RS20050183A

RS20050183A - Dnk sekvence vezane za kukuruzni transformant pv-zmir13 (mon 863)biljke i preparati i metode za njihovu detekciju

Info

Publication number: RS20050183A
Application number: YUP-2005/0183A
Authority: RS
Inventors: Tracey Cavato; Timothy Coombe; Scott Johnson
Original assignee: Monsanto Technology Llc.,
Priority date: 2002-07-29
Filing date: 2003-07-23
Publication date: 2007-06-04
Also published as: AR040710A1; RU2005105322A; RU2352638C2; WO2004011601A3; PL374995A1; WO2004011601A8; EP1532247A4; US20060095986A1; HRP20050134A2; EP1532247A2; AU2003254099A8; BG109051A; AU2003254099A1; US7705216B2; RU2008150326A; UA87808C2; MEP35008A; US20100260729A1; WO2004011601A2

Abstract

Predmetni pronalazak obezbedjuje preparate i postupke za detektovanje prisustva DNK kukuruznog transformanta MON863 ubačene u genom kukuruza iz transformacije rekombinantnog konstrukta koji sadrži Cry3Bb gen i genomsku sekvencu bočno od mesta insercije. Predmetni pronalazak tkaodje obezbedjuje biljke kukuruznog transformanta MON863, njihovo potomstvo i seme koje sadrži DNK kukuruznog tranformanta MON863.

Description

DNK sekvence vezane za kukuruzni transformant Pv-Zmir13

(MON863) biljke i preparati i metode za njihovu detekciju

Oblast pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na područje molekularne biologije biljaka. Pronalazak se još određenije odnosi na biljke kukuruza(Zea mays)PV-ZMIR13 otporne na koleoptere, označene kao MON863, i semena i potomstvo biljke kukuruza MON863. Biljka kukuruz MON863

i njeno potomstvo su posebno otporne naDiabrotica vergifera, Diabrotica undecimpunctatai

Leptinotarsa decemlineata.

Predmetni pronalazak se još određenije odnosi na konstrukt DNK koji je ubačen u genom bilke kukuruza u transformant MON863 da bi se obezbedila otpornost na najezdu insekata posebno koleopternih vrsta. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupke za detektovanje prisustva DNK biljke kukuruza MON863 u uzorku i njihove preparate.

Stanje tehnike

Kukuruz je važan usev i on je primarni izvor hrane u mnogim područjima sveta. Biotehnološki postupci su primenjeni na biljke kukuruza radi poboljšanja agronomskih karakteristika i kvaliteta proizvoda. Poznato je da je ekspresija stranih gena kod biljaka uslovljena njihovom pozicijom na hromozomima, verovatno zahvaljujući strukturi hromatina (npr., heterohromatina) ili blizini regulacionih elemenata transkripcije (npr., pojačivača) biizu mesta integracije (VVeising i sar., Ann. Rev. Genet 22: 421-477, 1988). Iz tog razloga, često je neophodno da se pregleda veliki broj transformanata sa ciljem da se identifikuje transformant okarakterisan sa optimalnom ekspresijom ubačenog gena za koji smo zainteresovani. Na primer, zapaženo je da kod biljaka i kod drugih organizama može postojati široko variranje u nivoima ekspresije uvedenog gena među transformantima. Takođe mogu postojati razlike u prostornim i vremenskim shemama ekspresije, na primer, razlike u relativnoj ekspresiji transgena u različitim biljnim tkivima, koje ne moraju odgovarati shemama koje se očekuju na osnovu prisustva transkriptornih regulacionih elemenata koji su prisutni u unetom genskom konstruktu. Zbog toga je uobičajeno da se proizvedu stotine do hiljade različitih transformanata i da se ovi transformanti pregledaju u odnosu na pojedinačni transformant koji ima željene nivoe ekspresije transgena i sheme za komercijalne svrhe. Transformant koji ima željene nivoe ili sheme ekspresije transgena je koristan za uvođenje transgena u drugu genetičku pozadinu putem polnog ukrštanja koristeći konvencionalne metode gajenja. Potomstvo takvih ukrštanja održava ekspre-siju transgenih karakteristika originalnog transformanta. Ova strategija je upotrebljena da se obezbedi odgovarajuća ekspresija gena u jednom broju varijeteta koji su dobro adaptirani na lokalne uslove rasta.

Bilo bi vrlo korisno da je moguće da se detektuje prisustvo određenog transformanta sa ciljem da se odredi da li potomstvo polnog ukrštanja sadrži transgen za koji smo zainteresovani. Sem toga postupak za detekciju određenog transformanta bio bi koristan, na primer, za ispunjavanje propisa koji su poptrebni za odobrenje pre tržišta i obeležavanje hrane koja je dobijena od rekombinantnih biljaka kukuruza. Moguće je da se detektuje prisustvo transgena bilo kojim dobro poznatim postupkom detekcije nukleinske kiseline kao što je polimerazna lančana reakcija (PCR) ili hibridizacija DNK korišćenjem proba za nukleinske kiseline. Ovi detekcioni postupci generalno se fokusiraju na genetičke elemente koji se učestalo koriste, kao što su pro-motori, terminatori, marker geni itd. Kao rezultat, takvi postupci mogu biti beskorisni za razlikovanje između različitih transformanata, posebno onih koji su produkovani koristeći isti konstrukt DNK sem ako nije poznata sekvenca hromozomske DNK koja je u susedstvu ubačene DNK ("bočna DNK"). Diskutovan je transformant-specifičan PCR ogled, na primer, od strane VVindels. i sar. (Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent 64/5b: 459-462, 1999), koji su identifikovali transformant 40-3-2 otporan na glifozat iz soje putem PCR-a koristeći set prajmera koji obuhvata spoj između inserta i bočne DNK, posebno jedan prajmer koji je uključivao sekvencu iz inserta i drugi prajmer koji je uključivao sekvencu iz bočne DNK.

Sadržaj pronalaska

U skladu sa poželjnim oblikom predmetnog pronalaska, obezbeđeni su preparati i postupci za detekciju prisustva transgen/genom regiona insercije iz nove biljke kukuruza PV-ZMIR13. označeni kao MON863. Obezbeđene su DNK sekvence koje sadrže najmanje jednu spojenu sekvencu MON863 odabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID br.:1 (arbitrarno označen 5' kraj insert-na-genom spoju) i SEQ ID br.:2 (arbitrarno označen 3' kraj insert-na-genom spoju) i njihovi komplementi, gde spojna sekvenca obuhvata spoj između heterologne DNK ubačene u genom kukuruza i DNK iz ćelije kukuruza koja je bočno od mesta insercije i koja je dijagnostička za transformant.

U skladu sa drugim poželjnim oblikom predmetnog pronalaska, otkriveni su, na primer, sekvence DNK koje sa-drže novi transgen/genom region insercije, SEQ ID br.:3 (sekvenca koja sadrži arbitrarno označeni 5' kraj ubačene DNK) i SEQ ID br.:4 (sekvenca koja sadrži arbitrarno označeni 3' kraj ubčene DNK).

U skladu sa još jednim poželjnim oblikom predmetnog pronalaska takođe su otkrivene u predmetnom pronalasku sekvence DNK koje sadrže najmanje od oko 11 do oko 50 ili više nukleotida 5' transgenog dela sekvence DNK SEQ ID br.:7 i sličnu dužinu 5' bočne sekvence DNK kukuruza SEQ ID br.:5, ili sličnu dužinu 3' transgenog dela DNK sekvence SEQ ID br.:8 i sličnu dužinu 3' bočne sekvence DNK kukuruza SEQ ID br.:6 za upotrebu kao prajmera DNK u postupcima amplifikacije DNK. Amplikoni produkovani koristeći ove prajmere su dijagnostički za kukuruzni transformant MON863. Amplikon koji je produkovan sa prvim prajmerom DNK koji je homolog ili komplementaran sa SEQ ID br.:7 spojen sa drugim prajmerom DNK homologim ili komplementarnim sa SEQ ID br.:5, kada su prisutni oba zajedno u reakcionoj mešavini sa DNK kukuruznog transformanta MON863 u uzorku su aspekt predmetnog pronalaska. Amplikon proizveden trećim prajmerom DNK koji je homolog ili komplementaran sa SEQ ID br.:8 spojen sa četvrtim prajmerom DNK koji je homolog ili komplementaran sa SEQ ID br.:6, kada su oba prisutna zajedno u reakcionoj mešavini sa kukuruznom DNK transformanta MON863 u uzorku, su drugi cilj predmetnog pronalaska. Biljka kukuruza MON863 i potomci izvedeni iz nje koji sadrže te sekvence DNK upotrebljene u reakciji amplifikacije DNK da se obezbedi jedan ili više dija-gnostičkih amplikona su ciljevi pronalaska.

U skladu sa još jednim poželjnim oblikom predmetnog pronalaska, obezbeđeni su postupci za detekciju prisustva DNK koja odgovara kukuruznom transformantu MON863 transfo-rmanta u uzorku. Takvi postupci sadrže korake: (a) kontaktiranja biloškog uzorka za koji se pretpostavlja da sadrži DNK transformanta MON863 sa parom prajmera, koji kada se koristi u reakciji amplifikacije nukleinske kiseline sa pomenutom DNK, produkuje amplikon koji je dija-gnostički za kukuruzni transformant MON863; (b) izvođenje reakcije amplifikacije nukleinske kiseline produkujući tako amplikon: i (c) detektovanje amplikona. Amplikoni koji su ovde specifično dati primerom odgovaraju prvom amplikonu od oko 508 baznih parova, kao što je postavljeno u SEQ ID br.:3 i drugom amplikonu od oko 584 bazna para, kao što je postavljeno u SEQ IDbr.:4, ili duži ili kraći amplikoni, gde prvi pomenuti amplikon sadrži najmanje nukleotidnu sekvencu koja odgovara SEQ ID br.:1 od nukleotida oko 1 do oko nukleotida 11 ili od nukleotida oko 10 do oko nukleotida oko 20 i pomenti drugi amplikon sadži najmanje nukleotidnu sekvencu koja odgovara SEQ ID br.:2 od nukleotida oko 1 do oko nukleotida 11 ili od nukleotida oko 10 do nukleotida oko 20.

U skladu sa još jednim poželjnim oblikom predmetnog pronalaska obezbeđeni su postupci detektovanja prisustva DNK koja odgovara transformantu MON863 u uzorku. Takvi postupci sadrže korake: (a) kontaktioranja biološkog uzorka za koji se sumnja da sadrži DNK transformanta MON863 sa probom koja hibridizuje pod uslovima visoke strogoće hibridizacije sa popmenutom DNK i ne hibridizuje pod strogim uslovima hibridizacije sa DNK iz kontrolne biljke kukuruza koja ne sadrži ubačenu DNK izvedenu iz pMON25097; (b) podvrgavanje uzorka i probe strogim uslovima hibridizacije; i (c) detektovanje hibridizacije probe sa genomskom DNK gde je detekcija vezivanja probe za pomenutu DNK dijagnostička za prisustvo DNK transformanta MON863 u pomenutom uzorku.

Prema daljem poželjnom obliku predmetnog pronalaska obezbeđena je nova biljka kukuruza MON863, koja sadrži sekvence DNK koje sadrže nove transgen/genom regione insercije kao što je postavljeno u SEQ ID br.:3 i SEQ ID br.:4. Semena biljaka MON863, potomstvo biljaka MON863 i postupci za proizvodnju biljke kukuruza putem ukrštanja biljke kukuruza MON863 same sa sobom ili sa drugom biljkom kukuruza su dalji oblici predmetnog pronalaska.

