RS108904A - N,n-disupstituisani diazocikloalkani korisni za tretman poremećaja cns usled serotonergijske disfunkcije - Google Patents

Abstract

N,N-disupstituisani diazocikloalkani formule I (R1=halogen, R2 = (C3-C8)-cikloalkil, R3 = (C1-C4)-alkoksi ili (C1-C4)-haloalkoksi grupa, m je 1 ili 2, n je 1 ili 2) imaju afinitet prema serotoninergijskim receptorima. Ova jedinjenja i njihovi enantiomeri, dijastereomeri, N-oksidi, polimorfi, solvati i farmaceutski prihvatljive soli, su korisni pri tretmanu pacijenata sa neuromuskularnom disfunkcijom donjeg urinarnog trakta i bolesti povezanih sa receptorom 5-HT1A. Poželjni su 1,4-disupstituisani-piperazini (n=1). Poželjno je da R1 predstavlja F u polocaju 2, da R2 predstavlja cikloheksil i R3 je poželjno da predstavlja metoksi ili 2,2,2-trifluoroetoksi grupu. Poželjno je da je m jednako 1.

Description

N,N-DISUPSTITUISANI DIAZOCIKLOALKANI

KORISNI ZA TRETMAN POREMEĆAJA CNS

USLED SEROTONERGIJSKE DISFUNKCIJE

Ovaj pronalazak se odnosi na nove N,N-disupstituisane diazocikloalkane koji imaju afinitet prema serotoninergijskim receptorima, na njihove farmaceutske preparate i na upotrebu tih jedinjenja i preparata.

Kod sisara je mokrenje (uriniranje) kompleksan proces koji zahteva integrisano delovanje bešike, njenih internih i eksternih sfinktera, muskulature donjeg dela karlice i neurološku kontrolu svih ovih mišica na tri nivoa (u zidu bešike ili samom sfinkteru, u autonomnim centrima kičmene moždine i u centralnom nervnom sistemu, na nivou pontinskog centra za mokrenje (PMC) u sistemu mozga (pons) pod kontrolom cerebralnog korteksa) (De Groat, "Neurobiologv of Incontinence",Ciba Foundation Symposium,1990, 151, 27). Mokrenje je rezultat kontrakcije mišica detruzora, koji se sastoji od upletenih vlakana glatkih mišića, pod kontrolom parasimpatičkog autonomnog sistema koji potiče iz sakralnog dela kičmene moždine. Jednostavan refleks za pražnjenje pokreću senzorni nervi za bol, temperaturu i otpuštanje, koji polaze iz bešike prema sakralnom delu kičmene moždine. Međutim, senzorni trakt iz bešike stiže takođe do PMC, generišući nervne impulse koji normalno zaustavljaju refleksni luk kortikalne inhibicije suzbijajući sakralni deo kičmene moždine, i opuštajući mišiće donjeg dela karlice i spoljašnjeg sfinktera. Konačno, dolazi do kontrakcije mišića detruzora, i dolazi do pražnjenja. Abnormalnosti funkcije donjeg dela urinamog trakta, tj. dizurija, inkontinencija i eneureza, su uobičajeni kod opšte populacije. Dizuriju čini učestanost uriniranja, noćno mokrenje i hitna potreba, koji mogu biti izazvani cistitisom (uključujući intersticijalni cistitis), prostatitisom ili benignom hiperpazijom prostate (BPH) (koja se dešava kod 70% starijih muškaraca), ili neurološkim poremećajima. Sindromi inkontinencije su inkontinencija usled stresa, inkontinencija zbog hitne potrebe, inkontinencija usled prepunjavanja i mešovita inkontinencija. Eneureza se odnosi na nevoljno ispuštanje urina tokom noći ili za vreme spavanja.

Ranije, tretman neuromuskularne disfunkcije donjeg urinamog trakta je obuhvatao ordiniranje jedinjenja koja direktno deluju na mišiće bešike, kao što je favoxate, spazmolitički lek (Ruffman,J. Int. Med. Res.1988, 16, 317), koji je takođe aktivan za PMC (Guameri et al.,Dmgs of Today,1994, 30, 91), ili antiholinergijska jedinjenja, kao što je oxybutynin (Anderson,Drugs,1988, 36, 477) i tolterodin (Nilvebrant,Life Sci.,2001, 68, 22-23). Uobičajena je takođe upotreba antagonista a1-adrenergijskog receptora u tretmanu BPH, ali je zasnovana na različitom mehanizmu delovanja (Lepor,Urology,1993, 42, 483). Međutim, tretmani koji obuhvataju direktnu inhibiciju karlične muskulature (uključujući mišić detruzor) mogu imati neželjene sporedne efekte, kao što je nekompletno pražnjenje ili akomodacionu paralizu, tahikardiju i sušenje usta (Andersson,Drugs,1988, 35, 477). Stoga, bilo bi poželjno da se koriste jedinjenja koja deluju preko centralnog nervnog sistema, na primer, utiču na refleks sakralnog dela kičmene moždine i/ili puteve inhibicije PMC, na način koji obnavlja normalno funkcionisanje mehanizma mokrenja.

U U.S. Patent-u No. 5,346,896, opisani su agensi za vezivanje 5-HTia koji se mogu koristiti u tretmanu poremećaja CNS, kao što je Na primer, anksioznost.

U EP 0924205 opisana su jedinjenja piperazina koja se vezuju na receptore 5-HT-ia.

Ovaj pronalazak daje jedinjenja predstavljena opštom formulom I.

gde su

R<1>predstavlja atom halogena,

R<2>predstavlja (C3-C8)-cikloalkil grupa,

R<3>predstavlja (CrC4)-alkoksi ili (CrC4)-haloalkoksi grupa,

m je 1 ili 2, i

n je 1 ili 2,

i njihovi enantiomeri, optički izomeri, dijastereomeri, N-oksidi (npr. N-piperazin oksidi), kristalni oblici, hidrati, solvati ili farmaceutski prihvatljive soli.

Jedinjenja formule I mogu postojati kao četri stereoizomera, koji mogu biti prisutni u racemskim smešama, ili u bilo kojoj drugoj kombinaciji. Racemske smeše se mogu podvrći enantiomernom obogaćivanju, dajući obogaćene sastave određenim enantiomerom, ili se potpuno razdvojiti na pojedinačne enantiomere, ili sastave koji sadrže pojedinačne enantiomere. Enantiomerno obogaćivanje se može iskazati kao ee (višak enantiomera), kao što je definisano niže.

Poželjna su jedinjenja formule I u kojima atom ugljenika koji nosi R<1->fenil grupu, ima (R) konfiguraciju. Najpoželjnija su jedinjenja u kojima atom ugljenika, koji nosi R<1->fenil grupu, ima (R) konfiguraciju, a susedni atom ugljenika, koji istovremeno nosi R<2>i hidroksilnu grupu, ima (S) konfiguraciju.

Ovaj pronalazak se odnosi takođe na metabolite prethodnih jedinjenja formule I, koji imaju istu vrstu aktivnosti, i koji će se u nastavku nazivati aktivnim metabolitima.

Ovaj pronalazak obuhvata takođe prolekove, koji se metabolišu u telu, generišući bilo koje od prethodnih jedinjenja.

U sledećoj realizaciji, ovaj pronalazak daje farmaceutske preparate koji sadrže jedinjenja formule I, enantiomere, dijastereomere, N-okside, kristalne oblike, hidrate, solvate ili farmaceutski prihvatljive soli ovih jedinjenja formule I, pomešane sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačima ili nosačima.

U drugim realizacijama, ovaj pronalazak daje postupke za smanjivanje učestanosti kontrakcija bešike, zahvaljujući dilataciji bešike kod sisara (kao što je humano biće) kojima je isto potrebno, preko ordiniranja efikasne količine najmanje jednog jedinjenja iz ovog pronalaska, za smanjivanje učestanosti kontrakcija bešike, zahvaljujući dilataciji bešike, kod sisara.

U drugim realizacijama, ovaj pronalazak daje postupke za povećavanje urinamog kapaciteta bešike kod sisara (kao što je humano biće), kome je isto potrebno, preko ordiniranja efikasne količine najmanje jednog od jedinjenja iz ovog pronalaska, za povećanje urinamog kapaciteta bešike kod sisara.

Još jedna realizacija je postupak za tretman poremećaja urinamog trakta kod sisara (uključujući humano biće), kome je isti potreban, preko ordiniranja efikasne količine najmanje jednog od jedinjenja iz ovog pronalaska, da se ublaži najmanje jedno od stanja između: velike hitnosti uriniranja, preaktivne bešike, povećane učestanosti uriniranja, smanjenjog prilagođavanja uriniranju (smanjen urinarni kapacitet bešike), cistitisa (uključujući intersticijalni cistitis), inkontinencije, curenja urina, enureze, disurije, oklevanja uriniranja i teškoća u pražnjenju bešike.

Za tretiranje gornjih poremećaja, jedinjenja iz ovog pronalaska se mogu ordinirati u kombinaciji sa drugim agensima, kao Na primer, antimuskarinskim lekovima, a1-adrenergijskim antagonistima, inhibitorima enzima ciklooksigenaze, koji mogu inhibirati i COX1 i COX2 izoenzime, ili koji, alternativno mogu biti selektivni na COX2 izoenzim, i derivate njegovog donora NO.

U još jednoj realizaciji, ovaj pronalazak daje postupak za tretiranje sisara koji pati od poremećaja centralnog nervnog sistema (CNS), koji se manifestuje serotoninergijskom disfunkcijom, preko ordiniranja efikasne količine najmanje jednog jedinjenja iz ovog pronalaska za tretiranje poremećaja CNS. Ove disfukcije obuhvataju, ali bez ograničavanja, anksioznost, depresiju, hipertenziju, poremećaj ciklusa san/budnost, poremećaje u ishrani, poremećaje u ponašanju, seksualnu disfunkciju i kognitivne poremećaje kod sisara (naročito kod humanih bića), a koji su povezani sa moždanim udarom, povredom, demencijom i koji potiču od neurološkog razvoja, poremećaja smanjenja pažnje i hiperaktivnosti (ADHD), zavisnosti od lekova, odvikavanja od lekova, sindroma iritabilne utrobe. Tretman se može ostvariti oslobađanjem jedinjenja iz ovog pronalaska u okolnu sredinu serotoninergijskog receptora 5-HT1A, na primer u vanćelijsku sredinu (sistemskim ili lokalnim ordiniranjem tog jedinjenja sisaru koji poseduje takav receptor 5-HTia), u količini jedinjenja iz ovog pronalaska koja je efikasna za tretiranje gore pomenutih poremećaja.

U poželjnoj realizaciji, ovaj pronalazak daje postupke za tretiranje sisara (uključujući humano biće) koji pati od poremećaja urinamog trakta, ordiniranjem najmanje jednog jedinjenja iz ovog pronalaska u okolinu receptora 5HTiA, u količini koja je efikasna za povećavanje trajanja mirovanja bešike, bez kontrakcija. Još poželjnije je kada je povećanje trajanja mirovanja bešike praćeno malim ili nikakvim (npr. smanjenim ili povećanim) pritiskom mokrenja.

Poželjne R<2>cikloalkil grupe su one koje imaju 3 do 6 atoma ugljenika, na primer, ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil i cikloheksil grupe.

Naziv "halogen" obuhvata fluor, hlor, brom i jod.

Naziv "haloalkoksi" obuhvata monohaloalkoksi grupe, tj. alkoksi grupe supstituisane sa jednim atomom halogena, i polihaloalkoksi grupe, tj. alkoksi grupe supstituisane sa najmanje 2 atoma halogena. Poželjna haloalkoksi grupa je 2,2,2-trifluoroetoksi.

"Metabolif jedinjenja opisanog ovde je derivat jedinjenja koje se formira kada se to jedinjenje metaboliše. Naziv "aktivni metabolif se odnosi na biološki aktivni derivat jedinjenja koje se formira kada se to jedinjenje metaboliše. Naziv "metabolisan" odnosi se na zbir svih procesa kojima se posmatrana supstanca menja u živom telu. Sva jedinjenja koja su prisutna u telu bivaju unutar tela manipulisana enzimima, sa ciljem da daju energiju i/ili da se ista uklone iz tela. Specifični enzimi izazivaju specifične strukturne promene na takvom jedinjenju. Na primer, citohrom P450 katalizuje razne reakcije oksidacije i redukcije. Na primer, uridindifosfat glukuroniltransferaze katalizuju prenos molekula aktivirane glukuronske kiseline na aromatične alkohole, alifatične alkohole, karboksilne kiseline, amine i slobodne sulfhidrilne grupe. Dodatne informacije o metabolizmu mogu se dobiti iz "The Pharmacological Basis of Therapeutics", 9. izdanje, McGravv Hill (1966), strane 11-17.

Metaboliti ovde opisanih jedinjenja mogu se identifikovati ili ordiniranjem tih jedinjenja domaćinu, pa analizom uzoraka tkiva domaćina, ili inkubiranjem jedinjenja sa ćelijama jetre ili drugim sistemimain vitro,kao što su citohromi ili mikrozomi, pa analizom dobijenih jedinjenja. Oba postupka su dobro poznata u stanju tehnike.

Naziv "stereoizomer", kako se ovde koristi, odnosi se na jedinjenje napravljeno od istih atoma, vezanih istim vezama, ali koje ima različite trodimenzionalne strukture koje nisu uzajamno izmenljive. Ove trodimenzionalne strukture se nazivaju konfiguracijama. Naziv "enantiomer" kako se ovde koristi, odnosi se na dva stereoizomera čiji molekuli se jedan prema drugom ne odnose kao lik i predmet u ogledalu. Naziv "optički izomer" je ekvivalentan nazivu "enantiomer". Jedinjenja koja su jedno u odnosu na drugo stereoizomeri, ali jednou odnosu na drugo nisu enantiomeri, nazivaju se dijastereomeri. Nazivi "racemat" ili "racemska smeša" odnose se na smešu jednakih delova enantiomera. Naziv "hiralni centar" se odnosi na atom ugljenika za koji su vezane četiri različite grupe. Naziv "enantiomerno obogaćivanje", kako se ovde koristi, odnosi se na povećanje količine jednog enantiomera u odnosu na drugi. Pogodan način za iskazivanje enantiomernog obogaćivanja je koncept enantiomernog viška, koji se uobičajeno obeležava sa "ee", a koji se izračunava korišćenjem sledeće jednačine:

gde su: Ei je količina prvog enantiomera, a E2je količina drugog enantiomera. Dakle, ukoliko je početni odnos dva enantiomera 50:50, kao što je u racemskoj smeši, enantiomerno obogaćivanje, dovoljno da se dobije krajnji odnos 50:30 postiže se ako je ee u odnosu na prvi enantiomer jednako 80%. U skladu sa jednom realizacijom ovog pronalaska, poželjan je ee veći od 90%, poželjniji je ee veći od 95%, najpoželjniji je ee veći od 99%. Enantiomerno obogaćivanje određuje onaj ko je uobičajeno verziran u stanje tehnike, koristeći standardne tehnike i procedure, kao što su tečna hromatografija visoke performanse sa hiralnom kolonom. Izbor odgovarajuće hiralne kolone, eluenta i uslova potrebnih da se ostvari razdvajanje para enantiomera, je unutar znanja onog ko je uobičajeno verziran u stanje tehnike. Pored toga, enantiomere jedinjenja formule I može da razdvoji onaj ko je uobičajeno verziran u stanje tehnike, korišćenjem

standardnih tehnika, koje su dobro poznate u stanju tehnike, kao što su one koje su opisali Jacques et al. u "Enantiomers, Racemates and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981. Primeri tehnika razdvajanja su tehnike rekristalizacije ili hiralne hromatografije.

