RO120198B1 - Anticorpi himerici anti-cd4, cu domenii constante de gamma 4 uman modificat - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la anticorpi specifici pentru antigenul CD4 uman, substanţial lipsiţi de activitate de depleţie a celulei T, care prezintă o bună afinitate pentru CD4 uman şi stabilitate mărită la ADN-ul recombinant, care îl codifică, la un procedeu pentru producerea unui anticorp himeric specific CD4 şi la utilizarea unui anticorp himeric specific CD4, pentru tratamentul sau profilaxia unei boli sau a unei afecţiuni inflamatorii cronice sau autoimune.

Description

Invenția se referă la un anticorp himeric, ce se leagă specific la CD4 uman, la un ADN recombinant, care codifică anticorpul, la un procedeu pentru producerea unui anticorp humeric specific CD4 și la utilizarea acestora pentru fabricarea unui medicament pentru tratamentul sau profilaxia unei boli sau a unei afecțiuni inflamatorii cronice sau autoimune.

Este cunoscut faptul că CD4 este o glicoproteină de suprafață, exprimată primar pe celulele liniile de limfocite T, incluzând o majoritate de timocite și o submulțime de celule T periferice. Niveluri scăzute de CD4 sunt exprimate, de asemenea, de unele celule nelimfoide, deși semnificația funcțională a unei astfel de distribuții celulare divergente este necunoscută. La celulele T mature, CD4 servește ca funcție de corecunoaștere prin interacția cu moleculele MCH din Clasa II exprimate în celulele care prezintă antigen. Celulele T CD4⁺ constituie primar submulțimea ajutătoare ce reglează funcția celulelor T și B în timpul răspunsurilor T-dependente la infecțiile virale, bacteriene, fungice și parazitare.

în timpul patogenezei bolii autoimune, în particular atunci când toleranța la auto-antigeni dispare, celulele T CD4⁺ contribuie la răspunsurile inflamatorii, ce conduc la distrugerea încheieturilor și a țesuturilor. Aceste procese sunt facilitate de reapariția celulelor inflamatorii ale liniei hematopoietice, producerea de anticorpi, a citokinelor și mediatorilor inflamatorii și de activare a celulelor ucigașe.

Artrita reumatoidă (RA) și boala inflamatorie a sinoviului sunt o manifestare a fenomenului autoimun care conduce la erodarea, deformarea și distrugerea încheieturilor. Ca cele mai multe dintre bolile autoimune, etiologia RA nu este bine definită. Totuși, este cunoscut că RA este caracterizată prin niveluri ridicate de limfocite T CD4⁺ în încheieturile afectate, iar în cele mai frecvente cazuri pentru RA nu există vindecare. Terapia de primă urgență pentru RA este destinată pentru a asigura ușurarea simptomelor RA și îmbunătățirea capacităților funcționale pe termen scurt. Imunosupresorii și steroizii de ordinul doi și trei, cum ar fi azatioprin, metotrexat și prednisolon, având drept țintă boala instalată, sunt administrați în cazurile mai severe și sunt fie numai cu efect mediu, fie prezintă o toxicitate inacceptabilă pentru terapia cronică. De asemenea, nu protejează împotriva distrugerii încheieturilor.

în afară de RA, celulele CD4⁺ au fost implicate, de asemenea, în alte afecțiuni cronice, care includ psoriazisul, diabetul zaharat dependent de insulină, lupusul eritematos sistemic și boala inflamatorie a intestinului. Mai mult, este probabil ca exprimarea CD4 să fie implicată și în alte boli autoimune.

Dată fiind implicarea celulelor T în dezvoltarea și menținerea bolilor autoimune, imunosupresia a devenit o strategie importantă de tratament. Medicamentele imunosupresoare disponibile, cum ar fi ciclosporina A, au fost utilizate cu succes pentru tratamentul rejectării transplantului. Totuși, efectele lor toxice secundare le face inacceptabile pentru terapia cronică a bolilor autoimune.

Epuizarea întregii populații de celule T, incluzând submulțimea CD4⁺, în cazuri clinice, a fost realizată prin metode care includ drenarea canalului toracic, iradierea limfoidă totală și limfofereza, care conduc la ameliorare clinică la unii pacienți. Strategiile curente sunt, totuși, focalizate pe agenți mai selectivi, care blochează răspunsurile imune nedorite sau alte efecte secundare majore. O cale pe care se poate atinge în mod potențial acest lucru este prin îndepărtarea selectivă sau inactivarea celulelor T care mediază boala cu anticorpi monoclonali (mAb-uri). mAb-urile pentru CD4 reprezintă o astfel de strategie. Pe modelele animale de autoimunitate și transplantare, mAb-urile anti-CD4 opresc sau conduc la regresia bolii atunci când administrarea se face profilactic sau terapeutic. în plus, rezultatele inițiale, din unele testări clinice cu mAb-uri anti-CD4 pentru RA, au oferit unele dovezi preliminare ale potențialei eficacități terapeutice.

RO 120198 Β1 în esență, obiectivul terapiei mAb anti-CD4 este de a stopa activitatea autodestructivă 1 a celulelor CD4⁺, în particular în timpul fazelor acute ale afecțiunii autoimune. Ultimul scop terapeutic este de a impune o stare de lipsă de răspuns imunologic (anergie) sau o toleranță 3 pe termen lung la antigenele vătămătoare (sau țesuturile specifice) care susțin boala instalată, fără a afecta apărarea normală a gazdei împotriva infecțiilor care pot să apară. în afară 5 de RA, mAb-urile CD4 pot fi, de asemenea, benefice pentru tratamentul altor boli autoimune, de exemplu, diabelul zaharat dependent de insulină, lupusul eritematos sistemic, psoriazisul, 7 boala inflamatorie a intestinului și scleroza multiplă.

Din cauza importanței potențiale a mAb-urilor anti-CD4 în imunoterapie, numeroase 9 companii și grupuri de cercetare au raportat mAb-urile anti-CD4 ca potențiali agenți terapeutici. De exemplu, Centocor a fost prezentat ca un mAb anti-CD4 la care se face referire ca 11 fiind Centara, care este un mAb murin himeric pentru CD4. Mai mult, Johnson & Jonhson/

Ortho a raportat OKT-4a, un mAb anti-CD4 care este un mAb murin umanizat. în plus, 13 Burroughs Wellcome a raportat un mAb anti-CD4 care este un mAb umanizat de șoarece pentru CD4. De asemenea, atât Sandoz, cât și Medlmmune (în colaborare cu Merck) au dez- 15 voltat mAb-uri anti-CD4 umanizat-murin, specific pentru CD4. Mai departe, Becton Dickinson, Immunotech și Boehringer Mannheim au dezvoltat ambele mAb-uri anti-CD4. 17 în afară de mAb-urile anti-CD4, au fost descrise diverese substanțe imunomodulatoare și medicamente care posedă o aplicabilitate potențială pentru tratarea RA. Astfel de 19 substanțe imunomodulatoare și medicamente includ, de exemplu, blocanți ai adeziunii celulare, blocanți ai receptorului de citokină, imunotoxine și antagoniști ai receptorului celulelor 21 T. Exemple specifice includ gamma interferonul, anti-ICAM-1 (un mAb anti-CD4 murin care blochează adeziunea transportului de leucocite), Campath-1H (mAb anti-Cdw52 umanizat 23 de șoarece), receptorul IL-1, cA2 (un mAb himeric TNF-alfa), CDP 571 (mAb anti-TNF), antiIL-2R (mAb anti-CD25 murin-umanizat), SDZ CHH 380 (mAb anti-CD7 murin-uman), 25 DAB486 IL-2 (toxină IL-2 de fuziune, nespecifică pentru celulele CD4 și CD8), Antril (IL1 RA), anti-TCR (proteine și mAb-uri care țintesc subansamblurile de receptori ai celulelor T) 27 și XomaZyme-CD5 (conjugat anti-CD5 toxină).

De asemenea, alți imunomodulatori și imunosupresori care au activitate potențială 29 pentru tratamentul bolilor autoimune includ Rapamicină (imunosupresiv oral), Therafectin, Leflunomidă (promedicamentimunosupresor),Tenidap (modulator de citokină/CO-inhibitor), 31

IMM-125 și RS-61443 (un imunosupresor oral).

După cum s-a notat, au fost raportați numeroși anticorpi monoclonali pentru CD4, 33 care au potențiale aplicări terapeutice. în cea mai mare parte, acești anticorpi cuprind mAburi murine, mAb-uri anti-CD4 himerici sau murini umanizați. 35

Anticorpii monoclonali murinici au o potențială utilitate pentru diagnosticul bolii umane, ca și în testele clinice, ca terapeutice pentru tratamentul bolilor umane acute, cât și 37 cronice, incluzând leucemiile, limfoamele, tumorile solide (de exemplu tumori de colon, sân, hepatice), SIDA și boli autoimune. Totuși, anticorpii murini prezintă dezavantajul că adesea 39 conduc la un răspuns anticorp imun la gazda contra anticorpilor monoclonali murini.

Au fost raportați, de asemenea, anticorpi himerici de șoarece/umani. Acești anticorpi 41 cuprind caracteristicile de legare ale anticorpului parental de șoarece și funcții efectoare asociate regiunii constante umane. Vezi, de exemplu, brevetul US 4816567 al lui Cabilly și 43 colab., brevetul US 4978775 al lui Shoemaker și colab., brevetul US 4975369 al lui Beavers și colab. și brevetul US 4816397 al lui Boss și colab., toate acestea fiind încorporate aici prin 45 referință. în general, acești anticorpi himerici sunt construiți prin prepararea unei colecții de genă genomică din ADN extras din hibridoamele murine preexistente (Nishman și colab.; 47 47

Cancer Research. 999 (1987)). Apoi colecția este testată pentru gene cu regiuni variabile,

RO 120198 Β1 atât din catenele grele, cât și ușoare, care prezintă modelul corect de fragment rearanjat de anticorp. Genele cu regiuni variabile donate sunt apoi ligate într-un vector de expresie care conține casetele donate de genă umană, cu regiune constantă, cu catena grea sau ușoară adecvată. Genele himerice sunt apoi ligate într-un vector de expresie care conține casetele donate de genă umană cu regiune constantă cu catena grea sau ușoară adecvată. Genele himerice sunt apoi exprimate într-o linie celulară la alegere, de obicei o linie de mielon murin.

Totuși, în timp ce astfel de anticorpi himerici au fost utilizați în terapia umană, aceștia sunt, de asemenea, subiectul unor probleme. în mod similar anticorpilor monoclonali murinici, receptorii umani pot produce anticorpi împotriva anticorpilor himerici, pentru eficacitatea terapiei continue cu anticorp himeric.

Ca o îmbunătățire adusă anticorpilor himerici monoclonali, unii cercetători au descris metode pentru producerea anticorpilor monoclonali umani, care ar trebui să nu fie subiectul unor astfel de probleme. Vezi, de exemplu, Erlich și colab., 34 Clinical ChemistryAfâî (1988); Erlich și colab., 7Hybridoma. 385 (1988); Erlich și colab., 6 Hybridoma. 151 (1987) și Erlich și colab., 1 Human Antibody Hibridomas. 23 (1990). Aceste referințe presupun, de asemenea, că anticorpii neumani de primate, de exemplu anticorpii monoclonali de cimpanzeu, ar fi bine tolerați de oameni din cauza similarității lor structurale cu anticorpii umani. Totuși, producerea anticorpilor la oameni are constrângeri etice evidente.

Din cauză că anticorpii umani sunt neimunogenici la maimuțele Rhesus (adică nu induc un răspuns anticorp), Erlich și colab. au precizat, de asemenea, că anticorpii de primate ar trebui să fie neimunogenici la oameni. Erlich și colab. (/d) indică faptul că testarea anticorpilor la oameni nu este necesară dacă un anticorp de primată are o regiune constantă identică cu cea a imunoglobulinei umane, sau o structură care să nu fie diferită de aceea a unei imunoglobuline umane sau, cel puțin, o structură care nu este cu mult diferită de o imunoglobulină umană/față de cât diferă diverși anticorpi umani unul de celălalt. Astfel, ei sugerează că anticorpii de cimpanzeu pot fi utili pentru terapia umană.

Ca o îmbunătățire față de anticorpii himerici cunoscuți, care adesea sunt antigenici la oameni, într-o serie de cereri US înrudite: 08/476237, înregistrată la 7 iunie 1995, 08/347072, înregistrată la 25 ianuarie 1995, 07/912212, înregistrată la 10 iunie 1992, 07/856281, înregistrată la 23 martie 1992, și 07/735064, înregistrată la 25 iulie 1991, toate încorporate aici ca referință, a fost descrisă fabricarea anticorpilor monoclonali de maimuță Old World și a anticorpilor himerici derivați din aceștia, produși prin metode recombinante, care conțin domeniul variabil al anticorpilor de maimuță Old World (de exemplu babuin sau macac), fuzionat la o regiune constantă donată umană, de cimpanzeu sau a altei maimuțe, sau la o regiune cadru de la altă maimuță. Aceste cereri descriu, în particular, obținerea unor astfel de maimuțe Old World și a anticorpilor himerici derivați de la acestea împotriva antigenilor umani, ca și utilizarea unor astfel de anticorpi recombinanți himerici ca agenți imunoterapeutici pentru tratamentul bolii umane. Aceste cereri sunt bazate pe descoperirea surprinzătoare că maimuțele distanțate din punct de vedere al evoluției (de exemplu, maimuțele babuin sau macac, incluzând maimuțele cynomologus sau Rhesus), spre deosebire de cimpanzei, nu sunt numai suficient de diferite de oameni pentru a permite ca la aceste maimuțe să apară anticorpi contra antigenilor umani chiar la antigenii umani bine conservați, de exemplu CD4 și CD54, ci sunt și suficient de asemănătoare oamenilor pentru a avea anticorpi care sunt similari din punct de vedere structural anticorpilor umani, astfel încât nu se obține nici un răspuns anti-anticorp al gazdei atunci când astfel de anticorpi de maimuță, sau anticorpi himerici recombinanți derivați de la aceștia, sunt introduși la om.

RO 120198 Β1

Aceste cereri descriu că, spre deosebire de unii anticorpi precedenți, utilizați în tera- 1 pia umană, inclusiv anticorpi himerici, astfel de anticorpi himerici nu suferă de mai multe dezavantaje, de exemplu: 3

1) imunogenicitate și inducerea răspunsului anti-anticorp uman (HAA) după administrare repetată, necesară pentru a trata afecțiunile cronice; 5

2) o viață de înjumătățire relativ scurtă, comparativ cu anticorpii umani;

3) lipsa funcțiilor efectoare la celulele umane sau complementare. 7

Lipsa acestor dezavantaje reprezintă un avantaj semnificativ pentru terapia umană.

De exemplu, în cazul bolilor umane cronice, incluzând bolile autoimune sau orice boală în 9 care este necesară administrarea prelungită a unui anticorp, unul dintre obstacolele majore la terapia repetată cu anticorp este răspunsul gazdei la anticorpul terapeutic. Răspunsurile 11 HAA sunt adesea neașteptate de la un pacient la altul. De asemenea, astfel de răspunsuri sunt, în mod predominant, deși nu exclusiv, îndreptate contra regiunii constante a moleculei 13 de anticorp și, o dată ce apar, adesea ele exclud sau reduc eficacitatea terapiei la acel anticorp sau la alt anticorp de același izotip. Anticorpii himerici recombinanți descriși în cererile 15 la care s-a făcut referire mai sus vor ocoli această problemă și vor permite generarea anticorpilor cu specificitate adecvată și funcție efectoare dorită, și utilizarea lor la producerea anti- 17 corpilor recombinanți.

Acești anticorpi recombinanți includ, în general, o porțiune potrivită cu regiune varia- 19 bilă a unui anticorp derivat de la o maimuță imunizată, care este necesară pentru legarea de antigen, și regiunea constantă a unui anticorp de la un om sau cimpanzeu. Prin urmare, 21 acest lucru permite menținerea specificităților și a afinităților mari ale anticorpilor monoclonali de maimuță și a funcțiilor efectoare dorite prin selectarea adecvată a regiunii constante 23 umane sau de cimpanzeu.

Mai multe astfel de cereri înrudite exemplifică în particular un anticorp himeric 25 maimuță/om cu specificitate pentru CD4, la care se face referire ca la CE9.1, care conține domeniul variabil, cu catenă ușoară și grea, a anticorpului monoclonal anti-CD4, produs la 27 o maimuță cynomologus, și regiunea constantă lambda, cu catenă ușoară a imunoglobulinei umane, și regiunea constantă gamma 1, cu catenă grea a imunoglobulinei umane. Acest 29 anticorp posedă unele activități de depletizare a celulei T, dar care este mai scăzută în comparație cu anticorpii monoclonali precedenți. Totuși, este de dorit să se producă anticorpi 31 care posedă mai puțină activitate de depletizare a celulelor T sau care sunt lipsite de o astfel de activitate, din cauză că acest lucru ar mări considerabil potențialul lor terapeutic. 33

Aceste cereri mai descriu și sisteme preferate de vectori pentru producerea unor astfel de anticorpi himerici, în particular pentru TCAE 5.2 și TCAE 6, care cuprind 35 următoarele:

1) patru casete transcripționale, în ordine în cascadă: 37 (a) o regiune constantă cu catenă ușoară de imunoglobulină umană. în TCAE

5.2, aceasta este regiunea constantă cu catenă ușoară kappa din imunoglobulină ușoară 39 (numărarea Kabataaminoacizilor 108-214 alotipul Km 3), și în TCAE 6, regiunea constantă lambda cu catenă ușoară din imunoglobulină umană (numărătoarea Kabat a aminoacizilor 41 108-215, genotip Oz minus, Mcg minus, alotip Ke minus);

(b) o regiune constantă cu catenă grea de imunoglobulină umană; în ambele 43 constructe, catena grea de imunoglobulină umană este gamma/regiune constantă (numărătoarea Kabat a aminoacizilor 114-478 alotip Gmla, Gm 12); 45 (c) DHFR conținând propriul său promotor eucariotic și regiune de poliadenilare; 47 (d) NEO conținând, de asemenea, propriul său promotor eucariotic și regiune de poliadenilare; 49

RO 120198 Β1

2) casetele de imunoglobulină umană cu catenă grea și ușoară, conținând secvențe semnal sintetice, pentru secretarea catenelor de imunoglobulină;

3) casetele de imunoglobulină umană cu catenă grea și ușoară, conținând legături specifice pentru ADN ce permite inserarea regiunilor variabile ușoare și grele ale imunoglobulinei, care mențin citirea translațională a cadrului și nu alterează aminoacizii găsiți în mod normal în catenele de imunoglobulină.

Totuși, independent de ce s-a descris mai înainte, încă există în domeniul de specialitate necesitatea existenței unor anticorpi îmbunătățiți, care sunt specifici pentru CD4, care posedă o antigenicitate scăzută la oameni și care pot fi utilizați terapeutic, de exemplu, pentru tratamentul bolilorautoimune, cum arfi artrita reumatoidă. în particular, există necesitatea producerii anticorpilor anti-CD4, care prezintă proprietăți îmbunătățite, de exemplu o viață de înjumătățire mai îndelungată, și/sau care sunt substanțial sau total lipsiți de activitate de depletizare.

Problema pe care o rezolvă invenția este un anticorp himeric, ce se leagă specific la CD4 uman, un ADN recombinant care codifică anticorpul, un procedeu pentru producerea unui anticorp himeric specific CD4 și utilizarea acestui anticorp pentru fabricarea unui medicament pentru tratamentul sau profilaxia unei boli sau afecțiunii autoimune.

Anticorpul himeric conform invenției înlătură dezavantajele de mai sus prin aceea că acesta cuprinde secvențele de aminoacizi ale catenei grea și ușoară dintr-un anticorp monoclonal de maimuță Old World, produs împotriva CD4 uman, o secvență a domeniul constant a catenei ușoare umane și o secvență a domeniului constant a catene grele umane, selectate din grupul alcătuit din:

1) domenii constante ale izotipului gamma 4 uman nemodificat;

2) domenii constante ale izotipului gamma 4 care au fost modificate prin mutageneză, pentru a dobândi stabilitate crescută, profil farmacocinetic schimbat, activitate redusă de legare a receptorului Fc, capacitate redusă de fixare a complementului și/sau activitate redusă de depleție a celulor T in vivo^-,

3) domeniu constant al izotipului gamma 4 cu mutații în poziția 236, prin substituirea leucinei cu acidul glutamic și/sau în poziția 229, prin substituirea serinei cu prolina.

ADN-ul recombinant conform invenției înlătură dezavantajele de mai sus prin aceea că acesta codifică și susține expresia unui anticorp himeric conform revendicărilor de la 1 la 5.

Procedeul pentru producerea unui anticorp himeric specific CD4, conform invenției, înlătură dezavantajele de mai sus prin aceea acesta cuprinde exprimarea secvenței de ADN recombinantului, conform revendicării 6, într-o celulă gazdă recombinantă.

Utilizarea unui anticorp himeric specific CD4, conform invenției, cuprinde fabricarea unui medicament pentru tratamentul sau profilaxia unei boli sau a unei afecțiuni inflamatorii cronice sau autoimune.

în acest scop, un obiect al prezentei invenții este de a oferi noi anticorpi monoclonali și himerici specifici pentru CD4, care au proprietăți îmbunătățite, de exemplu o viață de înjumătățire mai îndelungată, imunogenicitate mai scăzută la oameni și/sau activitate de depletizare a celulelor redusă sau absentă. Mai specific, un obiect al invenției este de a produce anticorpi himerici anti-CD4, care conțin porțiunea de recunoaștere a antigenului unei imunoglobuline de maimuță Old World specifice pentru CD4 și secvențe cu domeniu constant de om sau maimuță, în particular regiune constantă cu catenă ușoară kappa sau lambda umană și secvențe cu regiune constantă cu catenă grea de la om, gamma 1 sau gamma 4 uman sau gamma 4 mutant, cu funcții efectoare alterate și stabilitate îmbunătățită față de izotipul gamma 4.

RO 120198 Β1

Un obiect mai specific al prezentei invenții este de a oferi noi anticorpi monoclonali 1 și himerici, care conțin secvența ușoară variabilă anti-CD4 de maimuță, arătată în fig. 1, și secvența ușoară variabilă anti-CD4, arătată în fig. 2, fuzionate la secvențele cu domeniu con- 3 stant de maimuță sau umane, preferabil secvență cu domeniu constant, cu catenă ușoară kappa sau lambda umană, și secvență cu domeniu constant cu catenă grea de la om, 5 gamma 1 sau gamma 4 uman, sau o catenă grea gamma 4, cu mutație cu funcții efectoare (alterate) și stabilitate îmbunătățită față de izotipul gamma 4. 7

Un alt obiectiv al prezentei invenții este de a oferi secvențe ADN, care asigură expresia unor astfel de anticorpi anti-CD4 himerici și vectori îmbunătățiți, și celule gazdă, care pot 9 fi utilizate pentru exprimarea unor astfel de anticorpi himerici anti-CD4. Preferabil, astfel de vectori vor cuprinde vectorii de expresie la care se face referire în cererile care sunt încor- 11 porate aici prin referință, și celule gazdă vor fi, de preferință, celule CHO.

Un alt obiectiv al prezentei invenții este de a oferi compoziții farmaceutice pentru utili- 13 zare pentru tratamentul sau profilaxia bolilor legate de CD4, în particulara bolilor autoimune, care conțin o cantitate eficientă din punct de vedere profilactic sau terapeutic, din prezenții 15 anticorpi himerici anti-CD4 îmbunătățiți, în combinație cu un purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic. 17

Un alt obiectiv al prezentei invenții este de a oferi metode pentru tratarea sau profilaxia afecțiunilor legate de CD4, în particular a bolii autoimune sau a altor afecțiuni în care 19 este de dorit imunosupresia, prin administrarea unei cantități eficiente din punct de vedere profilactic sau terapeutic, din prezenții anticorpi himerici anti-CD4 îmbunătățiți, în combinație 21 cu un purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic.

Prezenta invenție se referă la noi anticorpi monoclonali himerici, specifici pentru CD4, 23 care conțin porțiunea de legare antigenică, cu regiune variabilă, a unui anticorp monoclonal anti-CD4 de maimuță Old World, fuzionat la secvențele dorite cu domeniu constant de mai- 25 muță sau om, preferabil domenii constante cu catenă grea gamma 1, gamma 4 sau gamma 4 cu mutații umane, sau secvențe umane cu domeniu constant kappa sau lambda cu catenă 27 ușoară. Acești anticorpi exercită proprietăți îmbunătățite față de anticorpii monoclonali antiCD4 convenționali, de exemplu, afinitate mare pentru CD4 uman, și au o imunogenicitate 29 mică sau absentă la oameni. Versiunile gamma 4 prezintă funcție efectoare redusă sau absentă, de exemplu, activitate de receptor Fc sau fixare la complement și activitate redusă 31 sau absentă de depleție a celulelor T.

Metode pentru obținerea anticorpilor monoclonali de maimuță Old World specifici 33 pentru CD4, și a clonelor care produc anticorpi monoclonali de maimuță Old World specifici pentru CD4, pot fi găsite în cererile de brevet specificate mai înainte, care sunt încorporate 35 aici ca referință.

în general, acestea cuprind imunizarea unei maimuțe Old World contra antigenului 37 uman GD4 în astfel de condiții, încât maimuța Old World să producă anticorpi anti-CD4, și imortalizarea celulelor de maimuță care sunt responsabile de producerea anticorpilor anti- 39 CD4, de exemplu, prin fuziune de hibridom, transformare virală cu Herpes papio, donarea celulei-B unice (denumită, de asemenea, imortalizare tranzitivă) și producerea colecției de 41 imunoglobuline recombinante. în variante preferate, această metodă include selectarea unei celule-B de la maimuță, dintr-o leucocită din sânge periferic, splină, măduvă osoasă sau 43 nodul limfatic, selectarea unui miez care produce anticorpul potrivit, separarea genelor de imunoglobulină care codifică acel anticorp din linia de celule imortalizate și exprimarea gene- 45 lor într-o linie celulară producătoare (adică o linie celulară care permite o producere suficientă de anticorp pentru a fi util pentru terapia umană). Așa cum este definit în cererile la 47 care s-a făcut referire mai înainte, maimuțele Old World includ maimuțe babuin și macac (incluzând maimuța Rhesus și maimuța cynomologus). 49

RO 120198 Β1

Așa cum s-a discutat mai sus, într-o variantă preferată, anticorpii himerici prezenți vor cuprinde secvențele variabile grele și ușoare de maimuță Old World, anti-CD4, din fig. 1 și 2, fuzionate la secvențele umane cu domeniu constant. Mijloace adecvate pentru obținerea acestor secvențe specifice cu domeniu variabil greu și cu domeniu variabil ușor sunt descrise în detaliu în cererile US 08/476.237, înregistrată la 7 iunie 1995, 08/347.072, înregistrată la 25 ianuarie 1995, 07/912.212, înregistrată la 10 iunie 1992, toate încorporate aici prin referință în totalitatea lor. Aceste cereri mai descriu și întregile secvențe de acid nucleic și de aminoacid ale acestor secvențe.

Aceste secvențe variabile grele și de domeniu pot fi fuzionate la orice secvențe umane cu domeniu constant. Alegerea particulară va afecta funcția efectoare a anticorpului anti-CD4 himeric ce rezultă. Preferabil, domeniul constant cu catenă grea uman va cuprinde domeniu constant uman cu catenă grea gamma 1, gamma 4, sau un domeniu constant mutat gamma 4, la care se face referire aici ca fiind gamma 4PE. Selectarea lui gamma 4 este avantajoasă din cauză că a fost descoperit că aceasta conduce la anticorpi himerici cărora le lipsește substanțial sau în întregime activitatea de depleție a celulei T (80...100% față de gamma 1). Se crede acest lucru din cauză că domeniul constant gamma 4 nu este capabil să se lege la complement. Domeniul constant poate fi, de asemenea, mutat pentru a îmbunătăți proprietățile anticorpului himeric rezultat, de exemplu stabilitatea, și/sau a elimina activitatea de depletizare. în particular, modificările P și E ale domeniului gamma 4 care se descriu mai jos sunt modificări ale gamma 4 în regiunea de legare, ce conferă stabilitate mărită a activității și elimină activitatea de depleție. Mai mult, se așteaptă ca alte modificări să ducă, de asemenea, la obținerea de anticorpi himerici care au proprietăți îmbunătățite.

Domeniul constant cu catenă ușoară uman, conținut în anticorpii himerici anti-CD4 de față, va fi, de preferință, regiune constantă cu catenă ușoară kappa sau lambda umană, mai ales regiune constantă cu catenă ușoară lambda umană. Secvențele de aminoacid și ADN are codifică domeniile constante gamma 1, gamma 4, kappa și lambda umane sunt cunoscute în domeniul de specialitate. De asemenea, secvențele de aminoacid și acid nucleic pentru secvențele umane gamma 4 și mutanții E și PE și domeniul constant lambda pot fi găsite în fig. 4...6 și, respectiv, în fig. 3.

