RS20050832A

RS20050832A - Beta-karbolini koji su korisni u tretiranju inflamatornih bolesti

Info

Publication number: RS20050832A
Application number: YUP-2005/0832A
Authority: RS
Inventors: Michael Hepperle; Julie Fields Liu; Francois Soucy; Yingchun Ye; Robert Murray; Raman Prakash; Jeremy Little; Alfredo Castro; Hormoz Mazdiyasni; Paul Fleming; Dominic Reynolds
Original assignee: Millennium Pharmaceuticals Inc.,
Priority date: 2003-04-09
Filing date: 2004-04-09
Publication date: 2007-12-31
Also published as: TNSN05257A1; OA13115A; WO2004092167A8; MA27837A1; NO20054598L; EA009121B1; EA200501584A1; BRPI0409263A; ECSP056145A; AU2004230952A1; CR8042A; EP1611134A1; CO5700746A2; CN1802375A; JP2006522824A; KR20060006031A; WO2004092167A1; US20040235839A1; HRP20050926A2; CA2521300A1

Abstract

Ovaj pronalazak obezbedjuje beta-karbolin jedinjenja formule (I) gde je prsten A jedan supstituisani piridinil, pirimidinil, morfolinil, piperidinil, piperazinil, pirolidinil, piranil, tetrahidrofuranil, cikloheksil, ciklopentil ili tiomorfolinil prsten i R1, R2 i R3 su kako je opisano u specifikaciji. Jedinjenja su IKK-2 inhibitori koji su korisni za tretiranje bolesti koje posreduje IKK-2, kao što su inflamatorna jedinjenja i karcinom.

Description

BETA-KARBOLINI KOJI SU KORISNI U TRETIRANJU

INFLAMATORNIH BOLESTI

Ova prijava se poziva na pravo prioriteta US prethodne patentne prijave 60/461468 podnete 9. aprila 2003.

Ovaj pronalazak se odnosi na beta-karbolin jedinjenja, njihove farmaceutske preparate, i postupke upotrebe preparata za tretiranje bolesti. Ova jedinjenja su naročito korisna za tretiranje inflamatornih bolesti i karcinoma.

Faktor (nuklearni) transkripcije NF-kB je član Rel protein familije, i tipičan je heterodimer koji se sastoji od p50 i p65 podjedinice. NF-kB je konstitutivno prisutan u citosolu, i inaktivira se svojim spajanjem sa jednim iz familije IkB inhibitora. Palombella et. al., WO 95/25533, uče da ubihitin-protozoa put igra suštinsku ulogu u regulisanju NF-kB aktivnosti, koja je odgovorna za procesuiranje p105 u p50 i degradaciju inhibitora proteina IkB-a. Chen et. al., Ce//84:853 (1996), uči da pre dergadacije, IkB-a prolazi selektivno fosforilovanje na serin ostacima 32 i 36 od strane multisub-jedinice IkB kinaza kompleksa (IKK). IkB-a se fosforiluje od strane IKK, koji ima dve katalitičke sub-jedinice, IKK-1 (IkB kinaza a ili IKK- a) i IKK-2 (IkB kinaza (3 ili IKK-P). Pošto je fosforilovan, IkB postaje meta ubikvitinacije i degradacije pomoću proteazoma 26S, dozvoljavajući translokaciju NF-kB u nukleus, gde se vezuje na specifične DNK sekvence u promoterima ciljnih gena i stimuliše njihovu transkripciju. Inhibitori IKK mogu blokirati fosforilovanje IKB i njene dalje nizvodne efekte, posebno one koji su povezani sa NF-kB faktorima transkripcije.

Proteinski produkti gena pod regulacionom kontrolom NF-kB su citokini, hemokini, molekuli adhezije ćelija, i proteini koji posreduju rast i kontrolu ćelija. Značajno, mnogi od ovih proinflamatornih proteina takođe su u stanju da deluju, bilo na autokrini ili parakrini način, na dalje stimulisanje NF-kB aktivacije. Dodatno, NF-kB igra ulogu kod rasta normalnih i malignih ćelija. Štaviše, NF-kB je heterodimerni faktor transkripcije koji može aktivirati veliki broj gena koji kodiraju, između ostalog, za proinflamatorne citokine kao što su IL-1, IL-2, TNFa ili IL-6. NF-kB je prisutan u citozolu ćelija, gde gradi kompleks sa svojim prirodno prisutnim inhibitorom IkB. Stimulisanje ćelija, npr. pomoću citokina, dovodi do fosforilovanja i kasnije proteolitičke degradacije IkB. Ova proteolitička degradacja dovodi do aktiviranja NF-kB, koji dalje migrira u nukleus ćelije i aktivira brojne proinflamatorne gene.

Rinehart et al., U.S. Pat. No. 4,631,149 (1986), opisuje beta-karbolin jedinjenja koja su korisna kao antivirusna, antibakterijska, i sredstva protiv tumora.

Ritzeler et al., WO 01/68648, opisuje beta-karbolin jedinjenja, koja imaju inhibitornu aktivnost za IkB kinaze, za upotrebu u tretmanu inflamatornih poremećaja (npr., reumatoidni artritis), osteoartritis, astma, infarkt srca, Alzheimer-ova bolest, karcinomatozni poremećaji (poboljšanje reagovanja na citotoksične terapije) i ateroskleroza.

Bilo bi korisno obezbediti nove IKK inhibitore koji poseduju dobre terapeutske osobine, naročito za tretiranje inflamatornih bolesti.

Ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenja koja su korisna za tretiranje bolesti koje posreduje IKK-2, kao što su inflamatorna jedinjenja i karcinom. Ova jedinjenja se mogu predstaviti formulom I:

gde se Prsten A bira iz grupe koju čine:

(a) piridinil ili pirimidinil prsten koji je supstituisan sa (i) -CH2C(0)-G i 0-1 R6aili (ii) 1-2 R6a, i (b) morfolinil, piperidinil, piperazinil, pirolidinil, piranil, tetrahidrofuranil, cikloheksil, ciklopentil ili tiomorfolinil prsten koji je supstituisan sa (i) -C(R<9>)3, -VV-G, ili -G, (ii) 0-4 R<6b>i (iii) 0-1 okso grupa na ugljeniku iz prstena ili 0-2 okso grupa na sumporu iz prstena ;

svaki R63 se nezavisno bira između C1-6alifatični, halo, C1-6alkoksi, ili amino;

svaki R613 se nezavisno bira između C1-3alifatični ili -N(R<7>)2, i dva R<66>na istom ili susednom ugljeniku opcionalno uzeti zajedno sa uključenim ugljenikom(cima) formira 5-6-člani prsten koji ima 1-2 heteroatoma u prstenu kojise biraju između N, 0 ili S;

Wje -Q-, -Q-C(0)-, -C(R<9>)2-C(R<9>) (R<12>)-, ili -C(R<9>)2-[C(R<9>)(R<12>) ]2-;

Q je -C(R9)2- ili -C(R9)2C(R9)2-;

G je -OH, -NR4R<5>, -N(R<9>)CONR4R<5>, -N(R<9>)S02(C1-3alifatični), - N(R<9>)COCF3, -N(R<9>)CO(Ci-6alifatični), -N(R<9>)CO(heterociklil), -N (R<9>)CO(heteroaril), -N (R<9>)CO(aril), 3-7 člani heterociklil prsten, ili 5-6 člani heteroaril, gde svaki od heteroaril, aril i heterociklil ostataka G je opcionalno supstituisan sa 1-3 R<10>;

R<1>je vodonik, halo, C1-3alifatični, amino, cijano, (C1-3alkil) 1-2 amino, C1-3alkoksi, -CONH2, -NHCOCF3, ili -CH2NH2;

R<2>je vodonik, halo, C1-3alifatični, -CF3;

R<3>je vodonik, halo, C1-6alifatični, C1-6haloalkil, Ci-6alkoksi, hidroksi, amino, cijano, ili (C1-6alkil)i.2amino;

R4 je vodonik, 3-7 člani heterociklil, ili C1-6alifatični;

R<5>je vodonik, C1-6alifatična grupa ili 3-7 člani heterociklični prsten koji ima 1-2 heteroatoma u prstenu koji se biraju između N, O, ili S, gde je R<5>opcionalno supstituisan sa halo, -OR<7>, -CN, -SR<8>, -S(0)2R<8>, -S(0)2N(R<7>)2, -C(0)R<7>, -C02R7 - N(R<7>)2, -C(0)N(R<7>)2, -N(R<7>)C(0)R<7>, -N(R<7>)C02R8, ili -N(R<7>)C(0)N(R<7>)2;

svaki R<7>se nezavisno bira između vodonika ili C1.4alifatični, ili dva R<7>na istom atomu azota uzeti zajedno sa azotom formiraju 5-6 člani heteroaril ili heterociklil prsten;

svaki R<8>se nezavisno bira između C1-4alifatični;

svaki R<9>se nezavisno bira između vodonika ili C1.3alifatični;

svakiR10se nezavisno bira između okso, -R<11>, -T-R<11>, ili -V-T-R<11>;

svaki R<11>se nezavisno bira između Ci^alifatični, halo, -S(0)2N(R<7>)2, -OR<7>, -CN, -SR<8>, -S(0)2R<8>, -C(0)R<7>, -C02R<7>, -N(R<7>)2, -C(0)N(R<7>)2, -N(R<7>)C(0)R<7>, - N(R<7>)C02R<7>, ili -N(R<7>)C(0)N(R<7>)2;

T je ravan ili račvast C-m alkilen lanac;

V je -0-, -N(R<7>)-, -S-, -S(0)-, -S(0)2-, -C(0)-, ili -C02-; i

R<12>je vodonik ili aminokiselinski bočni lanac.

Termin "alifatični" kada se ovde koristi znači ravan lanac, račvast ili ciklični Ci-Ci2ugljovodonik koji je potpuno zasićen ili koji sadrži jednu ili više nezasićenih jedinica ali koji nisu aromatični. Na primer, pogodne alifatične grupe su supstituisane ili nesupstituisane ravne, račvaste ili ciklične alkil, alkenil, alkinil grupe i njihovi hibridi kao što su (cikloalkil)alkil, (cikloalkenil)alkil ili (cikloalkil)alkenil. Termini "alkil", "alkoksi", "hidroksialkil", "alkoksialkil", i "alkoksikarbonil", kada se koriste sami ili kao deo većih ostataka, uključuju oba, ravne i račvaste lance koji sadrže jedan do dvanaest atoma ugljenika. Termini "alkenil" i "alkinil", kada se koriste sami ili kao deo većih ostataka, uključuju oba, ravne i račvaste lance koji sadrže dva do dvanaest atoma ugljenika. termin "cikloalkil, kada se koristi sam ili kao deo većih ostataka, uključuje ciklične C3-C12ugljovodonike koji su potpuno zasićeni ili sadrže jednu ili više nezasićenih jedinica, ali koji nisu aromatični.

Termini "haloalkil", "haloalkenil" i "haloalkoksi", znače alkil, alkenil ili alkoksi, zavisno od slučaja, supstituisan sa jednim ili više halogenih atoma. Termin

"halogen" znači F, Cl, Br, ili I.

Termin "heteroatom" znači azot, kiseonik ili sumpor i uključuje bilo koji oksidacioni oblik azota i sumpora, i kvaternerni oblik bilo kog baznog azota. Takođe termin "azot" uključuje azot u heterocikličnom prstenu koji se može supstituisati. Kao primer, u zasićenom ili delimično nezasićenom prstenu koji ima 0-3 heteroatoma koji se biraju između kiseonika, sumpora ili azota, azot može biti N (kao u 3,4-dihidro-2-pirolil), NH (kao u pirolidinil) ili NR<+>(kao u N-supstituisani pirolidinil).

Termini "karbocikle", "karbociklil", "karbociklo", ili "karbociklični" kada se ovde koristi znači alifatični prstenasti sistem koji ima tri do četrnaest članova. Termini "karbocikle", "karbociklil", "karbociklo", ili "karbociklični" bilo zasićeni ili delimično nezasićeni, takođe se odnosi na prstenove koji su opcionalno supstituisani. Termini "karbocikle", "karbociklil", "karbociklo", ili "karbociklični" takođe uključuju alifatične prstene koji su kondenzovani sa jednim ili više aromatskih ili nearomatskih prstenova, kao što je kod dekahodronaftil ili tetrahidronaftil, gde je radikal, ili tačka vezivanja na slifatičnom prstenu.

Termin "aril" kada se koristi sam ili kao deo većih ostataka kao u "aralkil", "aralkoksi", ili "ariloksialkil", odnosi se na aromatske prstenaste grupe koje imaju od pet do četrnaest članova, kao što su fenil, benzil, fenetil, 1-naftiI, 2-naftil, 1-antracil i 2-antracil. Termin "aril" takođe se odnosi na prstenove koji su opcionalno supstituisani. Termin "aril" se može koristiti koa međusobna zamen sa terminom "aril prsten". "Aril" takođe uključuje kondenzovane policiklične aromatske prstenaste sisteme kod kojih je jedan aromatski prsten kondenzovan sa jednim ili više prstenova. Primeri su 1-naftil, 2-naftil, 1-antracil i 2-antracil. Takođe je uključena u okviru termina "aril", kako se ovde koristi, grupa kod koje je jedan aromatski prsten kondenzovan sa jednim ili više nearomatskih prstenova, koa što su u indanil, fenantridinil, ili tetrahidronaftil, gde je radikal ili tačka vezivanja na aromatskom prstenu.

Termin "heterocikle", "heterociklil", ili "heterociklični" kada se ovde koristi uključuje ne-aromatske prstenaste sisteme koji sadrže pet do četrnaest članova, poželjno pet do deset, kod kojih je jedan ili više atoma u prstenu, poželjno jedan do četiri, svaki zamenjen sa heteroatomom kao što su N, O, ili S. Primeri heterocikličnih prstenova su 3-1 H-benzimidazol-2-on, (1-supstituisan)-2-okso-benzimidazol-3-il, 2-tetrahidrofuranil, 3-tetrahidrofuranil, 2-tetrahidropiranil, 3-tetrahidropiranil, 4-tetrahidropiranil, [1,3]-dioksalanil, [1,3]-ditiolanil, [1,3]-dioksanil, 2-tetrahidrotiofenil, 3-tetrahidrotiofenil, 2-morfolinil, 3-morfolinil, 4-morfolinil, 2-tiomorfolinil, 3-tiomorfolinil, 4-tiomorfolinil, 1-pirolidinil, 2-pirolidinil, 3-pirolidinil, 1-piperazinil, 2-piperazinil, 1-piperidinil, 2-piperidinil, 3-piperidinil, 4-piperidinil, 4-tiazolidinil, diazolonil, N-supstituisan diazolonil, 1-ftalimidinil, benzoksanil, benzopirolidinil, benzopiperidinil, benzoksolanil, benzotiolanil, i benzotianil. Takođe je uključena u okviru termina "heterociklil" ili "heterociklični", kako se ovde koristi, grupa u kojoj je ne-aromatski prsten koji sadrži heteroatom kondenzovan sa jednim ili više aromatskih ili nearomatskih prstenova, kao što su kod indolinil, hromanil, fenantridinil, ili tetrahidrohinolinil, gde je radikal ili tačka vezivanja na nearomatskom prstenu koji sadrži heteroatom. Termin "heterocikle", "heterociklil", ili "heterociklični" bilo zasićeni ili delimično nezasićeni, takođe se odnosi na prstenove koji su opcionalno supstituisani.

Termin "heteroaril", kada se koristi sam ili kao deo većih ostataka kao kod "heteroaralkil" ili "heteroarilalkoksi", odnosi se na heteroaromatske prstenaste grupe koje imaju pet do četrnaest članova. Primeri heteroaril prstenova su 2-furanil, 3-furanil, 3-furazanil, N-imidazolil, 2-imidazolil, 4-imidazolil, 5-imidazolil, 3-izoksazolil, 4-izoksazolil, 5-izoksazolil, 2-oksadiazolil, 5-oksadiazolil, 2-oksazolil, 4-oksazolil, 5-oksazolil, 1-pirolil, 2-pirolil, 3-pirolil, 1-pirazolil, 2-pirazolil, 3-pirazolil, 2-piridil, 3-piridil, 4-piridil, 2-pirimidil, 4-pirimidil, 5-pirimidil, 3-piridazinil, 2-tiazolil, 4-tiazolil, 5-tiazolil, 5-tetrazolil, 2-triazolil, 5-triazolil, 2-tienil, 3-tienil, karbazolil, benzimidazolil, benzotienil, benzofuranil, indolil, hinolinil, benzotriazolil, benzotiazolil, benzooksazolil, benzimidazolil, izohinolinil, indazolil, izoindolil, akridinil, ili benzoizoksazolil. Takođe je uključena u okviru termina "heteroaril", kako se ovde koristi, grupa kod koje je heteroatomni prsten kondenzovan sa jednim ili više aromatskih ili nearomatskih prstenova gde je radikal ili tačka vezivanja na heteroaromatskom prstenu. Primeri uključuju tetrahidrohinolinil, tetrahidroizohinolinil, i pirido[3,4-d]pirimidinil. Termin "heteroaril" takođe se odnosi na prstenove koji su opcionalno supstituisani. Termin "heteroaril" može se međisobno zamenjivati sa terminom "heteroaril prsten" ili terminom "heteroaromatski".

Jedna aril (uključujući aralkil, aralkoksi, ariloksialkil i si.) ili heteroaril (uključujući heteroaralkil i heteroarilalkoksi i si.) grupa može sadržati jedan ili više supstituenata. Primeri pogodnih supstituenata na nezasićenom atomu ugljenika na aril, heteroaril, aralkil, ili heteroaralkil grupi uključuju halogen, -R°, -OR°, -SR°, 1,2-metilen-dioksi, 1,2-etilendioksi, zaštićenu OH (kao što je aciloksi), fenil (Ph), supstituisan Ph, -O(Ph), supstituisan -O(Ph), -CH2(Ph), supstituisan -CH2(Ph), - CH2CH2(Ph), supstituisan -CH2CH2(Ph), -N02, -CN, - N(R°)2, -NR°C(0)R°, - NR°C(0)N(R°)2, -NR°C02R°, -NR°NR<o>C(0)R°, -NR°NR°C(0)N(R°)2, - NR°NR<o>C02R°, -C(0)C(0)R°, -C(0)CH2C(0)R°, -C02R°, -C(0)R°, -C(0)N(R°)2, - OC(0)N(R°)2, -S(0)2R°, -S02N(R°)2, -S(0)R°, -NR°S02N(R°)2, -NR°S02R°, -C (=S)N(R°)2, -C(=NH)-N(R°)2, - (CH2)yNHC(0)R°, - (CH2)yNHC(0)CH(V-R°)(R°); gde se svaki R° nezavisno bira između vodonika, supstituisane ili nesupstituisane alifatične grupe, nesupstituisanog heteroaril ili heterocikličnog prstena, fenila (Ph), supstituisanog Ph, -O(Ph), supstituisanog -O(Ph), -CH2(Ph), ili supstituisanog -CH2(Ph); y je 0-6; i V je vezna grupa. Primeri supstituenata na alifatičnoj grupi ili fenil prstenu R" su amino, alkilamino, dialkilamino, aminokarbonil, halogen, alkil, alkilaminokarbonil, dialkilaminokarbonil, alkilaminokarboniloksi, dialkilaminokarboniloksi, alkoksi, nitro, cijano, karboksi, alkoksikarbonil, alkilkarbonil, hidroksi, haloalkoksi, ili haloalkil.

Aromatična grupa ili nearomatski heterociklični prsten mogu sadržati jedan ili više supstituenata. Primeri pogodnih supstituenata na zasićenom ugljeniku 20 neke alifatične grupe ili na nearomatskom heterocikličnom prstenu su oni navedeni gore za nezasićen atom ugljanika neke aril ili heteroaril grupe i sledeći: =0, =S, =NNHR<*>, =NN(R<*>)2, =N-, =NNHC(0)R<*>, =NNHC02(alkil), =NNHS02(alkil), ili =NR*, gde se svako R<*>nezavisno bira između vodonika, nesupstituisane alifatične grupe ili supstituisane alifatične grupe. Primeri supstituenata na alifatičnoj grupi su amino, alkilamino, dialkilamino, aminokarbonil, halogen, alkil, alkilaminokarbonil, dialkilaminokarbonil, alkilaminokarboniloksi, dialkilaminokarboniloksi, alkoksi, nitro, cijano, karboksi, alkoksikarbonil, alkilkarbonil, hidroksi, haloalkoksi, ili haloalkil.

Pogodni dupstituenti na azotu nekog nearomatskog heterocikličnog prstena su - R<+>, -N(R<+>)2, -C(0)R<+>, -C02R<+>, -C(0)C(0)R<+>, -C(0)CH2C(0)R<+>, -S02R<+>, - S02N(R<+>)2, -C(=S)N(R<+>)2l-C(=NH)-N(R<+>)2, i -NR<+>S02R<+>; gde se svaki R<+>nezavisno bira između vodonika, alifatične grupe, supstituisane alifatičn grupe, fenila (Ph), supstituisanog Ph, -O(Ph), supstituisanog -O(Ph), CH2(Ph), supstituisanog CH2(Ph), ili nesupstituisanog heteroaril ili heterocikličnog prstena. Primeri supstituenata na alifatičnoj grupi ili fenil prstenu su amino, alkilamino, dialkilamino, aminokarbonil, halogen, alkil, alkilaminokarbonil, dialkilaminokarbonil, alkilaminokarboniloksi, dialkilaminokarboniloksi, alkoksi, nitro, cijano, karboksi, alkoksikarbonil, alkilkarbonil, hidroksi, haloalkoksi, ili haloalkil.

Termin "vezna grupa" ili "veznik" podrazumeva organski ostatak koji povezuje dva dela jedinjenja. Veznici se tipično sastoje od atoma kao što su kiseonik ili sumpor, neke jedinice kao što su -NH-, -CH2-, -C(O)-, -C(0)NH-, ili lanca atoma, kao što je neki alkiliden lanac. Molekulska masa veznika je tipično u granicama od oko 14 do 200, poželjno u granicama od 14 do 96 sa dužinom do oko šest atoma. Primeri veznika su zasićeni ili nezasićeni C1-6alkiliden lanac koji je opcionalno supstituisan, i gde su jedan ili dva zasićena ugljenika iz lanca opcionalno zamenjena sa -C(O)-, -C(0)C(0)-, -CONH-, -CONHNH-, -C02-, -

OC(O)-, -NHC02-, -0-, -NHCONH-, -OC(0)NH-, -NHNH-, -NHCO-, -S-, -SO-, -

S02-, -NH-, -S02NH-, ili -NHS02-.

Termin "alkiliden lanac" ili "alkilen lanac" odnosi se na opcionalno supstituisan, ravan ili račvast ugljenični lane koji može biti potpuno zasićen ili može imati jednu ili više nezasićenih jedinica. Opcionalni supstituenti su opisani gore za alifatičnu grupu.

Kombinacija supstituenata ili varijabile su dozvoljene samo ako takva kombinacija kao rezultat daje stabilno ili hemijski izvodljivo jedinjenje. Stabilno ili hemijski izvodljivo jedinjenje je ono kod koga hemijska struktura nije značajno izmenjena kada se drži na temperaturi od 40 °C ili manje, u odsustvu vlage ili drugih hemijski reaktivnih uslova, tokom najmanje nedelju dana.

Ukoliko se ne tvrdi drugačije, smatra se da ovde opisane strukture uključuju sve stereohemijske oblike strukture; tj., R i S konfiguracije za svaki asimetrični centar. Stoga, pojedinačni stereohemijski izomeri kao i enantiomerne i diastereomerne smeše ovih jedinjenja uključene su u okvire ovog pronalaska. Ukoliko se ne tvrdi drugačije, smatra se da ovde opisane strukture takođe uključuju jedinjenja koja se razlikuju samo po prisustvu jednog ili više izotopski obogaćenih atoma. Na primer, u obuhvat ovog pronalaska uključena su jedinjenja koja imaju ove strukture osim što je zamenjen atom vodonika deuterijumom ili tricijumom, ili je zamenjen ugljenik sa 13C- ili 14C-obogaćenim ugljenikom.

U jednoj realizaciji ovog pronalaska, Prsten A se bira između piridinil ili pirimidinil prstena koji je supstituisan sa 1-2 R63 grupa. U ovoj realizaciji, poželjni Prsteni A su 3-piridinil ili 5-pirimidinil prsten, prikazani dole kao jedinjenja formula ll-A i ll-B, respektivno.

Poželjno, R<6a>se bira između halo ili Ci-6 alifatični, kao što su hloro ili metil. Kada je R<6a>alifatična grupa kao što je metil, položaj koji ima prednost za R63 grupu je u položaju 2 piridinil prstena ili položaj 4 pirimidinil prstena, kako je prikazano u ll-C gore. Posebni Prsten A ostaci su 2-metil-3-piridinil i 4-metil-5-pirimidinil. Otkriveno je da jedinjenja formule ll-C gde je R<6a>metil grupa imaju iznenađujuće veći potencijal u biološkom testiranju na inhibiciju IKK od analognih jedinjenja koja imaju nesupstituisan Prsten A piridina, kao što su oni opisani u gore

navedenoj Ritzeler et al. PCT prijavi WO 01/68648.

Poželjne R<1>grupe su male grupe kao što su vodonik, metil, amino i fluoro.

Poželjne R<2>grupe su vodonik i halo. Hloro je poželjna R<2>halo grupa.

Poželjne R<3>grupe su vodonik, halo (naročito hloro) i alkoksi. Primeri pogodnih alkoksi grupa su C1.4alkoksi grupe kao što su metoksi, etoksi, propoksi i ciklopropilmetoksi.

U još jednoj realizaciji, Prsten A se bira između 5-6 članog nearomatskog prstena koji ima 0-2 heteroatoma u prstenu koji se biraju između azota, kiseonika i sumpora. Ova su obično označena kao jedinjenja formule III. Primeri nearomatskih Prsten A grupa su rnorfolinil, piperidinil, piperazinil, pirolidinil, piranil, tetrahidrofuranil, cikloheksil, ciklopentil i tiomorfolinil prsten. Poželjno, takvi nearomatski prstenovi su supstituisani sa (i) -C(R<9>)3ili -W-G, (ii) 0-4 R<6b>.i (iii) 0-1 okso grupa na ugljeniku iz prstena ili 0-2 okso grupa na sumporu iz prstena . Poželjnije, takvi nearomatski prstenovi su supstituisani sa (i) -VV-G, (ii) 0-2 R<6b>i (iii) 0-1 okso grupa na ugljeniku iz prstena ili 0-2 okso grupa na sumporu iz prstena.

Poželjno G je -NR<4>R<5>ili 3-7 člani heterociklil prsten. Poželjnije G je -NR<4>R<5>ili 5-6 člani heterociklil prsten, gde je G supstituisan sa 1-2 R<10>.

Poželjni R<4>je vodonik, 5-6 člani heterociklil prsten, ili C1-6alifatični, poželjnije vodonik ili C1-6 alifatični. R<4>takođe može biti C1-6alkoksi.

Poželjan R<5>je vodonik, 5-6 člani heterociklil prsten, ili Ci^alifatični, poželjnije vodonik ili C1-6alifatični.

Različita jedinjenja formule III gde je Prsten A nearomatski prsten prikazana su u Tabeli 2. Radi preglednosti, supstituenti na ovim jedinjenjima sa nearomatskim Prstenom A, osim u nekim slučajevima oksi grupa, nisu prikazani. Kada je Prsten A nearomatski, 6-člani heterociklični prsten, podesan položaj za - W-G i -C(R<9>)3supstituente na Prstenu A je orto u odnosu na položaj gde je vezan beta-karbolin deo. Na primer, u jedinjenjima lll-A, lll-B, lll-D, lll-H, lll-J i lll-M, pogodan položaj za vezivanje -W-G i -C(R<9>)3je na azotu Prstena A ili na N-1 u slučaju jedinjenja lll-F.

Poželjno, Wje -Q-, -Q-C(0)-, -C(R<9>)2-C(R<9>)(R<12>)-, ili -C(R<9>)2-[C(R9)(R12)]2-gde jeR<9>vodonik. Poželjnije, Wje -Q-, -Q-C(0)-, ili -C(R<9>)2-C(R9)(R1<2>)-. R12 je vodonik, Ci-6alifatični, supstituisan ili nesupstituisan fenil, supstituisan ili nesupstituisan benzil ili aminokiselinski bočni lanac, naročito bočni lanac prirodne aminokiseline. Primeri posebnih prirodnih aminokiselina su alanin, fenilalanin, valin, leucin, izoleucin, serin, tirozin, aspartinska kiselina i glutaminska kiselina.

U jednoj realizaciji, W je Q-C(0)-. U ovoj realizaciji, poželjno Q je -CH2- ili -CH2-CH2-, poželjnije -CH2-.

U još jednoj realizaciji, Prsten A je supstituisan sa 0-2 R6b Poželjna R<6b>grupa je metil. Kada je Prsten A nearomatski 6-člani prsten, jedna realizacija obezbeđuje jedinjenja formule III gde postoje dve metil grupe u položaju para na Prstenu A u odnosu na položaj gde je vezan beta karbolin deo. Jedan primer ove realizacije je jedinjenje gde je Prsten A 6,6-dimetil-morfolinil prsten. Poželjno, takva jedinjenja su dalje supstituisana sa -W-G kako je gore opisano.

Kada je Prsten A morfolinil prsten, otkriveno je da su poželjna jedinjenja koja imaju "S" stereohemiju u položaju 3 morfolin prstena, kako je prikazano dole kod jedinjenja formule (S)-lll-A.

gde n jeste 0-4 iR1,R<2>,R<3>, W, G i R<5b>jesu kako je gore opisano. Po analogiji, očekuje se da je takođe poželjna "S" stereohemija i za druga 6-člana nearomatska Prsten A jedinjenja formule III.

Jedna realizacija se odnosi na jedinjenja formule lll-A ili (S)-lll-A gde je R<1>vodonik, halo, metil ili amino;

R<2>je vodonik, metil ili halo;

R3 je vodonik, halo, alkoksi, ili (Ci-ealifatični)2amino;

Prsten A je supstituisan sa 0-2 R<6b>;

R6bje C1-3 alifatični;

W je -Q-, -Q-C(0)-, -C(R<9>)2-C(R<9>)(R<12>)-, ili -C(R<9>)2-[C(R<9>)(R<12>)]2-;

Q je -C(R<9>)2- ili -C(R<9>)2C(R<9>)2-;

G je -NR4R<5>, -N(R<9>)C(0)NR4R<5>, -N^SO^Ci.aalifatični), -N(R<9>)C(0)CF3, - N(R9)CO(Ci^alifatični), i -N(R<9>)CO(heterociklil), -N(R<9>)CO(heteroaril), - N(R<9>)CO(aril), 5-6 člani heterociklil prsten, ili 5-6 člani heteroaril, gde je svaki od heteroaril, aril i heterociklil ostataka G opcionalno supstituisan sa 1-3 R<10>;

R<4>je vodonik ili Ci^alifatični;

R<5>je vodonik ili Ci-6alifatična grupa koja je opcionalno supstituisana sa halo, -OR<7>, -CN, -SR<8>, -S(0)2R<8>, -S(0)2N(R<7>)2, -C(0)R<7>, -C02R<7>, -N(R<7>)2, - C(0)N(R<7>)2, -N(R<7>)C(0)R<7>, -N(R<7>)C02R<8>, ili -N(R<7>)C(0)N(R<7>)2;

svaki R<7>se nezavisno bira između vodonika ili Ci-4alifatični, ili dva R<7>na istom atomu azota uzeti zajedno sa azotom formiraju 5-6 člani heteroaril ili heterociklil prsten;

svaki R<8>se nezavisno bira između Ci-4alifatični;

R<9>je vodonik;

svaki R<10>se nezavisno bira između okso, R<11>, T-R<11>, ili V-T-R<11>;

svaki R<11>se nezavisno bira između Ci^alifatični, halo, -S(0)2N(R<7>)2, -OR<7>, -CN, -SR<8>,-S(0)2R<8>, -C(0)R7 -C02R<7>, -N(R<7>)2l-C(0)N(R<7>)2, -N(R<7>)C(0)R<7>, - N(R<7>)C02R<7>, ili -N(R<7>)C(0)N(R<7>)2;

T je ravan ili račvast C1-4alkilen lanac;

V je -O-, -N(R<7>)-, -S-, -S(O)-, -S(0)2-, -C(O)-, ili -C02-; i

R<12>je vodonik, Ci^alifatični, supstituisan ili nesupstituisan fenil, ili supstituisan ili nesupstituisan benzil.

Još jedna realizacija se odnosi na jedinjenja formule lll-A ili (S)-lll-A gde:

R<1>je vodonik, metil, fluoro ili amino; R<2>je hloro; R3 je vodonik ili alkoksi; Prsten A je supstituisan sa -W-G i 0-2 R<6b>; R6b je metil; W je -Q-, -Q-C(0)- ili -C(R<9>)2-C(R9)(R1<2>)-; Q je -C(R<9>)2- ili -C(R<9>)2C(R<9>)2-; G je -NR4R<5>, -N(R<9>)C(0)NR4R<5>, -N(R<9>)C(0)CF3, -N(R<9>)CO(Ci.6alifatični), i -N(R<9>)CO(heterociklil) , -N(R<9>)CO(heteroaril) , 5-6 člani heterociklil prsten, ili 5-6 člani heteroaril, gde svaki od heteroaril i heterociklil ostataka G je opcionalno supstituisan sa 1-3 R<10>;

R4 je vodonik ili Ci ^alifatični;

R5 je vodonik ili Ci-ealifatični

•IA

svaki R<7>se nezavisno bira između vodonika ili d-^alifatični, ili dva R<7>na istom atomu azota uzeti zajedno sa azotom čine 5-6 člani heteroaril ili heterociklil prsten;

svaki R<8>se nezavisno bira između Ci-4alifatični;

R<9>je vodonik;

svaki R<10>se nezavisno bira između okso, R<11>, T-R11, ili V-T-R<11>;

svaki R<11>se nezavisno bira između Ci^alifatični, halo, -S(0)2N(R<7>)2, -OR<7>, -CN, -SR<8>, -S(0)2R<8>, -C(0)R<7>, -C02R7, -N(R<7>)2, -C(0)N(R<7>)2, -N(R<7>)C(0)R<7>, - N(R<7>)C02R<7>, ili -N(R<7>)C(0)N(R<7>)2;

T je ravan ili račvast Ci-4alkilen lanac;

V je -O-, -N(R<7>)-, -S-, -S(O)-, -S(0)2-, -C(O)-, ili -C02-; i

R<12>je vodonik, Ci-6alifatični, fenil, ili benzil.

Poželjna jedinjenja formule lll-A su jedinjenja formule (S)-lll-A':

gdeR<1>,R2,R<3>, W i G jesu kako je gore opisano for (S)-lll-A.

Još jednda realizacija se odnosi na jedinjenja formule lll-A-a:

ili njihova farmaceutski prihvatljiva so, gde:

Q je -CH2-, -CH(R<9>)-, ili -C(R<9>)2-;

G je -NR<4>R<5>ili 3-7 člani heterociklil ili heteroaril prsten koji je opcionalno supstituisan sa 1-2 R<10>;

R<1>je vodonik, halo, Ci-3alifatični, amino, cijano, (C1-3alkil)i_2amino, Ci-3alkoksi, (Ci-3alifatični)-C(0)-, (Ci^alifatični)-C02-, ili (d.3alifatični) -C(0)NH-;

R<2>je vodonik, halo, Ci-3alifatični, C1-3alkoksi, C1-3haloalkoksi, ili C1-3haloalkil;

R<3>je vodonik, halo, Ci-ealifatični, Ci-6haloalkil, Ci-6alkoksi, hidroksi, amino, cijano, ili (Ci-6alkil)i_2amino;

R4 je vodonik ili Ci_6alifatični;

R<5>je Ci-ealifatična grupa koa je opcionalno supstituisana sa halo, -OR<7>, - CN, -SR<8>, -S(0)2R<8>, -C(0)R<7>, -C02R<7>, -N(R<7>)2, -C(0)N(R<7>)2, -N(R<7>)C(0)R<7>, - N(R<7>)C02R<8>, ili -N(R<7>)C(0)N(R<7>)2;

Prsten A je supstituisan sa 0-4 R<6b>;

svaki R<6b>se nezavisno bira između Ci^alifatičnih grupa;

svaki R<7>se nezavisno bira između vodonika ili Ci^alifatični, ili dva R<7>na istom atomu azota uzeti zajedno sa azotom formiraju 5-6 člani heteroaril ili heterociklil prsten;

svaki R<8>se nezavisno bira između Ci-4alifatičnih;

svaki R<9>se nezavisno bira između Ci-3alifatični-

svakiR10se nezavisno bira između R<11>, T-R<11>, ili V-T-R<11>;

svaki R<11>se nezavisno bira između Ci_6alifatični, halo, -OR<7>, -CN, -SR<8>, - S(0)2R<8>, -C(0)R<7>, -C02R<7>, -N(R<7>)2, -C(0)N(R<7>)2, -N(R<7>)C(0)R<7>, -N(R<7>)C02R<7>, ili -

N(R<7>)C(0)N(R<7>)2;

T je ravan ili račvast C^alkilen lanac; i

Vje -0-, -N(R<7>)-, -S-, -S(0)-, -S(0)2-, -C(0)-, ili -C02-.

Jedna realizacija se odnosi na jedinjenja formule lll-A-a gde:

Q je -CH2-, ili -CH(R<9>)-;

G je -NR<4>R<5>ili 5-6 člani heterociklil ili heteroaril prsten koji je opcionalno supstituisan sa 1-2 R<10>;

R<1>je vodonik, halo, Ci_2alkil, amino, ili (Ci_2alkil)i.2amino;

R2 je vodonik, halo, Ci-2alifatični, Ci.2alkoksi, ili Ci-2haloalkil;

R3 je vodonik, halo, Ci-2alifatični, Ci-2alkoksi, ili Ci-2haloalkil;

R<4>je vodonik ili Ci-ealifatični;

R<5>je Ci-6alifatična grupa koja je opcionalno supstituisana sa halo, -OR<7>, - CN, -SR<8>, -S(0)2R<8>, -C(0)R<7>, -C02R7, -N(R<7>)2, -C(0)N(R<7>)2, -N(R<7>)C(0)R<7>, - N(R<7>)C02R<8>, ili -N(R<7>)C(0)N(R<7>)2;

Prsten A je supstituisan sa 0-2 R<6b>;

svaki R<6b>se nezavisno bira između Ci-3alifatičnih grupa;

R8 je Ci-4alifatični;

R<9>se nezavisno bira između Ci.3alifatični

svakiR10se nezavisno bira između R<11>, T-R<11>, ili V-T-R<11>;

svaki R<11>se nezavisno bira između Ci^alifatični, halo, -OR<7>, -CN, -SR<8>, - S(0)2R<8>, -C(0)R<7>, -C02R<7>, -N(R<7>)2, -C(0)N(R<7>)2, -N(R<7>)C(0)R<7>, -N(R<7>)C02R<7>, ili - N(R<7>)C(0)N(R<7>)2;

T je ravan ili račvast Ci-4alkilen lanac; i

V je -0-, -N(R<7>)-, -S-, -S(0)-, -S(0)2-, -C(0)-, ili -C02-.

Još jedna realizacija se odnosi na jedinjenja formule lll-A-a gde:

Qje -CH2-, ili -CH(R<9>)-;

G je -NR<4>R<5>ili 5-6 člani heterociklil prsten, koji ima 1-2 heteroatoma u prstenu koji se biraju između kiseonika ili azota, koji je opcionalno supstituisan sa 1-2 R10;

R<1>je vodonik, halo, metil, amino, ili (Ci_2alkil)i-2amino;

R2 je vodonik, halo, Ci-2alifatični, ili Ci-2haloalkil;

R3 je vodonik, halo, ili Ci^alifatični;

R4 je vodonik ili Ci-6alifatični;

R<5>je Ci-6alifatična grupa koja je opcionalno supstituisana sa halo, -OR<7>, - CN, -SR<8>, -S(0)2R<8>, -C(0)R<7>, -C02R<7>, -N(R<7>)2, -C(0)N(R<7>)2, -N(R<7>)C(0)R<7>, - N(R<7>)C02R<8>, ili -N(R<7>)C(0)N(R<7>)2;

Prsten A je supstituisan sa nula ili dva R<6b>;

svaki R<6b>se nezavisno bira između Ci-3alifatičnih grupa;

R8 je Ci-4alifatični;

R<9>se nezavisno bira između Ci-3alifatični;

svaki R<10>se nezavisno bira između R11,T-R11, ili V-T-R<11>;

svaki R11 se nezavisno bira između Ci^alifatični, halo, -OR<7>, -CN, -SR<8>,-S(0)2R<8>, -C(0)R<7>, -C02R<7>, -N(R<7>)2, -C(0)N(R<7>)2, -N(R<7>)C(0)R<7>,-N(R<7>)C02R<7>, ili - N(R<7>)C(0)N(R<7>)2;

T je ravan ili račvast Ci-4alkilen lanac; i

V je -0-, -N(R<7>)-, -S-, -S(0)-, -S(0)2-, -C(0)-, ili -C02-.

Kod poželjnih jedinjenja formule lll-A-a, Q je -CH2-; G se bira između opcionalno supstituisanih piperidinil, piperazinil, morfolinil, pirolidinil, ili -NR<4>R<5>;

R4 je vodonik ili Ci-ealifatični; i

R<5>je Ci-6alifatični, 5-6 člani heterociklil, ili Ci-ehidroksialkil. Poželjnija su jedinjenja gde je G nesupstituisan ili supstituisan sa 1 -2 grupa koje se nezavisno biraju iz grupe koju čine: Ci-3alkil, HO-alkil, alkoksikarbonil, mono- ili dialkilaminokarbonil, i H02C-alkil. Za jedinjenja formule lll-A-a u svakoj od gornjih realizacija, poželjna je( S)stereohemija u položaju 3 morfolina.