Dijastereomeri se razlikuju i po fizičkim osobinama i po hemijskoj reaktivnosti. Smeša dijastereomera se može razdvojiti u parove enantiomera na osnovu rastvorljivosti, frakcione kristalizacije ili hromatografskih svojstava, npr. tankoslojnom hromatografijom, hromatografijom na koloni, ili pomoću HPLC.

Prečišćavanje kompleksnih smeša dijastereomera u enantiomere tipično zahteva dva koraka. U prvom koraku, razdvaja se smeša dijasterepmera u parove enantiomera, kao što je opisano gore. U drugom koraku, parovi enantiomera se dalje prečišćavaju u preparate obogaćene jednim ili drugim enantiomerom, ili poželjnije, razdvajaju u preparate koji sadrže čiste enantiomere. Razdvajanje enantiomera tipično zahteva reakciju ili molekulsku interakciju sa hiralnim agensom, npr. rastvaračem ili matricom kolone. Razdvajanje enantiomera može se postići, na primer, konvertovanjem smeše enantiomera, npr. racemske smeše, u smešu dijastereomera, reakcijom sa čistim enantiomerom drugog agensa, tj. agensa za razdvajanje. Tada se dobijena dva dijastereomerna proizvoda mogu razdvojiti. Ovako razdvojeni dijastereomeri se zatim re-konvertuju u čiste enantiomere, obrnutom polaznom hemijskom transformacijom.

Razdvajanje enantiomera se može takođe obaviti preko razlika u njihovom ne-kovalentnom vezivanju za hiralnu supstancu, npr. hromatografijom ili sa homohiralnim absorbentima. Nekovalentnim vezivanjem enantiomera i hromatografskog adsorbenta nastaju dijastereomerni kompleksi, koji dovode do različitog učešća u mobilnoj fazi i različitih vezanih stanja u hromatografskom sistemu. Stoga, dva enantiomera se kreću kroz hromatografski sistem, npr. kolonu, različitim brzinama, što dozvoljava njihovo razdvajanje.

Kolone za hiralno razdvajanje su dobro poznate u stanju tehnike i komercijalno su dostupne (npr. iz MetaChem Technologies Inc., odeljak ANSYS Technologies, Inc., Lake Forest, CA). Enantiomeri se mogu analizirati i prečistiti, na primer, korišćenjem stacionarnih hiralnih faza (CSP) za HPLC. Kolone za hiralnu HPLC tipično sadrže jedan oblik enantiomernog jedinjenja, imobilisanog na površini silicijum-dioksida, kao materijala za pakovanje. Da bi došlo do hiralnog razdvajanja, moraju postojati najmanje tri mesta istovremene interakcije između CSP i jednog enantiomera analita, gde su jedna ili više tih interakcija stereohemijski zavisne.

Za postizanje hiralnog prepoznavanja, Tip I CSP su D-fenilglicin i L-leucin, koji koriste kombinacije p-p interakcija, vodonične veze, interakcije dipol-dipol i sterne interakcije. Da bi došlo do razdvajanja na koloni Tipa I, enantiomeri u analitu moraju posedovati funkcionalnost koja je komplementarna onoj na CSP, tako da ovaj analit podleže suštinskim interakcijama sa CSP. Poželjno je da uzorak sadrži jednu od sledećih funkcionalnih grupa: p-kiselina ili p-baza, donor i/ili akceptor vodonične veze, ili amidni dipol. Ponekad se koristi derivatiazcija da se dodaju interaktivna mesta onim jedinjenjima koja ih nemaju. Najčešći derivati su stvaranje amida iz amina i karboksilnih kiselina.

MetChiral ODM™ je Tip II CSP. Primarni mehanizam za stvaranje kompleksa rastvorena supstanca-CSP je preko privlačnih interakcija, ali važnu ulogu igraju takođe i inkluzioni kompleksi. Vezivanje vodonika, vezivanje pi-pi i dipola, su od značaja kod MetChiral™ ODM. Često je potrebna derivatizacija, kada molekul rastvorene supstance ne sadrži grupe potrebne za interakcije rastvorena supstanca-kolona. Derivatizacija, obično u benzilamide, potrebna je takođe i za neke jako polarne molekule, kao što su amini i karboksilne kiseline, koji bi inače stupali u suviše jake interakcije sa sekundarnom fazom, preko ne-stereohemijski specifičnih interakcija.

U skladu sa poželjnom realizacijom ovog pronalaska, R<1>u formuli I je atom fluora. Pored toga, poželjno je da R<1>predstavlja atom fluora u položaju 2 fenil prstena.

Poželjna grupa koju predstavlja R<2>, je nesupstituisana cikloheksil grupa.

Poželjan supstituent koji predstavlja R<3>je alkoksi, poželjnije metoksi, a najpoželjnije metoksi grupa u položaju 2 fenil prstena.

Poželjno jedinjenje iz ovog pronalaska je 1-[4-cikloheksil-4-hidroksi-3-(2-fluorofenil)-butil]-4-(2-metoksifenil)-piperazin, koje ima formulu II:

gde Z<1>i Z<2>predstavljaju hiralne centre. Jedinjenja formule II mogu postojati kao jedan od sledećih stereoizomera:

Ova jedinjenja se mogu imenovati kao što sledi: 1-[(3R,4S)-4-cikloheksil-4-hidroksi-3-(2-fluorofenil)-butil]-4-(2-metoksifenil)- piperazin;

1-[(3S,4R)-4-cikloheksil-4-hidroksi-3-(2-fluorofenil)-butil]-4-(2-metoksifenil)-piperazin;

1-[(3S,4S)-4-cikloheksil-4-hidroksi-3-(2-fluorofenil)-butil]-4-(2-metoksifenil)-piperazin; i

1-[(3R,4R)-4-cikloheksil-4-hidroksi-3-(2-fluorofenil)-butil]-4-(2-metoksifenil)-piperazin.

Jedinjenja formule II se mogu razdvojiti kao parovi dijastereomera, na primer, razdvajanjem pomoću TLC. Ovi parovi dijastereomera se odnose na:

dijastereomer sa višom vrednošću Rfu TLC; i

dijastereomer sa nižom vrednošću Rfu TLC.

Ovi dijastereomeri se mogu dalje obogatiti pojedinačnim enantiomerima, ili se može odvojiti pojedinačni enantiomer, korišćenjem metoda koje su dobro poznate u stanju tehnike, kao što su one koje su ovde opisane.

U sledećoj poželjnoj realizaciji, ovaj pronalazak daje jedinjenje: 1-[4-cikloheksil-4-hidroksi-3-(2-fluorofenil)-butil]-4-[2-(2,2,2-trifluoroetoksi)-fenil]-piperazin, koji može postojati u obliku četiri stereoizomera: 1-[(3R,4S)^-cikloheksil-4-hidroksi-3-(2-fluorofenil)-butil]-4-[2-(2,2,2- trifluoroetoksi)-fenil])-piperazin,

1-[(3S,4R)-4-cikloheksil-4-hidroksi-3-(2-fluorofenil)-butil]-4-[2-(2,2,2-trifluoroetoksi)-fenil])-piperazin,

1-[(3R,4R)-4-cikloheksil-4-hidroksi-3-(2-fluorofenil)-butil]-4-[2-(2,2,2-trifluoroetoksi)-fenil])-piperazin, i

1-[(3S,4S)-4-cikloheksil-4-hidroksi-3-(2-fluorofenil)-butil]-4-[2-(2,2,2-trifluoroetoksi)-fenil])-piperazin,

i njihovi enantiomeri, optički izomeri, dijastereomeri, N-oksidi (npr. N-piperazin-oksidi), kristalni oblici, hidrati, solvati i farmaceutski prihvatljive soli.

Poželjni su (3R,4S) i (3R,4R), a najpoželjniji je (3R.4S).

Tretmani kombinacijama

U nekim realizacijama, poremećaji urinamog trakta se tretiraju ordiniranjem jedinjenja formule I u kombinaciji sa dodatnim antagonistom 5-HTiaili sa antagonistom jedne ili više dodatnih klasa receptora. U poželjnim realizacijama, jedinjenje formule I se ordinira u kombinaciji sa antagonistom a1-adrenergijskog, ili muskarinskog receptora.

U drugim realizacijama, bolest donjeg dela urinamog trakta se tretira ordiniranjem jedinjenja formule I, u kombinaciji sa jednim ili više inhibitora enzima ciklooksigenaze, koje mogu predstavljati oba izoenzima COX-1 i COX-2, od kojih, alternativno, selektivan može biti izoenzim COX-2 i njegovi derivati donora

NO.

Primeri antimuskarinskih lekova za ordiniranje u kombinaciji sa jedinjenjem formule I, su oxybutynin, tolterodine, darifenacin i temiverine.

Jedinjenje formule I se može ordinirati u kombinaciji sa a1-adrenergijskim antagonistima, za terapiju simptoma donjeg urinamog trakta, bez obzira da li su isti povezani sa BPH. Poželjni a1-adrenergijski antagonisti, pogodni za ordiiranje u kombinaciji sa jedinjenjem formule I, su Na primer, prazosin, doxazosin, terazosin, alfuzosin i tamsulosin. Dodatni a1-adrenergijski antagonisti, pogodni za ordiniranje u kombinaciji sa jedinjenjem formule I, su opisani u U.S. Patent-ima No. 5,990,114, 6,306,861, 6,365,591, 6,387,909 i 6,403,594.

Primeri antagonista 5-HTiA, koji se mogu ordinirati u kombinaciji sa jedinjenjem formule I, nalaze se u Leonardi et al.,J. Pharmacol. Exp. Ther.2001, 299, 1027-1037 (npr. Rec 15/3079), u U.S. Patent-u No. 6,071,920, a različiti su od derivata piperazina koji su opisani u WO 99/06383 i u priključenoj U.S. Patent Application Serial No. 10/266,088 i 10/266,104, podnetim 7. oktobra 2002. Dodatni antagonisti 5-HT-ia su DU-125530 i srodna jedinjenja, opisana u U.S. Patent No. 5,462,942, i robalzotan i srodna jedinjenja, opisani u WO 95/11891.

Primeri selektivnih inhibitora COX-2, koji se mogu ordinirati u kombinaciji sa jedinjenjem formule I, ali bez ograničavanja, su nimesulide, meloxicam, rofecoxib, celecoxib, parecoxib i valdecoxib. Dodatni primeri selektivnih inhibitora COX-2 su opisani, ali bez ograničavanja, u U.S. Patent-u No. 6,440,963. Primeri ne-selektivnih inhibitora COX-1 i COX-2 su, ali bez ograničavanja, acetilsalicilna kiselina, nifluminska kiselina, flufenaminska kiselina, enfenaminska kiselina, meclofenaminska kiselina, tolfenaminska kiselina, tiaprofenska kiselina, ibuprofen, naproxen, ketoprofen, flubiprofen, furprofen, indomethacin, acemethacin, proglumethacin, ketorolac, diclofenac, etodolac, sulindac, fentiazac, lornoxicam, cynnoxicam, ibuproxam, nabumetone, tolmentin, amtolmetin. Dakle, svaki od prethodnih primera, ali bez ograničavanja, može se ordinirati u kombinaciji sa jedinjenjem formule I.

Primeri derivata inhibitora COX, koji se mogu ordinirati u kombinaciji sa jedinjenjem formule I, su derivati inhibitora COX koji imaju nitratnu (nitrooksi) ili nitritnu grupu, kao što su oni koji su dati, na primer, u WO 98/09948, koji su u stanju da oslobađaju NOin vivo.

Farmaceutski preparati

Ovaj pronalazak daje još farmaceutske preparate koji sadrže jedinjenje formule I, ili enantiomer, dijastereomer, N-oksid, kristalni oblik, hidrat, solvat, aktivni metabolit ili farmaceutski prihvatljivu so tog jedinjenja. Ovaj farmaceutski preparat može takođe da sadrži opcione aditive, kao što su farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač, aromu, zaslađivač, prezervativ, boju, vezivo, agens za suspendovanje, agens za dispergovanje, agens za bojenje, dezintegrant, dodatak, razblaživač, lubrikant, poboljšavač absorpcije, baktericid i slično, stabilizator, plastifikator, jestivo ulje, ili bilo koju kombinaciju dva ili više pomenutih aditiva.

Pogodni farmaceutski prihvatljivi nosači su, ali bez ograničavanja, etanol, voda, glicerin, gel aloe vera, alantoin, glicerin, vitamin-A i -E u ulju, mineralno ulje, slani fosfatni pufer, PPG2 miristilpropionat, magnezijum-karbonat, kalijum-fosfat, biljno ulje, životinjsko ulje i solketal.

Pogodna veziva su, ali bez ograničavanja, škrob, želatin, prirodni šećeri, kao što su glukoza, saharoza i laktoza, zaslađivači iz kukuruza, prirodne i sintetske gume, kao što su akacija, tragant, biljna guma, natrijum-alginat, karboksimetilceluloza, polietilenglikol, voskovi i slično.

Pogodni dezintegratori su, ali bez ograničavanja, škrob, kao što je kukuruzni škrob, metilceluloza, agar, bentonit, ksantan guma i slično.

Pogodni lubrikanti su, ali bez ograničavanja, natrijum-oleat, natrijum-stearat, magnezijum-stearat, natrijum-benzoat, natrijum-acetat, natrijum-hlorid i slično.

