RS49691B - Liofilizovan preparat ljudskog morfogenetskog faktora mp52 kosti - Google Patents

Abstract

Liofilizovan preparat humanog koštanog morfogenetskog faktora MP52 i, naznačen time, što sadrži smešu humanog morfogenetskog faktora MP52 i manitola u težinskom odnosu 1:5-50. Prijava sadrži još 1 nezavisan i 2 zavisna patentna zahteva.

Description

Oblast tehnike

Pronalazak spada u oblast preparativne hernije.

Tehnički problem

Predmetni pronalazak se odnosi na liofilizovan preparat humanog koštanog morfogenetskog faktora MPS2 i na njegov postupak dobijanja. Specifičnije, ovaj pronalazak se odnosi na liofilizovan preparat koji sadrži humani koštani morfogenetski faktor MP52 i

manitol i na postupak za dobijanje.

Stanje tehnike

cDNA od Humanog morfogenetskog faktora MP52 kosti izolovan je prvi put 1994. go dine kao faktor koji se odnosi na osteogenezu koji je klasiflkovan kao TGF-p superfamilija (Biochem. Biophv. Res. Comm., Vol. 204, No.2, 1994). Zatim, tehnologija naprednog genetskog ižinjeringa učinila je mogućim dobijane koštanog morfogenetskog faktora MPS2 bez slabljenja njegove koštane morfogenetske aktivnosti (W096/33215). Koštani morfogenetski faktor MPS2 je čuvan u liofilizovanom stanju. To je medđtim praćeno sa nedostatkom da se smanjenje zapremine dešava tokom skladištenja i dolazi do kohezije praha tokom rekonstitucije.

Sa ciljem da se prevaziđu gore opisani problemi, korišćene su amino kiseline, saharidi

ili polihihidrinski alkoholi, za BMP-2 koji je protein klasiflkovan kao TGF-P superfamilija i

ima osobine koje su najbliže humanom koštanom morfogenetskom faktoru MP52 (JP-A bi.

HEI 6-508777). Pronalazači su zato pokušali primenu takvih aditiva na humani koštani morfogenetski faktor MP52, ali nisu mogli da prevaziđu navedene probleme. Posebno opisano, primećena je kohezija tokom rekonstitucije čak i ako je dodata neutralna ili bazna amino kiselina kao što je alanin, valin ili lizin u koštani morfogenetski faktor MPS2 u količini od 0.5 do 2.5% pre liofilizacije. Kada je dodat saharid kao što je sukroza ili dekstran u količini od 0.5 do 1 %, praćeno liofilizacijom, iz liofilizovanog proizvoda primećen je razvoj boje u bledo žućkasto zeleno. Kada se doda višebazni alkohol kao što sorbitol u količini od 0.5 do 1%, praćeno liofilizacijom, dolazi do rastvaranja koštanog morfogenetskog faktora MP52 u periodu liofilizacije, što dobijanje liofilizovanog proizvoda čini nemogućim.

Opis rešenia tehničko<g>problema

Pronalazači su nastavili na detaljnom istraživanju, sa ciljem da prevaziđu prethodno opisane probleme. Kao rezultat nađeno je da kada se u koštani morfogenetski faktor MPS2 doda manitol, nakon čega sledi liofilizacija, za vreme skladištenja liofilizovanog proizvoda, nije primećena ni promena boje niti skupljanje i ne dolazi do kohezije tokom rekonstitucije, što vodi ka ispunjenju ovog pronalaska.

Ovaj pronalazak, stoga, obezbeđuje liofilizovan preparat humanog koštanog morfogenetskog faktora MPS2 koji sadrži humani koštani morfogenetski faktor MPS2 i manitol. Kao koštani morfogenetski faktor MPS2 u predmetnom pronalasku, preferentno je korišćen humani koštani morfogenetski faktor MPS2 (koji je ovde dalje označen kao "rhMP52") koji je dobijen genetskim inžinjeringom kao što je opisano u W096/33215. Kao manitol preferentno je korišćen D-manitol kao što je navedeno u Japanskoj farmakopeji. Humani koštani morfogenetski faktor MP52 i manitol su preferentno pomešani u težinskom odnosu od 1 : 5 - 50.