Još jedna realizacija se odnosi na jedinjenja formule lll-A-aa:

ili njihova farmaceutski prihvatljiva so gde,

Q je -CH2-, ili -CH(R<9>)-;

G je -NR<4>R<5>ili 3-7 člani heterociklil prsten koji je opcionalno supstituisan sa 1-2 R10;

R<1>je vodonik, halo, C1-2 alkil, amino, ili (Ci-2alkil)i.2amino;

R2 je vodonik, halo, Ci-2 alifatični, Ci-2 alkoksi, ili Ci-2haloalkil;

R3je vodonik, halo, Ci-2 alifatični, Ci-2 alkoksi, ili Ci_2 haloalkil;

R<4>je vodonik ili C1-6 alifatični;

R<5>je C1-6alifatična grupa koja je opcionalno supstituisan sa halo, -OR<7>, - CN, -SR<8>, -S(0)2R<8>, -C(0)R<7>, -C02R<7>, -N(R<7>)2, -C(0)N(R<7>)2, -N(R<7>)C(0)R<7>, - N(R<7>)C02R<8>, ili -N(R<7>)C(0)N(R<7>)2;

svaki R<6b>se nezavisno bira između vodonika ili Ci_6 alifatični

svaki R<7>se nezavisno bira između vodonika ili C1-4 alifatični, ili dva R<7>na istom atomu azota uzeti zajedno sa azotom čine 5-6 člani heteroaril ili heterociklil prsten;

R8 je Ci-4alifatični;

R<9>se nezavisno bira između C1-3 alifatični

svaki R<10>se nezavisno bira između R<11>, T-R<11>, ili V-T-R<11>;

svaki R<11>se nezavisno bira između C1-6 alifatični, halo, -OR<7>, -CN, -SR<8>,-S(0)2R<8>, -C(0)R<7>, -C02R<7>, -N(R<7>)2, -C(0)N(R<7>)2, -N(R<7>)C(0)R<7>, -N(R<7>)C02R<7>, ili - N(R<7>)C(0)N(R<7>)2;

T je ravan ili račvast Ci-4alkilen lanac; i

V je -0-, -N(R<7>)-, -S-, -S(0)-, -S(0)2-, -C(0)-, ili -C02-.

Još jedna realizacija se odnosi na jedinjenja formule lll-A-aa gde:

Q je -CH2-;

G je -NR<4>R<5>ili 5-6 člani heterociklil prsten koji je opcionalno supstituisan sa 1-2 R10;

R<1>je vodonik, halo ili metil;

R2je vodonik, halo, C1-2alifatični, C1-2alkoksi, ili Ci-2haloalkil;

R<3>je vodonik;

R<4>je vodonik ili C1-6 alifatični;

svaki R<6b>se nezavisno bira između vodonika ili Ci^alifatični

svaki R<7>se nezavisno bira između vodonika ili Ci ^alifatični, ili dva R<7>na istom atomu azota uzeti zajedno sa azotom čine 5-6 člani heteroaril ili heterociklil prsten;

R8 je C1-4 alifatični

svaki R<10>se nezavisno bira između R<11>, T-R11, ili V-T-R<11>;

svaki R<11>se nezavisno bira između C1-6 alifatični, halo, -OR<7>, -CN, -SR<8>,-S(0)2R<8>, -C(0)R7 -C02R<7>, -N(R<7>)2, -C(0)N(R<7>)2, -N(R<7>)C(0)R<7>, -N(R<7>)C02R<7>, ili - N(R<7>)C(0)N(R<7>)2;

T je ravan ili račvast Ci-4alkilen lanac; i

V je -0-, -N(R<7>)-, -S-, -S(0)-, -S(0)2-, -C(0)-, ili -C02-.

Poželja jedinjenja lll-A-aa su jedinjenja gde:

Q je -CH2-;

G se bira između opcionalno supstituisanog piperidinil, piperazinil, morfolinil, pirolidinil, ili -NR<4>R<5>;

R<1>je vodonik, halo ili metil;

R2 je halo;

R<3>je vodonik;

R4 je vodonik ili Ci-6alifatični;

R5 je C1-6 alkoksi, Ci-6alifatični, ili Ci-6hidroksialkil;

svaki R<6b>se nezavisno bira između vodonika ili Ci-3alifatični. Poželjno, svaki R<6b>je vodonik ili metil. Za jedinjenja formule lll-A-aa u svakoj od gornjih

realizacija, poželjna je (S) stereohemija u položaju tri Prstena A morfolina.

Primeri specifičnih jedinjenja formule I prikazani su dole u Tabelama 3 i 4.

Tabela 4 dole prikazuje specifične primere jedinjenja lll-A-aa.

Table 4. Specifični primeri formula lll- A- a jedinjenja

Na bazi njihovih osobina inhibiranja IkB kinaza i drugih farmakoločkih osobina, poželjna su jedinjenja primeri broj 1-30, 39-62 i 64-106. Poželjnija jedinjenja su primeri br. 1, 2, 7,10, 11, 13, 16, 17, 19-27, 39-62, 64-106.

Jedinjenja ovog pronalaska mogu da se ordiniraju ljudima ili drugim sisarima različitim putevima, uključujući oblike za oralno doziranje i injekcije (intravenozne, intramuskularne, intraperitonealne, subkutane i si.). Brojni drugi oblici doziranja koji sadrže jedinjenja ovog pronalaska lako se mogu formulisati od strane osobe verzirane u stanje tehnike, korišćenjem pogodnih farmaceutskih ekscipijenata (ili nosača) kako je niže definisano.

Primeri farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata (ili nosača) i postupaka proizvodnje različitih preparata mogu se naći u A. Gennaro (ed.), Remington: The Science and Practice of Pharmacv, 20<th>Edition, Lippincott VVilliams & VVilkins, Baltimore, MD (2000), koji je ovde u celini uključen ovim navođenjem. Farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti (ili nosači) su sredstva za ukus, bojena sredstva ili pigmenti farmaceutske čistoće, rastvarači, ko-rastvarači, puferski sistemi, surfaktanti, prezervativi, sredstva za zaslađivanje, sredstva za viskoznost, punioci, sredstva za podmazivanje, sredstva za klizanje, dezintegratori, veziva i smole.

Mogu da se koriste uobičajena sredstva za ukus, kao što su ona koja su opisana u Remington's Pharmaceutical Sciences, 18<th>Ed., Mack Publishing Co., pp. 1288-1300 (1990), koji je ovde u celini uključen ovim navođenjem. Farmaceutski preparati ovog pronalaska u opštem slučaju sadrže od oko 0 do 2% sredstava za ukus.

Takođe mogu da se koriste uobičajena bojena sredstva ili pigmenti, kao što su ona opisana u Handbook of Pharmaceutical Excipients, by the American Pharmaceutical Association & the Pharmaceutical Societv of Great Britain, pp. 81-90 (1986), koji je ovde u celini uključen ovim navođenjem. Farmaceutski preparati ovog pronalaska u opštem slučaju sadrže od oko 0 do 2% bojenih sredstava ili pigmenata.

Farmaceutski preparati ovog pronalaska u opštem slučaju sadrže od oko 0,1 do 99,9% rastvarača. Poželjan rastvarač je voda. Poželjni ko-rastvarači su etanol, glicerin, propilenglikol, polietilenglikol, i si.. Farmaceutski preparati ovog pronalaska mogu sadržati od oko 0 do 50% ko-rastvarača.

Poželjni puferski sistemi su sirćetna, borna, karbonska, fosforna, sucinska, maleinska, vinska, limunska, sirćetna, benzoeva, mlečna, glicerinska, glukonska, glutarinska i glutaminska kiselina i njihove natrijum, kalijum i amonijum soli. Naročito poželjni puferi su fosforna, vinska, limunska i sirćetna kiselina i njihove soli. Farmaceutski preparati ovog pronalaska u opštem slučaju sadrže od oko 0 do 5% pufera.

Poželjni surfaktanti su polioksietilen sorbitan estri masnih kiselina, polioksietilen monoalkil etri, monoestri saharoze i lanolin estri i etri, alkil sulfat soli i natrijum, kalijum i amonijum soli masnih kiselina. Farmaceutski preparati ovog pronalaska u opštem slučaju sadrže od oko 0 do 2% surfaktanata.

Poželjni prezervativi su fenol, alkil estri parahidroksibenzoeve kiseline, o-fenilfenol benzoeve kiseline i njene soli, borna kiselina i njene soli, sorbinska kiselina i njene soli, hlorobutanol, benzil alkohol, timerozal, fenilmerkuri acetat i nitrat, nitromerzol, benzalkonium hlorid, cetilpiridinijum hlorid, metil paraben i propil paraben. Naročito poželjni prezervativi su soli benzoeve kiseline, cetilpiridinijum hlorid, metil paraben i propil paraben. Farmaceutski preparati ovog pronalaska u opštem slučaju sadrže od oko 0 do 2% prezervativa.

Poželjni zaslađivači su saharoza, glukoza, saharin, sorbitol, manitol i aspartam. Naročito poželjni zaslađivači su saharoza i saharin. Farmaceutski preparati ovog pronalaska obično sadrže od oko 0 do 5% zaslađivača.

Poželjna sredstva za viskoznost su metilceluloza, natrijum karboksimetilceluloza, hidroksipropil-metilceluloza, hidroksipropilceluloza, natrijum alginat, karbomer, povidon, akacija, gvar guma, ksantan guma i tragakant. Naročito poželjna sredstva za viskoznost su metilceluloza, karbomer, ksantan guma, gvar guma, povidon, natrijum karboksimetilceluloza, i magnezijum aluminum silikat. Farmaceutski preparati ovog pronalaska u opštem slučaju sadrže od oko 0 do 5% sredstava za viskoznost.

Poželjni punioci su laktoza, manitol, sorbitol, trobazni kalcijum-fosfat, dvobazni kalcijum-fosfat, kompresibilni šećer, škrob, kalcijum sulfat, dekstro i mikrokristalna celuloza. Farmaceutski preparati ovog pronalaska u opštem slučaju sadrže od oko 0 do 75% punioca.

Poželjni lubrikanti/sredstva za klizanje su magnezijum stearat, stearinska kiselina i talk. Farmaceutski preparati ovog pronalaska u opštem slučaju sadrže od oko 0 do 7%, poželjno, oko 1 do 5% lubrikanata/sredstava za klizanje.

Poželjni dezintegratori su škrob, natrijum škrob glikolat, krospovidon i kroskarmeloza natrijum i mikrokristalna celuloza. Farmaceutski preparati ovog pronalaska u opštem slučaju sadrže od oko 0 do 20%, poželjno, oko 4 do 15% dezintegratora.

Poželjna veziva su akacija, tragakant, hidroksipropilceluloza, preželatiniziran škrob, želatin, povidon, hidroksipropilceluloza, hidroksipropilmetilceluloza, metilceluloza, rastvori šećera, kao što su saharoza i sorbitol, i etilceluloza. Farmaceutski preparati ovog pronalaska u opštem slučaju sadrže od oko 0 do 12%, poželjno, oko 1 do 10% veziva.

Dopunsksa sredstva koja su poznata verziranom izrađivaču formulacija mogu se kombinovati sa jedinjenjima ovog pronalaska da bi se kreirali pojedindačni oblici doziranja. Alternativno, dodatna sredstva se mogu posebno ordinirati sisaru kao deo višestrukog oblika doziranja.

Za dobijanje farmaceutskih preparata koji sadrže jedinjenja ovog pronalaska, inertni, farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti ili nosači mogu biti bilo čvrsti ili tečni. Čvrsti oblici doziranja su prahovi, tablete, disperzibilne granule, kapsule, kašete i supozitorije. U opštem slučaju, prahovi i tablete mogu se sastojati od oko 5 do 95 masenih procenata aktivnog sastojka. Pogodni čvrsti nosači su poznati u stanju tehnike, na primer, magnezijum karbonat, magnezijum stearat, talk, šećer i laktoza. Tablete, prahovi, kašete i kapsule se mogu koristiti kao čvrsti oblici doziranja pogodni za oralno ordiniranje. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača i postupci proizvodnje različitih preparata mogu se naći u Remington's Pharmaceutical Sciences, 18"<1>Ed., Mack Publishing Co. (1990).

Tečni oblici preparata su rastvori, suspenzije i emulzije. Uobičajeni tečni oblici preparata uključuju vodu i vodene rastvore propilenglikola za parenteralno injektiranje ili dodavanje zaslađivača sredstava za zamućenje za oralne rastvore, suspenzije i emulzije. Preparati u tečnom obliku mogu takođe uključiti i rastvore za intranazalno ordiniranje.

Aerosol preparati pogodni za inhaliranje su rastvori i čvrste materije u obliku praha, koje se mogu kombinovati sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, kao što je neki inertan komprimovan gas (npr., azot).

Takođe su uključeni čvrsti oblici preparata koji se, kratko vreme pre upotrebe, prevode u tečan preparat za bilo oralno ili parenteralno ordiniranje. Takvi tečni oblici su rastvori, suspenzije i emulzije.

Jedinjenja ovog pronalaska se mogu takođe isporučiti transdermalno. Transdermalni preparati mogu imati oblik krema, losiona, aerosola i emulzija i mogu se nalaziti u transdermalnom povezu matričnog ili rezervoarskog tipa kako je uobičajeno u stanju tehnike za ove potrebe.

Poželjan način ordiniranja jedinjenja ovog pronalaska je oralni. Poželjno, farmaceutski preparat je u jediničnom obliku doziranja. U takvom obliku, preparat je podeljen u pogodno dimenzionisane jedinične doze koje sadrže odgovarajuće količine aktivne komponente, npr., efikasnu količinu da se postigne željena svrha.

Količina aktivnog sastojka (jedinjenja) u jediničnoj dozi praparata može varirati ili se podešavati od oko 0,01 do 4.000 mg, poželjno, od oko 0,01 to 1.000 mg, poželjnije, od oko 0,01 do 500 mg, i još poželjnije, od oko 0,01 do 250 mg, prema određenoj primeni. Tipičan preporučeni dnevni režim doziranja za oralno ordiniranje će obično biti od oko 0,02 do 2.000 mg/dan, u jednoj do četiri podeljene doze. Radi pogodnosti, ukupna dnevna doza može biti podeljena i ordinirana u porcijama tokom dana prema potrebi. Tipično, farmaceutski preparati ovog pronalaska će se ordinirati od oko 1 do 5 puta dnevno, ili alternativno, kao kontinualna infuzija. Takvo ordiniranje se može koristiti kod hronične ili akutne terapije. Količina aktivnog sastojka koji se može kombinovati sa ekscipijentom ili nosačem da bi se proizveo jedinični oblik doziranja variraće u zavisnosti od domaćina koji se tretira i posebnog načina ordiniranja. Tipičan preparat će obično sadržati od oko 5 do 95% aktivnog jedinjenja (mas/mas). Poželjno, takvi preparati će sadržati od oko 20 do 80 mas.% aktivnog jedinjenja.

Farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti ili nosači koji se koriste u sprezi sa jedinjenjima ovog pronalaska koriste se u koncentraciji dovoljnoj za praktičan odnos veličine i doze. Farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti ili nosači, ukupno, mogu činiti od oko 0,1 do 99,9% mas. farmaceutskog preparata ovog pronalaska, poželjno, od oko 20 do 80% mas.

Nakon poboljšanja stanja pacijenta, može se ordinirati doza za održavanje jedinjenja, preparata ili kombinacije ovog pronalaska, ako je primenljivo. Potom, mogu da se smanje doziranje ili učestanost ili oba, u funkciji simptoma, do nivoa na kome se zadržava poboljšano stanje. Kada se simptomi poboljšaju do željenog nivoa, tretman treba prekinuti. Međutim, pacijenti mogu zahtevati isprekidano tretiranje na dugoročnoj osnovi kod bilo kog ponovnog pojavljivanja simptoma bolesti.

Specifično doziranje i režim tretiranja za svakog određenog pacijenta može varirati i zavisiće od različitih faktora, uključujući aktivnost specifičnog jedinjenja koje se koristi, starosti, telesne mase, opšteg zdravstvenog stanja, pola i dijete pacijenta, vremena ordiniranja, brzine ekskrecije, specifične kombinacije lekova, ozbiljnosti i kretanja simptoma koji se tretiraju, dispozicije pacijenta na stanje koje se tretira i procene lekara koji sprovodi lečenje. Određivanje pravilnog režima doziranja za određenu situaciju je u okviru poznavanja stanja tehnike. Količina i frekvencija ordiniranja jedinjenja ovog pronalaska ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli može se regulisati u skladu sa ocenom zaduženog kliničkog lekara, na osnovu gore navedenih faktora. Kako će osoba verzirana u stanje tehnike oceniti, mogu biti potrebne više ili niže doze od onih navedenih gore.

Razume se da otkrivena jedinjenja obezbeđuju efikasan tretman različitih bolesti, simptoma i poremećaja, naročito, onih koji su po prirodi inflamatorni ili imuno-vezani, uključujući prihvatljivo vreme do početka delovanja posle ordiniranja, i prihvatljivo trajanje posle ordiniranja. Pošto hrana, dijeta, prethodna stanja, alkohol i drugi sistemski uslovi mogu produžiti vreme odlaganja početka delovanja otkrivenog leka posle njegovog ordiniranja, razume se da će optimalno doziranje imati kao rezultat efikasno tretiranje lekom u roku i u toku prihvatljive količine vremena.

Otkrivena jedinjenja mogu biti u nesolvatnom ili solvatnom obliku, uključujući i hidratne oblike. U opštem slučaju, solvatni oblici, sa farmaceutski prihvatljivim rastvaračima, kao što su voda, etanol i si., su ekvivalentni nesolvatnim oblicima za namene prema ovom pronalasku.

Otkrivena jedinjenja mogu formirati farmaceutski prihvatljive soli sa organskim i neorganskim kiselinama. Primeri pogodnih kiselina za formiranje soli su hlorovodonična, sumporna, fosforna, sirćetna, limunska, malonska, salicilna, malinska, fumarna, sucinska, askorbinska, maleinska, metansulfonska i druge mineralne i karboksilne kiseline dobro poznate osobama verziranim u stanje tehnike. Soli se dobijaju dovođenjem u kontakt slobodne bazne forme sa dovoljnom količinom željene kiseline da bi se dobila so na uobičajen način. Slobodne bazne forme se mogu regeneristi treiranjem soli sa pogodnim razblaženim vodenim rastvorom baze, kao što je razblažen vodeni rastvor natrijum hidroksida, kalijum karbonata, amonijum ili natrijum bikarbonata. Slobodne bazne forme se mogu delimično razlikovati od njihovih odgovarajućih oblika soli u određenim fizičkim osobinama, kao što su rastvorljivost u polarnim rastvaračima, ali su soli inače ekvivalentne njihovim odgovarajućim slobodnim baznim formama za namene prema ovom pronalasku.

Zahvaljujući njihovim farmakološkim osobinama, jedinjenja prema ovom pronalasku su pogodna za profilaktički tretman i terapiju bolesti, poremećaja i simptoma koji uključuju povećanu aktivnost IkB kinaza. Oni uključuju, na primer, zapaljenje zglobova (npr., reumatoidni artritis (RA), reumatoidni spondilitis, gihtozni artritis, traumatski artritis, rubela artritis, psorijatični artritis, osteoartritis, i druga artritična stanja), akutni sinovitis, tuberkuloza, ateroskleroza, mišićna degeneracija, kaheksija, Reiter-ov sindrom, endotoksemija, sepsa, septički šok, endotoksični šok, gram negativna sepsa, giht, sindrom toksičnog šoka, pulmonarne inflamatorne bolesti (npr., astma, akutni respiratorni distres sindrom, hronično obstruktivno pulmonarno obolenje, silikoza, pulmonarna sarkoidoza, i si.), bolesti resorpcije kosti, reperfuzione ozlede, karcinoze, leukemija, sarkoma, tumori limfnih čvorova, karcinoze kože, limfoma, apoptozis, reakcija kalema protiv domaćina, kalem protiv domaćina obolenje (GVHD), odbacivanje alografa i leproznost.

Pored toga, otkrivena jedinjenja se mogu koristiti u tretiranju imuno-povezanih bolesti, simptoma i poremećaja, na primer, infekcija, kao što su virusne infekcije (npr., HIV, citomegalovirus (CMV), influenca, adenovirus, Herpes grupa virusa, i si.), parazitske infekcije (npr., malarija, kao što je celebralna malarija), i kvasne i gljivične infekcije (npr., gljivični meningitis). Pored toga, otkrivena jedinjenja mogu biti korisna za tretiranje groznice i mialgija uzrokovane infekcijom, sindroma stečene imunodeficijencije (AIDS), kompleksa vezanog za AIDS (ARC), kaheksije kao posledice infekcije ili maligniteta, kaheksije kao posledice AIDS-a ili karcinoma, stvaranja keloidnog i ožiljnog tkiva, pirozis, diabetes, i inflamatorne bolesti utrobe (IBD) (npr., Crohn-ova bolest i ulcerativni kolitis). Jedinjenja ovog pronalaska su takođe korisna u tretiranju bolesti ili povreda mozga kod kojih je uključena prekomerna ekspresija TNF-a, kao što su multipla skleroza (MS), ishemijska povreda mozga, npr. cerebralni infarkt (šlog) i trauma glave. Jedinjenja ovog pronalaska su takođe korisna u tretiranju psorijaza, Alzheimer-ove bolesti, karcinomatoznih poremećaja (poboljšanje reagovanja na citotoksične terapije), infarkta srca, hroničnog obstruktivnog pulmonarnog obolenja (COPD) i akutnog respiratornog distres sindroma (ARDS).

U jednoj realizaciji jedinjenja ovog pronalaska su korisna za tretiranje karcinoma, naročito za tretiranje karcinoma kod kojih je aktivnost IKK nenormalno visoka. Tipovi karcinoma koji se mogu tretirati su limfomi, kao što su difuznih velikih B-ćelija, primarnih mediastinalnih B-ćelije, i "mantle" ćelija; multipli mijelom; osteolitična metastaza kosti; karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata; karcinom prostate; karcinom pankreasa i karcinom ne-malih ćelija. U jednoj realizaciji, ova jedinjenja su korisna za ABC limfom. Za tretiranje karcinoma, ova jedinjenja se mogu koristiti kao jedino sredstvo ili u kombinaciji sa drugim sredstvima za koja se zna da su korisna za tretiranje karcinoma. Primeri takvih drugih sredstava su bortezomib; kapecitibin; gemcitabin; irinotekan; fludarabin; 5-fluorouricil ili 5-fluorouricil/leukovorin; taksani, uključujući, npr., paklitaksel i docetaksel; platinska sredstva, uključujući, npr., cisplatina, karboplatina, i oksaliplatina; antraciklini, uključujući, npr., doksorubicin i lipozomni doksorubicin vezan za polietilen glikol; mitoksantron; deksametazon; vinkristin; etopozid; prednizon; talidomid; Herceptin; temozolomid; i sredstva za alkilovanje kao što su melfalan, hlorambucil, i ciklofosfamid.

Jedinjenja formule (I) su naročito korisna za tretiranje inflamatornih i imuno-povezanih bolesti, poremećaja ili simptoma, a još više, onih inflamatornih kao što su RA, astma, IBD, psorijaza, COPD i MS. Ceni se da su ova jedinjenja korisna za tretiranje bolesti, poremećaja ili simptoma vezanih za aktivnost NF-kB, TNF-a, i drugih enzima na putevima gde je poznato da IKK modulira aktivnost.

Jedinjenja ovog pronalaska su takođe korisna za tretiranje bolesti, simptoma ili poremećaja vezanih za kosti, kod kojih postoji deficit ili deficijencija kosti - bilo kao rezultat smanjenog formiranja nove kosti ili povećanja resorpcije kosti ili kombinacije oba. Specifični primeri uključuju osteoporozu, periodontalnu bolest, osteomielitis, reumatoidni artritis, aseptičko labavljenje zgloba i osteolitičke lezije (tipično vezane za karcinom). Poznato je da je reumatoidni artritis, za koji je karakteristično zapalenje zglobova, takođe povezan i sa destrukcijom hrskavice i kosti. Dalje, postoje izveštaji da IKK inhibitor obezbeđuje inhibiciju gubitka hrskavice i kosti kod murino modela artritisa indukovanog kolagenom. Vidi Mclntvre et al.,Artritis & Rheumatism(2003), 48(9), 2652-2659.

Osteoporoza je široki termin koji se koristi za određeni broj različitih bolesti kod kojih je smanjena koštana masa. One uključuju primarnu osteoporozu (npr., post-menopauze, senilnu osteoporozu i juvenilnu osteoporozu) i sekundarnu osteoporozu. Primeri sekundarne osteoporoze bi bili oni koji su povezani sa hroničnim bolestima (npr., hronična renalna bolest, insuficijencija jetre, poremećena gastrointestinalna apsorpcija, hronična imobilizacija i hronične inflamatorne bolesti, uključujući reumatoidni artritis, osteoartritis, periodontalno obolenje i aseptičko prostetičko labavljenje zgloba), bolestima vezanim za endokrine disfunkcije (npr., diabetes, hipertiroidizam, hiperparatiroidizam, hipogonadizam i hipopituitarizam), simptomi vezani za lekove i supstance (npr., kortikosteroide, heparin, antikonvulzante, alkohol i imunosupresante), i hematološkim poremećajima (npr., metastatične bolesti, mijelom, leukemija, gaucher-ova bolest i anemija). Objavljeno je da je inhibicija bilo direktno IkB ili indirektno NF-kB puta korisna za tretiranje osteoporoze i osteoartritisa. Vidi, na primer, PCT prijave WO 2003104219, WO 2003103658, WO 2003029242, WO 2003065972, i WO 9965495. U skladu sa tim, ovaj pronalazak takođe obezbeđuje postupak za tretiranje ili prevenciju gubitka kosti kod pacijenta kome je potrebno, koji se sastoji u ordiniranju pacijentu jedinjenja ovog pronalaska. Takođe obezbeđen je postupak za generisanje formiranja kosti kod pacijenta koji se sastoji u ordiniranju jedinjenja ovog pronalaska.

Još jedna realizacija ovog pronalaska obezbeđuje postupak inhibiranja aktivacije ekspresije NF-kB zavisnog gena povezane sa inhibiranjem katalitičke aktivnosti IKK i/ili fosforilovanja IkB, koji se sastoji u ordiniranju pacijentu kome je potrebno određene količine jedinjenja prema zahtevu 1 ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvata, ili njegovog farmaceutskog preparata, koja je efikasna da inhibira katalitičku aktivnost i/ili fosforilovanje IkB, i time inhibira aktiviranje ekspresije NF-kB zavisnog gena.

U jednoj realizaciji ovog pronalaska, predviđen je postupak za tretiranje ili prevenciju inflamatornog ili imuno-povezanog fiziolioškog poremećaja, simptoma ili bolesti kod pacijenta kome je takav tratman potreban, koji se sastoji u ordiniranju tom pacijentu određene količine najmanje jednog jedinjenja prema zahtevu 1, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvata, ili njegovog farmaceutskog preparata, koja je efikasna u tretiranju ili prevenciji tog inflamatornog ili imuno-povezanog fiziološkog poremećaja, simptome ili bolesti. Poželjno, to inflamatorno obolenje poremećaj ili simptom je reumatoidni artritis, astma, psorijaza, psorijatični artritis, hronično obstruktivno pulmonarno obolenje (COPD), inflamatorno obolenje utrobe ili multipla skleroza.

Ovaj pronalazak sadrži jedinjenje koje ima formulu (I), postupak za dobijanje otkrivenog jedinjenja, postupak za dobijanje farmaceutskog preparata od najmanje jednog otkrivenog jedinjenja i najmanje jednog farmaceutski prihvatljivog nosača ili ekscipijenta, i postupak za upotrebu jednog ili više otkrivenih jedinjenja radi tretiranja različitih poremećaja, simptoma i bolesti, naročito onih koje su po prirodi inflamatorne ili imuno-povezane. Otkrivena jedinjenja i njihove farmaceutski prihvatljiva so i neutralni praparati mogu se formulisati zajedno sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijentom ili nosačem i dobijeni preparat se takođe može ordiniratiin vivosisarima, kao što su primati, npr. šimpanze, i ljudima (npr. muškarcima i ženama) i životinjama (npr. psima, mačkama, kravama, konjima i si.), da bi se tretirali različiti poremećaji, simptomi i bolesti. Štaviše, ova otkrivena jedinjenja se mogu koristiti za dobijanje medikamenta koji je koristan za tretiranje različitih poremećaja, simptoma i bolesti.

Kako jedno ili više ovih otkrivenih jedinjenja mogu da se koriste u primeni monoterapije za tretiranje poremećaja, boelsti ili simptoma, ona se takođe mogu koristiti i u kombinovanoj terapiji, kod koje se upotreba nekog do otkrivenih jedinjenja ili preparata (terapeutsko sredstvo) se kombinuje sa upotrebom jednog ili više drugih terapeutskih sredstava za tretiranje istog i/ili drugih tipova poremećaja, simptoma ili bolesti. Kombinovana terapija uključuje ordiniranje terapeutskih sredstava paralelno ili sekvencijalno. Alternativno, terapeutska sredstva se mogu kombinovati u jedan preparat koji se ordinira pacijentu.

U jednoj realizaciji jedinjenja ovog pronalaska se koriste u kombinaciji sa drugim terapeutskim sredstvima, kao što su drugi inhibitori IKK, druga sredstva korisna u tretiranju stanja povezanih sa NF-kB i TNF-a, i sredstva korisna za tretiranje drugih poremećaja, simptoma ili bolesti. Naročito, sredstva koja indukuju apoptozu kao što su sredstva koja remete ćelijski ciklus ili mitohondrijalnu funkciju korisna su u kombinaciji sa IKK inhibitorima ovog pronalaska. Primeri sredstava za kombinovanje sa IKK inhibitorima uključuju antiproliferativna sredstva (npr. metotreksat) i sredstva opisana u U.S. Pat. Application Publication No. US2003/0022898, p 14, para. [0173-0174], koja je ovde uključena u celosti. U nekim realizacijama jedinjenje ovog pronalaska se ordinira u sprezi sa terapeutskim sredstvom koje se bira iz grupe koju čine citotoksična sredstva, radioterapijom, i imunoterapijom. Ne-ograničavajući primeri citotoksičnih sredstava pogodnih za upotrebu u kombinaciji sa IKK inhibitorima ovog pronalaska uključuju kapecitibin; gemcitabin; irinotekan; fludarabin; 5-fluorouracil ili 5-fluorouracil/leukovorin; taksane, uključujući npr. paklitaksel i docetaksel; platinska sredstva, uključujući npr. cisplatinu, karboplatinu, i oksaliplatinu; antracikline, ikljičijući npr. doksorubicin i pegilovan lipozomni doksirubicin; mitoksantron; deksametazon; vinkristin; etopozid; prednizon; talidomid; herceptin; temozolomid; i sredstva za alkilovanje kao što su melfalan, hlorambucil i ciklofosfamit. Podrazumeva se da druge kombinacije mogu da se pripreme, a da

se ostane u okviru obuhvata ovog pronalaska.

Još jedan aspekt ovog pronalaska je obezbeđenje kompleta koji se sastoji od posebnih kontejnera u jednom pakovanju, gde se otkrivena farmaceutska jedinjenja, preparati i/ili njihove soli koriste u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačima za tretiranje poremećaja, simptoma ili bolesti gde IkB kinaza igra ulogu.

Jedinjenja ovog pronalaska se mogu dobiti prema postupcima poznatim osobama verzirani u stanje tehnike za analogna jedinjenja, kako je ilustrovano u šemama dole, i pozivajući se na primere preparata prikazane dole.

Šema I gore pokazuje opšti put za dobijanje jedinjenja formule I. Prsten A karboksilne kiseline 1a može se kuplovati sa željenim amino beta-karbolinom 2a da bi se dobilo I. Mnogi la intermedijeri koji su korisni za dobijanje jedinjenja ovog pronalaska su lako dostupni iz polaznih materijala i hemijskih postupaka, naročito u pogledu ovde detaljno opisanih primera sinteze. Šeme ll-IV opisuju puteve za dobijanje različitih p-karbolin intermedijera 2a.

Šema II

Šema II gore prikazuje put za dobijanje beta-karbolin ostatka gde je R<1>vodonik, R<2>je hloro i R3 je alkoksi. lako je u šemi dat primer za slučaj kada je R<3>metoksi, osoba verzirana u stanje tehnike će oceniti da beta-karbolini koji imaju druge R<3>alkoksi grupe mogu da se dobiju zamenom NaOMe u koraku (e) sa drugim natrijum ili metalnim alkoksidima.

Šema III

Koraci: (a) NaHMDS, Mel (b) H2, Raney Nickel, PtO (c) i. TFA ii. CHOC02H iii. HCI (d) Pd/C, ksileni, 160 °C (e) i. NCS, 1N HCI ii. NaN02, TFA iii. H2, Pt

Šema III gore pokazuje put za dobijanje beta-karbolin intermedijera gde je R<1>neki alkil kao što je metil, R<2>je halo koa što je hloro i R<3>je vodonik. Osoba verzirana u stanje tehnike će razumeti kako gornja šema može da se modifikuje da bi se dobile R<1>alkil grupe drugčije od metil ili neka R<2>halo grupa drugačija od hloro.

Šema IV

Koraci: (a) i. LDA, THF, -78C, ii. SnBu3CI (b) 5% Pd(PPh3)2CI2, 10% Cul, DMF, refluks preko noći (c) 3eq NHMDS, THF, rt preko noći (d) i. TFA/NaN03, ii. zasićen NaHC03, iii. 5% Pt(S), NH402CH

Šema IV gore pokazuje put za dobijanje beta-karbolin intermedijera gde je R<1>fluoro, R<2>je hloro i R3 je vodonik. Može se proceniti da jednostavna modifikacija ove šeme dozvoljava dobijanje drugih intermedijera. Na primer, druge R<2>grupe mogu da se uvedu zamenom 4-hloro-2-jodoanilina u koraku b) sa drugim 2-jodoanilinom koji ima drugačiji supstituent od hloro u položaju 4.

Naročito korisni intermedijeri za dobijenje jedinjenja formule lll-A-aa jesu intermedijeri 3a:

gde je R<13>halo, OH, OR<15>, ili zaštitna grupa karboksilne kiseline; R<14>je amino zaštitna grupa, vodonik ili -W-G kako je gore definisano; i R<15>je neki organski radikal. Amino zaštitne grupe su poznate u stanju tehnike. Primeri pogodnih amino zaštitnih grupa uključuju alkoksikarbonil grupe kao što je t-butoksikarbonil (t-BOC) i benzil grupe kao što su benzil i para-metoksibenzil. Karboksilna kiselinska grupa u položaju 3 prstena morfolina može se zaštititi kao bilo koja stabilna estarska grupa kao što je jednostavan alkil ili aril estar kao što su metil, etil, benzil, ili pentafluorofenil estar. U jednoj realizaciji, R<14>je -W-G i R<13>je -OH, halo, ili zaštitna grupa karboksilne kiseline . Različite zaštitne grupe se detaljno opisane u Zaštitna grupa s in Organic Svnthesis, Theodora W. Greene i Peter G.

M. Wuts, 3<rd>edition, 1999, izdanje John Wiley i Sons.

Poželjni enantiomer intermedijera 3a je (S)-3a:

gde suR13i R<14>kako je gor opisano.

Intermedijeri 3a ili (S)-3a, kao karboksilne kiseline ili njihovi aktivirani oblici (kao što je kiseli hlorid), mogu se kuplovati sa odgovarajućim amino-beta-karbolinom kako je prikazano u Šemi I gore. Kada je R<14>neka amino zaštitna grupa , reakcija kuplovanja amida obezbeđuje dalje korisne intermedijere, prikazane dole kao jedinjenja formule IV:

gde je R<14>amino zaštitna grupa iR1,R<2>iR<3>kako je gore opisano. Osoba verzirana u stanje tehnike će oceniti da određena jedinjenja formule lll-A-aa (gde je svaki R<6b>metil) mogu da se dobiju iz jedinjenja formule IV uklanjanjem R<14>zaštitne grupe i zatim priključenjem -W-G dela upotrebom poznatih postupaka. Alternativno, jedinjenja formule lll-A-aa mogu da se dobiju prvio konstruisanjem intermedijera 3a gde R<14>predstavlja -W-G i R<13>je karboksilna kiselina ili njen derivat. Reakcija kuplovanja amida sa odgovarajućim amino-beta-karbolinom zatim obezbeđuje jedinjenja formule lll-A-aa direktno.

Koraci: (a) K2C03, Kl, 3-Bromo-2-metil-propen, MeCN (b) l2)NaHC03, MeCN (c) Bu3SnH, AIBN, toluen, 110°C (d) H2, 20% Pd(OH)2/C, 10% AcOH/MeOH

Šema V gore pokazuje korake za dobijanje intermedijera formule 3a, uključujući nezaštićene i-19. Selektivna zaštita i uklanjanje zaštite mino i karboksilnih kiselinskih grupa u i-19 radi dobijanja različitih 3a intermedijera nalazi se u okviru znanja osobe verzirane u stanje tehnike.

Još neki korisni intermedijeri za dobijanje jedinjenja formule lll-A-aa su jedinjenja formule V, poželjno (S)-V:

gde je R<13>halo ili druga napuštajuća grupa, OH, OR<15>, ili zaštitna grupa karboksilne kiseline , R<15>je jedan organski radikal kao što su Ci^alifatični, aril ili benzil, Prsten A ima 0-2 ili 0-4 R<6b>, i R1,R<2>R3, i R<6b>su kako je gore definisano.

d

Još jedan koristan intermedijer za dobijanje jedinjenja ovog pronalaska je VI, poželjno (S)-VI.

gde jedan od R13iR<13a>jeste OH ili napuštajuća grupa kao što je halo i drugi je OR<15>ili zaštitna grupa karboksilne kiseline , R<15>je jedan organski radikal kao što su C1-6alifatični, aril ili benzil, Prsten A ima 0-2, i R6b je kako je gore definisano.

Primeri sinteze

Sledeće skraćenice su korišćene u postupcima za dobijanje: RT ili rt je sobna temperatura; h, hr ili hrs su sat; min je minut; TFA je trifluorosirćetna kiselina; DMSO je dimetilsulfoksid; NCS je N-hlorosucinamid; EDCI je 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidrohlorid; EtOAc je etilacetat; DIEA je diizopropiletilamin; DCM je dihlorometan; DDQ je dihloro dicijano benzohinon; mCPBA je meta-hlorobenzoeva kiselina; MeOH je metanol; EtOH je etanol; MeCN je acetonitril; TLC je hromatografija tankog sloja; AIBN je azobisizobutironitril; NH4OAC je amonijum acetat; NaOAcje natrijum acetat; Et20 je dietil etar; AcOH je sirćetna kiselina; i DMF je dimetilformamid. TBTU je N, N,N', N'-tetrametil-o-(benzotriazol-1-il)uranijum tetrafluoroborat.

IN TERMEDIJER 1: 7- fluoro- 2, 3, 4, 9- tetrahidro- 1 H- p- karbolin- 1 - karboksilna

kiselina

U 10 g (46,6 mmol) komerijalno dostupnog 6-fluorotriptamin hidrohlorida dodaje se 50 ml_ 1M acetat pufera (pH 4,4) da bi se dobila suspenzija koja se meša na sobnoj temperaturi (RT). U mešanu suspenziju se zatim u jednoj porciji dodaje suspenzija monohidrata glioksilne kiseline u etilacetatu (1,1 eq, 51,28 mmol, 4,72

g). Suspenzija se meša tokom noći (16 h) na RT i čvrsti precipitat se pokupi filtriranjem i opere sa H20 i etilacetatom. Uzorak se zatim osuši pod vakuumom

da bi se dobilo svetio žuta čvrsta materija u kvantitativnom prinosu.

<1>H-NMR (300 MHz, sirćetna kiselina-d4): 5 3,04 (m, 2H), 3,56 (m, 1H), 3,83 (m, 1H) , 6,80 (m, 1H), 7,13 (dd, 1H), 7,34 (dd, 1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,17 min.

MS (M+H<+>): 235,0.

INTERMEDIJER 2: 7- fluoro- 2, 3, 4, 9- tetrahidro- 1H- p- karbolin

7-fluoro-2,3,4,9-tetrahidro-1H-p-karbolin-1-karboksilne kiseline (5 g, 21,36 mmol) se suspenduje u 130 mL 3M HCI u 500 mL boci sa okruglim dnom i drži na refluksu tokom noći (16 h) uz mešanje. Nakon što se ohladi, izdvoji se svetio mrk čvrst precipitat, koji se pokupi filtriranjem i opere se sa H20. Gore dobijena so filtriranjem se zatim rastvori u vrućem metanolu (200 mL) i tretira sa 3M K2CO3(5-10 mL) tako da se dobije pH vrednost oko 9. U ovu smešu se dodaje 100 mL H2O i ona se ostavlja da se meša na RT. Metanol se uparava u rotacionom evaporatoru da bi se dobila bela vodena suspenzija željene slobodne baze, koja se pokupi filtriranjem (3,2 g, 79% prinos).

<1>H-NMR (300 MHz, metanol-d4) : 5 2,73 (t, 2H) , 3,11 (t, 2H) , 3,94 (s, 2H) , 6,73 (m, 1H), 6,94 (m, 1H), 7,30 (dd, 1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1.25 min. MS (M+H+): 191.1.

INTERMEDIJER 3: 7- fluoro- 9H-( 3- karbolin

7-fluoro-2,3,4,9-tetrahidro-1H-B-karbolin (3,5 g, 18,42 mmol) se suspenduje u ksilenu (60 mL) u 250 mL boci sa okruglim dnom opremljenom kondenzatorom koji je otvoren prema atmosferi, i zagreva se. U ovu vruću reakcionu smešu se dodaje Pd/C (10 % mas., 0,2 eq, 700 mg) i smeša se drži na refluksu u ksilenima tokom noći (12-14 h). Rastvor se zatim filtrira kroz Celite jastučić i pokupljen filtrat se zatim uparava u rotirajućem evaporatoru da bi se dobio željeni proizvod u obliku mrke/svetio mrke čvrste materije (3,0 g, 88% prinos).

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) : 5 7,10 (m, 1H) , 7,37 (dd, 1H) , 8,10 (d, 1H) , 8,28 (dd, 1H), 8,35 (dd, 1H), 8,89 (s, 1H), 11,74 (s, 1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1.88 min. MS (M+H+) : 187,1.