Pogodan agens za suspendovanje je, ali bez ograničavanja, bentonit.

Pogodni agensi za suspendovanje i dispergovanje su, ali bez ograničavanja, sintetske i prirodne gume, kao što su biljna guma, tragant, akacija, alginat, dekstran, natrijum-karboksimetilceluloza, metilceluloza, polivinilpirolidon i želatin.

Pogodna jestiva ulja su, ali bez ograničavanja, ulje pamučnih semenki, susamovo ulje, kokosovo ulje i kikirikijevo ulje.

Primeri aditiva su, ali bez ograničavanja, sorbitol, talk, stearinska kiselina i dikalcijum-fosfat.

Oblici jedinične doze

Farmaceutski preparati se mogu formulisati u oblike jedinične doze, kao što su tablete, pilule, kapsule, bolusi, prahovi, sterilni parenteralni rastvori, sterilne parenteralne suspenzije, sterilne parenteralne emulzije, eliksiri, tinkture, odmereni aerosolni ili tečni sprejovi, kapi, ampule, uređaji za samoubrizgavanje i supozitorije. Oblici jedinične doze se mogu koristiti za oralno, parenteralno, intranazalno, sublingvalno ili rektalno ordiniranje, ili za ordiniranje inhalacijom ili insuflacijom, kao transdermalni flasteri i liofilizovani preparati. Obično, može se koristiti bilo koje oslobađanje aktivnih sastojaka, koje dovodi do sistemske dostupnosti tih sastojaka. Poželjno je da je oblik jedinične doze oralni oblik za doziranje, najpoželjnije čvrsta oralnia doza; stoga su poželjni oblici za doziranje tablete, pilule i kapsule. Međutim, poželjni su takođe i parenteralni preparati.

Čvrsti oblici jedinične doze se mogu dobiti mešanjem aktivnih agenasa iz ovog pronalaska sa farmaceutski prihvatljivim nosačem i bilo kojim poželjnim aditivima, koji su opisani gore. Tipično, smeša se meša dok se ne dobije homogena smeša aktivnog sastojka iz ovog pronalaska i bilo kojih drugih, poželjnih aditiva, tj. aktivni sastojci su ravnomerno dispergovani kroz takav preparat. U tom slučaju preparat se može formirati kao suve ili vlažne granule.

Oblici za doziranje se mogu formulisati, na primer u oblike za doziranje "sa neposrednim oslobađanjem". Oblici za doziranje "sa neposrednim oslobađanjem" tipično se formulišu kao tablete, koje oslobađaju najmanje 60%-90% aktivnog sastojka unutar 30-60 min, kada se testiraju u testu rastvaranja leka, videti npr. U.S. Pharmacopeia standard <711>. U poželjnoj realizaciji oblici za doziranje sa neposrednim oslobađanjem oslobađaju 75% aktivnog sastojka unutar oko 45 min.

Oblici za doziranje mogu se takođe formulisati, na primer, kao oblici za doziranje "sa kontrolisanim oslobađanjem". Ekvivalentni su termini oblika za doziranje sa "kontrolisanim", "uzdržanim", "produženim" ili "vremenskim oslobađanjem", kojima se opisuje vrsta oslobađanja aktivnog agensa koja se dešava prilikom oslobađanja aktivnog agensa iz tečnog nosača predviđenom brzinom ili brzinom sa kojom se može manipulisati unutar nekog perioda vremena, koje je obično reda veličina od nekoliko minuta, sati ili dana, tipično se kreće od oko šezdeset minuta do oko 3 dana, a ne da se disperguje neposredno nakon ulaska u digestivni trakt, ili nakon kontakta sa želudačnim sokovima. Brzina kontrolisanog oslobađanja varira u zavisnosti od brojnih faktora. Faktori koji utiču na brzinu oslobađanja kod kontrolisanog uslobađanja, su veličina čestica, sastav, poroznost, struktura naboja i stepena hidratacije tečnog nosača za oslobađanje i jednog ili više aktivnih sastojaka, kiselosti sredine (bilo interne ili eksterne u odnosu na tečni nosač za oslobađanje) i rastvorljivosti aktivnog agensa u fiziološkoj sredini, tj. posmatranoj lokaciji duž digestivnog trakta. Tipični parametri za test rastvaranja oblika za kontrolisano oslobađanje se nalaze u U S: Pharmacopeia <724>.

Oblici za doziranje mogu, u skladu sa rečenim, da se formulišu tako da oslobađaju aktivni agens u više faza, pri čemu se prva frakcija aktivnog sastojka oslobađa prvom brzinom, a najmanje druga frakcija aktivnog sastojka se oslobađa drugom brzinom. U poželjnoj realizaciji oblik za doziranje se može formulisati tako da oslobađa aktivni sastojak na dvofazni način, koji se sastoji od prve "faze za neposredno oslobađanje", tokom koje se frakcija aktivnog sastojka oslobađa gore pomenutom brzinom za neposredno oslobađanje iz oblika za doziranje, i druge "faze za kontrolisano oslobađanje", u kojoj se ostatak aktivnog sastojka oslobađa na način kontrolisanog oslobađanja, kako je opisan gore za oblike za doziranje sa kontrolisanim oslobađanjem. Tablete ili pilule se mogu obložiti ili drugačije pripremiti, tako da formiraju oblik jedinične doze koji ima odloženo i/ili uzdržano delovanje, kao što su oblici jedinične doze za kontrolisano oslobađanje i odloženo oslobađanje. Na primer, tableta ili pilula može da sadrži komponentu unutrašnje doze i spoljašnje doze, ova poslednja je u obliku sloja ili obloge preko prethodne. Ove dve komponente mogu biti razdvojene enteričkim slojem, koji služi da se odupre dezintegraciji u stomaku i dozvoli da unutrašnja komponenta prođe u dvanaestopalačno crevo, ili da joj se odloži oslobađanje.

Biodegradabilni polimeri za kontrolisano oslobađanje aktivnog sastojka su, ali bez ograničavanja, polimlečna kiselina, poliepsilon-kaprolakton, polihidroksi-buterna kiselina, poliortoestri, poliacetali, polihidropirani, policijanoakrilati i umreženi ili amfipatički blok kopolimeri hidrogelova.

Za tečne oblike za doziranje, aktivne supstance ili njihove fiziološki prihvatljive soli, se rastvaraju, suspenduju ili emulguju, opciono sa supstancama koje se obično koriste, kao što su stabilizatori, emulgatori i druga pomoćna sredstva. Rastvarači za aktivne kombinacije i odgovarajuće fiziološki prihvatljive soli, mogu biti voda, fiziološki slani rastvori ili alkoholi, npr. etanol, propandiol ili glicerin. Pored toga, u ovom pronalasku se mogu takođe koristiti smeše raznih rastvarača.

Ovaj pronalazak podrazumeva takođe i oblik za transdermalno doziranje. Transdermalni oblici mogu biti difuzioni transdermalni sistemi (transdermalni flasteri), koji koriste ili rezervoar fluida ili sistem matrice leka u adhezivu. Drugi transdermalni oblici za doziranje su, ali bez ograničavanja, površinski gelovi, losioni, masti, transmukozalni sistemi i uređaji i sistemi za jontoforetsko oslobađanje (električna difuzija). Transdermalni oblici za doziranje se mogu koristiti za odloženo oslobađanje i uzdržano oslobađanje aktivnog agensa iz ovog pronalaska.

Farmaceutski preparati i oblici jedinične doze iz ovog pronalaska za parenteralno ordiniranje, a naročito injekcijama, tipično obuhvataju farmaceutski prihvatljiv nosač, kao što je opsiano gore. Poželjan tečni nosač je biljno ulje. Injekcija može biti, na primer, intravenozna, epiduralna, intratekalna, intramuskularna, intraluminalna, intratrahealna ili subkutana.

Aktivni agensi se mogu takođe ordinirati u obliku lipozomskih sistema za oslobađanje, kao što su mali unilamelarni mehurići, veliki unilamelami mehurići i multilamelami mehurići. Lipozomi se mogu formirati od raznih fosfolipida, kao što su holesterol, stearilamin ili fosfatidilholini.

Aktivni agensi iz ovog pronalaska se mogu takođe kuplovati sa rastvornim polimerima, kao što su nosači leka na ciljano mesto. Ti polimeri su, ali bez ograničavanja, polivinilpirolidon, kopolimeri pirana, polihidroksipropilmetakril-amidofenol, polihidroksietilasparaginamidofenol i polietilenoksipolilizin, sa supstituisanim palmitoil ostacima.

Ordiniranje

Farmaceutski preparat ili oblici jedinične doze iz ovog pronalaska mogu se ordinirati raznim putevima, kao što su oralni i enteralni, intravenozni, intramuskularni, subkutani, transdermalni, transmukozalni (uključujući rektalni i bukalni) i inhalaconi. Poželjno je da se koriste oralni ili transdermalni put (tj. u čvrstim ili tečnim formulacijama, ili kao transdermalni flasteri, respektivno). Farmaceutski preparat ili oblici jedinične doze sadrže efikasnu količinu jedinjenja iz ovog pronalaska i mogu se ordinirati animalnom, poželjno humanom biću, kome je potreban tretman neuromuskularne disfunkcije donjeg urinamog trakta, kao što je opisao EJ. McGuire u "Campbell's UROLOGV, 5. izdanje, 616-638, VV.B.Saunders Companv, i pacijentima koji su ugroženi bilo kakvom fziološkom disfunkcijom, povezanom sa neusklađenošću funkcije receptora 5-HTia. Ovakve disfunkcije su, bez ograničavanja, poremećaji centralnog nervnog sistema, kao što su depresija, anksioznost, poremećaji u ishrani, seksualna disfunkcija, zavisnosti i srodni problemi.

Naziv "efikasna količina", kako se ovde koristi, odnosi se na količinu koja dovodi do merljivog ublažavanja najmanje jednog od simptoma ili parametara specifičnog poremećaja. U poželjnoj realizaciji, ovo jedinjenje tretira poremećaje urinamog trakta, kao što su iznenadna hitnost uriniranja, preaktivna bešika, povećana učestanost uriniranja, smanjeno prilagođavanje uriniranju (smanjeni kapacitet bešike), cistitis (uključujući interstcijalni cistitis), inkontinencija, curenje urina, enureza, disurija, oklevanje sa uriniranjem i teškoće pri pražnjenju bešike, ili poremećaje centralnog nervnog sistema usled serotonergijske disfunkcije (kao što su anksioznost, depresija, hipertenzija, poremećaj ciklusa spavanje/budnost, ponašanje u ishrani, seksualna funkcija i kognitivni poremećaj kod sisara (naročito humanog bića), koji su povezani sa moždanim udarom, povredom, demencijom i usled neurološkog razvoja, poremećaje usled hiperaktivnosti, povezane sa nedostajanjem pažnje (ADHD), zavisnosti od lekova, odvikavanja od zavisnosti od lekova, sindroma iritabilne utrobe.

Farmaceutski preparat ili oblik jedinične doze iz ovog pronalaska se mogu ordinirati u skladu sa režimima doziranja i ordiniranja koji su definisani rutinskim testiranjem, u svetlu uputstava datih gore, sa ciljem određivanja optimalne aktivnosti, uz minimiziranje toksičnih ili sporednih efekata kod posmatranog pacijenta. Međutim, ovo fino podešavanje terapeutskog režima je rutina u smislu uputstava datih ovde.

Doza aktivnih agenasa iz ovog pronalaska može da varira u skladu sa mnoštvom faktora, kao što su oni koji su obuhvaćeni stanjima bolesti, stanjem, masom, polom i starošću subjekta, i načinom ordiniranja. Efikasna količina za tretiranje nekog poremećaja lako se može odrediti empirijskim metodama, koje su poznate onima koji su uobičajeno verzirani u stanje tehnike, na primer, uspostavljanjem matrice doza i učestanosti ordiniranja i poređenja grupe eksperimentalnih jedinki ili subjekata u svakoj tački ove matrice. Tačna količina koja se može ordinirati pacijentu variraće zavisno od mesta i ozbiljnosti poremećaja i fizičke kondicije pacijenta. Merljivo ublažavanje bilo koga od simptoma ili parametara može odrediti osoba verzirana u stanje tehnike, ili se može saopštiti od strane pacijenta lekaru. Podrazumeva se da je unutar obima ovog pronalaska bilo koje klinički ili statistički značajno umanjenje ili ublažavanje bilo kog od simptoma ili parametara poremećaja urinamog trakta. Klinički značajno umanjenje ili ublažavanje znači da se može opaziti od strane pacijenta i/ili lekara.

Na primer, pacijent može da pati od nekoliko simptoma disurije istovremeno, kao što su Na primer, iznenadna hitnost i povećana učestanost uriniranja ili oboje, a da se isti mogu smanjiti korišćenjem postupka iz ovog pronalaska. U slučaju inkontinencije, bilo koje smanjenje učestanosti ili zapremine neželjenog ispuštanja urina smatra se korisnim efektom u postupku tremana iz ovog postupka.

Količina agensa koja treba da se ordinira može da se kreće između oko 0,01 i oko 25 mg/kg/dan, poželjno između oko 0,1 i 10 mg/kg/dan, a najpoželjnije između 0,2 i 5 mg/kg/dan. Podrazumeva se da farmaceutske formulacije iz ovog pronalaska nije neophodno da sadrže celokupnu količinu agensa koja je efikasna u tretmanu tog poremećaja, zato što se te efikasne količine mogu dostići ordiniranjem više doza takvih farmaceutskih formulacija.

U poželjnoj realizaciji ovog pronalaska, jedinjenja se formulišu u kapsule ili

tablete, koje poželjno sadrže 50 do 200 mg jedinjenja iz ovog pronalaska, i poželjno je da se ordiniraju pacijentu kao ukupna dnevna doza od 50 do 400 mg, poželjno 150 do 250 mg, a najpoželjnije oko 200 mg, za ublažavanje uriname inkontinencije i disfunkcija u okviru tretmana sa ligandom receptora 5-HTia. Ukupne dnevne doze se mogu ordinirati višestrukim ordiniranjem, npr. kroz 4 sub-doze na dan. U poželjnim realizacijama ukupna dnevna doza se ordinira u 1 ili 2 doze na dan.

Farmaceutski preparat za parenteralno ordiniranje sadrži od oko 0,01 mas% do oko 100 mas% aktivnih sastojaka iz ovog pronalaska, na bazi 100% ukupne mase farmaceutskog preparata.

