RS20050577A - PREPARATI I POSTUPCI ZA TRETIRANjE KANCERA KORIŠĆENjEM IGSF9 I LIV-1 - Google Patents

PREPARATI I POSTUPCI ZA TRETIRANjE KANCERA KORIŠĆENjEM IGSF9 I LIV-1

Info

Publication number
RS20050577A
RS20050577A YUP-2005/0577A YUP20050577A RS20050577A RS 20050577 A RS20050577 A RS 20050577A YU P20050577 A YUP20050577 A YU P20050577A RS 20050577 A RS20050577 A RS 20050577A
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
igsf9
liv
antibody
antigen
expression
Prior art date
Application number
YUP-2005/0577A
Other languages
English (en)
Inventor
Karen McLachlan
Scott Glaser
Robert J. Peach
Tony Rowe
Original Assignee
Biogen Idec Ma Inc.,
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen Idec Ma Inc., filed Critical Biogen Idec Ma Inc.,
Publication of RS20050577A publication Critical patent/RS20050577A/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1027—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Opisani su humani IGSF9 i LIV-1 polipeptidi, kao i DNK (RNK) koja kodira te polipeptide. Opisani polipeptidi i/ili polinukleotidi su posebno korisni u stvaranju antitela, kako modifikovanih, tako i nativnih, koja vezuju IGSF9 ili LIV-1. Takođe su opisani farmaceutski preparati i vakcine koje sadrže antitela, polipeptide i polinukleotide prema predmetnom pronalasku. Takođe, opisani su postupci za korišćenje takvih polipeptida za identifikaciju liganada, antagonista i agonista navedenih polipeptida. Konačno, opisani su postupci koji sadrže gore pomenute preparate za tretiranje, dijagnozu i/ili prognozu neoplastičnih poremećaja.

