RS49981B - Upotreba derivata hidroksilamina za dobijanje farmaceutskih kompozicija korisnih za povećanje ekspresije i aktivnosti molekulskih šaperona - Google Patents

Upotreba derivata hidroksilamina za dobijanje farmaceutskih kompozicija korisnih za povećanje ekspresije i aktivnosti molekulskih šaperona

Info

Publication number
RS49981B
RS49981B YUP-587/96A YU58796A RS49981B RS 49981 B RS49981 B RS 49981B YU 58796 A YU58796 A YU 58796A RS 49981 B RS49981 B RS 49981B
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
substituted
alkyl
unsubstituted
group
aralkyl
Prior art date
Application number
YUP-587/96A
Other languages
English (en)
Inventor
Laszlo Urogdi
Katalin Biro
Andrea Jednakovits
Maria Kurthy
Ede Marvanyos
Erszebet Hegedus
Gabor Balogh
Eva Udvardy
Bea Mezes
Beatrix Farkas
Jeno Szilbereky
Laszlo Koranyi
Ibolya Horvath
Gyorgy Dorman
Eszter Kovacs
Attila Glatz
Nagy Peter Literati
Laszlo Jaszlits
Mihaly Barabas
Zsolt Torok
Denes Medzihradszky
Erno Duda
Original Assignee
Biorex Kutato Es Feyleszto Rt.,
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27270113&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS49981(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biorex Kutato Es Feyleszto Rt., filed Critical Biorex Kutato Es Feyleszto Rt.,
Publication of YU58796A publication Critical patent/YU58796A/sh
Publication of RS49981B publication Critical patent/RS49981B/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/78—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms, with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/16—Central respiratory analeptics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/02—Non-specific cardiovascular stimulants, e.g. drugs for syncope, antihypotensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C259/00—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C259/02—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups with replacement of the other oxygen atom of the carboxyl group by halogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C259/00—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C259/12—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups with replacement of the other oxygen atom of the carboxyl group by nitrogen atoms, e.g. N-hydroxyamidines
    • C07C259/18—Compounds containing carboxyl groups, an oxygen atom of a carboxyl group being replaced by a nitrogen atom, this nitrogen atom being further bound to an oxygen atom and not being part of nitro or nitroso groups with replacement of the other oxygen atom of the carboxyl group by nitrogen atoms, e.g. N-hydroxyamidines having carbon atoms of hydroxamidine groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C275/00—Derivatives of urea, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C275/64—Derivatives of urea, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of urea groups singly-bound to oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C279/00—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C279/18—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of guanidine groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/89—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D215/00—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems
    • C07D215/02—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D215/16—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D215/48—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • C07D215/54—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen attached in position 3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D217/00—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems
    • C07D217/22—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to carbon atoms of the nitrogen-containing ring
    • C07D217/26—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D295/00—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D295/04—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms
    • C07D295/08—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by singly bound oxygen or sulfur atoms
    • C07D295/084—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by singly bound oxygen or sulfur atoms with the ring nitrogen atoms and the oxygen or sulfur atoms attached to the same carbon chain, which is not interrupted by carbocyclic rings
    • C07D295/088—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by singly bound oxygen or sulfur atoms with the ring nitrogen atoms and the oxygen or sulfur atoms attached to the same carbon chain, which is not interrupted by carbocyclic rings to an acyclic saturated chain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/56—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D307/68—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D333/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
    • C07D333/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D333/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom
    • C07D333/26—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D333/38—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D409/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D409/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D413/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/12—Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring
    • C07C2601/14—The ring being saturated

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Description

1. STANJE TEHNIKE
Molekulski šaperoni su proteini koji posreduju u uvijanju proteina. Oni se neko valentno vezuju za raspoložive površine proteina koji su tek sintetisani ili denaturisani ili pogrešno savijeni pomažu im da se uviju u pravilnu konforrnaciju. Molekulski šaperoni su takođe uključeni u mnoštvo ćelijskih procesa kao što je sinteza proteina, translokacija proteina i replikacija DNK.
Molekulski šaperoni uključuju proteine toplotnog šoka (heat shock), a to su proteini čija ekspresija znatno poraste u ćelijama posle izlaganja neobično visokim temperaturama (toplotni šok) ili izlaganja širokom spektru fizioloških stresova. Ovaj porast ekspresije molekulskih šaperona zauzvrat obezbeđuje ćelijama zaštitu od štetnih efekata hipertermije, što je pokazano termotolerancijom ćelija za inače letalne temperature ako su ćelije prethodno uslovljene kratkim izlaganjem visokoj temperaturi.
Fiziološki stresovi koji indukuju ekspresiju proteina toplotnog stresa uključuju širok spektar patoloških stanja povezanih sa mnogim bolestima. Sinteza proteina toplotnog stresa u ćelijama izloženim takvim stresovima ukazuje na zaštitu ćelije protiv fizioloških stresova, kao kao i u slučaju odgovora na toplotni stres.