Variantele exemplificate ale invenției includ un anticorp monoclonal anti-CD4 himeric specific, la care se face referire ca fiind CE9.1, care cuprinde domenii de legare a antigenului, obținute de la macac cynomologus imunizați cu S-CD4 uman (arătat în fig. 1 și 2), în combinație cu domeniile constante de IgGI uman, și anticorpii himerici monoclonali derivați de la acestea, de exemplu CE9 gamma 4, CE9 gamma 4A kappa și CE9 gamma 4E, CE9 gamma 4PE, care au aceleași domenii de legare a antigenului ca și ale CE9.1, dar au fost modificate genetic cu un cadru de domeniu de legare lgG4 Fc uman. Anticorpul monoclonal CE9 gamma 4E conține o mutație cu leucină a acidului glutamic (L236E) în apropierea regiunii de îmbinare a anticorpului (modificarea E). Anticorpul monoclonal CE9 gamma 4PE conține aceeași mutație a leucinei cu acidul glutamic, plus o mutație a serinei cu prolina S229P (modificare E și P). Anticorpul CE9 gamma 4 kappaA diferă de CE9 gamma 4 printr-o înlocuire a regiunii sale constante cu catenă ușoară de la kappa uman la subtipul lambda uman.

Aceste schimbări și mutații ale domeniului constant sunt făcute din cauză că este cunoscut că răspunsul biologic al anticorpilor IgG depinde de compoziția domeniilor lor carboxiterminale, adică de izotipul lor. Astfel, prin alterarea izotipului anticorpului prin modificarea proteinei, este foarte posibil să se modifice răspunsul biologic al anticopului IgG și, mai specific, anticorpii monoclonali anti-CD4 himerici despre care este vorba.

RO 120198 Β1

Rezultatul dorit al acestei tehnici de inginerie genetică este că schimbarea izotipului 1 porțiunii Fc nu va diminua afinitatea de legare a regiunilor Fab de legare a antigenului CD4.

Totuși, acest lucru nu era cunoscut la început. Era posibil ca schimbarea regiunii constante 3 sau modificarea acesteia să fi afectat negativ legarea CD4. Prin urmare, anticorpii rezultați au fost testați pentru a determina efectele sau modificările proprietăților de anticorp, în parti- 5 cular, legarea la antigen CD4. Pentru a măsura efectele posibile ale schimbării domeniului constant asupra legării antigenului, se utilizează metode de testare cunoscute. în particular, 7 s-a făcut un studiu cu privire la interacția între OD4 și CE9.1, CE9 gamma 4, CE9 gamma 4A kappa și CE9 gamma 4E, și CE9 gamma 4PE, prin analiza Scatchard și rezonanța plas- 9 monică de suprafață (SPR). Rezultatele acestor teste demonstrează că legarea CD4 la fiecare dintre anticorpii testați este echivalentă. Constantele de echilibru la disociere la 25’C, 11 pentru legarea CD4 la anticorpi, au fost găsite, toate, prin SPR, a fi aproximativ 1,0 nanomolar. Măsurătorile demonstrează suplimentar că: 13

1) legarea CD4 la anticorpi are loc printr-un model de legare la două situsuri independente și indentice; 15

2) proprietățile funcționale de legare ale domeniului de legare a antigenului sunt independente de modificările structurale aduse porțiunii Fc a anticorpului incluzând izotipurile 17 gamma 1, gamma 4 sau gamma 4 mutat. Prin urmare, prezenta invenție aduce o evidență că schimbarea izotipurilor între IgGI și lgG4 poate fi o tehnică utilă pentru modificarea gene- 19 tică a anticorpilor, fără pierderea afinității de legare a antigenului și, mai specific, de obținere a anticorpilor pentru CD4. 21

De asemenea, așa cum se descrie mai jos, s-a descoperit că înlocuirea domeniului constant al gamma 1 cu gamma 4 reduce substanțial legarea la receptorul Fc, fixarea corn- 23 plementară și activitatea de depleție a celulei T și, mai mult, că modificările E și, respectiv,

P, elimină legarea la receptorul Fc și activitatea de depleție a celulei T și asigură o stabilitate 25 mărită a anticorpului. Prin urmare, este rezonabil să se presupună că și alți anticorpi himerici produși conform invenției (modificați genetic pentru a conține domeniul constant uman 27 gamma 4 sau forme mutate ale acestuia) pot fi selectați cu funcție efectoare Fc alterată, anticorpi care, substanțial sau în totalitate, sunt lipsiți de activitate de depleție a celulei T și/sau 29 prezintă stabilitate mărită. Metode pentru testarea activității de depleție a celulei T, a funcției efectoare Fc și a stabilității anticorpului, sunt cunoscute în domeniul de specialitate. 31

Prin urmare, prezenta invenție oferă anticorpi recombinanți specifici, care sunt anticorpi monoclonali himerici de primat/om și care sunt direcționați împotriva antigenului uman 33 CD4 care prezintă proprietăți îmbunătățite, de exemplu, activitate scăzută de depleție a celulei T și stabilitate mai mare. Date fiind aceste proprietăți, acești anticorpi recombinanți au o 35 utilitate particulară ca imunomodulatori și sunt utili în special pentru tratamentul bolilor autoimune, cum ar fi artrita reumatoidă, psoriazisul, lupusul eritematos sistemic (SLE), ca și 37 pentru indicații neautoimune, cum ar fi boala de respingere a grefei de către gazdă la transplant (GVHD), astm sau HIV. De asemenea, anticorpii de față posedă utilitate ca auxiliari în 39 terapia genetică. în particular, prezenții anticorpi pot fi administrați înainte de, împreună cu sau după administrarea unui vector (conținând un ADN terapeutic), pentru a preveni sau 41 reduce răspunsul umoral al gazdei la respectivul vector. Aceste boli sunt exemplificări ale afecțiunilor legate de CD4. 43

Așa cum s-a descris mai în detaliu în exemple, anticorpul recombinant CE9.1 este generat prin grefarea domeniilor Ev variabile de legare a antigenului de la macacul 45 cynomologus la regiunile constante umane, de exemplu, domeniul constant IgGI. Mai în particular, anticorpul CE9.1 conține un domeniu gamma 1 și domeniul constant lambda 47 umane, CE9 gamma 4, CE9 gamma 4A kappa și CE9 gamma 4E, și CE9 gamma 4PE

RO 120198 Β1 conțin domeniul constant gamma 4 sau o formă mutată a acestuia și regiunea constantă fie lambda, fie kappa. Secvențele de anticorp recombinant rezultate sunt distinctive față de secvențele de imunoglobulină umană. Ca rezultat, acești anticorpi, ca și ceilalți anticorpi pentru CD4, produși prin metode similare, după administrarea in vivo la oameni, ar trebui să prezinte imunogenicitate redusă sau absentă și evacuare mai înceată din ser, comparativ cu anticorpii murini monoclonali sau himerici de șoarece-om, îndreptați către CD4.

Anticorpul CE9.1 se leagă la domeniul 1 la oameni, dar nu și la macac, la CD4, o regiune care este implicată în interacția cu Clasa II MHC de molecule pe celulele care prezintă antigen. De asemenea, testele au demonstrat că alți aticorpi exemplificați cuprind aceleași proprietăți de legare a antigenului ca și CE9.1

Activitate imunomodulatorie potențială a fost observată la anticorpii CE9.1 atât in vitro cât și in vivo. Date fiind aceste proprietăți, adică imunogenicitate redusă, eliminare mai înceată din ser și imunomodulare potențială, în comparație cu alte mAb-uri CD4 anti-umane cunoscute, care sunt derivate de la murine sau rozătoare, acest anticorp, ca și alți anticorpi descriși aici, ar trebui să fie adecvați pentru terapia pe termen lung a bolilor în care este dorită imunosupresia, de exemplu afecțiuni autoimune și boli inflamatorii cronice, cum ar fi artrita reumatoidă. Totuși, este de așteptat ca acești anticorpi să fie utili pentru tratamentul multor alte afecțiuni, incluzând cu titlu, de exemplu, tiroidita lui Hashimoto, mixoedemul primar, boala tirotoxicoză/Graves, anemia pernicioasă, gastrita atrofică autoimună, cardita autoimună, boala lui Addison, menopauza prematură, diabetul zaharat de tip I, sindromul Good al pășunatului, miastenia gravis, scleroza multiplă, infertilitatea masculină, urticaria vulgară, pempfigoidul, oftalmia simpatică, uveita facogenică, anemia hemolitică autoimună, purpura trombocitopenică idiopatică, leucopenia idiopatică, ciroza biliară primară, hepatita cronică activă (Hbs Ag negativă), ciroza criptogenică, sindromul inflamator al intestinului, sindromul lui Sjogren, psoriazisul, artrita reumatoidă, dermatomiozita, sclerodermia, boala conjunctivă de țesut mixt, lupusul eritematos discoid, vasculita sistemică și lupusul eritematos sistemic (SLE).

Așa cum s-a discutat mai sus, artrita reumatoidă (RA) este o boală inflamatorie a sinoviumului, care cuprinde o manifestare a unui fenomen autoimun, care conduce la eroziunea, diformitatea și distrugerea încheieturilor. După cum este în cazul celor mai multe boli autoimune, etiologia RA nu este bine definită, dar este caracterizată prin niveluri ridicate de limfocite-T CD4⁺ activate în încheieturile afectate. în mod curent, pentru RA nu există vindecare și terapia pentru această boală debilitantă este destinată numai pentru a ușura simptomele sau a îmbunătăți capacitățile funcționale pe termen scurt. Mai mult, imunosupresorii și steroizii de rang doi și trei, cum ar fi azatioprina, metotrexatul și prednisolonul, care se dau la boala instalată, sunt administrați numai în cazurile mai grave și, în mod uzual, au numai un efect blând sau prezintă o toxicitate inacceptabilă atunci când se utilizează în terapia cronică. Din contră, este de așteptat ca anticorpii de față să fie potriviți pentru administrarea prelungită și cronică, dat fiind faptul că aceștia prezintă o imunogenicitate scăzută, o viață de înjumătățire mai lungă și activitate imunomodulatoare potențială comparativ cu alte mAb-uri CD4 anti-umane, care sunt derivate de la murine sau rozătoare.

în esență, anticorpii monoclonali anti-CD4 recombinanți descriși exemplificați în această cerere, sau alți anticorpi produși conform prezentei invenții și descriși în cererile la care s-a făcut referire mai sus (încorporate ca referință), vor media, în mod probabil, activitatea terapeutică, prin oprirea sau alterarea activității destructive a celulelor CD4⁺, în particular, în timpul fazelor acute ale afecțiunilor autoimune, cum ar fi artrita reumatoidă. Astfel, administrarea anticorpilor conform invenției va conduce la o stare de lipsă de răspuns imunologic (anergie) sau la toleranță pe termen lung la antigenii care afectează (sau țesuturile

RO 120198 Β1 specifice) care susțin boala acută, fără a compromite apărarea normală a gazdei împotriva 1 infecțiilor care pot să apară. în afară de RA, anticorpii monoclonali CD4 ar trebui să fie benefici pentru tratamentul bolilor identificate mai sus și să ofere aplicări particulare pentru trata- 3 mentul diabetelor zaharate dependente de insulina, a lupusului eritematos sistemic, cirozei, bolii inflamatorii a intestinului, sclerozei multiple, ca și a altor boli autoimune, cum ar fi leuce- 5 mia, limfomul, boala de respingere a grefei de către gazdă la transplant, astmul și HIV.

Anticorpii monoclonali anti-CD4 recombinanți, produși conform invenției, ar trebui să 7 medieze efectul terapeutic in vivo prin unul sau mai multe dintre următoarele mecanisme:

i) blocarea interacției CD4 cu moleculele MHC Clasa 2; 9 ii) scăderea modulării suprafeței celulei CD4;

iii) cauzarea anergiei și/sau apoptozei; 11 iv) depleția celulelor CD4;

v) inducerea toleranței la autoantigeni. 13

Deși depleția tranzitivă a celulelor CD4⁺ conduce la imunosupresie și, poate, la normalizarea unui sistem imun, altfel hiperactiv, principalul mecanism prin care anticorpii 15 anti-CD4 își exercită efectul lor in vivo nu este dependent, în mod necesar, de depleția celulelor T. Mai degrabă, se crede că legarea anticorpului la molecula CD4 previne ajutarea acti- 17 vării celulei T, prin legarea antigenilor la receptorul celulei T, conducând la anergie sau toleranță specifică la antigen a celulei T. De exemplu, anticorpul CE9.1, care cuprinde un dome- 19 niu gamma 1 uman, prezintă o substanțială activitate de imunosupresie. Totuși, acesta depletizează numai parțial celulele CD4 la cimpanzei. Mai mult, rezultatele la oameni indică 21 cum acest anticorp conduce la o depleție substanțial mai mică a celulei comparativ cu alți anticorpi monoclonali, care acum se află în teste clinice. 23

De asemenea, la modelele experimentale in vivo a fost indusă toleranța specifică alogrefei cu anticorpi anti-CD4, care nu depletizează la momentul transplantului. Menținerea 25 stării de toleranță nu necesită un anticorp anti-CD4 depletizant, dar apare, totuși, ca fiind dependentă de prezența continuă a antigenului. Bazat pe aceste descoperiri, este de aștep- 27 tat ca prezenții anticorpi recombinanți sau alți anticorpi anti-CD4 recombinanți, produși conform invenției, să fie potriviți pentru tratamentul bolii autoimune. Scheme scurte de tratament 29 cu anticorpi anti-CD4 vor interfera cu răspunsul celulelor T ajutătoare contra autoantigenilor, conducând la îmbunătățiri clinice de durată în absența imunosupresiei generalizate. 31

Bazat pe informația conținută în cererea de față și utilizând metode cunoscute, un specialist în domeniu poate stabili cu ușurință un regim sigur, tolerabil și eficient cu anticorpii 33 anti-CD4 recombinanți exemplificați descriși aici, ca și cu alți anticorpi produși substanțial, conform invenției. 35

Așa cum s-a notat, CE9.1 este un anticorp monoclonal anti-CD4, anticorp himeric de macac-uman al unei molecule lgG1, exprimată în celulele de ovar al hamsterului chinez 37 (CHO), care prezintă o omologie de 91...92% cu regiunile de cadru ale imunoglobulinei umane. Prin urmare, această moleculă ar trebui să prezinte un răspuns imunogenic redus 39 sau absent la oameni și ar trebui să prezinte un timp de înjumătățire serică mai îndelungat comparativ cu anticorpii monoclonali murini sau himerici șoarece-om. De asemenea, anticor- 41 pul prezintă reactivitate încrucișată limitată în țesuturile umane. De exemplu, la testare nu s-a observat nici o evidență a legării acestui anticorp la țesuturile nelimfoide. Așa cum era 43 de așteptat, anticorpul se leagă la unele, dar nu la toate celulele limfoide din sângele periferic și din alte organe. De asemenea, s-a găsit că acest anticorp reacționează cu celulele 45 T CD4⁺ de cimpanzeu, dar nu reacționează cu celulele T CD4⁺ de macac rhesus, cynomologus sau cu coadă de porc, babuini, șobolani, șoareci sau iepuri. Prin urmare, bazat 47 pe această reactivitate, cimpanzeii sunt o specie relevantă pentru a confirma efectele farmacologice in vivo ale acestui anticorp, adică capacitatea sa de a funcționa ca un imunosu- 49 presor eficient.

RO 120198 Β1

Anticorpul CE9.1 prezintă activitate reversibilă de depleție a celulei T la cimpanzei. Mai mult, este probabil să fie îmbunătățită pentru anticorpii monoclonali anti-CD4 murini și murini/himerici în virtutea timpului său de înjumătățire, care este de așteptat să fie mai îndelungat, în serul uman, și a efectelor sale imunogenice adverse, potențial reduse. De asemenea, dată fiind prezența secvențelor cu domeniu constant umane, este de așteptat ca prezenții anticorpi, după administrarea la oameni, să mențină funcțiile efectoare normale ale anticorpilor umani. în fapt, funcțiile efectoare ale anticorpului CE9.1, ca și ale celorlalți anticorpi la care s-a făcut referire, au fost evaluate în mai multe teste diferite. S-a descoperit că anticorpul CE9.1 prezintă activitate inhibitorie în reacție cu limfocite amestecate (MLR), că prezintă legare Clq slabă, dar nu prezintă citotoxi citate celulară mediată de complement. De asemenea, s-a descoperit că acesta prezintă activitate citotoxică celulară pentru complement dependent de anticorp (ADDC) și că leagă FcR. Totodată, anticorpul CE9.1 a fost evaluat in vivo la cimpanzei, la care s-a descoperit că administrarea conduce la depleția parțială a celulelor CD4 și la modularea receptorului CD4.

Anticorpul CE9.1 a fost administrat cimpanzeilor în diverse doze. Mai specific, au fost studiate efectele dozelor de 0,1, 0,3, 1,5 și 10 mg/kg la cimpanzei, dozate la intervale de

7...14 zile. Nu s-a observat evidență clinică a toxicității. Dozele de 1 mg/kg sau mai mult au provocat o reducere de 80-95% a celulelor CD4⁺ în circulație la 24 h după dozare. Nu s-a observat o depresie semnificativă a celulelor CD4⁺ la șapte zile după o doză de 1 mg/kg. După o doză de 5 mg/kg, numărătoarea celulelor CD4⁺ a reajuns Ia aproximativ 40% din linia de bază după șapte zile, și la aproximativ 60% din linia de bază după paisprezece zile. După o doză de 10 mg/kg, numărătoarea celulelor CD4⁺ în circulație nu a reapărut la șapte zile după tratament și s-a recuperat numai cu 40% din linia de bază la patruzeci și două de zile după dozare. Nu s-au observat schimbări ale altor parametri clinici patologici.

Anticorpul CE9.1 a fost testat, de asemenea, la oameni. De exemplu, activitatea anticorpului CE9.1 a fost evaluată, de asemenea, în teste în care se dă o singură doză în faza 1 la pacienții cu artrită reumatoidă. Aceste rezultate au fost foarte promițătoare. în mod specific, circa o jumătate din pacienții cărora li s-a administrat au prezentat cel puțin o îmbunătățire de 30% a rezultatelor privind încheieturile suferinde, cu profilul evenimentelor adverse extrem de benign. Mai mult, așa cum s-a discutat mai sus, în timp ce, inițial, s-a presupus că CE9.1 ar fi depletizant, în fapt acest anticorp a arătat numai parțial și tranzitiv depletizare, după o unică administrare. Natura parțial nedepletizantă a acestui anticorp poate fi benefică deoarece, la un număr de animale studiate, s-a raportat că depletizarea celulelor T CD4⁺, aparent, nu este necesară pentru eficacitatea anticorpilor monoclonali CD4. (Vezi Carteron și colab., Induction of Immune Tolerance During Adminstration of Monoclonal Antibody to L3 T4 Des not Dependent on L3 T4⁺ Cells, Underlying Journal of Immunology, 140: 713-716 (1988); Carteron și colab. F(ab)2 Anti-CD4 și Intact Anti-CD4 Monoclonal Antibodies Inhibit the Accumulation of CD4⁺T Cells, CD8⁺T cells and BT I Cells in the Kidneys ofLupus-Prone NZB/NZWMice, Clinical Immunology Immunopathology 56:373-383 (1990).) Astfel, acest anticorp poate funcționa ca un antagonist clasic al receptorului, prin:

i) blocarea interacțiunii CD4 cu contra receptorul său MHCII; sau ii) provocând modularea CD4 din celulele de suprafață.

în aceste condiții, răspunsurile celulei T CD4⁺ care cer participarea receptorului CD4 vorfi atenuate sau blocate. Faptul că prezenții anticorpi CE9.1 prezintă, aparent, o mică activitate de depleție la oameni, este avantajos, deoarece poate îmbunătăți siguranța, poate preveni necesitatea unei monitorizări frecvente a numărului de celule CD4⁺ și poate, de asemenea, mări eficacitatea.

RO 120198 Β1

Anticorpul CE9.1 a fost proiectat pentru a reduce numărul celulelor CD4 in vivo prin 1 mecanisme de legare la receptorul Fc și la complement. Studii pe cimpanzei indică faptul că CE9.1 provoacă depletizarea parțială a celulelor CD4 și rezultatele inițiale indică faptul că 3 depleția celulelor la oameni este mult redusă comparativ cu alte mAb-uri CD4 cunoscute.

Totuși, de asemenea, este de dorit să se producă anticorpi care sunt lipsiți de activitate de 5 depletizare.

Utilitatea mAb-urilor CD4 nedepletizante trebuie îmbunătățită din următoarele 7 cauze:

i) depleția celulelor CD4 nu este necesară pentru eficacitatea mAb-urilor CD4; 9 ii) absența depleției celulei CD4 ar trebui să mărească siguranța lor;

iii) siguranța superioară permite utilizarea mAb-urilor mai devreme în procesul bolii; 11 iv) absența depleției celulei CD4 ar trebui să îmbunătățească eficacitatea; și

v) absența depleției celulei CD4 va preîntâmpina sau reduce necesitatea monitorizării 13 frecvente a numărului de celule CD4, mărind astfel conveniența și îmbunătățind costul global al tratamentului. 15

Acest lucru este susținut de faptul că la un număr de modele animale s-a arătat că depleția celulei T CD4⁺ nu este cerută pentru eficacitatea mAb-urilor CD4. Astfel, un mAb 17 CD4 nedepletizant va funcționa ca un agonist clasic de receptor prin:

i) blocarea interacțiunii CD4 cu contrareceptorul său MKCII; 19 ii) provocarea modulării CD4 din celulele de suprafață; sau iii) provocarea anergiei și/sau a apoptozei celulei T. 21

Prin aceasta, răspunsul celulei T CD4⁺ care necesită participarea receptorului OD4 va fi alterat sau blocat. 23 în general, răspunsurile celulei T, care sunt conduse de antigeni puternici sau cu afinitate mare, apara fi independente de funcțiile co-receptorului-CD4 și, astfel, nu vorfi blocați 25 în mod eficienți de mAb-urile CD4. Din contră, răspunsurile celulei T la antigeni slabi (cum ar fi autoantigenii) necesită funcția coreceptor CD4 și, prin urmare, vor fi inhibate de mAb 27 CD4. în mod normal, celulele T puternic autoreactive (celule T cu mare afinitate TCR la autoantigeni) sunt îndepărtate din țesut prin depleție donată și, prin urmare, nu apar niciodată 29 la periferie. Din contră, celulele T care conduc răspunsul autoimun se crede că sunt celule slab autoreactive, care au ieșit din mecanismul normal al toleranței periferice. Astfel de celule 31 depind de participarea co-receptorilor, cum ar fi CD4, pentru elaborarea deplină a răspunsului. Prin urmare, blocarea co-receptorilor va priva aceste celule T de funcțiile co-semna- 33 lante cruciale, ceea ce va conduce la activare parțială sau anergie. De asemenea, așa cum s-a notat mai sus, este de dorit să se producă anticorpi himerici specifici pentru CD4, care 35 să aibă o stabilitate (o viață de înjumătățire in vivo) mai mare.

în acest scop, au fost sintetizați diverși anticorpi himerici, care conțin domeniul con- 37 stant uman gamma 4. Acest domeniu a fost selectat din cauză că, aparent, nu leagă complementul uman sau receptorii FC gamma 1. Prin urmare, s-a presupus că anticorpii himerici 39 care conțin acest domeniu constant vorfi lipsiți, substanțial sau total, de activitate de depleție a celulei T. De asemenea, au fost confecționați mai mulți anticorpi himerici, care conțineau 41 modificări cunoscute ale domeniului constant gamma 4. în particular, mai mulți conțin modificarea E care este descrisă de Duncan și colab., Nature. 332: 563-564 (1988) și Winter și 43 colab., WO 88/07089 (1988), modificare care a fost descrisă ca reducând legarea la complement și la receptorul FC gamma 1. Această modificare cuprinde schimbarea leucinei cu acid 45 glutamic la poziția 236 (248, prin numărătoarea Kabat), pentru a abate orice legare reziduală la receptorul Fc. De asemenea, mai mulți anticorpi himerici conțin modificarea p care este 47

RO 120198 Β1 descrisă de Angal și colab., Mol. Immunol., 30 : 105-8 (1993). Această modificare, ce cuprinde schimbarea unei serine la poziția 229 (241, prin numărătoarea Kabat) cu o pralină, mărește stabilitatea (timp de înjumătățire seric) prin stabilizarea legăturilor disulfurice dintre catenele grele, și s-a raportat că mărește distribuția îmbunătățită a țesutului față de lgG4 himeric ce este lipsit de modificare.

Mai specific, rațiunea pentru apariția CE9 gamma 4 a fost de a abroga fixarea de complement și a descrește activitățile de legare FcR. Acest anticorp diferă de CE9.1 prin aceea că acesta conține domeniul constant uman gamma 4 (nu gamma 1). Totuși, deși acest lucru a fost dorit, rezultatul nu a fost de rutină sau predictibil. întradevăr, acum s-a descoperit că anticorpii himerici care conțin gamma 9 nemodificat au aceeași legare la receptorul Fc ca și anticorpul gamma 2. Prin contrast, rațiunea pentru a obține CE9 gamma 4A kappa este de a mări productivitatea constructului gamma 4. Acest anticorp diferă de CE9.1 prin aceea că acesta conține catena ușoară umană kappa mai degrabă decât lambda. Determinarea CE9 gamma 4 in vitro printr-un test de legare la receptorul Fc care măsoară legarea anticorpului monocite și la linii celulare stimulate monocitice a arătat că CE9 gamma 4 mai posedă încă o ativitate semnificativă de legare la receptorul Fc. Mai mult, în acest sistem de testare, legarea CE9 gamma 4 nu este distinctivă de CE9.1 (gamma 1). Astfel, rațiunea pentru fabricarea CE9 gamma E este de a abroga complet orice legare reziduală de FcR față de anticorpii himerici care conțin gamma 4 nemodificat. CE9 gamma E conține domeniul constant gamma 4 modificat la un situs (modificare E). în final, rațiunea pentru fabricarea CE9 gamma 4PE nemodificați este de a mări stabilitatea în comparație cu anticorpii himerici care conțin gamma 4 nemodificați sau o mutație la un situs (modificare E). Acest anticorp conține domeniul constant gamma 4 modificat la două situsuri (modificare P și E).

Așa cum s-a discutat, domeniul constant gamma 4 uman a fost selectat pentru abrogarea funcțiilor efectoare, adică reactivitate pentru receptorii Fc gamma sau Clq umani și absența depleției celulelor CD4⁺ in vivo. Acești patru cADNi dați au fost selectați și exprimați în celule CHO.

Doi dintre acești anticorpi monocionaii candidați sunt selectați pentru un studiu mai aprofundat, adică CE9 gamma 4E și CE9 gamma 4PE. Așa cum s-a notat, ambii conțin o substituire cu acid glutamicîn regiunea CH2, pentru a elimina legarea reziduală la FcR, asociată regiunii constante gamma 4. în plus, CE9 gamma 4PE conține o substituire a pralinei în regiunea de legare, intenționată pentru a mări stabilitatea interacției legăturii disulfurice a catenei grele.

Acești anticopi au fost găsiți a fi distinctivi în ce privește afinitatea lor pentru CD4, greutatea moleculară, stabilitatea la denaturarea la căldură, suprimarea MLR, absența legării la FcR și lipsa activității în ADCC și CDC. Astfel, ambii acești anticorpi satisfac criteriile in vitro pentru o afinitate mare pentru mAb CD4, fără funcții efectoare pentru FcR și complement.

Proprietățile CE9.1 și CE9 gamma 4PE sunt comparate în tabelul 1. Legarea redusă la receptorul Fc se intenționează să se refere la anticorpii himerici care se leagă la receptorul Fc cu mai puțin de un gamma 1 care conține anticorpi himerici, preferabil cel puțin 30 la 80% redus în comparație cu acesta și, mai ales, cel puțin 50 la 80% redus și, în special, total abrogat. Totuși, așa cum s-a pus în evidență prin rezultatele cu anticorp himeric gamma 4, rezultatul dorit nu a fost de natură predictibilă.

RO 120198 Β1

Tabelul 1 1

Compararea funcțiilor efectoare ale CE9.1 și CE9 gamma 4P

Activitate	CE9.1	CE9 gamma 4PE	3
in vitro MLR	da	da	5
Legare Clq	slabă	nu
CDC	nu	nu	7
ADCC	da	nu
Legare FcR	da	nu	9
in vivo (cimpanzeii) Depleția celulelor CD4	parțial	nu	11
Modularea receptorului CD4	da	da
in vivo (șoareci HuCD4+ transgenici) Depleția celulelor CD4	parțial	nu	13
Modularea receptorului CD4	da	da	15

ADCC = Citotoxicitate celulară dependentă de anticorp

CDC = Citotoxicitate celulară mediată de complement 17

FcR = Receptor Fc

MLR = Reacția limfocitelor amestecate 19

Astfel, aceste rezultate confirmă cum, conform invenției, potfi produși anticorpii hime- 21 rici care leagă CD4 uman, care sunt lipsiți de anumite funcții efectoare în virtutea selectării secvențelor specifice de domeniu constant. 23

La utilizarea anticorpilor anti-CD4 himerici sau a altor anticorpi himerici, produși conform invenției, ca imunosupresori sau modulatori ai CD4 pentru tratamentul afecțiunilor auto- 25 imune, incluzând, de exemplu, artrita reumatoidă, astfel de anticorpi potfi administrați singuri sau în combinație cu alți compuși adecvați pentru tratarea bolii particulare. De exemplu, anti- 27 corpul de față poate fi administrat în combinație cu alte proteine, de exemplu proteine solubile, anticorpi monoclonali receptoare pentru TNF-alfa, anticorpi monoclonali pentru recep- 29 torul IL2, anticorpi monoclonali și proteine de fuziune receptoare care antagonizează interacțiunea CD40/gp39și CTLA4-lg, în anticorpi monoclonali care antagonizează interacțiunea 31 B7/CD28. De asemenea, în cazul tratamentului artritei reumatoide, prezenții anticorpi pot fi administrați în combinație cu alți agenți terapeutici, de exemplu Rapamicină, Leflunomidă, 33 Tenidap, RS-61443 (Micofenolat Mofetil), Surenil (Hialuronat de sodiu), vaccin peptidic antiTCR (Vpi7), Anerva X (vaccin anti-MCH) și imunoabsorbanți ai proteinei A extracorporal, sau 35 combinații ale acestora. în plus, anticorpul de față poate fi administrat în combinație cu alți anticorpi produși conform invenției sau cunoscuți în domeniu, care sunt specifici pentru 37 proteina CD4.