Description

PREPARATI I POSTUPCI ZA TRETIRANJE KANCERA
KORIŠĆENJEM IGSF9 I LIV-1
Oblast pronalaska
Predmetni pronalazak se odnosi na preparate, specifično na antitela i na antigen vezujuće fragmente IGSF9 i LIV - 1, kao i na postupke korišćenja navedenih preparata za detekciju i tretiranje neoplastične bolesti.
Stanje tehnike
Kancer je drugi vodeći uzrok smrti u SAD i odgovoran je za preko 1/5 ukupne smrtnosti. Kancerske ćelije su defmisane sa dve nasledne kakrakteristike: one i njihovo potomstvo (1) reprodukuju se uprkos normalnim inhibitornim mehanizmima i (2) invadiraju i koloniziraju teritorije koje su normalno rezervisane za druge ćelije. Nekontrolisano umnožavanje kancerskih ćelija dovodi do stvaranja tumora ili neoplazme.
Ekspresija jedinstvenih komponenti normalnih ćelijskih proizvoda od strane kancerskih ćelija predstavlja fundamentalnu hipotezu na kojoj se zasniva tumorska imunologija. Značajan i ubedljiv dokaz sada postoji, koji jasno podržava koncept daje neoplastična transformacija udružena sa antigenim promenama na površinama ćelija sisara (Reisfeld, R.A i Cheresh, D.A., Ad. Immunol. 40: 323 - 377, 1987). U cilju definisanja velike grupe ćelijskih površinskih antigena, koji izgleda imaju makar povišenu ekspresiju na humanim tumorskim ćelijama, korišćeno je mnoštvo strategija serološkog ispitivanja (Old, L. J., Cancer Res. 41: 361 - 375, 1981; Rosenborg, S. A., urednik, Serologic Analvsis of Human Cancer Antigens., Academic Press, Nevv York, 1980). Dva takva antigena su IGSF9 i LIV - 1.
Članovi superporodice imunoglobulinskih proteina, koji su okarakterisani prisustvom domena sličnih imunoglobulinu. posreduju kako u homofilnom tako i heterofilnom vezivanju (Doudney, et al., Genomics 79: 663 - 670, 2002). Imunoglobulinski proteini često posreduju u prevođenju signala između ekstracelularnog Uganda i kaskada sekundarnih glasnika unutar ćelije. Kao takvi, mnogi imunoglobulinski proteini poseduju transmembranski domen i citoplazmatsku karboksi - terminalnu sekvencu koja interaguje sa intracelularnom sredinom. Na primer, imunoglobulinski proteini sa citoplazmatskim receptorskim tirozin - kinaza ili fosfataza domenima ispoljavaju svoj intracelularni uticaj na prevođenje signala direktno putem svoje enzimske aktivnosti dok drugi deluju putem udruživanja i aktiviranja intracelularnih kinaza. Aktivacije tirozin - kinazasrcporodice, putem vezivanja imunoglobulinskog Uganda dovodi do efekata na dinamiku ćelijskog citoskeleta, čime se obezbeđuje važna veza između ćelijske athezije i promena oblika ćelije udruženog sa morfogenetskim pokretima tokom embrionskog razvoja.
IGSF9 (član 9 imunoglobulinske superporodice) je novi član NCAM potklase imunoglobulinske suprerporodice, koji je identifikovan tokom napora na pozicionom kloniranju u cilju izolacie mišijegLpgena. (Doudnev, et al., Genomics 79: 663 - 670, 2002). Homolog IGSF9 je protein Turtle izDrosophila melanogaster,koji je ukjlučen u neuralnom razvoju. Dodatno, IGSF9 možda predstavlja važnog kandidata koji je ukjlučen u stvaranju i invazivnosti humanih tumora. Tumori sa duplikacijama lq22 - lq23 regiona hromozomskog regiona su često primećeni. i štaviše regulacija na gore ekaspresije imunoglobulinskih proteina je čest nalaz u humanim tumorima i može da doprinese kako disregulaciji ćelijske funkcije, tako i neinvazivnosti ćelijske plazme.
LIV - 1 je gen stimulisan od strane estrogena, koji je udružen sa metastatskim kancerom dojke. Istraživanje strukture LIV - 1 je otkrilo da je to jedan protein bogat histidinom, sa potencijalom da se vezuje i/ili transportuje Zn<2+>jone. Zn<2+>se aktivno transportuju kroz biološke membrane a njihovo preuzimanje i refluks su strogo regulisani, jer su ovi joni istovremeno i neophodni i toksični za ćelije. (Tavlor, K. M., IUBMB Life 49: 249 - 253, 2000).
LIV - 1 je jedini do sada poznati hormonski regulisani protein koji vezuje Zn<2+>. Ostaje da se odredi da li i drugi proteini koji vezuju Zn<2>~ imaju ulogu u metastatskim karcinomima. Međutim, određeni proteini koji vezuju Zn<2+>u različitim tkivima sa povezasni sa smrću ćelije i sa neuronskim oboljenjem.
Kratak opis predmetnog pronalaska
Predmetni pronalazak se generalno odnosi, između ostalog, na preparate koji mogu da se upotrebe u detekciji i tretmanu kancera i obezbeđuje postupak za detekciju i tretman kancera. Dole opisani eksperimentalni rezultati pokazuju da su IGSF9 i LIV - 1 diferencijalno eksprimirani u različitim neoplastičnim ćelijama. Ova diferencijalna ekspresija omogućava da IGSF9 i LIV - 1 budu mete za detekciju i tretman različitih neoplazmi, uključujući kancer dojke, debelog creva, jajnika, pluća, prostate.
Predmetni pronalazak se odnosi na izolovano antitelo ili antigen vezujući fragment ovog antitela koje se sparuje ili sa IGSF9 ili sa LIV - 1 ili sa fragmentima navedenih proteina. Posebno, izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment može da se veže sa IGSF9 između aminokiselina od 21 do 718, kao što je predstavljeno na Slici lb (sekvenca čiji je ID broj 2), između aminokiselina 21 i 734, sekvenca čiji je ID broj 8, sa aminokiselinama koje su predstavljene u sekvencama čiji su ID brojevi 22 - 27; ili sa LIV- 1 između mainokiselina 28 do 317, 373 do 417, 674 do 678 iuli 742 do 749. kao što je predstavljeno na Slici 22b (sekvenca čiji je ID broj 29).
Predmetni pronalazak se takođe odnosi na izolovano anti - IGSF9 ili anti - LIV - 1 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, pri čemu antitelo ili njegov antigen vezujući fragment obuhvata antitelo sa deletiranim domenom. Antitelo sa deletiranim domenom ili njegov antigen vezujući fragment mogu dalje da sadrže cititoksično sredstvo. U poželjnom rešenju citotoksično sredstvo je radionuklid.
Anti - IGSF9 ili anti - LIV - 1 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, prema predmetnom pronalasku, takođe mogu biti humanizovana ili primatizovana.
Predmetni pronalazak se takođe odnosi na antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji se vezuje sa IGSF9 ili LIV - 1-, pri čemu antitelo ili njegov antigen vezujući fragment inhibira jednu ili više funkcija koje su udružene sa IGSF9 ili LIV - 1.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na preparate koji sadrže antitelo ili njegov natigen vezujući fragment koji se vezuje sa 1GSF9 ili LIV - 1.
U poželjnom rešenju. postupak za tretitranje neoplastičnog poremećaja, obuhvata anti - IGSF9 antitelo sa deletiranim domenom ili anti - LIV - 1 sa deltiranim domenom ili njihov antigen vezujući fragment kovačlentno povezano sa jednim ili sa više bi funkcionalnih helatora. Bifunkcionalni helator je izabran iz grupe koju čine MX -
DTP A i CHX - DTPA.
Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupak tretiranja sisara koji ima neoplastični poremećaj, a obuhvata korak primene terapeutski efikasne količine antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, koje se vezuje sa IGSF9 ili LIV - 1. Navedeni postupak može dalje da obuhvata primenu terapijski efikasne količine barem jednog terapeutskog sredstva kod navedenog sisara; pri čemu navedeno hemoterapeutsko sredstvo i navedeno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment mogu da se primene u bilo kom međusobnom redosledu ili zajedno. U poželjnom rešenju, anti - IGSF9 ili anti - LIV - 1 ili antigen vezujući fragmenti se primenjuju kod sisara kome je potreban tretman. Anti - IGSF9 i anti - LIV - 1 ili antigen vezujući fragmenti mogu da se modifikuju tako da im nedostaje Ch2 domen i/ili mogu biti humanizovana. a mogu i dalje da sadrže citotoksično sredstvo.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na vakcinu za tretiranje kancera, koja sadrži IGSF9 ili LIV - 1 polipeptid ili njihov fragment i neki fiziolioški prihvatljivi nosilac. U poželjnom rešenju, antikancerska vakcina sadrži aminokiseline 1 do 1163 ili aminokiseline 21 do 718 IGSF9, kao što je predstavljeno na Slici lb (sekvenca čiji je ID broj 2); ili aminokiseline 1 do 749, aminokiseline 28 do 317 ili aminokiseline 373 do 417 LIV - 1, kao što je predstavljeno na Slici 22b (sekvenca čiji je ID broj 29). Vakcina može dalje da sadrži IGSF9 ili LIV - 1 peptide. koji su fuzionisani sa T helper peptidom. Dodatno, vakcina može dalje da sadrži fiziološki prihvatljiv nosilac kao što je adjuvans ili neko imunostimulatorno sredstvo. U još poželjnijem rešenju vakcina dalje sadrži adjuvans PROVAX™. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na postupak upotrebe navedene vakcine za indukciju imunog odgovora kod pacijenta kome je potreban tretman ili sprečavanje nastanka kancera.
Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupak detekcije prekomerne ekspresije IGSF9 ili LIV - 1 ili njihovih fragmenata, što obuhvata: a. obezbeđivanje uzorka porcklom od osobe kod koje je potrebno dijagnostikovati kavncer; b. detekciju IGSF9 ili LIV - 1 ili njihovog fragmenta u navedenom uzorku; c. detekciju ekspresije IGSF9 ili LIV - 1 ili njihovog fragmenta u kontrolnom uzorku iz normalne osobe ili iz normalnog tkiva osobe kod koje se postavlja dijagnoza: d. upoređivanje nivoa ekspresije IGSF9 ili LIV - 1 sa nivoom ekspresije dobijenom u kontrolnom uzorku, pri čemu je navedeno poređenje rezultuje u dijagnozi kancera.
U jednom rešenju prema predmetnom pronalasku prekomerna ekspresija se detektuje amplifikacijom nukleinske kiseline, hibridizacijom ili upotrebom antitela za IGSF9 ili LIV - 1 ili za njihove antigen vezujuće fragmente. U drugom rešenju, IGSF9 fragment sadrži egzone 5-10.
Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupak određivanja prognoze za osobu koja prima tretman za kancer, koji obuhvata: a. dobijanje uzorka od navedene osobe kojoj je potrebna prognoza kancerskog
tretmana
b. detekciju ekspresije IGSF9 ili LIV - 1 ili njihovog antigen vezujućeg
fragmenta u navedenom uzorku; c. detekciju ekspresije IGSF9 ili LIV - 1 ili njihovog fragmenta u kontrolnom uzorku poreklom od normalne osobe ili normalnog tkiva osobe kod koje se postavlja dijagnoza; d. upoređivanje nivoa ekspresije IGSF9 ili LIV - 1 sa nivoom ekspresije
dobijenim u kontrolnom uzorku, pri čemu poređenje vodi prognozi kancera.
U jednom rešenju, IGSF9 fragment obuhvata eksone 5 do 10.
Predmetni pronalazak se takođe odnosi na vakcinu koja sadrži kao aktivni sastojak, anti - idiotipsko antitelo koje imunološki imitira IGSF9 ili LIV - 1 antigene i njihove fragmente.
Predmetni pronalazak se takođe odnosi na komplete koji sadrže različite polinukleotide. polipeptide, antitela i antigen vezujuće fragmente koji su ovde opisani, zajedno sa uputstvima za njihovu upotrebu u lečenju ili detekciji kancera.
Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupak tretiranja neoplastičnog poremećaja kod sisara, kod koga neoplastične ćelije eksprimiraju IGSF9 ili LIV - 1 antigene, a koji obuhvata primenu kod navedenog sisara preparata koji sadrži farmaceutski efikasnu količinu antitela za 1GSF9 ili LIV - 1 ili njihove antigen vezujuće fragmente. U poželjnom rešenju za izazivanje anti - tumorskog odgovora se koristi vakcina koja sadrži farmaceutski prihvatljivi nosilac i efikasnu količinu imunogenog preparata koji sadrži IGSF9 ili LIV - 1 za indukovanje anti - tumorskog imunog odgovora.
Predmetni pronalazak se takođe odnosi na antisens nukleinsku kiselinu do 50 nukleotida dugačku, koja sadrži deo od najmanje 8 nukleotida IGSF9 ili LIV - 1, koji inhibira ekspresiju IGSF9 ili LIV - 1. Antisens nukleinske kiseline, prema predmetnom pronalasku, mogu da sadrže barem jednu modifikovanu internukleotidnu vezu. Dalje, predmetni pronalazak se odnosi na postupak inhibicije ekspresije IGSF9 ili LIV - 1 u ćelijama ili tkivima, koji podrazumeva stupanje u kontakt navedenih ćelija ili tkiva sa navedenim natisens nukleinskim kiselinama, tako da dolazi do inhibicije ekspresije IGSF9 ili LIV-1.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na izolovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži različite oblike IGSF9 (sekvenca čiji su ID brojevi: 1, 7 i 12 do 21). Predmetni pronalazak se takođe odnosi na vektore i ćelije domaćine koje sadrže sekvence čiji su ID brojevi 1, 7 i 12 - 15. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na izolovani polipeptid i preparte koji sadrže sekvence čiji su ID brojevi 2, 8 i 22 - 27. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na vakcije, kao što je gore opisano, koje sadrže polipeptide čije su sekvence sa ID brojevima 2, 8 i 22 - 27 kao i fiziološki prihvatljivi nosilac.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na izolovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži kratki oblik IGSF9 - Ig gena (sekvenca čiji je ID broj 3). Predmetni pronalazak se takođe odnosi na vektore i ćelije domaćine koji sadrže sekvencu čiji je ID broj 3. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na izolovani polipeptid i preparte koji sadrže polipeptid čija sekvenca ima ID broj 4. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na vakcinu, kao što je opisano gore, za tretiranje kancera. koja sadrži peptid čija je sekvenca ID broj 4 i fiziološki prihvatljivi nosilac.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na izolovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži dugi oblik IGSF9 - Ig gena (sekvenca čiji je ID broj 5). Predmetni pronalazak se takođe odnosi na vektore i ćelije domaćine koji sadrže sekvencu čiji je ID broj 5. Predmetni pronalazak, dalje se odnosi na preparate koji sadrže polipeptid čija sekvenca ima ID broj 6. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na vakcinu, kao što je opisano gore, za tretiranje kancera koja sadrži polipeptid čiji je ID broj 6 kao i fiziološki prihvatljivi nosilac.
Kratak opis slika
Slika la i lbpredstavljaju nukleotidnu (sekvenca čiji je ID broj 1) i proteinsku (sekvenca čiji je ID broj 2) sekvencu humanog IGSF9, respektivno. Slika lb Prikazuje predviđenu signalnu sekvencu prikazanu sa boldovanim slovima, predviđeni vanćelijski domen je podvučen a predviđeni transmembranski domen je prikazan boldovanim slovima i italikovano.
Slika2 prikazuje elektronski profil Northern analize koji pokazuje profil ekspresije gena IGSF9, na osnovu određivanja upotrebom Gene Logic datasuite.
Slika3 prikazuje ekspresiju IGSF9 u normalnim tkivima. Gornji panel prikazuje ekspresiju IGSF9, a donji panel prikazuje ekspresiju gliceraldehid 3 - fosfat dehidrogenaze. Uzorci cDNK koji su prisutni u svakoj od staza potiču iz: (1) mozga, (2) placente, (3) pluća, (4) jetre, (5) skeletnog mišića, (6) bubrega, (7) pankreasa, (8) slezine, (9) timusa, (10) prostate, (11) testisa, (12) jajnika, (13) tankog creva, (14) debelog creva,
(15) leukocita periferne krvi, (16) pozitivne kontrole i (17) negativne kontrole.
Slika4 prikazuje ekspresiju IGSF9 u seriji uzoraka i ćelijskih linija humanog tumora jajnika. Gornji panel prikazuje ekspresiju IGSF9, a donji panel prikazje ekspresiju GAPDH. Brojevi iznad svake od traka odgovaraju uzorcima sledećih vrsta tumora jajnika: (1) umereno diferenciranog cisadenokarcinoma, (2) slabo diferenciranog papilarnog seroznog adenokarcinoma, (3) slabo diferenciranog papilarnog seroznog adenokarcinoma, (4) slabo diferenciranog endometrioidnog adenokarcinoma, (5) papilarnog seroznog adenokarcinoma, (6) endometrioidnog adenokarcinoma, (7) slabo diferenciranog adenokarcinoma. (8) slabo diferenciranog papilarnog seroznog adenokarcinoma, (9) Ovčar - 3 ćelijske linije. (10) PA - 1 ćelijske linije, (11) pozitivne kontrole i (12) negativne kontrole.
Slika5 prikazuje ekspresiju IGSF9 u uzorcima tumora dojke i u odgovarajućim uzorcima normalne dojke. Gore prikazani gel pokazuje ekspresiju IGSF9, a dole prikazani gel ekspresiju GAPDH. (N) normalno tkivo, (T) tumorsko tkivo. Tumorski uzorci pripadaju sledećim tumorima: (pacijent A) infiltrirajući duktalni karcinom, (pacijent B) infiltrirajući duktalni karcinom, (pacijent C) tubularni adenokarcinom, (pacijent D) infiltrirajući duktalni karcinom, (pacijent E) infiltrirajući duktalni karcinom, (pacijent T) in situ i invazivni duktalni karcinom visokog gradusa, (pacijent X) duktalni adenokarcinom, (pacijent W) mešoviti duktalni i lobularni adenokarcinom, (pacijent GH19) infiltrirajući duktalni karcinom visokog gradusa, (pacijent GH17) intraduktalni karcinom niskog gradusa.
Slika 6 prikazuje ekspresiju IGSF9 u tumorima pluća. Gornji paneli prikazuju ekspresiju IGSF9, dok donji paneli prikazuju ekspresiju GAPDH. (N) normalan uzorak, (T) tumorki uzorak. Tumorski uzorci koji su analizirani priopadali su sledećim tumorima: (pacijent A) infiltrirajući duktalni karcinom, (pacijent B) skamo celularni keratinizujući karcinom, (pacijent C) adenoskamozni karcinom, (pacijent D) skamo celularni keratinizujući karcinom, (pacijent E) skamo celularni karcinom.
Slika7 prikazuje ekspresiju IGSF9 u tumorima debelog creva. Gornji paneli prikazuju ekspresiju IGSF9, dok donji paneli prikazuju ekspresiju GAPDH. Uzorci pripadaju sledećim tumorima (1) adenokarcinom gradus 3, (2) adenokarcinom gradus 2, (3) adenokarcinom gradus 1, (4) adenokarcinom gradus 2, (5) ćelijska linija HCT116 kolorektalnog kancera.
Slika8 prikazuje ekspresiju IGSF9 u humanim tumorskim ćelijskim linijama, upotrebom RT - PCR analize. Relativna ekspresija IGSF9 je određena u ćelijskim linijama pankreasa (istačkano), jajnika (vertikalne linije), dojke (dijagonalne donje linije), pluća (ispunjeni tačkama) i debelog creva (dijagonalne gornje linije).
Slika9 prikazuje sekvencu nukleotida i aminokiselina različitih konstrukata IGSF9. Slike 9a i 9b prikazuju nukleotidnu skvencu (sekvenca čiji je ID broj 3) i aminokiselnisku sekvencu (sekvenca čiji je ID broj 4), kratkog oblika rastvorljivog IGSF9-Ig, respektivno. Slike 9c i 9d prikazuju nukleotidnu sekvencu (sekvenca čiji je ID broj 5) i aminokiselinsku sekvencu (sekvenca čiji je ID broj 6) dugačkog oblika rastvorljivog IGSF9-Ig, respektivno. Slike 9e i 9f prikazuju nukleotidnu skvencu (sekvenca čiji je ID broj 7) i aminokiselnisku sekvencu (sekvenca čiji je ID broj 8) dugačkog oblika pune dužine IGSF9. respektivno. Slika 9g je poređenje proteinske sekvence između dugačkog i kratkog oblika IGSF9 (sekvenca čiji su ID brojevi 9 do 11). Slika 9h je nukleotidna sekvenca alternativnih formi isecanja IGSF9 u regionu eksona 5 - 11 poreklom iz uzoraka tumorskog ksenografta (sekvenca čiji su ID brojevi 12 - 15).
Slika 10prikazuje SDS - PAGE analizu rekombinantno eksprimiranih i prečišćenih IGSF9 polipeptida. Trake 1 i 2 opisuju kratki i dugi oblik rastvorljivog IGSF9-Ig, respektivno.
Slika11 prikazuje Northern blot analizu IGSF9 u stabilno transficiranim CHO ćelijskim linijama. Uzorci u svakoj traci pripadaju sledećim linijama: (1) netrnsficirane CHO DG44 ćelije divljeg tipa; (2) stabilnom CHO 5 nM metotrkasat (MTX) amplifikantu. koji eksprimira kratki oblik IGSF9 pune dužine; (3) stabilnom CHO 5 nM MRX amplifikantu koji eksprimira kratki oblik rastvorljivog IGSF9-Ig; (4) stabilnom CHO 50nM MTX amplifikantu, koji eksprimira kratki oblik rastvorljivog IGSF9-Ig; (5) stabilnom CHO G418 kolonu koji eksprimira dugi oblik rastvoljivog IGSF9-Ig.
Slika12 prikazuje, titer anti - IGSF9 tela u serumima miševa koji su određeni upotrebom ELISA kod prečišćenog kratkog oblika IGSF9-Ig.
Slika13 prikazuje FACS analizu površinske ekspresije kratkog oblika IGSF9 nad transficiranim G418 - rezistentnim i MTX amplifikovanim CHO DG44 ćelijsim linijama koje stabilno eksprimiraju kratki oblik IGSF9. Površinska ekspresija IGSF9 je prikazana kod netransficiranih CHO DG44 ćelija (DG44); kod G418 rezistentnih ćelija (G418); kod 5 nM MTX amplifikanta (5 nM) i kod 50 nM MTX amplifikantu (50 nM).
Slika 14prikazuje FACS analizu površinske ekspresije dugog oblika IGSF9 na transficiranim G418 - rezistentnim i MTX amplifikovanim CHO DG44 ćelijskim linijama koje stabilno eksprimiraju dugački oblik IGSF9. IGSF9 površinska ekspresija je prikazana kod ne transficiranih CHP DG44 ćelija (CHO); i kod G418 rezistentnih ćelija (G418).
Slika 15prikazuje FACS analizi površinske ekspresije endogenog IGSF9 kod NC1 - H69 tumorskih ćelija. Ispitivane su 2o kontrolne ćelije, po izotipu odgovarajuće antitelo (2B8), kao i višestruke koncentracije primarnog detektujućeg antitela 8F3.
Slika 16prikazuje Western blot analizu ekspresije u humanim tumorskim ćelijskim linijama. Prikazaba su 2 različita vremena izlaganja. 30 mimuta (levi panel) i 30 sekundi (desni panel, koji prikazuje samo trake 2 i 3). Ćelijske linije koje se koriste od svakoj od traka su sledeće: (1) lažno transficirane COS - 7 ćelije (5 ug), (2) COS - 7 ćelije prolazno transficirane sa IGSF9 pune dužine (5ug); (3) stabilni CHO g418 klon koji eksprimira IGSF9 pune dužine (50 uf): (4) MDA - MB - 468 ćelijka linija kancera dojke (50 ug); (5) ZR - 75 - 1 ćelijska linija kancera dojke (50 ug); (6) NCI - H69 ćelijska linija sitnoćelijskog kancera pluća (50 ug); (7) Ovčar - 3 ćelijska linija kancera jajnika (50 ug); (8) PA - 1 ćelijska linija kancera jajnuika (50 ug).
Slika 17prikazuje ekspresiju IGSF9 na površini ćelije u ZR - 75 ćelijskoj liniji tumora dojke upotrebom vizuelizacije putem imunofluoroscentne mikroskopije.
Slika 18prikazuje FACS analizu ekspresiju IGSF9 na površini ćelija kod Ovčar - 3 i NCI - H69 mišijih tumorskih ksenografta i kultivisanih tumorskih ćelija.
Slika 19 prikazuje RT - PCR analizu ekspresije IGSF9 kod dve in vivo pasaže (PO i Pl) LS174T NCI - H69 tumorskih ćelijskih linija, kao i kod Ovčar - 3 ćelija izvedenih iz mišijih ksenografta.
Slika 20prikazuje da su alternativni oblici isecanja IGSF9 eksprimirani od strane mišijih ksenografnih tumora.Slika 20apriakzuje PCR proizvode dobijene od sledećih ćelijskih linija: (1) NCI - H69 tumorske ćelijske linije; (2) Ovčar - 3 tumorske ćelijske linije; (3) NCI - H69 mišijeg ksenografta: (4) Ovčar - 3 mišijeg ksenografta; i (5) negativne kontrole.Slika 20bprikazuje shematsku predstavu poravnanja novih varijanti isecanja nađenih u Ovčar - 3 NCI - H69 tumorskim ksenograftima. Gornji dijagram prikazuje eksone 5-10, poznatih varijanti IGSF9 (kratki i dugački oblik). Donji dijagram prikazuje eksone 5-11 novih izoformi IGSF9.
Slika 21prikazuje poravnanja sekvence IGSF9 novih IGSF9 formi izvedenih iz mišijeg ksenograftskog tkiva.Slika 21aprikazuje poravnanje parcijalne nukleotidne sekvence dugog oblika nukleotida 1138 - 1 155 otvorenog rama čitanja koja sadrži eksone 8-10 poravnate sa odgovarajućom parsijalnom sekvencom iz jedinstvenih varijanti isecanja eksprimiranih u Ovčar - 3 i NCI - H69 ksenograftskim tumorima.Slika 21bprikazuje poravnanje translirane aminokiselinske sekvence aminokiselina 285 - 426 koja je sadržana u eksonima 8-11 koja je poravnata sa odgovarajućom parcijalnom sekvencom iz jedinstvenih varijanti isecanja eksprimiranih u Ovčar - 3 i NCI - H69 ksenograftskim tumorima. Sekvence koje su predstavljene u poravnanju jesu sledeće: (1) dugi oblik IGSF9 (sekvenca čiji su ID brojevi 16 i 22);(2) sekvenca dobijena iz Ovčar - 3 ksenografta. klon 2 (sekvenca čiji su ID brojevi 20 i 23);(3) sekvenca dobijena iz Ovčar - 3 ksenografta, klon 1 (sekvenca čiji su ID brojevi 18 i 24); (4) sekvenca dobijena iz NCI - H69 ksenografta, klon 1 (sekvenca čiji su ID brojevi 19 i 25);(5) sekvenca dobijena iz NCI - H69 ksenografta, klon 2 (sekvenca čiji su ID brojevi 20 i 26); i (6) konsenzus sekvenca (sekvenca čiji su ID brojevi 21 i 27).
Slike22ai22bsu nukleotidne (sekvenca čiji je ID broj 8) i proteinske (sekvenca čiji je ID broj 29) sekvence humanog LIV - 1, respektivno. Slika 22b prikazuje predviđenu signalnu sekvencu, boldovanim slovima, predviđene ekstracelularne domene, kao podvučene, a predviđene transmembranske domene kao italikone i boldovane.
Slika23 prikazuje elektronski profil Northern blot analize koji pokazuje profil ekspresije gena LIV - 1, upotrebom Gene Logic datasuite.
Slika24 prikazuje ekspresiju LIV - 1 u normalnim tkivima. Gornji panel preikazuje ekspresiju LIV - 1, a donji panel prikazuje ekspresiju GAPDH. Uzorci CDNK koji su prikazani u svakoj od traka su sledeći: (1) iz sca, (2) iz moozga, (3) placente, (4) pluća. (5) jetre, (6) skeletnog mišića, (7) bubrega, (8) pankreasa, (negativne kontrole i (10) pozitivne kontrole.
Slika25 prikazuje ekspresiju LIV - 1 u uzorcima tumora dojke i u odgovarajućim uzorcima normalne dojke. Gornji gelovi pokazuju espresiju LIV - 1, dok donji gelovi pokazuju ekspresiju GAPDH. Vrh strelice na desnoj strani Slike označava predviđenu veličinu LIV - 1 PCR proizvoda. Uzroci tumora su sledeći: (1 - pacijent A) infiltrativni duktalni karcinom, (2 - pacijent B) infiltrativni duktalni karcinom, (3 - pacijent C) tubularni adenokarcinom, (4 - pacijent) infiltrativni duktalni karcinom, (5 - pacijent E) infiltrativni duktalni karcinom, (6 - pacijent A) normalni nalaz, (7 - pacijent B) normalni nalaz, (8 - pacijent) normalni nalaz, (9 - pacijent D) normalni nalaz, (10 - pacijent E) normalni nalaz, (11) negativna kontrola, (12) pozitivna kontrola, (13 - pacijent G19) infiltrativni duktalni karcinom visokog radusa. (14 - pacijent G17) infiltrativni duktalni karcinom niskog gradusa, (15 - pacijent X) duktalni adenokarcinom, (16 - pacijent W) mešoviti duktalni i lobularni adenokarcinom. (17 - pacijent T) in situ invazivni duktalni karcinom visokog gradusa, (18 - pacijent G19), normalan nalaz, (19 - pacijent G17) normalan nalaz. (20 - pacijent X) normalan nalaz, (21 - pacijent W) normalan nalaz. (22 - pacijent T) normalan nalaz, (23) negativna kontrola i (24) pozitivna kontrola.
Slika 26prikazuje eksprediju LIV - 1 u tumorima debelog creva. Gornji panel prikazuje ekspresiju LIV - 1, a donji panel prikazuje ekspresiju GAPDH. Uzorci su sledeći: (1) adenokarcinom gradusa 3, (2) adenokarcinom gradusa 2. (3) adenokarcinom gradusa 1, (4) adenokarcinom gradusa 2. (5) ćelijska linija HCT 116 kolorektalnog kancera, (6) pozitivna kontrola i (7) negativna kontrola.
Detaljan opis pronalaska
Otkriće prema predmetnom pronalasku jeste činjenica da su geni za IGSF9 i LIV - 1 diferencijalno eksprimirani kod neoplastičnih ćelija, posebno kod neoplazmi dojke, jajnika, debelog creva, pluća i prostate i u normalnim ćelijama. Prekomerna ekspresija ovih gena može da se koristi kao marker za kancer. Ova informacija može da se iskoristi za postavljanje dijagnoze i za proizvodnju terapeutskih reagenasa specifičnih i za gene i za proizvode njihove ekspresije, za dobijanje specifičnih antitela i njihovih antigen vezujućih fragmenata. Takođe, one mogu da se koriste u dijagnostičkim i terapeutskim postupcima koji mogu da pomognu u obezbeđivanju odgovarajućih režima tretmana za pacijente obolele od kancera, posebno za one koji imaju kancer dojke, jajnika, debelog creva. pluća ili prostate.
Antitela prema predmetnom pronalasku
Peptidi izvedeni iz IGSF9 ili LIV - 1 mogu da se koriste za dobij anje poliklonskih i monoklonskih antitela. Predmetni pronalazak je predviđen barem delimično na osnovu činjenice da antitela ili antigen vezujući fragmenti koja su imunogeno reaktivna sa antigenima udruženim sa neoplastičnim ćelijama mogu da se modifikuju ili izmene kako bi se obezbedile pospešene biohemijske karakteristike i kako bi se poboljšala efikasnost kada se koriste u terapeutskim protokolima kod pacijenata obolelih od kancera. Poželjno, modifkovana antitela su udružena sa citotoksičnim sredstvom, kao što je radionuklid ili anti - neoplastično sredstvo.
Pojam "antitelo", kao što se ovde koristi označava molekul imunoglobulina i imunološki aktivne delove imunoglobulinskih (Ig) molekula. Takva antitela obuhvataju. bez ograničenja, poliklonska, monoklonska. himerična, jednolančana antitela, Fab, Fab' i Fab'2fragmente, Fv fragmente i Fab ekspresionu biblioteku. Generalno, molekul antitela koji je dobijen iz ljudi pripada bilo kojoj od klasa IgG, IgM. IgA, IgE, i IgD klase, koje se među sobom razlikuju po prirodi teškog lanca prisutnog u molekulu. Određene podklase poseduju IgGi, IgGii druge. Dalje, kod ljudi laki lanac može biti kapa lanac ili lambda lanac. Referenciranje u ovom tekstu na antitela obuhvata referenciranje na sve takve klase, podklase i tipove molekula antitela.
Pokazano je da fragmenti antitela mogu da poseduju funkciju vezivanja antigena. Pojam "antigen vezujući fragmenti", kao što se ovde koristi označava, obuhvata bez ograničenja: (i) Fab fragment koji se sastoji od VL, VH, Cli ChI domena; (ii) Fd fragment koji se sastoji od VHi ChI domena; (iii) Fv fragment koji se sastoji od VLi VHdomena jednog antitela; (iv) dAb fragment (Ward, E. S., et al., Nature 341: 544 - 546, 1989) koji se sastoji od VH domena; (v) izolovane CDR regione; (vi) F(ab')2fragmente; (vii) jednolančane Fv molekule (scFv), kod kojih su VHdomen i VLdomen povezani peptidnim veznikom koji omogućava da se dva domena udruže kako bi formirala antigen vezujuće mesto (Bird, et al., Science 242: 423 - 426, 1988; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879 - 5883, 1988); (viii) bispecifična jednolančane Fv dimere (PCT/US92/09965) i (ix) diatela, multivalente ili multispecifične fragmente konstruisane fuzijom gena (W094/ 13804; P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444 - 6448. 1993).
Izolovani polipeptid, prema predmetnom pronalasku, može imati namenu da služi kao antigen, ili njegov deo ili fragment a dodatno može biti upotrebljen za stvaranje antitela koja se imunospecifično vezuju za antigen, korišćenjem standardnih tehnika za dobij anje poliklonskih i monoklonskih antitela. Protein pune dužine može biti korišćen protein pune dužine ili alternativno predmetni pronalazak može da obezbedi antigene polipeptidne fragmente IGSF9 i LIV - 1 koji se upotrebljavaju kao imunogeni. Antigenipolipeptidni fragmenti sadrže najmanje 6 aminokiselinskih ostataka aminokiselinkse sekvence pune dužine IGSF9 ili LIV - 1 proteina, kao što su aminokiselinske sekvence prikazane na Slikama lb, 9b, 9d, 9f, 21b, ili 22b (sekvenca čiji je ID brojevi 2, 4, 6, 8. 22. 27 ili 29) i obuhvataju njihov epitop tako da antitelo koje je specifično za peptid formira specifični imunokompleks sa proteinom pune dužine ili sa bilo kojim fragmentom koji sadrži epitop. Poželjno antigeni peptid sadrži najmanje 10 aminokiselinskih ostataka ili najmanje 15 aminokiselinskih ostataka ili najmanje 20 aminokiselinskih ostataka ili najmanje 30 aminokiselinskih ostataka.
U određenim rešenjima, prema predmetnom pronalasku, barem jedan epitop koji je obuhvaćen antigenim peptidom jeste region IGSF9 ili LIV - 1 koji je lociran na površini proteina, npr., neki fidrofilni region. Analiza hidrofobnosti proteinskih sekvenci humanih IGSF9 ili LIV - 1 (Slike lb i 22b) je ukazala koji regioni ovih proteina su posebno hidrofilni i tako poseduju veću verovatnoću da kodiraju površinske ostatke korisne za usmeravanje proizvodnje antitela (Kyte i Doolittle, J. Mol. Biol., 157: 105 - 142. 1982). Stoga poželjni epitopi obuhvaćeni antigenim peptidima jesu regioni IGSF9 ili LIV - 1 koji su locirani na njihovoj površini, npr., od aminokiseline 21 do aminokiseline 718 IGSF9 (Slika lb); od aminokiseline 21 do aminokiseline 734 IGSF9 (Slika 9f); aminokiselinske sekvence kao što je prikazano na Slici 21b; ili od aminokiseline 28 do aminokiseline 317, od aminokiseline 373 do aminokiseline 417, od aminokiseline 674 do aminokiseline 678, ili od aminokiseline 742 do aminokiseline 749 LIV - 1 (Slika 22b)
(sekvence čiji su ID brojevi: 2, 4, 6, 8, 22 - 27 ili 29).
Za proizvodnju monoklonskih antitela različite pogodne životinje domaćini (zec, koza. miš ili drugi sisar) mogu biti imunizovani jednom ili sa više injekcija sa IGSF9 ili LIV - 1 peptidima. njihovim sintetskim varijantama, derivatima ili fragmentima. Odgovarajući imunogeni preparat može da sadrži na primer, prirodni imunogeni protein, hemijski sintetisani polipeptid koji predstavlja imunogeni protein ili rekombinantno eksprimirani polipeptid imunogenog proteina ili njegov fragment. Dalje, protein može biti konjugovan sa drugim proteinom za koji se zna da je imunogen kod sisara koji se imunizuje. Primeri takvih imunogenih proteina obuhvataju, bez ograničenja, hemocijanid prilepka, serumski albumin, goveđi tiroglobulin i inhibitor tripsina iz soje. Preparat može dalje da obuhvata adjuvans. Različiti adjuvansi se koriste kako bi se povećao imunološki odgovor i oni obuhvataju bez ograničenja. Freund - ov adjuvans (kompletni i nekompletni), mineralne gelove (npr.. albumin hidroksid. MPL - TDM (monofosforil Lipid A - sintetska trehaloza dihlorinomikolat). i PROVAX™.
Poliklonska antitela, specifična za IGSF9 ili LIV - 1 mogu da se izoluju iz imunizovanog sisara i dalje pročiste korišćenjem tehnika koje su dobro poznate u struci, kao što su afinitetna hromatografija uz upotrebu proteina A ili proteina G.
Iako se nastala antitela mogu prikupiti iz seruma sisara kako bi se dobili poliklonski preparati, obično je poželjno da se izoluju individualni limfociti iz slezine. limfnih čvorova ili iz periferne krvi, kako bi se obezbedili homogeni preparati monoklonskih antitela. Poželjno, limfociti se dobijaju iz slezine. Pojam "monoklonska antitela" (MAt). kao što se ovde koristi označava odnosi se na populaciju molekula antitela koja sadrži samo jednu molekulsku vrstu molekula antitela sastavljenu od jedinstvenog proizvoda gena za teški lanac. Posebno regioni za određivanje komplementarnosti MAt su identični sa svim molekulima date populacije. Stoga MAt - ovi sadrže antigen vezujuće mesto koje je sposobno za imunološku reakciju sa određenim epitopom na antigenu i karakteriše se jedinstvenim vezujućim afinitetom za njega.
U ovom dobro poznatom procesu (Kohler et al, Nature 256: 495 (1975)) relativno kratkoveki ili limfociti sa ograničenim životnim vekom iz sisara kome je injekcijom primenjen antigen se fuzionišu sa besmrtnom ćelijskom linijom tumora (npr., sa ćelijskom linijom mijeloma), čime se dobijaju hibridne ćelije ili "hibridomi", koji su i besmrtni i sposobni za proizvodnju genetski kodiranog antitela u B ćeliji. Nastali hibridi se izdvajaju u pojedinačne genetske sojeve, selekcijom, razblaživanjem i ponovnim rastom sa svakom pojedinačnom vrstom koja sadrži specifične gene za stvaranje jednog antitela.
Ćelije hibridoma koje su dobijene se zasejavaju i uzgajaju u odgovarajućoj podlozi kulture koja poželjno sadrži jednu ili više supstanci koja inhibira rast ili preživljavanje ne fuzionisanih roditeljskih mijelomskih ćelija. Stručnjaci shvataju da reagensi. ćelijske linije ili podloge za stvaranje, selekciju i rast hibridoma jesu komercijalno dostupni iz brojnih izvora i da su uspostavljeni i standardizovani protokoli.
Generalno, podloga za kulturu u kojoj se uzgajaju ćelije hibridoma se ispituje na proizvodnju MAt - ova specifičnih za željeni antigen. Poželjno, specifičnost vezuvanja monoklonskih antitela proizvedenih od strane hibridomskih ćelija se određuje imunoprecipitacijom ili in vitro testom kao što je radioimunitest (RIA) ili sa enzimom povezani imunosorbentni test (ELISA). Nakon identifikacije hibridomskih ćelija koja proizvode antitela željene specifičnosti, afiniteta i/ili aktivnosti, klonovi mogu biti subklonirani. pomoću postupaka ograničavajućeg razblaženja i uzgajani putem standardnih postupaka (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, str. 59 - 103 (Academic Press, 1986)). Dalje treba napomenuti da monoklonska antitela koja su sekretovana od strane subklonova mogu biti izdvojena iz podloge kulture, ascitesa ili seruma upotrebom konvencionalnih postupaka prečišćavanja kao što su na primer. hromatografija sa proteinom A, hromatografija sa hidroksilapatitom, gel elektroforeza, dijaliza ili afmitetna hromatografija.
Pojam "modifikovano antitelo", kao što se ovde koristi, označava bilo koje antitelo ili njegov antigen vezujući fragment ili rekombinantni oblik koji je imunoreaktivan ili sa IGSF9 ili sa LIV - 1, pri čemu je barem neka frakcija jednog ili više domena konstantnog regiona deletirana ili na drugi način izmenjena, tako da su obezbeđene željene biohemijske karakteristike kao što su pospešena lokalizacija tumora ili smanjen poluživot u serumu u poređenju sa celim, neizmenjenim antitelom približno iste specifičnosti vezivanja. U željenim rešenjima, modifikovana antitela, prema predmetnom pronalasku, poseduju makar neki deo jednog konstantnog domena koji je deletiran. U svrhe ovog opisa, takvi konstrukti se označavaju kao "sa deletiranim domenom". Poželjno, jedan čitav domen, konstantnog regiona modifikovanog antitela je deletiran. a još poželjnije je daje čitav CFLdomen deletiran. Kao što će biti diskutovano detaljnije u tekstu koji sledi svaka od željenih varijanti može biti lako proizvedena ili konstruisana iz celog prekursora ili roditeljskog antitela, korišćenjem dobro poznatih tehnika.
Stručnjaci shvataju da jedinjenja, preparati i postupci, prema predmetnom pronalasku, koriste za tretiranje bilo kog neoplastičnog poremećaja, tumora ili maligniteta koji eksprimira polipeptid, prema predmetnom pronalasku. Kao što je diskutovano gore, modifikovana antitela, prema predmetnom pronalasku su reaktivna ili sa IGSF9 ili sa LIV - 1: To znači da se antigen vezujući deo. (tj.. varijabilni region ili imunoreaktivni fragment ili njegov rekombinantni analog) opisanih modifikovanih antitela vezuje ili sa IGSF9 ili sa LIV - 1 na mestu na kome se nalazi malignitet. Generalno, modifikovana antitela koja su korisna, prema predmetnom pronalasku, mogu da se dobiju ili izvedu iz bilo kog antitela (uključujući ona koja su predhodno opisana u literaturi), koja interaguju sa 1GSF9 ili sa LIV - 1. Dalje, roditeljsko ili prekursorsko antitelo ili njegov fragment se koristi za dobijanje opisanih modifikovaih antitela, može biti misije, humano, himerično, humanizovano, poreklom od ne - humanog primata iliprimatizovano. U drugim poželjnim rešenjima, modifikovana antitela prema predmetnom pronalasku, obuhvataju jednolančane konstrukte antitela, (kao što su oni opisani u US patentu br. 5,892,019 koji je ovde inkorporiran prema referenci), koji sadrži izmenjene konstantne domene ako što je opisano ovde. Posledično, bilo koji od ovih tipova antitela koji su modifikovani, shodno ovde izloženom opisu, obuhvaćeni su obimom zaštite predmetnog pronalaska.
Modifikovana antitela, prema predmetnom pronalasku, poželjno se udružuju sa ili vezuju sa IGSF9 ili LIV - 1 . Svodno tome. kao što je diskutovano detaljnije u tekstu koji sledi, modifikovana antitela, prema predmetnom pronalasku, mogu da se izvedu, dobiju ili fabrički proizvode iz bilo kog od brojnih antitela koja reaguju sa IGSF9 ili LIV - 1. U poželjnim rešenjima, modifikovana antitela se izvode korišćenjem uobičajenih tehnika genetskog inžinjeringa, kojima se makar jedan deo jednog ili više domena konstantnog regiona deletiraju ili menjaju, tako da se obezbeđuju željene biohemijske karakteristike kao što je smanjen poluživot u plazmi. Posebno, kao što će biti prikazano u Primerima, dalje u tekstu, stručnjak može lako da izoluje genetsku sekvencu koja odgovara varijabilnim i/ili konstantnim regionima subjektnih antitela i da deletira ili izmeni odgovarajuće nukleotide,čime obezbeđuje modifikovana antitela, prema predmetnom pronalasku. Dalje, treba napomenuti da modifikovana antitela, mogu biti eksprimirana ili proizvedena u obimu za kliničku ili komercijalnu upotrebu korišćenjem dobro definisanih protokola.
U izabranim rešenjima, modifikovana antitela, koja su korisna u predmetnom pronalasku, izvedena su iz poznatih antitela za IGSF9 ili LIV - 1 . Ovo može lako da se postigne dobijanjem ili nukleotidne sekvence ili aminokiselinske sekvence roditeljskog antitela i modifikacijama upotrebom tehnika genetskog inžinjeringa, kao što je opisano ovde. U drugim rešenjimamože biti poželjno da se koristi samo antigen vezujući region (npr.. varijabilni region ili regioni koji određuju komplementarnost) poznatog antitela i da se kombinuju sa modifikovanim konstantnim regionom kako bi se dobila željena modifikovana antitela. Kompatibilni jednolančani konstrukti mogu da se dobiju na sličan način. U bilo kom slučaju treba napomenuti da antitela prema predmetnom pronalasku, takođe mogu biti konstruisana tako da im se poboljša imunitet ili da im se smanji imunogenost, što je uobičajeno u struci. Na primer, modifikovana antitela. prema predmetnom pronalasku, mogu biti izvedena ili fabrički proizvedena iz antitela koja su humanizovana ili himerična. Stoga, modifikovana antitela. prema predmetnom pronalasku, mogu da se izvedu iz, ili da sadrže prirodna misija, primatska. humana ili monoklonska antitela drugih sisara, himerična antitela, humanizovana antitela, primatska antitela, bispecifična antitela ili jednolančane konstrukte antitela, kao i imunoreakcione fragmente bilo kog tipa.
Kao dodatak antitelima koja su opisana gore,može biti poželjno da se obezbede modifikovana antitela izvedena iz, ili koja sadrže natigen vezujuće regione novih antitela, dobijenih korišćenjem imunizacije, upotrebom uobičajenih imunoloških tehnika opisanih gore.
U drugim kompatibilnim rešenjima. DNK koja kodira željena monoklonska antitela može biti lako izolovana ili sekvencionirana korišćenjem konvencionalnih postupaka (npr., upotrebom oligonukleotidnih proba, koje su sposobne da se specifično vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance mišijih antitela). Izolovane i subklonirane hibridomske ćelije služe kao poželjni izvor takve DNK. Kada se jednom izoluje DNK može da se ubaci u vektore za ekspresiju koji se potom transficiraju u prokariotske ili eukariotske ćelije - domaćine kao što su ćelije E. Coli, COS ćelije majmuna, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) ili mijelomske ćelije koje inače ne proizvode imunoglobuline. Posebno, izolovana DNK (koja može biti modifikovana kao što je ovde opisano) može da se koristi za kloniranje sekvenci konstantnog i varijabilnog regiona u cilju proizvodnje antitela, kao što je opisano u Nevvman et al.. U.S. patent broj 5,658,570 koja je ovde inkorporirana prema refernci. U suštini, ovo podrazumeva ekstrakciju RNK iz izabranih ćelija, konverziju u cDNK, kao i njihovu amplifikaciju upotrebom PCR korišćenjem prajmera specifičnih za imunoglobuline. Kao što će detakljnije biti opisano u tekstu koji sledi, transformirane ćelije koje eksprimiraju željeno antitelo, mogu da su uzgajaju u relativno velikim količinama, kako bi se obezbedile kliničke i komercijalne zalihe imunoglobulina.
Stručnjaci takođe shvataju da DNK koja kodira antitela ili fragmente antitela takođe mogu da se izvedu iz biblioteka faga za antitela, kao stoje opisano na primer, u E. P. 368 684 BI i u U. S. patentu broj 5.969,108 koji su ovde inkorporirani prema referenci. U nekoliko publikacija (npr., Marks et al., Bio Technologv 10: 779 - 783, 1992) je opisana proizvodnja humanih antitela visokog afiniteta upotrebom klizajućeg lanca, kao i kombinatornom infekcijom i in vivo rekombinacijom koje se koriste kao strategija za konstruisanje velikih biblioteka faga. Takvi postupci obezbeđuju viabilne alternative u odnosu na tradicionalne hibridomske tehnike za izolaciju i naknadno kloniranje monoklonskih antitela i kao takve su jasno obuhvaćene obimom zaštite predmetnog pronalaska.
Druga rešenja, prema predmetnom pronalasku, obuhvataju stvaranje praktično humanih antitela u organizmu transgenih živorinja (npr., u miševima) koje nisu sposobne za proizvodnju endogenih imunoglobulina (videti npr., U. S. patente br. 6, 075,181; 5, 939.598; 5, 591,669 i 5, 589,369 koji su svi ovde inkorporirani prema referenci). Na primer, opisano je da homozigotne delecije spajajućeg regiona teškog lanca antitela kod himeričnih i mutantnih miševa germinativne linije dovodi do kompletne inhibicije proizvodnje endogenih antitela. Transfer palete humanih imunoglobulinskih gena u germinativnu liniju ćelija mutantnih miševa dovodi do proizvodnje humanih antitela, nakon izlaganja antigenu. Drugi poželjni načini stvaranja humanih antitela upotrebom SCID miševa su opisani u važećoj U. S. patentu broj 5,811,524, koji je ovde inkorporiran prema referenci. Treba napomenuti da genetski materijal koji je udružen sa ovim humanim antitelima, takođe može biti izolovan i manipulisan na način koji je opisan ovde.
Još jedan visoko efikasan način za stvaranje rekombinantnih antitela je opisan od srtrane Nevvman, Biotechnologv 10: 1455 - 1460 (1992). Posebno, ovom tehnikom se dobijaju primatizovana antitela koja sadrže varijabilne domene majmuna i sekvence konstantnih domena ljudi. Ova referenca je inkorporirana ovde u potpunosti prema referenci. Šta više ova tehnika je takođe opisana u važećoj U. S. patentnoj prijavi 5, 658. 570 kao i 5, 693,780 i 5, 756,096 koje su sve ovde inkorporirane prema referenci.
Treba napomenuti da obim zaštite predmetnog pronalaska obuhvata sve alee. varijante i mutacije ovde opisanih DNK sekvenci.
Kao što je ovde opisano, RNK može da se izoluje iz originalnih hibridomskih ćelija ili iz drugih transformiranih ćelija upotrebom standardnih tehnika kao što su ekstrakcija sa guanidin izotiocijanatom i precipitacija, a nakon toga centrifugiranje ili hromatografija. Onda kada je to poželjno iRNK može da se izoluje iz ukupne RNK standardnim tehnikama kao što su hromatografija na oligodT celulozi. Tehnike koje su pogodne za ovde opisane svrhe poznate su u struci i opisane u gore navedenim referencama.