Jedno takvo patološko stanje povezano sa indukcijom molekulskih šaperona je ishemična povreda. Ishemična povreda tkiva je posledica smanjenog snabdevanja krvlju iz bilo kog mogućeg razloga. Na primer, produžena koronama okluzija izaziva teško oštećenje miokarda, koje dovodi do miokardijalne nekroze i ugrožava šanse za oporavak čak i kad je obnovljen protok krvi. U mozgu, ishemija može često da izazove značajna oštećenja koja dovode do umiranja moždanog tkiva.
Uočeno je da se količina heat shock proteina Hsp 70 povećava u miokardu tokom dovodeći do nekroze, čak i kada je ishemija kratkotrajna. U tim slučajevima, kao i pri toplotnom stresu, povećan sadržaj Hsp70 u ćelijama ih štiti od posiedica sledeće ishemije, koja bi inače izazvala nekrozu (DAS, D.K., et al., Cardiovascular Res. : 578. 1993). Ovo je takođe uočeno kad se ćelije pacova u kulturi podvrgnu ishemiji ( 3 . Clin. Invest.. 93: 759-767 (1994)). U skladu s tim, proteini sintetisani u miokardijalnim ćelijama obezbeđuju zaštitu protiv ishemičnih povreda.
Situacija u moždanom tkivu je slična, gde cerebralna ishemija dovodi do povećane ekspresije proteina toplotnog stresa u moždanom tkivu. Eksperimenti takođe potvrđuju da prethodno tretiranje životinja sa subletalnom ishemijom indukuje proteine toplotnog stresa (Hsp70) i štiti mozak od mnogo težeg sledećeg ishemičnog udara (Simon et al., Neurosci. Lett, 163: 135-137(1993)).
Još jedan primer fiziološkog stresa na tkivima i organima, povezan sa indukcijom molekulskih Šaperona, su inflamatorna oboljenja Inflamacija je nespecifičan odgovor ćelija domaćina na ulaz stranog materijala, kao u slučaju infekcije različitim bakterijskim i virusnim patogenima, i uključuje agregaciju i aktiviranje leukocita na mestu povrede, što imna za posledicu proizvodnju i oslobađanje visokih nivoa reaktivnih kiseoničnih vrsta i citokina. Ovi citokini i reaktivni kiseonični radikali napadaju patogen, ali i oštećuju tkivo domaćina (Jaquier Sarlin, Eksperientia. 50: 1031-1038/1994). Veruje se da kao zaštita protiv ovih toksičnih medijatora upale, tkiva domaćini povećavaju produkciju molekulskih šaperona. Ovako proizvedeni molekulski šaperoni štite ćelije domaćine od povreda izazvanih reaktivnim kiseoničnim vrstama i štite ćelije od citotoksičnosti TNF-a i drugih citokina i reaktivnih kiseoničnih radikala. U životinjanim studijama se pokazalo da prethodno izlaganje životinje toplotnom stresu, uz posledično povećanje ekspresije proteina toplotnog stresa (Hsp70), dovodi do znatnog smanjenja upale pluća. Shodno tome, molekulski šaperoni imaju antiinflamatornu funkciju.
Gornji primeri ilustruju mogućnost molekulskih šaperona da zaštite ćelije od raznih fizioloških stresova koji narušavaju ćelijsku homeostatsku ravnotežu i koji izazivaju povređivanje ćelija. Pokazano je i da su molekulski šaperoni blagotvorni u tretiranju neoplazmi. Na primer, prijavljeno je da kad se tumorskim ćelijama ugradi gen koji kodira molekulski šaperon (65 kd Hsp), one gube tumorogena svjojstva ili pokazuju njihovo smanjenje (PCT Application No. PCT/GB93/02339). Pored toga, prijavljeno je i da tumorske ćelije, kao odgovor na toplotni stres, eksponiraju molekulske šaperone u povećanoj količini. Međutim, oni su prisutni ne u citoplazmi, već na površini ćelijskih membrana (Ferrarini, M. et al., Int. J. Cancer, 51: 613-619/1992/). Povećano prisustvo molekulskih šaperona na površini ćelija povezano je sa povećanom osteljivošću NK ("natural killer" - prirodni ubica) ćelija u odnosu na tumorske ćelije, dozvoljavajući bolje ciljanje, infiltraciju i ubijanje tumorskih ćelija od strane NK ćelija (Kurosavva, S. et al.. Eur. J. Immunol. 23:1029/1993/1.
U pogledu pogodnosti vezanih za povećanu ekspresiju molekulskih šaperona u ćelijama, postupak koji povećava ovakvu ekspresiju ili povećava aktivnost molekulskih Šaperona bio bi jako poželjan.