Prin aplicarea invenției, se obțin următoarele avantaje: 39

- anticorpi monoclonali și himerici specifici CD4, cu viață de înjumătățim mai îndelungată; 41

- imunogenitate mai scăzută la oameni și/sau activitate de depletizare a celulelor redusă sau absentă. 43 în continuare, se prezintă 8 exemple de realizare a invenției, în legătură cu figurile ce reprezintă: 45

- fig. 1, secvența de aminoacizi și ADN ale domeniului variabil al lanțului greu al

CE9.1; 47

RO 120198 Β1

- fig. 2, secvența de aminoacizi și ADN ale domeniului variabil al lanțului ușor al

CE9.1;

- fig. 3, secvența de aminoacizi și ADN ale domeniilor umane variabil lambda și constant, conținute în CE9.1;

-fig. 4, secvența de ADN și de aminoacizi care codifică secvența variabilă cu catenă grea și constantă gamma 4;

- fig. 5, secvența de ADN și aminoacizi care codifică catena grea gamma 4 umană care conține mutatia E;

- fig. 6, secvența de ADN și aminoaizi care codifică catena grea gamma 4 umană care conține mutația P și E;

- fig. 7-1,7-2 și 8, secvența de acid nucleic cu diverse secvențe lider, utilă în invenție;

- fig. 9, o diagramă a legării CE9.1 la PMNC-uri umane proaspete, în care panoul A din cuadrantul de sus, dreapta, arată limfocite dublu colorate cu CE9.1 și OKT3, panoul B din cuadrantul de sus, dreapta, arată populația dublu colorate cu CE9.1 și OKT4, Panoul C din cuadrantul de sus, dreapta, arată absența celulelor dublu colorate cu CD8 și CE9.1, și panoul D de control arată celule colorate cu IgG normal și uman;

- fig. 10a, 10b și 10c arată caracteristicile de legare a CE9.1 a unui receptor Fc, în care măsurătorile arată aglutinarea histogramei citomerice a fluxului de CD4⁺ a fibroblastelor de legare cu: a) monocite proaspete, induse de gamma IFN, în care un control negativ utilizează fragmente F(ab')2 de CE9.1, b) monocite proaspete, cu sau fără incucere gamma IFN, și c) în prezența sCD4 sau în absență de anticorp;

- fig. 11, inhibarea reacției limfocitelor umane, amestecate de către CE9.1, în care se utilizează: a) PBL-uri umane proaspete, ca răspunzători, și celulele stimulatoare de mitomicin C-tratate, de la un donor neînrudit, se utilizează pentru testarea proprietăților inhibitorii a unui interval de concentrații de CE9.1, iar inhibarea este măsurată prin cantitatea de timidină încorporată la producerea de IL-2, și b) MLR, utilizând, ca răspunzători, cimpanzei, și, ca stimulatori, cimpanzei neînrudiți, în care Leu3a CD4 anti-uman murin este utilizat drept control;

- fig. 12, proprietățile citotoxice celulare, dependente de anticorp, ale CE9.1, în care liza celulelor țintă SupT-18, în prezență de gamma -interferon, stimulează celulele efectoare, și în care 4D9 este un anticorp monoclonal anti-CD4 murin lgG2a;

- fig. 13, o histogramă citometrică de flux a legării celulelor Clq și SupTI-18 în prezența sau absența CE9.1, în care se înregistrează 10000 de evenimente și rezultatele se exprimă sub formă de histogramă, PRO945 sunt anticorpi monoclonali de la maimuță cu titru ridicat de anti-CD4 seric și controlul negativ este C1q plus anti-C1q în absența CE9.1;

- fig. 14, testul de citotoxicitate dependentă de complement a CE9.1, unde liza celulelor este SupT-18 în prezență de CE9.1 și complement de iepure, în care 4D9 este un control anti-CD4 murin al subclasei lgG2a, care este capabil să fixeze complementul, și în care PRO965 este un amestec policlonal de anticorpi din serul unei maimuțe cynomologus cu un titru mare de anti-CD4;

- fig. 15, studiul farmacologic la doză mare, pe șase cimpanzei, unde sunt arătate, de asemenea, nivelurile de CD4, CD8 în sângele periferic pe o perioadă de 150-300 de zile, curbele CD3-CD8 indicând numărul de celulele modulate cu CD4, panoul din partea superioară - Grupa 1-numărători la cimpanzei monitorizați. Săgețile indică dozele de CE9.1.

(2) grup de control cu saramură, panoul din mijloc: Grupa 2-cimpanzei (2), care primesc 10 mg/kg de CE9.1. Dozarea se repetă atunci când determinarea CD4 revine la 30% de la linia de bază. Panoul de jos arată Grupa 3-cimpanzei (2), care primesc 10 mg/kg CE9.1. Dozarea se repetă atunci când determinarea CD4 revine la 70% din linia de bază;

RO 120198 Β1

- fig. 16, primeri PCR adecvați pentru obținerea regiunii constante gamma 4 umane; 1

- fig. 17, secvența cu catenă grea CE9 gamma 4PE;

- fig. 18, electroforeză pe gel de poliacrilamidă-SDS nereducător a CE9.1, CE9 3 gamma 4 (G4), CE9 gamma 4E (G4E) și CE9 gamma PE (G4PE). Molecula de Halfmer este văzută la o greutate moleculară de aproximativ 80kD; 5

- fig. 19 conține date pentru fazele de asociere și disociere ale curbelor de progres

SPR; 7

- fig. 20, efectul constructelor mAb CD4 asupra MLR primar;

- fig. 21, aderența liniei celulare monocite THP-1 indusă IFM- gamma la transfectorii 9 fibroblaști CD4⁺;

- fig. 22, aderența mediată de FcR și CD4-a CE9.1, CE9 gamma 4, CE9 gamma 4E 11 și E9 gamma 4 gamma kappa;

- fig. 23, rezultatele CDC și ADCC cu CE9 gamma 4PE, CE9.1 și un mAb murin de 13 fixare la HuCD4;

- fig. 24, concentrația plasmatică după 1 mg/kg în bolus de CE9 gamma 4E și CE9 15 gamma 4PE la șoareci Sprague-Dawley,

- fig. 25, efectul tratamentului cu mAb-uri ca răspuns la anticorp ovalbumin specific 17 la șoareci transgenici HuCD4.

Exemplul 1. Clonarea și exprimarea anticorpului himeric maimuță/om cu specificitate 19 pentru CD4

Generarea liniilor celulare-B imortalizate de maimuță 21

O maimuță cynomologus adultă (White SADNs New Mexico Primate Center) este imunizată intramuscular, în zone multiple, cu 150...300 pg de CD4 solubil (sCD4) sau mem- 23 brane celulare (1 x 10® celule) din linii celulare pozitive CD4 SupT1, utilizând un adjuvant standard. Imunizarea este repetată la fiecare 2...3 săptămâni, în total de șase ori. Maimuța 25 este sprijinită prin injectarea a 100 pg, de sCD4 în regiunea inghinală a unei coapse și, o săptămână mai târziu, se îndepărtează chirurgical ganglionul limfatic de drenare de la 27 aceeași coapsă. Din ganglionul limfatic se îndepărtează limfocitele prin tăierea în felii a ganglionului și spălarea cu mediu steril DMEM. Suspensia de celule este trecută printr-un tifon 29 de nylon și se colectează prin centrifugare la 1000 g timp de 10 min.

Aproximativ 1x10® limfocite se suspendă în tampon fris-clorură de amoniu (16 mM, 31 pH 7,5) și se încălzește la 37°C timp de 5 min, pentru a liza eritrocitele. Limfocitele se colectează prin centrifugare, se resuspendă în ester metilic de L-leucină (LME) și se incubează 33 la 37°C timp de 45 min. Celulele tratate cu LME se filtrează printr-o sită din nylon și se centrifughează. Se adaugă 1 ml de ser fetal de vițel, celulele se suspendă și se spală de două ori 35 cu RPMI fără ser. Celulele se numără și se amestecă într-un singur tub de centrifugare conic, de 50 ml, împreună cu un număr egal de celule de heteromielom K6H6/B5, prespălate 37 de două ori în mediu fără ser. Celulele se suspendă ușor în 1 ml de PEG (polietilen glicol)

50%, adăugat cu încetul, cu agitare ușoară, pe o perioadă de 1 min. Celulele se resuspendă 39 apoi prin adăugarea a 20 ml de mediu fără ser, pe o perioadă de 5 min, cu amestecare ușoară, pentru a dilua PEG. După spălare de două ori cu mediu fără ser, celulele sunt resus- 41 pendate la o concentrație de 5 x 10⁵/0,1 ml de mediu RPMI care conține 20% ser fetal de vițel și gentamicină, și se plasează în microplăci pentru culturi de țesuturi cu 96 de godeuri, 43 în concentrație de 0,1 ml în fiecare godeu. în fiecare godeu se adaugă un volum egal (0,1 ml) de mediu HAT și hibrizii sunt lăsați să se dezvolte timp de 14...17 zile înainte de screening. 45

Sreeningul hibrizilor celulari fuzionați pentru producerea de anti-CD4

Testul pentru a determina specificitatea anti-CD4 este după cum urmează: plăcuțe 47 ELISA sunt acoperite cu sCD4 recombinant în concentrație de100ng pe godeu și se

RO 120198 Β1 blochează cu 1% albumină din ser de bovină în PBS. Alicotele de 50 μΙ de supernatant de hibridom se îndepărtează din fiecare godeu și se lasă la incubat cu plăcile acoperite cu sCD4, timp de 60 de min. Legarea se detectează prin incubarea cu Ig anti-uman de capră sau anti-maimuță de capră, marcat cu I¹²⁵ timp de 60 de min. După spălare de patru ori cu apă distilată, godeurile sunt contorizate într-un contor gamma. Godeurile pozitive sunt retestate în duplicat și celulele de hibridom din acele godeuri sunt subclonate de trei ori, prima dată la trei celule în fiecare godeu, apoi de două ori la o celulă în fiecare godeu. în această etapă, probele pozitive anti-CD4 sunt testate pentru determinarea capacității de legare la CD4 de la suprafața celulelor. Acest lucru se face prin inhibarea legării la un anti-CD4 murin monoclonal, denumit 1F3, la linia celulară pozitivă CD4 supT1. Pe scurt, acest lucru se face prin co-incubarea a diferite cantități anti-CD4 de maimuță și 10 pg de 1F3 marcat cu I¹²⁵, cu 3x 10⁵ celule supT1/godeu într-o placă cu 96 de godeuri. După incubaretimpde 1 h la temperatura camerei (circa 20...25’C), celulele sunt îndepărtate sub vid, pe filtre din fibră de sticlă. După spălarea bine cu PBS, filtrele sunt contorizate într-un contor gamma pentru a determina inhibarea legării IF3 la celulele supT1 de către supernatantele cu hibridom de maimuță.

Este aleasă o clonă candidat, care produce un anticorp ce prezintă o puternică inhibare față de IF3. Clona este izotipizată utilizând reactivi de izotipizare umană și se găsește că este un lgG2 care posedă o catenă ușoară lambda. Această linie celulară este dezvoltată până la un număr mai larg, pentru clonarea genelor sale de imunoglobulină.

Clonarea genelor regiunii variabile a catenelorgrea și ușoară de la celulele B imortalizate de la maimuță.

ARN-ul total este izolat din 1 x 10⁷ celule B-imortalizate de la maimuță, utilizând metoda cu izocianat de guanidiniu. O zecime din totalul de ARN este utilizată pentru a prepara un ADNc monocatenar, utilizând un primer al oligonucleotidei oligo-dT și revers transcriptaza. O zecime din cantitatea de ADNc monocatenar este utilizată pentru pentru a efectua reacții PCR. Șase reacții PCR, fiecare incluzând unul din cei șase primeri 5' ai oligonucleotidelor specifice familiei V_H, conținând un situs de restricție Sal I, cu o oligonucleotidă a regiunii constante 3' de la IgG, conținând un situs Nhe I, sunt prezentate în fig. 7-1. în mod similar, sunt realizate cinci reacții PCR, utilizând unul din cei cinci primeri ai oligonucleotidei secvenței lider 5' lambda, conținînd un situs Bql II, și un primer al regiunii constante 3' lambda, conținînd un situs Avr II. Condițiile de reacție sunt descrise mai sus. Fiecare reacție PCR este realizată în triplicat. Produșii fiecăreia dintre reacțiile de amplificare a catenei grele și a catenei ușoare sunt administrați pe geluri de agaroză 1,2%. Primerul catenei grele VH4 (5'-ACTAAGTCGACATGAAACACTGTGGTTCTT 3') și primerul lambda (5-ATCACAGATCTCTCACCATGACCTGCTCCCCTCTCCTCC 3') au dat benzi puternice la electroforeză pe gel de agaroză. Produșii acestor reacții sunt utilizați pentru clonarea în vectorul TCAE 6, care conține lgG1 umană și secvențe ale regiunii constante lambda umane.

Clonarea a două gene ale regiunii variabile într-un vector de exprimare TCAE 6 se face în mod secvențial. în primul rând, produsul PCR al catenei grele și vectorul TCAE 6 sunt digestați cu enzimele de restricție Sal I și Nhe I, produșii sunt extrași cu fenol/cloroform și trecuți printr-o coloană spin SEPHADEX G-25. Produsul PCR este ligat la vectorul de scindare peste noapte, la 14°C, în prezență de ADN ligază T4. Aproximativ 500 ng ADN total esteligatîntr-un volumde 10 pl, cu un raport molar insert/vector de 10:1. Materialul ligat este utilizat pentru a transforma celulele Blue competent XL-1 (Stratagene), iar celulele transformate sunt întinse pe plăci de agar LB care conțin 50 ug/ml ampicilină. Colonii de bacterii rezistente la ampicilină sunt culese și crescute ca miniculturi de 5 ml. Plasmida ADN este extrasă din fiecare dintre aceste culturi prin metoda standard a lizei alcaline, tăiată cu

RO 120198 Β1 enzimele de restricție Sal I și Nhe I, iar produșii trecuți pe gel de agaroză 1,2%. Plasmidele 1 cu fragmentele de inserție de aproximativ 450 pb (perechi de baze) sunt utilizate ca modele pentru donarea ulterioară a regiunilor variabile ale catenei ușoare. Produșii reacției PCR a 3 catenei ușoare și, în aceeași măsură, plasmida care conține inserția catenei grele, sunt scindați cu enzimele de restricție Bql II și Avr II și ligați împreună. Miniculturile de plasmidă sunt 5 analizate prin scindare cu Bgl II și Avr II. Digeratele conducând la o inserție de aproximativ

400...450 bp sunt înregistrate pozitiv. Plasmidele conținând atât inserțiile Sal Ι/Nhe I, cât și 7 Bgl II Avr II, sunt crescute în cantități mai mari, pentru secvențializarea ADN.

Vectorii tandem TCAE 5,2 și TCAE 6 de exprimare ai anticorpului himeric sunt 9 derivați din vectorul CLDN, care este un derivat al vectorului RLDNIOb (253 Science. 77-79 (1991)). RLDNIOb este, în schimb, un derivat al vectorului de expresie TND (7 ADN, 651- 11

661 (1988)).

Vectorul RLDN10b diferă de vectorul TND în următoarele moduri. Caseta transcripțio- 13 nală a dihidrofolat reductazei (DHFR) (promotor, ADNc și regiunea de poliadenilare) este plasată între caseta activatorului plasminogen al țesutului (caseta de expresie t-PA) și caseta 15 neomicin fosfotransferazei (NEO), astfel încât toate trei casetele sunt în tandem și în aceeași orientare transcripțională. în plus, promotorul genei DHFR în CLDN a fost înlocuit de către 17 promotorul principal β-globin de la șoarece (3 Mol. Cell Biol. 1246-54 (1983) și ADNc t-PA înlocuit printr-un polilinker. Toate cele trei casete transcripționaleeucariote (Expresie, DHFR, 19

NEO) pot fi separate din ADN-ul plasmidei bacteriene (derivat pUC9), prin digestia cu endonucleaza de restricție Not I. 21

Vectorul CLDN diferă de RLDNIOb deoarece Rous LTR din fața polilinkerului a fost înlocuit de amplificatorul cel mai apropiat al promotorului genei timpurii a citomegalovirusului 23 uman (41, Cell, 521(1985)).

Vectorii de expresie TCAE 5.2 și TCAE 6 diferă de vectorul CLDN prin aceea că: 25

1) aceștia conțin patru casete transcripționale (în loc de trei), în ordinea tandemului:

a) o regiune constantă a catenei ușoare de la imunoglobulină umană derivată pe 27 calea amplificării ADNc printr-o reacție în lanț a polimerazei. în vectorul TCAE 5.2, aceasta este regiunea constantă kappa a catenei ușoare de imunoglobulină umană (Kabat amino- 29 acizii 108-214 în sistemul de numărare Kabat, alotipul Km 3) și în TCAE 6 aceasta este regiunea constantă lambda a catenei ușoare de imunoglobulină umană (aminoacizii 108-215 31 în sistemul de numărare Kabat, genotipul Oz minus, Mcg minus, alotip Ke minus);

b) o regiune constantă a catenei grele de imunoglobulină umană; în ambele cons- 33 trucții catena grea de imunoglobulină umană este regiunea constantă gamma 1 (Kabat numărând aminoacizii 114-478 în sistemul de numărare Kabat alotipul Gm1a, Gm1z), care 35 este derivată pe calea amplificării ADNc printr-o reacție în lanț a polimerazei;

c) DHFR, conținând propriul său promotor eukariotic și regiunea de poliadenilare; 37

d) NEO, conținând, de asemenea, propriul său promotor eukariotic și regiunea de poliadenilare; 39

2) casetele catenei grele și catenei ușoare de imunoglobulină umană conțin secvențe semnal sintetice pentru secreția catenelor de imunoglobulină; 41

3) casetele catenei grele și catenei ușoare de imunoglobulină umană conțin linkerii

ADN specifici, care permit inserția regiunilor variabile ușoară și grea de imunoglobulină care 43 mențin cadrul translațional de citire și nu modifică aminoacizii găsiți în mod normal în cafenele de imunoglobulină. încorporarea schimbărilordescrise conduce la construcția vectorilor 45

TCAE 5.2 și TCAE 6. Clonarea genelor din regiunile variabile ușoare și grele de imunoglobulină, de la linia celulară E9.1 de heterohibridoma anti-CD4în TCAE 6, conduce la constructul 47 care este depozitat în ATCC. Constructul, care a fost depozitat și care codifică

RO 120198 Β1 anticorpul CE 9.1, conține regiunea variabilă a catenei grele de imunoglobulină de maimuță cynomolgus și regiunea variabilă a catenei ușoare de imunoglobulină de maimuță cynomolgus, ale căror secvențe sunt prezentate în fig. 1 și, respectiv, 2, donate din linia celulară E9.1 de hibridoma anti-CD4. Regiunea constantă a catenei grele este de origine umană de izotip gamma 1 și Gmla, alotip Gmlz. Regiunea constantă a catenei ușoare lambda este, de asemenea, de origine umană, de genotip Oz minus, m.cg minus și alotip Ke minus. Genele de imunoglobulină sunt donate într-un vector de expresie TCAE 6 de mamifere, descris în cererile menționate anterior, încorporate prin referințe care, când suntelectroporate într-o linie celulară CHO de la mamifere, produc un anticorp himeric anti-CD4 maimuțe/om. Constructul ADN descris aici a fost utilizat pentru a transforma tulpina bacteriană XL-1 Blue, selectată din antibioticul ampicilină și depozitată ca o suspensie celulară bacteriană, în mediul steril LB, conținând 15% glicerină.

Secvențializarea ADN

Plasmida de ADN este preparată din culturi de 100 ml. Este apoi purificată suplimentar, prin precipitarea (1 volum) cu un amestec de clorură de sodiu 2,5 M și 20% polietilenglicol (6 volume) în gheață, timp de 15 min. După centrifugare la 10.000 x g timp de 20 min, peletele se spală cu 70% etanol, se recentrifughează și se usucă într-un Speedivac (Savant). Peletele de ADN sunt resuspendate în apă deionizată la o concentrație de 150...250 pg/ml. Secvențializarea este condusă pe 5 pg AND dublu catenar, utilizând tehnica Sânger. S-au utilizat primerii de secvențializare care au fost omologi ai secvențelor din vectorul de expresie din amonte și din vectorul de expresie în aval fie ale inserțiilor catenei ușoare, fie ale celor ale catenei grele. Inserțiile sunt secvențializate atât în direcțiile 5' la 3', cît și 3' la 5'.

Două clone ale catenei ușoare anti-CD4 și două clone ale catenei grele anti-CD4, generate fiecare din reacțiile separate PCR, sunt secvențializate în paralel, în scopul de a determina dacă sunt introduse, în timpul reacției PCR, unele schimbări de nucleotidă. Atât clonele catenei grele alese, cât și clonele catenei ușoare alese, s-a găsit că sunt identice pe întreaga lor lungime, aceasta confirmând faptul că nu s-a introdus nici o eroare în timpul procesului de amplificare. Secvența catenelor ușoare și grele anti-CD4 este prezentată în fig. 1 și 2.

Expresia vectorului himeric anti-CD4 de la maimuță/om

Expresia vectorului TCAE 5.2 și TCAE 6 nu este capabilă să fie utilizată numai pentru expresia integrată stabilă în liniile celulare Sp2/O și CHO, dar, din cauză că aceasta include originea S V40, este, de asemenea, capabilă să fie exprimată în mod trazitoriu în linia de celule COS. Exprimarea celulelor COS este realizată după cum urmează: celulele COS sunt însămânțate o zi înainte de transfecție, astfel încât acestea vorfi 50...70% confluente în ziua următoare. Mediul de cultură se îndepărtează și celulele se spală de două ori cu Tampon pentru transfecție (TB-140 mM NaCI, 25 mM Tris, 5mM KCI, 0,5 mM Na₂ HPO₄1 mM MgCI₂, 1 mM CaCI₂), 30 pg clorură de cesiu, plasmida TCAE 6 purificată, conținând catenele ușoare și grele anti-CD4 de imunuglobulină de maimuță/om, sunt amestecate cu 3 ml de dextran DEAE per placă (1 mg/ml în TB). ADN este lăsat la incubare cu celulele, timp de 1 h, la 37°C. Soluția de ADN este îndepărtată și înlocuită cu 3 ml de glicerină 20%, timp de 1,5...2,5 min, după care celulele sunt spălate de două ori cu TB. Celulele sunt incubate în 5 ml mediu proaspăt, conținând 100 μΜ clorochină, timp de 3...5 h, la 37°C, după care sunt spălate de două ori cu mediu și incubate cu DMEM normal, timp de 72 h.

O cantitate de 100 pl supernatant de la celulele COS transfectate este analizată la diferite diluții, pentru determinarea prezenței anticorpului prin tehnica bazată pe testul ELISA. Este utilizată lambda antiumană de capră, pentru a acoperi plăcile cu 96 de godeuri pentru test, și este utilizată o IgG anti-umană de la capră - marcată cu peroxidază drept anticorp de

RO 120198 Β1 detectare în condițiile testului standard ELISA. Celulele COS s-au găsit că produc între 10 1 și 40 ng/ml de anticorp himeric de maimuță/om. Volume mai mari de supernatant sunt concentrate de 10 ori și sunt utilizate pentru o legare directă a RIA la celulele SupT 1 pozitive ale 3 CD4. Anticorpul întreg parental de la maimuță și o imunoglobulină irelevantă sunt utilizați drept controale pozitiv și, respectiv, negativ. De asemenea, sunt utilizați anti-CD4 de mai- 5 muță și anticorpul himeric anti-CD4 de maimuță/om, pentru a inhiba legarea la un anticorp anti-CD4 de șoarece de afinitate înaltă (1F3). Aceste rezultate demonstrează că anticorpul 7 recombinant maimuță/om (ATCC 69030) nu se leagă numai la celulele CD4 pozitive, ci este capabil să inhibe legarea lui 1F3 la celulele pozitive CD4 la aproximativ aceleași concentrații 9 de anticorp întreg de maimuță sau chiar de 1F3.

Exemplul 2. Acest exemplu se referă la caracterizarea funcțională a CE 9.1 in vitro, 11 incluzând efectele acestuia asupra proliferării celulei T și a producției de IL-2 în MLR, la receptorul său Fc și la proprietățile de legare a complementului și la capacitatea sa de a 13 media răspunsurile ADCC și CDC. în plus, sunt analizate efectele in vivo asupra medierii receptorului de CD4 și asupra subseturilor limfoide în sângele periferic. 15 în aceste exemple sunt folosite următoarele materiale și metode (Anderson și colaboratorii, Caracterizarea in vitro și in vivo a unui mAb primatizat la CD4 uman; mAb cauzează 17 modularea receptorului CD4 dar nu provoacă depleția celulei T CD4 la cimpanzei).

Materiale și metode 19

Constructul molecular și expresia anti-CD4 Primatizat™

Genele regiunii variabile a imunoglobulinei sunt amplificate prin PCR și donate de la 21 o heterohibridomă derivată de la o maimuță imunizată cu sCD4, așa cum s-a descris anterior (Newman, R.A. și colaboratorii, în Primatizarea anticorpilor recombinând pentru imunote- 23 rapia bolilor la om: un anticorp himeric de macac/om împotriva CD4 uman, Biotechnology,

10: 1455 (1992)). Genele regiunii variabile a catenei grele și catenei ușoare sunt inserate 25 într-un vector de expresie a casetei, TCAE 6, într-o manieră tandemem și sunt exprimate ca o lgG1 lambda după integrarea stabilă în celulele DHFR CHO (Newman, ca mai sus). Trei 27 runde de amplificare cu cantități în creștere de metotrexat permit liniilor celulare să se dezvolte, exprimând nivelurile de anticorp în exces de 750 pg/ml, după 8 zile. Este generată 29 o linie celulară de producție, prin creștere în cultură în suspensie, și extinsă în mod progresiv, înaintea inoculării într-un reactor tubular de fibre (Evans și colab.; Producerea pe 31 scară largă a anticorpilor monoclonali de murină utilizând bioreactoare tabulare din fibre, Biotechnique 6(8): 762 (1988)). Anticorpul mAb CE9.1 este purificat prin trecerea superna- 33 tantului culturii din reactor, printr-o coloană Prosep A (de 300 ml, Bioprocessing Inc.), echilibrată anterior cu soluție salină tamponată cu fosfat, pH 7,2, la o viteză de 125 ml/min. 35 Coloana este spălată cu PBS, până se stabilește o linie de bază și anticorpul legat este eluat cu 5 volume de coloană de 0,2 M de acid acetic/tampon de glicină 0,1 M cu pH de 4,0. Recu- 37 perarea este în jur de 90%. Eluatul se menține la pH 5,5 și se trece printr-o coloană de Q-Sefaroză (de la Pharmacia). CE9.1 este legat la coloană, care este spălată cu 25 ml de Tris- 39 HCI 25 MM, pH de 8,5. Anticorpul este eluat cu 50 mM de Tris-HCI, pH de 6,5 conținând 100 mM de NaCI și este concentrat prin defiltrare (Millipore Pellicon) față de USP soluție 41 salină injectabilă. CE9.1 este, în final, filtrat printr-un filtru NDP din Nylon ₆₆ de 0,04 pm (Pali Filtration). 43

Specificitatea de legare: Legarea lui CE9.1 la celula SupT-18 a CD4⁺

Plăcile microtitru cu 96 de godeuri, cu fundul în formă de U (Corning), sunt preblocate 45 timp de 1 h, pe gheață cu PBS, conținând albumină serică bovină 0,2% și azidă de sodiu 0,1 %. Celulele SupT-18 (1 x 10⁵) prespălate cu același tampon sunt incubate timp de 30 min 47 pe gheață, cu concentrații variabile CE9.1 (2,4 pg/ml...10 ug/ml). Celulele sunt spălate de

RO 120198 Β1 două ori și sunt incubate timp de 30 min pe gheață, cu un al doilea strat de anticorpi (Ig antișoarece de capră marcată cu FITC). Celulele sunt spălate de două ori, sunt resuspendate în tampon de fixare (2% formaldehidă în PBS) și sunt analizate utilizând un citometru în flux continuu FACScan (Becton Dickinson).

Specificitatea de legare: Analiza în flux a legării CE9.1 la leucocitele umane din sângele periferic

Celulele mononucleare sunt izolate din sângele periferic uman, utilizând tehnica standard de centrifugare Ficoll/Hypac (Boyum.A., Separarea leucocitelor, granulocitelor și limfocitelor din sânge, Tissue Antigens, 4 : 269 (1974)). Celulele mononucleare din sângele periferic (PMNC) conținând stratul de interfață sunt îndepărtate, se spală cu soluția de sare Hank echilibrată (HBSS) și sunt numărate.

