RS20050274A

RS20050274A - Smeše polisaharida izvedene od heparina, njihovo dobijanje i farmaceutski preparati koji ih sadrže

Info

Publication number: RS20050274A
Application number: YUP-2005/0274A
Authority: RS
Inventors: Vesna Biberovic; Luc Grondard; Pierre Mourier; Christian Viskov
Original assignee: Aventis Pharma S.A.,
Priority date: 2002-10-10
Filing date: 2003-10-08
Publication date: 2007-06-04
Also published as: CA2501546A1; NO20052170L; BR0315149A; JP5021898B2; PE20040507A1; FR2845686B1; ATE548393T1; UA81925C2; NO20052170D0; CN1798771A; FR2845686A1; ES2383597T3; MXPA05003321A; CN101817940A; TWI332010B; CN101812139A; WO2004033503A1; SI1556414T1; EP1556414B1; TNSN05101A1

Abstract

Predmet ovog izuma su smeše polisaharida dobijene iz heparina koji imaju srednje molekulske mase od 1500 do 3000 daltona i odnos Anti-Xa/Anti-IIa veći od 30, metod njihovog dobijanja i farmaceutski sastavi koji ih sadrže.

Description

Smeše polisaharida izvedene od heparina, njihovo dobijanje i farmaceutski preparati

koji ih sadrže

Predmet ovog izuma su smeše polisaharida dobijene iz heparina, postupak njihovog dobijanja i farmaceutski sastavi koji ih sadrže.

Heparin je smeša sulfatisanih mukopolisaharida, animalnog porekla, koji se koristi zbog svojih antikoagulativnih i antitrombotskih osobina.

Pa ipak, heparin ima nedostatke koji ograničavaju uslove njegove primene. Naročito, njegova značajna antikoagulantna aktivnost (anti Ha) može da dovede do hemoragija.

Predloženi su heparini male molekulske mase, dobijeni baznom depolimerizacijom estara heparina (EP40144). Medjutim, i ovi proizvodi još uvek imaju značajnu anti-IIa aktivnost.

U US6384021 su takodje opisani heparini vrlo male molekulske mase. Medjutim, vrednosti aktivnosti Anti-Xa, dobijene u opisanim primerima, ne prelaze 120 IU, a dobijeni odnos Anti-Xa/Anti-IIa je izmedju 15 i 50.

U WO-0208295, heparni vrlo male molekulske mase se dobijaju postupkom koji se razlikuje od US6384021 i imaju aktivnost izmedju 100 i 150 IU, sa odnosom Anti-Xa/Anti-IIa takodje vrlo visokim za izvesne primere primene.

Ipak postoji stalna potreba da se u ovoj klasi lekova poboljšaju Anti-Xa aktivnosti, naročito dobijanjem aktivnosti većih od 150 IU/mg, kao i odnos Anti-Xa/Anti-IIa i da se, dakle, razvijaju nove generacije derivata heparina.

Jedan od predmeta ovog izuma je, dakle, da se poboljšaju poboljšaju Anti-Xa aktivnosti i odnos Anti-Xa/Anti-IIa modifikovanjem prethodno opisanih postupaka, naročito kontrolom procenta vode tokom stupnja depolimerizacije. Tako dobijeni heparni ispoljavaju, tako, odličnu antitrombotsku aktivnost i imaju aXa aktivnost blisku aktivnosti heparina, ali uz smanjenje rizika od hemoragije zbog vrlo slabe alla aktivnosti. Takodje, proizvodi ovog izuma imaju polu-živote koji su znatno duži od heparina

Predmet ovog izuma su, dakle, nove smeše polisaharida izvedenih iz heparina, koje imaju selektivniju aktivnost u odnosu na aktivirani faktor X (faktor Xa) i aktivirani faktor II (faktor Ha) nego heparin.

Podrazumeva se da se smeša polisaharida srednje molekulske mase od 1500 dO 3000 može kvalifikovati kao oligosaharidi.

Prema tome, predmet ovog izuma su smeše sulfatisanih oligosaharida opšte strukture polisaharida koji ulaze u sastav heparina i imaju sledeće karakteristike: oni imaju srednju molekulsku masu od 1500 do 3000 daltona, anti-Xa aktivnost od 120 do 200 IU/mg, aktivnost anti-IIa manju od 10 IU/mg i odnos aktivnosti anti-XA/anti Ha aktivnosti veći od 30; oligosaharidi koji čine smeše sadrže 2 do 26 šećernih jedinica, imaju jednu jedinicu 4,5- nezasićene uronske kiseline 2-O-sulfata najednom od svojih krajeva, i sadrže heksasaharid Alla-IIs-Is formule:

Heksasaharid Alla-IIs-Is koji se nalazi u smeši opisanoj u ovom izumu je sekvencija koja ima veliki afinitet za ATIII i odlikuje se aXa aktivnošću većom od 740 IU/mg.

Smeša oligosaharida opisana u ovom izumu nalazi se u obliku soli nekog alkalnog ili zemnoalkalnog metala.

Kao so alkalnog ili zemnoalkalnog metala najpoželjnije su soli natrijuma, kalijuma, kalcij uma i magnezij uma.

Srednja molekulska masa se odredjuje tečnom hromatografijom pod visokim pritiskom, korišćenjem dve kolone u seriji, kao, na primer, one koje se prodaju pod imenom TSK G3000 XL i TSK G2000 XL. Detekcija se izvodi refraktometrijom. Za eluiranje se koristi litijum nitrat, pri protoku 0,6 ml/min. Sistem je kalibrisan standardima dobijenim frakcionisanjem enoksaparina (AVENTIS) hromatografijom na gelu od agaroze i poliakrilamida (IBF) Ovo dobijanje se ostvaruje tehnikom koju su opisali Barrovvcliffe et al., Thromb. Res., 12, 27-36 (1977-78) ili D.A. Lane et al., Thromb. Res., 12, 257-271 (1977-78). Rezultati se izračunavaju pomoću programa GPC6 (Perkin Elmer).

Aktivnost anti-Xa se meri amidolitičkom metodom sa hromogenim supstratom opisanim u Teien et al., Thromb. Res., 10, 399-410 (1977), a kao standard se koristi prvi medjunarodni standard za heparine male molekulske mase.

Anti-IIa aktivnost se meri metodom koji su opisali Anderson L.O. et al., Thromb. Res., 15, 531-541 (1979), a kao standard se koristi prvi medjunarodni standard za heparine male molekulske mase

Poželjno je da frakcija heksasaharida predstavlja 15 do 25% smeše oligosaharida.

Smeše prema ovom izumu uglavnom sadrže 8 do 15% heksasaharida Alla-IIs-Is u frakciji heksasaharida smeše oligosaharida

Procenat frakcije heksasaharida može se analitički odrediti tečnom hromatografijom pod pod visokim pritiskom na kolonama TSK G3000 XL i TSK G2000 XL ili preparativnim odvajanjem frakcije heksasaharida U tom slučaju se smeša hromatografiše na kolonama ispunjenim gelom tipa poliakrilamida agaroze, kao što je onaj koji se prodaje pod nazivom Ultrogel ACA202<R>(Biosepra). Smeša se eluira rastvorom natrijumbikarbonata. Poželjno je da rastvor natrijumbikarbonata bude od 0,1 mol/l do 1 mol/l. Još je bolje da se separacija obavi pri koncentraciji 1 mol/l. Detekcija se vrši UV-spektrometrijom (254 nm). Posle frakcionisanja, frakcija heksasaharida u rastvoru natrijumbikarbonata se neutrališe glacijalnom sirćetnom kiselinom. Rastvor se zatim koncentruje pod sniženim pritiskom dok se ne dobije koncentracija acetata veća od 30%, težinskih. Frakcija heksasaharida se taloži dodavanjem 3 do 5 zapremina metanola. Frakcija heksasaharida se izdvaja filtrovanjem preko sinterovanog stakla n° 3. Dobijena smeša heksasaharida može se analizirati pomoću HPLC (Tečna hromatografija visoke rezolucije) da se odredi količina heksasaharida Alla-IIs-Is. Heksasaharid Alla-IIs-Is može se izolovati preparativnom HPLC hromatografijom ili afinitivnom hromatografijom na koloni od antitrombin III sefaroze, prema metodu koji se koristi u struci (M. Hook, I. Bjork, J. Hopvvood i U. Lindahl,F. E. B. S letters,vol 656(1)

(1976)).

Naročito, smeše prema ovom izumu imaju anti-Xa aktivnost izmedju 150 IU/mg i 200 IU/mg.

Smeše ovog izuma imaju pretežno anti-IIa aktivnost manju od 5 IU/mg , uglavnom, od 0,5 do 3,5 IU/mg. Primeri primene dati niže pokazuju vrednosti izmedju 1,1 i 1,6 IU/mg, ako se koriste poželjne karakteristike ovog procesa.

Uglavnom, smeše imaju odnos aktivnost anti-Xa/aktivnost anti-IIa viši od 50, i češće više od 100.

Uglavnom, smeše ovog izuma imaju srednje molekulske mase izmedju 2000 i 3000 daltona, najčešće srednje molekulske mase izmedju 2400 i 2650 Da.

Predmet ovog izuma su naročito smeše kakve su prethodno definisane i koje imaju anti-Xa aktivnost izmedju 150 i 200 IU/mg, anti-IIa aktivnost izmedju 0,5 i 3,5 IU/mg i srednju molekulsku masu izmedju 2400 i 2650 Da.

Smeša oligosaharida prema ovom izumu može se dobiti depolimerizacijom kvaternerne amonjumove soli benzil estra heparina u organskoj sredini, pomoću jake organske baze, poželjno pKa veće od 20 (osobine pretežno slične familiji fosfazena, kao što su je, na primer, definisali R. Schvvesinger et al., Angevv. Chem. Int. Ed. Engl. 26, 1167-1169 (1987), R. Schwesinger et al., Angew. Chem. 105, 1420 (1993)), prevodjenjem kvaternerne amonjumove soli benzil estra depolimerizovanog heparina u natrijumovu so, saponifikacijom preostalih estara i, eventualno, prečišćavanjem. Postupak ovog izuma ponavlja glavne faze postupka opisanog u WO 0208295, dodajući jednu bitnu karakteristiku koja omogućuje da se dobije smeša oligosaharida prema ovom izumu, sa opisanim fizikohemijskim karakteristikama i aktivnostima.

I, zaista, da bi se dobile specifične smeše oligosaharida prema ovom izumu potrebno je kontrolisati selektivnost baze putem vrlo precizne kontrole sadržaja vode u smeši u fazi depolimerizacije.

Postupak prema ovom izumu karakteriše, u stvari, kontrola jake selektivnosti baze tokom depolimerizacije. Ona omogućuje da se heparin depolimerizuje, a da se do maksimuma očuvaju sekvencije sa afinitetom za ATIII, kao što je heksasaharid Alla-IIs-Is, opisan u ovom izumu.

Ova odlika postupka dovodi do neočekivanih aXa aktivnosti s obzirom na srednje molekulske mase smeše oligosaharida (150 IU/mg < aXa < 200 IU/mg za srednje molekulske mase koje se nalaze izmedju 2000 Da i 3000 Da). Do ove selektivnosti dolazi zbog vrlo osobenih fizikohemijskih karakteristika baza fosfazena , koji imaju pKa veće od 20, vrlo jaku sternu smetnju i slabu nukleofilnost.

Ovaj efekt se ispoljava u punoj meri kada je reakciona sredina anhidrovana.

Nasuprot tome, kada se sadržaj vode u reakcionoj sredini povećava, primećuje se drastično smanjenje selektivnosti depolimerizacije. Očuvanje sekvenci sa afinitetom za ATIII se smanjuje, i, kao posledica toga, dolazi do znatnog pada aXa aktivnosti. U prisustvu malih količina vode, baza fosfazena se protonizuje i kvaternerni amonijum hidroksid postaje aktivna supstanca. U tom slučaju, osobine jake sterne smetnje i slabe nukleofilnosti se gube i znatno slabe kvalitet dobijenog proizvoda. Kada se reakcije depolimerizacije vrše sa odmerenom i kontrolisanom količinom vode, može se videti kako se taj efekt u potpunosti ispoljava.