Obično, oblici za transdermalno doziranje sadrže od oko 0,01 mas% do oko 100 mas% aktivnih sastojaka, u odnosu na 100% ukupne mase oblika za doziranje.

Farmaceutski preparat ili oblik jedinične doze se mogu ordinirati u jednoj dozi na dan, ili se ukupna dnevna doza može ordinirati u podeljenim dozama. Pored toga, može biti poželjno istovremeno ordiniranje ili sekvencijalno ordiniranje drugog jedinjenja u tretmanu tog poremećaja. Primeri ovakvih kombinovanih tretmana su opisani gore.

U kombinovanom tretmanu, u kome su jedinjenja u odvojenim formulacijama za doziranje, ova jedinjenja se mogu ordinirati paralelno, ili se svako može ordinirati u odvojenim predviđenim vremenima. Na primer, jedinjenje iz ovog pronalaska se može ordinirati ujutru, a antimuskarinsko jedinjenje se može ordinirati uveče, ili obrnuto. I druga jedinjenja se mogu ordinirati takođe u specifičnim intervalima. Redosled ordiniranja će zavisiti od mnoštva faktora, uključujući starost, masu, pol i medicinsko stanje pacijenta; ozbiljnost i etiologiju poremećaja koji treba da se tretira, put ordiniranja, bubrežne i jetrene funkcije pacijenta, istorije tretiranja pacijenta i odgovora pacijenta na terapiju. Određivanje redosleda ordiniranja može da se fino podešava, a to fino podešavanje je u okviru uputstava koja se ovde daju.

Upoterba/ postupci tretmana

Bez želje vezivanja za neku teoriju, smatra se da ordiniranje antagonista receptora 5-HTia smanjuje ili sprečava neželjenu aktivnost sakralnog refleksa i/ili kortikalnih mehanizama koji kontrolišu mokrenje. Dakle, podrazumeva se da se široki opseg neuromuskularnih disfunkcija donjeg urinamog trakta može tretirati korišćenjem jedinjenja iz ovog pronalaska, uključujući, ali bez ograničavanja, disuriju, inkontinenciju i enurezu (preaktivnu bešiku). Disurija obuhvata učestanost uriniranja, noćno uriniranje, naglu potrebu, smanjeno prilagođavanje uriniranju (smanjen kapacitet bešike), teškoće u pražnjenju bešike, tj. prilikom mokrenja se izbacuje suboptimalna zapremina urina. Sindromi inkontinencije su inkontinencija usled stresa, inkontinencija zbog nagle potrebe i inkontinencija usled eneureze, kao i mešoviti oblici inkontinencije. Eneureza se odnosi na nevoljno ispuštanje urina tokom noći ili tokom spavanja.

Jedinjenja iz ovog pronalaska mogu takođe biti korisna u tretmanu poremećaja centralnog nervnog sistema usled serotonergijske disfunkcije.

Sinteza jedinjenja iz ovog pronalaska.

Jedinjenja iz ovog pronalaska obično se dobijaju u skladu sa sledećim shemama:

Grupe A i R su iste, a R<2>i R<1>su definisane u opštoj formuli (I). Grupa B je ekvivalentna grupi R<3->fenil, kao što je definisano za opšte jedinjenje formule (I). R4 predstavlja alkil.

Polazni materijal (1) se tretira bazom, poželjno kalijum-terc-butoksidom, a zatim alkilovanjem sa 2-bromometilacetaldehid-dialkilacetalom ili drugim 2-haloacetanilidom sa zaštićenim karbonilom (npr. R<4>alkil grupe se takođe mogu pripojiti prstenu, dajući dioksolan ili prsten dioksana). Druge, alternativne i odgovarajuće baze za obavljanje ove kondenzacije su litijum-amidi, natrijum-hidrid, natrijum-hidroksid, kalijum-hidroksid, kalijum-karbonat, cezijum-karbonat i slično, uz pomoć ili bez nje, katalizatora prenosa faza.

Poželjno je da se ova reakcija obavlja u rastvaraču kao što je dimetilsulfoksid ili toluen, na tempeaturi od 0°C do refluksa.

Tretman (2) sa kiselinom, kao što je hlorovodonična kiselina ili p-toluensulfonska kiselina, ili trifluorosirćetna kiselina, u pogodnom organskom rastvaraču, daje aldehid (3). Obično se ova reakcija vodi u protonskom rastvaraču, kao što je smeša kiseline u vodi i acetona ili tetrahidrofurana, na temperaturama od oko 5°C do oko 75°C, poželjno na temperaturi okoline. Poželjan sličan postupak sastoji se od obavljanja reakcije u smeši trifluorosirćetne kiseline u vodi i hlorovanog rastvarača, na temperaturi okoline.

Aldehid (3) se kupluje sa željenim arildiazocikloalkanom (4) po proceduri redukcionog aminovanja, dajući (5). Poželjno je da se ova reakcija vodi na temperaturi okoline u ne-reaktivnom rastvaraču, kao što je dihloroetan, ili metilenhlorid, ili hloroform, u prisustvu natrijum-triacetoksiborohidrida, a suštinski se završava za jedan do 24 h (videti Na primer, A.F. Abdel-Magid, et al.,J. Org. Chem.,1996, 61., 3849), ili se može voditi u protonskom rastvaraču (npr. metanol), uz pomoć natrijum-cijanoborhidrida, opciono u prisustvu molekulskih sita.

Redukcija (5) u alkohol (I) lako se obavlja korišćenjem redukcionog sredstva, kao što je natrijum-borhidrid, ili diizobutilaluminijum-hidrid, ili drugi aluminijum- ili bor-hidridi, ili drugi postupak redukcije, da se konvertuje keton u alkohol, što je vrlo dobro poznato verziranim u stanje tehnike, da bi se dobilo hidroksi jedinjenje (I). Poželjno je da se ova reakcija vodi u organskom rastvaraču, kao što su metanol, ili metilenhlorid, ili tetrahidrofuran, na tempoperaturi od oko -20°C do temperature okoline.

Polazni materijal (1) je ili komercijalno dostupan, ili se može dobiti kuplovanjem odgovarajućeg Weinreb-ovog amida (6) (videti, Nahm i VVeinreb,Tetrahedron Leti.,1981, 22, 3815) sa (7), kao što opisuje gornja Shema 2, gde je M so metala, kao što su litijum- i magnezijum-halid.

Poželjno je da se reakcija vodi u inertnoj atmosferi, poželjno u azotu, u aprotonskom rastvaraču, kao što je tetrahidrofuran, na temperaturi okoline ili nižoj, sve do -78°C.

Alternativno, estar strukture ACOOalkil, može se tretirati sa supstituisanim benzilmagnezijum-hloridom ili benzilmagnezijum-bromidom, pod standardnim uslovima, dobro poznatim u stanju tehnike, dajući keton strukture (1).

Poželjan i sličan put sinteze (1) je kuplovanje acil halida, sa jedinjenjem (7), katalizovano sa paladijumom, gde M predstavlja Zn-halid.

Određenije, jedinjenje formule (5) se može dobiti procedurom koja je opisana u Shemi 3. Svi supstituenti, ukoliko se drugačije ne naznači, su definisani ranije. Reagensi i polazni materijali su lako dostupni onome ko je uobičajeno verziran u stanje tehnike.

U Shemi 3, korak A, na primer, dodaje se cikloheksankarbonilhlorid u smešu pogodnog benzilcink-hlorida ili bromida, uz odgovarajući paladijumov katalizator, npr. dihlorobis(trifenilfosfm)paladijum(ll), uz mešanje na 0°C, u rastvaraču, kao što je tetrahidrofuran. Posle toga, nastavi se sa mešanjem na temperaturi okoline još 4-24 h. Zatim se reakcija prekida, na primer zasićenim rastvorom amonijum-hlorida u vodi. Uobičajena procedura obrade ekstrakcijom, daje keton (8). Keton (8) se može prečistiti tehnikama dobro poznatim u stanju tehnike, kao što su fleš hromatografija na silikagelu, uz pogodan eluent, kao što je etilacetat/heksan, dajući prečišćen materijal. Alternativno, sirovi keton (8) se može preneti u korak

B.

U Shemi 3, korak B, keton (8) se alkiluje sa bromoacetaldehid-dietilacetalom, pod dobro poznatim uslovima u stanju tehnike, dajući jedinjenje strukture (9). Na primer, rastvori se keton (8) u pogodnom organskom rastvaraču, kao što je dimetilsulfoksid ili toluen, pa tretira sa viškom pogodne baze, kao što je kalijum-terc-butoksid. Ova reakcija se meša oko 15 do 30 min na temperaturi između 0°C i temperature refluksa rastvarača, pa se reakciji u kapima dodaje bromoacetaldehid-dietilacetal. Onome ko je uobičajeno verziran u stanje tehnike je jasno da se umesto odgovarajućeg dietilacetala može koristiti bromoacetaldehid-etilenacetal i slično.

U Shemi 3, korak C, jedinjenje (9) hidrolizuje u kiselim uslovima, dajući aldehid (10), na način koji je analogan proceduri opisanoj u Shemi I. Određenije, na primer jedinjenje (9) se rastvori u pogodnom organskom rastvaraču, kao što je dihlorometan, pa se tretira pogodnom kiselinom, kao što je trifluorosirćetna kiselina u vodi. Reakciona smeša se oko 1 do 6 h meša na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša se zatim razblaži istim rastvaračem, opere rastvorom soli, odvoji organski sloj, osuši iznad anhidrovanog natrijum-sulfata, filtrira i koncentriše pod vakuumom, dajući aldehid (10). Aldehid (10) se može prečistiti tehnikama koje su dobro poznate u stanju tehnike, kao što je fleš hromatografija na silikagelu, sa pogodnim eluentom, kao što je etilacetat/heksan. Alternativno, ovaj sirovi aldehid (10) se može koristiti direktno u koraku D.

U Shemi 3, korak D, aldehid (10) se redukciono aminuje, pod uslovima koji su dobro poznati u stanju tehnike, sa diazocikloalkanom (4), dajući keton (5), na način koji je analogan proceduri opisanoj u Shemi I. Određenije, na primer aldehid (10) se rastvori u pogodnom organskom rastvaraču, kao što je metilenhlorid. Ovom rastvoru se doda oko 1,05 ili više ekvivalenata diazocikloalkana (4). Opciono, može se dodati sirćetna kiselina, da se pomogne rastvaranje diazocikloalkana (4). Zatim se doda oko 1,4 do 1,5 ekvivalenata natrijum-triacetoksiborhidrida, pa se reakcija oko 3 do 5 h meša na sobnoj temperaturi. Reakcija se zatim razblaži dodavanjem pogodne baze, kao što je natrijum-karbonat ili -hidroksid u vodi, tako da se postigne pH od oko 8 do oko 12. Ovako preknuta reakcija se zatim ekstrahuje pogodnim organskim rastvaračem, kao što je metilenhlorid. Sjedine se organski ekstrakti, operu rastvorom soli, osuše, filtriraju i koncentrišu pod vakuumom, dajući jedinjenje formule (5). Ovaj materijal se zatim može prečistiti tehnikama koje su dobro poznate u stanju tehnike, kao što je fleš hromatografija na silikagelu, sa pogodnim eluentom, kao što je etilacetat/petroletar ili heksan.

Alternativno, jedinjenje strukture (5) se može dobiti sledećom procedurom, koja je opisana u Shemi 4. Svi supstituenti, ukoliko se drugačije ne naznači, su ranije definisani. Reagensi i polazni materijali su lako dostupni onome koje uobičajeno verziran u stanje tehnike.

U Shemi 4, korak A, kombinuje se aldehid (11) sa pogodnim organometalnim reagensom (12), pod uslovima koji su dobro poznati u stanju tehnike, dajući alkohol (13). Primeri pogodnih organometalnih jedinjenja su Grignard-ovi reagensi, alkil-litijum, alkil-cink i slično. Poželjni su Grignard-ovi reagensi. Na primer, tipičan Grignard-ov reagens i uslovi reakcije se mogu videti u J. March, "Advanced Organic Chemistrv: Reactions, Mechanisms and Structure", 2. izdanje, McGraw-Hill, str. 836-841 (1977). Određenije, aldehid (11) se rastvori u pogodnom organskom rastvaraču, kao što je tetrahidrofuran ili toluen, ohlađenom na oko -5°C, pa se tretira sa oko 1,1 do 1,2 ekvivalenta Grignard-ovog reagensa formule (12), gde M predstavlja MgCI ili MgBr. Reakcija se meša oko 0,5 do 6 h, zatim prekine, a alkohol (13) se izoluje dobro poznatom procedurom obrade.

U Shemi 4, korak B, alkohol (13) se oksidiše pod standardnim uslovima, dobro poznatim u stanju tehnike, kao što su oni koji su opisani u J. March, "Advanced Organic Chemistr/: Reactions, Mechanisms and Structure", 2. izdanje, McGravv-Hill, str. 1082-1084 (1977), dajući keton (1). [Keton (1) je polazni materijal koji se koristi u gornjoj Shemi 1].

Na primer, gornja oksidacija se takođe obavlja korišćenjem standardnih Swern-ovih uslova, koji su dobro poznati verziranima u stanje tehnike (Marx, Tidwell Jr.,J. Org. Chem.,1984, 48, 788), ili se alkohol (13) rastvori u pogodnom organskom rastvaraču, kao što je metilenhlorid, taj rastvor ohladi u kupatilu vlažni led-aceton, pa se tretira sa 2,5 do 3,0 ekvivalenta dimetilsulfoksida. Posle oko 30 min mešanja, reakcija se tretira sa oko 1,8 ekvivalenata P2O5. Reakcija se meša oko 3 h, a zatim je poželjno da se tretira oko 30 min sa oko 3,5 ekvivalenta pogodnog amina, kao što je trietilamin. Zatim se ukloni rashladno kupatilo, a reakcija meša oko 8 do 16 h. Keton (1) se zatim izoluje standardnim tehnikama ekstrakcije, dobro poznatim u stanju tehnike.