cDNK koje kodiraju lake i teške lance antitela, mogu biti generisane simultano ili razdvojeno, korišćenjem reverzne transkriptaze i DNK polimeraze, upotrebom dobro poznatih postupaka. Ovaj postupak može biti iniran prajmerima konsensus sekvence konstantnog regiona ili specifičnijim prajmerima koji se zasnivaju na objavljenim DNK sekvencama i aminokiselinskim sekvencama teškog i lakog lanca. Kao što je diskutovano ranije, PCR takođe može da se koristi za izolaciju DNK klonova koji kodiraju lake i teške lance antitela. U ovom slučaju mogu biti pretražene biblioteke upotrebom konsenzus prajmera ili većih homologih proba, kao što su probe za konstantni region miša.
DNK, tipično plazmidska DNK može da se izoluje iz ćelija kao što je ovde opisano da se mapira restrikcionim postupkom i sekvencionira upotrebom standardnih dobro poznatih tehnika koje su detaljno predstavljene u navedenim referencama koje se odnosena tehnike rekombinantne DNK. Naravno, DNK može biti modifikovana prema predmetnom pronalasku, u bilo kom vremenskom momentu tokom procesa izolacije ili naknadno analizom.
Prema predmetnom pronalasku, poznate tehnike mogu biti prilagođene za proizvodnju jednolančanih antitela, specifičnih za polipeptid prema predmetnom pronalasku, (videti U. S. patent 4, 946,778). Dodatno, poznati postupsi mogu biti prilagođeni za konstrukciju Fab ekspresionih biblioteka (Huse, et al., Science 246: 1275 - 1281. 1989.) kako bi se omogućila brza i efikasna identifikacija monoklonskih Fab fragmenata sa željenom specifičnošću za IGSF9 ili LIV - 1 ili njihove derivate,fragmente, analoge ili homologe. Fragmenti antitela koji sadrže idiotipove za polipeptid prema predmetnom pronalasku, mogu da se proizvedu upotrebom tehnika poznatih u struci, uključujući, bez ograničenja: (a) F(ab')?fragment proizveden digestijom molekula antitela pepsinom;(b) Fab fragment dobijen redukcijomdisulfidnih mostova F(ab'j2fragmenta; (c) Fab fragment dobijen tretmanom molekula antitela papainom i redukcionim sredstvom; i (d) Fv fragment.
Bispecifična antitela takođe su obuhvaćena obimom zaštite predmetnog pronalaska. Bispecifična antitela su monoklonska, poželjno humana ili humanizovana antitela koja poseduju specifičnost vezivanja za najmanje dva različita antigena. U slučaju predmetnog pronalaska, specifičnost vezivanja se odnosi na antigeni polipeptid, prema predmetnom pronalasku (IGSF9 ili LIV - 1) ili njihov fragment, a druga meta za vezivanje je neki drugi antigen, poželjno protein na površini ćelije ili receptora ili pod jedinice receptora.
Postupci za dobijanje bispecifičnih antitela su poznati u struci. Tradicionalno, rekombinantna proizvodnja bispecifičnih antitela se zasniva na koekspresiji dva para imunoglobulinskih teških lanaca/lakih lanaca, pri čemu dva teška lanca poseduju različite specifičnosti (Milstein & Cuello, Nature 305: 537 - 539, 1983.). Usled nasumičnog rasporeda imunoglobulinskih teških i lakih lanaca, ovi hibridomi (kvadromi), proizvode potencijalnu smešu deset različitih molekula antitela od kojih samo jedno poseduje ispravnu bispecifičnu strukturu. Pročišćavanje pravog molekula se obično postiže upotrebom afinitetnih hromatografija.
Varijabilni domeni antitela sa željenim specifičnostima vezivanja mogu da se fuzionišu sa sekvencama imunoglobulinskih konstantnih domena. Fuzija se poželjno vrši sa konstantnim domenom imunoglobulinskog teškog lanca, koji sadrži barem deo regiona šarke, Cy{ 2 i Ch3 regiona. Poželjno je da prvi konstantni region teškog lanca (ChI), koji sadrži mesto koje je neophodno za vezivanje lakog lanca bude prisutan barem u jednom od fuzionih oblika. DNK koja kodira fuzione oblike imunoglobulinsih teških lanaca i ukoliko je to poželjno imunoglobulinskog lakog lanca biva insertovana u razdvojene ekspresione vektore i kotransficirana u pogodne organizme domaćina. Ostali detalji o dobijanju bispecifičnih antitela mogu da se nađu u Surech et al., Methods in Enzymology 121:210; 1986.
Bispecifična antitela mogu da se dobiju kao antitela pune dužine ili kao fragmenti antitela. Tehnike za dobijanje bispecifičnih antitela iz fragmenata antitela su opisane u literaturi. Na primer, bispecifičnih antitela mogu da se dobiju korišćenjem standardnih hemijskih reakcija. Dodatno, Brennan et al.. Science 229: 81; 1985.. prikazuje postupak u kome se intaktna antitela proteolitički cepaju kako bi se dobili F(ab<!>)2.
Dodatno, Fab' fragmenti mogu da se ditektno dobiju iz E. coli i da se hemijski povežu tako da se dobiju bispecifična antitela (Shalabv et al., J. Exp. Med. 175: 217 - 225, 1992.). Ovi postupci mogu dase koriste za dobijanje potpuno humanizovanih bispecifičnih molekula F(ab')2antitela.
Antitela sa više od dve valencije su takođe obuhvaćene obimom zaštite predmetnog pronalaska. Na primer. mogu se dobiti trispecifična antitela (Tutt et al., J. Immunol. 147: 60, 1991.).
Bispecifična antitela iz pomenutih primera mogu da se vezuju za dva različita epitopa pri čemu makar jedan potiče sa polipeptida, prema predmetnom pronalasku. Alternativno anti - antigeni krak imunoglobulinskog molekula može da se kombinuje sa krakom koji se vezuje za okidački molekul na leukocitu kao što je to molekul T - žćelijskog receptora (npr., CD2, CD3, CD28 i B7) ili Fc receptori za IgG kako bi se usmerili ćelijski odbrambeni mehanizmi ka ćeliji koja eksprimira određene antigene. Bispecifična antitela takođe mogu da se koriste za usmeravanje citotoksičnih sredstava ka ćelijama koje eksprimiraju određeni antigen. Ova antitela poseduju antigen vezujući krak i krak koji vezuje citotoksično sredstvo ili radionuklidni helator, kao što je EOTUBE. DTPA, DOTA ili TETA.
Heterokonjugatna antitela su takođe obuhvaćena obimom zaštite prema predmetnom pronalasku. Heterokonjugatna antitela su sastavljena od dva kovalentno povezana antitela. Takva antitela su na primer, predložena za usmeravanje imunih ćelija ka neželjenim ćelijama (U. S. patent broj 4, 676,980). Takva antitela mogu da se dobiju in vitro, korišćenjem poznatih postupaka hernije sinteze proteina, uključujući i one tehnike koje obuhvataju sredstva za ukršteno vezivanje. Na primer, imunotoksini mogu das e konstruišu upotrebom reakcije disulfidne izmene ili reakcije formiranja tioetarske veze. Primeri odgovarajućih reagenasa za ovu svrhu obuhvataju imiotiolat i metil - 4 - merkaptobutirimidat.
U svrhe predmetnog pronalaska treba napomenuti da modifikovana antitela mogu da sadrže bilo koji tip varijabilnog regiona koji omogućava udruživanje antitela sa polipeptidima IGSF9 ili LIV - 1. U ovom slučaju varijabilni region može da sadrži ili može da bude izveden iz bilo kog tipa sisara kod koga može das e izazove humoralni odgovor i da se u njemu stvore imunoglobulini protiv željenih sa tumorom udruženih antigena. Tako, varijabilni region modifikovanih antitela može biti na primer, humanog porekla mišijeg porekla, primatskog ne humanog porekla, (npr., poreklom od Cvnomolgus majmuna, makakija itd.,) ili psećeg porekla. U posebno poželjnim rešenjima i varijabilni i konstantni regioni modifikovanih imunoglobulina su ljudski. U drugim izabranim rešenjima varijabilni regioni kompatibilnih antitela (obično izvedenih iz ne - humanog izvora) mogu biti konstruisani ili specifično napravljeni, tako da se poboljšaju vezujuća svojstva ili da se smanji imunogenost takvog molekula. U ovom slučaju, varijabilni regioni od koristi u predmetnom pronalasku, mogu biti humanizovani ili na drugi način izmenjeni putem inkluzije određenih aminokiselinskih sekvenci.
Pod pojmom "humanizovano antitelo" podrazumeva se antitelo izvedeno iz ne - humanog izvora, a to je tipično misije antitelo, koje zadržava ili u značajnoj meri zadržava antigen vezujuće svojstvo roditeljskog antitela, ali koje je manje imunogeno kod ljudi. Ovo može da se postigne upotrebom različitih postupaka, uključujući (a) presađivanjem kompletnih ne - humanih varijabilnih domena na humane konstantne regione kako bi se dobila himerične antitela: (b) presađivanje barem jednog dela jednog ili više ne - humanih regiona koji određuju komplementarnost (CDR - ova) na humane okvirne i konstantne regione sa ili bez zadržavanja kritičnih okvirnih ostataka; (c) transplantacijom kompletnih ne humanih varijabilnih domena uz njihovo "prepokrivanje" u dclovima koji su slični humanim, putem zamene površinskih ostataka. Ovi postupci su opisani u Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 489 - 498, 1991; Padlan, Molec. Immunol. 31: 169 - 217, 1994., i U. S. patenti br. 5, 585,089, 5, 693,761 i 5, 693,762, koji su svi ovde inkorporirani prema referenci u celosti.
Humanizovana antitela obuhvataju humane imunoglobuline (recipijentno antitelo) u kojima su ostaci iz regiona koji obezbeđuje komplemetnarnost (CDR) recipijenta, zamenjeni sa CDR - a ne - humane vrste (donorsko antitelo) kao što su miš, pacov ili zec, koja poseduju željenu specifičnost afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima. Fv okvirni ostaci humanog imunoglobulina zamenjuju se odgovarajućim ne - humanim ostacima. Humanizovana antitela takođe mogu da sadrže ostatke koji se ne nalaze ni u recipijentnom antitelu niti u importovanim CDR ili okvirnim sekvencama. Generalno, humanizovano antitelo sadrži praktično sve od najmanje jednog, tipično dva varijabilna domena u kojima su svi ili praktično svi CDR regioni odgovarajući onima iz ne - humanog imunoglobulina i kod kojih su svi ili praktično svi Fv regioni oni koji pripadaju konsenzus sekvenci humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo optimalno tkođe, sadrži barem jedan deo imunoglobulinskog konstantnog regiona, (Fc), tipično deo humanog imunoglobulina (Jones et al.. Nature 321: 522 - 525, 1986; Riechmann et al., Nature 332: 323 - 329, 1988; i Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593 - 596, 1992.).
Postupci za humanizovanje ne - humanih antitela su dobro poznati u struci. Generalno, humanizovano antitelo poseduje jedan ili više aminokiselinskih ostataka koji su uvedeni u njega iz izvora koji nije humani. Ovi ne - humani aminokiselinski ostaci se često označavaju kao "importovani" ostaci koji se tipično uzimaju iz importovanog varijabilnog domena. Humanizacija može biti praktično izvedena upotrebom postupka Winter - a i saradnika (Jones et al., Nature 321: 522 - 525, 1986; Riechmann et al., Nature, 332: 323 - 327, 1988; Verhoeven et al., Science 239: 1534 - 1536, 1988), supstitucijom CDR - ova ili CDR sekvenci glodara sa odgovarajućim sekvencama humanog antitela. Tako navedena humanizovana antitela su himerična antitela (U. S. patent broj 4, 816,567), gde je značajno manje od intaktnog humanog varijabilnog domena substituisano sa odgovatajućom sekvencom iz ne humane vrste. Humanizovana antitela su tipično humana antitela u kojima neki ostaci CDR i moguće neki FR ostaci su substituisani ostacima sa analognih mesta u antitelima glodara.
Izbor humanih varijabilnih domena, i lakih i teških, koji se upotrebljavaju pri dobijanju humanizovanih antitela, veoma je važan kako bi se smanjila antigenost i HAMA odgovor (humano anti - mišije antitelo) kada je antitelo namenjeno terapeutskoj upotrebi kod ljudi. Shodno postupku "najboljeg uklapanja" sekvenca varijabilnog domena antitela glodara se ispituje upoređivanjem sa kompletnom bibliotekom poznatih sekvenci humanog varijabilnog domena. Humana sekvenca V domena koja je najbliža sekvenci kod glodara se identifikule, a humani okvirni region (FR) u okviru nje prihvata za humanizovano antitelo (Sims et al, J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chotia et al., J. Mol. Biol. 196: 901, 1987). Drugi postupak koristi određeni okvirni region kojije izveden iz konsenzus sekvence svih humanih antitela određene podgrupe lakih ili teških lanaca. Isti okvirni region može da se koristi za nekoliko različitih humanizovanih antitela (Čarter et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151: 2623. 1993.).
Dalje, važno je da antitela budu humanizovana uz zadržavanje visokog afiniteta vezivanja za antitelo i uz zadržavanje drugih poželjnih bioloških svojstava. Kako bi se ovo postiglo, shodno poželjnom postupku, humanizovana antitela se dobijaju upotrebom procesa analize roditeljskih sekvenci i različitih konceptualnih humanizovanih proizvoda korišćenjem trodimenzionalnih modela roditeljskih i humanizovanih sekvenci. Trodimenzionalni imunoglobulinski modeli su lako dostupni i poznati su stručnjacima. Dostupni su kompjuterski modeli koji ilustruju i pokazuju moguće trodimenzionalne konformacione strukture, izabranih kandidata imunoglobulinskih sekvenci. Ispitivanje ovih prikaza omogućava anlizu verovatne uloge ostataka u funkcionisanju kandidatske imunoglobulinske sekvence, tj., analizu ostataka koji utiču na sposobnost kandidata imunoglobulina da se vezuje za antigen. Na ovaj način, FR ostaci mogu da se izaberu i kombinuju iz recipijentskih importovnih sekvenci tako da se postignu željenje karakteristike antitela kao što je povišen afinitet za ciljnim antitenom (antigenima). Generalno, ostaci hipervarijabilnog regiona su direktno i najznačajnije uključeni u postupak vezivanja antigena.
Predmetnim pronalaskaom su obuhvaćeni različiti oblici humanizovanih antitela. Na primer, humanizovano antitelo može biti fragment antitela, kao što je to Fab, koji je opciono konjugovan sa jednim ili sa više citotoksičnih sredstava, kako bi se dobio imunokonjugat. Alternativno, humanizovano antitelo može biti intaktno antitelo, kao što je intaktno IgGiantitelo.
Kao alternativa humanizaciji, mogu da se proizvedu humana antitela. Na primer, sada je moguće da se proizvedu transgene životinje (npr., miševi) koji su sposobni nakon imunizacije da proizvose pun repertoar humanih antitela pri čemu je odsutna proizvodnja endogenih imunoglobulina. Na primer, opisano je da homozigotna delecija gena za spojni regiona region teškog lanca antitela (Jh) kao i miševi sa mutiranom germinativnom linijom poseduju potpunu inhibiciju proizvodnje endogenih antitela. Transfer skupa humanih imunoglobulinskih gena germinativne linije u takve mutantne miševe za germinativnu liniju proizvode humana antitela nakon izlaganja antitela. Videti. na primer, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci.. USA 90: 2551, 1993; Jakobovits et al.. Nature. 362: 255 - 258, 1993; Bruggemann et al.. Year in Immuno. 7: 33, 1993.; U. S. patente br. 5.545.806, 5, 569,825. 5,591.669 (svi podneti od strane GenPharm); 5. 545,807; i WO 97/17852.
Alternativno, ekspresija putem faga (McCaffertv et al., Nature 348: 552 - 553
(1990)) može da se upotrebi za proizvodnju humanih antitela i fragmenata antitela in vitro iz repertoara gena za varijabilni V domen imunoglobulina poreklom iz neimunizovanih đonora. Prema ovoj tehnici geni za V domen antitela se klonitaju u istom ramu očitavanja u gen za veliki ili za mali prepokrivajući protein filamentoznog bakteriofaga, kao što je Ml3 ili fd i prikazuju s kao funkcionalni fragmenti antitela na površini čestice faga. Pošto filamentozna čestica sadrži jednolančanu DNK kopiju genoma faga, selekcija na osnovu funkcionalnih svojstava antitela dovodi do selekcije gena koji kodira antitelo koje pokazuje željena svojstva. Stoga, fag imitira neka od svojstava dve ćelije. Ekspresija putem faga može da se izvede u različitim oblicima, što je revijski prikazano u npr., Johnson, K. S. i Chrisvvell, D. J., Current Opinion in Structural Biologv 3: 564 - 571, 1993. Za ekspresiju putem faga može da se koristi nekoliko izvora V - gena (Clarkson et al.. Nature 352: 624 - 628, 1991.) koji su izolovani spektar različitih anti - oksazolon antitela iz male nasumične kombinatorne biblioteke V gena poreklom iz slezine imunizovanih miševa. Repertoar V gena iz ne imunizovanih humanih donora može da se konstruiše a antitela za različiti spektar antigena (uključujući sopstvene antigene) može da se izoluje upotrebom tehnika opisanih od strane Marks et al...!. Mol. Biol. 222: 581 - 597, 1991., ili Griffith et al., EMBO J. 12: 725 - 734, 1993. Videti takođe i U. S. patente br. 5, 565,332 i 5, 573,905.
Kao što je diskutovano gore, humana antitela takođe mogu da se dobiju od strane in vitro aktiviranih B ćelija (videti, U. S. patente br, 5, 567,610 i 5, 229,275).
Stručnjacima je jasno da presađivanje kompletnih ne - humanih varijabilnih domena na humane konstantne regione proizvodi "klasična" himerična antitela. U kontekstu predmetne prijave, kao pojam "himerično antitelo" označava bilo koje antitelo u kome se imunoreaktivni region ili mesto dobija ili izvodi iz jedne vrste, a konstantni region (koji može biti intaktni, parcijalni ili modifikovani, prema predmetnom pronalasku) se dobija iz druge vrste. U poželjnim rešenjima. antigen vezujući region ili mesto je poreklom iz ne - humanog izvora, (npr., miš) , a konstantni region je humani. Iako imunogena specifičnost varijabilnog regiona. generalno, nije izmenjena u odnosu na izvor, manja je verovatnoća da će humani konstantni region izazvati imuni odgovor od strane humanog subjekta, nego kada se koristi konstantni region poreklom iz ne - humanog izvora.
Poželjno, varijabilni domeni u teškom i lakom lancu se menjaju makar delimičnom zamenom jednog ili više CDR - ova, a ukoliko je potrebno putem parcijalne zamene okvirnih regiona i promene sekvence. Iako CDR - ovi mogu biti izvedeni iz antitela iste klase ili čak su iste podklase kojoj pripada antitelo iz koje se dobija okvirni region, poželjnoje da se CDR - ovi izvedu iz antitela različite klase, a poželjno iz antitela različite vrste. Mora se napomenuti da ne mora biti potrebno da se zamene svi CDR - ovi sa dvim CDR - ovima poreklom iz varijabilnog regiona donora kako bi se prebacio kapacitet vezivanja antigena sa jednog varijabilnog domena na drugi. Samo, može biti potrebno da se prebace oni ostaci koji su neophodni za održavanje aktivnosti mesta za vezivanje antigena. Uz objašnjenja koja su data u U. S. patentima br. 5. 585,089, 5. 693,761 i 5, 693,762, kompetentni stručnjaci upotrebom rutinske eksperimentacije ili putem ispitivanja po tipu pokušaj i greška, mogu da dobiju funkcionalno antitelo sa smanjenom imunogenošću.
Bez izmena varijabilnog regiona, stručnjaci znaju da modifikovana antitela prema predmetnom pronalasku obuhvataju antitela ili njihove imunoreaktivne fragmente, u kojima je barm deo jednog ili više domena konstantnih regiona deletirano ili na drugi način izmenjeno, tako da se obezbede željene biohemijske karakteristike, kao što je pospešena lokalizacija tulora ili smanje poluživot u serumu u poređenju sa antitelima otprilike iste imunogenosti koja sadrže nativne ili ne izmenjene konstantne regione. U poželjnim rešenjima konstantni region modifikovanih antitela sadrži humani konstantni region. Modifikacije konstantnog regiona koje su kompatibilne sa predmetnim pronalaskom obuhvataju, adicije, delecije i supstitucije jedne ili više aminokiselina u jednom ili u više domena. Ovo znači da ovde opisana modifikovana antitela mogu da sadrže izmene ili modifikacije jednog ili više od tri konstantna domena teškog lanca
(Cni. C ii2. ili Ch3) i/ili konstantnog dmena lakog lanca (Cl). Kao što je diskutovano detaljnije u tekstu koji sledi i kao što je prikazano u primerima, poželjan rešenja prema predmetnom pronalasku obuhvataju modifikovane konstantne regione gde je jedan ili više regiona delimično ili u potpunosti deletirano. U posebno poželjnim rešenjim. modifikovana antitela sadrže konstrukte ili varijante sa deletiranim domenima u kojima je čitav Ch2 domen uklonjen (A Ch- konstrukti). U drugim poželjnim rešenjima, preskočen konstantni region je zamenjen kratkim aminokiselinskim veznim regionom, (npr., od 10 ostataka), koji obezbeđuje nadoknadu molekulske fleksibilnosti koja je tipično oštećena usled nedostatka konstantnog regiona.
Pored njihove konfiguracije u struci je poznato da konstantni regioni posreduju u vršenju nekoliko efektorskih funkcija. Na primer, vezivanje Cl komponentne komplementa za antitelo aktivira sistem komplementa. Aktivacije komplementa je važna u opsonizaciji lili liziji ćelijskih aptogena. Aktivacije komplementa takođe stimuliše inflamatorni odgovor i može biti uključena u autoimunu preosetljivost. Dalje, antitela se vezuju za ćelije preko Fc regiona, pri čemu se Fc receptorsko mesto na Fc regionu antitela vezuje za Fc receptor (FcR) na ćeliji. Postoje brojni Fc receptori koji su specifični za različite klase antitela, uključujući IgG (gama receptor), IgE (eta receptor), IgA (alfa receptor) i IgM (mi receptori). Vezivanje antitela za Fc receptor na površini ćelije pokreće brojne važne i različite biološke odgovore, uključujući okruživanje i destrukciju čestica koje su obložene antitelima, odstranjivanje imunih kompleksa, lizu antitelima obloženih ciljnih ćelija od strane ćelija ubica ( što se naziva: od - antitela - zavisna ćelijski - posredovana citotoksičnost, ili ADCC), otpuštanje inflamatornih medijatora, tranfer kroz placentu i kontrolu proizvodnje imunoglobulina. Iako su različiti Fc receptori i receptorska mesta ispitivani u određenoj meti, još uvek je dosta toga nepoznato u vezi njihove lokalizacije, strukture i funkcionisanja.
Bez ograničavanja obima zaštite predmetnog pronalaska, smatra se da antitela koja sadrže konstantne regione koji su modifikovani na način koji je ovde opisan obezbeđuju izmenjene efektorske fnkcije koje za uzvrat utiču na biološki profil primenjenog antitela. Na primer, delecija ili inaktivacije, (preko tačkastih mutacija ili na neki drugi način) domena konstantnog regiona. može da smanji vezivanje za Fc receptor cirkulišućeg modifikovanog antitela, čime se pospešuje lokalizacija tumora. U drugim slučajevima moguće je da modifikacije konstantnog regiona. prema predmetnom pronalasku, posreduju u vezivanju komplementa i tako smanjuju poluživot u serumu i ne specifične asocijacije konjugovanog citotoksina. Druge modifikacije konstantnog regiona mogu da sc upotrebe za eliminaciju disulfidnih veza ili oligosahatidnih podjedinica čime se obezbeđuje pospešena lokalizacija usled povećanja specifičnosti za antigen ili fleksibilnosti antitela. Generalno, stručnjaci shvataju da modifikovana antitela koja su ovde opisana mogu da ispolje brojna suptilna dejstva koja mogu a ne moraju biti poželjna. Slično tome. modifikacije konstantnog regiona. prema predmetnom pronalasku, mogu lako da se načine upotrebom dobro poznatih biohemijskih tehnika ili tehnika molekularnog inžinjeringa, koje su poznate iskusnom stručnjaku.
Treba napomenuti da modifikovana antitela mogu biti tako konstruisana da je C|p domen direktno fuzionisan sa regionom šarke određenih modifikovanih antitela. U drugim konstruktima, može biti poželjno da se obezbedi peptidni spejser između regiona šarke i modifikovanih Ch2 i/ili Ch3 domena. Na primer, mogu biti eksprimirani kompatibilni konstrukti u kojima je Ch2 domen deletiran, a preostali Ch3 domen (modifikovan ili nemodifikovan) je povezan sa regionom šarke preko spejsera od 5 - 20 aminokiselina. U ovom slučaju jedan od poželjnih spejsera je aminokiselinska sekvenca IGKTISKKAK (sekvenca čiji je ID broj: 44). Takav spejser može biti dodat, na primer, kako bi se osiguralo da regulatorni elementi konstantnog domena ostanu slobodni i dostupni ili da region šarke ostane fleksibilan. Međutim, treba napomenuti da aminokiselinski spejseri mogu u nekim slučajevima biti imunogeni i izazvati neželjeni imunogeni odgovor usmeren protiv konstrukta. Shodno tome, poželjno je da spejser koji se dodaje kostruktu bude relativno ne imunogen ili poželjnije da se u potpunosti izostavi ukoliko željeni biohemijski kavaliteti modifikovanih antitela mogu da se očuvaju bez njega.
Pored delecije čitavih domena konstantnog regiona, treba napomenuti da antitela. prema predmetnom pronalasku, mogu da se dobiju parcijalnom delecijom ili supstitucijom nekoliko ili čak samo jedne aminokiseline. Na primer, mutacija jedne aminokiseline u izabranim područjima Ch2 domena može biti dovoljna da se značajno smanji Fc vezivanje i da se tako pospeši lokalizacija tumora. Slično tome, može biti poželjno da se jednostavno deletira taj deo jednog ili više domena konstantnog regiona koji kontroliše efektorsku funkciju (npr.. CLQ vezivanje komplementa) kaj a treba da bude modulirana. Takve parcijalne delecije konstantnih regiona mogu da poboljšaju izabrane karakteristike antitela (poluživot u serumu), dok se druge poželjne funkcije udružene sa predmetnim domenom konstantnog regiona čuvaju intaktnim. Staviše, kao što je nagovešteno gore konstantni regioni opisanih antitela mogu biti modifikovani putem mutacije ili supstitucije jedne ili više aminokiselina. čime se poboljšava profil rezultujućeg konstrukta. U ovom slučaju, moguće je da se ošteti aktivnost koju obezbeđuje konzervirano mesto vezivanja, (npr., Fc vezivanje) dok se u velikoj meri održava konfiguracija i imunogeni profil modifikovanog antitela. Druga poželjna rešenja obuhvataju adiciju jedne ili više aminokiselina u konstantni region čime se pospešuju željene karakteristike, kao što je efektorska funkcija ili čime se obezbeđuje vezivanje citotoksina ili ugljenog hidrata u većoj meri. U takvim rešenjima poželjno je da se insertuju ili repliciraju specifične sekvence izvedene iz izabranih domena konstantnog regiona.
U posebno poželjnim rešenjima, klonirani geni varijabilnog regiona se insertuju u ekspresioni vektor zajedno sa genima za konstantni region teškog i lakog lanca (poželjno humanih) koji su modifikovani na način opisan gore. Poželjno, ovo se postiže korišćenjem odgovarajućeg ekspresionog vektora, kompanije IDEC Inc. koje se naziva NEOSPLA. Ovaj vektor sadrži citomegalovirusni promoter/pojačivač, mišiji glavni promoter P globina, mesta početka replikacije SV40, sekvencu za poliadenilaciju goveđeg hormona rasta, ekson 1 i ekson 2, neomicinske fosfotransferaze, gen dihidrofolat reduktaze, i vodeću sekvencu. Kao što se vidi u dole opisanim primerima, ovaj vektor dovodi do veoma visokog nivoa ekspresije antitela, nakon inkorporacije gena za varijabilni konstatni region putem tranfekcije u CHO ćelije, nakon koje sledi selekcija u podlozi koja sadrži G418 i nakon amplifikacije metatrksatom. Ovaj vektorski sistem je opisan u važećim U. S. patentima br. 5,736,137 i 5,658,570 koja su oba inkorporirana prema referenci u celosti. Ovaj sistem obezbeđuje visoke nivoe ekspresije tj, nivoe veće od 30 pg/ćeliji/dan.
U drugim poželjnim rešenjima modifikovana antitela, prema predmetnom pronalasku, mogu biti eksprimirana upotrebom policistronskih konstrukata. kao što su oni koji su upisani u U. S. privremenoj patentnoj prijavi 60/331,481 koja je podneta novembra 2001. koja je ovde inkorporirana prema referenci u potpunosti. U ovim novim ekspresionim sistemima, višestruki genski proizvosi od interesa, kao što su teški i laki lanci antitela, mogu da se proizvedu iz jednog policistronskog konstrukta. Ovi sistemi poželjno koriste interno riboomskomesto ulaska (IRES) kako bi obezbedili relativno visoke nivoe ekspresije modifikovanih antitela u eukariotskim ćelijama domaćinima. Kompatibilne IRES sekvence su opisane u U. S. patentu broj 6,193,980 koji je ovde inkorporiran prema referenci. Stručnjaci shvataju da takvi ekspresioni sistemi mogu da se koriste za efikasnu proizvodnju punog opsega modifikovanih antitela opisanih u ovoj patentoj prijavi.
Generalno, kada je vektor ili DNK sekvenca koja sadrži polipeptid, prema predmetnom pronalasku, kao što je modifikovano antitelo, pripremljen, tada ekspresioni vektor može da se uvede u odgovarajuću ćeliju domaćina. To znači da ćelije domaćini mogu biti transformirane. Uvođenje plazmida u ćeliju domaćina može da se postigne primenom različitih tehnika koje su dobro poznate stručnjacima. Ovde spadaju bez ograničenja, transfekcija, uključujući i elektroforezu i elektroporaciju, fuzija protoplasta, precipitacija kalcijum fosfatom, ćelijska fuzija sa obloženom DNK, mikroinjektiranje i infekcija intaktnim virusom. Videti, Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expresion Vectors", glača 24.2, str 470 - 472; Vectors, Rodriguez i Denhardt, urednici, Buttervvorths, Bostom, MA. 1988. Najpoželjnije, uvođenje plazmida u ćeliju domaćina se obavlja putem elektroporacije. Transformirane ćelije se odgajaju u uslovima koji odgovaraju proizvodnji lakih lanaca i teških lanaca i ispituje se njihova sinteza proteina teških i/ili lakih lanaca. Primeri tehnika za ispitivanje obuhvataju sa enzimom povezani imunosorbentni test (ELISA), radioimuno test (RIA) ili sorter analizu fluorescencijom aktiviranih ćelija (FACS), imunohistohemijsko ispitivanje i slično.
Kao što se ovde koristi pojam "transformacija" koristi se u širem smislu da označi bilo koje uvođenje DNK u recipijentnu ćeliju domaćina kojim se menja genotip i koje posledično dovodi do promene recipijentne ćelije.
Zajedno sa ovim, pojam "ćelije domaćini" označava ćelije koje su transformirane vektorima konstruisanim upotrebom tehnika rekombinantne DNK i koje sadrže makar jedan heterologi gen. Kao što je ovde definidano, antitelo ili njegov modifikovani oblik koji je dobijen pomoću ćelije domaćina posledica je ove transformacije. U opisima postupaka za izolaciju antitela iz rekombinantnih domaćina, pojmovi "ćelija" i "ćelijska kultura" se koriste naizmenično kako bi opisali izvor antitela, osim ukoliko jasno nije naznačeno drugačije. Drugim rečima, dobijanje antitela iz "ćelija" može da znači ili dobijanje iz dezintegrisanih čitavih ćelija ili iz ćelijske kulture koja sadrži i podlogu i suspendovane ćelije.
Linija ćelija domaćina koja se koristi za ekspresiju proteina, najpoželjnije je da bude sisarskog porekla. Stručnjaci poseduju znanje da poželjno odrede određene linije ćelija domaćina, koje su najpogodnije za željeni genski proizvod koji treba da bude eksprimiran u njima. Primeri linija ćelija domaćina obuhvataju, bez ograničenja, DG44 i DUX BI 1 (linije ćelija jajnika kineskog hrčka. DHFR minus), HELA (humani cervikalni karcinom), CVI (linija ćelija majmunksog bubrega), COS (deriva CVI sa T antigenom SV40), R1610 (linija fibroblasta kineskog hrčka), BALBC/3T3 (misiji fibroblast), HAK (linija ćelija bubrega hrčka), SP2/0 (ćelije mijeloma miša), P3.times.63 - Ag3.653 (ćelije mijeloma miša), BFA - lclBPT (linija goveđih endotelnih ćelija), RAJI (linija humanih limfocita) i 293 ćelije (ćelije humanih bubrega). Posebno su poželjne CHO ćelije. Linije ćelija domaćina su tipično dostupne iz komercijalnih izvora, od strane američke kolekcije tkivnih kultura ili iz objavljene literature.
In vitro proizvodnja omogućava masivnost proizvodnje kojom se dobijaju velike količine željenih antitela. tehnike kultivacije sisarskih ćelija u uslovima kulture tkiva su poznate u struci i obuhvataju kulturu u homogenoj suspenziji, npr., u reaktoru sa protikomvazduha ili u reaktoru sa konstantnim mešanjem ili u mobilisanoj ili fiksiranojćelijskoj kulturi; u šupljim vlaknima, mikrokapsulama, na mikročesticama agroze ili na keramičkim kertridžima. Radi izolacije modifikovanih antitela, imunoglobulini u supernatantima kulture se prvo koncentruju, npr., putem precipitacije sa amonijum sulfatom, liziraju se nasuprot hidroskopnih materijala kao što je PEG, filtriraju se selektivne membrane ili slično. Ukoliko je neophodno i/ili poželjno, koncentrovana antitela se prečišćavaju uobičajenim hromatografskim postupcima, npr., gel filtracijom, jonoizmenjivačkom hromatografijom, hromatografijom preko DEAE - celuloze ili imunoafinitetnom hromatografijom.
Geni modifikovanog imunoglobulina i/ili polipeptida prema predmetnom pronalasku, takođe mogu biti eksprimirani u ne sisarskim ćelijama, kao što su bakterije ili ćelije gljivica. U ovom slučaju treba napomenuti darazličiti jednoćelijski ne sisarski mikroorganizmi kao što su bakterije takođe mogu biti transformirani; tj., to se odnosi na one koji su sposobni za uzgajanje u kulturama ili za fermentaciju. Bakterije koje mogu biti tranformirane obuhvataju članove porodice enterobacteriaceae, kao što su sojevi E. coli: Salmonella: Bacillaceae, kao što su Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus i Haemophilus influenzae. Dalje treba napomenuti da nakon ekspresije u bakterijama teški i laki lanci imunoglobulina tipično postaju delovi inkluzionih tela. Ti lanci tada moraju biti izolovani, prečišćeni, a zatim ponovo sklopljeni u funkcionalne molekule imunoglobulina.
Pored prokariota, takođe mogu biti korišćeni eukariotski mikroorganizmi. Među najčešće korišćenim eukariotskim mikroorganizmima jeste Saccharomvces serevisiae, mada su i brojni drugi sojevi lako dostupni.
Prilikom ekspresija u porodici Sacharomvces, često se koristi plazmid YRp7.
(Stinchcomb et al., Nature 282: 39, 1979; Kingston et al., Gene 7: 141, 1979; Tschemper te al.. Gene 10: 157, 1980). Ovaj plazmid već sadrži trpi gen koji predstavlja selekcioni marker za mutantni soj gljivice kojoj nedostaje sposobnost da raste u podlozi sa triptofanom, na primer to je mutantni soj ATCC broj 44076 ili PEP4 - 1 (Jones, genetics 85: 12, 1977). Prisustvo trpi lezije kao karakteristike genoma gljivičnih ćelija domaćina obezbeđuje efikasnu sredinu za detekciju transformacije pomoću uzgajanja u odsustvu triptofana.
Bez obzira kako se dobijaju klinički korisne količine, modifikovana antitela prema predmetnom pronalasku, mogu da se koriste u jednom od brojnih konjugovanih, tj., imunokonjugovanih ili ne konjugovanih oblika. Posebno antitela, prema predmetnom pronalasku, mogu da se konjuguju sa citotoksinima kao što su radio izotopi, kao što su radioizotopi, terapeutska sredstva, citostatska sredstva, biološki toksini ili prekursori lekova. Alternativno, modifikovana antitela. prema predmetnom pronalasku, mogu da se koriste u ne konjuhgovanom ili golom obliku, da bi izazvala prirodne odbrambene mehanizme subjekta, uključujući od komplementa zavisnu citotoksičnost (CDC) i od antitela zavisnu ćelijsku cititoksičnost (ADCC) u cilju eliminacije malignih ćelija. U posebno poželjnim rešenjima, modifikovana antitela mogu biti konjugovana sa radioizotopima, kao što<90>Y,12<5>I,<13>1I,123I,<m>In,<105>Rh, 153Sm,<67>Cu,<67>Ga,<166>Ho,<177>Lu,l<86>Re i<188>Re korišćenjem nekog od brojnih dobro poznatih helatora iili korišćenjem direktnog obeležavanja. U drugim rešenjima. predmetni preparati mogu da sadrže modifikovana antitela koja su povezana sa lekovima. prekursorima lekova ili sa modifikatorima biološkog odgovora, kao što su metatreksat, adriamicin i limfokini kao što je interferon. U drugim rešenjima. prema predmetnom pronalasku, obezbeđena je upotreba modifikovanih antitela konjugovanih sa specifičnim biološkim toksinima, kao što su licin ili toksin difterie. U drugim rešenjima, modifikovana antitela mogu biti kompleksno povezana sa drugim imunokloški aktivnim ligandima (npr., sa antitelima ili njihovim fragmentima) pri čemu se rezultujući molekul vezuje i za neoplastičnu ćeliju i za efektorsku ćeliju kao što je T ćelije. Izbor konjugovanog ili ne konjugovanog modifikovanog antitela zavisi od tipa i stadij uma kancera, od upotrebe dodatnih tretmana (npr.. hemoterapije ili eksterne radijacije), i od stanja pacijenta. Treba napomenuti da stručnjaci mogu lako da naprave takav izbor shodno ovde obezbeđenim opisima.
Kao što se ovde koristi, izraz "citotoksin ili citotoksično sredstvo" označava bilo koje sredstvo koje ima poguban uticaj na rast i proliferaciju ćelija i koje može delovati tako da smanji, inhibira ili uništi malignitet, kada se ovaj njemu izloži. Primeri citotoksina obuhvataju, bez ograničenja, radionuklide, biološke toksine, citostatska ili citotoksična sredstva, prekursore lekova, imunološki aktivne Ugande i modifikatore biološkog odgovora, kao što su citokini. Kao što će biti detaljnije diskutovano u tekstu koji sledi, radionuklidni citotoksini su posebno poželjni za upotrebu prema predmetnom pronalasku. Međutim, bilo koji citotoksin koji deluje tako da ošteti ili uspori rast malignih ćelija ili koji ih eliminiše i koji može biti udružen sa modifikovanim antitelima prema predmetnom pronalasku, obuhvaćen je obimom zaštite prema predmetnom pronalasku.
Treba napomenuti da u prethodnim ispitivanjima, anti - tumorska antitela koja su obeležena izotopima jesu uspešno korišćena za uništavanje ćelija u solidnim tumorima kao i u životinjskim modelima limfoma/leukemija, i u nekim slučajevima kod ljudi. Radionuklidi deluju tako što proizvode jonizujuće zračenje koje izaziva višestruke prekide niti jedarne DNK, što vodi ćelijskoj smrti. Izotopi koji se koriste za proizvodnju terapeutskih konjugata, tipično proizvode visokoenergetske a, p iliyčestice koje imaju terapijski efikasnu dužinu dejstva. Takvi radionuklidi ubijaju ćelije koje im se nalaze u blizini, npr., neoplastične ćelije za koje je konjugat prikačen ili u koju je ušao. Oni generalno ispoljavaju malo ili ni malo dejstva na nelokalizovane ćelije. Radionuklidi su praktično ne imuni.
Prilikom upotrebe radio - obeleženih konjugata, prema predmetnom pronalasku, modifikovana antitela mogu biti direktno obeležena. npr., putem jodinacije ili mogu biti obeležene indirektno, putem upotrebe helirajućeg sredstva. Kao što se ovde upotrebljava, pojmovi "indirektno obeležavanje" i "pristup putem indirektnog obeležavanja" označavaju da je helirajuće sredstvo kovalentno povezano sa antitelom i da je barem jedan radionuklid udružen sa helirajućim sredstvom. Navedena helirajuća sredstva se tipično označavaju kao konvencionalna helirajuća sredstva, jer se vezuju za polipeptid i za radioizotop. Posebno poželjna helirajuća sredstva, obuhvataju derivate 1-izotiocikmatobenzil-3-metildiotelen triaminpentasirćetnu kiseline (MX - DTPA) i cikloheksil diethilentriamin pentasirćetnu kiseline (CHX - DTPA). Druga helirajuća sredstva obuhvataju P - DOTA i EDTA derivate. Posebno poželjni radionuklidi za indirektno obeležavanje obuhvataju<1H>In i<90>Y.
Kao što se ovde upotrebljava, pojmovi "direktno obeležavanje" i "pristip direktnog obeležavanja", označavaju daje radionuklid kovalentno prikačen direktno za antitelo, tipično putem aminokiselinskog ostatka. Posebno, ove tehnologije povezivanja obuhvataju nasumično obeležavanje i na određeno mesto usmereno obeležavanje. U ovom drugom slučaju obeležavanje je usmereno na specifična mesta na dimeru ili dekameru, kao što su N - povezani šećerni ostaci prisutni samona Fc delu konjugata. Dalje, različite tehnike direktnog obeležavanja, protokoli su kompatibilni sa predmetnim pronalaskom. Na primer, Technetium-99m obeležena antitela, mogu da se dobiju postupcima izmene Uganda, redukcijom pertehnetata (Tc04") sa rastvorima sa jonom kalaj a, heliranjem redukovanog tehnecijuma na Sephadex kolonu i primenom antitela na ovu kolonu, ili može da se dobije tehnikama masovnog obeležavanja, npr., putem inkubacije pertehnetata, redukujućeg sredstva kao stoje SnCl2, rastvora pufera, kao što je rastvor natrijum - kalijum ftalata i antitela. U svakom slučaju, poželjni radionuklidi za direktno obeležavanje antitela su dobro poznati u struci, a posebno poželjan radionuklid za direktno obeležavanje je<131>1, koji je kovalentno povezan putem tirozinskih ostataka. Modifikovana antitela, prema predmetnom pronalasku, mogu biti derivirana, npr., sa radioaktivnim natrij um ili kalijum jodinom i hemijskim oksidacionim sredstvom, kao što je natrij um hipohlorit. hloramin T ili slični, ili sa enzimskim oksidacionim sredstvom, kao što je laktoperoksidaza, glukoza oksidaza ili glukoza. Međutim, za svrhe predmetnog pronalaska posebno je poželjan indirektni pristup obeležavanju.
Patenti koji se odnose na helatore i konjugate helatora su poznati u struci. Na primer, U. S. patent broj 4, 831,175 od Gansovv - a, se odnosi na helate polisupstituisane dietilentriaminpentasirćetne kiseline i proteinske konjugate koji sadrže istu. kao i na postupke za njihovo dobijanje. U. S. patenti broj 5,099,069; 5,246,692; 5,286,850; 5,434.287 i 5,124,471 od Gansow-a se takođe odnose na polisupstituisane DTPA helate . Ovi patenti su ovde inkorporirani prema referenci u celosti. Drugi primeri kompatibilnih metalnih helatora su etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTA), dietilentriaminpentasirćetna kiselina (DTPA. 1,4,8,11-tetraazatetradekan, 1,4,8,11-tetraazatetradekan-1,4.8,11 -tetrasirćetna kiselina. 1 -oksa-4,7,12,15-tetraazaheptadekan-4,7.12,15-tetrasirćetna kiselina, ili slične. Posebno su poželjni cikloheksil - DTPA ili CHX - DTPA, koji su u primerima ekstenzivno opisani. I drugi kompatibilni helatori, uključujući one koji tek treba da budu otkriveni, mogu lako da se upotrebe od strane stručnjaka i jasno su obuhvaćeni obimom zaštite, prema predmetnom pronalasku.
Kompatibilni helatori, uključujući specifični bifunkcionalni helator, se koristi da pospeši helaciju u važećim prijavama čiji su serijski brojevi 08/475,815 i 08/478,96, posebno su poželjno izabrani da obezbede visoki afinitet za trivalentne metale, i pokazuju povišeni odnos tumor - prema netumorskom i smanjeno preuzimanje od strane kosti , kao i veće in vivo zadržavanje radionuklida na ciljnim mestima, tj.. na mestima gde se nalazi B - ćelijski limfom. Međutim, i drugi bifunkcionalni helatori koji mogu a ne moraju da poseduju sve od ovih karakteristika, dobro su poznati u struci za koju mogu biti od koristi u terapiji protiv tumora.
Takođe, treba napomenuti da prema opisu predmetnog pronalaska, modifikovana antitela, mogu biti konjugovana sa različirim radioaktivnim oznakama u cilju dijagnostikovanja i tretiranja. U ovom slučaju, napred pomenute važeće patentne prijave koje su ovde inkorporirane prema referenci u potpunosti, opisuju radioaktivno obeležene terapeutske konjugate za dijagnostičko "snemanje" tumora pre primene terapijskog antitela. "In2B8" konjugat sadrži mišije monoklonsko antitelo, 2B8 koje je specifično za humani antigen CD20, prikačeno je za '"in putem bifunkcionalnog helatora, npr., MX - DTPA, koji sadrži smešu 1:1 supstanci l-izotiocijanatobenzil-3-metil-DTPA i l-metil-3-izotiocijanatobenzil-DTPA. Kao dijagnostički radionuklid posebno je poželjan '"in, jer se između 1 i 10 mCi može bezbedno primeniti bez detektabilne toksičnosti, a podaci dobijeni snimanjem generalno predviđaju naknadnu distribuciju antitela obeleženog sa<9>(<1>Y. Većina ispitivanja snimanjem koristi antitelo obeleženo sa mIn aktivnosti 5 mCi, jer je ova doza i sigurna i vodi povećanoj efikasnosti snimanja u poređenju sa manjim dozama, pri čemu se optimalno snimanje beležišest dana nakon primene antitela. Videti, na primer. Murrav, J. Nuc. Med. 26: 3328, 1985; i Carraguillo et al., J. Nuc. Med. 26: 67, 1985.
Kao što je naznačeno gore, različiti radionuklidi mogu da se primene, prema predmetnom pronalasku, a stručnjaci poseduju sposobnost da lako odrede koji radionuklid najviše odgovara datim uslovima. Na primer, je dobro poznat radionuklid koji se koristi za ciljanu imuno terapiju. Međutim, klinička upotrebljivost<bl>I može biti ograničena brojnim faktorima u koje spadaju: fizički poluživot od 8 dana; dehalogenizacija jodiniranih antitela i u krvi i na mestu tumora; i emisione karakteristike (npr,. značajna gama komponenta), koja može biti suboptimalna za depoziciju lokalizovane doze u tumoru. Sa pojavom, superiornih helirajućih sredstava, mogućnost za prikačinjanje metalnih helirajućih grupa na proteine, povećala je mogućnost upotrebe drugih radionuklida kao što se mIn i 90Y.<90>Y poseduje nekoliko prdnosti pri upotrebi u radioimunoterapijskim primenama: poluživot<90>Y od 64 časa je dovoljno da obezbedi akumulaciju antitela od strane tumora i za razliku od npr..<I31>I,<90>Y je čist beta emiter visoke energije, bez prateće gama radijacije pri svom raspadanju, sa opsegom dejstva u tkivu od 100 do 1000 ćelijskih dijametara. Dalje, minimalna količina penetrantne radijacije dozvoljava primenu antitela obeleženih sa 90Y u van bolničkim uslovima. Dodatno, internalizacija obeleženog antitela. nije neophodna za ubijanje ćelije, jer je lokalna emisija jonizujućeg zračenja letalna za okolne tumorske ćelije kojima nedostaje ciljni antigen.
Efikasne pojedinačne tretmanske doze (tj., terapijski efikasne količine)<90>Y - obeleženih modifikovanih antitela, nalaze se u opsegu između oko 5 i 75 mCi, poželjnije između oko 10 i oko 40 mCi. Efikasne pojedinačne tretmanske doze bez ablativnog dejstva na kostnu srž<1>3II- obeleženih antitela. nalaze se u opsegu između oko 5 do 70 mci. poželjnije između 5 i 40 mCi. Efikasne pojedinačne tretmanske ablativne doze (tj., doze koje mogu zahtevati autologu transplantaciju kostne srži)<131>1 - obeleženih antitela. nalaze se u opsegu od oko 30 do oko 600 mCi. poželjnije između 50 i manje od 500 mCi. Prilikom upotrebe himeričnih antitela. usled dužeg poluživota u cirkulaciji vis - a - vis mišijih antitela, efikasne pojedinačentretmanske doze koje nisu ablativne za kostnu srž '?1 - obeleženih himeričnih antitela se nalaze u opsegu od oko 5 do oko 40 mCi, poželjnije manje od oko 30 mCi. Kriterij umi za upotrebu pri snimanju npr., sa '"in - obeleženim sredstvima je aktivnost tipično manja od 5 mCi.