INTERMEDIJER 4: 6- hloro- 7- fluoro- 9H-( 3- karbolin

7-fluoro-9H-(3-karbolin (2,15 g, 11,58 mmol) se suspenduje u 100 mL 1M HCI. U ovu smešu se dodaje NCS (1,85 g, 13,89 mmol, 1.2 eq) i dobijena smeša se meša na RT tokom noći. Reakciona smeša se zatim filtrira da bi se dobila svetio žuta čvrsta meterija (2,1 g, 83% prinos).

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 ,7,86 (d, 1H), 8,64 (d, 1H) , 8,79 (d, 1H), 8,91 (d, 1H), 9,33 (s, 1H), 13,05 (s, 1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 2.19 min. MS (M+H+): 221,1.

INTERMEDIJER 5: 6- hloro- 7- fluoro- 8- nitro- 9H-( 5- karbolin

6-hloro-7-fluoro-9H-3-karbolin (2,1 g, 9,54 mmol) se stavi u bocu sa okruglim dnom (250 mL) i dodaje se NaNC03(1,136 g, 13,36 mmol, 1,4 eq). Zatim se u bocu dodaje TFA (48 mL) i dobijena smeša se drži na refluksu tokom noći. TFA se zatim ukloni u rotirajućem evaporatoru. Dobijena gusta suspenzija se suspenduje u vodi (50 mL) i podrobno tretira ultrazvukom. Dobijena suspenzija se zatim filtrira da bi se dobila žuta čvrsta materija (2,0 g, 80% prinos).

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 8,21 (d, 1H), 8,46 (d, 1H), 9,04 (m, 2H), 12,55 (8.1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 2,24 min.

MS (M+H<+>): 266,2.

INTERMEDIJER 6: 6- hlom- 7- metoksi- 8- nitro- 9H- p- karbolin

Metanol (0,462 mL, 11,4 mmol) se dodaje u suspenziju NaH (684 mg, 17,1 mmol) u DMF (10 mL) koja se meša pod atmosferom argona. Dobijeni rastvor se ostavlja da se meša na RT tokom 20 min. 6-hloro-7-fluoro-8-nitro-9H-6-karbolin (500 mg, 1,9 mmol) se dodaje u rastvor koji se meša i dobijena smeša se ostavlja da se meša na RT. Nakon što se doda H2O, istaloži se mrka čvrsta materija koja se filtrira da bi se dobio željeni 6-hloro-7-metoksi-8-nitro-9H-3-karbolin (510 mg, 97% prinos).

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) : 5 4,02 (s, 3H) , 8,52 (d, 1H), 8,60 (d, 1H), 9,05 (s, 1H), 9,12 (s,1H), 12,78 (b, 1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 2,28min.

MS (M+H<+>): 278.

INTERMEDIJER 7: 6- hloro- 7- metoksi- 9H- l3- karbolin- 8- ilamin

6-hloro-7-metoksi-8-nitro-9H-B-karbolin (510 mg, 1,84 mmol) se suspenduje u 50 mL metanola i dodaje se 100 mg Pd/C (10%). Boca se opremi sa balonom vodonika i reakciona smeša se meša preko noći na RT. Nakon filtriranja kroz celite jastučiće i uparavanja metanola, dobija se tamno mrka čvrsta materija. Ostatak se suspenduje u metanolu (15 mL) i dodaje se, uz snažno mešanje, u rastvor zasićenog NaHC03(100 mL). Svetio mrka čvrsta meterija koja se dobije kao precipitat se pokupi filtriranjem i dobro osuši u vakuumu da bi se dobio željeni proizvod (512 mg, kvantitativni prinos).

<1>H-NMR (300 MHz, metanol-d4) : 5,3,90 (s, 3H), 7,63 (s, 1H) , 8,11 (d, 1H), 8,27 (d, 1H), 8,84 (s, 1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,12 min.

MS (M+H<+>): 248.

INTERMEDIJER 8: 6- hloro- 9H-( 3- karbolin- 8- ilamin

Ciljno jedinjenje se dobija prema postupcima opisanim zaINTERMEDIJER 1doINTERMEDIJER 7gde je početni materijal zaINTERMEDIJER 1nesupstituisan triptamin. Alternativna sinteza 6-hloro-9H-B4<arbolin-8-ilamina je opisana na stranici 34, primer 15 PCT Application Publication No. WO 01/68648 Al, i ovde je obuhvaćena u celosti.

POSTUPAK A: Postupak kuplovanja za 6, 7, 8- supstituisane-$- KARBOLINE

6,7,8-supstituisan-9H-S-karbolin (1 mmol), EDCI (1,6 mmol) i odgovarajuća karboksilna kiselina (1,2 mmol) se stave u bocu sa okruglim dnom i suspenduju u piridinu (5 mL). Dobijena smeša se zagreva na 60°C preko noći. Piridin se zatim uklanja u rotacionom evaporatoru i dodaje se 5% rastvor Na2C03. Dobijena čvrsta meterija kao precipitat se pokupi filtriranjem. Prečišćavanjem hromatografijom dobija se željeni proizvod.

POSTUPAK B: Postupak kuplovanja za 6, 8- supstituisane-/ 3- KARBOUNE

6,8-supstituisan-9H-3-karbolin (1,0 mmol), EDCI (1,6 mmol) i karboksilna kiselina

(1,2 mmol) koji treba da se kupluju se stave u bocu sa okruglim dnom i suspenduju u piridinu (5 mL). Dobijena smeša se meša preko noći. Piridin se zatim uklanja u rotacionom evaporatoru i dodaje se 5% rastvor Na2C03. Dobijena čvrsta materija kao precipitat se pokupi filtriranjem. Prečišćavanjem hromatografijom dobija se željeni proizvod.

PRIMER 1: N-( 6- hloro- 7- metoksi- 9H- 3- karbolin- 8- in- 2- metil- nikotinamid

6-hloro-7-metoksi-9H-3-karbolin-8-ilamin (100 mg, 0,4 mmol), EDCI (125 mg, 0,64 mmol) i 2-metil nikotinska kiselina (66 mg, 0,48 mmol) se stave u bocu sa okruglim dnom i suspenduju u piridinu (2 mL). Dobijena smeša se zagreva na 80°C preko noći. Piridin se zatim uklanja u rotacionom evaporatoru i dodaje se 5% rastvor Na2C03Dobijena čvrsta meterija kao precipitat se pokupi filtriranjem. Prečišćavanjem hromatografijom dobija se željeni proizvod u prinosu od 50-70%.<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) : 5 2,71 (s, 3H), 3,89 (s, 3H) , 7,45 (dd, 1H), 8,15 (d, 1H), 8,21 (d, 1H), 8,38 (d, 1H), 8,45 (s, 1H), 8,61 (d, 1H), 8,92 (s, 1H), 10,33 (s, 1H), 11,57 (s, 1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1.77 min. MS(M+H<+>): 367.1.

PRIMER 2: ( 6- hloro- 7- metoksi- 9H- beta- karbolin- 8- il)- amid 4- metil- pirimidin- 5-

karboksilne kiseline

Željeno jedinjenje se dobija prema postupku A iz 6-hloro-7-metoksi-9H-beta-karbolin-8-ilamina i 4-metil-5-pirimidin karboksilne kiseline u prinosu od 80%.<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-ds) : 5 2,75 (s, 3H) , 3,92 (s, 3H) ,(d, 1H) , 8,41 (d, 1H), 8,50 (s, 1H), 8,96 (s, 1H) ,(s, 1H), 9,25 (s, 1H), 10,63 (s, 1H), 11,67 (s,IH). Vreme zadržavanja (LC, postupak: mravlja kiselina standard): 0,95 min.

MS (M+H<+>): 368.

INTERMEDIJER 9: 6- hloro- 7- etoksi- 8- nitro- 9H-( 3- karbolin

Natrijum etoksid (232 mg, 3.4 mmol) se dodaje u rastvor 6-hloro-7-fluoro-8-nitro-9H-8-karbolina (200 mg, 0.76 mmol) u DMSO (4 mL) i reakciona smeša se ostavlja da se meša preko noći. Reakciona smeša se razblaži sa vodom i pH rastvora se podesi na oko 4 dodavanjem 1M HCI. Vodeni rastvor se ekstrahuje

(3X) sa EtOAc. Kombinovani EtOAc slojevi se osuše i upare. Sirov proizvod se prećišćava fleš hromatografijom da bi se dobio željeni proizvod u prinosu od 40-60%.

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 1,44 (t, 3H), 4,24 (q, 2H), 8,21 (d, 1H), 8,46 (d, 1H), 8,91 (s, 1H), 9,02(8, 1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 2.37min. MS (M+H+): 291.9.

INTERMEDIJER 10: 6- hloro- 7- etoksi- 9H-^- karbolin- 8- ilamin

6-hloro-7-etoksi-8-nitro-9H-p-karbolin (160 mg, 0.55 mmol) se suspenduje u 4 mL metanola i dodaje se 25 mg Pd/C (10%). Boca se opremi sa balonom vodonika i reakciona smeša se meša preko noći na RT. Nakon filtriranje kroz celite jastučić i uparavanja metanola, dobija se tamno mrka čvrsta materija i utvrđuje se da je željeni 6-hloro-7-ciklopropilmetoksi-9H-(3-karbolin-8-ilamin (80 mg, 55%).

<1>H-NMR (300 MHz, Metanol-d^CDCb): 6 1,26 (t, 3H), 3,91 (q, 2H), 7,34 (s, 1H), 7,71 (d, 1H), 8,02 (s, 1H),8,56 (s,1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: mravlja kiselina standard): 1.16 min.

MS (M+H<+>): 262.0.

PRIMER 3: N-( 6- hloro- 7- etoksi- 9H- 3- karbolin- 8- il)- 2- metil- nikotinamid

Željeno jedinjenje se dobija prema postupku A iz 6-hloro-7-etoksi-9H-B-karbolin-8-ilamina i 2-metilnikotinske kiseline u prinosu od 40%.

<1>H-NMR (300 MHz, MeOH-d4): 5 1,39 (t, 3H), 2,76 (s, 3H) ,4,14 (q, 2H), 7,43 (dd, 1H), 8,05 (d, 1H), 8,26 (m, 3H), 8,55 (d, 1H), 8,79 (s, 1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,98 min. MS (M+H+): 381,3.

INTERMEDIJER 11: 6- hloro- 7-( NrN)- dimetilamino- 8- nitro- 9H- l3- karbolin

N,N-dimetilamin hidrohlorid (278 mg, 3,4 mmol) se dodaje u rastvor 6-hloro-7-fluoro-8-nitro-9H-B-karbolina (300 mg, 1,13 mmol) u DMSO (8 mL) koji se meša pod atmosferom argona. Nakon toga se dodaje DIEA (0,83 mL, 4,65 mmol) i reakciona smeša se zagreva na 60°C preko noći. Nakon što se reakciona smeša ostavi da se ohladi do RT, dodaje se voda i istaloži se tamno oranž čvrsta meterija. Čvrsta meterija se filtrira, opere sa vodom i osuši da bi se dobio željeni proizvod (230 mg, 70% prinos).

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) : 5 4,06 (s, 6H) , 7,23 (d, 1H), 7,53 (d, 1H), 7,66 (s,1H), 8,05 (s, 1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 2.41 min.

MS (M+H<+>): 290.9.

INTERMEDIJER 12: 6-r?/oro-7-f/V//V;-d/'meWam/no-9H-^-/farbo//n-8-//am/n

6-hloro-7-(N,N)-dimetilamino-8-nitro-9H-B-karbolin (828 mg, 2.86 mmol) se suspenduje u 30 mL metanola i dodaje se 166 mg Pd/C (10%). Boca se opremi sa balonom vodonika i reakciona smeša se meša preko noći na sobnoj temperaturi. Nakon filtriranja kroz celite jastučić i uparavanja metanola, dobija se tamno mrka čvrsta materija i utvrđuje se da je željeni 6-hloro-7-(N,N)-dimetilamino-9H-B-karbolin-8-ilamin (500 mg, 67% prinos).<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-de) : 5 2,80 (s, 6H), 5,42 (s, 2H), 7,45 (s, 1H), 7,95 (d, 1H), 8,23 (d, 1H), 8,86 (d, 1H). Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 2,32 min. MS (M+H+): 261,1.

PRIMER 4: N-( 6- hloro- 7- 7-( N. N)- dimetilamino- 9H- B- karbolin- 8- in- 2- metil-

nikotinamid

Željeno jedinjenje se dobija prema postupkuAiz 6-hloro-7-(N,N)-dimetilamino-9H-B-karbolin-8-ilamina i 2-metilnikotinske kiseline u prinosu od 40-60%.<1>H-NMR (300 MHz, Metanol-dVCDCb): 6 2,82 (s, 3H), 2,94 (s, 6H) , 7,33 (m, 1H), 8,02 (m, 3H), 8,34 (d, 1H), 8,61 (d, 1H), 8, 95 (s, 1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 2,29 min.

MS (M+H<+>): 380,3.

INTERMEDIJER 13: e-rl/o^o-7-('4-me///-p/pe^az/^-^//;-8-n/^^o-PH-/3-/fa^^o//>?

U rastvor 200 mg (0,755 mmol) 6-hloro-7-fluoro-8-nitro-9H-B-karbolina u DMSO (4 mL) špricem se dodaje 1-metilpiperazin (226 mg, 2,26 mmol) i DIEA (400 mg, 3,09 mmol). Reakcija se ostavlja da se meša preko noći na RT. Nakon dodavanja vode, istaloži se oranž čvrsta materija. Čvrsta materija se filtrira, opere i osuši da bi se dobilo 236 mg (91% prinos) željenog 6-hloro-7-(4-metil-piperazin-1-il)-8-

nitro-9H-8-karbolina.

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) : 5 2,24 (s, 3H), 2,48 (m, 4H) , 3,13 (m, 4H), 8,13 (d, 1H), 8,40 (d, 1H), 8,73 (s, 1H), 8, 94 (s, 1H), 12,05 (s, 1H) .

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,72min.

MS (M+H<+>): 346.

INTERMEDIJER 14: 6-r)/o^o-7-('4-me^//-p/pe^az/n-^//j-8-am/no-9H-i8-/fa^oo//^

Suspenduje se 236 mg 6-hloro-7-(4-metil-piperazin-1-il)-8-nitro-9H-p4^arbolina u 100 mL metanola i dodaje se 10% Pd/C (48 mg) u atmosferi argona. Boca se produva vodonikom (3X) i reakciona smeša se meša u atmosferi vodonika na RT preko noći. Reakciona smeša se filtrira i Pd/C se uklanja upotrebom celite jastučića. Reakciona smeša se uparava da bi se uklonio rastvarač i prečišćava fleš hromatografijom da bi se dobilo 119 mg (55% prinos) željenog 6-hloro-7-(4-metil-piperazin-1-il)-8-amino-9H-B4^arbolina.

<1>H-NMR (300 MHz, metanol-d4): 5 2,39 (s, 3H), 2,46 (m, 2H), 2,87 (m, 4H), 3,83 (m, 2H), 7,50 (s, 1H), 7,97 (d, 1H), 8,24 (d, 1H), 8,78 (s, 1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat polar): 1,32min. MS (M+H+): 316.

PRIMER 5: 2- hloro- N- r6- hloro- 7-( 4- metil- piperazin- 1 - il)- 9H- B- karbolin- 8- in-

n i koti nam i d

Željeno jedinjenje se dobija prema postupkuAiz 6-hloro-7-(4-metil-piperazin-1-il)-8-amino-9H-p-karbolina i 2-hloro-nikotinske kiseline u prinosu od 25%.<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) : 5 2,21 (s, 3H) , 2,33 (m, 2H), 2,54(m, 2H), 3,24 (m, 4H), 7,73 (dd, 1H), 8,12 (d, 1H), 8,35 (d, 1H), 8,37 (s, 1H), 8,48 (dd, 1H), 8,61 (dd, 1H), 8,91 (s, 1H), 10,40 (s, 1H) , 11,33 (s, 1H) .

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,46min.

MS (M+H+) : 455.

INTERMEDIJER 15: razdvajanje racemske terbinske kiseline

Terbinska kiselina se rastvori u 10:1 smeši EtOAc-MeOH [10 g terbinske kiseline (17,7 g soli) u 550 mL] i zagreva se na 50-55°C, nakon čega se dodaje (S)-(-)-a-metil-benzilamin. Reakciona smeša se meša tokom 2 minuta i zatim se ostavi na RT tokom 15 minuta. Reakciona smeša se zatim, zaseje sa obogaćenom soli (pripremljena u maloj količini upotrebom 3 ciklusa rekristalizacije), tretira ultrazvukom tokom 10-15 sekundi i ostavi na RT preko noći. Čvrsta materija se odfiltrira, opere sa EtOAc i osuši pod vakuumom. Rekristalizacija se izvede u istoj smeši rastvarača ponovnim rastvaranjem soli (24 mg/mL). Ova smeša se zatim zagreje do blagog refluksa tokom kraćeg vremenskog perioda (nekoliko kristala ostaje u suspenziji). Smeša se ostavi na RT preko noći. Čvrsta materija se obrađuje kako je prethodno opisano.

Enantiomerni višak se grubo utvrđuje upotrebom protonske NMR odgovarajućeg amida dobijenog iz TBTU kuplovanja.

Regeneracija ( R)-(+)- terbinske kiseline:So se rastvori u vodi (320 mg/mL), zagreva do 65°C i dodaje se 1.2 ekvivalent vodenog rastvora 6M HCI. Reakciona smeša se zatim ostavi na 4°C preko noći. Čvrsta materija se odfiltrira, opere sa malim porcijama hladne vode i osuši pod visokim vakuumom (prinos 25-30%).

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) : 5 1,30 (s, 3H) , 1,52 (s, 3H) , 2,74 (dd, 1H), 2,85 (dd, 1H), 3,25 (t, 1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 0,33 min. MS (M+H+): 159,0.

PRIMER 6: ( 6- hloro- 9H- 3- karbo) in- 8- il)- amid 2, 2- dimetil- 5- okso- tetrahidro- furan-3- karboksilne kiseline

Željeno jedinjenje se dobija prema postupkuBiz 6-hloro-9H-3-karbolin-8-ilamina i (R)-terbinske kiseline{ INTERMEDIJER 15)u prinosu od 80-90%.

^-NMR (300 MHz, DMSO-d6) : 5 1,44 (s, 3H), 1,59 (s, 3H) , 2,91 (dd, 1H), 3,08 (dd, 1H), 3,38 (dd, 1H), 7,85 (m, 1H), 8,17 (d, 1H) , 8,25 (d, 1H), 8,39 (d, 1H) , 9,05 (s, 1H), 10,26 (s, 1H), 11,72 (s, 1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,22 min.

MS (M+H<+>): 358,3.

PRIMER 7: ( 6- h! oro- 9H- B- karbolin- 8- il)- amid 1. 2. 2- trimetil- 5- okso- pirolidin- 3-

karboksilne kiseline

Željeno jedinjenje se dobija prema postupku 8 iz 6-hloro-9H-B-karbolin-8-ilamina i 1,2,2-trimetil-5-okso-pirolidin-3-karboksilne kiseline u prinosu od 68%.

<1>H-NMR (DMSO-d6, 300MHz) 5 1,23 (s, 3H), 1,45 (s, 3H), 2,59 (dd, 1H),2,66(S, 3H), 2,70 (dd, 1H), 3,17 (t, 1H), 7,91 (m, 1H), 8,18 (d, 1H), 8,24 (d, 1H), 8,40 (d, 1H), 9,07 (s, 1H), 10,16 (s, 1H), 11,32 (s, 1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,17 min. MS (M+H+): 371,3.

INTERMEDIJER 16: N- benzil- serin benzil estar

U smešu HCI estra L-serin-benzila (2,3 g), benzaldehida (1,05 eq.) i natrijum acetata (1 eq.) u metanolu dodaje se natrijum cijanoborohidrid (1,0 eq.). Dobijena smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 15 h, zatim se podeli na etar i zasićen vodeni rastvor natrijum bikarbonata. Odvojena organska faza se ekstrahuje sa 1M HCI (3X). Kombinovani vodeni ekstrakti se operu sa etrom, bazifikuju sa vodenim rastvorom 4.5 M K2C03i ekstrahuju sa etrom. Kombinovani organski ekstrakti se operu sa zasićenim rastvorom soli, osuše preko natrijum sulfata i koncentruju do suva da bi se dobilo 2,32 g željenog jedinjenja (voskasta čvrsta meterija, 81% prinos).

<1>H-NMR (300MHz, CDCI3) : 5 3,48 (dd, 1H) , 3,64 (dd, 1H) , 3,74 (d, 1H) , 3,80 (dd, 1H), 3,88 (d, 1H), 5,18 (s, 2H), 7,25-7,39 (m, 10H).

MS (M+H<+>): 286.

INTERMEDIJER 17: benzil estar 4- benzil- 6- jodometil- 6- metil- morfolin- 3-

karboksilne kiseline

U rastvor benzil estra N-benzil-serina( INTERMEDIJER 16,6,35 g) u 90 mL MeCN na sobnoj temperaturi dodaje se 3-bromo-2-metil-propen (5,6 mL), Kl (740 mg) i K2C03(7,7 g). Reakciona smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 72 h. Dodaje se 1 mL 3-bromo-2-metil-propena i reakciona smeša se meša tokom dodatnih 15 h. Ostaje samo mala količina početnog materijala prema TLC (1:1; EtOAc-heksan). U dobijenu smešu se dodaje 11,2 g joda. Nakon 4 h mešanja, TLC (10% EtOAc/heksan) pokazuje kompletnu konverziju. Reakciona smeša se podeli na etar (300 mL) i 0,5 M Na2S203(100 mL). Odvojena organska faza se uzastopno pere sa vodom, zasićenim NaHC03i zasićenim rastvorom soli, osuši preko MgS04, i koncentruje do suva. Ostatak se prečišćava na silicijum dioksidu (5% EtOAc/Heksan) da bi dobilo 6,65 g (žućkastog ulja, 64% prinos, oko 4:1 smeša) jedinjenja benzil estra 4-benzil-6-jodometil-6-metil-morfolin-3-karboksilne kiseline. Glavni sastojak:<1>H-NMR (300MHz, CDCI3) : 5 1,22 (s, 3H), 2,50 (d, 1H), 3,16-3,36 (m, 3H), 3,75-3,95 (m, 4H), 4,06 (dd, 1H), 5,16 (d, 1H), 5,21 (d, 1H), 7,28-7,36 (m, 10H).

MS (M+H<+>): 466.

INTERMEDIJER 18: benzil estar 4- benzil- 6, 6- dimetil- morfolin- 3- karboksilne

kiseline

U rastvor benzil estra 4-benzil-6-jodometil-6-metil-morfolin-3-karboksilne kiseline( INTERMEDIJER 17,1,23 g) i tributilkalaj hidrida (1,8 mL, 2,5 eq.) u 11 mL toluena pod slabim refluksom dodaje se tokom 1,5 h rastvor AIBN u toluenu (25 mg/1mL). Smeša se ostavi da se ohladi i koncentruje se do suva. Ostatak se podeli u 15% 1M HCI u acetonitrili i heksanu. Odvojena heksan faza se ekstrahuje 2 puta sa rastvorom acetonitrila. Kombinovani acetonitril rastvori se operu sa heksanom 2 puta i koncentruju. Ostatak se podeli u etru i 1M K2CO3. Odvojena etar faza se uzastopno opere sa 0,4M Na2S203i zasićenim rastvorom soli, osuši preko MgS04i koncentruje. Ostatak se prečišćava na silicijum dioksidu (7,5% EtOAc/heksan) da bi se dobilo 760 mg (ulje, 85% prinos) jedinjenja benzil estra 4-benzil-6,6-dimetil-morfolin-3-karboksilne kiseline.

<1>H-NMR (300MHz, CDCI3): 5 1,21 (s, 3H) , 1,24 (s, 3H) , 2,12 (d, 1H) , 2,84 (d, 1H), 3,29 (t, 1H), 3,58 (d, 1H) , 3,95-4,05 (m, 2H), 5,15 (d, 1H), 5,21 (d, 1H), 7,28-7,36 (m, 10H).

MS (M+H<+>) :340.

INTERMEDIJER 19: 6, 6- dimetil- morfolin- 3- karboksilne kiseline

U rastvor benzil estra 4-benzil-6,6-dimetil-morfolin-3-karboksilne kiseline( INTERMEDIJER 18,1,25 g) u 40 mL 10% AcOH/MeOH (pod atmosferom azota) dodaje se 250 mg 20% Pd(OH)2na uglju. Reakciona smeša se produva vodonikom (balon) i meša na sobnoj temperaturi tokom 72 h. U dobijenu sivu smešu dodaje se 4 mL vode da se pospeši rastvaranje. Katalizator se uklanja i filtrat se koncentruje do suva. Ostatak se ko-uparava sa etanolom (2X) i zatim se triturira sa EtOAc. Proizvedena bela čvrsta materija se odfiltrira i osuši pod visokim vakuumom da bi se dobilo 559 mg 6,6-dimetil-morfolin-3-karboksilne kiseline (95% prinos).

<1>H-NMR (300MHz, D20) : 5 1,35 (s, 3H), 1,38(s, 3H) , 3,11 (d, 1H), 3,32 (d, 1H), 3,81-3,87 (m, 1H), 4,05 (bt, 1H), 4,17 (bd, 1H).

MS (M+H<+>): 160.

INTERMEDIJER 20: 4, 6, 6- trimetil- morfolin- 3- karboksilna kiselina

U suspenziju 6,6-dimetil-morfolin-3-karboksilne kiseline( INTERMEDIJER 19,540 mg) u 17 mL etanola (pod atmosferom azota) dodaje se 100 mg 10% Pd na ugljeniku i 830 uL (~3 eq.) 37% vodenog rastvora formaldehida. Smeša se produva vodonikom (balon) i meša na sobnoj temperaturi tokom 5 h. U dobijenu sivu smeše se dodaje 4 mL vode i 4 mL metanola da bi se pospešilo rastvaranje. Katalizator se uklanja filtriranjem i filtrat se koncentruje do suva. Ostatak se trituriše sa EtOAc. Proizvedena bela čvrsta materija se odfiltrira i osuši pod visokim vakuumom da bi se dobilo 574 mg 4,6,6-trimetil-morfolin-3-karboksilne kiseline (97% prinos).

<1>H-NMR (300MHz, D20) : 5 1,35 (s, 3H) , 1,43(s, 3H) , 2,94(s, 3H), 3,08 (d, 1H), 3,41 (d, 1H), 3,68 (dd, 1H), 3,96 (t, 1H), 4,14 (dd, 1H).

MS (M+H+): 174.

PRIMER 8: ( 6- hloro- 9H- B- karbolin- 8- il)- amid 4. 6. 6- trimetil- morfolin- 3- karboksilne

kiseline

Željeno jedinjenje se dobija prema postupku 6 iz 6-hloro-9H-B-karbolin-8-ilamina i 4,6,6-trimetil-morfolin-3-karboksilne kiseline u prinosu od 61%.

<1>H-NMR (DMSO-d6, 300MHz) 5 1,15 (s, 3H), 1,39 (s, 3H), 1,98 (d, 1H), 2,26 (s, 3H), 2,72 (d, 1H), 2,80 (dd, 1H), 3,79(m, 2H), 7,91 (s, 1H), 8,03-8,08 (m, 2H) , 8,22 (d, 1H), 8, 97 (s, 1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,33 min.

MS (M+H<+>): 373,2.

PRIMER 9: ( 6- hloro- 7- metoksi- 9H- B- karbolin- 8- il)- amid 2. 2- dimetil- 5- okso-

tetrahidro- furan- 3- karboksilne kiseline

Željeno jedinjenje se dobija prema postupkuAiz 6-hloro-7-metoksi-9H-B-karbolin-8-ilamina i (R)-terbinske kiseline u prinosu od 60-80%.

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) : 5 1,48 (s, 3H) , 1,61 (s, 3H), 3,03 (m, 2H), 3,51 (m, 1H), 3,86 (s, 3H), 8,16 (m, 1H), 8,37 (m, 1H), 8,43 (s, 1H), 8,94 (s, 1H), 10,10 (s,1H), 11,33 (s,1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1, 94 min.

MS (M+H+) : 388.

INTERMEDIJER 21: 6- hlom- 7<ikhpropilmetoksM^ itrx>4H- p- karbolin

Ciklopropilmetil alkohol (0,921 mL, 11,4 mmol) se dodaje u suspenziju NaH (455 mg, 11,4 mmol) u DMF (20 mL) koja se meša pod atmosferom argona. Dobijeni rastvor se ostavlja da se meša na RT tokom 20 min. U mešajući rastvor se dodaje 6-hloro-7-fluoro-8-nitro-9H-B-karbolin (500 mg, 1,9 mmol) i dobijena smeša se ostavlja da se meša na RT. Nakon što se doda H2O, istaloži se čvrsta mrka materija koja se filtrira da bi se dobio željeni 6-hloro-7-ciklopropilmetoksi-8-nitro-9H-B-karbolin (510 mg, 85%).

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 0,35 (m, 2H), 0,59 (m, 2H), 1,32 (m, 1H), 4,04 (d, 2H), 8,21 (d, 1H), 8,46 (d, 1H), 8,90 (s, 1H), 9,02 (s, 1H), 12,32 (b, 1H) Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 2,63min. MS (M+H+):318.

INTERMEDIJER 22: 6- hloro- 7<iklopropilmetoksi- 9H-/ 3- karbolin- 8- ilamin

6-hloro-7-ciklopropilmetoksi-8-nitro-9H-B-karbolin (510 mg, 1,61 mmol) se suspenduje u 12 mL metanola i dodaje se 100 mg Pd/C (10%). Boca se oprema sa balonom vodonika i reakciona smeša se meša preko noći na RT. Nakon filtriranja kroz celite jastučić i uparavanja metanola, dobija se tamno mrka čvrsta materija. Ovaj ostatak se suspenduje u metanolu (10 mL) i dodaje, uz snažno mešanje, u rastvor zasićenog NaHC03(100 mL). Svetio mrka čvrsta materija dobijena precipitacijom se pokupi filtriranjem i detaljno osuši u vakuumu da bi se dobio željeni 6-hloro-7-ciklopropilmetoksi-9H-B-karbolin-8-ilamin (371 mg, 80% prinos).

<1>H-NMR (300 MHz, metanol-d4) : 5 0,36 (m, 2H) , 0,61 (m, 2H), 1,37 (m, 1H), 3,88 (d, 2H), 7,58 (s, 1H), 7,96(d, 1H), 8,23 (d, 1H), 8,76 (s, 1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 2,28min.

MS (M+H<+>): 288.

PRIMER 10: N-( 6- hloro- 7- ciklopropilmetoksi- 9H- 3- karbolin- 8- il)- 2- metil-

nikotinamid

Željeno jedinjenje se dobija prema postupkuAiz 6-hloro-7-ciklopropilmetoksi-9H-B-karbolin-8-ilamina i 2-metilnikotinske kiseline u prinosu od 40-60%.

<1>H-NMR (300 MHz, MeOH-d4) : 5 0,29 (m, 2H) , 0,55 (m, 2H), 1,29 (m, 1H), 2,78 (s, 3H), 3,95 (m, 2H), 7,46 (dd, 1H), 8,08 (m, 1H), 8,30 (m, 3H), 8,59 (m, 1H), 8,81 (s, 1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 2,18 min.

MS (M+H<+>): 405.

INTERMEDIJER 23: 6- hloro- 7-( N, N) <iimetilammoetoksi- 8^

N,N-dimetilaminoetil alkohol (6,0 eq) se dodaje u suspenziju NaH (6,0 eq) u DMF koja se meša u atmosferi argona. Dobijeni rastvor se ostavlja da se meša na RT tokom 20 min. 6-hloro-7-fluoro-8-nitro-9H-3-karbolin (1,0 eq) se dodaje u rastvor koji se meša i dobijena smeša se ostavlja da se meša na RT. Nakon što se doda H20, istaloži se mrka čvrsta materija koja se filtrira da bi se dobio željeni 6-hloro-7-(N,N)-dimetilaminoetoksi-8-nitro-9H-o-karbolin (kvantitativni prinos).

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 2,23 (s, 6H), 2,74 (t, 2H) , 4,28 (t, 2H) , 8,21 (d, 1H), 8,46 (d, 1H), 8,90 (s, 1H), 9,02 (s, 1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,26 min.

MS (M+H<+>): 335.

INTERMEDIJER 24: 6- hloro- 7-( N, N) <Jimetilaminoetoksi- 9H- l3- karbolin- 8- ilamin

6-hloro-7-(N,N)-dimetilaminoetoksi-8-nitro-9H-8-karbolin (500 mg, 1,5 mmol) se suspenduje u 12 mL metanola i dodaje se 100 mg Pd/C (10%). Boca se oprema sa balonom vodonika i reakciona smeša se meša preko noći na RT. Nakon filtriranja kroz celite jastučić i uparavanja metanola, dobija se tamno mrka čvrsta materija. Ostatak se suspenduje u metanolu (10 mL) i dodaje, uz snažno mešanje u rastvor zasićenog NaHC03(100 mL). Čvrsta materija koja se dobije precipitacijom se pokupi filtriranjem i podrobno osuši u vakuumu da bi se dobio

željeni 6-hloro-7-(N,N)-dimetilaminoetoksi-9H-P-karbolin-8-ilamin (380 mg, 83%).<1>H-NMR (300 MHz, metanol-d4) : 5 2,43 (s, 6H) , 2,84 (t, 2H), 4,11 (t, 2H), 7,47 (s, 1H), 7,88 (d, 1H), 8,20 (d, 1H), 8,72 (s, 1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,34min.

MS (M+H<+>): 305.

PRIMER 11: N- f6- hloro- 7-( 2- dimetilamino- etoksiV9H- B- karbolin- 8- in- 2- metil-

n i koti nam i d

Željeno jedinjenje se dobija prema postupkuAiz 6-hloro-7-(N,N)-dimetilaminoetoksi-9H-p-karbolin-8-ilamina i 2-metilnikotinske kiseline u prinosu od 40-60%.

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) : 5 1, 92 (s, 6H) , 2,49 (m, 2H), 2,68 (s, 3H), 4,25 (m, 2H), 7,50 (dd, 1H), 8,16 (m, 2H), 8,38 (d, 1H), 8,42 (s, 1H), 8,66 (m, 1H) , 9,00 (s, 1H), 11,27 (s, 1H), 11,78 (s, 1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,52 min.

MS (M+H+) : 424.

PRIMER 12: ( 6- hloro- 7- metoksi- 9H- B- karbolin- 8- in- amid 2- amino-

ciklopentankarboksilne kiseline

6-hloro-7-metoksi-9H-B4<arbolin-8-ilamin i 2-terc-butoksikarbonilamino-ciklopentankarboksilna kiselina se dovedu u reakciju upotrebom postupka A. U ovaj proizvod se dodaje~5 mL 4M HCI/dioksana i dobijena smeša se ostavi da se meša na RT. Nakon reakcije sledi LC-MS do završetka. Dozvoljava se uparavanje da bi se uklonio sav rastvarač čime se dobija sirova HCI so. Željeni proizvod se zatim prečišćava preparativnom HPLC.

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) : 5 1,68 (m, 1H), 1,84 (m, 2H), 2,06 (m, 2H), 2,20 (m, 1H), 3,46 (m, 1H), 3,67 (m, 1H), 3,89 (S, 3H), 8,24 (d, 2H), 8,61 (d, 1H), 8,72 (s, 1H), 8,78 (d, 1H), 9,19 (s, 1H), 10,58 (s, 1H), 13,20 (s, 1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,54 min.

MS (M+H<+>): 359.

INTERMEDIJER 25: 1-( 2- dimetilamino- etil)- 5- okso- pirolidin- 3- karboksilna kiselina

Smeša komerijalno dostupne itakonske kiseline i N,N-dimetiletilendiamina se zagreva do 160°C tokom oko 20-25 minuta. Smeša se ostavlja da se ohladi do 100°C i zatim se razblaži sa MeOH da se spreči očvršćavanje. Proizvod se dobija u prinosu od 56% nakon kristalizacije iz MeOH/EtOAc.

<1>H-NMR (300MHz, D20): 5 2,63 (dd, 1H), 2,80 (dd, 1H) , 2,95 (s, 6H), 3,15-3,25 (m, 1H), 3,32-3,44 (m, 1H), 3,44-3,76 (m, 4H), 3,82-3,94 (m, 1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 0,13 min. MS(M+H<+>): 201,0.

PRIMER 13: ( 6- hloro- 9H- B- karbolin- 8- in- amid 1-( 2- Dimetilamino- etiO- 5- okso-

pirolidin- 3- karboksilne kiseline

Dobija se prema postupku B iz 6-hloro-9H-B-karbolin-8-ilamina i 1-(2-dimetilamino-etil)-5-okso-pirolidin-3-karboksilne kiseline u prinosu od 70-80% kao di-HCI so.

<1>H-NMR (300MHz, D20) : 5 2,97 (dd, 1H) , 3,03 (s, 6H) , 3,08 (dd, 1H), 3,51 (t, 2H), 3,76-3,89 (m, 3H), 3,95 (dd, 1H), 4,01 (dd, 1H), 7,75 (d, 1H), 8,24 ( d, 1H), 8,45 (dd, 1H), 8,52 (dd, 1H), 9,10 (bs, 1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 0,99 min.

MS (M+H+) : 400.

PRIMER 14: ( 6- hloro- 7- metoksi- 9H- B- karbolin- 8- in- amid 1-( 2- dimetilamino- etil)- 5-

okso- pirolidin- 3- karboksilne kiseline

Dobija se prema postupkuAiz 6-hloro-7-metoksi-9H-B-karbolin-8-ilamina i 1-(2-dimetilamino-etil)-5-okso-pirolidin-3-karboksilne kiseline u prinosu od 60% nakon prečišćavanja upotrebom semipreparativne Chiralcel OD kolone sa85/7,5/7,5heksan/EtOH/MeOH kao eluenta.

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d5): 5 2,44 (s, 6H), 2,75 (t, 2H), 2,88 (d, 2H) , 3,56 (t, 2H), 3,66 (m, 1H), 3,85 (m, 2H), 3,90 (s, 3H), 8,03 (d, 1H), 8,21 (s, 1H), 8,28 (d,1H), 8,79 (s,1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,42 min.

MS (M+H+) : 430.

INTERMEDIJER 26: 6- hloro- 7- fluoro- 9H- p- karbolin- 8- ilamin

Gusta suspenzija 6-hloro-7-fluoro-8-nitro-9H-B-karbolina (500 mg, 1,88 mmol) u

MeOH (25 mL) se degasira argonom. Dodaje se paladijum na ugljeniku (20% mas/mas na C, 50 mg) i reakciona posuda se produva vodonikom. gusta suspenzija se meša pod balonom vodonika tokom 6 h, zatim filtrira kroz celite i koncektruje pod sniženim pritiskom da bi se dobio prinos 6-hloro-7-fluoro-9H-B-karbolin-8-ilamina (400 mg) u obliku mrke čvrste materije.

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 11,48 (br s, 1); 8,99 - 8,98 (m, 1); 8,37 - 8,35 (m, 1); 8,11 - 8,09 (m, 1); 7,74 - 7,72 (m, 1); 5, 65 (br s, 2).

HCOOH standardni uslovi.

DAD Rf= 1,00 min.

MS (M+H<+>): 236.

PRIMER 15: N-( 6- hloro- 7- fluoro- 9H- B- karbolin- 8- il)- 2- metil- nikotinamid

Rastvor 6-hloro-7-fluoro-9H-B-karbolin-8-ilamina (100 mg, 0,424 mmol) u piridinu (2,5 mL) se meša na RT, Dodaje se 2-metil nikotinska kiselina (70 mg, 0,509 mmol), i zatim EDCI (130 mg, 0,678 mmol). Suspenzija se meša na 100°C jedan dan. Piridin se uklanja pod sniženim pritiskom i dobijeno tamno ulje se triturira sa zasićenim vodenim rastvorom NaHCO-3. Formirani precipitat se filtrira i opere sa MeOH. Materijal se tretira sa 2M HCI u Et20 da bi se dobio prinos sive čvrste materije, di-HCI soli N-(6-hloro-7-fluoro-9H-B-karbolin-8-il)-2-metil-nikotinamida (110 mg).

1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 13,15 (s, 1); 11,03 (s, 1); 9,33 (s, 1); 8,99-8,97 (m, 1); 8,92 - 8,89 (m, 1); 8,79 -8,73 (m, 2); 8,50 (m, 1); 7,70 (m, 1); 2,80 (s, 3), HCOOH standardni uslovi,

DAD Rf = 0,91 min.

MS (M+H+) : 355.

INTERMEDIJER 27: 6- hloro- 7- metilsulfanil- 8- nitro- 9H- l3- karbolin

250 mL boca sa okruglim dnom sa magnetnim mešačem se napuni sa 6-hloro-7-fluoro-8-nitro-B-karbolinom{ INTERMEDIJER 5,3,959 g, 14,9 mmol) i 100 mL bezvodnog DMF. Dobijena oranž smeša se ohladi do 0°C (ledeno kupatilo) i u nju se polako dodaje natrijum tiometoksid (1,809 g, 25,8 mmol) u praškastom obliku. Reakciona smeša se meša tokom 1 h na 0°C, zagreje do RT, i polako dodaje u smešu 4:1 H20 / zasićeni vodeni rastvor natrijum bikarbonata (500 mL) koja se

meša. Precipitat u obliku čvrste materije se pokupi filtriranjem usisavanjem i osuši na vazduhu da bi se dobilo 4,017 g 6-hloro-7-metilsulfanil-8-nitro-9H-84<arbolina u obliku oranž praha. Sirov materijal se direktno koristi u sledećim koracima.<1>H-NMR (300 MHz, Metanol-d4) : 5 8,91 (1H, d) 8,63 (1H, s) 8,42 (1H, d) 8,17 (1H, dd)2,54 (3H, s).

LCMS (mravlja kiselina standardan postupak)

Vreme zadržavanja= 1,43 min.

MS (M+H<+>): 294.

