RS20090249A

RS20090249A - Spiroketon inhibitori acetil-coa karboksilaze

Info

Publication number: RS20090249A
Application number: RSP-2009/0249A
Authority: RS
Inventors: Jeffrey Wayne Corbett; Richard Louis Elliott; Andrew Simon Bell
Original assignee: Pfizer Products Inc.
Priority date: 2006-11-29
Filing date: 2007-11-16
Publication date: 2010-06-30
Also published as: KR20090083956A; CN101541809A; BRPI0721053A2; CR10831A; CO6180424A2; TN2009000204A1; EA200900613A1; JP2010511035A; AU2007326950B2; MX2009005604A; ZA200903268B; AP2009004880A0; ECSP099371A; SV2009003281A; EP2097420A1; MA30932B1; EP2097420B1; WO2008065508A1; CA2670422A1; AU2007326950A1

Abstract

Pronalazak obezbeduje jedinjenje Formule (I) ili farmaceutski prihvatljivu so navedenog jedinjenja, gde su R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 i R9 kako je ovde opisano; njihove farmaceutske kompozicije i njihovu upotrebu u lečenju sisara koji pate od stanja prekomerne težine.

Description

SPIROKETON INHIBITORI ACETIL-CoA KARBOKSILAZE

POLJE PRONALASKA

Ovaj pronalazak se odnosi na supstituisana r-(benzoil)spiro[hromen-2;4'-piperidin]-4(3H)-on jedinjenja koja deluju kao inhibitori acetil-CoA karboksilaze i na njihovu upotrebu u tretiranju gojaznosti.

POREKLO PRONALASKA

Prevelika gojaznost je dominantna bolest u Sjedinjenim Državama i drugim državama. Komplikacije, kao posledice gojaznosti, obuhvataju hipertenziju, dijabetes, oboljenje koronarne arterije, šlog, kongestivno oštećenje srca, oboljenje vena, veliki broj ortopedskih problema i plućnu insuficijenciju uz značajno smanjenje kvaliteta života. Medicinski tretman koji uključuje tehnike dijetete, psihoterapiju, lečenje i promenu navika ima izuzetno slabe rezultate u višestrukim pokušajima. Pokušano je sa nekoliko hirurških tehnika kojima se premoštavala apsorptivna površina tankog creva ili je cilj bio da se redukuje veličina želuca ili deljenjem ili premoštavanjem. Ove procedure su se pokazale rizičnim i zbog izazivanja smrti gojaznih pacijenata i zbog toga što su opterećene brojnim postoperativnim komplikacijama koje mogu da ugroze život. Pored toga, nakon ovakvih postupaka često nema povratka.

Acetil-CoA karboksilaze (ACC) su familija enzima nađena u velikom broju vrsta i povezane su sa sintezama i metabolizmom masnih kiselina katalizacijom produkcije malonil-CoA iz acetil-CoA. Kod sisara su izdvojena dva izooblika ACC enzima. ACC1, koji se u velikom broju pojavljuje u lipogeničnim tkivima, kao što su masno tkivo i jetra, kontroliše prvu izvršenu fazu u biosintezi masnih kiselina dugog lanca. Ukoliko se acetil- CoA ne karboksiliše u malonil-CoA, metaboliše se preko Krebs-ovog ciklusa. ACC2, koja je sporedna komponenta hepatične ACC ali je predominantan izooblik u srčanoj i skeletnoj muskulaturi, i katališe produkciju malonil-CoA na cistolitičnoj površini mitohondrije, reguliše količinu masne kiseline koja se utroši u [3-oksidaciji inhibicijom karnitin palmitoil transferaze. Prema tome, povećanjem utroška masne kiseline i sprečavanjem povećanja sinteze novih masnih kiselina, dugotrajna primena ACC-1 može takođe da isprazni TG depoe jetre i adipoznog tkiva kod gojaznih subjekata koji primenjuju ishranu sa velikom ili malom količinom masti, što dovodi do selektivnog gubitka telesne masnoće.

Do sada, ACC1 ili ACC2 inhibitori nisu korišćeni kao medikamenti protiv gojaznosti.

Stoga, postoji stalna potreba za medikamentima koji sadrže ACC1 i ACC2 inhibitore za lečenje gojaznosti inhibicijom sinteze masnih kiselina ili povećavanjem oksidacije masnih kiselina, tim redom.

KRATAK SADRŽAJ PRONALASKA

Ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenja koja imaju strukturu Formule (1)

ili na njihovu farmaceutski prihvatljivu so, pri čemu:

(a) R<1>je H, OH, halo, cijano, C1.3alkil, C1.3alkoksi, C1.3haloalkil, C1.3haloalkoksi, C1.3alkilsulfonil-, -CO(0)H, -C(0)OCi.3alkil ili fenil grupa, pri čemu je navedena fenil grupa opciono supstituisana sa jednim do pet R<10>; (b) svaki R<10>je nezavisno OH, halo, cijano, C1-3alkil, C1.3alkoksi, C1.3haloalkil ili C1.3haloalkoksi grupa; (c) R<2>i R<3>su svaki nezavisno H, OH, halo, cijano, C1-3alkil, C1.3alkoksi, C1.3haloalkil, C,.3haloalkoksi, C,.3alkilsulfonil-, -CO(0)H, -C(0)OC,.3alkil, -C(0)NR<n>R<12>ili fenil grupa, pri čemu je navedena fenil grupa opciono supstituisana sa jednim do pet R<10>; (d)R11i R<12>su uzeti odvojeno i svaki je nezavisno H ili Ci_3alkil grupa, ili su Ru i R<12>uzeti zajedno sa azotom za koji su vezani da formiraju 4-7-člani heterocikloalkil prsten; (e) R4 je H, halo, cijano, c,.3alkil ili C1.3haloalkil grupa; (f) R6 je uzet odvojeno i predstavlja H, OH, halo, C1.3alkil, C1.3alkoksi, C1.3haloalkil ili Cj-3haloalkoksi grupu; (g) R<7>je uzet odvojeno i predstavlja H, OH, halo, C1.3alkil, C1.3alkoksi, Ct_3haloalkil ili C1.3haloalkoksi grupu; (h) R<5>je uzet odvojeno i predstavlja 4-7-člani heteroaril prsten opciono supstituisan sa halo, C1.3alkil, Ci-3alkoksi, C1.3alkil-OH, C1.3haloalkil ili C1.3grupom; ili

(i) R<5>je uzet zajedno sa R<6>ili R<7>i sa fenil grupom, za koju suR<5>iR<6>ili R<7>vezani, formira policiklčni heterociklični radikal, sa prstenom koji sadrži azot, pri čemu je najmanje jedan atom azota vezan za atom ugljenika navedene fenil grupe, pri čemu je prsten koji sadrži azot opciono spojen sa cikloheksanom, 5,6-dihidro-piridinom ili 5,6-dihidro-lH-piridin-2-onom, i pri čemu je prsten koji sadrži azot opciono nezavisno supstituisan sa jednom ili dve okso, halo, Ci-3alkil, C1-3alkoksi, C1-3alkil-OH, C1.3haloalkil, C1.3haloalkoksi, 4-7-člani heteroaril, 4-7-člani heterocikloalkil ili fenil grupe, pri čemu je navedena fenil grupa opciono supstituisana sa jednim do pet R<10>, pod uslovom da R<5>nije uzet zajedno sa R<6>da formiraju benzotriazolil ili benzooksadiazolil i pod uslovom da R<5>nije uzet zajedno sa R<7>da formira benzooksadiazolilradikal; i

(j) R<8>i R<9>su nezavisno H, OH, halo, C1-3alkil, C1.3alkoksi, c,.3haloalkil ili C1.3haloalkoksi grupa, pod uslovom da navedeno jedinjenje nije l'-(lH-l,2,3-benzotriazol-5-ilkarbonil)-5-metoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, 6-hloro-7-metil-l'-[3-(lH-pirazol-4-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, 6,7-dimetil-r-[3-(lH-pirazol-4-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on ili 6,7-dimetil-l'-[3-(lH-pirazol-4-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

Ovaj pronalazak se takođe odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja uključuje jedinjenje Formule (1) ili jedno od jedinjenja l'-(lH-l,2,3-benzotriazol-5-ilkarbonil)-5-metoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on; 6-hloro-7-metil-l'-[3-(lH-pirazol-4-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on; 6,7-dimetil-r-[3-(lH-pirazol-4-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on; i 6,7-dimetil-l '-[3-(lH-pirazol-4-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, ili farmaceutski prihvatljivu so jedinjenja i farmaceutski prihvatljiv nosač, vehikulum, razblaživač ili ekscipijent.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na postupak za tretiranje stanja prekomerne težine kod sisara kojima je potreban takav tretman, a koji uključuje primenu na sisaru terapeutski efektivne količine jedinjenja Formule (1) ili l'-(IH-1,2,3-benzotriazol-5-ilkarbonil)-5-metoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-ona; 6-hloro-7-metil-l '-[3-(lH-pirazol-4-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-ona; 6,7-dimetil-l '-[3-(lH-pirazol-4-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-ona; i 6,7-dimetil-l'-[3-(lH-pirazol-4-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-ona, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli.

Jedinjenja, soli i farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska se koriste za tretman dijabetesa Tip 2, rezistencije na insulin, metaboličkog sindroma, ateroskleroze, hiperlipidemije, dislipidemije, kongestivnog oštećenja srca, koronarnog oboljenja srca, sloga i kancera. Preferirano, jedinjenja, soli i farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska se koriste za lečenje stanja prekomerne težine ili gojaznosti kod sisara.

DETALJAN OPIS

Nazivi koji su korišćeni za opis ovog pronalaska imaju ovde sledeća značenja. Jedinjenja i međuproizvodi iz ovog pronalaska su generalno označeni u skladu sa IUPAC (Međunarodno udruženje za čistu i primenjenu herniju), preporukama za Nomenklaturu u organskoj herniji i u skladu sa pravilima CAS indeksa.

Atom ugljenika kao deo različitih radikala koji sadrže ugljovodonik može da se označi prefiksom koji označava najmanji i najveći broj aoma ugljenika u radikalu, na primer, prefiksi (Ca-Cb)alkil i Ca-balkil, označavaju alkil radikal sa celim brojem "a" do "b" atoma ugljenika, uključujući oba. Prema tome, na primer, (Ci-C6)alkil i Ci_6alkil se odnosi na alkil grupu od jednog do šest atoma ugljenika, uključujući oba.

Naziv "supstituisan" označava daje atom vodonika na atomu ugljenika, azota ili sumpora u okviru radikala, zamenjen sa nekim drugim atomom ili radikalom. Atom ili molekul koji zamenjuje atom vodonika se označava kao "supstituent."

Naziv "radikal" označava grupu atoma koji se ponašaju kao jedan reaktant u hemijskoj reakciji, na primer, organski radikal je grupa atoma koja prenosi karakteristične osobine na jedinjenje koje ga sadrži, ili koji ostaje nepromenjen u toku serija reakcija ili transformacija.

Naziv "alkil" označava ravan ili račvast, zasićen lanac atoma ugljenika. U primere alkil grupa spadaju, ali se ne ograničavaju samo na, metil, etil, propil, izopropil, butil i terc-butil.

Naziv "alkoksi" označava ravne ili račvaste, monovalentne, zasićene lance atoma ugljenika vezane za atom kiseonika. Primeri alkoksi grupa obuhvataju metoksi, etoksi, propoksi, izo-butoksi, terc-butoksi i slično.

Naziv "halo" se odnosi na hlor, fluor ili brom.

Naziv "haloalkil" se odnosi na alkil grupu gde su jedan ili više ugljenika supstituisani sa halo grupama. Primeri haloalkil grupa obuhvataju, ali se ne ograničavaju samo na, difluorometil, trifluorometil i 1,2-difluoroetil.

Naziv, "4-7-člani heterocikloalkil" označava radikal koji ima alifatični prsten sa četiri do sedam atoma u prstenu, koji obuhvata jedan azot i, opciono, jedan ili dva dodatna heteroatoma izabrana iz grupe koja sadrži O, N i S. U primere navedenih 4-7 članih heterocikloalkil prstenova spadaju, ali se ne ograničavaju samo na, azetidin, pirolidin, piperidin, azepan, pirolin, imidazolin, imidazolidin, pirazolidin, morfolin, tiomorfolin i piperazin.

Naziv "4-7-člani heteroaril" se odnosi na radikal koji ima monociklični aromatični prsten koji sadrži četiri do sedam atoma u prstenu koji se sastoje od ugljenika i jedan do tri heteroatoma od kojih je svaki izabran iz grupe koja sadrži O, N i S. Primeri ovakvih heteroarila obuhvataju, ali se ne ograničavaju samo na, pirol, pirazol, piridin, imidazol, oksadiazol, pirimidin, oksazol, izoksazol, triazol, tetrazol, piridazin, pirazin, tiazol i tiadiazol. Heteroaril grupa ovog pronalaska može opciono da bude supstituisana sa jednim ili dva supstituenta nezavisno izabrana od halo, alkil, C1-3alkoksi, alkil-OH, C1-3 haloalkil i haloalkoksi grupe.

Naziv "policiklični heterociklični radikal" se odnosi na dva ili tri prstena heterocikličnog radikala koji uključuje benzen prsten koji je spojen sa aromatičnim ili alifatičnim 5-6-članim prstenom koji sadrži azot, pri čemu prsten koji sadrži azot ima jedan atom azota koji je vezan za atom ugljenika na benzen prstenu i opciono dodatno sadrži jedan ili dva heteroatoma izabrana od N, O i S. Prsten koji sadrži azot policikličnog heterociklusa može opciono da bude spojen sa trećim prstenom izabranim iz grupe koja sadrži cikloheksen i 5,6-dihidro-lH-piridin-2-on. U primere policikličnih heterociklil grupa spadaju, ali se ne ograničavaju samo na, lH-indazol, 1H-benzoimidazol, kvinolin, 1,2,3,4-tetrahidrokvinolin, kvinoksalin, lH-indol, 2,3-dihidro-lH-benzoimidazol i lH-benzo[d][l,2,3]triazol, 6,7,8,9-tetrahidro-5H-karbazol, 2,3,4,9-tetrahidro-lH-pirido[3,4-b]indol i benzooksazol. U policikličnom heterociklusu iz ovog pronalaska, prsten koji sadrži azot je opciono supstituisan sa jednim ili dva supstituenta nezavisno izabrana od okso, halo, C1.3alkil, Ci.3alkoksi, Ci.3alkil-OH, Ci.3haloalkil, c,.3haloalkoksi, fenil, 4-7-članog heterocikličnog prstena.

Izraz "odgovarajuće soli" kako se ovde koristi, označava farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja iz ovog pronalaska.

Izraz "farmaceutski prihvatljiv" označava daje određeni nosač, vehikulum, razblaživač, ekscipijent(i) i/ili so generalno hemijski i/ili fizički kompatibilan sa drugim sastojcima koji se nalaze u formulaciji, i fiziološki kompatibilan sa primaocem.

Naziv "sisar" se odnosi na pojedinačnu životinju koja pripada taksonomičnoj klasi Mammalia. U primere sisara spadaju, ali se ne ograničavaju samo na, ljudi, psi, mačke, konji i goveda. U ovom pronalasku, preferirani sisari su ljudi, psi i mačke. Još poželjnije, sisar je čovek.

Izraz "terapeutski efektivna količina" označava količinu jedinjenja iz ovog pronalaska koja (i) leci ili sprečava određeno oboljenje, stanje ili poremećaj, (ii) ublažava, poboljšava ili eliminiše jedan ili više simptoma određenog oboljenja, stanja ili poremećaja, ili (iii) sprečava ili odlaže početak jednog ili više simptoma ovde opisanog određenog oboljenja, stanja ili poremećaja.

Nazivi "lečenje", "tretiranje" ili "tretman", kako se ovde koriste, obuhvataju prevenciju (na primer, profilaksu), palijaciju, usporavanje progresije i lečenje oboljenja, kao što je gojaznost.

U jednom aspektu jedinjenja Formule (1) i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli, gde je R<5>uzet zajedno sa R<7>, opciono supstituisani prsten koji sadrži azot opciono sadrži drugi N, O, ili S heteroatom. Navedeni prsten koji sadrži azot je opciono spojen sa cikloheksen, 5,6-dihidro-piridin ili 5,6-dihidro-lH-piridin-2-on prstenom.

Još poželjnije, za jedinjenja i soli gde su R<5>i R<7>uzeti zajedno, navedeni policiklični heterociklični radikal je IH-indazolil, lH-benzoimidazolil, kvinolil, 1,2,3,4-tetrahidrokvinolil, kvinoksalil, lH-indolil, 2,3-dihidro-lH-benzoimidazolil, lH-benzo-[d][l,2,3]triazolil, 6,7,8,9-tetrahidro-5H-karbazolil, 2,3,4,9-tetrahidro-lH-pirido-[3,4-b]indolil ili benzooksazolil. Prsten koji sadrži azot navedenog policikličnog heterocikličnog radikala je opciono supstituisan.

U jednom aspektu, čak još poželjnije, policiklični heterociklični radikal je opciono supstituisani IH-indazolil, lH-benzoimidazolil, lH-indolil ili 2,3,4,9-tetrahidro-lH-pirido[3,4-bjindolil. Čak još poželjnije, za jedinjenja i soli gdesuR<5>iR<7>uzeti zajedno, R<1>je H, halo, CH3ili OCH3grupa; R<3>je H, halo, CH3ili OCH3grupa; a R<4>je H.

U još jednom aspektu jedinjenja Formule (1) i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli gde je R<5>uzet zajedno sa R<6>, opciono supstituisani prsten koji sadrži azot opciono sadrži drugi N, O, ili S heteroatom. Navedeni prsten koji sadrži azot je opciono spojen sa cikloheksen, 5,6-dihidro-piridin ili 5,6-dihidro-lH-piridin-2-on prstenom.

Još poželjnije, za jedinjenja i soli gde su R<5>i R<a>uzeti zajedno, navedeni policiklični heterociklični radikal je IH-indazolil, lH-benzoimidazolil, lH-indolil ili 2,3-dihidro-lH-benzoimidazolil. Prsten koji sadrži azot navedenog policikličnog heterocikličnog radikala je opciono supstituisan.

U ovom aspektu, čak još poželjnije, policiklični heterociklični radikal je opciono supstituisani IH-indazolil. Čak još poželjnije, za jedinjenja i soli gde su R<5>i R<7>uzeti zajedno, R<1>je H, halo, CH3ili OCH3grupa; R3 je H, halo, CH3ili OCH3grupa; i R4 je H.

Kadaje R5 uzet odvojeno, preferirano je daje R<5>opciono supstituisana heteroaril grupa izabrana iz grupe koja sadrži pirazolil, imidazolil, oksadiazolil i pirimidinil. Još poželjnije, R5 je opciono supstituisana heteroaril grupa izabrana iz grupe koja sadrži pirazolil i imidazolil. Čak još poželjnije, R1 je H, halo, CH3ili OCH3grupa; R3 je H, halo, CH3ili OCH3; i R4 je H.

Jedinjenja iz ovog pronalaska mogu da sadrže stereogenične centre. Takva jedinjenja mogu da egzistiraju kao mešavine enantiomera ili kao čisti enantiomeri. Kada jedinjenje uključuje stereogenični centar, jedinjenja mogu da se prevedu u čiste enantiomere postupcima koji su poznati stručnjaku sa iskustvom u tehnici, na primer formiranjem dijastereoizomernih soli koje mogu da se razdvoje, na primer, kristalizacijom; formiranjem stereoizomernih derivata ili kompleksa koji mogu da se razdvoje, na primer, kristalizacijom, gasno-tečnom ili tečnom hromatografijom; selektivnom reakcijom jednog enantiomera sa reagensom specifičnim za enantiomer, na primer, enizmatičkom esterifikacijom; ili gasno-tečnom ili tečnom hromatografijom u asimetričnoj sredini, na primer na asimetričnoj podlozi, na primer silicij umu sa vezanim asimetričnim ligandom ili u prisustvu asimetričnog rastvarača. Jasno je da kada se željeni stereoizomer konvertuje u drugi hemijski entitet jednom od procedura razdvajanja koje su prethodno opisane, naredna faza je oslobađanje željenog enantiomernog oblika. Alternativno, specifični stereoizomeri mogu da se sintetišu korišćenjem optički aktivnog početnog materijala, asimetričnim sintezama koristeći optički aktivne reagense, supstrate, katalizatore ili rastvarače, ili konverzijom jednog stereoizomera u drugi asimetričnom transformacijom.

Izvesna jedinjenja Formule (1) mogu da egzistiraju u različitim stabilnim konformacionim oblicima koji mogu da se razdvoje. Torziona asimetrija zbog restriktivne rotacije oko asimetrične jednostruke veze, na primer zbog steričnih smetnji ili vrste prstena, može da dozvoli razdvajanje različitih konformnih oblika. Jedinjenja iz ovog pronalaska dalje uključuju svaki konformacioni izomer jedinjenja Formule (I) i njihove mešavine.

Farmaceutski prihvatljive soli, kako se ovde koriste u odnosu na jedinjenja iz ovog pronalaska, uključuju farmaceutski prihvatljive neorganske i organske soli navedenog jedinjenja. Ove soli mogu da se izrade kao takve u toku finalnog izdvajanja i prečišćavanja jedinjenja, ili odvojenom reakcijom jedinjenja ili njegovog proleka sa odgovarajućom organskom ili neorganskom kiselinom i izolovanjem tako nastale soli. U reprezentativne soli spadaju, ali bez ograničenja na, hidrobromidne, hidrohloridne, hidrojodid, sulfatne, bisulfatne, nitratne, acetatne, trifluoroacetatne, oksalatne, besilatne, palmitatne, pamoatne, malonatne, stearatne, lauratne, malatne, boratne, benzoatne, laktatne, fosfatne, heksafluorofosfatne, benzen sulfonatne, tosilatne, formatne, citratne, maleatne, fumaratne, sukcinatne, tartratne, naftilatne, mesilatne, glukoheptonatne, laktobionatne i laurilsulfonatne soli, i slično. Soli takođe mogu da uključe katjone alkalnih i zemno alkalnih metala, kao što su natrijum, litijum, kalijum, kalcijum, magnezijum, i slično, kao i ne-toksične amonijum, kvaternarne amonijum i amin katjone, uključujući, ali bez ograničenja na, amonijum, tetrametilamonijum, tetraetilamonijum, metilamonijum, dimetilamonijum, trimetilamonijum, trietilamonijum, etilamonijum, i slično. Za dodatne primere, videti, na primer, Berge i saradnici, J. Pharm. Sci., 66,1-19 (1977).

Jedinjenja i soli iz pronalaska mogu da egzistiraju i u obliku solvata i u ne-solvatnom obliku. Naziv 'solvat' se ovde koristi da opiše molekularni kompleks koji uključuje jedinjenje iz pronalaska i jednu ili više molekula farmaceutski prihvatljivog rastvarača, na primer, etanola. Naziv 'hidrat' se koristi kada je navedeni rastvarac voda. Farmaceutski prihvatljivi solvati uključuju hidrate i druge solvate, gde rastvarač za kristalizaciju može da bude izotopno supstituisan,na primerD20, dć-aceton, dć-DMSO (dimetil sulfoksid).

Izvesna jedinjenja Formule (1) i njihove soli mogu da egzistiraju u više od jednog kristalnog oblika. Polimorfni oblici jedinjenja predstavljenih Formulom (I) čine deo ovog pronalaska i mogu da se izrade kristalizacijom jedinjenja Formule (I) pod različitim uslovima. Na primer, koristeći različite rastvarače ili različite mešavine rastvarača za kristalizaciju; kristalizaciju na različitim temperaturama; različite načine hlađenja, od veoma brzog do veoma sporog hlađenja u toku kristalizacije. Polimorfni oblici mogu takođe da se dobiju zagrevanjem ili topljenjem jedinjenja Formule (I), a nakon toga postepenim ili brzim hlađenjem. Prisustvo polimorfnih oblika može da se odredi nuklearnom magnetnom rezonantnom spektroskopijom (NMR) čvrstog uzorka, infracrvenom (IR) spektroskopijom, posmatranjem diferencijalne kalorimetrije, difrakcijom X-zraka praškastog uzorka ili sličnim drugim tehnikama.

Ovaj pronalazak takođe obuhvata izotopno obeležena jedinjenja koja su identična sa jedinjenjima opisanim Formulom (I), ali se razlikuju zbog činjenice da je jedan ili više atoma zamenjeno sa atomom koji ima atomsku masu ili maseni broj različit od atomske mase ili masenog broja koji se obično nalazi u prirodi. Primeri izotopa koji mogu da se inkorporiraju u jedinjenja iz pronalaska uključuju izotope vodonika, ugljenika, azota, kiseonika, sumpora i fluora, kao što su2H,3H,<13>C,14C, 15N,<18>0,<I7>0,<35>S,<36>C1,<125>1, 129I i 18F, tim redom. Jedinjenja iz ovog pronalaska i farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja koja sadrže prethodno pomenute izotope i/ili druge izotope drugih atoma, obuhvaćeni su okvirom ovog pronalaska. Izvesna izotopno obeležena jedinjenja iz ovog pronalaska, na primer ona u kojima su inkorporirani radioaktivni izotopi kao što su<3>H i<14>C su korisna u ispitivanju distribucije leka i/ili supstrata tkiva. Tricijum, (to jest,<3>H) i ugljenik-14 (to jest,<14>C) izotopi su posebno preferirani zbog svoje jednostavne izrade i detektabilnosti. Osim toga, supstitucija sa težim izotopima kao što je deuterijum (to jest,<2>H), može da ima izvesne terapeutske prednosti, što za rezultat ima veću metaboličku stabilnost, na primer, povećanje polu-životain vivoili smanjenje zahtevanih doza, i stoga mogu da budu preferirani u nekim situacijama. Izotopno obeležena jedinjenja Formule (I) iz ovog pronalaska i njihove soli, mogu generalno da se izrade po procedurama koje su otkrivene u niže datim Semama i/ili Primerima, supstitucijom ne-izotopno obeleženog reagensa sa lako raspoloživim izotopno obeleženim reagensom.

Jedinjenja iz ovog pronalaska mogu da se izoluju i koriste kao takva ili u obliku svojih farmaceutski prihvatljivih soli. U skladu sa ovim pronalaskom, jedinjenja sa više baznih atoma azota mogu da formiraju soli sa različitim brojem ekvivalenata ("eq.") kiseline. Stručnjacima sa iskustvom u praksi je jasno da su sve takve soli obuhvaćene okvirom ovog pronalaska.

Ovaj pronalazak dalje obuhvata prolekove jedinjenja Formule (1). Prolek jedinjenja Formule (1) može da bude oblik formiran na uobičajeni način sa funkcionalnom grupom jedinjenja, kao na primer sa amino, hidroksi ili karboksi grupom. Naziv "prolek" označava jedinjenje koje sein vivotransformiše da se dobije jedinjenje Formule (I) ili farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja. Transformacija može da se izvrši različitim mehanizmima, kao što je hidroliza u krvi. Diskusija o upotrebi prolekova je data od strane T. Higuchi i W. Stella, "Pro-drugs as Novel Deliverv Svstems," Vol. 14 the A.C.S. Svmposium Series, i u Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association i Pergamon Press, 1987.

Na primer, kako mnoga jedinjenja iz ovog pronalaska sadrže amino funkcionalnu grupu, prolek može da se formira supstitucijom atoma vodonika u amino grupi sa grupom kao što su R-karbonil, RO-karbonil, NRR'-karbonil, gde su R i R' svaki nezavisno (Ci-Cio)alkil, (C3-C7)cikloalkil, benzil grupa, ili je R-karbonil prirodni a-aminoacil ili prirodni a-aminoacil-prirodni a-aminoacil, -C(OH)C(0)OY', gde je Y' H, (Ci-C6)alkil ili benzil grupa, -C(OY0)Yi, gde je Yo (C1-C4) alkil grupa a Yije (Ci-Ce)alkil, karboksi(Ci-Cć)alkil, amino(c,-c4)alkil ili mono-N- ili di-N,N-(Ci-C6)alkilaminoalkil grupa, -C(Y2)Y3, gde je Y2H ili metil grupa, a Y3 je mono-N- ili di-N,N-(Ci-C6)alkilamino, morfolino, piperidin-l-il ili pirolidin-l-il grupa.

Slično tome, ukoliko jedinjenje iz ovog pronalaska sadrži alkoholnu funkcionalnu grupu, prolek može da se formira supstitucijom atoma vodonika alkoholne grupe sa grupom kao što su (C1 -Cć)alkanoiloksimetil, 1 -((C1 -C6)alkanoiloksi)etil, 1 -metil-1 -((C1 -C6)alkanoiloksi)etil, (C1 - C6)alkoksikarboniloksimetil, N-C(Ci-C6)alkoksikarbonilaminometil, sukcinoil, (Ci-C6)alkanoil, a-amino(Ci-C4)alkanoil, arilacil i a-aminoacil, ili a-aminoacil-a-aminoacil, gde je svaka a-aminoacil grupa nezavisno izabrana od prirodno dobijenih L-amino kiselina, P(0)(OH)2, -P(0)(0(Ci-C6)alkil)2ili glikozil-(-radikal dobijen od uklonjene hidroksilne grupe hemiacetalnog oblika ugljovodonika).

Ukoliko jedinjenje iz ovog pronalaska sadrži kiselu karboksilnu funkcionalnu grupu, prolek može da uključi estar formiran supstitucijom atoma vodonika kisele grupe sa grupom kao što su (Ci-Cg)alkil, (C2-Ci2)alkanoiloksimetil, l-(alkanoiloksi)etil koja ima od 4 do 9 atoma ugljenika, 1-metil-l-(alkanoiloksi)-etil koja ima od 5 do 10 atoma ugljenika, alkoksikarboniloksimetil koja ima od 3 do 6 atoma ugljenika, l-(alkoksikarboniloksi)etil koja ima od 4 do 7 atoma ugljenika, 1-metil-l-(alkoksikarboniloksi)etil koja ima od 5 do 8 atoma ugljenika, N-(alkoksikarbonil)aminometil koja ima od 3 do 9 atoma ugljenika, 1-(N-

(alkoksikarbonil)amino)etil koja ima od 4 do 10 atoma ugljenika, 3-ftalidil, 4-krotonolaktonil, gama-butirolakton-4-il, di-N,N-(Ci-C2)alkilamino(C2-C3)alkil (kao što je (3-dimetilaminoetil), karbamoil-(Ci-C2)alkil, N,N-di(Ci-C2)alkilkarbamoil-(Ci-C2)alkil i piperidino-, pirolidino- ili morfolino(C2-C3)alkil.

Sinteze

Generalno, jedinjenja Formule (I) iz ovog pronalaska mogu da se izrade postupcima koji uključuju procese poznate u hemijskoj tehnici, posebno u svetlu ovde datih opisa. Izvesni procesi za izradu jedinjenja Formule (I) iz ovog pronalaska su ilustrovani narednim šemama reakcija. Drugi procesi su opisani u eksperimentalnom delu. Neka od početnih jedinjenja za reakcije opisane u šemama i Primerima su izrađeni kako je ovde ilustrovano.

Jedinjenja Formule (I), gde su R1,R2,R<3>, R<4>R5, R<6>, R<7>, R<8>iR<9>kako je prethodno definisano, mogu da se izrade na način koji je pokazan u niže datoj Šemi A.

U Šemi A, jedinjenje Formule (I) se formira udvajanjem spirocikličnog ketona (2) sa karboksilnom kiselinom (3) dok je u rastvoru. Spirociklični keton (2) i karboksilna kiselina (3) mogu da se spoje formiranjem aktiviranog estra karboksilne kiseline, kao stoje kontakt karboksilne kiseline (3) sa peptidnim reagensom za udvajanje, kao što je 2-(7-aza-lH-benzotriazol-l-il)-l,l,3,3-tetrametiluronijum heksafluorofosfat (HATU), u prisustvu aktivirajućeg sredstva, kao što je N,N-diizopropiletilamin (DIEA), a nakon toga kontaktiranjem aktiviranog estra karboksilne kiseline sa spirocikličnim ketonom (2) da se formira jedinjenje Formule (I). Alternativno, jedinjenja Formule (I) mogu da se formiraju prvo konvertovanjem karboksilne kiseline (3) u hlorid kiseline, kao što je reakcija sa tionil hloridom, a nakon toga reakcijom hlorida kiseline sa spirocikličnim ketonom (2) da se formira jedinjenje Formule (I).

Sinteze jedinjenja Formule (2), i njihovih početnih materijala, mogu da se izvrše kako je opisano u Šemama od B do E.

Za izradu spiroketona (2), rastvor supstituisanog ili nesupstituisanog l-(2-hidroksifenil)etanona (5), terc-butil 4-oksopiperidin-l-karboksilata i pirolidina (molarni odnos 1:1:1) u rastvaraču kao što je metanol, se meša 24 sata na temperaturi u rasponu od sobne temperature do temperature refluksa i upari da se dobije N-Boc-Spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on (4). Nakon toga se u rastvor N-Boc-Spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-ona (4), u rastvaraču kao što su dihlorometan, izopropanol ili dioksan, uz neprekidno mešanje, doda kiselina, kao što je HC1 ili trifluoroacetatna kiselina, za deprotekciju amina uklanjanjem Boe (t-butiloksikarbonil) grupe, da se formira spirociklični keton (2).

Alternativno, N-Boc-spiro[hromen-2-,4'-piperidin]-4(3H)-on može da se izdvoji kako je pokazano u Šemi C. Na primer, tretiranjem N-Boc-spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-ona, gde je jedan od R<1>, R<2>, R<3>ili R<4>bromo-grupa (14), sa ugljen monoksidom u prisustvu pogodnog katalizatora, kao što je dihlorobis(trifenilfozin)paladijum II, baze kao što je trietilamin i u prisustvu alkoholnog rastvarača, kao što je metanol, dobijaju se derivati metil estra N-Boc-spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-ona (24). Alternativna izrada uključuje podvrgavanje rastvora jedinjenja iz koga se izdvaja hidroksil-N-Boc-spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on (34) u inertnom rastvaraču, kao što je metilen hlorid, trifličnom anhidridu u prisustvu pogodne baze, kao stoje piridin, da se dobije željeni derivat triflatN-Boc-spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on (44). Tretiranjem rastvora triflata u rastvaraču kao što je dimetilformamid sa pogodnom mešavinom katalizatora, kao što su paladijum acetat i 1,1 -bis(difenilfosfino)ferocen, u prisustvu pogodne baze, kao što je trietilamin, u prisustvu alkohola, kao što je metanol, sa ugljen monoksidom, dobija se željeni metil estar (54).