Oblici koji slede i drugi poželjni oblici predmetnog pronalaska postaće mnogo očigledniji iz sledećih detaljnih opisa.

KRATAK OPIS SLIKA I SEKVENCI

Opis slika

Slika 1 ilustruje biljni ekspresioni vektor PV-ZMIR13, takođe označen ovde kao pMON 25097, iz kojeg je kukuruzni transformant MON863 crva korena generisan putem tehnologije aksceleracije čestica koristeći Mlu I restrikcioni fragment od oko 149. nukleotidne pozicije do oko nukleotidne pozicije 4840.

Slika 2 je grafička mapa koja ilustruje opštu organizaciju elementa koji sadrže heterologe sekvence nukleotidne kiseline ubačene u genom kukuruznog transformanta MON863 i esencijalno postavljene pozicije na kojima su sekvence nukleinske kiseline koje su ubačene vezane za sekvence genomske DNK kukuruza označene ovde kao sekvence genomske nukleinske kiseline kukuruza koje su bočno na krajevima ubačenih heterologih sekvenci DNK; kukuruzni transformant MON863 je okarakterisan na sledeći način: kukuruzna genomska DNK

[1] koja je bočno arbitrarno je označena kao 5' kraj pune dužine primarne funkcionalne sekvence ubačene DNK i spojena je za CaMV35S AS4 promotorsku sekvencu koja se ne javlja prirodno [2] (P-CaMV.AS4, SEQ ID br.:17) operativno vezanu za hlorofil pšenice A/B vezujući protein ne translacionu lider sekvencu [3] (L-Ta.hcb1, SEQ ID br.:18) operativno vezan za intronsku sekvencu aktina pirinča [4] (l-Os.Act1, SEQ ID br.:19) operativno vezan za sekvencu koja se ne javlje prirodno koja kodira Cry3Bb varijantni protein [5] (SEQ ID br.:20) operativno vezan sa nit šok Hsp17 pšenice transkripcionu terminaciju i poliadenilirajuću sekvencu [6] (T-Ta.Hsp17, SEQ ID br.:21) i primarnu funkcionalnu sekvencu ubačene DNK pune dužine koja je bočno u odnosu na genomsku DNK kukuruza na arbitrarno označenom 3' kraju [7] u kojoj je veza izme-đu [1] i [2] ([8]) odgovara SEQ ID br.:1 i veza između [6] i [7] ([9]) odgovara SEQ ID br.:2.

Opis sekvenci

SEQ ID br.:1 odgovara spojnoj sekvenci između genoma kukuruza i ubačene DNK koja je dijagnostička za arbitrarno označeni 5' kraj i primarnu funkcionalnu ubačenu sekvencu DNK pune dužine u kukurznom transformantu MON863.

SEQ ID br.:2 odgovara spojnoj sekvenci između genoma kukuruza i ubačene DNK koja je dijagnostička za arbitrarno označeni 3' kraj i primarnu funkcionalnu ubačenu sekvencu DNK pune dužine u kukurznom transformantu MON863.

SEQ ID br.:3 odgovara sekvenci koja je u potpunosti predstavljena sa [1] i [2] sa slike 2.

SEQ ID br.:4 odgovara sekvenci koja je u potpunosti predstavljena sa [6] i [7] sa slike 2.

SEQ ID br.:5 odgovara delu sekvence genomske DNK kukuruza koja je susedna i bočno 5' kraju arbitrarno označenom kao 5' kraj delimične kodirajuće DNK sekvence Cry3Bb koja je ubačena u kukuruzni transformant MON863.

SEQ ID br.:6 odgovara delu sekvence genomske DNK kukuruza koja je susedna i bočno 3' kraju, arbitrarno označenom kao 3' kraj, delimične kodirajuće DNK sekvence Cry3Bb koja je ubačena u kukuruzni transformant MON863.

SEQ ID br.:7 odgovara sekvenci arbitrarno označenog 5' kraja delimične kodirajuće DNK sekvence Cry3Bb koja je ubačena u kukuruzni transformant MON863.

SEQ ID br.:8 odgovara sekvenci arbitrarno označenog 3' kraja delimične kodirajuće DNK sekvence Cry3Bb koja je ubačena u kukuruzni transformant MON863.

SEQ ID br.:9 odgovara 5' prajmer sekvenci (prajmer A) koja je komplementarna delu sekvence genomske DNK kukuruza koja je identifikovana kao bočni arbitrarno označeni 5' kraj primarne funkcionalne ubačene sekvence DNK pune dužine kukuruznog transformanta MON863 i koja kada je sparena sa prajmerom koji odgovara reverznom komplementu sekvence postavljene u SEQ ID br.:10 i matrici DNK kukuruznog transformanta MON863, produkuje amplikon koji sadrži SEQ ID br.:3 koji je dijagnostički za DNK kukuruznog transformanta MON863 u uzorku.

SEQ ID br.:10 odgovara reverznom komplementu 3' prajmer sekvence (prajmer B) koja je komplementarna delu sekvence arbitrarno označenom kao 5' kraj primarne funkcionalne sekvence DNK pune dužine ubačene u genom kukuruza u kukuruznom transformantu MON863 i koja kada je sparena sa prajmerom koji odgovara sekvenci postavljenoj u SEQ ID br.:9 i matrici DNK kukuruznog transformanta MON863, produkuje amplikon koji sadrži SEQ ID br.:3 koji je dijagnostički za DNK kukuruznog transformanta MON863 u uzorku.

SEQ ID br.:11 odgovara 5' prajmer sekvenci (prajmer C) koja je komplementarna delu sekvence arbitrarno označenom kao 3' kraj primarne funkcionalne sekvence DNK pune dužine ubačene u genom kukuruza u kukuruznom transformantu MON863 i koja kada je sparena sa prajmerom koji odgovara reverznom komplementu sekvence postavljene u SEQ ID br.:12 i matrici DNK kukuruznog transformanta MON863, produkuje amplikon koji sadrži SEQ ID br.:4 koji je dijagnostički za DNK kukuruznog transformanta MON863 u uzorku.

SEQ ID br.:12 odgovara reverznom komplementu 3' prajmer sekvence (prajmer D) koja je komplementarna delu sekvence genomske DNK kukuruza identifikovanoj kao bočni arbitrarno označeni 3' kraj primarne funkcionalne ubačene sekvence DNK pune dužine u kukuruznom transformantu MON863 i koja kada je sparena sa prajmerom koji odgovara sekvenci postavljenoj . u SEQ ID br.:11 i matrici DNK kukuruznog transformanta MON863, produkuje amplikon koji sadrži SEQ ID br.:4 koji je dijagnostički za DNK kukuruznog transformanta MON863 u uzorku.

SEQ ID br.:13 odgovara 5' genomskom šetajućem prajmeru 1.

SEQ ID br.:14 odgovara 5' genomskom šetajućem prajmeru 2.

SEQ ID br. :15 odgovara 3' genomskom šetajućem prajmeru 1.

SEQ ID br.:16 odgovara 3' genomskom šetajućem prajmeru 2.

SEQ ID br.:17 odgovara CaMV35S AS4 promotorskoj sekvenci.

SEQ ID br.:18 odgovara lider sekvenci vezujućeg proteina A/B hlorofila pšenice (L-Ta.hcbl).

SEQ ID br.:19 odgovara intronskoj sekvenci aktina pirinča (l-Os.Act1).

SEQ ID br.:20 odgovara sekvenci koja kodira Cry3Bb, varijantni protein koje se ne javlja

prirodno.

SEQ ID br.:21 odgovara poliadenilirajućoj sekvenci terminacije transkripcije hit šok pše-nice Hsp17.

DETALJNI OPIS POŽELJNIH OBLIKA

Definicije i postupci koji slede obezbeđeni su da bi se bolje definisao predmetni pronalazak i da se upute oni sa iskustvom u praksi u primeni predmetnog pronalaska. Sem ako je naglašeno drugačije, termini treba da se shvate u skladu sa konvencionalnom upotrebom onih koji imaju uobičajeno iskustvo u odgovarajućoj praksi. Definicije uobičajenih termina u molekularnoj biologiji mogu se takođe naći u Rieger i sar., Rečnik genetike: Klasične i molekularne, 5 izdanje, Springer-Verlag: New York, 1991; i Levvin, Genes V, Oxford Universitv Press: New York, 1994. Nomenklatura za baze DNK upotrebljena je kao što je postavljeno u 37 CFR§ 1.822.

Onako kako se ovde koristi termin "biološki uzorak" ili "uzorak" predviđen je da uključi nukleinske kiseline, polinukleotide, DNK, RNK, tRNK, cDNK i tome slično u preparatu ili fiksirane za supstrat koji omogućuje da se uzorak podvrgne analizi molekularne probe ili termalnoj amplifikaciji koristeći oligonukleotidne probe i/ili prajmere.

Onako kako se ovde koristi termin "kukuruz" označavaZea maysili kukuruz i uključuje

sve biljne varijetete koji se mogu ukrštati sa kukuruzom, uključujući divlje vrste kukuruza.

Onako kako se ovde koristi termin "sadrži" označava "uključivanje ali bez ograničenja

na".

Onako kako se ovde koristi termin "dijagnostički" odnosi se na činjenicu da su, za svrhu identifikacie sekvenci nukleinske kiseline kao što su one sadržane u, ili izvedene iz kukuruznog transformanta MON863, bilo koja ili više novih sekvenci DNK postavljenih ovde, sadrže bočne sekvence genoma kukuruza u susedstvu i vezane za arbitrarno označene krajeve ubačenih heterologih sekvenci DNK, neophodne i dovoljne kao opisne i kao karakteristike za razlikovanje genoma kukuruznog transformanta MON863, sve dok sekvence sadrže najmanje deo jednog od krajeva ubačene heterologe sekvence DNK ili genomske bočne sekvence kukuruza ili susedno od jednog od ovih krajeva i uključuju najmanje dva nukleotida, di-nukleotida, sadržeći tačku u kojoj su sekvenca genoma kukuruza i ubačena heterologa sekvenca DNK vezani zajedno fosfo-diestarskom vezom. Dobro je poznato u praksi da je sekvenca koja je dijagnostička za određeni transformant, kao što je onaj opisan ovde za transformant kukuruza MON863, koja nije prisutna u određenom uzorku koji sadrži nukleinske kiseline genoma kukuruza, indikacija da uzorak ne sadrži dijagnostičku sekvencu, i prema tome, nukleinske kiseline u uzorku nisu ili nisu bile izvedene iz i nisu bile sadržane u genomu kukuruznog transformanta MON863. Sem toga, dodatne nove i dijagnostičke sekvence prisutne su u DNK kukuruznog transformanta MON863 kao što je ovde dato primerima odabranim iz grupe koja se sastoji od SEQ ID br.:1, SEQ ID br.:2, SEQ ID br.:3 i SEQ ID br.:4 i njihovih komplemenata.