Sledeća tabela sumira udeo količine vode na selektivnost depolimerizacije (samo se taj parametar menja u probama: stehiometrijski odnosi reaktanata, razblaženja, temperature ostaju konstantni prema kriterijumima stručnjaka. Baza koja je korišćena je baza fosfazena: 2-tert-butilimino-2-dietilamino-l,3-dimetilperhidro-l,2,3-diazafosforin).

Za optimalnu selektivnost i maksimalnu očuvanost sekvencija sa afinitetom za ATIII, poželjno je raditi pri sadržaju vode manjem od 0,6%, a najbolje manjem od 0,3%, kada se radi sa 1 molskim ekvivalentom baze fosfazena u odnosu na benzetonijum so benzil estra heparina.

Predmet ovog izuma je, dakle, naročito faza depolimerizacije kvaternerne amonijumove soli benzil estra heparina, dobijene metodima poznatim stručnjacima, koji se odlikuju time što se koristi neka baza iz familije fosfazena, naročito u rastvoru dihlorometana koji sadrži manje od 0,6% vode. Poželjno je da se izabere procenat koji je manji od 0,3%, a još bolje manji od 0,2%.

Korisno je da molski odnos jake baze prema estru bude izmedju 0,2 i 5, najbolje izmedju 0,6 i 2, a naročito izmedju 0,8 i 1,2. Korišćenje ekvimolarnih odnosa čini, dakle, deo poželjnih načina izvodjenja ovog izuma.

Mogu se takodje koristiti i drugi aprotički rastvarači, poznati ljudima u struci, kao što su THF ili DMF.

Poželjno je da kvaternerna amonijumova so benzil estra heparina bude so benzetonijuma, cetilpiridinijuma ili cetiltrimetil amonijuma.

Poželjno je da baze iz familije fosfazena imaju formulu:

u kojoj su radikali Rl do R7 identični ili različiti i predstavljaju alkil radikale.

U prethodnim formulama, alkil radikali sadrže 1 do 6 atoma ugljenika u pravom ili razgranatom lancu.

Predmet ovog izuma je, dakle, postupak dobijanja smeše oligosaharida ovog izuma koji sadrži sledeće faze:

a) Transalifikacija natrijum heparina delovanjem benzetonijum hlorida,

b) Esterifikacija benzetonijum heparinata delovanjem benzil hlorida

c) Transalifikacija dobijenog benzil estra u kvaternernu amonijumovu so

d) Depolimerizacija kvaternerne amonijumove soli benzil estra heparina gore opisanim metodom

e) Transformacija kvaternerne amonijumove soli u so natrijuma

f) Eventualna saponifikacija heparina delovanjem baze kao što je natrijum hidroksid

g) Eventualno prečišćavanje, naročito delovanjem nekog oksidujućeg agensa, kao što je oksigenisana voda

Sledeća šema reakcija ilustruje ovaj izum:

Transformacija kvaternerne amonijumove soli benzil estra depolimerizovanog heparina u natrijumovu so (faza e) se obavlja, uglavnom, tretiranjem reakcione smeše alkoholnim rastvorom natrijum acetata i, pretežno, 10% rastvorom natrijum acetata u metanolu (w/v), na temperaturi izmedju 15 i 25°C. Najbolje je da ekvivalentna težina dodatog acetata bude 3 puta veća od mase kvaternerne amonijumove soli benzil estra heparina upotrebljenog u reakciji depolimerizacije

Saponifikacija (faza f) se obavlja, uglavnom, pomoću nekog hidroksida alkalnog metala, kao što je natrijum hidroksid, kalijum hidroksid, litijum hidroksid, u vodenoj sredini, na temperaturi izmedju 0 i 20°C , najbolje izmedju 0 i 10°C. Najčešće se koriste od 1 do 5 molskih ekvivalenata hidroksida alkalnog metala.

Krajnji proizvod se, eventualno, može prečistiti (faza g) bilo kojim poznatim metodom za prečišćavanje depolimerizovanog heparina (na primer EP 0037319B1). Najčešće se prečišćavanje vrši pomoću vodonik peroksida, u vodenoj sredini, na temperaturi od 10 do 50°C. Najpoželjnje je da se ta operacija izvede izmedju 20 i 40°C.

Kvaternerna amonijumova so benzil estra heparina može se dobiti prema sledećoj šemi reakcija: a) transformacija natrijumove soli heparina pomoću benzetonijum hlorida, da bi se dobio heparinat benzetonijuma (transalifikacija), b) esterifikacija prethodno dobijene soli benzetonijuma pomoću benzilhlorida, a zatim tretiranjem alkoholnim rastvorom natrijum acetata da bi se dobila natrijumova so benzil

estra heparina,

c) transalifikacija natrijumove soli benzil estra heparina u kvaternernu amonijumovu so, poželjno u so benzetonijuma, cetil piridinijuma ili cetiltrimetil amonijuma.

Reakcija u fazi a) izvodi se delovanjem viška benzetonijum hlorida na natrijum heparin, na temperaturi bliskoj 15 do 25°C. Korisno je da molarni odnos soli prema natrijum heparinu bude izmedju 3 i 4.

Kao početni heparin najpoželjnije je koristti heparin svinje. Ovaj se može prethodno prečistiti postupkom opisanim u patentu FR2663639, da bi se smanjila količina dermatan sulfata.

Esterifikacija u fazi b) se uglavnom izvodi u nekom organskom rastvaraču sa hlorom (na promer, hloroformu, metilen hloridu), na temperaturi izmedju 25 i 45°C, a najbolje izmedju 30 i 40°C. Estar, u obliku soli benzetonijuma, se zatim povrati u obliku natrijumove soli taloženjem 10%, težinski, natrijum acetatom u alkoholu, kao što je metanol. Uglavnom se koriste 1 do 1,2 zapremine alkohola u odnosu na reakcionu smešu. Količina benzil hlorida i vreme reakcije se prilagodjavaju tako da se dobije prinos esterifikacije izmedju 50 i 100%, poželjno izmedju 70 i 90 %. Najčešće se koristi 0,5 do 1,5 težinskih delova benzil hlorida na 1 težinski deo benzetonijum soli heparina. Takodje, najbolje vreme reakcije biće izmedju 10 i 35 h.

Transalifikacija u fazi c) se vrši pomoću nekog kvaternernog amonijum hlorida, najbolje pomoću benzetonijum hlorida, cetil piridinijum hlorida ili cetiltrimetil amonijum hlorida, u vodenoj sredini, na temperaturi izmedju 10 i 25°C. Korisno je da molski odnos kvaternernog amonijum hlorida/natrijumova so benzil estra heparina bude izmedju 2 i 3.

Smeše prema ovom izumu , u obliku natrijumove soli, mogu da se transormišu u neku drugu so alkalnog ili zemnoalkalnog metala. Eventualno prevodjenje iz jedne vrste soli u drugu vrši se korišćenjem metoda opisanog u patentu FR 73 13 580.

Smeše iz ovog izuma nisu toksične i mogu se takodje koristiti kao lekovi.

Smeše oligosaharida ovog izuma mogu se koristiti kao antitrombotski agensi. Naročito, oni se koriste za lečenje ili prevenciju venskih i arterijskih tromboza, trombozu dubinskih

vena, plućne embolije, nestabilnu anginu, infarkt miokarda, kardijalnu ishemiju, okluzivna oboljenja perifernih arterija i atrijalnu fibrozu. Takodje su korisni i u prevenciji i tretiranju proliferacije ćelija glatkih mišića, ateroskleroze i arterioskleoze, za lečenje i prevenciju kancera modulisanjem angiogeneze i faktora rasta, i za lečenje i prevenciju poremećaja u dijabetesu, kao što su dijabetične retinopatije i nefropatije

Predmet ovog izuma su takodje i farmaceutski sastavi koji kao aktivni princip sadrže

smešu formule (I), eventualno sa jednim ili više inertnih ekscipijenata.

Farmaceutski sastavi su, na primer, rastvori koji se mogu injecirati subkutano ili

intravenozno.Oni se takodje korisni za davanje preko pluća (inhalacija) ili oralno davanje.

Doziranje može da varira, zavisno od starosnog doba, težine i zdravstvenog stanja pacijenta. Za odrasle, doza je uglavnom izmedju 20 i 100 mg dnevno kada se daje intramuskularno ili subkutano.

Sledeći primeri ilustruju ovaj izum, ali ga nikako ne ograničavaju.

PrimerA : DOB I JANJE HEPARINATA BENZIL SOLI BENZETONIJUMA

Heparinat benzetonijuma

Rastvoru od 10 g natrijum heparina u 100 ml vode, dodaje se rastvor benzetonijum hlorida od 25 g u 125 ml vode. Proizvod se filtruje, opere i osuši.

Benzil estar heparina (natrijumova so)

Rastvoru od 20 g benzetonijum heparinata u 80 ml metilen hlorida dodaje se 16 ml benzil hlorida. Rastvor se zagreva na temperaturi od 30°C tokom 12 sati. Zatim se dodaje 108 ml 10% rastvora natrijum acetata u metanolu, filtruje, opere metanolom i osuši. Na ovaj način se dobija 7,6 g benzil estra heparina u obliku natrijumove soli sa prinosom esterifikacije od 77%.

Benzil estar heparina (so benzetonijuma)

U erlenmajer A od 2 litra uvede se 36 g (0,0549 mola) benzil estra heparina ; (natrijumove soli) i 540 ml destilovane vode. Posle homogenizacije na temperaturi od oko 20°C dobija se bledo žuti rastvor. Uz mešanje na magnetnoj mešalici, u erlenmajeru B od 1 litra, pripremi se rastvor od 64,45 g (0,1438 mola) benzetonijum hlorida i 450 ml vode. Rastvor iz erlenmajera B se, uz mešanje, sipa tokom oko 35 minuta u rastvor u erlenmajeru A. Opaža se formiranje obilnog belog taloga. Erlenmajer B se ispere sa 200 ml destilovane vode i ta voda se doda erlenmajeru A. Prestaje se sa mešanjem i ostavi se da se suspenzija slegne tokom 12 sati. Po isteku tog vremena, bistra faza se odliva i baca. Na talog (kašastog izgleda) se dodaje 560 ml vode i meša 20 minuta. Ostavi se oko 30 minuta da se talog ponovo slegne. Gornja faza (oko 560 ml) se odvadi i baci. Pošto se talog slegne, ovaj postupak pranja sa po oko 560 ml vode ponovi se dva puta. U poslednjem postupku pranja talog se ostavi u suspenziji i profiltruje kroz sinterovano staklo 3. Kolač se zatim ispere 4 puta sa po 200 ml destilovane vode. Čvrsta bela supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (2,7 kPa), na temperaturi blizu 60°C. Posle 12 sati sušenja, dobija se 87,5 g benzil heparinata, soli benzetonijuma. Dobijeni prinos je 94,9%.

Primer B. OPIS HEKSASAHARIDA ATIII (Alla-IIs-Is)

Protonski spektar u D20, 500 MHz, T=298 K, 8 u ppm : 1,97 (3H, s), 3,18 (IH, dd, 10 i 3Hz), 3,30 (IH, t, 8Hz), 3,37 (IH, dd, 10 i 3Hz), 3,60 (2H, m), izmedju 3,65 i 3,85 (6H, m), 3,87 (2H, m), 3,95 (IH, d, 8Hz), 4,03 (IH, d, 8Hz), izmedju 4,05 i 4,13 (4H, m), izmedju 4,16 i 4,45 (8H, m), 4,52 (IH, d, 8Hz), 4,67 (IH, m), 5,06 (IH, d, 6Hz), 5,10 (IH, d, 3Hz), 5,33 (IH, d, 4Hz), 5,36 (IH, d, 3Hz), 5,46 (IH, d, 3Hz), 5,72 (IH, d, 4Hz).