Iako je veliki deo kliničkog iskustva stečen sa<bl>I i sa 90Y, druge radio oznake koje su poznate u struci su korišćene u slične svrhe. Takođe, i drugi radioizotopi su korišćeni za snimanje. Na primer, dodatni radioizotopi koji su kompatibilni sa obimom zaštite, prema predmetnom pronalasku, obuhvataju, bez ograničenja:<123>I,<12>T,<j2>P,"<7>Co,<64>Cu.77Br,8,Rb, slKr,87Sr,1,3In, ,97Hg,203Pb,206Bi,177Lu, 186Re, 212Pb, 212Bi, 47Sc,
<105>Rh.<109>Pd,l5<3>Sm,<188>Re,<199>Au,<225>Ac,<21>'At i<213>Bi. U ovom slučaju i alfa i gama i beta emiteri su kompatibilni sa predmetnim pronalaskom. Dalje, prema predmetnom opisu, podrazumeva se da stručnjak može lako da odredi koji radio nukleotidi su kompatibilni sa izabranom vrstom tretmana bez nepotrebne eksperimentacije. Tako, dodatni radionuklidi koji su već korišćeni za postavljanje kliničke dijagnoze, obuhvataju<125>I,<12j>I,<99>Tc,<43>K,<52>Fe.<67>Ga,<ć8>Ga kao i<lu>In. Takođe, antitel a su obeležena sa različitim radionuklidima radi potencijalne upotrebe u ciljanoj imunoterapiji (Peirersz et al., Immunol. Cell Biol. 65: 111 - 125, 1987.). Ovi radionuklidi obuhvataju<188>Re i<186>Re, kao i<199>Au i<67>Cu u manjem stepenu. U. S. patent broj 5,460,785 obezbeđuje dodatne podatke o takvim radioizotopima i ovde je inkorporiran prema referenci.
Kao dodatak radionuklidima, modifikovana antitela prema predmetnom pronalasku mogu biti konjugovana ili udružena sa bilo kojim od brojnih modifikatora biološkog odgovora, sa farmaceutskim sredstvima toksinima i imunološki aktivnim ligandima. Stručnjaci shvataju da ovi ne radioaktivni konjugati mogu biti sklopljeni upotrebom različitih tehnika, što zavisi od izabranog citotoksina. Na primer, konjugati sa biotinom se dobijaju, npr., reakcijom modifikovanihantitela sa aktiviranim estrom biotina kao što je biotin - N - hidroksisukcinimin estar. Slično tome, konjugati sa fluoroscentnim markerom mogu da se dobiju u prisustvu sredstva za vezivanje, npr., kao što su ona koja su navedena gore, putem reakcije sa izotiocijanatom, poželjno sa fluoroscein - izotiocijanatom. Konjugati himeričnih antitela, prema predmetnom pronalasku sa citostatskim/citotoksičnim supstancama i metalni helati se dobijaju na analogni način.
Poželjna sredstva za upotrebu p prema predmetnom pronalasku, jesu citotoksični lekovi, posebno oni koji se koriste uterapiji kancera. Takvi lekovi obuhvataju, generalno, citostatska sredstva. alkilirajuća sredstva, antimetabolite, antiproliferativna sredstva.sredstva koja vezuju tubulin, hormone i antagoniste hormona i slične. Primeri citostatika koji se kompatibilni sa predmetnim pronalaskom, obuhvataju alkilirajuće supstance, kao što su mehloretamin, trietilenfosforamid, ciklofosfamid, ifosfamid. hlorambucil, busulfan. melfalan ili triazihon. takođe obuhvataju i nitrozurea jedinjenja kao što su karmustin, lomustin, ili semustin. Druge poželjne klase citotoksičnih sredstava, obuhvataju, na primer, antraciklinsku porodicu lekova, vinka lekove, mitomicine, leomicine, citotoksične nukleozide, pteridinsku familiju lekova, diene, i podofilotoksine. Posebno korisni članovi ovih klasa obuhvataju, na primer, adriamicin, karminomicin, daounorubicin (daunomicin), doksorubicin, aminopterin, metotreksat, metopterin, mitramicin, streptonigrin, dihlorometotreksat, mitomicin - C, aktinomicin - D, porfiromicin, 5 - fluorouracil, floksuridin, ftorafur, 6 - merkaptopurin, citarabin, citozin arabinozid, podofilotoksin, ili derivate podofilotoksina, ako što su etopozid ili etopozid fosfat, melfalan, vinblastin, vinkristin, leurosidin, vindezin, leurozin i slične. Drugi citotoksini koji su kompatibilni sa ovde iznetim opisom obuhvataju taksol, taksan,citohalazin - B. gramicidin - D, etidijum bromid, emetin, tenopozid, kolhicin, dihiđroksi - antracin dion, toksantron, prokain, , tetrakain, lidokain, propranolol i furomicin, kao i njihove naloge i homologe. Sa opisom koji je ovde predstavljen takođe su kompatibilni, hormoni i hormonski antagonisti, kao što su kortikosteroidi, npr., prednizon, progestini, npr., hidroksiprogesteron, ili medroprogesteron, estrogeni, npr., dietilstilbestrol, antiestrogeni, npr., tamoksifen, androgeni, npr., testosteron i inhibitori aromataze, npr., aminoglutetimid. Kao što je ranije napomenuto, stručnjak može da napravi hemijske modifikacije željenih jedinjenja, kako bi se reakcije jedinjenja bolje prilagodile za svrhe dobijanja konjugata prema predmetnom pronalasku.
Jedan primer posebno poželjnih citotoksina obuhvata članove ili derivate enedinske porodice anti - tumorskih antibiotika, uključujući kaliheamicin,esperamicine ili dinemicine. Ovi toksini su ekstremno potentni i deluju tako što cepaju nuklearni DNK. što vodi ćelijskoj smrti. Za razliku od proteinskih toksina, koji mogu in vivo da budu degradirani, čime se dobijaju neaktivni, ali imunogeni polipeptidni fragmenti, toksini kao što su kaliheamicin, esperamicini i drugi enediini su mali molekuli koji su praktično ne imunogeni. Ovi ne peptidni toksini su hemijski povezani sa dimerima upotrebom tehnika koje su ranije korišćene za obeležavanje monoklonskih antitela i drugih molekula. Ove tehnologije povezivanja obuhvataju za mesto specifično vezivanje putem N - povezanih šećernih ostataka, prisutnih samo na Fc delu konjugata. Takvi postupci povezivanja usmereni na mesto imaju tu prednost što smanjuju moguće efekte vezivanja na svojstva vezivanja konjugata.
Kao što je prethodno pomenuto, kompatibilni citotoksini mogu da sadrže prekursor leka. Kao što se ovde koristi, pojam "prekursor leka" označava prekursor ili derivirani oblik farmaceutski aktivne supstance koji je manje citotoksičan prema tumorskim ćelijama u poređenju sa osnovnim lekom i koji poseduje sposobnost da bude enzimski aktiviran ili preveden u aktivniji roditeljski oblik. Prekursori lekova koji su kompatibilni sa predmetnim pronalaskom obuhvataju, bez ograničenja, prekursore lekova koji sadrže fosfate, prekursore lekova koji sadrže tiofosfate, prekursore lekova koji sadrže sulfate, prekursore lekova koji sadrže peptid. prekursore lekova koji sadrže (3 - laktan, opciono supstituisane prekursore lekova koji sadrže fenoksiacetamid, ili opciono supstituisane prekursore lekova koji sadrže fenilacetamid, 5 - fluorocitozin i drugi 5 - fluoridinski prekursori lekova kojimogu biti prevedeni u aktivnije slobodne citotoksične lekove. Dalji primeri citotoksičnih lekova koji mogu biti aktivirani u prekursore lekova radi upotrebu u predmetnom pronalasku, obuhvataju hemoterapeutska sredstva koja su opisana ranije.
Među drugim citotoksinima, treba napomenuti da antitelo takođe može biti udruženo sa biološkim toksinima, kao što su podjedinica A ricina, abrin, toksin difterije, botulinus, cijanginozini, saksitoksin, šigatoksin,tetanus, tetrodotoksin, trihotecen, verukologen ili neki toksični enzim. Poželjno, takvi konstrukti se prave korišćenjem tehnika genetskog inžinjeringa koje omogućavaju direktnu ekspresiju konstrukta antitela i toksina. Drugi modifikatori biološkog odgovora koji mogu biti udruženi sa modifikovanim antitelima prema predmetnom pronalasku obuhvataju citokine. kao što su limlbkini i interferoni. Štaviše, kao što je naznačeno gore, slični konstrukti takođe mogu biti upotrebljeni za udruživanje imunološki aktivnih liganada (npr., antitela ili njihovih fragmenata) sa modifikovanim antitelima prema predmetnom pronalasku. Poželjno, ovi imunološki aktivni Ugandi su usmereni ka antigenima na površini imunoaktivnih eektorskih ćelija. U ovim slučajevima, konstrukti se koriste da dovedu efektorske ćelije kao što su te ćelije ili NK ćelije u neposrednu blizinu neoplastičnih ćelija koje nose antigen udružen sa tumorom, čime se izaziva željeni imuni odgovor. U ovom predmetnom opisu se podrazumeva da stručnjak može lako da sačini takve konstrukte upotrebom konvencionalnih tehnika.
Druga klasa kompatibilnih citotoksina koja može biti upotrebljena zajedno sa opisanim modifikovanim anatitelima jeste klasa lekova koji povećavaju radiosenzitivnost koji mogu efikasno biti usmereni ka tumorskim ćelijama. Takvi lekovi povećavaju senzitivnost na jonizujuće zračenje, čime povećavaju efikasnost radioterapije. Konjugat sa antitelom koji je internalizovan od strane tumorske ćelije doprema sredstvo za povećavanje radiosenzitivnosti bliže jedru gde raiosenzitizacije treba da bude maksimalna. Nevezano sredstvo za radiosenzitivaciju koje je povezano sa modifikovanim antitelima treba da bude brzo izbačeno iz cirkulacije, čime se lokalizuje ostatak sredstva za radiosenzitivaciju u ciljnom tumoru i čime se obezbeđuje minimalno preuzimanje od strane normalnog tkiva. Nakon brzog klirensa iz krvi, dodatna radioterapija treba da bude primenjena na jedan od tri moguća načina: 1.) u vidu eksternog zračenja zracima usmerenim specifično na tumor; 2.) u vidu radioaktivnosti koja je direktno inpplantirana u tumor ili 3.) u vidu sistemske radioimunoterapije sa istim antitelima za ciljanje. Potencijalno privlačna varijanta ovog pristupa bi bila prikačinjanje terapeutskog radioizotopa za imunokonjugat sa radiosenzitirajućim sredstvom, čime se na pogodan način obezbeđuje primena samo jednog leka kod pacijenata.
Bez obzira da li se opisana antitela koriste ili ne koriste u konjugovanom ili ne konj ugovanom obliku, treba napomenuti da je glavna prednost predmetnog pronalaska sposobnost da se koriste ova antitela kod mijelosuprimiranih pacijenata, posebno kod onih koji su podvrgnuti ili koji su bili podvrgnuti dodatnim terapijama kao što su radioterapija i hemoterapija. To znači da pogodni profil dopremanja (tj., relativno kratko vreme koje provode u serumu i poboljšana lokalizacija) modifikovanih antitela čini ih posebno pogodnim za tretiranje pacijenata koji poseduju smanjene rezerve crvene kostne srži koji su osetljivi na mijelotoksičnost. U ovom smislu, jedinstveni profil dopremanja modifikovanih antitela čini ih vrlo efikasnim prilikom primene radioaktivno obeleženih konjugata, kod mijelosuprimiranih pacijenata obolelih od kancera. Kao takva, modifikovana antitela su korisna u konjugovanom ili ne konjugovanom obliku kod pacijenata koji su prethodno bili podvrgnuti dodatnim terapijama, kao što su eksterna zračna terapija ili hemoterapija. U drugim poželjnim rešenjim, modifikovana antitela (ponovo u konjugovanom ili ne konjugovanom obliku) mogu da se koriste u kombinovanim terapijskim režimima sa hemoterapeutskim sredstvima. Stručnjacima je jasno da takvi terapijski režimi mogu da obuhvataju sekvencijalnu, simultanu, konkurentu ili koekstenzivnu primenu opisanih antitela i jednog ili više hemoterapeutskih sredstava. Posebno poželjna rešenja prema predmetnom pronalasku, jesu ona koja obuhvataju primenu radioaktivno obeleženog antitela.
Iako modifikovana antitela mogu biti primenjena kao što je opisano u tekstu neposredno iznad, treba napomenuti da u drugim rešenjima, konjugovana ili ne konjugovana modifikovana antitela mogu biti primenjena kod inače zdravih kancerskih pacijenata, kao terapeutsko sredstvo prve linije. U takvim rešenjima, modifikovana antitela mogu biti primenjena kod pacijenata koji poseduju neoplaziju i/ili kod pacijenata koji nisu bili i trenutno nisu podvrgnuti dodatnim terapijama, kao što su zračenje, eksterno zračenje ili hemoterapija.
Polipeptidi prema predmetnom pronalasku
Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje izolovane IGSF9 ili LIV - 1 polipeptide koji poseduju aminokiselinske sekvence predstavljene na slikama 1B, 9F, 21B ili 22B (sekvence čiji su brojevi : 2, 4, 6, 8, 22 - 27, ili 29), ili peptide ili polipeptide koji sadrže deo gore navedenih polipeptida. Pojam "peptid" i "oligopeptid" se smatraju sinonimima (kao što je to inače uobičajeno), a svaki od pojmova može da se koristi naizmenično sa onim drugim kao što zahteva kontekst kako bi se naznačio lanac od najmanje dve aminokiseline povezane peptidnim vezama. Pojam "polipeptid" se ovde koristi za lance koji sadrže više od deset aminokiselinskih ostataka. Sve oligopeptidne i polipeptidne formule ili sekvence ovde su napisane sleva nadesno i u smeru od amino terminala ka karboksi terminalu.
Treba napomenuti da u struci neke aminokiselinske sekvence polipeptida IGSF9 ili LIV - 1 mogu da variraju bez značajnog efekta na strukturu ili funkciju proteina. Ukoliko su takve razlike u sekvencima učinjene, treba zapamtiti da postoje kritična područja na proteinima koja određuju njihovu aktivnost. Generalno, moguće je zameniti ostatke koji formiraju tercijalnu strukturu, uz uslov da ostaci koji poseduju slične funkcije budu upotrebljeni. U drugim slučajevima, tip ostatka može biti potpuno nevažan, ukoliko se promena čini na nekritičnom regionu proteina.
Tako, predmetni pronalazak dalje obuhvata varijacije IGSF9 ili LIV - 1 polipeptida koje obuhvataju regione IGSF9 ili LIV - 1 proteina kao što su proteinski delovi opisani ispod. Takvi mutanti obuhvataju delecije, insercije, inverzije, ponavljajuće delove i supstitucije istog tipa (na primer, supstitucija jednog hidrofilnog ostatka drugim, ali ne jako hidrofilnog za jako hidrofobnog). Male promene ili navedene "neutralne" aminokiselinske supstitucije generalno ispoljavaju mali efekat na aktivnost.
Kao tipično konzervativne supstitucije se smatraju zamene jedne sa drugom između alifatičnih aminokiselina Ala, Val, Leu i Ile; zamena hidroksilnih ostataka Ser i Thr. izmena kiselih ostataka Asp i Glu, supstitucija između amidnih ostataka Asn i Gln, izmena baznih ostataka Lys i Arg i zamena između aromatičnih ostataka Phe, Tyr.
Kao što je detaljno naznačeno gore, dalja smernica koja određuje koje aminokiselinske promene će verovatno biti fenotipski neme (tj.; za koje postoji verovatnoća da neće izazvati značajan poguban efekat na funkciju) opisane su u Bovvie, J. U., et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions"Science 247 :1306 -1310 (1990) .
Tako, fragment, derivat ili analog polipeptida prikazanih na slikama 1B, 9B, 9D, 9F, 21B, ili 22B (sekvence čiji su ID brojevi: 2, 4, 6, 8, 22 - 27, ili 29), može biti: (i) onaj u kome je jedan ili više aminokiselinskih ostataka supstituisano sa konzerviranim ili nekonzerviranim aminokiselinskim ostatkom (poželjno konzerviranim aminokiselinskim ostatkom), a takav supstituisan aminokiselinski ostatak može a ne mora biti onaj koji je kodiran u genetskom kodu ili (ii) onaj kod koga jedan ili više aminokiselinskih ostataka sadrži supstituentsku grupu, ili (iii) onaj kod koga je zreli polipeptid fuzionisan sa drugim jedinjenjem, kao što je to jedinjenje koje povećava poluživot polipeptida u plazmi (na primer, polietilen glikol), ili (iv) onaj kod koga su dodatne aminokiseline fuzionisane sa zrelim polipeptidom, kao što je to IgG Fc fuzioni region peptid ili lider ili sekretorna sekvenca ili sekvenca koja se koristi za prečišćavanje zrelog peptida ili pro - proteinske sekvence. Takvi fragmenti, derivati i analozi su poznati stručnjacima na osnovu ovde iznetog opisa.
Aminokiseline u IGSF9 ili LIV - 1 proteinima prema predmetnom pronalasku koje su od ključne važnosti za funkciju mogu biti identifikovane postupcima koji su poznati u struci, kao što su na određeno mesto usmerena mutageneza ili mutageneza sa ispitivanjem alanina (Cunningham & Wells.Science 244: 1081 - 1085 (1989)). Ovaj drugi postupak podrazumeva uvođenje mutacija pojedinačnih alanina na svakom ostatku u molekulu. Dobijeni mutantni molekuli se zatim ispituju na biološku aktivnost. Mesta koja su kritična za vezivanje liganda i receptora takođe mogu biti određena putem strukturne analize kao sto je kristalizacija, nuklearna magnetna rezonanca ili fotoafmititno vezivanje (Smithet al, J. Mol. Bio. 224: 899-904 (1992) & de Voset al. Science 255 :306 -312 (1992)).
Polipeptidi prema predmetnom pronalasku su poželjno obezbeđeni u izolovanom obliku. Pojam "izolovani polipeptid" označava polipeptid koji je uklonjen iz svog nativnog okruženja. Tako, polipeptid koji je proizveden i / ili koji je sadržan u rekombinantnoj ćeliji domaćinu smatra se izolovanim za svrhe predmetnog pronalaska. Takođe, pod "izolovanim polipeptidima" smatraju se polipeptidi koji su prečišćeni, parcijalno ili značajno prečišćeni iz rekombinantne ćelije domaćina.
Brojni postupci koji su poznati u struci mogu da se upotrebe za dobijanje bilo kog izolovanog polipeptida prema predmetnom pronalasku. Na najprostijem nivou, aminokiselinska sekvenca može biti sintetisana upotrebom komercionalno dostupnih peptidnih sredstava za sintezu. Sintetski konstruisane proteinske sekvence zbog toga što poseduju primarne, sekundarne ili tercijarne strukturne i/ili konformacione karakteristike koje su iste sa proteinima dobijenim u ćelijama mogu da poseduju biološka svojstva koja su identična tim proteinima, uključujući i njihovu proteinsku aktivnost. Ova tehnika je posebno korisna pri proizvodnji malih peptida i fragmenata većih polipeptida. Fragmenti su korisni, na primer, pri dobijanju antitela protiv nativnih polipeptida. Tako, oni mogu biti upotrebljeni kao biološki aktivni ili imunološki supstituenti za prirodne, prečišćene proteine prilikom ispitivanja terapijskih jedinjenja i imunoloških procesa tokom razvoja antitela.
Polipeptidi prema predmetnom pronalasku mogu alternativno biti prečišćeni iz ćelija koje su izmenjene tako da eksprimiraju željeni polipeptid. Kao što se ovde koristi, za ćeliju se kaže da je izmenjena u smislu ekspresije željenog polipeptida onda kada je ćelija putem genetske manipulacije tako načinjena da proizvodi polipeptid koji se normalno ne proizvodi u ćeliji ili koji ćelija normalno proizvodi u malom nivou. Stručnjak lako može da prilagodi postupke za uvođenje i ekspresiju bilo rekombinantnih ili sintetskih sekvenci u eukariotske ili prokariotske ćelije kako bi se dobila ćelija koja proizvodi jedan od polipeptida prema predmetnom pronalasku. Ovde spadaju, između ostalog, oni plazmidi i ćeije domaćini koji su opisani ranije. Na primer, rekombinantno proizvedena verzija bilo IGSF9 ili LIV - 1 polipeptida može biti u značajnoj meri prečišćena upotrebom postupka sa jednim korakom koji je opisan kod Smith & Johnson,Gene67:3\-40(1988).
IGSF9 ili LIV - 1 polipeptidi prema predmetnom pronalasku obuhvataju polipeptide koji sadrže vodeću sekvencu ; zreli polipeptid bez vodeće sekvence (tj., zreli protein); polipeptid koji sadrži aminokiseline od 21 do 718 koje su prikazane na slici 1B (sekvenca čiji je ID br. 2); polipeptid koji sadrži aminokiseline od 1 do 1179 koje su prikazane na slici 9F (sekvenca čiji je ID br. 8); polipeptid koji sadrži aminokiseline od 21 do 1179 koji je prikazan na slici 9F (sekvenca čiji je ID br. 8); polipeptid koji sadrži sekvencu prikazanu kao sekvenca čiji je ID br. 4, 6, 22 - 27; polipeptid koji sadrži aminokiseline od 28 do 317 koji je prikazan na slici 22B (sekvenca čiji je ID br. 29); polipeptid koji sadrži aminokiseline od 373 do 417 koje su prikazane na slici 22B (sekvenca čiji je ID br. 29); polipeptid koji sadrži aminokiseline od 674 do 678 prikazan je na slici 22B (sekvenca čiji je ID br. 29); polipeptid koji sadrži aminokiseline od 742 do 749 prikazan je na slici 22B (sekvenca čiji je ID br. 29); kao i polipeptide koji su najmanje 80% identični, koji su poželjnije barem 90 % ili 95 % identični, još poželjnije barem 96 %, 97 %, 98 % ili 99 % identični sa polipeptidima koji su opisani gore i koji takođe sadrže delove takvih polipeptida sa najmanje 30 aminokiselina, a poželjnije sa najmanje 50 aminokiselina.
Pod pojmom "procenat sličnosti" dva polipeptida smatra se ocena sličnosti koja se dobija poređenjem aminokiselinskih sekvenci dva polipeptida upotrebom Bestfit programa, kao i standardnih podešavanja za određivanje sličnosti. Bestfit program koristi algoritam lokalne homologije opisan od Smith & Waterman (Advances in Applied Mathematics 2 : 482 - 489, 1981), kako bi se pronašao najbolji segmenat sličnosti između dve sekvence.
Kada se kaže da polipeptid poseduje aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje, na primer, 95 % "identična" sa referentnom aminokiselinskom sekvencom bilo IGSF9 ili LIV - 1 polipeptida. podrazumeva se da je aminokiselinska sekvenca polipeptida identična sa referentnom sekvencom sa izuzetkom što polipeptidna sekvenca može da sadrži do pet izmenjenih aminokiselina na svakih sto aminokiselina referentne aminokiselinske sekvence IGSF9 ili LIV - 1 polipeptida. Drugim rečima, da bi se dobio polipeptid koji poseduje aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95 % identična sa referentnom aminokiselinskom sekvencom, do 5% aminokiselinskih ostataka u referentoj sekvenci može biti deletirano ili supstituisano sa drugim aminokiselinama ili 5 % od ukupnih aminokiselinskih ostataka u referentnoj sekvenci može biti insertovano u referentnu sekvencu. Ove promene referentne sekvence mogu da se jave na amino ili na karboksi terminalnim položajima referentne aminokiselinske sekvence ili bilo gde između ovih terminalnih položaja, tako što su individualno razmeštene među ostacima referentne sekvence ili se nalaze u vidu jedne ili više kontinualnih grupa unutar referentne sekvence.
Praktično posmatarano, određivanje da li je neki dati polipeptid najmanje 90, 95, 96, 97, 98, ili 99% identičan sa, na primer, aminokiselinskom sekvencom koja je prikazana na slikama 1B i 22B (sekvenca čiji su ID br. 2 i 29) može da se postigne konvencijalnom upotrebom poznatih kompjuterskih programa kao što je Bestfit program (Wisconsin Sequence Analvsis Package, Version 8 for Unix. Genetics Computer Group, Universitv Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711). Kada se koristi Bestfit program ili bilo koji drugi program za poravnavanje sekvenci pri određivanju da li je određena sekvenca, na primer, 95% identična sa referentnom sekvencom prema predmetnom pronalasku, parametri su podešeni, naravno, tako da se procenat identičnosti proračunava u odnosu na referentnu aminokiselinsku sekvencu pune dužine i da se dozvoljava postojanje praznina u homologiji sve do 5% od ukupnog broja aminokiselinskih ostataka u referentnoj sekvenci.
Polipeptidi prema predmetnom pronalasku su korisni kao markeri molekulske mase na SDS - PAGE gelovima ili na kolonama sa filtracijom sa gelovima koji su molekularna sita upotrebom postupaka koji su dobro poznati stručnjacima.
Prečišćeni polipeptidi mogu da se koriste u in vitro testovima vezivanja koji su dobro poznati u struci za identifikaciju molekula koji se vezuju za polipeptide. Ovi molekuli obuhvataju, bez ograničenja, na primer, male molekule, molekule iz kombinatornih biblioteka, antitela ili druge proteine.
Dodatno, peptidi prema predmetnom pronalasku ili molekuli koji su sposobni za vezivanje za ove peptide mogu da formiraju komplekse sa toksinima, npr., sa ricinom ili kolera toksinom ili sa drugim jedinjenjima koja su toksična za ćelije. Molekulski kompleks koji se vezuje za toksin se zatim usmerava ka tumoru ili ka drugim ćelijama putem specifičnosti vezivanja molekula za polipeptide prikazane na slikama 1B, 9B, 9D, 9F, 21B, ili 22B (sekvence čiji su ID brojevi 2, 4, 6, 8, 22 - 27, ili 29).
Kao što je ranije detaljno opisano, polipeptidi prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste za izazivanje proizvodnje poliklonskih i monoklonskih antitela, koja su korisna u dijagnostičkim testovima za detekciju IGSF9 ili LIV - 1 proteinske ekspresije, kao što je opisano ispod ili za upotrebu kao agonista i antagonista sposobnih za pospešivanje ili inhibiciju funkcije IGSF9 ili LIV - 1. Dalje, takvi polipeptidi mogu da se upotrebe dvohibridnom sistemu gljivica kako bi "zarobili" IGSF9 ili LIV - 1 proteine koji vezuju IGSF9 ili LIV - 1 proteine koji su takođe kandidati kao agonisti i antagonisti prema predmetnom pronalasku. Gljivični dvohibridni sistem je opisan u Fields & Song,Nature 340: 245 - 246 (1989).
Polimikleotidi prema predmetnom pronalasku
Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje izolovane molekule nukleinskih kiselina koji sadrže polinukleotide koji kodiraju polipeptide IGSF9 ili LIV - 1 koji su opisani gore.
Izuzev ukoliko drugačije nije naznačeno, svaka od "nukleotidnih sekvenci" koje su predstavljene ovde. označena je kao sekvenca deoksiribonukleotida (skraćenice A, G. C i T). Međutim, pojam "nukleotidna sekvenca" molekula nukleinske kiseline ili polinukleotida označava u slučaju DNK molekula ili polinukleotida sekvencu deoksiribonukleotida, a u slučaju RNK molekula ili polinukleotida, odgovarajuću sekvencu ribonukleotida (A, G, C, i U), pri čemu svaki timidinski deoksinukleotid (T) u specifičnoj sekvenci deoksinukleotida je zamenjen ribonukleotidom uridina (U). Na primer. referenciranje na RNK molekul koji poseduje sekvencu čiji je ID br. 1 predstavljenu korišćenjem skraćenica za deoksiribonukleotide označava RNK molekul koji poseduje sekvencu u kojoj je svaki deoksinukleotid A, G ili C sekvence čiji je ID br. 1 zamenjen odgovarajućim ribonukleotidom A, G ili C, i u kome je deoksinukleotid T zamenjen ribonukleotidom U.
Korišćenjem ovde obezbeđenih informacija, kao što su one o nukleotidnim sekvencama na slikama 1A, 9A, 9C, 9E. 9H, 21A i 22A, molekonukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku koji kodira bilo IGSF9 ili LIV - 1 polipeptid može da se dobije korišćenjem standardnih postupaka kloniranja i ispitivanja, kao što su oni postupci kloniranja cDNK koji upotrebljavaju iRNK kao početni materijal. Izolovane nukleinske kiseline takođe mogu biti klonirane u vektorima i propagirane u ćelijama domaćinima kao što je opisano gore i kao što je dobro poznato u struci.
Određena nukleotidna sekvenca IGSF9 prikazana na slici 1A sadrži otvoreni ram čitanja koji kodira protein od oko 1163 aminokiselinskih ostataka sa inicijalnim kodonom na položaju 1 nukleotidne sekvence prikazane na slikama 1A - 1B (sekvence čiji su ID brojevi 1 - 2), kao i predviđenu vodeću sekvencu od oko 20 aminokiselinskih ostataka. Aminokiselinska sekvenca predviđena od proteina IGSF9 dalje sadrži ekstracelularni domen od oko 21 aminokiseline do oko 718 aminokiselina, kao što je prikazano na slici 1B.
Određena nukleotidna sekvenca LIV - 1 predstavljena na slici 8A sadrži otvoreni ram očitavanja koji kodira protein od oko 749 aminokiselinskih ostataka sa inicijalnim kodonom na položaju 1 nukleotidne sekvence prikazane na slikama 22A - 22B (sekvence čiji su ID brojevi 28 - 29), kao i predviđenu vodeću sekvencu od oko 27 aminokiselinskih ostataka. Aminokiselinska sekvenca predviđenog LIV - 1 proteina dalje sadrži ekstracelularne domene od oko 28 aminokiselina do oko 317 aminokiselina. od oko 373 do oko 417 aminokiselina, od oko 674 do oko 678, i od oko 742 do oko 749. kao što je prikazano na slici 22B.
Kao što je naznačeno, molekuli nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku mogu da se nalaze u obliku RNK, kao što je to iRNK, ili u obliku DNK. uključujući, na primer, cDNK i genomsku DNK dobijenu kloniranjem ili proizvedenu sintetski. DNK može biti dvolančana ili jednolančana. Jednolančana DNK ili RNK može biti kodirajuća nit, takođe poznata kao kodna nit, ili može biti nekodirajuća nit takođe poznata kao antikodna nit.
Pod pojmom "izolovani" molekul (molekuli) nukleinske kiseline podrazumeva se molekul nukleinske kiseline. DNK ili RNK. koji je uklonjen iz svog prirodnog okruženja. Na primer, rekombinantni molekuli DNK koji se nalaze u vektoru smatraju se izolovanim za svrhe predmetnog pronalaska. Dalji primeri izolovanih molekula DNK obuhvataju rekombinantne DNK molekule koji se održavaju u heterologim ćelijama domaćinima ili prečišćene (delimično ili značajno) DNK molekule u rastvoru. Izolovani RNK molekuli obuhvataju in vivo ili in vitro RNK transkripte DNK molekula prema predmetnom pronalasku. Izolovani molekuli nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku dalje sadrže opisane molekule koji su proizvedeni sintetski.
Izolovani molekuli nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku obuhvataju DNK molekule koji sadrže otvoreni ram očitavanja (ORO) sa inicijalnim kodonom na položaju 1 nukleotidne sekvence prikazane na slikama 1A i 22A (sekvence čiji su ID brojevi 1 i 28); DNK molekule koji sadrže kodirajuću sekvencu za zrele oblike IGSF9 i LIV - 1 proteina prikazane na slikama 1A i 22A (sekvence čiji su ID brojevi 1 i 28); DNK molekule koji sadrže kodirajuću sekvencu prikazanu na slikama 9A, 9C, 9E, 9H, i 21A (sekvevence čiji su ID brojevi 3, 5, 7 i 12 - 21); kao i DNK molekule koji sadrže sekvencu koja je značajno različita od one koja je opisana ranije, ali koja usled degeneracije genetskog koda još uvek kodira IGSF9 ili LIV - 1 proteina. Naravno, genetski kod je dobro poznat u struci. Tako. u domen rutinske veštine stručnjaka spada dobijanje degenerisanih varijanti opisanih gore.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na fragmente izolovanih molekula nukleinske kiseline koji su opisani ovde. Pod fragmentom molekula izolovane nukleinske kiseline koji poseduje nukleotidnu sekvencu koja je prikazana na slikama 1A, 9A, 9C, 9E, 9H, 21A ili 22A (sekvence čiji su ID brojevi 1, 3, 5, 7, 12 - 21, ili 28) podrazumevaju se fragmenti od najmanje 15 nukleotida. poželjnije od najmanje 20 nukleotida, još poželjnije od najmanje 30 nukleotida. a još poželjnije od oko 40 nukleotida u dužini, koji su korisni kao dijagnostičke probe i prajmeri koji su opisani ovde. Naravno, veći fragmenti od 50 - 500 nukleotida u dužini su takođe korisni prema predmetom pronalasku kao fragmenti koji odgovaraju većim delom. ukoliko ne i potpuno nukleotidnoj sekvenci koja je prikazana na slikamalA, 9A, 9C, 9E. 9H, 21A ili 22A (sekvence čiji su ID brojevi 1, 3, 5. 7, 12 - 21 ili 28). Pod pojmom fragmenta od najmanje 20 nukleotida u dužini, na primer, podrazumevaju se fragmenti koji obuhvataju 20 ili više faza u neprekinutom nizu nukleotidne sekvence prikazane na slikama 1A, 9A, 9C, 9E. 9H, 21A ili 22A (sekvence čiji su ID brojevi 1, 3, 5, 7, 12 - 21 ili 28). Poželjni fragmenti nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku obuhvataju molekule nukleinske kiseline koji kodiraju delove koji nose epitope proteina IGSF9 ili LIV - 1. Takvi izolovani molekuli, posebno DNK molekuli korisni su kao probe za mapiranje gena putem in situ hibridizacije sa hromozomima, kao i za detekciju ekspresije IGSF9 ili LIV - 1 gena u humanom tkivu, na primer, korišćenjem Northern blot analize. Kao što je detaljno opisano u tekstu koji sledi, detekcija izmenjene ekspresije gena za IGSF9 ili LIV - 1 u određenim tkivima ili telesnim tečnostima ukazuje na određene neoplastične poremećaje. U drugom aspektu prema predmetnom pronalasku obezbeđeni su molekuli izolovane nukleinske kiseline koji kotiraju polipeptide prema predmetnom pronalasku koji sadrže polinukleotid koji hibridizuje pod striktnim uslovima hibridizacije sa delom polinukleotida u molekulima nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku koji su opisani gore. Pojam "striktni uslovi hibridizacije" označava inkubaciju na temperaturi od 42°C tokom noći u rastvoru u kome se nalazi 50% formamid, 5X SSC (750 mM NaCl, 75mM trinatrijumcitrat), 50mM natrijumfosfat (pH vrednost 7,6), 5X Denhardt - ov rastvor, 10% dekstran sulfat, i 20 ug/ml denaturisane DNK iz crvenih lososa, nakon čega sledi ispiranje filtera 0,1X SSC na temperaturi na oko 65 °C. Fraza "polinukleotid koji hibridizuje sa delom polinukleotida" označava da polinukleotid (bilo DNK ili RNK) hibridizuje sa najmanje oko 15 nukleotida, poželjnije sa najmanje oko 20 nukleotida, još poželjnije sa najmanje oko 30 nukleotida, a još poželjnije sa oko 30 - 70 nukleotida referentnog polinukleotida. Ovi molekuli su korisni kao dijagnostičke probe i prajmeri kao što je opisano gore, i kao što je detaljnije opisano u tekstu koji sledi.
Naravno, kao probe shodno predmetnom pronalasku korisni su i polinukleotidi koji hibridizuju sa većim delom referentnih polinukleotida, na primer, sa delom od 50 - 750 nukleotida u dužini, ili čak sa čitavom dužinom referentnog polinukleotida. kao što su to polinukleotidi koji odgovaraju većem delu, ukoliko ne i celoj nukleotidnoj sekvenci prikazanoj na slikama 1A, 9A, 9C, 9E, 9H, 21 A, ili 22A (sekvence čiji su ID brojevi 1, 3, 5. 7. 12 - 21 ili 28). Fraza "deo polinukleotida sa najmanje 20 nukleotida u dužini", na primer, označava 20 ili više nukleotida u nizu iz nukleotidne sekvence referentnog polinukleotida. Kao što je ranije naznačeno, takvi delovi su dijagnostički upotrebljivi bilo kao proba pri upotrebi konvencionalnih tehnika DNK hibridizacije ili kao prajmeri za amplifikaciju ciljne sekvence upotrebom lančane reakcije polimeraze (PCR), kao što je opisano, na primer, u Molecular Cloning, A Laboratorv Manual, 2nd. edition, edited by Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T., (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, čiji je opis ovde u potpunosti inkorporiran po referenci.
S obzirom da su nukleotidne sekvence IGSF9 i LIV - 1 predstavljene na slikama 1A, 9A, 9C, 9E, 9H, 21A, ili 22A (sekvence čiji su ID brojevi 1, 3, 5, 7, 12 - 21, ili 28), dobijanje polinukleotida koji hibridizuju sa delom molekula IGSF9 ili LIV - 1 spada u rutinsku praksu stručnjaka. Na primer, cepanje restriktivnim endonukleazama ili cepanje ultrazvukom molekula IGSF9 ili LIV - 1 može lako da se upotrebi za dobijanje DNK delova različitih veličina koji predstavljaju polinukleotide koji hibridizuju sa delom molekula IGSF9 ili LIV - 1 pune dužine. Alternativno, polinukleotidi prema predmetnom pronalasku koji mogu da hibridizuju, mogu da se dobiju sintetski prema poznatim tehnikama. Naravno, polinukleotid koji hibridizuje samo sa poli A sekvencom (kao što je to 3' terminalna poli (A) deo IGSF9 ili LIV - 1 polinukleotida), ili sa komplementarnom sekvencom T (ili U) ostataka, ne bi trebalo da bude uključen u polinukleotid prema predmetnom pronalasku koji se koristi za hibridizaciju sa delom nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku, zbog toga što takav polinukleotid hibridizuje sa bilo kojim molekulom nukleinske kiseline koji sadrži poli (A) sekvencu ili sa njom komplementnom sekvencom.
Kao što je naznačeno, molekuli nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku koji kodiraju IGSF9 ili LIV - 1 polipeptide mogu da sadrže, bez ograničenja, one sekvence koje kodiraju aminokiselinsku sekvencu zrelog polipeptida; kodirajući sekvencu za zreli polipeptid i dodatne sekvence, kao što su one koje kodiraju vodeću ili sekretornu sekvencu od oko 20 aminokiselina. kao što je to pre- , ili pro- ili prepro-proteinska sekvenca; kodirajuća sekvenca zrelog polipeptida sa ili bez napred navedenih dodatnih kodirajućih sekvenci zajedno sa dodatnim nekodirajućim sekvencama uključujući, na primer. bez ograničenja, introne i nekodirajuće 5' ili 3' sekvence, kao što su transkribovane netranslirane sekvence koje imaju određenu ulogu u procesu transkripcije, obrade iRNK (uključujući signale za isecanje i poliadenilaciju) , sekvence za vezivanje ribozoma i stabilnost iRNK: dodatna kodirajuća sekvenca koja kodira dodatne aminokiseline, kao što su one koje obezbeđuju dodatne funkcionalne sposobnosti. Tako, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira polipeptide može biti fuzionisana sa sekvencama markera, kao što je to sekvenca koja kodira peptid koji olakšava perečišćavanje fuzionisanih polipeptida. U određenim poželjnim rešenjima predmetnog pronalaska, marker aminokiselinska sekvenca jeste heksa-histidinski peptid, kao što je to oznaka koja je obezbeđenja u okviru pQE vektoru (Qiagen, Inc.), između ostalih markera koji su komercijalno dostupni. Kao što je opisano, na primer, u Gentzet al. Proc. Natl. Acad. Sci., USAS<5:821 - 824 (1989), heksahistidinska oznaka omogućava lako prečišćavanje fuzionog proteina. "HA" oznaka je drugi peptid koji je koristan za prečišćavanje i on odgovara epitopu deriviranom iz proteina hemaglutinina influence, koji je opisan u Wilsonet al., Cell 37: 767 (1984) . Drugi slični fuzioni proteini obuhvataju IGSF9 ili LIV - 1 polipeptide koji su fuzionisani sa Fc domenom IgG na amino ili karboksi terminalu.
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na varijante molekula nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku, koje kodiraju delove, analoge ili derivate IGSF9 ili LIV - 1 proteina. Varijante mogu da se jave u prirodi, na primer, u vidu prirodnih alelnih varijanti. Pod pojmom "alelna varijanta" podrazumeva se jedan od nekoliko alternativnih oblika gena koji se nalazi na datom lokusu hromozoma određenog organizma. (Genes II, Levvin. ed.). Varijante koje se ne javljaju u prirodi mogu da se dobiju tehnikama mutageneze koje su poznate u struci.
Takve varijante obuhvataju one koje su dobijene nukleotidnim supstitucijama, delecijama, adicijama. Supstitucije, delecije. adicije mogu da obuhvate jedan ili više nukleotida. Varijante mogu biti izmenjene u okviru kodirajućih ili nekodirajućih regiona ili u okviru obe vrste regiona. Alteracije u kodirajućim regionima podrazumevaju konzervativne ili nekonzervativne aminokiselinske supstitucije, delecije, adicije. Među ovim su posebno poželjne tihe supstitucije, adicije i delecije. koje ne menjaju svojstva i aktivnosti IGSF9 ili LIV - 1 proteina ili njihovih delova. Takođe, u ovom smislu su posebno poželjne i konzervativne supstitucije. Najpoželjniji molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju zrele oblike IGSF9 ili LIV - 1 proteina poseduju aminokiselinske sekvence koje su prikazane na slikama 1A, 9A, 9C, 9E i 22A (sekvence čiji su brojevi 1, 3, 5, 7, i 28).
Dalje rešenje prema predmetnom pronalasku obuhvataju molekule izolovanih nukleinskih kiselina koji sadrže polinukleotid sa nukleotidnom sekvencom koja je barem 90% identična, poželjnije barem 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa : (a) nukleotidnom sekvencom koja kodira IGSF9 ili LIV - 1 polipeptide sa sekvencama prikazanim na slikama 1A, 9A, 9C, 9E, 9H, 21A ili 22A (sekvence čiji su ID brojevi 1,3, 5. 7. 12 - 21, ili 28); (b) nukleotidnom sekvencom koja kodira zreli oblik IGSF9 ili LIV - 1 polipeptida sa aminokiselinskom sekvencom od položaja 21 do položaja 317 na slici 1B (sekvenca čiji je ID br. 2), od položaja 28 do položaja 317 na slici 22B (sekvenca čiji je ID br. 29), od položaja 373 do položaja 417 na slici 22B (sekvenca čiji je ID br. 29), od položaja 674 do položaja 678 na slici 22B (sekvenca čiji je ID br. 29), od položaja 742 do položaja 749 na slici 22B (sekvenca čiji je ID br. 29) ; i (c) sa nukleotidnom sekvencom koja je komplementarna sa bilo kojom od nukleotidnih sekvenci navedenih u (a), ili (b) navedenim gore.
Fraza "polinukleotid koji poseduje nukleotidnu sekvencu koja je barem, na primer, 95% identična sa referentnom nukleotidnom sekvencom koja kodira IGSF9 ili LIV - 1 polipeptid" označava daje nukleotidna sekvenca datog polinukleotida identična sa referentnom sekvencom sa izuzetkom da navedena polinukleotidna sekvenca može da obuhvati do 5 tačkastih mutacija na svakih 100 nukleotida referentne nukleotidne sekvence koja kodira ili IGSF9 ili LIV - 1 polipeptid. Drugim rečima, da bi se dobio polinukleotid koji poseduje nukleotidnu sekvencu koja je barem 95% identična sa referentnom nukleotidnom sekvencom. do 5% nukleotida u referentnoj sekvenci može biti deletirano ili supstituisano drugim nukleotidima, ili broj nukleotida do 5% od ukupnog broja nukleotida referentne sekvence može biti insertovan u referentnu sekvencu. Ove mutcije referentne sekvence mogu da se jave na 5' ili 3' terminalnim položajima referentne nukleotidne sekvence ili bilo gde drugde između ovih terminalnih položaja, bilo da su rasejane individualno između nukleotida u referntnoj sekvenci ili da se nalaze u vidu jedne ili više grupa sukcesivno povezanih nukleotida unutar referentne sekvence.
U praktičnom pogledu identičnost bilo kog određenog molekula nukleinske kiseline od barem 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% sa, na primer, nukleotidnom sekvencom koja je prikazana na slikama 1A, 9A, 9C, 9E, 9H, 21A ili 22A (sekvenca čiji su ID brojevi 1, 3, 5, 7, 12 - 21, ili 28) , može da se odredi na konvencionalni način upotrebom poznatih kompjuterskih programa kao što je Bestfit program (Wisconsin Sequence Analvsis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, Universitv Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 5371 1). Bestfit program koristi algoritam lokalne homologije opisan od Smith & Waterman (Advnces in Applied Mathematics 2 : 482 - 489, 1981) kako bi našao najbolju segmentnu homologiju između dve sekvence. Kada se koristi Bestfit program ili bilo koji drugi program za poravnanje sekvenci u cilju određivana da li je određena sekvenca, na primer, 95% identična sa referentnom sekvencom prema predmetnom pronalasku, parametri se podešavaju, naravno, tako da se procenat identičnosti izračunava u odnosu na referentnu nukleotidnu sekvencu pune dužine, s tim da se dozvoljava postojanje praznina u homologiji do 5% od ukupnog broja nukleotida u referentnoj sekvenci.
Naravno, usled degeneracije genetskog koda, prosečan stručnjak može odmah da prepozna daje veliki broj molekula nukleinskih kiselina koji poseduje sekvencu koja je barem 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična sa nukleotidnim sekvencama prikazanim na slikama 1A, 9A, 9C, 9E, 9H, 21 A, ili 22A (sekvence čiji su ID brojevi 1, 3. 5. 7, 12-21. ili 28). kodira polipeptid koji poseduje aktivnost proteina IGSF9 ili LIV - 1. Ustvari, s obzirom da degenerisane varijante ovih nukleotidnih sekvenci kodiraju isti polipeptid. ovo će biti jasno vestom stručnjaku bez izvođenja gore opisanog testa uporedivanja. Takođe. treba napomenuti da za one molekule nukleinskih kiselina koje ne predstavljaju degenerisane varijante, određeni njihov broj će takođe kotirati polipeptid koji poseduje aktivnost proteina 1GSF9 ili LIV - 1. Iskusni stručnjak shvata daje ovo posledica aminokiselinskih supstitucija koje ili malo verovatno ili sasvim malo verovatno utiču na funkciju proteina (npr., zamena jedne alifatične aminokiseline drugom alifatičnom aminokiselinom).
Na primer, uputstvo koje se odnosi na dobijanje feno tipski nemih aminokiselinskih supstitucija nalazi se u Bovvie. J. U., et al.. "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions."Science 247 :1306 -1310
(1990). gde autori ukazuju da su to dva glavna pristupa za ispitivanje tolerancije aminokiselinske sekvence na promenu. Prvi postupak se odnosi na proces evolucije, tokom koga se mutacije ili prihvataju ili odbacuju putem prirodne selekcije. Drugi pristup koristi genetski inženjering za uvođenje aminokiselinskih promena na specifičnim položajima kloniranog gena, kao i selekcije ili pretraživanja u cilju identifikacije sekvenci koje održavaju funkionalnost. Kao što ovi autori tvrde, navedena ispitivanja su otkrila da su proteini iznenađujuće tolerantni na aminokiselinske supstitucije. Autori dalje ukazuju koje aminokiselinske promene su verovatno permisivne na određenom položaju u proteinu. Na primer, većina u unutrašnjosti postavljenih aminokiselinskih ostataka zahteva postojanje nepolarnih bočnih lanaca, dok se nekoliko karakteristika površinskih bočnih lanaca generalno konzervira. Druge takve fenotipski neme supstitucije su opisane u Bovvie, J. U., et al., navedeno gore, kao i u referencama koje su gore citirane.
Dijagnostikovanje i terapija kancera
Polipeptidi prema predmetnom pronalasku mogu da budu uključeni u stvaranju kancerskih ćelija, njihovoj proliferaciji ili metastaziranju. Detekcija prisustva ili količine polinukleotida ili polipeptida prema predmetnom pronalasku može biti korisna pri dijagnostikovanju i / ili postavljanju prognoze za jedan ili za više tipova kancera. Na primer, prisustvo ili povećana ekspresija polinukleotida / polipeptida prema predmetnom pronalasku može da ukazuje na nasledni rizik za razvoj kancera, prekanceroznog stanja ili postojanje maligniteta. Slično tome, defekt u ovom genu ili odsustvo polipeptida može biti udruženo sa kancerskim stanjem. Identifikacija polimorfizma pojedinačnih nukleotida udruženih sa kancerom ili sa predispozicijom za razvoj kancera takođe može biti korisna za dijagnostikovanje ili postavljanje prognoze.
Tretmani za kancer pospešuju regresiju tumora putem inhibicije proliferacije tumorskih ćelija, inhibicije angiogeneze (rasta novih krvnih sudova koji su neophodni za podržavanje tumorskog rasta) i / ili putem onemogućavanja metastaziranja smanjenjem pokretljivosti ili invazilnosti tumorske ćelije. Terapeutski preparati prema predmetnom pronalasku mogu biti korisni kod odraslih i pediatrijskih onkoloških pacijenata uključujući pacijente sa tumorima sa čvrstom fazom (malignitetima), tumore / malignitete sa čvrstom fazom, kancere pluća uključujući karcinom malih ćelija i nesitno ćelijski karcinom, kancere dojke uključujući karcinom malih ćelija i duktalni karcinom, gastrointastinalne kancere uključujući kancer jednjaka, kancer želuca, kancer debelog creva, kolorektalni kancer i polipe udružene sa kolorektalnom neoplazijom. urološke kancere uključujući i kancer bešike i kancer prostate i malignitete ženskog reproduktivnog trakta uključujući karcinom jajnika, kancere materice (uključujući endometrijum) i čvrste tumore folikula jajnika.