Spirociklični estri izrađeni postupcima opisanim u Šemama B i C mogu dalje da se podvrgnu reakcijama da se dobiju amidi, estri i kiseline, kako je pokazano u Šemi D. Uklanjanjem N-Boc zaštitne grupe iz metil estra pomoću kiseline, dobij a se izdvojeni spirociklični estar (12). Alternativno, saponifikacijom spirociklusa zaštićenog saN-Boc grupom, dobija se karboksilna kiselina kao međuproizvod (64). Amini mogu da se udvoje sa karboksilnom kiselinom koristeći postupke koji su poznati stručnjaku sa iskustvom u tehnici, da se dobiju amidni derivati (74) koji, kada se tretiraju sa kiselinom, daju željene spiprociklične amine (22).

Spirociklični estri izrađeni postupcima koji su opisani u Šemama B i C mogu dalje da se prevedu u odgovarajuće aldehide koristeći postupke poznate stručnjaku sa iskustvom u tehnici, kako je pokazano u Šemi E. Aldehid može da se konvertuje u različite petočlane heterocikluse postupcima koje su opisali Tanaka, A.; i saradnici, J. Med. Chem. 1998, 41, 2390 - 2410. Alternativno, aril bromid može da se konvertuje direktno u Weinreb amid koristeći poznati protokol (Buchwald, S. L, i saradnici, Org. Lett. 2006, online preprint). Dobijeni Weinreb amid može da se konvertuje u željeni keton koristeći postupke koji su poznati stručnjaku sa iskustvom u tehnici. Nastali ketoni mogu da se transformišu u različite petočlane heterocikluse postupcima koje su opisali Tanaka, A.; i saradnici, J. Med. Chem. 1998, 41, 2390-2410.

Za izradu orto-hidroksiacetofenona (5), reagens za acetilaciju, kao što su acetil hlorid ili acetatni anhidrid, se doda u fenol (6) i reaktivna mešavina mesa na temperaturi između sobne temperature i temperature refluksa. Višak reagensa za acetilaciju seukloni pod vakuumom,a nakon toga se O-acetilisani fenol tretira sa AICI3i zagreva na visokoj temperaturi kao što je 180° C. Reaktivna mešavina se nakon toga ohladi, neutrališe sa vodenim rastvorom kiseline, kao što je razblažena hidrohloridna kiselina, i filtrira da se dobije željeni orto-hidroksiacetofenon.

Farmaceutska kompozicija iz ovog pronalaska uključuje terapeutski efektivnu količinu jedinjenja Formule (I) ili farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja i farmaceutski prihvatljiv nosač, vehikulum, razblaživač ili ekscipijent.

U jednom preferiranom aspektu farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska gde su R<5>i R uzeti zajedno, navedeni policiklični heterociklični radikal je IH-indazolil, 1H-benzoimidazolil, kvinolil, 1,2,3,4-tetrahidrokvinolil, kvinoksalil, lH-indolil, 2,3-dihidro-lH-benzoimidazolil, lH-benzo-[d][l,2,3]triazolil, 6,7,8,9-tetrahidro-5H-karbazolil, 2,3,4,9-tetrahidro-lH-pirido-[3,4-b]indolil ili benzooksazolil. Prsten koji sadrži azot navedenog policikličnog heterocikličnog radikala je opciono supstituisan.

U još jednom preferiranom aspektu farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska gde su R5 'R6 uzeti zajedno, navedeni policiklični heterociklični radikal je IH-indazolil, 1H-benzoimidazolil, lH-indolil ili 2,3-dihidro-lH-benzoimidazolil spojen sa cikloheksenom, 5,6-dihidro-piridinom ili 5,6-dihidro-lH-piridin-2-onom. Prsten koji sadrži azot navedenog policikličnog heterocikličnog radikala je opciono supstituisan.

U još jednom preferiranom aspektu farmacetuske kompozicije iz ovog pronalaska, R<5>je uzet odvojeno i to je opciono supstituisani pirazolil, imidazolil, oksadiazolil ili pirimidinil radikal.

Farmaceutska kompozicija formirana kombinovanjem jedinjenja iz ovog pronalaska i farmaceutski prihvatljivih nosača, vehikuluma ili razblaživača se nakon toga jednostavno primenjuje u različitim doznim oblicima, kao što su tablete, praškovi, lozenge, sirupi, injektibilni rastvori i slično. Ove farmaceutske kompozicije mogu, ukoliko se želi, da sadrže dodatne sastojke, kao što su sredstva za korigovanje ukusa, vezivna sredstva, ekscipijenti i slično. Prema tome, u svrhu oralne primene, tablete koje sadrže različite ekscipijente kao što su natrijum citrat, kalcijum karbonat i/ili kalcijum fosfat, mogu da sadrže i različite dezintegratore kao što su škrob, alginatna kiselina i/ili izvesni kompleksi silikata, zajedno sa vezivnim sredstvima kao što su polivinilpirolidon, saharoza, želatin i/ili akacija. Dodatno, lubrikantna sredstva kao što su magnezijum stearat, natrijum lauril sulfat i talk su često korisna u cilju tabletiranja. Čvrste kompozicije sličnog tipa mogu takođe da se upotrebe kao punioci u meko i čvrsto punjenim želatinskim kapsulama. U preferirane materijale za ovu svrhu spadaju laktoza ili mlečni šećer i polietilen glikoli velike molekulske težine. Kada se za oralnu primenu žele suspenzije ili eliksiri, aktivno farmaceutsko sredstvo može da se kombinuje sa različitim sredstvima za zaslađivanje ili korigovanje ukusa, sredstvima za bojenje ili bojama i, ukoliko se želi, emulgatorima ili sredstvima za suspendovanje, zajedno sa razblaživačima kao što su voda, etanol, propilen glikol, glicerin i/ili njihove kombinacije.

Za parenteralnu primenu, mogu da se koriste rastvori jedinjenja ili kompozicija iz ovog pronalaska u sezamovom ili kikirikijevom ulju, razblaženom propilen glikolu ili u sterilnim vodenim rastvorima. Ovi vodeni rastvori treba da budu odgovarajuće puferovani, ukoliko je to potrebno, pa se tečni razblaživač prvo izotonizuje sa odgovarajućom količinom soli ili glukoze. Ovi određeni vodeni rastvori su posebno pogodni za intravenoznu, intramuskularnu, subkutanu i intraperitonealnu primenu. U vezi sa ovim, sterilni vodeni medijumi za korišćenje su svi lako dostupni standardnim tehnikama koje su poznate stručnjaku sa iskustvom u tehnici.

Za intranazalnu primenu ili primenu inhalacijom, jedinjenja ili kompozicije iz pronalaska se uobičajeno oslobađaju u obliku rastvora ili suspenzije iz kontejnera sa sprej pumpom koji se istisne ili ispumpa od strane pacijenta ili se kao aerosol sprej oslobađa iz kontejnera pod pritiskom ili iz nebulizera, uz upotrebu pogodnog propelanta, na primer, dihlorodifluorometana, trihlorofluorometana, dihlorotetrafluoroetana, ugljen dioksida ili drugog pogodnog gasa. U slučaju aerosola pod pritiskom, dozirana jedinica može da se odredi obezbeđivanjem ventila za oslobađanje odmerene količine. Kontejner pod pritiskom ili nebulizer može da sadrži rastvor ili suspenziju jedinjenja iz ovog pronalaska. Kapsule i kartridži (izrađeni, na primer, od želatine) za upotrebu u inhaleru ili insuflatoru, mogu da se formulišu tako da sadrže praškastu mešavinu jedinjenja iz pronalaska i odgovarajuće praskaste baze kao što su laktoza ili škrob.

Postupci za izradu različitih farmaceutskih kompozicija sa određenom količinom aktivnog sastojka su poznati ili će biti jasni u svetlu ovog pronalaska, stručnjaku sa iskustvom u tehnici. Za primere postupaka za izradu farmaceutskih kompozicija, videti Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Companv, Easton, Pa., 19th Edition (1995).

Ovaj pronalazak se takođe odnosi na terapeutske postupke za lečenje ili prevenciju stanja prekomerne težine ili gojaznosti kod sisara, uključujući ljude, pri čemu se jedinjenje Formule (I) iz ovog pronalaska ili njegova so primenjuje kao deo odgovarajućeg doznog režima određenog tako da se dobije uspešna terapija. Odgovarajući dozni režim, količina svake primenjene doze i intervali između doza jedinjenja će zavisiti od jedinjenja Formule (I) iz ovog pronalaska koje se koristi, tipa farmaceutskih kompozicija koje se koriste, karakteristika subjekta koji se tretira i ozbiljnosti stanja.

Generalno, efektivna doza za jedinjenja, i soli, iz ovog pronalaska je u rasponu od 0.001 miligram(mg)/kg/dan do 100 mg/kg/dan, preferirano 0.01 mg/kg/dan do 10 mg/kg/dan aktivnog jedinjenja u jednoj ili podeljenim dozama. Međutim, neumitno dolazi do nekih varijacija u doziranju u zavisnosti od stanja subjekta koji se tretira. Pojedinačni odgovor na doziranje će, u svakom slučaju, da odredi odgovarajuću dozu za svaki pojedinačni subjekt. Praktičari će razumeti da se "kg" odnosi na težinu pacijenta merenu u kilogramima. Trenutno predviđene doze za ljudsku upotrebu su u rasponu od 10-300 mg/kg. Jedinjenja sa povećanom potencijom i/ili poboljšanom farmakodinamikom će imati niže zahtevane doze, obično od 0.1 do lOmg/kg.

Jedinjenja ili kompozicije iz ovog pronalaska mogu da se primene u jednoj (na primer, jednom dnevno) ili više doza ili konstantnom infuzijom. Jedinjenja iz ovog pronalaska mogu takođe da se primene sama ili u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačima, vehikulumima ili razblaživačima, ili u jednoj ili u više doza. Pogodni farmaceutski nosači, vehikulumi i razblaživači obuhvataju inertne čvrste razblaživače ili punioce, sterilne vodene rastvore i različite organske rastvarače.

Jedinjenja ili kompozicije iz ovog pronalaska mogu na subjektu kome je potreban tretman, da se primene različitim uobičajenim načinom primene, uključujući oralno i parenteralno (na primer, intravenozno, subkutano ili intramedularno). Osim toga, farmaceutske kompozicije iz ovog pornalaska mogu da se primene intranazalno, kao supozitorije, ili koristeći "flash" formulaciju, do jest, ostavljajući lek da se rastvori u ustima bez potrebe za korišćenjem vode.

OBJAŠNJENJE PRIMERIMA

Primeri koji su navedeni u niže datom tekstu dati su samo kao ilustracija. Ovde date kompozicije, postupci i različiti parametri treba samo primerima da objasne različite aspekte i otelotvorenja pronalaska, a ni na koji način nemaju za cilj da ograniče okvir pronalaska za koji se traži zaštita.

Ukoliko nije drugačije navedeno, svi učesnici reakcija su nabavljeni na tržištu.

Gasna hromatografija se izvodi u skladu sa postupkom koji su opisali Still i saradnici, J. Org. Chem., 1978,43,2923.

Sva Biotage® prečišćavanja, ovde diskutovana, su izvršena koristeći ili 40M ili 40S Biotage® kolonu koja sadrži KP-SIL silika gel (40-63 uM, 60 Angstrema) (Bioatge AB; Uppsala, Sweden).

Sva Combiflash® prečišćavanja, ovde diskutovana, su izvršena koristeći CombiFlash® Companion sistem (Teledvne Isco; Lincoln, Nebraska) uključujući RediSep® kolone sa silika gelom.

Maseni spektar se beleži na Waters (Waters Corp.; Milford, MA) Micromass Platform II spektrometru. Ukoliko nije drugačije navedeno, maseni spektar se beleži na Waters (Milford, MA) Micromass Platform II spektrometru.

Proton NMR hemijske promene su date u delovima po milion u opadaj ućim vrednostima iz tetrametilsilana i zabeležene su na Varian Unity 400 MHz (megaHertz) spektrometru (Varian Inc.; Palo Alto, CA). NMR hemijske promene su date u delovima po milion u opadaj ućim vrednostima iz tetrametilsilana (za proton) ili fluorotrihlorometana (za fluor).

Naredni postupci izrade se koriste u sintezama jedinjenja iz ovog pronalaska koja su dalje objašnjena u narednim primerima.

Spirociklični ketoni

Spirociklični ketoni, koji se koriste za izradu jedinjenja koja su data u primerima ovog pronalaska, se izrađuju koristeći jedan od narednih postupaka izrade spirocikličnih ketona 1-25.

Izrada spirocikličnog ketona 1

7- Metoksispiro[ hromen- 2, 4'- piperidinl- 4r3H)- on

U rastvor l-(2-hidroksi-4-metoksifenil)etanona (Acros Organics USA, Morris Plains, NJ)

( 83 miligrama ("mg"), 0.5 milimola ("mmol") u metanolu (1 mililitar ("mL")) se dodaju terc-butil

4-oksopiperidin-l-karboksilat (111 mg, 0.56 mmol) i pirolidin (42.5 mikrolitara ("uL"), 0.51 mmol). Mešavina se zagreva pod refluksom u toku noći. Mešavina se ohladi na sobnu temperaturu, koncentruje i prečisti Biotage hromatografijom (mešavina 8% aceton/heptan) da se dobije N-Boc-7-metoksispiro-[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on kao žuta čvrsta supstanca (89 mg, 51%), 248 (M-Boc, ES+).

U rastvor N-Boc-7-metoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-ona (58 mg, 0.17 mmol) u metanolu (1 mL) se doda 4 N rastvor HC1 u dioksanu (0.40 mL). Mešavina se meša 3 sata na sobnoj temperaturi. Mešavina se koncentruje da se dobije 7-metoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on hidrohlorid koji se koristi bez dodatnog prečišćavanja (45 mg, 95%), 248

(ES+).

Izrada spirocikličnog ketona 2

6- Metoksispiro [ hromen- 2. 4- piperidin] - 4( 3 H)- on

U rastvor l-(2-hidroksi-5-metoksifenil)etanona (831 mg, 5.0 mmol) u toluenu (5 mL) se dodaju terc-butil 4-oksopiperidin-l-karboksilat (1.20 grama ("g"), 6.0 mmol) i pirolidin (356 mg, 5.0 mmol). Mešavina se zagreva pod refluksom u toku noći. Mešavina se ohladi na sobnu temperaturu, koncentruje i prečisti Biotage hromatografijom (mešavina 8% aceton/heksan) da se dobije N-Boc-6-metoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on kao žuta čvrsta supstanca (1.27 g, 70%).

'H NMR (CDCl3) 5 7.27 (d, J=3, IH), 7.10 (dd, 3=9, 3, IH), 6.91 (d, 3=9, IH), 3.84 (m, 2H), 3.78 (s, 3H), 3.18 (t, J=12, 2 H), 2.68 (br s, 2H), 2.01 (d, J=13, 2H), 1.57 (m, 2H), 1.44 (s, 9H).

U rastvor N-Boc-6-metoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-ona (42 mg, 0.12 mmol) u metanolu (1 mL) se doda 4 N rastvor HC1 u dioksanu (0.30 mL). Mešavina se meša 90 minuta na sobnoj temperaturi. Mešavina se koncentruje da se dobije 6-hloro-7-metilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on koji se koristi bez dodatnog prečišćavanja (34 mg, 100%).

Izrada spirocikličnog ketona 3

6- hloro- 7- metilspiro|" hromen- 2. 4'- piperidinl- 4( 3H)- on

U rastvor l-(5-hloro-2-hidroksi-4-metilfenil)etanona (371 mg, 2.0 mmol) u benzenu (2 mL) se doda terc-butil 4-oksopiperidin-l-karboksilat. Mešavina se zagreva pod refluksom u toku noći. Mešavina se ohladi na sobnu temperaturu, koncentruje i prečisti Biotage hromatografijom

(mešavina 10% aceton/heptan) da se dobije N-Boc-6-hloro-7-metilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on kao žuta čvrsta supstanca (670 mg, 91%). N-Boc-6-hloro-7-metilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, 91%, *H NMR (CDC13) 5 7.79 (s, IH), 6.87 (s, IH), 3.88 (m, 2H), 3.17 (m, 2H), 2.66 (s, 2H), 2.42 (m, IH), 2.36 (s, 3H), 1.98 (m, 2H), 1.58 (m, 2H), 1.44(s, 9H).

U rastvor N-Boc-6-hloro-7-metilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-ona (60 mg, 0.16 mmol) u MeOH (1 mL) se doda 4 N rastvor HC1 u dioksanu (0.40 mL). Mešavina se meša 4 sata na sobnoj temperaturi. Mešavina se koncentruje da se dobije 6-hloro-7-metilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on hidrohlorid koji se koristi bez dodatnog prečišćavanja (50 mg, 100%), 266

(ES+)

Izrada spirocikličnog ketona 4

5, 6, 7- Trimetoksispiro[ hromen- 2. 4'- piperidinl- 4f3HVon

U rastvor l-(6-hidroksi-2,3,4-trimetoksifenil)etanona (452 mg, 2.0 mmol) u benzenu (2 mL) se dodaju terc-butil 4 oksopiperidin-l-karboksilat (438 mg, 2.2 mmol) i pirolidin (0.2 mL, 2 mmol). Mešavina se zagreva pod refluksom u toku noći. Mešavina se ohladi na sobnu temperaturu, koncentruje i prečisti Biotage hromatografijom (mešavina 15%aceton/heptan) da se dobije N-Boc-5,6,7-trimetoksispiro-[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on kao žuto-smeđa čvrsta supstanca (203 mg, 33%), 308 (ES+).

U rastvor N-Boc-5,6,7-trimetoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-ona (60 mg, 0.15 mmol) u metanolu (1 mL) se doda 4N rastvor HC1 u dioksanu (0.40 mL). Mešavina se meša 4 sata na sobnoj temperaturi. Mešavina se koncentruje da se dobije 5,6,7-trimetoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on hidrohlorid koji se koristi bez dodatnog prečišćavanja (53 mg, 100%), 308 (ES+).

Izrada spirocikličnog ketona 5

6- hloro- 5- metoksispirorhromen- 2, 4'- piperidin1- 4( 3HVon

U rastvor 2-hidroksi-6-metoksiacetofenona (500 mg, 3.0 mmol) u dietil etru (4.5 mL) se u kapima na 0 °C doda sulfuril hlorid (0.27 mL, 3.4 mmol). Dobijena mešavina se zagreva 4 sata pod refluksom pre nego što se ohladi na sobnu temperaturu. Dietil etarski rastvor se ispere dva puta sa vodom, organska faza se izdvoji i koncentruje. Materijal se prečisti Biotage hromatografijom (40 S kolona, mešavina 6%aceton/heptan) da se dobije l-(3-hloro-6-hidroksi-2-metoksifenil)etanon kao žuta tečnost (563 mg, 93%). ES- m/z 199 (M-, 100%),<*>H NMR (CDC13) 8 12.68 (s, IH), 7.41 (d, J=9.2, IH), 6.72 (d, J=9.2, IH), 3.92 (s, 3H), 2.74 (s, 3H).

U rastvor l-(3-hloro-6-hidroksi-2-metoksifenil)etanona (563 mg, 2.8 mmol) u metanolu (3 mL) se dodaju terc-butil 4-oksopiperidin-l-karboksilat (623 mg, 3.13 mmol) i pirolidin (0.24 ml, 2.9 mmol). Mešavina se zagreva pod refluksom u toku noći. Mešavina se ohladi na sobnu temperaturu, koncentruje i prečisti Biotage hromatografijom (mešavina 7 -10% aceton/heptan) da se dobije N-Boc-6-hloro-5-metoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on kao crvena čvrsta supstanca (670 mg, 63%),<*>H NMR (CDC13) 5 7.45 (d, J=9, IH), 6.74 (d, J=9, IH), 3.88 (s, 3H), 3.18 (m, 3H), 2.68 (s, 3H), 2.43 (t, J=5, IH), 1.97 (br d, J=13,2H), 1.60 (m, 4H), 1.44 (s, 9H).

U rastvor N-Boc-6-hloro-5-metoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-ona (64 mg, 0.17 mmol) u MeOH (1 mL) se doda 4 N rastvor HC1 u dioksanu (0.40 mL). Mešavina se meša 3 sata na sobnoj temperaturi. Mešavina se koncentruje da se dobije 6-hloro-5-metoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on koji se koristi bez dodatnog prečišćavanja (56 mg; 100%), 282 (ES+).

Izrada spirocikličnog ketona 6

Metil 4- okso- 3, 4- dihidrospiro[ hromen- 2, 4'- piperidin1- 6- karboksilat hidrohlorid

(Faza 1) U rastvor l-(5-bromo-2-hidroksifenil)etanona (2.0 g, 9.3 mmol) u metanolu (20 mL) se dodaju pirolidin (0.8 mL, 9.6 mmol) i terc-butil 4-oksopiperidin-l-karboksilat (1.91 g, 9.6 mmol). Mešavina se meša na sobnoj temperaturi u toku noći. Reaktivna mešavina se koncentruje i prečisti Biotage hromatografijom (40M kolona, gradijent 8% - 20% etil acetat/heptan) da se dobije terc-butil 6-bromo-4-okso-3,4-dihidro-lH-spiro[hromen-2,4 - piperidin]-l- karboksilat kao žuta čvrsta supstanca (3.09 g, 84%). 'H NMR (CDC13) 6 7.96 (d, J=2.5, IH), 7.56 (dd, J=8.7, 2.5, IH), 6.89 (d, J=8.7, IH), 2.70 (s, 2H), 1.44 (s, 9H).

(Faza 2) U rastvor terc-butil 6-bromo-4-okso-3,4-dihidro-lH-spiro[hromen-2,4 - piperidin]-l -karboksilata (0.8 g, 2 mmol) u metanolu (60 mL) se dodaju trietilamin (0.32 mL) i dihlorobis(trifenilfosfin)paladijum II (144 mg, 0.21 mmol). Mešavina se zagreva 2 dana na 80 °C pod pritiskom ugljen monoksida od 50 psi. Mešavina se ohladi na sobnu temperaturu, filtrira kroz diatomejsku zemlju i prečisti Biotage hromatografijom (40 S kolona, mešavina 15% EtoAc/heptan) da se dobije N-Boc Metil 4-okso-3,4-dihidrospiro[hromen-2,4'-piperidin]-6-karboksilat kao žuta čvrsta supstanca (677 mg, 90%). 'H NMR (CDC13) § 8.55 (d, J=2.1, IH), 8.16 (dd, J=8.8, 2.1, IH), 7.04 (d, J=8.7, IH), 3.90 (s, 3H), 2.76 (s, 2H), 1.46 (s,9H).

(Faza 3) U rastvor N-Boc Metil 4-okso-3,4-dihidrospiro[hromen-2,4'-piperidin]-6-karboksilata (225 mg, 0.60 mmol) u metanolu (4 mL) se doda 4 N rastvor HC1 u dioksanu (1.5

ml). Mešavina se meša 3 sata na sobnoj temperaturi, koncentruje da se dobije naslovljeno jedinjenje kao žuta čvrsta supstanca (195 mg, 100%). MS (ACPI)m/ z276 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije ("RT") 1.0 minuta.

Izrada spirocikličnog ketona 7

l- rterc- butoksikarbonil- 4- okso- 3. 4- dihidrospiro|" hromen- 2, 4'- piperidin]- 6- karboksilatna

kiselina

U rastvor N-Boc metil 4-okso-3,4-dihidrospiro[hromen-2,4'-piperidin]-6-karboksilata, izi Izrade Spiroketona 6, (375 mg, 1.0 mmol) u mešavini metanol/voda (1:1 odnos, 5 mL) se doda litijum hidroksid (49 mg). Mešavina se zagreva 2 sata na 50 °C pre nego što se ohladi na sobnu temperaturu. Mešavina se koncentruje, razblaži sa vodom i zakiseli sa KHSO4do pH 3. Precipitat koji se formira se ekstrahuje sa EtOAc, suši preko Na2SC>4, filtrira i koncentruje da se dobije naslovljeno jedinjenje kao žuta čvrsta supstanca (260 mg, 72%). MS (ACPI)m/ z360 (M-H)", HPLC vreme retencije 2.4 minuta.<*>H NMR (CDC13) 5 8.63 (2.0, IH), 8.20 (dd, J=8.7, 2.5, IH), 6.69 (d, J=8.8, IH), 2.76 (s, 2H), 1.45 (s, 9H).

Izrada spirocikličnog ketona 8

6-( Pirolidin- l- ilkarbonil) spiro[ hromen- 2. 4 - piperidin]- 4( 3H)- on

(Faza 1) U rastvor 1 -(terc-butoksikarbonil)-4-okso-3,4-dihidrospiro[hromen-2,4'-piperidin]-6-karboksilata (54 mg, 0.15 mmol) u CH2CI2(1 mL) se dodaju pirolidin (17 mg, 20 uL, 0.24 mmol), 0-(7-azabenzotriazol-l-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum heksafluorofosfat (HATU) (60 mg, 0.16 mmol) i trietilamin (50 uL, 0.36 mmol). Mešavina se meša na sobnoj temperaturi u toku noći. Mešavina se nakon toga koncentruje, a sirovi materijal se rastvori u EtOAc, ispere sa vodom i organski ekstrakt se koncentruje da se dobije naslovljeno jedinjenje kao lepljiva guma koja se koristi u nepromenjenom obliku bez dodatnog prečišćavanja (79 mg). MS (ACPI)m/ z415 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.3 minuta.

(Faza 2) U rastvor terc-butil 4-okso-6-(pirolidin-l-ilkarbonil)-3,4-dihidro-lH-spiro[hromen-2,4 -piperidin]-l-karboksilata (62 mg, 0.15 mmol) u metanolu (0.5 mL) se doda 4 N rastvor HC1 u dioksanu (0.15 mL). Mešavina se meša 2 sata na sobnoj temperaturi i doda se trietilamin (80 uL) da neutrališe kiselinu i mešavina se koncentruje da se dobije sirovi produkt koji se koristi bez dodatnog prečišćavanja. MS (ACPI)m/ z315 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 0.3 minuta.

Izrada spirocikličnog ketona 9

N- izopropil- 4- okso- 3, 4- dihidrospiro[ hromen- 2. 4- piperidin]- 6- karboksilat

Po proceduri opisanoj u Izradi spirocikličnog ketona 8, supstitucijom izopropilamina, dobija se terc-butil 6-[(izopropilamino)karbonil]-4-okso-3,4-dihidro-lH-spiro[hromen-2,4-piperidin]-l -karboksilat u obliku gume koja se koristi bez dodatnog prečišćavanja (89 mg). MS (ACPI)m/ z403 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.5 minuta.

Naslovljeno jedinjenje se izrađuje od terc-butil 6-[(izopropilamino)karbonil]-4-okso-3,4-dihidro-lH-spiro[hromen-2,4 -piperidin]-l -karboksilata, kako je opisano u Izradi spirocikličnog ketona 8 (faza 2). MS (ACPI)m/ z303 (M+H)<+>HPLC vreme retencije 0.6 minuta.

Izrada spirocikličnog ketona 10

N, N- Dimetil- 4- okso- 3, 4- dihidrospiro[ hromen- 2, 4- piperidin]- 6- karboksilat hidrohlorid

Po proceduri opisanoj u Izradi spirocikličnog ketona 8, supstitucijom dimetilamina, dobija se terc-butil 6-[(dimetilamino)karbonil]-4-okso-3,4-dihidro-lH-spiro[hromen-2,4-piperidin]-l -karboksilat kao žuta čvrsta supstanca koja se koristi bez dodatnog prečišćavanja (58 mg). MS (ACPI)m/ z389 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.2 minuta.

Naslovljeno jedinjenje se izrađuje od terc-butil 6-[(dimetilamino)karbonil]-4-okso-3,4-dihidro-lH-spiro[hromen-2,4 -piperidin]-l-karboksilata, kako je opisano u Izradi spirocikličnog ketona 8 (faza 2), izuzev što se ne dodaje trietilamin. MS (ACPI)m/ z289 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 0.2 minuta.

Izrada spirocikličnog ketona 11

6-( Morfolin- 4- ilkarbonil) spiro[ hromen- 2, 4 - piperidin~|- 4( 3H)- on

Po proceduri opisanoj u Izradi spirocikličnog ketona 8, supstitucijom morfolina, dobija se terc-butil 6-(morfolin-4-ilkarbonil)-4-okso-3,4-dihidro-lH-spiro[hromen-2,4-piperidin]-l - karboksilat kao žuta čvrsta supstanca koja se koristi bez dodatnog prečišćavanja (56 mg). MS (ACPI)m/ z431 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.3 minuta.

Naslovljeno jedinjenje se izrađuje od terc-butil 6-(morfolin-4-ilkarbonil)-4-okso-3,4-dihidro-lH-spiro[hromen-2,4 -piperidin]-! -karboksilata kako je opisano u Izradi spirocikličnog ketona 8 (faza 2), izuzev što se ne dodaje trietilamin. MS (ACPI)m/ z331 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 0.3 minuta.

Izrada spirocikličnog ketona 12

N- metil- 4- okso- 3. 4- dihidrospirofhromen- 2, 4- piperidinl- 6- karboksilamid

Po proceduri opisanoj u Izradi spirocikličnog ketona 8, supstitucijom metilamina, dobija se terc-butil 6-[(metilamino)karbonil]-4-okso-3,4-dihidro-lH-spiro[hromen-2,4-piperidin]-l - karboksilat kao žuta čvrsta supstanca koja se koristi bez dodatnog prečišćavanja (52 mg). MS (ACPI)m/ z375 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.8 minuta.

Naslovljeno jedinjenje se izrađuje od terc-butil 6-[(metilamino)karbonil]-4-okso-3,4-dihidro-lH-spiro[hromen-2,4 -piperidin]-l -karboksilata, kako je opisano u Izradi spirocikličnog ketona 8 (faza 2). MS (ACPI)m/ z275 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 0.3 minuta.

Izrada spirocikličnog ketona 13

4- okso- 3. 4- dihidrospiro rhromen- 2, 4- piperidin] - 6- karboksilamid

U posudu se dodaju N-Boc metil 4-okso-3,4-dihidrospiro[hromen-2,4'-piperidin]-6-karboksilat (56 mg, 0.15 mmol), izrađen kako je opisano u Izradi spirocikličnog ketona 6 (faza 2) i amonijum hidroksid (1 mL). Mešavina se zagreva na 65 °C u toku noći. Reaktivna mešavina se ohladi na sobnu temperaturu i koncentruje da se dobije terc-butil 6-(aminokarbonil)-4-okso-3,4-dihidro-lH-spiro[hromen-2,4 -piperidin]-l -karboksilat (56 mg, 100%). MS (ACPI)m/ z361

(M+H)<+>.

Naslovljeno jedinjenje se izrađuje od terc-butil 6-(aminokarbonil)-4-okso-3,4-dihidro-lH-spiro[hromen-2,4-piperidin]-l -karboksilata, kako je opisano u Izradi spirocikličnog ketona 8. MS (ACPI)m/ z261 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.1 minuta.

Izrada spirocikličnog ketona 14

6- izopropoksispiro[ hromen- 2, 4'- piperidin]- 4( 3H)- on hidrohlorid

Rastvor l-(2,5-dihidroksifenil)etanona (3.82 g, 25.1 mmol),), terc-butil 4-oksopiperidin-1-karboksilata (5.0 g, 25.1 mmol) i pirolidina (2.1 mL, 25.1 mmol) u metanolu (100 mL). Mešavina se zagreva 2 dana na 60 °C, a nakon toga koncentruje i prečisti Biotage hromatografijom da se dobije terc-butil 6-hidroksi-4-okso-3,4-dihidro-l'H-spiro[hromen-2,4'-piperidinj-l'-karboksilat kao žuta čvrsta supstanca (7.80 g, 93%).

Mešavina terc-butil 6-hidroksi-4-okso-3,4-dihidro-1 'H-spiro[hromen-2,4'-piperidin]-1 '-karboksilata (1.00 g, 3.00 mmol), acetona (5.0 mL), izopropil jodida (3.06 g, 1.80 mL, 18 mmol) i K2CO3(1.24 g, 9.0 mmol) se zagreva u zatvorenoj kiveti na 70 °C u toku noći. Čvrsti sastojci se uklone filtriranjem pod vakuumom, a filtrat se koncentruje. Ostatak se prečisti Biotage hromatografijom da se dobije terc-butil 6-izopropoksi-4-okso-3,4-dihidro-rH-spiro[hromen-2,4'-piperidin]-l'-karboksilat (890 mg, 79%).

Mešavina terc-butil 6-izopropoksi-4-okso-3,4-dihidro-rH-spiro[hromen-2,4'-piperidin]-l'-karboksilata (890 mg, 2.37 mmol), metanola (5.0 mL) i konc. HC1 se meša na sobnoj temperaturi u toku noći da se dobije 6-izopropoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on hidrohlorid (750 mg, 100%).

Izrada spirocikličnog ketona 15

6- etoksispirorhromen- 2. 4'- piperidinl- 4( 3H)- on hidrohlorid

Mešavina terc-butil 6-hidroksi-4-okso-3,4-dihidro-1 'H-spiro[hromen-2,4'-piperidin]-l'-karboksilat a(1.00 g, 3.00 mmol), izrađena kako je opisano u Izradi spirocikličnog ketona 14, acetona(5.0 mL),jodoetana (2.81 g, 1.45 mL, 18 mmol) i K2CO3(1.24 g, 9.0 mmol) se zagrevau zatvorenoj kiveti na 70 °C u toku noći. Čvrsti sastojci se uklone filtriranjem pod vakuumom, a filtrat se koncentruje. Ostatak se prečisti Biotage hromatografijom da se dobije terc-butil 6-etoksi-4-okso-3,4-dihidro-rH-spiro[hromen-2,4'-piperidin]-r-karboksilat (1.00 g, 92%).