Transgeni "transformant" je proizveden putem transformacije biljne ćelije sa heterologom DNK, tj., konstruktom nukleinske kiseline koji uključuje transgen za koji smo zainteresovani, regeneraciju populacije biljaka nastalih iz ubacivanja transgena u genom biljke i selekciju određene biljke okarakterisane sa insercijom u određenu genomsku lokaciju. Termin "transformant" odnosi se na originalni transformant i potomstvo transformanata koje uključuje heterologu DNK. Termin "transformant" takođe se odnosi na potomstvo produkovano polnim ukrštanjem između transfo-rmanta i drugog varijeteta koji uključuje heterologu DNK. Čak i nakon ponovljenih povratnih ukrštanja povratnog roditelja, ubačena DNK i bočna DNK iz transformisanog roditelja je prisutna u potomstvu ukrštanja na istoj hromozomskoj lokaciji. Termin "transformant" takođe se odnosi na DNK iz originalnog transformanta koji sadrži ubačenu DNK i bočnu genomsku sekvencu odmah spojenu za ubačenu DNK za koju se očekuje da se prenese u potomstvo koje prima ubačenu DNK uključujući trasgen za koji smo zainteresovani kao rezultat polnog ukrštanja jedne roditeljske linije koja uključuje ubačenu DNK (npr., originalni transformant i potomstvo koje je nasta-lo samooprašivanjem) i roditeljske linije koja ne sadrži ubačenu DNK.

Takođe treba da se shvati da dve različite transgene biljke mogu takođe da se ukrste da bi proizvele potomstvo koje sadrži dva ili više egzogena gena koji se nezavisno razdvajaju (egzogeni geni odnose se na nukleotidne sekvence koje se ne javljaju prirodno u biljnom genomu. tj., heterogene za biljku kukuruza). Oprašivanje odgovarajućeg potomstva može proizvesti biljke koje su homozigotne za bilo koju kombinaciju egzogenih gena. Povratno ukrštanje sa roditeljskom biljkom i spoljašnje ukrštanje sa ne-transgenom biljkom takođe su zamišeljeni, kao što je i vegetativna propagacija. Opisi drugih postupaka ukrtanja koji se uobičajeno koriste za različite karakteristike i useve mogu se naći u jednoj od nekoliko referenci, npr., Fehr, u Metodi gajenja za razviće kultivara, Wilcox J. izd., American Societv of Agronomv, Madison Wl

(1987).

"Proba" je izolovana nukleinska kiselina za koju se može vezati ili pričvrstiti konve-ncionalni detektabilni obeleživač ili reporter molekul, npr., radioaktivni izotop, veznik, hemilu-minescentni agens, ili enzim. Takva proba je komplementarna sekvenci u ciljnoj nukleinskoj kise-lini, u slučaju predmetnog pronalaska, sekvenci genomske DNK iz kukuruznog transformanta MON863 bilo iz biljke kukuruza ili iz uzorka koji uključuje DNK is transformanta. Probe u skladu sa predmetnim pronalaskom uključuju ne samo dezoksiribonukleinske ili ribonukleinske kiseline nego i poliamide i druge materijale proba koje se vezuju specifično za ciljnu sekvencu DNK i koje se mogu upotrebiti da se detektuje prisustvo ciljne sekvence DNK.

"Prajmen" su izolovane probe nukleinske kiseline koje su vezane za, za bilo koji dati po-jedinačni prajmer, komplementarnu ciljnu sekvencu DNK putem hibridizacije nukleinske kiseline da se formira hibrid između prajmera i ciljne sekvence DNK i zatim produži duž ciljnog DNK lanea putem polimeraze, npr., DNK polimeraze. Parovi prajmera predmetnog pronalaska odnose se na dva ili više različitih prajmer sekvenci koje su za amplifikaciju sekvence nukleinske kiseline koja je između i vezana za ciljnu sekvencu označenu kao reverzni komplement ili gotovo potpuno reverzni komplement prajmera, npr., pomoću polimerazne lančane reakcije (PCR) ili drugih konvencionalnih postupaka amplifikacije nukleinske kiseline.

Probe i prajmeri su generalno od oko 11 nukleotida ili više u dužinu, poželjno od oko 18 nukleotida ili više u dužinu, još poželjnije od oko 24 nukleotida ili više u dužinu i najpoželjnije od oko 30 nukleotida ili više u dužinu. Takve probe i prajmeri hibridizuju specifično za ciljnu sekvencu pod uslovima visoke strogoće. Poželjno, probe i prajmeri u skladu sa predmetnim pronalaskom imaju kompletnu sličnost sekvence sa ciljnom sekvencom, i ako probe koje se razli-kuju od ciljne sekvence i koje zadržavaju sposobnost da hibridizuju sa ciljnim sekvencama mogu da budu dizajnirane konvencionalnim postupcima.

Postupci za pripremanje i upotrebu proba i prajmera opisani su, na primer, uMolekularno kloniranje: Laboratorijski priručnik,2 izd.., vol 1-3, izd. Sambrook i sar., Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (ovde, "Sambrok i sar., 1989");Tekući protokoli u molekularnoj biologiji,izd. Ausbel i sar., Greene Publishing i Wiley-lnterscience, New York, 1992 (sa periodičnim dopunama) (ovde, "Ausber i sar., 1992") i Innis i sar.,PCR protokoli: Vodič za postupke i primene,Academic Press: San Diego, 1990. Parovi PCR prajmera mogu se izvesti iz poznate sekvence, na primer, koristeći kompjuterske programe koji su namenjeni za tu svrhu kao što je Primer (verzija 0.5, © 1991, VVhitehead Institute for Biome-dical Research, Cambridge, MA).

Prajmeri i probe koji su konstruisani na osnovu bočne DNK. insert sekvenci i spojnih sekvenci koje su otkrivene ovde mogu se upotrebiti da se potvrdi prisustvo otkrivenih sekvenci u uzorku putem konvencionalnih postupaka, npr., putem re-kloniranja i sekvenciranja takvih sekvenci.

Bilo koja pojedinačna proba nukleinske kiseline ili prajmer predmetnog pronalaska hibridizuju pod strogim uslovima za specifičnu ciljnu sekvencu DNK. Bilo koja konvencionalna hibridizacija nukleinske kiseline ili postupak amplifikacije mogu se upotrebiti da se identifikuje prisustvo DNK iz transgenog transformanta u uzorku. Molekuli nukleinske kiseline ili njihovi fragmenti specifično hibridizuju za molekule druge nukleinske kiseline pod određenim uslovima. Onako ka-ko se koristi ovde, dva različita molekula nukleinske kiseline od koji svaki sadrže različite sekvence, predviđeni su da specifično hibridizuju jedan sa drugim ako dva molekula formiraju anti-paralelnu, dvolančanu strukturu nukleinske kiseline. Za molekul nukleinske kiseline kaže se da je "komplement" molekula druge nukleinske kiseline ako oni pokazuju potpunu kompleme-ntarnost. Onako kako se koristi ovde kaže se da molekuli pokazuju "kompletnu komplementa-rnost" kada je svaki nukleotid jednog od molekula komplementaran nukleotidu drugog. Rečeno je da su dva molekula "minimalno komplementarna" ako mogu da hibridizuju jedan sa drugim sa dovoljnom stabilnošću koja im dozvoljava da ostanu ne vezani jedan sa drugim pod najmanje uslovima konvencionalane "niske strogoće". Slično, rečeno je da su molekuli "komple-mentarni" ako oni hibridizuju jedan sa drugim sa dovoljnom stabilnošću koja im omogućuje da ostanu vezani jedan sa drugim pod konvencionlalnim uslovima "visoke strogoće". Konvencio-nalan! uslovi strogoće opisani su od strane Sambrook i sar., 1989. i od strane Haymes i sar., (u:Hibridizacija nukleinske kiseline, praktičan pristup,IRL Press, VVashington, DC, 1985). Odstupanja od kompletne komplementarnosti su prema tome dozvoljena sve dok takva odstupanja ne isključuju potpuno kapacitet molekula da formiraju dvolančane strukture. Sa ciljem da molekul nukleinske kiseline služi kao prajmer ili proba potrebno je da bude samo dovoljno komplementaran u sekvenci da bi bio u stanju da formira stabilnu dvolančanu strukturu pod određenim rastvaračem i upotrebljenim koncentracijama soli.

Termin "specifično za (ciljnu sekvencu)" naznačava da proba ili prajmer hibridizuju pod strogim uslovima hibridizacije samo za ciljnu sekvencu u uzorku koji sadrži ciljnu sekvencu, i da se ta hibridizacija može detektovati.

Onako kako se koristi ovde "izolovana" nukleinska kiselina je ona koja je, gotovo u potpunosti, izdvojena od, ili prečišćena iz sekvenci druge nukleinske kiseline u ćeliji organizma u kojoj se nukleinska kiselina prirodno javlja, tj. druga hromozomalna i ekstra-hromozomalna DNK i RNK, putem postupaka konvencionalanog prečišćavanja nukleinske kiseline. Termin takođe obuhvata rekombinantne nukleinske kiseline i himijski sisntetizovane nukleinske kiseline.

Onako kako se koristi ovde "gotovo u potpunosti homologa" sekvenca je sekvenca nukleinske kiseline koja specifično hibridizuje sa komplementom sekvence nukleinske kiseline sa kojom je bila upoređena, tj., ciljnom sekvencom, pod strogim uslovima. Odgovarajući uslovi strogoće koji promovišu hibridizaciju DNK, na primer, 6.0 x natrijum hlorid/natrijum citrat (SSC) na-oko 45°C, nakon čega sledi ispiranje sa 2 x SSC na 50°C, su poznati onima sa iskustvom u praksi ili se mogu naći uTekući protokoli u molekularnoj biologiji,John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6., 1989. Na primer, koncentracija soli u koraku ispiranja može se odabrati iz niske strogoće od oko 2.0 x SSC na 50°C do visoke strogoće od oko 0.2 x SSC na 50°C. Sem toga, temperatura u koraku ispiranja može se povisiti od uslova niske strogoće na sobnoj temperaturi, oko 22°C, do uslova visoke strogoće na oko 65°C. I temperatura i so se mogu varirati, ili bilo temperatura ili koncentracija soli mogu ostati konstantni dok se druga promenjiva menja. U poželjnom obliku, nukleinska kiselina predmetnog pronalaska će specifično hibridizovati sa jednim ili više molekula nukleinske kiseline postavljeninih bilo u SEQ ID br.:1 ili SEQ ID br.:2 ili njihovim komplementima ili njihovim fragmentima pod umerenim uslovima strogoće, na primer na oko 2.0 x SSC na oko 65°C. U posebno poželjnom obliku, nukleinska kiselina predmetnog pronalaska će specifično hibridizovati sa jednim ili više molekula nukleinske kiseline postavljenog bilo u SEQ ID br.:1 ili SEQ ID br.:2 ili komplementu ili njihovim fragmentima pod uslovima visoke strogoće. Nukleinska kiselina predmetnog pronalaska koja hibridizuje sa sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži SEQ ID br.:1 ili sa sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži SEQ ID br.:3 neće neophodno hibridizovati sa sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži SEQ ID br.:2 ili sa sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži SEQ ID br.:4; i obrnuto.

U jednom aspektu predmetnog pronalaska, poželjne molekul marker nukleinske kiseline predmetnog pronalaska ima sekvencu nukleinske kiseline postavljenu u SEQ ID br.:1 ili SEQ ID br.:2 ili njegovim komplementima ili njihovim fragmentima. U drugom aspektu predmetni pronalazak, poželjni marker molekula nukleinske kiseline predmetnog pronalaska deli između 80% i 100% ili između 90% i 100% identičnosti sekvence sa sekvencom nukleinske kiseline postavljenom u SEQ ID br.:1 i SEQ ID br.:2 ili nihovom komplementu ili njihovim fragmentima. U daljem aspektu predmetnog pronalaska poželjni marker molekul nukleinske kiseline predmetnog pronalaska deli između 95% i 100% identičnosti sekvence sa sekvencom postavljenom u SEQ ID br.:1 i SEQ ID br.:2 ili njihovom komplementu ili njhovim fragmentima. SEQ ID br.:1 i SEQ ID br.:2 mogu se upotrebiti kao markeri u postupcima gajenja biljaka da se identifikuje potomstvo genetičkih ukrštanja slično postupcima opisanim za jednostavnu analizu marker sekvence repetitivne DNK, u" DNK markeri" protokoli primene i sveobuhvatni prikaz,173-185, Cregan i sar., izd., Wiley-Liss NY, 1997. Hibridizacija probe za molekul ciljne DNK može se detektovati bilo kojim od brojnih postupaka, poznatih onima sa iskustvom u praksi, ovi mogu uključiti, ali nisu ograničeni na, fluorescentne oznake, radioaktivne oznake, oznake bazirane na antitelu i hemiluminescentne oznake.