Polipeptidi, polinukleotidi, antitela (ili antigen vezujući fragmenti) ili modulatori polipeptida prema predmetnom pronalasku (uključujući inhibitore i stimulatore biološke aktivnosti polipeptida prema predmetnom pronalasku) mogu biti primenjeni u cilju tretiranja kancera. Terapeutski preparati mogu biti primenjeni u terapijski efikasnim dozama sami ili u kombinaciji sa adiuvantnom kancerskom terapijom kao što je hirurgija, hemoterapija. radioterapija, termoterapija i terapija laserom, i mogu da obezbede poželjna dejstva, npr., smanjivanje veličine tumora, usporavanje tumorskog rasta, inhibiciju pojave metastaza ili da na drugi način poboljšaju ukupno kliničko stanje, bez obavezne eradikacije kancera.
Preparati prema predmetnom pronalasku takođe mogu biti primenjeni u terapijski efikasnim količinama kao deo anti - kancerskog koktela. Anti - kancerski koktel predstavlja smešu polipeptida ili modulatora prema predmetnom pronalasku sa jednim ili sa više anti-kancerskih lekova, uz dodatak farmaceutski prihvatljivog nosioca radi isporuke. Korišćenje anti - kancerskih koktela kao tretmana za kancer je rutinska stvar. Anti - kancerski lekovi koji su dobro poznati u struci i koji mogu biti korišćeni kao tretman u kombinaciji sa polipeptidom ili modulatorom prema predmetnom pronalasku obuhvataju: Aktinomicin D, Aminoglutetimid, Asparaginazu, Bleomicin, Busulfan, Karboplatin, Karmustin, Halorambucil. Cisplatin (cis - DDP), Ciklofosfamid, Citarabin HC1 (Citozin arabinozid), Dakarbazin. Daktinomicin, Daunorubicin HC1, Doksorubicin HC1. Estramustinfosfatnatrijum, Etopozid (VI6 - 213), Floksuridin, 5 - Fluorouracil (5 - Fu). Flutamid, Hidroksiureil (hidroksikarbamid), Ifosfamid, Interferon Alfa - 2a, Interferon Alfa - 2b, Leuprolid acetat (analog LHRH - oslobađajućeg faktora), Lomustin, Mehloretamin HC1 (azotni iperit), Melfalan. Merkaptopurin. Mesnu, Metotreksat (MTX), Mitomicin, Mitoksantron HC1, Oktreotid, Plikamicin, Prokarbazin HC1, Streptozocin, Tamoksifen citrat, Tioguanin, Tiotepa, Vinblastin sulfat, Vinkristin sulfat, Amsakrin, Azacidin, Heksametilmelamin, Interleukin - 2, Mitoguazon, Pentostatin, Semustin, Tenipozid, i Vindesin sulfat.
Dodatno, terapeutski preparati prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste za profilaktički tretman kancera. Postoje nasledna stanja i / ili stanja u okruženju (npr., izlaganje kancerogenima) za koje se zna u struci da predisponiraju pojedinca razvoju kancera. U ovim slučajevima, može biti poželjno da se ovi pojedinci tretiraju sa terapijski efikasnim dozama polipeptida prema predmetnom pronalasku kako bi se smanjio rizik od razvoja kancera.
In vitro modeli mogu da se koriste za određivanje efikasnih doza polipeptida prema predmetnom pronalasku kao potencijalnih tretmana za kancer. Ovi in vitro modeli obuhvataju testove proliferacije tumorskih ćelija u kulturi, rast kultivisanih tumorskih ćelija u mekom agaru (videti Freshnev, (1987) Culture of Animals Cells : A Manual of Basic Technique, Wily - Liss, Nevv York, NY, poglavlje 18 & 21), tumorske sisteme u ogoljenim miševima kao što je opisano Giovanella et al., J. Natl. Can Inst. 52 : 921 - 30
(1974), ispitivanje mobilnosti invazivalnog potencijala tumorskih ćelija u Bovden Chamber testovima kao što je opisano i Pilkington et al., Anticancer Res. 17: 4107 - 9
(1997), kao i testove angiogeneze, npr.. test indukcije vaskularizacije pileće horioalantoisne membrane ili testove indukcije migracije vaskularizacije endotelnih ćelija koji su opisani u Ribatta et al, Intl. J. Dev. Biol. 40 : 1189 - 97 (1999) i u Li et al., Clin. Exp. Metastasis 17 : 423 - 9 (1999), respektivno. Odgovarajuće tumorske ćelijske linije mogu se npr.. naručiti iz kataloga američke kolekcije tipskih tkivnih kultura. Međutim, kao što je diskutovano gore, izabrana rešenja prema predmetnom pronalasku obuhvataju primenu modifikovanih antitela kod pacijenata sa kancerom ili u kombinaciji ili zajedno sa jednom ili sa više adijuvantnih terapija kao što je radio-terapija ili hemioterapija (tj., u vidu kombinovanog terapijskog režima). Kao što se ovde koristi, fraza "primena modifikovanih antitela zajedno ili u kombinaciji sa adiuvantnom terapijom" označava sekvencijalnu. simultanu, koekstenzivnu, konkurentnu, konkomitantnu ili istovremenu primenu ili primenjivanje terapije i predmetnih antitela. Stručnjaci shvataju da primena ili primenjivanje različitih komponenti kombinovanog terapeutskog režima može biti tako uvremenjeno da se pospeši ukupna efikasnost tretmana. Na primer, hemoterapeutska sredstva mogu da se primene u standardnim dobro poznatim režimima tretmana nakon čega sledi za nekoliko nedelja primena radioimuno konjugata prema predmetnom pronalasku. Suprotno, citotoksin koji je udružen sa modifikovanim antitelima može da bude primenjen intravenski a nakon toga da tumorsko tkivo bude lokalno ozračeno spoljašnjim zračenjem. U drugim rešenjima modifikovano antitelo može biti primenjeno zajedno sa jednim ili sa više izabranih hemoterapeutskih sredstava tokom jedne posete lekaru. Iskusni stručnjak (npr., iskusni onkolog) lako može da proceni efikasnost kombinovanih terapeutskih režima bez nepotrebne eksperimentacije na osnovu izabrane adiovantne terapije i opisa datog u ovoj predmetnoj specifikaciji. U ovom smislu, treba napomenuti da kombinacija modifikovanog antitela (sa ili bez citotoksina) i hematerapeutskog sredstva može biti primenjena u bilo kom redosledu i u bilo kom vremenskom intervalu koji obezbeđuje terapijsku korisnost kod pacijenta. To znači da hematerapeutsko sredstvo i modifikovano antitelo mogu biti primenjeni u bilo kom redosledu ili istovremeno. U izabranim rešenjima, modifikovana antitela prema predmetnom pronalasku se primenjuju kod pacijenata koji su prethodno podvrgnuti hemoterapiji. U drugim rešenjima, modifikovana antitela i hemoterapeutski tretman se primenjuju praktično simultano ili istovremeno. Na primer, pacijentu može biti primenjeno modifikovano antitelo dok se nalazi na hemoterapeutskom tretmanu. U poželjnim rešenjima, modifikovano antitelo se primenjuje u periodu od jedne godine u odnosu na primenu hemoterapeutskog sredstva ili tretmana. U drugim poželjnim rešenjima. modifikovano antitelo se primenjuje u periodu od 10, 8, 6, 4, ili 2 meseca u odnosu na primenu bilo kog hemoterapeutsog sredstva ili tretmana. U drugim poželjnim rešenjima, modifikovano antitelo se primenjuje u periodu od 4, 3, 2 ili 1 nedelje od momenta primene hematerapeutskog sredstva ili tretmana. U drugim rešenjima modifikovano antitelo se primenjuje u intervalo od 5, 4, 3, 2 ili 1 dana od primene izabranog hematerapeutskog sredstva ili tretmana. Treba napomenuti da se dva sredstva ili tretmana mogu primeniti kod pacijenta u okviru intervala od nekoliko časova ili minuta (tj., praktično simultano). U ovom slučaju, treba napomenuti da modifikovana antitela prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste zajedno ili u kombinaciji sa bilo kojim hemoterapeutskim sredstvom ili sredstvima ili sa režimom (npr., kako bi se obezbedio kombinovani terapeutski režim) koji eliminiše, smanjuje, inhibira ili kontroliše rast neoplastičnih ćelija in vivo. Kao što je ranije opisano, takva sredstva često dovode do redukcije rezervi crvene kostne srži. Ova redukcija može biti izbegnuta, u potpunosti ili delimično, smanjenjem milotoksičnosti jedinjenja prema predmetnom pronalasku koja imaju tu prednost da dozvoljavaju agresivan tretman neoplazme kod takvih pacijenata. U drugim poželjnim rešenjima, radioaktivno obeleženi imunokonjugati koji su ovde opisani mogu biti efikasno upotrebljeni sa sredstvima za povećanje radiosenzitivnosti koja pospešuju prijemčivost neoplastičnih ćelija za radionukleide. Na primer. jedinjenja koja povećavaju radiosenzitivnost mogu biti primenjena nakon što se radioaktivno obeleženo modifikovano antitelo u značajnoj meri izbaci iz cirkulacije, s tim da još uvek ostaju njegovi terapijski efikasni nivoi na mestu na kome se nalazi tumor ili tumori. U odnosu na ove aspekte predmetnog pronalaska, primeri hemoterapeutskih sredstava koji su kompatabilni sa predmetnim pronalaskom obuhvataju alkilirajuća sredstva, vinka alkaloide (npr., vinkristin i vinblastin) , prokarbazin, metotreksat i prednizon. Kombinacija četri leka čija je oznaka MOPP (mehletamin (azotni iperit) ,vinkristin (Oncovin) , prokarbazin i prednizon) je veoma efikasna u tretiranju različitih tipova limfoma i predstavlja poželjno rešenje prema predmetnom pronalasku. Kod pacijenata koji su rezistentni na MOPP režim, mogu da se koriste kombinacije ABVD (npr., adriamicin, bleomicin, vinblastin i dakarbazin), ChlVPP (hlorambucil, vinblastin, prokarbazin i prednizon), CABS (lomustin. doksorubicin. bleomicin i streptozotocin) , MOPP plus ABVD, MOPP plus ABV (doksorubicin, bleomicin i vinblastin) ili BCVPP (karmustin, ciklofosfamid, vinblastin. prokarbazin i prednizon). Videti Arnold S. Freedman & Lee M. Nadler,Malignant Lvmphomas,u Harrison' Principles of Internal Medicine 1774 - 1788 (Kurt J. Isselbacherel al.,urednici, 13. izdanje, 1994) i V. T. De Vita et al., (1997), kao i tamo citirane reference za standardne režime doziranja i primene. Ove terapije mogu biti nepromenjene ili mogu da se menjaju po potrebi na osnovu potreba pojedinačnog pacijenta u kombinaciji sa jednim ili sa više modifikovanih antitela koja su ovde opisana. Dodatni režimi koji su korisni u kontekstu predmetnog pronalaska obuhvataju upotrebu pojedinačnih alkilirajućih sredstava kao što su ciklofosfamid ili hlorambucil, ili kombinacije kao što su CVP (ciklofosfamid. vinkristin i prednizon), CHOP (CVP i doksorubicin), C-MOPP (ciklofosfamid, vinkristin, prednizon i prokarbazin), CAP - BOP (CHOP plus prokarbazin i bleomicin), m-BACOD (CHOP plus metotreksat, bleomicin i leukovorin), ProMACE - MOPP (prednizon. metotreksat, doksorubicin, ciklofosfamid, etopozid i leukovorin plus standardni MOPP), ProMACE - CvtaBOM (prednizon, doksorubicin, ciklofosfamid, etopozid, citarabin, bleomicin, vinkristin, metotreksat i leukovorin) i MACOP - B (metotreksat, doksorubicin, ciklofosfamid, vinkristin, fiksna doza prednizona, bleomicin i leukovorin). Stručnjaci mogu lako da odrede standardne doze i vreme primene za svaki od ovih režima. CHOP se takođe kombinuje sa bleomicinom, metotreksatom, prokarbazinom. azotnim iperitom, citozin arabinozidom i etopozidom. Druga kompatibilna hemoterapeutska sredstva obuhvataju, bez ograničenja, 2-hlorodeoksiadenozin (2 - CDA), 2'-deoksikoformicin i fludarabin. Količina hemoterapeutskog sredstva koji se upotrebljava u kombinaciji sa modifikovanim antitelima prema predmetnom pronalasku može da varira od pacijenta do pacijenta ili može biti primenjena shodno činjenicama poznatim u struci. Videti, na primer, Bruce A Chabner et al, Antineoplastic Agents, in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics 1233 - 1287 ((Joel G. Hardman et al., urednici, 9. izdanje 1996). Kao što je ranije diskutovano, modifikovana antitela prema predmetnom pronalasku, njihovi imunoreaktivni fragmenti ili rekombinantni oblici mogu da se primene u farmaceutski efikasnoj količini radi in vivo tretmana maligniteta kog sisara. U ovom slučaju, treba napomenuti da su opisana antitela tako formulisana da pospeše primenu i da promovišu stabilnost aktivnog sredstva. Poželjno, farmaceutski preparati prema predmetnom pronalasku sadrže farmaceutski prihvatljiv, netoksični, sterilni nosilac, kao što je fiziološki rastvor NaCl. netoksični puferi, konzervansi i slično. Za svrhe ove primene, farmaceutski efikasna količina modifikovanog antitela njegovog imunoreaktivnog fragmenta ili rekombinantnog oblika, konjugovanog ili nekonjugovanog sa terapeutskim sredstvom, treba da se održava na nivou srednje vrednosti koja odgovara količini koja je dovoljna za postizanje efikasnog vezivanja sa izabranim imunoreaktivnim antigenima ili neoplastičnim ćelijama i da obezbedi povećanje razaranja ovih ćelija. Naravno, farmaceutski preparati prema predmetnom pronalasku mogu biti primenjeni i vidu pojedinačne ili višestrukih doza u cilju obezbeđivanja farmaceutski efikasne količine modifikovanog antitela u organizmu primaoca. Specifično, opisana antitela i postupci treba da budu od koristi pri smanjivanu veličine tumora, pri inhibiciji rasta tumora i / ili pri produžavanju vremena životinja koje imaju tumor. Shodno tome, predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupak tretiranja tumora kod čoveka ili druge životinje putem primene kod takvog čoveka ili životinje efikasne, netoksične količine modifikovanog antitela. Stručnjak može upotrebom rutinske eksperimentacije da odredi koja je efikasna netoksična količina modifikovanog antitela poželjna za postizanje cilja lečenja maligniteta. Na primer. terapijski efikasna količina modifikovanog antitela može da varira u odnosu na činioce kao što su stadijum bolesti (npr., stadijum I nasuprot stadijumu IV), starosna dob, pol, medicinske komplikacije (npr., stanja sa imunosupresijom ili drugim bolestima) i telesna masa pacijenta, kao što zavisi i od antitela koje izaziva željeni odgovor kod pacijenta. Dozni režim može biti tako podešen da obezbedi optimalni terapijski odgovor. Na primer, dnevno može biti primenjeno nekoliko podeljenih doza ili doze mogu biti proporcionalno smanjivane u odnosu na pokazatelje koje se javljaju u datoj terapijskoj situaciji. Generalno, međutim, očekuje se da se efikasna doza nalazi u opsegu od oko 0,05 do 100 u,g po kilogramu telesne mase po danu, a poželjno u opsegu od oko 0,5 do 10 ug/kg telesne mase na dan. Poštujući obim zaštite predmetnog pronalaska, modifikovana antitela prema predmetnom pronalasku mogu biti primenjena kod čoveka ili neke druge životinje shodno gore pomenutim postupcima tretiranja u količini koja je dovoljna da izazove željeni efekat u terapijskom ili profilatičkom stepenu. Antitela prema predmetnom pronalasku mogu biti primenjena kod takvih ljudi ili drugih životinja u uobičajnom doznom obliku dobijenom kombinovanjem antitela prema predmetnom pronalasku sa konvencionalnim farmaceutski prihvatljivim nosiocem ili diluentom primenom poznatih tehnika. Stručnjak shvata da su oblik i karakter farmaceutski prihvatljivog nosioca ili diluenta diktirani količinom aktivnog sastojka sa kojim oni treba da se kombinuju. da su diktirani načinom primene i drugim dobro poznatim varijablama. Stručnjaci dalje shvataju da koktel koji sadrži jednu ili više vrsta monokleonskih antitela prema predmetnom pronalasku može biti posebno efikasan. Postupci za dobijanje i primenu konjugata antitela. njegovih imunoreaktivnih fragmenata ili rekombinantnih oblika i terapeutskog sredstva su dobro poznati ili lako mogu biti određeni od strane stručnjaka. Način primene antitela (ili njihovih fragmenata) prema predmetnom pronalasku može biti oralni, parenteralni, putem inhalacije ili topijski. Pojam "parenteralni" koji se ovde koristi obuhvata intravensku, intra - arterijsku, intraperitonalnu, intramuskularnu, subkutanu, rektalnu ili vaginalnu primenu. Intravenski, intra - arterijski, subkutani i intramuskularni oblik parenteralne primene su generalno poželjni. Svi ovi oblici primene su jasno obuhvaćeni obimom zaštite predmetnog pronalaska, poželjan oblik primene je rastvor za injekciju, posebno za intravensku ili intra - arterijsku injekciju. Uobičajno je da pogodni farmaceutski preparat za injekciju sadrži pufer (npr., acetatni, fosfatni ili citratni pufer), surfaktant (npr., polisorbat), opciono sredstvo za stabilizaciju (npr., fumani albumin), itd. Međutim, u drugim postupcima koji su kompatibilni sa predmetnim pronalaskom modifikovana antitela mogu biti primenjena direktno na mesto na kome se nalazi malignitet, čime se povećeva izlaganje neoplastičnog tkiva terapeutskom sredstvu. Preparati za parenteralnu primenu obuhvataju sterilne vodene ili nevodene rastvore, suspenzije ili imulzije. Primeri nevodenih rastvarača su propilenglikol, polietilenglikol, biljna ulja kao stoje maslinovo ulje i injektabilni organski estri kao što je etiloleat. Vodeni nosioci obuhvataju vodu, alkoholne / vodene rastvore, emulzije ili suspenzije uključujući fiziološki rastvor i puferovane podloge. U predmetnom pronalasku, farmaceutski prihvatljivi nosioci, obuhvataju, bez ograničenja, 0,01 - 0,1 M i poželjno 0,05 M fosfatni pufer ili 0,8% fiziološki rastvor. Drugi uobičajeni parenteralni vehikulumi obuhvataju natrijumfosfatne rastvore, Ringerov rastvor sa dekstrozom, dekstrozu i natrijumhlorid, Ringerov rastvor sa laktatom ili fiksirana ulja. Intravenski vehikulumi obuhvataju sredstva za nadoknađivanje tečnosti i hranljivih sastojaka, sredstva za nadoknadu elektrolita, kao što su ona koja se zasnivaju na Ringerovom rastvoru sa dekstrozom i slična. Konzervansi i drugi aditivi takođe mogu biti prisutni i to su. na primer, antimikrobna sredstva, antioksidanti, helirajuća sredstva, i inertni gasovi i slično. Posebno, farmaceutski preparati koji su pogodni za primenu u vidu injekcija obuhvataju sterilne vodene rastvore (kada su preparati rastvorljivi u vodi) ili disperzije i sterilne praškove za pripremu neposredno pre primene sterilnih rastvora ili disperzija za primenu injekcijama. U takvim slučajevima, preparat mora biti sterilan i treba da bude fluidan u stepenu koji omogućava laku primenu špricom. Preparat treba da bude stabilan u uslovima proizvodnje i skladištenja i poželjno je da bude sačuvan od kontaminirajućeg dejstva mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice. Nosilac može biti rastvarač ili disperzivna podloga koja sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (npr., glicerol, propilenglikol, i tečni polietilenglikol i slične), i njihove pogodne smeše. Odgovarajuća fluidnost može da se održava, na primer, upotrebom sredstava za oblaganje kao što je lecitin, podržavanjem željene veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Sprečavanje dejstva mikroorganizama može da se postigne različitim antibakterijskim i antigljivičnim sredstvima, na primer, parabenima, hlorobutanolom, fenolom, askorbinskom kiselinom, timerosalom i sličnim. U mnogim slučajevima, poželjno je da se u preparat uključi sredstvo za održavanje izotoničnosti, na primer, šećeri, polialkoholi, kao što je manitol, sorbitol, ili natrijumhlorid. Produžena apsorbcija preparata za primenu injekcijama može da se postigne uključivanjem u preparat sredstva koje odlaže apsorbciju, na primer, aluminijum monostearata i gelatina. U svakom slučaju, sterilni rastvori za primenu injekcijama mogu da se dobiju inkorporiranjem aktivnog (npr., modifikovanog antitela samog po sebi ili u kombinaciji sa drugim aktivnim sredstvima) u željenoj količini u odgovarajućem rastvaraču sa jednim ili sa kombinacijom sastojaka koji su ovde nabrojani, po potrebi, nakon čega sledi sterilizacija filtracijom. Generalno, disperzije se dobijaju inkorporiranjem aktivnog jedinjenja u sterilnom vehikumu, koji sadrži osnovnu disperzivnu podlogu i neophodne druge sastojke koji su gore nabrojani. U slučaju sterilnih praškova, za dobijanje sterilnih rastvora koji se primenjuje u vidu injekcije, poželjni postupci za dobijanje jesu sušenje u vakumu i sušenje zamrzavanjem, čime se dobija aktivni sastojak u vidu praška uz neko od dodatnih poželjnih sastojaka iz njihovog rastvora koji je prethodno sterilisan filtracijom. Preparati za primenu u vidu injekcija se obrađuju, ubacuju u kontejnere kao što su ampule, vreće, boce, špricevi ili bočice, i pečate se u aseptičnim uslovima shodno postupcima koji su poznati u struci. Dalje, preparati mogu biti upakovani i prodavani u obliku kompleta kao što su oni opisani u važećoj U. S. S. N. 09/259,337 i U. S. S. N. 09/259,338 koje su ovde u potpunosti inkorporirane po referenci. Takvi proizvodni artikli poželjno poseduju oznake ili uputstva u pakovanju koji naznačavaju da je su sa njima udruženi preparati korisni za tretiranje subjekta koji boluje od, ili je predisponiran za nastanak kancera, maligniteta ili neoplastičnih poremećaja. Kao što se gore detaljno diskutuje, predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenja, preparate, komplete i postupke za tretman neoplastičnih poremećaja kod sisara kome je potreban tretman ovih stanja. Poželjno, subjekt je čovek. Neoplastični poremećaj (npr., kancer i maligniteti) obuhvata čvrste tumore kao što su melanomi, gliomi, sarkomi i karcinomi, kao i mialoidne ili hematogone malignitete kao što su limfomi i leukemije. Generalno, predmetni pronalazak može da se koristi za profilaktički ili terapeutski tretman bilo koje neoplazme koja sadrži IGSF9 ili LIV - 1 kao antigene markere koji omogućavaju ciljanje kancerskih ćelija putem modifikovanog antitela. Primeri kancera koji mogu biti tretirani obuhvataju, bez ograničenja, kancer prostate, debelog creva, dojke, jajnika i pluća. Kao dodatak gore pomenutim neoplastičnim poremećajima, treba napomenuti da predmetni pronalazak može poželjno da se koristi za tretiranje dodatnih maligniteta koji sadrže IGSF9 ili LIV - 1.
Aktivnost receptor / ligand
Polipeptidi prema predmetnom pronalasku takođe mogu da pokazuju aktivnost kao receptori, Ugandi receptora ili inhibitori ili agonisti u receptor / ligand interakcijama. Polinukleotid prema predmetnom pronalasku može da kodira polipeptid koji pokazuje takve karakteristike. Primeri takvih receptora i liganda obuhvataju, bez ograničenja, receptore za citokine i njihove Ugande, receptor kinaze i njihove Ugande (uključujući, bez ograničenja, molekule ćelijske athezije (kao što su selektini. integrini i njihovi Ugandi) i receptor/ligand parove uključene u prezentaciju antigena, u prepoznavanje antigena i razvoj ćelijskih i humoralnih imunih odgovora). Receptori i Ugandi su takođe korisni za ispitivanje potencijalnih peptidnih inhibitora ili inhibitora čiji su molekuli mali u odgovarajućim receptor/ligand interakcijama. Polipeptid prema predmetnom pronalasku (uključujući, bez ograničenja, fragmente receptora i Uganda) sam po sebi može biti koristan kao inhibitor receptor/ligand interakciji.
Odgovarajući testovi za određivanje receptor / ligand aktivnosti polipeptida prema predmetnom pronalasku obuhvataju, bez ograničenja, one koji su opisani uCurrent Prolocoh in Immunology,urednik J. E. Coligan, et al., Pub. Greene Publishing Associates & Wiley - Interscience (Poglavlje 7.28, Measurement of Cellular Adhesion under static conditions 7.28.1 - 7.28.22), Takaiet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6864 - 6868, 1987; Biereret al, J. Exp. Med. 168 :1145 - 1156, 1988; Rosenstein et al.,J. Exp. Med. 169:149 -160 1989; Stoltenborget al, J. Immunol. Methods 175 :56 - 98, 1994; Stittet al., Cell 80 : 661- 670, 1995.
Primera radi, polipeptidi prema predmetnom pronalasku mogu da se upotrebe kao receptor za ligand (Ugande) koji prenose signale o biološkoj aktivnosti liganda (liganada). Ligandi mogu biti identifikovani pomoću testova vezivanja, afinitetnom hromatografijom, testova dihibridnog ispitivanja, putem BIAcore testova, putem testova za prekrivanjem gelom, ili primenom drugih postupaka koji su poznati u struci.
Ispitivanja kojima se vrši karakterizacija lekova ili proteina kao agonista ili antagonista ili parcijalnih agonista ili parcijalnih antagonista zahtevaju upotrebu drugih proteina kao kompetitivnih liganada. Polipeptidi prema predmetnom pronalasku ili njihovi ligandi mogu da se obeleže putem vezivanja za radioizotope, kolorimetrijske molekule ili molekulom toksina upotrebom konvencionalnih postupaka(" Guide to Protein Purification"Murrav P. Deutscher (urednik) Methods in Enzymology Vol. 182
(1990). Academic Press, Inc. San Diego). Primeri radioizotopa obuhvataju, bez ograničenja, tricium i ugljenik - 14. Primeri kolorimetriskih molekula obuhvataju, bez ograničenja, fluorescenntne molekule kao što su fluorescamin, ili rodamin ili druge kolorimetriske molekule. Primeri toksina obuhvataju. bez ograničenja, ricin.
Testovi aktivnosti receptora
Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupke za detekciju specifičnog vezivanja polipeptida prema predmetnom pronalasku, npr.. kao liganda ili kao receptora. U struci postoje brojni testovi koji su posebno korisni za identifikaciju prethodno nepoznatih partnera za vezivanje sa receptorskim polipeptidima prema predmetnom pronalasku. Na primer, testovi ekspresije sa kloniranjem korišćenjem sisarskih ili bakterijskih ćelija ili testovi dihibridnog ispitivanja mogu da se koriste za identifikaciju polinukleotida koji kodiraju partnere za vezivanje. Kao drugi primer, afinitetna hromatografija sa odgovarajućim i mobilisanim polipeptidom prema predmetnom pronalasku može da se koristi za izolaciju polipeptida koji ih prepoznaju i koji se vezuju za polipeptide prema predmetnom pronalasku. Postoje brojne različite biblioteke koje se koriste za identifikaciju jedinjenja i kod posebno malih molekula služe za modulaciju (tj., za povećanje ili smanjenje) biološke aktivnosti polipeptida prema predmetnom pronalasku. Ligandi za receptorske polipeptide prema predmetnom pronalasku takođe mogu biti identifikovani dodavanjem egzogenih liganada, ili koktela liganada u dvoćelijske populacije koje su genetski identične izuzev u odnosu na ekspresiju receptora prema predmetnom pronalasku: jedna ćelijska populacija eksprimira receptor prema predmetnom pronalasku dok druga ne eksprimira. Odgovor dvoćelijske populacije na dodavanje liganda se zatim upoređuje. Alternativno, ekspresiona biblioteka može biti koeksprimirana sa polipeptidom prema predmetnom pronalasku u ćelijama i ispitivana na prisustvo autokrinog odgovora u cilju identifikacije potencijalnog liganda. Kao još jedan primer, BIAcore testovi, testovi sa prekrivanjem gelom ili drugi postupci koji su poznati u struci mogu da se koriste za identifikaciju vezujućih partnera polipeptida, uključujći, (1) organske i neorganske biblioteke, (2) biblioteke prirodnih proizvoda, i (3) kombinatorne biblioteke koje se sastoje od nasumičnih peptida, oligonukleotida ili organskih molekula.
Može biti određena uloga sekundarnih i ostalih intracelularnih signalnih molekula u signalnoj kaskadi polipeptida prema predmetnom pronalasku. Na primer, himerični protein kod koga je citoplazmatski domen polipeptida prema predmetnom pronalasku fuzionisan sa ekstracelularnim delom proteina čiji ligand je već identifikovan, proizvodi se u ćeliji domaćina. Ćelija se potom inkubira sa Ugandom koji je specifičan za ekstracelularni deo himeričnog proteina čime se aktivira himerični receptor. Sekundarni i drugi poznati proteinski glasnici koji su uključeni u intracelularnom signaliziranju mogu potom biti ispitivani na prisustvo očekivanih modifikacija tj., na prisustvo fosforilacije. Drugi postupci koji su poznati stručnjacima takođe mogu biti korišćeni za identifikaciju signalnih molekula koji su uključeni u aktivnost receptora.
Oligonukleotidi nekodirajućeg lanca
Drugo rešenje prema predmetnom pronalasku obezbeđuje izolovane molekule nukleinske kiseline nekodirajućeg lanca koji mogu da hibridizuju sa ili koji su komplementarni sa molekulima nukleinske kiseline koji sadrže nukleotidne sekvence prikazane na slikama 1A, 9A, 9C, 9E, 9H, 21 A, ili 22A (sekvence čiji su ID brojevi: 1, 3, 5, 7. 12 - 21, ili 28), ili sa njihovim fragmentima, analozima ili derivatima. Nukleinska kiselina nekodirajuće niti sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna nukleinskoj kiselini kodirajuće niti koja kodira protein. U specifičnim rešenjima, molekuli nukleinske kiseline nekodirajuće niti su obezbeđeni i komplementarni su sa sekvencom od oko 10, 25, 50, 100, 250 ili 500 nukleotida kodirajućeg lanca ili sa čitavim kodirajućim lancem ili samo sa nekim njegovim kodirajućim delom. Dodatno su obezbeđeni molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju fragmente, homologe, derivate i analoge proteina prikazanih na slikama 1B, 9B, 9D, 9F, 21B, ili 22B (sekvence čiji su ID brojevi 2, 4, 6, 8, 22 - 27, ili 29), ili nukleinske kiseline nekodirajuće niti koje su komplementarne sa sekvencama nukleinskih kiselina prikazanih na slikama 1A, 9A, 9C, 9E, 9H, 21A, ili 22A (sekvence čiji su ID brojevi: 1, 3, 5, 7, 12 - 21, ili 28).
U jednom rešenju, molekul nukleinske kiseline nekodirajuće niti je komplementaran kodirajućem regionu kodirajuće niti neke nukleotidne sekvence prema predmetnom pronalasku. Pojam "kodirajući region" odnosi se na region nukleotidne sekvence koji sadrži kodone koji se transiiraju u aminokiselinske ostatke. U drugom rešenju. molekul nukleinske kiseline nekodirajuće niti je komplementaran nekodirajućem regionu kodirajuće niti nukleotidne sekvence prema predmetnom pronalasku. Pojam "nekodirajući region" odnosi se na 5' i 3' sekvence koje se nalaze bočno od kodirajućeg regiona i koje se ne transliraju u aminokiseline (tj., takođe se označavaju kao 5'i 3' netranslirajući regioni).
Kao što se koristi u predmetnom pronalasku, pojam "nukleinska kiselina nekodirajuće niti" obuhvata i oligomerne podjedinice nukleinske kiseline tipa koji može da se nađe u prirodi, kao što su deoksiribonukleotidne i ribonukleotidne strukture DNK i RNK, kao i analoge napravljene od strane čoveka koji su sposobni da se vezuju za nukleinske kiseline koje se nalaze u prirodi. Oligonukleotidi prema predmetnom pronalasku zasnivaju se na ribonukleotidnim ili deoksiribonukleatidnim monomerima povezanim fosfodietarskim vezama ili putem metilfosfonatnih, fosforotioatnih ili drugih veza. Oni takođe mogu da sadrže monomerne podjedinice koje poseduju izmenjene osnovne strukture ili druge modifikacije, s tim da zadržavaju sposobnost da se vezuju za prirodne DNK i RNK strukture.
U odnosu na sekvence kodirajućeg lanca koje su ovde opisane (npr., sekvence čiji su ID brojevi 1, 3, 5, 7, 12 - 21, ili 28) , mogu da se dizajniraju nukleinske kiseline nekodirajućeg lanca prema predmetnom pronalasku shodno pravilima o uparivanju baza koje su postavili Watson & Crick ili Hoogsteen. Molekul nekodirajuće niti može biti komplementaran čitavom kodirajućem regionu iRNK, ali poželjnije to je oligonukleotid koji je komplementaran samo sa delom kodirajućeg ili nekodirajućeg regiona koji okružuje mesto početka translacije iRNK. Oligonukleotid nekodirajućeg lanca može biti, na primer, dugačak oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 nukleotida. Pri izboru poželjne dužine oligonukleotida nekodirajućeg lanca mora biti postignuta ravnoteža kako bi se dobile najpoželjnije karakteristike. Kraći oligonukleotidi od 10 - 15 baza u dužini lako ulaze u ćelije, ali poseduju manju gensku specifičnost. Nasuprot tome, duži nukleotidi od 20 - 30 baza omogućavaju superiornu gensku specifičnost, ali imaju umanjenu kinetiku preuzimanja u ćelije. Videti Stein et al., Phosphorothioate 01igodeoxynucleotide Analogues u "01igodeoxynucleotides - Antisense Inhibitors of Gene Expression" Cohen, urednik. McMillan Press, London (1988).
Nekodirajući lanac nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku može biti konstruisan korišćenjem hemijske sinteze ili reakcija enzimske ligacije upotrebom postupaka koji su poznati u struci. Na primer, nekodirajući lanac nukleinske kiseline može biti hemijski sintetisan upotrebom prirodnih nukleotida ili na razne načine modifikovanih nukleotida dizajniranih tako da povećaju biološku stabilnost molekula ili da povećaju fizičku stabilnost dvostrukog lanca koji se stvara spajanjem kodirajućeg i nekodirajućeg lanca nukleinskih kiselina (npr.. mogu da se koriste fosforotioatni derivat i nukleotidi supstituisani akridinom).
Primeri modifikovanih nukleotida koji mogu da se upotrebe za dobijanje nekodirajućeg lanca nukleinske kiseline uključuju: 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-hlorouracil, 5-jodouracil, hipoksantin, ksantin, 4-acetilcitozin, 5-(karboksihidroksilmetil) uracil, 5-karboksimetilaminometil-2-tiouridin, 5-karboksimetilaminometiluracil, dihidrouracil, (3-D-galaktozilheozin, inozin, N6-izopentananiladenin, 1-metilguanin, 1-metilinozin, 2,2-dimetilguanin, 2-metiladenin, 2-metilguanin, 3-metilcitozin, 5-metilcitozin, N6-adenin, 7-metilguanin, 5-metilaminometiluracil, 5-metoksiaminometil-tiouracil, P-D-manozilheozin, 5'-metoksikarboksimetiluracil, 5-metoksiuracil, 2-metiltio-N6-izopenteniladenin, uracil-5-oksisirćetna kiselina (v), vibutoksozin, pseudouracil, heozin, 2-tiocitozin, 5-metil-2-tiouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-metiluracil, metilestar uracil-5-oksisirćetne kiseline, uracil-5-oksisirćetna kiselina (v), 5-metil-2-tiouracil. 3-(3-amino-3-N-2-karboksipropil) uracil, (acp3) w i 2,6-diaminopurin. Alternativno, nekodirajući molekul nukleinske kiseline može da se dobije biološkim postupkom upotrebom vektora ekspresije u kome je nukleinska kiselina subkodirana u orijentaciji nekodirajućeg lanca (tj., RNK koja je transkribovana na insertovane nukleinske kiseline će imati orijentaciju nekodirajućeg lanca u odnosu na ciljnu nukleinsku kiselinu od interesa, stoje dalje opisano u sledećem pasusu).
Nekodirajući molekuli nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku se tipično primenjuju kod subjekta ili se stvarajuin situtako da hibridizuju ili se vezuju za ćelijsku iRNK i/ili genomsku DNK koja kodira protein prema predmetnom pronalasku čime se inhibira ekspresija proteina, npr., tako što se inhibira transkripcija i/ili translacija. Hibridizacija može da se ostvari putem konvencionalne komplementarnosti nukleotida čime se formira stabilna dvostruka forma ili, na primer, može da se ostvari u slučaju da se molekul nekodirajuće molekul nukleinske kiseline vezuje za DNK dvostruke forme putem specifičnih intereakcija u glavnom segmentu dvostrukog heliksa. Primer načina primene nekodirajućih molekula nukleinske kiseline jeste modifikacija molekula prema izabranim ciljnim ćelijama, a potom sistemska primena. Na primer, kod sistemske primene, nekodirajući molekuli nukleinske kiseline mogu biti tako modifikovani da se specifično vezuju za receptore ili antigene koji su eksprimirani na površini izabranih ćelija, npr., putem vezivanja nekodirajućin molekula nukleinske kiseline za peptide ili antitela koja se vezuju za površinske ćelijske receptore ili antigene. Nekodirajući molekuli nukleinskih kiselina takođe mogu da se dopreme do ćelija upotrebom ovde opisanih vektora. Da bi se postigle dovoljne unutar ćelijske koncentracije nekodirajućih molekula nukleinske kiseline poželjni su vektorski konstrukti u kojima je nekodirajići molekul nukleinske kiseline stavljen pod kontrolu jakog pol II ili pol III promotera.
U još jednom rešenju prema predmetnom pronalasku, nekodirajući molekul nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku je a - anomerni molekul nukleinske kiseline. Molekul a - anomerne nukleinske kiseline formira specifične dvolančane hibride sa komplementarnom RNK u kojima za razliku od običnih (3 - pod jedinica lanci se prostiru paralelno jedan u odnosu na drugi (Gaultieret al, Nucleic Acids Res 15: 6625 - 6641 (1987)). Nekodirajući molekul nukleinske kiseline takođe može da sadrži 2'-o-metilribonukleotid (Inoueet al., Nucleic Acids Res 15 :6131 - 6148 (1987) ili himerični RNK - DNK analog (Inoueet al.,FEBS Lett 215 : 327 - 330 (1987)).
Vakcine za tumore
Peptidi prema predmetnom pronalasku ili njihovi analozi mogu da se koriste za tretiranje ili sprečavanje nastanka neoplastičnog poremećaja u obliku preparata vakcine. Peptidi prema predmetnom pronalasku ili njihovi analozi koji poseduju imuno stimuliraj uću aktivnost mogu biti tako modifikovani da obezbede druge željene osobine pored povećanja poluživota u serumu. Na primer, sposobnost peptida da indukuje CTL aktivnost može da se poveća povezivanjem sa sekvencom koja sadrži barem jedan epitop koji je sposoban za indukciju T - helper ćelijskog odgovora. Posebno poželjni imunogeni peptidi / T helper konjugati su povezani putem veznog molekula. Spejser sekvenca je tipično sastavljena od relativno malih, neutralnih molekula, kao što su aminokiseline ili mimetici aminokiselina, koji su praktično nenaelektrisani u fiziološkim uslovima i koji mogu da poseduju linearne ili razgranate bočne lance. Vezne sekvence su tipično izabrane iz grupe koju čine, na primer, Ala, Gly, ili druge neutralne vezne sekvence nepolarnih aminokiselina ili neutralnih polarnih aminokiselina. Treba napomenuti da opciono prisutna vezna sekvenca ne mora da se sastoji iz istih ostataka, tako da može biti hetero - ili homo - oligomer. Kada je prisutna, vezna sekvenca se sastoji obično od jednog ili dva ostatka, uobičajeno od tri do šest ostataka. Alternativno, CTL peptid može biti povezan sa T helper peptidom bez vezne sekvence.
Imunogeni peptid može biti povezan sa T - helper peptidom direktno ili putem vezne sekvence, bilo na amino ili na karboksi terminalu CTL - peptida. Aminoterminal imunogenog peptida ili T - helper peptida može biti acilovan. Primeri T- helper peptida obuhvataju tetanusni toksoid 830 - 843, influencu 307 - 319, cirkumsporozoid malarije 382 - 398 i 378 - 389.
U nekim rešenjima može biti poželjno da u preparat vakcine prema predmetnom preonalasku bude uključena barem jedna komponenta koja je imunostimulator. Stoga, predmetni pronalazak takodje obuhvata upotrebu adjuvansa koji se razlikuje od nukleinske kiseline. Adjuvans koji se razlikuje od nukleinske kiseline u nekim rešenjima jeste adjuvans koji omogućava depo efekat, to može biti imunostimulirajući adjuvans ili adjuvans koji stvara depo efekat i stimuliše imuni sistem. Poželjni adjuvans koji omogućava depo efekat izabran je iz grupe koju sačinjavaju aluminijum (npr., aluminijumhidroksid, aluminijumfosfat), emulzije koje se zasnivaju na formulacijama koje sadrže mineralno ulje, nemineralno ulje, emulzije tipa voda - u - ulju, ili ulje - u - vodi, kao što je Seppic ISA serija Montanid adjuvanasa: MF - 59 i PROVAX™ U još poželjnijem rešenju imunostimulirajuće sredstvo je PROVAX™.
U nekim rešenjima imunostimulirajući adjuvans je izabran iz grupe koju čine saponini prečišćeni iz koreQ. saponariadrveta, kao što je QS21; poli[di(karboksilatofenoksi)fosfazen (PCPP) derivati lipopolisaharida kao što su monofosforil lipid (MPL), muramil dipeptid (MDP) i treonil muramil dipeptid (tMDP); OM - 174 ; i faktor elongacije Leishmania-e. U jednom rešenju, adjuvans koji omogućava depo efekat i stimuliše imunosistem izabran je iz grupe koju čine ISCOMS; SB - AS2; SB - AS4; nejonski blok kopolimeri koji formiraju micele kao što je CRL 1005; i sinteks adjuvansni preparat.
Imunogeni peptidi mogu da se dobiju sintetski ili primenom tehnologije rekombinanatne DNK ili izolacijom iz prirodnih izvora kao što su čitavi virusi ili tumori. Iako je peptid poželjno u značajnoj meri očišćen od drugih prirodnih proteina ćelije domaćina i njihovih fragmenata, u nekim rešenjima peptidi mogu biti sintetski konjugovani sa nativnim fragmentima ili česticama. Polipeptidi ili peptidi mogu imati različitu dužinu, bilo u svojim prirodnim (nepromenjenim) oblicima ili u oblicima soli, a takođe mogu da ne poseduju modifikacije kao što su glikolizacija, oksidacija bočnog lanca, ili fosforilacija, ili mogu da sadrže ove modifikacije, što zavisi od toga da li modifikacija uništava biološku aktivnost ovde opisanih polipeptida ili ne.
Alternativno, tehnologija rekombinantne DNK može da se koristi tako da se nukleotidna sekvenca koja kodira imunogeni peptid od interesa insertuje u ekspresioni vektor, da bude transformirana ili transficirana u odgovarajuću ćeliju domaćina i kultivisana pod uslovima koji odgovaraju ekspresiji. Ovi postupci su generalno poznati u struci i generalno su opisani u Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982), koja je ovde inkorporirana po referenci. Stoga, fuzioni proteini koji sadrže jednu ili više pepetidnih sekvenci prema predmetnom pronalasku mogu da se upotrebe za prezentaciju odgovarajućeg T - ćelijskog epitopa.
Peptidi prema predmetnom pronalasku i njihovi farmaceutski preparati i preparati vakcina korisni su za primenu kod sisara, posebno kod ljudi, u cilju lečenja neoplazmi. Primeri neoplastičnih bolesti koje mogu da se tretiraju upotrebom imunogenih peptida prema predmetnom pronalasku obuhvataju kancer pluća, kancer jajnika, kancer dojke i kancer prostate.
Preparati vakcina koji sadrže peptide prema predmetnom pronalasku primenjuju se kod pacijenata koji su podložni za razvoj ili koji na drugi način poseduju rizik od razvoja virusne infekcije ili kancera u cilju izazivanja imunog odgovora protiv antigena, čime se pojačavaju sposobnost imunog odgovora samog pacijenta. Količina preparata koja izaziva ovaj efekat označava se kao "imunološki efikasna doza". Pri ovakvoj upotrebi, precizne količine ponovo zavise od opšteg zdravstenog stanja pacijenta i njegove telesne mase, od načina primene, od prirode formulacije, itd., ali se generalno nalaze u opsegu od oko 1,0 u.g do oko 5000 ug po telesnoj masi od 70 kg pacijenta, češće od oko 10 ug do oko 500 ug po telesnoj masi od oko 70 kg pacijenta.
Pri primenama u terapeutske svrhe ili svrhe imunizacije, peptidi prema predmetnom pronalasku takođe mogu biti eksprimirani od strane atenuiranih virusnih domaćina, kao što su virus vakcinije peradi. Ovaj pristup obuhvata upotrebu virusa vakcinije kao vektora ekpresije nukleotidnih sekvenci koje kodiraju peptide prema predmetnom pronalasku. Nakon uvođenja u akutno ili hronično inficiranog domaćina ili u neinficiranog domaćina, rekombinantni virus vakcinije eksprimira imunogeni peptid i tako izaziva CTL odgovor domaćina. Vektori vakcinija virusa i postupci koji su korisni u protokolima imunozacije opisani su, npr., u U.S. patentu br. 4, 722, 848 koji je ovde inkorporiran po referenci. Drugi vektor je BCG (Bacille Calmette Guerin). BCG vektori su opisani u (Stoveret al, Nature 351: 456 - 460 (1991)), koji je ovde inkorporiran po referenci. Širok spektar drugih vektora je koristan za terapeutsku primenu ili za imunizaciju putem peptida prema predmetnom pronalasku, npr., vektoriSalmonella typhii slični što je očigledno stručnjacima na osnovu ovde iznetog opisa.
Takođe, antigeni peptidi mogu da se koriste za izazivanje CTL ex vivo. Nastali CTL može da se upotrebi za tretiranje hroničnih infekcija (virusnih ili bakterijskih) ili tumora kod pacijenata koji ne reaguju na druge konvencionalne oblike terapije ili koji ne reaguju na terapijski pristup upotrebom peptidne vakcine. Ex vivo CTL odgovori na određeni patogen (infektivni agens ili tumorski antigen) se indukuju inkubacijom u tkivnoj kulturi pacijentovih CTL prekursorskih ćelija (CTLp) zajedno sa izvorom antigen - prezentujućih ćelija (APC) i sa odgovarajućim imunogenim peptidom. Nakon određenog vremena inkubacije (tipično 1 - 4 nedelje) tokom koga se CTLp aktiviraju i sazrevaju i ekspandiraju u efektorske CTL. ćelije se infuzijom vraćaju u organizam pacijenta, gde razaraju svoje specifične ciljne ćelije (inficirane ćelije ili tumorske ćelije).
Peptidi takođe mogu da se koriste kao dijagnostički reagensi. Na primer, peptid prema predmetnom pronalasku može da se koristi za određivanje podložnosti određenog pojedinca režimu tretmana koji koristi taj peptid ili povezane peptide, pa tako može biti u pomoći u modifikaciji postojećeg protokola tretmana ili od pomoći u određivanju prognoze aficiranog pojedinca. Dodatno peptidi mogu da se koriste za predviđanje koji pojedinac poseduje značajan rizik za razvoj hronične infekcije.
Anti - idiotipska antitela
Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupke koji koriste anti - idiotipska antitela za imunoterapiju i imunoprofilaksu tumora. Predmetni pronalazak se odnosi na manipulaciju idiotipske mreže u cilju postizanja terapijskih efekata. Imunizacija sa anti-idiotipskim antitelima (Ab2) može da indukuje stvaranje anti - anti - idiotipskih imunoglobulina od kojih neki poseduju istu antigenu specifičnost kao antitelo (Abl) koja se koristi za derivaciju anti - idiotipa. Ovaj postupak predstavlja značajan način za manipulaciju imunim odgovorima na taj način što predstavlja mehanizam za stvaranje i amplifikaciju antigen - specifičnog prepoznavanja u imunom sistemu. Izgleda da imuni odgovor na tumor obuhvata idiotip - specifično prepoznavanje tumorskog antigena; predmetni pronalazak se odnosi na strategije za manipulaciju ovim prepoznavanjem u cilju postizanja terapijske koristi. Posebna rešenja prema predmetnom pronalasku obuhvataju upotrebu anti - idiotipskog antitela za imunizaciju protiv tumora, za aktivaciju limfocita koji se koriste u adoptivnoj imunoterapiji, i za inhibiciju imune supresije posredovane supresorskim T - ćelijama ili supresorskim faktorima koji eksprimiraju idiotop usmeren protiv tumorskog antigena. Anti - idiotipska antitela ili njihovi fragmenti takođe mogu da se koriste za praćenje anti - antitelo indukcije kod pacijenata koji se podvrgavaju pasivnoj imunizaciji na tumorski antigen putem primene anti - tumorskog antitela.