Mešavina terc-butil 6-etoksi-4-okso-3,4-dihidro-lH-spiro[hromen-2,4'-piperidin]-r-karboksilata (1.00 g, 2.77 mmol), metanola (5.0 mL) i konc. HC1 se meša na sobnoj temperaturi u toku noći da se dobije 6-etoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on hidrohlorid (830 mg, 100%).

Izrada spirocikličnog ketona 16

5- hloro- 7- metoksispiro[ hromen- 2. 4'- piperidin1- 4( 3H)- on hidrohlorid

U 3-hloro-5-metoksifenol (4.00 g, 25.2 mmol) se doda acetil hlorid (9.0 mL, 5.0 mmol) i mešavina se zagreva na 60 °C u toku noći. Acetil hlorid se ukloni pod sniženim pritiskom, doda se AICI3(1.96 g, 14.7 mmol) i mešavina se zagreva 1 sat na 180 °C. Reaktivna mešavina se ohladi na sobnu temperaturu. U mešavinu se polako doda mešavina 38% HCl/voda (30 mL/100 mL) i snažno meša 4 h. Mešavina se filtrira da se dobije mešavina 1 -(2-hloro-6-hidroksi-4-metoksifenil)etanona i l-(4-hloro-2-hidroksi-6-metoksifenil)etanona (5.38 g).

U mešavinu l-(2-hloro-6-hidroksi-4-metoksifenil)etanona i l-(4-hloro-2-hidroksi-6-metoksifenil)etanona (5.38 g, 26.8 mmol) se dodaju terc-butil 4-oksopiperidin-l-karboksilat

(5.34 g, 26.8 mmol), metanol (100 mL) i pirolidin (1.9 g, 2.2 mL, 27 mmol). Mešavina se zagreva na 60 °C u toku noći. Rastvarači se uklone pod sniženim pritiskom i prečiste pomoću CombiFlash® [hromatografija na silika gelu] da se dobiju terc-butil 7-hloro-5-metoksi-4-okso-3,4-dihidro-l'H-spiro[hromen-2,4'-piperidin]-r-karboksilat (2.32 g) i terc-butil 5-hloro-7-metoksi-4-okso-3,4-dihidro-rH-spiro[hromen-2,4'-piperidin]-r-karboksilat (1.40 g).

Mešavina terc-butil 5-hloro-7-metoksi-4-okso-3,4-dihidro-rH-spiro[hromen-2,4'-piperidin]-l -karboksilata (500 mg, 1.31 mmol) u metanolu (5.0 mL) i konc. HC1 (6.6 mL) se meša na sobnoj temperaturi u toku noći. Reaktivna mešavina se koncentruje da se dobije naslovljeni produkt (425 mg, 100%).

Izrada spirociklično<g>ketona 17

7- hloro- 5- metoksispiro[ hromen- 2. 4'- piperidin1- 4( 3H)- on

Rastvor terc-butil 7-hloro-5-metoksi-4-okso-3,4-dihidro-l 'H-spiro[hromen-2,4'-piperidin]-l '-karboksilata (izrađen kako je opisano u Izradi spirocikličnog ketona 16) (500 mg, 1.31 mmol) u metanolu (5.0 mL) koji sadrži koncentrovanu HC1 (6.6 mL) se meša na sobnoj temperaturi u toku noći. Reaktivna mešavina se koncentruje da se dobije naslovljeno jedinjenje (420 mg, 100%).

Izrada spirocikličnog ketona 18

7- Metoksi- 5- metilspiro[" hromen- 2. 4'- piperidin]- 4( 3H)- on hidrohlorid

U rastvor l-(2-hidroksi-4-metoksi-6-metilfenil)etanona (0.81 g, 4.5 mmol) u metanolu (15 mL) se dodaju pirolidin (0.38 mL, 4.5 mmol) i terc-butil 4-oksopiperidin-l-karboksilat (896 mg, 4.5 mmol). Mešavina se meša na 60 °C u toku noći. Rastvarači se uklone, a ostatak se prečisti sa CombiFlash® [hromatografija na silika gelu] da se dobije terc-butil 7-metoksi-5-metil-4-okso-3,4-dihidro-l'H-spiro[hromen-2,4'-piperidin]-r-karboksilat (960 mg, 59%).

U mešavinu terc-butil 7-metoksi-5-metil-4-okso-3,4-dihidro-rH-spiro[hromen-2,4'-piperidin]-l'-karboksilata (960 mg, 2.66 mmol) u metanolu (5.0 mL) se doda 2 M rastvor HC1 (13.3 mL). Mešavina se meša na sobnoj temperaturi u toku noći i nakon toga koncentruje da se dobije naslovljeni produkt (780 mg, 99%).

Izrada spirocikličnog ketona 19

Spiro[ hromen- 2. 4'- piperidin1- 4( 3H')- on

Rastvor l-(2-hidroksifenil)etanona (100 g, 0.74 mol), terc-butil 4-oksopiperidin-l-karboksilata (146 g, 0.74 mol) i pirolidina (61 mL, 0.74 mol) u metanolu (600 mL) se meša 24 sata i upari. Ostatak se podvrgne hromatografiji (mešavina heksan/etil acetat 100:0-» 90:10) na silika gelu da se dobije N-Boc-Spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on u prinosu od 97% (225 g), 218(M-Boc; ES+).

Čista trifluoroacetatna kiselina (80 mL) se doda u rastvor [N-Boc-Spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-ona ili terc-butil 4-okso-3,4-dihidro-rH-spiro[hromen-2,4'-piperidin]-r-karboksilata] (40 g, 0.126 mol) u dihlorometanu (250 mL). Rastvor se nakon toga meša u toku noći i zatim upari. U ostatak se doda voda (približno 300 mL), dobijeni rastvor se zaalkališe sa 10N rastvorom NaOH do pH približno 14. Produkt se nakon toga ekstrahuje sa hloroformom. Ekstrakt se suši preko Na2S04i upari da se dobije spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on u prinosu od 93.7% (25.6 g), 218 (ES+)

Izrada spirocikličnog ketona 20

7- Fluorospiro [ hromen- 2. 4'- piperidin] - 4( 3 H)- on hidrohlorid hidrat

Rastvor l-(4-fluoro-2-hidroksifenil)etanona (200 g, 1.3 mol), terc-butil 4-oksopiperidin-1-karboksilata (258 g, 1.3 mol) i pirolidina (108 mL, 1.3 mol) u metanolu (800 mL) se meša 24 sata, a zatim upari. Ostatak se nakon toga rastvori u etil acetatu, ispere sa vodom, 0.5 N rastvorom HC1, rastvorom NaHC03i zasićenim vodenim rastvorom NaCl i propusti kroz tanak sloj Si02i Na2S04. Filtrat se upari, ostatak se ispere sa mešavinom heksan/etil acetat (9:1) i podvrgne hromatografiji (mešavina heksan/etilacetat 90:10-» 80:20) da se dobije N-Boc-7-Fluorospiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on u prinosu od 33% (144 g), 236 (M-Boc; ES+).

HC1 (90 mL) se doda u rastvor N-Boc-7-Fluorospiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-ona]

(44.2 g, 0.132 mol) u izopropanolu (150 mL) i dobijena mešavina se refluksuje 3 sata. Nakon toga, mešavina se upari, a ostatak se ponovo dva puta upari sa izopropanolom, ispere sa etrom i suši da se dobije 7-fluorospiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on hidrohlorid hidrat u prinosu od 99% (35.8 g), 236(AP1+).

Izrada spirocikličnog ketona 21

6- metilspiro|" hromen- 2. 4'- piperidinl- 4( 3H)- on

Rastvor l-(2-hidroksi-5-metilfenil)etanona (100 g, 0.67 mol), terc-butil 4-oksopiperidin-1-karboksilata (133 g, 0.67 mol) i pirolidina (55.8 mL, 0;67 mol) u metanolu (600 mL) se meša 24 sata i filtrira. Izdvojeni kristali se isperu sa mešavinom heksan/etil acetat (9:1), nakon toga refluksuju sa heksanom (150 mL) i ponovo razdvoje filtriranjem. Kristali se konačno osuše da se dobije terc-butil 6-metil-4-okso-3,4-dihidro-rH-spiro[hromen-2,4'-piperidin]-l '-karboksilat u prinosu od 89% (195.5 g).<*>HNMR (DMSO-d6) 6 7.48 (s, IH), 7.36 (dd, J=3, 8,1H), 6.94 (d, J=8,1H), 3.67 (m, 2H), 3.08 (m, 2H), 2.76 (s, 2H), 2.23 (s, 3H), 1.82 (m, 2H), 1.56 (m, 2H), 1.36 (s, 9H).

Cista trifluoroacetatna kiselina (80 mL) se doda u rastvor terc-butil 6-metil-4-okso-3,4-dihidro-rH-spiro[hromen-2,4'-piperidin]-l'-karboksilata (40 g, 0.12 mol) u dihlorometanu (300 mL). Dobijeni rastvor se meša u toku noći i zatim upari. U ostatak se nakon toga dodaju voda (200 mL) i hloroform (200 mL) i dobijeni rastvor se zaalkališe sa 19 N rastvorom NaOH do pH približno 12. Produkt se nakon toga ekstrahuje sa hloroformom. Ekstrakt se propusti kroz sloj Si02i Na2S04i upari da se dobije 6-metilspiro[hromen-2,4 -piperidin]-4(3H)-on u prinosu od 96% (26:7 g). 232 (ES+).

Izrada spirocikličnog ketona 22

6, 7- Dimetilspirorhromen- 2. 4'- piperidin~|- 4( 3H)- on

l-(2-Hidroksi-4,5-dimetilfenil)etanon (150 g, 0.914 mol) i pirolidin (76.3 mL, 0.914 mol) u metanolu (1 L) se mešaju 15 minuta. Nakon toga se doda terc-butil 4-oksopiperidin-l - karboksilat (182.2 g, 0.914 mol) i mešavina se meša 24 sata. Formirani precipitat se izdvoji filtriranjem, ispere sa heksanom i suši da se dobije 245 g čistog terc-butil 6,7-dimetil-4-okso-3,4-dihidro-rH-spiro[hromen-2,4'-piperidin]-l'-karboksilata. Kombinovani filtrati se upare, a ostatak se kristališe iz malo heksana da se dobije dodatna količina (21 g) produkta. Ukupan prinos je 77.1% (266 g). 'HNMR (CDC13) 5 7.58 (s, IH), 6.76 (s, IH), 3.84 (br d, J=13, 2H), 3.18 (m, 2 H), 2.64 (s. 2H). 2.25 (s, 3H), 2.19 (s, 3H). 1 99 (br d J=12, 2H), 1 59 (m, 2H), 1.44 (s, 9H), 344

(API-).

Čista trifluoroacetatna kiselina (80 mL) se uz hlađenje sa hladnom vodom doda u terc-butil 6,7-dimetil-4-okso-3,4-dihidro-rH-spiro[hromen-2,4'-piperidin]-r-karboksilat (50 g, 0.145 mol) u dihlorometanu (300 mL). Mešavina se meša na sobnoj temperaturi u toku noći, a isparljivi delovi se nakon toga upare. Ostatak se rastvori u vodi i vodeni sloj ispere dva puta sa etrom, nakon toga zaalkališe sa NaOH do pH približno 14. Produkt se ekstrahuje sa CHC13, suši (Na2S04) i koncentruje da se dobije produkt (27.9 g; 78.6%).<*>H NMR (DMSO-d6) 8 7.49 (s, IH), 6.94 (s, IH), 3.34 (br s, 6 H), 3.95 (brd, J=12, IH), 3.82 (t, J=12, IH), 2.82 (s, IH), 2.24 (s, 2H), 2.18 (s, 2H),2.59 (d, J=15, IH), 2.34 (t, J=ll, IH). LC/MS API+246 (MH+).

Izrada spirociklično<g>ketona 23

6- hlorospirorhromen- 2. 4'- piperidin"|- 4( 3H)- on

Rastvor l-(5-hloro-2-hidroksifenil)etanona (ASDI Inc., Newark, DE) (103.9 g, 0.609 mol), terc-butil 4-oksopiperidin-l-karboksilata (2; 121.2 g, 0.609 mol) i pirolidina (50.8 mL, 0.609 mol) u metanolu (500 mL) se meša 24 h, nakon toga se precipitirani kristali izdvoje filtriranjem i isperu sa mešavinom heksanom/etil acetat (9:1). Nakon toga se doda heksan (150 mL), dobijena mešavina se refluksuje i nakon toga filtrira. Izdvojeni kristali se suše da se dobije N-Boc-6-hlorospiro-[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on u prinosu od 72% (153 g).

Čista trifluoroacetatna kiselina (80 mL) se doda u rastvor N-Boc-6-hlorospiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-ona (50 g, 0.14 mol) u dihlorometanu (300 mL). Mešavina se meša 24 sata i zatim upari. U ostatak se dodaju voda (200 mL) i hloroform (200 mL), dobijena mešavina se zaalkališe sa 19 N rastvorom NaOH do pH približno 12. Produkt se ekstrahuje sa hloroformom. Ekstrakt se propusti kroz tanak sloj Si02i Na2S04da se dobije 6-hlorospiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on u prinosu od 88% (30.8 g), 252/254 (ES+).

Izrada spirocikličnog ketona 24

5- Metoksispiro[ hromen- 2, 4'- piperidinl- 4( 3H)- on

l-(2-Hidroksi-6-metoksifenil)etanon (40.5 g, 0.244 mol) i pirolidin (20.3 mL, 0.244 mol) u metanolu (250 mL) se mešaju 15 minuta, nakon toga se doda terc-butil 4-oksopiperidin-l-karboksilat (48.6 g, 0.244 mol). Mešavina se meša još 24 sata i filtrira. Izdvojeni precipitat se ispere sa heksanom i suši da se dobije N-Boc-5-metoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on u prinosu od 83.5% (70.7 g), 248 (M-Boc; ES+)

Čista trifluoroacetatna kiselina (80 mL) se doda u N-Boc-5-metoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on (50 g, 0.144 mol) u dihlorometanu (200 mL) i mešavina se meša na sobnoj temperaturi u toku noći, a zatim upari. Ostatak se razblaži sa vodom (500 mL) i zaalkališe sa 10 N rastvorom NaOH do pH 14. Produkt se ekstrahuje sa hloroformom, ekstrakt se suši preko Na2S04i upari. Ostatak se podvrgne hromatografiji (mešavina hloroform/metanol/trietilamin 100:0:0-> 91:9-» 0:86:14) na silika gelu da se dobije 5-metoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on u prinosu od 84.7% (30 g), 248 (ES+).

Izrada spirocikličnog ketona 25

U mešavinu orto-hidroksiacetofenona ili 2-hidroksibenzamida i pirolidina (0.75 do 1 ekvivalenat) u pogodnom rastvaraču, kao što su metanol, benzen ili toluen, se doda terc-butil 4-oksopiperidin-1-karboksilat (1 ekvivalent) i mešavina meša 18-48 sati na temperaturi između sobne temperature i temperature refluksa. Produkt se izdvoji filtriranjem, opciono prečisti hromatografijom na silika gelu a nakon toga rastvori u vodi.

Na sobnoj temperaturi, rastvor N-Boc-spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-ona u pogodnom rastvaraču, kao što su dihlorometan, dioksan ili metanol, se tretira sa pogodnom kiselinom, kao što su trifluoroacetatna kiselina ili 4 N rastvor HC1 u dioksanu, sve dok se reakcija ne završi. Isparljivi delovi se upare da se dobije so željenog produkta. Produkt se dalje koristi u obliku soli ili, kada se izrađuje slobodna baza, so se rastvori u vodi ispirajući vodeni sloj sa etrom, vodena faza se zaalkališe sa NaOH do pH približno 14. Produkt se ekstrahuje sa CHCI3, suši (Na2S04) i koncentruje da se dobije slobodna baza željenog produkta.

Koristeći ovaj postupak, spirociklični ketoni se izrađuju od niže navedenih komercijalno raspoloživih orto-hidroksiacetofenona: 2'-hidroksi-4'-metilacetofenon (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), l-(4-hloro-2-hidroksi-fenil)etanon (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan), l-(3-hidroksi-bifenil-4-il)etanon (Bradsher, C. K.; i saradnici, J. Am. Chem. Soc. 1954, 76, 2357-2362), l-(2-hidroksi-3,5-dimetil-fenil)etanon (Oakwood Products, Inc., West Columbia, SC), l-(2-hidroksi-5-trifluorometoksi-fenil)etanon (Apollo Scientific Ltd., Cheshire, UK), 3-acetil-4-hidroksi-benzonitril (Ramidus AB, Lund, Sweden), 4',5'-dimetoksi-2'-hidroksiacetofenon (Indofine Chemical Companv, Inc., Hillsborough, NJ), l-(3,5-dihloro-2-hidroksifenil)etanon (ASDI Inc., Nevvark, DE), 3-acetil-4-hidroksibenzoatna kiselina (Princeton BioMolecular Research Inc., Monmouth Junction, NJ), l-(2-hidroksi-5-(metilsulfonil)fenil)etanon (CiventiChem, Research Triangle Park.NC), i l-(2-hidroksi-5-izopropilfenil)etanon (AstaTech, Inc., Bristol, PA).

Pored toga, naredni orto-hidroksiacetofenoni, koji se izrađuju kako je niže opisano, se koriste za izradu spirocikličnih ketona, koristeći postupak Izrada spirocikličnog ketona 25, 4'-hloro-2'-hidroksi-5'-metilacetofenon, 4'-hloro-2'-hidroksiacetofenon, 4',5'-dihloro-2'-hidroksiacetofenon, 4-acetil-3-hidroksi-benzonitril, l-(2-hidroksi-5-trifluorometil-fenil)etanon, 1 -(5-hloro-4-fluoro-2-hidroksifenil)etanon, 1 -(4-hloro-5-fluoro-2-hidroksifenil)etanon, 1 -(5-bromo-2-hidroksi-4-metilfenil)etanon, 1 -(2,4-dihloro-6-hidroksifenil)etanon, 1 -(3-hloro-6-hidroksi-2,4-dimetilfenil)etanon i 1 -(2-fluoro-6-hidroksi-3-metoksifenil)etanon.

Orto- hidroksiacetofenoni

Orto-hidroksiacetofenoni, koji se koriste za izradu jedinjenja iz primera ovog pronalaska, se izrađuju koristeći jedan od narednih postupaka za izradu hidroksiacetofenona 1-6.

Izrada orto- hidroksiacetofenona 1

l-( 4- hloro- 2- hidroksi- 5- metilfenil) etanon

U 3-hloro-4-metilfenol (1.97 g, 13.8 mmol) se doda acetil hlorid (1.15 g, 1.04 mL, 14.6 mmol) i dobijena mešavina se zagreva 2 sata na 60° C. U mešavinu se doda AICI3(1.84 g, 13.8 mmol) i mešavina se zagreva 30 minuta na 180° C. Reaktivna mešavina se nakon toga ohladi na sobnu temperaturu i polako neutrališe sa mešavinom 38% HCl/voda (8 mL/17 mL) i meša 30 minuta. Čvrsti sastojci se uklone filtriranjem, vodeni rastvor se koncentruje i suši da se dobije naslovljeno jedinjenje kao žuta čvrsta supstanca (1.97 g, 77%). 'HNMR (CDC13) 8 11.21 (s, 1 H), 7.54 (s, 1 H), 7.00 (s, 1 H), 2.59 (s, 3 H),. 2.32 (s, 3 H).

Izrada orto- hidroksiacetofenona 2

1 -( 2- hidroksi- 5 - trifluorometil- feniDetanon

Mešavina 4-trifluorometil-2"-bromofenola (1.00 gl 4715 mmol), toluena (20 mL), (1-etoksivinil)tributil stanana (1.65 g, 4.56 mmol) i dihlorobis (trifenilfosfin)paladijuma (146 mg, 0.207 mmol) se zagreva na 100 °C u toku noći pre nego što se ohladi na sobnu temperaturu. U ovu mešavinu se doda 1 N rastvor HC1 (6 mL) i mešavina se nakon toga snažno meša približno 90 minuta. Organska faza se ispere sa vodom (30 mL), zasićenim vodenim rastvorom NaCl, suši preko Na2S04, filtrira i koncentruje da se dobije crno ulje. Produkt se prečisti Biotage hromatografijom (EtOAc/heptan gradijent) da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bledo žuto ulje (335 mg, 39.5%).

Izrada orto- hidroksiacetofenona 3

l-( 2- hidroksi- 6- metoksi- 4- metilfenil) etanon

U rastvor 5-metil-cikloheksan-l,3-diona (1.01 g, 8.0 mmol) u CH2C12(15 mL) se doda trietilamin (1.2 mL, 8.6 mmol), a nakon toga acetil hlorid (0.6 mL, 8.4 mmol). Mešavina se meša 3 sata na sobnoj temperaturi, a nakon atoga ispere sa vodom (2x). Vodena faza se ponovo ekstrahuje sa EtOAc. Kombinovani organski ekstrakti se koncentruju i prečiste sa Biotage (40S kolona, mešavina 15%aceton/heptan) da se dobije 5-metil-3-oksocikloheks-l-enil acetat (1.2 g, 89%).

Mešavina 5-metil-3-oksocikloheks-l-enil acetata (1.2 g, 7.1 mmol), CH3CN (15 mL), trietilamina (2.1 mL) i natrijum cijanida (7 mg, 0.1 mmol) se meša na sobnoj temperaturi u toku noći. Mešavina se koncentruje, ponovo rastvori u EtOAc i zakiseli sa 1 N rastvorom HC1. Organska faza se izdvoji, koncentruje i prečisti Biotage hromatografijom (40S kolona, mešavina 8% aceton/heksan) da se dobije 2-acetil-5-metilcikloheksan-l,3-dion (0.96 g, 96%).

Rastvor 2-acetil-5-metilcikloheksan-l,3-diona (0.96 g, 5.7 mmol) u metanolu (28 mL) koji sadrži jod (2.90 g, 11.4 mmol) se zagreva pod refluksom u toku noći. Mešavina se ohladi na sobnu temperaturu i koncentruje. Materijal se rastvori u CH2CI2i ispere sa vodenim rastvorom Na2S203, a vodena faza se ponovo ekstrahuje sa CH2CI2(2x). Kombinovani organski ekstrakti se koncentruju i prečiste Biotage hromatografijom (40 M kolona, mešavina 10%aceton/heptan) da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bledo žuta čvrsta supstanca (550 mg, 53%).

Izrada orto- hidroksiacetofenona 4

1 -( 2- fluoro- 6- hidroksi- 3 - metoksifenil) etanon

U rastvor l,4-dimetoksi-2-fluorobenzena (1.56 g, 10 mmol) u THF (15 mL) se na -78 °C doda n-BuLi (5.0 mL 2.5 M rastvor heksana, 12 mmol). Mešavina se meša 30 minuta, a nakon toga se polako doda acetaldehid (0.79 mL, 14 mmol). Reaktivna mešavina se meša dodatnih 30 minuta, nakon toga se neutrališe dodavanjem metanola i zasićenog vodenog rastvora NH4CI. Reaktivna mešavina se zagreje na sobnu temperaturu i ekstrahuje sa EtOAc. Organski ekstrakt se koncentruje i prečisti Biotage hromatografijom (40 S kolona, mešavina 15%aceton/heptan) da se dobije l-(2-fludro-3,6-dimetoksifenil)etanol (1.57 g, 79%).

U ledeno hladan rastvor l-(2-fluoro-3,6-dimetoksifenil)etanola (1.57 g, 7.84 mmol) u acetonu (23 mL) se polako doda Jones reagens (izrađen dodavanjem 1,57 g Cr03u 1.6 mL koncentrovane H2S04u 4.7 mL ledeno hladne vode). Mešavina se meša 30 minuta, kupatilo za hlađenje se nakon toga ukloni i doda se izopropanol (2 mL). Dobijeni zeleni precipitat se ukloni filtriranjem kroz diatomejsku zemlju, a diatomejska zemlja se ispere sa etil acetatom ("EtOAc"). Filtrat se koncentruje i ponovo rastvori u EtOAc, ispere sa zasićenim vodenim rastvorom NaHC03, zasićenim vodenim rastvorom NaCl, koncentruje i prečisti Biotage hromatografijom (40 S kolona, mešavina 8% aceton/heksan) da se dobije naslovljeno jedinjenje kao žuto ulje (1.06 g, 68%).

Izrada orto- hidroksiacetofenona 5

U fenol se doda reagens za acetilaciju, kao što su acetil hlorid (1.0-2.0) ili acetatni anhidrid, i reaktivna mešavina meša 2-18 sati na temperaturi između sobne temperature i temperature refluksa. Višak reagensa za acetilaciju se ukloni pod vakuumom, nakon toga se O-acetilirani fenol tretira sa A1C13(1.0-1.25 eq) i zagreva 30-60 minuta na visoku temperaturu, kao što je 180° C. Reaktivna mešavina se nakon toga ohladi, neutrališe sa razblaženom kiselinom i filtrira da se dobije željeni orto-' hidroksiacetofenon.

Hidroksiacetofenoni se izrađuju, koristeći postupak izrade hidroksiacetofenona 5, od komercijalno raspoloživi reagenasa kako sledi: 4-Acetil-3-hidroksi-benzonitril od 3-hidroksibenzonitrila, l-(5-hloro-4-fluoro-2-hidroksifenil)etanon od 4-hloro-3-fluorofenola, l-(4-hloro-5-fluoro-2-hidroksifenil)etanon od 3-hloro-4-fluorofenola, l-(5-bromo-2-hidroksi-4-metilfenil)etanon od 4-bromo-3-metilfenola, l-(2,4-dihloro-6-hidroksifenil)etanon od 3,5-dihlorofenola, l-(3-hloro-6-hidroksi-2,4-dimetilfenil)etanon od 4-hloro-3,5-dimetilfenola.

Izrada orto- hidroksiacetofenona 6

1 -( 4, 5 - Dihloro- 2- hidroksifenil) etanon

U 3,4-dihlorofenol (2.00 g; 12.3 mmol) se na sobnoj temperaturi doda acetil hlorid (1.02 g, 13 mmol) i nakon 30 minuta reaktivna mešavina se zagreva 45 minuta na 60° C. Nakon toga se doda AICI3(1.64 g, 12.3 mmol) i reaktivna mešavina zagreva 30 minuta na 180° C. Reaktivna mešavina se ostavi da se ohladi i polako neutrališe sa mešavinom 38% HCI/H2O (30 mL/100 mL), a nakon toga meša 2.5 sata. Dobijeni precipitat se filtrira, ispere sa vodom i suši pod visokim vakuumom da se dobije produkt kao beličasta čvrsta supstanca (2.07 g; 82% prinos).<l>HNMR (CDCI3) 5 12.16 (s, IH), 7.78 (s, IH) 7.11 (s, IH), 2.61 (s, 3H); LC-MS m/z @ 203, 205, 207 (ES-).

Karboksilne kiseline

Niže date komercijalno raspoložive karboksilne kiseline se koriste za izradu u primerima datih jedinjenja Formule (1) iz ovog pronalaska: 2-etil-l-(3-metoksi-fenil)-lH-benzoimidazol-5-karboksilna kiselina (DiscovervLab Ltd., Russia), lH-indazol-5-karboksilna kiselina (Tyger Scientific, Inc., Ewing, NJ), lH-indazol-6-karboksilna kiselina (Sinova Inc., Bethesda, MD), 1-Metil-lH-indol-5-karboksilna kiselina (ASDI Inc., Newark, DE), lH-Benzoimidazol-5-karboksilna kiselina (Infarmatik, Inc., Newark, DE), 2-Piridin-2-il-lH-benzoimidazol-5-karboksilna kiselina (Aurora Fine Chemicals Ltd., Graz, Austria), 2-Trifluorometil-lH-benzoimidazol-5-karboksilna kiselina (Oakwood Products, Inc., West Columbia, SC), 2-metil-lH-benzoimidazol-5-karboksilna kiselina (Acros Organics USA, Morris Plains, NJ), lH-indazol-4-karboksilna kiselina; lH-indol-7-karboksilna kiselina (J & W PharmLab LLC, Morrisville, PA), lH-indol-6-karboksilna kiselina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 1 -metil-lH-indol-4-karboksilna kiselina (Mavbridge, Cornvvall, UK), 2-Piridin-4-il-3H-benzoimidazol-5-karboksilna kiselina (Infarmatik, Inc., Newark, DE), 2-hidroksimetil-lH-benzoimidazol-4-karboksilna kiselina (Matrix Scientific, Columbia, SC), lH-benzoimidazol-4-karboksilna kiselina (Infarmatik, Inc., Newark, DE), 2-metil-lH-benzoimidazol-4-karboksilna kiselina(lnfarmatik,lnc, Newark, DE), l-metil-2-okso-2,3-dihidro-lH-benzoimidazol-5-karboksilna kiselina (Chemstep, Carbon Blanc, France), kvinolin-6-karboksilna kiselina (Alfa Aesar, Ward Hill, MA), lH-benzotriazol-5-karboksilna kiselina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 1-metil-lH-benzotriazol-5-karboksilna kiselina (Ryan Scientific, Mt. Pleasant, SC), 3-(lH-pirazol-3-il)-benzoatna kiselina (Mavbridge. Cormvall, UK), 3-pirazol-l-il-benzoatna kiselina (ASDI Inc., Newark, DE), -lH-indol-4-karboksilna kiselina (Matrix Scientific, Columbia, SC), 1- metil-lH-benzoimidazol-5-karboksilna kiselina (Ambinter Sari, Pariš, France), 3-(5-metil-[l,2,4]oksadiazol-3-il)-benzoatna kiselina (ASDI Inc. Newark, DE), l-okso-2,3,4,4a,9,9a-heksahidro-lH-beta-karbolin-6-karboksilna kiselina (J & W PharmLab LLC, Morrisville, PA), 2- fenil-lH-benzimidazol-6-karboksilna kiselina (Fluorochem Ltd., Derbyshire, UK), 1-(2,3,4,9-tetrahidro-lH-karbazol-6-il)etanon (Matrix Scientific, Columbia, SC), lH-benzimidazol-6-karboksilna kiselina (ASDI Inc., Newark, DE), 2,3-dimetil-lH-indol-5-karboksilna kiselina (Matrix Scientific, Columbia, SC), benzotriazol-5-karboksilna kiselina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 2,3-dimetil-lH-indol-5-karboksilna kiselina (Matrix Scientific, Columbia, SC), 5-karboksiindol (Apollo Scientific Ltd., Cheshire, UK), l,2-dimetil-lH-benzoimidazol-5-karboksilna kiselina (Matrix Scientific, Columbia, SC), 5-Benzimidazolkarboksilna kiselina Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), Benzotriazol-5:karboksilna kiselina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), l-izo-propilbenzotriazol-5-karboksilna kiselina (Fluorochem Ltd., Derbyshire, UK), 2-okso-l,2,3,4-tetrahidrokvinolin-6-karboksilna kiselina (Aurora Fine Chemicals Ltd., Graz, Austria) i kvinoksalin-6-karboksilna kiselina (Ryan Scientific, Inc., Mount Pleasant, SC).

Niže date karboksilne kiseline koje se koriste u izradi jedinjenja iz ovog pronalaska, kako je opisano u Primerima, se izrađuju prethodno saopštenim načinima: 2-metil-lH-indol-6-karboksilna kiselina (Journal Organic Chemistry (1980), 45(8), 1546-7, primer 7, strana 1547), l-izopropil-lH-benzoimidazol-4-karboksilna kiselina (US 2005/020626, strana 17, Preparation 11), 3-(lH-imidazol-2-il)-benzoatna kiselina (US 2003/0232860, strana 14, primer 14) i 1,3-benzoksazol-5-karboksilna kiselina (Sawada, Y.; i saradnici, Pest Management Science (2003), 59(1), 25-35).

Pored toga, karboksilne kiseline, koje se koriste za izradu jedinjenja iz ovog pronalaska, kako je opisano u Primerima, izrađene su kako je opisano u niže datim Izradama kiselina:

Izrada kiseline 1

7- metil- 1 H- indazol- 5 - karboksilna kiselina

U rastvor 5-bromo-7-metilindazola, (nabavljen od PharmaLab, Morrisville, PA) (2.00 g, 9.47 mmol) u anhidrovanom THF (50 ml) se na sobnoj temperaturi doda NaH (570 mg, 14.25 mmol; 60% suspenzija u mineralnom ulju). Nakon 20 minuta, mešavina se ohladi na -78 °C i u kapima se doda sec-butillitijum (1.4 M rastvor u cikloheksanu, 17 ml; 23.8 mmol) i dobijena mešavina se meša 4 sata. Bezvodni CO2se nakon toga 1 sat propušta u mehurićima kroz reaktivnu mešavinu i ostavi da se zagreje na sobnu temperaturu. Nakon toga se meša na sobnoj temperaturi u toku noći. Doda se 1 N rastvor HC1 i rastvor ekstrahuje sa EtOAc. Organski sloj se ispere sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl, suši (MgS04), nakon toga filtrira i koncentruje. Ostatak se ponovo rastvori u MeOH, filtrira, a nakon toga koncentruje da se dobije produkt kao smeđa čvrsta supstanca (1.445 g, 86.6%). 'H NMR (DMSO-d6) 6 8.23 (s, IH), 8.17 (s, IH), 7.65 (s, IH), 2.46 (s, 3H). LC/MS ES+177 (MH+).

Izrada kiseline 2

lH- indazol- 7- karboksilna kiselina

Mešavina 2-amino-3-metilbenzoatne kiseline (15.2 g, 0.10 mol), dimetilformamida (333 mL) i CSCO3(49 g, 0.15 mol) se meša na sobnoj temperaturi približno 40 minuta, nakon toga se u kapima doda jodometan (14.2 g, 6.2 mL, 0.10 mol) u dimetilformamidu ("DMF") (115 mL). Mešavina se meša na sobnoj temperaturi u toku noći. Mešavina se razblaži sa vodom (1 L) i ekstrahuje sa dietil etrom. Vodena faza se ponovo ekstrahuje sa dietil etrom. Kombinovani organski ekstrakti se isperu sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl, suše preko MgS04, filtriraju i koncentruju. Dobijeni materijal se suši na sobnoj temperaturi/0.5 mm Hg da se dobije metil 2-amino-3-metilbenzoat (17 g, 100%).