Celule în număr de 5 x 10⁶ sunt incubate cu 20 pl de CE 9.1 (25 μl/ml) timp de 30 min la 4°C. Celulele sunt spălate apoi cu HBSS și incubate cu 20 μΙ de anti-uman IGG-FITC de capră (Fisher Scientific). După incubarea pe gheață pentru încă 30 min, sunt analizate celulele pe un instrument FACScan Becton Dickinson, utilizînd autocompensația și precalibrarea cu perle de Calibrite.

Populațiile de limfocite viabile sunt identificate ca mai sus, în raport cu dispersia luminii în unghi drept, și populația totală de limfocite este izolată prin eliminarea tuturor celorlalte cazuri. Măsurătorile de fluorescență ulterioare reflectă numai cazurile de limfocite selectate. Anticorpii mAb sunt utilizați pentru numărarea celulelor colorate dublu și studiile ulterioare pe sânge de cimpanzeu au inclus anti-uman CD3 (Leu-4-FITC; Becton Dickinson), anti-uman CDS conjugat cu fluoresceină (Leu-2a-FITC; Becton Dickinson), anti-uman CD8 conjugat cu ficoeritrină (Leu-2a-PE; Becton Dickinson), anti-uman CD20 conjugat cu ficoeritrină (Leu-16-PE; Becton Dickinson), IgG F (ab')₂ (Cappel) antiumană de capră, conjugată cu fluoresceină și anti-Cd4 (OKT4) de murină, conjugat cu ficoeritrină (Ortho Pharmaceuticals).

Reactivitatea încrucișată a țesutului uman

CE9.1 sunt evaluate pentru reactivitatea încrucișată pe țesuturi umane normale. CE9.1 biotinilat este testat pe secțiuni înghețate, tăiate în regim criostatic, de la 32 țesuturi diferite, utilizând tehnica imunoperoxidazei avidină-biotina (Wilchek. M și col., Complexul avidină-biotină în aplicațiile bioanalitice, Anal. Biochem., 171: 1 (1983)). Celulele SupTI (CD4⁺) sunt utilizate drept linie celulară de control pozitiv, iar celulele SB (CD4) sunt utilizate drept linie celulară de control negativ. Un anticorp himeric irelevant biotinilat șoarece/om (IgGI) este utilizat drept control de anticorp negativ.

Pentru multe țesuturi, sunt examinate trei specimene separate și se apreciază reactivitatea CE9.1 pe o scală de la 0 la 3⁺. în cazul unor țesuturi, se apreciază separat structuri diferite din țesut. De exemplu, în ficat, hepatocitele canalelor biliare și celulele Kupffer sunt apreciate în mod independent.

Specificitatea speciilor

Sângele periferic de la mai multe primate obișnuite de laborator și de la neprimate este analizat cu CE9.1 pentru identificarea unei posibile reactivități încrucișate a celulelor T.CD4 pozitive. Grupul include cimpanzei, babuini, rhesus, cynomolgus și șobolani macac, șoareci, iepuri și câini. Celulele de sânge sunt izolate din 1-5 ml de sânge total prin centrifugare (1500 rpm timp de 5 min) la 4°C și este spălat prin resuspendare în volume egale de PBS. Procedeul se repetă încă o dată și celulele sunt resuspendate în volume egale de ser fetal de bovină. Două sute de microlitri de suspensie de celule pentru fiecare specie se introduc într-un tub conic de 15 ml pentru centrifugă, cu 20 pl de CE9.1 (25 mg/ml). Anticorpul și celulele sunt amestecate, sunt plasate pe gheață timp de 30 min, apoi sunt spălate

RO 120198 Β1 puternic cu HBSS. Sunt adăugați apoi 20 pl de anti-uman IgG-FITC de capră (Fisher 1 Scientific) și proba este omogenizată. După incubare pe gheață timp de încă 30 min, proba este îndepărtată de pe gheață și sunt adăugați 10 ml de tampon pentru liză (bicarbonat de 3 potasiu 0,01 M, pH de 7,4, conținând clorură de amoniu 0,16 M și EDTA de sodiu 0,1 M), preîncălzit la 37°C. Probele sunt incubate la temperatura camerei, timp de 15 min, și apoi 5 centrifugate la 1500 rpm, timp de 5 min. Peletele de celule marcate sunt spălate încă de două ori în HBSS (pH de 7,4) conținând albumină serică de bovină 1% și azidă de sodiu l 0,05%. Celulele marcate sunt fixate prin resuspendarea în tampon de fixare (clorură de sodiu 0,5 M, conținând 1 % formaldehidă, filtrat printr-un filtru de 0,22 pm). Probele sunt analizate 9 cu un instrument Becton Dickinson FACScan, așa cum s-a arătat mai sus.

Testări funcționale in vitro: reacția limfocitei amestecate o dată și de trei ori 11

Celule T umane sau de cimpanzeu (1,3 x 10⁵) sunt cultivate, cu sau fără CE9.1, în microgodeuri cu fund plat, timp de 7 zile, cu PBMCs tratat cu mitomicin C (6,0 x 10⁴) obținut 13 de la un donor neînrudit, de origine umană, sau de la un cimpanzeu. Se adaugă 1 μ Ci/godeu de timidină tritiată la cultură, în perioada ultimelor 18 h de cultivare. Plăcile de microtitrare 15 sunt centrifugate și peletele celulare sunt spălate cu HBSS și apoi numărate cu un numărător cu scintilație lichidă. Fiecare probă este analizată în triplicat (în trei exemplare). 17

MLR umane sunt conduse utilizând trei donori separați, neînrudiți, drept amestecuri stimulatoare și de răspuns. Acest protocol este adoptat pentru a maximiza șansele unui răs- 19 puns bun într-o probă de celule roșii ale sângelui cu înveliș neted transversal, aleasă la întâmplare, necaracterizată cu HLA. în acest protocol, nici unul dintre donorii de sânge nu 21 a fost tratat cu mitomicin C sau nu a fost iradiat.

Testul de adeziune a celulei THP-1 pentru a măsura activitatea CE9.1 de legare a 23 receptorului Fc.

Acest test depinde de legarea prin punte a celor două linii de celule, una exprimând 25 CD4 și cealaltă exprimând receptorii Fc, impusă de un anticorp anti-CD4. Partenerul care exprimă CD4 utilizat este DAP aderent la linia celulară a fibroblastelor de murină, care este 27 transfectat cu CD4 uman (DAP/CD4). Celulele care poartă receptorul Fc sunt THP-1. Celulele DAP/CD4 sunt plasate pe plăci cu 96 de godeuri cu fund plat (100 μΙ/godeu; 25000 de 29 celule/godeu) și sunt lăsate să adere peste noapte. Celulele THP-1 sunt resuspendate în 50 ml de mediu RPMI (1 x 10⁶ celule/ml) și sunt induse timp de 24 h, la 37°C, printr-o 31 adăugare de 50 U/ml de gamma IFN.

Celulele THP-1 induse cu gamma IFN sunt tratate (încărcate) cu ester acetometoxi 33 de calcinat (CAM, Molecular Probes), după cum urmează: celulele sunt spălate cu tampon de încărcare (PBS cu calciu și magneziu și cu albumină serică de bovină 0,1% de la 35 Dulbecco) și sunt resuspendate la 5 x 10⁶ celule/ml în 10 ml din același tampon. CAM (1 mg/ml în DMSO) este diluat (1: 50) cu tampon de încărcare și este adăugat la suspensiile 37 de celule THP-1 1:1 v/v. După incubare timp de 20 min la temperatura camerei, se adaugă 25 ml de tampon de încărcare proaspăt pentru fiecare, 4 ml de amestec de celule/CAM și 39 sunt incubate 40 min la temperatura camerei. Celulele sunt spălate apoi de două ori cu tampon de încărcare și sunt resuspendate la 8 x 10⁶ celule/ml. Diluțiileînseriede CE9.1 în PBS 41 (fără calciu, magneziu sau BSA) sunt adăugate în godeurile conținând celule CD4⁺ DAP incubate, timp de 5 min, la temperatura camerei. 50 μΙ de suspensie de celule THP-1 alimen- 43 tate cu CAM sunt apoi adăugate și plăcile sunt incubate la temperatura camerei, timp de 1 h, la întuneric. Godeurile de control fără celule DAP sunt, de asemenea, analizate. După 45 incubare, godeurile sunt spălate de trei ori cu PBS. După spălarea finală, se adaugă 100 μΙ PBS/godeu, urmată de adăugarea a 10 μΙ de Triton X-100 20%. După plasarea pe un agita- 47 tor vibrator, timp de 10...15 sec, plăcile sunt citite într-un Fluoroscan (MTX Lab. System Inc.).

RO 120198 Β1

Testul de legare a monocitelor activate pentru a măsura activitatea CE9.1 de legare a receptorului Fc.

Testarea receptorului Fc este condusă în același mod ca la descrierea de mai sus pentru celulele THP-1, cu excepția următoarelor diferențe. Se prepară monocite din sânge periferic uman proaspăt, prin separare standard Ficoll/hypac și cu gradient Percoll. Monocitele sunt stimulate cu gamma IFN, ca mai sus, dar timp de 48 h. Plăcile sunt acoperite cu monocite stimulate timp de 24 h și, în această analiză, linia SupT-18 CD4⁺ a fost încărcată cu CAM, așa cum s-a descris mai sus. Celulele SupT-18 sunt apoi adăugate la plăcile acoperite cu monocite stimulate, așa cum s-a descris mai sus. Principala diferență în această analiză este linia celulară CD4⁺ încărcată cu CAM și adăugată la celulele care poartă FcR, pe placă. în analiza de mai sus utilizând celule THP-I, ordinea a fost inversată.

Legarea la fibroblastele de murină transfectate cu Fc gamma Rll

O linie celulară de fibroblaste de murină (CDW32-L), care au fost transfectate cu FCRH uman, este obținută de la ATCC. Legarea directă a CE9.1 este determinată prin incubarea anticorpului în prezența și în absența de sCD4. Legarea de CE9.1 este detectată prin incubarea cu anticorpi Ig anti-umani de la capră, conjugați cu peroxidaza de hrean (Southern Biotech). Fragmente de Fab ale CE9.1 sunt generate prin digestie enzimatică și sunt utilizate drept probe control negative. Valorile absorbantei obținute de la CE9.1 (fragmente Fab) preincubat cu celule în prezența sCD4 sunt sustrase de la absorbanța obținută pentru anticorpi, în absența CD4.

Testul ADCC (liza celulelor supTI)

Probele de sânge uman proaspăt heparinizate sunt colectate și PMNC-urile sunt izolate prin proceduri de centrifugare standard pe Ficol/Hypac. Celulele roșii ale sângelui în înveliș tamponat sunt lizate cu clorură de amoniu și celulele sunt spălate de două ori în soluție de sare la echilibru Hank. Limfocitele din sânge periferic (PBL) sunt stimulate cu 10 unități de EL-2 per ml de RPMI/10% de ser fetal de vițel (FCS), timp de 24 h, la 37°C, CO₂ 5%. După 24 h, PBL sunt resuspendate în RPMI/FCS.

Celulele SupTL'¹⁸ (1 x 10°C sunt marcate prin incubare cu 100 pCi ⁵¹Cr, timp de 1 h, la 37°C, CO2 5%. Celulele sunt spălate de două ori cu RPMI/FCS 5% și se adaugă 1 x 10⁴ celule în fiecare godeu. Trei loturi de anticorpi CE9.1 sunt diluați în serie 1:2 cu RPMI/FCS 5% și sunt adăugate părți de alicote triplicate la godeurile conținând SUPT1-18, timp de 30 min, la 37’C, CO25%. Sunt utilizați 100 pl de 1% Triton X-100 și 100 pl de mediu drept control de eliberare maximă și, respectiv, spontană. PBL stimulate cu IL-2 (8 x 10⁵ celule) sunt adăugate în godeuri. Plăcile sunt centrifugate timp de 3 min la 900 rpm și incubate timp de 16 h la 37°C, CO₂ 5%. Supernatantul din fiecare godeu este colectat și cantitatea de radioactivitate este măsurată cu un contor gamma. Testul este realizat în triplicat. Procentul de liză a celulei este determinat utilizând formula următoare:

%Liză- {^num^'^are(V^,ro^^or ~ eliberarespontană) (eliberaremaximă-eliberarespontană)

Testul de legare C1q

Testul C1 q este realizat utilizând linia celulară pozitivă SupTI-18 CD4 într-o suspensie de 4 x 10⁶ per ml. CE9.1 și anticorpul anti-CD4 de maimuță, purificat prin controlul afinității (50 pl) la concentrații echivalente de 20 pCi/ml, sunt adăugate la 2 x 10⁵ celule pozitive țintă. Suspensia de celule și anticorpii sunt incubate timp de 1 h pe gheață, apoi sunt spălate de două ori cu 1%BSAîn PBS. Cincizeci plde Clq uman (10 ug/ml) sunt adăugați în fiecare tub și sunt incubați 1 h, pe gheață. Fiecare tub este spălat de două ori, apoi sunt incubate (1 h,

RO 120198 Β1 pe gheață, în întuneric) cu o diluție 1: 15 de Clq FITC anti-uman de iepure (50 pl). Celulele 1 sunt spălate din nou de două ori în 0,5 ml de formaldehidă/PBS. Celulele sunt analizate pe un citometru în flux continuu de tip FACScan Becton Dickinson, utilizând un program Consort 3 30, pentru achiziționarea și analizarea datelor.

Testul citotoxicitătii mediate de complement. 5

Celule SupT1 (1 x 10⁶) sunt marcate prin incubarea cu 100 pCi ⁵¹Cr, timp de 1 h, la 37’C, CO₂ 5%. Celulele sunt spălate de două ori cu RPMI/FCS 5% și sunt adăugate 1 x 10⁴ 7 celule în fiecare godeu. CE9.1 și anticorpii de control anti-CD4 sunt diluate în serie 1:2 cu RPMI/FCS 5%, și 50 μΙ părți alicote sunt adăugate în triplicat, în godeurile conținând 9 SUPT1-18. Sunt adăugați 100 μΙ de 1% Triton X-100 sau 100 plde mediu în godeuri, pentru a măsura eliberarea de ⁵¹Cr maximă și, respectiv, spontană. După o incubare de 90 min la 11 37°C, CO₂ 5%, se adugă în godeuri o diluție 1:5 de complement de iepure (Cappel).

Plăcile sunt incubate încă 90 de min la 37°C, CO₂ 5%, și apoi sunt centrifugate timp 13 de 3 min, la 900 rpm. Supernatantul din fiecare godeu este colectat și cantitatea de radioactivitate este măsurată cu un contor gamma . Testul este realizat în triplicat. Procentul de liză 15 a celulei este determinat utilizând următoarea formulă:

%Liză = f^lum&d^eP^r°b^e ~ eliberare spontană) _χ ^θθ (eliberare maximă - eliberare spontană)

Studii in vivo pe cimpanzei 21

Șase cimpanzei sunt împărțiți în trei grupe de cîte două animale fiecare: grupul 1 (control salin), grupul II (10,0 mg/kg de anticorp CE9.1) și grupul III (10,0 mg/kg de anticorp 23

CE9.1). Grupul II de animale este tratat din nou cu 10,0 mg/kg de CE9.1 după 30 de zile, pentru că numărul celulelor lor T CD4⁺ a revenit la 30% din linia de bază. Grupul III de ani- 25 male este tratat din nou cu 10,0 mg/Kg de CE 9.1, pentru că numărul celulelor lor T CD4* a revenit la 70% din linia de bază. Dacă aceste valori nu sunt realizate în ziua a 30-a, ani- 27 malele vor trebui testate pentru valorile celulei T CD3⁺, CD4⁺ și CD8⁺, la intervale bisăptămânale, până cînd valorile celulei T CD4⁺ ating valoarea țintă pentru acest grup. în acest 29 moment, animalele vor primi intravenos, din nou, 10,0 mg/kg de anticorp CE9.1, până la un maximum de trei doze. 31

Determinările liniei de bază ale valorilor numărului total de celule albe din sânge, de limfocite și granulocite, și ale subpopulațiilor de limfocite CD3⁺, CD4⁺ și CD8⁺, sunt realizate 33 în ziua a 6-a, în ziua 0 imediat înaintea primei dozări și, din nou, la 24 de h și la 14 zile după dozare. Trei cicluri de tratament, fiecare cu doze de 10,0 mg/kg, sunt administrate la 35 cimpanzei în acest studiu.

Rezultate 37

Specificitatea de legare a mAb CE9.1

Măsurătorile de afinitate prin SPR pentru legarea CE9.1 la CD4 solubil arată un Kd 39 de 1,0 nM (Brigham-Burke și colab. North American BIAsymposium, 1995 (în literatura de specialitate)). Nu a fost observată nici o legare la liniile celulare CD4 și studiile de inhibare 41 au demonstrat că legarea la celulele CD4⁺ a putut fi abolită complet de către CD4 solubil în manieră stoichiometrică. 43

Pentru determinarea specificității reactivității CE9.1, s-a determinat PBMC proaspăt izolată de la om, prin analiza citometrică în flux continuu cu două culori. Fig. 9 arată că circa 45 2/3 din celulele CD3⁺ leagă CE9.1. în subpopulația limfoidă, toate celulele care leagă OKT4 sunt, de asemenea, pozitive pentru CE9.1, în timp ce celulele CD8⁺ sunt toate negative. 47 Anumite celule CD3 arată, de asemenea, reactivitate cu CE9.1, deși natura acestei reactivități nu a fost clar determinată. 49

RO 120198 Β1

Analiza imunohistochimică este condusă pentru a determina reactivitatea țesutului de CE9.1, incluzând 32 țesuturi umane normale diferite, de origine limfoidă și nelimfoidă. Țesutul nelimfoid include organele principale, creierul, inima, pielea mușchilor scheletici, ficatul, rinichiul, țesuturile glandulare și reproductive. Asemenea analiză nu a arătat reactivitate încrucișată la oricare țesut, altele decât acelea de origine limfoidă, incluzând nodulii limfatici, splină, amigdale și sânge periferic (datele nu sunt prezentate). Colorarea legată de agregatele limfoide nu a fost observată în intestinul lung, plămân, esofag și piele.

Inhibarea MLR uman prin CE 9.1

Efectul lui CE 9.1 asupra răspunsurilor celulei T este evaluat prin MLR uman, ca răspunsuri ale producției de IL-2 sau ca răspunsuri proliferative. CE 9.1 a blocat atât proliferarea, cât și producția IL-2 cu IC₅₀ de 10...30 ng/ml, cu circa 80% inhibare la 60 ng/ml (fig. 10).

Activitatea CE 9.1 de legare a receptorului Fc

Testele de adeziune celulă-celulă, bazate pe CD4 și pe receptorul Fc, au fost dezvoltate pentru a determina reactivitatea lui CE 9.1 cu receptorii Fc pe celulele monocitice. într-o configurație a testelor, monocitele sunt izolate de la PBMC prin centrifugare în gradient de fracționare, sunt însămânțate pe plăci de microtitrare și sunt stimulate cu gamma IFN, timp de 48 h. După 48 h, sunt adăugate celule CD 4⁺ SupTI încărcate, colorate, la monocitele aderente, activate în prezența sau în absența CE 9.1. într-o a doua realizare a acestui test de adeziune, linia celulară monocitară neaderentă THP-1 este stimulată cu gamma IFN. După 24 h, celulele activate THP 1 sunt încărcate cu un colorant marker și sunt adăugate, în prezență sau absență de CE 9.1, la fibroblastele transfectantele CD 4⁺aderente, care au fost puse pe placă anterior (cu 24 h mai devreme), pe plăcile de microtitrare. în ambele cazuri, adeziunea celulă-celulă este dependentă de legarea anticorpului mAb la CD 4 pe o celulă și a receptorilor Fc pe altă celulă.

Datele prezentate în fig. 10a, 10b și 10c, bazate pe monocitele proaspăt activate gamma IFN și pe celulele CD 4⁺ SupTI T, arată că CE 9.1 mediază adeziunea celulă-celulă într-o manieră dependentă de doză, cu un ED₅₀ de aproximativ 20 ng/ml. Adeziunea a fost blocată complet de sCD4 și nu a putut fi mediată de fragmentul F(ab') 2 al CE 9,1. Monocitele neactivate de gamma IFN sunt incapabile să lege CE 9.1 (fig. 10d). Date similare au fost obținute, de asemenea, la testul bazat pe testul cu fibroblaste THP-1 și CD4⁺ (datele nu sunt prezentate). Legarea directă a CE 9.1 la o linie de fibroblaste de murină transfectate cu receptorii umani FC gamma Rll a fost, de asemenea, observată (datele nu sunt prezentate).

Citotoxicitatea celulară mediată de anticorpi (ADCC)

Celulele SupTI radiomarcate, folosite drept țintă într-un test ADCC, se dovedesc a fi lizate în mod specific, de celule efectoare, în prezența CE9.1. Citotoxicitatea maximă se atinge la aproximativ 6 pg/ml cu o liză specifică totală de circa 50% (fig. 12). Ca un control pozitiv, se folosește un anti-CD4 de murină a izotipului lgG2a (4D9). Acest anticorp se comportă foarte asemănător cu CE9.1, dând același nivel de liză celulară totală. De aceea, CE9.1 este foarte eficient în legarea receptorilor Fc pe celulele efectoare și în medierea omorârii liniilor celulare tintă CD4⁺.

t

Fixarea complementului prin CE9.1

Legarea Clq este măsurată prin citometrie în flux continuu, așa cum s-a descris mai sus (Materiale și metode). Așa cum se arată în fig. 13, în ciuda faptului că CE9.1 conține o regiune constantă a catenei grele de la om a subtipului gamma 1, prezintă numai o legare minimă a Clq (fig. 13). Anticorpi serici anti-CD4 de la maimuță, purificați prin afinitate, sunt eficienți în medierea legării C1q, sugerând astfel că lipsa legării C1q de către CE9.1 este o proprietate specifică a acestui anticorp. Lipsa legării C1q de către CE9.1 se reflectă în incapacitatea de a fixa complementul (fig. 14). Anticorpii anti-CD4 din serul de la maimuță, purificați prin afinitate, și lgG2a monoclonală de la murină produc, amândoi, liză semnificativă în același domeniu de concentrații.

RO 120198 Β1

Reactivitatea încrucișată a speciilor CE9.1 1

Analiza citometrică în flux continuu a limfocitelor de la diferite specii indică faptul că numai celulele de cimpanzeu sau celulele umane leagă puternic CE9.1. Babuinii au fost sin- 3 gura specie care a prezentat o reactivitate slabă cu CE9.1 (de 10 ori mai mică decât la om). Limfocitele umane și cele de la cimpanzeu au reacționat la fel de bine cu anticorpul mAb 5 (tabelul 2). Aceasta se reflectă într-o inhibare comparabilă a proliferării celulelor T și a producerii de IL-2 în MLR de la cimpanzeu, de către anticorpul CE9.1 (datele nu sunt prezentate). 7

Tabelul 2 9

Specii	Reactivitate
Om	+++
Cimpanzeu	+++
Babuin	0
Rhesus	-
Cynomolgus	-
Macac cu coadă	-
Câine	-
Iepure	-
Șobolan	-
Șoarece	-

Studii in vivo pe 6 cimpanzei

Pe baza lipsei de depleție ale celulelor CD4 în cadrul studiului dozei extinse la un sin- 23 gur cimpanzeu, o doză de 10 mg/kg s-a administrat la 4 cimpanzei (în plus, 2 animale într-o grupă de control au primit ser). Așa cum s-a descris în Materiale și Metode, pentru grupele 25 cu două doze s-au administrat 10 mg/kg în ziua 0 a studiului. Fig. 15 prezintă în mod sumar efectele asupra numerelor CD4 și CD8 la aceste animale. Se poate vedea că există o scă- 27 dere a celulelor care exprimă receptorul CD4, scădere care urmează imediat ce se administrează anticorpul. Reducerea numărului CD4 este observată numai imediat după fiecare 29 doză de anticorp dată. Schimbări similare ale CD4 nu au fost observate la grupul de control (sser). Numărul de CD8 a rămas neafectat integral în cursul tratamentului, deși a fost obser- 31 vată o variabilitate pe baza dozării zilnice (fig. 15, panou stîng, cercuri deschise). Prin examinarea populațiilor CD3⁺-CD8⁺, au fost observate reduceri mai puțin dramatice ale nume- 33 relor CD4. Datele sugerează apariția populațiilor de celule T CD3⁺, CD8⁺, care pot să fie rezultatul modulării antigenului CD4. Mecanismul exact al modulării este neclar la această 35 etapă, dar poate să includă internalizarea moleculelor CD4 sau a mecanismului de formare a moleculelor CD4 drept rezultat al procesului de crosslinking prin receptorii Fc exprimați pe 37 alte celule limfoide sau celule monocitice. Compararea numerelor de celule în fig. 15 arată anumite depleții ale celulelor CD4⁺ care pot să aibă loc, deși efectele principale se datorează 39 modulării receptorului CD4. în cele mai multe cazuri, efectul modulator se pare că durează circa 7...10 zile și urmează direct administrării anticorpului, după care expresia CD4 revine 41 chiar sub nivelurile liniei de bază.

Numărul CD4 total rămâne scăzut comparativ cu punctul timp al liniei de bază de 43

10...50% după încetarea tratamentului, revenind în limitele normale. Cimpanzeii au fost urmăriți pentru o perioadă de timp de până la 150 zile (grupele 1 și 2) sau 300 zile (grupa 3). 45

Numărul CD4 al animalelor din grupa 2 a revenit la nivelurile normale la 80 de zile după tratamentul final, în timp ce animalele grupei 3 au revenit la linia de bază de 20%, în același 47 domeniu de timp.

RO 120198 Β1

Exemplul 3. Acest exemplu descrie construcția genetică a vectorului de exprimare ADN utilizat în celulele de mamifere pentru a produce CE9 gamma 4PE, care este un anticorp himeric anti-CD4 de macac/om, conținând izotipul gamma 4 uman, care încorporează schimbările P și E.

Construcția Vectorului de exprimare ADN

Gena catenei grele gamma 4 umană este izolată prin PCR din linia celulară TPIT10.4 (obținută de la S. Morrison, UCI.A), utilizând 5' IDEC primer # 479 și 3' IDEC primer # 462 (vezi fig. 16) care conține situsurile Nhel și, respectiv, (BamHI.) Fragmentul donat în întregime de la gena catenei grele gamma 4 umană a fost secvențializat și s-a găsit că este identic cu cel descris de Kabat și colab. (în NIH Publication Fifth Edition nr. 91-3242, U.S. Dept. Of Health and Human Services (1991)) (vezi fig. 17). Fragmentul Nhe Ι/BamH I este donat în vectorul de exprimare Anex 2. Genele de la imunoglobulina catenei întregi, grea și ușoară, de la această plasmidă, este mutată la altă plasmidă de exprimare, pe un fragment Bgl II la Sac I. Această plasmidă este denumită anti-CD4 (G4, L, Oz-) în NEOSPLA3F.

Se utilizează mutageneza PCR pentru a schimba aminoacizii #229 și 236 în regiunea constantă gamma 4. PCR se realizează utilizând 5' primer GE212 (MidIADN) și 3' IDEC primer #698, conținând situsurile de restricție Nhe I și, respectiv, BspH l(vezi fig. 16), iarfragmentul este donat într-o plasmidă anti-CD4 (G4, L, Oz-), într-o ligareîn trei părți, și plasmida secvențializată este denumită anti-CD4 (G4, (PE), L, Oz-) în NEOSPLA3F.

Exemplul 4. Exprimarea în celulele ovariene de hamster chinezesc (cho)

Integrarea plasmidei și selecția clonelor producătoare de anticorpi

Celulele de CHO (DG44) (Urlaub și colab., Som. Cell. Mol. Genei.,16: 555-566 (1986)) sunt crescute în mediu CHO-S-SFM II conținând (GIBCO/BRL, mediu CHO), 50 μΜ Hipoxantină și 8 μΜ de Timidină (GIBCO/BRL, mediu CHO). Acest mediu este denumit mediu CHO plus HT.

Sunt realizate cinci electroporări cu 4 x 10⁶ celule și 5 pg de plasmidă ADN [Anti-CD4 (gamma 4(PE), Lambda, OZ-)în NEOSPLA3F], utilizând un dispozitiv de electroporare BTX 600 (BTX, San Diego, CA) în cuvete disponibile de 0,4 ml. înainte de electroporare, plasmida este restricționată cu Pac I, care separă genele exprimate în celulele mamiferului, de porțiunea plasmidei utilizată pentru a crește plasmida în bacterie. Condițiile pentru electroporare sunt 230 v, 400 pF, 13 Ω. Fiecare electroporare este întinsă pe o singură placă cu 96 de godeuri (circa 40.000 celule/alveolă). Plăcile sunt alimentate cu mediu CHO + HT conținând G418 (Geneticin, GEBCO), la 400 pg/ml compus activ, la două zile după electroporare și, după aceasta, se lasă până cresc coloniile. Supernatantul de la coloniile confluente sunt testate pentru prezența imunoglobulinei himerice printr-un ELISA specific pentru anticorpul uman. Douăzeci și opt de colonii rezistente G418 apar pe cinci plăci (în afară de 480 de godeuri). Colonia rezistentă G418, exprimând cel mai bun anticorp, clonă 5 C1, este confluentă 30 de zile după electroporare. Analiza Southern Blot arată cum clona 5 C1 este integrată într-o singură copie (nu sunt prezentate datele). într-o cultură de patru zile, însămânțată la 10⁵ celule/ml într-un agitator de 125 ml, această clonă se dublează la fiecare 24 h și are o viteză de producere a anticorpului de 0,5 pg/celulă/zi (0,9 mg/l).