U specifičnom rešenju, indukcija anti - idiotipskih antitelain vivo,putem primene anti - tumorskog antitela ili imunih ćelija ili faktora koji pokazuju anti - tumorski idiotop može da poseduje terapijsku vrednost.
Predmetni pronalazak takođe obuhvata molekule anti - idiotipskih monoklonskih anttitela ili fragmente molekula anti - idiotipskih monoklonskih antitela ili njihove modifikacije koje prepoznaju idiotip koji je usmeren protiv IGSF9 ili LIV - 1.
Molekuli monoklonskih antitela prema predmetnom pronalasku obuhvataju čitave molekule monoklonkog antitela ili fragmente ili bilo koje hemijske modifikacije ovih molekula, koje sadrže antigen - kombinujuće mesto koje se vezuje za idiotip drugog molekula antitela sa specifičnošću prema IGSF9 ili LIV - 1. Fragmenti monoklonskog antitela koji sadrže idiotip MAt molekul mogu da se dobiju primenom različitih tehnika. Ovde spadaju, bez ograničenja, sledeći postupci : F(ab')2fragment koji može da se dobije tretiranjem molekula antitela pepsinom; Fab' fragmenti koji mogu da se dobiju redukcijom disulfidnih mostova F(ab')2fragmenta; i 2 Fab ili Fab fragmenti koji mogu da se dobiju tretiranjem molekula papainom i redukcionim sredstvom kojim se redukuju disulfidni mostovi.
U zavisnosti od upotrebe, anti - idiotipska antitela prema predmetnom pronalasku mogu biti hemijski modifikovana povezivanjem sa nekim od mnogih jedinjenja upotrebom tehnika povezivanja koje su poznate u struci. Ovde spadaju, bez ograničenja, enzimske reakcije, oksidativne supstitucije, helacija itd., koje se koriste, na primer, pri vezivanju radio - izotopa kod imunotestova.
Stvaranje hemijske veze ili vezivanje jedinjenja za molekul može biti usmereno ka mestu koje ne učestvuje u idiotipskom vezivanju, na primer, može biti usmereno prema Fc domenu molekula. Ovo može da se postigne zaštitom vezujućeg mesta molekula pre izvođenja reakcije vezivanja. Na primer, molekul može biti vezan za idiotip koji prepoznaje pre reakcije vezivanja. Nakon završetka vezivanja, kompleks može biti rasturen kalo bi se dobio modifikovani molekul sa minimalnim efektom na vezujuće mesto molekula.
Anti - idiotipska antitela ili fragmenti molekula antitela prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste kao imunogeni za indukciju, modifikaciju ili regulaciju specifičnog ćelijski posredovanog tumorskog imuniteta. Ovo obuhvata, bez ograničenja, upotrebu ovih molekula pri imunizaciji protiv singenih tumora.
Kompleti
Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje postupke za identifikaciju prisustva i ekspresije nekog od polinukleotida ili polipeptida prema predmetnom pronalasku ili njegovog homologa u ispitivanom uzorku, upotrebom probe na nukleinsku kiselinu ili antitela prema predmetnom pronalasku, koji su opciono konjugovani ili na drugi način udruženi sa odgovarajućom oznakom.
Generalno, postupci za detekciju polinukleotida prema predmetnom pronalasku obuhvataju uspostavljanje kontakata između uzorka i jedinjenja koje se vezuje za i stvara kompleks sa polinukleotidom tokom vremenskog perioda koji je dovoljan za stvaranje kompleksa, kao i detekciju kompleksa, tako da u slučaju da se kompleks detektuje polinukleotid prema predmetnom pronalasku se smatra detektovanim u uzorku. Takvi postupci takođe mogu da obuhvataju uspostavljanje kontakta uzorka u strogim uslovima hibridizacije sa prajmerima nukleinske kiseline koji odgovaraju polinukleotidu prema predmetnom pronalasku u navedenim uslovima i koji amplifikuju polinukleotide za koje su vezani, tako da ukoliko je polinukleotid amlifikovan, polinukleotid prema predmetnom pronalasku se smatra detektovanim u uzorku.
Generalno, postupci za detekciju polinukleotida prema predmetnom pronalasku obuhvataju uspostavljanje kontakta uzorka sa jedinjenjem koje se vezuje i koje formira kompleks sa polinukleotidom tokom vremenskog perioda koji je dovoljan za stvaranje kompleksa, kao i detekciju komleksa, tako da ukoliko je kompleks detektovan, polipeptid prema predmetnom pronalasku se smatra detektovanim u uzorku.
Detaljnije, takvi postupci obuhvataju inkubaciju ispitivanog uzorka sa jednim ili sa više antitela ili sa jednom ili sa više proba na nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku i ispitivanje vezivanja proba za nukleinske kiseline ili antitela za komponente u ispitivanom uzorku.
Uslovi za inkubaciju probe za nukleinsku kiselinu ili antitela sa ispitivanim uzorkom variraju. Uslovi inkubacije zavise od formata koji se koristi u testu, od postupaka za detekciju koji se koriste i od tipa i prirode probe na nukleinsku kiselinu ili antitela koji se koristi u testu. Stručnjak shvata da bilo koji od uobičajeno dostupnih formata hibridizacije, amplifikacije ili imunoloških testova može lako da bude adaptiran radi upotrebe proba za nukleinsku kiselinu ili antitela prema predmetnom pronalasku. Primeri takvih testova mogu da se nađu u Chard, T.,An Introduction to Rađioimmunoassay and Related Techniques,Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Holandija (1986); Bullock, G. R.et al, Techniques in Immunocytochemistry,Academic Press, Orlando, FL Vol. 1 (1982), Vol. 2 (1983), Vol. 3 (1985); Tijssen, P., Practice and Theorv of immunoassays:Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Holandija (1985). Ispitivani uzorci prema predmetnom pronalasku obuhvataju ćelije, proteinske ili membranske ekstrakte ćelija ili biološke tečnosti kao što su sputum, krv, serum, plazma ili urin. Ispitivani uzorak koji se koristi u gore opisanom postupku varira u odnosu na format testa, prirodu postupka detekcije i tkiva, ćelija ili ektrakata koji se koriste kao uzorci koji treba da se ispitaju. Postupci za pripremanje proteinskih ekstrakata ili membranskih ektrakata ćelija su dobro poznati u struci i mogu lako da se adaptiraju u cilju dobijanja uzorka koji je kompatabilan sa sistemom koji se koristi.
U drugom rešenju prema predmetnom pronalasku, obezbeđeni su kompleti koji sadrže neophodne reagense za izvođenje testova prema predmetnom pronalasku. Specifično, predmetni pronalazak obezbeđuje komplet sa odeljcima koji su dobro zatvoreni i sa jednim ili više kontejnera koji sadrže: (a) prvi kontejner koji sadrži jednu od proba ili antitela prema predmetnom pronalasku; i (b) jedan ili više drugih kontejnera koji sadrže jednu ili više od sledećih supstanci: reagense za ispiranje, reagense sposobne da detektuju prisustvo vezane probe ili antitela.
Detaljnije, komplet sa odeljcima obuhvata bilo koji komplet u kome se reagensi nalaze u razdvojenim kontejnerima. Takvi kontejneri sadrže male staklene kontejnere, plastične kontejnere ili trake plastike ili papira. Takvi kontejneri omogućavaju efikasni prenos reagenasa iz jednog odeljka u drugi odeljak, tako da se uzorci i reagensi ne ukrštaju i kontaminiraju, i tako da sredstva ili rastvori iz svakog kontejnera mogu da se dodaju na kvantitativan način iz jednog odeljka u drugi. Takvi kontejneri obuhvataju kontejner koji prihvata ispitivani uzorak, kontejner koji sadrži antitela ili probe koje se koriste u testu, kontejnere koji sadrže sredstva za ispiranje (kao što je fiziološki rastvor puferovan fosforatom, Tris - puferi, itd. ) , kao i kontejnere koji sadrže reagense koji se koriste za detekciju vezanog antitela ili probe. Tipovi reagensa za detekciju obuhvataju obeležene probe za nukleinske kiseline, obeležena sekundarna antitela ili kao alternativu, ukoliko je primarno antitelo obeleženo, enzimske ili reagense koji se vezuju za antitelo koji su sposobni za reakciju sa obeleženim antitelom. Sručnjak shvata da opisane probe i antitela prema predmetnom pronalasku mogu lako da se inkorporiraju u jedan od ustaljenih formata kompleta koji su dobro poznati u struci.
Primeri
Primer 1 : Ekspresija IGSF9
Ekspresija gena IGSF9 je ispitivana u brojnim normalnim i neoplastičnim tkivima. Slika 2 predstavlja rezultate "elektronske Northern blott analize" koji opisuje profil ekspresije ovog gena koji je određen upotrebom Gene Logic datasuite. Vrednosti duž y - ose predstavljaju intenzitet ekspresije izražen u Gene Logic jedinicama. Svaki od glavnih kružića na slici predstavlja uzorak određenog pacijenta. Grafikon sa prečkama na slici sa leve strane prikazuje procenat svakog od tipa tkiva u kome je željeni genski fragment eksprimiran. Ukupni broj uzoraka za svaki tip tkiva tkiva je sledeći: maligno tkivo dojke (60); maligno tkivo debelog creva (91); maligno tkivo pluća (40); maligno tkivo jajnika (37); maligno tkivo prostate (26); normalno tkivo dojke (30); normalno tkivo debelog creva (30); normalno tkivo jednjaka (17); normalno tkivo bubrega (27); normalno tkivo jetre (19); normalno tkivo pluća (34); normalno tkivo limfnog čvora (9); normalno tkivo jajnika (22); normalno tkivo pankreasa (18); normalno tkivo prostate (21): normalno tkivo rektuma (22): normalno tkivo slezine (9); normalno tkivo želuca (21).
Dodatno, ekspresija IGSF9 u normalnim i malignim humanim tkivima je dalje ispitivana pomoću PCR eksperimenata upotrebom komercionalno dostupnih panela humane cDNK i uzoraka cDNK koji su dobijeni od strane istraživača iz humanih tkiva i ćelijskih linija. Rezultati ovih eksperimenata predstavljeni u tekstu ispod na slikama 3-7. Sledeći PCR prajmeri su sintetisani i korišćeni u svim eksperimentima :
Sekvenca ovih prajmeraje sadržana u delu IGSF9 koji je predstavljen u IMAGE klonu br. 2013096 / ATCC kataloški br. 3068496, iz koga je kao pozitivna kontrola od svakog od eksperimenata korišćena plazmidska DNK. Ovi prajmeri amplifikuju PCR proizvod od 387 bp iz bilo koje cDNK matrice kaja sadrži gen za IGSF9. Kao kontrola cDNK integriteta u svim eksperimentima je merena ekspresija gliceraldehid 3 - fosfat dehidrogenaze (GAPDH). GAPDH je tzv., "housekeeping" gen koji je u velikoj meri eksprimiran u svim humanim tkivima. Prajmeri koji se koriste za amplifikaciju gena GAPDH su :
Ovi prajmeri amplifikuju proizvode od 482 bp iz bilo koje cDNK matrice koja kodira gen za GAPDH. U svim slučajevima, uključene su pozitivne i negativne kontrole ; pozitivna kontrola je plazmidska DNK za IMAGE klon 4762143, a negativna kontrola je voda (bez matrice).
Slika 3 prikazuje ekspresiju IGSF9 u normalnim tkivima, koja je određena upotrebom Clontech-ovih humanih višestrukih tkivnih cDNK panela (BD Biosciences, kataloški broj K1420 - 1 i K1421 - 1). Gornji panel prikazuje ekspresiju IGSF9, dok donji panel prikazuje ekspresiju GAPDH. Uzorci cDNK koji su prisutni u svakoj od traka su poreklom iz sledećoh organa : (1) mozak, (2) placenta, (3) pluća, (4) jetra, (5) skeletni mišić, (6) bubreg, (7) pankreas, (8) slezina, (9) timus, (10) prostata, (11) testis, (12) jajnik, (13) tanko crevo, (14) debelo crevo. (15) leukociti periferne krvi, (16) pozitivna kontrola i (18) negativna kontrola. Vrhovi strelica na desnoj strani slike označavaju očekivanu veličinu PCR proizvoda IGSF9. Podaci na ovoj slici pokazuju da se IGSF9 slabo eksprimira u normalnom tkivu jetre, pankreasa, prostate, testisa i debelog creva, kao i da je ekspresija odsutna u svim drugim normalnim tkivima.
Na slici 4 je prikazana ekspresija IGSF9 u panelu uzoraka humanog tumora jajnika i dve ćelijske linije tumora jajnika. Uzorci tumora jajnika su dobijeni od strane Cooperative Human Tissue Netvvork (CHTN); ćelijske linije Ovčar - 3 i PA1 su dobijene od strane Američke kolekcije tipskih kultura (ATCC, Rockville MD). Iz svakog uzorka ćelijske linije je izolovana RNK korišćenjem Qiagen-ovog RNeasv kompleta (kataloški br.75162). cDNK je dobijena iz ukupne RNK korišćenjem Invitrogen - ovog sistema za sintezu cDNK (kataloški br. 11904 - 018). Gornji panel prikazuje ekspresiju IGSF9, a donji panel prikazuje ekspresiju GAPDH. Brojevi iznad svake od traka odgovaraju uzorcima tumora jajnika: (1) umereno diferencirani cistoadenokarcinom, (2) slabo diferencirani papilarni serozni adenokarcinom, (3) slabo diferencirani papilarni serozni adenokarcinom, (4) slabo diferencirani endometrioidni adenokarcinom, (5) papilarni serozni adenokarcinom, (6) endometrioidni adenokarcinom, (7) slabo diferencirani adenokarcinom, (8) slabo diferencirani serozni adenokarcinom, (9) Ovčar - 3 ćelijska linija, (10) PA - 1 ćelijska linija, (11) pozitivna kontrola, i (12) negativna kontrola. Vrhovi strelica na desnoj strani slike označavaju predviđene veličine PCR proizvoda IGSF9. Podaci na ovom panelu pokazuju da je IGSF9 eksprimiran u 7 od 8 uzorakatumora, sa jakom ekspresijom u 5 od ovih uzoraka. On je takođe eksprimiran u obe ćelijske linije tumora jajnika.
Slika 5 prikazuje ekspresiju IGSF9 u uzorcima tumora dojke i u odgovarajućim uzorcima normalne dojke. Ekspresija u tkivu dojke je određena korišćenjem Clontech - ovog panela uklopljenih cDNK parova humane dojke (BD Biosciences, kataloški br. K1432 - 1, prvih 5 setova uzoraka) kao i korišćenjem 5 uzoraka uklopljenih u laboratoriji istraživača dobijenih iz Grossmont bolnice, La Mesa CA. RNK je izolovana iz svakog uzorka upotrebom TRIzol reagensa (Invitrogen, kataloški br. 15596026). cDNK je dobijena iz ukupne DNK korišćenjem Gibco BRL sistema za sintezu cDNK (Life Technologies, kataloški br. 18267 - 021). Gornji panel prikazuje ekspresiju IGSF9; donji panel prikazuje ekspresiju GAPDH. (N) normalno tkivo, (T) tumorsko tkivo. Uzorci tumora su označeni na sledeći način: (Pacijent A) infiltrirajući duktalni karcinom; (pacijent B) infiltrirajući duktalni karcinom; (pacijent C) tabularni adenokarcinom; (pacijent D) infiltrirajući duktalni karcinom; (pacijent E) infiltrirajući duktalni karcinom; (pacijent T) in situ & invazivni duktalni karcinom visokog gradusa; (pacijent X) duktalni adenokarcinom; (pacijent W) mešoviti duktalni i lobularni adenokarcinom; (pacijent GH19) invazivni duktalni karcinom visokog gradusa; (pacijent GH17) intraduktalni karcinom niskog gradusa. Vrhovi strelica na desnoj strani slike prikazuju očekivane veličine PCR proizvoda IGSF9. Podaci koji su prikazani ovde ukazuju da je IGSF9 eksprimiran u 8 od 10 uzoraka tumora dojke, a samo 4 od 10 normalnih uzoraka.
Ekspresija IGSF9 u tumorima pluća je prikazana na slici 6. Ekspresija je određena upotrebom Clontech - ovog panela uklopljenih cDNK parova humanih pluća (BD Biosciences, kataloški br. K1434 - 1). Gornji paneli prikazuju ekspresiju IGSF9, a donji paneli prikazuju ekspresiju GAPDH. (N) normalno tkivo, (T) tumorsko tkivo. Uzorci tumora koji su analizirani su sledeći : (Pacijent A) infiltrirajući duktalni karcinom, (pacijent B) skvamocelularni keratinizujući karcinom, (pacijent C) adenoskvamozni karcinom, (pacijent D) keratinizujući skvamocelularni karcinom, (pacijent E) skvamocelularni karcinom. Vrhovi strelica na desnoj strani slike označavaju očekivane veličine PCR proizvoda IGSF9. Ovde prikazani podaci ukazuju daje IGSF9 prisutan u svih 5 uzoraka tumora pluća, a samo u 2 od 5 normalnih uzoraka.
Ekspresija IGSF9 u tumorima debelog creva je prikazana na slici 7. Uzorci tumora debelog creva su dobijeni iz Grossmont bolnice, La Mesa CA. Ćelijska linija HCT116 kolorektalnog kancera je dobijena od Američke kolekcije tipskih kultura (ATCC, Rockville, MD) RNK je izolovana iz svakog od uzorka i ćelijske linije upotrebom Qiagen - ovog RNeasv kompleta (kataloški broj 75162). cDNK je dobijena iz ukupne RNK upotrebom Gibco - ovog BRL sistema sinteze cDNK (Life Technologies, kataloški br. 18267 - 021). Gornji panel prikazuje ekspresiju IGSF9, a donji panel prikazuje ekspresiju GAPDH. Uzorci su sledeći: (1) adenokarcinom gradusa 3, (2) adenokarcinom gradusa 2, (3) adenokarcinom gradusa 2, (4) adenokarcinom gradusa 2, (5) ćelijska linija HCT116. Vrhovi strelica na desnoj strani slike označavaju očekivanu veličinu PCR proizvoda IGSF9. Podaci na ovoj slici ukazuju daje IGSF9 eksprimiran u ćelijskoj liniji HTC116 tumora debelog creva i daje možda takođe slabo eksprimiran u barem 1 od 4 tumorska uzorka.
Posmatrano zajedno, ovde prikazani podaci pokazuju daje IGSF9 eksprimiran u značajnim nivoima u višestrukim uzorcima tumora jajnika, dojke, pluća i debelog creva. Stoga, IGSF9 može da predstavlja opšti karcinomski antigen i pogodnu metu za terapiju tumora bilo kojoj od gore pomenutih indikacija.
Primer 2: Ekspresija IGSF9 u ćelijama humanog tumora određena pomoću
RT -PCR
Ispitivana je ekspresija IGSF9 u kolekciji ćelijskih linija humanih tumora koja je dobijena od ATCC (Manassas, VA) i od Arizona Cancer Center ( Tucson, AZ) pomoću RT - PCR. Rezultati ovog eksperimenta koji su prikazani na slici 8, ukazuju daje IGSF9 eksprimiran u brojnim različitim ćelijskim linijama tumora.
Korišćene su sledeće ćelijske linije tumora :
Pankreas : PANC - 1.
Dojka : ZR - 75 - 1, MDA - MB468, MAD - MB231, ME - 180, UACC812.
Jajnik: UACC326.
Pluća : A549 (NSCLC) , NCI - H69 (sitno ćelijski) , NCI - HI 1299 (NSCLC) , NCI - H2126(NSCLC).
Debelo crevo : HT 29, LoVo, SW 620, Colo 201, Colo 205, Colo 320.
RNK je izolovana iz svake ćelijskih linija upotrebom Qiagen - ovog RNeasv kompleta, a cDNK je nakon toga dobijena iz ukupne RNK korišćenjem Invitrogen - ovog sistema za sintezu cDNK. Rezultat ovog PCR eksperimenta je interpretiran na slici 8, na kojoj je relativna ekspresija IGSF9 u svakom uzorku predstavljena kao odnos intenziteta ekspresije IGSF9 i intenziteta ekspresije gliceraldehid 3 - fosfat dehidrogenaze (GAPDH) kao interne kontrole.
Sintetisani su i korišćeni u svim eksperimentima sledeći PCR prajmeri:
Ovi prajmeri amplifikuju PCR proizvod od 387 bp na osnovu bilo koje cDNK matrice koja sadrži gen za IGSF9. Ekspresija GAPDH je merena u svim eksperimentima kao kontrola integriteta cDNK. Korišćeni su sledeći prajmeri za amplifikaciju gena za
GAPDH:
Ovi prajmeri amplifikuju proizvod od 482 bp na osnovu bilo koje cDNK matrice koja kodira gen za GAPDH.
Primer 3: Dobijanje stabilnih ćelijskih linija sisara koje eksprimiraju IGSF9
konstrukte
U javnim bazama podataka su identifikovana dva alternativna oblika IGSF9, koji se ovde označavaju kao "kratki oblik" i "dugi oblik" IGSF9. Dugi oblik IGSF9 je alternativno obrađena varijanta koja sadrži inserciju od 17 aminokiselina u ekstracelularnom domenu koja je locirana između 2 Ig domena. Nukleotidna i proteinska sekvenca kratkog oblika je prikazana na slikama 1A i 1B. Slike 9E i 9F predstavljaju nukleotidnu i proteinsku sekvencu dugog oblika IGSF9, respektivno.
cDNK pune dužine koje kodiraju kratki i dugi oblik IGSF9 konstruisane su iz komercijalno dostupnih EST plazmida korišćenjem standardnih tehnika molekularnog kloniranja i sintetskih oligonukleotidnih prajmera. Klonovi pune dužine su zatim insertovani u odgovarajuće ekspresione vektore za sisare (opisano u U. S. patentima br. 5,648,267, 5,733, 779, 6, 017,733, i 6,159,730, mada su komercionalno dostupni vektori, kao što je pIND / hygro dostupni od Invitrogen-a: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl i pSG su dostupni od Stratagene - a; i pSVK3, pBPV, pMSG i pSVL su dostupni od Pharmacia-e ; kao i slično). Rastvorljivi oblici i kratkog i dugačkog oblika IGSF9 takođe mogi da se konstruišu genetskom fuzijom cDNK koje kodiraju ekstracelulame domene molekula cDNK koja kodira Fc domen humanog IgGl (imunoadhezini). Ekstracelularni domeni i kratkog i dugačkog oblika IGSF9 dobijaju se PCR metodologijom korišćenjem gena pune dužine kao matrica. Ovi konstrukti se zatim insertuju u odgovarajuće ekspresione vektore za sisare koji sadrže gensku sekvencu Fc domena IgGl. Kloniranjem se dobijaju fuzioni proizvodi u istom ramu očitavanja IGSF9 ekstracelularnog domena i N - terminala Fc domena IgGl (videti sliku 9 na kojoj su predstavljene sve ove sekvence)
Svi gore navedeni konstrukti su korišćeni za dobijanje stabilno transficiranih ćelijskih linija jajnika kineskog hrčka (CHO). Ukratko, ekspresioni konstrukti su transficirani u DHFR - CHO DG44 ćelije (Urlaub et. al., 1985. Som. Cell. Mol. Gen., 12 : 555 -566) pomoću elektroporacije. Ćelije su isprane, prebrojane i resuspendovane u ledeno hladnom SBS puferu (7 mM NaP04, 1 mM MgCl2.272 mM sukroza, pH 7,4) . Plazmidska DNK je linearizovana pomoću PacI restikcione digestije, pa je 1 ili 0,5 ug/ml DNK pomešano sa 4xIO<6>DG44 ćelija i izvršena je elektroporacija. Ćelije su zasejane na pločama od 96 polja za mikrotitraciju pa su ćelijske linije izabrane putem rezistencije na G418 u CHO S SFM II podlozi (Gibco) uz dodatak hipoksantina i timidina (HT, Gibco). Polja ploča u kojima je izvršena transfekcija sa najmanjom koncentracijom DNK i koja su pokazala brz ćelijski rast ispitivana su na ekspresiju surogat markera pomoću ELISA (B7Ig u slučaju konstrukata pune dužine i CTLA4Ig u slučaju konstrukata imunoadhezina). Imunoadhezinske ćelijske linije sa najvećom proizvodnjom su ekspandirane u kulturama uz konstantno mešanje, a molekuli imunoadhezina su prečišćeni iz supernatanta kulture pomoću afinitetne hromatografije sa proteinom A, nakon čega su korišćeni imunogeni za proizvodnju mišjih monoklonskih antitela.
Slika 10 prikazuje SDS - PAGE analizu prečišćenih imunoadhezina. Materijal je prečišćen iz 10 litara supernatanta kulture. Proteini su vizualizovani bojenjem coomassie blue. Izražena traka predviđene molekulske mase primećena je samo kod dugačkog oblika IGSF9 (traka 2) . Kratki oblik (traka 1) je dao izgled višestrukih proizvoda degradacije. Podaci sa slike 10 ukazuju da rekombinantni molekuli IGSF9 mogu uspešno da se eksprimiraju u visokim nivoima u ćelijama sisara.
Ćelijske linije koje eksprimiraju najveće nivoe konstrukata IGSF9 pune dužine amplifikovane su u 5 nM metotreksatu (MTX), a nakon toga u 50 nM MTX. Ukratko, ćelije su zasejane sa gustinom u opsegu od 1,5 ćelija po ploči do 3000 ćelija po ploči u dvostrukim inkrementima i kultivisane su u podlozi koja sadrži 5 nM MTX ili 50 nM MTX tokom dve nedelje. Ćelije koje su preživele su ispitivane na ekspresiju surogat markera pomoću ELISA, a klonovi sa najvećim stepenom proizvodnje su ekspandirani u kulturama uz konstantno mešanje. Ekspresija IGSF9 u dobijenim ćelijskim linijama je potvrđena pomoću RT - PCR ili Northern blott analize. Rezultati Northern blott analizesu prikazani na slici 11. Tokom ove analize, ukupna RNK je eksrahovana iz 1 x 10 ćelija
korišćenjem Qiagen-ovog RNeasv Maxi kompleta uz poštovanje protokola koji je obezbedio proizvođač. iRNK je izolovana upotrebom Qiagen-ovog 01igotex mRNK Direct Midi/Maxi kompleta praćenjem predloženog protokola za masovnu proizvodnju. Ukupno 3 u.g iRNK je izdvojeno na 1% agaroza gelu koji sadrži 3% formaldehida i urađena je blott analiza prema standardnim protokolima. Nukleotidne probe specifične za ekstracelularni region IGSF9, zajedno sa probom na GAPDH kontrolu su obeležene sa dioksigeninom (DIG) pomoću PCR korišćenjem nukleotidne smeše obeležene sa DIG prema uputstvima proizvođača (Roche). Smeša je hibridizovana na temperaturi od 50 °C u DIG Easy Hyb rastvoru (Roche) upotrebom IGSF9 proba u jednakim koncentracijama do ukupno 50 ng/ml i sa koncentracijom GAPDH probe od 15 ng /ml. Smeša je isprana i izvršena je detekcija korišćenjem ispiranja sa DIG i sistema za detekciju blokiranjem prema uputstvima proizvođača (Roche). Film je nakon toga eksponiran smeši tokom otprilike 16 časova, jedan od glavnih proizvoda očekivane veličine može se videti na slici 11 u trakama 2 - 5, kao što je prikazano. Pojava drugog, većeg transkripta je verovatno posledica neprekinute transkripcije. Podaci koji su predstavljeni na ovoj slici potvrđuju da rekombinantni IGSF9 molekuli jesu eksprimirani u detektibilnim nivoima u ćelijama sisara.
Primer 4: Proizvodnja anti - IGSF9 monoklonskog antitela 8F3
Monoklonska antitela se dobijaju injektiranjem cDNK konstrukta koji kodira kratki rastvorljivi oblik IGSF9 - Ig u mužjake BALB / c miševa starih 6 -8 nedelja tokom pet puta upotrebom genskog injektora. Nakon toga miševima je injektiran fuzioni protein kratkog oblika IGSF9 i Ig koji je prečišćen iz supernatanta CHO ćelijske linije koja ga stabilno eksprimira (videti prethodni primer) pomoću afinitetne hromatografije sa proteinom A. Miševima je injektiran prečišćeni protein upotrebom tehnike brze imunizacije koja se sastoji od pet setova od dvanaest injekcija tokom perioda od jedanaest dana. Uzorci krvi su uzeti iza miševa tokom 12-og dana, a titar IGSF9 specifičnih antitela je određen pomoću ELISA na pločama od 96 polja koje su obložene sa prečišćenim fuzionim proteinom kratkog oblika IGSF9 i Ig. Tokom 13-og dana, iz miševa koji su imali najveći titar uklonjene su slezine i fuzionisane su sa ćelijama mišjeg mieloma Sp2 / 0 upotrebom standardnih imunoloških tehnika (Kohler, G. and Milstein, C. 1975. Nature 256, p 495). Slika 12 prikazuje rezultate ELISA merenja reaktivnosti IGSF9 u serijskim razblaženjima seruma iz dva miša koji su imunizovani kao što je opisano gore.
Svi hibridomi su inicijalno ispitivani na reaktivnost usmerenu protiv kratkog oblika IGSF9 - Ig pomoću ELISA i svi pozitivni hibridomi su zatim ispitivani na prisustvo irelevantnih Ig fuzionih proteina kako bi se isključila bilo koja mogućnost ukrštene reaktivnosti antitela. Klonovi sa najvećim stepenom proizvodnje su subklonirani pomoću ograničavajućeg razblaženja i na kraju su ekspandirani u reakcionim sudovima uz konstantno mešanje. Antitela su prečišćena iz supernatanta kulture pomoću afinitetne hromatografije sa proteinom A nakon 10 do 12 dana pa je urađeno određivanje izotipa upotrebom ELISA kompleta za mišje imunoglobuline (Pharmingen) prema uputstvima proizvođača. Jedno monoklonsko antitelo, koje je označeno kao 8F3, izabrano je za dalja ispitivanja na osnovu njegovog velikog titra i specifičnosti vezivanja za IGSF9. Primeri 5 i 6 opisuju eksperimente u kojima se koristi ovo antitelo u cilju ispitivanja ekspresije IGSF9 u različitim tkivima od značaja.
Slike 13 i 14 prikazuju rezultate analiza upotrebom protočne citometrije ekspresije kratkog i dugog oblika IGSF9 u stabilnim CHO transfektantima. Podaci na ovim slikama ukazuju da su oba oblika eksprimirana na površini transficiranih ćelija, a povećana MTX amplifikacija transfektanata za kratki oblik dovodi do povećane površinske ekspresije molekula.
Površinska ekspresija IGSF9 na ćelijama tumorskih linija određena protočnom
citometrijom
Endogena površinska ekspresija IGSF9 u ćelijskoj liniji humanog tumora pluća NC-H69 je merena protočnom citometrijom na način koji je opisan ranije, s tim da su ispitivane višestruke koncentracije primarnog antitela 8F3. Rezultati ovog eksperimenta su prikazani na Slici 15. Ovaj eksperiment pokazuje da se endogeno eksprimirani IGSF9 nalazi na površini ćelija ćelijske linije humanog tumora pluća.
Ekspresija IGSF9 na ćelijama tumorskih ćelijskih linija određena pomoću
JVestern blott analize
Imunoblot eksperimenti uz upotrebu proteinskih lizata ćelijskih linija humanog tumora koje su ispitivane upotrebom anti-IGSF9 monoklonskog antitela 8F3 su potvrdili da je IGSF9 protein eksprimiran u detektibilnim nivoima u brojnim ćelijskim linijama humanih tumora. Ovi podaci su predstavljeni na Slici 16. Ukupni proteinski lizati su dobijeni direktnom lizom ćelija u SDS puferu za gel uzorke i ponovo su rastvoreni pomoću SDS-PAGE. Koncentracije proteina u lizatima su određene upotrebom DC Protein Assay kompleta (Biorad) prema uputstvima proizvođača. Celijski lizati su ponovo rastvoreni pomoću SDS-PAGE (6% akrilamid gel), prebačeni su na PVDF membranu i imunoblotirani su korišćenjem prečišćanog antićIGSF9 MAt (8F3-10 ug/ml) tokom noči na 4 °C, a potom su inkubirani sa sekundarnim anti-mišijim IgG antitelom koje je konjugovano sa peroksidazom rena (HRP) (BioRad) pri razblaženju od 1 : 1000. Imunoblot je razvijen korišćenjem ECL reagensa (Amersham Pharmacia) prema uputstvima proizvođača.
Ekspresija IGSF9 na površini tumorskih ćelija određena fluorescentnom
mikroskopijom
ZR-75-1 ćelije tumora dojke su uzgajane na pokrovnim pločicama obloženim poli L-lizinom i inkubirane su tokom 16 časova sa anti-IGSF9 monoklonskim antitelom 8F3 (10 (.ig/ml). Ćelije su isprane sa PBS i fiksirane korišćenjem ledeno hladnog metanola. Fiksirane ćelije su blokirane puferom za blokiranje (3% koziji serum, 0,5% BSA u PBS) i inkubirane su tokom 45 minuta na sobnoj temperaturi sa DAPI (0,5 p-g/ml) i sa Alexa488-kozijim anti-mišijim sekundarnim antitelom (Molecular Probes) pri razblaženju od 1 : 2000. Ćelije su isprane sa PBS, nanete su na staklene pločice upotrebom ProLong® Antifade kompleta (Molecular Probes) i ispitane su upotrebom BioRad Radiance 2100 konfokalnog mikroskopskog sistema (objektiv 60 x). Rezultati ovog eksperimenta su prikazani na Slici 17. Slika prikazuje površinsko bojenje ćelija tumora dojke.
Posmatrani zajedno, podaci prikazani na Slikama 13 - 17 pokazuju da monoklonsko antitelo 8F3 pokazuje reaktivnost prema IGSF9 i da služi za potvrdu daje IGSF9 protein na površini ćelija. Ovi podaci takođe potvrđuju hipotezu da IGSF9 može biti pogodna imunoterapijksa meta kod humanih tumora, jer je nađeno daje eksprimiran u značajnim nivoima na površini ćelija ćelijskih linija humanih tumora.
Primer 6: Ekspresija IGSF9 u ksenograftima mišijih tumora
Mišiji tumorski ksenografti su dobijeni na sledeći način: prikupljene su ćelije tumorskih ćelijskih linija NCI-H69 (pluća), ZR-75-1 (dojka), LS174T (debelo crevo) i Ovcar-3 (jajnik) koje su kultivisane uin vitrouslovima, a ćelijski agregati su disocirani propuštanjem ćelijske suspenzije kroz špric sa iglom veličine 22 G. Ćelije su isprane, izbrojane i resuspendovane u PBS.
Ukupno je 2 - 10x10<6>ćelija/100 ul je injektovano subkutano (s.c.) u desni bok obrijanog miša. Tunorske mase su ekscidirane nakon 4 - 8 nedelja rasta. U cilju ponovne pasažein vivo,isečci tumora od 2 mm su ponovo uneti s.c. u bok obrijanog miša i omogućen je tumorski rast tokom još 4-8 nedelja.
Površinska ekspresija IGSF9 na mišijim tumorskim ksenograftima i ćelijskim
linijama merena protočnom citometrijom korišćenjem anti- IGSF9 monoklonskih antitela
U cilju analize protočnom citometrijom, sveži uzorci tumora su iseckani i razgrađeni na 37 °C tokom jednog časa sa rastvorom kolagena koji sadrži 5% BSA i 0,05% NaN3. Žive ćelije su razdvojene od mrtvih ćelija i drugih ostataka putem centrifugiranja sa gradijentom gustine. Ćelije su potom nanete na ploče od 96 polja sa okruglim dnom i obrađene su za postupak protočne citometrije kao što je opisano u Primeru 5. Ćelije koje su uzgajane u kulturi su odlepljene od podloge korišćenjem ne-enzimskog pufera, isprane su, nanete na ploče od 96 polja i obrađene kao što je opisano ranije.
Slika 18 prikazuje reprezentativni FACS eksperiment merenjem ekspresije IGSF9 na NCI-H69 i Ovcar-3 mišijim tumorskim ksenograftima i kultivisanim ćelijama. Podaci sa Slike 18 ukazuju daje IGSF9 eksprimiran na površini ćelija koje su uzgajane u kulturi, kao i na ćelijama koje suin vivopasažirane. a koje su derivirane iz mišijih ksenografta. Ekspresija IGSF9 na površini humanih tumorskih ćelija koje su uzgajanein vivodalje podržava ideju daje IGSF9 pogodna terapijska meta.
IGSF9 signal u mišijim ksenograftima se detektuje pomoću RT- PCR
Ekspresija IGSF9 na uzorcima mišijih ksenografta se meri pomoću RT-PCR korišćenjem humanih prajmera specifičnih za IGSF9 i za GAPDH kao kontrolu. Uzorci ksenografta se dobijaju i ekscidiraju kao što je opisano ranije. Ukupna RNK se izoluje iz 0,25 g uzoraka tkiva korišćenjem Qiagen RNeasv<®>kompleta, tretira se DNKazom i prečišćava korišćenjem Qiagen minElute<®>kolona. cDNK se sintetiše upotrebom oligo-dT prajmera i Invitrogen-ovog Super Script First-Strand Svnthesis sistema. PCR se izvodi . pod standardnim uslovima. PCR prajmeri koji se koriste za amplifikaciju IGSF9 su sledeći:
Rezultati reprezentativnog RT-PCR eksperimenta su prikazani na Slici 19. IGSF9 signal je detektovan u dvein vivopasaže (PO i Pl) tumorskih ćelijskih linija LS174T i NCI-H69, kao i u barem jednoj pasaži (PO) Ovcar-3 ćelija deriviranih iz mišijih ksenografta.
Alternativni oblici obrade IGSF9 su eksprimirani u mišijim ksenograftskim
tumorima
Analiza sekvence PCR proizvoda dobijenih iz mišijih ksenograftskih uzoraka pokazuje da su višestruki oblici IGSF9 eksprimirani u ćelijama deriviranim iz tumora. RT-PCR analiza je izvedena kao što je opisano ranije, korišćenjem prajmera dizajniranih za bočni region IGSF9, pri čemu su PCR prajmeri za kratku i dugu izoformu IGSF9 koje divergiraju u sekvenci:
Proizvodi proizvodi su klonirani shotgun postupkom uz upotrebu pCR-TOPO TA sistema za kloniranje (Invitrogen), a inserti su sekvencionirani korišćenjem ABI automatskog DNK sekvencera. U klonovima izvedenim iz NCI-H69 ksenografta su identifikovane dve nove izoforme, a još jedna dodatna različita izoforma je identifikovana u klonovima izvedenim iz Ovcar-3 ksenografta.
Sve nove izoforme slede AG/GT pravilo isecanja, što sugeriše da su one zaista prave varijante alternativnog isecanja (Breatnach, R. et al., 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75; 4853-7). Prikaz reprezentativnog PCR gel zapisa se može naći na Slici 20, zajedno sa šematskim prikazom eksona IGSF9 koji su zahvaćeni alternativnim isecanjem. Translacija u istom ramu očitavanja svake dobijene nukleotidne sekvence predviđa da će sve nove sekvence proizvesti skraćeni protein kome nedostaje transmembranski domen. Poravnanje konkretnih dobijenih nukleotidnih sekvenci, zajedno sa njihoim predviđenim proteinskim sekvencama, prikazano je na Slici 21. Parcijalne nukleotidne sekvence su poravnate sa eksonima 5-10 dugačkog oblika IGSF9 .
Podaci o sekvencioniranju koji su ovde prikazani ukazuju da u humanim tumorima mogu postojati višestruke izoforme IGSF9, a mnoge od njih mogu predstavljati potencijalne mete za imunoterapiju.
Primer 7: Ekspresija LIV-1
Slika 2 je prikaz elektronske Norther blott analize koja opisuje profil genske ekspresije ovog gena, što se određuje korišćenjem Gene Logic datasuite. Vrednosti duž y ose predstavljaju intenzitete ekspresije izražene u Gene Logic jedinicama. Svaki plavi kružić na slici predstavlja uorak određenog pacijenta. Histogram na levoj strani slike opisuje procenat svakog tkivnog tipa za koji je nađeno da eksprimira dati genski fragment. Ukupan broj uzoraka za svaki tip tkiva je sledeći: maligni tumor dojke (60); maligni tumor debelog creva (91); maligni tumor pluća (40); maligni tumor jajnika (37); maligni tumor prostate (26); normalno tkivo dojke (30); normalno tkivo debelog creva (30): normalno tkivo jednjaka (17); normalno tkivo bubrega (27); normalno tkivo jetre (19); normalno tkivo pluća (34); normalno tkivo limfnog čvora (9); normalno tkivo jajnika (22); normalno tkivo pankreasa (18); normalno tkivo prostate (21); normalno tkivo rektuma (22); normalno tkivo slezine (9); normalno tkivo želuca (21).
Ekspresija LIV-1 u normalnim i malignim humanim tkivima je dalje ispitivana u toku OCR eksperimenata korišćenjem komercijalno dostupnih panela cDNK i uzoraka cDNK dobijenih u laboratoriji istraživača iz humanih tkiva i ćelijskih linija, kao što je opisano u prethodnom primeru. Rezultati ovih eksperimenata su predstavljeni na Slikama 23 - 25. U eksperimentima su sintetisani i korišćeni sledeći PCR prajmeri:
Sekvenca ovih prajmera je sadržana u delu LIV-1 koji je prisutan u plazmidskoj DNK IMAGE klona br. 4697878/ATCC kataloški br. 6645729, iz koje je korišćen kao pozitivna kontrola u svakom od eskperimenata. Ovi prajmeri amplifikuju PCR proizvod od 360 bp iz bilo koje cDNK matrice koja sadrži gen za LIV-1. Ekspresija GAPDH se određuje u svim eksperimentima kao kontrola za integritet cDNK, kao što je opisano u prethodnom primeru. LIV-1 prajmeri amplifikuju proizvod od 482 bp iz bilo koje cDNK matrice koja kodira gen za GAPDH. U svim slučajevima, takođe su uključene pozitivne i negativne kontrole; pozitivna kontrola je plazmidska DNK iz IMAGE klona 4697878, a negativna kontrola je voda (nema matrice).
Slika 23 prikazuje ekspresiju LIV-1 u normalnim tkivima, koja se određuje Clontech-ovim panelima cDNK iz više humanih tkiva (BD Biosciences, kataloški br. K1420-1 i K1421-1). Gornja slika prikazuje ekspresiju LIV-1, a donja slika prikazuje ekspresiju GAPDH. Uzorci cDNK koji su prisutni u svakoj od traka su sledeći: (1) srce, (2) mozak, (3) placenta, (4) pluća, (5) jetra. (6) skeletni mišić, (7) bubreg, (8) pankreas, (9) negativna kontrola i (10) pozitivna kontrola. Vrhovi strelica označavaju predviđenu veličinu LIV-1 proizvoda PCR. Podaci koji su ovde prikazani ukazuju daje LIV-1 slabo eksprimiran u normalnom tkivu mozga, placente, pluća, jetre i bubrega, a da je eksprimiran u malo većem stepenu u tkivu noralnog pankreasa. Slika 24 prikazuje ekspresiju LIV-1 u uzorcima tumora dojke i u odgovarajućim uzorcima tkiva normalne dojke. Ekspresija u tkivu dojke se određuje upotrebom Clontech-ovog panela poklapajućih parova humane cDNK (BD Biosciences kataloški br. Kl432-1, leva strana slike) i 5 u istraživačkoj laboratoriji pripremljenih poklapajućih uzoraka dobijenih iz Grossmont bolnice, La Mesa, CA (desna strana slike). RNK je izolovana iz svakog uzorka korišćenjem TRIzol reagensa (Invitrogen, kataloški br. 15596026). Iz ukupne RNK je dobijena cDNK upotrebom Gibco BRL sistema za sintezu cDNK (Life Technologies, kataloški br. 18267-021). Gornje trake gelova prikazuju ekspresiju LIV-1; donje trake gelova prikazuju ekspresiju GAPDH. Vrhovi strelica na desnoj strani slike označavaju predviđenu veličinu LIV-1 proizvoda PCR. Uzorci tumora su sledeći: (1 - pacijent A) infiltrirajući duktalni karcinom, (2 - pacijent B) infiltrirajući duktalni karcinom, (3 - pacijent C) tubularni adenokarcinom, (4 - pacijent D) infiltrirajući duktalni karcinom, (5 - pacijent E) infiltrirajući duktalni karcinom, (6 - pacijent A) normalno tkivo, (7 - pacijent B) normalno tkivo, (8 - pacijent C) normalno tkivo, (9 - pacijent D) normalno tkivo, (10 - pacijent E) normalno tkivo, (11) negativna kontrola, (12) pozitivna kontrola, (13 - pacijent G19) invazivni duktalni karcinom visokog gradusa, (14 - pacijent G17) intraduktalni karcinom niskog gradusa, (15 - pacijent X) duktalni adenokarcinom, (16 - pacijent W) mešoviti duktalni i lobularni adenokarcinom, (17 - pacijent T) in situ & invazivni duktalni karcinom visokog gradusa, (18 - pacijent G19) normalno tkivo, (19- pacijent G17) normalno tkivo, (20 - pacijent X) normalno tkivo, (21 - pacijent W) normalno tkivo, (22 - pacijent T) normalno tkivo, (23) negativna kontrola, (24) pozitivna kontrola. Podaci koji su prikazani na ovoj slici ukazuju da je LIV-1 eksprimiran u svih deset analiziranih uzoraka kancera dojke. U četiri od deset uzoraka ekspresija je značajno veća u tumorskom tkivu, nego u odgovarajućim poklapajučim normalnim uzorcima.
Ekspresija LIV-1 u tumorima debelog creva je prikazana na Slici 25. Uzorci tumora debelog creva su dobijeni iz Grossmont bolnice, La Mesa, CA. Ćelijska linija HCT116 adenokarcinoma debelog creva je dobijena iz Američke kolekcije tipskih kultura (ATCC, Rockville, MD). RNK je izolovana iz svakog od uzoraka i ćelijske linije upotrebom Qiagen-ovog RNeasv kompleta (kataloški br. 75162). Iz ukupne RNK je pripremljena cDNK upotrebom Gibco-vog BRL sistema za sintezu cDNK (Life Technologies, kataloški br. 18267-021). Gornja slika prikazuje ekspresiju LIV-1, a donja slika prikazuje ekspresiju GAPDH. Uzorci su sledeći: (1) adenokarcinom gradusa 3, (2) adenokarcinom gradusa 2, (3) adenokarcinom gradusa 1, (4) adenokarcinom gradusa 2, (5) ćelijska linija HCT116 kolorektalnog kancera, (6) pozitivna kontrola i (7) negativna kontrola. Podaci koji su ovde prikazani ukazuju da je LIV-1 eksprimiran u sva četiri ispitivana uzorka tumora debelog creva.
Uzeto zajedno, podaci koji su ovde prikazani ukazuju daje LIV-1 eksprimiran u značajnim nivoima u više uzoraka tumora dojke i debelog creva. Gene Logic podaci ukazuju da je ovaj protein takođe prekomerno eksprimiran u uzorcima tumora prostate. Stoga, LIV-1 mode da predstavlja pankarcinomski antigen i pogodnu metu za terapiju tumora u bilo kojoj od gore navedenih indikacija.
Primer 8: Postupak lečenja kancera
Dobijen je uzorak tkiva od pacijenta sa kancerom ili od pacijenta za koga se sumnja da ima kancer. Ovaj uzorak može biti biopsijki uzorak, uzorak za patologa dobijen nakon uklanjanja tumora iz tkiva ili arhivirani uzorak koji je ranije dobijen od pacijenta. Uzorak se analizira slično postupcima u Primerima 1 - 7.
Na osnovu analize nivoa IGSF9 i/ili LIV-1 u tumorskom uzorku, određuje se režim tretmana korišćenjem prihvatljivih alternativa tretmana koje su poznate stručnjacima. Ovde spadaju, bez ograničenja, postupci koji su ovde opisani, posmatranje, hirurški zahvati, neadjuvantne terapije kao što su zračenje i adjuvantne terapije kao što je terapija tamoksifenom ili citotoksična hemoterapija.
Predmetni pronalazak je potvrdio daje prekomerna ekpsresija IGSF9 ili LIV-1 udružena sa mnogim neoplazmama. Stoga, od značaja je da je predmetni pronalazak pokazao da nivoi ekspresije IGSF9 i LIV-1 predstavljaju informativne prognostičke markere za različite kancere. Nivoi ekspresije IGSF9 ili LIV-1 mogu da se odrede upotrebom antitela, antigen vezujućih fragmenata ili polinukleotida prema predmetnom pronalasku. Poznavanje nivoa ekspresije IGSF9 i LIV-1 u primarnim tumorima u vreme postavljanja dijagnoze i hirurškog uklanjanja tumora tako mogu direktno da utiču na terapijske odluke koje se tiču adjuvantne hormonske teraoije i hemoterapija, kao i na dodatnu terapiju zračenjem.
Kao dodatak uticaju na izbor i korišćenje trenutno dostupnih terapija za kancere, poznavanje nivoa ekspresije IGSF9 i LIV-1 može biti korisno za primenu novih terapija za kancer. Terapije za uspostavljanje normalnih nivoa ekspresije IGSF9 i LIV-1 obuhvataju, bez ograničenja, one koje su opisane ranije.
Primer 9: Postupak za ispitivanje jedinjenja
Faramaceutska industrija je zainteresovana za evaluaciju jedinjenja koja su od koristi za farmaciju, a koja deluju ka agonisti ili antagonisti površinskih ćelijskih receptrora. Potrebno je testirati desetine hiljada jedinjenja godišnje u protokolu ispitivanja na nivou ulaska u dalje faze istraživanja ili u protokolu ispitivanja "visokog fluksa". Jedno ili dva jedinjenja od hiljadu koje se ispituju pokazuje neku aktivnost u testu na nivou ulaza. Ova jedinjenja se zatim biraju za dalji razvoj i ispitivanje. Idealno, protokol ispitivanja treba da bude automatizovan tako da se radi sa dosta jedinjenja odjednom i ne treba da koristi radioizotope ili druga jedinjenja koja su opasna ili za koje postoji problem pri odlaganju. Pristup sa korišćenjem antitela za evaluaciju željene ili neželjene regulacije aktivnosti površinskog receptora pomoću leka obezbežuje navedene prednosti i nudi dodatnu prednost visoke selektivnosti.
Posebno, antitela koja prepoznaju IGSF9 ili LIV-1 mogu da se koriste za ispitivanje lekova u različitim protokolima ispitivanja. Generalno, koriste se dva pristupa. Pristupi koji se zasnivaju na ćelijama ili tkivu koriste indikatorsku ćelijsku liniju ili tkivo koje se izlaže jedinjenjima koja treba da se testiraju. Smatra se da pristup sa korišćenjem ćelija može brzo da eliminiše lek koji poseduje probleme sa rastvorljivošću ili sa propustljivošću membrane. Ispitivanja koja se zasnivaju na proteinima ili enzimima mogu da koriste prečišćene proteine i mogu da identifikuju lekove koji reaguju sa IGSF9 ili LIV-1 i koji utiču na prenos intracelulamog signala.
Za ispitivanje koje se zasniva na upotrebi ćelija i tkiva u cilju identifikacije lekova koji modulišu (npr., stimulišu, blokiraju, inhibiraju ili suprimiraju) ekspresiju IGSF9 ili LIV-1, mogu da se koriste imunohistohemijski i citohemijski postupci određivanja ekspresije IGSF9 ili LIV-1 kako bi se merili efekti pojedinačnih sredstava.
Postupak koji koristi imunohistohemijski prostup koji precizno detektuje nivoe ekspresije IGSF9 ili LIV-1 takođe poseduje prednost da može da se koristi kod eksplantiranih kultura čvrstih tumora i organoidnim kulturama, pa tako omogućava preciznu detekciju lekova koji modulišu ekspresiju IGSF9 ili LIV-1 u okruženju koje je više fiziološko, nego u slučaju korišćenja drugih postupaka. Dalje, predloženi postupak je takođe primenjiv na ispitivanje ili praćenje efekta lekova na ekspresiju IGSF9 ili LIV-1 u tkivima i ćelijama kod eksperimentalnih životinja i ljudiin vivo.Uzorci mogu da se dobiju biopsijom (npr., aspiracijom finom iglom, isecanjem) ili prikupljanjem tkiva u slučaju eksperimentalnih životinja, a potom se podvrgavaju postupcima prema predmetnom pronalasku.
Predviđeni postupak je veoma senzitivan, jer nivoi ekspresije IGSF9 i LIV-1 u principu mogu da se posmatraju na jednoj ćeliji. U cilju praktične upotrebe, potrebno je više ćelija, ali dobre analitičke procene mogu sigurno da se dobiju na uzorku od samo 20
- 100 ćelija.
Izložena specifikacija predmetnog pronalaska, uključujući specifična rešenja i primere, ilustrativne je prirode i ne ograničava obim njegove zaštite ninakoji način. Mogu se izvesti brojne druge varijacije i modifikacije bez odstupanja od duha i obima zaštite predmetnog pronalaska. Sve publikacije, patenti i patentne prijave koje su ovde citirani su inkorporirani po referenci u potpunosti u predmetnom opisu.