U rastvor metil 2-amino-3-metilbenzoata (16.5 g, 0.10 mol) u CHCI3(286 mL) se doda acetatni anhidrid (23.5 g, 21.7 mL, 0.23 mol) tako da se održi unutrašnja temperatura <40 °C. Mešavina se meša na sobnoj temperaturi 1 sat, nakon toga se doda kalijum acetat (2.94 g, 30 mmol) i izoamil nitrit (25.8 g, 30 mL, 0.22 mol). Dobijena mešavina se zagreva pod refluksom u toku noći. U mešavinu se nakon toga doda metanol (94 mL) i 6 N rastvor HC1 (94 mL) i mešavina se meša u toku noći. Reaktivna mešavina se koncentruje da se dobije narandžasta čvrsta supstanca koja se nakon toga triturira sa etil acetatom, a čvrsti delovi se izdvoje filtriranjem pod vakuumom. Čvrsti delovi se suše na sobnoj temperaturi/0.5 mmHg da se dobije metil lH-indazol-7-karboksilat (15.4 g, 88%).

Rastvor metil lH-indazol-7-karboksilata (14.96 g, 84.9 mmol) u metanolu (180 mL) se ohladi na 0 °C, nakon toga se doda 29% vodeni rastvor kalijum hidroksida (36 mL). Ledeno kupatilo se ukloni i reaktivna mešavina se meša na sobnoj temperaturi u toku noći. pH se podesi na 5.5 koristeći koncentrovanu HC1. Isparljivi delovi se uklone filtriranjem pod vakuumom, a dobijeni materijal se suspenduje u vodi (100 mL) i etil acetatu (200 mL). Dobijeni precipitat se izdvoji filtriranjem pod vakuumom i ispere sa etil acetatom. Čvrsti sastojci se suše na sobnoj temperaturi/0.5 mmHg da se dobije naslovljeno jedinjenje (7.54 g, 55%).

Izrada kiseline 3

2- metil- 2H- indazol- 6- karboksilatna kiselina

Metil lH-indazol-6-karboksilat se izrađuje u skladu sa postupkom koji je opisan u J. Med. Chem. 2000, 43 (1), 41-58 (primer 12b, strana 49). Alkilacijom pod standardnim uslovima (natrijum heksametildisilazid, THF, jodometan, refluks) dobija se metil 2-metil-2H-indazol-6-karboksilat (44%). Saponifikacijom pod standardnim uslovima (1 N rastvor NaOH) dobija se naslovljeni produkt (53%).

Izrada kiseline 4

3- ( 5- Trifluorometil- lH- pirazol- 3- il)- benzoatna kiselina

Natrijum hidrid (60% u ulju, 2.20 g, 55 mmol) se prenese u suvu reaktivnu bocu u atmosferi azota i ispere dva puta sa po 10 mL heksana, a heksan se ukloni dekantovanjem. Natrijum hidrid se nakon toga suspenduje u 30 mL bezvodnog 1,2-dimetoksietana ("DME") uz mešanje. Rastvor 9.0 mL (75 mmol) prečišćenog etil trifluoroacetata i 3.63 g (25 mmol) 3-cijanoacetofenona (Aldrich) u 40 mL DME se u kapima dodaje u toku 40 minuta. Reaktivna mešavin a se meša dodatnih 60 minuta, nakon čega se višak hidrida uništi dodavanjem metanola (približno 3 mL). Isparljive komponente se uklone evaporacijom pod vakuumom, a ostatak se suspenduje u 30 mL vode. Mešavina se zakiseli sa 70 mL 1 M rastvorom hidrohloridne kiseline i ekstrahuje sa etrom. Etar se ispere sa vodom, zasićenim vodenim rastvorom NaCl, suši (MgSC»4) i upari da se dobije 7.02 g čvrstog ostatka 3-(4,4,4-trifluoro-3-okso-butiril)-benzoatne kiseline koja sadrži malo ostatka trifluoroacetatne kiseline.

Produkt iz Faze 1 (3.71 g, 15 mmol) se rastvori u 30 mL etanola i zagreva na temperaturi refluksa, i na toj temperaturi se u jednoj porciji doda 0.97 mL anhidrovanog hidrazina (31 mmol). Zagrevanje se nastavi još 90 minuta, nakon čega se mešavina koncentruje pod vakuumom. Ostatak se tretira sa vodom i etrom; etar se ispere sa 1 M rastvorom hidrohloridne kiseline, vodom, zasićenim vodenim rastvorom NaCl, suši (MgS04) i upari. Doda se acetonitril i uparavanje se ponovi da se dobije bela čvrsta supstanca koja se rastvori u 15 mL glacijalne acetatne kiseline, zagreva pod refluksom 20 minuta i koncentruje pod vakuumom da se dobije 3.12 g 3-(5-trifluorometil-2H-pirazol-3-il)-benzonitril kao bela čvrsta supstanca.

Produkt iz Faze 2 (3.12 g, 13 mmol) se rastvori u 20 mL 1-propanola. Doda se rastvor 4.33 g kalij um hidroksida u 8 mL vode i mešavina se zagreva pod refluksom 2 sata. Mešavina se ohladi i upari pod vakuumom. Ostatak se rastvori u 75 mL vode, zagreje do ključanja i zakiseli sa koncentrovanom hidrohloridnom kiselinom. Mešavina se ostavi da se ohladi, a precipitat se filtrira, ispere sa vodom i suši da se dobije 3.21 g naslovljenog jedinjenja kao bela čvrsta supstanca.

Izrada kiseline 5

7- hloro- 1 H- indazol- 5- karboksilatna kiselina.

U rastvor 4-amino-3-hloro-5-metilbenzonitrila (3.00 g, 18.0 mmol) u CHC13(50 mL) se doda acetatni anhidrid (3.9 mL, 41.4 mmol). Mešavina se meša na sobnoj temperaturi u toku noći, a nakon toga zagreva 5 sati pod refluksom. Reaktivna mešavina se ohladi na sobnu temperaturu i dodaju se kalijum acetat (530 mg, 5.40 mmol) i izoamil nitrit (5.28 mL, 39.6 mmol). Mešavina se zagreva pod refluksom 3 dana. Reaktivna mešavina se ispere sa zasićenim vodenim rastvorom NaHC03, suši preko Na2S04i koncentruje. U mešavinu se doda metanol, nakon toga voda (25 mL) i 38% HC1 (25 mL). Mešavina se meša na sobnoj temperaturi u toku noći. Reaktivna mešavina se koncentruje i pH se podesi na približno 7. Čvrsti sastojci se izdvoje filtriranjem, zatim isperu sa vodom (2x30 mL) i heptanom (2x30 mL). Prečišćavanjem Biotage hromatografijom (CH2Cl2-heptan (1: l)/MeOH gradijent dobija se 7-hloro-lH-indazol-5-karbonitril koji se izoluje kao bela čvrsta supstanca (585 mg, 18%).

U rastvor 7-hloro-lH-indazol-5-karbonitrila (250 mg, 1.41 mmol) u mešavini etanol/voda (3:1 odnos, 15 mL) se doda kalijum hidroksid (395 mg, 7.04 mmol) i mešavina se zagreva pod refluksom. Nakon 3 sata, veći deo etanola se ostavi se izdestiliše, doda se još kalijum hidroksida (614 mg) i zagrevanje se nastavi u toku noći. Reaktivna mešavina se ohladi na sobnu temperaturu, ispere sa Et20 (3 x 20 mL), a organski ekstrakt se zakiseli sa 1 N rastvorom HC1. Dobijeni precipitat se izdvoji filtriranjem pod vakuumom, ispere sa vodom (približno 15 mL) i heptanom (približno 15 mL), suši na sobnoj temperaturi/0.5 mmHg da se dobije naslovljeno jedinjenje (221 mg, 79.7%).

Izrada kiseline 6

5- Bromo- l H- indazol- 7- karboksilatna kiselina

U rastvor 2-amino-3-metilbenzoatne kiseline (5.00 g, 33.1 mmol) u acetatnoj kiselini (110 mL) se u kapima na 0 °C, u toku približno 5 minuta, dodaje mešavina broma (1.7 mL, 33 mmol) u acetatnoj kiselini (50 mL). Nakon dodavanja, kupatilo zahlađenje se ukloni i mešavina se meša na sobnoj temperaturi 30 minuta, a nakon toga se acetatna kiselina ukloni pod sniženim pritiskom. Mešavina se razblaži sa CH2CI2i ispere sa zasićenim vodenim rastvorom Na2C03. Vodena faza se ponovo ekstrahuje sa CH2CI2. Vodena faza se zakiseli pomoću koncentrovane HC1 do pH 7.2 uz stvaranje intenzivne pene. Formira se obilan precipitat koji se izdvoji filtriranjem pod vakuumom . Filtrat se zatim zakiseli sa koncentrovanom HC1 do pH 6.3 i nova količina precipitata se sakupi. Kombinovane čvrste supstance se suše na 65 °C /0.5 mmHg da se dobije 2-amino-5-bromo-3-metilbenzoatna kiselina (6.43 g, 85%).

Rastvor 2-amino-5-bromo-3-metilbenzoatne kiseline (6.43 g, 27.9 mmol) u DMF (93 mL) koji sadrži cezijum karbonat (13.7 g, 41.9 mmol) se meša 40 minuta na sobnoj temperaturi, nakon toga se u kapima doda rastvor jodometana (1.7 mL, 28 mmol) u DMF (21 mL). Mešavina se meša na sobnoj temperaturi 2 dana. Mešavina se razblaži sa vodom (300 mL) i ekstrahuje sa EtOAc (2 x 100 mL). Kombinovani organski ekstrakti se suše preko MgS04, filtriraju i koncentruju da se dobije smeđe ulje koje očvrsne u bež čvstu supstancu nakon sušenja na sobnoj temperaturi/0.5 mmHg da se dobije metil 2-amino-5-bromo-3-metilbenzoat (5.45 g, 80%).

U rastvor metil 2-amino-5-bromo-3-metilbenzoata (5.45 g, 22.3 mmol) u CHCi3(64 mL) se dodaje acetatni anhidrid (4.9 mL) takvom brzinom da se održi unutrašnja temperatura ispod 40 °C. Dobijena mešavina se meša na sobnoj temperaturi 1 sat, nakon toga se dodaju kalijum acetat (0.66 g, 6.7 mmol) i izoamil nitrit (6.6 mL, 49 mmol). Reaktivna mešavina se zagreva pod refluksom u toku noći, nakon toga ohladi na sobnu temperaturu i koncentruje. Ostatak se rastvori u metanolu (22 mL) i 6 N rastvoru HC1 (22 mL) i meša na sobnoj temperaturi približno 4 sata. Žuta čvrsta supstanca se izdvoji filtriranjem pod vakuumom i ispere sa vodom. Čvrsti sastojci se suše na 65 C/0.5 mmHg da se dobije metil 5-bromo-lH-indazol-7-karboksilat (4.90 g, 86%).

U rastvor 5-bromo-lH-indazol-7-karboksilata (250 mg, 0.98 mmol) u metanolu (2 mL) se na 0 °C doda 30% vodeni rastvor KOH (0.15 g KOH u 0.5 mL vode). Mešavina se meša na sobnoj temperaturi 2 dana. Dobijene čvrste supstance se izdvoje filtriranjem pod vakuumom i isperu sa MeOH. Čvrsti materijal se suši na 65 °C /0.5 mmHg da se dobije naslovljeno jedinjenje kao svetio žuta čvrsta supstanca (182 mg, 67%).

Izrada kiseline 7

3 - metil- lH- indazol- 6- karboksilatna kiselina

Rastvor 2-fluoro-4-metoksiacetofenona (2.0 g, 12 mmol) u hidrazinu (30 mL) se zagreva pod refluksom 2 dana. Mešavina se ohladi na sobnu temperaturu, sipa u vodu i ekstrahuje sa EtOAc (3x). Kombinovani organski ekstrakti se koncentruju, rastvore u minimalnoj količini CH2CI2, filtriraju da se dobije 6-metoksi-3-metil-lH-indazol kao žuta čvrsta supstanca (620 mg, 32%).

U rastvor 6-metoksi-3-metil-lH-indazola (620 mg, 3.82 mol) u CH2CI2(25 mL) se na 0 °C doda rastvor bor tribromida u dihlorometanu (17 mL 1 M rastvor). Mešavina se meša na sobnoj temperaturi u toku noći. Rastvor se pažljivo neutrališe laganim sipanjem u ledeno hladan zasićeni vodeni rastvor NaHC03. Faze se razdvoje i vodena faza se ekstrahuje sa EtOAc (3x). Kombinovani organski ekstrakti se koncentruju, sirovi materijal se prečisti Biotage hromatografijom (40S kolona, mešavina aceton/heptan 45% 500 mL i 60% 150 mL) da se dobije 3-metil-lH-indazol-6-ol kao narandžasta čvsta supstanca (458 mg, 81%).

Rastvor 3-metil-lH-indazol-6-ola (458 mg,3.1 mmol) u THF (30 mL) se tretira sa natrijum hidridom (0.50 g 60% disperzija u ulju). Nakon što se početna efervescencija smanji, rastvor se zagreva 1 sat na 50 °C, a nakon toga se ohladi na sobnu temperaturu i doda se N-feniltrifluorometan-sulfonamid (2.50 g, 7.0 mmol). Mešavina se meša na sobnoj temperaturi 2 sata, a nakon toga sipa u vodu. Vodena faza se ekstrahuje sa EtOAc (3x). Kombinovani organski ekstrakti se koncentruju, a sirovi materijal se prečisti Biotage hromatografijom (40M kolona, mešavina 12%aceton/heptan). Dobija se 3-metil-l-(trifluorometilsulfonil)-lH-indazol-6-il trifluorometansulfonat (1.13 g, 89%).

Rastvor 3-metil-l-(trifluorometilsulfonil)-lH-indazol-6-il trifluorometansulfonata (0.61 g, 1.5 mmol) u DMF (6 mL) se ispira u toku 5 minuta sa ugljen dioksidom. U rastvor se dodaju paladijum acetat (68 mg, 0.30 mmol), 1,1 -bis(difenilfosino)ferocen (167 mg, 0.30 mmol), trietilamin (0.33 g, 0.45 mL, 3.2 mmol) i metanol (4 mL). Rastvor se meša na sobnoj temperaturi u toku noći u atmosferi CO. Rastvor se sipa u vodu i ekstrahuje sa EtOAc (3x). Kombinovani organski ekstrakti se koncentruju i prečiste Biotage hromatografijom (40S kolona, 8% mešavina EtOAc/heptani) da se dobije metil 3-metil-l-(trifluorometilsulfonil)-lH-indazol-6-karboksilat (330 mg, 69%).

U rastvor 3-metil-l-(trifluorometilsulfonil)-lH-indazol-6-karboksilata (590 mg, 1.83 mmol) u mešavini MeOH/voda(3:l, 72 mL) se doda kalijum karbonat (1.01 g, 7.31 mmol) i mešavina se zagreva 2 sata pod refluksom. Mešavina se ohladi na sobnu temperaturu, a metanol se ukloni pod sniženim pritiskom. Vodeni rastvor se zakiseli sa KHSO4do pH 3 - 3.5. Formirani beli precipitat se izdvoji filtriranjem pod vakuumom, rastvori u EtOAc i ispere sa vodom. Organski ekstrakt se suši preko MgS04, filtrira, koncentruje i suši da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (259 mg, 80%).

Izrada kiseline 8

7- Etil- 1 H- indazol- 5- karboksilna kiselina

U rastvor 2-etil-6-metilanilina (2.03 g, 15 mmol) u DMF (50 mL) se na 0 C doda N-bromosukcinimid (2.66 g, 14.9 mmol). Mešavina se meša na sobnoj temperaturi 10 minuta, nakon toga se doda u zasićeni vodeni rastvor NaCl. Mešavina se ekstrahuje sa EtOAc, organska faza se ispere sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl (2x), koncentruje i sirovi materijal se prečisti Biotage hromatografijom (40M, 15% EtOAc/heptan) da se dobije 4-bromo-2-etil-6-metilbenzenamin kao smeđe crvena tečnost (3.21 g, 100%).

Rastvor 4-bromo-2-etil-6-metilbenzenamina (3.21 g, 15 mmol) u acetatnoj kiselini (50 mL) se meša 3 sata, nakon toga se doda 2 M rastvor natrijum nitrita (11 mL, 22.5 mmol). Dobijena mešavina se meša u toku noći na sobnoj temperaturi. Rastvor se koncentruje i čvrsta supstanca se rastvori u EtOAc i ispere sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl (3x). Organski ekstrakt se suši preko Na2S04, filtrira i koncentruje, sirovi materijal se prečisti Biotage hromatografijom (40M, 15-30% mešavina EtOAc/heptan) da se dobiju 5-bromo-7-etil-lH-indazol (1.11 g, 33%) i 5-bromo-3,7-dimetil-lH-indazol (0.84 g, 25%).

U rastvor 5-bromo-7-etil-lH-indazola (225 mg, 1.00 mmol) u dioksanu (1.5 mL), dodaju se heksakarbonilmolibden (132 mg, 0.50 mmol), Herrmann-ov katalizator (trans-Bis(acetato)bis[o-(di-o-tolilfosfino)benzil]dipaladijum) (46.9 mg, 0.05 mmol) i rastvor natrijum karbonata (318 mg, 3.00 mmol) u vodi (2 mL). Suspenzija se zatvori i podvrgne zračenju 15 minuta u mikrotalasnom reaktoru na 165 °C (podešeno na visoku apsorpciju). Epruveta se otvori, sadržaj se filtrira kroz diatomejsku zemlju, ispere sa EtOAc i koncentruje da se dobije naslovljeno jedinjenje (140 mg, 74%).

Izrada kiseline 9

3- hloro- 1 H- indol- 5- karboksilatna kiselina

U rastvor indol-6-karboksilne kiseline u dihlorometanu (40 mL) i DMF (4 mL) se doda N-hlorosukcinimid i ostavi da se meša 3 sata na sobnoj temperaturi. Reaktivna mešavina se nakon toga koncentruje pod sniženim pritiskom, a sirovi materijal se 2 sata meša u dihlorometanu (100 mL) i filtrira i suši u toku noći da se dobije naslovljeno jedinjenje (1.15 g, 95%).

Izrada kiseline 10

3, 7- Dimetil- 1 H- indazol- 5- karboksilna kiselina

U reaktivnu posudu koja sadrži ponovo prečišćen rastvor 5-bromo-3,7-dimetil-lH-indazola (izrađuje se kako je opisano u Izradi kiseline 8, 285 mg, 1.27 mmol) u dioksanu (1.3 mL) se dodaju heksakarbonilmolibden (264 mg, 1.0 mmol), Hermann-ov katalizator (93 mg, 0.1 mmol) i rastvor Na2C03u vodi (636 mg u 2 mL vode). Suspenzija se zagreva 15 minuta u mikrotalasnom reaktoru na 165 °C (visoka apsorpcija). Epruveta se otvori, zakiseli sa 1 N rastvorom HC1 (do pH 2). Reaktivna mešavina se filtrira kroz diatomejsku zemlju, ispere sa EtOAc, a organski sloj se ispere sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl (3x). Organski ekstrakt se koncentruje da se dobije naslovljeno jedinjenje kao ružičasta čvrsta supstanca (65 mg, 17%).

Izrada kiseline 11

1 - metil- lH- indol- 6- karboksilna kiselina

U metil estar N-metilindol-6-karboksilne kiseline u 3 mL 1:1:1:1 mešavine acetonitril/THF/voda/MeOH se doda LiOH i ostavi da se meša na sobnoj temperaturi u toku vikenda. Reaktivna mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom, nakon čega se dodaju EtOAc i voda. Organska faza se izdvoji, a voda se zakiseli sa IN rastvorom HC1 i ekstrahuje u EtOAc (3x50 mL), ispere sa vodom, zasićenim vodenim rastvorom NaCl, suši preko MgS04, filtrira i koncentruje pod sniženim pritiskom. Materijal se suši pod sniženim pritiskom da se dobije naslovljeni produkt (0.16 g, 86%).

Izrada kiseline 12

1 - metil- 2- pirolidin- 1 - il- 1 H- benzimidazol- 5- karboksilatna kiselina

Metil 3-nitro-4-hlorobenzoat (72.01 g, 0.334 mol) se suspenduje u sveže destilovanom acetonitrilu (360 mL) uz mešanje. U ovu suspenziju se uz snažno mešanje dodaju anhidrovani natrijum acetat (41.1 g, 0.5 mol) i 30% vodeni rastvor rastvor metilamina (69 mL, 0.67 mol). Dobijena mešavina se refluksuje 7 sata, a nakon toga ostavi u toku noći z praćenje pomoću TLC (hloroform/CCU 1:2). Žuti precipitat se izdvoji filtriranjem i izmeša sa rastvorom K2CO3(25 g) u vodi (500 mL). Mešavina se meša 30 minuta i filtrira. Žuti precipitat se ispere sa vodom da se postigne pH 7. Filtrat se koncentruje pod sniženim pritiskom do zapremine od približno 200 mL i izmeša sa rastvorom K2CO3(5 g) u vodi (100 mL). Mešavina se meša 30 minuta i filtrira. Žuti precipitat se ispere sa vodom da se postigne pH 7. Dva gore navedena precipitata se kombinuju i suše da se dobije metil 4-(metilamino)-3-nitrobenzoat kao žuti prašak (67.63 g, 96%).

4-(Metilamino)-3-nitrobenzoat (63.06 g, 0.3 mol) se suspenduje u metanolu (700 mL), uz snažno mešanje. U suspenziju se doda suspenzija Raney nikla (15 g, sveže izrađena tretmanom legure nikl-aluminijum 50/50 sa 2N rastvorom NaOH) u metanolu (30 mL). Dobijena mešavina se zagreva na 40 - 45 °C uz snažno mešanje i u suspenziju se u kapima, u toku 3 sata, na temperaturi ispod 55 °C, dodaje hidrazin monohidrat (60 mL, 1.2 mol). Mešavina se meša 3 sata na 50 55 °C i ostavi u toku noći na sobnoj temperaturi. Reaktivna mešavina se ponovo zagreje na 40 45 °C uz snažno mešanje i u mešavinu se doda dodatna količina hidrazin hidrata (5 mL). Suspenzija se refluksuje 2 sata uz snažno mešanje, ohladi i razblaži sa hloroformom (1 L). Mešavina se propusti kroz diatomejsku zemlju (gornji sloj 2 cm, prečnik 17 cm) i silika gel (donji sloj 5 cm) da se ukloni Raney nikl. Slojevi se isperu sa mešavinom hloroform/metanol (1:1, 5 x 600 mL). Filtrat se koncentruje pod sniženim pritiskom. Ostatak se razblaži sa benzenom (100 mL) i mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom da se ukloni voda. Ova operacija se ponovi da se dobije metil 3-amino-4-(metilamino)benzoat kao smeđa kristalna čvrsta supstanca (53.6 g, 99%) koja se koristi u sledećoj fazi bez naknadnog prečišćavanja.

Metil 3-amino-4-(metilamino)benzoat (53.6 g, 0.3 mol) se rastvori u anhidrovanom dihlorometanu (700 mL). U ovaj rastvor se u toku 2 sata, uz mešanje, u nekoliko malih porcija, dodaje 1,1 karbonildiimidazol (CDI, 62.59 g, 0.386 mol). Reaktivna mešavina se meša na sobnoj temperaturi u toku noći. Formirani precipitat se izdvoji filtriranjem, ispere sa hladnim etrom (3 x 50-mL) i suši da se dobije metil l-metil-2-okso-2,3-dihidro-lH-benzimidazol-5-karboksilat kao svetio ružičasti kristali u prinosu od (49.75 g, 81%).

Fosforil bromid (POBr3,102.4 g, 0.357 mol) se rastvori u dihloroetanu (400 mL). U ovaj rastvor se u nekoliko malih porcija, uz mešanje, doda metil l-metil-2-okso-2,3-dihidro-lH-benzimidazol-5-karboksilat (36.7 g, 0.178 mol) i dobijena suspenzija se refluksuje uz praćenje pomoću TLC (hloroform/l,2-dimetoksietan 10:1). Nakon stoje reakcija završena (približno 19 sati), reaktivna mešavina se ohladi u ledeno hladnom kupatilu i pažljivo neutrališe u toku 3 sata sa vodom (50 mL), a nakon toga sa rastvorom Na2C03(100 g) u vodi (800 mL) uz intenzivno formiranje pene. Neutralisana mešavina se ekstrahuje sa hloroformom (2 L). Slojevi se razdvoje, i vodeni sloj se ponovo ekstrahuje sa hloroformom (500 mL). Organski slojevi se kombinuju, isperu sa vodom (3 x 250 mL) i suše preko CaCl2. Organski rastvor se koncentruje pod sniženim pritiskom. Dobijena bledo siva čvrsta supstanca se rekristališe iz acetonitrila da se dobije metil 2-bromo-1 -metil-lH-benzimidazol-5-karboksilat kao bela čvrsta supstanca u prinosu od (37.1 g, 77.5%).

Mešavina metil 2-bromo-l-metil-lH-benzimidazol-5-karboksilata (40.0 g, 0.149 mol), pirolidina (25.37 g, 30 mL, 0.357 mol), cezijum fluorida CsF (31.61 g, 0.208 mol) i DMSO (240 mL) se stavi u mikrotalasni reaktor (MILESTONE Microwave Labstation; Shelton, CT). Reaktivna mešavina se tretira 8 h mikrotalasnom radijacijom uz mešanje na unutrašnjoj temperaturi od 115 °C, ohladi i sipa ledeno hladnu vodu (1 L). Formirani precipitat se izdvoji filtriranjem, ispere sa hladnom vodom (2 x 50 mL), heksanom (2 x 100 mL) i suši. Produkt se izmeša sa etrom (250 mL) i acetonitrilom (20 mL) i mešavina se ostavi u ultrasoničnom kupatilu 1.5 sat. Precipitat se izdvoji filtriranjem, ispere sa etrom (2 x 50 mL) i suši da se dobije metil 1-metil-2-pirolidin-l-il-lH-benzimidazol-5-karboksilat u prinosu od (28.82 g, 75%).

Suspenzija metil l-metil-2-pirolidin-l-il-lH-benzimidazol-5-karboksilata (28.8 g, 0.111 mol) u metanolu (200 mL) se izmeša sa rastvorom KOH (12.44 g, 0,222 mol) u vodi (200 mL). Mešavina se refluksuje 3 sata i ostavi u toku noći na sobnoj temperaturi. Reaktivna mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom da se ukloni metanol. Ostatak se izmeša sa rastvorom KHSO4(30.21 g, 0.222 mol) u vodi (200 mL) i mešavina se meša 1 sata. Reaktivna mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom do sušenja, a produkt se ekstrahuje iz ostatka čvrste supstance sa toplom mešavinom hloroforma i izopropanola (1:1, približno 7 L). Dobijeni ekstrakt se koncentruje pod sniženim pritiskom, a ostatak se rastvori u ključaloj mešavini dihlorometana i izopropanola (1:1, 500 mL). Rastvor se refluksuje 30 minuta i ohladi u zamrzivaču. Formirani precipitat se izdvoji filtriranjem i suši da se dobije l-metil-2-pirolidin-l-il-lH-benzimidazol-5-karboksilna kiselina kao bledo žuta kristalna čvrsta supstanca u prinosu od (18.3 g, 67%).

Izrada kiseline 13

3- hloro- lH- indol- 6- karboksilatna kiselina

U rastvor lH-indo 1-5 -karboksilne kiseline u dihlorometanu (20 mL) i DMF (2 mL) se doda N-hlorosukcinimid i ostavi 3 sata da se meša na sobnoj temperaturi. Reaktivna mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom. Sirovi materijal se meša u dihlorometanu (100 mL) u toku noći, filtrira i suši da se dobije naslovljeno jedinjenje (0.439 g, 72%).

Izrada kiseline 14

1 - metil- 1 H- indazol- 6- karboksilatna kiselina

Metil lH-indazol-6-karboksilat se izrađuje u skladu sa postupkom koji je opisan u J. Med. Chem. 2000, 43 (1), 41-58 (primer 12b, strana 49). Alkilacija se vrši pod standardnim uslovima (natrijum heksametildisilazid, THF, jodometan, refluks) da se dobije metil 1-metil-1H-indazol-6-karboksilat (43%). Saponifikacija se vrši pod standardnim uslovima (1 N rastvor NaOH) da se dobija naslovljeni produkt (96%).

Izrada kiseline 15

1, 3- Dimetil- l H- indazol- 6- karboksilatna kiselina

2-acetil-5-bromofenil estar metansulfonatne kiselina se izrađuje kako je opisano u Internacionalnoj patentnoj prijavi broj WO 2005/090305 (Primer 40a). 2-Acetil-5-bromofenil estar metansulfonatne kiseline se nakon toga tretira 6 dana pod refluksom sa metilhidrazinom i amonijum acetatom da se dobije 6-bromo-l,3-dimetil-lH-indazol (60%). Rastvor 6-bromo-l,3-dimetil-lH-indazola u THF se tretira sa n-BuLi, a nakon toga sa ugljenk dioksidom da se dobije naslovljeno jedinjenje (1.23 g, 60%).

Izrada kiseline 16

3 - Etil- 1 - metil- 1 H- indazol- 6- karboksilatna kiselina

5-bromo-2-propionilfenil metansulfonat se tretira 6 dana pod refluksom sa metilhidrazinom i amonijum acetatom da se dobije 6-bromo-3-etil-1 -metil-lH-indazol (33%). Rastvor 6-bromo-3-etil-l -metil-lH-indazola u THF se tretira sa n-BuLi, a nakon toga sa ugljenk dioksidom da se dobije naslovljeno jedinjenje (66%).

Izrada kiseline 17

2- Fluoro- 5-( l H- pirazol- 3- il)- benzoatna kiselina

5-Bromo-2-fluorobenzoatna kiselina (100 g, 0.457 mol) se doda u rastvor HC1 u metanolu (400 mL; približno 11 %). Suspenzija se refluksuje 8 sati, a zatimupari pod vakuumom.Ostatak se rastvori u benzenu (500 mL) i rastvor se ispere sa vodenim rastvorom K2CO3(2 jc 50 mL) i vodom (3 x 100 mL), suši preko Na2S04i upari pod vakuumom da se dobije metil 5-bromo-2-fluorobenzoat kao žuto ulje u prinosu od 88% (93.7 g).

Metil 5-bromo-2-fluorobenzoat (154.2 g, 0.66 mol), bezvodni benzen (450 mL), etinil(trimetil)silan (78.0 g, 0.79 mol), diizopropilamin (100 g, 0.99 mol) i tetra(trifenilfosfin)paladijum (20.0 g, 0.017 mol) se u atmosferi argona stave u bocu zapremine 1 litar sa okruglim dnom i tri grlića, opremljenu sa magnetnom mešalicom i termometrom. Mešavina se meša 30 minuta, nakon toga ohladi na 10 °C. Doda se bakar jodid (12.5 g, 0.066 mol) i dobijena suspenzija se meša 2.5 sata na 20 °C, a nakon toga 3 sata na 60 °C i konačno ostavi da stoji na sobnoj temperaturi u toku noći. Nakon toga se mešavina razblaži sa etrom (200 mL), a precipitat se izdvoji filtriranjem i ispere sa etrom (2 x 100 mL). Dobijeni organski rastvor (800 mL) se ispere sa zasićenim vodenim rastvorom NH4CI i NaCl, suši preko Na2S04i upari. Sirovi produkt se prečisti hromatografijom (heksan/etilacetat 10:1) na koloni silika gela da se dobije metil 2-fluoro-5-(2-trimetilsilil)etinil)benzoat koji sadrži približno 13% metil 5-bromo-2-fluorobenzoata, u prinosu od približno 80% (148.1 g).

Suspenzija 2-fluoro-5-(2-trimetilsilil)etinil)benzoata (171.1 g, 0.684 mol), merkuri(2+) diacetata (12.0 g, 0.051 mol) u THF (400 mL) i koncentrovane H2S04(74 mL, 1.37 mol) se meša 2 h na 50-60 °C. Nakon toga se mešavina ohladi, a THF (350 mL) se upari pod vakuumom. Ostatak se razblaži sa etrom (700 mL) i filtrira da se uklone merkuri soli, koje se isperu od kiseline. Etarski rastvor se nakon toga suši preko-Na2S04i koncentruje. Sirovi produkt (125 g) se prečisti hromatografijom na koloni silika gela, uz eluiranje prvo sa mešavinom heksan/etil acetat (10:1) da se uklone primese metil 5-bromo-2-fluorobenzoat, a nakon toga sa mešavinom heksan/etil acetat (1:1) da se dobije metil 5-acetil-2-fluorobenzoat u prinosu od 75% (90.0 g).

(Dimetoksimetil)dimetilamin (92 mL, 0.69 mol) se doda u suspenziju metil 5-acetil-2-. fluorobenzoata (90.0 g, 0.46 mol) u toluenu (90 mL). Mešavina se refluksuje 7 sati za koje vreme se formirani metanol eliminiše destilacijom. Rastvor se nakon toga koncentruje pod vakuumom, a ostatak (115.2 g) se prečisti kristalizacijom da se dobije metil 5-(3-(dimetilamino)akriloil)-2-fluorobenzoat u obliku žutih prizmi u prinosu od 80% (93.9 g).