2. SUŠTINA PRONALASKA
Pronalazak se odnosi na derivate hidroksilamina, čiji su tautomerni oblici prikazani formulama (I) i (H), ili njihove soli, ili njihove optički aktivne stereoizomere koji se mogu upotrebiti prema pronalasku koji je ovde opisan. U gornjim formulama, A je alkil, supstituisana alkil, aralkil, aralkil supstituisana u aril i/ili alkil delu, ari!, supstituisana aril, heteroaril ili supstituisana heteroaril grupa,
Z je kovalentna veza, kiseonik ili =NR<3>, gde je R<3>odabrano iz grupe koju Čine vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril, aralkil, ili aralkil supstituisan u aril i/ili alkil delu, R je alkil ili supstituisani alkil,
X u tautomeru formule (1) je halogen ili supstituisana hidroksi ili amino, monosupstituisana amino ili disupstituisana amino gupa i
X u tautomeru formule (II) je kiseonik, imino ili supstituisana imino gmpa, a
R' je vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril, aralkil, aralkil koji ima supstituisan aril i/ili alkil deo, acil ili supstituisana acil grupa,
i jedinjenja formule (I) opciono sadrže intramolekulsku prstenastu strukturu obrazovanu spajanjem A i reaktivnog supstituenta.
Pronalazak se takođe odnosi na postupke za povećanje ekspresije ili povećanje aktivnosti molekulskih šaperona u ćeliji. Konkretno, prema jednom neograničavajućem izvođenju pronalaska, obezbeđuje se postupak koji se sastoji od tretiranja ćelije koja je izložena fiziološkom stresu efektivnom količinom hemijskog jedinjenja kao što su ona prikazana formulama (I) i (II) tokom, pre ili posle fiziološkog stresa, koja povećava ekspresiju molekulskog šaperona u ćeliji iznad količine izazvane fiziološkim stresom.
Jedno drugo neograničavajuće izvođenje pronalaska je postupak za povećanje aktivnosti molekulskih šaperona u ćeliji izloženoj fiziološkom stresu, koji obuhvata davanje efektivne količine derivata hidroksilamina strukture (I) ili (II). kao što je opisano gore. Prema tome. aktivnost molekulskog šaperona se povećava iznad količine indukovane samo fiziološkim stresom. U bilo kojem od ovih postupaka, poželjno je da je ćelija na koju se primenjuje derivat hidroksilamina eukariotska ćelija.
Prema pronalasku, eukariotske ćelije se tretiraju derivatima hidroksilamina kao što je definisano gore.
Još jedan predmet pronalaska je upotreba derivata hidroksilamina formule (I) ili (II) ili njihovih soli u dobijanju farmaceutskih kompozicija koje mogu da se upotrebe u tretiranju kardiovaskularnih, vaskularnih, cerebralnih, tumorskih oboljenja, oboljenja kože i/ili sluzokože ili oboljenja epitelnih ćelija renalnih tubula, kao i u proizvodnji kozmetičkih kompozicija.
Pronalazak se dalje odnosi na nove derivate hidroksilamina koji imaju širok opseg bioloških efekata i koji su korisni za povećanje nivoa molekulskih šaperona u organizmu ili aktivnosti navedenih molekulskih šaperona i za dobijanje farmaceutskih i kozmetičkih kompozicija primenljivih za ovu svrhu.
Još jedan predmet ovog pronalaska je predstavljen farmaceutskim i kozmetičkim kompozicijama koje sadrže nove derivate hidroksilamina zajedno sa nosačima i pomoćnim sredstvima opšte prihvatljivim u takvim kompozicijama.
Ovaj pronalazak se zasniva, bar delimično, na neočekivanom otkriću da su derivati hidroksilamina, koji imaju gore opisane strukture, kad se upotrebe u tretiranju ćelija, sposobni da povećaju količinu molekulskih šaperona proizvedenih u toj ćeliji ili da pojačaju njihovu aktivnost. Ovaj efekat je naročito veliki kad je ćelija pod fiziološkim stresom koji indukuje ekspresiju molekulskih šaperona. U takvim slučajevima, hemijsko jedinjenje povećava ekspresiju molekulskih šaperona u ćeliji iznad količine indukovane sarno fiziološkim stresom. Ovo otkriće je značajno u pogledu uloge koju molekulski šaperoni igraju u ćelijama koje se brane od patoloških efekata različitih oboljenja. Prema tome, ako je jedinjenje sposobno da poveća količinu ili da pojača aktivnost molekulskih šaperona koji se eksprimiraju u ćelijama, to omogućava ćelijama da se zaštite od štetnih efekata oboljenja i da poprave oštećenja izazvana njima.
KRATAK OPIS SLIKA
Slika 1 prikazuje promene u nivou Hsp u miokardu H9c2 pacova izloženog toplotnom stresu, koje su efekat tretiranja N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)-propoksi]-3-piridinkarboksi-midoil hlorid maleatom. Ovo jedinjenje je obeleženo sa B i na slikama i u daljem tekstu.
