interrupção numa posição na sequência que codifica a proteína precursora entre cerca do aminoácido 111 e cerca do aminoácido 160.
22. 22. - Processo de acordo com a reivindicação 21, carac terizado pelo facto de se colocar um codão de interrupção numa posição na referida sequência que codifica a proteína precursora entre cerca do aminoácido 111 e cerca do aminoácido 137.
23. 23. - Processo de acordo com a reivindicação 22, carac terizado pelo facto de se colocar um codão de interrupção numa posição na referida sequência que codifica a proteína precurso- -53- / ra entre cerca do aminoácido 120 e cerca do aminoácido 137.
24. 24.- Processo de acordo com a reivindicação 23, carac terizado pelo facto de se colocar um codão de interrupção numa posição na referida sequência que codifica a proteína precursora imediatamente a seguir a um codão para um resíduo de argini— na.
25. 25. - Processo de acordo com a reivindicação 24, cara£ terizado pelo facto de· se colocar um codão de interrupção numa posição na referida sequência que codifica a proteína precursora seleccionada entre o grupo, constituído pelo aminoácido 120, aminoácido 127, aminoácido 131, aminoácido 134, aminoácido 136 e o aminoácido 137.
26. 26. - Processo de acordo com a reivindicação 25, carac terizado pelo facto de se colocar um codão de interrupção na po sição do aminoácido 120.
27. 27. - Célula hospedeira, caracterizada pelo facto de ser transformada ou transfectada com uma sequência que codifica a proteína precursora de acordo com a reivindicação 26 de forma a permitir ã referida célula hospedeira exprimir um análogo do factor B de crescimento derivado de plaquetas possuindo uma sequência de aminoácidos homogénea.
28. 28. - Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo facto.de a referida sequência que codifica a proteína precursora ser a sequência codificadora indica da na reivindicação 14.
29. 29. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado pelo facto de se misturar uma quan tidade terapeuticamente eficaz de um análogo do factor B de crescimento derivado de plaquetas de acordo com a reivindicação 9 com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico -
30. 30. - Processo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo facto de o análogo do factor B de crescimento derivado de. plaquetas ser um análogo de acordo com a reivindicação 13.
31. 31.- Processo de acordo.com a reivindicação 30, caracterizado pelo facto de o análogo do factor B de crescimento derivado de plaquetas ser um análogo de acordo com a reivindicação 14.
32. 32.- Método de tratamento de uma ferida, caracteriza do pelo facto de se administrar à referida ferida uma quantida de terapeuticamente eficaz de um análogo do factor B de crescimento derivado de plaquetas preparado pelo processo de acor /55- do com a reivindicação 9.
33. 33.- Método de acordo com a reivindicação. 32, caracte rizado pelo facto de o análogo do factor de crescimento derivado de plaquetas ser um análogo preparado, pelo processo de acordo com a reivindicação 13.
34. 34.- Método de acordo com a reivindicação 33, caracte rizado pelo facto de o análogo do factor de crescimento derivado de plaquetas ser um análogo preparado pelo processo de acordo com a reivindicação 14. Lisboa, 19 de Dezembro de 1990 O Agente Oficial da Propriedade Industrial