Mešavina metil 5-(3-(dimetilamino)akriloil)-2-fluorobenzoata (50 g, 0.2 mol), hidrazin hidrata (11.0 g, 0.22 mol) u metanolu (500 mL) se ostavi da stoji 48 sati na 20 °C. Nakon toga se rastvarač upari, a ostatak se prečisti hromatografijom (mešavina etil acetat/heksan 1:2) na koloni silika gela da se dobije 22.0 g metil 2-fluoro-5-(lH-pirazol-3-il)benzoat, koji sadrži nečistoće. Produkt se prečisti kristalizacijom iz metanola da se dobije metil 2-fluoro-5-(lH-pirazol-3-il)benzoat u obliku žutih prizmi u prinosu od 45% (19.9 g).

Rastvor metil 2-fluoro-5-(-lH-pirazol-3-il)benzoata (25.2 g, 0.115 mol) se refluksuje 2 sata u koncentrovanoj HC1 (150 ml). Nakon toga se reaktivna mešavina ohladi i filtrira. Izdvojeni precipitat se ispere sa etanolom, suši i nakon toga refluksuje u vodi (200 mL) u toku 30 minuta da se uklone tragovi metil estra i HC1, ohladi i filtrira. Izdvojeni precipitat se ispere sa vodom i suši da se dobije naslovljeno jedinjenje u prinosu od 90. 7% (21.4 g).

Izrada kiseline 18

2- hloro- 5-( lH- pirazol- 3- ilVbenzoatna kiselina

Etil 5-bromo-2-hlorobenzoat (100 g, 0.38 mol), bezvodni benzen (450 mL), etinil(trimetil)silan (44.7 g, 0.45 mol), piperidin (38.3 g, 0.45 mol) i tetra(trifenilfosfin)paladijum (22.0 g, 0.019 mol) se u atmosferi Ar stave u bocu zapremine 1 litar sa okruglim dnom i sa tri grlića, opremljenu sa magnetnom mešalicom i termometrom. Mešavina se meša 30 minuta, nakon toga ohladi na 0 °C. Doda se bakar jodid (7.23 g, 0.038 mol) i dobijena suspenzija se meša još 2.5 sata na 30-35 °C i filtrira. Izdvojeni precipitat se ispere sa benzenom, a kombinovani filtrat se ispere sa zasićenim vodenim rastvorima NH4CI i NaCl, suši preko Na2S04i upari. Sirovi produkt se prečisti hromatografijom (mešavina heksan/etilacetat 10:1) na koloni silika gela da se dobije etil 2-hloro-5-(2-(trimetilsilil)etinil)benzoat u prinosu od 95% (101 g).

Suspenzija etil 2-hloro-5-(2-(trimetilsilil)etinil)benzoata (101 g; 0.36 mol), merkuri(2+) diacetata (8.6 g, 0.027 mol) u THF (250 mL) i koncentrovane H2S04(40 mL) se meša 3 sata na 60 °C. Nakon toga se mešavina ohladi, razblaži sa etrom (500 mL) i ispere da se dobije neutralini medijum. Nakon toga se rastvor suši preko Na2S04i upari. Ostatak se prečisti hromatografijom (heksan/etilacetat 4:1) na koloni silika gela da se dobije etil 5-acetil-2-hlorobenzoat u prinosu od 70% (57 g).

(Dimetoksimetil)dimetilamin (40 mL) se doda u suspenziju etil 5-acetil-2-hlorobenzoata (57 g, 0.25 mol) u toluenu (60 mL). Mešavina se refluksuje 9 sati, za koje vreme se formirani metanol izdvoji destilacijom. Rastvor se nakon toga koncentruje pod vakuumom, a ostatak se prečisti hromatografijom (etil acetat) na koloni silika gela da se dobije etil 2-hloro-5-(3-(dimetilamino)akriloil)benzoat kao svetli prizmatični kristali u prinosu od 80% (57.6 g).

Hidrazin hidrat (5.5 g, 0.11 mol) se doda u suspenziju etil 2-hloro-5-(3-(dimetilamino)akriloil)benzoata (28 g, 0.1 mol) u etanolu (100 mL). Reaktivna mešavina se ostavi da stoji na 20 °C u toku noći i nakon toga koncentruje. Ostatak se prečisti hromatografijom (mešavina etilacetat/heksan 1:2) na koloni silika gela da se dobije etil 2-hloro-5-(lH-pirazol-3-il)benzoat u prinosu od 94% (22.9 g).

Suspenzija jedinjenja etil 2-hloro-5-(lH-pirazol-3-il)benzoata (22.9 g, 0.091 mol), natrijum metilata (7.4 g, 0.14 mol) u etanolu (250 mL) se refluksuje 10 minuta. Formirani precipitat se izdvoji i rastvori u vodi (1 L). Dobijeni vodeni rastvor se zakiseli sa koncentrovanom HC1 do pH približno 2 što dovodi do precipitacije. Precipitat se izdvoji filtriranjem, ispere sa vodom i suši da se dobije 2-hloro-5-(lH-pirazol-3-il)benzoatna kiselina kao žućkasti kristali u prinosu od 92% (18.9 g).

Izrada kiseline 19

2- Hidroksi- 5-( lH- pirazol- 3- il)- benzoatna kiselina

Mešavina metil 5-acetil-2-hidroksibenzoata (1; 20 g, 0.1341 mol), (hlorometil)benzena (17.82 g, 0.1410 mol) i Na2C03(17.1 g, 0.1613 mol) u DMF (50 mL) se zagreva (110-115 °C) u toku 2 sata uz mešanje. Nakon toga se reaktivna mešavina ohladi, a ostatak se uklonid filtriranjem i ispere sa DMF (15 mL). Kombinovani filtrat se upari pod vakuumom i u ostatak se doda voda (100 mL). Dobijena mešavina se upari pod vakuumom da se ukloni (hlorometil)benzen. Nakon toga se tragovi vode uklone uparavanjem sa toluenom (2 x 100 mL) pod vakuumom, ostatak se triturira sa heksanom (100 mL), izdvoji filtriranjem i suši da se dobije metil 5-acetil-2-(benziloksi)benzoat u prinosu od 84.7% (27.17 g).

(Dimetoksimetil)dimetilamin (28.70 g, 32.0 mL, 0.241 mol) se doda u suspenziju metil 5-acetil-2-(benziloksi)benzoata (27.17 g, 0.1135 mol) u DMF (30 mL). Mešavina se zagreva (110-115 °C) 8 sati, uz mešanje , za koje vreme se formirani metanol izdvoji destilacijom. Nakon toga se rastvor koncentruje pod vakuumom, a ostatak se tretira sa bezvodnim etrom (150 mL), izdvoji filtriranjem i ponovo ispere sa bezvodnim etrom (30 mL) da se dobije metil 2-(benziloksi)-5-(3-(dimetilamino)-akriloil)benzoat u obliku žutih prizmi u prinosu od 82.1% (31.63 g).

Mešavina metil 2-(benziloksi)-5-(3-(dimetilamino)akriloil)benzoata (68.1 g, 0.20 mol) i hidrazin hidrata (11.0 g, 0.22 mol) u metanolu (600 mL) se ostavi da stoji na sobnoj temperaturi 48 sati. Nakon toga se rastvarač ukloni, a ostatak se prečisti hromatografijom (etilacetat) na koloni silika gela da se dobije metil 2-(benziloksi)-5-(lH-pirazol-3-il)benzoat u prinosu od 70%

(43.0 g).

Suspenzija metil 2-(benziloksi)-5-(lH-pirazol-3-il)benzoata (43.0 g, 0.139 mol) se refluksuje u koncentrovanoj HC1 (250 mL) u toku 2.5 sata, da se ukloni benzil hlorid. Reaktivna mešavina se nakon toga ohladi, a formirani precipitat se izdvoji filtriranjem, ispere sa vodom i suši da se dobije naslovljeno jedinjenje u prinosu od 75.4% (27.0 g).

Izrada kiseline 20

2- hloro- 5-( l - metil- lH- pirazol- 3- il)- benzoatna kiselina

Mešavina etil 2-hloro-5-(3-(dimetilamino)akriloil)benzoata, izrađena kako je opisano u Izradi 15, (31.7 g, 0.13 mol) i metilhidrazina (12.44 g, 0.32 mol) u metanolu (120 mL) se ostavi da stoji na sobnoj temperaturi 24 sata. Nakon toga se rastvarač upari, a ostatak se prečisti hromatografijom (mešavina etilacetat/heksan 1:2) na koloni silika gela da se dobije etil 2-hloro-5-(l-metil-lH-pirazol-3-il)benzoat u prinosu od 28% (9.6 g).

Suspenzija etil 2-hloro-5-(l-metil-lH-pirazol-3-il)benzoata (9.6 g, 0.046 mol) i natrijum metilata (4.8 g, 0.07 mol) u etanolu (150 mL) se refluksuje 30 minuta. Precipitat se izdvoji filtriranjem i rastvori u vodi. Vodeni rastvor se zakiseli sa koncentrovanom HC1 do pH približno 2 što dovodi do precipitacije. Precipitat se izdvoji filtriranjem, ispere sa vodom i suši da se dobije naslovljeno jedinjenje u obliku kristala u prinosu od 92%.

Izrada kiseline 21

3 - Pirimidin- 4- il- benzoatna kiselina

Metil 3-bromobenzoat (110 g, 0.51 mol), bezvodni acetonitril (500 mL), etinil(trimetil)silan (60.0 g, 0.61 mol), diizopropilamin (62.0 g, 0.61 mol) i tetra(trifenilfosfm)paladijum (23.6 g, 0.02 mol) se u atmosferi argona stave u bocu zapremine 1 litar sa okruglim dnom i sa tri grlića, opremljenu sa magnetnom mešalicom i termometrom. Mešavina se meša 30 minuta, nakon toga ohladi na 10 °C. Doda se bakar jodid (9.7 g, 0.06 mol) i dobijena suspenzija se meša još 2.5 sata na 20 °C i konačno 3 sata na 60 °C. Nakon toga se mešavina ostavi da stoji na sobnoj temperaturi u toku noći i filtrira. Precipitat hidrobromida se ispere sa etrom, a kombinovani filtrat se ispere sa zasićenim vodenim rastvorom NH4CI i NaCl, suši preko Na2S04i upari. Sirovi produkt se prečisti hromatografijom (heksan) na koloni silika gela da se dobije metil 3-(2-(trimetilsilil)etinil)benzoat u prinosu od 95% (112.8 g).

Suspenzija metil 3-(2-(trimetilsilil)etinil)benzoata (112.8 g, 0.48 mol), merkuri(2+) diacetata (16.2 g, 0.005 mol) u THF (350 mL) i koncentrovane H2SO4(40 mL) se meša 3 sata na 60 °C. Nakon toga se mešavina ohladi, razblaži sa etrom (500 mL), filtrira da se uklone istaložene merkuri soli i ispere da se dobije neutralni medijum. Nakon toga se rastvor suši preko Na2S04i upari. Ostatak se prečisti hromatografijom (mešavina heksan/etil acetat 4.T) na koloni silika gela da se dobije metil 3-acetilbenzoat u prinosu od 75% (65.2 g).

(Dimetoksimetil)dimetilamin (90 mL) se doda u suspenziju metil 3-acetilbenzoata (65.2 g, 0.27 mol) u toluenu (90 mL). Mešavina se refluksuje 9 sati, za koje vreme se formirani metanol izdvoji destilacijom. Rastvor se nakon toga koncentruje pod vakuumom, a ostatak se prečisti iz etra kristalizacijom da se dobije metil 3-(3-(dimetilamino)akriloil)benzoat kao žuti prizmatični kristali u prinosu od 80% (68.1 g).

Imidoformamid acetat (20.3 g, 0.19 mol) se doda u suspenziju metil 3-(3-(dimetilamino)akriloil)benzoata (30.3 g, 0.13 mol) u toluenu (300 mL). Reaktivna mešavina se refluksuje 20 sati, za koje vreme se toluen i dimetilamin acetat izdvoje destilacijom. Nakon toga se ponovo dodaju imidoformamid acetat (6.7 g) i toluen (175 mL), a nakon 8 sata mešavina se upari pod vakuumom. Ostatak se prečisti hromatografijom (mešavina etilacetat/heksan 3:1) na koloni silika gela da se dobije metil 3-(pirimidin-4-il)benzoat u prinosu od 70% (19.5 g).

Suspenzija metil 3-(pirimidin-4-il)benzoata (19.5 g, 0.091 mol), natrijum metilata(7.6 g, 0.14 mol) u etanolu (250 mL) se refluksuje 30 minuta. Nakon toga se reaktivna mešavina ohladi, a formirani precipitat koji se izdvoji filtriranjem se rastvori u vodi. Dobijeni rastvor se zakiseli sa koncentrovanom HC1 do pH približno 2, što dovodi do precipitacije. Precipitat se izdvoji filtriranjem, ispere sa vodom i suši da se dobije naslovljeno jedinjenje u obliku kristala u prinosu od 94% (17.2 g).

Izrada kiseline 22

1 - metil- 2- pirolidin- 1 - il- 1 H- benzimidazol- 5- karboksilatna kiselina

Metil 3-nitro-4-hlorobenzoat (72.01 g, 0.334 mol) se suspenduje u sveže destilovanom acetonitrilu (360 mL), uz mešanje. U ovu suspenziju se uz snažno mešanje dodaju anhidrovani natrijum acetat (41.1 g, 0.5 mol) i 30% vodeni rastvor metilamina (69 mL, 0.67 mol). Dobijena mešavina se refluksuje 7 sati, a nakon toga ostavi u toku noći uz praćenje pomoću TLC (mešavina hloroform/CCLj1:2). Žuti precipitat se izdvoji filtriranjem i izmeša sa rastvorom K2CO3(25 g) u vodi (500 mL). Mešavina se meša 30 minuta i filtrira. Žuti precipitat se ispere sa vodom da postigne pH 7. Filtrat se koncentruje pod sniženim pritiskom do zapremine od približno 200 mL i izmeša sa rastvorom K2C03(5 g) u vodi (100 mL). Mešavina se meša 30 minuta i filtrira. Žuti precipitat se ispere sa vodom da postigne pH 7. Ova dva precipitata se kombinuju i suše da se dobije metil 4-(metilamino)-3-nitrobenzoat kao žuti prašak u prinosu od 96% (67.63 g).

Metil 4-(metilamino)-3-nitrobenzoat (63.06 g, 0.3 mol) se uz snažno mešanje suspenduje u metanolu (700 mL). U suspenziju se doda suspenzija Raney nikla (15 g, sveže izrađen tretiranjem nikl-aluminijum 50/50 legure sa 2N rastvorom NaOH) u metanolu (30 mL). Dobijena mešavina se zagreva na 40 45 °C uz snažno mešanje, a u suspenziju se, u kapima, 3 sata dodaje hidrazin monohidrat (60 mL, 1.2 mol) na temperaturi nižoj od 55 °C. Mešavina se meša 3 sata na 50 55 °C i ostavi u toku noći na sobnoj temperaturi. Reaktivna mešavina se ponovo zagreva do

40 45 °C uz snažno mešanje i u mešavinu se doda dodatna količina hidrazin hidrata (5 mL). Suspenzija se refluksuje 2 sata uz snažno mešanje, ohladi i razblaži sa hloroformom (1 L). Mešavina se propusti kroz diatomejsku zemlju (gornji sloj 2 cm, prečnik 17 cm) i silika gel (donji sloj 5 cm) da se ukloni Raney nikl. Slojevi se isperu sa mešavinom hloroformom/metanol (1:1, 5 x 600 mL). Filtrat se koncentruje pod sniženim pritiskom. Ostatak se razblaži sa benzenom (100 mL) i mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom da se ukloni voda. Ova operacija se ponovi da se dobije metil 3-amino-4-(metilamino)benzoat kao smeđa kristalna čvrsta supstanca u prinosu od 99% (53.6 g). Metil 3-amino-4-(metilamino)benzoat se koristi u sledećoj fazi bez naknadnog prečišćavanja. Metil 3-amino-4-(metilamino)benzoat (53.6 g, 0.3 mol) se rastvori u anhidrovanom dihlorometanu (700 mL). U ovaj rastvor se u nekoliko malih porcija, uz mešanje, 2 h dodaje 1,1 -karbonildiimidazol (GDI, 62.59 g, 0.386 mol). Reaktivna mešavina se meša na sobnoj temperaturi u toku noći. Formirani precipitat se izdvoji filtriranjem, ispere sa hladnim etrom (3 x 50 mL) i suši da se dobije metil l-metil-2-okso-2,3-dihidro-lH-benzimidazol-5-karboksilat kao svetio ružičasti kristali u prinosu od 81% (49.75 g).

Fosforil bromid (POBr3,102.4 g, 0.357 mol) se rastvori u dihloroetanu (400 mL). U ovaj rastvor se u nekoliko malih porcija, uz mešanje doda metil t-metil-2-okso-2,3-dihidro-lH-benzimidazol-5-karboksilat (36.7 g, 0.178 mol) i dobijena suspenzija se refluksuje uz praćenje pomoću TLC (hloroform/l,2-dimetoksietan 10:1). Nakon završetka reakcije (približno 19 sati), reaktivna mešavina se ohladi u ledenom kupatilu i pažljivo, 3 sata, neutrališe sa vodom (50 mL), a nakon toga sa rastvorom Na2C03(100 g) u vodi (800 mL), pri čemu se uočava intenzivno penušanje. Dobijena mešavina se ekstrahuje sa hloroformom (2 L). Slojevi se razdvoje i vodeni sloj se ponovo ekstrahuje sa hloroformom (500 mL). Organski slojevi se kombinuju, isperu sa vodom (3 x 250 mL) i suše preko CaC^. Organski rastvor se koncentruje pod sniženim pritiskom. Dobijena bledo siva čvrsta supstanca se rekristališe iz acetonitrila da se dobije metil 2-bromo-1 -metil- lH-benzimidazol-5-karboksilat kao bela čvrsta supstanca u prinosu od 77.5%

(37.1 g).

Mešavina metil 2-bromo-l-metil-lH-benzimidazol-5-karboksilata (40.0 g, 0.149 mol), pirolidina (25.37 g, 30 mL, 0.357 mol), cezijum fluorida CsF (31.61 g, 0.208 mol) i DMSO (240 mL) se stavi u mikrotalasni reaktor. Reaktivna mešavina se tretira 8 h mikrotalasnom radijacijom uz mešanje na unutrašnjoj temperaturi od 115 °C, ohladi i sipa u ledeno hladnu vodu (1 L). Formirani precipitat se izdvoji filtriranjem, ispere sa hladnom vodom (2x50 mL), heksanom (2 x 100 mL) i suši. Produkt se izmeša sa etrom (250 mL) i acetonitrilom (20 mL) i mešavina se ostavi 1.5 sati u ultrasoničnom kupatilu. Precipitat se izdvoji filtriranjem, ispere sa etrom (2x50 mL) i suši da se dobije metil l-metil-2-pirolidin-l-il-lH-benzimidazol-5-karboksilat u prinosu od 75% (28.82 g).

Suspenzija metil l-metil-2-pirolidin-l-il-lH-benzimidazol-5-karboksilata (28.8 g, 0.111 mol) u metanolu (200 mL) se izmeša sa rastvorom KOH (12.44 g, 0.222 mol) u vodi (200 mL). Mešavina se refluksuje 3 sata i ostavi u toku noći na sobnoj temperaturi. Reaktivna mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom da se ukloni metanol. Ostatak se izmeša sa rastvorom KHSO4(30.21 g, 0.222 mol) u vodi (200 mL) i mešavina se meša 1 sat. Reaktivna mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom do sušenja, a produkt se ekstrahuje iz ostatka čvrste supstance sa toplom mešavinom hloroforma i izopropanola (1:1, približno 7 L). Dobijeni ekstrakt se koncentruje pod sniženim pritiskom, a ostatak se rastvori u ključaloj mešavini dihlorometana i izopropanola (1:1, 500 mL). Rastvor se refluksuje 30 minuta i ohladi u zamrzivaču. Formirani precipitat se izdvoji filtriranjem i suši da se dobije l-metil-2-pirolidin-l-il-lH-benzimidazol-5-karboksilna kiselina kao bledo žuta kristalna čvrsta supstanca u prinosu od 67% (18.3 g).

Izrada kiseline 23

7- hloro- 4- metoksi- 2- metil- 1 H- benzimidazol- 5 - karboksilna kiselina

U koncentovanu sumpornu kiselinu (10 mL) ohlađenu u kupatilu sa mešavinom led/aceton se doda komercijalno raspoloživ metil 4-(acetilamino)-5-hloro-2-metoksibenzoat (500 mg, 2.0 mmol) i meša 5 minuta. U ovo se u kapima dodaje pušljivi nitratni kiselina (2 mL) u toku 10 minuta, uz održavanje temperature ispod 10 °C. Reaktivna mešavina se meša dodatnih 20 minuta na 0 °C. Reaktivna mešavina se pažljivo sipa na led (30 mL), dobijena čvrsta susptanca se izdvoji filtriranjem i suši pod vakuumom da se dobije metil 4-(acetilamino)-5-hloro-2-metoksi-3-nitrobenzoat (497 mg, 85%).

Mešavina metil 4-(acetilamino)-5-hloro-2-metoksi-3-nitrobenzoata(5.53 g, 18.3 mmol) i Raney nikla (500 mg) u etanolu (95 mL) i vodi (5 mL) se meša 5 sati na sobnoj temperaturi pod pritiskom vodonika od 30 funti po kvadratnom inču (psi). Reaktivna mešavina se filtrira preko arbocela i filtrat se koncentruje pod vakuumom da se dobije metil 4-(acetilamino)-3-amino-5-hloro-2-metoksibenzoat (4.60 g, 92%).

Metil 4-(acetilamino)-3-amino-5-hloro-2-metoksibenzoat (4.60 g, 16.9 mmol) i p-toluensulfonatna kiselina (290 mg, 1.69 mmol) se rastvore u toluenu i zagrevaju pod refluksom 1 sat. Rastvarači se upare i podele između CH2CI2i zasićenog vodenog rastvora NaHCC»3. Organski ekstrakt se koncentruje da se dobije metil 7-hloro-4-metoksi-2-metil-lH-benzimidazol-5-karboksilat (4.21 g, 98%).

Mešavina metil 7-hloro-4-metoksi-2-metil-lH-benzimidazol-5-karboksilata (2.00 g, 7.85 mmol) u THF koji sadrži 1 M rastvor NaOH (12 mL) se zagreva 3 sata pod refluksom. Kako reakcija nije završena, doda se još 1 M rastvor NaOH (6 mL) i reaktivna mešavina se zagreva pod refluksom dodatnih 4 sata. THF se upari, a dobijeni rastvor se pažljivo neutrališe sa koncentrovanom HC1 (1.4 mL). Nakon mešanja u toku 10 minuta dobija se beli precipitat. Mešanje se nastavi 10 minuta na sobnoj temperaturi nakon čega se sakupi filtriranjem pod vakuumom i ispere sa vodom. Čvrsti deo se suši pod vakuumom, a preostala voda azeotropira sa metanolom da se dobije 7-hloro-4-metoksi-2-metil-lH-benzimidazol-5-karboksilna kiselina (1.89 g, 100%).

Primeri

Izrada jedinjenja Formule ( 1)

Jedinjenja Formule (1) se izrađuju na jedan od sledećih šest postupaka koristeći odgovarajuće karboksilne kiseline i spiro ketone: Postupak A: U epruvete za kulturu dimenzija 10x75 mm se doda 500 uL (1 ekvivalent ("eq")) 0.2 M rastvora odgovarajuće karboksilne kiseline u anhidrovanom DMF. U ovo se doda 500 uL (0.10 mmol) 0.2 M rastvora spirocikličnog amina 6,7-dimetilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-ona u anhidrovanom dimetilformamidu (DMF). U ovo se doda 200 uL (1 eq) 0.5 M rastvora trietilamina u anhidrovanom DMF. U ovo se doda 200 uL (1 eq) rastvora 0.5 M 0-(7-azabenzotriazol-l-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum heksafluorofosfata (HATU) u anhidrovanom DMF. Epruvete se zatvore i reaktivna mešavina se meša 16 sati na sobnoj temperaturi. Isparljivi elementi iz kivete se uklone pomoću sistema rotacionog evaporatora na 55 °C u toku 4 sata. U svaku epruvetu se doda dimetilsulfoksid (1540 uL koji sadrži 0.01% 2,6-di-t-butil-4-metilfenola (BHT)) (finalna teoretska koncentracija 0.05 M). Epruvete se pokriju celofanom i mućkaju 5 minuta ili sve dok se produkt u svakoj epruveti ne rastvori. Produkt se analizira pomoću LC/MS.

Alternativno Postupku A, koriste se sledeće analize i postupak prečišćavanja (u daljem tekstu, "Postupak Al"). Kroz ceo Postupak Al, koriste se sledeći rastvarači: A: voda, B: acetonitril i C: 1% vodeni rastvor trifluoroacetatne kiseline, [zapreminski procenat]

Analize pre prečišćavanja se izvode na 4.6 x 30 mm Waters (Waters Corp.) X-Bridge

Cl 8, 5pm koloni uz brzinu protoka od 2.5 mL/minut u zapremini punjenja od 2 uL u DMSO sa sledećim gradijentom: 5% acetonitril/95% voda do 95% acetonitril/5% voda u toku 3.0 minuta, 1%> vodeni rastvor trifluoroacetatna kiselina/99%) voda se zadržava na 1 %. Korišćeni detektori uključuju: detektor sa nizom dioda (DAD), detektor raspršenog evaporativnog svetla (ELSD) i vreme protoka masene spektrometrije: elektrosprej pozitivni mod (TOF MS: ES(+)).

Preparativna hromatografija se izvodi na 19 x 50 Waters X-Bridge C-18, 5pm uz przinu protoka od 25 mL/minuti u zapremini punjenja od 900 uL u DMSO (10-30 mg) koristeći gradijent koji je određen na osnovu vremena retencije u analizama pre prečišćavanja koristeći DAD, MS: ES (+) detektore sa uzetom frakcijom pokrenutom selekcijom jona zabeleženim pomoću MS; jedna epruveta po injekciji.

Analiza nakon prečišćavanja se izvodi na 4.6 x 30 mm Waters X-Bridge C8, 5 um koloni uz brzinu protoka od 2.5 mL/minuta koristeći zapreminu punjenja od 2 uL u DMSO sa gradijentom 4% B do 95% B u toku 3.0 minuta, C se zadržava na 1%. Korišćeni detektori uključuju: DAD, ELSD, TOF MS: ES (+) mod.

Postupak B: U bocu se dodaju odgovarajući amin ili amin hidrohlorid (1 ekvivalent), DMF ili CH2CI2(približno 0.1 M), karboksilna kiselina, N,N-diizopropiletilamin (DIEA) (4-6 ekvivalenata) ili trietilamin (TEA) (4-6 ekvivalenata) i HATU (1-1.3 ekvivalenata). Mešavina se meša na sobnoj temperaturi sve dok se reakcija ne završi što se određuje pomoću LC/MS. Mešavina se razblaži sa etil acetatom i ispere sa zasićenim vodenim rastvorom NaHC03(2x), a nakon toga sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl. Organski ekstrakt se suši preko MgS04, filtriraju i koncentruju. Sirovi materijal se prečisti tečnom hromatografijom da se dobije produkt. Alternativno, (u daljem tekstu, "Postupak BI"), sirova reaktivna mešavina se koncentruje i direktno prečisti hromatografijom kako je opisano u Postupku Al.

Postupak C: U rastvor spiro ketona, izrađenog u Postupku B, u mešavini MeOH/voda (približno 0.1 M; V:V 2:1), se doda LiOH (1-5 eq.). Rastvor se zagreva 3 sata na 50 °C. Reaktivna mešavina se nakon toga ohladi, koncentruje i prečisti hromatografijom na koloni.

Postupak D: U posudu zapremine 1 dram se doda 260 uL 0.25 M rastvora amina rastvorenog u 1 M rastvoru trietilamina u CH2Cl2. U ovo se doda 260 uL 0.25 M rastvora karboksilne kiseline u CH2CI2. Mešavina se centrifugira i u ovu mešavina se doda 260 uL HATU u CH2C12. Epruveta se centrifugira i nakon toga mućka 16 sati na sobnoj temperaturi. Sirova reaktivna mešavina se prečisti tečnom hromatografijom da se dobije željeni produkt.

Postupak E: U otvor zapremine 2.2 mL ploče sa 96 dubokih otvora se doda rastvor karboksilne kiseline (0.5 mL 0.5 M rastvor DMF), rastvor amina (0.5 mL 0.5 M rastvor DMF) i rastvor HATU (0.5 mL 0.5 M rastvor DMF). U ovo se doda trietilamin (3 ekvivalenta). Ploča se zatvori i mućka 16 sati. Rastvarači se uklone centrifugalnom evaporacijom pod sniženim pritiskom. Ostataci se rastvore u CH2CI2(1 mL) i isperu po redu sa K2CO3(2 x 0.7 mL 0.5 M rastvor) i vodom (0.7 mL) pre nego što se prenesu u ploču za sakupljanje. Konačni vodeni ostatak se re-ekstrahuje sa CH2C12(0.5 mL), kombinuje sa prvim CH2CI2ekstraktom i upari do sušenja.

Postupak F: U rastvor spiro ketona u mešavini MeOH/voda (približno 0.1 M; V:V 2:1), se doda LiOH (1-5 eq.). Rastvor se zagreva 3 sata na 50 °C. Reaktivna mešavina se nakon toga ohladi, koncentruje i prečisti hromatografijom na koloni.

Soli trifluoroacetatne kiseline finalnog produkta se dobijaju nakon HPLC hromatografije koristeći vodenu fazu koja sadrži TFA.

Primeri A1- A35

Pr. Al: Postupak BI se koristi da se formira 6,7-dimetil-r-[(7-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]spiro-[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on kako sledi. Rastvor 6,7-dimetilspiro[hromen-2,4 -piperidin]-4(3H)-ona (300 mg, 0.83 mmol) u CH2CI2(5 mL) se tretira sa trietilaminom (0.70 mL, 5.0: mmol) i 0-(7-azabenzotriazol-l-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum heksafiuorofosfatom ("HATU") (317 mg, 0.84 mmol). Mešavina se meša na sobnoj temperaturi 6 sati, a nakon toga se rastvarači uklone pod sniženim pritiskom, a ostatak se prečisti hromatografijom da se dobije naslovljeno jedinjenje (50 mg, 48,.%).<J>H NMR (CDCI3) 8 8.24 (br s, IH), 7.71 (s, IH), 7.59 (s, IH), 7.33 (s, IH), 6.80 (s, IH), 2.66 (m, 3H), 2.26 (s, 3H), 2.20 (s, 3H).

Pr. A2: Postupak A se koristi da se formira 6,7-dimetil-r-[(7-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]spiro-[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on so trifluoroacetatne kiseline kako sledi. U bakteriološke epruvete zapremine 10x75 mm se doda 400 uL (0.08 mmol) 0.2 M rastvora 6,7-dimetilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-ona u anhidrovanom dimetilformamidu (DMF), nakon toga se nanos izmeša. U ovo se doda 400 uL (1 eq) 0.2 M rastvora odgovarajuće karboksilne kiseline u anhidrovanom DMF. U ovo se doda 160 uL (1 eq) 0.5 M rastvora trietilamina u anhidrovanom DMF. U ovo se doda 160 uL (1 eq) 0.5 M rastvor HATU u anhidrovanom DMF. Epruvete se pokriju celofanom i reaktivne mešavine se mešaju 16 sati. Isparljivi delovi iz epruveta se uklone pomoću sistema rotacione evaporacije uz umereno zagrevanje. U svaku epruvetu se doda dimetilsulfoksid (1540 uL koji sadrži 0.01 % 2,6-di-t-butil-4-metilfenol (BHT)) (konačna teorijska koncentracija 0.05 M). Epruvete se pokriju celofanom i mešaju 5 minuta ili sve dok se produkt u svakoj epruveti ne rastvori. MS(ACPI)m/ z404 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.56 minuta,<*>H NMR (CDCh) 5 8.24 (br s, IH), 7.71 (s, IH), 7.59 (s, IH), 7.33 (s, IH), 6.80 (s, IH), 2.66 (m, 3H), 2.26 (s, 3H), 2.20 (s, 3H).

Pr. A3: 6-izopropoksi-r-[(7-metil-TH-indazol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI) m/z (M+H)<+>434, HPLC vreme retencije 2.4 minuta.<*>H NMR (CDCb) 8 8.14 (s, IH), 7.69 (s, IH), 7.32 (d, IH), 7.27-7.28 (m, 2H), 7.10-7.12 (dd, IH), 6.94-6.96 (d, IH), 4.49-4.54 (m, IH), 2.75 (br s, 2H), 2.59 (s, 3H), 1.32-1.33 (d, 6H)

Pr. A4: 6-etoksi-r-[(7-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]spiro[bjomen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI) m/z (M+H)<+>420 HPLC vreme retencije 2.4.<*>H NMR (CDC13) 5 8.14 (s, IH), 7.69 (s, IH), 7.30-7.31 (d, IH), 7:12-7.14 (dd, IH), 6.95-6.97 (d, H), 4:01-4:05 (m, 2H), 2.75 (br s, 2H), 2.60 (s, 3H), 1,40-1,43 (t, 3H)

Pr. A5: N-metil-1 '-[(7-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]-4-okso-3,4-dihidrospiro[hromen-2,4'-piperidin]-6-karboksamid, MS(ACPI) m/z (M+H)+ 433 HPLC vreme retencije 1.7 minuta.