Dekanatrijumova so 4-dezoksi-a-L-treo-heksenepiranoziluronska kiselina-(1^4)-2-dezoksi-2-acetamido-6-0-sulfo-a-D-glukopiranozil-(l->4)-(3-D-glukopiranoziluronska kiselina-(1^4)-2-dezoksi-2-sulfamido-3,6-di-0-sulfo-a-D-glukopiranozil)-(l-^4)-2-0-sulfo-a-L-idopiranoziluronska kiselina- (1^4)-2-dezoksi-2-sulfamido-6-0-sulfo-a-D-glukopiranoza

Primeri 1 do 7 i 12 ilustruju uticaj sadržaja vode na selektivnost reakcije polimerizacije i aktivnost aXa i alla dobijenih proizvoda.

Primeri 8 do 10 ilustruju uticaj broja ekvivalenata baze na aktivnost aXa i alla dobijenog proizvoda (sa sadržajem vode od 0,1%).

Primer 11 ilustruje korišćenje baze fosfazena koja nije 2-tert-butilimino-2-dietilamino-1,3-dimetilperhidro-l ,2,3-diazafosforin

Korišćenje tert-butilimino tri(pirolidino) fosforana

PRIMER 1

Depolimerizacija i prevodjenje u natrijumovuso (0,l%vode):

U erlenmajer A stavi se 70 ml dihlorometana. Polako, uz mešanje, dodaje se 10 g (0,006 mola) benzil estra heparina (procenat esterifikacije 75 %, so benzetonijuma), dobijenog kao što je opisano u primeru A. Sadržaj vode u reakcionoj smeši podešava se na 0,1 %. • Rastvor se zagreje do 40°C, pod azotom. Posle potpunog rastvaranja vraća se na temperaturu blisku 20°C i dodaje 1,75 ml (0,006 mola) 2-tert-butilimino-2-dietilamino-l,3-dimetilperhidro-l,2,3-diaza- fosforina. Meša se tokom 24 sata, na temperaturi blizu 20°C. Za to vreme se u erlenmajeru B pripremi rastvor od 30 g anhidrovanog natrijum acetata u 300 ml metanola. Kad se potpuno rastvori, rastvoru se doda 5 g celita Hyflo supercel. Na magnetnoj mešalici, reakciona smeša iz erlenmajera A se sipa za 1 minut i 30 sekundi u metanolni rastvor natrijum acetata, na temperaturi bliskoj 5°C. Posle 5 minuta mešanja, suspenzija se ostavi jedan sat i 30 minuta da se slegne. Bistra gornja faza se odvadi i baci (220 ml). Na talog se dodaje 220 ml metanola i meša 5 minuta. Ostavi se da se taloži oko 1 sat i 20 minuta. Supernatant se odvadi i baci (250 ml). Na staloženi precipitat dodaje se 250 ml metanola i meša 5 minuta. Suspendovan talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni kolač se zatim opere sa 100 ml metanola. Vlažna bledožuta čvrsta supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 40°C. Posle 18 sati sušenja dobija se 2,51 g natrijumove soli depolimerizovanog heparina u celitu (5 g). Dobijeni prinos je 64 %.

Saponifikacija:

U erlenmajer od 50 ml stavlja se prethodno dobijenih 2,5 g (0,0038 mola) sirove natrijumove soli depolimerizovanog heparina u celitu (5 g), i 17 ml vode. Suspenzija se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3 i opere 2 puta sa po 5 ml vode. Dobijeni filtrat se prenese u jedan erlenmajer od 150 ml. Na magnetnoj mešalici, dodaje se 0,4 ml (0,004 mola) 30% kaustične sode, na temperaturi bliskoj 5°C. Posle dodavanja, smeša se meša 2 sata. Rastvor se neutrališe dodavanjem 1N HC1 i dodaje se 3 g natrijum hlorida. Posle rastvaranja, reakcionoj smeši se dodaje 21 ml metanola. Posle 15 minuta mešanja, dodaje se 44 ml metanola, a zatim se meša još jedan sat. Tada se mešanje prekida i suspenzija ostavi da se slegne tokom 45 minuta, na temperaturi bliskoj 5°C. Supernatant se zatim odvadi i baci (90 ml). Na staložen precipitat se dodaje 90 ml metanola i meša 5 minuta. Ostavi se da se slegne tokom oko 20 minuta. Supernatant se ukloni i baci (80 ml). Na staložen precipitat nalije se 80 ml metanola i meša oko 5 minuta. Suspendovan talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni kolač se zatim opere sa 50 ml metanola. Vlažna supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 40°C. Posle 18 sati sušenja dobija se 1,31 g sirovog depolimerizovanog heparina (natrijumova so). Dobijeni prinos je 66 %.

Prečišćavanje:

U erlenmajer od 50 ml stavlja se 1,3 g prethodno dobijenog sirovog depolimerizovanog heparina i 13 ml destilovane vode.Smeša se dovede do 40°C, uz mešanje na magnetnoj mešalici. Dodavanjem 1N natrijum hidroksida pH se dovede na 9,7±0,1. Reakciona smeša se profiltruje kroz 0,45 um membranu i dodaje 0,07 ml 30% vodenog rastvora vodonik peroksida. Posle oko 2 sata mešanja, na temperaturi bliskoj 20°C, smeša se neutrališe dodavanjem 1N HC1, a zatim se dodaje 2 g natrijum hlorida. Rastvor se zatim profiltruje kroz 0,45 um membranu kroz koju se propusti i 14 ml metanola. Rastvor se zatim ohladi na 10°C i meša oko 15 minuta. Zatim se dodaje 36 ml metanola i meša još jedan sat. Mešanje se prekida i ostavi da se suspenzija slegne oko 15 minuta. Supernatant se zatim odvadi i baci (50 ml). Na staloženi precipitat dodaje se 50 ml metanola i meša 5 minuta Ostavi se da se taloži oko 25 minuta. Supernatant se ukloni i baci (50 ml).. Suspendovan talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni beli kolač se zatim opere sa 50 ml metanola. Vlažna supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 40°C. Posle 18 sati sušenja dobija se 1,13 g čistog depolimerizovanog heparina (natrijumova so). Dobijeni prinos je 87 %.

Karakteristike tako dobijenog depolimerizovanog heparina su sledeće:

srednja molekulska masa 2600 daltona

Anti-Xa aktivnost : 177 IU/mg

Anti-IIa aktivnost: 1,5 IU/mg

Odnos aktivnosti anti-Xa/anti-IIa: 118

PRIMER 2

Depolimerizacija i prevodjenjeu sonatriju ma(0,2%)

U erlenmajer A stavlja se 70 ml dihlorometana. Uz mešanje i pod pritiskom azota polako se unosi 10 g (0,006 mola) benzil estra heparina (procenat esterifikacije 75 %, so benzetonijuma), dobijenog kao što je opisano u primeru A. Sadržaj vode u reakcionoj smeši podešava se na 0,2 %. Posle potpunog rastvaranja

dodaje se 1,75 ml (0,006 mola) 2-tert-butilimino-2-dietilamino-l,3-dimetilperhidro-1,2,3-diaza- fosforina. Meša se tokom 24 sata, na temperaturi blizu 20°C. Za to vreme se u erlenmajeru B pripremi rastvor od 30 g anhidrovanog natrijum acetata u 300 ml metanola. Kad se potpuno rastvori, rastvoru se doda 5 g celita Hyflo supercel. Na magnetnoj mešalici, reakciona smeša iz erlenmajera A se sipa za 1 minut i 30 sekundi u metanolni rastvor natrijum acetata, na temperaturi bliskoj 5°C. Posle 5 minuta mešanja, suspenzija se ostavi jedan sat i 30 minuta da se slegne. Bistra gornja faza se odvadi i baci (220 ml). Na talog se dodaje 220 ml metanola i meša 5 minuta. Ostavi se da se taloži oko 2 sata. Supernatant se odvadi i baci (230 ml). Na staloženi precipitat dodaje se 230 ml metanola. Suspendovani talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni kolač se zatim opere sa 150 ml metanola. Vlažna bledožuta čvrsta supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 40°C. Posle 18 sati sušenja dobija se 2,63 g sirovog depolimerizovanog heparina u celitu (5 g). Dobijeni prinos je 67 %.

Saponifikacija:

U erlenmajer od 50 ml stavlja se prethodno dobijenih 2,5 g (0,0038 mola) natrijumove soli depolimerizovanog heparina u celitu (5 g), i 18 ml vode. Suspenzija se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3 i opere 2 puta sa po 5 ml vode. Dobijeni filtrat se prenese ujedan erlenmajer od 150 ml. Na magnetnoj mešalici, dodaje se 0,4 ml (0,004 mola) 30% kaustične sode, na temperaturi bliskoj 5°C. Posle dodavanja, smeša se meša 2 sata. Rastvor se neutrališe dodavanjem 1N HC1 i dodaje se 2 g natrijum hlorida. Reakcionoj smeši se dodaje 14 ml metanola. Posle 15 minuta mešanja, dodaje se 36 ml metanola, a zatim se meša još jedan sat. Tada se mešanje prekida i suspenzija ostavi da se slegne tokom 45 minuta, na temperaturi bliskoj 5°C. Supernatant se zatim odvoji i baci (80 ml). Na staložen precipitat se dodaje 90 ml metanola i meša 5 minuta. Ostavi se da se slegne tokom oko 20 minuta. Supernatant se ukloni i baci (80 ml). Na staložen precipitat nalije se 80 ml metanola i meša 5 minuta. Suspendovan talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni kolač se zatim opere sa 50 ml metanola. Vlažna supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 40°C. Posle 48 sati sušenja dobija se 2,3 g sirovog depolimerizovanog heparina (natrijumova so). Dobijeni prinos je 65 %.

Prečišćavanje:

U erlenmajer od 50 ml stavlja se 1,4 g prethodno dobijenog sirovog depolimerizovanog heparina i 15 ml destilovane vode. Smeša se dovede do 40°C, uz mešanje na magnetnoj mešalici. Dodavanjem 1N natrijum hidroksida pH se dovede na 9,7±0,1. Reakciona smeša se profiltruje kroz 0,45 um membranu i dodaje 0,07 ml 30% vodenog rastvora vodonik peroksida. Posle oko 2 sata mešanja, na temperaturi bliskoj 40°C, smeša se ohladi do temperature bliske 20°C, zatim se neutrališe dodavanjem 1N HC1. Reakcionoj smeši se dodaje 2 g natrijum hlorida. Rastvor se zatim profiltruje kroz 0,45 um membranu kroz koju se propusti i 14 ml metanola. Rastvor se zatim ohladi na 10°C i meša 15 minuta. Zatim se dodaje 36 ml metanola i meša još jedan sat. Mešanje se prekida i ostavi da se suspenzija slegne 15 minuta. Supernatant se zatim odvadi i baci (40 ml). Na staloženi precipitat (kašastog izgleda) dodaje se 40 ml metanola i meša 5 minuta. Ostavi se da se taloži oko 20 minuta. Supernatant se ukloni i baci (50 ml). Suspendovan talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni beli kolač se zatim opere sa 50 ml metanola. Vlažna supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 40°C. Posle 18 sati sušenja dobija se 1,2 g čistog depolimerizovanog heparina (natrijumova so). Dobijeni prinos je 86 %. Karakteristike tako dobijenog depolimerizovanog heparina su sledeće:

srednja molekulska masa 2650 daltona

Anti-Xa aktivnost : 161 IU/mg

Anti-IIa aktivnost: 1,4 IU/mg

Odnos aktivnosti anti-Xa/anti-IIa : 115

PRIMER 3

Depolimerizacija i prevodjenje u natrijumovu so (0,3%vode):

U erlenmajer A stavi se 70 ml dihlorometana. Uz mešanje, i pod azotom pod pritiskom, dodaje se 10 g (0,006 mola) benzil estra heparina (procenat esterifikacije 75 %, so benzetonijuma), dobijenog kao što je opisano u primeru A. Sadržaj vode u reakcionoj smeši podešava se na 0,3 %. Posle potpunog rastvaranja dodaje se 1,75 ml (0,006 mola) 2-tert-butilimino-2-dietilamino-l,3-dimetilperhidro-l,2,3-diaza- fosforina. Meša se tokom 24 sata, na temperaturi blizu 20°C. Za to vreme se u erlenmajeru B pripremi rastvor od 30 g anhidrovanog natrijum acetata u 300 ml metanola. Kad se potpuno rastvori, rastvoru se doda 5 g celita Hyflo supercel. Na magnetnoj mešalici, reakciona smeša iz erlenmajera A se sipa za 1 minut i 30 sekundi u metanolni rastvor natrijum acetata, na temperaturi bliskoj 5°C. Posle 5 minuta mešanja, suspenzija se ostavi 1 sat i 10 minuta da se slegne. Bistra gornja faza se odvadi i baci (220 ml). Na talog se dodaje 220 ml metanola i meša 5 minuta. Suspendovan talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni kolač se zatim opere sa 100 ml metanola. Vlažna čvrsta supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 40°C. Posle 18 sati sušenja dobija se 2,57 g sirove natrijumove soli depolimerizovanog heparina u celitu (5 g). Dobijeni prinos je 66 %.