Kada se razmatra amplifikacija cilje sekvence nukleinske kiseline (npr. putem PCR) koristeći posebne amplifikacione parove prajmera, "uslovi strogoće" su uslovi koji dozvoljavaju individualnim prajmerima, u paru prajmera, da hibridizuju samo za individualnu i jedinstvenu sekvencu nukleinske kiseline za koju svaki prajmer, koji sadrži odgovarajuću sekvencu divljeg tipa (ili njen komplement), će se vezati i poželjno da produkuje jedinstveni amplifikacioni produkt, amplikon u reakciji termalne amplifikacije DNK.

Onako kako se ovde koristi termin "transformacija" odnosi se na transfer fragmenta nukleinske kiseline u genom organizma domaćina kao što je biljka domaćin, rezultujući genetički stabilnim nasleđivanjem. Biljke domaćini koje sadrže transformisane fragmente nukleinske kiseline označene su kao "transgene biljke".

Onako kako se ovde koristi "amplifikovana DNK" ili "amplikon" odnosi se na produkt amplifikacije nukleinske kiseline ciljne sekvence nukleinske kiseline koja je deo matrice nukleinske kiseline. Na primer, da se odredi da li biljka kukuruza nastala iz polnog ukrštanja sadrži transgeni transformant genomske DNK iz biljke kukuruza MON863 predmetnog pronalaska, DNK ekstrahovana iz uzorka tkiva biljke kukuruza može se podvrgnuti postupku amplifikacije nukleinske kiseline koristeći par prajmera koji uključuje prajmer izveden iz bočne sekvence u genomu biljke susedno mestu insercije ubačene heterologe DNK i drugi prajmer izveden iz ubačene heterologe DNK da se produkuje amplikon koji je dijagnostički za prisustvo transfo-rmanta DNK. Amplikon je dugačak i ima sekvencu koja je takođe dijagnostička za transformant. Amplikon može imati raspon dužine od kombinovane dužine parova prajmera plus jedan par nukleotidnih baza, poželjno plus oko pedeset parova nukleotidnih baza, još poželjnije plus oko dvesta pedeset parova nukleotidnih baza i čak još poželjnije plus oko četiri stotine pedeset parova nukleotidnih baznih parova. Alternativno par prajmera može se izvesti iz bočne sekvence na obe strane ubačene DNK tako da se produkuje amplikon koji uključuje celu ubačenu nukleotidnu sekvencu. Član para prajmera izveden iz sekvence genoma biljke može se locirati na ra-zdaljini od ubčene DNK sekvence, ovo rastojanje može biti u rasponu od jednog baznog nukleotidnog para sve do oko dvadeset hiljada nukleotidnih baznih parova. Upotreba termina "amplikon" specifično isključuje dimere prajmera koji se mogu formirati u DNK reakcijom termalne amlifikacije.

Amplifikacija nukleinske kiseline može biti izvršena bilo kojim od različitih postupaka amplifikacije nukleinske kiseline poznatih u praksi, uključujući polimeraznu lančanu reakciju (PCR). Mnoštvo amplifikacionih postupaka je poznato u praksi i opisani suinter alia,u U.S. patent br. 4,683,195 i 4,683,202 i uPCR protokolima: Vodič za postupke i primene,izd. Innis i sar., Academis Press San Diego, 1990. PCR amplifikacioni postupci su razvijeni da se amplifikuje sve do 22 kb genomske DNK i sve do 42 kb DNK bakteriofaga (Cheng i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5695-5699, 1994). Ovi postupci kao i drugi postupci poznati u praksi amplifikacije DNK mogu se upotrebiti u praksi predmetnog pronalaska. Sekvenca heterologog inserta DNK ili bočna sekvenca iz kukuruznog transformanta MON863 može biti potvrđena (i ispravljena ako je neophodno) amplifikacijom takvih sekvenci iz transformanta koriteći prajmere izvedene iz sekvenci obezbeđenih ovde, praćene standardnim sekvenciranjem DNK, PCR amplikona ili klonirane DNK.

Amplikon produkovan ovim postupcima može se detektovati mnoštvom tehnika. Jedan takav postupak je genetička analiza bita (Nikiforov i sar., Nucleic Acid Res. 22: 4167-4175, 1994) gde je oligonukleotid DNK dizajniran tako da preklapa i susedne bočne sekvence genomske DNK i ubačene sekvence DNK. Oligonukleotid je imobiliziran u bunarčićima ploče sa mikrobunarčićima. Nakon PCR-a regiona od interesa (koristeći jedan prajmer na ubačenoj sekvenci i jedan na susednoj bočnoj genomskoj sekvenci) jednolančani PCR produkt može biti hibridizovan na imobilizirani oligonukleotid i poslužiti kao matrica za reakciju produžavanja poje-dinačnih baza koristeći DNK polimerazu i obeležene ddNTP-ove specifične za očekivanu sledeću bazu. Očitavanje može biti fluorescentno ili zasnovano na ELISA. Signal naznačava prisustvo insert/bočne sekvence zahvaljujući uspešnoj amplifikaciji, hibridizaciji i dodavanju pojedinačne baze.

Drugi postupak je tehnika pirosekvenciranja kao što ju je opisao Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). U ovom postupku oligonukleotid je dizajniran tako da preklapa susednu genomsku DNK i spoj sa ubačenom DNK. Oligonukleotid je hibridizovan za jednolančani PCR produkt iz regiona za koji smo zainteresovani (jedan prajmer u ubačenoj sekvenci i jedan u bočnoj genomskoj sekvenci) i inkubiran u prisustvu DNK polimeraze, ATP, sulfurilaze, luciferaze, apiraze, adenozin 5' fosfosulfata i luciferina. dNTP-ovi su dotati pojedinačno i inkorporacija rezultira svetlim signalom koji je meren. Svetlosni signal ukazuje na prisustvo transgen/bočna sekvence zahvaljujući uspešnoj amplifikaciji, hibridizaciji i pojedinačnom ili višestrukom dodavanju baze.

Fluorescentna polarizacija kao što se je opisali Chen i sar., (Genome Res. 9: 492-498, 1999) je postupak koji se može upotrebiti da se detektuje amplifikacija predmetnog pronalaska. Koristeći ovaj postupak dizajniran je oligonukleotid koji preklapa vezu genomske bočne i uba-čene DNK. Oligonukleotid je hibridizovan sa jedno-lančanim PCR produktom iz regiona za koji smo zainteresovani (jedan prajmer ubačene DNK i jedan od bočne genomske DNK sekvence) i inkubiran u prisustvu DNK polimeraze i fluorescentno obeleženog ddNTP. Pojedinačno doda-vanje baze rezultira inkorporacijom ddNTP. Inkorporacija se može meriti kao promena u polarizaciji koristeći fluorometar. Promena u polarizaciji ukazuje na prisustvo transgene insert/bočne sekvence zahvaljujući uspešnoj amplifikaciji, hibridizaciji i dodavanju pojedinačne baze.

Taqman® (PE Applied Biosvstems, Foster City, CA) je opisan kao metod za detektovanje i kvantifikovanje prisustva DNK sekvence i potpuno je jasan na osnovu uputstava koje obezbeđuje proizvođač. Ukratko, dizajnirana je FRET oligonukleotidna proba koja preklapa vezu genomske bočne i ubačene DNK. FRET proba i PCR prajmeri (jedan prajmer u ubačenoj sekvenci DNK i jedan u bočnoj genomskoj sekvenci) su bili u ciklusu u prisustvu termostabilne polimeraze i dNTP-ova. Hibridizacija FRET probe rezultira isecanjem i oslobađanjem fluorescentne grupe iz neutralisane grupe FRET probe. Fluorescentni signal ukazuje na prisustvo bočne/transgene insert sekvence zahvaljujući uspešnoj amplifikaciji i hibridizaciji.

Opisani su molekularni svetionici koji se koriste u detekciji sekvenci kao što je opisano u Tvangi i sar. (Nature Biotech, 14: 303-308, 1996). Ukratko, dizajnirana je FRET oligonukleotidna proba koja preklapa vezu genomske bočne i ubačene DNK. Jedinstvena struktura FRET probe rezultira u sekundarnoj strukturi koju ona sadrži koja održava fluorescentne i neutralisane grupe u neposrednoj blizini DNK. FRET proba i PCR prajmeri (jedan prajmer u ubačenoj sekvenci DNK i jedan u bočnoj genomskoj sekvenci) su bili u ciklusu u prisustvu termostabilne polimeraze i dNTP-ova. Nakon uspešne PCR amplifikacije, hibridizacija FRET probe za ciljnu sekvencu rezultira uklanjanjem probe sekundarne strukture i prostornim razdvajanjem fluore-scencije i neutralisanih grupa. Nastaje fluorescentni signal. Fluorescentni signal ukazuje na prisustvo bočne/transgene insert sekvence zahvaljujući uspešnoj amplifikaciji i hibridizaciji i dija-gnostički je za nukleinsku kiselinu kukuruznog transformanta MON863 u uzorku.

Svi gornji postupci mogu se modifikovati da se odredi zigotnost određenog uzorka nukleinske kiseline izvedene iz pojedinačnog uzorka. Na primer, biljka kukuruznog transformanta MON863 koja je homozigotna za transformant 863 alel sadrži u svom genomu dve kopije karakterističnog alela transformanta 863 i dijagnostičke za genom kukuruznog transformanta MON863, i tako, kada se ukrsti, će se uspešno razmnožiti. Alternativno, homozigotna biljka kukuruznog transformanta MON863 može se ukrstiti sa drugim varijetetom kukuruza, i rezultat ukrštanja biće biljke koje su heterozigotne za alel kukuruznog transformanta MON863. Osmišljeni su postupci u kojima neko sa iskustvom u praksi može odrediti zigotnost određene biljke sa pozivom na alel kukuruznog transformanta MON863.

Na primer, upotreba tri različita prajmera u reakciji amplifikacije sa DNK kukuruznog transformanta MON863 kao matrice i u odvojenoj i paralelnoj reakciji amplifikacije sa negativnom kontrolom kukuruzne DNK koja nije MON863, tj., ne sadrži ubačenu DNK koja je prisutna u MON863 DNK, rezultiraće u dva različita izlaza u zavisnosti od zigotnosti kukuruzne DNK koja sadrži DNK kukuruznog transformanta MON863. Karakteristični primeri mogu se odabrati iz grupe koja se sastoji od SEQ ID br.:9, SEQ ID br.:10 i SEQ ID br.:12. Amplifikacija ne-MON863

.. DNK sa ovom grupom prajmera rezultiraće u prajmer paru SEQ ID br.:lĐ i SEQ ID br.:l2 produkujući prvi amplikon koji odgovara susednoj genomskoj sekvenci kukuruza u koju je sekvenca PV-ZMIR13 ubačena, ova amplifikovana sekvenca odgovara gotovo u potpunosti vezanoj kombinaciji SEQ ID br.:5 i SEQ ID br.:6. Ovaj prvi amplikon če se očekivati kod biljke koja je heterozigotna za alel kukuruznog transformanta MON863, međutim, heterozigot će takođe proizvesti drugi amplikon koji odgovara SEQ ID br.:3 iz dodavanja para prajmera koji odgovaraju

SEQ ID br.:9 i SEQ ID br.:10. Biljka kukuruza koja sadrži DNK koja je bila homozigotna za MON863 alel produkovaće samo drugi amplikon.