Pr. A6: 5-hloro-7-metoksi-1'-[(7-metil-1 H-indazol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]- 4(3H)-on, MS(ACPI) m/z (M+H)+ 440.<[>H NMR (CDC13) 5 8.13 (s, IH), 7.68 (s, IH), 7.25 (s, IH), 6.68 (m, IH), 6.53-6.54 (d, IH), 3.91 (s, 3H), 2.73 (s, 2H), 2.58 (s, 3H)

Pr. A7: 6-metoksi-r-[(7-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on so trifluoroacetatne kiseline, MS(ACPI)m/ z406 (M+H)<+>,<!>H NMR (CDC13) 5 8.24 (s, IH), 7.76 (s, IH), 7.35 (s, IH), 7.32 (d, J=3, IH), 7.15 (dd, J=3, 8.8, IH), 6.96 (d, J=8.8, IH), 2.77 (br s, 2H), 2.63 (s, 3H)

Pr. A8: 6-bromo-7-metil-l '-[(7-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z486(M+H)<+>HPLC vreme retencije 2.64 minuta

Pr. A9: 5-fluoro-6-metoksi-l '-[(7-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z424 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.1 minut

Pr. A10: r-[(7-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]-4-okso-3,4-dihidrospiro[hromen-2,4'-piperidin]-6-. karboksamid, MS(ACPI) m/z (M+H)<+>419 HPLC vreme retencije 1.6 minuta

Pr. Ali: metil r-[(7-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]-4-okso-3,4-dihidrospiro[hromen-2,4'-piperidin]-6-karboksilat, MS(ACPI)m/ z434 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.15 minuta

Pr. A12:1 '-[(7-metil-1 H-indazol-5-il)karbonil]-6-(trifluorometoksi)spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z460 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.5 minuta,<*>H NMR (CDCI3) 5 8.13 (s, IH), 7.69-7.74 (m, 2H), 7.38 (dd, J=2.6, 9.3, IH), 7.07 (d, J=8.8, IH), 2.80 (s, 2H), 2.59 (s, 3H)

Pr. A13: 6-hloro-7-metil-1 '-[(7-metil-1 H-indazol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z424 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.5 minuta, 'H NMR (CDCI3) 5 9.40 (s, IH), 8.25 (s, IH), 7.79-7.81 (m, IH), 7.72 (s, IH), 7.34 (s, IH), 6.91 (s, IH), 2.72 (s, 2H)

Pr. A14:6,7-dihloro -r-[(7-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z444 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.6 minuta,<*>H NMR (CDC13) 5 8.20 (s, IH), 7.95 (s, IH), 7.72 (s, IH), 7.32 (s, IH), 7.22 (s, IH), 2.78 (s, 2H), 2.65 (s, 3H)

Pr. A15: 6-metil-1 '-[(7-metil-1 H-indazol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z390 (M+H)+, 'H NMR (CDC13) 6 8.13 (s, IH), 7.68-7.69 (m, 2H), 7.34 (dd, J=2.6, 8.3, IH), 7.27 (s, IH), 6.93 (d, J=8.8), 2.75 (s, 2H), 2.60 (s, 3H), 2.32 (s, 3H)

Pr. A16: 6-metoksi-r-[(7-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z406 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.1 minut, !H NMR (CDC13) 5 8.13 (s, IH), 7.74 (s, IH), 7.27 (d, J=3.1, IH), 7.25 (s,.lH), 7.18 (d, J=3.3, IH), 7.16 (d, J=3.1, IH), 7.04 (s, IH), 7.02 (s, IH), 4.91 (s, 2H), 3.78 (s, 3H), 2.60 (s, 3H)

Pr. A17: 7-hloro-1'-[(7-metil-1 H-indazol-5-il)karbonil] spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z410 (M+H)<+>,<*>H NMR (CDC13) 8 8.13 (s, IH), 7.82 (d, J=8.2, IH), 7.69 (s, IH), 7.26 (s, IH), 7.07 (s, IH), 7.02-7.03 (m, IH), 2.77 (s, 2H), 2.58 (s, 3H)

Pr. Al8: 6-hloro-5,7-dimetil-r-[(7-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z438(M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.7 minuta

Pr. A19: 7-hloro-5-metoksi-l '-[(7-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI) m/z (M+H)<+>440. 'H NMR (CDC13) 8 8.13 (s, IH), 7.69 (s, IH), 7.26 (s, IH), 6.64 (m, IH), 6.43-6.44 (m, IH), 3.86 (s, 3H), 2.76 (s, 2H), 2.59 (s, 3H)

Pr. A20: 1 '-[(7-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]-6-(trifluorometil)spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z444 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.5 minuta, 'H NMR (CDC13) 8 8.18 (s, IH), 8.13 (s, IH), 7.76 (dd, J=2.0, 8.8, IH), 7.70 (s, IH), 7.27 (s,lH), 7.15 (d, J=8.8, IH), 2.83 (s, 2H), 2.59 (s, 3H)

Pr. A21: 6-hloro-7-fluoro-l '-[(7-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z426 (M-H), HPLC vreme retencije 2.4 minuta,<*>H NMR (CDC13) 8 8.13 (s, IH), 7.95 (d, J=8.3, IH), 7.69 (s, IH), 7.27 (s, IH), 6.85 (d, J=3.1, IH), 2.77 (s, 2H), 2.59 (s, 3H)

Pr. A22: 7-hloro-6-fluoro-l '-[(7-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI) m/z 428 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.4 minuta,lVLNMR (CDC13) 8 8.17 (s, IH), 7.71 (s, IH), 7.62 (d, J=8.3, IH), 7.30 (s, IH), 7.14 (d, J=5.7, IH), 2.78 (s, 2H), 2.62 (s, 3H)

Pr. A23: 6-izopropil-l '-[(7-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z418 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.5 minuta

Pr. A24: 7-metoksi-l'- [(7-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z406 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.0 minuta,<l>KNMR (CDC13) 8 8.14 (s, IH), 7.82 (d, J=8.8, IH), 7.69 (s, IH), 7.27 (s, IH), 6.59 (dd, J=8.8, 2.6, IH), 6.47 (dd, J=2.0, IH), 3.87 (s, 3H), 2.73 (s, 2H), 2.60 (s, 3H)

Pr. A25: 5-metoksi-l '-[(7-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z406 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.9 minuta,<*>HNMR (CDC13) 8 8.15 (s, IH), 7.69 (s, IH), 7.41 (t, J=8.3, IH), 6.62 (d, J=8.8, IH), 6.53 (d, J=8.3, IH), 3.92 (s, 3H), 2.75 (s, 2H), 2.60 (s, 3H)

Pr. A26: 6-hloro-r-[(7-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z410 (M+H)<+>, 'HNMR (CDC13) 5 8.16 (s, IH), 7.84 (d, J=2.6, IH), 7.70 (s, IH), 7.46 (dd, J=8.8, 3.1, IH), 7.00 (d, J-8.8, IH), 2.78 (s, 2H), 2.61 (s, 3H)

Pr. A27: N,N-dimetil-1 '-[(7-metil-1 H-indazol-5-il)karbonil]-4-okso-3,4-dihidrospiro[hromen-2,4'-piperidin]-6-karboksamid, MS(ACPI) m/z (M+H)<+>447 HPLC vreme retencije 1.7.

Pr. A28: 7-metoksi-5-metil-l '-[(7-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI) m/z (M+H)<+>420 HPLC vreme retencije 2.3 minuta.<!>H NMR (CDC13) 5 8.13 (s, IH), 7.69 (s, IH), 7.27 (s, IH), 6.36-6.38 (m, 2H), 3.85 (s, 3H), 2.71 (s, 2H), 2.62 (s, 3H), 2.59 (s, 3H)

Pr. A29: 5,7-dimetil-l '-[(7-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z404 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.5 minuta

Pr. A30: 5,7-dihloro-l '-[(7-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z444 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.5 minuta

Pr. A31: l'-[(7-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]-4-okso-3,4-dihidrospiro[hromen-2,4'-piperidin]-6-karbonitril, MS(ACPI)m/ z401 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.9 minuta, 'H NMR (CDC13) 8 8.21-8.23 (m, 2H), 7.77 (dd, J=8.8, IH), 7.74 (s, IH), 7.34 (s, IH), 7.15 (d, J=8.8, IH), 2.85 (s, 2H), 2.66 (s, 3H)

Pr. A32: 1 '-[(7-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]-4-okso-3,4-dihidrospiro[hromen-2,4'-piperidin]-7-karbonitril, MS(ACPI)m/ z401 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.3 minuta,<l>HNMR (CDC13) 8 8.17 (s, IH), 7.97 (d, J=7.7, IH), 7.71 (s, IH), 7.38 (m, IH), 7.30-7.32 (m, IH), 2.84 (s, 2H), 2.62 (s, 3H)

Pr. A33: Postupak C se koristi da se izradi 1 '-[(7-metil-1 H-indazol-5-il)karbonil]-4-okso-3,4-dihidrospiro[hromen-2,4'-piperidin]-6-karboksilna kiselina so trifluoroacetatne kiseline. U rastvor metil l'-[(7-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]-4-okso-3,4-dihidrospiro[hromena, izrađenog po Postupkuk B, u MeOH/voda (1.4 mL, 2:1), se doda LiOH (7.5 mg). Rastvor se zagreva 3 sata na 50 °C. Reaktivna mešavina se nakon toga ohladi, koncentruje i prečisti hromatografijom na koloni. MS(ACPI)m/ z420 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.0 minuta. MS(ACPI)m/ z420 (M+H)<+>HPLC vreme retencije 1.85 minuta.

Pr. A34: 1 '-[(7-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]-7-fenilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI) m/z 452 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.6 minuta

Pr. A35: r-[(7-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]-6-(metilsulfonil)spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z454 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.85 minuta, 'HNMR (CDC13) 5 8.47 (d, J=2.6, IH), 8.15 (s, IH), 8.07 (dd, J=1.3, 8.8, IH), 7.70 (s, IH), 7.27 (s, IH), 7.22 (d, J=8.8, IH), 3.08 (s, 3H), 2.86 (s, 2H), 2.60 (s, 3H)

Primeri BI- BI 4

Pr. B1:1 '-[(7-hloro-1 H-indazol-5-il)karbonil]-6,7-dimetilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on *H NMR (CDC13) 5 8.16 (s, IH), 7.75 (s, IH), 7.59 (s, IH), 7.48 (s, IH), 6.80 (s, IH), 5.29 (s, IH), 2.70 (s, 2H), 2.26 (s, 3H), 2.20 (s, 3H)

Pr. B2:r-[(7-hloro-lH-indazol-5-il)karbonil]-6-izopropoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on.<l>KNMR (CDC13) 5 8.18 (s, IH), 7.78 (s, IH), 7.50 (s, IH), 7.32-7.33 (d, IH), 7.10-7.12 (dd, IH), 6.94-6.96 (d, IH), 4.49-4.54 (m, IH), 2.84 (br s, 2H), 2.75 (br s, 2H), 1.32-1.34

(d,6H)

Pr. B3:r-[(7-hloro-lH-indazol-5-il)karbonil]-6-etoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on 'H NMR (CDC13) 8 8.18 (s, IH), 7.78 (s, IH), 7.50 (s, IH), 7.30-7.31 (d, IH), 7.12-7.15 (dd, IH), 6.95-6.97 (d, IH), 4.01-4.05 (q, 2H), 2.84 (s, 2H), 2.75 (s, 2H), 1.40-1.43 (t, 3H)

Pr. B4: 6-hloro-7-metil-l '-[(7-hloro-lH-indazol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on<[>HNMR (CDC13) 8 8.16 (s, IH), 7.81 (s, IH), 7.74 (s, IH), 7.47 (s, IH), 6.91 (s, IH), 2.72 (s, 2H),2.38 (s,3H)

Pr. B5:l '-[(7-hloro-lH-indazol-5-il)karbonil]-6-metoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on<!>H NMR (CDC13) 8 8.16 (s, IH), 7.75 (m, IH), 7.48 (m, IH), 7.28-7.30 (m, IH), 7.10-7.14 (m, IH), 6.91-6.95 (m, IH), 3.79 (s, 3H), 2.73 (s, 2H)

Pr. B6:l '-[(7-hloro-lH-indazol-5-il)karbonil]-5-metoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on lH NMR (CDC13) 8 8.19 (s, IH), 7.78 (s, IH), 7.51 (s, IH), 7.41-7.44 (m, IH), 6.63 (d, J=8.3, IH), 6.54 (d, J=8.3, IH), 3.93 (s, 3H), 2.75 (s, 2H)

Pr. B7:r-[(7-hloro-lH-indazol-5-il)karbonil]-7-metoksispiro[hromen-2,4-piperidin]-4(3H)-on, 'H NMR (CDC13) 8 8.18 (s, IH), 7.83 (d, J=5.2, IH), 7.78 (s, IH), 7.50 (s, IH), 6.59-6.62 (m, IH), 6.47-6.48 (m, IH), 3.87 (s, 3H), 2.73 (s, 2H)

Pr. B8: 6-hloro-l '-[(7-hloro-lH-indazol-5-il)karbonil]spiro[hrornen-2,4'-piperidin]-4'(3H)-on, 'HNMR (CDC13) 8 8.19 (s, IH), 7.85 (d, J=3.1, IH), 7.78 (s, IH), 7.51 (s, IH), 7.47 (dd, J=8.8, 2.5, IH), 7.00 (d, J=8.8, IH), 2.78 (s, 2H)

Pr. B9: 5,7-dihloro-r-[(7-hloro-lH-indazol-5-il)karbonil]spiro[hrornen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on,<*>H NMR (CDC13) 8 8.18 (s, IH), 7.77 (s, IH), 7.50 (s, IH), 7.08 (d, J=2.1, IH), 7.01 (d, J=1.5, IH), 2.81 (s, IH)

Pr. BIO: 7-hloro-r-[(7-hloro-lH-indazol-5-il)karbonil]-6-fluorospiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, 'H NMR (CDC13) 8 8.18 (s, IH), 7.78 (s, IH), 7.63 (d, J = 8.3, IH), 7.50 (s, IH), 7.15 (d, J=5.7, IH), 2.78 (s, 2H)

Pr. BI 1:l'-[(7-hloro -lH-indazol-5-il)karbonil)-5-fluoro-6-metoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on

Pr. B12: r-[(7-Moro-lH-indazol-5-il)karbonil]-6-(trifluorometil)spiro[hromen-2,4'-piperiđin]-4(3H)-on, 'HNMR (CDC13) 5 8.19 (s, 2H), 7.79 (s, IH), 7.76 (dd, J-8.3,2.1, IH), 7.51 (s, IH), 7.16 (d, J=8.9, IH), 2.84 (s, 2H)

Pr. B13: 6-hloro-l '4(7-hloro-lH4ndazol-5-il)karbonil]-7-fluorospiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, 'HNMR (CDC13) 5 8.15 (s, IH), 7.90-7.93 (m, IH), 7.75 (d, J=1.2, IH), 7.47 (d, J=1.2, IH), 6.83 (d, J=9.6, IH), 2.75 (s, 2H)

Pr. B14: r-[(7-hloro-lH-indazol-5-il)karbonil]-4-okso-3,4-dihidrospiro[hromen-2,4'-piperidin] -6-karbonitriI

Primeri C1- C5

Pr. Cl: r-[(7-etil-lH-indazol-5-il)karbonil]-6,7-dimetilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on

Pr. C2: r-[(7-etil-lH-indazol-5-il)karbonil]-6-metoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on

Pr. C3: 1 -[(7-etil-1 H-indazol-5-il)karbonil]-5-metoksi-7-metilspiro[hromen-2,4'-piperidin] -4(3 H)-on

Pr. C4: 6-hloro-l '4(7-etil4H-indazol-5-il)karborul]-7-metilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on

Pr. C5: metil 1 '-[(7-etil-lH-indazol-5-il)karbonil]-4-okso-3,4-dihidrospiro[hromen-2,4'-piperidin] -6-karboksilat

Primeri Dl- D3

Pr. Dl: 6J-dimetil-r-[(l-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on

Pr. D2: 6-metoksi-r-[(l-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on

Pr. D3: 6-hloro-7-metil-T-[(l-metil-lH-indazol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin] -4(3 H)-on

Primeri E1- E4

Pr. El: 1 '-(lH-indazol-5-ilkarbonil)-6,7-dimetilspiro[hromen-2,4'-piperidm]-4( MS(ACPI)m/ z390 (M+H)<+>HPLC vreme retencije 2.2 minuta

Pr. E2: 6-hloro-l '-(lH-indazol-5-ilkarbonil)-7-metilspiro[hromen-2,4 -piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z410 (M+H)<+>HPLC vreme retencije 2.3 minuta

Pr. E3: 1 '-[(3,7-dimetil-lH-indazol-5-il)karbonil]-6,7dimetilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI) m/z (M+H)<+>418 HPLC vreme retencije 2.4 minuta

Pr. E4: metil 1 '-[(3,7-dimetil-lH-indazol-5-il)karbonil]-4-okso-3,4-dihidrospiro[hromen-2,4'-piperidin]-6-karboksilat, MS(ACPI) m/z (M+H)<+>448 HPLC vreme retencije 2.3 minuta

Primeri F1- F5

Pr. Fl: 6 J-dimetil4'-[(3-metil-lH-indazol-6-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on

Pr. F2: 6-metoksi-l '-[(3-metil-lH-indazol-6-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on

Pr. F3: 6-hloro-7-metil-l '-[(3-metil-lH-indazol-6-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on

Pr. F4: metil r-[(3-metil-lH-indazol-6-il)karbonil]-4-okso-3,4-dihidrospiro[hromen-2,4'-piperidin] -6-karboksilat

Pr. F5: Postupak C se koristi da se formira trifluoroacetatna so r-[(3-metil-lH-indazol-6-il)karbonil]-4-okso-3,4-dihidrospiro[hromen-2,4'-piperidin]-6-karboksilne kiselina. Postupak B se koristi da se izradi metil 1 -[(3-metil-lH-indazol-6-il)karbonil]-4-okso-3,4-dihidrospiro[hromen-2,4 -piperidin]-6-karboksilat. U rastvor metil 1 -[(3-metil-lH-indazol-6-il)karbonil]-4-okso-3,4-dihidrospiro[hromen-2,4-piperidin]-6-karboksilata u mešavini MeOH/voda (1.4 mL, 2:1) se doda LiOH (7.5 mg). Rastvor se zagreva 3 sata na 50 °C. Reaktivna mešavina se nakon toga ohladi, koncentruje i prečisti hromatografijom na koloni (16.6 mg, 33%).

Primeri G1- G5

Pr. Gl:l'-(lH-indazol-6-ilkarbonil)-6,7-dimetilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on so trifiuoroacetatne kiseline

Pr. G2: 6,7-dimetil-l '-[(l-metil-lH-indazol-6-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on

Pr. G3:l '-[(l,3-dimetil-lH-indazol-6-il)karbonil]-6,7-dimetilspiro[hromen-2,4'-piperidin] -4(3H)-on

Pr. G4:1 ,-[(3-etil-l-metil-lH-mdazol-6-il)karbonil]-6,7-dimetilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on

Pr. G5: r-[(7-bromo-lH-indazol-6-il)karbonil]-6-hlorospiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on

Primeri Hl- H24

Pr. Hl: Postupak D se koristi za formiranje 1 '-(lH-indazol-7-ilkarbonil)-6,7-dimetilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-ona. Posebno, u posudu zapremine 1 dram se doda 260 uL 0.25 M rastvora 6,7-dimetilspiro[hromen-2,4 -piperidin]-4(3H)-ona rastvorenog u 1 M rastvoru trietilamina u CH2CI2. U ovo se doda 260 uL 0.25 M rastvora lH-indazol-7-karboksilne kiseline u CH2CI2. Mešavina se centrifugira i u ovu mešavinu se doda 260 uL HATU u CH2CI2. Posuda se centrifugira 16 sati a nakon toga mućka na sobnoj temperaturi. Sirova reaktivna mešavina se prečisti tečnom hromatografijom da se dobije naslovljeni produkt.

Pr. H2: 7-hloro-1 '-(lH-indazol-7-ilkarbonil)-6-metilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on

Pr. H3: 6-bromo-l' -(lH-indazol-7-ilkarbonil)-7-metilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on

Pr. H4:1'-(1 H-indazol-7-ilkarbonil)-5-metoksi-7-metilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on

Pr. H5: 6-hloro- T-( 1 H-indazol-7-ilkarbonil)-7-metilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4{3H)-on

Pr. H6: 5-fluoro-T-(lH-indazol-7-ilkarbonil)-6-metoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on

Pr. H7: 1 '-(lH-indazol-7-ilkarbonil)-6-metoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on

Pr. H8: 6-hloro-l '-(lH-indazol-7-ilkarbonil)-5,7-dimetilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on

Pr. H9: 1 '-(1 H-indazol-7-ilkarbonil)-6-metilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on

Pr. Hl0: 1 '-(IH-indazol-7-ilkarbonil)-6-izopropilspiro[hromen-2,4'-piperidin-4(3)-on

Pr. Hll: r-(lH-indazol-7-ilkarbonil)-5,6,7-trimetoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on.

Pr. H12: T-( 1 H-indazol-7-ilkarbonil)-7-metilspiro[hromen-2,4'-piperidin]r4(3H)-on

Pr. Hl3; Postupak E se koristi da se formira l'-(lH-indazol-7-ilkarbonil)-6,8-dimetilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on. U otvor zapremine 2.2 mL u ploči sa 96 dubokih otvora se doda rastvor lH-indazol-7-karboksilna kiselina (0.5 mL 0.5 M rastvor DMF), rastvor 6,8-dimetilspiro[hromen-2,4 -piperidin]-4(3H)-ona (0.5 mL 0.5 M rastvor DMF) i rastvor HATU (0.5 mL 0.5 M rastvor DMF). U ovo se doda trietilamin (3 ekvivalenta). Ploča se zatvori i mešavina se meša 16 sati. Rastvarači se uklone centrifugalnom evaporacijom pod sniženim pritiskom. Ostaci se rastvore u CH2CI2(1 mL) i isperu po redu sa K2C03(2 x 0.7 mL 0.5 M rastvor) i vodom (0.7 mL) a nakon toga prenesu na ploču za sakupljanje. Konačni vodeni ostatak se re-ekstrahuje sa CH2CI2(0.5 mL), kombinuje sa prvim CH2CI2ekstraktom i upari do sušenja. MS(ACPI)m/ z390.(M+H)<+>, HPLC vreme retencije 3.4 minuta.

Pr. H14: 6-hloro-1'-(1 H-indazol-7-ilkarbonil)spiro [hromen-2,4'-piperidin] -4(3H)-on

Pr. H15: 5,7-dihloro-l'-(lH-indazol-741karbonil)spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on Pr. H16:r-(lH-indazol-7-ilkarbonil)-5-metoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on

Pr. Hl7: 6-hloro-l'-(lH-indazol-7-ilkarbonil)-5-metoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on

Pr. H18: 1' -(lH-indazol-7-ilkarbonil)-7-fenilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on Pr. H19: 7-fluoro-r-(lH-indazol-7-ilkarbonil)spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on

Pr. H20: r-(lH-indazol-7-ilkarbonil)-5-metoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, ^NMRCCDC^SS.ll (s, IH), 7.85 (d, J=7.9, IH), 7.37-7.42 (m, 2H), 7.14-7.18 (m, IH), 6.61 (d, J=8.3, IH), 6.52 (d, J=8.3, IH), 3.90 (s, 3H), 2.72 (s, 2H)

Pr. H21:r-(lH-indazol-7-ilkarbonil)-7-metoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on Pr. H22: 6,8-dihloro-l '-(lH-indazol-7-ilkarbonil)spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on

Pr. H23:1 '-[(lH-indazol-7-il)karbonil]-6-hloro-7-metilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-(3H)-on

Pr. H24: 1 '-[(lH-indazol-7-il)karbonil]-6-hloro-7-metilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on

Primeri J1- J3

- nje broj koji pokazuje koliko puta je izvršena analiza.

Pr. JI :1 '-[(5-bromo-lH-indazol-7-il)karbonil]-6-hloro-7-metilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z488 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.8 minuta

Pr. J2: 6-hloro-r-(lH-indazol-4-ilkarbonil)-7-metilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI) m/z410 (M+H)<+>,<!>H NMR (CDC13) 8 8.14 (s, IH), 7.83 (s, IH), 7.59 (d, J-8.3, IH), 7.44-7.47 (m, IH), 7.23 (d, J=6.8, IH), 6.95 (s, IH), 2.75 (s, 2H), 2.40 (s, 3H)

Pr. J3: 6,7-.dimetil-1 '-[(2-metil-2H-indazol-6-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPl)m/ z404 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.4 minuta

Primeri K1- K3

Pr. Kl: 6,7-dimetil-1 '-[(1 -okso-2,3,4,9-tetrahidro-1 H-beta-karbolin-6-il)karbonil] spiro[hromen-2,4'-piperidin] -4(3 H)-on

Pr. K2: 5-metoksi-l'-[(l-okso2,3,4,9-tetrahidro-lH-beta-karbolin-6-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on

Pr. K3: 6-hloro-1'-[(1 -okso-2,3,4,9-tetrahidro-1 H-beta-karbolin-6-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on

Primeri LI- L48

Pr. LI: i'-(lH-indol-7-ilkarbo^ so trifluoroacetatne kiseline, MS(ACPI) m/z 389 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.9 minuta

Pr. L2:r-(lH-indol-6-ilkarbonil)-6,7-dimetilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on so trifluoroacetatne kiseline, MS(ACPI)m/ z389 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.80 minuta

Pr. L3: 6,7-dimetil-l'-[(2-metil-lH-indol-6-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on so trifluoroacetatne kiseline, MS(ACPI)m/ z403 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.89 minuta

Pr. L4: 6,7-dimetil-1'-[(1 -metil-1 H-indol-6-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI) m/z 403 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.88 minuta

Pr. L5: 6-hloro-l'-[(l-metil-lH-indol-6-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z409 (M+H)<+>HPLC vreme retencije 2.08 minuta.

Pr. L6: 1 '-[(3-hloro-l H-indol-6-il)karbonil]-5-metoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z425 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.63 minuta

Pr. L7: 6-hloro-l '-[(3-hloro-lH-indol-6-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z429 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.9 minuta

Pr. L8: 6-hloro-r-(lH-indol-5-ilkarbonil)-7-metilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z456 (M+H)<+>, HPLC Vreme retencije 2.8 minuta,<l>HNMR (DMSO-d6) 8 11.29 (s, IH), 7.63-7.64 (m, 2H), 7.41-7.43 (m, 2H), 7.17 (s, IH), 7.14-7.15 (m, 2H), 6.48 (s, IH), 2.87 (s, 2H), 2.35 (s, 3H).

Pr. L9: 1 '-[(3-hloro-lH-indol-5-il)karbonil]-6 J-dimetilspirofliromen^^'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z423 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.85 minuta

Pr. LIO: l'-[(3-hloro-lH-indol-5-il)karbonil]-5-metoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z425 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.54 minuta

Pr. Lll:l,-[(2,3-dimetil4H-indol-5-il)karbonil]-5-metoksispiro[hromen-2,4,-piperidin]-4{3H)-on, MS(ACPI)m/ z419 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.68 minuta

Pr. L12: 6-hloro-l'-[(23-dimetil-lH-indol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z423 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.88 minuta

Pr. LI3: 6,7-dimetil-14(2-okso-2,3-dihidro-1 H-indol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z405 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.45 minuta

Pr. L14:l'-(lH-indol-4-ilkarbonil)-6,7-dimetilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on so trifluoroacetatne kiseline, MS(ACPI)m/ z389 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.7771 minuta

Pr. LI5: 6,7-dimetil-14(l-metil-lH-indol-4-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z403 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.88 minuta

Pr. L16: 5-metoksi-1! '-(2,3,4,9-tetrahidro-lH-karbazol-6-ilkarbonil)spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z445 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.7 minuta

Pr. L17:l'-( 1 H-benzimidazol-4-ilkarbonil)-6,7-dimetilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on so trifluoroacetatne kiseline, MS(ACPI)m/ z390 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.24 minuta

Pr. L18:1'-(1 H-benzimidazol-4-ilkarbonil)-6-hloro-7-metilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z410 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.2 minuta,<*>H NMR (DMSO-d6) 8 8.61 (s, IH), 7.72 (d, J-8.3, IH), 7.64 (s, IH), 7.34 (t, J=7.8, IH), 7.29 (d, J=7.3, IH), 7.16 (s, IH), 2.86 (s, 2H), 2.35 (s, 3H).

Pr. L19: 6,7-dimetil-r-[(2-metil-lH-benzimidazol-4-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on so trifluoroacetatne kiseline, MS(ACPI)m/ z404 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.28 minuta

Pr. L20: r-{[2-(hidroksimetil)-lH-benzimidazol-6-il]karbonil}-6,7-dimetilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on so trifluoroacetatne kiseline, MS(ACPI)m/ z 420(M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.17 minuta

Pr. L21:1'-[(1 -izopropil-1 H-benzimidazol-4-il)karbonil] -6,7-dimetilspiro[hromen-2,4-piperidin]-4(3H)-on so trifluoroacetatne kiseline, MS(ACPI)m/ z432 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.38 minuta

Pr. L22:r-(lH-benzimidazol-5-ilkarbonil)-6,7-dimetilspiro[hromen-2,4'-piperidin^ 4(3H)-on so trifluoroacetatne kiseline, MS(ACPI)m/ z390 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.17 minuta

Pr. L23: 6,7-dimetil-14(1 -metil-1 H-benzimidazol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on so trifluoroacetatne kiseline, MS(ACPI)m/ z404 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.21 minuta

Pr. L24: 6,7-dimetil-14(2-metil-1 H-benzimidazol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,41-piperidin]-4(3H)-on so trifluoroacetatne kiseline, MS(ACPI)m/ z404 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.18 minuta

Pr. L25: 6,7-dimetil-14[2-(trifluorometil)-lH-benzimidazol-5-il]karbonil}spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on so trifluoroacetatne kiseline, MS(ACPI)m/ z458 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.68.minuta

Pr. L26: 6,7-dimetil-r-[(2-piridin-2-il-lH-benzimidazol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on so trifluoroacetatne kiseline, MS(ACPI)m/ z467 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.47 minuta

Pr. L27:1'- [(4-hloro-7-metoksi-2-metil-1 H-benzimidazol-6-il)karbonil] -6,7-dimetilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z 474(M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.45 minuta.