Preparat prema ovom pronalasku može se dobiti sa liofilizacijom vodenog rastvora koštanog morfogenetskog faktora MP52 i manitola prema konvencionalnom postupku.

Odnosno, preparat ovog pronalaska se dobija dodavanjem prethodno određene količine manitola u vodenom rastvoru prečišćenog humanog koštanog morfogenetskog faktora MP52, mešanjem, filtriranjem dobijenog rastvora vodene smeše, punjenjem filtrata u sterilne bočice i liofilizacijom.

Preparat predmetnog pronalaska administrira se pacijentu u količini koja je efikasna za terapeutsko lečenjc posle rastvaranja u destilovanoj vodi za injekciju ili u slaboj kiselini (pH oko 3), na primer, rastvor hlorovodonične kiseline ili pufer limunske kiseline, posle primene.

Preferenta količina manitola koji je sastavni deo preparata predmetno pronalaska određena je testiranjem stabilnosti. Testiranje stabilnosti je izvedeno u skladu sa postupkom opisanom u instrukcijama za standardni postupak operacije koji je baziran na Japanskoj farmakopeji XIII, gde se uočavaju ili mere karakteristike kao što je izgled i bistrina rastvora, elektroforeza i sadržaj vode na početku testa i 3 meseca kasnije i ektopično (abnormalno) stvaranje kosti posle 6 meseci.

Kao rezultat, nisu primećene promene u izgledu i bistrini rastvora na početku testiranja, i 3 meseca kasnije. Iz rezultata merenja elektroforeze i sadržaja vode, preparat koji sadrži manitol u gore datom težinskom odnosu bilo je stabilan i na početku testiranja i posle 3 meseca.

Napomenuto je daje preferentan sadržaj vode liofilizovanog proizvoda generalno2%ili manje. Iz prethodnih rezulatata procenjeno je da je preferentna onaj preparat koštanog morfogenetskog faktora MPS2 koji sadrži manitol u količini od S do 50 mg, poželjno 10 mg, po 1 mg koštanog morfogenetskog faktora MP52.

Dalje, ektopično stvaranje kosti svakog od liofilizovanih preparata humanog morfogenetskog koštanog faktora MP52 koji sadrži 10, 25 i 50 mg manitola, respektivno, je mereno posle skladištenja od 6 meseci. Kao rezultat, uočeno je ektopično formiranje kosti iz bilo kojeg preparata bez obzira na temperaturu skladištenja ili količinu manitola. Na osnovu gore opisanih rezultata testa, potvrđeno je da dodavanje manitola u humani koštani morfogenetski faktor MP52 pre liofilizacije nema štetne efekte na koštani morfogenetski faktor MP52 i rezultujući preparat ostaje stabilan duže vreme.

Predmetni pronalazak će biti daljnije opisan sledećim primerima.

Primer1 Dobijanje preparata rhMP52

U 1 mg/ml vodenog rastvora prečišćenog rhMP52, koji je dobijen prema postupku za dobijanje opisanom u W096/33215, dodat je D-manitoI apanske Farmakopeje u količini od 10, 25 i 50 mg, respektivno, i rastvor je promešan. Posle filtracije rezultujuće smeše kroz membranu filtera od 22 um, pa su porcije filtrata od 1 ml sipane u sterilne ampule. Onda su liofilizovani, pri čemi je preparat iz ovog pronalaska dobijen u obliku farmaceutskog proizvoda.

Primer2 Testiranje stabilnosti preparata rhMP52

Liofilizovan preparat rhMP52 dobijen u primeru 1 stavljan je u ampulu (koja je nepropusna za vazduh, transparentna) i čuvan na 2 - 8°C, 25°C i 40°C, respektivno. Stabilnost je procenjena na osnovu sledećih kriterij uma, posle 3 meseca skladištenja. Kriterijumi za evaluaciju su sledeći:

Osobine:

(Izgled): Preparat koji je ostao u obliku belog kolača i nije promenio bolju, ocenjen je kao "nepromenjen".