Slika 2 prikazuje rezultate gornjeg eksperimenta dobijene Western blot analizom koja se zasniva na denzitometrijskim procenama.
Slika 3 prikazuje rezultate Northern blot analize iRNK za Hsp70, dobijene tokom ispitivanja efekta jedinjenja B na ćelijsku ekspresiju Hsp na transkripcionom nivou.
Slika 4 prikazuje rezultate Northern blot analize iRNK za Hsp26, dobijene na ćelijamaSaccharomyces cerevisiaetokom ispitivanja efekta jedinjenja B na aktivaciju Hsp.
Slika 5 prikazuje efekat benzil alkohola na aktivaciju adenilat ciklaze i stanje plazma membrane.
Slika 6 prikazuje brzinu ekspresije Hsp gena u HeLa ćelijama, uz upotrebu reporter gena za luciferazu kao testa.
Slika 7 ilustruje efekat jedinjenja B na ekspresiju Hsp72 na površini ćelije u ćelijskoj liniji K562.
Slika 8 prikazuje interakciju jedinjenja B i različitih lipidnih membrana, gde se vidi povećanje površinskog pritiska.
Slika 9 prikazuje efekat jedinjenja B u koncentracijama od 10 mM i 100 mM na dvostruki sloj (La) => T heksagonalan (HH) fazni transfer velikih unilamelarnih vezikula đobijenih iz di-palmitoil-fosfatidil etanolamina.
Slika 10 je dijagram efekta jedinjenja B na serumski nivo TNF u zdravim i STZ dijabetičnim pacovima.
Slika 11 prikazuje efekat jedinjenja B na efekat inhibicije rasta keratinocit cikloheksilimida. Slika 12 prikazuje efekat jedinjenja B na efekat oštećenja ćelija cikloheksimidom u endotelnim ćelijama.
Slika 13 prikazuje citoprotektivni efekat jedinjenja B od efekta oštećenja ćelija cikloheksiimidom u HeLa ćelijskoj liniji.
Slika 14 prikazuje efekat jedinjenja B na efekat inhibicije rasta cikloheksilimidom u H9c2 ćelijskoj liniji miokarda pacova.
SlikalS prikazuje efekat jedinjenja B na aktivnost transkripcionog faktora Pl u ćelijama kvasca AB 1380.
Slika 16 prikazuje efekat jedinjenja B na aktivnost transkripcionog faktora AP1 u ćelijama kvasca JF1.
Slika 17 prikazuje efekat jedinjenja B na aktivnost transkripcionog faktora Pl u ćelijama kvasca AB 1380.
Slika 18 prikazuje rezultate testa dobijene na modelu izolovanog funkcionišućeg srca ishemičnog pacova, gde je model tretiran jedinjenjem B, određene Westem blot analizom 2 sata posle ishemije.
Slika 19 prikazuje rezultate testa dobijene na modelu izolovanog funkcionišućeg srca ishemičnog pacova, gde je model tretiran jedinjenjem B, određene Westem blot analizom 3 sata posle ishemije.
Slika 20 prikazuje zaceljivanje rane na STZ dijabetičnim pacovima posle povrede toplotom uz tretiranje kremom koja sadrži 1% jedinjenjaB.
Slika 21 prikazuje zaceljivanje rane na STZ dijabetičnim pacovima posle povrede toplotom uz tretiranje kremom koja sadrži 2% jedinjenja B.
Slika 22 prikazuje zaceljivanje rane na STZ dijabetičnim pacovima posle povrede toplotom uz tretiranje kremom koja sadrži 4% jedinjenja B.
Slika 23 prikazuje zaceljivanje rane na STZ dijabetičnim pacovima posle povrede toplotom uz tretiranje kremom koja sadrži 1% jedinjenja B, ali određeno vizuelno.
Slika 24 prikazuje zaceljivanje rane na STZ dijabetičnim pacovima posle povrede toplotom uz tretiranje kremom koja sadrži 2% jedinjenja B, ali određeno vizuelno.
Slika 25 prikazuje zaceljivanje rane na STZ dijabetičnim pacovima posle povrede toplotom uz tretiranje kremom koja sadrži 4% jedinjenja B, ali određeno vizuelno.
Slika 26 prikazuje uporedne fotografije (tretiranih i kontrolnih), urađene u gornjim testovima tehnikom digitalne epiluminescentne mikroskopije.
Slika 27 prikazuje nivo Hsp 72 u uzorcima dobijenim u prethodnim testovima, određen Westem blot tehnikom, uz tretiranje kremama koje sadrže 1, 2 i 4% jedinjenja B.
Slika 28 prikazuje nivoe Hsp 72 određene imunohistohemijskom analizom (tretiranih i kontrolnih) u SCID miševima izloženim UV-B zracima i tretiranih jedinjenjem B.