Amplificarea

Clona 5 C1 este amplificată și aplicată pe plăci la concentrații variate de la 10⁶ celule/ placă la 3 χ 10⁴ celule/placă, pe plăci cu 96 de godeuri, conținând mediu CHO + 5 nM Metotrexat (MTX, Sigma (+) Amethopterin). Douăzeci de zile mai târziu, clona 5C1-5B9 devine confluentă pe 3 x 10⁵ celule/placă (în 49 din cele 96 godeuri s-a realizat creștere pe această placă). Această clonă este amplificată. într-o cultură de patru zile, însămânțată la 10⁵ celule/ml într-un T150, această clonă se dublează la fiecare 35,5 h și are o viteză de

RO 120198 Β1 reducere a anticorpului de 15,3 pg/celulă/zi (18 mg/l). Clona 5C1-5B9 este amplificată și 1 aplicată pe plăci la concentrații variate de la 100 celule/placă la 3 x 10⁴ celule/placă, în plăci cu 96 godeuri, conținând mediu CHO + 50 nM Metotrexat. Treizeci și șase de zile mai târziu 3 clona 5C1-5B9 50 C1 devine aproximativ 60% confluentă pe 10⁵ celule/placă (în 50 din 96 godeuri s-a realizat creștere pe această placă). Această clonă este amplificată. 5

Bănci de celule pentru furnizarea de rezerve pentru faza I a stocului cu origine de însămânțare a CE9 gamma 4PE (PSS) 7

O cantitate de 50 nM PSS MTX a clonei 5C1-5B9-50 CI este congelată. Celulele sunt cultivate într-un agitator de 500 ml, conținând mediu CHO plus 50 nM MTX. în acest moment 9 al congelării, cultura a atins o densitate de 1,1 x 10® celule/ml, cu o viabilitate de 96% și un timp de dublare de 29,3 h. Producția de anticorp este determinată printr-un test ELISA 11 sandwich pentru aproximativ 27 pg/celulă/zi. Celulele sunt centrifugate din mediu și sunt introduse în fiole, la o densitate de 2,0 x 10 ⁷ celule/ml, în ser fetal de bovină 95% JHR 13

Biosciences și amestec etalon obișnuit 5% Sigma, 1 ml de mediu congelat cu celule este congelat în fiole. Fiolele sunt congelate la -70°C și, în ziua următoare, sunt plasate într-un 15 recipient cu azot lichid. O fiolă de 50 nM PSS MTX este dezghețată și însămânțată într-un balon cu agitator de 100 ml, conținând mediu CHO plus 50 nM MTX. Trei zile mai târziu, con- 17 ținutul acestui balon cu agitator se împarte în 2 x 125 ml baloane cu agitatoare la 2 x 10⁵ celule/ml; un balon cu agitator, conținând mediu CHO plus 50 nM MTX, celălalt conținând 19 numai mediu CHO.

Trei zile mai târziu, 15 ml de celule și de mediu din balonul cu agitatorul numai cu 21 mediu CHO sunt congelați și trimiși la Tektagen, pentru testarea micoplasmei. Producția care decurge atât cu, cât și fără MTX este continuată timp de opt săptămâni. Rezultatele de la 23 Tektagen au indicat anti-CD4 (gamma 4 (PE), Λ, OZ-) NEOSPLA3F în CHO); clona 5 C15B9-50 C1 din stocul de origine de însămânțare este lipsită de micoplasmă. Zece fiole de 25 50 nM PSS NM sunt transferate pentru stocare în azot lichid.

Banca etalon de celule (MCB) 27

Două fiole de 50 mM MTX PSS de clonă 5 C1-5B9-50C1 sunt dezghețate și clona este însămânțată într-un balon cu agitator de 100 ml, conținând mediu CHO plus 50 nM 29 MTX. Cultura este extinsă pentru șase zile, în baloane cu agitator din ce în ce mai mari, până cînd ating un volum de 2000 ml, cu o densitate de 9,5 x 10⁵ și o viabilitate de 98%. Celulele 31 sunt centrifugate din mediu și resuspendate la o densitate de 2,0 x 10⁷ celule/ml, în ser fetal de bovină 95% JRH Biosciences și 5% DMSO Hibrimax Sigma 5%. Suspensia de celule în 33 mediul congelat este porționată în părți alicote (10 ml), în fiecare din cele 80 fiole crioscopice desemnate MCB G4PE50-M-A. Fiolele sunt congelate la -70° C. 24 h mai târziu, banca de 35 celule este transferată pentru stocare în azot lichid.

Exemplul 5. Stabilitatea anticorpului mAb CD4 37

Stabilitatea fizică și chimică a soluțiilor de CE9 gamma 4PE și CE9 gamma 4E sunt monitorizate timp de 3 luni la 5°C, 40°C și la lumină difuzată prin SDS-PAGE (redusă și 39 neredusă), IEF, HPLC cu fază inversă, cromatografie de excluziune sterică (SEC) și ELIS

A. Testarea inițială, prin HPLC cu fază inversă și SDS-PAGE neredusă, sugerează că 41 CE9 gamma 4E este compusă din două specii principale, denumite moleculă întreagă neredusă și o moleculă asociată necovalent, care, în condițiile de analiză, se rupe în două 43 unități egale, marcate jumătăți de meri. în mod interesant, nici o diferență importantă în profilurile bioanalitice ale acestor doi anticorpi mAb nu au fost observate prin SEC, IEF; SDS- 45 PAGE (redus) și ELISA. Cantitățile de jumătate de mer în CE9 gamma 4PE sunt mai mici de 1 % fie prin HPLC cu fază inversă, fie SDS-PAGE (neredus). Fig. 18 prezintă analiza SDS- 47 PAGE (neredus) a monomerului și a jumătății de mer în soluțiile de CE9 gamma 4PE și

RO 120198 Β1

CE9 gamma 4E. Cantitatea de jumătate de mer” în CE9 gamma 4E a rămas constantă față de testarea inițială, timp de trei luni, în orice condiții de testare. Nu s-au observat diferențe majore între stabilitatea CE9 gamma 4PE și a CE9 gamma 4E la 5°C și 40°C. Soluția de CE9 gamma 4E depozitată în condiții de lumină difuză este mai puțin stabilă decât soluția de CE9 gamma 4PE. Datele sugerează că jumătatea de mer în CE9 gamma 4E nu are un efect semnificativ asupra stabilității generale a întregii molecule. Nu s-au observat diferențe majore între stabilitatea fizică a soluțiilor de CE9 gamma 4PE și CE9 gamma 4E.

Afinitatea și stoichiometria anticorpilor mAb CD4 prin rezonanța de suprafață a plasmonului

Stoichiometria de legare a CD4 solubil la anticorpii mAb imobilizați poate fi determinată prin experimente de legare saturată, pe BIAcore (Pharmacia). Datele pentru fazele de asociere și disociere ale dezvoltării SPR (fig. 19) sunt analizate în mod direct, utilizând formele integrate ale ecuațiilor ratei, așa cum s-a descris de către O' Shannessey și colab., în Anal. Biochem., 212: 467-468 (1993)). Un sumar al datelor de legare, exprimate ca moli de CD4/moli de mAb, este prezentat în tabelul 3. Din aceste date se poate vedea că, în toate cazurile, stoichiometria de legare este mai mare de 1,5: 1. Dat fiind că BIAcore este un sistem de interacție în fază solidă și că protocolul de imobilizare este aleator, aceste rezultate sugerează că ambele situsuri de legare a antigenului de fiecare mAb sunt funcționale. Astfel, stoichiometria de legare a CD4 este aceeași pentru toți anticorpii mAb și este apropiată de valoarea teoretică de 2,0. în plus, măsurătorile de afinitate arată că afinitatea este aceeași pentru toți complecșii mAb, și anume de aproximativ 1,0 nM.

Tabelul 3

Stoichiometria și afinitatea de legare măsurate prin rezonanța suprafeței plasmonului

Anticorp	BIAcore Stoichiometrie	Afinitate (nM la 25‘C)
CE9.1	1,56	0,99
CE9 gamma 4	1,61	1,34
CE9 gamma 4E	1,72	1,43
CE9 gamma 4lambda kappa	1,67	1,08
CE9 gamma 4PE		1,09

Exemplul 6. Evaluare biologică in vitro a CE9 gamma 4PE

Rezumat

CE9.1, CE9⁺ 4PE și ceilalți derivați de gamma 4 sunt comparați pentru activitatea mediată de către regiunea Fab (MLR) și domeniul Fc (legarea receptorului Fc, ADCC și CDC). Activitatea dependentă de Fab (MLR) nu a diferit în cadrul anticorpilor mAb, dar aceștia sunt distinși prin proprietățile lor de legare a receptorului Fc. Derivatul CE9 gamma 4 gamma 4 nemodificat a arătat, în mod surprinzător, o legare puternică la receptorii Fc, dar mutația E în CE gamma 4E și CE9 gamma 4PE a înlăturat această legare, precum și activitatea ADCC.

Efectul anticorpilor mAb asupra răspunsurilor limfocitar mixt (MLR)

Testul de răspuns limfocitar mixt în trei moduri (MLR) este realizat pentru a determina efectul constructelor mAb asupra proliferării celulei T determinate de alo-antigen și asupra producerii EL-2. MLR-urile sunt dependente de prezența celulelor T CD4⁺ și o mare proporție a răspunsului este dependentă de participarea receptorului CD4 prin interacțiunile sale cu molecule CMH din Clasa II pe celule care prezintă antigen. Răspunsul MLR este o corelare in vitro a aspectelor respingerii in vivo a transplantului. Legat de alți agenți farmacologici, MLR-urile sunt, de asemenea, blocate de agenți imunosupresivi, precum ciclosporina A.

RO 120198 Β1

Toate constructele mAb au fost echivalente în ceea ce privește capacitatea lor de 1 blocare a MLR, înregistrată atât ca răspuns proliferativ al celulelor T, cât și ca producere de IL-2 (fig. 20, tabelul 4). Astfel, grefarea domeniilor V ale CE9.1 pe structuri umane Iambda4 3 și substituțiile P și E în regiunea balama și domeniile CH2 nu au afectat capacitatea anticorpilor mAb de a bloca răspunsurile in vitro ale celulei T dependente de CD4. 5

Tabelul 4 7

Efectul anticorpilor mAb asupra MLR-Rezumat

Anticorp	Proliferare (IC50)	Producere de IL-2 (IC50)
CE9.1	20ng/ml	5 ng/ml
CE9 gamma 4	20 ng/ml	5 ng/ml
CE9 gamma 4E	20ng/ml	10 ng/ml
CE9 gamma 4lambda kappa	20 ng/ml	20 ng/ml
CE9 gamma 4PE	20 ng/ml	ND

Concluzii

Toți anticorpii mAb sunt echivalenți în ceea ce privește inhibarea MLR. 17

Proprietățile de legare a anticorpilor mAb de receptorul Fc. Validarea testului de determinare a legării receptorului Fc 19

CE9 gamma 4PE a fost desemnat ca fiind lipsit de activități de legare a FcR. Pentru a măsura această activitate, s-a realizat un test pe bază de atașare mediată de FcR și ata- 21 șare mediată de CD4 a celulelor prin crearea de punți prin intermediul anticorpilor mAb.

Acest test măsoară simultan funcțiunile de legare de FcR și de CD4 a anticorpilor mAb, ca 23 o corelare in vitro a FcR și a depleției mediată de mAb a celulelor GD4 in vivo.

Fig. 21 demonstrează că CE9.1 facilitează adeziunea celulelor monocitare, care 25 exprimă FcR (celulele THP-1 induse de gamma -IFN), la fibroblastele CD4⁺ (linia celulară de fibroblaste transfectate CD4), într-un test de adeziune. Legarea este dependentă de dome- 27 niile Fc ale mAb CE9.1, întrucât F(ab') trunchiat nu a putut facilita legarea. Legarea necesită, de asemenea, situsul de recunoaștere a antigenului al CE9.1, deoarece ocuparea sa cu 29 sCD4 blochează atașarea celulă-celulă.

Determinarea activităților anticorpului mAb de legare a receptorului Fc. 31

Anticorpii mAb CE9.1 (IgGI), CE9 gamma 4 (lgG4), CE9 gamma 4lambda kappa (lgG4 lambda kappa hibrid), CE9 gamma 4E (lgG4 mutant E) și CE9 gamma 4PE (lgG4 mu- 33 tant PE) sunt evaluați pentru capacitatea lor de a lega, în mod simultan, CD4, de la suprafața celulelor, și FcR. 35

Așa cum s-a sperat, CE9.1 a avut o activitate bună de legare în acest test. în mod surprinzător, constructele CE9 gamma 4 și CE9 gamma 4lambda kappa ale lgG4 au reținut 37 suficientă afinitate pentru FcR pentru ca aceștia să poată fi distinși de CE9.1 prin acest test. Activitatea în acest test este pierdută numai când substituția E” este introdusă ca în CE9 39 gamma 4E și CE9 gamma 4PE (vezi fig. 22)

Proprietățile CE9 gamma 4PE de legare în vitro a C1q 41

Sistemul complement conține, printre diferitele sale componente funcționale, capacitatea de a interacționa cu anumite tipuri de anticorpi într-o manieră care conduce la liza și 43 distrugerea celulei. Anticorpii IgG 1 umani posedă, în mod normal, capacitatea de a lega Clq și de depleție a celulelor țintă, care poartă antigenele de suprafață pentru care au specifici- 45 tate alte izotipuri umane, astfel că lgG4 prezintă capacitate redusă de a lega Clq și, astfel, vor fi incapabile de depleția celulelor țintă. Ingineria lui CE9 gamma 4PE într-un construct 47 gamma 4 ar putea, teoretic, să realizeze obiectivele de prevenire a fixării complementului și ar putea permite anticorpului să se lege la celulele țintă CD4, eliminând potențialele efecte 49 secundare distructive.

RO 120198 Β1

Compararea proprietăților efectoare CDC ale CE9 gamma 4PE și CE9.1 este realizată utilizând metodele clasice de citoliză mediată de complement a celulelor SupT1 CD4⁺, marcate cu crom în prezența complementului de iepure. în aceste studii, este utilizat drept control pozitiv un complement de murină, care fixează mAb la HuCDA, 4D9 (lgG2a) a fost utilizat ca un control pozitiv. Atât CE9.1, cât și CE9 gamma 4PE sunt ineficienți în fixarea complementului de iepure (fig. 23). S-a subliniat mai înainte că CE9.1 leagă slab C1q și astfel este incapabil de a fixa complementul uman. Aceste rezultate arată că ambele constructe sunt incapabile să inițieze liza celulelor prin mecanismele efectoare ale complementului.

Proprietățile CE9 gamma 4PE efectoare ADCC in vitro

Celulele cu potențial citotoxic, care pot lega anticorpii mAb prin intermediul FcR, pot să medieze ADCC direcționat împotriva celulelor țintă acoperite cu anticorp. Celulele T helper umane, care exprimă molecula CD4, sunt recunoscute de către anticorpul mAb CE9.1, care declanșază atacul citolitic, prin celulele killer purtătoare de FcR, granulocitele și/sau macrofage. Obiectivul ingineriei CE9 gamma 4PE este de a îndepărta capacitatea anticorpului mAb de a se lega la FcR, care va elimina capacitatea celulelor auxiliare pentru a media depleția celulelor țintă CD4, în timp ce permite încă anticorpului mAb să rămână imunosupresiv.

Compararea proprietăților efectoare ADCC ale CE9 gamma 4PE și CE9.1 este realizată utilizând metodele clasice ale citolizei mediate celular a celulelor SupTI CD4⁺ marcate cu crom. Drept control pozitiv a fost ales anticorpul de murină mAb CD 4, 4D9 (lgG2a, K). Celulele efectoare sunt leucocite din sânge periferic uman, obținute de sub piele. Fig. 12 arată capacitatea atât a anticorpului mAb 4D9, cât și a CE9.1 de a media liza specifică a celulelor CD4⁺. în condiții identice, CE9 gamma 4PE are efect foarte slab.

Aceste rezultate arată că CE9 gamma 4PE este incapabil să medieze liza celulelor fie prin FcR, fie prin mecanismele complementului.

Exemplul 7. Analiza P kappa comparativă CE9 gamma 4E și CE9 gamma 4PE

Farmacocineticile comparative ale celor doi anticorpi derivație mAb Iambda4, CE9 gamma 4E și CE9 gamma 4PE sunt investigate la șobolani masculi Sprague-Dawley. Se administrează CE9 gamma 4E și CE9 gamma 4PE ca o doză bolus intravenos de 1 mg/kg (patru animale per grup), sau se iau probe de sânge timp de 4 săptămâni după luarea dozei. Concentrațiile de CE9 gamma 4E și CE9 gamma 4PE din plasmă sunt determinate utilizând un test ELISA sADNwich sCD4/anti-lgG umană, desemnat să confirme capacitatea de a lega CD4 solubil uman recombinant.

Urmând unei administrări de bolus intravenos de 1 mg/kg de mAb CD4, concentrațiile de CE9 gamma 4E în plasmă au scăzut într-o manieră trifazică și concentrațiile CE9 gamma 4PEîn plasmă au scăzut în manieră bifazică. (fig. 24). Pentru scopuri comparative și datorită unui număr insuficient de date în faza terminală descrisă în mod adecvat pentru CE9 gamma 4E, toate profilurile concentrație în plasmă-timp sunt analizate utilizând un model bifazic. Se observă o variabilitate mică între subiecți. Timpul de înjumătățire predominant t/2 al fazei a doua este de aproximativ 4 zile pentru CE9 gamma 4E și 9 zile pentru CE9 gamma 4PE, și considerat ca 67% și, respectiv, 93% din suprafața totală, sub curba concentrație în plasmătimp. Viteza de dispariție aparentă din plasmă pentru CE9 gamma 4PE a fost mică (6,4 ml/h/kg) și a fost aproximativ jumătate cea a CE9 gamma 4E (1,0 ml/h/kg). Astfel, caracteristicile farmacocinetice ale anticorpului mAb gamma 4 mutant PE, CE9 gamma 4PE, sunt similare cu ale altor anticorpi mAb gamma 1 umanizați la șobolani.

Timpul de înjumătățire în marea circulație a CE9 gamma 4PE intact funcțional la șobolan sugerează, de asemenea, că CE9 gamma 4PE este posibil să fie eficient pe o perioadă extinsă de timp, când se administrează la om.

RO 120198 Β1

Aceste rezultate confirmă că CE9 gamma 4PE mutant PE are o rată de dispariție din 1 plasmă mai mică de 2 ori și un timp de înjumătățire mai mare decât CE9 gamma E mutant la șobolani. 3

Tabelul 5

Parametrii farmacocinetici (Medie ± SD) a CE9 gamma 4E și CE9 gamma 4PE care 5 urmează administrării unui bolus intravenos de 1 mg/kg la șobolani Sprague-Dawley

mAbCD4	CL(ml/h/kg)	AUCo^nf (pgx h/ml)	MRT (h)	V (h)	V (h)	%AUC2	Vss (ml/kg)
CE9 gamma 4E	0,999±137	1010±130	109±12	15,2±3,0	97,7±29,5	55,7±14,2	109±14
CE9 gamma 4E	1,32±0,30	760±138	79,5±16,0	16,6±6,9	95,3±30,8	52,1±20,0	103±18
CE9 gamma 4E	0,410±0,074	2500±440	295±43	9,9±3,3	224±33	93,4±2,2	119+16

Prescurtările parametrilor farmacocinetici:

CL= viteza de dispariție din plasma totală; 17

AUC_Odnf = suprafața totală sub curba concentrației în plasmă, funcție de timp;

MRT = timp mediu de staționare; 19

T_l/2'¹ = timpul de înjumătățire aparent, în faza inițială;

T_1/2 ² = timpul de înjumătățire aparent, în faza a doua; 21 %AUC₂ = procent al suprafeței de sub curba concentrației în plasmă, în funcție de timp, în cea de a doua fază; 23

V_ss = volumul distribuției în etapa stabilă.

Bazat pe aceste rezultate, CE9 gamma 4PE ar trebui să fie adecvat pentru utilizare în terapie, de exemplu prin administrare intravenoasă. De asemenea, pot fi adecvate și alte 27 căi de administrare.

Exemplul 8. Studii farmacologice in vivo pe șoareci transgenici hucd4* 29

Descrierea șoarecilor transgenici HuCD4

Introducere 31

Gradul înalt al specificității specie-specifică a CE9.1 și CE9 gamma 4PE complică evaluarea eficienței in vivo. Pentru CE9.1, răspunsul farmacologic ar putea fi monitorizat ușor 33 la cimpanzei, printr-o depleție a celulelor CD4⁺ dependentă de doză. Absența așteptată a acestei activități în CE9 gamma 4PE ne-a determinat să utilizăm alte mijloace de evaluare 35 a eficienței. în particular, eficiența este evaluată la șoareci transgenici HuCD4. Studiile în acest sistem sunt descrise mai jos. 37

Transgenici HuCD4⁺

La șoareci transgenici HuCD4, dezvoltați la UCSF (Killeen și colab. EMBO J., 12; 39

1547-53 (1993)), gena MuCD4 endogenă este distrusă prin recombinare omoloagă și o minitransgenă CD4 umană este introdusă sub controlul promotorului MuCD4. La acești șoareci, 41 care au fost acum crescuți prin încrucișare până la homozigotare, HuCD4 substituie MuCD4.

HuCD4 reface selecția pozitivă și negativă în timus, reglând producerea numai a celulelor 43 T periferice pozitive CD4⁺ sau CD8⁺, la niveluri comparabile cu cele găsite la șoareci normali, în plus, comparativ cu celulele MuCD4 scoase din competiție, celulele mature T HuCD4 45 demonstrează proprietăți înrudite cu cele ale echivalentelor lor normale de la murină; (1) in vivo, nivelurile de IgG din ser sunt refăcute la nivelurile normale, și (2), aceste animale arată 47 răspunsuri adecvate, dependente de CMH RMN in vitro.

RO 120198 Β1

Fundamentul genetic al acestor șoareci este întrucâtva complex, datorită necesității de a utiliza tulpini diferite de celule stern embrionare și de șoareci, și în experimentele originale, de a elimina din competiție, și în experimentele transgenice. Șoarecii originari eliminați din competiție/transgenici sunt crescuți ulterior până la homozigotare, pentru locusul MHC, și șoarecii în utilizare curentă la SB sunt de haplotip H-2^dd.

Rezultatele au arătat că un răspuns bun la un antigen străin, ovalbumina, este obținut la acești șoareci HuCD4, și studiile inițiale au demonstrat activitatea in vivo pentru CE9 gamma 4PE.

Evaluarea preliminară a CE9 gamma 4PE la șoareci transgenici HuCD4

S-au primit doisprezece șoareci transgenici HuCD4 (H-2^dd) și au fost utilizați pentru a compara CE9 gamma 4PE cu IF3 (anti-CD4 uman de la murină) și GK1.5. Șoarecii au primit doze în ziua -2, -1 și ziua 0, de 1 mg de anticorp, administrat intraperitoneal, și s-au imunizat cu OVA, timp de 3 h, după care urmează ultima doză. Șoarecii sunt sacrificați două săptămâni mai târziu și serul și celulele sunt evaluate pentru activitatea funcțională. Răspunsul anticorpului specific-OVA este prezentat în fig. 25. Așa cum s-a așteptat, anticorpul mAb la șoarecele CD4 (GK1.5) nu are efect asupra răspunsului umoral, în timp ce ambii mAb au blocat acest răspuns la HuCD4. CE9 gamma 4PE este cel mai dramatic din cei doi anticorpi mAb.

Toate grupele de șoareci au răspuns la Con A și la LS, totuși există anumite variații în răspuns la ovalbumină și în MLR. Aceasta se poate datora faptului că acest lot de animale conține atât șoareci masculi, cât și șoareci femele, și că au vârste diferite.

Șoarecii MuCD4-/-(CD4 eliminați din competiție) și HuCD4 +/+ (șoareci transgenici) sunt tratați cu CE9.1, CE9 gamma 4PE sau ser. Studiile au fost conduse pe o perioadă de 28 de zile, cu probele luate în zilele 1, 3, 7, 14 și 28. Analiza citometrică în flux continuu, cu trei culori, a splenocitelor de la acești șoareci, este utilizată pentru a urmări evoluția celulelor T CD4⁺ și CD8⁺. Pentru a examina nivelurile celulei T sunt utilizați următorii anticorpi: CD3PE, OKT4-FITC, CD8-TC. Pentru a urmări soarta celulelor T și B la acești șoareci, sunt utilizați următorii anticorpi: CD3-PE, CD2-FITC, CD45-TC. Pentru a urmări evoluția celulelor acoperite cu CE9.1 sau cu CE9 gamma 4PE, sunt utilizate gamele de mAb care urmează: OKT4-PE, Leu 3a-FITC, CD3-TC.

Datele au arătat că atât în șoarecii transgenici tratați cu CE9.1, cât și în cei tratați cu CE9 gamma 4PE (HuCD4 +/+), toate celulele CD4⁺ au fost acoperite cu anticorp în ziua 1. Acoperirea persistă câteva zile și nu mai este detectabilă începând cu ziua 28. Numărul total de celule CD4⁺ tratate în șoarecii tratați cu CE9.1 descrește în mod semnificativ, chiarîn ziua 28. în contrast cu aceasta, șoarecii tratați cu CE9 gamma 4PE nu arată o descreștere în numărul total de celule CD4⁺. Ambii anticorpi indică evidența modulării receptorului CD4. Deși există a creștere reciprocă în procentul celulelor CD8⁺la șoarecii tratați cu CE9.1, nu a existat nici o dovadă că aceste numere absolute au fost afectate de tratament. Numerele celulelor CD4⁺ au fost, de asemenea, neafectate la șoarecii tratați cu CE9 gamma 4PE. în toate experimentele cu oricare din anticorpi, numărul celulelor B a rămas constant.

Studii in vivo la cimpanzei

Sunt examinați 6 cimpanzei pentru depleția celulelor T CD4⁺și/sau modularea receptorilor CD4 de la suprafața celulelor, după infuzii ale unor doze crescânde de anticorp CE9 gamma 4PE, de până la 15 mg/kg. Se colectează probe de sânge periferic de la fiecare cimpanzeu, cu trei și cu două săptămâni înainte de începerea studiului, pentru a stabili nivelurile de bază ale celulelor T CD4⁺. în plus față de celulele CD4⁺, se măsoară, de asemenea, nivelurile celulelor CD3⁺ și CD8⁺, prin citometrie, în flux continuu. Se utilizează drept control mAb OKT4, care se leagă la o regiune diferită a moleculei CD4 și care nu intră în competiție

RO 120198 Β1 pentru legare cu CE9 gamma 4PE. Prin scăderea numărului CD8⁺ din numărul total de CD3⁺, 1 se poate calcula o valoare teoretică a numărului celulelor T CD4⁺. Prin compararea acestei valori cu celulele CD4⁺ măsurate față de OKT4, modularea receptorului CD4 a putut fi 3 distinsă de depleția celulelor CD4⁺.

La începutul acestui studiu, fiecare cimpanzeu primește o infuzie intravenoasă de 5 soluție salină. Se colectează probe de sânge imediat după infuzie și 3 și 14 zile mai târziu.

Se infuzează fiecărui cimpanzeu CE9 gamma 4PE (0,05 mg/kg) și se colectează probele de 7 sânge la 3 și 14 zile după aceea. Celulele CD4⁺ se monitorizează și, dacă se încadrează în limite normale, se administrează următoarea doză de CE9 gamma 4PE. în ansamblu, fiecare 9 cimpanzeu primește următorul protocol: soluție salină, 0,05 mg/kg CE9 gamma 4PE,

1,5 mg/kg CE9 gamma 4PE, soluție salină, 15 mg/kg CE9 gamma 4PE. 11

Nu se observă efecte asupra nivelurilor CD4 după infuzie cu soluție salină sau cu CE9 gamma 4PE la 0,05 mg/kg. La 1,5 mg/kg se observă învelirea celulelor cu CD4⁺ și o 13 modulare tranzitorie și parțială a receptorilor CD4 de la suprafața celulelor, deși nu se observă depleția celulelor CD4⁺. La 15 mg/kg de CE9 gamma 4PE nu se observă depleția 15 celulelor CD4⁺ la nici un animal, deși se observă modulare semnificativă la toate animalele.

Efectul modulator este tranzitoriu și revine la normal în 14 până la 21 zile. Nu se observă nici 17 un efect advers la nici un animal. Se poate detecta CE9 gamma 4PE la suprafața celulelor până la două zile după administrare și în ser. 19

CE9 gamma 4PE este desemnat să fie un anticorp de non depleție și nu s-a observat la nici un animal depleție, nici chiar la doze relativ mari de 15 mg/kg. CE9 gamma 4PE este 21 stabil în serurile cimpanzeilor și rămâne în circulație timp de până la 21 de zile.