INTERMEDIJER 28: 6- hloro- 7- metilsulfanil- 9H-/ 3- karbolin- 8- ilamin

500 mL boca sa okruglim dnom sa magnetnim mešačem se napuni sa 6-hloro-7-metilsulfanil-8-nitro-9H-6-karbolinom (4,011 g, 13,6 mmol) i 200 mL bezvodnog etanola. U dobijenu smešu se dodaje vodeni rastvor amonijum hlorida (75 mL 0,33 M rastvora, 24,7 mmol), vodeni rastvor hlorovodonične kiseline (10 mL 1M rastvora, 10 mmol), i gvožđe u prahu (7.734 g, 138 mmol). Dobijena smeša se zagreva do 60°C (uljno kupatiolo) i snažno meša tokom 3,5 h. Reakcija se ohladi do RT, razblaži sa EtOAc (75 mL) i dodaje se aktivni ugalj (cea 2,5 g). Dobijena smeša se meša na RT tokom dodatnih 1,5 h, filtrira kroz celite jastuče i dobijeni filtrat se koncentruje (rotavap, zatim vakuum pumpa) da bi se dobilo 5,153 g žućkasto-oranž obojene čvrste materije. Čvrsta materija se ponovo rastvori u MeOH (50-100 mL) i polako se dodaje zasićenom vodenom rastvoru natrijum bikarbonata (500 mL) uz mešanje. Smeša se meša na RT tokom 45 min i dobijena čvrsta materija se pokupi filtriranjem usisavanjem i osuši na vazduhu da bi se dobilo 3,476 g 6-hloro-7-metilsulfanil-9H-B-karbolin-8-ilamina u obliku tamne čvrste materije koja se koristi bez daljeg prečišćavanja u sledećim koracima.

<1>H-NMR (300 MHz, Metanol-d4): 5 8,87 (1H, s) 8,35-8,24 (1H, m) 8,16-8,06 (1H, m) 7,67 (1H, s)2,32 (3H, s).

LCMS (amonijum acetat standardni postupak)

Vreme zadržavanja= 2,12 min.

MS (M+H<+>): 264.

PRIMER 16: N-( 6- hloro- 7- metilsulfanil- 9H- B- karbolin- 8- in- 2- metil- nikotinamid

250 mL boca sa okruglim dnom sa magnetnim mešačem se napuni sa 6-hloro-7-

metilsulfanil-9H-B-karbolin-8-ilaminom( INTERMEDIJER 28,2,336 g, 8,86 mmol) i 2-metilnikotinskom kiselinom (3,219 g, 23,4 mmol) u 80 mL bezvodnog piridina. U dobijenu smešu se na RT dodaje čvrst 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidrohlorid (7,080 g, 36,9 mmol) i reakciona smeša se zagreva do 100°C (uljno kupatilo) tokom 2 dana. Dobijena smeša se ohladi do RT i koncentruje (rotavap) da bi se dobio mrk ostatak. Ostatak se ponovo rastvori u MeOH (50 mL), polako dodaje u smešu 5:1 H20 / zasićeni vodeni rastvor natrijum bikarbonata (600 mL) koja se meša i meša na RT tokom -18 h. Dobijeni čvrst precipitat se pokupi filtriranjem usisavanjem, opere sa Et20 (2 x 150 mL), i osuši na vazduhu da bi se dobilo 3,036 g sirovog N-(6-hloro-7-metilsulfanil-9H-B-karbolin-8-il)-2-metil-nikotinamida u obliku mrke čvrste materije. Sirov materijal se prečišćava putem HPLC (prinosi = -40-60%)

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 11,72 (1H, s) 10,50 (1H, s) 8,97 (1H, s) 8,62 (1H, dd) 8,57 (1H, s) 8,41 (1H, d) 8,33-8,27 (1H, m) 8,21 (1H, d) 2,73 (3H, s) 2,41 (3H, s).

LCMS (amonijum acetat standardni postupak)

Vreme zadržavanja= 1,89 min.

MS (M+H<+>): 383.

INTERMEDIJER 29: 6- hloro- 7^ tilsulfanil- 8- nitro- 9H- p- karbolin

25 mL boca sa okruglim dnom sa magnetnim mešačem se napuni sa 6-hloro-7-fluoro-8-nitro-9H-B-karbolinom (102 mg, 0,38 mmol) u 5 mL bezvodnog DMF. U dobijenu oranž smešu se na RT polako dodaje natrijum tioetoksid (80% čist, 69,7 mg, 0,66 mmol) u obliku praha. Reakciona smeša se meša na RT tokom 45 minuta, i zatim se ukapavanjem dodaje u 5:1 smešu H20 / zasićen natrijum bikarbonat (~30 mL). Dobijena čvrsta materija kao precipitat se pokupi filtriranjem usisavanjem, opere sa 1:1 heksani / dietil etar (2 x 20 mL), i osuši na vazduhu da bi se dobilo 95,0 mg 6-hloro-7-etilsulfanil-8-nitro-9H-B-karbolina u obliku oranž čvrste materije (79%).

<1>H-NMR (300 MHz, CD3OD, ppm) 5 8,91 (1H, s) 8,63 (1H, s) 8,42 (1H, d) 8,18 (1H, d)3,04 (2H, q) 1,20 (3H, t).

Vreme zadržavanja (LC, mravlja kiselina standard postupak): 1,71 min.

MS (M+H<+>): 308.

INTERMEDIJER 30: 6- hloro- 7^ tilsulfanil- 9H- f3- karbolin- 8- ilamin

50 mL boca sa okruglim dnom sa magnetnim mešačem se napuni sa 6-hloro-7-etilsulfanil-8-nitro-9H-B-karbolinom (85,0 mg, 0,28 mmol) u 10 mL bezvodnog etanola. U dobijenu oranž smešu na RT se dodaje 0,33 M vodeni rastvor amonijum hlorida (2,0 mL, 0,66 mmol) i gvožđe u prahu (680 mg, 12,2 mmol). Reakciona smeša se zagreva do 60°C i snažno meša tokom 20 h. Zatim se smeša ohladi do RT, razblaži sa acetatom (15 mL), i dodaje se aktivni ugalj (-180 mg). Dobijena smeša se filtrira kroz celite jastučić i filtrat se koncentruje da bi se dobilo 77,8 mg 6-hloro-7-etilsulfanil-9H-B-karbolin-8-ilamina u obliku žute čvrste materije (> 99%).

<1>H-NMR (300 MHz, CD3OD, ppm) 5 8,94 (1H, s) 8,33-8,29 (1H, m) 8,21-8,18 (1H, m) 7,73 (1H, s) 2,85 (2H, q) 1,21 (3H, t).

LCMS (amonijum acetat standard postupak)

Vreme zadržavanja= 2,13 min.

(M<+>= 278; M" = 276).

PRIMER 17: N-( 6- hloro- 7- etilsulfanil- 9H- 3- karbolin- 8- in- 2- metil- nikotinamid

25 mL boca sa okruglim dnom sa magnetnim mešačem se napuni sa 6-hloro-7-etilsulfanil-9H-B-karbolin-8-ilaminom (37,2 mg, 0,13 mmol) i 2-metilnikotinskom kiselinom (36,2 mg, 0,26 mmol) u 3 mL bezvodnog piridina. U dobijenu svetio oranž smešu se na RT dodaje čvrsti 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidrohlorid (73,2 mg, 0,38 mmol) i dobijena reakciona smeša se zagreva do 80°C tokom 5 dana. Zatim se reakciona smeša ohladi do RT i koncentruje da bi se dobio mrk, viskozan sirup. Sirup se rastvori u minimalnoj količini MeOH (~2 mL), i polako se dodaje u 5:1 smešu H20 / zasićeni natrijum bikarbonat (-20 mL), i meša na RT tokom 2,5 h. Dobijeni čvrsti precipitat se pokupi putem filtriranja usisavanjem, opere sa 1:1 heksani / dietil etar (2 x 20 mL), i osuši na vazduhu da bi se dobio 21,0 mg N-(6-hloro-7-etilsulfanil-9H-p-karbolin-8-il)-2-metil-nikotinamida u obliku svetio mrke čvrste materije (-38%).

LCMS (amonijum acetat standard postupak)

Vreme zadržavanja = 2,33 min.

(M<+>= 397; M" = 395).

<1>H-NMR (300 MHz, CD3OD, ppm) 5 8,89 (1H, s) 8,63-8,58 (1H, m) 8,44-8,38 (2H, m) 8,36 (1H, d) 8,15 (1H, d) 7,52-7,44 (1H, m) 2,98 (2H, q) 2,84 (3H, s) 1,20 (3H, t).

INTERMEDIJER 31: [ 2-( 6- hloro- 8- nitro- 9H-/ 3- karbolin- 7- ilsuM

amin

25 mL boca sa okruglim dnom sa magnetnim mešačem se napuni sa 6-hloro-7-fluoro-8-nitro-9H-B-karbolinom (98 mg, 0,37 mmol) u 2 mL bezvodnog DMF. Druga 10 mL boca sa okruglim dnom sa magnetnim mešačem se napuni sa 2-dimetilamino-etantiol hidrohloridom (100 mg, 0,70 mmol) u 2 mL bezvodnog DMF. U dobijenu suspenziju špricem se dodaje n-butillitijum (0,43 mL 1,6 M rastvor u heksanima, 0,69 mmol) i smeša se meša tokom 5 min na RT. Zatim se tioanjon rastvor špricem dodaje u 6-hloro-7-fluoro-8-nitro-9H-B-karbolin, i dobijeni crveni rastvor se meša na RT tokom 30 min. Reakciona smeša se polako dodaje u 5:1 rastvor H20 / zasićeni vodeni rastvor natrijum bikarbonata (30 mL) i ostavlja se da stoji na RT tokom nekoliko sati. Dobijeni čvrsti precipitat se pokupi filtriranjem usisavanjem i osuši na vazduhu da bi se dobilo 109 mg [2-(6-hloro-8-nitro-9H-B-karbolin-7-ilsulfanil)-etil]-dimetil-amina u obliku oranž čvrste materije (83%).

LCMS (amonijum acetat standard postupak)

Vreme zadržavanja= 1,35 min.

(M<+>= 351; M" = 349).

<1>H-NMR (300 MHz, CD3OD, ppm) 5 8 , 92 (1H, d, J = 1,0 Hz) 8,66 (1H, s) 8,43 (1H, d) 8,19 (1H, dd) 3,18-3,13 (2H, m) 2,57-2,52 (2H, m) 2,21 (6H, s).

INTERMEDIJER 32: 6- hloro- 7-( 2^ imetilamino^ tllsulfaM

50 mL boca sa okruglim dnom sa magnetnim mešačem se napuni sa [2-(6-hloro-8-nitro-9H-B-karbolin-7-ilsulfanil)-etil]-dimetil-aminom (106 mg, 0,30 mmol) u 8 mL bezvodnog etanola. U dobijenu oranž smešu na RT se dodaje 0,33 M vodeni rastvor amonijum hlorida (1,95 mL, 0,64 mmol) i gvožđe u prahu (540 mg, 9,67 mmol). Reakciona smeša se zagreva do 60°C i snažno meša tokom 20 h. Zatim se smeša ohladi na RT, razblaži sa etil acetatom (20 mL) i dodaje se aktivni ugalj (cea. 150 mg). Dobijena smeša se filtrira kroz celite jastučić i dobijeni filtrat se koncentruje da bi se dobilo 103 mg 6-hloro-7-(2-dimetilamino-etilsulfanil)-9H-B-karbolin-8-ilamina u obliku žute čvrste materije. Sirov proizvod se koristi direktno u koraku kuplovanja. LCMS (amonijum acetat standard postupak) Vreme zadržavanja= 1,34 min. (M<+>= 321; M~= 319).

<1>H-NMR (300 MHz, CD3OD, ppm) 5 8,87 (1H, s) 8,30 (1H, d) 8,06 (1H, d) 7,75 (1H, s) 3,23-3,13 (4H, m) 2,84 (6H, s).

PRIMER 18: N46- hloro- 7-( 2- dimetilamino- etilsulfanin- 9H- B- karbolin- 8- in- 2- metil-

nikotinamid

25 mL boca sa okruglim dnom sa magnetnim mešačem se napuni sa 6-hloro-7-(2-dimetilamino-etilsulfanil)-9H-B-karbolin-8-ilamina (45,2 mg, 0,14 mmol) i 2-metilnikotinskom kiselinom (39,0 mg, 0,28 mmol) u 4,5 mL bezvodnog piridina. U dobijenu svetio oranž smešu na RT se dodaje čvrsti 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidrohlorid (95,0 mg, 0,49 mmol). Dobijena reakciona smeša se zagreva do 80°C tokom 3 dana. Zatim se reakcija ohladi do RT i koncentruje da bi se dobio mrk, viskozan sirup. Sirup se rastvori u minimalnoj količini MeOH (-2 mL), i polako se dodaje u 5:1 smešu H2O / zasićeni natrijum bikarbonat (-25 mL), i ekstrahuje sa etil acetatom (3 x 30 mL). Kombinovani organski slojevi se operu sa zasićenim rastvorom soli (1 x 30 mL), osuše preko Na2S04, filtriraju i koncentruju da bi se dobio mrk talog (79,6 mg). Ostatak se ponovo rastvori u MeOH (-5 mL), i filtrira kroz pamučni čep. U dobijeni filtrat se dodaje HCI u 1,4-dioksanu (1,0 mL, 4,0 mmol), i dobijeni rastvor se meša na RT tokom 3 h, i ukapavanjem se dodaje u dietil etar (30 mL) uz mešanje. Proizvod dobijen precipitacijom se pokupi filtriranjem usisavanjem, opere sa etrom i osuši na vazduhu da bi se dobilo 36,3 mg N-[6-hloro-7-(2-dimetilamino-etilsulfanil)-9H-B-karbolin-8-il]-2-metil-nikotinamid tris-hidrohlorida u obliku žutog praha.

<1>H-NMR (300 MHz, CD3OD, ppm) 5 8,95 (1H, s) 8,62 (1H, dd) 8,43 (1H, s) 8,38-8,34 (2H, m) 8,16 (1H, d) 7,50 (1H, dd) 3,09 (2H, t) 2,85 (3H, s) 2,30 (2H, t) 1,99 (6H, s).

LCMS (amonijum acetat standard postupak)

Vreme zadržavanja= 1,56 min.

(M<+>= 440; M' = 438).

INTERMEDIJER 33: 4- terc- butil estar morfolin- 3( S), 4- dikarboksilna kiselina

Suspenzija morfolin-3(S)-karboksilne kiseline (2,00 g, 15,3 mmol) u DMF (75 mL) se meša na RT. Dodaje se trietilamin (7,47 ml, 53,6 mmol) i di-terc-butil dikarbonat (BOC2O, 4,02 g, 18,4 mmol), Suspenzija se meša na RT tokom 1 h, za koje vreme se reakcijom formira bistar žuti rastvor. Rastvor se koncentruje da bi se smanjila zapremina (~25 mL) i razblaži sa vodom (15 mL) i 1M HCI (15 mL). Smeša se sipa u levak za odvajanje, ponovo razblaži sa vodom (100 mL) i zasićenim rastvorom soli (100 mL), i ekstrahuje sa Et20 (3 x 100 mL). Organski sloj se opere sa zasićenim rastvorom soli, osuši, filtrira i koncentruje da bi se dobio prinos bele čvrste materije. Čvrsta materija, koja sadrži višak BOC20, se rastvori u Et20 (500 mL) i ekstrahuje sa 1M NaOH (3 x 100 mL). Vodeni sloj se zakiseli sa 6M HCI do otprilike pH 2, i zatim brzo ekstrahuje sa Et20 (3 x 100 mL). Et20 sloj se osuši, filtrira i koncentruje da bi se dobio prinos bele čvrste materije (3,07 g).

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 12,95 (br s, 1); 4,34 - 4,30 (m, 1); 4,18 - 4,10 (m, 1); 3,83 - 3,74 (m, 1); 3,59 - 3,51 (m, 2); 3,39 - 3,32 (m, 1); 3,21 - 2,95 (m, 1); 1,41 -1,36 (m, 9).

NH4OAC standardni uslovi.

ELSD Rf = 1,08 min.

M-H = 230.

PRIMER 19: ( 6- hloro- 9H- B4<arbolin- 8- in- amid 4- metil- morfolin- 3( SVkarboksilna

kiselina

Gusta suspenzija morfolin-3(S)4<arboksilne kiseline (3,00 g, 22,9 mmol) u EtOH (115 mL) se meša na RT. Dodaje se rastvor vodenog CH20 (3,42 mL, 45,8 mmol, 37% mas/mas u H20), i zatim Pd(OH)2(600 mg, 20% mas/mas na ugljeniku). Boca se napuni sa vodonikom (1 bar) i siva gusta suspenzija se meša tokom 24 h na RT pod balonom vodonika. Boca se produva azotom i crna gusta suspenzija se razblaži sa MeOH, filtrira kroz papirni filter i koncentruje da bi se smanjila zapremina. Bledo sivi rastvor se filtrira kroz 0,45 pm špric filter da bi se uklonio rezidualni Pd(OH)2i koncentruje da bi se dobio prinos bistrog bezbojnog ulja. Ulje se stavi pod visok vakuum tokom 24 h i izoluje se bela čvrsta pena. Pena se rastvori u piridinu (200 mL) i dodaje se 6-hloro-9H-B-karbolin-8-ilamin

(3,74 g, 17,2 mmol), i zatim EDCI (5,87 g, 30,6 mmol). Bistri bledo oranž rastvor se meša na RT tokom 24 h. Rastvor se razblaži sa H20 (300 mL) i sipa u levak za odvajanje koji sadrži EtOAc (300 mL). Smeša se protrese i slojevi se odvajaju. Vodeni sloj se ekstrahuje sa EtOAc (3 x 150 mL) i kombinovani organski slojevi se operu sa H20 i zasićenim rastvorom soli. Organski sloj se osuši, filtrira i koncentruje da bi se dobio prinos mrkog ulja koje se stavlja pod visoki vakuum. Dobijena mrka pena se triturira sa MeOH i formirani precipitat se filtrira i opere sa MeOH. Dobijena bledo žuta čvrsta materija se prečišćava pomoću hiralne HPLC da bi se dobio prinos bele čvrste materije (3,23 g).

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 11,36 (s, 1); 10,02 (s, 1); 9,04 (s, 1); 8,38 (d, 1); 8,22 - 8,21 (m, 1); 8,15 (d, 1); 7,91 - 7,90 (m, 1); 4,00 (dd, 1); 3,85 - 3,81 (m, 1); 3,69 - 3,58 (m, 2); 2,99 - 2,95 (dd, 1); 2,89 - 2,85 (m, 1); 2,32 (s, 3); 2,32 - 2,24 (m.1).

NH4OACstandardni uslovi.

DAD Rf = 1,89 min.

M+H = 345.

Hiralna preparativna HPLC: 10% v/v EtOH/Heksani.

Chiralcel OD kolona.

Rf = 11,5-14 min.

Enantio čistoća proizvoda > 99% ee.

POSTUPAK C: POSTUPAK ZA 4- MORFOLIN SUPSTITUISANE ANALOGEKao

što je naglašeno zaINTERMEDIJER 34, INTERMEDIJER 35i PRIMER 20:INTERMEDIJER 34: terc- butil estar 3( S)-( 6- hloro- 9H-/ 3- karbolin- 8- ilkarbamoil)-morfolin- 4- karboksilne kiseline

Rastvor 4-terc-butil estra morfolin-3(S),4-dikarboksilne kiseline (2,83 g, 12,7 mmol) u piridinu (106 mL) se meša na RT. Dodaje se 6-hloro-9H-3-karbolin-8-ilamin (2,30 g, 10,6 mmol), i zatim EDCI (4,06 g, 21,2 mmol). Bistri oranž mrk rastvor se meša na RT tokom 14 h. Rastvor se razblaži sa H20 (120 mL) i sipa u levak za odvajanje koji sadrži EtOAc (200 mL), H20 (100 mL) i zasićen rastvor soli (100 mL). Smeša se trese i slojevi se odvoje. Vodeni sloj se ekstrahuje sa EtOAc (2 x 50 mL) i kombinovani organski slojevi se operu sa zasićenim rastvorom soli. Organski sloj se osuši, filtrira i koncentruje da bi se smanjila zapremina, i zatim se ukapavanjem dodaje u rastvor 1:1 Et20/heksani (500 mL) koji se meša. Precipitat koji se formira se filtrira i opere sa 1:1 Et20/Heksani. Filtrat se koncentruje da bi se smanjila zapremina i druga grupa precipitata se pokupi. Čvrsta materija se stavi pod visok vakuum tokom 2 h da bi se dobio prinos terc-butil estra 3(S)-(6-hloro-9H-B-karbolin-8-ilkarbamoil)-morfolin-4-karboksilne kiseline u obliku bledo žute do bledo mrke čvrste materije (4,36 g).

1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 11,30 (s, 1); 10,13 (s, 1); 9,06 (s, 1); 8,40-8,38 (m, 1); 8,19 - 8,16 (m, 2); 7,98 (s, 1); 4,67 - 4,47 (m, 2); 3,96 - 3,60 (m, 2); 3,64 - 3,39 (m, 3); 1,42 (s, 9).

NH40AC standardni uslovi.

DAD Rf = 2,31 min.

M+H = 431.

INTERMEDIJER 35: terc- butil estar 2( R)-[ 3( S)-( 6- hloro- 9H- p- karbolin- 8-

ilkarbamoil)- morfolin- 4- ilmetil]- pirolidin- 1- karboksilne kiseline

Rastvor terc-butil estra 3(S)-(6-hloro-9H-B-karbolin-8-ilkarbamoil)-morfolin-4-karboksilne kiseline (1,00 g, 2,32 mmol) u CH2CI2(6 mL) se meša na RT. Dodaje se trifluorosirćetna kiselina (6 mL) i rastvor se meša na RT tokom 45 min, i zatim koncentruje do ostatka. Ostatak se koncentruje još jednom iz CH2CI2da bi se dobio prinos žuto mrke čvrste materije koja se rastvori u THF (13 mL) pod argonom. Ponekad je potrebno lagano zagrevanje da bi se obezbedilo kompletno rastvaranje. Dodaje se rastvor N-(terc-butoksikarbonil)-D-prolinala (693 mg, 3,48 mmol) u THF (2 mL), i zatim natrijum triacetoksiborohidrida (738 mg, 3,48 mmol). Rastvor se meša na RT tokom 30 min, i zatim umiri dodavanjem 1M vodenog rastvora NaOH (30 mL). Smeša se sipa u levak za odvajanje koji sadrži EtOAc (100 mL), H20 (100 mL), i zasićeni rastvor soli (100 mL). Smeša se protrese i razdvoje se slojevi. Vodeni sloj se ekstrahuje sa EtOAc (2 x 50 mL) i kombinovani organski slojevi se operu sa zasićenim rastvorom soli. Organski sloj se osuši, filtrira i koncentruje da bi se dobio prinos svetio mrke čvrste materije. Hromatografijom u koloni (2%-4% MeOH/CH2CI2) se dobija prinos terc-butil estra 2(R)-[3(S)-(6-Hloro-9H-3-karbolin-8-ilkarbamoil)-morfolin-4-ilmetil]-pirolidin-1-karboksilne kiseline u obliku bele čvrste materije (915 mg).

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 11,30 (s, 1); 9,88 (s, 1); 9,04 (s, 1); 8,39 - 8,37 (m, 1); 8,20 - 8,15 (m, 2); 7,95 (s, 1); 3,99 - 3,82 (m, 3); 3,69 - 3,63 (m, 2); 3,44 - 3,32 (m, 1); 3,27 - 3,11 (m, 3); 2,92 - 2,80 (m, 1); 2,44 - 2,32 (m, 1); 1,99 - 1,67 (m, 5); 1,33 (s, 9).

HCOOH standardni uslovi.

DAD Rf = 1.3 9 min.

M+H = 514.

Hiralna HPLC.

Proverava se enantio čistoća uzorka. Uzorci su 97% ee. Chiralpak AD kolona. 15% vol/vol EtOH/Heksani koji sadrže 0,1% Et2NH.

PRIMER 20: ( 6- hloro- 9H- g- karbolin- 8- il)- amid 4- pirolidin- 2( R)- ilmetil- morfolin-3( S)- karboksilne kiseline HCI so

U rastvor terc-butil estra 2 (R)-[3(S)-(6-hloro-9H-B-karbolin-8-ilkarbamoil)-morfolin-4-ilmetil]-pirolidin-1-karboksilne kiseline (850 mg, 1,65 mmol) u MeOH (16 mL) dodaje se koncentrovani vodeni rastvor HCI (13 mL). Rastvor se meša na RT tokom 30-45 min, za koje vreme se stvori fini žuti precipitat. Reakciona smeša se koncentruje da bi se dobio prinos (6-hloro-9H-B-karbolin-8-il)-amida 4-pirolidin-2(R)-ilmetil-morfolin-3(S)-karboksilne kiseline HCI so u obliku bledo žute čvrste materije (755 mg).

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) : 5. 13,30 (s, 1); 11,56 (br s, 1); 9,63 (br s, 1); 9,46 (s, 1); 8,87 - 8,85 (m, 1); 8,66 -8,57 (m, 2); 8,25 (s, 1); 4,38 - 4,26 (m, 1); 4,24 - 4,08 (m, 1); 4,04 - 3,86 (m, 2); 3,86 - 3,68 (m, 2); 3,57 - 3,39 (m, 1); 3,39 - 3,02 (m, 4); 2,99 -2,76 (m, 1); 2,10 - 1,84 (m, 3) ; 1,75 - 1,56 (m, 1) .

HCOOH standardni uslovi.

DAD Rf = 0,81 min.

M+H =414.

INTERMEDIJER 36: ( 6- hloro- 9H- karbolin- 8- il) amid cis- 2-( terc-

butoksikarbonilamino)- ciklopentankarboksilne kiseline

Rastvor cis-2-(terc-butoksikarbonilamino)-ciklopentan karboksilne kiseline (550 mg, 2,4 mmol) u piridinu (10 mL) se meša na RT. Dodaje se 6-hloro-9H-B-karbolin-8-ilamin (436 mg, 2,0 mmol), i zatim EDCI (615 mg, 3,2 mmol), i oranž rastvor se meša na RT tokom 1,5 h. Rastvor se razblaži sa H20 (20 mL) i i sipa u levak za odvajanje koji sadrži H20 (50 mL) i EtOAc (100 mL). Smeša se trese i slojevi se odvoje. Vodeni sloj se ekstrahuje sa EtOAc (100 mL). Kombinovani organski slojevi se operu sa zasićenim rastvorom soli, osuše preko MgS04, filtriraju, i koncentruju do oranž uljastih čvrstih materija koje se zatim trituriraju sa 5% MeOH u Et20 (20 mL) i pokupe filtriranje da bi se dobio prinos (6-hloro-9H-karbolin-8-il) amida cis-2-(terc-butoksikarbonilamino)-ciklopentankarboksilne kiseline u obliku svetio žute čvrste materije (740 mg).

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 11,17 (s, 1); 9,89 (s, 1); 9,04 (s, 1); 8,36 (d, 1); 8,18 - 8,08 (m, 2); 7,95 (s, 1); 6,92 (d, 1); 4,32 - 4,22 (m, 1); 3,16 - 3,09 (m, 1); 2,13 -2,01 (m, 1); 1,96 - 1,75 (m, 3); 1,74 - 1,59 (m, 1); 1,58 -1,42 (m, 1) ; 1,07 (s, 9).

NH4OAc standardni uslovi.

DAD Rf = 2,52 min.

M+H = 429.

PRIMER 21: ( 6- hloro- 9H-( 3- karbolin- 8- il)- amid cis- 2- amino- ciklopentankarboksilne

kiseline

Rastvor (6-hloro-9H-S-karbolin-8-il) amida 2-(terc-butoksikarbonilamino)-ciklopentankarboksilne kiseline (736 mg, 1,72 mmol) u trifluorosirćetnoj kiselini (5 mL) se meša na RT tokom 20 min, i zatim koncentruje do oranž ulja. Ulje se rastvori u MeOH (5 mL) i neutrališe sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (25 mL). Dobijena smeša se dalje razblaži sa H20 (25 mL) i EtOAc (100 mL). Vodeni sloj se uklonio i ekstahuje sa EtOAc (100 mL). Organski slojevi se kombinuju, operu sa zasićenim rastvorom soli, osuše preko MgS04, filtriraju i koncentruju do žutih čvrstih materija (507 mg). Ove čvrste materije se rastvore u MeOH (5 mL) i dodaje se rastvor HCI u dioksanu (4 M, 1,5 mL). Jarko žut rastvor se meša 30 min, i zatim koncentruje da bi se dobio prinos (6-hloro-9H-B-karbolin-8-il)-amida cis-2-amino-ciklopentankarboksilne kiseline u obliku žutog praha (600 mg).

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 9,29 (s, 1); 8,75 (d, 1); 8,53 (d, 1); 8,37 (s, 1); 8,02 (s, 1); 4,05 - 3,95 (m, 1); 3,42 - 3,34 (m, 1); 2,46 - 1,80 (m, 6).

NhUOAc standardni uslovi.

DAD Rf = 1,65 min.

M+H = 329.

PRIMER 22: ( 6- hloro- 9H- B- karbolin- 8- il)- amid 4-( 2- amino- etil)- morfolin- 3-

karboksilne kiseline, HCI so

Prati sepostupak C upotrebomracemske morfolin-3-karboksilne kiseline reduktivno alkilovane sa 2-aminoacetaldehidom.

<1>H-NMR (300 MHz, MeOH-d4): 5 9,37 (s, 1); 8,76 (d, 1); 8,55 (d, 1); 8,44 (d, 1); 8,06 (d, 1); 4,68 - 4,55 (m, 2); 4,17 - 3,99 (m, 3); 3,84 - 3,73 (m, 2); 3,57 - 3,39 (m, 4).

NH4OACstandardni uslovi.

DAD Rf = 1,69 min.

M+H = 374.

PRIMER 23: ( 6- hloro- 9H- B- karbolin- 8- il)- amid 4- f2( SVamino- propil)- morfolin-3( S)- karboksilne kiseline, HCI so ( prvo eluiranie diastereomera)

Prati sepostupak C upotrebomracemske morfolin-3-karboksilne kiseline reduktivno alkilovane sa odgovarajućim alanin aldehidom. Diastereomeri se razdvoje hromatografijom u koloni pre koraka uklanjanja zaštite.

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 9,32 (s, 1); 8,76 (d); 8,55 (d, 1); 8,41 (s, 1); 8,08 (s, 1); 4,38 (d, 1); 4,32 - 4,21 (m, 1); 4,16 - 4,09 (m, 1); 4,04-3,95 (m, 2); 3,79-3,57 (m, 2); 3,47 - 3,40 (m, 1); 3,22 - 3,05 (m, 2); 1,44 (d, 3).

NH4OAc standardni uslovi.

DAD Rf = 1,38 min.

M+H = 388.

PRIMER 24: ( 6- hloro- 9H- B- karbolin- 8- il)- amid 4-( 2( S)- amino- propil)- morfolin-3( R)- karboksilne kiseline, HCI so ( drugo eluiranie diastereomera)

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 9,34 (s, 1); 8,77 (d, 1); 8,55 (d, 1); 8,42 (s, 1);

8,06 (s, 1); 4,42 (d, 1); 4,30 - 4,12 (m, 1); 4,07 - 3,92 (m, 3); 3,89 - 3,74 (m, 1); 3,65 - 3,49 (m, 1); 3,25 - 2,90 (m, 3); 1,36 (d, 3).

NH4OAC standardni uslovi.

DAD Rf = 1,57 min.

M+H = 388.

PRIMER 25: ( 6- hloro- 9H- B- karbolin- 8- il)- amid 2- amino- cikloheksankarboksilne

kiseline

Rastvor cis-2-(terc-butoksikarbonilamino)-cikloheksan karboksilne kiseline (255 mg, 1,05 mmol) u piridinu (10 mL) se meša na RT. Dodaje se 6-hloro-9H-B-karbolin-8-ilamin (218 mg, 1,00 mmol), i zatim EDCI (315 mg, 1,64 mmol) i blago magličast oranž rastvor se meša na RT tokom 16 h. Rastvor se razblaži sa H2O (20 mL) i sipa u levak za odvajanje koji sadrži H20 (50 mL) i EtOAc (50 mL). Smeša se trese i slojevi se odvoje. Vodeni sloj se ekstrahuje sa EtOAc (50 mL) i kombinovani organski slojevi se operu sa zasićenim rastvorom soli. Organski sloj se osuši, filtrira i koncentruje da bi se dobio prinos žutog ulja koje se stavlja pod visok vakuum tokom 4 h. Dobijeno žuto mrko staklo se gusto suspenduje u CH2CI2(10 mL) na RT. Trifluorosirćetna kiselina (5 mL) se dodaje i gusta suspenzija se odmah rastvori da bi se stvorio bistri oranž rastvor. Rastvor se meša na RT tokom 45 min, i zatim koncentruje do mrkog ostatka. Ostatak se azeotropski uparava iz toluena (3x10 mL) da bi se dobio prinos žute materije. Razblaženi vodeni rastvor Na2C03se dobija dodavanjem male količine 10% vodenog rastvora Na2C03u H20 (50 mL) dok vodeni rastvor ne dostigne pH 10. Žuta čvrsta materija se rastvori u minimalnoj količini MeOH i ukapavanjem se dodaje u vodeni rastvor uz mešanje. Stvoreni precipitat se filtrira, opere sa H20 i stavi pod snažan vakuum da bi se dobio prinos (6-hloro-9H-B-karbolin-8-il)-amida 2-amino-cikloheksankarboksilne kiseline u obliku bledo žute čvrste materije (147 mg).

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 9,00 (s, 1); 8,37 - 8,34 (m, 1); 8,16 - 8,13 (m, 2); 7,83 (m, 1); 5,66 - 5,00 (br s, 2); 3,42 - 3,40 (m, 1); 2,70 - 2,62 (m, 1); 2,02 - 1,90 (m, 1); 1,70-1.64 (m, 5); 1,42 - 1,29 (m, 2).

NH4OAC standardni uslovi.

DAD Rf= 1,46 min.

M+H = 343.

PRIMER 26: ( 6- hloro- 9H- 3- karbolin- 8- il)- amid 4-( 2( R)- amino- propin- morfolin-3( S)- karboksilne kiseline, HCI so

Prati sepostupak C upotrebomracemske morfolin-3-karboksilne kiseline reduktivno alkilovane sa odgovarajućim alanin aldehidom. Diastereomeri se odvoje hromatografijom u koloni pre koraka uklanjanja zaštite.

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 9,35 (s, 1); 8,77 (m, 1); 8,55 (m, 1); 8,43 (s, 1); 8,01 (s, 1); 4,45 (d, 1); 4,26 (m, 1); 4,09-3,91 (m, 3); 3,79 (m, 1); 3,63 (m, 1); 3,28-2,99 (m, 3); 1,37 (d, 3).

NH4OAC standardni uslovi.

DAD Rf = 1,39 min.

M+H = 388.

PRIMER 27: ( 6- hloro- 9H- 3- karbolin- 8- in- amid 4-( 2( R)- amino- 3- fenil- propil)-morfolin- 3( S)- karboksilne kiseline. HCI so

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 6 9,34 (s, 1); 8,77 (d, 1); 8,55 (d, 1); 8,42 (s, 1); 8,04 (s, 1); 7,44 - 7,23 (m, 5); 4,39 (d, 1); 4,65 - 4,07 (m, 1); 4,40 - 3,82 (m, 4); 3,50 - 3,25 (m, 1); 3,30 - 3,14 (m, 1); 3,11 - 2,88 (m, 3); 2,85 - 2,69 (m, 1). NH4OAC standardni uslovi.

DAD Rf = 1,90 min.

M+H = 464.

POSTUPAK D: Uslovi hromatografije

LCMS

Tip kolone: Phenomenex Luna C18(2) columns, 5 um, veličina 50 x 4,6 mm Vreme trajanja: 5,00 minuta

NH4OACUslovi:

RastvaračA: 10 mM NH4OAC 99% H20 1% MeCN

Rastvarač B: 10 mM NH4OAC 5% H20 95% MeCN

Standardni gradijent:

Inicijalni uslovi - 95% A, 5% B

3,5 minuta gradijent od 5%-100% B

3,5 - 4,3 minuta zaustavljanje na 100% B 4,3-5 minuta inicijalni uslovi

Polarni gradijent:

Inicijalni uslovi - 70% A, 30% B

3,5 minuta gradijent od 70%-100% B 3,5 - 4,3 minuta održavanje na 100% B 4,3-5 minuta inicijalni uslovi

Nepolarni gradient:

Inicijalni uslovi -100% A

3,5 minuta gradijent od 0%-50% B

3,5 - 4,3 održavanje na 100% B

4,3-5 minuta inicijalni uslovi

HCOOH uslovi:

rastvarač C: 0,1% HCOOH 99% H20 1% MeCN rastvarao D: 0,1% HCOOH 5% H20 95% MeCN

Standardni gradijent:

inicijalni uslovi - 95% C, 5% D

3,5 minuta gradient od 5%-100% D

3,5 - 4,3 minuta održavanje na 100% D 4,3-5 minuta inicijalni uslovi

Polarni gradijent:

inicijalni uslovi - 70% C, 30% D

3,5 minuta gradient od 70%-100% D

3,5 - 4,3 minuta održavanje na 100% D

4,3-5 minuta inicijalni uslovi

Nepolarni gradient:

inicijalni uslovi -100% C

3,5 minuta gradient od 0%-50% D

3,5 - 4,3 minuta održavanje na 100% D

4,3-5 minuta inicijalni uslovi

INTERMEDIJER 37: 6- hloro- 2, 3, 4, 9- tetrahidro- 1H- l3- karbolin, HCI so

5- hiorotriptamin hidrohlorid (5 g, 20 mmol, 1 equiv.) se rastvori u 40 mL 3M NaOAc pufera (pH = 4,8) i 40 mL vode. Dodaje se glioksalna kiselina (1,84 g, 20 mmol, 1 equiv.) u jednoj porciji i rastvor se meša na RT preko noći. Dobijena gusta suspenzija se filtrira i svetio zelene čvrste materije se suspenduju u 100 mL 6M HCI i zagrevaju na 125°C pod refluksnim kondenzatorom tokom 1 h sa povremenim dodavanjem koncentrovane HCI (2 mL svakih 15 min). Nakon hlađenja do RT, filtriranjem se izoluje 4,38 g (90%) 6-hloro-2,3,4,9-tetrahidro-1H-8-karbolin, HCI so u obliku plavo sive čvste materije.

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 11,33 (br, 2H) , 9,62 (br, 2H) , 7,53 (d, 1), 7,39 (d, 1), 7,09 (dd, 1), 4,33 (br, 2H), 2,92 (t, 2)

Mravlja kiselina standardni uslovi.

DAD RT = 1,56 min.

M+H = 207.

INTERMEDIJER 38: ( 6- hloro- 1, 3, 4, 9- tetrahidro- p- karbolin- 2- il)- fenil- metanon

6- hloro-2,3,4,9-tetrahidro-1H-S-karbolin, HCI so (10,2 g, 42 mmol, 1 equiv.) se suspenduje u 100 mL suvog piridina pod N2i ohladi do 0°C u ledenom kupatilu. U hladan rastvor se ukapavanjem dodaje benzoil hlorid (7,3 mL, 63 mmol, 1,5 equiv.) nakon čega se reakcija ukloni iz ledenog kupatila i ostavlja da se meša preko noći na sobnoj temperaturi. Reakcija se umiri sa dodavanjem vode dok se ne uguši sa čvrstim materijama. Ove čvrste materije se uhvate filtriranjem, operu sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata, re-suspenduju u vodi, tretiraju ultrazvukom, i refiltriraju da bi se dobilo 1.27 g (94%) (6-hloro-1,3,4,9-tetrahidro-(3-karbolin-2-il)-fenil-metanona u obliku kristalne oranž čvrste materije.

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 10,65 - 10,59 (br, 1H), 7,0 -7,5 (m, 9H), 4,60 - 4,83 (br, 2H), 3,62 - 3,99 (br, 2H), 2,75 (br„ 2H).

Mravlja kiselina standardni uslovi.

DAD RT = 2,68 min.

M+H = 311.

INTERMEDIJER 39: 2- benzoil- 6- hloro- 1, 2, 3, 9- tetrahidro- f5- karbolin- 4- on

(6-hloro-1,3,4,9-tetrahidro-3-karbolin-2-il)-fenil-metanon (1,76 g, 5,66 mmol, 1 equiv,) i DDQ (2,31 g, 10,2 mmol, 1,8 equiv,) se mešaju kao čvrste materije i ohlade do -78°C. 15 mL 9:1 THF/H20 rastvora se ohladi do -78°C i dobijena gusta suspenzija se dodaje u ohlađene čvrste materije, i zatim se dodaje dodatnih 15 mL THF (takođe ohlađen na -78°C). Tamno plavi rastvor se meša na

-78"C tokom 2 h i zatim postepeno zagreva do sobne temperature i meša tokom dodatna 2 h. Reakcija se umiri dodavanjem 1M NaOH, i ekstrahuje sa 3 x 150 mL EtOAc. Kombinovani organski slojevi se operu sa 2 x 100 mL 1M HCI, 1 x 100 mL zasićenog rastvora soli, osuše preko MgS04, filtriraju i koncentruju da bi se dobio prinos 1,38 g (75%) 2-benzoil-6-hloro-1,2,3,9-tetrahidro-3-karbolin-4-ona u obliku oranž čvrstih materija. <1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 12,11 - 12,48 (br, 1H), 7,29 -7,88 (m, 8H), 4,93 - 5,18 (br, 2H), 4,60 - 4,46 (br, 2H).

Tačna masa: 324,07.

Mravlja kiselina standardni uslovi

DAD RT = 2,15 min.

M+H = 325.

INTERMEDIJER 40: 4- amino- 6- hloro- p- karbolin

Sirov 2-benzoil-6-hloro-1,2,3,9-tetrahidro-S-karbolin-4-on (4 g) se rastvori u 30 mL bezvodnog hidrazina i meša na refluksu (130°C uljno kupatilo) pod N2 tokom 6 h, nakon čega se reakciona smeša ostavi da se ohladi do sobne temperature i ostavi da odstoji preko noći. Žute čvrste materije kao precipitat se uklone filtriranjem i operu sa vodom, 2x5 mL, da bi se dobio prinos 785 mg (30%) 4-amino-6-hloro-3-karbolina u obliku beličaste čvrste materije. Dodatna voda se dodaje kombinovanim filtratima sve dok ne prestane odvajanje precipitata. Ove čvrste materije se takođe ukone filtriranjem da bi se dobilo 1,056 g (39%) 4-amino-6-hloro-3-karbolina u obliku žutih čvrstih materija (69% ukupni prinos).<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 11,48 (s, 1H), 8,44 (s, 1H), 8,13 (s, 1H), 7,77 (s,1H), 7,42-7,52 (m, 2H), 5,86 (s, 2H).