Slično tome, treći amplikon će biti produkovan iz reakcije termalne amplifikacije koja koristi prajmere SEQ ID br.:10, SEQ ID br.:11 i SEQ ID br.:12 sa DNK iz biljke kukuruza MON863 kao matrice, ovaj treći amplikon odgovara SEQ ID br.:4. Ovaj treći amplikon biće jedini amplikon koji je produkovan koristeći ovu određenu kombinaciju prajmera i matricu DNK ako je biljka homozigotna za MON863 alel, međutim, heterozigotna matrica DNK će rezultirati amplifikacijom prvog i trećeg amplikona, a ne-MON863 matrica DNK će rezultirati amplifikacijom samo prvog amplikona.

Ovde su pronalazači odredili na osnovu procene putem molekularne karakterizacije da kukuruzni transformant MON863 sadrži primarni funkcionalni insert koji sadrži značajan deo transformacionog plazmida, PV-ZMIR13. Segment je detektabilan i dijagnostički za sekvence nukleinske kiseline transformanta MON863 u uzorku, posebno kod biljaka koje su samooprašene nakon nastanka transformanta MON863.

Postoji mnogo postupaka za transformisanje molekula nukleinske kiseline Cry3Bb u biljne ćelije kao što su ćelije biljke kukuruza da se proizvede željeni transformant kao što je MON863. Smatra se da pogodni postupci uključuju gotovo bilo koje postupke kojima se mogu molekuli nukleinske kiseline ubaciti u ćelije, kao što su infekcija saAgrobacteriumili direktna isporuka molekula nukleinske kiseline koja može uključiti PEG-posredovanu transformaciju, elektroporaciju i ubrzavanje obavijenih čestica DNK, itd (Potvkus, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 205-225, 1991; Vasil, Plant Mol. Biol. 25: 925-937, 1994). Na primer, elektroporacija je bila upotrebljena da se transformišu protoplastiZea mays(Fromm i sar., Nature, 312: 791-793, 1986). Generalno, sledeća četiri su najčešće korišćeni opšti postupci za isporuku gena u ćelije: (1) hemijski postupci (Graham i van der Eb, Virology 54: 536-539, 1973); (2) fizički postupci kao što je mikroinjekcija (Capecchi, Cell 22: 479-488, 1980), elektroporacija (Wong i Neumann, Biochem. Biophys. Res. Commun. 107: 584-587, 1982; Fromm i sar. Proc. Natl. Acad. Sci.

(SAD) 82: 5824-5825, 1985; U.S. patent br. 5,384,253); i genski pištolj (Johnston i Tang, Methods Cell Biol. 43: 353-365, 1994); (3) pomoću virusnih vektora (Clapp, Clin. Perinatol. 20: 155-168, 1993; Lu i sar., J. Exp. Med. 178: 2089-2096, 1993; Eglitis i Anderson, Biotechniques 6: 608-614, 1988); i (4) receptor posredovanih mehanizama (Curiel i sar., Hum. Gen. Ther. 3: 147-154, 1992; VVagner i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. (SAD) 89: 6099-6103, 1992).

Transformacija biljnih protoplata može se postići korišćenjem postupaka zasnovanih na taloženju kalcijum fosfata, tretmanu polietilen glikolom, elektroporaciji i kombinaciji ovih tretmana. Vidi, na primer, (Potrykus i sar. Mol. Gen. Genet., 205: 193-200, 1986; Lorz i sar., Mol. Gen. Genet., 199: 178, 1985; Fromm i sar. Nature 319: 791, 1986; Uchimiya i sar., Mol. Gen. Genet., 204: 204, 1986; Callis i sar., Gens and Development, 1183, 1988; Marcotte i sar., Nature 335: 454, 1988). Primena ovih sistema na različite biljne sojeve zavisi od sposobnosti da se regenerišu ti određeni biljni sojevi iz protoplasta. Među njima su postupci za kukuruz (U.S. patent br. 5,569,834, U.S. patent br. 5,416,011; McCabe i sar. Biotechnology 6: 923, 1988; Christov i sar, Plant Physil. 87: 671-674, 1988). Ilustrativni postupci za regeneraciju žitarica iz protoplasta su takođe opisani (Fujimura i sar., Plant Tissue Culture Letters, 2: 74, 1985; Toriyama i sar., Theor. Appl. Genet. 205: 34, 1986; Yamada i sar., Plant Cell rep., 4: 85, 1986; Abdullah i sar., Biotechnology 4: 1087, 1986).

Transgene biljke kao što je biljka transgenog kukuruza MON863 formirane koristeći postupke transforamacije obično sadrže pojedinačno dodati Cry3Bb gen na jednom hromozomu. Takve transgene biljke mogu se označiti kao heterozigotne za dodati Cry3Bb gen. Još poželjnije transgene biljke koje su homozoigotne za dodati gen Cry3Bb; tj. transgena biljka koja sadrži dva dodata Cry3Bb gena, jedan gen na istom lokusu na svakom hromozomu iz hromozomskog pa-ra. Hromozigotna transgena biljka može se dobiti polnim ukrštanjem (samooprašivanjem) neza-visnim razdvajanjem transgene biljke koja sadrži pojedinačni dodati Cry3Bb gen, isklijavanjem nekih od semena koja su produkovana i analiziranjem nastalih biljaka produkovanih za Cry3Bb gen.

Shvaćeno je da dve razližite transgene biljke takođe mogu da se ukrste da proizvedu potomstvo koje sadrži dva nezavisno razdvajajuća dodata Cry3Bb gena. Samooprašivanje odgo-varajućeg potomstva može produkovati biljke koje su homozigotne za oba dodana Cry3Bb gena '"■ koji kodiraju Cry3Bb polipeptide. Povratno ukrštanje roditeljske biljke i ukrštanje van srodstva sa ne-transgenom biljkom su takođe predviđeni, kao što je i vegetativna propagacija.

Specifično, postupak za proizvodnju biljke kukuruza koja je rezistentna na najezdu koleopternih insekata može se obaviti u sledećim koracima: 1) Polnim ukrštanjem prve biljke kukuruza koja je izrasla iz semena kukuruza transformanta MON863, koja sadrži molekul DNK odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID br.:1, SEQ ID br.:2, SEQ ID br.:3, SEQ ID br.:4 i SEQ ID br.:20, koji donose rezistenciju na najezdu koleopternih insekata i druge biljke kukuruza kojoj nedostaje rezistencija na najezdu koleopternih insekata, produkujući tako mnoštvo biljaka prve generacije; 2) odabiranja biljke prve generacije potomstva koja je otporna na najezdu koleopternih insekata, 3) samooprašivanja pomenute biljke potomstva prve generacije, produkujući tako mnoštvo biljka potomstva druge generacije; i 4) selekcijom biljaka iz pomenutog potomstva druge generacije biljke otporne na najezdu koleopternih insekata. Biljka potomstva prve generacije koja je rezistentna na najezdu koleopternih insekata ili biljka potomstva druge generacije koja je rezistentna na najezdu koleopternih insekata, mogu se povratno ukrstiti sa drugom biljkom kukuruza ili trećom biljkom kukuruza dajući kao rezultat biljku kukuruza koja je otporna na štetu najezde koleopternih insekata.

Regeneracija, razviće i kultivacija biljaka, kao što su biljke MON863 iz transformanata ili iz različitih transformisanih eksplanata su dobro poznati u praksi (Weissbach i VVeissbach, u:Postupci za biljke u molekularnoj biologiji,izd. Academic Press Inc. San Diego, CA, 1988). Ova regeneracija i procesi rasta mogu obično uključiti korake selekcije transformisanih ćelija koje sadrže egzogene Cry3Bb gene, kultivisanje ovih individualizovanih ćelija kroz korisne korake razvitka embriona preko stupnja ukorenjene biljčice. Transgeni embrioni i semena su slično regenerisana. Nastali transgeni ukorenjeni izdanci su nakon toga zasađeni u odgovarajući me-dijum za rast biljke kao što je zemlja.

Regeneracija biljaka koje sadrže strane, egzogene gene koji kodiraju protein za koji smo zainteresovani je dobro poznata u praksi. Kao što je opisano u predmetnom pronalasku, regenerisane biljke kao što su regenerisane MON863 biljke koje sadrže Cry3Bb nukleinske kiseline, bilo divljeg tipa ili hemijski sintetizovane, koji kodiraju za Cry3Bb proteine, mogu se poželjno samooprašiti da se obezbede homozigotne transgene biljke kukuruza, kao što je disukutovano ranije. Inače, polen dobijen iz regenerisanih biljaka kukuruza može se ukrstiti sa biljkama odraslim iz semena agronomski važnih linija. Obrnuto, polen iz biljaka tih agronomski važnih linija je upotrebljen da se opraše regenerisane biljke. Transgena MON863 biljka predmetnog pronalaska može se kultivisati kopristeći postupke dobro poznate onima sa iskustvom u praksi.

Postoji mnoštvo postupaka za regenerisanje biljaka iz tkiva biljke. Određeni postupak regeneracije zavisiće od polaznog tkiva biljke i određene biljne vrste koja treba da se rege-neriše. Transformacija monokotilih biljaka koristeći elektroporaciju, bombardovanje česticama i"Agrobacteriumje takođe objavljena. Transformacija i regeneracija biljke postignuta je kod mnogo monokotiledonih biljaka uključujući kukuruz, asparagus, ječam i pšenicu itd. (Bytebier i sar., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:5345, 1987; Wan i Lemaux, Plant Physiol. 104: 37, 1994; Rhodes i sar., Science 240: 204, 1988; Gordon-Kamm i sar., Plant Cell, 2: 603, 1990: Fromm i sar., BiofiTechnology 8: 833, 1990; Armstrong i sar., Crop Science 35: 550-557, 1995; Vasil i sar., Bio/Technology 10: 667; U. S. patent br. 5,631,152).

U dodatku na gore diskutovane procedure, praktičari su familijarni sa standardnim izvornim materijalima koji opisuju specifične uslove i procedure za konstrukciju, manipulaciju i izolaciju makromolekula (npr., molekula DNK, plazmida, itd.), generisanje rekombinantnih organizama i pregledanje i izolovanje klonova (vidi, na primer, Sambrook i sar., Molekularno kloniranje: Laboratorijski priručnik, Cold Spring Harbor Press, 1989; Mailga i sar., Postupci u molekularnoj biologiji biljaka, Cold Spring Harbor Press, 1995; Birren i sar., Analiza genoma: Analiza DNK, 1, Cold Spring Harbor New York, 1997).

Kitovi za detekciju DNK mogu se razviti koristeći preparate otkrivene ovde i postupke koji su dobro poznati u praksi detekcije DNK. Kitovi su korisni za identifikaciju DNK kukuruznog transformanta MON863 u uzorku i mogu se primeniti na postupke za gajenje biljaka kukuruza koje sadrže DNK MON863. Kitovi sadrže jednu ili više sekvenci DNK koje sadrže najmanje 11 kontinuiranih nukleotida homologih ili komplementarnih sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID br.: 1, SEQ ID br.:2, SEQ ID br.:3, SEQ ID br.:4, SEQ ID br.:5, SEQ ID br.:6, SEQ ID br.:7, SEQ ID br.:8, SEQ ID br.:9, SEQ ID br.:10, SEQ ID br.:11, SEQ ID br.:12, SEQ ID br.:13, SEQ ID br.:14, SEQ ID br.:15, SEQ ID br.:16, SEQ ID br.:17, SEQ ID br.:18, SEQ ID br.:19, SEQ ID br.:20, SEQ ID br.:21, i njihovih komplemenata. Ove sekvence DNK mogu se upotrebiti u reakcijama amplifikacije DNK ili kao probe u postupku hibridizacije DNK.