Utilizare 23

Anticorpii produși în maniera descrisă mai sus sau prin tehnici echivalente pot fi purificați printr-o combinație a cromatografiei de afinitate cu cromatografia de excluziune sterică 25 pentru caracterizare, prin testele biologice funcționale. Aceste teste includ determinarea specificității și afinității de legare și, în aceeași măsură, includ funcția efectoare, asociată cu izo- 27 tipul exprimat, de exemplu ADCC, sau fixarea complementului. Astfel de anticorpi pot fi utilizați ca agenți terapeutici pasivi sau activi, împotriva unui număr de boli umane care implică 29 exprimarea CD4, și celulele T, incluzând celula B de limfom, bolile infecțioase incluzând SIDA, bolile autoimune și inflamatorii și transplantele. Anticorpii pot fi utilizați fie în forma lor 31 nativă, fie ca părți ale unui complex anticorp/chelat, anticorp/medicament, anticorp/toxină. în plus, anticorpii întregi sau fragmentele de anticorpi (Fab₂, Fab, Fv) pot fi utilizați ca reactivi 33 de imagine sau ca vaccinuri sau imunogene potențiale în imunoterapia activă, pentru generarea răspunsului antiidiotipic. 35

Cantitatea de anticorp utilă pentru a produce un efect terapeutic poate fi determinată prin tehnici standard bine cunoscute specialiștilor în domeniu. Anticorpii vor fi, în general, 37 furnizați prin tehnici standard, într-un tampon acceptabil farmaceutic, și pot fi administrați pe orice cale dorită. Datorită eficienței și toleranței de către om a anticorpilor revendicați în pre- 39 zenta invenție, este posibil să se administreze acești anticorpi în mod repetat, cu scopul de a combate diferite boli sau stări de boală la un om. 41

Anticorpii anti-CD4 recombinanți (sau fragmente ale acestora) sunt, de asemenea, folositori pentru inducerea imunomodulării, de exemplu, inducând supresarea sistemului 43 imun uman sau animal. De aceea, această invenție se referă la o metodă de inducere a imunomodulării în mod profilactic sau terapeutic, la un om sau la un animal care necesită 45 aceasta, prin administrarea unei cantități eficiente, netoxice, dintr-un astfel de anticorp al prezentei invenții, la un asemenea om sau animal. 47

RO 120198 Β1

Capacitatea compușilor prezentei invenții de a induce irnunomodularea poate fi demonstrată prin teste standard utilizate în acest scop, de exemplu, un test al reacție himfocitare mixte sau un test care măsoară inhibarea proliferării celulei T prin absorbția detimidină.

Faptul că anticorpii prezentei invenții au utilizare în inducerea imunosupresiei înseamnă că aceștia sunt folositori în tratamentul sau prevenirea rezistenței la sau în respingerea organelor sau țesuturilor transplantate (de exemplu rinichi, inimă, plămâni, măduva spinării, piele, cornee), în tratamentul sau prevenirea bolilor autoimune, inflamatorii, proliferative și hiperproliferative, și ale manifestărilor cutanate ale bolilor mediate imunologic (de exemplu, artrite reumatoide, lupus eritematos, lupus eritematos sistemic, tiroidită Hashimoto, scleroză multiplă, miastenie gravis, diabet tip 1, uveită, sindrom nefrotic, psoriazis, dermatite atopice, dermatite de contact și, în plus, dermatitele eczematiforme, dermatite seboreice, Lichen planus, Pemplugus, pemphicjusbullous, epidermoliză buloasă, urticarie, angioedeme, vasculitite, eritem, eozinofilie cutanată, alopecie areată), în tratamentul bolilor obstractive reversibil ale căilor respiratorii, inflamațiilor și alergiilor intestinale (de exemplu, boiaCoeliac, proctită, gastroenterită eozinofilică, mastocitoză, boala Crohn și colită ulcerantă) și alergii legate de alimentație (de exemplu migrene, rinite și eczeme). De asemenea, anticorpii în discuție au utilitate în tratamentul stărilor neautoimune, în care irnunomodularea este dorită, de exemplu, printre altele, sunt: boala grefa-contra-gazdă (GVHD), respingere transplant, astm, HIV, leucemie, limfom.

Un specialist în domeniu va putea, datorită experienței sale, să determine ce cantitate de anticorp este eficientă, netoxică, în scopul inducerii imunopresiei. Totuși, în general, un dozaj eficient va fi în domeniul de la circa 0,05 la 100 mg/kg greutate corp/zi.

Anticorpii (sau fragmente ale acestora) conform prezentei invenții ar trebui, de asemenea, să fie folositori pentru tratarea tumorilor la un mamifer. Mai specific, aceștia artrebui să fie folositori pentru reducerea dimensiunii tumorii, să inhibe dezvoltarea tumorii și/sau să prelungească viața animalelor care sunt purtătoare de tumori. în concordanță cu acestea, prezenta invenție se referă, de asemenea, la o metodă de tratare a tumorilor la om sau animal, prin administrarea unei cantități eficiente, netoxice, dintr-un anticorp. Un specialist în domeniu va fi capabil, datorită experienței de rutină, să determine ce cantitate dintr-un anticorp va fi eficientă, netoxică, pentru tratarea tumorilor carcinogene. Totuși, în general, un dozaj eficient este de așteptat să fie în domeniul de la circa 0,05 la 100 mg/kg greutate corp/zi.

Anticorpii conform invenției pot fi administrați la un om sau la un animal, în concordanță cu metodele de tratament menționate anterior, într-o cantitate suficientă pentru a produce un astfel de efect la un nivel terapeutic sau profilactic. Astfel, anticorpii prezentei invenții pot fi administrați la om și animale într-o formă de dozaj convențională, preparată prin combinarea anticorpului invenției cu un purtător sau un diluant acceptabil farmaceutic convențional, conform cu tehnicile cunoscute. Va fi recunoscut de către specialiștii în domeniu că forma și caracteristicile purtătorului sau diIuantului acceptabil farmaceutic sunt dictate de cantitatea de ingredient activ cu care este combinată, cu calea de administrare și de alte variabile bine cunoscute.

Calea de administrare a anticorpului (sau a fragmentelor acestuia) invenției poate fi orală, parenterală, prin inhalare sau topică. Termenul parenteral așa cum s-a utilizat aici include: administrarea intravenoasă, intramusculară, subcutanată, rectală, vaginală sau intraperitoneală. Sunt, în general, preferate calea subcutanată și cea intramusculară a administrării parenterale

Regimurile zilnice de dozaj parenteral sau oral, pentru compușii conform invenției, folosiți pentru imunosupresia indusă profilactic sau terapeutic, sau pentru tratarea tumorilor carcinogene, vorfi, în general, în domeniu cuprins între 0,05 până la 100, dar de preferință de la circa 0,5 până la 10 mg/kg greutate corp/zi.

RO 120198 Β1

Anticorpul conform invenției poate fi, de asemenea, administrat prin inhalare. Forme 1 de dozaj potrivite pentru o astfel de administrare, sub formă de aerosol sau o doză măsurată pentru inhalare, pot fi preparate prin tehnici convenționale. Cantitatea de dozare preferată 3 pentru un compus al invenției este în domeniul 10 până la 100 mg.

Anticorpul conform invenției poate fi administrat, de asemenea, pe cale topică. Prin 5 administrare topică se înțelege administrarea nesistemică și aceasta include aplicarea unui anticorp (sau a fragmentelor acestuia), compus al prezentei invenții, în exterior, pe epidermă, 7 în cavitatea bucală, precum și instilarea unui asemenea anticorp în ureche, ochi sau nas, și acolo unde nu este semnificativă pătrunderea în circuitul sanguin. Prin administrare siste- 9 mică se înțelege administrarea orală, intravenoasă, intraperitoneală și intramusculară. Cantitatea dintr-un anticorp necesară pentru obținerea unui efect terapeutic sau profilactic va 11 varia, desigur, în funcție de anticorpul ales, de natura și gravitatea bolii care trebuie tratată și de animalul care suportă tratamentul, și este, în final, la dispoziția medicului curant. O 13 doză topică adecvată dintr-un anticorp va fi, în general, în domeniul de la circa 1 la 100 mg/kg greutate corp/zi. 15

Formulări în timp ce un anticorp sau un fragment al acestuia poate fi administrat singur, este 17 de preferat ca acesta să fie prezentat ca o formulare farmaceutică. Ingredientul activ poate cuprinde, pentru administrare topică, de la 0,001 la 10% greutate/greutate, de exemplu, de 19 la 1 la 2%, în greutatea formulării, deși poate cuprinde la fel de mult ca 10% greutate/ greutate, dar, preferabil, în exces de 5% greutate/greutate și, mai preferabil, de la 0,1 la 1% 21 greutate/greutate din formulare.

Formulările topice, conform prezentei invenții, cuprind un ingredient activ împreună 23 cu unul sau mai mulți purtători acceptabili pentru acesta și, în mod opțional, un alt ingredient (ți) terapeutic(i). Purtătorul(ii) pot fi acceptabili în sensul de a fi compatibil(i) cu alți ingre- 25 dienți ai formulării și de a nu fi periculos pentru destinatarul acestuia.

Formulările adecvate pentru administrare topică includ preparate lichide sau semi- 27 lichide, adecvate pentru penetrarea prin piele în locurile unde este necesartratamentul, cum ar fi alifii, loțiuni, creme, unguente sau paste și picături adecvate administrării la ochi, în 29 urechi și nas.

Picăturile conform prezentei invenții pot să cuprindă soluții apoase sau uleioase, sau 31 suspensii sterile, care pot fi preparate prin dizolvarea ingredientului activ într-o soluție apoasă adecvată, a unui agent bactericid și/sau fungicid, și/sau alt conservant adecvat, și, 33 de preferință, incluzând un agent activ de suprafață. Soluția care rezultă poate fi limpezită prin filtrare, transferată într-un recipient adecvat, care este apoi sigilat, sterilizat prin autocla- 35 vare la 90...100°C timp de 1,5 h. în mod alternativ, soluțiile pot fi sterilizate prin filtrare și transferare, într-un container, printr-o tehnică aseptică. Exemple de agenți bactericizi și fungi- 37 cizi, adecvați pentru includerea în picături, sunt nitratul sau acetatul fenilmercuric (0,002%), clorura de benzalconiu (0,01 %) și acetatul de clorhexidină (0,01 %). Solvenți adecvați pentru 39 prepararea de soluții uleioase includ glicerina, alcoolul diluat și propilen glicolul.

Loțiunile conform prezentei invenții includ pe acelea adecvate pentru o aplicare pe 41 piele sau pe ochi. O loțiune pentru ochi poate cuprinde o soluție aposă sterilă, conținând, opțional, un bactericid, și poate fi preparată prin metode similare acelora pentru prepararea 43 picăturilor. Loțiunile sau alifiile pentru aplicare pe piele pot să cuprindă, de asemenea, un agent pentru a accelera uscarea și pentru a răcori pielea, ca un alcool sau o cetonă și/sau 45 un umectant, glicerină sau ulei, ulei de ricin sau ulei de arahide.

Cremele, unguentele sau pastele conform cu prezenta invenție sunt formulări semi- 47 solide de ingredienți activi, pentru aplicații externe. Acestea pot fi preparate prin amestecarea

RO 120198 Β1 ingredientului activ într-o formă fin divizată sau pulverulentă sau într-o soluție sau o suspensie dintr-un fluid apos sau neapos, cu adăugarea de mașini adecvate, cu o bază grasă sau lipsită de grăsime. Baza poate cuprinde hidrocarburi ca parafină grea, ușoară sau lichidă, glicerină, ceară de albine, un săpun de metal, un mucilagiu, un ulei de origine naturală, ca uleiul de migdale, de porumb, de arahide, de ricin sau de măsline, lanolină sau derivații săi, sau un acid gras, cum ar fi acidul stearic sau oleic, împreună cu un alcool ca propilen glicol sau macrogeluri. Formularea poate să încorporeze orice agent activ de suprafață adecvat, ca un agent activ de suprafață anionic, cationic sau neionic, eteri de sorbitan sau derivați de polioxietilenă ai acestuia. Agenți de suspendare, ca gume naturale, derivați de celuloză sau materiale anorganice, cum ar fi silice silicică, și alți ingredienți, ca lanolină, pot fi, de asemenea, incluși.

Va fi recunoscut de specialiștii în domeniu că o cantitate optimă și distanța dintre dozele individuale de anticorp sau de fragment de anticorp conform invenției vor fi determinate de natura și de extinderea bolii care este tratată, de forma, calea și locul administrării și de animalul tratat, și că astfel de valori optime pot fi determinate prin tehnici convenționale. Va fi, de asemenea, de apreciat de către un specialist în domeniu cursul optim al tratamentului, adică numărul dozelor dintr-un anticorp sau dintr-un fragment al acestuia, conform invenției, date per zi, pentru un număr definit de zile, ce poate fi stabilit de către specialist, utilizând teste convenționale de determinare a cursului tratamentului.

Fără alte experimente, se crede că un specialist în domeniu poate, folosind descrierea precedentă, să utilizeze prezenta invenție la întreaga sa întindere. De aceea, exemplele care urmează sunt date în scop ilustrativ, fără a limita întinderea protecției solicitate.

Compoziție pentru capsulă

O compoziție farmaceutică conform invenției, sub formă de capsule, se prepară prin umplerea unei capsule standard tari de gelatină, având două compartimente, cu 50 mg dintr-un anticorp sau dintr-un fragment de anticorp conform prezentei invenții, sub formă pulverulentă, 100 mg de lactoză, 32 mg de talc și 8 mg de stearat de magneziu.

Compoziții parenterale injectabile

O compoziție farmaceutică a acestei invenții într-o formă adecvată pentru administrare prin injectare este preparată prin agitarea a 1,5% în greutate anticorp conform prezentei invenții, sau un fragment al acestuia, în propilen glicol 10%, în volume și apă. Soluția este sterilizată prin filtrare.

Compoziție pentru unguent

Se utilizează 1,0 g anticorp sau un fragment al acestuia, conform prezentei invenții, și până la 100,0 g parafină albă ușoară.

Anticorpul conform invenției sau fragmentul acestuia se dispersează într-un mic volum de vehicul, pentru a produce un produs omogen fin. Tuburi metalice deformabile sunt apoi umplute cu această dispersie.

Compoziție topică de cremă

Anticorp conform invenției sau un fragment al acestuia 1,0 g

Polawax GP 200 20,0 g

Lanolină anhidră 2,0 g

Ceară albă de albine 2,5 g

Hidroxibenzoat de metil 0,1 g

Apă distilată până la 100,0 g.

RO 120198 Β1

Materiile prime Polawax, ceara de albine și lanolina se încălzesc la 60’C. Se adaugă 1 apoi o soluție de hidroxibenzoat de metil și omogenizarea se realizează utilizând un agitator cu viteză mare. Apoi temperatura se lasă să scadă la 50“C. Se adaugă după aceea anti- 3 corpul conform prezentei invenții sau un fragment al acestuia, iar compoziția obținută se lasă la răcit, sub agitare slabă. 5

Compoziție de lotiune topică 7

Anticorp conform invenției sau un fragment al acestuia 1,0 g

Monolaurat de sorbitan 0,6 g 9

Polisorbat 20 0,6 g

Alcool cetostearic 1,2 g 11

Glicerină 6,0 g

Hidroxibenzoat de metil 0,2 g. 13

Apă purificată (B.P.) până la 100,0 ml (B.P. = British Pharmacopeia). 15

Hidroxibenzoatul de metil și glicerina se dizolvă în 70 ml de apă la 75°C. Monolauratul de sorbitan, polisorbat 20 și alcoolul cetostearilic sunt topiți împreună la 75°C și apoi adău- 17 gați la soluția apoasă. Emulsia care rezultă este omogenizată, lăsată să se răcească sub agitare continuă și apoi se adaugă anticorpul sau un fragment al acestuia, conform invenției, 19 sub forma unei suspensii, în apa rămasă. întreaga suspensie se agită până la omogenizare.

Compoziție de picături pentru ochi

Anticorp conform invenției sau un fragment al acestuia 0,5 g 23

Hidroxibenzoat de metil 0,01 g

Hidroxibenzoat de propil 0,04 g 25

Apă purificată (B.P.) până la 100,00 ml.

Hidroxibenzoații de metil și de propil sunt dizolvați în 70 ml de apă purificată, la 75°C.

Soluția care rezultă se lasă la răcire. Se adaugă apoi anticorpul sau un fragment al acestuia, 29 conform prezentei invenții, și soluția este sterilizată prin filtrare, printr-un filtru membrană (dimensiunea porilor 0,022 pm) și ambalată în condiții aseptice, în containere sterile adecvate. 31

Compoziție pentru administrare prin inhalare

Pentru un recipient cu aerosol, de capacitate de la 15...20 ml: se amestecă 10 mg 33 dintr-un anticorp sau un fragment din acest anticorp, conform prezentei invenții, cu 0,2-0,5% agent lubrifiant, ca Polisorbat 85 sau acid oleic, și se dispersează amestecul obținut într-un 35 agent propelant, ca freonul, preferabil într-o combinație de 1,2 diclortetrafluoretan și difluorclormetan, și se pune într-un recipient pentru aerosol potrivit, adaptat fie pentru administrare 37 intranazală, fie pentru inhalare orală. Compoziție pentru administrare prin inhalare, pentru un recipient cu aerosol cu o capacitate de 15...20 ml: se dizolvă 10 mg de anticorp sau un 39 fragmentdin acest anticorp confom prezentei invenții, în 6-8 ml etanol, se adaugă 0,1 ...0,2% agent lubrifiant, ca Polisorbat 85 sau acid oleic; se dispersează amestecul obținut într-un 41 agent propelant, ca freonul, preferabil într-o combinație de 1,2 diclortetrafluoretan și difluorclormetan, și se pune într-un recipient pentru aerosol potrivit, adaptat fie pentru administrare 43 intranazală, fie pentru administrarea orală a inhalației.

Anticorpii și compozițiile farmaceutice ale prezentei invenții sunt, în particular, utile 45 pentru administrare parenterală, adică subcutanat, intramuscular sau intravenos. Compozițiile pentru administrare parenterală vor cuprinde, de obicei, o soluție de anticorp sau un 47 fragmentdin acest anticorp conform prezentei invenții, sau un amestec al acestora, dizolvat

RO 120198 Β1 într-un purtător acceptabil, preferabil un purtător apos. Pot fi folosiți o varietate de purtători în soluție apoasă, ca, de exemplu, apă, apă tamponată, soluție salină 0,4%, glicină 0,3% și altele asemenea. Aceste soluții sunt sterile și, în general, libere de o anume substanță. Aceste soluții potfi sterilizate prin tehnici de sterilizare convenționale bine cunoscute. Compozițiile pot conține substanțe auxiliare acceptabile farmaceutic, necesare pentru realizarea condițiilor fiziologice, ca agenți de corectare a pH-ului și agenți tampon. Concentrația de anticorp sau a fragmentului acestuia, conform prezentei invenții, variază în limite foarte largi, de exemplu, de la mai puțin de circa 0,5%, în mod obișnuit, la, sau la cel puțin circa 1%, la aproape 15 sau 20% în greutate, și vor fi selectate în primul rând pe baza volumelor de fluid, a vâscozității, conform cu tipul particular de administrare selectată.

Astfel, o compoziție farmaceutică conform invenției, pentru injectare intra mu seu Iară, poate fi preparată astfel încât să conțină 1 ml apă tamponată sterilă și 50 mg dintr-un anticorp sau un fragment al acestuia, conform invenției. în mod similar, o compoziție farmaceutică conform invenției, pentru infuzie intravenoasă, poate fi preparată astfel încât să conțină 250 ml de soluție sterilă Ringer și 150 mg dintr-un anticorp sau un fragment al acestuia, conform invenției. Metodele actuale pentru prepararea compozițiilor administrabile parenteral sunt bine cunoscute sau vorfi evidente specialiștilorîn domeniu și sunt descrise mai detaliat, de exemplu, în Remington's Pharmaceutical Science, 15 th ed. Mack Publishing Company Easton, Pennsylvania, încorporată printre referințe.

Anticorpii (sau fragmente ale acestora) conform prezentei invenții potfi liofilizați pentru depozitare și reconstituire, apoi cu un purtător adecvat, înainte de utilizare. Această tehnică s-a arătat a fi eficientă cu imunoglobulinele convenționale și pot fi folosite tehnicile de liofilizare și de reconstituire cunoscute în domeniu.

în funcție de rezultatul care se intenționează, compoziția farmaceutică conform invenției poate fi administrată pentru tratamente profilactice și/sau terapeutice. în aplicațiile terapeutice, compozițiile sunt administrate la un pacient care deja suferă de o boală, într-o cantitate suficientă pentru a elimina sau cel puțin pentru a împiedica evoluția bolii și complicațiile sale. în aplicațiile profilactice, compozițiile conținând anticorpii prezenți sau amestecuri ale acestora sunt administrate la un pacient care nu se află într-o stare de boală, pentru a mări rezistența acestuia.

Administrări singure sau multiple ale compozițiilor farmaceutice pot fi conduse la niveluri de doze și la etaloane selectate prin tratamentele efectuate de medicul curant. în orice caz, compoziția farmaceutică conform invenției furnizează o cantitate de anticorp modificat (sau fragmente ale acestuia), conform prezentei invenții, suficiente pentru a trata eficient pacientul.

Este, de asemenea, de notat că anticorpii prezentei invenții pot fi utilizați pentru construcția și sinteza fiecărui compus peptidic sau nepeptidic (mimetice), ce vor fi folositoare în aceleași domenii ca și anticorpul. (Vezi, de exemplu, Saragovici și colab., Science, 253:792795(1991).)

Depozit

Tulpina XL1 Blue, anti-CD4 în TCAE 6, care exprimă CE9.1, a fost depozitată cu ATCC și număr de desemnare 69030. Acest depozit a fost realizat în 9 iulie 1992.

Solicitanții și împutemiciții lor își asumă responsabilitatea de a înlocui aceste culturi în cazul în care acestea vor muri înainte de terminarea perioadei de eliberare a unui brevet pe baza acestuia, 5 ani după ultima cerere pentru o cultură sau chiar mai lung, de 30 ani, și responsabilitatea lor de a notifica depozitarului despre eliberarea unui astfel de brevet, moment în care depozitul va fi, în mod irevocabil, la dispoziția publicului. Până la acel moment, depozitul va fi făcut disponibil Comisionerului de Brevete în termenii stipulați de C.F.R. 37 a Secțiunii 1-14 și U.S.C. 35 a Secțiunii 112.

RO 120198 Β1

LISTA DE SECVENȚE (1) INFORMAȚII GENERALE 3 (i) SOLICITANT: Hanna, Nabil 5

Newnam, Roland A.

Reff, Mitchell E. 7 (ii) TITLUL INVENȚIEI: Anticorpi himerici anti-CD-4 cu domenii constante de gamma uman modificat 9 (iii) NUMĂRUL DE SECVENȚE: 59 (iv) ADRESĂ DE CORESPONDENȚĂ: 11 (A) DESTINATAR: BURNS, DOANE, SWECKER & MATHIAS (B) STRADA: 699 Prince Street 13 (C) ORAȘ: Alexandria (D) STAT: VA 15 (E) ȚARA: USA (F) COD: 22314-3187 17 (v) FORMA CITIBILĂ PE COMPUTER:

(A) TIP DE MEDIU: Floppy disk 19 (B) COMPUTER: PC compatibil IBM (C) SISTEM DE OPERARE: PC-DOS/MS-DOS 21 (D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Versiunea #1.30 (vi) DATE PRIVIND PREZENTA CERERE: 23 (A) NUMĂR DE CERERE: US 08/523,894 (B) DATA DE ÎNREGISTRARE: 06-SEP-1995 25 (C) CLASIFICARE (viii) INFORMAȚII MANDATAR/AGENT: 27 (A) Nume: Teskin, Robin L.

(B) NUMĂR ÎNREGISTRARE: 35, 030 29 (C) REFERINȚĂ/NUMĂR DOCUMENT: : 012712-165 (ix) INFORMAȚII DE TELECOMUNICAȚII: 31 (A) TELEFON: 703-836-6620 (B) TELEFAX: 703-836-2021 33 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 1 35 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ: 37 (A) Lungime: 420 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic 39 (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară 41 (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (vi) ORIGINEA SURSEI: 43 (A) ORGANISM: Maimuță

RO 120198 Β1 (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT:domeniu variabil al lanțului greu al CE9.1 (ix) TRĂSĂTURĂ:

(A) NUME/CHEIE: CDS (B) LOCALIZARE: 4...420 (ix) TRĂSĂTURĂ:

(A) NUME/CHEIE: mat_peptidă (B) LOCALIZARE: 61...420 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 1

GAC

ATG AAA CAC CTG TGG

TTC TTC CTC CTC CTG GTG GCA GCC CCC AGA

48

Met Lys -19

His

Leu Trp -15

Phe

Phe

Leu Leu

Leu -10

Val

Ala

Ala Pro

Arg -5

TGG

GTC

TTG

TCC

CAG

GTG

CAG

CTG

CAG

GAG

GCG

GGC

CCA

GGA

CTG.

GTG

96

Trp

Val

Leu

Ser

Gin

Val

Gin

Leu

Gin

Glu

Ala

Gly

Pro

Gly

Leu

Val

1

5

10

AAG

CCT

TCG

GAG

ACC

CTG

TCC

CTC

ACC

TGC

AGT

GTC

TCT

GGT

GGC

TCC

144

Lys

Pro

Ser

Glu

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Ser

Val

Ser

Gly

Gly

Ser

15

20

25

ATC

AGC

GGT

GAC

TAT

TAT

TGG

TTC

TGG

ATC

CGC

CAG

TCC

CCA

GGG

AAG

192

Xle

Ser

Gly

Asp

Tyr

Tyr

Trp

Phe

Trp

Xle

Arg

Gin

Ser

Pro

Gly

Lys

30

35

40

GGA

CTG

GAG

TGG

ATC

GGC

TAC

ATC

TAT

GGC

AGT

GGT

GGG

GGC

ACC

AAT

240

Gly

Leu

Glu

Trp

lle

Gly

Tyr

Xle

Tyr

Gly

Ser

Gly

Gly Gly

Thr

Asn

45

50

55

60

TAC

AAT

CCC

TCC

CTC

AAC

AAT

CGA

GTC

TCC

ATT

TCA

ATA

GAC

ACG

TCC

288

Tyr

Asn

Pro

Ser

Leu

Asn

Asn

Arg

Val

Ser

lle

Ser

lle

Asp

Thr

Ser

65

70

75

AAG

AAC

CTC

TTC

TCC

CTG

AAA

CTG

AGG

TCT

GTG

ACC

GCC

GCG

GAC

ACG

336

Lys

Asn

Leu

Phe

Ser

Leu

Lys

Leu

Arg

Ser

Val

Thr

Ala

Ala

Asp

Thr

80

85

90

GCC

GTC

TAT

TAC

TGT

GCG

AGT

AAT

ATA

TTG

AAA

TAT

CTT

CAC

TGG

TTA

384

AX©

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Ser

Asn

lle

Leu

Lys

Tyr

Leu

Kis

Trp

Leu

95

100

105

TTA

TAC

TGG

GGC

CAG

GGA

GTC

CTG

GTC

ACC

GTC

TCC

420

Leu

Tyr Trp Gly

Gin

Gly

Val

Leu

Val

Thr

Val

Ser

110

115

120

(2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 2 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 139 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 2

RO 120198 Β1

Met Lys His Leu

Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val

Ăla Ala Pro Arg Trp

1 3 5 7

-19 Val Leu Ser

Gin 1 Thr

-15 Val Leu

Gin Ser

-10 Leu Gin Glu Ala Gly 5

Pro Gly Leu 10

-5 Val Lys

Pro

Ser Glu 15

Leu 20

Thr

Cys Ser

Val

Ser 25

Gly

Gly

Ser

Ile

Ser

Gly

Asp Tyr Tyr Trp

Phe

Trp

Ile

Arg

Gin

Ser

Pro

Gly

Lys

Gly

30

35

40

4 5

9

Leu

Glu

Trp

Ile

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Gly

Ser

Gly

Gly

Gly

Thr

Asn

Tyr

11

50

55

50

Asn

Pro

Ser

Leu

Asn

Asn

Arg

Val

Ser

Ile

Ser

Ile

Asp

Thr

Ser

Lys

13

65

70

75

Asn

Leu

Phe

ser

Leu

Lys

Leu

Arg

Ser

Val

Thr

Ala

Ala

Asp

Thr

Ala

15

80

85

90

17

Val

Tyr

Tyr

cys

Ala

ser

Asn

Ile

Leu

Lys

Tyr

Leu

His

Trp

Leu

Leu

95

100

105

19

Tyr

Trp Gly

Gin

Gly

Val

Leu

Val

Thr

Val

Ser

110

115

120

21

(2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 3 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 287 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: Maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENTdomeniu variabil al lanțului greu al CE9.1 (ix) TRĂSĂTURĂ:

(A) NUME/CHEIE: CDS (B) LOCALIZARE: 4...387 (ix) TRĂSĂTURĂ:

(A) NUME/CHEIE: mat_peptidă (B) LOCALIZARE: 61...387 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 3