Slika 29 prikazuje nivoe Hsp 72 određene Westem blot tehnikom u uzorcima biopsije kože SCID miševa izloženih UV-B zracima i tretiranih jedinjenjem B.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
DERIVATI HIDROKSILAMINA IZ PRONALASKA
Derivati hidroksilamina, čiji su tautomernioblici prikazani formulama (I) i (II), ili njihove soli, ili njihovi optički aktivni stereoizomeri mogu biti korišćeni u skladu sa pronalaskom opisanim ovđe. TJ gornjim formulama A je alkil, supstituisani alkil, aralkil, aralkil supstituisan u aril i/ili alkil delu, aril, supstituisani aril, heteroaril ili supstituisana heteroaril grupa,
Z je kovalentna veza, kiseonik ili =NR<3>, gde je R<3>odabran iz grupe koja sadrži vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril, aralkil i aralkil supstituisan u aril i/ili alkil grupi,
X u tautomeru formule (I) je halogen ili supstituisana hidroksi ili amino, monosupstituisana amino ili disupstituisana amino grupa, a X u tautomeru formule (II) je kiseonik, imino ili supstituisana imino grupa,
R je alkil ili supstituisani alkil,
R' je vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril, aralkil, aralkil koji ima supstituisanu aril ili alkil grupu, acil ili supstituisanu acil grupu,
i jedinjenja formule (I) opciono sadrže intramolekulske prstenaste strukture formirane spajanjem X i reaktivnog supstituenta.
pod uslovom da
a) kada je R supstituisani alkil koji je suptsituisan sa bar hidroksi ili aciloksi, tada X nije halo, i
b) kadajeX-NH2 ili =N-H
tada R nije co-amino-alkil disupstituisan u amino grupi u kojoj dva amino supstituenta,
zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju 3- do 7-člani prsten koji sadrži dodatan(tne) hetero atom(e),
Gde god se pominje "alkil", misli se na linearne ili razgranate alkil grupe koje sadrže i kratke i duge lance.
Tipičan broj ugljenikovih atoma poželjnih alkil grupa kratkih lanaca kreće se u opsegu od 1 do 8 i to mogu biti metil-, etil-, propil-, izopropil-, butil-, izobutil-,se^-butil-,pentil-, terc-pentil-, heksil-, heptil-, oktil- grupe i slične, poželjnije od 1 do 6 i tada mogu biti metil-, etil-, propil-, izopropil-, butil-, izobutil-, jeA-butil-, pentil-, rerc-pentil- i heksil- grupe.
Tipičan broj ugljenikovih atoma poželjnih alkil grupa dugih lanaca kreće se u opsegu od 9 do 21 i to mogu biti nonil-, decil-, undecil-, dodecil-, tridecil, tetradecil-, pentadecil-, heksadecil-, heptadecil, oktadecil-, nonadecil-, eikosil-, heneikosil- grupe i slične, poželjnije od 9 do 17 i tada mogu biti nonil-, decil-, undecil-, dodecil-, tridecil, tetradecil-, pentadecil-, heksadecil- i heptadecil- grupe.
Poželjna cikloalkil grupa označava cikloalkil grupu kratkog cikloalkilnog lanca u opsegu od 3 do 8 i to mogu biti ciklopropil-, ciklobutil-, ciklopentil-, cikloheksil-, cikloheptil-, ciklooktil- grupe i slične, poželjnije od 3 do 7 i tada mogu biti ciklopropil-, ciklobutil-, ciklopentil-, cikloheksil- i cikloheptil- grupe.
Opciono supstituisani aril ili alkil označava aril ili alkil grupu koja ima jedan ili više supstituenata kao što su cijano-, hidroksil-, alkil kratkog lanca (npr. metil-, etil-, propil-, izopropil-, butil-, izobutil-, sek- buti\-, pentil-, terc-pentil-, heksil-, heptil-, oktil- i slične), alkoksi kratkog lanca (npr. metoksi-, etoksi-, propoksi-, izopropoksi-, butoksi-, izobutoksi-,sek-butoksi-, terc-butoksi- pentiloksi-, terc-pentil-oksi-, heksiloksi- i slične), aril- (npr. fenil-, naftil- i slične), nitro-, amino-, mono-(alkil kratkog lanca)-supstituisan amino-(npr. metil, etil, propil, izopropil, terc-butil)-amino i slične, di-(alkil kratkog lanca)-supstituisan amino- (npr. dimetilamino-, dietilamino-, dipropilamino-, diizopropilamino-, dibutilamino-, dipentilamino-, diheksilamino- i slične), raonohalogen-, dihalogen- ili trihalogen (kratkolančani)-alkil- (npr. hlorometil, 2,2-dihloroetil, trifluorometil- i slična) grupa ili atom halogena (npr. fluora, hlora, broma i joda), kao i druge slične.