Primeri koji slede su priloženi zato da prikažu primere određenih poželjnih oblika predmetnog pronalaska. Mora de se prihvati, od strane onih sa iskustvom u praksi, da postupci koji su otkriveni u primerima koji slede predstavljene pristupe za koje su pronalazači utvrdili da dobro funkcionišu u praksi pronalaska, i prema tome, mogu se smatrati da konstituišu primere poželjnih oblika za njegovu primenu. Međutim, oni sa iskustvom u praksi moraju, u svetlu predmetne prijave, prihvatiti da se mnoge promene mogu napraviti u specifičnim oblicima koji su obelodanjeni i ili se još uvek dobijaju kao nalik ili kao slični rezultati bez odstupanja od obima i cilja predmetnog pronalaska.

PRIMERI

Primer 1. Izolacija i karakterizacija sekvenci koje su bočno u odnosu na kukuruzni transformant MON863

Kukuruzni transformant MON863 je generisan putem tehnologije akceleracije čestica koristeći 1.7 kb Mlu I restrikcioni fragment izolovan na agaroznom gelu iz plazmidnog vektora PV-ZMIR13 (pMON25097, slika 1). Biljni ekspresioni vektor pMON25097sadrži prvu ekspresionu kasetu koja sadrži CaMV35S AS4 promotor sekvencu koja se ne javlja u prirodi (P-CaMV.AS4, SEQ ID br.:17) koja je operativno vezana za netranslacirajuću lider sekvencu pšeničnog hlorofil A/B vezujućeg proteina (L-Ta.hcbl, SEQ ID br.:18) operativno vezanu za intronsku sekvencu aktina (l-Os.Act1, SEQ ID br.:19) operativno vezanu za sekvencu koja se ne javlja prirodno koja kodira Cry3Bb varijantni protein (SEQ ID br.:20) operativno vezan za pšenični hit šok Hsp17 transkripciono terminirajuću i poliadenilirajuću sekvencu (T-Ta.Hsp17, SEQ ID br.:21). Biljni ekspresioni vektor pMON25097 sadrži drugu ekspresionu kasetu vezanu za Cry3Bb ekspresionu kasetu koja obezbeđuje otpornost na paromomicin transformisanom tkivu biljke (tj., 3' kraj cry3Bb ekspresione kesete je vezan za 5' kraj druge ekspresione kasete obezbeđujući otpornost na paromomicin). Ova kaseta za rezistentnost sadrži pojačani CaMV35S promotor sekvencu (U.S. patent br. 5,164,316) koji je operativno vezan za sekvencu koja kodira neomicin fosfotransferazu (U.S. patent br. 5,569.834) koji je operativno vezan za sekvencu terminacije transkripcije nopalin sintaze i poliadenilacije (Fraley i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4803-4807, 1983). Transgene biljke kukuruza otporne na paromomicin su izvedene u osnovi kao što je opisano u U.S. patentu 5,424,412.

Molekularna karakterizacija inserta u kukuruznom transformantu MON863 pokazala je da jedna kopija fragmenta DNK koja je upotrebljena za transformaciju prisutna u kukuruznom rmant, sekvence kukuruzne ONK bočno od 5' i 3' krajeva od inserta u kukuruznom transformantu MON863 određene su koristeći GenomeVVaiker™ tehnologiju (Clontech Laboratories, Ine) u skladu sa uputstvima proizvođača. GenomeVVaiker™ postupak uključuje prvo kompletno dige-stivno prečišćavanje DNK kukuruznog MON863 sa različitim restrikcionim enzimima obezbeđenim u GenomeVVaiker™ kitu koji ostavlja tupe krajeve. Sledeće, prečišćeni tupi krajevi genomske

DNK fragmenata su vezani za GenomeVVaiker™ adaptere koji sadrže fragmente poznate nuklei-? nske kiseline. Svaka veza je zatim amplifikovana u prvoj PCR reakciji koristeći spoljašnji adapte-rski prajmer SEQ ID br.:22 (5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3') koje obezbeđuje Genome VValker™ i spoljašnji, prajmer specifičan za gen (SEQ ID br.:13, 5'GAACGTCTTC I I I I I CCACGATGCTCC-3', i SEQ ID br.:15, 5'-GCGAAGTTCTGATGAGACATCTCTGTAT-3', za 5' i 3' krajeve transgenog inserta, respektivno). Mešavina prvog PCR produkta je zatim razblažena i upotrebljena kao matrica za drugi ili nestid PCR sa nestid adaptor prajmerom, SEQ ID br.:23 (5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3') obezbeđenim od strane GenomeVVaiker™ i nestid specifični prajmer (SEQ ID br.:14, 5'- TCGGCAGAGGCATCTTGAATGATAGC-3', i SEQ ID br.:16, 5'-AATTTGGTTGATGTGTGTGCGAGTTCT-3', za 5' i 3' krajeve transgenog inserta, respektivno). Sekundarni PCR produkt, koji počinje sa poznatim sekvencama specifičnim za gen i produžuje se u nepoznatu susednu genomsku DNK, može se zatim sekvencirati koristeći postupke dobro poznate u praksi. Kada je jednom određena bočna kukuruzna genomska sekvenca, razvijeni su PCR ogledi sposobni da detektuju u uzorku prisustvo DNK biljke kukuruza PV-ZMIR13 (MON863).

Sledeći ovu proceduru, nukleotidna sekvenca kao što je postavljena u SEQ ID br.:5 je okarakterisana kao genomska sekvenca kukuruza koja je u neposrednom susedstvu i uzvodno od arbitrarno označenog 5' kraja i fragment DNK pMON25097 koji je ubačen u genom kukuruza dajući kao rezultat konstrukciju i izolaciju transgenog kukuruznog transformanta MON863. Neko sa iskustvom u praksi, ili čak neko sa prosečnim iskustvom u praksi, shvatiće da se može lako dobiti dodatna informaciona nukleotidna sekvenca koja je čak još više udaljena od spojne sekvence kao što je postavljeno u SEQ ID br.:1 ali još uvek u okviru genoma kukuruza, nego što su 242 prisutna nukleotida koja su data kao primer ovde u SEQ ID br.:5, i od nukleotidne pozicije 267 do nukleotidne pozicije 508 kao što je postavljeno u SEQ ID br.:3. Takođe je nukleotidna sekvenca, kao što je postavljeno u SEQ ID br.:6, bila okarakterisana kao kukuruzna genomska sekvenca koja je u neposrednom susedstvu sa i nizvodno od arbitrarno označenog 3' kraja od DNK fragmenta pMON25097 koji je ubačen u genom kukuruza rezultirajući konstrukcijom i izolacijom transgenog kukuruznog transformanta MON863. Neko sa iskustvom u praksi takođe će shvatiti da se dodatna informaciona nukleotidna sekvenca može lako dobiti, koja je čak više distalno od spojne sekvence kao što je postavljno u SEQ ID br.:2, ali još uvek u okviru genoma kukuruza nego 224 prisutna nukleotida koja su data ovde u primeru u SEQ ID br.:6 i nukleotidne pozicije 361 do nukleotidne pozicije 584 kao što je postavljeno u SEQ ID br.:4.

Primer2,Detekcija prisustva DNK MON863 u uzorku

Dalje je obezbeđen ne ograničavajkući primer PCR ogleda razvijenih da se detektuje

prisustvo DNK MON863 u uzorku.

DNK ekstrahovana iz približno 100 mg tkiva zrna iz zemljišta koristeći Qiagen's Dneasv Plant Mini Kit (katalog #68163, Valencija, CA) u skladu sa preporučenim protokolom proizvo-đača sa jednim izuzetkom. Upotrebljeno zrno je procesovano pre ekstrakcije u frižideru na - 80°C, a ne u zemlji sa tečnim azotom koristeći tučak i avan neposredno pre ekstrakcije. Kvantifikacija DNK je izvedena koristeći postupke dobro poznate u praksi, Hoefer DNK Quant 200 fluorometar, i Boehringer Mannhein (Indianapolis, IN) marker molekula-rne veličine IX kao DNK kalibracioni standard.

PCR analiza sekvenci genomske DNK bočno 5' kraju od inserta u MON863 je izvedena koristeći jedan prajmer (prajmer A) izveden iz 5' genomske bočne sekvence (SEQ ID br.:9, 5'-GTCTTGCGAAGGATAGTGGGAT-3') sparen sa drugim prajmerom (prajmer B) lociranim pored 5' kraja ubačene DNK u 35S promotoru (SEQ ID br.:10, 5'-CATATGACATAAGCGCTCTTGG-3') koji pokriva 508-bp region. PCR analiza sekvenci genomske DNK bočno od 3' kraja inserta MON863 je izvedena koristeći jedan prajmer (prajmer D) izveden iz 3' genomske bočne sekvence (SEQ ID br.:12, 5'-AGACTCTATGCTCTGCTCATAT-3') sparen sa drugim prajmerom (prajmer C) lociranim u tahsp17 poliadenilirajućoj sekvenci blizu 3' kraja inserta koji obuhvata 584-bp region (SEQ ID br.:11, 5'CTGATCATTGGTGCTGAGTCCTT-3') (slika 2). PCR analizae su obavljene koristeći 50 ng kukuruznog transformanta MON863 genomske DNK ili ne-transgene MON863 genomske DNK matrice u 50 u.L reakcione zapremine koja sadrži konačnu koncentraciju od 1.5 mM Mg<2+>, 0.4 u,M svakog prajmera, 200 u.M svakog dNTP i 2.5 jediniceTaqDNK polimeraze. Reakcije su izvedene pod sledećim uslovima za cikluse: 1 ciklus na 94°C tokom 3 minuta, 38 ciklusa od 94°C tokom 30 sekundi, 60°C tokom 30 sekundi, 72°C tokom 1.5 minuta; ciklus na 72°C tokom 10 minuta.

PCR produkti (20 u.L) očekivanih veličina koje predstavljaju genomsku sekvencu bočno od 5' i 3 krajeva inserta izolovane su putem gel elektroforeze na 2% agaroznom gelu na 60 V tokom~1 časa i učinjene vidljivim bojenjem sa etidijum bromidom. PCR fragmenti koji prestavljaju 5' i 3' bočne sekvence su isečni sa gela i prečišćeni koristeći QIAquick Gel Extraction Kit (Oiagen, katalog # 28704) sledeći proceduru koja je dobijena od proizvođača. Prečišćeni PCR produkti su sekvencirani sa inicijalnim PCR prajmerima koristeći herniju boja-terminator.

Kontrolne reakcije koje nisu sadržale matricu kao i reakcije koje su sadržale ne-transgenu kukuruznu DNK nisu generisale PCR produkt sa bilo kojim setom prajmera, kao što je i očekivano. PCR analize kukuruznog transformanta DNK crva korena MON863 generisale su produkte očekivane veličine od 508 bp koji predstavljaju 5' bočnu sekvencu (SEQ ID br.:3) kada se koriste prajmeri A i B koji imaju SEQ ID br.:9 i 10 i 584 bp koje predstavljaju 3' bočnu sekvencu (SEQ ID br.:4) kada se koriste prajmeri D i C koji imaju SEQ ID br.: 11 i 12.