ACC ATG

GCC Ala

TGG GCT CTG CTG CTC CTC

GGC Gly

CTC Leu -10

CTT Leu

GCT Ala

CAC TTT His Phe

ACA Thr -5

Met -19

Trp

Ala Leu Leu Leu -15

Leu

GAC

TCT

CCG

GCC

TCC

TAT

GAG

TTG

AGT

CAG

CCT

CGC

TCA

GTG

TCC

GTG

Asp

Ser

Ala

Ala

ser

Tyr

Glu

Leu

ser

Gin

Pro

Arg

ser

val

ser

Val

1

5

10

TCC

CCA

GGA

CAG

ÂCG

GCC

GGG

TTC

ACC

TGT

GGG

GGA

GAC

AAC

GTT

GGA

Ser

Pro

Gly

Gin

Thr

Ala

Gly

Phe

Thr

Cys

Gly

Gly

Asp

Asn

Val

Gly

15

20

25

RO 120198 Β1

1 3 5

AGG AAA AGT GTA CAG TGG TAC CAG CAG AAG CCA CCG CAG GCC CCT GTG

192 240

Arg CTG Leu 45

Lys Ser Val Gin

Trp GAC Asp 50

Tyr Gin Gin Lys Pro Pro Gin

Ala Pro Val

30 GTC ATC Val 11·

TAT GCT

35 AGC Ser

GAA GlU

40 CGG CCC TCA GGG

ATC Ile

CCT GCG Pro Ala

CGA Arg 60

Tyr

Ala

Arg

Pro

Ser 55

Gly

7

TTC

TCT

GGC

TCC

AAC

TCA

GGG

AAC

ACC

GCC

ACC

CTG

ACC

ATC

AGC

GGG

288

1

Ph*

Ser

Gly

Ser

Asn

Ser

Gly

Asn

Thr

Ala

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Gly

65

70

75

9

GTC

GAG

GCC

GGG

GAT

GAG

GCT

GAC

TAT

TAC

TGT

CAG

GTG

TGG

GAC

AGT

336

Val

Glu

Ăla

Gly

Asp

Glu

Ala

Asp

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Val

Trp

Asp

Ser

11

80

85

90

ACT

CCT

GAT

CAT

TGG

GTC

TTC

GGC

GGA

GGG

ACC

CGG

CTG

ACC

GTC

CTA

384

13

Thr

Ala

Asp

His

Trp

Val

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Arg

Leu

Thr

Val

Leu

95

100

105

GGT 387

Gly (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 4 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 128 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ:

(xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 4

25

Met Ala -19

Trp Ala

Leu -15

Leu Leu

Leu

Gly Leu Leu -10

Ala His

Phe

Thr -5

Asp

27

Ser

Ala

Ala

Ser Tyr

Glu

Leu

Ser

Gin

Pro

Arg

Ser

Val

Ser

Val

Ser

1

5

10

29

Pro

Gly

Gin

Thr

Ala

Gly

Phe

Thr

Cys

Gly

Giy

Asp

Asn

Val

Gly

Arg

15

20

25

31

Lys

Ser

Val

Gin

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Pro

Gin

Ala

Pro

Val

Leu

33

30

35

40

45

Val

ile

Tyr

Ala

Asp

Ser

Glu

Arg

Pro

Ser

Gly

Ile

Pro

Ala

Arg

Phe

35

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Asn

Ser

Gly

Asn

Thr

Ala

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Gly

Val

37

65

70

75

Glu

Ala

Gly

Asp

Glu

Ala

Asp

Tyr Tyr

Cys

Gin

Val

Trp

Asp

Ser

Thr

39

80

35

90

41

Ala

Asp

His

Trp

Val

Phe

Gly Gly Gly

Thr

Arg

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

95

100

105

(2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 5 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 702 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic)

RO 120198 Β1 (vi) ORIGINEA SURSEI: 1 (A) ORGANISM: Homo sapiens (viii) POZIȚIE ÎN GENOM: 3 (A) CROMOZOM/SEGMENT:domenii lambda variabile și constante în CE9.1 (ix) TRĂSĂTURĂ: 5 (A) NUME/CHEIE: CDS (B) LOCALIZARE: 1...702 7 (ix) TRĂSĂTURĂ:

(A) NUME/CHEIE: mat_peptidă 9 (B) LOCALIZARE: 1...702 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 5 11

ATG Met 1

GCC TGG

GCT Ala

CTG CTG

CTC CTC GGC CTC CTT GCT CAC TTT ACA GAC

48

13

Ala

Trp

Leu 5

Leu

Leu Leu Gly

Leu 10

Leu

Ala

Kis

Phe Thr 15

Asp

TCT

SCS

GCC

TCC

TAT

GAG

TTG

AGT

CAG

CCT

CGC

TCA

GTG

TCC

GTG

TCC

96

15

Ser

Ala

Ala

Ser

Tyr

Glu

Leu

Ser

Gin

Pro

Arg

Ser

Val

Ser

Val

Ser

20

25

30

17

CCA

GGA

CAG

ACG

GCC

GGG

TTC

ACC

TGT

GGG

GGA

GAC

AAC

GTT

GGA

AGG

144

Pro

Gly

Gin

Thr

JAlat

Gly

Phe

Thr

Cys Gly Gly Asp

Asn

Val

Gly Arg

19

35

40

45

AAA

AGT

GTA

CAG

TGG

TAC

CAG

CAG

AAG

CCA

CCG

CAG

GCC

CCT

GTG

CTG

192

21

Lys

Ser

Val

Gin

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Pro

Gin

Ala

Pro

Val

Leu

50

55

60

23

CTC ATC

TAT

GCT

GAC

AGC

GAA

CGG

CCC

TCA

GGG

ATC

CCT

GCG

CGA

TTC

240

Val

île

Tyr

Ala

Asp

Ser

Glu

Arg

Pro

Ser

Gly

Ile

Pro

Ala

Arg

Phe

65

70

75

30

25

TCT

GGC

TCC

AAC

TCA

GGG

AAC

ACC

GCC

ACC

CTG

ACC

ATC

AGC

GGG

GTC

288

Ser

Gly

Sar

Asn

Sar

Gly

Asn

Thr

Ala

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Gly

Val

27

35

90

95

GAG

GCC

GGG

GAT

GAG

GCT

GAC

TAT

TAC

TGT

CAG

GTG

TGG

GAC

AGT

ACT

336

29

Glu

Ala

Gly

ASp

GlU

Ala

ASP

Tyr Tyr

Cys

Gin

Val

Trp

Asp

Ser

Thr

100

105

110

31

GCT

GAT

CAT

TGG

GTC

TTC

GGC

GGA

GGG

ACC

CGG

CTG

ACC

GTC

CTA

GGT

384

Ala

Asp

His

Trp

Val

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Arg

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

115

120

125

33

CAG

CCC

AAG

GCT

GCC

CCC

TCG

GTC

ACT

CTG

TTC

CCG

CCC

TCC

TCT

GAG

432

Gin

Pro

Lys

Ala

Ala

Pro

Ser

val

Thr

Leu

Phe

Pro

Pro

Ser

Ser

Glu

35

130 135 140

GAS CTT Glu Leu 145

CAA Gin

CCC AAC AAG GCC Ala Asn Lys Ala 150

ACA CTG GTC TGT CTC ATA AGT GAC TTC Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

480

39

155

160

TAC

CCG

GGA

GCC

GTG

ACA

GTG

GCC

TGG

AAG

GCA

GAT

AGC

AGC

CCC

GTC

528

41

Tyr

Pro

Gly

Ala

Val

Thr

Val

Ala

Trp

Lys

AU

Asp

ser

Ser

Pro

Val

165

L70

175

AAG

GCG

GGA

GTG

GAG

ACC

ACC

ACA

CCC

TCC

AAA

CAA

AGC

AAC

AAC

AAG

576

43

Lys

Ala

Gly

Val

Glu

Thr

Thr

Thr

Pro

Ser

Lys

Gin

Ser

Asn

Asn

Lys

180

185

190

45

TAC

GCG

GCC

AGC

AGC

TAC

CTG

AGC

CTG

ACG

CCT

GAG

CAG

TGG

AAG

TCC

624

Tyr

Ala

Ala

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ser

Leu

Thr

Pro

Glu

Gin

Trp

Lys

Ser

47

195

200

205

CAC

AGA

AGO

TAC

AGC

TGC

CAG

GTC

ACG

CAT

GAA

GGG

AGC

ACC

GTG

GAG

672

UiS

Arg

Ser

iyr

ser

cys

Gin

Val

Thr

His

Glu

Gly

Ser

Thr

Val

Glu

49

210

215

220

AAG

ACA

GTG

GCC

CCT

ACA

GAA

TGT

TCA

TGA

702

51

Lys

Thr

Val

Ala

Pro

Thr

Glu

cys

Ser

*

225

230

RO 120198 Β1 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 6 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 234 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: proteină (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 6

Met

Ala

Trp

Ala

leu

leu

leu

leu

Gly

leu

leu

Ala

His

Phe

Thr

Asp

1

5

10

15

Ser

Ala

Ala

Ser

Tyr

Glu

leu

Ser

Gin

Pro

Arg

Ser

Val

Ser

Val

Ser

20

25

30

Pro

Gly

Gin

Thr

Ala

Gly

Phe

Thr

Cys

Gly

Gly

Asp

Asn

Val

Gly

Arg

35

40

45

Lys Ser Val Gin 50

Trp Tyr Cin Gin Lys Pro Pro Gin Ala

Pro

Val

leu

55

60

val

Ile

Tyr

Ala

Asp

Ser

Glu

Arg

Pro

Ser

ciy

Ile

Pro

Ăla

Arg

Phe

65

70

75

80

Ser

ciy

Ser

Asn

Ser

Gly

Asn

Thr

Ala

Thr

leu

Thr

Ile

Ser

Gly

Val

85

90

95

Glu

Ala

Gly Asp

GlU

Ala

Asp

Tyr

Tyr

cys

Gin

Val

Trp

Asp

Ser

Thr

100

105

110

Ala

Asp

His

Trp

Val

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Arg

Leu

Thr

Val

Leu

Gly

115

120

125

Gin

Pro

Lys

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Thr

Leu

Phe

Pro

Pro

Ser

Ser

Glu

130

13 5

140

G1U

leu

Gin

Ala

Asn

lys

Ala

Thr

Leu

Val

Cys

leu

Ile

Ser

Asp

Phe

145

150

155

ISO

Tyr

Pro

Gly

Ala

Val

Thr

Val

Ala

Trp

lys

Ala

Asp

Ser

Ser

Pro

Val

165

170

175

lys

Ala

Gly

Val

Glu

Thr

Thr

Thr

Pro

Ser

Lys

Gin

Ser

Asn

Asn

lys

180

185

190

Tyr

Ala

Ala

Ser

Ser

Tyr

leu

Ser

Leu

Thr

Pro

Glu

Gin

Trp

Lys

Ser

195

200

205

His

Arg

Ser

Tyr

Ser

Cys

Gin

Val

Thr

His

Glu

Giy

Ser

Thr

val

Glu

210

215

220

Lys

Thr

val

Ala

Pro

Thr

GlU

cys

Ser

«

225 230 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 7 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 1404 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic)

RO 120198 Β1 (viii) POZIȚIE ÎN GENOM: 1 (A) CROMOZOM/SEGMENT: gamma 4 cu catenă grea, variabilă și constantă.

(ix) TRĂSĂTURĂ: 3 (A) NUME/CHEIE: CDS (B) LOCALIZARE: 1...1404 5 (ix) TRĂSĂTURĂ:

(A) NUME/CHEIE: mat_peptidă 7 (B) LOCALIZARE: 1...1404 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 7

13 Q

135

143

11

GCC

CCA

TCC

GTC

TTC

CCC

CTG

GCG

CCC

TGC

TCC

AGG

AGC

ACC

TCC

GAG

430

13

Gly

?ro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

145

150

155

160

AGC

ACA

GCC

GCC

CTG

GGC

TGC

CTG

GTC

AAG

GAC

TAC

TTC

CCC

GAA

CCG

528

15

Ser

Thr

At:l»L

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

165

170

175

17

GTG

ACG

GTG

TCG

TGG

AAC

TCA

GGC

GCC

CTG

ACC

AGC

GGC

GTG

CAC

ACC

576

Vel

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

KÎ3

Thr

19

ISO

185

190

TTC

CCG

GCT

GTC

CTA

CAG

TCC

TCA

GGA

CTC

TAC

TCC

CTC

AGC

AGC

GTG

624

21

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

195

200

205

GTG

ACC

GTG

CCC

TCC

AGC

AGC

TTG

GGC

ACG

AAG

ACC

TAC

ACC

TGC

AAC

672

23

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Lys

Thr

Tyr

Thr

Cys

Asn

210

215

220

25

GTA

GAT

CAC

AAG

CCC

AGC

AAC

ACC

AAG

GTG

GAC

AAG

AGA

GTT

GAG

TCC

720

vai

Asp

His

Lys

Pro

ser

Asn

Thr

Lys

val

Asp

Lys

Arg

val

GlU

ser

27

225

230

235

240

AAA TAT

GGT

CCC

CCA

TGC

CCA

TCA

TGC

CCA

GCA

CCT

GAG

TTC

CTG

GGG

768

29

Lys

Tyr

Gly

Pro

Pro

Cys

Pro

Ser

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Phe

Leu

Gly

245

250

255

GGA

CCA

TCA

GTC

TTC

CTG

TTC

CCC

CCA

AAA

CCC

AAG

GAC

ACT

CTC

ATG

816

31

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

260

265

270

33

ATC

TCC

CGG

ACC

CCT

GAG

GTC

ACG

TGC

GTG

GTG

GTG

GAC

AGC

CAG

864

Ile

ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

Gin

275

280

285

35

GAA

GAC

CCC

GAG

GTC

CAG

TTC

AAC

TGG

TAC

GTG

GAT

GGC

GTG

GAG

GTG

912

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Gin

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

37

290

295

300

CAT

AAT

GCC

AAG

ACA

AAG

CCG

CGG

GAG

GAG

CAG

TTC

AAC

AGC

ACG

TAC

960

39

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

Tyr

305

310

315

320

41

CGT

GTG

GTC

AGC

GTC

CTC

ACC

GTC

CTG

CAC

CAG

GAC

TGG

CTG

AAC

GGC

1008

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

325

330

335

43

AAG

GAG

TAC

AAG

TGC

AAG

GTC

TCC

AAC

AAA

GGC

CTC

CCG

TCC

TCC

ATC

1056

Lys

Glu

Tyr

cys

cys

Lys

val

Ser

Asn

Lys

Gly

Leu

Pro

Ser

Ser

Ile

45

340

345

350

GAG

AAA

ACC

ATC

ȚCC

AAA

GCC

AAA.

GGG

CAG

CCC

CGA

GAG

CCA

CAG

GTG

1104

47

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

RO 120198 Β1

355 360 385

TAC ACC

CTG CCC CCA

TCC CAG GAG GAG

ATG ACC AAG AAC CAG GTC AGC

1152

Tyr

Thr 370

Leii

Pro Pro

Ser Gin 375

Glu

Glu

Met Thr Lys 380

Asn

Gin val ser

CTG

ACC

TGC

CTG

GTC

AAA

GGC

TTC

TAC

CCC

AGC

GAC

ATC

GCC

GTG

GAG

1200

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Xle

Ala

Val

Glu

385

390

395

400

TȘG

GAG

AGC

AAT

GGG

CAG

CCG

GAG

AAC

AAC

TAC

AAG

ACC

ACG

CCT

CCC

1248

Trp

Glu

sar

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

405

410

415

GTG

CTG

GAC

TCC

GAC

GGC

TCC

TTC

TTC

CTC

TAC

AGC

AGG

CTA

ACC

GTG

1296

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Arg

Leu

Thr

Val

420

425

430

GAC

AAG

AGC

AGG TGG

CAG

GAG

GGG

AAT

GTC

TTC

TCA

TGC

TCC

GTG

ATG

1344

Asp

Lys

Sar

Arg

Trp

Gin

Glu

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

435

440

445

CAT

GAG

CCT

CTG

CAC

AAC

CAC

TAC

ACA

CAG

AAG

AGC

CTC

TCC

CTG

TCT

1392

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Sar

Leu

ser

Leu

Ser

450

455

480

CTG GGT AAA TGA 1404

Leu Gly Lys *

465 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 8 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 468 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: proteină (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 8

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val

Ala Ala

Pro

Arg 15

Trp

1

5

10

Val

Leu

Ser

Gin

Val

Gin

Leu

Gin

G lu

Ser

Gly

Pro

Gly

Leu

Val

Lys

20

25

30

Pro

Ser

Glu

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Ser

Val

Ser

Gly

Gly

Ser

lle

35

40

45

Ser

Gly

ASp

Tyr

Tyr

Trp

Phe

Trp

lle

Arg

Gin

Ser

Pro

Gly

Lys

Gly

50

55

60

Leu

Glu

Trp

lle

Gly Tyr

Xle

Tyr

Gly

Ser

Gly

Gly

Gly

Thr

Asn

Tyr

65

70

75

80

RO 120198 Β1

Asn

Pro

Sar

Leu

Asn 85

Asn

Arg

Val

Ser

Xle 90

Ser

lle

Asp

Thr

Ser 95

k’/s

1

Asn

Leu

Phe

Ser 100

Leu

Lys

Leu

Arg

Ser 105

Val

Thr

Ala

Ala

Asp 110

Thr

Ala

3

Val

Tyr

Tyr 115

CVS

Ala

Ser

Asn

Xle 120

Leu

Lys

Tyr

Leu

His 125

Trp

Leu

Leu

5

Tyr

Trp Gly 130

Gin

ciy

Val

Leu 135

Val

Thr

Val

ser

Ser 140

Ala

Ser

Thr

Lys

7

eiy 145

Pro

Ser

Val

Phe

Pro 150

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser 155

Arg

Ser

Thr

Ser

GlU 150

9

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu 165

Gly

Cys

Leu

Val

Lys Asp 170

Tyir

Phe

Pro

Glu 175

Pro

11 13

Val

Thr

val

Ser ISO

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala 185

Leu

Thr

Ser

Gly

Val ISO

His

Thr

15

Phe

Pro

Ala 195

val

Leu

Gin

Ser

Ser 200

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu 205

Ser

Ser

Val

17

Val

Thr 210

Val

Pro

Ser

Ser

Ser 215

Leu

Gly

Thr

Lys

Thr 220

Tyr

Thr

Cys

Asn

19

Val 225

Asp

Bis

Lys

Pro

ser 230

Asn

Thr

Lys

Val

Asp 235

Lys

Arg

val

Glu

Ser 240

21

Lys

Tyr

Gly

Pro

Pro 245

Cys

Pro

Ser

Cys

Pro 250

Ala

Pro

Glu

Phe

Leu 255

Gly

23

Gly

Pro

Ser

val 260

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro 265

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr 270

Leu

Met

25

lle

Ser

Arg 275

Thr

Pro

Glu

Val

Thr 280

Cys

Val

Val

Val

Asp 285

Val

Ser

Gin

27

Glu

Asp 290

Pro

Glu

Val

Gin

Phe 295

Asn

Trp Tyr

Val

Asp 300

Gly

val

Glu

Val

29

Bis 305

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys 310

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin 315

Phe

Asn

Ser

Thr

Tyr 320

31

Arg

Val

Val

ser

val 325

Leu

Thr

Val

Leu

Bis 330

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn 335

Gly

33

Lys

Glu

Tyr

Lys 340

Cys

Lys

Val

Ser

Asn 345

Lys

Gly

Leu

Pro

Ser 350

Ser

Ils

35

Glu

Lys

Thr 355

lle

Ser

Lys

Ala

Lys 3 60

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu 365

Pro

Gin

Val

37

Tyr

Thr 370

Leu

Pro

Pro

Ser

Gin 375

Glu

Glu

Met

Thr

Lys 380

Asn

Gin

Val

Ser

39

RO 120198 Β1

Leu 385

Thr

cp

Leu Val

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

390

395

400

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly 405

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn 410

Tyr Lys

Thr

Thr

Pro 415

Pro

Val

Leu

Asp

ser 420

Asp

Gly

ser

Phe

Phe 425

Leu

Tyr

Ser

Arg

Leu 430

Thr

Val

Asp Lys

Ser 435

Arg Trp

Gin

Glu

Giy 440

Asn

Val

Phe

Ser

Cys 445

Ser

Val

Met

His

Glu 450

Ala

Leu

His

Asn

His 455

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser 460

Leu

Ser

Leu

Ser

Leu 465

siy

Lys

*

(2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 9 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 1404 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: homo sapiens (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A)CROMOZOM/SEGMENT: catenă grea gamma 4 cu mutație E (ix) TRĂSĂTURĂ:

(A) NUME/CHEIE: CDS (B) LOCALIZARE: 1...1404 (ix) TRĂSĂTURĂ:

(A) NUME/CHEIE: mat_peptidă (B) LOCALIZARE: 1...1404 33 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 9 35

37

ATG AAA Met Lys 1

CAC CTG TGG TTC TTC CTC CTC CTG GTG GCA GCC

CCC AGA Pro Arg 15

TGG Trp

48

His Leu

Trp Phe Phe Leu 5

Leu Leu Val 10

Ala

Ala

39

GTC

TTG

TCC

CÂG

GTG

CAG

CTG

GAG

GAG

TCG

GGC

CCA

GGA

CTG

GTG

ĂAG

96

val

Leu

Ser

Gin

Val

Gin

Leu

Gin

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

Leu

Val

Lys

41

20

25

30

CCT

TCG

GAG

ACC

CTG

TCC

CTC

ACC

TGC

AGT

GTC

TCT

GGT

GGC

TCC

ATC

144

43

Pro

Sei·

Glu

Thr

Leu

iSeX

Leu

Thr

cys

ser

Val

Ser

Gly

Gly

Ser

Ile

35

40

45

RO 120198 Β1

AGC GGT GAC TAT TAT TGG TTC TGG ATC CGC CAG TCC CCA GGG AAG GGA

192 240

1 3 5

Ser Gly Asp Tyr Tyr 50 CTG GAG TGG ATC GGC

Trp Phe Trp Ile Arg 55

Gin Cer Pro Gly Lys

Gly TAC Tyr 80

60

ACC AAT

TAC Tyr 70

ATC ile

TAT GGC AGT

GGT Gly 75

GGG GGC

Leu 65

Glu

Trp Ile Gly

Tyr

Gly

Ser

Gly

Gly

Thr

Asn

AAT

CCC

TCC

CTC

AAC

AAT

CGA

GTC

TCC

ATT

TCA

ATA

GAC

ACG

TCC

AAG

288

Asn

pro

Ser

Leu

Asn

Asn

Arg

Val

ser

Ile

ser

Ile

Asp

Thr

ser

Lys

7

85

90

95

ί

AAC

CTC

TTC

TCC

CTG

AAA

CTG

AGG

TCT

GTG

ACC

GCC

GCG

GAC

ACG

GCC

336

Asn

Leu

Phe

Ser

Leu

Lys

Leu

Arg

Ser

Val

Thr

Ala

Ala

Asp

Thr

Ala

9

100

105

110

GTC

TAT

TAC

TGT

GCG

AGT

AAT

ATA

TTG

AAA

TAT

CTT

CAC

TGG

TTA

TTA

384

11

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Sar

Asn

Ile

Leu

Lys

Tvt

Leu

His

Trp

Leu

Leu

115

120

125

13

TAC

TGG

GGC

CAG

GGA

GTC

CTG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

GCT

AGC

ACC

AAG

432

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Val

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

130

135

140

15

GGG

CCA

TCC

GTC

TTC

CCC

CTG

GCG

cec

TGC

TCC

AGG

AGC

ACC

TC***

GAG

480

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

17

145

150

155

160

AGC

ACA

GCC

GCC

CTG

GGC

TGC

CTG

GTC

AAG

GAC

TAC

TTC

CCC

GAA

CCG

528

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

19

165

170

17 5

GTG

ACG

GTG

TCG

TGG

AAC

TCA

GGC

GCC

CTG

ACC

AGC

GGC

GTG

CAC

ACC

576

21

Văl

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Alâ

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

180

185

190

TTC

CCG

GCT

GTC

CTA

CAG

TCC

TCA

GGA

CTC

TAC

TCC

CTC

AGC

AGC

GTG

624

23

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

195

200

205

25

GTG

ACC

GTG

CCC

TCC

AGC

AGC

TTG

GGC

ACG

AAG

ACC

TAC

ACC

TGC

AAC

672

val

Thr

val

Pro

ser

Ser

ser

Leu

Gly

Thr

Lys

Thr

Tyr

Thr

Cys

Asn

210

215

220

27

29

GTA

GAT

CAC

AAG

CCC

AGC

AAC

ACC

AAG

GTG

GAC

AAG

AGA

CTT

CAG

TGC

720

31

Val

Asp

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Ser

225

230

2 3 o

240

AAA

TAT

GGT

CCC

CCA

TGC

CCA

TCA

TGC

CCA

GCA

CCT

GAG

TTC

GAG

GGG

768

33

Lys

Tyr

Gly

Pro

Pro

cys

Pro

Ssr

CVS

Pro

Ala

Pro

GlU

Phe

Glu

Gly

245

250

255

35

GGA

CCA

TCA

GTC

TTC

CTG

TTC

CCC

CCA

AAA

CCC

AAG

GAC

ACT

CTC

ATG

816

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

260

265

270

37

RO 120198 Β1

ATC

TCC

CGG

ACC

CCT

GAG

GTC

ACG

TGC

GTG

GTG

GTG

GAC

GTG

AGC

CAG

Ile

Ser

Arg 275

Thr

Pro

Glu

Val

Thr 280

cys

Val

Val

Val

Asp 285

Val

Ser

Gin

GAA

GAC

CCC

GAG

GTC

CAG

TTC

AAC

TGG

TAC

GTG

GAT

GGC

GTG

GAG

GTG

Glu

Asp 290

Pro

GlU

val

Gin

Phe 295

Asn

Trp

Tyr

val

Aso 300

Gly

Val

GlU

val

CAT AAÎ

GCC

AAG

ACA

AAG

CCG

CGG

GAG

GAG

CAG

TTC

AAC

AGC

ACG

TAC

His 305

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys 310

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin 315

Phe

Asn

Ser

Thr

Tyr 320

CGT

GTG

GTC

AGC

GTC

CTC

ACC

GTC

CTG

CAC

CAG

GAC

TGG

CTG

AAC

GGC

Arg

Val

val

Ser

Val 325

Leu

Thr

Val

Leu

His 330

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn 335

Gly

AAG

GAG

TAC

AAG

TGC

AAG

GTC

TCC

AAC

AAA

GGC

CTC

CCS

TCC

TCC

ATC

Lys

Glu

Tyr

Lys 340

Cys

Lys

Val

Ser

Asn 345

Lys

Gly

Leu

Pro

Ser 350

ser

Ile

GAG

AAA

ACC

ATC

TCC

AAA

GCC

AAA

GGG

CAG

CCC

CGA

GAG

CCA

CAG

GTG

Glu

Lys

Thr 355

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys 360

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu 365

Pro

Gin

val

TAC

ACC

CTG

CCC

CCA

TCC

CAG

GAG

GAG

ATG

ACC

AAG

AAC

CAG

GTC

AGC

Tyr

Thr 370

Leu

Pro

Pro

Ser

Gin '375

GlU

Glu

Met

Thr

Lys 330

Asn

Gin

val

Ser

CTG

ACC

TGC

CTG

GTC

AAA

GGC

TTC

TAC

CCC

AGC

GAC

ATC

GCC

GTG

GAG

Leu 385

Thr

cys

Leu

Val

Lys 390

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser 395

Asp

Ile

Ala

Val

Glu 400

TGG

GAG

AGC

AAT

GGG

CAG

CCG

GAG

AAC

AAC

TAC

AAG

ACC

ACG

CCT

CCC

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly 405

Gin

Pro

Glti

Asn

Asn 410

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro 415

Pro

GTG

CTG

GAC

TCC

GAC

GGC

TCC

TTC

TTC

CTC

TAC

AGC

AGG

CTA

ACC

GTG

Val

Leu

Asp

Ser 420

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe 425

Leu

Tyr

Ser

Arg

Leu 430

Thr

Val

GAC

AAG

AGC

AGG

TGG

CAG

GAG

GGG

AAT

GTC

TTC

TCA

TGC

TCC

GTG

ATG

Asp

Lys

Ser 435

Arg

Trp

Gin

Glu

Gly 440

Asn

Val

Phe

Ser

Cys 445

Ser

Vai

Met

CAT

GAG

GCT

CTG

CAC

AAC

CAC

TAC

ACA

CAG

AAG

AGC

CTC

TCC

CTG

TCT

His

Glu 450

Ala

Leu

His

Asn

His 455

Tyr

Thr

Gin

Lys

ser 460

Leu

Ser

Leu

Ser

CTG GGT AAA TGA Leu Gly Lys * 469 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 10 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 468 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: proteină

RO 120198 Β1 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 10

Met 1

Lys

Hi»

Leu Trp 5

Phe Phe

Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

5

10

15

Val

Leu

Ser

Gin

Val

Gin

Leu

Gin

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly Leu

val

Lys

•7

20

25

30

7

Pro

Ser

Glu

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

ser

val

ser

Gly Gly

Ser

lle

o

35

40

45

&

Ser

Gly Asp Tyr Tyr

Trp

Phe

Trp

lle

Arg

Gin

Ser

Pro

Gly

Lys

Gly

11

50

55

60

Leu

Glu

Trp

lle

Gly

Tyr

lle

Tyr

Gly

Ser

Gly

Gly

Gly

Thr

Asn

Tyr

13

65

70

75

80

Asn

Pro

Ser

Leu

Asn

Asn

Arg

Val

Ser

lle

Ser

lle

Asp

Thr

Sar

Lys

15

85

90

95

Asn

Leu

Phe

Ser

Leu

Lya

Leu

Arg

Ser

Val

Thr

Ala

Ala

Asp

Thr

Ala

17

100

105

110

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

ser

Asn

lle

Leu

Lys

Tyr

Leu

His

Trp

Leu

Leu

19

115

120

125

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Val

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Sar

Ala

ser

Thr

Lys

21

130

135

140

Gly

Pro

Ser

val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

23

145

150

155

160

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

25

ies

170

175

val

Thr

Val

Sar

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Sar

Gly

Val

His

Thr

27

ISO

185

190

Phe

Pro

Ala

val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

ser

Leu

ser

Ser

Val

29

195

200

205

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

ser

Leu

Gly

Thr

Lys

Thr

Tyr

Thr

cys

Asn

31

210

215

220

Val

Asp

His

LVS

Pro

Ser

Asn.