Pr. L28: 1 '-[(1,2-dimetil-lH-benzimidazol-5-il)karbonil]-6,7-dimetilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z344, HPLC vreme retencije 1.21 minuta

Pr. L29: 6,7-dimetil-14(1 -metil-2-pirolidin-1 -il-1 H-benzimidazol-5 - il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z473 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.33 minuta

Pr. L30: 1'- {[2-etil-1 -(3 -metoksifenil)-1 H-benzimidazol-5-iljkarbonil} spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z496 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.4 minuta

Pr. L31:1 '-{[2-etil-l-(3-metoksifenil)-lH-benzimidazol-5-il]karbonil}-5-metoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z526 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.1 minut

Pr. L32: 6,7-dimetil-1'-[(1 -metil-2-okso-2,3-dihidro-1 H-benzimidazol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z420 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.46 minuta

Pr. L33:1 '-(lH-benzimidazol-6-ilkarbonil)-6,7-dimetilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z390 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.16 minuta

Pr. L34:1 '-(1 H-benzimidazol-5-ilkarboiul)-6-hlorospiro[hromen-2,4'-piperidin]-4( MS(ACPI)m/ z396 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.13 minuta

Pr. L35: 5-metoksi-l '-[(2-fenil-lH-benzimidazol-6-il)-karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI) m/z 468 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.12

Pr. L36: 6,7-dimetil-l '-[(2-piridin-4-il-lH-benzimidazol-6-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on so trifluoroacetatne kiseline, MS(ACPI)m/ z467 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.30 minuta

Pr. L37:l '-(lH-l,2,3-benzotriazol-5-ilkarbonil)-6,7-dimetilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z391 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.57 minuta

Pr. L38:l,-(lH-l,2,3-benzotriazol-5-ilkarbonil)-6-hlorospiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z397 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.47 minuta

Pr. L39:l '-(lH-l,2,3-benzotriazol-5-ilkarbonil)-6,7-dimetilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on so trifluoroacetatne kiseline, MS(ACPI)m/ z391 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.46 minuta

Pr. L40:1 '-(1H-1,2,3-benzotriazol-5-ilkarbonil)-6-hloro-7-metilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, !H NMR (DMSO-d6) 6 8.11 (s, IH), 7.83 (s, IH), 7.64 (s, IH), 7.16 (s, IH), 2.87 (s, 2H), 2.35 (s, 3H); MS(ACPI)m/ z411 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.4 minuta

Pr. L41: 6,7-dimetil-l'-[(l-metil-lH-l,2,3-benzotriazol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]- 4(3H)-on, MS(ACPI) m/z 405 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.53 minuta

Pr. L42: 6-hloro-1'-[(1 -izopropil-1H-1,2,3-benzotriazol-5-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z439 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.72 minuta

Pr. L43: 6,7-dimetil-r-(kvinolin-6-ilkarbonil)spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on so trifluoroacetatne kiseline, MS(ACPI)m/ z401 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.38 minuta

Pr. L44: 6,7-dimetil-l'-[(2-okso-l,2,3,4-tetrahidrokvinolin-6-il)karbonil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z419 (M+H)<+>, HPLC 1.49 minuta

Pr. L45::6,7-dimetil-r-(kvinoksalin-6-ilkarbonil)spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z402 (M+H)<+>HPLC 1.53 minuta

Pr. L46: 1 '-(l,3-benzoksazol-5-ilkarbonil)-6-hloro-7-metilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI) m/z (M+H)+ 411.<l>H NMR (CDC13) 5 8.74 (s, IH), 8.26 (s, IH), 7.84 (s, IH), 7.70 (s, IH), 6.99-7.01 (m, IH), 6.94 (s, IH), 6.79-6.81 (d, IH), 2.74 (s, 2H), 2.41 (s, 3H)

Primeri M1-M36

Pr. Ml: 5-metoksi-7-metil-r-[3-(lH-pirazol-3-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4{3H)-on, MS(ACPI)m/ z432 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.1 minut

Pr. M2: 6,7-dimetil-1'-[3-(1 H-pirazol-3-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI) m/z 416 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.5 minuta

Pr. M3: 6-hloro-7-metil-l'-[3-(lH-pirazol-3-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z436 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.58 minuta

Pr. M4: N-metil-4-okso-l '-[3-(lH-pirazol-3-il)benzoil]-3,4-dihidrospiro[hromen-2,4'-piperidin]-6-karboksamid, MS(ACPI)m/ z445 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.7 minuta

Pr. M5: 4-okso-l 43 (lH-pirazol-3-il)benzoil]-3,4-dihidrospiro[hromen-2,4'-piperidin]-6-karboksamid, MS(ACPI)m/ z431 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.6 minuta

Pr. M6: 6-metoksi-1'-[3 -(1 H-pirazol-3-il)benzoil] spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3 H)-on, MS(ACPm/ z418 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.2 minuta

Pr. M7: 7-hloro-6-metil-1'- [3-(1 H-pirazol-3 -il)benzoil] spiro[hromen-2,4'-piperidin] - 4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z436 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.59 minuta

Pr. M8: 6,7-dihloro-l'-[3-(lH-pirazol-3-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z456 (M+H)<+>, HPLC RT2.6 minuta,<*>H NMR (CDC13) 8 7.95 (s, IH), 7.87 (s,

IH), 7.85 (s, IH), 7.69 (d, J=2.6, IH), 7.49 (t, J=7.8, IH), 7.38 (d, J=7.8, IH), 7.21 (s, IH), 6.68 (d, J=2.6, IH), 2.77 (s 2H)

Pr. M9: r43-(lH-pirazol-3-il)benzoil]-6-(pirolidin-l-ilkarbonil)spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H) on, MS(ACPI)m/ z485 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.9 minuta

Pr. MIO: 6-bromo-7-metil-l '-[3-(lH-pirazol-3-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z480 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.6 minuta

Pr. Mll: metil 4-okso-r-[3-(lH-pirazol-3-il)benzoil]-3,4-dihidrospiro[hromen-2,4'-piperidin]-6-karboksilat, MS(ACPI)m/ z446 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.3 minuta

Pr. M12: 7-metil-1'-[3-( 1 H-pirazol-3-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI]m/ z402 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.4 minuta

Pr. M13: 1 '-[3-(lH-pirazol-3-il)benzoil]-6-(trifluorometoksi)spiro[hromen-2,4,-piperidin]-4(3H)-on. MS(ACPI)m/ z472 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.6 minuta, 'H NMR (CDC13) 5 8.03 (s, IH), 7.92 (s, IH), 7.89 (d, J=7.8, IH), 7.80 (m, IH), 7.73-7.74 (m, IH), 7.49-7.55 (m, IH), 7.43-7.44 (m, IH), 7.38-7.39 (m, IH), 7.07 (d, J-9.4, IH), 6.72 (br s, IH), 2.81 (s, 2H)

Pr. M14: 5-fluoro-6-metoksi-1'-[3 -(1 H-pirazol-3-il)benzoil]spiro [hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z436.(M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.2 minuta

Pr. M15: 7-hloro-1'-[3-( 1 H-pirazol-3-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z422 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.5 minuta,<!>H NMR (CDC13) 5 7.84-7.85 (m, 3H), 7.82 (d, J=8.8, IH), 7.50 (t, J=7.8, IH), 7.41 (d, J=7.8, IH), 7.01-7.08 (m, 2H), 6.70 (s, IH), 2.80 (2, 2H)

Pr. M16: 5,7-dihloro-1'-[3-(1 H-pirazol-3-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z456 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije [2.6] minuta

Pr. M17: N-izopropil-4-okso-1'-[3-( 1 H-pirazol-3-il)benzoil]-3,4-dihidrospiro[hromen-2,4'-piperidin]-6-karboksamid, MS(ACPI)m/ z473 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.0 minuta

Pr. M18: 6-hloro-5-metoksi-1'-[3-(1 H-pirazol-3-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z452.(M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.3 minuta

Pr. M19:1 '-[3-(lH-pirazol-3-il)benzoil]-6-(trifluorometil)spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z456 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.6 minuta,<*>H NMR (CDC13) 5 8.18 (d, J=2:0, IH), 7.85-7.87 (m, 2H), 7.75-7.77 (m, IH), 7.65-7.66 (m, IH), 7.47-7.50 (m, IH), 7.37-7.39 (m, IH), 7.15 (d, J=8.3, IH), 6.66 (d, J-2.6, IH), 2.82 (s, 2H)

Pr. M20: 6-(metilsulfonil)- r-[3-(lH-pirazol-3-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z456 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.7 minuta,<*>H NMR (CD3OD) 5 8.37 (d, J=2.1, IH), 8.10 (dd, 1=2. 6, 8.8,1H), 7.88 (br s, 2H), 7.73 (br s, IH), 7.53 (br s, IH), 7.34 (d, J=8.8, IH), 6.75 (s, IH), 5.51 (s, IH), 3.32(s, 3H), 3.13 (s, 2H)

Pr. M21: 5,6,7-trimetoksi-1'-[3 -(1 H-pirazol-3-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin] - 4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z478 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.1 minut

Ex M22: 6-hloro-5,7-dimetil-l '-[3-(lH-pirazol-3-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z450 (M+H)<+>HPLC vreme retencije 2.85 minuta

Pr. M23: 6-metil-l'-[3-(lH-pirazol-3-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z402 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije [2.4] minuta

Pr. M24: 6-hloro-7-fluoro-r-[3-(lH-pirazol-3-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z440 (M+H)<+>, HPLC RT2.6 minuta, 'H NMR (CDC13) 5 7.94-7.97 (m, IH), 7.84-7.85 (m, 2H), 7.69 (d, J=2.1, IH), 7.50 (t, J=7.8, IH), 7.40 (d, J=7.2, IH), 6.84 (d, J=9.3, IH), 6.69 (d, J=2.1, IH), 2.77 (s, 2H)

Pr. M25: 7-metoksi-r-[3-(lH-pirazol-3-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z 418.(M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.25 minuta

Pr. M26: 5-metoksi-l'-[3-(lH-pirazol-3-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z430 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.6 minuta

Pr. M27: 5-metoksi-r-[3-(lH-pirazol-3-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z418 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.0 minuta

Pr. M28:r-(lH-lndazol-7-ilkarbonil)-6-metoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z413 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.3 minuta, 'H NMR (CDC13) 5 7.97 (d, J=7.8, IH), 7.94 (m, IH), 7.89 (d, J=7.7, IH), 7.81 (d, J=2.6, IH), 7.53 (t, J=7.8, IH), 7.44 (d, J=7.8, IH), 7.38 (s, IH), 7.30 (d, J=6.7, IH), 6.72 (d, J=2.0, IH), 2.86 (s, 2H)

Pr. M29: N,N-dimetil-4-okso-143-(1 H-pirazol-3-il)benzoil]-3,4-dihidrospiro[hromen-2,4<*->piperidin]-6-karboksamid, MS(ACPI)m/ z459 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.9 minuta

Pr. M30: 6-hloro-l'-[3-(lH-pirazol-3-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z422.(M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.4 minuta

Pr. M31: 6,7-Dimetoksi-r-[3-(lH-pirazol-3-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z448 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.3 minuta

Pr. M32: 6-(morfolin-4-ilkarbonil)-l '-[3-(lH-pirazol-3-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z501 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.9 minuta

Pr. M33:4-okso-l '-[3-(lH-pirazol-3-il)benzoil]-3 4-dihidrospiro[hromen-2,4'-piperidin]-6-karbonitril, MS(ACPI)m/ z413 (M+H)<+>, HPLC RT2.2 minuta,<*>H NMR (CDC13) 5 8,21 (d,

J=2.1,1H), 7.90 (s, IH), 7.87 (d, J=7.8, IH), 7.76 (dd, J=8.3, 2.0, IH), 7.72 (d, J=2.6, IH), 7.50 (t, J=7.7, IH), 7.40 (d, J=7.3, IH), 7.15 (d, J=8.3, IH), 6.69 (d, J=2.0, IH), 2.84 (s, 2H)

Pr. M34: 7-Fluoro-l ,43-(lH-pirazol-3-il)ber^oil]spiro[hromen-2,4l-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z406 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.25 minuta

Pr. M35: 6,8-dihloro-l'-[3-(lH-pirazol-3-il)ber^oil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPi)m/ z456.(M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.6 minuta

Pr. M36: 7-hloro-6-fluoro-r-[3-(lH-pirazol-3-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z440 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.5 minuta,<l>H NMR (CDC13) 8 7.86-7.88 (m, 2H), 7.70 (d, J=2.1, IH), 7.62 (d, J=8.3, IH), 7.49 (t, J=7.8, IH), 7.39 (d, J=7.8, IH), 7.14 (d, J-5.7, IH), 2.77 (s, 2H)

Primeri NI- N3

Pr. NI: 4-okso-l '-[3-(lH-pirazol-3-il)benzoil]-3,4-dihidrospiro[hromen-2,4'-piperidin]-6-karboksilna kiselina so trifluoroacetatne kiseline

Pr. N2: 6-etoksi-l,-[3-(lH-pirazol-3-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, 'H NMR (CDC13) 5 7.87 (s, IH), 7.85 (s, IH), 7.67-7.68 (d, IH), 7.46-7.49 (m, IH), 7.37-7.39 (d, IH), 7.30 (m, IH), 7.12-7.14 (dd, IH), 6.94-6.96 (d, IH), 6.66-6.67 (d, IH), 4.01-4.05 (q, 2H), 2.74-2.75 (m, 2H), 1.40-1.43 (t, 3H)

Pr. N3: 6-izopropoksi-l,43-(lH-pirazol-3-il)benzoil]s<p>iro[ru-omen-2,4<l->piperidin]-4(3H)-on,<l>HNMR (CDC13) 5 7.87 (s, IH), 7.85 (s, IH), 7.67 (m, IH), 7.46-7.49 (m, IH), 7.37-7.39 (m, IH), 7.31-7.32 (d, IH), 7.09-7.11 (dd, IH), 6.93-6.95 (d, IH), 6.66-6.67 (m, IH), 4.49-4.55 (q, IH), 2.74-2.75 (m, 2H), 1.32-1.33 (d, 6H)

Primeri 01- 04

Pr. 01: r-[3-(lH-pirazol-5-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on

Pr. 02: 5-hloro-7-metoksi-l '-[3-(lH-pirazol-5-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on,<*>H NMR (CDC13) 8 7.87 (s, IH), 7.84-7.85 (d, IH), 7.63-7.64 (d, IH), 7.44-7.47 (m, IH), 7.34-7.36 (m, IH), 6.66-6.67 (d, IH), 6.63-6.64 (d, Ih), 6.53 (m, IH), 3.91 (s, 3H), 2.71-2.72 (m, 2h)

Pr. 03: 7-hloro-5-metoksi-l '-[3-(lH-pirazol-5-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, 'HNMR(CDC13)S7.88 (s, IH), 7.84-7.85 (d, IH), 7.63-7.64 (m, IH), 7.44-7.48 (m, IH), 7.35-7.36 (m, IH), 6.63 (m, 2H), 6.42-6.43 (m, IH), 3.85 (s, 3H), 2.72-2.73 (m, IH)

Pr. 04: 7-metoksi-5-metil-l '-[3-(lH-pirazol-5-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, 'H NMR (CDC13) 8 7.84-7.87 (m, 2H), 7.64-7.65 (d, IH), 7.45-7.48 (m, IH), 7.36-7.38 (d, IH), 6.65 (d, IH), 6.35-6.37 (d, IH), 3.84 (s, 2H), 2.69-2.70 (m, IH), 2.61 (s, 3H)

Primeri Pl- P 15

Pr. Pl: Koristeći postupak F, 6,7-dimetil4'-{345-(trifluorometil)-lH-pirazol-3-il]benzoil}spiro-[hromen-2,4'- piperidin]-4(3H)-on se i2xađuje kako sledi. U posudu se doda 3-[5-trifluorometil)-lH-pirazol-3-il]benzoatna kiselina (84.5 mg, 0.33 mmol) i tionil hlorid (357 mg, 3.0 mmol) i mešavina se zagreva 1 sat na 60° C. Reaktivna mešavina se koncentruje i aazeotropira sa toluenom (3x), a ostatak suši pod sniženim pritiskom. 6,7-Dimetilspiro[hromen-2,4 -piperidin]-4(3H)-on (73.6 mg, 0.3 mmol) se rastvori u CH2C12(1 mL) i DIEA (85 mg, 0.12 mL, 0.66 mmol). Ovaj rastvor se doda u rastvor kiselog hlorida u CH2C12(do konačne koncentracije 1 M). Dobijena mešavina se meša u toku noći na sobnoj temperaturi. Materijal se prečisti tečnom hromatografijom (Biotage Flash 40, 98:2 CH2Cl2/MeOH) da se dobije naslovljeni materijal (96 mg, 70%), MS(ACPI) m/z 484 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.9 minuta,<*>H NMR (CDC13) 5 7.69 (s, IH), 7.59 (s, IH), 7.54 (d, 3=7A, IH), 7.35-7.39 (m., IH), 7.29-7.31 (m, 1H)„ 6.78 (s, IH), 6.70 (s, IH), 2.68 (s, 2H), 2.26 (s, 3H), 2.20 (s, 3H).

Pr. P2: 6-hloro-7-metil-l '-{3-[5-(trifluorometil)-lH-pirazol-3-il]benzoil}spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on so trifluoroacetatne kiseline, MS(ACPI)m/ z504 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 3.0 minuta

Pr. P3:l'-[2-hloro-5-(l-metil-lH-pirazol-3-il)benzoil]-6,7-dimetilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z464 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.88 minuta

Pr. P4:r-[2-fluoro-5-(lH-pirazol-3-il)benzoil]-6,7-dimetilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on. so trifluoroacetatne kiseline, MS(ACPI)m/ z434 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.71 minuta

Pr. P5: l'-[2-hloro-5-(lH-pirazol-3-il)benzoil]-6,7-dimetilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on so trifluoroacetatne kiseline, MS(ACPI)m/ z450 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.76 minuta

Pr. P6: 1 '-[2-hidroksi-5-(lH-pirazol-3-il)benzoil]-6,7-dimetilspiro[hromen-2,4<r->piperidin]-4(3H)-on so trifluoroacetatne kiseline, MS(ACPI)m/ z432 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.48 minuta

Pr. P7: r-[2-etoksi-5-(lH-pirazol-3-il)benzoil]-6,7-dimetilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on so trifluoroacetatne kiseline, MS(ACPI)m/ z460 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.73 minuta

Pr. P8: r-t2-etoksi-5-(lH-pirazol-3-il)benzoil]-6,7-dimetilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z460 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.6 minuta

Pr. P9: 6-hloro-r-[2-etoksi-5-(lH-pirazol-3-il)benzoil]-7-metilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z480 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 2.8 minuta

Pr. P10: T- [2-hloro-5-(1 -metil-1 H-pirazol-5-il)benzoil]-6,7-dimetilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z464 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.83minuta

Pr. Pl 1: 6,7-Dimetil-l'-[3-(lH-pirazol-l-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z416 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.78 minuta

Pr. P12: l'-[3-(lH-imidazol-2-il)benzoil]-6,7-dimetilspiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on so trifluoroacetatne kiseline, MS(ACPI)m/ z416 (M+H)<+>416, HPLC vreme retencije 1.26

Pr. P13: 6,7-Dimetil-r-[3-(pirimidin-4-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z428 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.64 minuta

Pr. P14: 6,7-Dimetil-1 '-t3-(5-metil-1,2,4-oksadiazol-3-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]- 4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z432 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.82 minuta

Pr. P15: 6,7-Dimetil-l'-[3-(5-etil-1,2,4-oksadiazol-3-il)benzoil]spiro[hromen-2,4<*->piperidin]-4(3H)-on, MS(ACPI)m/ z446 (M+H)<+>, HPLC vreme retencije 1.95 minuta

Biološki protokoli

Vrednost jedinjenja Formule (I) i farmaceutski prihvatljivih soli jedinjenja u tretmanu oboljenja (kao što su ovde detaljno opisana oboljenja) kod životinja, posebno sisara (na primer, ljudi), može da se pokaže njihovom aktivnošću u uobičajenim ispitivanjima koja su poznata stručnjaku sa uobičajenim iskustvom u relevantnoj tehnici, uključujući niže opisanain vitroiin vivoispitivanja. Ova ispitivanja takođe obezbeđuju načine kojima aktivnosti jedinjenja Formule (I) mogu da se uporede sa aktivnostima drugih poznatih jedinjenja.

Naredni protokoli mogu, naravno, da se menjaju od strane stručnjaka sa iskustvom u tehnici.

Direktna inhibicija aktivnosti ACC1 i ACC2

ACC inhibitorna aktivnost jedinjenja Formule (I) iz ovog pronalaska i soli ovih jedinjenja, je pokazana postupcima na bazi standardnih procedura. Na primer, direktna inhibicija aktivnosti ACC1 i ACC2 za jedinjenja Formule (I) se određuje pomoću izrade ACC1 iz jetre pacova i ACC2 iz skeletnih mišića pacova.

[1] Izrada ACC1 i ACC2. ACC1 se dobija iz jetre pacova, a ACC2 se dobija iz skeletnih mišića pacova na bazi standardnih procedura kao što su one koje su opisali Thampy i Wakil (J. Biol. Chem. 260: 6318-6323; 1985) koristeći sledeći postupak.

Mužjaci CD pacova težine 150-200 g se izgladnjuju 2 dana a nakon toga im se 3 dana daje hrana sa visokim sadržajem saharoze (A1N-76A hrana za glodare; Cat # D10001, Research

Diets Inc., New Brunswick, N.J.), nakon čega se žrtvuju asfiksacijom sa CO2. Jetre (za izradu ACC1) ili tkivo skeletnih mišića (za izradu ACC2) se uklone, isperu u ledeno hladnom puferu fosfatnih soli (PBS) i homogenizuju u 5 zapremina pufera za homogenizaciju (50 mM kalijum fosfat, pH 7.5, 10 mM EDTA, 10 mM 2-merkaptoetanol, 2 mM benzamidin, 0.2 mM fenilmetilsulfonilfiuorid (PMSF), 5 mg/L svakog od leupeptina, aprotinina i antitripsina) u Waring® blenderu na 4 °C, u toku 1 minut. Sve dalje operacije se izvode na 4 °C. Izradi se homogenat u koncentraciji od 3% sa polietilen glikolom -(PEG) dodavanjem 50% rastvora PEG-a i centrifugiranjem 15 minuta na 20,000 x g. Dobijeni supernatant se podesi na 5% PEG dodavanjem 50% rastvora PEG-a i meša 5 minuta. Peleta (sadrži aktivne ACC) se sakupi centrifugiranjem 20 minuta na 20,000 x g, ispere sa ledeno hladnom vodom za injekcije da se ukloni višak PEG-a i re-suspenduje u jednu četvrtinu originalne zapremine homogenata sa puferom za homogeniziaciju. Amonijum sulfat (200 g/litar) se polako dodaje uz mešanje. Nakon 45 minuta, enzim se sakupi centrifugiranjem 30 minuta na 20,000 x g, re-suspenduje u 10 ml 50 mM HEPES-a, pH7.5, 0.1 mM DTT, 1.0 mM EDTA i 10% glicerolu i eliminišu soli na Sephadex™ G-25 koloni (2.5 cm x 50 cm) (Pharmacia, Piscataway New Jersey sada GE Healthcare) i uravnoteži sa istim puferom. Preparat enzima iz koga su eliminisane soli se čuva u alikvotama na -70 °C. Neposredno pre upotrebe, zamrznute ACC1 ili ACC2 alikvote se otope, razblaže do 500 ug/ml u puferu koji sadrži 50 mM HEPES, pH7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM trikalijum citrat, 2.0 mM ditiotreitol (DTT) i 0.75 mg/ml albumina seruma govečeta bez masne kiseline (BSA) i pre-inkubira 30 minuta na 37 °C.

[2] Merenje ACC inhibicije. Procedure za merenje inhibicije ACC1 i inhibicije ACC2 su identične, izuzev izvora izozima. Za merenje aktivnosti ACC i procenu inhibicije ACC, test jedinjenja se rastvore u dimetilsulfoksidu (DMSO) i alikvote od po 1 uL se prenesu u polipropilenske kivete zapremine 0.5 ml. Kontrolne kivete sadrže samo 1 uL DMSO. Kivete se inkubiraju na 37 °C u vodenom kupatilu na konstantnoj temperaturi. U svaku kivetu za analizu se doda po 139 uL substrata pufera koji sadrži 50 mM HEPES, pH7.5, 2.0 mM MgCl22.0 mM trikalijum citrat, 2 mM DTT, 0.75 mg/ml BSA, 25 uM acetil-CoA, 4.0 mM ATP i 12.5 mM KH[<14>C]03(2 xl06 cpm). Nakon toga se reakcija započinje dodavanjem 10 uL pre-inkubirane ACC frakcije izrađene kako je prethodno opisano. Nakon 7 minuta, reakcija se prekida dodavanjem 50 uL 6N rastvora HC1 i 150 uL alikvota reaktivne mešavine se prenese u staklene posude za scintilaciju i upare do sušenja na 90 °C u toku najmanje 1 sat. Suve posude se nakon toga ohlade, doda se 0.5 ml vode i 5.5 ml Ready Safe tečnog fluida za scintilaciju (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA), i određuje se radioaktivnost pomoću brojača scintilacije tečnosti. Kivete u koje je dodata HC1 pre dodavanja ACC služe kao slepe probe.

[3] Specifičnosti za ACC1 u odnosu na ACC2 inhibiciju. Specifičnost jedinjenja za inhibiciju ACC1 u odnosu na ACC2 može da se odredi upoređivanjem koncentracije test jedinjenja koja je potrebna da inhibira 50% aktivnosti koja se nalazi u alikvotu ACC1 u poređenju sa koncentracijom istog jedinjenja potrebne da inhibira 50% aktivnosti alikvote ACC2.

Merenje ACC inhibicije u ćelijama kulture

ACC inhibitoraa aktivnost jedinjenja iz ovog pronalaska i soli ovih jedinjenja, je potvrđena u kulturi humanih ćelija koristeći postupke na bazi standardnih procedura. Na primer, pošto ACC katalizuju prvu uključenu fazu u biosintezi masnih kiselina,in vivoaktivnost izvesnih jedinjenja Formule (I) je potvrđena merenjem sposobnosti jedinjenja, i soli tih jedinjenja, da spreče formiranje radio-obeleženih masnih kiselina od radio-obeleženog acetata u kultivisanim hepatocitima sisara ili u odgajanim humanim hepatoma ćelijama Hep-G2 ćelijske linije (ATCC HB 8065). Direktna procena produkcije malonil-CoA u ćelijama izolovanim iz tkiva koje sintetizuju (na primer jetra i adipozno tkivo) ili ne sintetizuju masne kiseline (na primer skeletni mišići) može takođe da se koristi za određivanje ACC inhibicije u ćelijama izolovanim iz ovih tkiva.

[1] Merenje inhibicije sinteze masnih kiselina u kultivisanim ćelijama. Sinteza masnih kiselina se ispituje u odgajanim hepatocitima sisara ili u humanim hepatoma ćelijama Hep-G2 ćelijske linije merenjem inkorporiranja [2-<14>C]acetata u lipide koji mogu da se saponifikuju u osnovi kako je prethodno opisano za procenu sinteze sterola (Harvvood i saradnici Biochem. Pharmacol. 53: 839-864,1997; Petras i saradnici J. Lipid Res. 40: 24-38,1999) uz sledeće modifikacije koje omogućavaju procenu sinteze masnih kiselina. Na primer, Hep-G2 ćelije odgajane u T-75 posudama i oslobođene tretmanom sa tripsinom, kako je prethodno opisano (Harvvood i saradnici Biochem. Pharmacol. 53: 839-864,1997; Petras i saradnici J. Lipid Res. 40: 24-38, 1999), se zaseju u ploče sa 24 otvora u gustini od 1.2xl0<5>ćelija/otvor i održavaju u 1.0 mL Supplemented Dulbecco's minimal essential media (DMEM) medijumu (DMEM medijum koji sadrži 10% seruma fetusa govečeta inaktiviranog toplotom, 2 mM L-glutamina, 40 ug/mL gentamicina) u toku 7 dana na 37 °C, u inkubatoru sa 5% CO2 i uz promenu medijuma 3. i 5. dana. Za ovo vreme, kulture dostižu 80-90% upliva i održavaju >90% životne sposobnosti ćelija (bojenje sa Trvpan plavim). 8-og dana, medijum se ukloni i zameni sa svežim medijum koji sadrži 1% DMSO + test jedinjenje. Neposredno nakon dodavanja jedinjenja, u svaki inkubirani otvor se doda po 25 uL medijuma koji sadrži 4 uCi [2-<14>C]acetata (56 mCi/mmol). Ploče se nakon toga zatvore sa parafilmom da se spreči evaporacija, i ćelije se inkubiraju 6 sati na 37 °C uz blago mućkanje. Nakon inkubacije, uzorci se saponifikuju dodavanjem 1 ml 5 N KOH u MeOH, u svaki otvor, nakon toga se prvo inkubiraju 2 sata na 70 °C, a nakon toga se inkubiraju u toku noći na sobnoj temperaturi. Mešavine se prenesu u staklene konusne epruvete i ekstreahuju tri puta sa po 4.5 ml heksana da se uklone ne-saponifikovani lipidi (na primer holesterol, post-skvalen prekursorsi holesterola i drugi lipidi koji ne podležu saponifikaciji). Preostala vodena faza (koja sadrži natrijumove soli masne kiseline) se zakiseli do pH<2 dodvanjem 0.5 ml 12 M rastvora HC1. Dobijene mešavine se prenesu u staklene konusne epruvete i ekstrahuju tri puta sa po 4.5 ml heksana. Odvojene organske frakcije (koje sadrže protonizirane masne kiseline) se suše u atmosferi azota, re-suspenduju u 50 uL mešavine hloroform:metanol::l:l(v/v) i nanesu u kanale veličine 1x20 cm Silica Gel 60C TLC ploče. Kanali koji sadrži ne-radioaktivne masne kiseline su uključeni na posebno označenim selektovanim TLC pločama. TLC ploče se razvijaju u mešavini heksamdietil etar:acetatna kiselina (70:30:2), suše na vazduhu i vizuelizuju za radioaktivne masne kiseline ispitivanjem pomoću Berthold Linear Radioactivitv Analvzer (Berthold, Gaithersburg, Md., USA) koji beleži položaj radioaktivnog pika i integrisanu oblast pika. Inhibicija sinteze masnih kiselina pomoću test jedinjenja može da se izrazi kao koncentracija koja je potrebna da smanji za 50% dpm [2-<14>C]acetat inkorporiran u lipide koji se saponifikuju u toku 6 sati inkubacije na 37 °C.

[2] Merenje inhibicije produkcije malonil-CoA u uzgajanim ćelijama. Direktna procena produkcije malonil-CoA u ćelijama izdvojenim iz tkiva koje ili sintetišu (na primer jetra i adipozno tkivo) ili ne sintetišu masne kiseline (na primer skeletni mišići), preko njihove stehiometrijske konverzije u radio-obeleženi palmitat u prisustvu prečišćene sintetaze masne kiseline i radio-obeleženog acetata, može takođe da se koristi za određivanje inhibicije ACC u ćelijama izolovanim iz ovih tkiva, kako je prethodno opisano (McGarrv i saradnici. J. Biol. Chem. 253: 8291-8293,1978). Stručnjak se iskustvom u tehnici može lako da prilagodi proceduru koja se odnosi na ukupna tkiva, kako je navedeno u daljem tekstu, na uzgajane ćelije.

in vivoProcena akutne ACC inhibicije na eksperimentalnim životinjama

ACC inhibitorna aktivnost jedinjenja iz ovog pronalaska i soli ovih jedinjenja, može da se potvrdiin vivoprocenom njihove sposobnosti da inhibiraju produkciju hepatične masne kiseline i da stimulišu oksidaciju masnih kiselina celog organizma postupcima na bazi standardnih procedura. Na primer, kako ACC katalizuje prvu završenu fazu u biosintezi masnih kiselina,in vivoaktivnost ovih jedinjenja može da se potvrdi merenjem sposobnosti jedinjenja iz ovog pronalaska i soli ovakvih jedinjenja, da spreče formiranje radio obeleženih masnih kiselina iz radio obeleženog acetata u jetrama tretiranih životinja.

Direktna procena produkcije radio obeleženog malonil-CoA iz radio obeleženog acetata u tkivima koja ili sintetišu (na primer jetra i adipozno tkivo) ili ne sintetišu masne kiseline (na primer skeletni mišići) može takođe da se koristi za odredivanaje CC inhibicije u ovim tkivima. Mada smanjene vrednosti malonil-CoA kao posledice ACC inhibicije, ublažavaju povratnu inhibiciju karnitin-palmitoil transferaze 1 (CPT1) posredstvom malonil-CoA, enzima koji katalizuje brzinu koja ograničava reakciju oksidacije u masnim kiselinama mitohondrija,in vivoaktivnost jedinjenja iz ovog pronalaska i soli ovih jedinjenja, može da bude potvrđena merenjem njihove sposobnosti da povećaju iskorišćavanje masnih kiselina kao izvora energije, što se procenjuje redukcijom respiratornog količnika kod tretiranih životinja

[1] Merenje inhibicije sinteze masnih kiselina kod eksperimentalnih životinja. Inkorporiranje [2-<14>C]acetata u lipide u jetri sisara koji mogu da se saponifikuju (na primer CD1 miševi, C57BI/6J-ob/ob miševi, Sprague Dawley pacovi (raspoloživi od Charles River Boston, Mass. ili Jackson Labs Bar Harbor, Me.)) mogu u osnovi da se mere kako je prethodno opisano za procenu sinteze hepatičnog sterola (Hanvood i saradnici, Biochem. Pharmacol, 40: 1281-1293, 1990; Harvvood i saradnici Biochem. Pharmacol. 53: 839-864,1997) sa sledećim modifikacijama koje omogućavaju procenu sinteza masnih kiselina. Na primer, Sprague Dawley pacovima se oralno daje po 0.1 ml po 40 g telesne težine određena količina vehikuluma (na primer voda ili 0.5% metilceluloza u vodi) ± test jedinjenje. Jedan do četiri sata nakon primene jedinjenja, životinjama se intraperitonealnom injekcijom da 0.5 ml [2-<14>C]acetata (64 uCi/ml; 57 mCi/mmol). Jedan sat nakon primene radio obeleženog reagensa, životinje se žrtvuju asfiksijom sa CO2i dva uzorka jetre od po 0.75 g se izdvoje i saponifikuju na 70 uC u toku 120 minuta u 1.5 ml 2.5 M rastvora NaOH. Nakon saponifikacije, u svaki uzorak se doda po 2.5 ml apsolutnog EtOH, rastvori se izmešaju i ostave da stoje u toku noći. Nakon toga se u svaki uzorak doda po 4.8 ml petrol etra i mešavine se prvo intenzivno mućkaju 2 minuta, a nakon toga centrifugiraju na 1000 x g u Sorvall® aparatu u toku 5 minuta. Dobijeni slojevi petrol etra, koji sadrže nesaponifikovane lipide (na primer holesterol, post-skvalen prekursor holesterola i drugi lipidi koji se ne-saponifikuju) se uklone i odbace. Preostalai vodeni sloj (koji sadrži natrijumove soli masnih kiselina) se zakiseli do pH<2 dodavanjem 0.6 ml 12 M rastvora HC1 i ekstrahuje dva puta sa po 4.8 ml petrol etra. Izdvojene organske frakcije (koje sadrže protonisane masne kiseline) se prenesu u posude za tečnu scintilaciju, suše u atmosferi azota, rastvore u 7 ml Aquasol fluida za tečnu scintilaciju i ispituju na radioaktivnost koristeći brojač tečne scintilacije. Inhibicija sinteze masnih kiselina sa test jedinjenjem se izražava kao koncentracija koja je potrebna za redukciju od 50% dpm [2-<14>C]acetata inkorporiranog u lipide koji se saponifikuju u toku intervala od 1 sat između injektiranja radio obeleženog acetata i asfiksije sa CO2.

Neka jedinjenja iz ovog pronalaska su procenjena na inhibiciju sinteze masnih kiselina kako je prethodno opisano. Kako je niže pokazano, uočeno je da sva ova jedinjenja inhibiraju sinteze masnih kiselinain vivo.

[2] Merenje inhibicije produkcije malonil-CoA na eksperimentalnim životinjama.

Direktna procena produkcije malonil-CoA u tkivima koja ili sintetišu (na primer jetra i adipozno tkivo) ili ne sintetišu masne kiseline (na primer skeletni mišići), preko svoje stehiometrijske konverzije u radio obeleženi palmitat u prisustvu prečišćene sintetaze masnih kiselina i radio obeleženog acetil-CoA može takođe da se koristi za određivanje ACC inhibicije u ovim tkivima, kako je prethodno opisano (McGarrv i saradnici J. Biol. Chem. 253: 8291-8293, 1978). Životinje se tretira sa vehikulumom ± test jedinjenje kako je prethodno opisano u [1] Merenje inhibicije sinteze masnih kiselina kod eksperimentalnih životinja. Ukratko, ispitivanja se izvode u duplikatu u zatvorenim staklenim test kivetama. Reaktivna mešavina sadrži, u 1.025 ml 200 mM pufera kalijum fosfata (pH=7.0), 2.5 mM ditiothreitola, 2.0 mM EDTA, 0.2 mM NADPH, 1 mg/ml albumina iz seruma govečeta bez masnih kiselina, 4.4 uM [3H]acetil-CoA (približno 150,000 dpm/nmol) i odgovarajuće količine malonil-CoA standarda ili ekstrakta test tkiva. Ekstrakti tkiva se izrađuju od tkiva (na primer jetra i skeletni mišići) koji su učvršeni zamrzavanjem u toku 10 sekundi nakon asfikcije sa CO2, prvo usitnjavanjem tkiva pod tečnim azotom a nakon toga ekstrakcijom 1 g praškastog tkiva sa 5 ml 6% (m/v) rastvora HCIO4i neutralisanjem ekstrakta do pH 6.0 sa KOH i centrifugiranjem da se uklone krupniji ostaci. Reakcije se započinju dodavanjem 25 milijedinica (mU) prečišćene sintetaze masnih kiselina. Nakon 45 minuta inkubiranja na 37 °C, reakcije se prekidaju dodavanjem 25 uL 70% (m/v) HCIO4, a nascentni palmitat se nakon toga ekstrahuje dodavanjem u svaku kivetu pol ml EtOH a nakon toga po 5 ml petrol etra. Nakon 30 sekundi intenzivnog mešanja i centrifugiranja da se postigne razdvajanje faza, faza petrol etra se prenese u drugu staklenu kivetu koja sadrži 2 ml vode, mućka, ponovo centrifugira i 2.0 ml faze petrol etra se prenese u posude za tečnu scintilaciju, suše i procenjuju na radioaktivnost u brojaču tečne scintilacije nakon dodavanja 10 ml Aquasol fluida za tečnu scintilaciju (PerkinElmer, Shelton, CT). Slepe probe u kojima se ne nalaze ni malonil-CoA ni ekstrakt jetre su uključene u svaku seriju odoređivanja i oduzimaju se od svih vrednosti. Inhibicija produkcije malonil-CoA test jedinjenjem se izražava kao koncentracija koja je potrebna da za 50% redukuje inkorporiranje dpm [2-<u>C]acetil-CoA u palmitat u toku 45 minuta inkubacije na 37°C.