Mravlja kiselina standardni uslovi.

DAD RT = 1,68 min.

M+H = 218.

INTERMEDIJER 41: N-( 6- hloro- 9H- f3- karbolin- 4- il)- 2, 2, 2- trifluoro- acetamid

4-amino-6-hloro-(3-karbolin (1,05 g, 4,82 mmol, 1 equiv.) se rastvori u 4 mL bezvodnog piridina i 20 mL THF i ohladi do 0°C pod N2. Trifluorosirćetni anhidrid (3,4 mL, 24 mmol, 5 equiv.) se dodaje ukapavanjem u ohlađeni rastvor. Nakon što se završi dodavanje, reakcija se uklanja iz ledenog kupatila i meša se na sobnoj temperaturi tokom 1,5 h. Reakcija se umiri laganim dodavanjem vode (10 mL) i ekstrahuje sa 2 X 150 mL EtOAc, opere sa 2 x 100 mL zasićenog vodenog rastvora natrijum bikarbonata, 1 x 100 mL zasićenog rastvora soli, osuši preko MgS04, filtrira i koncentruje do oranž čvrstih materija. Ove čvrste materije se trituriraju sa 10 -15 mL Et20 i pokupe filtriranjem da bi se dobilo 1,23 g (81%) N-(6-hloro-9H-p-karbolin-4-il)-2,2,2-trifluoro-acetamida u obliku žute čvrste materije.<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 12,11 (s, 1H), 11,89 (s, 1H), 8,92 (s, 1H), 8,33 (s, 1H), 7,82 (s, 1H), 7,60-7,70 (m, 2H).

Mravlja kiselina standardni uslovi.

DAD RT = 2,12 min.

M+H = 314.

INTERMEDIJER 42: N-( 6- hloro- 8- nitro- 9H- f3- karbolin- 4- il)- 2f 2, 2- trifluoro- acetamid

N-(6-hloro-9H-3-karbolin-4-il)-2,2,2-trifluoro-acetamid (125 mg, 0,4 mmol, 1 equiv.) se rastvori u 2 mL TFA i dodaje se NaN02(541 mg, 7,84 mmol, 2 equiv.) u jednoj porciji. Rastvor se meša na sobnoj temperaturi tokom 4 h. Isparljive materije se uklanjaju u rotacionom evaporatoru i dobijene uljaste čvrste materije se suspenduju u vodi, neutrališu sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata i filtriraju da bi se dobilo 132 mg (92%) N-(6-hloro-8-nitro-9H-3-karbol in-4-i I )-2,2,2-trif I uoro-acetam i da.

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 12,87 (s, 1H), 12,03 (s, 1H), 9,11 (s, 1H), 8,56 (s, 1H), 8,53 (s, 1H),8,26(s, 1H).

Mravlja kiselina standardni uslovi.

DAD RT = 2,27 min.

M+H = 359.

INTERMEDIJER 43: N-( 8- amino- 6- hloro- 9H- l3- karbolin- 4- il)- 2, 2, 2- trifluoro- acet

amid

Sirov N-(6-hloro-8-nitro-9H-p-karbolin-4-il)-2,2,2-trifluoro-acetamid (130 mg, 0,36 mmol) se rastvori u 7 mL MeOH i reakcioni sud se vakumski produva 3 X sa N2. Brzo se dodaje platina (20 mg, 20% mas. na aktivnom uglju) i reakcioni sud se ponovo produva 3 X sa N2, i nakon toga sa 3 dodatna ciklusa vakuumskog produvavanja sa H2. Reakcija se ostavlja da se meša po H2na 1 bar preko noći. Nakon završetka, iz reakcionog suda se izduva H2i filtrira preko celite. Celite se opere nekoliko puta sa metanolom do bistrog filtrata. Kombinovani filtrati se koncentruju da bi se dobio N-(8-amino-6-hloro-9H-p-karbolin-4-il)-2,2,2-trifluoro-acetamid u obliku žute čvrste materije (112 mg, 95%).

1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 6 11,83 (s, 1H), 8,98 (s, 1H), 8,30 (s, 1H), 7,10 (s, 1H), 6,82 (s, 1H), 5,87 (br, 2H).

Mravlja kiselina standardni uslovi.

DAD RT = 1,95 min.

M+H = 329.

INTERMEDIJER 44: N-[ 6- hloro- 4-( 2, 2, 2- trifluoro- acetilamino)- 9H-^- karbolin- 8- il]-2- metil- nikotinamid

N-(8-amino-6-hloro-9H-p-karbolin^-il)-2,2,2-trifluoro-acetamid (90 mg, 0,274 mmol, 1 equiv.) i 2-metilnikotinska kiselina (45 mg, 0,329 mmol, 1,2 equiv.) se rastvore u 1.5 mL bezvodnog piridina pod N2. Dodaje se EDCI (84 mg, 0,438 mmol, 1,6 equiv.) u jednoj porciji i reakciona smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 2 h. Reakcija se umiri sa vodom i dobijene tamne čvrste materije se pokupe filtriranjem. Ove čvrste materije se trituriraju u 3:1 metanol-DMSO rastvoru da bi se dobio N-[6-hloro-4-(2,2,2-trifluoro-acetilamino)-9H-8-karbolin-8-il]-2-metil-nikotinamid u obliku svetio žutih čvrstih materija (41 mg, 3%).

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 11,94 (br, 1H), 11,78 (s, 1H), 10,61 (s, 1), 9,00 (s, 1), 8,64 (d, 1), 8,38 (s, 1H), 8,13 (d, 1), 8,01 (s, 1H), 7,73 (s, 1H), 7,45 (m, 1H), 2,68 (s, 3H).

Mravlja kiselina standardni uslovi.

DAD RT = 1,98 min.

M+H =448.

INTERMEDIJER 45: /V-f6-rl/oro-4-(2/^2-^^/f/wo^o-acef/7am/^o^9H-^-/ca^/?o//^-8-^ -

nikotinamid

N-(8-amino-6-hloro-9H-B-karbolin-4-il)-2,2,2-trifluoro-acetamid (90 mg, 0,274 mmol, 1 equiv.) i 2-metilnikotinska kiselina (40 mg, 0,329 mmol, 1,2 equiv.) se rastvore u 1,5 mL bezvodnog piridina pod N2. Dodaje se EDCI (84 mg, 0,438 mmol, 1,6 equiv.) u jednoj porciji i reakciona smeša se meša na sobnoj temperaturi 2 h. Reakcija se umiri i tretira prateći prethodni protokol da bi se dobilo 38 mg (32%) N-[6-hloro-4-(2,2,2-trifluoro-acetilamino)-9H-3-karbolin-8-il]-nikotinamida.

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 11,89 (br, 1H), 10,73 (s, 1), 9,28 (s, 1), 8,97 (s, 1), 8,84 (d, 1), 8,43 (d, 1), 8,37 (s, 1), 7,85 (s, 1), 7,76 (s, 1), 7,67 (m, 1).

Mravlja kiselina standardni uslovi.

DAD RT = 1,94 min.

M+H = 434.

PRIMER 28: N-( 4- amino- 6- hloro- 9H- g- karbolin- 8- in- 2- metil- nikotinamid

N-[6-hloro-4-(2,2,2-trifluoro-acetilamino)-9H-3-karbolin-8-il]-nikotinamid (41 mg, 0,092 mmol, 1 equiv.) se suspenduje u 5 mL MeOH i u nju se dodaje 2 mL vodenog rastvora K2C03(127 mg, 0,92 mmol, 10 equiv.). Dobijeni bistri rastvor se zagreva na 60°C tokom 16 h i zatim se ostavlja da se ohladi do RT. Dodatna voda se dodaje i dobijaju se fine čvrste materije koje se pokupe filtriranjem, operu jednom sa 10 mL 5% MeOH u Et20, i osuše pod visokim vakuumom da bi se dobilo 18 mg N-(4-amino-6-hloro-9H-3-karbolin-8-il)-2-metil-nikotinamida u obliku praškastih žutih čvrstih materija (56% prinos).

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 6 11,18 (s, 1H), 10,41 (s, 1H), 8,62 (d, J = 3,6,

1H), ), 8,32 (s, 1H) , 8,20 (s, 1H) , 8,11 (d, J = 7,5, 1H), 7,91 (s, 1H), 7,79 (s, 1H) , 7,43 (m, 1H), 5,91 (br, 2H), 2,66 (s, 3H).

Mravlja kiselina standardni uslovi.

DAD RT = 1,63 min.

M+H = 352.

PRIMER 29: N-( 4- amino- 6- hloro- 9H- B4<arbolin- 8- il)- nikotinamid

N-[6-hloro-4-(2,2,2-trifluoro-acetilamino)-9H-3-karbolin-8-il]-nikotinamid (38 mg, 0,088 mmol, 1 equiv.) se suspenduje u 5 mL MeOH i u nju se dodaje 2 mL vodenog rastvora K2CO3(121 mg, 0,92 mmol, 10 equiv.). Dobijeni bistri rastvor se zagreva na 60°C tokom 11 h. Nakon hlađenja do RT, fine čvrste materije koje su kao precipitat pokupljene filtriranjem se operu sa 10 mL vode da se bi dobilo 2,78 mg (10%) N-(4-amino-6-hloro-9H-B-karbolin-8-il)-nikotinamida.

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 11,32 (s, 1H), 10,56 (s, 1H), 9,26 (s, 1H), 8,82 (d, 1), 8,42 (d, 1), 8,36 (s, 1H), 8,18 (s, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,64 (m, 1H), 5,91 (br, 2H).

Mravlja kiselina standardni uslovi.

DAD RT = 1,55 min.

M+H = 338.

INTERMEDIJER 46: terc- butil estar 3- cijanometil- indol- 1- karboksilne kiseline

Rastvor 3-indolacetonitrila (10 g, 64 mmol) u DMF (160 mL) se meša na RT. Dodaju mu se K2CO3(13,3 g, 96 mmol) i di-terc-butil dikarbonat (15,35 g, 70 mmol) i reakciona smeša se meša na RT tokom 12 h. U reakcionu smešu se dodaje H20 (100 mL) i dobijeni precipitat se uhvati filtriranjem. Čvrste materije se rastvore u vrućem metanolu (20 mL) i rastvor se ostavi da se polako ohladi, čime se dobijaju svetio oranž čvrste materije koje se izoluju filtriranjem da bi se dobio terc-butil estar 3-cijanometil-indol-1-karboksilne kiseline (9,2 g).

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 8,08 (d, 1); 7,70 - 7,66 (m, 2); 7,4 2 - 7,2 9 (m, 2); 4,12 (s, 2); 1,63 (3, 9).

NH4OACstandardni uslovi.

DAD Rf= 3,31 min.

M+H = 257.

INTERMEDIJER 41: terc- butil estar 3-( cijano- metil- metil)- indol- 1- karboksilne

kiseline

Rastvor terc-butil estra 3-cijanometil-indol-1-karboksilne kiseline (2,15 g, 8,39 mmol) u THF (40 mL) koji se meša se ohladi do -78°C u atmosferi argona. U njega se dodaje natrijum bis(trimetilsilil)amid (1M u THF, 10 ml, 10 mmol) i hladan rastvor se meša tokom 30 minuta. U njega se dodaje jodometan (627 uL, 10 mmol) i reakciona smeša se meša 1,5 h i postepeno se zagreva do 0°C. U nju se dodaje H20 (100 mL) i rastvor dovodi do RT i razblaži sa EtOAc (250 mL). Vodeni sloj se ukloni i ekstrahuje sa EtOAc (250 mL). Kombinovani organski slojevi se operu sa vodenim rastvorom HCI (IN, 3 x 50 mL), i zatim sa zasićenim rastvorom soli, zatim osuše preko MgS04, filtriraju, i koncentruju do oranž ulja. Prečišćavanjem hromatografijom u koloni (heksani:etilacetat) dobija se terc-butil estar 3-(cijano-metil-metil)-indol-1-karboksilne kiseline (1,8 g).

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 6 8,09 (d, 1); 7,73 (d, 1); 7,69 (s, 1); 7,74 - 7,29 (m, 2); 4,56 (q, 1); 1,66 (d, J = 7,2, 3); 1,63 (s, 9).

INTERMEDIJER 48: terc- butil estar 3-( 2- amino- 1- metil- metil)- indol- 1- karboksilne

kiseline

Rastvor terc-butil estra 3-(cijano-metil-metil)-indole-1-karboksilne kiseline (850 mg, 3,14 mol) u metanolu (15 mL) se meša na RT. U njega se dodaje Raney-Nickel katalizator (50% g/mas suspenzija u H20, 1 mL) i reakcioni vessel se poklopi i vakuumski produva 3 puta sa argonom, i zatim slično sa vodonikom. Smeša se meša 22 h pod 1 bar vodonika, vakumski produva sa argonom i filtrira kroz celite. Filtrat se koncentruje do ulja (670 mg) i LCMS-om se utvrđuje da se sastoji uglavnom od željenog jedinjenja terc-butil estra 3-(2-amino-1-metil-metil)-indol-1-karboksilne kiseline.

NH4OAc standardni uslovi.

DAD Rf= 1,78 min.

M+H = 275.

INTERMEDIJER 49: 4- metil- 2, 3, 4/ 9- tetrahidro- 1H-/ 3- karbolin- 1- karboksilne

kiseline

Sirov terc-butil estar 3-(2-amino-1-metil-metil)-indole-1-karboksilne kiseline (670 mg, approx. 2,44 mmol) se rastvori u trifluorosirćetnoj kiselini (2 mL) i meša 30 min na RT, zatim koncentruje do uljaste čvrste materije pod sniženim pritiskom. Dobijeno ulje se rastvori u 3M NaOAc.AcOH pufer rastvoru (pH =4,8, 12 mL) i H20 (6 mL) na RT. Glioksalna kiselina (225 mg, 2,44 mmol) se dodaje u njega i reakciona smeša se meša tokom 4 h na RT, i zatim koncentruje do suva. Za dobijene čvrste materije je LCMS-om utvrđeno da se uglavnom sastoje od željenog jedinjenja 4-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-B-karbolin-1-karboksilne kiseline i neposredno zatim se koristi bez prečišćavanja.

NH4OACstandardni uslovi.

DAD Rf= 1,24 min.

M+H = 231.

INTERMEDIJER 50: 4- metil- 2, 3, 4, 9- tetrahidro- 1H-^- karbolin

Sirova 4-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-8-karbolin-1-karboksilna kiselina (approx. 2,44 mmol) se suspenduje u H20 (5 mL) i HCI (12 N, 5 mL) i suspenzija se zagreva na 120°C tokom 1 h, i zatim ostavlja da se ohladi do RT. Tamno oranž mrke čvrste materije se uklanjaju filtriranjem i zatim rastvore u metanolu (5 mL). U njih se zatim dodaje zasićeni rastvor natrijum bikarbonata (20 mL), i dobija se gusta žuta suspenzija. Ova reakciona smeša se filtrira da bi se dobio prinos žutih čvrstih materija koje se sastoje uglavnom od 4-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-B-karbolina (386 mg) kako je utvrđeno LCMS.

NH4OACstandardni uslovi.

DAD Rf= 1,23 min.

M+H = 187.

INTERMEDIJER 51: 4- Metil- 9H-/ 3- karbolin

4-metil-2,3,4,9-tetrahidro-1H-B-karbolin (214 mg, 1,17 mmol) se suspenduje u ksilenima (10 mL). Pd (10% mas. na ugljeniku, 21 mg) katalizator se dodaje u nju i reakciona smeša se meša na 160°C tokom 24 h, i zatim se ohladi do RT i filtrira kroz celite. Filtrat se koncentruje do suva da bi se dobio 4-metil-9H-B-karbolin (210 mg).

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 11,73 (br s, 1); 8,78 (br s, 1); 8,19 (d, 1); 8,13

(s, 1); 7,62 (br s, 1); 7,53 (t, 1); 7,25 (t, 1); 2,78 (s, 3).

NH4OAc standardni uslovi.

DAD Rf= 2,2 4 min.

M+H = 183.

INTERMEDIJER 52: 6- Hlorc~ 4- metil- 9H- p- karbolin

4-metil-9H-(3-karbolin (97 mg, 0,532 mmol) se rastvori u HCI (1M, 4 mL) i meša na RT. U njega se dodaje NCS (85 mg, 0,637 mmol) i reakciona smeša se meša tokom 5 h. U nju se dodaje zasićeni rastvor natrijum bikarbonata (20 mL) i reakciona smeša se ekstrahuje dva puta sa EtOAc (100 mL). Kombinovani organski slojevi se operu sa zasićenim rastvorom soli, osuše preko MgS04, filtriraju, i koncentruju da bi se dobio 6-hloro-4-metil-9H-B4<arbolin (108 mg) u obliku ulja.

<1>H-NMR (300 MHz, DMS0-d6): 5 8,67 (s, 1); 8,19 (s, 1); 8,11 (s, 1); 7,57 - 7,54 (m, 2); 2,82 (s, 3).

NH4OAc standardni uslovi.

DAD Rf= 2,48 min.

M+H =217.

INTERMEDIJER 53: 6- hloro- 4- metil- 8- nitro- 9H- p- karbolin

Rastvor 6-hloro-4-metil-9H-S-karbolin (100 mg, 0,462 inmol) u trifluorosirćetnoj kiselini (10 mL) se meša na RT. U njega se dodaje NaN03(106 mg, 1,25 mmol) i reakciona smeša se meša 30 min, i zatim koncentruje da bi se dobio oranž ostatak. Ostatak se rastvori u MeOH (5 mL) i neutrališe dodavanjem zasićenog rastvora natrijum bikarbonata (20 mL) čime se formiraju žute čvrste materije koje se uhvate filtriranjem, operu sa H20 (10 mL) i Et20 (2x10 mL) da bi se dobio 6-hloro-4-metil-8-nitro-9H-B-karbolin (82 mg).

<1>H-NMR (300 MHz, DMS0-d6): 5 8, 90 (s, 1); 8,65 (s, 1); 8,55 (s, 1); 8,29 (s, 1); 2,89 (s, 3).

NH4OAc standardni uslovi.

DAD Rf= 3.00 min.

M+H = 262.

INTERMEDIJER 54: 6- hloro- 4- metil- 9H- f3- karbolin- 8- ilamin

Rastvor 6-hloro-4-metil-8-nitro-9H-(3-karbolina (80 mg, 0,31 mmol) u MeOH (10 mL) se meša na RT. U njega se dodaje platina (10% mas. na ugljeniku, 24 mg) katalizator i reakcioni sud se poklopi i vakuumski produva 3 puta sa argonom, i nakon toga slično sa vodonikom. Reakciona smeša se meša 1,5 h pod 1 atm vodonika, i zatim vakuumski produva sa argonom, razblaži sa DCM (10 mL) i filtrira kroz 0,2 uM špric filter. Filtrat se koncentruje da bi se dobio prinos 6-hloro-4-metil-9H-B-karbolin-8-ilamina (67 mg) u obliku svetio mrkog ulja.

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 9,04 (s, 1); 8,29 (s, 1); 7,74 (d, 1); 7,10 (d, 1); 2,98 (s, 3).

NH4OAc standardni uslovi.

DAD Rf= 1.89 min.

M+H = 231.

PRIMER 30: N-( 6- hloro- 4- metil- 9H- B- karbolin- 8- ilVnikotinamid

Rastvor 6-hloro-4-metil-9H-B-karbolin-8-ilamina (43 mg, 0,19 mmol) u piridinu (4 mL) se meša na RT pod atmosferom argona. U njega se dodaje nikotinoil hlorid hidrohlorid (40 mg, 0,22 mmol) i reakciona smeša se meša tokom 12 h. Rastvor se razblaži sa H20 (5 mL) i sipa u levak za odvajanje koji sadrži H20 (5 mL) i EtOAc (25 mL). Reakciona smeša se trese i slojevi se odvoje. Vodeni sloj se ekstrahuje sa EtOAc (2 x 25 mL). Kombinovani organski slojevi se operu sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata (15 mL), i zatim sa zasićenim rastvorom soli, i zatim osuše preko MgS04, filtriraju, i koncentruju da bi se dobio prinos N-(6-hloro-4-metil-9H-B-karbolin-8-il)-nikotinamida (5,2 mg) u obliku oranž viskoznog ulja.

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 11,67 (s, 1); 10,70 (s, 1); 9,27 (s, 1); 8,83 (s, 2); 8,45 (s, 1); 8,20-8,12 (m, 2); 7,83 (s, 1); 7,66 (s, 1); 2,80 (s, 3).

NH4OAC standardni uslovi.

DAD Rf = 1,92 min.

M+H = 337.

INTERMEDIJER 55: 4- terc- butil estar 1, 1- Dioksc~ 1A6- tiomorfolin- 3, 4-

dikarboksilne kiseline

4-terc-butil estar tiomorfolin-3,4-dikarboksilne kiseline (120 mg, 0,485 mmol) se rastvori u Et20 (8 mL). U rastvor se dodaje mCPBA (172 mg, 0,994 mmol), i zatim druga porcija mCPBA (84 mg, 0,485 mmol). Formirani precipitat se filtrira, opere sa Et20 i osuši da bi se dobio prinos bele čvrste materije 4-terc-butil estar 1,1-diokso-^6-tiomorfolin-3,4-dikarboksilne kiseline (74 mg).

PRIMER 31: ( 6- hloro- 9H- 3- karbolin- 8- ilVamid 1, 1- Diokso- 1A6- tiomorfolin- 3-

karboksilne kiseline

Gusta suspenzija 6-hloro-7-fluoro-9H-B-karbolin-8-ilamina (43 mg, 0,198 mmol), 4-terc-butil estra 1,1-diokso-1A<6->tiomorfolin-3,4-dikarboksilne kiseline (72 mg, 0,257 mmol), i EDCI (76 mg, 0,396 mmol) u piridinu (2 mL) se zagreva do 70°C. Nakon 1 h, rastvarač se uklanja pod sniženim pritiskom i dobijeno mrko ulje se rastvori u MeOH (1 mL). MeOH solution se dodaje ukapavanjem u rastvor vodenog NaHC03koji se meša i formira se žuti precipitat. Čvrste materije se filtriraju, osuše, i rastvore u 2M HCI u Et20. Nakon mešanja preko noći dobijena žuta čvrsta materija se filtrira i osuši da bi se dobio prinos žute čvrste materije, di-HCI soli (6-hloro-9H-(3-karbolin-8-il)-amida 1,1-Diokso-M<6->tiomorfolin-3-karboksilne kiseline (78 mg).

<1>H-NMR (300 MHz, MeOH-d4): 5 9,26 (s, 1); 8,74 (d, 1); 8,54 (d, 1); 8,37 (d, 1); 7,94 (d, 1); 5,01 (dd, 1); 4,15 -3,75 (m, 4); 3,64 - 3,58 (m, 2).

NH4OACstandardni uslovi.

DAD Rf = 1.57 min.

M+H = 379.

INTERMEDIJER 56: 4- terc- butil estar 6, 6- Dimetil- morfolin- 3, 4- dikarboksilne

kiseline

U suspenziju 6,6-dimetil-morfolin-3-karboksilne kiseline (5,56 g, 34,9 mmol) u dioksanu (58 mL) dodaje se vodeni rastvor kalijum karbonata (1M, 58 mL). U dobijeni bistar bezbojni rastvor se dodaje di-terc-butil dikarbonat (9,14 g, 41,9 mmol). Rastvor se meša na sobnoj temperaturi preko noći. Reakciona smeša se razblaži sa vodom (200 mL) i pH rastvora se potvrdi da je otprilike 7. Reakciona smeša se sipa u levak za odvajanje i ekstrahuje sa Et20 (2 x 100 mL) da bi se uklonio višak di-terc-butil dikarbonata. Vodeni sloj se zakiseli dodavanjem 6M vodenog rastvora HCI uz mešanje dok se ne dostigne pH 3. Smeša se brzo ekstrahuje sa Et20 (2 x 200 mL) i organski slojevi se kombinuju, osuše preko magnezijum sulfata, filtriraju, i koncentruju da bi se dobio prinos bistrog bezbojnog ulja. Ulje se rastvori u Et20 (50 mL), triturira sa heksanima (150 mL), i koncentruje da bi se dobio prinos bele čvrste materije. Čvrsta materija se stavlja na pumpu sa visokim vakuumom tokom nekoliko sati, nakon čega se dobija 8,85 g 4-terc-butil estra 6,6-dimetil-morfolin-3,4-dikarboksilne kiseline (97% prinos).

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 12,95 (s, 1); 4,35 ("dd", 1); 3,98 - 3,8 3 (m, 2); 3,48 ("dd", 1); 2,81 ("dd", 1); 1,39 ("dd", 9); 1,15 (s, 3); 1,08 ("dd", 3).

NH4OACstandardni uslovi.

DAD R( = 0,98 min.

M-H = 258.

INTERMEDIJER 57: terc- butil estar ( S)- 5-( 6- Hloro- 9H- 0- karbolin- 8- ilkarbamoil)-2, 2- dimetil- morfolin- 4- karboksilne kiseline

Željeno jedinjenje se dobija prema postupku C iz 6-hloro-9H-3-karbolin-8-ilamina i 4-terc-butil estra 6,6-dimetil-morfolin-3,4-dikarboksilne kiseline u prinosu od 87%.

<1>H-NMR (DMS0-d6, 300MHz) 5 11,33 (s, 1); 10,14 (s, 1); 9,05 (s, 1); 8,38 (d, 1); 8,21 (d, 1); 8,16 (d, 1); 7,94 (s, 1); 4,70 - 4,56 (m, 1); 4,25-4,14 (m, 1); 4,07 (dd, 1); 3,64-3,56 (m, 1); 3,30-3,14 (m, 1); 1,41 ("dd", 9); 1,21 (s, 3); 1,15 (s, 3). NH4OACstandardni uslovi.

DAD Rf = 1,84 min.

M+H = 459.

Chiral HPLC: > 95% ee.

Chiralpak AD column. 15% v/v EtOH/Heksans containing 0.1% Et2NH.

INTERMEDIJER 58: ( 6- hloro- 9H- beta- karbolin- 8- il)- amid [( S)- 4-(( S)- 2- Aminc~

propil)- 6, 6- dimetil- morfolin- 3- karboksilne kiseline trifluoroacetat so

Željeno jedinjenje se dobija upotrebom istog postupka kao za INTERMEDIJER 35 sa startom iz terc-butil estra (S)-5-(6-Hloro-9H-beta-karbolin-8-ilkarbamoil)-2,2-dimeti1-morfolin-4-karboksilne kiseline i upotrebom Boc-alaninala u koraku reduktivnog alkilovanja u prinosu od 60%.

<1>H-NMR (300 MHz, D20) : 5 1,16 (d, 3H) , 1,25 (s, 3H) , 1,28 (s, 3H), 2,41 (d, 1H), 2,59 (dd, 1H), 2,89 (dd, 1H), 2,95 (d, 1H), 3,35-3,50 (m, 2H), 3,95-4,15 (m, 2H), 7,59 (d, 1H), 7,97 (d, 1H), 8,11 (d, 1H), 8,30 (d, 1H), 8,40 (d, 1H) , 8, 94 (s, 1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,57 min. MS (M+H+): 416,2.

POSTUPAK E; Postupak kuplovanja upotrebom trifluorosirćetne soli (6-hloro-9H-beta-karbolin-8-il)-amid [(S)-4-((S)-2-Amino-propil)-6,6-dimetil-morfolin-3-karboksilne kiseline trifluorosirćetne soli (6-hloro-9H-beta-karbolin-8-il)-amid [(S>4-((S)-2-Amino-propil)-6,6-dimetil-morfolin-3-karboksilne kiseline (1,0 mmol), TBTU (1,2 mmols), kiselina (1,25 mmols) se kupluje sa i EfeN (4-6 mmols, basic pH) se stave u acetonitril (10 mL). Dobijena smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 4-15 h. Reakciona smeša se zatim podeli u EtOAc i 10% vodeni rastvor Na2C03. Odvojene vodene faze se zatim dalje ekstrahuju sa EtOAc. Kombinovani ekstrakti se uzastopno operu sa 10% vodenim rastvorom Na2C03i zasićenim rastvorom soli, osuše preko Na2S04i koncentruju u potpunosti. Ostatak se prečišćava na silicijum dioksidu (2-7%MeOH/CH2CI2) da bi se dobio odgovarajući proizvod.

PRIMER 39: ( 6- hloro- 9H- 6^ arbdin- 8šlVamid 6. 6- Dimetil- 442-( 2. 2. 2- trifluoro-

acetilamino)- propill- morfolin- 3- karboksilne kiseline:

(64iloro-9H-B-karbolin-8il)-amid 4-(2-Amino-propil>6, 6-dimetil-iTioilblin^karboksilne kiseline (3 CF3COOH so) (1,5g) se suspenduje u dihlorometanu (80 mL) zajedno sa 5 equivalents trietilamina. Dodaje se trifluorosirćetni anhidrid (56 uL, 2 eq.) i smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 1 h. Rastvarač se uklanja u rotacionom evaporatoru. Proizvod se prečišćava silika gel fleš hromatografijom (5% metanol / dihlorometan, proizvod Rf 0.3) da bi se dobio 1g.

<1>H-NMR (300 MHz, relativno na CDCI3pik na 7,3 ppm) 5 10 (s, 1H), 9,7 (d, 1H), 8,7 (s, 1H), 8,6 (s, 1H), 8,2 (d, 1H), 7,6 (s, 2H), 6,6 (s, 1H), 4,3 (m, 1H), 3,9 (m, 1H), 3,8 (t, 1H), 3,2 (m, 1H), 2,7-2,9 (m, 2H), 2,5 (m, 1H), 2,2 (d, 1 H), 1,4 (d, 3H), 1,3 (s, 3H), 1,2 (s, 3H).

LCMS (amonijum acetat standardni postupak)

Vreme zadržavanja = 1,84 min.

(M+ = 512;M" = 510).

PRIMER 40: ( 6- hloro- 9H- B- karbolin- 8- il)- amid 4-(( S)- 2- Acetilamino- propil)- 6, 6- dimetilmorfolin- 3-( S)- karboksilne kiseline

Željeni proizvod se dobija prema prethodnom primeru iz (6-hloro-9H-B4<arbolin-8il)-amida 4-(2-Amino-propil)-6,6-dimetil-morfolin-34<arboksilne kiseline (3 CF3COOH so) i sirćetnog anhidrida.

<1>H-NMR (300 MHz, metil-d3alkohol-d): 6 1,15 (d, 3H), 1,23 (s, 3H), 1,39 (s, 3H), 1,98 (s, 3H), 2,24 (d, 1H), 2,38 (m, 1H), 2,68 (m, 1H), 2,92 (d, 1H) , 3,24 (m, 1H) , 3,98 (m, 2H), 4,22 (m, H), 7,78 (d, 1H), 7,98 (m, 2H), 8,27 (d, 1H), 8,84 (s, 1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,54 min. MS(M+H<+>):458.

PRIMER 41: ( 6- hloro- 9H- B4<arbolin- 8- ilVamid 4-(( SV- 2- Metansulfonilamino- propin- 6. 6-

dimetil- morfolin- 3-( S)- karboksilne kiseline

Željeni proizvod se dobija prema postupku E.

<1>H-NMR (300 MHz, metil-d3alkohol-d): 5 1,28 (s, 3H), 1,29 (d, 3H), 1,43 (s, 3H), 2,28 (d, 1H), 2,57 (m, 1H), 2,66 (m, 1H), 2,98 (s, 3H), 3,03 (d, 1H), 3,34 (m, 1H), 3,66 (m, 1H), 4,05 (m, 2H), 7,67 (d, 1H), 8,10 (m, 2H), 8,32 (d, 1H), 8,89 (s, 1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,54 min. MS(M+F<T>):494.

PRIMER 42: ( 6- hloro- 9H- beta- karbolin- 8- ilVamid 4- f2- f(- 4. 6- Dimetil- pirimidin- 5-

karbonil)- amino|- propil}- 6, 6- dimetil- morfolin- 3- karboksilne kiseline

Željeni proizvod se dobija upotrebom [4-(2-Amino-propil)-6,6-dimetil-morfolin-3H'lmetil]-(6-hloro-9H-beta-karbolin-8-il)-amina i 4,6-dimetil pirimidin-5-karboksilne kiseline prema postupkui E u prinosu od 51 %.

<1>H-NMR (300MHz, DMSO): 5 11,27 (1H, s), 10,02 (1H, s), 9,0 (1H, s), 8,86 (1H, s), 8,5 (1H, d), 8,3 (1H, d), 8,22 (2H, m), 7,88 (1H, s), 4,1 (1H, m), 3,9 (2H, m), 2,99 (2H, m), 2,36 (6H, s), 2,1 (2H, m), 1,3 (3H, s), 1,24 (6H, m).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,50 min.

MS (M+H+). 551

PRIMER 43: ( 6- hloro- 9H- beta- karbolin- 8- il) namid ( S)- 6. 6- DimetiW( S)- 2- f( 2- metil-

piridin- 3karbonil) amino] propil)- morfolin- 3- karboksilne kiseline.

Željeni proizvod se dobija prema postupku E iz (6-hloro-9H-beta4<arbolin-8-

il)-amid (S)-4-{(S)-2-Amino-propil)-6)6-dimetil-morfolin-34<arboksilne kiseline trifluoroacetat so i 2-metil-nikotinske kiseline u prinosi od 75%.

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-de): 5 1,21 (s,3H), 1,22 (d,3H), 1,36 (s,3H), 2,10 (d,IH), 2,42 (m,1H), 2,60 (m,1H), 2,99 (d,1H), 3,20 (m,IH), 3,92 (m,2H), 4,22 (m,1H), 7,22 (dd,IH), 7,65 (d,IH), 7,90 (s,IH), 8,16 (d,1H), 8,23 (s,IH), 8,31 ( d,\ H), B, Z8 (d,IH), 8,45 (d,IH), 9,02 sJHJ.IO^sJH^H^s.lH).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 2,16min.

MS(M+H<+>): 535,5.

PRIMER 44: ( 6- hlcfo- 9H- 64<afbolin- 8- ilVamid 6. 6- Dimetil- 442- r( tetrahidro- piran- 4-

karbonil)- amino|- propil>- morfolin- 34<arboksilne kiseline: (e-hlcH-CH<g>H-pM^arbolin-S-il^amid 4-(2-AmhcHprop^ kiseline (3 CF3COOH so) (300 mg) se suspenduje u metilen hloridu

(12 mL) zajedno sa 3 equivalents trietilamina. Dodaje se morfolin-4-karbonil hlorid (70 mg, 1.3 equivalents) i smeša se meša na sobnoj temperaturi preko noći. Rastvarao se ukloni u rotirajućem evaporatoru. Proizvod se podeli preparativnom TLC na silika pločama (10/90 metanol/etil acetat kao eluent, proizvod Rf 0,4) Prinos: 83 mg.

<1>H-NMR (300 MHz, relative to CD3OD pik na 3,3 ppm) 5 8,8 (s, 1H), 8,27 (d, 1H), 7,9-7,99 (m, 3H), 3,95-4,15 (m, 2H), 3,85-3,95 (m, 2H), 3,5-3,6 (m, 5H), 3,3-3,45 (m, 2H), 3,15-3,3 (m, 2H), 2,85-2,95 (d, 1H), 2,6-2,72 m, 1H), 2,3-2,43 (m, 1H), 2,2-2,28 (d, 1H), 2,0 (s, 2H), 1,35-1,45 (d, 3H), 1,05-1,25 (m, 6H).

LCMS (amonijum acetat standard postupak)

Vreme zadržavanja= 2,39 min.

(M<+>= 529; M" = 527).

PRIMER 45: ( 6- hloro- 9H- B- karbolin- 8- il)- amid 4- f( S)- 2- r( 1- Acetil- pirolidin- 2-( S)-karbonil)- amino1- propilV6. 6- dimetil- morfolin- 3-( S)- karboksilne kiseline

Željeno jedinjenje se dobija prema postupku E.

<1>H-NMR (300 MHz, metil-d3alkohol-d): 5 1,21 (d, 3H), 1,28 (s, 3H), 1,39 (s, 3H), 1,95 (m, 3H), 2,05 (s, 3H), 2,17 (m, 1H), 2,28 (d, 1H), 2,51 (m, 1H), 2,74 (m, 1H), 3,05 (d,

1H), 3,30 (m, 1H), 3,55 (m, 1H), 3,61 (m, 1H), 4,05 (m, 2H), 4,18 (m, 1H), 4,34 (m 1H), 7,78 (d, 1H), 8,10 (m, 2H), 8,33 (d, 1H), 8,90 (s, 1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 2,07 min. MS(M+H<+>):555.

PRIMER 46: ( 6- hloro- 9H- beta- karbolin- 8- il)- amid 6. 6- Dimetil- 4- f- 2- f( 5- metil-

izoksazole- 3- karbonil)- amino1- propil}- morfolin- 34<arboksilne kiseline

Željeno jedinjenje se dobija upotrebom [4-(2-amino-propil)-6,6-dimetil-morfolin-3-ilmetil]-(6-hloro-9H-beta-karbolin-8-il)-amina i 5-metilizoksazol karbonil hlorida prateći postupak E u prinosu od 61%.

<1>H-NMR (300MHz, DMSO): 5 11,2 (1H, s), 9,98 (1H, s), 9,0 (1H, s), 8,7 (1H, d), 8,6 (1H, d), 8,2 (2H, m), 7,9 (1H, s), 6,47 (1H, s), 3,87 (2H, m), 3,17 (2H,m), 2,9 (1H, d), 2,7 (1H, m), 2,3 (4H), 2,1 (1H, d), 1,29 (3H, s), 1,15 (6H, m).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,81 min.

MS (M+H+): 526

PRIMER 47: ( 6- hloro- 9H- 34<arbolin- 8- il) - amid 6. 6- Dimetil- 4- r2-( 3- metil- ureido)-proplill- morfolin- 3- karboksilne kiseline: (6-hloro-9H-64<arbolin-8il)-amid 4-(2-Amino-propil)-6,6-dimetil-morfolin-3-karboksilne kiseline (3 HCI so) (300mg) se suspenduje u dihlorometanu (10 mL) trietil amin (4 eq.) i metil izocijanat (2 eq.) se istovremeno dodaju. Nakon jednog sata na sobnoj temperaturi rastvarao se uklanja u rotacionom evaporatoru. Proizvod se prečišćava silika gel fleš hromatografijom (5% metanol / dihlorometan, proizvod Rf =0,3) da bi se dobilo 200 mg.

<1>H-NMR (300 MHz, u odnosu na CDCI3pik na 7,3 ppm) 5 12,3 (s, 1H), 10,2 (s, 1H), 8,9 (S, 1H), 8,6 (s, 1H), 8,4 (d, 1H), 7,9 (d, 1H), 7,8 (s, 1H), 5,4 (s, 1H), 5,2 (d, 1H), 4,2 (s, 1H), 3,8 (m, 2H), 3,2 (m, 1H) , 2,6-3 (m, 7H), 2,3 (d, 1H) , 2,2 (t, 1H), 1,4 (s, 3H), 1,2 (s, 3H), 1,1 (d, 3H)

LCMS (amonijum acetat standard postupak)

Vreme zadržavanja = 1,62 min.

(M+ = 473; M" = 471).

PRIMER 49: metil estar (( S)- 2- f( S)- 5-( 6- Hloro- 9H- beta- karbolin- 8- ilkarbamoin-

2, 2- dimetil- morfolin- 4- in- 1 - metil- etill- karbaminske kiseline.

U rastvor (6-hloro-9H-beta-karbolin-8-il)-amida (S)-4-((S)-2-Amino-propil)-6,6-dimetil-morfolin-3 karboksilne kiseline hidrohlorid so (3,45g, 6,59 mmol) u 68 mL suvog piridina, dodaje se u tri porcije tokom 1,5 h, 3M DCM rastvor metil hloroformata (9,2 ml, 27,6 mmol, 4,2 eq). Nakon 2 h, dodaje se 10 mL vode i smeša se koncentruje do suva. Ostatak se podeli u 150 mL EtOAc i 100 mL vodenog rastvora 0,5M K2CO3. Odvojenia vodena faza se ekstrahuje sa 50 mL EtOAc. Kombinovani organski ekstrakti se uzastopno operu sa vodom (2 X 50 mL) i zasićenim rastvorom soli (50 mL), osuše preko Na2S04i koncentruju do suva. Ostatak se prečišćava na silicijum dioksidu (5% MeOH/Ch^Cb) da bi se dobilo 2,48 g (gusto ulje, 77% prinos) željenog proizvoda.

<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3): 8 1,15 (d, 3H), 1,28 (s, 3H) t 1,42 (s, 3H), 2,33 (dd, 1H), 2,42 (d, 1H), 2,78 (dd, 1H), 2,86 (d, 1H), 3,32 (dd, 1H), 3,86 (s, 3H), 3,92 (t, 1H), 4,01 (dd, 1H), 4,18 (m, 1H), 4,78 (d, 1H), 7,95 (d, 1H), 7,97 (s, 1H), 8,29 (s, 1H), 8,50 (d, 1H), 8,98 (s, 1H), 9,88 (s, 1H), 10,94 (s, 1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,70 min.

MS (M+H+): 474,1

PRIMER 50: ( 6- hloro- 9H- beta- karbolin- 8- in- amid 442- f( 2. 4- Dimetil- piridin- 3-

karbonin- amino)- propil}- 6, 6- dimetil- morfolin- 3- karboksilne kiseline

Željeno jedinjenje se dobija iz [4-(2-Amino-propil)-6,6-dimetil-morfolin-3-ilmetil]-(6-hloro-9H-beta4<arbolin-8-il)-amina i 2,4-dimetil nikotinske kiseline prateći postupak E u prinosu od 50%.

<1>H-NMR (300MHz, DMSO): 5 11,27 (1H, s), 10 (1H, s), 8,9 (1H, s), 8,37 (2H, d), 8,24 (3H, m), 7,8 (1H, s), 7,04 (1H, d) , 3,91 (2H, m), 3,1 (2H, m), 2,36 (4H, m), 2,1 (3H, m), 2,05 (1H, d), 1,3 (3H, s), 1,2 (6H, m).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,53 min.