Claims (43)

1. Izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, naznačeno time što se vezuje ili sa IGSF9 ili sa LIV-1.
2. Izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, naznačeno time što se vezuje sa IGSF9 između aminokiselina 21 do 718 sekvence čiji je ID broj 2, između aminokiselina 21 do 734 sekvence čiji je ID broj 8, čije su aminokiselinske sekvence predstavljene kao sekvence čiji su ID brojevi 22 - 27; ili se vezuje sa LIV-1 između aminokiselina 28 do 317, 373 do 417, 674 do 678 ili 742 do 749 sekvence čiji je ID broj 29.
3. Izolovano antitelo ili antigen vezujući fragment prema zahtevu 2, naznačeno time što navedeno antitelo ili antigen vezujući fragment obuhvata antitelo sa deletiranim domenom.
4. Antitelo sa deletiranim domenom ili njegov antigen vezujući fragment prema zahtevu 3, naznačeno time što dalje obuhvata citotoksično sredstvo.
5. Antitelo sa deletiranim domenom ili njegov antigen vezujući fragment prema zahtevu 4, naznačeno time što je navedeno citotoksično sredstvo radionuklid.
6. Antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema zahtevu 1, naznačeno time što je navedeno antitelo humanizovano.
7. Antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema zahtevu 1, naznačeno time što je navedeno antitelo primatizovano.
8. Antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, naznačeno time što se vezuje sa IGSF9 ili LIV-1, pri čemu navedeno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment inhibira jednu ili više funkcija koje su udružene sa IGSF9 ili LIV-1.
9. Preparat naznačen time što sadrži antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koje se vezuje sa IGSF9 ili LIV-1.
10. Preparat za tretman neoplastičnog poremećaja, naznačen time što obuhvata anti-IGSF9 ili anti-LIV-1 antitelo sa deletiranim domenom ili njegov antigen vezujući fragment koje je kovalentno povezano sa jednim ili sa više bifunkcionalnih helatora.
11. Preparat prema zahtevu 10, naznačen time što je navedeni bifunkcionalni helator izabran iz grupe koju čine MX-DTPA i CHX-DTPA.
12. Postupak tretiranja sisara sa neoplastičnim poremećajem, naznačen time što obuhvata korak primene terapijski efikasne količine antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta koje se vezuje za IGSF9 ili LIV-1.
13. Postupak prema zahtevu 12, naznačen time što dalje obuhvata korak primene terapijski efikasne količine barem jednog hemoterapijskog sredstva kod navedenog sisara; pri čemu navedeno hemoterapijsko sredstvo i navedeno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment mogu da se primene u bilo kom redosledu ili zajedno.
14. Postupak prema zahtevu 12, naznačen time što je navedeno anti-IGSF9 ili anti-LIV-1 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment antitelo sa deletiranim domenom.
15. Postupak prema zahtevu 14, naznačen time što navedenom antitelu sa deletiranim domenom ili njegovom antigen vezujući fragmentu nedostaje CH2 domen.
16. Postupak prema zahtevu 12, naznačen time što je navedeno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment humanizovano.
17. Postupak prema zahtevu 12, naznačen time što je navedeno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment udruženo sa citotoksičnim sredstvom. ;
18. Postupak prema zahtevu 12, naznačen time što se navedeno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment primenjuje u periodu od dve nedelje u odnosu na navedeno hemoterapijsko sredstvo.
19. Vakcina za tretiranje kancera, naznačena time što sadrži IGSF9 ili LIV-1 polipeptid ili njihov fragment i fiziološki prihvatljivi nosilac.
20. Vakcina prema zahtevu 19, naznačena time što navedeni polipeptid sadrži aminokiseline 1 do 1163 ili aminokiseline 21 do 718 IGSF9 čija sekvenca ima ID broj 2; ili aminokiseline 1 do 749, aminokiseline 28 do 317 ili aminokiseline 373 do 417 LIV-1 čija sekvenca ima ID broj 29.
21. Vakcina prema zahtevu 19, naznačena time što navedeni fiziološki prihvatljivi nosilac obuhvata adjuvans ili imunostimulatorno sredstvo.
22. Vakcina prema zahtevu 21, naznačena time što je navedeni adjuvans PROVAX™.
23. Vakcina prema zahtevu 19, naznačena time što je navedeni polipeptid fuzionisan sa T helper peptidom.
24. Postupak indukovanja imunog odgovora kod pacijenta kome je potreban tretman za lečenje ili prevenciju kancera, naznačen time što obuhvata primenu vakcine iz zahteva 19 kod navedenog pacijenta.
25. Postupak za dijagnostikovanje kancera putem detekcije prekomerne ekspresije IGSF9 ili LIV-1 ili nekog njihovog fragmenta, naznačen time što obuhvata: a. obezbeđivanje uzorka od pojedinca kome je potrebno dijagnostikovanje kancera; b. detekciju ekspresije IGSF9 ili LIV-1 ili nekog njihovog fragmenta u navedenom uzorku; c. detekciju ekspresije IGSF9 ili LIV-1 ili nekog njihovog fragmenta u kontrolnom uzorku od normalnog pojedinca ili iz normalnog tkiva pojedinca koji je podvrgnut dijagnostikovanju; i d. upoređivanje nivoa ekspresije IGSF9 ili LIV-1 sa onim koji je dobijen u kontrolnom uzorku, pri čemu navedeno poređenje rezultuje dijagnostikovanjem kancera.
26. Postupak prema zahtevu 25, naznačen time što navedeni fragment IGSF9 sadrži eksone 5-10.
27. Postupak prema zahtevu 25, naznačen time što se navedena prekomerna ekspresija detektuje amlifikacijom nukleinske kiseline ili hibridizacijom.
28. Postupak prema zahtevu 25, naznačen time što se navedena prekomerna ekspresija detektuje korišćenjem antitela za IGSF9 ili LIV-1, ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta.
29. Postupak za određivanje prognoze kod pojedinca koji prima tretman za kancer, naznačen time što obuhvata: a. obezbeđivanje uzorka od navedenog pojedinca kome je potrebna prognoza tretmana za kancer; b. detekciju ekspresije IGSF9 ili LIV-1 ili nekog njihovog fragmenta u navedenom uzorku; c. detekciju ekspresije IGSF9 ili LIV-1 ili nekog njihovog fragmenta u kontrolnom uzorku od normalnog pojedinca ili iz normalnog tkiva pojedinca koji je podvrgnut dijagnostikovanju; i d. upoređivanje nivoa ekspresije IGSF9 ili LIV-1 sa onim koji je dobijen u kontrolnom uzorku, pri čemu navedeno poređenje kao rezultat ima prognozu kancera.
30. Postupak prema zahtevu 29, naznačen time što navedeni fragment IGSF9 obuhvata eksone 5-10.
31. Vakcina, naznačena time što sadrži kao aktivni sastojak anti-idiotipsko antitelo koje imunološki imitira IGSF9 ili LIV-1 antigene ili njihove fragmente.
32. Komplet, naznačen time što sadrži preparat iz zahteva 9 zajedno sa uputstvima za njegovu upotrebu za lečenje ili detekciju kancera.
33. Postupak za tretiranje neoplastičnog poremećaja kod sisara, naznačen time što neoplastične ćelije eksprimiraju IGSF9 ili LIV-1 antigene, koji obuhvata kod navedenog sisara primenu preparata koji sadrži farmaceutski efikasnu količinu antitela za IGSF9 ili LIV-1 ili njegov antigen vezujući fragment.
34. Vakcina, naznačena time što sadrži farmaceutski prihvatljiv nosilac i anti-tumorsku efikasnu količinu imunogenog preparata koji sadrži IGSF9 ili LIV-1 koja idukuje imuni odgovor, pri čemu je navedeni imunogeni preparat sposoban da indukuje anti-tumorski imuni odgovor.
35. Nukleinska kiselina nekodirajućeg lanca do 50 nukleotida u dužini, naznačena time što sadrži barem deo od 8 nukleotida IGSF9 ili LIV-1, koji inhibira ekspresiju IGSF9 ili LIV-1.
36. Nukleinska kiselina prema zahtevu 35, naznačena time što oligonukleotid nekodirajućeg lanca sadrži barem jednu modifikovanu internukleotidnu vezu.
37. Postupak inhibicije ekspresije IGSF9 ili LIV-1 u ćelijama ili tkivima, naznačen time što obuhvata kontaktiranje navedenih ćelija ili tkiva sa nukleinskom kiselinom iz zahteva 34, tako daje ekspresija IGSF9 ili LIV-1 inhibirana.
38. Izolovana nukleinska kiselina, naznačena time što je izabrana iz grupe koju čine: sekvenca čiji je ID broj 3; sekvenca čiji je ID broj 5; sekvenca čiji je ID broj 12; sekvenca čiji je ID broj 13; sekvenca čiji je ID broj 14; sekvenca čiji je ID broj 15; sekvenca čiji je ID broj 16; sekvenca čiji je ID broj 17; sekvenca čiji je ID broj 18; sekvenca čiji je ID broj 19; sekvenca čiji je ID broj 20; i sekvenca čiji je ID broj 21.
39. Vektor, naznačen time što sadrži nukleinsku kiselinu iz zahteva 38.
40. Ćelija domaćin, naznačena time što sadrži nukleinsku kiselinu iz zahteva 38.
41. Izolovani polipeptid, naznačen time što je izabran iz grupe koju čine: sekvenca čiji je ID broj 4; sekvenca čiji je ID broj 6; sekvenca čiji je ID broj 22; sekvenca čiji je ID broj 23; sekvenca čiji je ID broj 24; sekvenca čiji je ID broj 25; sekvenca čiji je ID broj 26; i sekvenca čiji je ID broj 27.
42. Preparat, naznačen time što sadrži polipeptid iz zahteva 41.
43. Vakcina za tretman kancera, naznačena time što sadrži polipeptid iz zahteva 41 i fiziološki prihvatljivi nosilac.
YUP-2005/0577A 2003-01-27 2004-01-27 PREPARATI I POSTUPCI ZA TRETIRANjE KANCERA KORIŠĆENjEM IGSF9 I LIV-1 RS20050577A (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US44253503P 2003-01-27 2003-01-27
PCT/US2004/002044 WO2004066933A2 (en) 2003-01-27 2004-01-27 Compositions and methods for treating cancer using igsf9 and liv-1