Saponifikacija:

U erlenmajer od 50 ml stavlja se prethodno dobijenih 2,5 g (0,0038 mola) sirove natrijumove soli depolimerizovanog heparina u celitu (5 g), i 18 ml vode. Suspenzija se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3 i opere 2 puta sa po 5 ml vode. Dobijeni filtrat se prenese u erlenmajer od 150 ml. Na magnetnoj mešalici, dodaje se 0,4 ml (0,004 mola) 30% kaustične sode, na temperaturi bliskoj 5°C. Posle dodavanja, smeša se meša 2 sata. Rastvor se neutrališe dodavanjem 1N HC1 i dodaje se 3 g natrijum hlorida. U reakcionu smešu uliva se 15 ml metanola.. Posle 15 minuta mešanja, dodaje se 36 ml metanola, a zatim se meša još jedan sat. Tada se mešanje prekida i suspenzija ostavi da se slegne tokom 1 sata.. Supernatant se zatim odvadi i baci (70 ml). Na staloženi precipitat se dodaje 70 ml metanola i meša 5 minuta. Suspendovani talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni kolač se zatim opere sa 50 ml metanola. Vlažna supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 40°C. Posle 48 sati sušenja dobija se 1,42 g sirovog depolimerizovanog heparina (natrijumova so). Dobijeni prinos je 62 %.

Prečišćavanje:

U erlenmajer od 50 ml stavlja se 1,4 g prethodno dobijenog sirovog depolimerizovanog heparina i 14 ml destilovane vode. Smeša se dovede do 40°C, uz mešanje na magnetnoj mešalici. Dodavanjem 1N natrijum hidroksida pH se dovede na 9,7±0,1. Reakciona smeša se profiltruje kroz 0,45 um membranu i dodaje 0,07 ml 30% vodenog rastvora vodonik peroksida. Posle oko 2 sata mešanja, na temperaturi bliskoj 20°C, smeša se neutrališe dodavanjem 1N HC1, a zatim se dodaje 2 g natrijum hlorida. Posle rastvaranja, rastvor se profiltruje kroz 0,45 um membranu kroz koju se propusti i 14 ml metanola. Rastvor se zatim ohladi na 10°C i meša 15 minuta. Zatim se dodaje 36 ml metanola i meša još jedan sat. Mešanje se prekida i ostavi da se suspenzija slegne oko 40 minuta. Supernatant se zatim odvadi i baci (50 ml). Na staloženi precipitat (kašastog izgleda) dodaje se 50 ml metanola i meša 5 minuta. Ostavi se da se taloži oko 25 minuta. Suspendovani talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni beli kolač se zatim opere sa 50 ml metanola. Vlažna supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 40°C. Posle 18 sati sušenja dobija se 1,24 g čistog depolimerizovanog heparina (natrijumova so). Dobijeni prinos je 89 %.

Karakteristike tako dobijenog depolimerizovanog heparina su sledeće:

Srednja molekulska masa 2400 daltona

Anti-Xa aktivnost: 132 IU/mg

Anti-IIa aktivnost : 1,4 IU/mg

Odnos aktivnosti anti-Xa/anti-IIa: 94

PRIMER 4

Depolimerizacija i prevodjenje unatrijumovuso (0,4%vode):

U erlenmajer A stavi se 70 ml dihlorometana. Polako, uz mešanje, dodaje se 10 g (0,006 mola) benzil estra heparina (procenat esterifikacije 75 %, so benzetonijuma), dobijenog kao što je opisano u primeru A. Sadržaj vode u reakcionoj smeši podešava se na 0,4 %. Rastvor se zagreje na 30°C, pod azotom. Posle potpunog rastvaranja vraća se na temperaturu blisku 20°C i dodaje 1,75 ml (0,006 mola) 2-tert-butilimino-2-dietilamino-l,3-dimetilperhidro-l,2,3-diaza- fosforina. Meša se tokom 24 sata, na temperaturi blizu 20°C. Za to vreme se u erlenmajeru B pripremi rastvor od 30 g anhidrovanog natrijum acetata u 300 ml metanola. Kad se potpuno rastvori, rastvoru se doda 5 g celita Hyflo supercel. Na magnetnoj mešalici, reakciona smeša iz erlenmajera A se sipa za 1 minut i 30 sekundi u metanolni rastvor natrijum acetata, na temperaturi bliskoj 5°C. Posle 5 minuta mešanja, suspenzija se ostavi 2 sata da se slegne. Bistra gornja faza se odvadi i baci (80 ml). Na talog se dodaje 80 ml metanola i meša 5 minuta. Ostavi se da se taloži oko 1 sat. Supernatant se odvadi i baci (80 ml). Na staloženi precipitat dodaje se 80 ml metanola i meša 5 minuta. Suspendovan talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni kolač se zatim opere sa 150 ml metanola. Vlažna bledožuta čvrsta supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 40°C. Posle 18 sati sušenja dobija se 3,25 g sirove natrijumove soli depolimerizovanog heparina u celitu (5 g). Dobijeni prinos je 83 %.

Saponifikacija:

U erlenmajer od 50 ml stavlja se prethodno dobijenih 3,1 g (0,0018 mola) sirove natrijumove soli depolimerizovanog heparina u celitu (10 g), i 21 ml vode. Suspenzija se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3 i opere 2 puta sa po 6 ml vode. Dobijeni filtrat se prenese u erlenmajer od 150 ml. Na magnetnoj mešalici, dodaje se 0,7 ml (0,007 mola) 30% kaustične sode, na temperaturi bliskoj 5°C. Posle dodavanja, smeša se meša 2 sata. Rastvor se neutrališe dodavanjem 1N HC1 i dodaje se 4 g natrijum hlorida. Reakcionoj smeši se dodaje 28 ml metanola. Posle 15 minuta mešanja, dodaje se 72 ml metanola, a zatim se meša još jedan sat. Tada se mešanje prekida i suspenzija ostavi da se slegne tokom jednog sata.. Supernatant se zatim odvadi i baci (90 ml). Na staloženi precipitat se dodaje 90 ml metanola i meša 5 minuta. Ostavi se da se slegne tokom oko 20 minuta. Supernatant se odvadi i baci (90 ml). Na staložen precipitat nalije se 90 ml metanola i meša 5 minuta. Suspendovani talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni kolač se zatim opere sa 50 ml metanola. Vlažna supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 40°C. Posle 48 sati sušenja dobija se 1,9 g sirovog depolimerizovanog heparina (natrijumova so). Dobijeni prinos je 67%.

Prečišćavanje:

U erlenmajer od 50 ml stavlja se 1,9 g prethodno dobijenog sirovog depolimerizovanog heparina i 19 ml destilovane vode. Smeša se dovede do 40°C, uz mešanje na magnetnoj mešalici. Dodavanjem 1N natrijum hidroksida pH se dovede na 9,7±0,1. Reakciona smeša se profiltruje kroz 0,45 um membranu i dodaje 0,1 ml 30% vodenog rastvora vodonik peroksida. Posle oko 2 sata mešanja, na temperaturi bliskoj 20°C, smeša se neutrališe dodavanjem 1N HCI, a zatim se dodaje 2 g natrijum hlorida. Rastvor se zatim profiltruje kroz 0,45 um membranu kroz koju se propusti i 14 ml metanola i meša 15 minuta. Zatim se dodaje 36 ml metanola i meša još jedan sat. Mešanje se prekida i ostavi da se suspenzija slegne 15 minuta. Supernatant se zatim odvadi i baci (40 ml). Na staloženi precipitat dodaje se 40 ml metanola i meša 5 minuta. Ostavi se da se taloži oko 20 minuta. Supernatant se odvadi i baci (50 ml). Na staloženi precipitat dodaje se 500 ml metanola i meša 5 minuta. Ostavi se da se taloži oko 20 minuta. Suspenzija se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni beli kolač se zatim opere sa 50 ml metanola. Vlažna supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 40°C. Posle 72 sata sušenja dobija se 1,56 g čistog depolimerizovanog heparina (natrijumova so). Dobijeni prinos je 82 %.

Karakteristike tako dobijenog depolimerizovanog heparina su sledeće:

Srednja molekulska masa 2350 daltona

Anti-Xa aktivnost: 122 IU/mg

Anti-IIa aktivnost: 1,3 IU/mg

Odnos aktivnosti anti-Xa/anti-IIa: 94

PRIMER 5

Depolimerizacija i prevodjenje u natrijumovu so (0,57 % vode):

U erlenmajer A stavi se 140 ml dihlorometana. Polako, uz mešanje, dodaje se 20 g (0,019 mola) benzil estra heparina (procenat esterifikacije 75 %, so benzetonijuma), dobijenog kao što je opisano u primeru A. Sadržaj vode u reakcionoj smeši podešava se na 0,57 %. Posle ; potpunog rastvaranja dodaje se 3,5 ml (0,012 mola) 2-tert-butilimino-2-dietilamino-l,3-dimetilperhidro-1,2,3-diaza- fosforina. Meša se tokom 24 sata, na temperaturi blizu 20°C. Za to vreme se u erlenmajeru B pripremi rastvor od 60 g anhidrovanog natrijum acetata u 600 ml metanola. Kad se potpuno rastvori, rastvoru se doda 10 g celita Hyflo supercel. Na magnetnoj mešalici, reakciona smeša iz erlenmajera A se sipa za 1 minut i 30 sekundi u metanolni rastvor natrijum acetata, na temperaturi bliskoj 4°C. Posle 5 minuta mešanja, suspenzija se ostavi 30 minuta da se slegne. Bistra gornja faza se odvadi i baci (400 ml). Na talog se dodaje 400 ml metanola i meša 5 minuta. Ostavi se da se taloži oko 1 sat. Supernatant se odvadi i baci (420 ml). Na staloženi precipitat dodaje se 420 ml metanola i meša 5 minuta. Suspendovan talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni kolač se zatim opere sa 200 ml metanola. Vlažna bledožuta čvrsta supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 50°C. Posle 18 sati sušenja dobija se 6,66 g natrijumove soli depolimerizovanog heparina u celitu (10 g). Dobijeni prinos je 85 %.