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Va]

Glu

Ser

33

225

230

235

240

Lys Tyr

Gly

Pro

Pro

Cys

Pro

Ser

cys

Pro

Ala

Pro

GiU

Phe

GlU

Gly

35

245

250

255

RO 120198 Β1

Gly

pro

Ser

Val 260

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro 265

Lys

Pro

Lys

ASp

Thr 270

Leu

Met

Xle

Ser

Arg 275

Thr

Pro

GlU

vai

Thr 280

Cys

Val

Val

Val

Asp 285

val

ser

Gin

Glu

Asp 290

Pro

Glu

Val

Gin

Phe 295

Asn

Trp

Tyr

Val

ASp 300

Gly

Val

Glu

Val

His 305

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys 310

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin 315

Phe

Asn

Ser

Thr

Tyr 320

Arg

Val

Val

ser

Val 325

Leu

Thr

val

Leu

His 330

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn 335

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys 340

Cys

Lys

Val

Ser

Asn 345

Lys

Gly

Leu

Pro

Ser 350

Ser

île

Glu

Lys

Thr 355

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys 360

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu 365

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr 370

Leu

Pro

Pro

Ser

Gin 375

Glu

Glu

Met

Thr

Lys 380

Asn

Gin

Val

Ser

Leu 385

Thr

Cys

Leu

Val

Lys 390

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser 395

Asp

Ile

Ala

Val

Glu 400

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly 405

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn 410

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro 415

Pro

Val

Leu

Asp

Ser 420

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe 425

Leu

Tyr

Ser

Arg

Leu 430

Thr

Val

λβρ Lys

Ser 435

Arg

Trp

Gin

Glu

Gly 440

Asn

Val

Phe

Ser

Cys 445

Ser

Vâl

Met

Glu 450

Ala

Leu

His

Asn

His 455

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser 460

Leu

Ser

Leu

Ser

Leu Gly Lys * 465 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 11 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 1404 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: homo sapiens (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: gamma 4 cu catenă grea, cu mutație P și E (ix) TRĂSĂTURĂ:

(A) NUME/CHEIE: CDS

RO 120198 Β1 (B) LOCALIZARE: 1...1404 1 (ix) TRĂSĂTURĂ:

(A) NUME/CHEIE: mat_peptidă 3 (B) LOCALIZARE: 1...1404 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 11

ATG AAA CAC CTG

TGG Trp 5

TTC TTC CTC CTC CTG GTG GCA GCC CCC AGA TGG

48

9

Met 1

Lys

Bis

Leu

Phe

Phe

Leu

Leu

Leu 10

Val Ala

Ala

Pro Arg 15

Trp

GTC

TTG

TCC

CAG

GTG

CAG

CTG

CAG

GAG

TCG

GGC

CCA

GGA

CTG

GTG

AAG

95

Val

Leu

ser

Gin

Val

Gin

Leu

Gin

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

Leu

Val

Lys

11

20

25

30

CCT

TCG

GAG

ACC

CTG

TCC

CTC

ACC

TGC

AGT

GTC

TOT

GGT

GGC

TCC

ATC

14 4

13

Pro

Ser

Glu

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Ser

Val

Ser

Gly

Gly

Ser

Ile

35

40

45

AGC

GGT

GAC

TAT

TAT

TGG

TTC

TGG

ATC

CGC

CAG

TCC

CCA

GGG

AAG

GGA

192

15

ser

Gly Asp

Tyr Tyr

Trp

Phe

Trp

Ile

Arg

Gin

Ser

Pro

Gly

Lys

Gly

50

55

60

17

CTG

GAG

TGG

ATC

GGC

TAC

ATC

TAT

GGC

AGT

GGT

GGG

GGC

ACC

AAT

TAC

240

Leu

Glu

Trp

Ile

Gly

Tyr

Ile

Tyr

Gly

Ser

Gly

Gly

Gly

Thr

Asn

Tyr

65

70

75

SO

19

AAT

CCC

TCC

CTC

AAC

AAT

CGA

GTC

TCC

ATT

TCÂ

ATA

GAC

ACG

TCC

AAG

238

Asn

Pro

Ser

Leu

Asn

Asn

Arg

Val

Ser

Ile

Ser

Ile

Asp

Thr

Ser

Lys

35

90

95

21

AAC

CTC

TTC

TCC

CTG

AAA

CTG

AGG

TCT

GTG

ACC

GCC

GCG

GAC

ĂCG

GCC

335

Asn

Leu

Phe

Ser

Leu

Lys

Leu

Arg

Ser

Val

Thr

Ala

Ala

Asp

Thr

Ala

23

100

105

110

GTC

TAT

TAC

TGT

GCG

AGT

AAT

ATA

TTG

AAA

TAT

CTT

CAC

TGG

TTA

TTA

384

25

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Ser

Asn

Ile

Leu

Lys

Tyr

Leu

Bis

Trp

Leu

Leu

115

120

125

TAC TGG GGC CAG GGA GTC

CTG GTC ACC GTC TCC TCA GCT AGC ACC AAG

432

Tyr Trp Gly Gin Gly

Val

Leu 13S

Val

Thr

val

Ser

Ser Ala 140

Ser

Thr

Lys

130

GGG

CCA

TCC

GTC

TTC

CCC

CTG

GCG

CCC

TGC

TCC

AGG

AGC

ACC

TCC

GAG

430

Gly

Pro

ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

ser

Glu

145

150

155

160

AGC

ACA

GCC

GCC

CTG

GGC

TGC

CTG

GTC

AAG

GAC

TAC

TTC

CCC

GAA

CCG

528

Ser

Thr

Ala

ÂXai

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

RO 120198 Β1

165 170 175

GIG

ACG

GTG

TCG

TGG

AAC

TCA

GGC

GCC

CTG

ACC

AGC

GGC

GTG

CAC

ACC

val

Thr

Val

Ser 180

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala 135

Leu

Thr

Ser

Gly

Val 190

His

Thr

TIC

CCG

GCP

GTC

CTA

CKG

TCC

TCA

GGA

CTC

TAC

TCC

CTC

AGC

AGC

GTG

Phe

Pro

Ala 195

Val

Leu

Gin

Ser

Ser 200

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu 205

Ser

Ser

Val

GTG

ACC

GTG

CCC

TCC

AGC

AGC

TTG

GGC

ACG

AAG

ACC

TAC

ACC

TGC

AAG

Val

Thr 210

Val

Pro

Ser

Ser

Ser 215

Leu

Gly

Thr

Lys

Thr 220

Tyr

Thr

Cys

Asn

GTA

GAT

CAC

AAG

CCC

AGC

AAC

ACC

AAG

GTG

GAC

AAG

AGA

GTT

GAG

TCC

val 225

Asp

His

Lys

Pro

Ser 230

Asn

Thr

Lys

val

Asp 235

Lys

Arg

Val

GlU

ser 240

AAA

TAT

GGT

CCC

CCA

TGC

CCA

CCA

TGC

CCA

GCA

CCT

GAG

TTC

GAG

GGG

Lys

Tyr

ciy

Pro

Pro 245

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro 250

Ala

Pro

Glu

Phe

Glu 255

Gly

GGA

CCA

TCA

GTC

TTC

CTG

TTC

CCC

CCA

AAA

CCC

AAG

GAC

ACT

CTC

ATG

Cly

Pro

Ser

Val 260

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro 265

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr 270

Leu

Met

ATC

TCC

CGG

ACC

CCT

GAG

GTC

ACG

TGC

GTG

GTG

GTG

GAC

GTG

AGC

CAG

Ile

Ser

Arg 275

Thr

Pro

Glu

Val

Thr 230

Cys

Val

Val

Val

Asp 285

val

ser

Gin

GAA

GAC

CCC

GAG

GTC

CAG

TTC

AAC

TGG

TAC

GTG

GAT

GGC

GTG

GAG

GTG

Glu

Asp 290

Pro

Glu

Val

Gin

Phe 295

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp 300

Gly

val

Glu

Val

CAT

AAT

GCC

AAG

ACA

AAG

CCG

CGG

GAG

GAG

CAG

TTC

AAC

AGC

ACG

TAC

His 305

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys 310

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin 315

Phe

Asn

Ser

Thr

Tyr 320

CGT

GTG

GTC

AGC

GTC

CTC

ACC

GTC

CTG

CAC

CAG

GAC

TGG

CTG

AAC

GGC

Arg

Val

Val

Ser

val 325

Leu

Thr

val

Leu

His 330

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn 335

Gly

AAG

GÎ&

TAC

AAG

TGC

AAG

GTC

TCC

AAC

AAA

GGC

CTC

CCG

TCC '

TCC

ATC

Lys

Glu

Tyr

Lys 340

Cys

Lys

val

Ser

Asn 345

Lys

Gly

Leu

Pro

Ser 350

Ser

Ile

GAG

AAA

ACC

ATC

TCC

AAA

GCC

AAA

GGG

CAG

CCC

CGA

GAG

CCA

CAG

GTG

GlU

Lys

Thr 355

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys 360

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu 365

Pro

Gin

Val

TAC

ACC

CTG

CCC

CCA

TCC

CAG

GAS

GAG

atg

ACC

AAG

AAC

CAG

GTC

AGC

Tyr

Thr 370

Leu

Pro

Pro

Ser

Gin 375

Glu

Glu

Met

Thr

Lys 380

Asn

Gin

val

Ser

CTG

ACC

TGC

CTG

GTC

AAA

GGC

tic

TAC

CCC

AGC

GAC

ATC

GCC

GTG

GAG

Leu

Thr

cys

Leu

Val

Lys

Giy

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

RO 120198 Β1

385 390 395 400

TGG GAG AGC AAT GGG CAG

CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

1248 1296

3 5 7

Txp GTG Val

Glu CTG Leu

Sar Aan Gly Gin

GAC Asp

405

410 TCC TTC TTC CTC TAC AGC AGG CTA

415 ACC GTG

TCC Ser 420

GAC Asp

GGC Gly

Ser Phe

Phe 425

Leu

Tyr

Ser

Arg

Leu 430

Thr

Val

GAC

AAG

AGC

AGG

TGG

CAG

GAG

GGG

AAT

GTC

TTC

TCA

TGC

TCC

GTG

ÂTG

1344

Asp

Lye

Ser

Arg

Trp

Gin

Glu

Gly

Asn

Val

Phe

ser

cys

ser

vai

Met

9

435

440

445

CAT

GAG

GCT

CTG

CAC

AAC

CAC

TAC

ACA

CAG

AAG

AGC

CTC

TCC

CTG

TCT

1392

11

His

GlU

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

ser

450

455

450

CTG GGT AAA TGA 1404

Leu Gly Lya *

455 15 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 12 17 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ: 19 (A) Lungime: 468 aminoacizi (B) TIP: aminoacid 21 (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: proteină 23 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 12 25

Mat Lys 1 Val Leu

His Leu Trp Phe 5

Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Ara Trp

10

15

Ser Glu 35

Gin 20 Thr

Val Gin

Val Lys

29 31 33

Leu Gin Glu

Ser Ser

Gly Val

Pro Gly Leu 30

Leu

Thr 40

25 cys

Pro

Ser

Leu

Ser

Ser

Gly 45

Gly

Ser

Ile

ser

Gly

Asp

Tyr

Tyr

Trp

Phe

Trp

Ile

Arg

Gin

Ser

Pro

Gly

Lys

Gly

35

50

55

00

Leu

Glu

Trp

Ile

Gly

Tyr

Xle

Tyr Gly

Ser

Gly

Gly

Gly

Thr

Asn

Tyr

37

65

70

75

80

Asn

Pro

Ser

Leu

Asn

Asn

Arg

Val

Ser

Ile

Ser

Ile

Asp

Thr

Ser

Lys

39

85

90

95

Asn

Leu

Phe

Ser

Leu

Lys

Leu

Arg

Ser

Val

Thr

Ala

Ala

Asp

Thr

Ala

41

100

105

110

43

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Sar

Asn

Ile

Leu

Lys

Tyr

Leu

His

Trp

Leu

Leu

RO 120198 Β1

115 120 125

Tyr Trp	Gly	Gin	Gly Val Leu Val Thr Val ser Ser Ala Ser Thr	Lys
	130	135	140
Gly	pro	Ser	Val	Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr ser	Glu
145				150	155	160
Ser	Thr	Ala	Ala	Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu	Pro
				165 170	175
Val	Thr	Val	Ser	Trp Asn Ser Gly Ala Leu	Thr Ser Gly Val His	Thr
			180	185	190
Phe	Pro	Ala	Val	Leu Gin Ser Ser Gly Leu	Tyr Ser Leu Ser Ser	Val
		195		200	20S
Val	Thr	Val	Pro	Ser Ser Ser Leu Gly Thr	Lys Thr Tyr Thr Cys	Asn
	210			215	220
Val	Asp	His	Lys	Pro Ser Asn Thr Lys Val	Asp Lys Arg Val Glu	Ser
225				230	235	240
Lys Tyr	Gly	Pro	Pro Cys Pro Pro Cys Pro	Ala Pro Glu Phe Glu	Gly
				245 250	255
Gly	pro	Ser	Val	Phe Leu Phe Pro Pro Lys	Pro Lys Asp Thr Leu	Met
			280	265	270
Xle	Ser	Arg	Thr	Pro Glu Val Thr Cys Val	Val Val Asp Val Ser	Gin
		275		280	285
Glu	Asp	Pro	Glu	Val Gin Phe Asn Trp Tyr	Val Asp Gly Val Glu	Val
	290			295	300
His	Asn	Ala	Lys	Thr Lys Pro Arg Glu Glu	Gin Phe Asn Ser Thr	Tyr
305				310	315	320
Arg	Val	Val	Ser	Val leu Thr Val Leu His	Gin Asp Trp Leu Asn	Gly
				325 330	335
Lys	GlU	Tyr	Lys	Cys Lys Val Ser Asn Lys	Gly Leu Pro Ser Ser	Ile
			340	345	350
GlU	Lys	Thr	Ile	ser Lys Ala Lys Gly Gin	Pro Arg Glu Pro Gin	Val
		355		360	355
Tyr	Thr	Leu	Pro	Pro Ser Gin Glu Glu Met	Thr Lys Asn Gin Val	Ser
	370			375	380
Leu	Thr	Cys	Leu	Val Lys Gly Phe Tyr Pro	Ser Asp Ile Ala Val	Glu
385				390	395	400
Trp	Glu	Ser	Asn	•Gly Gin Pro Glu Asn Asn	Tyr Lys Thr Thr Pro	Pro
				405 410	415
Val	Leu	ASp	ser	Asp Gly ser Phe Phe Leu	Tyr Ser Arg Leu Thr	Val
			420	425	430
Asp	Lys	Ser	Arg	Trp Gin Glu Gly Asn Val	Phe Ser Cys Ser Val	Met
		435		440	445
Hi»	Glu	Ala	Leu	His Asn His Tyr Thr Gin	Lys Ser Leu Ser Leu	Ser
	450			455	460

Leu Gly Ly» * 465

RO 120198 Β1 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 13 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 26 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: secvență lider VH1 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 13 ACTAAGTCGA CATGGACTGG ACCTGG 26 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 14 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 31 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: secvență lider VH2 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 14 ACTAAGTCGA CATGGACATA CTTTGTTCCA C 31 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 15 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 29 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță

RO 120198 Β1 (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: secvență lider VH3 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 15 ACTAAGTCGA CATGGAGTTT GGGCTGAGC 29 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 16 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 31 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: secvență lider VH4 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 16 ACTAAGTCGA CATGTCTGTC TCCTTCCTCA T 31 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 17 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 31 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: secvență lider VH5 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 17 ACTAAGTCGA CATGTCTGTC TCCTTCCTCA T 31 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 18 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 31 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară

RO 120198 Β1 (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) 1 (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI: 3 (A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM: 5 (A) CROMOZOM/SEGMENT: secvență lider VH6 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 18 ACTAAGTCGA CATGTCTGÎC TCCTTCCTCA T 31 9 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 19 11 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ: 13 (A) Lungime: 30 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic 15 (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară 17 (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu 19 (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță 21 (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: secvență lider VH1 cu situs Mlul 23 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 19 25

CGCAGCACCT ACGCGTGCCC ACTCCSACCT _3fl (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 20 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 30 perechi de baze 31 (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică 33 (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) 35 (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI: 37 (A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM: 39 (A) CROMOZOM/SEGMENT: secvență lider VH2 cu situs Mlul (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 20 GGCAGCASCY ACGCGTGCCC ACTCCGAGGT ₃₀ ⁴³ (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 21 45 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ: 47 (A) Lungime: 27 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic 49

RO 120198 Β1 (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: secvență lider VH3 cu situs Mlul (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 21 GCTATTTTCA CGCGTGTCCA GTGTGAG 27 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 22 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 27 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: secvență lider VH4 cu situs Mlul (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 22 GCTATTTTCA CGCGTGTCCA GTGTGAG 27 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 23 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 30 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: secvență lider VH5 cu situs Mlul (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 23 GGCTGTTCTC ACGCGTGTCT GTGCCGAGGT 30

RO 120198 Β1 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 24 1 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ: 3 (A) Lungime: 23 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic 5 (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară 7 (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu 9 (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță 11 (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: primer VH1, 3a, 5 cu situs Xho 13 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 24 15

CAGGTGCAGC TGCTCGAGTC TGG 23 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 25 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 23 perechi de baze 21 (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică 23 (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) 25 (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI: 27 (A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM: 29 (A) CROMOZOM/SEGMENT: primer VH2 cu situs Xho I (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 25 CAGGTGCAGC TGCTCGAGTC TGG 23 33 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 26 35 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ: 37 (A) Lungime: 23 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic 39 (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară 41 (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu 43 (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță 45 (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: primer VH3b cu situs Xho I 47

RO 120198 Β1 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 26 CAGGTGCAGC TGCTCGAGTC TGG 23 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 27 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 23 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: primer VH4 cu situs Xho I (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 27 CAGGTGCAGC TGCTCGAGTC TGG 23 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 28 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 23 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: primer VH6 Xho I (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 28 CAGGTGCAGC TGCTCGAGTC TGG 23 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 29 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 26 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI:

RO 120198 Β1 (A) ORGANISM: uman sau maimuță 1 (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: primer lgG1 -4 cu situs Nhel 3 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 29 5

GGCGGATGCG CTAGCTGAGG AGACGG ₂₆ (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 30 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 38 perechi de baze 11 (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică 13 (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) 15 (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI: 17 (A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM: 19 (A) CROMOZOM/SEGMENT: primer cu catenă ușoară kappa cu situs Bg1 II (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 30 ATCACAGATC TCTCACCATG GTGTTGCAGA CCCAGGTC _3S ²³ (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 31 25 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ: 27 (A) Lungime: 37 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic 29 (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară 31 (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu 33 (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță 35 (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: primer cu catenă ușoară kappa cu situs Bg1 II 37 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ. SECV. ID. NR. 31 39

ATCACAGATC TCTCACCATG G5GWCCCCWG CKCAGCT 37 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 32 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 41 perechi de baze 45 (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică 47

RO 120198 Β1 (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: primer cu catenă ușoară kappa cu situs Bg1 II (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 32 ATCACAGATC TCTCACCATG GACATGAGGG TCCCCGCTCA G 41 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 33 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 41 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: primer cu catenă ușoară lambdacu situs Bg1 II (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 33 ATCACAGATC TCTCACCATG GACATGAGGG TCCCCGCTCA G 41 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 34 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 39 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: primer cu catenă ușoară lambdacu situs Bg1 II (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 34 ATCACAGATC TCTCACCATG GCCTGGGCTC TGCTGCTCC 39

RO 120198 Β1 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 35 1 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ: 3 (A) Lungime: 39 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic 5 (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară 7 (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu 9 (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță 11 (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: primer cu catenă ușoară lambda cu situsBgl II 13 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 35 15

ATCACAGATC TCTCACCATG GCCTGGGCTC TGCTGCTCC 39 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 36 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 39 perechi de baze 21 (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică 23 (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) 25 (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI: 27 (A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM: 29 (A) CROMOZOM/SEGMENT: primer cu catenă ușoară lambda cu situs Bg1 II (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 36 ATCACAGATC TCTCACCATG GCCTGGGCTC TGCTGCTCC 39 ³³ (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 37 35 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ: 37 (A) Lungime: 39 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic 39 (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară 41 (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu 43 (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță 45 (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: primercu catenă ușoară lambda cu situsBgl II 47

RO 120198 Β1 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 37 ATCACAGATC TCTCACCATG GCCTGGGCTC TGCTGCTCC 39 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 38 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 38 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: primer cu catenă ușoară lambda cu situs Bg1 II (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 38 ATCACAGATC TCTCACCATG ACTTGGACCC CACTCCTC 38 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 39 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 36 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: primer cu catenă ușoară kappa cu situsuri Kpn1 și BsiW1 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 39 CCGTTTGATT TCCAGCTTGG TACCTCCACC GAACGT 36 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 40 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 30 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu

RO 120198 Β1 (vi) ORIGINEA SURSEI: 1 (A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM: 3 (A) CROMOZOM/SEGMENT: primercu catenă ușoară kappa cu situsuri Kpn1 și BsiW1 5 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 40 7

ACCTAGGACG GTAAGCTTGG TACCTCCGCC 30 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 41 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 30 perechi de baze 13 (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică 15 (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) 17 (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI: 19 (A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM: 21 (A) CROMOZOM/SEGMENT: primer cu catenă ușoară lambda cu situsuri

Hindlll și Kpn1 23 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 41 25

TGCACCATCC GTACGTTTGA TTTCCAGCTT 30 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 42 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 36 perechi de baze 31 (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică 33 (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) 35 (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI: 37 (A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM: 39 (A)CROMOZOM/SEGMENT: primer cu catenă ușoară lambda cu situsuri

Kpn1 41 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 42

ACCTAGGACG GTCASSTTGG TACCTCCGCC GAACAC 36 ⁴³ (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 43 45 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ: 47 (A) Lungime: 27 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic 49

RO 120198 Β1 (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: primer cu catenă ușoară lambda cu situsuri

Avrll (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 43 CTTGGGCTGA CCTAGGACGG TCAGCCG 27 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 44 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 17 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: primer cu catenă ușoară lambda cu situsuriAvrII (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 44 CCATGGACTG GACCTGG ’-⁷ (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 45 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 20 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: regiune variabilă cu catenă VH2 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 45 ATGGACATAC TTTGTTCCAC 20

RO 120198 Β1 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 46 1 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ: 3 (A) Lungime: 20 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic 5 (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară 7 (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu 9 (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță 11 (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: regiune variabilă cu catenă VH3 13 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 46 15

ATGGGGTCAA CCGCCATCCT 20 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 47 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 20 perechi de baze 21 (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică 23 (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) 25 (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI: 27 (A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM: 29 (A) CROMOZOM/SEGMENT: regiune variabilă cu catenă VH4 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 47 CCATGGAGTT TGGGCTGAGC 20 33 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 48 35 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ: 37 (A) Lungime: 20 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic 39 (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară 41 (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu 43 (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță 45 (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: regiune variabilă cu catenă VH5 47

RO 120198 Β1 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 48 CCATGGAGTT TGGGCTGAGC 20 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 49 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 20 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: regiune variabilă cu catenă VH6 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 49 CCATGGAGTT TGGGCTGAGC 20 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 50 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 16 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A)CROMOZOM/SEGMENT: regiune constantă cu catenă grea IgM (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 50 TTGGGGCGGA TGCACT ÎS (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 51 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 16 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță

RO 120198 Β1 (viii) POZIȚIE ÎN GENOM: 1 (A) CROMOZOM/SEGMENT: regiune constantă cu catenă grea IgM (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 51 GATGGGCCCT TGGTGGA 17 5 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 52 7 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ: 9 (A) Lungime: 21 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic 11 (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară 13 (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu 15 (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță 17 (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: regiune variabilă cu catenă ușoară kappa 19 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 52 21

CTCAÎTYRCT GCMCAGGGTC C 21 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 53 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 21 perechi de baze 27 (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică 29 (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) 31 (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI: 33 (A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM: 35 (A) CROMOZOM/SEGMENT: regiune variabilă cu catenă ușoară kappa (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 53 CTCAîTYRCT GCMCAGGGTC C 21 39 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 54 41 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ: 43 (A) Lungime: 19 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic 45 (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară 47

RO 120198 Β1 (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: regiune constantă cu catenă ușoară kappa (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 54 AACACAGATG GTGCAGCCA 19 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 55 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 20 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: regiune constantă cu catenă ușoară lambda (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 55 GGAACAGAGT GACCGAGGGG 20 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 56 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 30 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: primer PCR pentru regiune constantă gamma 4 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 56 GGGGGGATCC TCATTTACCC AGAGACAGGG 30 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 57 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 31 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic

RO 120198 Β1 (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: primer PCR pentru regiune constantă gamma 4 (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 57 GGGGGCTAGC ACCAAGGGCC CATCCGTCTT C (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 58 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 96 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: mutageneză PCT a gamma 4 uman (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 58 TCCTCAGCTA GCACCAAGGG GCCATCC (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID. NR. 59 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) Lungime: 27 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIP DE MOLECULĂ: ADN (genomic) (iv) Anti-sens: Nu (vi) ORIGINEA SURSEI:

(A) ORGANISM: uman sau maimuță (viii) POZIȚIE ÎN GENOM:

(A) CROMOZOM/SEGMENT: utageneză PCT a gamma 4 uman (xi) DESCRIERE SECVENȚĂ: SECV. ID. NR. 59 CCGGGAGATC ATGAGAGTGT CCTTGGGTTT TGGGGGGAAC AGGAAGACTG ATGGTCCCCC CTCGAACTCA GGTGCTGGGC ATGGTGGGCA TGGGGG

Claims (11)

Revendicări

1...5, pentru tratamentul sau profilaxia unei boli sau a unei afecțiuni inflamatorii cronice sau autoimune.

1) domenii constante ale izotipului gamma 4 uman nemodificat;

1. Anticorp himeric ce se leagă specific la CD4 uman, substanțial lipsit de activitatea de depleție a celulei T, caracterizat prin aceea că acesta cuprinde secvențele de aminoacizi din catena grea și ușoară dintr-un anticorp monoclonal de maimuță Old World, produs împotriva CD4 uman, o secvență a domeniului constant a catenei ușoare umane și o secvență a domeniului constant a catenei grele umane, selectate din grupul alcătuit din:

2. Anticorp himeric conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că secvențele de legare la antigen ale catenelor variabile grea și ușoară sunt prezentate în fig. 1 și 2.

2) domenii constante ale izotipului gamma 4 care au fost modificate prin mutageneză, pentru a dobândi stabilitate crescută, profil farmacocinetic schimbat, activitate redusă de legare a receptorului Fc, capacitate redusă de fixare a complementului și/sau activitate redusă de depleție a celulei T in vivo;

3. Anticorp himeric conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că acesta are una sau mai multe din următoarele proprietăți:

i. este lipsit de sau are activitate redusă de legare a receptorului Fc față de anticorpii himerici gamma I;

ii. prezintă capacitate redusă sau absentă de fixare la complement;

iii. prezintă profil farmacocinetic modificat;

iv. prezintă activitate de depleție a celulei T în vivo redusă sau absentă.

3) domeniu constant al izotipului gamma 4 cu mutații în poziția 236, prin substituirea leucinei cu acidul glutamic, și/sau în poziția 229, prin substituirea serinei cu prolina.

4. Anticorp himeric conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că acesta modifică sau reglează funcțiile imune legate de CD4, incluzând inducerea alergiei și apoptozei în celulele T.

5. Anticorp himeric conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că este ales din grupul format din CE9 gamma 4, CE9 gamma 4lambda kappa, CE9 gamma 4E și CE9 gamma 4PE.

6. ADN recombinant, caracterizat prin aceea că acesta codifică și susține expresia unui anticorp himeric, conform revendicărilor de la 1 la 5.

7. Procedeu pentru producerea unui anticorp himeric specific CD4, caracterizat prin aceea că acesta cuprinde exprimarea secvenței de ADN recombinant, conform revendicării 6, într-o celulă gazdă recombinantă.

8. Utilizarea unui anticorp himeric specific CD4, conform cu oricare din revendicările

9. Utilizare conform revendicării 8, în care boala respectivă sau afecțiunea inflamatorie, cronică sau autoimună, este aleasă din grupul format din artrită reumatoidă, boala inflamatorie a intestinului, psoriazis, diabet mellitus insulino-dependent, lupus eritematos sistemic, ciroză și scleroză multiplă.

10. Utilizarea unui anticorp himeric specific CD4, conform cu oricare din revendicările de la 1 la 5, pentru tratarea sau profilaxia unei boli sau afecțiuni non-autoimune.

11. Utilizare conform cu revendicarea 10, în care afecțiunea non-autoimună respectivă este aleasă din grupul constând din limfom, reacția de respingere a grefei față de gazdă, astm, respingerea transplantului și infecție HIV.