U Shemi 4, korak C, tretira se keton (1) sa pogodnom bazom, pa sledi dodavanje alkena (15), gde X predstavlja pogodnu odlazeću grupu, dajući jedinjenje (14). Na primer, keton (1) se kombinuje sa viškom alkena (15) u pogodnom organskom rastvaraču, kao što je tetrahidrofuran, pa ohladi u kupatili vlažan led-aceton. Primeri pogodnih odlazećih grupa su Cl, Br, I, tozilat, mezilat i slično. Poželjne odlazeće grupe su Cl i Br. Doda se oko 1,1 ekvivalent pogodne baze, pa se reakcija ostavi da se meša oko 2 h, na sobnoj temperaturi. Primeri pogodne baze su kalijum-terc-butoksid, natrijum-hidrid, NaN(Si(CH3)3)2, litijum-diizopropilamid, KN(Si(CH3)3)2, NaNH2, natrijum-etoksid.natrijum-metoksid i slično. Poželjna pogodna baza je kalijum-terc-butoksid. Reakcija se zatim prekida sa kiselinom u vodi, a jedinjenje (14) se izoluje uobičajenom procedurom obrade.

U Shemi 4, korak D, tretira se jedinjenje (14) sa pogodnim oksidacionim sredstvom, dajući aldehid (3). (Aldehid (3) se takođe dobija u Shemi 1). Primeri pogodnih oksidacionih sredstava su ozon, katalizator NalOVosmium i slično. Poželjno oksidaciono sredstvo je ozon. Primeri pogodnih oksidacionih reagenasa i uslova su opisani u J. March, "Advanced Organic Chemistrv: Reactions, Mechanism and Structures", 2. izdanje, McGraw-Hill, 1090-1096 (1977).

Na primer, jedinjenje (14) se rastvori u pogodnom organskom rastvaraču, kao što je metanol, doda se mala količina indikatora Sudan III, pa se rastvor ohladi na oko -20°C. Kroz ovaj rastvor se oko 4 h barbotira ozon, sve dok se ružičasta boja ne preobrati u žutu boju. Zatim se doda redukciono sredstvo, kao što je Me2S ili tributilfosfin. Koncentrisanje daje intermedijarni dimetilacetal aldehida (3). Ovaj dimetilacetal se lako hidrolizuje pod standardnim kiselim uslovima, dajući aldehid (3). Alternativno, aldehid (3) se može dobiti direktno, ozonolizom (14), u rastvaraču koji ne formira acetal, kao što je metilenhlorid.

U Shemi 4, korak E, redukciono se aminuje aldehid (3), pod analognim uslovima onima koji su opisani gore u Shemi 3, korak D, dajući jedinjenje (5). (Jedinjenje (5) se takođe dobija u Shemi 1).

Shema 5 daje alternativnu sintezu za dobijanje ketona (5). Svi supstituenti, ukoliko se drugačije ne naznači, su ranije definisani. Reagensi i polazni materijali su lako dostupni onome ko je uobičajeno verziran u stanje tehnike.

U Shemi 5, korak A, kondenzuje se aldehid (3) sa diazocikloalkanom (4), pod standardnim uslovima, dobro poznatim u stanju tehnike, dajući enamin (15). Na primer, oko 1,05 ekvivalenata aldehida (3) se rastvori u organskom rastvaraču, kao što je izopropilacetat ili izopropanol, pa se doda u čist diazocikloalkan (4), kao slobodnu bazu. Doda se još organskog rastvarača tako da nastane gusta suspenzija, pa se reakcija meša oko 1 do 2 h. Ovaj enamin (15) se zatim izoluje pomoću standardnih tehnika, kao što je sakupljanje filtriranjem.

U Shemi 5, korak B, hidrogenuje se enamin (15), pod uslovima koji su dobro poznati onom ko je uobičajeno verziran u stanje tehnike, dajući jedinjenje (5). Na primer, enamin (15) se kombinuje sa pogodnim organskim rastvaračem, kao što je izopropil alkohol, u Parr-ovom reaktoru, uz dodatak katalitičke količine 5% paladijuma na ugljeniku. Ova smeša se stavi pod 3,4 bar vodonika, pa se mućka oko 2 dana, na sobnoj temperaturi. Gusta suspenzija se zatim filtrira da se ukloni katalizator, a filtrat koncentriše, dajući jedinjenje (5).

Bez obzira kojim putem se dobijaju, keto-intermedijari (5) se mogu transformisati u odgovarajuća konačna jedinjenja formule I, reakcijom sa redukcionim sredstvima, a naročito onim, koja generišu vodonične anjone, kao što je natrijum-borhidrid ili DIBAL-H. Ti keto-intermedijari (5), redukovani bez predhonog razdvajanja, obično generišu smešu dijastereomera, u kojoj par (RS, SR) kvantitativno dominira nad parom (RR, SS). Zatim se par (RS, SR) izoluje pomoću hromatograftje na koloni sa silikagelom, pa se razdvoji u pojedinačne enantiomere (RS) i (SR), na primer, hromatografijom na stacionarnoj hiralnoj fazi, ili drugim metodama koje su dobro poznate verziranima u stanje tehnike. Alternativno, racemski keton (5) se može poznatim metodama razdvojiti u njegova dva enantiomera, pa se zatim (R)-5 podvrgne redukciji, generišući dominantno (S,R) enantiomer, koji je poželjan u ovom pronalasku, i može se lako prečistiti fizičkim metodama.

Stereohemija

U Shemi 1, jedinjenja I se dobijaju kao sin/anti smeša dijastereomera, sa odnosom koji zavisi od korišćenih uslova reakcije. Ovi dijastereomeri se mogu razdvojiti uobičajenim tehnikama, poznatim verziranima u stanje tehnike, uključujući frakcionu kristalizaciju baza ili njihovih soli, ili hromatografske tehnike, kao što je LC ili fleš hromatografija. Za oba dijastereomera, (+) enantiomer se može razdvojiti od (-) enantiomera, korišćenjem tehnika i procedura dobro poznatih u stanju tehnike, kao što su one koje su opisane u J. Jacques et al., "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, 1981. Na primer, hiralna hromatografija sa pogodnim organskim rastvaračem, kao što je etanol/acetonitril i pakovanje kolone Chiralpak AD od 20 pm, može se takođe koristiti da se ostvari razdvajanje ovih enantiomera.

Slobodne baze formule I, njihovi dijastereomeri ili enantiomeri, mogu se konvertovati u odgovarajuće farmaceutski prihvatljive soli, pod standardnim uslovima koji su dobro poznati u stanju tehnike. Na primer, rastvori se slobodna baza formule I u pogodnom organskom rastvaraču, kao što je metanol, tretira sa jednim ekvivalentom, na primer maleinske ili oksalne kiseline, sa jednim ili dva ekvivalenta na primer hlorovodonične kiseline ili metansulfonske kiseline, pa zatim koncentriše pod vakuumom, dajući odgovarajuću farmaceutski prihvatljivu so. Ostatak se može zatim prečistiti rekristalizacijom iz pogodnog organskog rastvarača ili smeše organskih rastvarača, kao što je metanol/dietiletar.

N-oksidi jedinjenja formule I se mogu sintetizovati jednostavnim procedurama oksidacije, dobro poznatim u stanju tehnike. Procedura oksidacije koju su opisali P. Brougham et al.( Synthesis,1987, 1015-1017), dozvoljava razlikovanje između dva azota u piperazinu, što omogućava da se dobiju N-oksidi i N,N'-dioksid.

Sledeći primeri predstavljaju tipične sinteze jedinjenja formule I, koje su uopšteno opisane gore. Ovi primeri su samo ilustrativni i nije namera da na bilo koji način ograniče ovaj pronalazak. Reagensi i polazni materijali su lako dostupni onom ko je uobičajeno verziran u stanje tehnike.

Primer 1

1-[( SR- RS)- 4- cikloheksil- 4- hidroksi- 3-( 2- fluorofenin- butin- 4-( 2- metoksifenin-

piperazin ( dijastereomer sa višom Rf u TLC) ( Ex. 1)

1- r( 3S- 4R)- 4- dkloheksil- 4- hidroksi- 3-( 2- fluorofenil)- butin- 4-( 2- metoksifenil)-piperazin ( Ex. 1X)

1- f( 3R- 4S)- 4- cikloheksil- 4- hidroksi- 3-( 2- fluorofenil)- butin- 4-( 2- metoksifenil)-piperazin ( Ex. 1Y)

Primer 2

1- f( RR- SS)- 4- cikloheksil- 4- hidroksi- 3-( 2- fluorofenil)- butin- 4-( 2- metoksifenil)-piperazin ( dijastereomer sa nižom Rf u TLC) ( Ex. 2 )

1- f( 3R- 4R)- 4- cikloheksil- 4- hidroksi- 3-( 2- fluorofenil)- butin- 4-( 2- metoksifenin-

piperazin ( Ex. 2X)

1- f( 3S- 4S)- 4- cikloheksil- 4- hidroksi- 3-( 2- fluorofenil)- butill- 4-( 2- metoksifenin-

piperazin ( Ex. 2Y)

Cikloheksil 2 - fluorobenzilketon ( Jedinjenje 1a )

U smešu 36 mL 2-fluorobenzilcink-hlorida (0,5 M rastvor u tetrahidrofuranu) i 0,008 g dihlorobis(trifenilfosfin)paladijuma(ll), koja se meša na 0°C, dodaje se u kapima, kroz špric, 2,14 mL cikloheksankarbonilhlorida. Posle toga, reakciona smeša se 4 h meša na sobnoj temperaturi (s.t.), pa tretira zasićenim rastvorom amonijum-hlorida u vodi (25 mL), ekstrahuje sa 20 mL EtOAc, ovaj ekstrakt osuši

(Na2SC>4) i ispari do suva pod vakuumom, dajući 3,52 g sirovog naslovljenog jedinjenja, koje se može koristiti u narednom koraku bez daljeg prečišćavanja.<1>H-NMR (CDCb, 6): 1,10-2,05 (m, 10H), 2,47 (tt, 1H), 3,77 (s, 2H), 6,97-7,32 (m, 4H).

4 - cikloheksil - 4 - okso - 3 -( 2 - fluorofenil )- butiraldehid dietilacetal ( Jedinjenje 1b )

Rastvor 5,02 g jedinjenja 1a u 136 mL toluena, zagreva se pod refluksom, zamenjujući 35 mL toluena destilacijom, da se ukloni voda. Posle toga, doda se 3,18 g kalijum-terc-butoksida, pa se nastavi još 30 min sa mešanjem pod refluksom; reakciona smeša se ohladi na 80°C, pa se doda 4,27 mL 2-bromoacetaldehid dietilacetata. Posle 18 h pod refluksom, reakciona smeša se ohladi na s.t., tretira zasićenim rastvorom amonijum-hlorida u vodi (30 mL) i ekstrahuje sa 30 mL EtOAc. Ekstrakti se osuše (Na2S04) i ispare do suva pod vakuumom, dajući sirovi proizvod koji se prečisti fleš hromatografijom (petroletar-EtOAc, 92,5:7,5), dajući 2,97 g čistog naslovljenog proizvoda.

<1>H-NMR (CDCb, 5): 1,00-2,10 (m, 17H), 2,20-2,52 (m, 2H), 3,30-3,72 (m, 4H), 4,25-4,45 (m, 2H), 6,90-7,35 (m, 4H).

4 - cikloheksil - 4 - okso - 3 -( 2 - fluon3fenil )- butiraldehid ( Jedinjenje 1c )

Smeša 1,12 g jedinjenja 1b, 9 mL 50% trifluorosirćetne kiseline u vodi i 18 mL CH2CI2, meša se 2 h na s.t, pa razblaži sa 10 mL CH2CI2Odvoji se organski sloj, opere rastvorom soli (2x15 mL), osuši (Na2S04) i ispari do suva pod vakuumom, dajući sirovi proizvod (0,88 g), koji se koristi u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

<1>H NMR (CDCb, 6): 0,90-2,10 (m, 10H), 2,25-2,70 (m, 2H), 3,12-3,52 (m, 1H), 4,60-4,80 (m, 1H), 6,95-7,40 (m, 4H), 9,75 (s, 1H).

1 -{ 4<:ikloheksil - 4<ikso - 3 -( 2 - fluorofenil )- butill - 4 -( 2 - m

( Jedinjenje 1d )

Smeša 0,88 g naslovljenog jedinjenja 1c, 0,84 g 1-(2-metoksifenil)-piperazin HCI, 1,06 g natrijum-triacetoksiborhidrida i 33 mL CH2CI2, meša se 1 h na s.t., ostavi preko noći da stoji, učini alkalnom sa 20% NaC03u vodi. Odvoji se organski sloj, opere rastvorom soli (2x30mL), osuši (Na2S04) i ispari do suva pod vakuumom, dajući sirovi proizvod (1,46 g) koji se koristei u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. Uzorak, prečišćen fleš hromatografijom (petroetar-EtOAc, 6:4) daje čist uzorak.

<1>H-NMR (CDCb, 5): 1,05-2,00 (m, 11H), 2,20-2,44 (m, 4H), 2,45-2,72 (m, 4H), 2,90-3,20 (m, 4H), 3,85 (s, 3H), 4,38 (t, 1H), 6,80-7,30 (m, 8H).

( SRBS )- 1 ^ ikloheksil - 4 - f4 -( 2 - metoksifenil )- Diperazin - 1 - ill ^

1ol ( dijastereomer sa višom Rfu TLC ) i

( RR , SS )- 1 - cikloheksil - 4 - f4 -( 2 - metoksifenil )- Diperazin - 1 - il ]- 2 -( 2 - fluorofenil )- butan -

1 - ol ( dijastereomer sa nižom Rf u TLC )

U rastvor 1,46 g jedinjenja 1d u 33 mL metanola, koji se meša na 0°C, doda se 0,19 g natrijum-borhidrida, pa se smeša 4 h meša na s.t. Ispari se rastvarač, a sirovi proizvod reakcije se rastvori u vodi, pa ekstrahuje sa EtOAc. Odvoji se organski sloj, opere rastvorom soli (2x15 mL), osuši (Na2S04) i ispari do suva pod vakuumom, dajući sirovi proizvod koji se prečišćava redom, fleš hromatografijom (petroletar-EtOAc-2M amonijak u metanolu, 75.25.2; petroletar-EtOAc-2M amonijak u metanolu, 80:20:2), dajući 0,82 g jedinjenja iz Primera 1 (viša Rf u TLC; eluent: petroletar-EtOAc-2M amonijak u metanolu, 70:30:2), a posle toga 0,062 g jedinjenja iz Primera 2 (niža Rf u TLC; isti eluent).

Ex. 1:<1>H-NMR (CDCb, 5): 0,80-1,40 (m, 6H), 1,50-1,82 (m, 4H), 1,85-2,10 (m, 3H), 2,21-2,45 (m, 2H), 2,52-2,85 (m, 4H), 2,98-3,26 (m, 4H), 3,28-3,42 (m, 1H), 3,50-3,60 (m, 1H), 3,85 (s, 3H), 6,80-7,30 (m, 7H), 7,62-7,80 (m, 1H); OH pik nije detektovan.