Saponifikacija:

U erlenmajer od 50 ml stavlja se prethodno dobijenih 6,66 g (0,0101 mola) sirove natrijumove soli depolimerizovanog heparina u celitu (10 g), i 47 ml vode. Suspenzija se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3 i opere 2 puta sa po 15 ml vode. Dobijeni filtrat se prenese u erlenmajer od 150 ml. Na magnetnoj mešalici, dodaje se 1,1 ml (0,011 mola) 30 % kaustične sode, na temperaturi bliskoj 5°C. Posle dodavanja, smeša se meša 2 sata. Rastvor se neutrališe dodavanjem 1N HC1 i dodaje se 9,5 g natrijum hlorida. Reakcionoj smeši se dodaje 66 ml metanola. Posle 15 minuta mešanja, dodaje se 171 ml metanola, a zatim se meša još jedan sat. Tada se mešanje prekida i suspenzija ostavi da se slegne tokom 3/4 sata, na temperaturi bliskoj 5°C. Supernatant se zatim odvadi i baci (160 ml). Na staložen precipitat se dodaje 160 ml metanola i meša 5 minuta. Ostavi se da se slegne tokom oko 20 minuta. Supernatant se ukloni i baci (180 ml). Na staložen precipitat nalije se 180 ml metanola i meša 5 minuta. Suspenzija se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni kolač se zatim opere 2 puta sa po 50 ml metanola. Vlažna supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 40°C. Posle 18 sati sušenja dobija se 4,53 g sirovog depolimerizovanog heparina (natrijumova so). Dobijeni prinos je 74 %.

Prečišćavanje:

U erlenmajer od 100 ml stavlja se 4,53 g prethodno dobijenog sirovog depolimerizovanog heparina i 45 ml destilovane vode. Smeša se dovede do 40 °C, uz mešanje na magnetnoj mešalici. Dodavanjem 1N natrijum hidroksida pH se dovede na 9,7±0,1. Reakciona smeša se profiltruje kroz 0,45 um membranu i dodaje 0,25 ml 30% vodenog rastvora vodonik peroksida. Posle oko 2 sata mešanja, na temperaturi bliskoj 20°C, smeša se neutrališe dodavanjem 1N HC1, a zatim se dodaje 5,5 g natrijum hlorida. Rastvor se zatim profiltruje kroz 0,45 pm membranu kroz koju se propusti i 38 ml metanola, na temperaturi bliskoj 10 °C. Rastvor se zatim dovede do 20 °C i meša 15 minuta. Zatim se dodaje 100 ml metanola i meša još jedan sat. Mešanje se prekida i ostavi da se suspenzija slegne 20 minuta. Supernatant se zatim odvadi i baci (90 ml). Na staloženi precipitat dodaje se 90 ml metanola i meša 5 minuta. Ostavi se da se taloži oko 25 minuta. Supernatant se odvadi i baci (100 ml).. Suspendovani talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni beli kolač se zatim opere sa 50 ml metanola. Vlažna supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 50°C. Posle 18 sati sušenja dobija se 3,7 g čistog depolimerizovanog heparina (natrijumova so). Dobijeni prinos je 82 %.

Karakteristike tako dobijenog depolimerizovanog heparina su sledeće:

Srednja molekulska masa 2200 daltona

Anti-Xa aktivnost : 120 IU/mg

Anti-IIa aktivnost: 1,4 IU/mg

Odnos aktivnosti anti-Xa/anti-IIa: 86

PRIMER 6

Depolimerizacija i prevodjenje u natrijumovu so (1,8 % vode):

U erlenmajer A stavi se 140 ml dihlorometana. Polako, uz mešanje, dodaje se 20 g (0,019 mola) benzil estra heparina (procenat esterifikacije 75 %, so benzetonijuma), dobijenog kao što je opisano u primeru A. Sadržaj vode u reakcionoj smeši podešava se na 1,8 %. Posle potpunog rastvaranja dodaje se 3,5 ml (0,012 mola) 2-tcrt-butilimino-2-dictilamino-l,3-dimetilperhidro-1,2,3-diaza- fosforina. Meša se tokom 24 sata, na temperaturi blizu 20°C. Za to vreme se u erlenmajeru B pripremi rastvor od 60 g anhidrovanog natrijum acetata u 600 ml metanola. Posle potpunog rastvaranja, rastvoru se doda 10 g celita Hyflo supercel. Na magnetnoj mešalici, reakciona smeša iz erlenmajera A se sipa za 1 minut i 30 sekundi u metanolni rastvor natrijum acetata, na temperaturi bliskoj 4°C. Posle 5 minuta mešanja, suspenzija se ostavi 30 minuta da se slegne. Bistra gornja faza se odvadi i baci (400 ml). Na talog se dodaje 400 ml metanola i meša 5 minuta. Ostavi se da se taloži oko 1 sat. Supernatant se odvadi i baci (420 ml). Na staloženi precipitat dodaje se 420 ml metanola i meša 5 minuta. Suspendovan talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni kolač se zatim opere sa 200 ml metanola. Vlažna bledožuta čvrsta supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 50°C. Posle 18 sati sušenja dobija se 7,54 g sirove natrijumove soli depolimerizovanog heparina u celitu (10 g). Dobijeni prinos je 96 %.

Saponifikacija:

U erlenmajer od 50 ml stavlja se prethodno dobijenih 7,54 g (0,0101 mola) sirove natrijumove soli depolimerizovanog heparina u celitu (10 g), i 53 ml vode. Suspenzija se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3 i opere 2 puta sa po 15 ml vode. Dobijeni filtrat se prenese u erlenmajer od 150 ml. Na magnetnoj mešalici, dodaje se 1,25 ml (0,012 mola) 30% kaustične sode, na temperaturi bliskoj 4°C. Posle dodavanja, smeša se meša 2 sata. Rastvor se neutrališe dodavanjem 1N HC1 i dodaje se 10,5 g natrijum hlorida. Reakcionoj smeši se dodaje 70 ml metanola. Posle 15 minuta mešanja, dodaje se 190 ml metanola, a zatim se meša još jedan sat. Tada se mešanje prekida i suspenzija ostavi da se slegne tokom 3/4 sata, na temperaturi bliskoj 4°C. Supernatant se zatim odvadi i baci (180 ml). Na staloženi precipitat se dodaje 180 ml metanola i meša 5 minuta. Ostavi se da se slegne tokom oko 20 minuta. Supernatant se odvadi i baci (180 ml). Na staložen precipitat nalije se 180 ml metanola i meša 5 minuta. Suspendovani talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni kolač se zatim opere 2 puta sa po 50 ml metanola. Vlažna supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 50°C. Posle 18 sati sušenja dobija se 5,53 g sirovog depolimerizovanog heparina (natrijumova so). Dobijeni prinos je 80 %.

Prečišćavanje:

U erlenmajer od 100 ml stavlja se 5,53 g prethodno dobijenog sirovog depolimerizovanog heparina i 55 ml destilovane vode. Smeša se dovede do 40°C, uz mešanje na magnetnoj mešalici. Dodavanjem 1N natrijum hidroksida pH se dovede na 9,7±0,1. Reakciona smeša se profiltruje kroz 0,45 um membranu i dodaje 0,31 ml 30% vodenog rastvora vodonik peroksida. Posle oko 2 sata mešanja, na temperaturi bliskoj 20°C, smeša se neutrališe dodavanjem 1N HC1, a zatim se dodaje 7 g natrijum hlorida. Rastvor se zatim profiltruje kroz 0,45 um membranu kroz koju se propusti i 49 ml metanola, na temperaturi bliskoj 10°C. Rastvor se zatim dovodi na 20°C i meša 15 minuta.. Zatim se dodaje 126 ml metanola i meša još jedan sat. Mešanje se prekida i ostavi da se suspenzija slegne tokom 20 minuta. Supernatant se zatim odvadi i baci (105 ml). Na staloženi precipitat dodaje se 105 ml metanola i meša 5 minuta. Ostavi se da se taloži oko 25 minuta. Supernatant se odvadi i baci (110 ml).. Suspendovani talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni beli kolač se zatim opere sa 50 ml metanola. Vlažna supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 55°C. Posle 18 sati sušenja dobija se 4,53 g čistog depolimerizovanog heparina (natrijumova so). Dobijeni prinos je 82 %.

Karakteristike tako dobijenog depolimerizovanog heparina su sledeće:

Srednja molekulska masa 2600 daltona

Anti-Xa aktivnost: 105 IU/mg

Anti-IIa aktivnost : 3,1 IU/mg

Odnos aktivnosti anti-Xa/anti-IIa: 34

PRIMER 7

Depolimerizacija i prevodjenje u natrijumovu so (2,5 % vode):

U erlenmajer A stavi se 140 ml dihlorometana. Polako, uz mešanje, dodaje se 20 g (0,019 mola) benzil estra heparina (procenat esterifikacije 75 %, so benzetonijuma), dobijenog kao stoje opisano u primeru A. Sadržaj vode u reakcionoj smeši podešava se na 2,5 %. Posle potpunog rastvaranja dodaje se 3,5 ml (0,012 mola) 2-tert-butilimino-2-dietilamino-l,3-dimetilperhidro-l,2,3-diaza- fosforina. Meša se tokom 24 sata, na temperaturi blizu 20°C. Za to vreme se u erlenmajeru B pripremi rastvor od 60 g anhidrovanog natrijum acetata u 600 ml metanola. Kad se potpuno rastvori, rastvoru se doda 10 g celita Hyflo supercel. Na magnetnoj mešalici, reakciona smeša iz erlenmajera A se sipa za 1 minut i 30 sekundi u metanolni rastvor natrijum acetata, na temperaturi bliskoj 4°C. Posle 5 minuta mešanja, suspenzija se ostavi jedan sat da se slegne. Bistra gornja faza se odvadi i baci (400 ml). Na talog se dodaje 400 ml metanola i meša 5 minuta. Ostavi se da se taloži oko 30 minuta. Bistar deo supernatanta se odvadi i baci (400 ml). Suspendovani talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni kolač se zatim opere sa 200 ml metanola. Vlažna bledožuta čvrsta supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 50°C. Posle 18 sati sušenja dobija se 7,78 g sirove natrijumove soli depolimerizovanog heparina u celitu (10 g). Dobijeni prinos je 99,6 %.

Saponifikacija:

U erlenmajer od 50 ml stavljaju se prethodno dobijena 7,78 g (0,0119 mola) sirove natrijumove soli depolimerizovanog heparina u celitu (10 g), i 79 ml vode. Suspenzija se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3 i opere 2 puta sa po 15 ml vode. Dobijeni filtrat se prenese u erlenmajer od 150 ml. Na magnetnoj mešalici, dodaje se 1,3 ml (0,012 mola) 30% kaustične sode, na temperaturi bliskoj 4°C. Posle dodavanja, smeša se meša 2 sata. Rastvor se neutrališe dodavanjem 1N HC1 i dodaje se 10 g natrijum hlorida. Reakcionoj smeši se dodaje 60 ml metanola. Posle 15 minuta mešanja, dodaje se 190 ml metanola, a zatim se meša još jedan sat. Tada se mešanje prekida i suspenzija ostavi da se slegne tokom 3/4 sata, na temperaturi bliskoj 4°C. Supernatant se zatim odvadi i baci (180 ml). Na staložen precipitat se dodaje 180 ml metanola i meša 5 minuta. Ostavi se da se slegne tokom oko 20 minuta. Supernatant se ukloni i baci (180 ml). Na staložen precipitat nalije se 180 ml metanola i meša 5 minuta. Suspendovani talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni kolač se zatim opere 2 puta sa po 50 ml metanola. Vlažna supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 50°C. Posle 18 sati sušenja dobija se 5,87 g sirovog depolimerizovanog heparina (natrijumova so). Dobijeni prinos je 82 %.

Prečišćavanje:

U erlenmajer od 100 ml stavlja se 5,87 g prethodno dobijenog sirovog depolimerizovanog heparina i 59 ml destilovane vode. Smeša se dovede do 40°C, uz mešanje na magnetnoj mešalici. Dodavanjem 1N natrijum hidroksida pH se dovede na 9,7±0,1. Reakciona smeša se profiltruje kroz 0,45 um membranu i dodaje 0,34 ml 30% vodenog rastvora vodonik peroksida. Posle oko 2 sata mešanja, na temperaturi bliskoj 20°C, smeša se neutrališe dodavanjem 1N HC1, a zatim se dodaje 7 g natrijum hlorida. Rastvor se zatim profiltruje kroz 0,45 um membranu kroz koju se propusti i 49 ml metanola, na temperaturi od 10°C. Rastvor se zatim dovede do 20°C i meša 15 minuta. Zatim se dodaje 126 ml metanola i meša još jedan sat. Mešanje se prekida i ostavi da se suspenzija slegne tokom 20 minuta. Supernatant se zatim odvadi i baci (105 ml). Na staloženi precipitat dodaje se 105 ml metanola i meša 5 minuta. Ostavi se da se taloži oko 25 minuta. Supernatant se odvadi i baci (110 ml).. Suspendovani talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni beli kolač se zatim opere sa 50 ml metanola. Vlažna supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 55°C. Posle 18 sati sušenja dobija se 5,21 g čistog depolimerizovanog heparina (natrijumova so). Dobijeni prinos je 89 %.