Podaci o sekvenci ukazuju da se 5' amplikon, tj., SEQ ID br.:3, sastojao od 266 bp od 5' kraja 35S promotora na 5' kraju inserta praćenog sa 242 bp kukuruzne genomske bočne DNK. Podaci o sekvenci naznačili su da se 3' amplikon, tj., SEQ ID br.:4, sastojao od 360 bp od tahsp17 3' poliadenilacione sekvence koja definiše 3' kraj inserta, neposredno praćen sa 224 bp kukuruzne genomske bočne DNK.

Poljoprivredno i komercijalno važni proizvodi i/ili preparati koji se razmatraju uključujući, ali bez ograničenja na, hranu za životinje, smeštaj i produkte žita i sporedne produkte name-njene za upotrebu kao hrana za humanu ishranu ili za upotrebu u preparatima koji su namenjeni za ljudsku upotrebu, uključujući, ali bez ograničenja na kuruzno brašno, kukuruzna jela, sirup od kukuruza, kukuruzno ulje, kukuruzni škrob, kokice, kukuruzne pahuljice, cerealije koje sadrže kukuruz i sporedne proizvode kukuruza i tome slično, predviđeni su da budu u obimu predmetnog pronalaska ako ti proizvodi i preparati na koje se to odnosi sadrže detektabilne koli-čine nukleotidnih sekvenci koje su postavljene ovde kao dijagnostičke za kukuruzni transformant MON863.

Seme koje sadrži kukuruzni transformant MON863 je deponovano od strane podnosioca prijave u American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, SAD ZIP 20110-2209 17. oktobra 2000. ATCC obezbeđen od strane podnosioca prijave sa potvrdom depozita, upisanog kao ATCC Depozitna prijava br. PTA-2605 kukuruzniZea maystranformant MON863 PV-ZMIR13.

Oni sa iskustvom u praksi, u svetlu ovih primera, treba da shvate da se mogu napraviti mnoge promene u prethodnim ogledima da se detektuje DNK izvedena iz kukuruznog transformanta MON863 u uzorku. Na primer, set prajmera koji sadrži jedan prajmer komplementaran sa DNK genoma kukuruza i drugi prajmer komplementaran sekvencama u insertu su takođe predviđeni. Dalje je takođe predviđen bilo koji od različitih hibridizacionih ogleda opisanih ranije koji koriste DNK probe komplementarne novim sekvencama nukleinske kisleine lociranim na spoju transgen/genom.

Pošto smo ilustovali i opisali principe predmetnog pronalaska, osobama sa iskustvom u praksi mora biti očigledno da se pronalazak može modifikovati u aranžmanu i detaljima bez odstupanja od takvih principa. Mi štitimo sve modifikacije koje su u okviru duha i obima podne-tih patentnih zahteva.

Sve publikacije i štampani patentni dokumenti citirani u ovoj prijavi su inkorporirani ode sa referencom u istom obimu kao što je i svaka pojedinačna publikacija ili patentna prijava bila specifično ili pojedinačno naznačena da bude inkorporirana referencom.

Claims

1. Izolovani molekul DNK, naznačen time što sadrži nukleotidnu sekvencu kao što je postavljena u SEQ ID br.:1 ili njen komplement.

2. Izolovani molekul DNK, naznačen time što sadrži nukleotidnu sekvencu kao što je postavljena u SEQ ID br.:2 ili njen komplement.

3. Izolovani molekul DNK, naznačen time što sadrži najmanje jednu spojnu nukleotidnu sekvencu kukuroznog transformanta MON863 odabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID br.:1, SEQ ID br.:2 i njihovih komplemenata.

4. Izolovana nukleinska kiselina, naznačena time što vezuje heterologni molekul DNK za genom biljke kukuruza u kukuroznom transformantu MON863 koji sadrži sekvencu od oko 11 do oko 20 uzastopnih nukleotida odabranih iz grupe koja se sastoji od SEQ ID br.:1, SEQ ID br.:2 i njihovih komplemenata.

5. Sekvenca izolovanog nukleotidnog prajmera, naznačena time što sadrži najmanje od oko 11 do oko 41 kuntinuiran nuk-leotid kao što je postavljeno u SEQ ID br.:3 ili njen komplement, od oko 247. nukleotidne pozicije do oko nukleotidne pozicije 287.

6. Sekvenca izolovanog nukleotidnog prajmera, naznačena time što sadrži najmanje od oko 11 do oko 40 kuntinuiranih nukleotid kao što je postavljeno u SEQ ID br.:4 ili njen komplement, od oko 341. nukleotidne pozicije do oko nukleotidne pozicije 380.

7. Sekvenca prvog polinukleotidnog prajmera i sekvenca drugog polinukleotidnog prajmera, naznačene time što funkcionišu zajedno u prisustvu matrice DNK kukuroznog transfo-rmanta MON863 u uzorku da produkuju amplikon koji je dijagnostički za kukurozni transformant MON863, pomenuta prva i druga polinukleotidna sekvenca prajmera su odabrane od grupe koja se sastoji od SEQ ID br.:5, SEQ ID br.:6, SEQ ID br.:7, SEQ ID br.:8, SEQ ID br.:9, SEQ ID br.:10, SEQ ID br.:11 i SEQ ID br.:12 i njihovih komplemenata.

8. Prvi i drugi polinukleotidni prajmeri prema zahtevu 7, naznačeni time što pomenuta prva polinukleotidna sekvenca prajmera sadrži reverzni komplement sekvence kao što je postavljeno u SEQ ID br.:9 i druga pomenuta sekvenca prajmera sadrži reverzni komplement sekvence kao što je postavljeno u SEQ ID br.:10 i gde pomenuti amplikon sadrži sekvencu gotovo u potpunosti kao što je postavljeno u SEQ ID br.:3.

9. Prvi i drugi polinukleotidni prajmeri prema zahtevu 7, naznačeni time što pomenuta prva polinukleotidna sekvenca prajmera sadrži reverzni komplement sekvence kao što je postavljeno u SEQ ID br.:12 i druga pomenuta sekvenca polinukleotidnog prajmera sadrži sekvencu kao što je postavljeno u SEQ ID br.:11 i gde pomenuti amplikon sadrži sekvencu gotovo u potpunosti kao što je postavljeno u SEQ ID br.:4.

10. Sekvence prvog i drugog polinukleotidnog prajmera prema zahtevu 8, naznačena time što pomenuta prva polinukleotidna prajmer sekvenca jeste ili je komplementarna genomskoj DNK biljke kukuruza bočno od tačke insercije heterologe sekvence DNK ubačene u genom biljke kukuruza, kukuruznog transformanta MON863 i pomenuta druga polinukleotidna prajmer sekvenca jeste ili je komplementarna heterologoj sekvenci DNK ubačenoj u genom biljke kukuruza kukuruznog transformanta MON863 i gde je pomenuti amplikon dijagno-stički za biljku kukuruznog transformanta MON863.

11. Biljka kukuruza, naznačena time što je najmanje jedan predak pomenute biljke kukurza kukuruzni transformant MON863 koji sadrži molekul DNK odabran od grupe koja se sastoji od SEQ ID br.:1, SEQ ID br.:2 i njihovih komplemenata.

12. Biljka kukuruza, naznačena time što sadrži najmanje prvu i drugu sekvencu DNK vezane zajedno da formiraju kontinuiranu nukleotidnu sekvencu, gde je pomenuta prva sekvenca DNK unutar spojne sekvence i sadrži najmanje oko 11 kontinuiranih nukleotida odabranih od grupe koja se sastoji od (a) nukleotidne pozicije 247-287 kao što je postavljeno u SEQ ID br.:3; (b) nukleotidne pozicije 341-380 kao što je postavljeno u SEQ ID br.:4; (c) SEQ ID br.:5; (d) SEQ ID br.:6; i (e) njihov komplement; gde pomenuta druga sekvenca DNK je unutar transgenog inserta sekvence DNK, pomenuti transgeni insert sekvence DNK je odabran od grupe koja se sastoji od SEQ ID br.:17, SEQ ID br.:18, SEQ ID br.:19, SEQ ID br.:20, SEQ ID br.:21 i njihov komplement; i gde su pomenute prva i druga sekvenca DNK korisne kao nukleotidni prajmeri ili probe za detektovanje prisustva sekvenci nukleinske kiseline kukuruznog transformanta MON863 u biološkom uzorku.

13. Biljka kukuruza prema zahtevu 12, naznačena time što su nukleotidni prajmeri upotrebljeni u postupku amplifikacije DNK da se amplifikuje ciljna sekvenca DNK iz matrice DNK ekstrahovane iz pomenute biljke kukuruza i pomenuta biljka kukuruza se može identi-fikovati u odnosu na druge biljke kukuruza na osnovu produkovanja amplikona koji odgovara sekvenci DNK koja sadrži SEQ ID br.:1 ili SEQ ID br.:2.

14. Kit za detekciju nukleinske kiseline za upotrebu u identifikovanju prisustva nukleinskih kiselina kukuruznog transformanta MON863 u biološkom uzorku, naznačen time što sadrži: a) probu koja jeste ili je komplementarna sa delom transgene sekvence DNK prisutne u genomu kukuruznog transformanta MON863, pomenuta proba sadrži najmanje oko 11 uzastopnih nukleotida, pomenuti uzastopni nukleotidi su odabrani iz grupe koja se sastoji od SEQ ID br.:1 ili SEQ ID br.:2, i njihovih komplemenata; b) reagense neophodne za detekciju vezivanja pomenute probe za pomenutu transgenu sekvencu DNK; i c) uputstva za upotrebu; upakovana zajedno u pomenuti kit.

15. Postupak za detekciju prisustva DNK kukuruznog transformanta MON863 u biološkom uzorku, naznačen time što sadrži korake: a) kontaktiranja pomenutog uzorka sa prvom polinukleotidnom prajmer sekvencom i drugom polinukleotidnom prajmer sekvencom koje funkcionišu zajedno u reakciji amplifikacije nukleinske kiseline u prisustva matrice DNK iz kukuruznog transformanta MON863 da se proizvede amplikon koji je dijagnostički za pomenuti kukuruzni transformant; b) izvođenja reakcije amplifikacije nukleinske kiseline, produkujući tako pomenuti amplikon; i c) detektovanja pomenutog amplikona.

16. Postupak prema zahtevu 15, naznačen time što pomenuti amplikon sadrži nukleotidnu sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID br.:1, SEQ ID br.:2, SEQ ID br.:3, SEQ ID br.:4 i njihovih komplemenata.

17. Postupak prema zahtevu 16, naznačen time što pomenuti amplikon sadrži SEQ ID br.:l, gde je pomenuta prva polinukleotidna prajmer sekvenca odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID br.:1 od nukleotidne pozicije oko 1 do nukleotidne pozicije oko 20, SEQ ID br.:3 od nukleotidne pozicije oko 1 do nukleotidne pozicije oko 267, i SEQ ID br.:9 od nukleotidne pozicije oko 1 do nukleotidne pozicije oko 22, i gde je pomenuta druga polinukleotidna prajmer sekvenca odabrana od grupe koja se sastoji od sekvence komplementarne SEQ ID br.:1 od nukleotidne pozicije oko 9 do nukleotidne pozicije oko 20, sekvence komplementarne SEQ ID br.:3 od nukleotidne pozicije oko 266 do nukleotidne pozicije oko 508, i sekvence komplementare SEQ ID br.:10 od nukleotidne pozicije oko 1 do nukleotidne pozicije oko 22.