MS (M+H+): 550

PRIMER 51: ( 6- hloro- 9H- beta- karbolin- 8- il)- amid 6. 6- dimetil- 442- f( pirazin- 2-

karbonil)- amino1- propil}- morfolin- 34carboksilne kiseline

Željeno jedinjenje se dobija iz [4-(2-Amino-propil)-6,6-dimetil-morfolin-3-ilmetil]-(6-hloro-9H-beta-karbolin-8-il) -amina i 2-pirazin karboksilne kiseline prateći

postupak E u prinosu od 62%.

<1>H-NMR (300MHz, DMSO): 5 12,9 (1H, s), 10,89 (1H, s), 9,42 (1H, s), 9,0 (1H, s), 8,8 (1H, d), 8,6 (1H, d), 8,4 (1H, s), 8,2 (1H, m), 4,5 (1H, m), 4,1 (2H, m), 3,1 (1H, m), 2,1 (4H, m), 1,23 (9H, m).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,69 min.

MS (M+): 522.2

PRIMER 52: 4-(( 2- f5-( 6- hloro- 9H- 84<arbolin- 8- ilkarbamoil)- 2. 2- dimetii- morfolin- 4-

il>- 1 - metil- etil)- amid>3- metilamid piridin- 3. 4- dikarboksilne kiseline

U rastvor [4-(2-Amino-propil)-6, 6-dimetil-morfolin-3-ilmetil]-(6-hloro-9H-beta-karbolin-8-il)-amina (100 mg, 0,132 mmol) u 0,6 mL suvog acetonitrila, dodaje se 3,4-piridindikarboksilni anhidrid (21 mg, 0,15mmol) i trietilamin (102 ml, 0,8mmol). Reakciona smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 1 h. Zatim se ukloni rastvarao pod sniženim pritiskom i ostatak se pokupi u piridin (0,6 mL). U dobijenu smešu se dodaje 2M metilamin rastvor u THF (0,2 ml, 0,4 mmol) i EDCI (40 mg, 0,21 mmol). Reakciona smeša se meša tokom 4 h, rastvarač se ukloni pod sniženim pritiskom i ostatak se podeli u EtOAc i 1M vodeni rastvor K2CO3. Odvojena vodena faza se ekstrahuje dva puta sa EtOAc. Kombinovane organske faze se uzastopno operu sa vodom i zasićenim rastvorom soli, osuše preko MgS04, i koncentruju u potpunosti. Ostatak se prečišćava na silika gelu (10% MeOH-CH2Cl2) da bi se dobilo naslovljeno jedinjenje u obliku bele čvrste materije u prinosu od 36% .

<1>H-NMR (300MHz, DMSO): 5 9,24 (1H, s), 8,17 (IH,s), 7,81 (2H, m), 7,5 ( 3H, m) , 7,3 (1H, s), 7,0 (1H, s) 6,5 (1H, d), 3,08 (2H, d), 3,35 (1H, m), 2,4 (3H, m), 1,86 (4H, m) , 0,5 (3H, s), 0,37 (6H, m).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,46 min.

MS (M+H+): 579

PRIMER 53: ( 6- hloro- 9H- beta- karbolin- 8- il)- amid 6. 6- Dimetil- 44( 4- metil- pirimidin-54<arbonil)- amino)- propil)- morfolin- 3- karboksilne kiseline

Željeno jedinjenje se dobija prema postupku E iz [4-(2-Amino-propil)-6,6-dimetilmorfolin-3-ilmetil]-(6-hloro-9H-beta-karbolin-8-il)-amina i 4-metil-pirimidin-5-karboksilne kiseline u prinosu od 55%.

1H-NMR (300MHz, DMSO): 5 11,26 (1H, s), 10,04 (1H, s) 9,04 (2H, m), 8,66 (1H, d) 8,3 (2H, m) 8,22-8,17 (2H, m), 7,9 (1H, s), 4,2 (1H, m), 3,93 (2H, m), 3,2 (1H, m),2,98 (2H, m), 2,6 (3H, m), 2,1 (2H, m), 1,36 (3H, s), 1,23 (6H, m).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,55 min.

MS (M+H+): 537

PRIMER 54: ( 6- hloro- 9H- beta- karbolin- 8- il)- amid ( S)- 6. 6- Dimetil- 4-(( S)- 2- f( 4-

metil- piridin- 3- karbonil)- amino1- propil>- morfolin- 3- karboksilne kiseline.

Željeno jedinjenje se dobija prema postupku E iz (6-hloro-9H-beta-karbolin-8-il)-amida (S)-4-((S)-2-Amino-propil)-6,6-dimetil-morfolin-3-karboksilne kiseline trifluoroacetat so i 4-metil-nikotinske kiseline u prinosu od 79%.

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) : 5 1,21 (s,3H), 1,22 (d, 3H) , 1,36 (s,3H), 2,10 (d,IH), 2,40 (m,1H), 2,62 (m,1H), 2,99 (d,1H), 3,22 (m,1H), 3,94 (m,2H), 4,23 (m,1H), 7,26 (d,1H), 7,90 (S,1H), 8,16 (d,IH), 8,23 (s,IH), 8,34-8,46 (m,3H), 9,02 (s,IH),10,04 (S,1H), 11,27 (s,IH).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 2,22min.

MS (M+H<+>): 535,5.

PRIMER 47: ( 6- hloro- 9H- B- karbolin- 8in- amid 4- f2-( 2- Amino- 2- metil- propionim-6, 6- dimetil- morfolin- 3- karboksilne kiseline

Rastvor terc-butil estra { 2-[5-( 6-Hloro-9HB-karbolin-8-ilkarbamoil) 2,2-dimetilmorfolin-4-il]-1-metil-etil}-karbamske kiseline (70,2 mg, 0,14 mmol) u TFA (2 mL) se meša na sobnoj temperaturi. Nakon 15 min, reakcija se koncentruje i sirov proizvod se azeotroped sa CH2CI2(2x5 mL). Smeša sirovog intermedijera, TBTU (54,0 mg, 0,17 mmol), trietilamina (0,2 mL, 1,43 mmol) i 2-terc-butoksikarbonilamino-2-metil-propionske kiseline (45,0 mg, 0,22 mmol) u MeCN (1 mL) se meša na sobnoj temperaturi tokom 18 h. Rastvor se razblaži sa H20 (20 mL) i i sipa u levak za odvajanje koji sadrži EtOAc (50 mL), i zasićen rastvor soli (50 mL). Smeša se trese i slojevi se odvoje. Vodeni sloj se ekstrahuje sa EtOAc (2 x 50 mL). Kombinovani organski slojevi se osuše, filtriraju i koncentruju. Sirov proizvod se prečišćava fleš hromatografijom da bi se dobio prinos žute čvrste materije (51,0 mg, 62%) za koju je NMR-om i LCMS-om pokazano da je (6-hloro-9H-B-karbolin-8il)-amid 4-[2-(2-amino-2-metil-propionil]-6,6-dimetil-

morfolin-3-karboksilne kiseline.

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 12,94 (br s, 1); 11,36 (br s, 1); 10,16 (s, 1); 9,06 (s, 1); 8,39 (d, 1); 8,22 (d, 1); 8,19 (d, 1); 7,95 (s, 1); 4,77 - 4,52 (m, 1); 4,28 - 4,13 (m, 1); 4,13 - 4,00 (m, 1); 3,68 - 3,52 (m, 1); 3,22 - 3,12 (m, 1); 1,44 (s, 3); 1,41 -1,38 (m, 6); 1,28 -1,24 (m, 2); 1,22 (s, 3); 1,25 (s, 3); 1,11 -1,07 (m, 1).

NH4OACstandardni uslovi.

DAD Rf = 1,31 min.

M+H = 501.

PRIMER 55: ( 6- hloro- 9H- beta- karbolin- 8- il) amid 6. 6 Dimetil- 4-( 1. 2. 3. 4-tetrahidroizohinolin- 3- ilmetil)- morfolin- 3- karboksilne kiseline

Željeno jedinjenje se dobija prateći postupak naglašen u postupku C upotrebom 6,6-dimetil morfolin-3-karboksilne kiseline i (s)-tetrahidroizohinolin aldehida.<1>H-NMR (300MHz, D20) : 6 9,1 (1H, s), 8,68 (1H, d) , 8,52 (1H, d) , 8,41 (1H, d), 7,68 (1H, d), 7,27 (1H, d), 7,06 (1H, m), 6,97 (1H, d), 6,84 (1H, m), 4,31 (2H, m), 4,09 (2H, m), 3,68 (1H, m), 3,56 (1H, t), 3,2 (2H, m), 3,06 (2H, m), 2,7 (2H, m) 1,48 (3H, s), 1,32 (3H, s)

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 2,43 min.

MS (M+H+): 505

INTERMEDIJER 59: (6-hloro-9H-3-karbolin-8-il)-amid 6, 6-Dimetil-morfolin-3-karboksilne kiseline, HCI so

U bistar, mrk, rastvor terc-butil estra 5-(6-hloro-9H-3-karbolin-8-ilkarbamoil)-2,2-dimetil-morfolin-4-karboksilne kiseline (10,4 g, 22,7 mmol) u metanolu (41 mL) dodaje se HCI u dioksanu (4M, 91 mL). Reakcija se meša tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi, za koje vreme počne da se formira mrk precipitat. Smeša se sipa u količinu od 250-mL snašno mešanog Et20. Dobijena gusta suspenzija se meša na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta, zatim filtrira da bi se dobio prinos bledo oranž čvrste materije. Čvrsta meterija se stavlja na pumpu sa visokim vakuumom preko noći, nakon čega se dobija 9,71 g (6-hloro-9H-3-karbolin-8-il)-amida 6,6-dimetil-morfolin-3-karboksilne kiseline (99% prinos).

<1>H-NMR (DMSO-d6, 300MHz) 5 13,47 (s, 1); 11,77 (s, 1); 9,42 (s, 1); 8,86 (d, 1); 8,66 (d, 1); 8,58 (d, 1); 8,25 (d, 1); 4,41 -4,37 (m, 2); 4,05 (dd, 1); 3,32 - 3,28 (m, 1); 3,04 - 3,00 (m, 1); 1,34 (s, 3); 1,30 (s, 3).

NH40AC standardni uslovi.

DAD Rf= 1.4 8 min.

M+H = 359.

PRIMER 56: ( 6- hloro- 9H- B- karbolin- 8- il)- amid 4-( 2- Amino- butil)- 6, 6- dimetilmorfolin- 3- karboksilne kiseline (takođe INTERMEDIJER 60)

Prati se postupak C, upotrebom terc-butil estra 5-(6-hloro-9H-P-karbolin-8-ilkarbamoil)-2,2-dimetil-morfolin-4-karboksilne kiseline i odgovarajućeg aldehida, terc-butil estra (l-formil-propil)-karbamske kiseline.

<1>H-NMR (DMS0-d6, 300MHz) 5 .9,06 (s, 1); 8,37 (d, 1); 8,19 (d, 1); 8,15 (d, 1); 7,85 (d, 1); 6,75 (br s, 2); 3,96 -3,85 (m, 2); 3,17 - 3,13 (m, 1); 2,89 (d, 1); 2,78 - 2,74 (m, 1); 2,67-2,59 (m, 1); 2,26-2,20 (m, 1); 2,14 (d, 1); 1,5 8- 1,50 (m, 1); 1,32 (s, 3); 1,32-1,23 (m, 1); 1,18 (s, 3); 0,87 (t, 3).

NH4OAc standardni uslovi.

DAD Rf= 1,27 min.

M+H = 430.

PRIMER 57: ( 6- hloro- 9H- B- karbolin- 8- in- amid 6, 6- Dimetil- 442- f( 2- metil- piridin- 3-

karbonil)- amino1- butil}- morfolin- 3- karboksilne kiseline, HCI so

U rastvor (6-hloro-9H-B-karbolin-8-il)-amida 4-(2-amino-butil)-6,6-dimetil-morfolin-3-karboksilne kiseline (100 mg, 0,233 mmol) u piridinu (4 mL) dodaje se 2-metil-nikotinska kiselina (38,4 mg, 0,280 mmol) i EDCI (71,5 mg, 0,373 mmol). Rastvor se meša preko noći na sobnoj temperaturi, i zatim razblaži sa vodom (5 mL). Smeša se sipa u levak za odvajanje i dalje razblaži sa vodom (20 mL). Smeša se ekstrahuje sa EtOAc (2 x 20 mL), i zatim se kombinovani organski slojevi operu sa zasićenim rastvorom soli. Organski sloj se osuši preko magnezijum sulfata, filtrira, i koncentruje da bi se dobio prinos žuto mrkog ulja koje se prečišćava hromatografijom u koloni. Dobijena žuta čvrsta materija se rastvori u metanolu (2 mL) i dodaje se HCI u Et20 (2M, 2 mL). Smeša se meša tokom 5 minuta, i zatim se koncentruje da bi se dobio prinos 103 mg (6-hloro-9H-B-karbolin-8-il)-amida 6,6-dimetil-4-{2-[(2-metil-piridina-3-karbonil)-amino]-butil}-morfolin-3-karboksilne

kiseline (71% prinos).

<1>H-NMR (DMS0-d6, 300MHz) 5 13,31 (br s, 1); 11,41 (br s, 1); 11,14 (br s, 1); 9,44 (s, 1); 8,85 (d, 1); 8,73 - 8,64 (m, 3); 8,52 (s, 1); 8,32 (s, 1); 7,72 (s, 1); 4,64 - 3,55 (m, 6); 3,2 4 - 3,0 6 (m, 1); 2,95 - 2,81 (m, 1); 2,71 (s, 3); 1,8 9 - 1,74 (m, 1); 1,55 -1,41 (m, 1); 1,32 (s, 3); 1,23 (s, 3); 0,93 (t, 3).

NH40AC standardni uslovi.

DAD Rf= 1,66 min.

M+H = 549.

INTERMEDIJER 61: (6-hloro-9H-B-karbolin-8-il)-amid 4-(2-Amino-3-metil-butil)-6, 6-dimetil-morfolin-3-karboksilne kiseline

Prati se postupak C, upotrebom terc-butil estra 5-(6-hloro-9H-B-karbolin-8-ilkarbamoil)-2,2-dimetil-morfolin-4-karboksilne kiseline i odgovarajućeg aldehida, terc-butil estar (1-formil-2-metil-propil)-karbamske kiseline.

<1>H-NMR (DMSO-d6, 300MHz) 5 9,05 (s, 1); 8,37 (d, 1); 8,21 (d, 1); 8,16 (dd, 1); 7,90 (d, 1); 6,71 (br s, 2); 3,93 -3,86 (m, 2); 3,18 - 3,14 (m, 1); 2,91 (d, 1); 2,70 - 2,65 (m, 2); 2,21 (dd, 1); 2,15 (d, 1); 1,74 - 1,66 (m, 1); 1,31 (s, 3); 1,19 (s, 3); 0,85 (d, 3); 0,80 (d, 3).

NH40AC standardni uslovi.

DAD Rf= 1,27 min.

M+H = 444.

PRIMER 58: ( 6- hloro- 9H- 3- karbolin- 8- il) - amid 6, 6- Dimetil- 443- metil- 2- r( 2- metil-

piridina- 3- karbonil)- amino1- butill- morfolin- 3- karboksilne kiseline

U rastvor (6-hloro-9H-B-karbolin-8-il)-amida 4-(2-amino-3-metil-butil)-6, 6-dimetilmorfolin-3-karboksilne kiseline (1,47 g, 3,31 mmol,) u piridinu (35 mL) dodaje se 2-metil-nikotinska kiselina (544 mg, 3,97 mmol) i EDCI (1,02 g, 5,30 mmol). Rastvor se meša 6,5 h na sobnoj temperaturi, i zatim razblaži sa vodom (100 mL). Smeša se sipa u levak za odvajanje i dalje razblaži sa vodom (50 mL) i EtOAc (150 mL). Slojevi se tresu i odvoje. Vodeni sloj se ekstrahuje sa EtOAc (3 x 50 mL), zatim se kombinovani organski slojevi operu sa zasićenim rastvorom soli. Organski sloj se osuši preko magnezijum sulfata, filtrira, i koncentruje da bi se dobio prinos oranž žute polu čvrste ostatka koji se prečišćava hromatografijom u koloni. Dobijena žuta čvrsta materija se stavi na pumpu sa visokim vakuumom preko noći, nakon čega se dobija 1,43 g (6-hloro-9H-p4<arbolin-8-il)-amida 6,6-dimetil-4-{3-metil-2-[(2-metil-piridin-3-karbonil)-amino]-butil}-morfolin-3-karboksilne kiseline (77% prinos).

<1>H-NMR (DMS0-d6, 300MHz) 5 11,32 (s, 1); 10,08 (s, 1); 9,02 (s, 1); 8,46 (dd, 1); 8,38 (d, 1); 8,21 -8,14 (m, 3); 7,97 (d, 1); 7,64 (dd, 1); 7,23 (dd, 1); 4,23-4,14 (m, 1); 3,99 - 3,87 (m, 2); 3,22 - 3,19 (m, 1): 3,02 (d, 1); 2,85 (dd, 1); 2,52 (s, 3); 2,30 (dd, 1); 2,11 (d, 1); 2,05-1,95 (m, 1); 1,32 (s, 3); 1,21 (s, 3); 0,93 (d, 3); 0,86 (d, 3).

NH4OAc standardni uslovi.

DAD Rf = 1,67 min.

M+H = 563.

PRIMER 59: ( 6- hloro- 9H- B- karbolin- 8- il)- amid 6. 6- Dimetil- 4-( 3- metil- 2- rS)-r( tetrahidro- furan- 3- karbonil)- aminol- butil>- morfolin- 3-( S)- karboksilne kiseline

Željeno jedinjenje se dobija prateći Postupak E iz INTERMEDIJERa 61 i odgovarajuće kiseline.

<1>H-NMR (300 MHz, metil-d3alkohol-d): 5 0,87 (m, 6H), 1,25 (d, 3H), 1,37 (d, 3H), 1,81 (m, 1H), 2,10-2,47 (m, 4H), 2,93 (m, 2H), 3,10 (m, 1H), 3,26 (m, 1H), 3,80 (m, 1H), 3,86-4,07 (m, 6H) , 7,86 (d, 1H), 8,10 (m, 2H) , 8,32 (d, 1H), 8,89 (s, 1H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,73 min.

MS (M+H<+>): 542.

INTERMEDIJER 62: terc-butil estar {(S)-2-{(S)-5-(6-Hloro-4-metil-9H-B-karbolin-8-ilkarbamoil)-2,2-dimetil-morfolin-4-il]-1 -metil-etil}-karbamska kiselina Rastvor (S)-4-((S)-2-terc-butoksikarbonilamino-propil)-6,6-dimetil-morfolin-3-karboksilne kiseline (3,316 g, 10,5 rnmol) (dobijen reduktivnim alikilovanjem (S)-6,6-dimetil-morfolin-3-karboksilne kiseline sa N-(terc-butoksikarbonil)-L-alanal) u bezvodnom piridinu (75 mL) se meša na sobnoj temperaturi. Dodaje se 6-hloro-4-metil-9H-B-karbolin-8-ilamin (1,869 g, 8,09 mmol), i zatim EDCI (2,894 g, 15,1 mmol). Reakcija se meša na sobnoj temperaturi tokom 14-18 h pod argonom. Reakcija se delimično koncentruje, razbalži sa H20 (20 mL) i prebaci u levak za odvajanje. Smeša se razblaži sa zasićenim rastvorom soli (50 mL) i ekstrahuje sa EtOAc (3 x 100 mL). Kombinovani organski slojevi se operu sa zasićenim rastvorom soli, osuše, filtriraju i koncentruju da bi se dobio tamni ostatak. Hromatografijom u koloni (0-8% MeOH / CH2C12) dobija se prinos terc-butil estar {(S)-2-[(S)-5-(6-Hloro-4-metil-9H-(3-karbolin-8-ilkarbamoil)-2,2-dimetil-morfolin-4-il]-1-metil-etil}-karbamske kiseline u obliku svetio tamne čvrste materije (2,688 g).<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 11,25 (s, 1) 9,94 (s, 1) 8,88 (s, 1) 8,18 (s, 1) 8,02 (s, 1) 7,92 (s, 1) 6,73 (d, 1) 3,95 - 3,85 (m, 2) 3,66 (br s, 1) 3,16 - 3,08 (m, 1) 2,88 (d, 1) 2,76 (s, 3) 2,51 - 2,40 (m, 1) 2,23 (dd, 1) 1,99 (d, 1) 1,34 (br s, 12) 1,17 (s, 3)1,08 (d, 3).

NH40AC standardni uslovi.

ELSD Rf= 2,07 min.

M+H = 530.

PRIMER 60: ( 6- hloro- 4- metil- 9H- B- karbolin- 8- il)- amid fS)- 6. 6- Dimetil- 44( S)- 2- r( 2-

metil- piridin- 3- karbonil)- amino1- propil>- morfolin- 3- karboksilne kiseline

Rastvor terc-butil estra {(S)-2-[(S)-5-(6-Hloro^1-metil-9H-p-karbolin-8-ilkarbamoil)-2,2-dimetil-morfolin-4-il]-1-metil-etil}-karbamske kiseline (2,688 g, 5,08 mrtiol) u EtOH (60 mL) se meša na sobnoj temperaturi. Dodaje se koncentrovana HCI (10 mL) i reakcija se meša tokom 14 h na sobnoj temperaturi pod argonom. Reakcija se koncentruje da bi se dobila žuta čvrsta materija (2,84 g). Čvrsta materija se rastvori u bezvodnom piridinu (40 mL) i meša na sobnoj temperaturi pod argonom. Dodaje se trietilamin (2,20 mL, 15,7 mmol) i EDCI (1,39 g, 7,28 mmol). Reakciona smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta i 2-metil-nikotinske kiselina (0,868 g, 6,33 mmol) se dodaje. Reakcija se meša na sobnoj temperaturi tokom 14-18 h i razblaži sa H20 (40 mL). Smeša se sipa u levak za odvajanje koji sadrži H20 (40 mL) , zasićen rastvor soli (40 mL), i EtOAc (40 mL). Smeša se trese i slojevi se odvoje. Vodeni sloj se ekstrahuje sa EtOAc (2 x 40 mL) i kombinovani organski slojevi se operu sa zasićenim rastvorom soli. Organski sloj se osuši, filtrira i koncentruje. Dobijeni ostatak se rastvori u EtOAc (10-20 mL) i dodaje ukapavanjem u rastvor 4:1 heksani / Et20 (300 mL) koji se meša. Precipitat koji se formira se pokupi filtriranjem i osuši na vazduhu da bi se dobio prinos (6-hloro-4-metil-9H-3-karbolin-8-il)-amida (S)-6,6-Dimetil-4-{(S)-2-[(2-metil-piridina-3-karbonil)-amino]-propil}-morfoIin-3-karboksilne kiseline u

obliku tamne čvrste materije (3,151 g).

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 11,28 (s, 1) 9,98 (s, 1) 8,81 (s, 1) 8,45 - 8,39 (m, 1) 8,26 (d, 1) 8,13 (s, 1) 7,97 (s, 1) 7,89 (s, 1) 7,64 - 7,56 (m, 1) 7,24 - 7,12 (m, 1) 4,25 -4,10 (m, 1) 3,91 - 3,82 (m, 2) 3,20 - 3,10 (m, 1) 2,94 (d, 1) 2,71 (s, 3) 2,61 - 2,49 (m, 1) 2,37 (s, 3) 2,06 - 2,02 (m, 2) 1,30 (s, 3) 1,16 (d, 3) 1,15 (s, 3).

NH4OAc standardni uslovi.

ELSD Rf = 1,57 min.

M+H = 549.

INTERMEDIJER 63: 3,5-Difluoro-4-tributilstananil-piridin

n-Butil litijum (1,0 eq, 76 mmol, 47,6 mL, 1,6 M u heksanima) dodaje se Ikroz levak za ukapavanje u rastvor diizopropilamina (1,05 eq, 80 mmol, 11,2 mL) u THF (300 mL) na -78°C pod azoztom (N2). Rastvor se meša tokom 30 min na -78 °C, zatim se ukapavanjem špricem dodaje rastvor 3,5-difluoropiridina (1,05 eq, 80 mmol, 9,2 g) u THF (20 mL). Primećuje se da se formira bež precipitat. Reakcija se meša na -78°C tokom 90 min i zatim se ukapavanjem špricem dodaje tributiltin hlorid (1,0 eq, 76 mmol, 20,7 mL) i dobijeni rastvor se ostavlja da se zagreje do RT tokom 2 h. Dodaje se voda (5 mL), i zatim se otprilike 250 mL THF ukloni u rotacionom evaporatoru. Dobijeni materijal se razblaži sa dietil etrom (350 mL) i opere uzastopno sa vodom (2x200 mL), zasićenim rastvorom natrijum hlorida (1x150 mL), osuši preko magnezijum sulfata, filtrira i koncentruje u vakuumu da bi se dobio 3,5-Difluoro-4-tributilstananil-piridin u obliku bezbojnog ulja (27,5 g, 88%). Ovaj materijal se koristi sirov bez daljeg prečišćavanja.

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 3,35 min.

MS (M+H<+>): 406.

INTERMEDIJER 64: 4-Hloro-2-(3,5-difluoro-piridin-4-il)-fenilamin

Stille kuplovanje: Dimetil formamid (256 mL) rastvor sirovog INTERMEDIJERA 63 (1,1 eq, 70 mmol, 27,5 g) i 2-jodo-4-hloro-fenilamin (1.0 eq, 64 mmol, 16.2 g) se degasiraju sa N2tokom 15 min. Dodaje se dihlorobis(trifenilfosfin)paladijum (II)

(0,05 eq, 3,2 mmol, 2,2 g) i bakar (I) jodid (0,1 eq, 6,4 mmol, 1,2 g) i suspenzija se zagreva na refluksu tokom 15 h pod N2. Smeša se ohladi do RT, filtrira kroz short plug of celite® i dimetil formamid se uklanja u rotacionom evaporatoru.

Sirov materijal se rastvori u acetonitrilu (300 mL), opere sa heksanima (2x 200 mL) i zatim koncentruje u vakuumu. Materijal se zatim rastvori u etilacetatu (400 mL) i opere uzastopno sa vodom (2x200 mL), zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata (1x200 mL), zasićenim rastvorom natrijum hlorida (200 mL), osuše preko magnezijum sulfata, filtriraju i koncentruju u vakuumu. Dobijena čvrsta materija se triturira sa dietil etrom (50 mL) da bi se uklonila tamna boja, i zatim rastvori u minimalnoj količini metanola, filtrira da bi se uklonile nerastvorljive nečistoće i koncentruje u vakuumu da bi se dobio 4-Hloro-2-(3,5-difluoro-piridin-4-il)-fenilamin u obliku tamne čvrste materije (12,3 g,~80%,) koji se koristi u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

<1>H-NMR (300 MHz, dmso-d6) : 5 5,28 (s, 2H) , 6,77 (d, 1H), 7,08 (d, 1H), 7,19 (dd, 1H) i 8,58 <s, 2H).

Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,70 min.

MS (M+H<+>): not observed.

INTERMEDIJER 65 : 6-Hloro-4-fluoro-9H-(3-karbolin

Natrijum bis (trimetilsilil) amid (3,0 eq, 130 mmol, 130 mL, 1,0M u THF) se dodaje kroz levak za ukapavanje u rastvor sirovog INTERMEDIJERa 64 (1,0 eq, 43 mmol, 10,4 g) u THF na RT pod N2. Nakon mešanja tokom 15 h višak baze se umiri sa opreznim dodavanjem zasićenog rastvora amonijum hlorid (100 mL) i veći deo THF se ukloni u rotirajućem evaporatoru. Dobijena gusta suspenzija se ekstrahuje sa etil acetatom (400 mL zatim 2x200 mL), i zatim se kombinovani organski slojevi operu uzastopno sa zasićenim rastvorom natrijum bikarbonata (300 mL), zasićenim rastvorom natrijum hlorida (300 mL), osuše preko natrijum sulfate i filtriraju. Dodaje se silika gel i gusta suspenzija se koncentruje u rotacionom evaporatoru. Materijal se prečišćava upotrebom Biotage Flash 75 sistema za prečišćavanje (kratka kolona) eluiranjem sa 96:4 dihlorometan/metanol da bi se dobio 6-Hloro-4-fluoro-9H-3-karbolin u obliku beličaste čvrste materije (7,8 g, 82%).

<1>H-NMR (300 MHz, dmso-d6): 5 7,71-7,61 (m, 3H), 8,11 (d, 1H) i 12,16 (s, 1H). Vreme zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,70 min. MS (M+H+): 221.

INTERMEDIJER 66 :6- hloro- 4- fluoro- 9H- B- karbolin- 8- ilamin

Natrijum nitrat (1,5 eq, 53 mmol, 4,5 g) dodaje se u porcijama u rastvor Intermedijera 65 (1,0 eq, 35 mmol, 7,8 g) u trifluorosirćetnoj kiselini (200 mL) i nastala smeša se greje na 70 °C tokom 3 h. Posle hlađenja do RT ukloni se trifluorosirćetna kiselina na rotacionom uparivaču da bi se dobila sirova čvrsta supstanca koja se suspenduje u maloj zapremini metanola i dodaje u kapima u snažno mešanu smešu zasićenog rastvora natrijum bikarbonata (500 mL). Nastala gusta suspenzija se meša tokom 15 min zatim se istaložene čvrste materije pokupe vakuum filtracijom, operu vodom (300 mL) i zatim osuše u vakuumu da bi se dobio 6-hloro-4-fluoro-8-nitro-9H-p-karbolin (oko 9,5 g) koji se koristi u narednom koraku bez prečišćavanja.

Vreme Zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,79 min. MS (M+H<+>): 266

Sulfat platine (-0,1 eq, 1 g) se dodaje u suspenziju 6-hloro-4-fluoro-8-nitro-9H-p-karbolina (1,0 eq, 35 mmol, 9,3 g) i amonijum formata (3,0 eq, 105 mmol, 6,6 g) u etanolu (175 mL) i nastala smeša se greje na 75 °C tokom 4 h. Posle hlađenja do RT smeša se filtrira kroz kratak čep Celite® opere sa obilnom količinom metanola, i zatim se filtrat koncentriše u vakuumu da bi se dobila bež čvrsta supstanca. Čvrsta supstanca se suspenduje u minimalnj zapremini matanola i doda kap po kap u snažno mešanu smešu zasićenog rastvora natrijum bikarbonata i zasićenog rastvora natrijum hlorida. Posle mešanja tokom 15 min istaložena čvrsta materija se pokupi vakuum filtracijom, opere sa vodom (200 mL) i osuši u vakuumu da bi se dobio 6-hloro-4-fluoro-9H-p-karbolin-8-ilamin (5,8 g, 70% 2 koraka) u obliku bež praha.

<1>H-NMR (300 MHz, dmso-d6): 5 5,76 (s, 2H), 6,81 (d, 1H), 7,29 (d, 1H), 8,24 (d, 1H), 8,82 (d, 1H), i 11,71 (s, 1H).

Vreme Zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,59 min.

MS (M+H<+>): 236.

PRIMER 61: ( 6- hloro- 4- fluoro- 9H- B4<arbolin- 8- il)- amid 4-( 2- Acetilamino- propiD-6. 6- dimetil- morfolin- 3- karboksilne kiseline

Željeno jedinjenje se dobija iz Intermedijera 66 i anhidrida sirćetne kiseline.

<1>H-NMR (300 MHz, dmso-d6) : 5 11,70 (s, 1H), 10,17 (s, 1H), ,8,92 (s, 1H)„ 8,34 (d, 1H), 7,95 (s, 2H), 7,81 (d, 1H), 4,05-3,95 (m, 1H), 3,92-3,83 (m, 2H), 3,18-3,12 (m, 1H), 2,87 (d, 1H), 2,55-2,47 (m, 1H), 2,40-2,31 (m, 1H), 2,03 (d, 1H), 1,78 (s, 3H), 1,32 (s, 3H), 1,63 (s, 3H) i 1,08 (d, 3H).

Vreme Zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,73 min.

MS (M+H<+>): 474.

PRIMER 62: ( 6- hloro- 4- fluoro- 9H- B- karbolin- 8- in- amid 6. 6- Dimetil- 442- r( 2- metil-

piridin- 3- karbonil)- amino]- propil}- morfolin- 3- karboksilne kiseline

Željeno jedinjenje se dobija prema Postupku E iz Intermedijera 66 i metilnikotinske kiseline .<1>H-NMR (300 MHz, dmso-d6): 5 11,63 (s, 1H) , 6, 10,10 (s, 1H), 5, 8,90 (s, 1H), č, 8,44 (d, 1H), 5, 8,34 (s, 1H), 5, 8,29 (d, 1H), 7,94 (s, 2H), 7,65 (d, 1H), 7,21 (dd, 1H), 4,25-4,15 (m, 1H), 3,97-3,88 (m, 2H), 3,24-3,15 (m, 1H), 2,99 (d, 1H), 2,59 (t, 1H), 2,49 (s, 3H), 2,40 (dd, 1H), 2,09 (d, 1H), 1,35 (s, 3H), 1,21 (d, 3H) i 1,20 (s, 3H).

Vreme Zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,67 min.

MS (M+H<+>): 553.

Primer 63: f( S)- 5-( 6- Hloro- 9H- beta- karbolin- 8- ilkarbamoin- 2. 2- dimetil- morfolin- 4-

ill- sirćetna kiselina

U suspenziju (6-hloro-9H-beta-karbolin-8-il)-amida (S)-6,6-Dimetil-morfolin-3-karboksilne kiseline (2,6 g, 6,0 mmol) u 60 mL metanola dodaje se 1,7 mL trietilamina (2,0 eq.), natrijum cijanoborohidrida (575 mg, 9,1 mmol) i glioksilna kiselina (780 mg, 8,5 mmol). Reakciona smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 1,5 h Dodaje se voda (5 mL) i smeša se koncentriše do gustog žute suspenzije. Zatim se dodaje jošp vode (30 mL) i nastala gusta suspenzija se meša na sobnoj temperaturi tokom 10 min. i filtrira. Sakupljena žuta supstanca se opere sa vodom i suši pod visokim vakuumom da bi se dobilo 1,80 g (71%) željenog proizvoda.

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) : 6 1,17 (s,3H), 1,30 (s,3H), 2,81 (d,1H), 3,34 (d,1H), 3,46 (d,1H), 3,56 (dd,IH), 3,84-3,90 (m,2H), 7,92 (s,1H), 8,15 (d,1H), 8,21 (s,1H), 8,36 (d,1H), 9,01 (s,1H), 10,28 (s,1H),11,40 (s,1H).

Vreme Zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,26 min.

MS (M+H+): 417,1.

POSTUPAK F: Postupak kuplovanja za dobijanje amida iz r( S)- 5-( 6- Hloro- 9H-beta- karbolin- 8- ilkarbamoil)- 2, 2- dimetil- morfolin- 4- il1- sirćetna kiselina

[(S)-5-(6-Hloro-9H-beta-karbolin-8-ilkarbamoil)-2,2-dimetil-morfolin-4-il]-sirćetna

kiselina (1,0 mmol), EDCI (1,6 mmol) i amin (1,2 mmol) koji se kupluje uzmu se u bocu sa okruglim dnom i suspenduju u piridinu (5 mL). Nastala smeša se meša preko noći. Zatim se piridin uklanja pod sniženim pritiskom i ostatak se raspodeli u EtOAc i 5% vodenom rastvoru Na2C03- Razdvojene vodene faze se dalje ekstrahuju sa EtOAc. Kombinovani ekstrakti se sukcesivno peru sa vodom i zasićenim rastvorom soli, osuše preko Na2S04i kompletno koncentrišu. Ostatak se prečišćava na silikagelu da bi se dobio željeni proizvod.

PRIMER 64: ( 6- hloro- 9H- beta- karbolin- 8- in- amid ( SV6. 6- Dimetil- 4-( 2- okso- 2-

pirolidin- 1 - il- etil)- morfolin- 3- karboksilne kiseline

Željeno jedinjenje se dobija prema Postupku F iz [(S)-5-(6-Hloro-9H-beta-karbolin-8-ilkarbamoil)-2,2-dimetil-morfolin-4-il]-sirćetne kiseline i pirolidina sa 82% prinosom.

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) : 5 1,21 (s,3H), 1,29 (s,3H), 1,75-1,92 (m,4H), 2,46 (d,1H), 2,77 (d,1H), 3,35-3,68 (m,7H), 3,94 (m,2H), 8,08 (s,IH), 8,19 (d,1H), 8,23 (s,IH), 8,41 (d,IH), 9,05 (S,1H), 10,71 (s,IH),11,51 (s,IH).

Vreme Zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,75 min.

MS (M+H<+>): 470,3.

PRIMER 65: ( 6- hloro- 9H- beta- karbolin- 8- in- amid ( S)- 6. 6- Dimetil- 4-( 2- okso- 2-piperidin- 1 - il- etil) morfolin- 3- karboksilne kiseline

Željeno jedinjenje se dobija prema Postupku F iz [(S)-5-(6-Hloro-9H-beta-karbolin-8-ilkarbamoil)-2,2-dimetil-morfolin-4-il]-sirćetne kiseline i piperidina sa 90% prinosom.

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 1,17 (s,3H), 1,29 (s,3H), 1,35-1,60 (m,6H), 2,25 (d,1H), 2,71 (d,1H), 3,15 (d,IH), 3,26 (dd,1H), 3,37 (dd,1H), 3,45-3,65 (m, 2H), 3,65 (d, 1H), 3,70 (m, 1H), 3,89 (m, 2H) 7,95 (d,1H), 8,15 (d,IH), 8,20 (d,IH), 8,37 (d,1H), 9,01 (s,IH), 10,43 (s,IH),11,32 (S,1H)

Vreme Zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,86 min.

MS (M+H<+>): 484,3.

PRIMER 66: ( 6- hloro- 9H- beta- karbolin- 8- in- amid ( S)- 6, 6- Dimetil- 4-( 2- morfolin- 4-

il- 2- okso- etil)- morfolin- 3- karboksilne kiseline

Željeno jedinjenje se dobija prema Postupku F iz [(S)-5-(6-Hloro-9H-beta-karbolin-8-ilkarbamoil)-2,2-dimetil-morfolin-4-il]-sirćetne kiseline i morfolina sa 86% prinosom.

<1>H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 1,17 (s,3H), 1,30 (s,3H), 2,1 (d,IH), 2,71 (d,IH), 3,03 (d,1H), 3,16 (d,1H), 3,22 (dd,IH), 3,45-3,72 (m,7H), 3,80-3,98 (m, 3H), 7,94 (d,1H), 8,15 (d,IH), 8,21 (d,IH), 8,37 (d,1H), 9,03 (s,IH), 10,35 (s,IH),11,28 (s,IH). Vreme Zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,56 min.

MS (M+H<+>): 486,3.

PRIMER 67: ( 6- hloro- 9H- beta- karbolin- 8- in- amid ( S)- 4-( f( 2- Hidroksi- etil)- metil-

karbamoill- metil>- 6. 6- dimetil- morfolin- 3- karboksilne kiseline

Željeno jedinjenje se dobija prema Postupku F iz [(S)-5-(6-Hloro-9H-beta-karbolin-8-ilkarbamoil)-2,2-dimetil-morfolin-4-il]-sirćetne kiseline i 2-metilamino-etanola sa 55% prinosom.

<1>HNMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 1,21 (s, 3H) , 1,30 (s, 3H) , 2,39 (m,1H), 2,75 (bd,1H), 2,96 (s,1,5H), 3,17 (s,1,5H), 3,50-3,65 (m,2,5H), 3,70-3,85 (m,1,5H), 3,93 (m, 2H), 4,69 (m, 0,5H), 4,94(m, 0,5H), 8,05 (d,1H), 8,18-8,25 (m, 2H), 8,42 (d,1H), 9,06 (s,1H), 10,68 (s,1H),11,38 (s,1H).

Vreme Zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,47 min.

MS (M+H<+>): 474.

PRIMER 68: ( 6- hloro- 9H- beta- karbolin- 8- ilVamid ( S)- 6. 6- Dimetil- 4- fpiridin- 3-

ilkarbamoilmetil)- morfolin- 3- karboksilne kiseline

Željeno jedinjenje se dobija prema Postupku F iz [(S)-5-(6-Hloro-9H-beta-karbolin-8-ilkarbamoil)-2,2-dimetil-morfolin-4-il]-sirćetne kiseline i 3-aminopiridina. Porizvod se izoluje kao hidrohlorid so sa 55% prinosom.

<1>H NMR (300 MHz, D20) : 5 1,34 (s, 3H), 1,54 (s, 3H) , 2,60 (d,IH), 3,4 (d, 1H), 3,50 (d, 1H), 3,70 (t, 1H) , 3,81 (d, 1H) 4,23 (d, 2H), 7,69 (d, 1H), 7,98 (d, 1H),

8,01 (d, 1H), 8,17(d, 1H), 8,42 (d, 1H), 8,48-8,55 (m, 3H), 9,09 (s,IH), 9,30 (d, 1H).

Vreme Zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,56 min.

MS (M+H<+>): 493,2.

PRIMER 69: ( 6- hloro- 9H- beta- karbolin- 8- in- amid ( S)- 6. 6- Dimetil- 4- ir( piridin- 4-

ilmetil)- karbamoin- metilVmorfolin- 3- karboksilne kiseline

Željeno jedinjenje se dobija prema Postupku F iz [(S)-5-(6-Hloro-9H-beta-karbolin-8-ilkarbamoil)-2,2-dimetil-morfolin-4-il]-sirćetne kiseline i 4-(aminometil)piridina. Porizvod se izoluje kao hidrohlorid so sa 53% prinosom.

<1>HNMR (300 MHz, D20) : 5 1,34 (s, 3H), 1,49 (s, 3H), 2,64(d, 1H), 3,03 (d, 1H), 3,48 (d, 1H) , 3,72 (t, 1H) , 3,74 (d,1H), 4,15-4,25 (m, 2H), 7,66 (d, 1H), 7,88 (s, 1H), 7,91 (s, 1H), 8,21 (d, 1H), 8,44 (d,1H), 8,53 (d, 1H), 8,56 (s, 1H) , 8,58 (s, 1H), 9,08 (s, 1H).

Vreme Zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard):

1,47 min.

MS (M+H<+>): 507,3.