Poželjna aralkil grupa označava alkil grupu kratkog lanca kao što je napisano gore, supstituisanu jednom ili više aril grupom (po želji supstituisanom) i može biti benzil-, benzhidril-, tritil-, 1-fenil-etil-, 2-feniletil-, 2-benzhidirl-etil-, 3-fenilpropil-, l-metil-2-fenil-etil-, 1-fenilbutil-, 4-tritilbutil-, l,l-dimetil-2-feniletil-, 4-fenilbutil-, 5-fenilpentil-, 6-fenilheksil-grupa i slične, poželjnije niži alkil grupa od 1 do 4 atoma ugljenika, supstituisana fenil grupom i može biti benzil-, 1-feniletil-, 2-feniletil-, i l-metil-2-feniletil grupa. Poželjna aril grupa može biti fenil-, naftil-, pentalenil-, antracenil- grupa i slična, poželjnije fenil- i naftil grupa.
Poželjna zasićena heterociklična grupa sa 3-8 članova, poželjnije 5-8 članova, koja sadrži N, označava zasićenu heterocikličnu grupu koja sadrži 1-4 atoma azota i može biti aziridinil-, azetidinil-, oksaziranil-, pirolidinil-, imidazolidinil-, pirazolidinil-, perhidrotiazolil-, perhidro-izoksazolil-, piperidinil-, piperazinil-, perhidro-piirmidinil-, perhidro-piirdazinil-, morfolinil-, perhidro-lH-azepinil- grupa i slične.
Poželjna heteroaril grupa označava nezasićenu hetero-monocikličnu grupu sa 3-8 članova, poželjnije 5-6 članova, koja sadrži 1-4 N i može biti pirolil-, pirolinil-, imidazolil, pirazolil-, piridil- grupa i njen N-oksid, pirimidinil-, pirazinil-, piridazinil-, triazolil-, tetrazolil-, dihidrotirazinil- grupa i slične; ili označava nezasićenu, kondenzovanu heterocikličnu grupu koja sadrži 1-5 N i može biti indolil-, izoindolil-, indolizinil-, benzimidazolil-, hinolil-, izohinolil-, inđazolil-, benzotriazolil-, tetrazolopiridil-, tetrazolopiirdazinil-, dihidro-triazolopiridazinil- grupa i slične; ili označava nezasićenu hetero-monocikličnu grupu sa 3-6 članova, poželjnije 5-6 članova, koja sadrži 1-3 N i može biti oksazolil-, izoksazolil-, oksadiazolil- (npr. 1,2,4-oksadiazolil- i druge) grupa i slične; ili označava nezasićenu, kondenzovanu heterocikličnu grupu koja sadrži 1-2 kiseonik i 1-3 N i može biti benzoksazolil-, benzoksadiazolil- grupa i slične; ili označava nezasićenu hetero-monocikličnu grupu sa 3-8 članova, poželjnije 5-6 članova, koja sadrži 1-2 sumpor i 1-3 N i može biti tiazolil-, 1,2-tiazolil-, tiazolinil-, tiadiazolil- grupa i slične; ili označava nezasićenu hetero-monocikličnu grupu sa 3-8 članova, poželjnije 5-6 članova, koja sadrži jedan S i može biti tienil-grupa; ili označava nezasićenu hetero-monocikličnu grupu koja sadrži jedan O i može biti furil-grupa; ili označava nezasićenu, kondenzovanu heterocikličnu grupu koja sadrži 1-2 sumpor- i 1-3 N i može biti benzotiazolil-, benzotiadiazolil- grupa i slične.
Poželjna "acil" grupa, sama za sebe ili kad formira deo acilovane grupe, poželjno označava acil grupu koja može biti kratkolančana alkanoil- (npr. formil-, acetil-, propionil, butiril- i slične), kratkolančana alkoksi-karbonil- (npr. metoksi-karbonil-, etoksi-karbonil-, propoksi-karbonil-, butoksi-karbonil-, rerc-butoksi-karbonil- i slične), kratkolančana alkil-sulfonil- (npr. metil-sulfonil-, etil-sulfonil- i slične), aril-sulfonil- (npr. fenilsulfonil- i slične), aroil- (npr. benzoil, naftoil- i slične), aril-(kratkolančana alkanoil)- (npr. fenil-acetil-, fenil-propionil- i slične), ciklo-(kratkolančana alkil)-(kratkolančana alkanoil)- (npr. cikloheksil-acetil i slične), aril-(kratkolančana alkoksi)-karbonil- (npr. benziloksi-karbonil i slične), aril-karbamoil- (npr. fenil-karbamoil-, naftil karbamoil i slične), cikloalkil-karbamoil- (npr. cikloheksil-karbamoil- i slične), hetero monociklična sulfonil- (npr. tienil-sulfonil-, furil-sulfonil- i slične) grupa; i acil grupa može opciono biti supstituisana sa 1-3 supstituenta kao što je napisano gore u delu "opciono supstituisan".