Ex. 2:<1>H-NMR (CDCb, 5): 0,75-2,00 (m, 13H), 2,00-2,30 (m, 1H), 2,31-2,55 (m, 2H), 2,56-2,95 (m, 4H), 3,00-3,30 (m, 4H i OH), 3,60 (dd, 1H), 3,85 (s, 3H), 6,80-7,38 (m, 8H).

1 - r ( 3SAR )- 4 ^ ikloheksil - 4 - hidmksi - 3 -( 2 - fluorofenil )^

piperazin ( Pnmer 1X )

Ovo jedinjenje se dobija hromatografijom na hiralnoj koloni jedinjenja iz Primera 1, koristeći Chiralpak AD (0,46*25 cm) i eluiranje sa n-heksan-EtOH, 95:5 (protok 0,5 mL/min; detekcija sa UV 247 nm).

1 -[( 3RAS )- 4 ^ ikloheksil - 4 - hidmksi - 3 -( 2 - fluo ^

Dipemzin ( Primer 1Y )

Ovo jedinjenje se dobija hromatografijom na hiralnoj koloni jedinjenja iz Primera 1, koristeći Chiralpak AD (0,46*25cm) i eluiranje sa n-heksan-EtOH, 95:5 (protok 0,5 mL/min; detekcija sa UV 247 nm).

1 - r ( 3SAS ) A ^ ikfoheksilA - hidivksi - 3 -( 2 - nuorofeM

piperazin ( Primer 2 Y )

Ovo jedinjenje se dobija hromatografijom na hiralnoj koloni jedinjenja iz Primera 2, koristeći Chiralpak AD (2*25 cm) i eluiranje sa n-heksan-EtOH, 85:15 (protok 8 mL/min; detekcija sa UV 254 nm).

Apsolutna stereohemija jedinjeja 1X i 2Y, u obliku njihovih soli sa vodonik-bromidom, određena je difrakcijom X-zraka na monokristalu, kao što sledi.

Eksperiment difrakcije X- zraka na monokristalu:

Odabran je monokristal igličastog oblika za analizu difrakcije X-zraka i pričvršćen je na stakleno vlakno. Podaci su sakupljeni pomoću detektora Rigaku Rapid image plate X-ray area cilindričnog oblika, sa razrezom detektora 45,0*25,6 cm. Kontrolisan je pomoću PC kompjutera, sa Windows 2000 i softverom Rapid Auto verzija 1,06 (Rigaku, 2000), na niskoj temperaturi (-120 K), sa ogledalima Micromax-002 micro-Confocal i zračenjem CuKa [X(CuKa)=0,15405 nm]. Indeksovanje se obavlja od tri 3° oscilacije ramova koji su eksponirani 360 s. Sve refleksije su merene u pet grupa imidža sa šest ramova u svakoj grupi; vreme eksponiranja je bilo 160 s po stepenu. Među njima, pet grupa imidža je bilo pod uglovima fi=0°, 90°, 180°, 270° sa hi=50° i fi=0°, a svi ramovi su bili delta omega=30°, koji čine 29^ = 136,3°. Rastojanje uzorak/detektor bilo je 12,74 cm. Podaci programa redukcije, Rapid Auto verzija 1,06 (Rigaku, 2000) su odredili Laue-grupu kao -1, a za rešavanje i poboljšavanje strukture integrisano je ukupno 7.986 refleksija.

Rezultati za monokristal:

Struktura je rešavana direktnim metodama, koristeći SIR92 (Altomare et al., 1994). Sva izračunavanja su obavljena korišćenjem kristalografskog softverskog paketa CrystalStructure 3,0 (MSG/Rigaku, 2002; VVatkin et al., 1996, Carruthers i VVatkin, 1979). Probno rešenje je dobijeno za 38 atoma koji nisu vodonik u asimetričnoj jedinki. Poboljšanje pomoću najmanjih kvadrata obuhvatilo je sve koordinate atoma koji nisu vodonik i anizotropne termalne parametre. Krajnji ciklus poboljšanja cele matrice pomoću najmanjih kvadrata na F, zasnovan je na 6.297 refleksija, sa l>3o(l), koji konvergira sa faktorima saglasnosti. R=0,071, S=2,224, Rw=0,073. Apsolutna konfiguracija je određena korišćenjem izračunatog parametra Flack X, koji je bio 0,00 sa esd=0,04. Očekivane vrednosti su 0,0 (unutar 3 esd) za ispravnu, i +1,0 za invertovanu apsolutnu strukturu.

Literatura:

Altomare, A, Cascarano, G., Giacovazzo, C, Guagliardi, A., Burla, M., Polidori,

G. i Camalli, M:, IRR92,J. Appl. Cryst.,1994, 27, 435.

Carruthers, J.R. i VVatkin, D.J.,Acta Cryst...1979, A35, 698-699.

Rigaku (2000), Rapid Auto, Rigaku Corporation, Tokyo, Japan.

Rigaku i Rigaku/MSC, (2000-2002), softver za analizu kristalne strukture, Crystal Structure version 3.00, Rigaku/MSC, 9009 NewTrails Drive, The

VVoodlands, TX, USA 77381-5209.

Rigaku, 3-9-12 Akishima, Tokyo 196-8666, Japan.

VVatkin, D.J., Prout, C.K., Carruthers, J.R. i Betteridge, P.W:,Crystals,sveska 10, Chemical Crystallography Laboratory, Oxord, UK.

Primer 3

1- r( RS. SR)- 4- cikloheksil- 4- hidroksi- 3-( 2- fluorofenin- butill- 4- r2-( 2. 2, 2-trifluoroetoksiVfenin- piperazin ( dijastereomer sa višom Rf u TLC)

Primer 4

1-[( RR. SS)- 4- cikloheksil- 4- hidroksi- 3-( 2- fluorofenin- butill- 4- f2-( 2. 2. 2-trifluoroetoksO- fenin- piperazin ( dijastereomer sa nižom Rf u TLC)

1 -( 4 ^ ikloheksil - 4<>kso - 3 -( 2 - ifuorofenil )- butill - 4 - r2 -( 22

piperazin ( Jedinienie 3a )

Naslovljeno jedinjenje se dobija kada se sledi procedura opisana za jedinjenje 1d, ali koristeći 1-(2,2,2-tirfluoroetoksifenil)-piperazinHCI, umesto 1-(2-metoksifenil)-piperazina-HCI. Preašćavanje sa fleš hromatografijom (petroletar-EtOAc, 7:3) daje naslovljeno jedinjenje (51%).

<1>H-NMR (CDCb, 5): 1,00-1,85 (m, 10H), 1,86-2,05 (m, 1H), 2,20-2,44 (m, 4H), 2,45-2,70 (m, 4H), 2,95-3,18 (m, 4H), 4,25-4,60 (m, 3H), 6,85-7,30 (m, 8H).

U ( RS . SR ) A<:ikloheksil - 4 ^ kso - 3 -( 2 - fluorofenii )- bum - 4 -( 2 -( 2 . 2 . 2 - tnfluoroetoksi )-fenilj - piperazin ( dijastereomer sa višom Rf u TLC ) i

1 -[( RR . SS )- 4 - cikloheksil - 4 - okso - 3 -{ 2 - fluorofenil )- butil l - 4 -[ 2 -( 2 . 2 . 2 - thfluometoksi )-fenilj - piperazin ( dijastereomer sa nižom Rfu TLC )

Naslovljeno jedinjenje se sintetizuje korišćenjem procedure opisane za jedinjenje u Primerima 1 i 2, ali koriseći kao polazni materijal jedinjenje 3a, umesto jedinjenja 1d. Prečišćavanje fleš hromatografijom (petroletar-EtOAc-2M amonijak u metanolu, 60:40:2) daje jedinjenje Primera 3 kao dijastereomer koji ima višu vrednost za Rf (79%); frakcije koje sadrže jedinjenje iz Primera 4, kao dijastereomer koji ima nižu vrednost Rf, pečišćene su fleš hromatografijom (petroletar-EtOAc-2M amonijak u metanolu, 75:25:1), dajući čist proizvod (3,5%). Ex. 3:<1>H-NMR (CDCb, 5): 0,80-1,40 (m, 6H), 1,45-1,80 (m, 4H), 1,85-2,10 (m, 3H), 2,21-2,45 (m, 2H), 2,50-2,75 (m, 4H), 2,95-3,26 (m, 4H), 3,30-3,42 (m, 1H), 3,50-3,60 (m, 1H), 3,70-4,30 (br, 1H, OH), 4,38 (q, 2H), 6,85-7,30 (m, 7H), 7,65-7,75 (m, 1H).

Ex. 4: 1H-NMR (CDCb, 6): 0,75-1,95 (m, 12H), 2,05-2,90 (m, 7H i OH), 3,00-3,30 (m, 5H), 3,65 (d, 1H), 4,38 (q, 2H), 6,85-7,40 (m, 8H).

Primer 5 ( uporedni)

1- r( RS, SR)- 4- cikloheksil- 4- hidroksi- 3- fenil- butill- 4-( 2- metoksifenin- piperazin

benzilcikloheksilketon ( Jedinjenje 5a )

U rastvor 11 mL 0,5 M rastvora benzilcink-bromida u anhidrovanom tetrahidrofuranu, doda se, na 0°C, 5 mg bis-trifenilfosfmpaladijum-dihlorida i 0,66 mL cikloheksankarbonilhlorida. Ova smeša se 1,5 h meša na s.t., tretira zasićenim rastvorom amonijum-hlorida u vodi i ekstrahuje etilacetatom. Sakupljeni organski slojevi se operu vodom, osuše (Na2S04) i rastvarač ispari pod vakuumom. Sirovi materijal se prečisti fleš hromatografijom i eluira sa petroletar-EtOAc, 95:5, dajući 0,78 g (52%) naslovljenog jedinjenja.

<1>H-NMR (200 MHz, CDCb, 5): 1,09-1,92 (m, 10H), 2,32-2,53 (m, 1H), 3,72 (s, 2H), 7,12-7,39 (m, 5H).

4 - cikloheksil - 4 - okso - 3 - fenil - butiraldehid dietilacetal ( Jedinjenje 5 b )

U rastvor 1,78 g Jedinjenja 5a u 30 mL anhidrovanog dimetilformamida doda se, na s.t., 0,37 g 60% natrijum-hidrida, disperzije u ulju, pa se smeša 1 h meša na s.t. Doa se 1,46 mL 2-bromoacetaldehid dietilacetala, pa se smeša 1 h meša na s.t. i 1 h na 80°C, ohladi na s.t., tretira vodom i ekstrahuje sa EtOAc. Sakupljeni organski slojevi se operu vodom, osuše (Na2S04) i rastvarač ispari pod vakumom. Sirovi materijal se prečisti fleš hromatografijom i eluira sa petroletar-EtAOc, 95:5, dajući 1,17 g (42%) naslovljenog jedinjenja.

<1>H-NMR (200 MHz, CDCb, 5): 1,01-1,98 (m, 17H), 2,28-2,48 (m, 2H), 3,30-3,71 (m, 4H), 3,98 (t, 1H), 4,25 (t, 1H), 7,12-7,39 (m, 5H).

4 - cikloheksil - 4 - okso - 3 ~ fenil - butiraldehid ( Jedinjenje 5c )

Rastvor 1,17 g Jedinjenja 5b u 10 mL acetona i 22,1 mL 2M HCI, meša se 5 h na s.t. Posle stajanja preko noći, vodeni sloj se ekstrahuje sa EtOAc. Sakupleni organski slojevi se operu vodom, osuše (Na2S04) i rastvarač ispari pod vakuumom, dajući 0,84 g (100%) naslovljenog jedinjenja, koje se odmah koristi, bez daljeg prečišćavanja.

1 -( 4 ^ ikloheksil - 4<>kso - 3 - fenil - butil )- 4 -( 2 - metoksifenil )- piperazin ( Jedinjenje 5d )

U rastvor 0,84 g Jedinjenja 5c i 1,19 g 1-(2-metoksifenil)-piperazina u 30 mL dihlorometana, dodaju se 1,48 g natrijum-triacetoksiborhidrida i 0,98 mL sirćetne kiseline, pa se dobijena smeša 5 h meša na s.t. Posle stajanja preko noći organski sloj se opere sa viškom 1M NaOH, a zatim vodom, osuši (Na2S04) i rastvarač ispari pod vakuumom. Sirovi materijal se prečisti fleš hromatografijom, uz eluiranje sa petroletar-EtOAc, 7:3, dajući 1,45 g (99%) naslovljenog jedinjenja.<1>H-NMR (200 MHz, CDCb, 5): 1,01-2,05 (m, 11H), 2,20-2,30 (m, 12H), 3,82 (s, 3H), 3,91-4,02 (m, 1H), 6,75-7,08 (m, 4H), 7,12-7,39 (m, 5H).

1 - f ( RS , SR ) A<:ikioheksilA - hidroksi - 3 - fenii - butiiM -( 2 - m

U rastvor 1,21 g Jedinjenja 5d u 60 mL dihorometana, na -78°C, ukapava se 11,5 mL 1M rastvora diizibutilaluminijum-hidrida (DIBAL-H) u toluenu. Smeša se 1 h meša na -78°C, pa tretira na -60°C sa zasićenim rastvorom NH4CI u vodi, i ekstrahuje hloroforomom. Sakupljeni organski slojevi se operu vodom, osuše (Na2S04) i rastvarač ispari pod vakuumom. Sirovi materijal se prečisti fleš hromatografijom i eluira sa petroletar-EtOAc-2M amonijakom u metanolu, 30:70:2, dajući 1,06 g (80%) naslovljenog jedinjenja.

<1>H-NMR (200 MHz, CDCb, 5): 1,01-1,38 (m, 6H), 1,61-1,78 (m, 4H), 1,86-2,02 (m, 3H), 2,22-2,38 (m, 3H), 2,52-2,78 (m, 4H), 2,75-2,95 (m, 1H), 3,02-3,20 (m, 4H), 3,48 (t, 1H), 3,82 (s, 3H), 6,80-7,03 (m, 4H), 7,10-7,38 (m, 5H).