Karakteristike tako dobijenog depolimerizovanog heparina su sledeće:

Srednja molekulska masa 3550 daltona

Anti-Xa aktivnost: 99 IU/mg

Anti-IIa aktivnost: 13,4 IU/mg

Odnos aktivnosti anti-Xa/anti-IIa aktivnost: 7,4

PRIMER 8

Depolimerizacija i prevodjenje u natrijumovu so ( 0, 5 ekvivalenata baze) :

U erlenmajer A stavi se 140 ml dihlorometana. Polako, uz mešanje, dodaje se 20 g (0,019 mola) benzil estra heparina (procenat esterifikacije 75 %, so benzetonijuma), dobijenog kao što je opisano u primeru A. Posle potpunog rastvaranja, na temperaturi bliskoj 30°C, i vraćanja na temperaturu oko 20°C, dodaje se 1,75 ml (0,006 mola) 2-tert-butilimino-2-dietilamino-l,3-dimetilperhidro-l,2,3-diaza- fosforina. Meša se tokom 24 sata, na temperaturi bliskoj 20°C. Za to vreme se u erlenmajeru B pripremi rastvor od 60 g anhidrovanog natrijum acetata u 600 ml metanola.. Uz mešanje na magnetnoj mešalici, reakciona smeša iz erlenmajera A se sipa u metanolni rastvor natrijum acetata, na temperaturi bliskoj 4°C. Posle 1 sata mešanja, suspenzija se ostavi 2 sata da se slegne. Bistra gornja faza se odvadi i baci (420 ml). Na talog se dodaje 420 ml metanola i meša 30 minuta. Ostavi se da se taloži oko 18 sati. Bistar deo supernatanta se odvadi i baci (400 ml). Na staloženi precipitat dodaje se 400 ml metanola i meša 30 minuta. Supernatant se odvadi i baci (400 ml) Suspendovani talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni kolač se zatim opere 2 puta sa po 100 ml metanola. Vlažna bledožuta čvrsta supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 60°C. Posle sušenja, dobija se 5,7 g sirove natrijumove soli depolimerizovanog heparina. Dobijeni prinos je 73 %.

Saponifikacija:

U erlenmajer od 100 ml stavljaju se prethodno dobijena 5,7 g (0,0086 mola) sirove natrijumove soli depolimerizovanog heparina i 53 ml vode. Na magnetnoj mešalici, dodaje se 0,93 ml (0,009 mola) 30% kaustične sode, na temperaturi bliskoj 4°C. Posle dodavanja, smeša se meša 2 sata. Rastvor se neutrališe dodavanjem 1N HC1 i dodaje se 6 g natrijum hlorida. Reakcionoj smeši se dodaje 42 ml metanola. Posle 15 minuta mešanja, dodaje se 108 ml metanola, a zatim se meša još 30 minuta. Tada se mešanje prekida i suspenzija ostavi da se slegne tokom 30 minuta, na temperaturi bliskoj 4°C. Supernatant se zatim odvadi i baci (180 ml). Na staloženi precipitat se dodaje 180 ml metanola i meša 5 minuta. Ostavi se da se slegne tokom oko 30 minuta. Supernatant se odvadi i baci (170 ml). Na staloženi precipitat nalije se 170 ml metanola i meša 30 minuta. Suspendovani talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni kolač se zatim opere 2 puta sa po 30 ml metanola. Vlažna supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom, na temperaturi bliskoj 60°C. Posle sušenja dobija se 3,5 g sirovog depolimerizovanog heparina (natrijumova so). Dobijeni prinos je 67,4 %.

Prečišćavanje:

U erlenmajer od 100 ml stavlja se 3,5 g prethodno dobijenog sirovog depolimerizovanog heparina i 35 ml destilovane vode. Smeša se dovede do 40°C, uz mešanje na magnetnoj mešalici. Dodavanjem 1N natrijum hidroksida pH se dovede na 9,6±0,1. Reakciona smeša se profiltruje kroz 0,45 um membranu i dodaje se 0,18 ml 30% vodenog rastvora vodonik peroksida. Posle oko 2 sata mešanja, na temperaturi bliskoj 20°C, smeša se neutrališe dodavanjem 1N HC1, a zatim se dodaje 3,6 g natrijum hlorida. Rastvor se zatim profiltruje kroz 0,45 um membranu kroz koju se propusti i 27 ml metanola, na temperaturi bliskoj 10°C. Rastvor se zatim dovede na 20°C i meša 15 minuta. Zatim se dodaje 65 ml

■ metanola i meša 30 minuta. Mešanje se prekida i ostavi da se suspenzija slegne tokom 30 minuta. Supernatant se zatim odvadi i baci (80 ml). Na staloženi precipitat dodaje se 80 ml metanola i meša 30 minuta. Ostavi se da se taloži oko 30 minuta. Supernatant se odvadi i baci (70 ml). Na staloženi sediment dodaje se 70 ml metanola i meša 30 minuta. Suspendovani talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni beli kolač se zatim opere 2 puta sa po 30 ml metanola. Vlažna supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom, na

temperaturi bliskoj 60°C. Posle sušenja dobija se 2,8 g čistog depolimerizovanog heparina (natrijumova so). Dobijeni prinos je 80 %.

Karakteristike tako dobijenog depolimerizovanog heparina su sledeće:

Srednja molekulska masa 2900 daltona

Anti-Xa aktivnost : 146 IU/mg

Anti-IIa aktivnost: 5,1 IU/mg

Odnos aktivnosti anti-Xa/anti-IIa: 28,6

PRIMER 9

Depolimerizacija i prevodjenje unatrijumovuso ( 0, 6 ekvivalenata baze) :

U trogrli balon A stavi se 280 ml dihlorometana. Polako, uz mešanje, dodaje se 40 g (0,024 mola) benzil estra heparina (procenat esterifikacije 75 %, so benzetonijuma), dobijenog kao što je opisano u primeru A. Posle potpunog rastvaranja, na temperaturi bliskoj 30°C, i vraćanja na temperaturu oko 20°C, dodaje se 4,2 ml (0,014 mola) 2-tert-butilimino-2-dietilamino-l,3-dimetilperhidro-l,2,3-diaza- fosforina. Meša se tokom 24 sata, na temperaturi blizu 20°C. Za to vreme se u erlenmajeru B pripremi rastvor od 60 g anhidrovanog natrijum acetata u 600 ml metanola.. Uz mešanje na magnetnoj mešalici, polovina reakcione smeše iz suda A se ulije u metanolni rastvor natrijum acetata, na temperaturi bliskoj 4°C. Posle 1 sata mešanja, suspenzija se ostavi da se slegne. Bistra gornja faza se odvadi i baci (310 ml). Na talog se dodaje 310 ml metanola i meša 1 sat. Ostavi se da se taloži oko 18 sati. Bistar deo supernatanta se odvadi i baci (400 ml). Na staloženi precipitat dodaje se 400 ml metanola i meša 1 sat.. Supernatant se odvadi i baci (300 ml) Suspendovani talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni kolač se zatim opere 2 puta sa po 100 ml metanola. Vlažna bledožuta čvrsta supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom, na temperaturi bliskoj 60°C. Posle sušenja, dobija se 6 g sirove natrijumove soli depolimerizovanog heparina. Dobijeni prinos je 77 %.

Saponifikacija:

U erlenmajer od 250 ml stavljaju se prethodno dobijena 6 g (0,0091 mola) sirove natrijumove soli depolimerizovanog heparina i 56 ml vode. Na magnetnoj mešalici, dodaje se 1 ml (0,010 mola) 30% kaustične sode, na temperaturi bliskoj 4°C. Posle dodavanja, smeša se meša 2 sata. Rastvor se neutrališe dodavanjem 1N HC1 i dodaje se 6,4 g natrijum hlorida. Reakcionoj smeši se dodaje 45 ml metanola. Posle 15 minuta mešanja, dodaje se 115 ml metanola, a zatim se meša još 30 minuta. Tada se mešanje prekida i suspenzija ostavi da se slegne tokom 30 minuta, na temperaturi bliskoj 4°C. Supernatant se zatim odvadi i baci (170 ml). Na staloženi precipitat se dodaje 170 ml metanola i meša 30 minuta. Ostavi se da se slegne tokom oko 30 minuta. Supernatant se odvadi i baci (140 ml). Na staloženi precipitat nalije se 140 ml metanola i meša 30 minuta. Suspendovani talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni kolač se zatim opere 2 puta sa po 30 ml metanola. Vlažna supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom, na temperaturi bliskoj 60°C. Posle sušenja dobija se 3,6 g sirovog depolimerizovanog heparina (natrijumova so). Dobijeni prinos je 65,3%.

Prečišćavanje:

U erlenmajer od 100 ml stavlja se 3,5 g prethodno dobijenog sirovog depolimerizovanog heparina i 35 ml destilovane vode. Smeša se dovede do 40°C, uz mešanje na magnetnoj mešalici. Dodavanjem 1N natrijum hidroksida pH se dovede na 9,6±0,1. Reakciona smeša se profiltruje kroz 0,45 um membranu i dodaje se 0,18 ml 30% vodenog rastvora vodonik peroksida. Posle oko 2 sata mešanja, na temperaturi bliskoj 20°C, smeša se neutrališe dodavanjem 1N HC1, a zatim se dodaje 3,5 g natrijum hlorida. Rastvor se zatim profiltruje kroz 0,45 um membranu kroz koju se propusti i 25 ml metanola, na temperaturi bliskoj 10°C. Rastvor se zatim dovede na 20°C i meša 15 minuta. Zatim se dodaje 63 ml metanola i meša 30 minuta. Mešanje se prekida i ostavi da se suspenzija slegne tokom 30 minuta. Supernatant se zatim odvadi i baci (70 ml). Na staloženi precipitat dodaje se 70 ml metanola i meša 30 minuta. Ostavi se da se taloži nekoliko minuta. Suspendovani talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni beli kolač se zatim opere 2 puta sa po 30 ml metanola. Vlažna supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom, na temperaturi bliskoj 60°C. Posle sušenja dobija se 2,5 g čistog depolimerizovanog heparina (natrijumova so). Dobijeni prinos je 71,4 %.

Karakteristike tako dobijenog depolimerizovanog heparina su sledeće:

Srednja molekulska masa 2600 daltona

Anti-Xa aktivnost: 150,5 IU/mg

Anti-IIa aktivnost: 3,2 IU/mg

Odnos aktivnosti anti-Xa/anti-IIa: 47

PRIMER 10

Depolimerizacija i prevodjenje u natrijumovu so ( 0, 8 ekvivalenata baze) :

U erlenmajer A stavi se 70 ml dihlorometana. Polako, uz mešanje, dodaje se 10 g (0,006 mola) benzil estra heparina (procenat esterifikacije 75 %, so benzetonijuma), dobijenog kao što je opisano u primeru A. Posle potpunog rastvaranja na temperaturi bliskoj 30°C i vraćanja na temperaturu blisku 20°C, dodaje se 1,38 ml (0,004 mola) 2-tert-butilimino-2-dietilamino-l,3-dimetilperhidro-l,2,3-diaza- fosforina. Meša se tokom 24 sata, na temperaturi bliskoj 20°C. Za to vreme se u erlenmajeru B pripremi rastvor od 30 g anhidrovanog natrijum acetata u 300 ml metanola. Na magnetnoj mešalici, reakciona smeša iz erlenmajera A se sipa za 1 minut i 15 sekundi u metanolni rastvor natrijum acetata, na temperaturi bliskoj 4°C. Posle 5 minuta mešanja, suspenzija se ostavi jedan sat da se slegne. Bistra gornja faza se odvadi i baci (190 ml). Na talog se dodaje 190 ml metanola i meša 5 minuta. Ostavi se da se taloži oko 30 minuta . Supernatant se odvadi i baci (190 ml). Na staloženi precipitat dodaje se 190 ml metanola i meša 30 minuta. Supernatant se odvadi i baci (190 ml). Suspendovani talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni kolač se zatim opere sa 150 ml metanola. Vlažna bledožuta čvrsta supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 40°C. Posle 18 sati sušenja dobija se 3,05 g sirove natrijumove soli depolimerizovanog heparina u celitu (10 g). Dobijeni prinos je 80%.