Poželjna co-amino-alkil grupa označava alkil grupu kratkog lanca koja sadrži supstituisan N-atom na co poziciji alkilnog lanca i u kojoj je alkilni lanac opciono supstituisan jednim ili više supstituenata, poželjno jednim ili sa dva halogena (npr. hloro-, bromo-, fluoro-, jodo-), hidroksil grupom ili acilovanom hidroksil grupom, gde je acil grupa definisana ranije; poželjnije jednom ili sa dve kratkolančane alkil grupe i definicija "alkila" je ista kao što je napisano gore. N-atom na co poziciji alkilnog lanca može biti supstituisan jednim ili više supstituenata kratkog alkilnog lanca, poželjno metil-, etil-, terc-butil- i sličnim; cikloalkil karbamoilom- (npr. cikloheksil-karbamoil- i slični), poželjnije N-atom može biti deo zasićene heterociklične grupe koja sadrži 1-4 azotova atoma i može biti aziridinil-, azetidinil-, oksaziranil-, pirolidinil-, imidazolidinil-, pirazoiidinil-, perhidro-tiazolil-, perhidro-izoksazolil-, piperidinil-, piperazinil-, perhidro-piirmidinil-, perhidro-piridazinil-, morfolinil-, perhidro-lH-azepinil- grupa i slične; N-atom na co poziciji može biti supstituisan aril grupom (npr. fenil i slična) i može biti kvaternizovan kratkolančanim alkil supstituentom, a i oksidovan.
Po želji, slobodne baze opštih formula (I) i (II) mogu se transformisati u kisele adicione soli reakcijama sa organskim kiselinama i mogu biti acetat, maleat i slične; ili reakcijama sa neorganskim kiselinama i mogu biti hidrohlorid, hidrobromid, hidrojodid, sulfat, fosfat i slične; ili reakcijama sa amino kiselinama i mogu biti so arginina, so glutaminske kiseline i slične.
U jednom neograničavajućem izvođenju derivata hidroksilamina strukture (I), Z je kovalentna veza, a X je halogen, poželjno hlor ili brom. Poželjna jedinjenja koja pripadaju ovoj grupi imaju kao A (i) aralkil ili aralkil koji ima supstituisanu aril grupu, poželjno fenil alkil ili fenil alkil sa jednim ili više supstituenata, poželjno alkoksi; (ii) aril ili supstituisan aril, poželjno fenil ili supstituisan fenil, poželjno supstituisan fenil sa jednom ili više alkil, halogenih. haloalkil, alkoksi ili nitro grupa; (iii) naftil; (iv) heteroaril grupu koja sadrži N, uključujući one koje mogu biti kondenzovane sa benzenovim prstenom, poželjno piridilom; (v) heteroaril grupu koja sadrži S ili (vi) heteroaril grupu koja sadrži O. Poželjna jedinjenja koja pripadaju ovoj grupi imaju kao R (i) co-amino-alkil, (ii) co-amino-alkil sa mono ili disupstituisanom amino grupom; (iii) o-amino alkil sa supstituisanom alkil grupom; (iv) co-amino alkil sa mono ili disupstituisanom amino grupom, a takođe supstituisanom alkil grupom, sa hidroksi ili aciloksi grupom kao poželjnim supstituentima za alkil grupu. Od co-amino-alkil grupa od (i) do (iv), naročito su poželjne one sa alkil grupom sa 3-8 ugljenikovih atoma.
Određeni tipovi derivata hidroksilamina strukture (I) koji imaju kovalentnu vezu kao Z i halogen kao X su opisani u U.S. Patent Nos. 5,147,879, 5,328,906 i 5,296,606. Ova jedinjenja mogu se dobiti procedurama opisanim u navedenim US patentima, poželjno diazotizacijom odgovarajućih X - NH2derivata u prisustvu pogodnih halogenovodonika. Polazna jedinjenja mogu se dobiti poznatim procedurama opisanim npr. u mađarskom patentu No. 177.578 (1976), naime, spajanjem amidoksima strukture 1 (R<1>= R<2>= H) sa npr. reaktivnim derivatom strukture 2 u prisustvu baze i obično se mogu diazotirati bez izolovanja ili prečišćavanja. Terminalne grupe A i R ovih jedinjenja se mogu dalje pretvoriti u amide ili derivatizovati, po želji.