Primer 6

Vezivanje radioliganda za različite receptore

6A . Humani rekombinantni receptori 5 - HTia

Postupak:

Genomski klon, kodiran za humani serotonergijski receptor 5HTiA, stabilno je transficiran u soj humanih ćelija (HeLa). Ćelije HeLa se gaje kao monoslojevi u medijumu Dulbecco, modifikacija Eagle, (DMEM), koji sadrži 10% seruma goveđeg fetusa, gentamicin (0,1 mg/mL) i 5% ugljen-dioksida, na 37°C. Ćelije se odvoje od balona u kome se gaje, pri 95% konfluenciji, pomoću strugača ćelija, pa se lizuju u hladnom 5 mM Tris i 5 mM EDTA puferu (pH 7,4). Homogenati se centrifugiraju sa 40.000xg*20 min, pa se pelete resuspenduju u maloj zapremini hladnog 5 mM Tris i 5 mM EDTA pufera (pH 7,4), odmah smrznu i čuvaju na

-70°C, do upotrebe.

Vezivanje [ 3H] 8- OH- DPAT:

Na dan eksperimenta membrane ćelija se resuspenduju u puferu za inkubaciju: 50 mM Tris HCI (pH 7,4), 2,5 mM MgCI2, 10 mM pargvline (Fargin et al.,Nature,1988, 335, 358-369). Ove membrane se 30 min inkubiraju u krajnjoj zapermini od 1 mL, na 30°C, sa 1 nM [<3>H]-OH-DPAt, u odsustvu ili prisustvu testiranih jedinjenja. Nespecifično vezivanje se određuje u prisustvu 10 uM 5-HT. Inkubacija se zaustavlja dodavanjem hladnog pufera Tris-HCI i brzim filtriranjem kroz filter Whatman-GF/B ili Schleicher-&-Schuell, prethodno tretiran sa 0,2% polietilenaminom.

Afinitet testiranih jedinjenja je ocenjivan kao inhibicija specifičnog vezivanja radioliganda za receptore 5-HTiA(ICso), korišćenjem programa nelinearnog krivolinijskog fitovanja (De Lean et. al.Am. J. Physiol.,1978, 235. E97-E102). Vrednost IC50se konvertuje u konstantu afiniteta (Kj) pomoću jednačine Cheng et al.,Biochem. Pharmacol.,1973, 22, 3099-3108.

Vezivanje [^ SJGTPrS:

Na dan eksperimenta, membrane HeLa ćelija se transficiraju sa humanim kloniranim receptorima 5-HTiA, pa se resuspenduju u puferu sa pH 7,4, koji sadrži 20 mM HEPES, 3 mM MgCI2 i 120 mM NaCI (Stanton, J. A., Beer, M.S.,Eur. J. Pharmacoi,1997, 320, 267-275). Ove membrane se 20 min inkubiraju sa 10 uM GDP i opadajućim koncentracijama lekova (od 100 uM do 0,1 nM), ili opadajućim koncentracijama 5-HT (od 100 uM do 0,1 nM, referentna kriva), na 30°C, u konačnoj zapremini oko 0,25 mL. Uzorcima se doda [35S]GTPyS (200-250 pM u 10 uL), pa se inkubiraju još 30 min na 30°C. Nespecifično vezivanje se određuje u prisustvu 10 uM GTPyS. Inkubacija se zaustavlja dodavanjem ledom ohlađenog HEPES pufera i brzim filtriranjem kroz filtre GF/C, koristeći sakupljač ćelija Filtermate (Packard). Filtri se operu četri puta sa ukupno 1,2 mL istog pufera. Radioaktivnost se meri tečnom scintiliacionom spektrometrijom, sa efikasnošću >90%(TopCount Packard). Simulacija vezivanja [<35>S]GTPyS, izazvana testiranim jedinjenjima, iskazuje se kao procenat vezivanja gornje bazalne vrednosti, stim što se maksimalna stimulacija, opažena sa 5-HT, uzima kao 100%. Kriva koncentracija-odgovor agonističke aktivnosti se analizira programom linearnog fitovanja (De Lean et al.,Am. J. Physiol.,1978, 235,97- 102).

Stimulacija vezivanja [<35>S]GTPyS predstavlja zavisnu korelaciju vezivanja jedinjenja agonista za receptore 5-HTia. Stimulacija izazvana endogenim ligandom 5-HT smatra se maksimalnom mogućom stimulacijom koja se može dostići. Jedinjenja koja stimulišu vezivanje [35S]GTPyS na nižem nivou smatraju se delimičnim agonistima. Jedinjenja koja ne stimulišu vezivanje [<35>S]GTPyS se smatraju neutralnim antagonistima.

Rezultati

Rezultati, prikazani u Tabeli 1, pokazuju da testirana jedinjenja iz ovog pronalaska imaju visok afinitet prema receptom 5-HTiA. Jedinjenja Ex.1, Ex. 1Y, Ex. 2 i Ex. 2X su snažnija nego Ex. 5 (statistička signifikantnost p<0,01). U pogledu vezivanja [<35>S]GTPyS, jedinjenja Ex. 1X i 2Y su delimični agonisti, koji izazivaju stimulaciju vezivanja [<35>S]GTPyS. Druga jedinjenja ne stimulišu vezivanje [<35>S]GTPyS, ponašajući se kao neutralni antagonisti.

6B . Podvrste humanog rekombinantnog ai - adrenoceotora

Postupak:

Vezivanje za klonirane humane podvrste ai-adrenoceptora je obavljeno na membranama ćelija CHO (ćelije jajnika kineskog hrčka) transficiranim elektroporacijom sa genom koji izlučuje DNK koji kodira svaku od podvrsta ai-adrenoceptora. Kloniranje i stabilno izlučivanje humanog gena ai-adrenoceptora obavljeno je kao što je ranije objavljeno (Testa et al.,Pharmacol. Comm.,1995, 6, 79-86).

Ćelije CHO se gaje u suspenziji medijuma Dulbecco, Iscove-ova modifikacija, sa dodatkom 10% seruma goveđeg fetusa i gentamicina (50 pg/mL), na 37°C, u 7% CO2, u vlažnom inkubatoru. Ćelije se sakupe centrifugiranjem, lizuju u ledom ohlađenom puferu Tris 5 mM i EDTA 5 mM (pH 7,4), pa se blago homogenizuju. Homogenati se centifugiraju sa 40.000xgx20 min, a pelete se resuspenduju u maloj zapremini ledom ohlađenog Tris 5 mM i EDAT 5 mM pufera (pH 7,4), odmah smrznu i čuvaju na -80°C do upotrebe.

Membrane CHO ćelija se resuspenduju i 30 min inkubiraju u 50 mM Tris, pH 7,4, sa 0,2 nM [<3>H]prazosinom, u konačnoj zapremini od 1,02 mL, na 25°C, u odsustvu ili u prisustvu kompetitivnih lekova. Nespecifično vezivanje se određuje u prisustvu 10 pM phentolamine-a. Inkubacija se zaustavlja brzim filtriranjem kroz filtere Schleicher & Schuell GF52, prethodno tretirane sa 0,2% polietilenaminom, koristeći sakupljač ćelija Tomtec (PerkinEImer). Ovi filtri se operu 3*1mL sa ledom ohlađenim puferom Tris, osuše, a radioaktivnost meri brojanjem tečne scintilacije, pomoću Betaplate (VVallac).

Inhibicija specifičnog vezivanja pomoću ovih jedinjenja se analizira da bi se procenila vrednost IC50pomoću programa nelinearnog fitovanja krive Allfit (De Lean et al.,Am. J. Physiol.,1978, 235, E97-E102). Vrednost IC50se konvertuje u konstantu afiniteta Ki, pomoću jednačine Cheng & Prusoff( Biochem. Pharmacol.,1973, 22, 3099-3108).

Rezultati

Rezultati prikazani u Tabeli 2, pokazuju da testirana jedinjenja iz ovog pronalaska imaju različit afinitet prema podvrstama ai-adrenoceptora, stim da su naročito snažni za podvrstu a™. Selektivnost (izračunata kao odnos između vrednosti Kiza podvrste ai-adrenoceptora i vrednosti Kj za receptor 5-HTiA) zaj edinjenja iz ovog pronalaska je obično bolja nego za jedinjenje opisano u prethodnom stanju tehnike (Ex. 5).

6c . Rekombinantni D?receptori dopamina oacova

Postupak

Koriste se D3receptori dopamina kloniranog pacova, koji se stalno izlučuju u ćelijama CHO (Chio et al.,Mol. Pharmacol.,1994, 45, 51-60). Membrane se pripremaju mehaničkim razaranjem peleta ćelija u ledom ohlađenom 50 mM Tris, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7,4, posle čega slede korak centrifugiranja niskom (1000g), srednjom (20.000g) i visokom (80.000g) brzinom. Eksperiment kompeticije vezivanja radioliganda koristi 11 koncentracija leka, obavljen je u duplikatu, u formatu testa scinitilation proximity (SPA). Upotrebljeni radioligand je bio [<3>H]-7-OH-DPAT (154 Ci/mmol). Nespecifično vezivanje (75-95% od ukupnog) se definiše sa hladnim haloperidolom, dodatim u višku (3 uM). Ukupno vezivanje je određeno u puferu 20 mM HEPES, 10 mM MgSCU, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA (pH 7,4). Smeše za vezivanje se prave u fleksibilnim pločama VVallac Micro-Beta, sa 96 bazenčića, dodavanjem 11 pL razblaženja leka, 11 pL radioliganda i 178 pL suspenzije zrnca membrana (SPA (100 mg zrnaca SPA obloženih sa WGA, inkubiranih sa 5-15 pg protein/ploče u 10 mL pufera za vezivanje, tokom 30 min, na sobnoj temperaturi, posle čega sledi centrifugiranje malom brzinom, pa resuspendovanje u 2 mL pufera za vezivanje). Posle hermetizovanja i 1 h inkubiranja na sobnoj temperaturi, ove ploče se broje u scinitilacionom brojaču VValac Micro-Beta.

Vrednosti IC50iz oba postupka testa se ocenjuju preko fitovanja podataka u jednostranom kompeticionom modelu:Y= T/(1 + 1 olog(xHo9<IC50)), gde V predstavlja specifično vezan CPM pri koncentraciji X, a T je specifično vezan CPM u odsustvu kompetitora. Konstante inhibicije (Ki) su izračunavane korišćenjem jednačine Cheng-Prusoff( Biochem. Pharmacol., 1973, 22, 3099-3108).

Rezultati

Rezultati prikazani u Tabeli 3 pokazuju da testirana jedinjenja iz ovog pronalaska imaju afinitet prema podvrsti D3dopaminergijskog receptora. Selektivnost (izračunata kao odnos između K vrednosti na D3-dopaminergijskoj podvrsti i vrednosti K, na receptom 5-HTiA) za jedinjenja iz ovog pronalaska je bolja nego za jedinjenje opisano u prethodnom stanju tehnike (Ex. 5).

Primer 7

Efekat na ritmičke kontrakcije pražnjenja bešike, izazvan punjenjem bešike

anesteziranim pacovima

A . Postupak

Koriste se ženke pacova Sprague-Dawley, mase 225-275 g (Crl: Cd<®>(SD) IGS BR, Charles River, Italia). Životinje su smeštene sa slobodnim pristupom hrani i vodi i drže se najmanje nedelju dana na forsiranom ciklusu 12-to časovne izmene svetlo-mrak, na 22-24°C, izuzev za vreme samog eksperimenta. Aktivnost ritmičkih kontrakcija pražnjenja bešike se ocenjuje u skladu sa metodom Dray-a (Dray, J.,J. Pharmacol. Methods,1985, 13, 157), uz neke modifikacije, kao kod Guarneri-a (Guarneri,Pharmacol. Res.,1993, 27, 173). Ukratko, pacovi se anesteziraju subkutanim injekcijama sa 1,25 g/kg (5 mL/kg) uretana, posle čega se bešika kateterizuje preko uretre, koristeći polietilensku cev PE 50, napunjenu slanim fiziološkim rastvorom. Kateter se vezuje ligaturom oko spoljašnjeg otvora uretre i povezan je sa konvencionalnim transducerima pritiska (Statham P23 ID/P23 XL). Pritisak unutar bešike se kontinualno prati na pisaču sa trakom (Battaglia Rangoni KV 135 sa DCI/TI pojačavačem). Bešika se zatim puni preko katetera registrovanjem inkremenata zapremine toplog (37°C) slanog rastvora, dok ne dođe do kontrakcija za pražnjenje bešike (obično 0,8-1,5 mL). Za intravenoznu injekciju bioaktivnih jedinjenja polietilenska cev PE 50, napunjena fiziološkim rastvorom, ubaci se u jugularnu venu.

Iz cistometrograma se određuje broj kontrakcija, registrovanih 15 min pre (bazična vrednost) i posle tretmana, kao i srednja amplituda ovih kontrakcija (srednja visina pikova u mm Hg).

Pošto većina jedinjenja izaziva efekat koji je relativno brz po početku i dovodi do poptunog prekida kontrakcija bešike, pogodno je da se bioaktivnost ocenjuje merenjem trajanja mirovanja (tj. dužine vremena tokom koga se ne dešavaju kontrakcije). Broj ispitivanih životinja koji pokazuje smanjenje kontrakcija veće od 30% u odnosu na opaženi bazični period, takođe je registrovan.

Da bi se uporedila snaga testiranih jedinjenja za inhibiranje kontrakcija pražnjenja bešike, izračunavane su ekvi-efikasne doze, koje su dovodile do nestanka kontrakcija tokom vremena od 10 min (ED10min), pomoću linearne regresije, korišćenjem metode najmanjih kvadrata. Ekstrapolisane doze, koje izazivaju smanjenje u broju kontrakcija veće od 30% kod 50% tretiranih pacova (EDs)), izračunavane su po metodu Bliss-a (Bliss, C.I.,Quart. J. Pharm. Pharmacol.,1938, 11, 192-216).

B . Rezultati

Brzo rasterećenje bešike kod pacova anesteziranih uretanom, izazivalo je seriju ritmičkih kontrakcija pražnjenja bešike, čije karakteristike su opisane (Maggi et al.,Brain Res.,1986, 380, 83; Maggi et al.,J. Pharmacol. Exp. Ther,1984, 230. 500). Učestanost ovih kontrakcija je povezana sa senzornom dovodnom granom refleksa za mokrenje i sa glavninom centra za mokrenje, gde njihova amplituda zavisi od funkcije odvodne grane refleksa. U ovom model sistemu, jedinjenja koja deluju uglavnom na centralni nervni sistem (kao što je morfijum) izazivaju blokadu kontrakcija za pražnjenje, dok lekovi koji deluju na nivou mišića detruzora, kao što je oxybutynin, snižavaju amplitudu kontrakcija bešike.