18. Postupak prema zahtevu 16, naznačen time što pomenuti amplikon sadrži SEQ ID br.:2 gde je pomenuta prva polinukleotidna prajmer sekvenca odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID br.:2 od nukleotidne pozicije oko 1 do nukleotidne pozicije oko 20, SEQ ID br.:4 od nukleotidne pozicije oko 1 do nukleotidne pozicije oko 361 i SEQ ID br.: 11 od nukleotidne pozicije oko 1 do nukleotidne pozicije oko 23, i gde je pomenuta druga polinukleotidna prajmer sekvenca odabrana od grupe koja se sastoji od sekvence komplementarne SEQ ID br.:2 od nukleotidne pozicije oko 9 do nukleotidne pozicije oko 20, sekvence komplementarne SEQ ID br.:4 od nukleotidne pozicije oko 360 do nukleotidne pozicije oko 584, i sekvence komplementare SEQ ID br.:12 od nukleotidne pozicije oko 1 do nukleotidne pozicije oko 22.

19. Postupak prema zahtevu 17 ili 18, naznačen time što pomenuti amplikon sadrži nukleotidnu sekvencu koja sadrži najmanje 20 uzastopnih nukleotida odabranih iz grupe koja se sastoji od SEQ ID br.:1, SEQ ID br.:2, SEQ ID br.:3 i SEQ ID br.:4.

20. Postupak za detekciju DNK kukuruznog transformanta MON863 u biološkom uzorku, naznačen time što sadrži korake: a) kontaktiranja uzorka koji je pod sumnjom da sadrži pomenutu DNK sa polinukleotidnom probom koja hibridizuje pod strogim uslovima hibridizacije sa pomenutom DNK i koja ne hibridizuje pod strogim uslovima hibridizacije sa DNK iz kontrolne biljke kukuruza koja nije kukuruzni transformant MON863; b) podvrgavanja pomenutog uzorka i pomenute probe pomenutim strogim uslovima hibridizacije; i c) detektovanja hibridizacije pomenute probe sa DNK kukuruznog transformanta MON863.

21. Biološki uzorak izveden iz kukuruznog transformanta MON863 biljke, tkiva ili semena, naznačen time što pomenuti uzorak sadrži nukleotidnu sekvencu koja jeste ili je komplementarna sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID br.:1 i SEQ ID br.:2 i gde je pomenuta sekvenca detektabilna u pomenutom uzorku koristeći amplifikaciju nukleinske kiseline ili postupak hibridizacije nukleinske kiseline.

22. Biološki uzorak prema zahtevu 21, naznačen time što sadrži biljku, tkivo ili seme transgenog kukuruznog transformanta MON863 koji ima seme deponovano u American Type Culture Collection (ATCC) sa prijavom br. PTO-2506.

23. Biološki uzorak prema zahtevu 22, naznačen time što je pomenuti uzorak odabran od grupe koja se sastoji od ekstrakta koji se može dobiti od biljke transgenog kukuruznog transformanta MON863 i gde pomenuti ekstrakt sadrži jednu ili više nukleotidnih sekvenci odabranih od grupe koja se sastoji od SEQ ID br.:1, SEQ ID br.:2 i njihovog komplementa.

24. Biološki uzorak prema zahtevu 23, naznačen time što je pomenuti uzorak odabran od grupe koja se sastoji od kukuruznog brašna, kukuruznog obroka, kukuruznog sirupa, kukuruznog ulja, kukuruznog škroba i cerealija proizvedenih u celini ili delom tako da sadrže sporedne proizvode kukuruza.

25. Ekstrakt izveden od biljke kukuruznog transformanta MON863, tkiva ili semena, naznačen time što sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna nukleotidnoj sekvenci odabranoj od grupe koja se sastoji od SEQ ID br.:1 i SEQ ID br.:2.

26. Ekstrakt prema zahtevu 25, naznačen time što je pomenuta sekvenca detektabilna u pomenutom ekstraktu koristeći amplifikaciju nukleinske kiseline ili postupak hibridizacije nukleinske kiseline.

27. Ekstrakt prema zahtevu 26, naznačen time što sadrži biljku, tkivo ili seme biljke transgenog kukuruznog transformanta MON863.

28. Ekstrakt prema zahtevu 27, naznačen time što je uzorak odabran od grupe koja se sastoji od kukuruznog brašna, kukuruznog obroka, kukuruznog sirupa, kukuruznog ulja, kukuruznog škroba i cerealija proizvedenih u celini ili delom tako da sadrže sporedne proizvode kukuruza.

29. Kukuruzni transformant MON863, naznačen time što ima seme deponovano u American Type Culture Collection (ATCC) sa prijavom br. PTA-2506.

30. Kukuruzni transformant prema zahtevu 29, naznačen time što genom pomenutog transformanta ili njegovo potomstvo sadrže molekul DNK odabran od grupe koja se sastoji od SEQ ID br.:1 i SEQ ID br.:2.

31. Delovi biljke, naznačeni time što su od kukuruznog transformanta iz zahteva 30.

32. Izolovani molekul DNK, naznačen time što je pomenuti molekul DNK dijagnostički za prisustvo DNK iz kukuruznog transformanta MON863 i gde je pomenuta DNK odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID br.:1, SEQ ID br.:2, SEQ ID br.:3, SEQ ID br.:4 i njihovog komplementa.

33. Nukleotidna sekvenca, naznačena time što sadrži sekvencu DNK odabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID br.:3 i SEQ ID br.:4, gde je pomenuta sekvenca DNK upotrebljena kao matrica u postupku amplifikacije DNK u kojem je produkovan amplikon koji je dijagno-stički za DNK kukuruznog transformanta MON863 u uzorku.

34. Nukleotidna sekvenca prema zahtevu 33, naznačena time što pomenuti amplikon sadrži SEQ ID br.:1.

35. Nukleotidna sekvenca prema zahtevu 33, naznačena time što pomenuti amplikon sadrži SEQ ID br.:2.

36. Izolovani molekul DNK polinukleotinog prajmera, naznačen time što sadrži najmanje 11 kontinuiranih nukleotida SEQ ID br.:3 od nukleotidne pozicije oko 247 do nukleotidne pozicije oko 287, ili njegov komplement, za upotrebu u detekciji prisustva DNK kukuruznog transformanta MON863 u biološkom uzorku.

37. Izolovani molekul DNK polinukleotinog prajmera, naznačen time što sadrži najmanje 11 kontinuiranih nukleotida SEQ ID br.:4 od nukleotidne pozicije oko 348 do nukleotidne pozicije oko 380, ili njegov komplement, za upotrebu u detekciji prisustva DNK kukuruznog transformanta MON863 u biološkom uzorku.

38. Kit za detekciju prisustva DNK kukuruznog transformanta MON863 u biološkom uzorku, naznačen time što sadrži molekul prve probe koji se sastoji od najmanje oko 11 kontinuiranih nukleotidnih homologa ili je komplementaran nukleotidnoj sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID br.:3 od nukleotidne pozicije oko 247 do nukleotidne pozicije oko 287, i molekula druge probe koji se sastoji od najmanje oko 11 kontinuiranih homologa nukleotida ili je komplementaran nukleotidnoj sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID br.:4 od nukleotidne pozicije oko 341 do nukleotidne pozicije oko 380 gde pomenuti molekul hibridizuje specifično sa pomenutom nukleotidnom sekvencom pod strogim uslovima hibridizacije.

39. Postupak proizvodnje biljke kukuruza otporne na najezdu koleopternih insekata, naznačen time što sadrži: (a) polno ukrštanje prve roditeljske biljke kukuruza koja sadrži DNK kukuruznog transformanta MON863 i druge roditeljske biljke koja nema pomenutu DNK, produ-kujući tako mnoštvo biljaka potomstva prve generacije; i (b) odabiranje biljke iz prve generacije potomsta koja je otporna na najezdu koleopternih insekata; i (c) samooprašivanje pomenute biljke iz prve generacije potomstva, produkujući tako mnoštvo biljaka druge generacije potomstva; i (d) odabiranje iz pomenutog potomstva druge generacije biljaka, biljke koja je otporna na najezdu koleopternih insekata; gde pomenute biljke potomci druge generacije sadrže nukleotidnu sekvencu odabranu od grupe koja se sastoji od SEQ ID br.:1 i SEQ ID br.:2.

40. Postupak za detektovanje prisustva DNK kukuruznog transformanta MON863 u biološkom uzorku, naznačen time što postupak sadrži: (a) kontaktiranje pomenutog uzorka sa parom prajmera, koji, kada se koriste u reakciji amplifikacije nukleinske kiseline sa DNK kukuruznog transformanta MON863 produkuju amplikon koji je dijagnostički za DNK kukuruznog transformanta MON863; i (b) izvođenje reakcije amplifikacije nukleinske kiseline, produkujući na taj način pomenuti amplikon; i (c) detektovanje pomenutog amplikona.

41. Postupak za detektovanje prisustva DNK kukuruznog transformanta MON863 u uzorku, naznačen time što postupak sadrži: (a) kontaktiranje uzorka sa probom koja (i) hibridizuje pod strogim uslovima hibridizacije sa DNK kukuruznog transformanta MON863, i (ii) ne hibridizuje pod uslovima stroge hibridizacije sa DNK ne-kukuruznog transfo-rmanta MON863 gde pomenuta proba sadrži sekvencu koja je komplementarna sa sekvencom od najmanje 11 baza koja je odabrana od grupe koja se sastoji od SEQ ID br.:1 i SEQ ID br.:2; (b) podvrgavanje pomenutog uzorka i probe strogim uslovima hibridizacije; i (c) detektovanje hibridizacije pomenute probe za pomenutu DNK MON863.

42. Postupak za određivanje zigotnosti biljke koja , sadrži DNK kukuruznog transformanta MON863, naznačen time što postupak sadrži: (a) kontaktiranje uzorka koji sadrži pomenutu DNK sa prvim parom prajmera koji sadrži SEQ ID br.:9 i SEQ ID br.:10, koji kada se upotrebe u prvoj reakciji amplifikacije nukleinske kiseline sa DNK kukuruznog transformanta MON863, produkuje prvi amplikon koji je dijagnostički za kukuruzni transformant MON863; (b) izvođenje pomenute prve reakcije amplifikacije nukleinske kiseline, produkujući na taj način pomenuti prvi amplikon; (c) detektovanje pomenutog prvog amplikona; (d) kontaktiranje pomenutog uzorka koji sadrži DNK kukuruza sa drugim parom prajmera, koji, kada se koristi u drugoj reakciji amplifikacije nukleinske kiseline sa genomskom DNK, drugoj sem DNK transformanta MON863, produkuje drugi amplikon koji sadrži prirodnu genomsku DNK kukuruza, gde pomenuti drugi par prajmera sadrži prvi prajmer koji sadrži najmanje 15 kontinuiranih nukleotida odabranih iz grupe nukleotida postavljenih u SEQ ID br.:3 od nukleotidne pozicije oko 267 do oko nukleotida oko 508 i drugi prajmer koji sadrži najmanje 15 kontinuiranih nukleotida odabranih od grupe nukleotida komplementarnih SEQ ID br.:4 od nukleotidne pozicije oko 361 do nukleotidne pozicije oko 584; (e) izvođenje pomenute druge reakcije amplifikacije nukleinske kiseline, produkujući tako pomenuti drugi amplikon; (f) detektovanje pomenutog drugog amplikona; i (g) poređenje pomenutog prvog i pomenutog drugog amplikona u uzorku, čime je određena zigotnost pomenute biljke.