Saponifikacija:

U erlenmajer od 100 ml stavljaju se prethodno dobijena 3,05 g (0,0048 mola) sirove natrijumove soli depolimerizovanog heparina u celitu (10 g), i 21 ml vode. Suspenzija se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3 i opere 2 puta sa po 6 ml vode. Dobijeni filtrat se prenese u erlenmajer od 150 ml. Na magnetnoj mešalici, dodaje se 0,6 ml (0,006mola) 30% kaustične sode, na temperaturi bliskoj 4°C. Posle dodavanja, smeša se meša 2 sata. Rastvor se neutrališe dodavanjem 1N HC1 i dodaje se 4 g natrijum hlorida. Reakcionoj smeši se dodaje 28 ml metanola. Posle 15 minuta mešanja, dodaje se 72 ml metanola, a zatim se meša još jedan sat. Tada se mešanje prekida i suspenzija ostavi da se slegne tokom 30 minuta, na temperaturi bliskoj 4°C. Supernatant se zatim odvadi i baci (80 ml). Na staloženi precipitat se dodaje 80 ml metanola i meša 5 minuta.. Ostavi se da se slegne oko 30 minuta. Supernatant se zatim odvadi i baci (80 ml). Na staloženi precipitat dodaje se 80 ml metanola i meša 30 minuta. Suspendovani talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni kolač se zatim opere sa 50 ml metanola. Mokra supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 40°C. Posle sušenja dobija se 1,6 g sirovog depolimerizovanog heparina (natrijumova so). Dobijeni prinos je 57 %.

Prečišćavanje:

U erlenmajer od 50 ml stavlja se 1,6 g prethodno dobijenog sirovog depolimerizovanog heparina i 16 ml destilovane vode. Smeša se dovede do 40°C, uz mešanje na magnetnoj mešalici. Dodavanjem 1N natrijum hidroksida pH se dovede na 9,6±0,1. Reakciona smeša se profiltruje kroz 0,45 um membranu i dodaje 0,08 ml 30% vodenog rastvora vodonik peroksida. Posle oko 2 sata mešanja, na temperaturi bliskoj 20°C, smeša se neutrališe dodavanjem 1N HC1, a zatim se dodaje 2 g natrijum hlorida. Rastvor se zatim profiltruje kroz 0,45 pm membranu kroz koju se propusti i 14 ml metanola, na temperaturi bliskoj 10°C. Rastvor se zatim dovede do 20°C i meša 15 minuta. Zatim se dodaje 36 ml metanola i meša još jedan sat. Mešanje se prekida i ostavi da se suspenzija slegne oko 30 minuta. Supernatant se zatim odvadi i baci (50 ml). Na staloženi precipitat dodaje se 50 ml metanola i meša 5 minuta. Ostavi se da se taloži oko 30minuta. Supernatant se odvadi i baci (50 ml).. Suspendovani talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Vlažna supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 40°C. Posle sušenja dobija se 1,25 g čistog depolimerizovanog heparina (natrijumova so). Dobijeni prinos je 78%.

Karakteristike tako dobijenog depolimerizovanog heparina su sledeće:

Srednja molekulska masa 2400 daltona

Anti-Xa aktivnost: 154,3 IU/mg

Anti-IIa aktivnost: 1,6 IU/mg

Odnos aktivnosti anti-Xa/anti-IIa: 96,4

PRIMER 11

Depolimerizacija i prevodjenje u natrijumovuso:

U erlenmajer A stavi se 140 ml dihlorometana. Polako, uz mešanje, dodaje se 20 g (0,019 mola) benzil estra heparina (procenat esterifikacije 75 %, so benzetonijuma), dobijenog kao što je opisano u primeru A Posle potpunog rastvaranja na temperaturi bliskoj 40°C i vraćanja na temperaturu bliski 20°C, dodaje se 3,5 ml (0,011 mola) 2-tert-butilimino-2-dietilamino-l,3-dimetilperhidro-l,2,3-diaza- fosforina. Meša se tokom 24 sata, na temperaturi blizu 20°C. Za to vreme se u erlenmajeru B pripremi rastvor od 60 g anhidrovanog natrijum acetata u 600 ml metanola. Kad se potpuno rastvori, rastvoru se doda 10 g celita Hyflo supercel. Na magnetnoj mešalici, reakciona smeša iz erlenmajera A se sipa za 1 minut i 30 sekundi u metanolni rastvor natrijum acetata, na temperaturi bliskoj 4°C. Posle 5 minuta mešanja, suspenzija se ostavi 30 minuta da se slegne. Bistra gornja faza se odvadi i baci (400 ml). Na talog se dodaje 400 ml metanola i meša 5 minuta. Ostavi se da se taloži oko 1 sat i 20 minuta . Supernatant se odvadi i baci (250 ml). Na staloženi precipitat dodaje se 250 ml metanola i meša 5 minuta. Suspendovan talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni kolač se zatim opere sa 200 ml metanola. Vlažna bledožuta čvrsta supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 40°C. Posle sušenja dobija se 5,39 g sirove natrijumove soli depolimerizovanog heparina u celitu (10 g). Dobijeni prinos je 69 %.

Saponifikacija:

U erlenmajer od 50 ml stavljaju se prethodno dobijenih 5 g (0,0076 mola) sirove natrijumove soli depolimerizovanog heparina u celitu (10 g), i 35 ml vode. Suspenzija se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3 i opere 2 puta sa po 10 ml vode. Dobijeni filtrat se prenese u erlenmajer od 250 ml. Na magnetnoj mešalici, dodaje se 1 ml (0,01 mol) 30% kaustične sode, na temperaturi bliskoj 4°C. Posle dodavanja, smeša se meša 2 sata. Rastvor se neutrališe dodavanjem 1N HC1 i dodaje se 6 g natrijum hlorida. Reakcionoj smeši se dodaje 42 ml metanola. Posle 15 minuta mešanja, dodaje se 104 ml metanola i meša 15 minuta . Tada se mešanje prekida i suspenzija ostavi da se slegne tokom jednog sata, na temperaturi bliskoj 4°C. Supernatant se zatim odvadi i baci (140 ml). Na staloženi precipitat se dodaje 140 ml metanola i meša 5 minuta. Ostavi se da se slegne oko 45 minuta. Supernatant se odvadi i baci

(160 ml). Na staloženi precipitat nalije se 160 ml metanola i meša oko 5 minuta. Suspendovani talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni kolač se zatim opere sa 100 ml metanola. Vlažna supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 40°C. Posle 48 sati sušenja dobija se 2,7 g sirovog depolimerizovanog heparina (natrijumova so). Dobijeni prinos je 59%.

Prečišćavanje:

U erlenmajer od 50 ml stavlja se 2,6 g prethodno dobijenog sirovog depolimerizovanog heparina i 25ml destilovane vode. Smeša se dovede do 40°C, uz mešanje na magnetnoj mešalici. Dodavanjem 1N natrijum hidroksida pH se dovede na 9,7±0,1. Reakciona smeša se profiltruje kroz 0,45 pm membranu i dodaje 0,15 ml 30% vodenog rastvora vodonik peroksida. Posle oko 2 sata mešanja, na temperaturi bliskoj 20°C, smeša se neutrališe dodavanjem 1N HC1, a zatim se dodaje 3 g natrijum hlorida. Rastvor se zatim profiltruje kroz 0,45 pm membranu kroz koju se propusti i 21 ml metanola, na temperaturi bliskoj 10°C. Rastvor se zatim dovede na 20°C i meša 15 minuta . Zatim se dodaje 54 ml metanola i meša još jedan sat. Mešanje se prekida i ostavi da se suspenzija slegne 20 minuta. Supernatant se zatim odvadi i baci (50 ml). Na staloženi precipitat dodaje se 50 ml metanola i meša 5 minuta. Ostavi se da se taloži oko 20 minuta. Supernatant se odvadi i baci (50 ml).. Suspendovani talog se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni beli kolač se zatim opere sa 50 ml metanola. Vlažna supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 40°C. Posle 18 sati sušenja dobija se 2,35 g čistog depolimerizovanog heparina (natrijumova so). Dobijeni prinos je 90 %.

Karakteristike tako dobijenog depolimerizovanog heparina su sledeće:

Srednja molekulska masa 2400 daltona

Anti-Xa aktivnost: 167,5 IU/mg

Anti-IIa aktivnost: 1,1 IU/mg

Odnos aktivnosti anti-Xa/anti-IIa: 152

PRIMER12

Depolimerizacija i prevodjenje u natrijumovu so (0,05 % vode):

Ujedan erlenmajer stavi se 140 ml dihlorometana. Polako, uz mešanje, dodaje se 20 g (0,019 mola) benzil estra heparina (procenat esterifikacije 75 %, so benzetonijuma), dobijenog kao što je opisano u primeru A. Reakcionoj smeši se dodaje 20 g molekulskog sita 4 A, sadržaj vode se dovede na 0,05 % i polako meša 48h. Posle potpunog rastvaranja dodaje se 3,5 ml (0,012 mola) 2-tert-butilimino-2-dietilamino-l,3-dimetilperhidro-l,2,3-diaza- fosforina. Meša se tokom 24 sata, na temperaturi blizu 20°C. Za to vreme se u erlenmajeru B pripremi rastvor od 60 g anhidrovanog natrijum acetata u 600 ml metanola. Kad se potpuno rastvori, rastvoru se doda 10 g celita Hyflo supercel. Na magnetnoj mešalici, reakciona smeša iz erlenmajera A se sipa za oko 2 minuta u metanolni rastvor natrijum acetata, na temperaturi bliskoj 4°C. Posle 15 minuta mešanja, suspenzija se ostavi 1 sat i da se slegne. Bistra gornja faza se odvadi i baci (420 ml). Na talog se dodaje 420 ml metanola i meša 15 minuta. Ostavi se da se taloži oko 1 sat. Supernatant se odvadi i baci (450 ml). Na staloženi precipitat dodaje se 450 ml metanola i meša 15 minuta. Suspenzija se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni kolač se zatim opere sa 200 ml metanola. Vlažna bledožuta čvrsta supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 50°C. Posle 16 sati sušenja dobija se 5,36 g sirove natrijumove soli depolimerizovanog heparina u celitu (10 g). Dobijeni prinos je 68,6 %.

Saponifikacija:

U erlenmajer od 50 ml stavljaju se prethodno dobijenih 5,36 g (0,00817 mola) sirove natrijumove soli depolimerizovanog heparina u celitu (10 g), i 50 ml vode. Suspenzija se filtruje preko sinterovanog stakla 3 i opere 4 puta sa po 15 ml vode. Dobijeni filtrat se prenese u erlenmajer od 150 ml. Na magnetnoj mešalici, dodaje se 1,01 ml (0,0122 mola) 35% kaustične sode, na temperaturi bliskoj 4°C. Posle dodavanja, smeša se meša 3 sata. Rastvor se neutrališe dodavanjem 1N HC1 i dodaje se 11 g natrijum hlorida. Reakcionoj smeši se dodaje 77 ml metanola. Posle 15 minuta mešanja, dodaje se 200 ml metanola, a zatim se meša još

jedan sat. Tada se mešanje prekida i suspenzija ostavi da se slegne tokom 1 sata, na temperaturi bliskoj 4°C. Supernatant se zatim odvadi i baci (240 ml). Na staložen precipitat se dodaje 240 ml metanola i meša 10 minuta. Ostavi se da se slegne tokom oko 30 minuta. Supernatant se

ukloni i baci (225 ml). Na staložen precipitat nalije se 225 ml metanola i meša 10 minuta. Suspenzija se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 3. Dobijeni kolač se zatim opere 2 puta sa po 50 ml metanola. Vlažna supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 40°C. Posle 18 sati sušenja dobija se 2,65 g sirovog depolimerizovanog heparina (natrijumova so). Dobijeni prinos je 53,7 %.