[3] Merenje stimulacije oksidacije masnih kiselina kod pacova. ACC inhibitorna aktivnost jedinjenja iz ovog pronalaska i soli ovih jedinjenja, može dalje da se potvrdiin vivoispitivanjem sposobnosti inhibicije ACC da poveća iskoristljivost masnih kiselina, koristeći postupke koji se baziraju na standardnim procedurama. Na primer, u toku promene sa oksidacije ugljovodonika na oksidaciju masnih kiselina ili promene od sinteze do oksidacije masnih kiselina, smanjuje se respiratorni koeficient (RQ)=odnos produkcije CO2/utrošak 02. Zbog toga što su masne kiseline mnogo više u redukovanom stanju nego ugljovodonici, (kao što je glukoza), potreban je utrošak mnogo veće količine kiseonika za produkciju svakog C02i stoga imaju niži RQ. Ukoliko životinja unosi samo ugljovodonik, RQ=1.0, a ako životinja unosi samo masne kiseline, RQ=0.7. Prema tome, RQ kod životinja, uključujući ljude i domaće životinje, je indirektna mera tipa energije koja se koristi. Stručnjak sa iskustvom u odgovarajućoj tehnici će često koristiti indirektnu kalorimetriju kod životinja, uključujući ljude, za merenje RQ.

Stručnjak sa iskustvom u tehnici razume da smanjenje RQ i istovremeni prelazak u korišćenju energije od oksidacije ugljovodonika na oksidaciju masti može da smanji depoe masti u organizmu i da bude efikasan u vezi sa tretmanom, na primer, gojaznosti, metaboličkog sindroma i dijabetesa.

Sposobnost jedinjenja iz ovog pronalaska i soli ovih jedinjenja, da generišu smanjenje u RQ odgovoru može da se pokaže u skladu sa sledećim protokolom. Ovajin vivopostupak je osmišljen da proceni efikasnost jedinjenja koja su ACC inhibitori, koristeći kao efikasno krajnje merenje utrošak kiseonika, produkciju C02i RQ za ceo organizam. Protokol uključuje primenu jedne doze jedinjenja na Sprague Dawley pacovima. Mužjaci Sprague Dawley pacova čija je telesna težina u rasponu od približno 350-400 g se zatvore pod standardnim laboratorijskim uslovima pre početka studije.

Na dan kada se jedinjenje testira, utrošak kiseonika i RQ se mere pomoću indirektnog kalorimetra (Oxymax, Columbus Instruments, Columbus, Ohio 43204) na bazi otvorenog ciklusa. Pre svakog eksperimenta, Oxymax senzori za gas se kalibriraju sa N2gasom i gasnom mešavinom (približno 0.5% C02, približno 20. 5% 02, približno 79% N2). Pacovi koji se ispituju se izvade iz kaveza i zabeleži im se telesna težina. Pacovi se prenesu u zatvorene Oxymax komore (43x43x10 cm) (po jedan pacov u komori), komore se stave u monitore aktivnosti i brzina protoka vazduha kroz komore se podesi na približno 1.6 L/min. Oxymax softver izračunava potrošnju kiseonika (mL/kg/h) po pacovu na bazi brzine protoka vazduha kroz komore i na bazi razlike u sadržaju kiseonika u vazduhu koji ulazi i vazduhu koji izlazi. Monitori aktivnosti imaju 15 zraka infracrvene svetlosti smeštenih na približnom rastojanju od 1 inč u odnosu na svaku osu, a privremena aktivnost se beleži kada su dva uzastopna zraka prekinuta, a rezultati se beleže u brojkama.

Osnovni utrošak kiseonika, RQ i privremena aktivnost se mere približno svakih 10 minuta u toku približno 1 do 3.5 sati. Nakon dobijanja osnovnih vrednosti, komore se otvore i test jedinjenje i vehikulum se primene oralnom gavažom kao pojedinačna doza. Test jedinjenje se rastvori u vehikulumu koji sadrži približno 0. 5% metil celuloze u vodi ili drugom vehikulumu. Zaprmina doze je približno 1 ml. Nakon doziranja, pacovi se vrate u Oxymax komore, poklopci komora se zatvore a merenja se vrše svakih 10 minuta u toku približno 3 do 6 sati nakon doziranja. Promene u RQ u odgovoru na test jedinjenje ili vehikulum se izračunava za svakog pojedinačnog pacova deljenjem prosečnih vrednosti nakon doziranja (izuzimajući vrednosti dobijene u toku vremenskih perioda kada je privremena aktivnost prelazila 100 brojanja) sa prosečnim osnovnim vrednostima pre doziranja (isključujući prvih 5 vrednosti i vrednosti dobijenih u toku perioda kada je privremena aktivnost prelazila 100 brojanja) i izražavajući vrednosti kao procenat promene u RQ.

Sub-hronična i hronična efikasnost kod eksperimentalnih životinja

Jedinjenja iz ovog pronalaska se lako adaptiraju za kliničku upotrebu kao sredstva za smanjenje hiperinsulinemije, sredstva za povraćaj osetljivosti na insulin, sredstva protiv gojaznosti i anti-aterosklerotična sredstva. Ova aktivnost može da se odredi količinom test jedinjenja koja smanjuje vrednosti insulina, neposredno podstiče i/ili ubrzava redukciju vrednosti insulina i glukoze kao odgovor na oralno unetu glukozu, smanjuje telesnu težinu i/ili redukuje kompoziciju tela (na primer, redukuje procenat telesne masnoće) i redukuje akumulaciju masnih naslaga na zidovima krvnih sudova u odnosu na kontrolni vehikulum bez test jedinjenja kod sisara, na primer kod Sprague Dawley pacova koji se hrane unošenjem ili hrane bogate saharozom ili hrane bogate mastima, u toku 3-8 nedelja pre i u toku primene test jedinjenja ili kod mužjaka ob/ob miševa ili kod zečeva hranjenih holesterolom.

Takođe, kako je koncentracija insulina u krvi povezana sa promocijom rasta vaskularnih ćelija i povećanom retencijom natrij uma u bubrezima, (kao dodatak drugim delovanjima, na primer, poboljšana iskoristi)ivost glukoze), a poznato je da ove funkcije dovode do hipertenzije, jedinjenja iz ovog pronalaska, svojim hipoinsulinemičnim delovanjem, sprečavaju, zaustavljaju i/ili smanjuju hipertenziju.

[1] Subhronična procena anti-dijabetične efikasnosti kod pacova i miševa. Anti-dijabetički potencijal jedinjenja Formule (I) iz ovog pronalaska, njegovih prolekova i soli tih jedinjenja i prolekova, može da se pokaže procenom njihovog anti-hiperinsulinemičnog potencijala i potencijala na osetljivost insulina, koristeći postupke na bazi standardnih procedura. Na primer, anti-hiperinsulinemični potencijal i potencijal na osetljivost insulina ovih jedinjenja može da se pokaže na Sprague Dawley pacovima koji se hrane ili standardnom hranom za glodare, hranom bogatom saharozom (A1N-76A hrana za glodare; Cat# Dl0001, Research Diets Inc., New Brunswick, NJ.) ili hranom bogatom mastima (Cat # Dl2451, Research Diets Inc., New Brunswick, NJ.)ad libitumu toku 3-4 nedelje pre i u toku primene test jedinjenja ili na 4-8 starim mužjacima C57BL/6J-ob/ob miševa (dobijenih od Jackson Laboratory, Bar Harbor, Me.) hranjenih standardnom hranom za glodare ad libitum. Životinje se tretiraju od 1 do 8 nedelja sa test jedinjenjem koje se primenjuje ili oralnom gavažom u vodi ili u 0.25% metilcelulozi u vodi koristeći S.D., B.I.D. ili T.I.D. režim doziranja ili primenom gore pomenute hrane u praškastom obliku. Za studije u kojima je procenjen anti-hiperinsulinemični potencijal jedinjenja Formule (I), u različitim vremenskim periodima u toku studije ili pri žrtvovanju (asfiksijom sa C02), uzima se krv ili iz vene repa neanesteziranih pacova ili iz retro-orbitalnog sinusa neanesteziranih miševa ili iz vene cave žrtvovanih pacova ili miševa, u kivetama zapremine 0.5 ml sa separatorom seruma. Sveže uzeti uzorci se centrifugiraju dva minuta na 10,000 xg na sobnoj temperaturi, a supernatant seruma se čuva na -80 °C do ispitivanja. Koncentracija insulina u serumu se određuje koristeći Equate® RIAINSULIN kitove (popstupak dvostrukog antitela; kako je specificirano od strane proizvođača) nabavljen od Binax, South Portland, Me. Koeficijent unutrašnje varijacije je 10%. Smanjenje insulina u serumu delovanjem test jedinjenja se određuje statističkim analizama (neupareni t-test) srednje koncentracije insulina u serumu između grupe sa test jedinjenjem i kontrolne grupe tretirane vehikulumom. Za studije u kojima se procenjuje potencijal test jedinjenja za senzitizaciju insulina, u različita vremena u toku ispitivanja životinja na dijeti, primenjuje se oralno ili intraperitonealno glukoza po 1.0 g/kg telesne težine, i uzima se krv ili iz vene repa neanesteziranih pacova ili iz retro-ortibalnog sinusa neanesteziranih miševa, u različito vreme do 2 sata nakon primene glukoze, u kivete zapremine 0.5 ml sa separatorom seruma. Sveže sakupljeni uzorci se centrifugiraju dva minuta na 10,000 xg na sobnoj temperaturi, a supernatant seruma se čuva na -80 °C do ispitivanja. Koncentracija insulina u serumu se određuje koristeći Equate® RiA INSULIN setove, kako je prethodno opisano. Koncentracija glukoze u serumu se određuje pomoću Abbott VP™ (Abbott Laboratories, Diagnostics Division, Irving, Tex.) i VP Super Svstem® autoanalajzera (Abbott Laboratories, Irving, Tex.), ili pomoću Abbott Spectrum CCX™ (Abbott Laboratories, Irving, Tex.) koristeći A-Gent™ Glucose-UV sistem test reagensa (Abbott Laboratories, Irving, Tex.) (modifikacija postupka Richterich i Dauvvalder, Schweizerische Medizinische Wochenschrift, 101: 860 (1971)). Aktivnost test jedinjenja na osteljivost insulina se određuje statističkim analizama (neupareni t-test) prosečnom razlikom u piku insulina i koncentracije glukoze i brzini nestajanja insulina i glukoze iz plazme nakon njihovih odgovarajućih vrednosti pikova između grupe test jedinjenja i kontrolne grupe tretirane vehikulumom. Za studije u kojima se procenjuje potencijal test jedinjenja za sniženje lipida, u različita vremena u toku studije ili nakon žrtvovanja (asfikcijom CO2), uzima se krv ili iz vene repa neanesteziranih pacova ili iz retro-orbitalnog sinusa neanesteziranih miševa, ili iz vene kave žrtvovanih pacova ili miševa u kivete zapremine 0.5 ml sa separatorom seruma. Sveže sakupljeni uzorci se centrifugiraju dva minuta na 10,000 xg na sobnoj temperaturi, i supernatant seruma se čuva na -80 °C do ispitivanja. Trigliceridi u serumu se određuju koristeći Abbott VP™ i VP Super Svstem® autoanalajzer (Abbott Laboratories," Irving, Tex) ili Abbott Spectrum CCX™

(Abbott Laboratories, Irving, Tex.) koristeći A-Gent™ sistem test reagenasa za trigliceride (Abbott Laboratories, Diagnostics Division, Irving, Tex.) (postupak lipaza udvojenog enzima; modifikacija postupka koji su dali Sampson, i saradnici, Clinical Chemistrv 21:1983 (1975)).

Vrednosti ukupnog holesterola se određuju koristeći Abbott VP™ i VP Super Svstem® autoanalajzer (Abbott Laboratories, Irving, Tex.), i A-Gent™ sistem test reagenasa za test holesterol (postupak udvajanja enzima holesterol esteraze; modifikacija postupka koji su dali Allain, i saradnici Clinical Chemistrv 20: 470 (1974)) koristeći 100 i 300 mg/dl standarda. Koncentracija slobodnih masnih kiselina u serumu se određuje koristeći kit nabavljen od Amano International Enzvme Co., Inc., koji je prilagođen za upotrebu sa Abbott VP™ i VP Super Svstem® autoanalajzer (Abbott Laboratories, Irving, Tex.), ili Abbott Spectrum CCX™ (Abbott Laboratories, Irving, Tex.). Aktivnosti test jedinjenja na snižavanje vrednosti triglicerida, holesterola i slobodnih masnih kiselina u serumu se određuju statističkim analizama (neupareni t-test) srednjih koncentracija triglicerida, holesterola i slobodnih masnih kiselina u serumu između grupe sa jedinjenjem i kontrolne grupe tretirane vehikulumom.

[2] Subhronična procena efikasnosti na gojaznost kod pacova i miševa. Potencijal protiv gojaznosti jedinjenja iz Formule (I) iz ovog pronalaska, njegovih prolekova i soli tih jedinjenja i prolekova, može da se pokaže procenom njihovog potencijala da produkuju gubitak telesne težine, smanjenje procenta telesne masnoće i smanjenje vrednosti leptima u plazmi.

Na primer, potencijal test jedinjenja na smanjenje telesne težine, redukciju procenta masnoće u organizmu i smanjenje leptina u plazmi može da se pokaže na Sprague Dawley pacovima koji se hrane ili standardnom hranom za glodare, hranom bogatom saharozom (A1N-76A hrana za glodare; Cat # Dl0001, Research Diets Inc., New Brunswick, NJ.) ili hranom bogatom masnoćom (Cat # Dl2451, Research Diets Inc., New Brunsvvick, NJ.) ad libitum u toku 3-4 nedelje pre i u toku primene test jedinjenja ili na 4-8 nedelje starim mužjacima C57BL/6J-bb/ob miševa (dobijeni od Laboratory, Bar Harbor, ME) hranjenih standardnom hranom za glodare,ad libitum.Životinje se tretiraju 1 do 8 nedelja sa test jedinjenjem koje se primenjuje ili oralnom gavažom u vodi ili u 0.25% metilcelulozi u vodi, koristeći S.D., B.I.D. ili T.I.D. režim doziranja ili primenom prethodno pomenute hrane u praškastom obliku.

Ukupan gubitak telesne težine se jednostavno procenjuje upoređivanjem ukupne telesne težine pre i nakon tretmana sa test jedinjenjem. Za procenu gubitka težine i izmene u telesnoj kompoziciji (na primer izmene u procentu telesne masti i u odnosu bezmasne telesne mase sa masnom telesnom masom) tretiranih i kontrolnih životinja koje su blago anestezirane i izmerene pomoću dvostruko-energetske apsorpciometrije x-zraka (DEXA, QDR-1000/W, Hologic Inc., Waltham, Mass.) opremljene sa "Regional High Resolution Scan" softverom. Veličina polja koje se skenira se podesi da se prilagodi veličini vrsta koje se procenjuju. Rezolucija je 0.0254 x 0.0127 cm a brzina skeniranja je 7.25 mm/sekundi. Aktivnost test jedinjenja na smanjenje ukupne telesne težine, procenta telesne masti i odnosa kolčine masti prema bezmasnoj telesnoj masi se određuje statističkim analizama (neupareni t-test) srednje vrednosti ukupne telesne težine, procenta telesne masti i odnosa masne mase prema bezmasnoj masi između grupe tretirane test jedinjenjem i kontrolne grupe tretirane vehikulumom.

Promene u vrednostima leptina u plazmi su blisko povezane sa promenama u procentu telesne masti i stoga su koristan marker za procenu potencijala protiv gojaznosti. Za procenu promena vrednosti leptina u plazmi kao odgovor na tretman sa test jedinjenj ima, u različito vreme u toku studija ili nakon žrtvovanja (asfiksacijom sa CO2), uzima se krv ili iz vene repa neanesteziranih pacova ili iz retro-orbitalnog sinusa neanesteziranih miševa, ili iz vene kave žrtvovanih pacova ili miševa, u kivete zapremine 0.5 ml sa separatorom seruma. Sveže uzeti uzorci se centrifugiraju dva minuta na 10,000 x g na sobnoj temperaturi, a supernatant seruma se čuva na -80 °C do ispitivanja. Koncentracija leptina u serumu se određuje koristeći LINCO leptin pacova RIA kit (Cat # RL-83K; postupak dvostrukh antitela kako je proizvođač specificirao) nabavljen od LINCO, St Charles, Mo. Aktivnost test jedinjenja na smanjenje vrednosti leptina u serumu se određuje statističkim analizama (neupareni t-test) srednje koncentracije leptina u serumu između grupe tretirane test jedinjenjem i kontrolne grupe tretirane vehikulumom.

[3] Procena hronične anti-aterosklerotične efikasnosti kod zečeva. Za prikazivanje anti-aterosklerotičnog potencijala jedinjenja Formule (I) iz ovog pronalaska i soli tih jedinjenja, anti-aterosklerotični efekti mogu da se odrede količinom test jedinjenja koja je potrebna da smanji taloženje lipida u aorti zeca. Mužjacima New Zealand belih zečeva se daje hrana koja sadrži 0.2% holesterola i 10% kokosovog ulja u toku 4 dana (hrane se jedanput dnevno). Zečevima se zaseče marginalna ušna vena a vrednosti ukupnog holesterola u plazmi se određuju iz ovih uzoraka. Zečevi se nakon toga podele u grupe za tretman tako da se u svakoj grupi nalaze zečevi sa sličnom prosečnom ± SD vrednošću koncentracije ukupnog holesterola u plazmi, koncentracije HDL holesterola i/ili koncentracije triglicerida. Nakon što su grupe formirane, zečevima se dnevno daje doza test jedinjenja izmešana sa hranom ili u obliku malih parčića želatine. Kontrolna grupa zečeva prima samo vehikulum koji je ili u hrani ili u želatinskim parčićima. Ishrana sa holesterolom/kokosovim uljem se nastavlja zajedno sa primenom test jedinjenja u toku studije. Vrednosti holesterola i/ili triglicerida u plazmi mogu da se odrede u bilo kom trenutku u toku studije uzimanjem krvi iz marginalne ušne vene. Nakon 3-5 meseci, zečevi se žrtvuju i aorta se odvoji od torakalnog luka za granu ilijačnih arterija. Aorta se očisti od primesa, otvori longitudinalno a nakon toga oboji sa Sudan IV bojom, kako su opisali Holman i saradnici (Lab. Invest. 1958, 7, 42-47). Procenat obojene oblasti na površini se kvantifikuje denzitometrijom koristeći Optimas Image Analvzing Svstem (Image Processing Svstems). Smanjenje nataloženih lipida je indikovano smanjenjem procenta obojene oblasti površine u grupi koja je dobijala jedinjenje, u poređenju sa kontrolnom grupom zečeva.

Claims

1. Jedinjenjekojeima formulu ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, pri čemu: (a) R<!>jeH, OH, halo, cijano, C1.3alkil, C1-3alkoksi, C1.3haloalkil, C1.3haloalkoksi, Ci.3alkilsulfonil-, -CO(0)H, -C(0)OQ.3 alkil ili fenil grupa, pri čemu je navedena fenil grupa opciono supstituisana sa jednim do pet R<10>; (b) svaki R10 je nezavisno OH, halo, cijano, C1.3alkil, C1.3alkoksi, C1-3haloalkil ili C1.3haloalkoksi grupa; (c) R<z>iR<J>susvaki nezavisno H, OH, halo, cijano, C1.3alkil, C1.3alkoksi, C1.3haloalkil, C1.3haloalkoksi, d.3alkilsulfonil-, -CO(0)H, -C(0)OCi-3alkil, -C(0)NR<u>R<12>ili fenil grupa, pri čemu je navedena fenil grupa opciono supstituisana sa jednim do pet R<10>; (d) R11 i R<12>su uzeti odvojeno i svaki je nezavisno H ili C1-3alkil grupa, ili su R<11>i R<12>uzeti zajedno sa azotom za koji su vezani da formiraju 4-7-člani heterocikloalkil prsten; (e) R4 je H, halo, cijano, c,.3alkil ili C1.3haloalkil grupa; (f) R6 je uzet odvojeno i predstavlja H, OH, halo, C1.3alkil, C1.3alkoksi, C1.3haloalkil ili C1-3haloalkoksi grupu; (g) R<7>je uzet odvojeno i predstavlja H, OH, halo, C1.3alkil, C1-3alkoksi, C1.3haloalkil ili Ci-3haloalkoksi grupu; (h) R<5>je uzet odvojeno i predstavlja 4-7-člani heteroaril prsten opciono supstituisan sa halo, Ci_3alkil, C1.3alkoksi, C1.3alkil-OH, C1.3haloalkil ili C1.3grupom; ili (i) R<5>je uzet zajedno sa R<6>ili R<7>i sa fenil grupom, za koju suR<5>iR<6>ili R<7>vezani, formira policiklčni heterociklični radikal, sa prstenom koji sadrži azot, pri čemu je najmanje jedan atom azota vezan za atom ugljenika navedene fenil grupe, pri čemu je prsten koji sadrži azot opciono spojen sa cikloheksanom, 5,6-dihidro-piridinom ili 5,6-dihidro-lH-piridin-2-onom, i pri čemu je prsten koji sadrži azot opciono nezavisno supstituisan sa jednom ili dve okso, halo, Ci-3alkil, C1.3alkoksi, C1.3alkil-OH, C1-3haloalkil, C1.3haloalkoksi, 4-7-člani heteroaril, 4-7-člani heterocikloalkil ili fenil grupe, pri čemu je navedena fenil grupa opciono supstituisana sa jednim do pet R<10>, pod uslovom da R<5>nije uzet zajedno saR<6>da formiraju benzotriazolil ili benzooksadiazolil i pod uslovom da R nije uzet zajedno sa R da formira benzooksadiazolilradikal; i (j) R O iR Q su nezavisno H, OH, halo, C1.3alkil, C1.3alkoksi, C,.3haloalkil ili C1.3haloalkoksi grupa, pod uslovom da navedeno jedinjenje nije l'-(lH-l,2,3-benzotriazol-5-ilkarbonil)-5-metoksispiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on, 6-hloro-7-metil-l'-[3-(lH-pirazol-4-il)benzoil]spiro[hromen-2,4-piperidin]-4(3H)-on, 6,7-dimetil-l'-[3-(lH-pirazol-4-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on ili 6,7-dimetil-l'-[3-(lH-pirazol-4-il)benzoil]spiro[hromen-2,4'-piperidin]-4(3H)-on.

2. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, v • 5*7' naznačeno time što su R i R uzeti zajedno, pri čemu navedeni opciono supstituisani prsten koji sadrži azot opciono sadrži drugi N, O, ili S heteroatom, i gde je navedeni prsten koji sadrži azot opciono spojen sa cikloheksanom, 5,6-dihidro-piridinom ili 5,6-dihidro-lH-piridin-2-onom.

3. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 2, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što su R<5>i R<7>uzeti zajedno, pri čemu je navedeni policiklični heterociklični radikal IH-indazolil, lH-benzoimidazolil, kvinolil, 1,2,3,4-tetrahidrokvinolil, kvinoksalil, 1H-indolil, 2,3-dihidro-lH-benzoimidazolil, lH-benzo-[d][l,2,3]triazolil, 6,7,8,9-tetrahidro-5H-karbazolil, 2,3,4,9-tetrahidro-lH-pirido-[3,4-b]indolil ili benzooksazolil, i gde je prsten koji sadrži azot navedenog policikličnog heterocikličnog radikala opciono supstituisan.

4. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 3, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što je policiklični heterociklični radikal opciono supstituisani IH-indazolil, 1H-benzoimidazolil, lH-indolil ili 2,3,4,9-tetrahidro-lH-pirido[3,4-b]indolil.

5. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 4, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što: (a) R<1>je H, halo, CH3ili OCH3grupa; (b) R<3>je H, halo, CH3ili OCH3grupa; i (c) R<4>jeH.

6. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što su R5 i R<6>uzeti zajedno, pri čemu navedeni opciono supstituisani prsten koji sadrži azot opciono sadrži drugi N, 0, ili S heteroatom, i pri čemu je navedeni prsten koji sadrži azot opciono spojen sa cikloheksanom, 5,6-dihidro-piridinom ili 5,6-dihidro-lH-piridin-2-onom.

7. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 6, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što su R<5>i R<6>uzeti zajedno, pri čemu je navedeni policiklični heterociklični radikal IH-indazolil, lH-benzoimidazolil, lH-indolil ili 2,3-dihidro-lH-benzoimidazolil, i pri čemu je prsten koji sadrži azot navedenog heterocikličnog radikala opciono supstituisan.

8. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 7, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što je policiklični heterociklični radikal opciono supstituisani IH-indazolil.

9. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 8, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što: (a) R<1>je H, halo, CH3ili OCH3grupa; (b) R3 je H, halo, CH3ili OCH3grupa; i (c) R<4>jeH.

10. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što je R<5>uzet odvojeno i to je opciono supstituisani pirazolil, imidazolil, oksadiazolil ili pirimidinil.

11. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 10, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što je R<5>uzet odvojeno i što je to opciono supstituisani pirazolil ili imidazolil.

12. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 11, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što: (a) R<1>je H, halo, CH3ili OCH3grupa; (b) R<3>je H, halo, CH3ili OCH3grupa; i (c) R<4>jeH.

13. Farmaceutska kompozicij a koj a uključuj e: (1) Jedinj enj e koj e ima formulu ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, pri čemu: (a) R<1>je H, OH, halo, cijano, Ci-3alkil, Ci.3alkoksi, Ci-3haloalkil, C1.3haloalkoksi, Ci.3alkilsulfonil-, -CO(0)H, -C(0)OCi.3alkil ili fenil grupa, pri čemu je navedena fenil grupa opciono supstituisana sa jednim do pet R<10>; (b) svaki R<10>je nezavisno OH, halo, cijano, Ci.3alkil, Cj.3alkoksi, Ci-3haloalkil ili C1.3haloalkoksi grupa; (c) R<2>i R<3>su svaki nezavisno H, OH, halo, cijano, C1-3alkil, Ci_3alkoksi, C1.3haloalkil, C1.3haloalkoksi, C1.3alkilsulfonil-, -CO(0)H, -C(0)OCi.3alkil, -C(0)NR<u>R<12>ili fenil grupa, pri čemu je navedena fenil grupa opciono supstituisana sa jednim do pet R<10>; (d) R<11>i R<12>su uzeti odvojeno i svaki je nezavisno H ili Cj.3alkil grupa, ili su RH iR12uzeti zajedno sa azotom za koji su vezani da formiraju 4-7-člani heterocikloalkil prsten; (e) R<4>je H, halo, cijano, c,., alkil ili C1.3haloalkil grupa; (f) R6 je uzet odvojeno i predstavlja H, OH, halo, C1-3alkil, C1.3alkoksi, C1.3haloalkil ili C1-3haloalkoksi grupu; (g) R<7>je uzet odvojeno i predstavlja H, OH, halo, C1.3alkil, C1.3alkoksi, C1.3haloalkil ili C1.3haloalkoksi grupu; (h) R5 je uzet odvojeno i predstavlja 4-7-člani heteroaril prsten opciono supstituisan sa halo, C1.3alkil, C1.3alkoksi, C1-3alkil-OH, C1.3haloalkil ili C1.3grupom; ili (i) R<5>je uzet zajedno saR<6>ili R<7>i sa fenil grupom, za koju suR<5>i R<6>ili R<7>vezani, formira policiklčni heterociklični radikal, sa prstenom koji sadrži azot, pri čemu je najmanje jedan atom azota vezan za atom ugljenika navedene fenil grupe, pri čemu je prsten koji sadrži azot opciono spojen sa cikloheksanom, 5,6-dihidro-piridinom ili 5,6-dihidro-lH-piridin-2-onom, i pri čemu je prsten koji sadrži azot opciono nezavisno supstituisan sa jednom ili dve okso, halo, C1.3alkil, Ci-3alkoksi, Ci_3alkil-OH, C1.3haloalkil, C1-3haloalkoksi, 4-7-člani heteroaril, 4-7-člani heterocikloalkil ili fenil grupe, pri čemu je navedena fenil grupa opciono supstituisana sa jednim do pet R<10>, pod uslovom da R<5>nije uzet zajedno sa R<6>da formiraju benzotriazolil ili benzooksadiazolil i pod uslovom da R<5>nije uzet zajedno sa R<7>da formira benzooksadiazolilradikal; i (j) R i R su nezavisno H, OH, halo, C1.3alkil, C1-3alkoksi, c,_3haloalkil ili C1-3haloalkoksi grupa, i (2) farmaceutski prihvatljiv nosač, vehikulum, razblaživač ili ekscipijent.

14. Farmaceutska kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 13, naznačena time što suR 5 iR 7 uzeti zajedno, pri čemu je navedeni policiklični heterociklični radikal IH-indazolil, lH-benzoimidazolil, kvinolil, 1,2,3,4-tetrahidrokvinolil, kvinoksalil, lH-indolil, 2,3-dihidro-lH-benzoimidazolil, lH-benzo-[d][l,2,3]triazolil, 6,7,8,9-tetrahidro-5H-karbazolil, 2,3,4,9-tetrahidro-lH-pirido-[3,4-b]indolil ili benzooksazolil, i pri čemu je prsten koji sadrži azot navedenog policikličnog heterocikličnog radikala opciono supstituisan.

15. Farmaceutska kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 13, naznačena time što su R5 i R<6>uzeti zajedno, pri čemu je navedeni policiklični heterociklični radikal IH-indazolil, lH-benzoimidazolil, lH-indolil ili 2,3-dihidro-lH-benzoimidazolil, i pri čemu je prsten koji sadrži azot navedenog heterocikličnog radikala opciono supstituisan.

16. Farmaceutska kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 13, naznačena time što je R5 uzet odvojeno i što je to opciono supstituisani pirazolil, imidazolil, oksadiazolil ili pirimidinil.

17. Postupak za lečenje gojaznosti ili stanja prekomerne težine kod sisara kojima je potreban takav tretman, naznačen time što uključuje primenu na sisaru terapeutski efektivne količine jedinjenja koje ima formulu ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, pri čemu: (a) R<1>je H, OH, halo, cijano, C1.3alkil, C1.3alkoksi, C1.3haloalkil, C1.3haloalkoksi, C1-3alkilsulfonil-, -CO(0)H, -C(0)OCi-3alkil ili fenil grupa, pri čemu je navedena fenil grupa opciono supstituisana sa jednim do pet R<10>; (b) svaki R<10>je nezavisno OH, halo, cijano, C1-3alkil, C1.3alkoksi, C1-3haloalkil ili C1.3haloalkoksi grupa; (c) R<2>i R<3>su svaki nezavisno H, OH, halo, cijano, C1-3alkil, C1.3alkoksi, C1.3haloalkil, C,.3haloalkoksi, d.3 alkilsulfonil-, -CO(0)H, -C(0)OC,.3alkil, -C(0)NR<n>R<12>ili fenil grupa, pri čemu je navedena fenil grupa opciono supstituisana sa jednim do pet R<10>; (d) R11 i R<12>su uzeti odvojeno i svaki je nezavisno H ili C1-3alkil grupa, ili su R11 i R<12>uzeti zajedno sa azotom za koji su vezani da formiraju 4-7-člani heterocikloalkil prsten; (e) R4 je H, halo, cijano, c,.3alkil ili C1.3haloalkil grupa; (f) R6 je uzet odvojeno i predstavlja H, OH, halo, C1-3alkil, C1.3alkoksi, C1.3haloalkil ili Ci-3haloalkoksi grupu; (g) R je uzet odvojeno i predstavlja H, OH, halo, C1-3alkil, C1.3alkoksi, C1.3haloalkil ili C1.3haloalkoksi grupu; (h) R<5>je uzet odvojeno i predstavlja 4-7-člani heteroaril prsten opciono supstituisan sa halo, C1.3alkil, C1.3alkoksi, C1.3alkil-OH, C1.3haloalkil ili C1.3grupom; ili (i) R<5>je uzet zajedno sa R<6>ili R<7>i sa fenil grupom, za koju su R<5>i R<6>ili R<7>vezani, formira policiklčni heterociklični radikal, sa prstenom koji sadrži azot, pri čemu je najmanje jedan atom azota vezan za atom ugljenika navedene fenil grupe, pri čemu je prsten koji sadrži azot opciono spojen sa cikloheksanom, 5,6-dihidro-piridinom ili 5,6-dihidro-lH-piridin-2-onom, i pri čemu je prsten koji sadrži azot opciono nezavisno supstituisan sa jednom ili dve okso, halo, C1.3alkil, C1.3alkoksi, C1.3alkil-OH, C1.3haloalkil, C1.3haloalkoksi, 4-7-člani heteroaril, 4-7-člani heterocikloalkil ili fenil grupe, pri čemu je navedena fenil grupa opciono supstituisana sa jednim do pet R<10>, pod uslovom da R<5>nije uzet zajedno sa R<6>da formiraju benzotriazolil ili benzooksadiazolil i pod uslovom da R<5>nije uzet zajedno sa R<7>da formira benzooksadiazolilradikal; i (j) R i R su nezavisno H, OH, halo, C1.3alkil, C1.3alkoksi, c,.3haloalkil ili C1.3haloalkoksi grupa.

18. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 17, naznačen time što je navedeni sisar čovek.