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS20050577A true RS20050577A (sr) 2007-09-21

Family

ID=32825236

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YUP-2005/0577A RS20050577A (sr) 2003-01-27 2004-01-27 PREPARATI I POSTUPCI ZA TRETIRANjE KANCERA KORIŠĆENjEM IGSF9 I LIV-1

Country Status (16)

Country Link
US (2) US20040258616A1 (sr)
EP (1) EP1596806A4 (sr)
JP (1) JP2006520194A (sr)
KR (1) KR20050102627A (sr)
CN (1) CN1849337A (sr)
AU (1) AU2004207538A1 (sr)
BR (1) BRPI0407031A (sr)
CA (1) CA2514062A1 (sr)
EA (1) EA200501197A1 (sr)
IS (1) IS7960A (sr)
MX (1) MXPA05007940A (sr)
NO (1) NO20053986L (sr)
PL (1) PL379264A1 (sr)
RS (1) RS20050577A (sr)
WO (1) WO2004066933A2 (sr)
ZA (1) ZA200506671B (sr)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040141983A1 (en) * 1999-03-15 2004-07-22 Protein Design Labs, Inc. Compositions against cancer antigen LIV-1 and uses thereof
WO2004067564A2 (en) 2003-01-29 2004-08-12 Protein Design Labs, Inc. Compositions against cancer antigen liv-1 and uses thereof
US20080070836A1 (en) * 2003-12-26 2008-03-20 Toshio Hirano Emt-Inducing Agents
WO2006014999A2 (en) * 2004-07-27 2006-02-09 Five Prime Therapeutics, Inc. Compositions and methods of use for modulators of nectin 4, semaphorin 4b, igsf9, and kiaa0152 in treating disease
KR20090010194A (ko) * 2006-04-13 2009-01-29 노바티스 백신즈 앤드 다이아그노스틱스, 인크. 암의 치료, 진단 또는 검출 방법
KR20110091423A (ko) * 2010-02-05 2011-08-11 국립암센터 항―ｔｍａｐ／ｃｋａｐ２ 항체를 포함하는 암의 예후 진단용 조성물
PT3156420T (pt) 2010-12-06 2019-05-27 Seattle Genetics Inc Anticorpos humanizados a liv-1 e seu uso para tratar o cancro
EA201891968A1 (ru) 2016-03-15 2019-02-28 Сиэтл Дженетикс, Инк. Комбинированное лечение с использованием liv1-adc и химиотерапевтического средства
KR102755136B1 (ko) * 2017-05-09 2025-01-17 심리스 바이오로직스 게엠베하 변형된 마이크로시스틴 및 노둘라린
CN110563845A (zh) * 2019-09-12 2019-12-13 滨州医学院 抗igsf9抗体、药物组合物及其应用
KR20210122185A (ko) * 2020-03-31 2021-10-08 웰마커바이오 주식회사 Igsf1에 대한 항체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 이를 이용한 암 치료 방법
CN116082503B (zh) * 2022-08-19 2023-08-04 滨州医学院 一种靶向人igsf9的单克隆抗体及其应用
WO2024109944A1 (zh) * 2022-11-25 2024-05-30 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗liv-1抗体、其药物偶联物及其医药用途
CN117379561B (zh) * 2023-10-13 2025-07-22 滨州医学院 一种靶向人igsf9的抗体偶联药物及其制备方法与应用

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4722848A (en) * 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4676980A (en) * 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5567610A (en) * 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
US4831175A (en) * 1986-09-05 1989-05-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Backbone polysubstituted chelates for forming a metal chelate-protein conjugate
US5099069A (en) * 1986-09-05 1992-03-24 Gansow Otto A Backbone polysubstituted chelates for forming a metal chelate-protein conjugate
US5246692A (en) * 1986-09-05 1993-09-21 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services Backbone polysubstituted chelates for forming a metal chelate-protein conjugate
US5892019A (en) * 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
GB8823869D0 (en) * 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) * 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5460785A (en) * 1989-08-09 1995-10-24 Rhomed Incorporated Direct labeling of antibodies and other protein with metal ions
EP1690935A3 (en) * 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) * 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5124471A (en) * 1990-03-26 1992-06-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Bifunctional dtpa-type ligand
US5229275A (en) * 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
GB9015198D0 (en) * 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5545806A (en) * 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2246502T3 (es) * 1990-08-29 2006-02-16 Genpharm International, Inc. Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5756096A (en) * 1991-07-25 1998-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant antibodies for human therapy
IE922437A1 (en) * 1991-07-25 1993-01-27 Idec Pharma Corp Recombinant antibodies for human therapy
US5648267A (en) * 1992-11-13 1997-07-15 Idec Pharmaceuticals Corporation Impaired dominant selectable marker sequence and intronic insertion strategies for enhancement of expression of gene product and expression vector systems comprising same
US5736137A (en) * 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
ATE139900T1 (de) * 1992-11-13 1996-07-15 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörper gegen menschlichen b lymphozyt beschränkter differenzierung antigen für die behandlung von b-zell-lymphoma
CA2149326C (en) * 1992-11-13 2007-04-17 Mitchell E. Reff Fully impaired consensus kozak sequences for mammalian expression
CA2132500A1 (en) * 1994-09-20 1996-03-21 David Lockwood Manning Methods for predicting the behaviour of breast tumours
US5811524A (en) * 1995-06-07 1998-09-22 Idec Pharmaceuticals Corporation Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof
GB9524973D0 (en) * 1995-12-06 1996-02-07 Lynxvale Ltd Viral vectors
MY133346A (en) * 1999-03-01 2007-11-30 Biogen Inc Kit for radiolabeling ligands with yttrium-90
IL150592A0 (en) * 2000-01-25 2003-02-12 Genentech Inc Liv-1 related protein, polynucleotides encoding the same and use thereof for treatment of cancer
WO2002022660A2 (en) * 2000-09-11 2002-03-21 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides

Also Published As

Publication number Publication date
AU2004207538A1 (en) 2004-08-12
ZA200506671B (en) 2006-09-27
BRPI0407031A (pt) 2006-01-17
US20040258616A1 (en) 2004-12-23
JP2006520194A (ja) 2006-09-07
NO20053986L (no) 2005-10-27
EP1596806A2 (en) 2005-11-23
WO2004066933A3 (en) 2006-03-02
PL379264A1 (pl) 2006-08-07
EP1596806A4 (en) 2007-08-29
NO20053986D0 (no) 2005-08-26
KR20050102627A (ko) 2005-10-26
MXPA05007940A (es) 2007-06-14
US20070071674A1 (en) 2007-03-29
WO2004066933A2 (en) 2004-08-12
CN1849337A (zh) 2006-10-18
IS7960A (is) 2005-07-27
CA2514062A1 (en) 2004-08-12
EA200501197A1 (ru) 2006-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5185815B2 (ja) 抗ｃｄ７１モノクローナル抗体および悪性腫瘍細胞を治療するためのその使用
US20040023870A1 (en) Methods of therapy and diagnosis using targeting of cells that express toll-like receptor proteins
US6991901B2 (en) Proteins and nucleic acids encoding same
US20080213171A1 (en) Cancerous disease modifying antibodies
US20050037439A1 (en) Differentially expressed genes involved in cancer, the polypeptides encoded thereby, and methods of using the same
US20150297697A1 (en) Cancer-associated antigen related applications
US7141549B2 (en) Proteins and nucleic acids encoding same
US8697075B2 (en) Cancer specific antibody and cell surface proteins
US20070071674A1 (en) Polynucleotides encoding novel isoforms of IGSF9
JP2009545528A (ja) 癌性疾患修飾抗体
US7361342B2 (en) Cancerous disease modifying antibodies
US20090081209A1 (en) Methods of therapy and diagnosis using targeting of cells that express killer cell immunoglobulin-like receptor-like proteins
WO2003104429A2 (en) Genes overexpressed by ovarian cancer and their use in developing novel therapeutics
TW200922619A (en) Cancerous disease modifying antibodies
JP2009528993A (ja) 癌様疾患修飾性抗体１４１２０５−０２
WO2005079490A2 (en) Methods of therapy and diagnosis using targeting of cells that express steap2 polypeptides
CA2476555A1 (en) Methods of therapy and diagnosis
US20040109863A1 (en) Methods of therapy and diagnosis using targeting of cells that express Ly-9
TW200936757A (en) Cancerous disease modifying antibodies
CA2507156A1 (en) Methods of therapy and diagnosis using targeting of cells that express lax
AU2003213064B2 (en) Methods of therapy and diagnosis
CA2506356A1 (en) Methods of therapy and diagnosis
US20040109862A1 (en) Methods of therapy and diagnosis using targeting of cells that express Ly-9
CN101535470A (zh) 修饰癌性疾病的抗体180706-01
WO2004094607A2 (en) Methods of therapy and diagnosis using targeting of cells that express a human transporter-like protein