Rezultati, dobijeni posle ordiniranja jedinjenja iz prethodnog stanja tehnike i jedinjenja iz ovog pronalska, prikazani su u Tabeli 4.

Jedinjenja iz ovog pronalaska su superiornija u odnosu na referentni standard, u blokiranju ritmičkih kontrakcija bešike izazvanih zapreminom. Ex. 1Y je snažniji, nego Ex. 5, jer je njegova ekstrapolisana doza, koja izaziva 10-to minutni nestanak kontrakcija, najmanje dvostruko niža. Pored toga, posle ordiniranja 0,3 mg/kg Ex. 1Y, kontrakcije bešike su nestale tokom 24 min, dok je posle ordiniranja 0,3 mg/kg Ex. 5 ovo vreme iznosilo samo 14 min.

U poređenju sa jedinjenjima iz ovog pronalaska, oxybutynin ima efekat smanjivanja amplitude kontracija na način zavisan od doze, sa vrednošću ED50(ekstrapolisana doza koja izaziva 30% smanjenje amplitude kontrakcija kod 50% tretiranih pacova) od 240 pg/kg. Pri ovoj dozi, oxybutynin ne izaziva blokadu kontrakcija bešike, a to je zbog specifičnog mehanizma delovanja (antimuskarinski), koji je različit od mehanizma jedinjenja iz ovog pronalaska.

TABELA 4. Efekti na ritmičke kontrakcije pražnjenja bešike

posle intravenoznog ordiniranja

Podaci predstavljaju ED10mjnvrednosti (ektrapolisana doza koja izaziva 10-to minutni nestanak kontrakcija), vrednosti ED50(učestanost) (ekstrapolisane doze koje izazivaju

smanjenje broja kontrakcija za >30% kod 50% tretiranih pacova) i vrednosti ED50(amplituda) (ekstrapolisane doze koje izazivaju 30% smanjenje amplitude kontrakcija kod 50% tretiranih pacova)

Primer 8

Efekat na cistometrijske parametre kod svesnih pacova, posle oralnog ordiniranja

A . Postupak

Koriste se mužjaci pacova Sprague-Dawley [Crl: CD<®>(SD) IGS BR] od 300-400 g, dobavljeni iz Charles River, Italia. Životinje su smeštene sa slobodnim pristupom hrani i vodi i drže se najmanje nedelju dana na forsiranom ciklusu 12-to časovne izmene svetlo-mrak, na 22-24°C, izuzev za vreme samog eksperimenta. Da bi se kvantitativno odredili urodinamički parametri kod svesnih pacova, obavljena su cistometrografska ispitivanja u skladu sa procedurom koja je ranije objavljena (Guameri et al.,Pharmacol. Res.,1991, 24, 175).

Ukratko, pacovi se anesteziraju intraperitonealnim ordiniranjem 3 mL/kg rastvora equithensin-a (pentobarbital 30 mg/kg i hloral hidrat 125 mg(kg), pa se postave u nauznak položaj. Napravi se približno 10 mm dug središnji rez, na obrijanom i čistom abdominalnom zidu. Bešika se lagano oslobodi od adheriranih tkiva, isprazni i zatim stavi kanila, kroz rez u telu bešike, koristeći polietilensku kanilu (0,58 mm unutrašnjeg prečika, 0,96 mm spoljašnjeg prečnika), koja se trajno zašije sa svilenim koncem. Kanila se izvuče kroz potkožni tunel u oblast iza lopatice, gde se poveže sa plastičnim adapterom, kako bi se izbegao rizik od uklanjanja od strane životinje. Za testiranje leka, koriste se pacovi dan posle implantacije.

Na dan eksperimenta, pacovi se stave u modifikovane Bollman-ove kaveze, tj. ograničavajuće kaveze koji su dovoljno veliki da dozvole pacovima adaptaciju na normalnu čučeću pozu, ali dovoljno uski da spreče okretanje oko sebe. Posle perioda stabilizacije od oko 20 min, slobodni kraj kanile bešike se poveže preko cevi T-oblika za transducer pritiska (Statham P23XL) i za peristaltičku pumpu (Gilson miniplus 2), za kontinualnu infuziju toplog (37°C) slanog rastvora u bešiku, sa konstantnom brzinom od 0,1 mL/min. Signal intraluminalnog pritiska, tokom infuzije u bešiku, kontinualno se registruje na poligrafu (Rectigraph-8K San-ei sa BM614/2 pojačavačem, iz Biomedica Mangoni). Za ocenjivanje urodinamičkih parametara zapreminskog kapaciteta bešike BVC) i pritiska mokrenja (MP), koristi se cistometrogram. BVC (mL) se definiše kao zapremina infuzije slanog rastvora u bešiku neophodna da izazove kontrakciju detruzora, posle koje sledi mokrenje. MP (mmHg) se definiše kao maksimalni pritisak unutar bešike koji izaziva kontrakciju tokom mokrenja. Bazične vrednosti BVC i MP se izračunavaju kao srednje vrednosti opažene na cistometrogramu, a registrovane su u početnom periodu od 30-60 min. Posle određivanja bazičnih BVC i MP, prekida se infuzija, a ispitivano jedinjenje se ordinira oralno, pomoću stomačne cevčice. Ponovo se počne sa infuzijom u bešiku, a promene u BVC i MP se izračunavaju iz srednjih vrednosti u cistometrogramima, dobijene tokom 1, 2, 3, 4 i 5 sati posle tretmana. Jedinjenja se ordiniraju u zapremini od 2 mL/kg, a grupe kontrolnih životinja primaju oralno istu zapreminu tečnog nosača (0,5% methocel u vodi).

Rezultati su prikazani na priključenim crtežima, gde su:

Slika 1 je vremenski tok promena BVC i MP kod pacova, posle oralnog ordiniranja tečnog nosača (krugovi), ili 10,0 mg/kg jedinjenja iz Primera 1 (1-cikloheksil-4-[4-(2-metoksifenil)-1-piperazinil]-2-(2-fluorofenil)butan-1-ol; višaRf u TLC) (kvadrati). Podaci predstavljaju % promena u odnosu na vrednosti u raznim vremenima tretmana. Zatim "n" = broj pacova u grupi. Signifikantnost, prikazana kao P<... (tretman između: ANOVA of CONTRAST VARIABLES) pokazuje razliku između opaženog trenda kod kontrolnih (tečni nosač) i tretiranih grupa. Zvezdica u superskriptu (<*>= p<0,05,<**>=p<0,01 i<***>=p<0,001) pokazuje signifikantnost između opažene vrednosti u vremenu registrovanja i bazične vrednosti (unutar tretmana).

Slika 2 je vremenski tok promena BVC i MP kod pacova posle oralnog ordiniranja tečnog nosača (krugovi) ili 3,0 mg/kg oxybutynin-a (kvadrati). Podaci su iskazani kao na Slici 1.

Statistička analiza

Podaci se iskazuju kao srednja vrednost±standardna greška. Procenat promena BVC i MP u odnosu na bazične vrednosti, kao i A vrednosti (razlika u mL ili mm Hg) za BVC i MP (BVC ili MP u vremenu " x" minus bazična vrednost), izračunavaju se takođe za svakog pacova/vreme. Na slikama podaci su dati kao % promene u odnosu na bazične vrednosti.

Statistička analiza vrednosti BVC i MP, kao i A vrednosti, obavljena je pomoću softvera S.A.S./STAT, verzija 6.12. Opažene razlike između tečnog nosača (kontrola) i ispitivanih tretmana su ocenjivane preko A vrednosti BVC i MP, dok su razlike između vrednosti u raznim vremenima u zavisnosti od bazičnih vrednosti analizirane na originalne podatke za BVC i MP.

Primer 9

Inhibicija stereotipa ( ritmičko lupkanje prednje šape) izazvanog sa 8- OH- DPAT,

kod pacova ( post- sinaptički antagonizam)

A . Postupak

Inhibitorni efekat antagonista receptora 5-HTia na stereotip lupkanja prednje šape, izazvan kod pacova sa subkutanom injekcijom 8-OH-DPAT, ocenjivan je po metodu Tricklebank-a (Tricklebank et al.,Eur. J. Pharmacol.,1985, 117, 15), uz minorne modifikacije, opisane niže.

Koriste se mužjaci pacova Sprague-Dawley [Crl: CD<®>(SD) IGS BR] od 150-175 g, dobavljeni iz Charles River, Italia. Životinje su smeštene sa slobodnim pristupom hrani i vodi i drže se najmanje nedelju dana na forsiranom ciklusu 12-to časovne izmene svetlo-mrak, na temperaturi 22-24°C. Na dan eksperimenta pacovi se stave pojedinačno u providne plastične kontejnere, 10-15 min pre ordiniranja tečnog nosača ili jedinjenja koja treba da se testiraju. Za ocenjivanje antagonističke aktivnosti, posle intravenoznog ili oralnog ordiniranja, jedinjenja se ordiniraju 1 i 4 h pre izazivanja stereotipa sa 8-OH-DPAT (1 mg/kg, subkutano). Opažanje je trajalo 30 s, a počelo je 3 min posle tretmana sa 8-OH-DPAT-om, i ponavljano je svakih 3 min, tokom perioda od 15 min.

Pojava simptoma izazvanog postsinaptičkom stimulacijom receptora 5-HTiaje registrovana, a intenzitet je ocenjivan koristeći skalu intenziteta ukojoj su: 0 = odsutan, 1 = sumnjiv, 2 = prisutan i 3 = intenzivan. Ocene ponašanja tretiranih životinja se sakupljaju tokom vremena posmatranja (5 perioda posmatranja) i iskazuju kao srednje vrednosti za 4 pacova/doza. Promena u srednjim vrednostima kod tretiranih životinja, u poređenju sa kontrolnom grupom (tečni nosač), iskazana kao procenat inhibicije, koristi se za kvantnitativno iskazivanje antagonističkog dejstva.

B . Rezultati

Rezultati su pokazani u Tabeli 5. Ovi rezultati pokazuju da ordiniranje jedinjenja iz ovog pronalaska dovodi do signifikantnog, dugotrajnog, post-sinaptičkog antagisitičkog dejstva na receptor 5-HTiA. Da bi se ocenila snaga jedinjenja iz ovog pronalaska za inhibiranje ovog stereotipa (ritmičko lupkanje prednjom šapom), izazvanog sa 8-OH-DPAT, određivana je vrednost ED75(ekvi-efikasna doza koja inhibira lupkanje prednjom šapom kod 75%), pomoću linearne regresije, korišćenjem metode najmanjih kvadrata.

Posle intravenoznog ordiniranja, jedinjenja Ex. 2X, Ex. 1Y i Ex. 5 su praktično ekvi-potentna. Posle oralnog ordiniranja, Ex. 1Y je snažniji nego Ex. 5, a naročito 4 h posle ordiniranja.

Claims (8)

1. Jedinjenje koje ima opštu formulu I: naznačeno time, što su R<1>predstavlja atom halogena, R<2>predstavlja (C3-C8)-cikloalkil grupa, R<3>predstavlja (Ci-C4)-alkoksi ili (Ci-C4)-haloalkoksi grupa, m je 1 ili 2, i n je 1 ili 2, ili njegov enantiomer, optički izomer, dijastereomer, N-oksid, kristalni oblik, hidrat, solvat ili farmaceutski prihvatljiva so.

2. Jedinjenje prema Zahtevu 1, naznačeno time, što R<3>predstavlja (C1-C4)-alkoksi grupa.

3. Jedinjenje prema Zahtevu 1, naznačeno time, što R<3>predstavlja (C1-C4)-haloalkoksi grupa.

4. Jedinjenje prema bilo kome od Zahteva 1 do 3, naznačeno time, što atom ugljenika koji nosi R<1->fenil grupu ima (R) konfiguraciju.

5. Jedinjenje prema Zahtevu 4, naznačeno time, što atom ugljenika koji nosi R<2>i hidroksi grupu ima (S) konfiguraciju.

6. Jedinjenje prema Zahtevu 1, naznačeno time, što ga predstavlja: 1-[4-cikloheksil-4-hidroksi-3-(2-fluorofenil)-butil]-4-(2-metoksifenil)-piperazin, u obliku bilo kog od njegovih izolovanih stereoizomera: 1-[(3R,4S)-4-cikloheksil-4-hidroksi-3-(2-fluorofenil)-butil]-4-(2-metoksifenil)- piperazin, 1-[(3S,4R)-4-cikloheksil-4-hidroksi-3-(2-fluorofenil)-butil]-4-(2-metoksifenil)- piperazin, 1-[(3R,4R)-4-cikloheksil-4-hidroksi-3-(2-fluorofenil)-butil]-4-(2-metoksifenil)- piperazin, i 1-[(3S,4S)-4-cikloheksil-4-hidroksi-3-(2-fluorofenil)-butil]-4-(2-metoksifenil)- piperazin, ili smeša bilo koja dva ili više od ovih, u bilo kom odnosu.

7. Jedinjenje prema Zahtevu 1, naznačeno time, što ga predstavlja: 1-[4-cikloheksil-4-hidroksi-3-(2-fluorofenil)-butil]-4-[2-(2,2,2-trifluoroetoksi)-fenil]-piperazin, u obliku bilo kog od njegovih izolovanih stereoizomera. 1-[(3R,4S)-4-cikloheksil-4-hidroksi-3-(2-fluorofenil)-butil]-4-[2-(2,2,2- tilfuoroetoksi)-fenil]-piperazin, 1-[(3S,4R)-4-cikloheksil-4-hidroksi-3-(2-fluorofenil)-butil]-4-[2-(2,2,2- tilfuoroetoksi)-fenil]-piperazin, 1-[(3R,4R)-4-cikloheksil-4-hidroksi-3-(2-fluorofenil)-butil]-4-[2-(2,2,2- tilfuoroetoksi)-fenil]-piperazin, 1-[(3S,4S)-4-cikloheksil-4-hidroksi-3-(2-fluorofenil)-butil]-4-[2-(2,2,2- tilfuoroetoksi)-fenil]-piperazin, ili smeša bilo koja dva ili više od ovih, u bilo kom odnosu.

8. Farmaceutski preparat, naznačen time, što sadrži jedinjenje prema bilo kom od Zahteva 1 do 7, ili njegov enantiomer, optički izomer, dijastereomer, N-oksid, kristalni oblik, hidrat, solvat ili farmaceutski prihvatljivu so, u smeši sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačem ili nosačem.