PRIMER 70: ( 6- hloro- 9H- beta- karbolin- 8- ilVamid 4- r2-( 4- Hidroksimetil- piperidin-1 - il)- 2- okso- etin- 6, 6- dimetil- morfolin- 3- karboksilne kiseline

[5-(6-Hloro-9H-beta-karbolin-8-ilkarbamoil)-2,2-dimetil-morfolin-4-il]-sirćetna

kiselina (200 mg, 0,48 mmol) i piperidin-4-il-metanol (111 mg, 0,96 mmol) se rastvore u piridinu (4 mL). Nastali žuti rastvor se meša na sobnoj temperaturi tokom 10 min i zatim se dodaje EDC (184 mg, 0,96 mmol) u jednoj porciji. Reakciona smeša se ostavi da se meša preko noći (16 h). Dodaje se voda (4 mL) i smeša se koncentriše pod sniženim pritiskom. Nastali ostatak se razdvaja između etilacetata (50 mL) i 1 M vodenog rastvora kalijum karbonata. Vodeni sloj se ponovo ekstrahuje sa etil acetatom (3 x 50 mL) i kombinovani ekstrakti se operu sa vodom i koncentrovanim rastvorom soli, osuše preko natrijum sulfata, filtriraju i koncentrišu. Sirovi ostatak se prečišćava pomoću hromatografije na silikagelu (metilen hlorid i metanol gradijent) da bi se dobio čist (6-hloro-9H-beta-karbolin-8-il)-amid 4-[2-(4-hidroksimetil-piperidin-1-il)-2-okso-etil]-6,6-dimetilmorfolin-3-karboksilne kiseline u obliku žute pene (152 mg, 62%). Bis-HCI so se

dobija dodavanjem 2 mola koncentrovane HCI u etanolni rastvor slobodne baze. Koncentrovanje, i posle toga trituracija etrom daju so u obliku tečljivog žutog praha.

<1>H-NMR (slobodna baza, 300 MHz, CDCI3) 5: 11,03 (d, 1 H), 10,51 (d, 1 H), 8,97 - 8,80 (m, 1 H), 8,47 - 8,27 (m, 2 H), 7,94 - 7,76 (m, 2 H), 4,84 (d, 1 H) , 4,16 - 3,77 (m, 3 H), 3,68 - 3,26 (m, 5 H), 3,08 (ddd, 1 H), 2,89 - 2,64 (m, 2 H), 2,50 - 2,37(m, 2H), 1,98 -1,70 (m, 3 H), 1,38 (s, 3H), 1,25 (s, 3 H), 1,19-0,97 (m, 1).

MS (NH4OAC standardni uslovi, ES+) e/z = 514 (M+H)<+>

DAD Rf = 1,51 min

PRIMER 71: ( 6- hloro- 9H- beta- karbolin- 8- il)- amid 4- f2-( 4- Hidroksi- piperdin- 1- il)- 2-

okso- etiH- 6. 6- dimetil- morfolin- 3- karboksilne kiseline

Željeno jedinjenje se sintetizuje upotrebom [5-(6-Hloro-9H-beta-karbolin-8-ilkarbamoil)-2,2-dimetil-morfolin-4-il]-sirćetne kiseline i 4-hidroksipiperazina sledeći Postupak F sa 31% prinosom.

<1>H-NMR (300 MHz, D20) : 5 8,85 (IH.s), 8,19 (2H, s), 7,82 (1H, s), 7,44 (1H, s), 4,15 (2H, m), 3,9-3,75 (4H, m), 3,6 (2H, m), 3,56 (2H, m), 3,12 (1H, m), 2,9 (3H, m), 2,8 (1H, m), 1,7 (2H, m)1,34 (3H, s), 1,19 (3H, s)

Vreme Zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,5 min

MS (M+H+): 501

PRIMER 72: ( 6- hloro- 9H- beta- karbolin- 8- in- amid 4- Dietilkarbamoilmetil- 6. 6-

dimetil- morfolin- 3- karboksilne kiseline

Željeno jedinjenje se dobija upotrebom [5-(6-Hloro-9H-beta-karbolin-8-ilkarbamoil)-2,2-dimetil-morfolin-4-il]-sirćetne kiseline i dietilamina sledeći Postupak F sa 60% prinosom.

^-NMR (300MHz, D20): 5 8,87 (1H, s), 8,26 (2H, m), 7,8 (1H, s), 7,52 (1H, s), 4,1 (3H, m) , 3,8 (2H, m) , 3,22 (2H, m) , 3,0 (1H, d) , 2,7 (1H, d) , 1,3 ( 3H, s), 1,19 (3H, s), 0, 09 (6H, m).

Vreme Zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,96 min

MS (M+H+): 472

PRIMER 73: ( 6- hloro- 9H- beta- karbolin- 8- in- amid 6. 6- dimetil- 4- f- 2-( 4- metilpiperazin- 1 - in- 2- okso- etil1- morfolin- 3- karboksilne kiseline

Željeno jedinjenje se dobija upotrebom [5-(6-Hloro-9H-beta-karbolin-8-ilkarbamoil)-2,2-dimetil-morfolin-4-il]-sirćetne kiseline i 1-metilpiperazina sledeći Postupak F sa 12% prinosom.

<1>H-NMR (DMSO) 5 11,28 (1H, s), 10,35 (1H, s), 9,01 (IH,s), 8,37 (1H, s), 8,21-8,15 (2H, m), 7,9 (1H, s), 3,89 (2H, m), 3,7 (5H, m), 3,1 (2H, m), 2,85 (2H, m), 2,49 (3H, s), 2,4 (3H, m), 1,2 (3H, s), 1,16 (3H, s)

Vreme Zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,34 min.

MS (M+H+): 500

PRIMER 74: ( 6- hloro- 9H- B- karbolin- 8- in- amid 4- r2-( 2. 6- Dimetil- morfolin- 4- il)- 2-

okso- etin- 6. 6- dimetil- morfolin- 3- karboksilne kiseline

Željeno jedinjenje se dobija upotrebom [5-(6-Hloro-9H-beta-karbolin-8-ilkarbamoil)-2,2-dimetil-morfolin-4-il]-sirćetne kiseline i 2,6-dimetil morfolina sledeći Postupak F. Hromatografsko prečišćavanje daje željeni proizvod sa 70-80% prinosom.

<1>H-NMR (300 MHz, CDCI3) : 5 9,31 (s, 1H) , 8,75 (d, 1H) , 8,55 (d, 1H), 8,37 (d, 1H), 8,14 (m, 1H), 4,73 (m, 2H), 4,96 (m, 1H) , 4,37 (m, 2H), 3,69 (m, 2H), 3,57 (m, 4H) , 2,82 (t, 1H), 2,47 (t, 1H) , 1,50 (d, 3H) , 1,42 (d, 3H) , 1,18 (m, 6H) Vreme Zadržavanja (LC, postupak: nravlja kiselina standard): 1,14 min

(Diode array).

MS (M+H+):514, (M-H+): 512

PRIMER 75: metil estar 1- f2- r5-( 6- Hloro- 9H- beta- karbolin- 8- ilkarbamoin- 2. 2-

dimetil- morfolin- 4- ill- acetil}- piperidin- 4- karboksilne kiseline

kiselina (200 mg, 0,48 mmol) i metil izonipekotat (137 mg, 130 uL, 0,96 mmol) se rastvore u piridinu (4 mL) i mešaju na sobnoj temperaturi 10 min. EDC se dodaje i reakciona smeša se ostavi da se meša na sobnoj temperaturi preko noći (16 h). Dodaje se dodatni metil izonipekotat (137 uL, 0,96 mmol) i smeša se meša dodatnih 24 h. Dodaje se voda (4 mL) i smeša se koncentriše. Sirovi ostatak se raspodeli između etil acetata (75 mL) i 1 M vodenog kalijum karbonata (50 mL).

Vodena faza se ponovo ekstrahuje sa dodatnim etil acetatom (75 + 50 mL). Kombinovani ekstrakti se operu sa vodom i koncentrovanim rastvorom soli, osuše preko natrijum sulfata, filtriraju, koncentrišu i prečišćavaju silikagel hromatografijom (metilen hlorid/metanol gradijent) da bi se dobila slobodna baza u obliku žute pene (150 mg, 57%). Bis-HCI so se dobija dodavanjem 2 mola koncentrovane HCI u etanolni rastvor slobodne baze. Koncentrovanje, za kojim sledi trituracija sa etrom, daje so u obliku tečljivog žutog praha.

<1>H-NMR (slobodnda baza, 300 MHz, CDCI3) 5 11,04 (d, 1 H), 10,48 (d, 1 H), 8,95 (s, 1 H), 8,48 - 8,31 (m, 2 H), 7,96 - 7,79 (m, 2 H), 4,48 (dd, 1 H), 4,13 - 3,92 (m, 2 H), 3,88 - 2,97 (m, 9 H), 2,84 - 2,35 (m, 3 H), 2,09 - 1,90 (m, 2 H), 1,85 -1,52 (m, 2 H), 1,38 (s, 3 H), 1,23 (s, 3 H).

MS (NH4OAc standardni uslovi, ES+) e/z = 542 (M+H)<+>

DAD Rf = 1,72 min

PRIMER 76: ( 6- hloro- 9H- beta- karbolin- 8- il)- amid- bis- hidrohlorid so ( S)- 4- f2-( 3. 3-Dimetil- morfolin- 4- il)- 2H3kso- etin- 6. 6- dimetil- morfolin- 3- karboksilne kiseline

2,2-Dimetilmorfolin (3,0 g, 26,1 mmol) (dobijen prema postupku Cottle, D.L., et al.J. Org. Chem.1946,11, 286-291)rastvori se u dihlorometanu (60 mL). Dodaje se trietilamin (3,6 mL, 2,66 g, 26,1 mmol) i reakcija se ohladi na -10°C. Dodaje se bromoacetil hlorid (2,2 mL, 4,08 g, 26,1 mmol) kap po kap i rastvor se zagreje polako do sobne temperature. Reakcija se koncentriše do suva u vakuumu, ponovo rastvori u etil acetatu i propusti kroz čep silikagela. Eluant se koncentriše do žutog ulja (3,45 g, 56%) koje se prenosi u sledeći korak.

Vreme Zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,20 min.

MS (M+H+) : 237.

Intermedijer 59 (60 mg, 0,14 mmol) se suspenduje u dihlorometanu (3 mL). Dodaje se rastvor 1M kalijum karbonaat (0,5 mL). Odvoji se organski sloj, osuši preko MgS04i koncentriše do suva. Slobodna baza se rastvori u DMF (1 mL) i meša na sobnoj temepraturi. 2-Bromo-1-(3,3-dimetil-morfolin-4-il)-etanon (30 mg, 0,13 mmol) rastvori se u DMF (1 mL) i dodaje kap po kap. Reakcija se meša tokom 3 h na sobnoj temperaturi i koncentriše do suva u vakuumu. Hromatografija na fleš koloni (93:7 dihlorometan:metano!) daje žuto ulje, koje se rastvori u 4M HCI/dioksan (2 mL). Koncentrovanje u vakuumu daje naslovljeno jedinjenje u obliku čvrste žute supstance (22 mg, 29%).<1>HNMR (300 MHz, MeOH-d4): 5 1,35 (s, 3H) , 1,41 (s, 3H), 1,43 (s, 6H), 2,98 (m, 1H), 3,45 (m, 4H), 3,56 (m, 1H), 3,76 (m, 3H), 4,30 (m, 4H), 8,04 (s, 1H), 8,39 (s, 1H), 8,52 (d, 1H), 8,73 (d, 1H), 9,24 (s,1H)

Vreme Zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,16 min.

MS (M+H<+>): 514

PRIMER 77: ( 6- hloro- 9H- beta- karbolin- 8- in- amid 4- fCfrans- 4- hidroksi-

cikloheksilkarbamoil)- metin- 6. 6- dimetil- morfolin- 3- karboksilne kiseline

kiselina (200 mg, 0,48 mmol), frans-4-aminocikloheksanol hidrohlorid (145 mg, 0,96 mmol) i diizopropiletilamin (124 mg, 167 uL, 0,96 mmol) se rastvore u piridinu (4 mL) i mešaju na sobnoj temepraturi 10 min. Dodaje se EDC (184 mg) i reakcija se meša na sobnoj temepraturi preko noći (16 h) . Dodaje se voda (2 mL) i nastala smeša se koncentriše pod sniženim pritiskom. Nastali ostatak se razblaži sa 50 mL 1 M vodenog rastvora kalijum karbonata i ekstrahuje sa etil acetatom (75 + 2 x 50 mL). Kombinovani ekstrakti se operu vodom i koncentrovanim rastvorom soli, osuše preko natrijum sulfata, filtriraju i koncentrišu. Sirovi ostatak se prečišćava silikagel hromatografijom (metanol / metilen hlorid gradijent) da bi se dobio čist (6-hloro-9H-beta-karbolin-8-il)-amid 4-[(trans-4-hidroksi-cikloheksilkarbamoil)-metil]-6,6-dimetil-morfolin-3-karboksilne

kiseline (148 mg, 59%) u obliku žute pene. Bis-HCI so se dobija dodavanjem 2 ekivalenta koncentrovane HCI u etanolni rastvor slobodne baze. Koncentracija, koju sledi etarska trituracija daje so u obliku tečljivog, žutog praha.

<1>H-NMR (slobodna baza, 300 MHz, CDCI3) 5 11,71 (br s, 1 H), 10,21 (s, 1 H), 9,06 (s, 1 H), 8,45 - 8,27 (m, 2 H), 8,08 - 7,84 (m, 2 H), 6,36 (br s, 1 H), 4,13 - 3,81 (m, 3 H), 3,72 - 3,56 (m, 1H), 3,51 - 3,37 (m, 2 H), 3,03 (d, 1 H), 2,79 -2,26 (m, 5 H), 2,16 -1,94 (m, 4 H), 1,54-1,30 (m, 5 H), 1,22 (s, 3 H).

MS (NH4OACstandardni uslovi, ES+) e/z = 514 (M+H)<+>

DAD Rf = 1,39 min

PRIMER 78: ( 6- hloro- 9H- beta- karbolin- 8- il)- amid- d/ s- hidrohlorid so ( 5)- 4- f2-( f2R5R)- 2. 5- Dimetil- pirolidin- 1- ilV2^

kiseline

(2R,5R)-2,5-Dimetil-pirolidin hidrohlorid (270 mg, 2,0 mmol) (dobijen upotrebom postupka Masamune, S., et al.J. Org. Chem.1989,54,1756) rastvori se u dihlorometanu (3 mL) i ohladi na 0°C. Dodaje se trietilamin (405 mg, 0,56 mL, 4,0 mmol). Hloroacetil hlorid (226 mg, 0,16 mL, 2,0 mmol) se rastvori u dihlorometanu (1 mL) i dodaje kap po kap. Smeša se zagreje do sobne temperature i meša dodatnih 30 min. Reakcija se razblaži dihlorometanom (5 mL), ekstrahuje sa 1M HCI i concentrovanim rastvorom soli, zatim osuši preko MgS04. Organski sloj se koncentriše do mrkog ulja. Mas.: 242 mg (82%).

Vreme Zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 1,24 min.

MS (M+H<+>): 176,5. Materijal se prenosi u sledeći korak bez daljeg prečišćavanja.

Intermedijer 59 (495 mg, 1,15 mmol) rastvori se u smeši acetonitrila (8 mL) i vode (2 mL). Dodaje se kalijum karbonat (477 mg, 3,45 mmol) i reakcija se zagreje do 40<a>C. 2-Hloro-1-((2R,5R)-2,5-dimetil-pirolidin-1-il)-etanon (242 mg, 1,38 mmol)

(dobijen kako je gore opisano) rastvori se u acetonitrilu (1 mL) i dodaje kap po kap. Reakcija se zagreje do 80°C i meša preko noći. Reakcija se ohladi na 40 °C. Natrijum jodid (207 mg, 1,38 mmol) se rastvori u acetonu (1 mL) i dodaje u jednoj porciji. Reakcija se meša preko noći na 40 °C. Reakcija se koncentriše u vakuumu i razblaži etilacetatom (40 mL). Organski sloj se ekstrahuje dva puta sa vodom, koncentrovanim rastvorom soli zatim osuši preko MgS04. Organski sloj se filtrira , i koncentriše do oranž pene u vakuumu. Hromatografija na fleš koloni (95:5 dihlorometan/metanol) daje žutu čvrstu supstancu, koja se rastvori u 4N HCI/dioksan (1 mL) i koncentriše do suva. Trituracija etrom daje naslovljeno jedinjenje u obliku žute čvrste supstance (18 mg, 3%).

<1>H-NMR (300 MHz, MeOH-d4): 5 1,23 (dd, 6H) , 1,38 (s, 3H), 1,48 (s, 3H) , 1,65 (m, 2H) , 2,23 (m, 2H) , 3,18 (m, 1H) , 3,50 (m, 1H), 3,66 (m, 1H), 4,18 (m, 2H) , 4,35 (m, 4H), 8,15 (s, 1H), 8,42 (s, 1H), 8,55 (d, 1H) , 8,78 (d, 1H), 9,29 (s, 1H). Vreme Zadržavanja (LC, postupak: amonijum acetat standard): 2,02 min.

MS (M+H<+>): 498.

PRIMER 79: ( 6- hloro- 9H- 8- karbolin- 8- ilVamid 4-( 2- f4-( 1- Hidroksi- 1- metil- etih-

piperidin- 1- in- 2- okso- etil)- 6, 6- dimetil- morfolin- 3- karboksilne kiseline.

Rastvor metil estra 1-{2-[5-(6-hloro-9H-B4<:arbolin-8-ilkarbamoil)-2,2-dimetilmorfolin-4-il]-acetil}-piperidin-4-karboksilne kiseline (62 mg, 0,11 mmol) u smeši bezvodnog etra i toluena (1 mL: 1 mL) meša se na 0° C pod N2. U ovaj rastvor se lagano dodaje metilmagnezijum bromid (3,0 M u etru, 306uL, 0,917mmol) . Reakciona smeša se meša na sobnoj temperaturi preko noći, i zatim priguši dodavanjem zasićenog vodenog rastvora natrijum bikarbonata. Nastala smeša se dalje razblaži vodom (10 mL) i etil acetatom (30 mL). Vodeni sloj se ukloni i ekstrahuje sa etil acetatom (30x2 mL). Organski slojevi se kombinuju, operu koncentrovanim rastvorom soli, osuše preko magnezijum sulfata, filtriraju i koncentrišu da bi se dobila žuta čvrsta supstanca (85 mg). Ostatak se prečišćava pomoću HPLC, da bi se dobio čist proizvod (13 mg, 20%).

<1>H-NMR (300 MHz, HCDCI3): 5 10,94 (d, 1 H), 10,47 (d, 1 H), 8,94 (s, 1 H), 8,41 (d, 1 H), 8,32 (d, 1 H), 7,89 - 7,81 (m, 2H) , 4,91 (d, 1 H), 4,04 - 3,91 (m, 2 H); 3,64 - 3,57 (m, 1 H), 3,43 (s, 1 H), 3,37 - 3,31 (m, 1 H), 3,15 - 2,90 (m, 1 H), 2,77 - 2,58 (m, 2 H), 2,47 - 2,41 (m, 1 H) , 2,00 - 1,86 (m, 2 H), 1,53 - 1,03 (m, 17 H). NH4OAC standardni uslovi.

DAD Rf = 1,8 5 min

M+H = 542

PRIMER 80: ( 6- hloro- 9H- beta4<arbolin- 8- in- amid 4- r2-( 3. 3- Dimetil- 4- okso-

piperidin- 1- il)- 2- okso- etin- 6. 6- dimetil- morfolin- 3- karboksilne kiseline

7erc-butil estar 4-okso-piperidin-1-karboksilne kiseline (5 g, 25 mmol) rastvori se u tetrahidrofuranu (100 mL) i nastali rastvor se ohladi na 0 °C. Dodaje se natrijum hidrid (60% u mineralnom ulju, 2,10 g, 53 mmol) dodaje se u ohlađeni rastvor odjednom, i nastala mutna smeša se ostavi da se meša tokom 10 min. Posle toga se dodaje metil jodid i smeša se ostavi da se zagreje do sobne temperature tokom nekoliko sati. Mešanje se nastavlja preko noći (12 h). Svetio oranž smeša se koncentriše pod sniženim pritiskom. Ostatak se raspodeli između etra i vode. Vodena faza se ponovo ekstrahuje sa dodatnim etrom. Kombinovani ekstrakti se operu vodom i koncentrovanim rastvorom soli, osuše preko natrijum sulfata, filtriraju i koncentrišu do svetio žute čvrste supstance. Čvrsta supstanca se

trituriše sa 4% etil acetatom u heksanima (50 mL) da bi se dobio ferc-butil estar 3,3-dimetil-4-okso-piperidin-1 -karboksilne kiseline u obliku krem obojene čvrste supstance(1,8g, 32%).

<1>NMR (CDCI3, 300 MHz) 5 3,73 (t, 2 H), 3,43 (br s, 2 H) , 2,49 (t, 2 H), 1,49 (s, 9 H), 1,13 (s, 6 H).

Tako dobijen ferc-butil estar 3,3-dimetil-4-okso-piperidin-1 -karboksilne kiseline (450 mg, 1,97 mmol) rastvori se u metilen hloridu (10 mL). Trifluorosirćetna kiselina se dodaje (305 uL) i nastali rastvor se meša na sobnoj temepraturi 2 h. Dodaje se dodatna trifluorosirćetna kiselina (300 uL) i reakcija se meša na sobnoj temepraturi 3 dana. Bledo žuti rastvor se koncentriše da bi se dobio uljasi ostatak, koji se trituriše sa etrom. Čvrsta supstanca se pokupi vakuum filtracijom i suši u vakuumu. 3,3-Dimetil-piperidin-4-on se izoluje i koristi kao njegova so trifluorosirćetne kiseline (381 mg, 80%).

<1>H-NMR (de-DMSO, 300 MHz) 5 3,44 - 3,33 (m, 4 H), 2 , 63 -2,57 (m, 2 H), 1,11 (s, 6 H).

kiselina (100 mg, 0,24 mmol), trifluoroacetatna kisela so 3,3-dimetil-piperidin-4-ona (116 mg, 0,48 mmol) i diizopropiletilamin (62 mg, 85 nL) se rastvore u piridinu (3 mL) i mešaju 10 min. Dodaje se EDC (92 mg, 0,48 mmol) i smeša se meša na sobnoj temepraturi 4 dana. Dodaje se voda (3 mL) i prigušena reakcija se koncentriše. Ostatak se raspodeli između etil acetata (50 mL) i 1 M vodenog rastvora natrijum karbonata (50 mL). Vodena faza se ekstrahuje sa dodatnim etil acetatom (50 mL), i ekstrakti se kombinuju. Zatim se ekstrakti operu vodom i koncentrovanim rastvorom soli, osuše preko natrijum sulfata, filtriraju, osuše i koncentrišu pod sniženim pritiskom. Nastali ostatak se prečišćava silikagel hromatografijom (hloroform, etil acetat, metanol gradijent), dajući (6-hloro-9H-beta-karbolin-8-il)-amid 4-[2-(3,3-dimetil-4-okso-piperidin-1-il)-2-okso-etil]-6,6-dimetil-morfolin-3-karboksilne kiseline u obliku žute pene (91 mg, 73%). Bis-HCI so se dobija dodavanjem 2 ekvivalenta konc. HCI u etanolni rastvor slobodne baze. Koncentracija, koju sledi etarska trituracija daje so u obliku tečljivog, žutog praha.

<1>NMR (CDCb, 300 MHz) 5 10,67 (s, 1 H) , 10,37 (d, 1 H) , 8,93 (s, 1 H), 8,41 (d, 1 H), 8,15 (dd, 1 H) , 7,82 (d, 1 H) , 7,71 (d, 1 H) , 4,07 - 3,92 (m, 3 H), 3,83 - 3,89 (m, 6 H) , 2,79 - 2,68 (m, 1 H), 2,62 - 2,40 (m, 3 H), 1,41 - 1,36 (m, 3 H), 1,27 -1,22 (m, 3 H), 1,18 -1,13 (m, 3 H), 1,07 - 0,99 (m, 3 H).

MS (NH4OAC standardni uslovi, ES+) e/z = 526 (M+H)<+>

DAD Rf = 1,79 min

PRIMER 81: ( 6- hloro- 4- metil- 9H- B- karbolin- 8- il)- amid 6. 6- Dimetil- 4-( 2- okso- 2-

pirolidin- 1 - il- etil)- morfoiin- 3- karboksilne kiseline

Željeno jedinjenje se dobija prema Postupcima C, E i F iz 6-hloro-4-metil-9H-B-karbolin-8-ilamina (Intermedijer 54) i pirolidina.

<1>NMR (300 MHz, MeOD-d4) 5 9,17 (s, 1) 8,39 (s, 1) 8,26 (d, 1) 8,17 (d, 1) 4,74 - 4,52 (m, 3) 4,47 - 4,30 (m, 1) 3,80 - 3,52 (m, 3) 3,48 - 3,34 (m, 4) 3,01 (s, 3) 1,76 -1,55 (m, 4) 1,50 (s, 3)1,43 (s, 3).

NH4OAc standardni uslovi

ELSD Rf= 2,01 min.

M+H = 498

Biološko ispitivanje

Jedinjenja ovog pronalaska su efikasni inhibitori IkB kinaza (IKK), i stoga, su korisna za tretiranje stanja izazvanih ili otežanih usled aktivnosti ovih kinaza. Inhibitorna aktivnost jedinjenja formule I na IkB kinasein vitroiin vivomože se odrediti različitim postupcima poznatim u stanju tehnike. Jačina afiniteta za IkB kinaze koji pokazuju otkrivena jedinjenja može se meriti kao IC50vrednost (u nM), koja predstavlja koncentraciju (u nM) jedinjenja koja je potrebna da bi se obezbedila 50%-na inhibicija IkB kinaza.

Slede primeri testova koji mogu biti korisni za ocenjivanje i izbor jedinjenja koje modulira IKK.

Test za merenie inhibicije enzima IkB kinaze

Testin vitroza određivanje i merenje inhibitorne aktivnosti protiv IkB kinaza kompleksa od strane kandidata za farmakološko sredstvo može upotrebiti polipeptid koji premošćuje oba Ser<32>i Ser<36>na IkB (SvvissProt Accession No. P25963, Swiss Institute of Bioinformatics, Geneva, Switzerland) i jedno sredstvo za detekciju fosforilovanog proizvoda, npr. specifično antitelo koje se vezuje samo za fosforilovani oblik polipeptida, koje je bilo monoklono ili poliklono (npr., komercijalno dostupan anti-fosfino-serin<32>IkB antitela). U primeru detektovanja fosforilovanog proizvoda pomoću anti-fosfinoserin<32>IkB antitela, pošto se formira kompleks antitelo-fosfino-polpeptid, taj kompleks se može detektovati različitim analitičkim postupcima (npr., radioaktivnost, luminiscencija, fluorescencija, ili optička apsorpcija). Radi upotrebe u DELFIA (Dissociation Enhancement Lanthanide Fluorescence Immunoassav) postupku (vremenski-određena fluorometrija, Perkin Elmer Life and Analvtical Sciences Inc., Boston, MA), ovaj kompleks se može imobilisati bilo na biotin-veznoj ploči (npr., ploča obložena Neutravidin-om) i detektovati sa sekundarnim antitelom konjugovanim na europijum, ili na antitelo-veznoj ploči (npr., ploča obložena sa Protein-om A) i detektovati sa biotin-veznim proteinom konjugovanim na europijum (npr., Streptavidin-Europium). Nivo aktivnosti sa može staviti u odnos sa standardnom krivom koja koristi sintetske fosfinopeptide koji odgovaraju polipeptidu supstrata. Dole je detaljnije opisano kako se pripremaju materijali i sprovodi ovo ispitivanje.

Izolovanie IkB kinaza kompleksa

IkB-a kinaza kompleks se priprema prvo razblaživanjem 10 mL HeLa S3 ćelijskog ekstrakta S100 frakcije (Lee et al. (1997)Cell88:213-222) sa 40 mL 50 mM HEPES pH 7,5. Zatim se dodaje 40% amonijum sulfat i inkubira na ledu tokom 30 min. Nastala istaložena peleta se ponovo rastvori sa 5 mL SEC pufera (50 mM HEPES pH 7,5, 1 mM DTT, 0,5 mM EDTA, 10 mM 2-glicerofosfat), izbistri centrifugiranjem pri 20,000 x g tokom 15 min., i filtrira kroz 0,22 um filter jedinicu. Uzorak se uvodi u 320 mL SUPEROSE-6 gel filtracionu FPLC kolonu (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden) uravnoteženu sa SEC puferom koja radi sa protokom od 2 mL/min na 4 °C. Frakcije koje imaju premošćen marker molekularne mase 670-kDa grupišu se radi aktiviranja. Skupina koja sadrži kinazu aktivira se inkubacijom sa 100 nM MEKKIA (Leeet at.(1997)Cell 88:213-222), 250 uM Mg ATP, 10 mM MgCI2, 5 mM DTT, 10 mM 2-glicerofosfat, 2,5 uM Microcystin-LR, tokom 45 min na 37 °C. Aktivirani enzim se čuva na -80 °C do dalje upotrebe.

Merenje IkB kinaza fosfino- transferaza aktivnosti

U bazenčićima ploče sa 96 bazenčića, pred-inkubiraju se jedinjenja u različitim koncentracijama u 5 uL 20% DMSO tokom 30 min na 25 °C sa 40 uL aktiviranog enzima razblaženog 1:25 sa test puferom (50 mM Hepes pH 7,5, 5 mM DTT, 10 mM MgCI2l10 mM 2-glicerofosfat, 2 uM Microcvstin-LR, 0,1% Bovine Serum Albumin). Po 5 uL peptidnog substrata (biotin-(CH2)6-DRHDSGLD(fosfmoS) MKD-CONH2) pri 200 uM + 500 uM ATP dodaje se u svaki bazenčić i inkubira tokom 1 h pre prigušivanja sa 50 uL 50 mM Hepes pH 7,5, 0,1% BSA, 100 mM EDTA. U Protein A ploču (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA) koja sadrži 90 uL anti-fosfino IkB S32/S36 antitela (Cell Signaling Technologies Beverly, MA, USA) pri 2 ug/mL prenese se 5 uL prigušene kinaza reakcije. Uzorci se inkubiraju tokom 2 h uz treskanje. Posle 3 pranja sa PBS + 0,05% Tween20, dodaje se 90 uL europijum helata vezanog za streptavidin (Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Boston, MA, USA) pri 0,1 ug/mL u svaki bazenčić i inkubira tokom 1 h uz treskanje. Posle 3 pranja sa PBS + 0,05% Tween20, dodaje se u svaki bazenčić 100 uL DELFIA rastvora za poboljšanje (Perkin Elmer Life i Analvtical Sciences, Boston, MA, USA). Signal europijuma se čita sa eksitacijom od 330 nM i emisijom od 615 nM na VVallac Victor čitaču ploča (Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Boston, MA). Kako se ranije pokazalo da je test linearan u odnosu na koncentraciju enzima i vremena za testirano razblaženje enzima, nivoi signala europijuma su korišćeni za određivanje inhibitorne aktivnosti kandidata za farmakološka sredstva.

Jedinjenja ovog pronalaska su aktivni inhibitori IKK kompleksa. Ceni se da jedinjenja ovog pronalaska mogu pokazivati različite stepene inhibitornih aktivnosti za IkB kinaze. Prateći postupke testova, kao što su ovde opisaniin vitroi testove bazirane na ćelijama, srednja IC50vrednosti inhibicije IkB kinaze za otkrivena jedinjenja u opštem slučaju su ispod oko 10 uM, poželjno ispod oko 1,0 uM i i poželjnije ispod oko 100 nM. Otkrivena jedinjenja su takođe selektivna na inhibiranje IKK-2 za razliku od IKK-1.

Testovi sa ćelijama

Izolovanje linija ćelija Multiplog Mijeloma ( MM) i MM ćelija razvijenih kod

pacijenta

RPMI 8226 i U266 humane MM ćelije se nabavljaju od American Type Culture Collection (Manassas, VA). Sve linije MM ćelija se kultivišu u RPMI-1640 koji sadrži 10% serum goveđeg fetusa (FBS, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO), 2 mM L-glutamina, 100 U/mL penicilina (Pen) i 100 ug/mL streptomicina (Strep)

(proizvod GIBCO vrste ćelijske kulture koji se može nabaviti od Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). MM ćelije koje se razvijaju kod pacijenta prečišćavaju se iz koštane srži pacijenta (BM) aspiriraju upotrebom ROSETTESEP (B cell enrichment kit) sistema za separaciju (StemCell Technologies, Vancouver, Canada). Čistoća MM ćelija se potvrđuje protočnom citometrijom upotrebom PE-konjugovanog anti-CD138 antitela (BD Biosciences, Bedford, MA).

Kulture stroma ćelija koštane srži

Uzorci koštane srži (BM) se dobijaju od pacijenta sa MM. Mononuklearne ćelije (MNC) izdvojene pomoću Ficoll-Hipaque sedimentacije po gustini koriste se za uspostavljanje dugoročnih BM kultura kako je ranije opisano (Uchivamaet al., Blood1993, 82:3712-3720). Izvrši se žetva ćelija u Hank's Buffered Saline Solution (HBSS) koji sadrži 0,25% tripsina i 0,02% EDTA, operu se i sakupe centrifugiranjem.

Proliferacija ćelija preko merenja brzine DNK- sinteze

Proliferacija se meri kako je ranije opisano (Hideshima etal., Blood96:2943

(2000)). MM ćelije (3 x 104 ćelija/bazenčić) se inkubiraju u ploči za kulturu sa 96 bazenčića (Corning Life Sciences, Corning, NY) u prisustvu medijuma ili nekog IKK inhibitora ovog pronalaska tokom 48 h na 37°C. Sinteza DNK se meri pomoću inkorporiranja [<3>H]-timidina ([<3>H]-TdR, New England Nuclear division of Perkin Elmer Life and Analvtical Sciences, Boston, MA) u ćelije koje se dele. Ćelije se pulsiraju sa [<3>H]TdR (0,5 (uCi/bazenčić) tokom poslednjih 8 h kulture od 48 h. Svi eksperimanti se izvode u triplikatu.

Test preživljavanja MTT ćelija

Inhibitorni efekti prezentiranih jedinjenja na rast MM ocenjuje se merenjem smanjenja žutog tetrazolium MTT (3-(4,5-dimetiltiazolil-2)-2,5-difeniltetrazolium bromida) od strane metabolički aktivnih ćelija (J.Immunol. Methods174: 311-320, 1994). Ćelije iz 48-časovnih kultura pulziraju se sa 10 uL 5 mg/mL MTT u svaki bazenčić u toku poslednjih 4 h 48-časovnih kultura, a posle toga sa 100 uL izopropanola koji sadrži 0,04M HCI. Meri se apsorpcija pri 570 nm upotrebom spektrofotometra (Molecular Devices Corp., Sunnvvale CA).

Test NF- kB aktivacije preko šifta elektroforetske pokretljivosti

Analiza šifta elektroforetske pokretljivosti (EMSA) vrši se kako je ranije opisano (Hideshima etal., Oncogene2001, 20:4519). Ukratko, MM ćelije se pred-inkubiraju sa nekim IKK inhibitorom ovog pronalaska (10 uM tokom 90 min) pre stimulacije sa TNF-a (5 ng/mL) tokom 10 do 20 min. Ćelije se zatim peletiraju, resuspenduju u 400 uL hipotoničnog liza pufera (20 mM HEPES, pH 7,9, 10 mM KCI, 1 mM EDTA, 0,2% Triton X-100, 1 mM Na3V04, 5 mM NaF, 1 mM PMSF, 5 ug/mL leupeptina, 5 ug/mL aprotinina) , i drže na ledu tokom 20 min. Posle centrifugiranja (14000g tokom 5 min) na 4°C, nuklearna peleta se ekstrahuje sa 100 uL hipertoničnog liza pufera (20 mM HEPES, pH 7,9, 400 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM Na3V04, 5 mM NaF, 1 mM PMSF, 5 ug/mL leupeptina, 5 ug/mL aprotinina) na ledu tokom 20 min. Posle centrifugiranja (14000g tokom 5 min) na 4°C, supernatant se pokupi kao nuklearni ekstrakt. Dvolančana NF-kB konsensus oligonucleotidna proba (5'-GGGGACTTTCCC-3', Santa Cruz Biotechnologv Inc., Santa Cruz CA) obeležena je na kraju sa [(<32>P]ATP (50 uCi pri 222 TBq/mM; New England Nuclear division of Perkin Elmer Life and Analvtical Sciences, Boston, MA). Izvrše se reakcije vezivanja koje sadrže 1 ng oligonukleotida i 5 ug nuklearnog proteina na sobnoj temperaturi tokom 20 min u ukupnoj zapremoni od 10 uL vezujućeg pufera (10 mM Tris-HCi, pH 7,5, 50 mM NaCI, 1 mM MgCt2, 0,5 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 4% glicerola (vol/vol) , i 0,5 ug poli(dl-dC) (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden). Za analizu superšiffa, 1 ug anti-p65 NF-kB Ab dodaje se 5 min pre reakcionih smeša, odmah nakon dodavanja radio-označene probe. Uzorci se stavljaju na 4% poliakrilamid gel, prenesu na VVhatman papir (VVhatman International, Maidstone, U.K.), i vizuelizuju autoradiografijom.

Test proliferacije ćelija limfoma difuznih velikihB- ćelija ( DLBCL)

ABC-like (LY3 i Ly10) i GCB-like (Ly7 i Ly19) DLBCL linije ćelija (Alizadeh et al

(2000)Nature403:503-511; Daviš et al. (2001)J. Exp. Med.194:1861-1874) održavaju se u medijumu za rast (GM, Iscove-ov DMEM+10%FBS) pasažom ćelija dva puta nedeljno. Ćelije se izgladnjuju preko noći u Iscove-ovom DMEM medijumu + 0,5% FBS pre upločavanja u testu proliferacije. Na dan testiranja, ćelije se prebroje i proveri se preživljavanje upotrebom Trypan Blue bojenja. Za Ly3 i Ly10 ćelije, 5000 ćelija se uploči u GM po bazenčiću u ploči sa 96 bazenčića. Ćelije Ly7 i Ly19 se uploče po 10,000 ćelija po bazenčiću. IKK inhibitori se prvo rastvore u DMSO i zatim razblaže u GM da bi se dostigle krajnje koncentracije od 80 pM -0,01 uM. Svaka koncentracija se uploči u triplikatu. Preživljavanje ćelija se određuje upotrebom standardnog VVST-1 testa preživljavanja ćelija (Roche Applied Science, Indianapolis, IN).

Test otpuštanja citokina monocita humane periferne krvi ( PBMC)

Humani PBMC se prečišćava od normalne kompletne krvi donora pomoću Ficoll gradijent postupka. Posle PBS pranja, PBMC se resuspenduje u AIM-V medijumu. Dodaju se serijski razblaženi IKK inhibitori ovog pronalaska u 100% DMSO pri 1 uL na dno ploče sa 96-bazenčića i meša sa 180 uL 4,5 X 10<5>PBMC u AIM-V medijumu po bazenčiću. Posle pred-inkubiranja PBMC sa inhibitorom na 37°C tokom 40 min, ćelije se stimulišu sa 20 uL bilo sa LPS (100 ng/mL) ili sa anti-CD3 (0,25Mg/mL) i anti-CD28 (0,25(ug/mL) (Pharmingen division of BD Biosciences, Bedford, MA) na 37°C tokom 5 h. Pokupe se supernatanti i ocenjuju na otpuštanje IL-1B ili TNFa upotrebom standardnih komercijalno dostupnih ELISA kompleta.

Test otpuštnja humanih hondrocita matričnih metaloproteaza ( MMP)

Ćelijska linija humanih hondrocita SVV1353 (ATCC, Manassas, VA) kultiviše se uz sadržaj 10% seruma govećeg fetusa (Hvclone, Logan, UT), 2 mM L-glutamina (GIBCO vrsta proizvoda ćelijske kulture koja se može nabaviti od Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) i 1% Pen/Strep (GIBCO). Ćelije sezaseju u Poly-D-Lvsine ploče sa 96 bazenčića (BD BIOCOAT, Black/Clear bottom, BD Biosciences, Bedford, MA). Dodaju se senjski razblaženi IKK inhibitori po 1 uL u svaki bazenčić na ploči sa 96 bazenčića i mešaju sa 180 uL 4,5 X 105 hondrocita po bazenčiću. Posle pred-inkubacije ćelija sa jedinjenjima tokom 1 h na 37°C, ćelije se stimulišu sa 20 uL IL-1B (10 ng/mL, R&D Svstems Inc.) na 37°C tokom 24 h . Zatim se pokupe supernatanti i ocenjuje proizvodnja matričnih metaloproteinaza (MMP) upotrebom komercijalno dostupnih ELISA kompleta.

Test na humanim fibroblastolikim sinoviocitima ( HFLS)

HFLS izolovane iz RA sinovijalnih tkiva dobijenih kod operacija zamene zgloba nabavljaju se od Cell Applications Inc. (San Diego, CA). Inhibitori IKK ovog pronalaska testiraju se na njihovu sposobnost da blokiraju TNF- ili IL-1B-indukovano otpuštanje IL-6 ili IL-8 iz ovih ćelija upotrebom komercijalno dostupnih ELISA kompleta. Uslovi za kulturu ćelija i test metodi su opisani u Aupperle etal.,Journal of lmmunology,163:427-433(1999).

Test sa mast ćelijama izvedenim iz krvi humane pupčane vrpce

Krv humane pupčane vrpce se nabavlja od Cambrex (VValkersville, MD). Mast ćelije se diferenciraju i kultivišu na način sličan onom koji je opisan od strane Hsieh et al.,J. Exp. Med,193:123-133 (2001). IKK inhibitori ovog pronalaska se testiraju na njihovu sposobnost da blokiraju IgE- ili LPS-indukovano otpuštanje TNFa upotrebom komercijalno dostupnih ELISA kompleta.