Prečišćavanje:

U erlenmajer od 100 ml stavlja se 2,65 g prethodno dobijenog sirovog depolimerizovanog heparina i 26,5 ml destilovane vode. Smeša se dovede do 40°C, uz mešanje na magnetnoj mešalici. Dodavanjem 1N natrijum hidroksida pH se dovede na 9,7±0,1. Reakciona smeša se profiltruje kroz 0,45 pm membranu i dodaje 0,25 ml 30% vodenog rastvora vodonik peroksida. Posle oko 2 sata mešanja, na temperaturi bliskoj 20°C, smeša se neutrališe dodavanjem 1N HC1, a zatim se dodaje 3 g natrijum hlorida. Rastvor se zatim profiltruje kroz 0,45 pm membranu kroz koju se propusti i 21 ml metanola, na temperaturi bliskoj 10°C. Rastvor se zatim dovede na 20°C i meša 15 minuta. Zatim se dodaje 54 ml metanola i meša još jedan sat. Mešanje se prekida i ostavi da se suspenzija slegne oko

45 minuta. Supernatant se zatim odvadi i baci (46 ml). Na staloženi precipitat dodaje se 46 ml

metanola i meša 5 minuta. Ostavi se da se taloži oko 30 minuta. Supernatant se odvadi i baci (50 ml).. Talog se suspenduje u 50 ml metanola i suspenzija se zatim filtruje preko sinterovanog stakla 4. Dobijeni beli kolač se zatim opere 2 puta sa po 10 ml metanola. Vlažna supstancija se ocedi, a zatim osuši pod sniženim pritiskom (6 kPa), na temperaturi bliskoj 50°C. Posle 18 sati sušenja dobija se 2,363 g čistog depolimerizovanog heparina (natrijumova

so). Dobijeni prinos je 89,1 %.

; Karakteristike tako dobijenog depolimerizovanog heparina su sledeće:

Srednja molekulska masa 2500 daltona

Anti-Xa aktivnost: 192 IU/mg

Anti-IIa aktivnost: 1,3 IU/mg

Odnos aktivnosti anti-Xa/anti-IIa: 148

Claims

1)Smeše sulfatisanih oligosaharida opšte strukture polisaharida koji ulaze u sastav heparina i koje imaju sledeće karakteristike: imaju srednju molekulsku masu od 1500 do 3000 daltona, aktivnost anti-Xa od 120 do 200 IU/mg, aktivnost anti-IIa manju od 10 IU/mg, i odnos aktivnosti anti-Xa/anti-IIa veći od 30, sadrže 2 do 26 saharidnih jedinica imaju jednu jedinicu 4,5-nezasićene uronske kiseline 2-O-sulfata na jednom od svojih krajeva, - sadrže heksasaharid Alla-IIs-Is formule:- i nalaze se u obliku soli alkalnog ili zemnoalkalnog metala.

2) Smeša oligosaharida prema zahtevu 1, koja se odlikuje time što se so alkalnog ili zemnoalkalnog metala bira od soli natrijuma, kalijuma, kalcijuma i magnezijuma.

3) Smeša oligosaharida prema zahtevima 1 ili 2 koja se odlikuje time što sadrži frakciju heksasaharida koja čini 15 do 25 % smeše oligosaharida.

4)Smeša oligosaharida prema zahtevu 3 koja se odlikuje time što sadrži 8 do 15 % heksasaharida Alla-IIs-Is u frakciji heksasaharida smeše oligosaharida.

5) Smeša oligosaharida prema bilo kom od zahteva 1 do 4, koja se odlikuje time što pokazuje anti-Xa aktivnost izmedju 150 IU/mg i 200 IU/mg.

6) Smeša oligosaharida prema bilo kom od zahteva 1 do 5, koja se odlikuje time što je anti-IIa aktivnost manja od 5 IU/mg, uglavnom izmedju 0,5 to 3,5 IU/mg.

7) Smeša oligosaharida prema bilo kom od zahteva 1 do 6, koja se odlikuje time što ima odnos aktivnosti anti-Xa/ anti-IIa veći od 50 i, češće ,više od 100.

8) Smeša oligosaharida prema bilo kom od zahteva 1 do 7, koja se odlikuje time što ima srednju molekulsku masu izmedju 2000 i 3000 daltona, najčešće od 2400 do 2650 Da.

9) Smeša oligosaharida prema bilo kom od zahteva 1 do 8, koja se odlikuje time što ispoljava anti-Xa aktivnost izmedju 150 i 200 IU/mg, anti-IIa aktivnost izmedju 0,5 i 3,5 IU/mg i srednju molekulsku masu izmedju 2400 i 2650 Da.

10) Postupak dobijanja smeša oligosaharida prema bilo kom zahtevu 1 do 9, u kome se kvaternerna amonjumova so benzil estra heparina depolimerizuje u organskoj sredini pomoću jake organske baze, poželjno pKa veće od 20, i koji se karakteriše time što se korišćena organska baza sastoji od familije fosfazena, a u rastvoru dihlorometana, sadrži procenat vode manji od 0,6 %.

11) Postupak dobijanja prema zahtevu 10 smeša oligosaharida iz zahteva 1, koji se odlikuje time što je sadržaj vode manji od 0,3 %, a poželjno manji i od 0,2 %.

12) Postupak dobijanja prema zahtevu 10 ili 11, koji se odlikuje time što je kvaternerna amonijumova so benzil estra heparina so benzetonijuma, cetilpiridinijuma ili cetiltrimetil amonijuma.

13) Postupak dobijanja prema zahtevu 10 ili 11 koji se odlikuje time što su baze iz familije fosfazena, baze formule: u kojoj su radikaliR\to R7identični ili različiti i predstavljaju linearne ili razgranate alkil radikale sa 1 do 6 atoma ugljenika.

14) Postupak dobijanja prema zahtevu 10 ili 11 koji se odlikuje time što je molski odnos jaka baza/estar izmedju 0,2 i 5, najpoželjnije izmedju 0,6 i 2.

15) Postupak dobijanja oligosaharida prema bilo kom zahtevu od 1 do 9, počev od heparina, u kome se obavljaju sledeće operacije: h) Transalifikacija heparina natrijuma delovanjem benzetonijum hlorida, i) Esterifikacija benzetonijum heparinata delovanjem benzil hlorida, j) Transalifikacija dobijenog benzil estra i dobijanje kvaternerne amonijumove soli k) Depoiimerizacija kvaternerne amonijumove soli benzil estra heparina metodom definisanim u zahtevu 10 ili 11,

1) Transformacija kvaternerne amonijumove soli u so natrijuma m) Eventualna saponifikacija heparina delovanjem baze, kao što je natrijum hidroksid n) Eventualno prečišćavanje, naročito delovanjem nekog oksidujućeg agensa, kao što je oksigenisana voda

16) Metod prema zahtevu 15, koji se odlikuje time što se reakcija iz faze a) ostvaruje delovanjem benzetonijum hlorida u višku na natrijum heparin, na temperaturi u oblasti 15 do 25°C, sa molarnim odnosom so/natrijum heparin izmedju 3 i 4.

17) Postupak iz zahteva 15 koji se odlikuje time što se esterifikacija u fazi b) odvija u hlorisanom organskom rastvaraču, kao što su hloroform ili metilen hlorid, na temperaturi izmedju 25°C i 45°C, a najbolje izmedju 30 i 40°C, i estar, u obliku natrijumove soli, se povrati taloženjem pomoću 10 težinskih % natrijum acetata u alkoholu, kao što je metanol, u odnosu 1 do 1,2 zapremine alkohola na jednu zapreminu reakcione smeše.

18) Postupak iz zahteva 15, ili 17 koji se odlikuje time što je stepen esterifikacije kvaternerne amonijumove soli benzil estra heparina izmedju 50 i 100 %, najpoželjnije izmedju 70 i 90 %.

19) Postupak iz zahteva 15, 17 ili 18 koji se odlikuje time što se koriste 0,5 do 1,5 težinskih delova benzil hlorida na 1 težinski deo benzetonijumove soli heparina, pri vremenima reakcije izmedju 10 i 35 h.

20) Postupak prema zahtevu 15 koji se odlikuje time što se transalifikacija u fazi c) izvodi pomoću kvaternernog amonijum hlorida i to, najpoželjnije, pomoću benzetonijum hlorida,, cetilpiridinijum hlorida ili cetiltrimetil amonijum hlorida, u vodenoj sredini, na temperaturi izmedju 10 i 25°C .

21) Postupak prema zahtevu 20, koji se odlikuje time što je molski odnos kvaternerni amonijum hlorid/natrijumova so benzil estra heparina izmedju 2 i 3

22) Postupak prema zahtevu 15 koji se odlikuje time što se prevodjenje kvaternerne amonijum soli benzil estra depolimerizovanog heparina (faza e) u so natrijuma vrši tretiranjem reakcione smeše alkoholnim rastvorom natrijum acetata, najpoželjnije 10 % rastvorom natrijum acetata u metanolu (w/v), na temperaturi izmedju 15 i 25°C

23) Postupak prema zahtevu 15 koji se odlikuje time što se saponifikacija (faza f) vrši pomoću hidroksida alkalnog metala, kao što je natrijum hidroksid, kalijum hidroksid, hidroksid litijuma, u vodenoj sredini, na temperaturi izmedju 0 i 20°C, a najpoželjnije izmedju 0 i 10°C

24) Postupak prema zahtevu 23 koji se odlikuje time što se koristi 1 do 5 molskih ekvivalenata hidroksida alkalnog metala, najbolje 1 do 2 molska ekvivalenta natrijum hidroksida.

25) Postupak prema zahtevu 15 koji se odlikuje time što se prečišćavanje (faza g) vrši :pomoću vodonik peroksida, u vodenoj sredini, na temperaturi od 10 do 50°C, najpoželjnije izmedju 20 i 40°C

26) U svojstvu leka, oligosaharidi prema bilo kom zahtevu od 1 do 9.

27) U svojstvu leka sa antitrombotskom aktivnošću oligosaharidi prema bilo kom zahtevu od 1 do 9.

28) Lekovi iz zahteva 26 i 27 za prevenciju ili lečenje venskih i arterijskih tromboza, tromboze dubinskih vena, plućne embolije, nestabilne angine, infarkta miokarda, kardijalne ishemije, okluzivnih oboljenja perifernih arterija, atrijalne fibroze, proliferacije ćelija glatkih mišića, ateroskleroze i arterioskleoze, kancera modulisanjem angiogeneze i faktora rasta, i poremećaja u dijabetesu, kao što su dijabetične retinopatije i nefropatije

29) Farmaceutski preparati koji sadrže bar jedan lek kako je definisano u zahtevu 26 i jedan ili više farmaceutski inertnih vezivnih sredstava ili nosača ili aditiva

30) Farmaceutski preparati prema zahtevu 29 koji se odlikuju time što se nalaze u rastvorima koji se mogu injecirati subkutano ili intravenozno.

31) Farmaceutski preparati prema zahtevu 29 koje se odlikuju time što se nalaze u formulaciji za inhaliranje, namenjenoj pulmonarnom davanju.

32) Farmaceutski preparai prema zahtevu 29 koje se odlikuju time što se nalaze u formulaciji namenjenoj oralnom davanju.

33)Smeše polisaharida kao što su definisane bilo u kom zahtevu od 1 do 9 koje se mogu dobiti postupkom definisanim u zahtevu 15.