(Bistrina rastvora): Rastvor preparata koji rastvoren u 1 ml destilovane vode za injekciju ocenjen je kao "nepromenjen" kada je bezbojan, transparentan i bez kohezije.

(Elektroforeza): Čistoća glavne trake je izračunata iz procenta površine, posle ubacivanja slike pomoću film skenera koji vrši prcnos pomoću crvenog filma i zatim nalazi integraciju optičke gustine (IOD) % svake trake.

(Sadržaj vode): Sadržaj vode preparata izmeren je sa uređajem koji meri mikro količine vlage.

Kao rezultat, po pitanju osobina, preparat iz pronalaska je ostao nepromenjenog izgleda i bistrina rastvora jc ostala ncpromenjena, dok je kohezija primećena samo kod liofilizovanog proizvoda rhMP52. Prema rezultatima elektroforeze, svaki preparat je pokazao dobru stabilnost (%).

Rezultati merenja količine vode (%) dati su u tabeli 1 koja pokazuje da nema velike promene u sadržaju vode (%) u preparatima. Tabela 1 pokazuje da je, poređenjem sa proizvodom koji je sastavljen samo od rhMP52, sadržaj vode u svakom preparatu prema predmetnom pronalasku manji u momentu dobijanja ili posle skladištenja i zato ne dolazi lako do skupljanja.

Primer3 Ektopično formiranje kostiju od rhMPS2

Jedna ampula (1 mg/amplui) koja sadrži rhMP52 preparat dobijen u Primeru 1 skladištena je tokom 6 meseci na 4°C i 25°C, respektivno, zatim je u ampulu dodat 1 ml destilovane vode za injekciju, pri čemu je dobijen rastvor za administraciju. Ovako dobijen rastvor je intramuskularno administriran u ICR miša (nabavljen od Nippon Crea Co., Ltd.) u količini od 20 ug/20 ul. Dve nedelje kasnije, praćeno je prisustvo ili odusustvo ektopičnog formiranja kosti fotografisanjem mekim rendgenskim zrakom (n=2). Rezultati su dati u tabeli 2.

Liofilizovan proizvod humanog koštanog morfogenetskog faktora MP52 se generalno susreće sa problemima kao što je bojenje ili skupljanje tokom skladištenja i kohezije prilikom rekonstitucije. Liofilizovan preparat prema predmetnom pronalasku, međutim, nema ovakve probleme. Humani koštani morfogenetski faktor MPS2 u liofilizovanom preparatu predmetnog pronalaska ostaje stabilan i ne primećuje se suštinska pramena u čistoći, sadržaju vode i ektopičnom formiranju kosti, čak i posle dugotrajnog skladištenja. Shodno ovom, predmetni pronalazak je primenljiv u kao farmaceutski proizvod.

Claims (4)

1. Patentni zathevi:1. Liofilizovan preparat humanog koštanog morfogenetskog faktora MP52 i, naznačen time, što sadrži smešu humanog morfogenetskog faktora MPS2 i manitola u težinskom odnosu 1 : 5-50.
2. 2. Liofilizovan preparat prema zahtevu 1, naznačen time što je humani koštani morfogenetski faktor MP52 dobijen tehnologijom genetskog inžinjeringa.
3. 3. Postupak za dobijanje liofilizovanog preparata humanog koštanog morfogenetskog faktora MP52 , naznačen time, što obuhvata dodavanje manitola u vodeni rasvor prečišćenog humanog koštanog morfogenetskog faktora MP52 u težinskom onosu 1:5-50 i zatim liofilizaciju dobijenog rastvora vodene smeše.
4. 4. Postupak za dobijanje liofilizovanog preparata prema zahtevu 3, naznačen time, što je humani koštani morfogenetski faktor MP52 dobijen tehnologijom genetskog inžinjeringa.