Diferencijacija osteoklasta i funkcionalni testovi

Humani osteoklast prekursori se nabavljaju u krio-prezervisanom stanju od Cambrex (VValkersville, MD). Ove ćelije se na bazi instrukcija proizvođača diferencijraju u kulturu. IKK inhibitori ovog pronalaska se testiraju na njihovu sposobnost da blokiraju diferencijaciju, resorpciju kosti i degradaciju kolagena kako je ranije opisano (vidi Khapli, S. M.,Journal of Immunol,171:142-151

(2003); Karsdal, M. A.,J Biol Chem,278:44975-44987 (2003); i Takami, M.,Journal of Immunol,169:1516-1523 (2002)).

Modeli pacova za reumatoidni artritis

Otkriveno je da su određena jedinjenja ovog pronalaska aktivna kod jednog ili više modela pacova za reumatoidni artritis. Takvo testiranje je poznato u literaturi i uključuje standardan LPS model pacova kako je opisano u Conway et al., "Inhibition of Tumor Necrosis Factor-a (TNF-a) Production and Artritis in the Rat by GVV3333, a Dual Inhibitor of TNF—Converting Enzyme and Matrix Metalloproteinases",J. Pharmacol. Exp. Ther298(3), 900-908 (2001); model adjuvantom indukovanog artritisa pacova kako je opisano u Pharmacological Methods in the Control of Inflammation (1989) p 363-380 "Rat Adjuvant Artritis: A Model of Chronic Inflammation" Barry M. VVeichman autor poglavlja knjige {Alan R. Liss Ine Publisher}; i model kolagenom indukovanog artritisa pacova kako je opisano u Pharmacological Methods in the Control of Inflammation (1989) p 395-413 "Type II Collagen Induced Artritis in the Rat" DE Trentham i RA Dynesuis-Trentham autori poglavlja knjige {Alan R. Liss Ine Publisher}. Vidi takođe, "Animal Models of Artritis: Relevance to Human Disease" (1999) od autora A. Bendele, J. McComb, T. Gould, T. McAbee, G. Sennello, E. Chlipala i M. Guy. Toxicologic Pathology Vol 27 (1) 134-142.

Na bazi rezultata jednog ili više modela pacova kao što su oni opisani gore, jedinjenja formule ll-C su se pokazala iznenađujuće superiornijim u poređenju sa drugim jedinjenjima kada Prsten A predstavlja prsten piridina. Takođe kod modela pacova, jedinjenja formule lll-A-a, naročito jedinjenja formule lll-A-aa, pokazala su se iznenađujuće superiornijim u poređenju sa drugim jedinjenjima kada Prsten A predstavlja morfolin prsten.

Kako smo opisali samo određeni broj realizacija ovog pronalaska, očigledno je da naši osnovni primeri mogu da se izmene kako bi se obezbedile druge realizacije, koje upotrebljavaju jedinjenja i postupke ovog pronalaska. Stoga se smatra da obuhvat ovog pronalaska definišu priloženi zahtevi, pre nego specifične

realizacije koje su predstavljene putem primera.

Claims

1. Jedinjenje formule I: ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time, što: Prsten A se bira iz grupe koju čine: (a) piridinil ili pirimidinil prsten koji je supstituisan sa (i) -CH2C(0)-G i 0-1 R6aili (ii)1-2R6a, i (b) morfolinil, piperidinil, piperazinil, pirolidinil, piranil, tetrahidrofuranil, cikloheksil, ciklopentil ili tiomorfolinil prsten koji je supstituisan sa (i) -C(R<9>)3, -W-G, ili -G, (ii) 0-4 R<6b>i (iii) 0-1 okso grupa na ugljeniku iz prstena ili 0-2 okso grupa na sumporu iz prstena ; svaki R<6a>se nezavisno bira između Ci-salifatični, halo, alkoksi, ili amino; svaki R<6b>se nezavisno bira između Ci-3alifatični ili -N(R<7>)2, i dva R<6b>na istom ili susednom ugljeniku opcionalno su uzeta zajedno sa uključenim uglenikom(cima) da bi se formirao 5-6-člani prsten koji ima 1-2 heteroatoma u prstenu koji se biraju između N, O ili S; Wje -Q-, -Q-C(0)-, -C(R<9>)2-C(R9)(R12)- ili -C(R<9>)2-[C(R9)(R1<2>)]2-; Qje -C(R9)2-ili -C (R9) 2C (R9) 2-; G je -OH, -NR4R<5>, -N(R<9>)CONR4R<5>, -N(R<9>)S02(C1-3alifatični), - N(R<9>)COCF3, -N(R9)CO(Ci^alifatični) , -N(R<9>)CO(heterociklil), N(R<9>)CO(heteroaril) , -N(R<9>)CO(aril), 3-7 člani heterociklil prsten, ili 5-6 člani heteroaril, gde je svaki od heteroaril, aril i heterociklil ostataka G opcionalno supstituisan sa 1-3 R<10>, R<1>je vodonik, halo, Ci^alifatični, amino, cijano, (Ci.3alkil)i.2amino, Ci-3alkoksi, -CONH2, -NHCOCF3, ili -CH2NH2; R<2>je vodonik, halo, Ci-3alifatični, -CF3; R<3>je vodonik, halo, Ci^alifatični, Ci^haloalkil, Ci-ealkoksi, hidroksi, amino, cijano, ili (Ci-6alkil)i.2amino; R<4>je vodonik, 3-7 člani heterociklil, ili Ci-ealifatični; R<5>je vodonik, Ci-6alifatična grupa ili 3-7 člani heterociklični prsten koji ima 1-2 heteroatoma u prstenu koji se biraju između N, O, ili S, gde je R<5>opcionalno supstituisan sa halo, -OR<7>, -CN, -SR8 -S(0)2R<8>, -S(0)2N(R<7>)2, -C(0)R<7>, -C02R<7>, - N(R<7>)2, -C(0)N(R<7>)2, -N(R<7>)C(0)R<7>, -N(R<7>)C02R<8>, ili -N(R<7>)C(0)N(R<7>)2; svaki R<7>se nezavisno bira između vodonika ili Ci ^alifatični, ili dva R<7>na istom atomu azota uzeti zajedno sa azotom formiraju 5-6 člani heteroaril ili heterociklil prsten; svaki R<8>se nezavisno bira između Ci-4alifatični svaki R<9>se nezavisno bira između vodonika ili C^alifatični; svaki R<10>se nezavisno bira između okso, -R<11>, -T-R11, ili -V-T-R<11>; svaki R<11>se nezavisno bira između Ci-6alifatični, halo, -S(0)2N(R<7>)2, -OR<7>, -CN, -SR<8>, -S(0)2R<8>, -C(0)R<7>, -C02R<7>, -N(R<7>)2, -C(0)N(R<7>)2, -N(R<7>)C(0)R<7>, - N(R<7>)C02R<7>, ili -N(R<7>)C(0)N(R<7>)2; T je ravan ili račvast Ci-4alkilen lanac; V je -0-, -N(R<7>)-, -S-, -S(0)-, -S(0)2-, -C(0)-, ili -C02-; i R12 je vodonik ili aminokiselinski bočni lanac.

2. Jedinjenje iz Zahteva 1, naznačeno time, što Prsten A predstavlja 3-piridinil ili 5-pirimidinil prsten supstituisan sa 1 -2 R6a grupe.

3. Jedinjenje iz Zahteva 2 koje ima formulu ll-C: naznačeno time, što: Y je N ili CH, R<1>je vodonik, halo, Ci-3alifatični, amino, cijano, (Ci-3alkil)i-2amino, Ci-3alkoksi, -CONH2, -NHCOCF3, ili -CH2NH2; R2 je vodonik, halo, Ci-3alifatični, -CF3; R<3>je vodonik, halo, Ci-6alifatični, d^haloalkil, Ci-6alkoksi, hidroksi, amino, cijano, ili (Ci-6alkil)i_2amino; i R<6a>se bira između Ci-6alifatični ili halo.

4. Jedinjenje iz Zahteva 3 , naznačeno time, što je R<6a>metil.

5. Jedinjenje iz Zahteva 4 , naznačeno time, što je R<1>vodonik, metil, amino ili fluoro; R<2>je vodonik ili halo; i R3 je vodonik, halo ili d^alkoksi.

6. Jedinjenje iz Zahteva 5 , naznačeno time, što jeY CH.

7. Jedinjenje iz Zahteva 5, naznačeno time, što Y predstavlja N.

8. Jedinjenje iz Zahteva 1, naznačeno time, što se Prsten A bira između morfolinila, piperidinila, piperazinila, pirolidinila, piranila, tetrahidrofuranila, cikloheksila, ciklopentila ili tiomorfolinila i gde je Prsten A supstituisan sa (i) -C(R<9>)3ili -W-G, (ii) 0-4 R<6b>i (iii) 0-1 okso grupa na ugljeniku iz prstena ili 0-2 okso grupa na sumporu iz prstena .

9. Jedinjenje iz Zahteva 8, naznačeno time, što je -W-G ili -C(R<9>)3supstituent na Prstenu A u orto prema položaju gde je beta-karbolin deo vezan.

10. Jedinjenje formule lll-A: ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time, što: Prsten A je supstituisan sa 0-4 R<6b>; svaki R<6b>se nezavisno bira između Ci^alifatični ili -N(R<7>)2, i dva R<6b>na istom ili susednom ugljeniku se opcionalno uzimaju zajedno sa uključenim ugljenikom(cima) da bi se formirao 5-6 člani prsten koji ima 1-2 heteroatoma u prstenu koji se biraju između N, O ili S; Wje -Q-, -Q-C(0)-, -C(R<9>)2-C(R<9>) (R<12>)-, ili -C(R<9>)2-[C(R9)(R1<2>)]2-; Qje -C(R9)2-ili -C(R9)2C(R9)2-; G je -OH, -NR<4>R<5>, -N(R<9>)CONR<4>R<5>, -N(R<9>)S02(Ci-3alifatični), - N(R<9>)COCF3, -N(R9)CO(Ci.6alifatični) , -N(R<9>)CO(heterociklil) N(R<9>)CO(heteroaril) , -N(R<9>)CO(aril) , 3-7 člani heterociklil prsten, ili 5-6 člani heteroaril, gde je svaki od heteroaril, aril i heterociklil ostataka G opcionalno supstituisan sa 1-3 R<10>; R<1>je vodonik, halo, Ci-3alifatični, amino, cijano, (Ci-3alkil)i.2amino, Ci-3alkoksi, -CONH2, -NHCOCF3, ili -CH2NH2; R2je vodonik, halo, Ci-3alifatični, -CF3; R<3>je vodonik, halo, Ci ^alifatični, Ci-ehaloalkiI, Ci^alkoksi, hidroksi, amino, cijano, ili (Ci-6alkil)i.2amino; R4 je vodonik, 5-6 člani heterociklil, ili d^alifatični; R<5>je vodonik, Ci-6alifatična grupa ili 5-6 člani heterociklični prsten koji ima 1-2 heteroatoma u prstenu koji se biraju između N, O, ili S, gde je R<5>opcionalno supstituisan sa halo, -OR<7>, -CN, -SR<8>, -S(0)2R<8>, -S(0)2N(R<7>)2, -C(0)R<7>, -C02R<7>, - N(R<7>)2, -C(0)N(R<7>)2, -N(R<7>)C(0)R7,-N(R<7>)C02R<8>, ili -N(R<7>)C(0)N(R<7>)2; svaki R<7>se nezavisno bira između vodonika ili Ci-4alifatičnog, ili dva R<7>na istom atomu azota uzeti zajedno sa azotom čine 5-6 člani heteroaril ili heterociklil prsten; svaki R<8>se nezavisno bira između Ci-4alifatičnih svaki R<9>se nezavisno bira između vodonika ili Ci-3alifatičnih svakiR10se nezavisno bira između okso, -R<11>, -T-R<11>, ili -V-T-R<11>; svaki R<11>se nezavisno bira između Ci^alifatičnih, halo, -S(0)2N(R<7>)2, - OR<7>, -CN, -SR<8>, -S(0)2R8, -C(0)R<7>, -C02R<7>, -N(R<7>)2, -C(0)N(R<7>)2, -N(R<7>)C(0)R<7>, -N(R<7>)C02R<7>, ili -N(R<7>)C(0)N(R<7>)2; T je ravan ili račvast Ci-4alkilen lanac; Vje -0-, -N(R<7>)-, -S-, -S(0)-, -S(0)2-, -C(0)-, ili -C02-; i R12 je vodonik ili aminokiselinski bočni lanac.

11. Jedinjenje iz Zahteva 10, naznačeno time, što ima formulu (S)-lll-A: gde je n 0-4 i R<1>, R<2>, R<3>, W,Gi R<6b>su kako je definisano u Zahtevu 10.

12. Jedinjenje iz Zahteva 11, naznačeno time, što: R<1>je vodonik, halo, metil ili amino; R<2>je vodonik, metil ili halo; R3 je vodonik, halo, alkoksi, ili (Ci-6alifatični)2amino; n je 0-2; R<6b>je Ci-3alifatični; W je -Q-, -Q-C(0)-, -C(R<9>)2-C(R<9>) (R<12>)-, ili -C(R<9>)2-[C(R9)(R1<2>)]2-; Q je -C(R<9>)2- ili -C(R<9>)2C(RV; G je -NR4R<5>, -N(R<9>)C(0)NR4R<5>, -N(R<9>)S02(Ci-3alifatični) , -N(R<9>)C(0)CF3, -N (R<9>) CO (Ci-6alifatični) , i -N(R<9>)CO(heterociklil), -N(R<9>)CO(heteroaril), -N(R<9>) CO(aril) , 5-6 člani heterociklil prsten, ili 5-6 člani heteroaril, gde svaki od heteroaril, aril i heterociklil ostataka G je opcionalno supstituisan sa 1-3 R<10>; R<4>je vodonik ili Ci_6alifatični; R<5>je vodonik ili Ci-ealifatična grupa koja je opcionalno supstituisana sa halo, -OR<7>, -CN, -SR<8>, -S(0)2R<8>, -S(0)2N(R<7>)2, -C(0)R<7>, -C02R7 -N(R<7>)2, - C(0)N(R<7>)2, -N(R<7>)C(0)R<7>, -N(R<7>)C02R<8>, ili -N (R<7>)C(0)N(R<7>)2; svaki R<7>se nezavisno bira između vodonika ili Ci-4alifatičnih, ili dva R<7>na istom atomu azota uzeti zajedno sa azotom formiraju 5-6 člani heteroaril ili heterociklil prsten; svaki R<8>se nezavisno bira između Ci-4alifatičnih; R<9>je vodonik; svaki R<10>se nezavisno bira između okso, R<11>, T-R11, ili V-T-R<11>; svaki R<11>se nezavisno bira između Ci-6alifatičnih, halo, -S(0)2N(R<7>)2, - OR<7>, -CN, -SR<8>, -S(0)2R<8>, -C(0)R<7>, -C02R7, -N(R<7>)2, -C(0)N(R<7>)2, -N(R<7>)C(0)R<7>, -N(R<7>)C02R<7>, ili -N(R<7>)C(0)N(R<7>)2; T je ravan ili račvast Ci^alkilen lanac; V je -O-, -N(R<7>)-, -S-, -S(O)-, -S(0)2-, -C(O)-, ili -C02-; i R<12>je vodonik, Ci-6alifatični, supstituisan ili nesupstituisan fenil, ili supstituisan ili nesupstituisan benzil.

13. Jedinjenje iz Zahteva 12, naznačeno time, što: R<1>je vodonik, metil, fluoro ili amino; R<2>je hloro; R<3>je vodonik ili alkoksi; n je nula ili 2; R<6b>je metil; W je -Q-, -Q-C(0)- ili -C(R<9>)2-C(R<9>) (R<12>)-; Q je -C(R<9>)2- ili -C(R<9>)2C(R<9>)2-; G je -NR<4>R<5>, -N(R<9>)C(0)NR<4>R<5>, -N(R<9>)C(0)CF3, -N(R9)COfCi-6 alifatični), i -N(R<9>)CO(heterociklil),-N(R<9>)CO(heteroaril), 5-6 člani heterociklil prsten, ili 5-6 člani heteroaril, gde je svaki od heteroaril i heterociklil ostataka G opcionalno supstituisan sa 1-3 R<10>; R<4>je vodonik ili Ci-ealifatični; R<5>je vodonik ili Ci-6alifatični- svaki R<7>se nezavisno bira između vodonika ili Ci-4alifatičnih, ili dva R<7>na istom atomu azota uzeti zajedno sa azotom formiraju 5-6 člani heteroaril ili heterociklil prsten; svaki R<8>se nezavisno bira između Ci-4alifatičnih; R<9>je vodonik; svaki R<10>se nezavisno bira između okso, R11, T-R11, ili V-T-R11; svaki R<11>se nezavisno bira između Ci.6alifatičnih, halo, -S(0)2N(R<7>)2, - OR<7>, -CN, -SR<8>. -S(0)2R<8>, -C(0)R<7>, -C02R<7>, -N(R<7>)2, -C(0)N(R<7>)2, -N(R<7>)C(0)R<7>, -N(R7)C02R7 ili -N(R<7>)C(0)N(R<7>)2; T je ravan ili račvast Ci-4alkilen lanac; V je -O-, -N(R<7>)-, -S-, -S(O)-, -S(0)2-, -C(O)-, ili -C02-; i R12 je vodonik, Ci^alifatični, fenil, ili benzil.

14. Jedinjenje formule (S)-lll-A': ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačena time, što: R<1>je vodonik, metil, fluoro ili amino; R<2>je hloro; R<3>je vodonik ili alkoksi; W je -Q-, -Q-C(0)- ili -C(R<9>)2-C(R9)(R1<2>)-; Q je -C(R9)2- ili -C(R9)2C(R9)2-; G je -NR4R<5>, -N(R<9>)C(0)NR<4>R<5>,-N(R<9>)C(0)CF3, -N(R9)CO(Ci-6alifatični), i -N(R<9>)CO(heterociklil) , -N(R<9>)CO(heteroaril), 5-6 člani heterociklil prsten, ili 5-6 člani heteroaril, gde je svaki od heteroaril i heterociklil ostataka G opcionalno supstituisan sa 1-3 R<10>; R<4>je vodonik ili Ci-6alifatični; R<5>je vodonik ili Ci-ealifatični- svaki R<7>se nezavisno bira između vodonika ili Ci^alifatičnih, ili dva R<7>na istom atomu azota uzeti zajedno sa azotom formiraju 5-6 člani heteroaril ili heterociklil prsten; svaki R<8>se nezavisno bira između C^alifatičnih; R<9>je vodonik; svaki R<10>se nezavisno bira između okso, R<11>, T-R11, ili V-T-R<11>; svaki R<11>se nezavisno bira između Ci-6alifatičnih, halo, -S(0)2N(R<7>)2, - OR<7>, -CN, -SR<8>, -S(0)2R<8>, -C(0)R<7>, -C02R<7>,-N(R<7>)2, -C(0)N(R<7>)2, -N(R<7>)C(0)R<7>, -N(R<7>)C02R7, ili -N(R<7>)C(0)N(R<7>)2, T je ravan ili račvast Ci-4alkilen lanac; V je -0-, -N(R<7>)-, -S-, -S(0)-, -S(0)2-, -0(0)-, ili -C02-; i R12 je vodonik, Ci-6alifatični, fenil, ili benzil.

15. Jedinjenje iz Zahteva 14, koje ima formulu (S)-lll-A-a: naznačeno time, što je R<1>vodonik, halo, metil ili amino; R<2>je vodonik, metil ili halo; R3 je vodonik, halo, alkoksi, ili (Ci-6alifatični)2 amino; Prsten A je supstituisan sa 0-2 R<6b>; R<6b>je Ci-3alifatični; Q je -C(R9)2- ili -C (R9) 2C (R9) 2-; G je -NR<4>R<5>ili supstituisan ili nesupstituisan 5-6 člani heterociklil prsten; R4 je vodonik ili Ci-6alifatični; R<5>je vodonik ili Ci^alifatična grupa koja je opcionalno supstituisana sa halo, -OR<7>, -CN, -SR<8>, -S(0)2R<8>, -S(0)2N(R<7>)2, -C(0)R<7>, -C02R<7>, -N(R<7>)2, - C(0)N(R<7>)2, -N(R<7>)C(0)R<7>, -N(R<7>)C02R<8>, ili -N(R<7>)C(0) N (R<7>)2; svaki R<7>se nezavisno bira između vodonika ili Ci-4alifatičnih, ili dva R<7>na istom atomu azota uzeti zajedno sa azotom formiraju 5-6 člani heteroaril ili heterociklil prsten; svaki R<8>se nezavisno bira između Ci-4alifatičnih; i svaki R9 je nezavisno vodonik ili Ci_3alifatičnih.

16. Jedinjenje, naznačeno time, što se bira iz grupe koju čine:

17. Farmaceutski preparat, naznačen time, što sadrži jedinjenje iz Zahteva 1 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

18. Farmaceutski preparat, naznačen time, što sadrži jedinjenje iz Zahteva 16 i farmaceutski prihvatljivi nosač.

19. Postupak tretiranja IKK-posredovanog oboljenja, naznačen time, što se pacijentu kome je takav tretman potreban ordinira terapeutski efikasna količina jedinjenja iz Zahteva 1.

20. Postupak prema Zahtevu 19, naznačen time, što je oboljenje jedno inflamatorno oboljenje ili imuno-povezano oboljenje.

21. Postupak iz Zahteva 19 , naznačen time, što se bolest bira iz grupe koju čine reumatoidni artritis, astma, psorijaza, psorijazni artritis, hronično obstruktivno pulmonarno obolenje, inflamatorno oboljenje utrobe ili multipla skleroza.

22. Postupak iz Zahteva 19, naznačen time, što je bolest karcinom.

23. Postupak iz Zahteva 22, naznačen time, što se karcinom bira između limfoma, multiplog mijeloma, osteolitičke metastaze kosti, karcinoma glave ili vrata, karcinoma pluća, karcinoma prostate ili karcinoma pankresa.

24. Postupak iz Zahteva 23, naznačen time, što je karcinom limfom.

25. Postupak za inhibiranje IKK kod pacijenta kome je potreban, naznačen time, što se sastoji u ordiniranju pacijentu jedinjenja iz Zahteva 1.

26. Jedinjenje formule 3a: naznačeno time, što je R<13>halo, OH, OR<15>, ili zaštitna grupa za karboksilnu kiselinu; R15 je alifatični, aril, heteroaril, aralkil, ili heteroaralkil; R<14>je amino zaštitna grupa, vodonik ili -W-G; Wje -Q-, -Q-C(0)-, -C(R<9>)2-C(R<9>) (R<12>)-, ili -C(R<9>)2-[C(R<9>) (R<12>) ]2-; Q je -C(R<9>)2- ili -C(R<9>)2C(R<9>)2-; G je -OH, -NR4R<5>, -N(R<9>)CONR4R<5>, -N(R<9>)S02(Ci-3alifatični), - N(R<9>)COCF3, -N(R<9>)CO(Ci-6alifatični), -N(R<9>)CO(heterociklil), -N (R<9>)CO(heteroaril), -N(R<9>)CO(aril), 3-7 člani heterociklil prsten, ili 5-6 člani heteroaril, gde je svaki od heteroaril, aril i heterociklil ostataka G opcionalno supstituisan sa 1-3 R<10>; R4 je vodonik, 3-7 člani heterociklil, ili Ci^alifatični; R<5>je vodonik, Ci-ealifatična grupa ili 3-7 člani heterociklični prsten koji ima 1-2 heteroatoma u prstenu koji se biraju između N, O, ili S, gde je R<5>opcionalno supstituisan sa halo, -OR<7>, -CN, -SR<8>, -S(0)2R<8,>-S(0)2N(R<7>)2, -C(0)R<7>, -C02R<7>, - N(R<7>)2, -C(0)N(R<7>)2, -N(R<7>)C(0)R<7>, -N(R<7>)C02R<8>, ili -N(R<7>)C(0)N(R<7>)2; svaki R<7>se nezavisno bira između vodonika ili Ci-4alifatičnih, ili dva R<7>na istom atomu azota uzeti zajedno sa azotom formiraju 5-6 člani heteroaril ili heterociklil prsten; svaki R<8>se nezavisno bira između Ci-4alifatičnih- svaki R<9>se nezavisno bira između vodonika ili Ci-3alifatičnih-svakiR10se nezavisno bira između okso, -R<11>, -T-R<11>, ili -V-T-R<11>; svaki R<11>se nezavisno bira između Ci.6alifatičnih, halo, -S (0)2N(R<7>)2, - OR<7>, -CN, -SR<8>, -S(0)2R<8>, -C(0)R7 -C02R<7>, -N(R<7>)2, -C(0)N(R<7>)2, -N(R<7>)C(0)R<7>, -N(R<7>)C02R<7>, ili -N(R<7>)C(0)N(R<7>)2; T je ravan ili račvast d^alkilen lanac; V je -O-, -N(R<7>)-, -S-, -S(O)-, -S(0)2-, -C(O)-, ili -C02-; i R12 je vodonik ili aminokiselinski bočni lanac.

27. Jedinjenje iz Zahteva 26 , naznačeno time, što je (S)-3a.

28. Jedinjenje formule IV: naznačeno time, što je R<14>jedna amino zaštitna grupa ili vodonik; R<1>je vodonik, halo, Ci-3alifatični, amino, cijano, (Ci-3alkil)i-2amino, C1-3alkoksi, -CONH2, -NHCOCF3, ili -CH2NH2; R<2>je vodonik, halo, Ci-3alifatični, -CF3; i R<3>je vodonik, halo, Ci-ealifatični, Ci^haloalkil, Ci^alkoksi, hidroksi, amino, cijano, ili (Ci-ealkil^amino.

29. Jedinjenje iz Zahteva 28 naznačeno time, što je (S)-IV.

1.Zahtevi U Zahtevu 3 se navodi Formula ll-C. Zbog zavisnosti od Zahteva 2 (i kao posledica od Zahteva 1), definicije za R<1>i R<2>su nepotrebno ponovljene. Formula lll-A iz Zahteva 10 ne odgovara formuli lll-A iz opisa. Jedinjenje koje se navodi u Zahtevu 10, iako je jasno da je deo opšte formule I, nema preciznu zasnovanost u opisu. Ova posebna realizacija treba da se prenese u specifikaciju među poželjne realizacije. Posledica toga je da je zavisnost sledećih Zahteva neregularna. Izlazi da Zahtev 11 nalazi potporu na strani 16 opisa. Ali druga jedna neregularnost se vidi u Zahetvu 12 gde grupa R<12>nema isto značenje kao u Zahtevu 10 na kome je prema navodu Zahtev 12 zasnovan. Ista primedba se odnosi i na Zahtev 13. Zahtev 14 nalazi potporu u opisu, strana 19. Zahtev 16 se odnosi na jedinjenja iz Primera 1-31, 39-43, 45-47, 49-63. Jedinjenja sa slika br. 32-38, 47 nisu data u Primerima već su prikazana na stranama 30, 32 respektivno. Slika 44 ne odgovara jedinjenju iz primera 44 koje prikazuje morfolin prsten na mestu piran prstena. Prema preparatu, očekivao bi se morfolin prsten kako je prikazano na slici 44. Primer 47, strana 126 odgovara slici br. 48. Drugi primer 47 (?) opisan na strani 130 nema odgovarajuću sliku u opisu ili Zahtevu 16. Ako je nomenklatura pogrešna zbog mogućeg izostavljanja dela posle "-propionil-" ovaj drugi Primer 47 bi mogao da odgovara slici br. 47 na strani 32 koja se takođe pojavljuje u Zahtevu 16. Prema preparatu, naziv Primera 71 bi verovatno glasio "-piperazin-1-il-" umesto "piperidin-1-il-". Jedinjenja (S)-lll-A iz Zahteva 15 nemaju potporu u opisu. Štaviše data zavisnost od Zahteva 14 je pogrešna zbog nekoliko odstupanja u definiciji supstituenata. Form PCT/Separate Sheet/409 (Sheet 1)(EPCKJanuary 2004) Osnova za Zahtev 26 koji se odnosi na intermedijema jedinjenja formule 3a delimično je na strani 57 opisa. Ali R<15>je tamo definisano kao "organski radikal" koji nije nigde specificiran u specifikaciji. Definicija za "ograničen" data u Zahtevu 25 u opštim terminima "alifatični", "aril", itd. nije više dopuštena pošto takođe nema potporu. Radi odgovarajuće potpore, tekst Zahteva 26 treba uneti u opis uključujući korektne definicije koje su već izložene za nespecifične izraze kao "alifatični", "aril", njihove derivate i "karboksilna kiselina i amino zaštitne grupe". Zahetvi 27, 28 i (implicitno) 29 su zasnovani u opisu, strane 58 i 59 uz gore učinjene rezerve.

2.Opis Definicije koje su date u opisu za izraze koje se ne pojavljuju u Zahtevima (kao "vezna grupa") su nepotrebne i mogu eventualno da budu zbunjujuće za prosto razumeavnje pronalaska. Razmatrajući biološko testiranje, suštinski test postupci su dati bez specifičnih rezultata. Samo je u opisu merenja aktivnosti IKB kinaza fosfotransferaza rečeno da su jedinjenja aktivni inhibitori IKK kompleksa i da su srednje IC50vrednosti inhibicije IKB kinaza "generalno" ispod "oko" 10 mikroM. Takođe je rečeno da su "inventivna jedinjenja" (jedinjenja ovog pronalaska ili jedinjenja koja pokazuju inventivan efekat ?) selektivna za inhibiranje IKK-2 za razliku od IKK-1. Tamo se pojavljuje više tvrdnji koje mogu biti nedovoljno potkrepljene. Kod testa na modelima pacova za reumatoidni artritis, "otkriveno je da su neka jedinjenja aktivna". Ovaj test se ne može uzeti u razmatranje kod ocenjivanja stepena inventivnosti pošto se ne tvrdi da se tiče svih jedinjenja iz zahteva. Štaviše, rečeno je da " je otkriveno da su jedinjenja formule ll-C iznenađujuće superiornija u poređenju sa drugim jedinjenjima gde je prsten A jedan piridin prsten". Ovo je prilično nejasno pošto, prvo, jedinjenja formule ll-C su jedinjenja gde je presten A jedan piridin prsten i, drugo, rečena "druga jedinjenja" nisu definisana. Ista primedba se odnosi i na sledeću rečenicu o jedinjenjima formule lll-A-a. Form PCT/Separate Sheet/409 (Sheet 2)(EPO-January 2004) add.Sekcija III Zahtevi 19 do 25 se odnose na postupke za tretiranje ljudskog ili životinjskog tela hirurškim putem ili terapijom kao i na dijagnostičke postupke. Ovo Telo smatra se oni odnose na predmet koji pokrivaju odredbe Pravila 67.1 (iv) PCT. U odnosu na primenljivost u industriji mišljenje neće biti formulisano za predmet ovih Zahteva (Član 34(4)(a)(l) PCT). Za ocenu pitanja da li su oni industrijski primenljivi, ne postoje unificirani kriterijumi kod država Članica PCT Sporazuma. Patentabilnost takođe može zavisiti od formulacije zahteva. Na primer, EPO, ne prepoznaje kao industrijski primenljive predmete zahteva koji se odnose na upotrebu jedinjenja u medicinskom tretmanu, međutim, mogu odobriti, zahteve za prvu upotrebu poznatog jedinjenja u medicinskom tretmanu i upotrebu takvog jedinjenja u proizvodnji medikamenta za novi medicinski tretman. Prema uslovima iz Pravila 39.1(iv) PCT, od ISA se ne zahteva da izvrši pretraživanje takvih zahteva, ali kako je navedeno u ISR, izvršeno je pretraživanje i na bazi navodnih efekata ovih jedinjenja. Slično, od IPEA (koje je ISA) se ne zahteva da izvrši Prethodno Međunarodno ispitivanje takvih zahteva, ali zbog ISR, IPER će biti baziran na navodnim efektima ovih jedinjenja (Pravilo 67.1(iv) PCT). add.Sekcija V

1.Citirani dokumenti Međufazni dokumenti D7 i D8 su relevantni za potrebe Pravila 33.1 c, 64.3 i 70.10 PCT, ali pošto prioritetni dokumenti nisu dostupni u vreme utvrđivanja pisanog mišljenja, oni nisu uzeti u obzir. Ono je zasnovano na pretpostavci da svi zahtevi uživaju pravo prioriteta od datuma podnošenja prioritetnog(ih) dokumen(a)ta. Ako se kasnije ispostavi da ova pretpostavka nije ispravna, međufazni dokument u Izveštaju o Međunarodnom Pretraživanju može postati relevantan u cilju ocene da li ovi zahtevi zadovoljavaju kriterijume postavljene u Članu 33(1) PCT. Ako datum prioriteta nije validan za ceo predmet zahteva, ovaj dokument može postati relevantno prethodno stanje tehnike u mogućoj regionalnoj/nacionalnoj fazi.

2.Novitet

2.1 Finalna jedinjenja D1 pobija novitet finalnih jedinjenja sa otkrivanejm primera 83, 118 i 121 za koje se takođe prijavljuju iste biološke osobine. Zbog ekstremne bliskosti prethodnog stanja tehnike, izniklo je pitanje koja karakteristika će nesumnjivo izdvojiti ovaj predmet od stanja tehnike. Izdvajajuća karakteristika mora biti jasno zajednička za sva jedinjenja iz zahteva u cilju zadovoljenja kriterijuma jedinstva (Pravilo 13 PCT).

2.1 Intermedijerna jedinjenja D9 pobija novitet jedinjenja koja se navode u Zahtevu 26 sa prikazivanjem primera 23 do 25. Napominje se da je ovo suštinski zbog nespecifičnosti izraza "zaštitna grupa karboksilne kiseline" ili "amino zaštitna grupa" (u suštini to su funkcionalne definicije koje nisu dozvoljene kada se one mogu bolje definisati) Intermedijerna jedinjenja formule IV iz Zahteva 28 se javljaju kao nova.

3Stepen inventivnosti

3.1 Prema opisu, problem koji naglašava ovaj pronalazak jeste da se obezbede beta-karbolini koji su korisni u tretiranju inflamatornih bolesti i karcinoma, i naročito za tretiranje bolesti koje posreduje IKK-2. D1 opisuje jedinjenja koja imaju iste aktivnosti i pobijaju novitet.

3.2 Pre nastavljanja stvarnog ispitivanja, mora biti jasno utvrđen novitet, tj. bar jedna karakteristična osobina koja se slaže sa zahtevom jedinstva. Stoga je neophodno da ova "nova osobina" bude dobro definisana, pošto priznavanje stepena inventivnosti treba da bude zasnovano na neočekivanom efektu koji ova određena razlika donosi novom pronalasku (vidi takođe stavku 1.2 gore, primedbe u vezi testova opisanih u specifikaciji). Citati D2 do D6 pripadaju prethodnom stanju tehnike koje može biti korisno u postupku ispitivanja. add. Sekcija i Nejasnoće i nedoslednosti.

1.Zahtevi U Zahtevu 3 se navodi Formula ll-C. Zbog zavisnosti od Zahteva 2 (i kao posledica od Zahteva 1), definicije za R<1>i R<2>su nepotrebno ponovljene. Formula lll-A iz Zahteva 10 ne odgovara formuli lll-A iz opisa. Jedinjenje koje se navodi u Zahtevu 10, iako je jasno da je deo opšte formule I, nema preciznu zasnovanost u opisu. Ova posebna realizacija treba da se prenese u specifikaciju među poželjne realizacije. Posledica toga je da je zavisnost sledećih Zahteva neregularna. Izlazi da Zahtev 11 nalazi potporu na strani 16 opisa. Ali druga jedna neregularnost se vidi u Zahetvu 12 gde grupa R<12>nema isto značenje kao u Zahtevu 10 na kome je prema navodu Zahtev 12 zasnovan. Ista primedba se odnosi i na Zahtev 13. Zahtev 14 nalazi potporu u opisu, strana 19. Zahtev 16 se odnosi na jedinjenja iz Primera 1-31, 39-43, 45-47, 49-63. Jedinjenja sa slika br. 32-38, 47 nisu data u Primerima već su prikazana na stranama 30, 32 respektivno. Slika 44 ne odgovara jedinjenju iz primera 44 koje prikazuje morfolin prsten na mestu piran prstena. Prema preparatu, očekivao bi se morfolin prsten kako je prikazano na slici 44. Primer 47, strana 126 odgovara slici br. 48. Drugi primer 47 (?) opisan na strani 130 nema odgovarajuću sliku u opisu ili Zahtevu 16. Ako je nomenklatura pogrešna zbog mogućeg izostavljanja dela posle "-propionil-" ovaj drugi Primer 47 bi mogao da odgovara slici br. 47 na strani 32 koja se takođe pojavljuje u Zahtevu 16. Prema preparatu, naziv Primera 71 bi verovatno glasio "-piperazin-1-il-" umesto "piperidin-1-il-". Jedinjenja (S)-lll-A iz Zahteva 15 nemaju potporu u opisu. Štaviše data zavisnost od Zahteva 14 je pogrešna zbog nekoliko odstupanja u definiciji supstituenata. Osnova za Zahtev 26 koji se odnosi na intermedijerna jedinjenja formule 3a delimično je na strani 57 opisa. AJi R<15>je tamo definisano kao "organski radikal" koji nije nigde specificiran u specifikaciji. Definicija za "ograničen" data u Zahtevu 25 u opštim terminima "alifatični", "aril", itd. nije više dopuštena pošto takođe nema potporu. Radi odgovarajuće potpore, tekst Zahteva 26 treba uneti u opis uključujući korektne definicije koje su već izložene za nespecifične izraze kao "alifatični", "aril", njihove derivate i "karboksilna kiselina i amino zaštitne grupe". Zahetvi 27, 28 i (implicitno) 29 su zasnovani u opisu, strane 58 i 59 uz gore učinjene rezerve.

2.Opis Definicije koje su date u opisu za izraze koje se ne pojavljuju u Zahtevima (kao "vezna grupa") su nepotrebne i mogu eventualno da budu zbunjujuće za prosto razumeavnje pronalaska. Razmatrajući biološko testiranje, suštinski test postupci su dati bez specifičnih rezultata. Samo je u opisu merenja aktivnosti IKB kinaza fosfotransferaza rečeno da su jedinjenja aktivni inhibitori IKK kompleksa i da su srednje IC50vrednosti inhibicije IKB kinaza "generalno" ispod "oko" 10 mikroM. Takođe je rečeno da su "inventivna jedinjenja" (jedinjenja ovog pronalaska ili jedinjenja koja pokazuju inventivan efekat ?) selektivna za inhibiranje IKK-2 za razliku od IKK-1. Tamo se pojavljuje više tvrdnji koje mogu biti nedovoljno potkrepljene. Kod testa na modelima pacova za reumatoidni artritis, "otkriveno je da su neka jedinjenja aktivna". Ovaj test se ne može uzeti u razmatranje kod ocenjivanja stepena inventivnosti pošto se ne tvrdi da se tiče svih jedinjenja iz zahteva. Štaviše, rečeno je da " je otkriveno da su jedinjenja formule ll-C iznenađujuće superiornija u poređenju sa drugim jedinjenjima gde je prsten A jedan piridin prsten". Ovo je prilično nejasno pošto, prvo, jedinjenja formule ll-C su jedinjenja gde je presten A jedan piridin prsten i, drugo, rečena "druga jedinjenja" nisu definisana. Ista primedba se odnosi i na sledeću rečenicu0jedinjenjima formule lll-A-a. add.Sekcija Hl Zahtevi 19 do 25 se odnose na postupke za tretiranje ljudskog ili životinjskog tela hirurškim putem ili terapijom kao i na dijagnostičke postupke. Ovo Telo smatra se oni odnose na predmet koji pokrivaju odredbe Pravila 67.1 (iv) PCT. U odnosu na primenljivost u industriji mišljenje neće biti formulisano za predmet ovih Zahteva (Član 34(4)(a)(l) PCT). Za ocenu pitanja da li su oni industrijski primenljivi, ne postoje unificirani kriterijumi kod država Članica PCT Sporazuma. Patentabilnost takođe može zavisiti od formulacije zahteva. Na primer, EPO, ne prepoznaje kao industrijski primenljive predmete zahteva koji se odnose na upotrebu jedinjenja u medicinskom tretmanu, međutim, mogu odobriti, zahteve za prvu upotrebu poznatog jedinjenja u medicinskom tretmanu i upotrebu takvog jedinjenja u proizvodnji medikamenta za novi medicinski tretman. Prema uslovima iz Pravila 39.1(iv) PCT, od ISA se ne zahteva da izvrši pretraživanje takvih zahteva, ali kako je navedeno u ISR, izvršeno je pretraživanje i na bazi navodnih efekata ovih jedinjenja. Slično, od IPEA (koje je ISA) se ne zahteva da izvrši Prethodno Međunarodno ispitivanje takvih zahteva, ali zbog ISR, IPER će biti baziran na navodnim efektima ovih jedinjenja (Pravilo 67.1(iv) PCT). add.Sekcija V Međufazni dokumenti D7 i D8 su relevantni za potrebe Pravila 33.1 c, 64.3 i 70.10 PCT, ali pošto prioritetni dokumenti nisu dostupni u vreme utvrđivanja pisanog mišljenja, oni nisu uzeti u obzir. Ono je zasnovano na pretpostavci da svi zahtevi uživaju pravo prioriteta od datuma podnošenja prioritetnog(ih) dokumen(a)ta. Ako se kasnije ispostavi da ova pretpostavka nije ispravna, međufazni dokument u Izveštaju o Međunarodnom Pretraživanju može postati relevantan u cilju ocene da li ovi zahtevi zadovoljavaju kriterijume postavljene u Članu 33(1) PCT. Ako datum prioriteta nije validan za ceo predmet zahteva, ovaj dokument može postati relevantno prethodno stanje tehnike u mogućoj regionalnoj/nacionalnoj fazi.

2. Novitet

3Stepen inventivnosti

3.2 Pre nastavljanja stvarnog ispitivanja, mora biti jasno utvrđen novitet, tj. bar jedna karakteristična osobina koja se slaže sa zahtevom jedinstva. Stoga je neophodno da ova "nova osobina" bude dobro definisana, pošto priznavanje stepena inventivnosti treba da bude zasnovano na neočekivanom efektu koji ova određena razlika donosi novom pronalasku (vidi takođe stavku 1.2 gore, primedbe u vezi testova opisanih u specifikaciji). Citati D2 do D6 pripadaju prethodnom stanju tehnike koje može biti korisno u postupku ispitivanja.