U jednom drugom neograničavajućem izvođenju derivata hidroksilamina strukture (I), Z je kovalentna veza, a X je supstituisana hidroksi grupa OQ, gde je Q nesupstituisana ili supstituisana alkil ili aralkil grupa. U poželjnom izvođenju, Q je linearan ili razgranat alkil. U ovim jedinjenjima, A je aril ili heteroaril, poželjno heteroaromatična grupa koja sadrži N; a poželjno je da je R (i) co-amino-alkil, (ii) co-amino-alkil sa mono ili disupstituisanom amino grupom; (iii) co-amino alkil sa supstituisanom alkil grupom; (iv) co-amino alkil sa mono ili disupstituisanom amino grupom a i supstituisanom alkil grupom, sa hidroksi ili aciloksi grupom kao poželjnim supstituentima za alkil grupu. Od co-amino-alkil grupa od (i) do (iv), naročito su poželjne one sa alkil grupom sa 3-8 ugljenikovih atoma.
Posebna grupa derivata hidroksilamina strukture (I), gde je Z kovalentna veza, a X je OQ, je strukture (1'). Struktura (1') sadrži prsten zatvoren preko hidroksi grupe. Ova jedinjenja predstavljaju cikličan oblik jedinjenja strukture (I), gde je R -CH2CH(OH)-R", R" je linearan ili razgranat alkil, ili supstituisan linearan ili razgranat alkil, poželjno co-amino-alkil koji je opciono supstituisan na amino grupi poželjno sadrži Cm linearan ili razgranat alkilan lanac. Najpoželjnije, R" je co-amino-alkil mono- ili disupstituisan na amino grupi, gde amino supstituenti, nezavisno jedan od drugog, mogu biti jedan ili dva linearna ili razgranata alkila ili cikloalkila, ili dva amino supstituenta, zajedno sa susednim atomom azota, formiraju heteroprsten sa 3 do 7, poželjno 5 do 7 članova, koji opciono sadrži dodatni hetero atom. Od ovih, poželjna jedinjenja imaju A koji je fenil, supstituisan fenil, heteroaril koji sadrži N, supstituisan heteroaril koji sadrži N, heteroaril koji sadrži S, ili supstituisan heteroaril koji sadrži S.
Derivati hidroksilamina strukture (I) koji imaju kovalentnu vezu na mestu Z i OQ na mestu X su opisani u mađarskoj Patent Application No. 2385/1992. Ova jedinjenja mogu se dobiti od odgovarajućih halogenih derivata gornje grupe (derivati hidroksilamina strukture (I), gde je Z kovalentna veza, a X halogen) procedurama opisani u mađarskoj Pat. Appln. No. 2385/1992, npr., reakcijom sa alkoksidima, ili alkalnim zatvaranjem prstena za ciklična jedinjenja strukture (I').
U jednom neograničavajućem izvođenju derivata hidroksilamina strukture (I), Z je kovalentna veza, a X je NP<J>R<2>, gde su R<1>i R<2>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, supstituisan linearan ili razgranat alkil, cikloalkil, ili R<1>i R<2>, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju zasićen prsten od 3 do 7, a poželjno 5-7 članova.
Od jedinjenja opisanih u prethodnom paragrafu, naročito su poželjna ona gde je R (i) co-amino-alkil, (ii) co-amino-alkil sa mono ili disupstituisanom amino grupom; (iii) co-amino alkil sa supstituisanom alkil grupom; (iv) co-amino alkil sa mono ili disupstituisanom amino grupom, a i supstituisanom alkil grupom, sa hidroksi ili aciloksi grupom kao poželjnim supstituentima za alkil grupu. Od co-amino-alkil grupa od (i) do (iv), posebno su poželjne one sa alkil grupom sa 3-8 ugljenikovih atoma. Od ovih jedinjenja, dalje su poželjna ona koja imaju A koje je (i) aralkil ili aralkil sa supstituisanom alkil grupom, poželjno fenil alkil ili fenil alkil sa jednim ili više supstituenata, poželjno alkoksi; (ii) aril ili supstituisan aril, poželjno fenil ili supstituisan fenil, poželjno supstituisan fenil sa jednom ili više alkil, halogen, haloalkil, alkoksi, nitro, ili acilamino grupa; (iii) naftil; (iv) heteroaril grupa koja sadrži N, uključujući one koje mogu biti kondenzovane sa benzenovim prstenom, poželjno piridilom; (v) heteroaril grupa koja sadrži S ili (vi) heteroaril grupa koja sadrži 0.
Derivati hidroksilamina strukture (I) koji imaju kovalentnu vezu na mestu Z, a NR<]>R<2>na mestu X, uključuju i poznate i nove derivate. Jedinjenja gde je X NEbsu opisana u mađarskom patentu No. 177578 (1976) i mogu biti sintetisana alkilacijom nesupstituisanih derivata amidoksima strukture 1 (struktura 1, gde je R<1=>R<2=>H) reaktivnim derivatom strukture 2 u prisustvu baze.
Specijalna grupa derivata hidroksilamina strukture (I), gde je Z kovalentna veza, a X je NR R , je data strukturom (1"). Struktura (1") predstavlja cikličan oblik strukture (I), koji sadrži prsten zatvoren preko NR^2 grupe. Ova jedinjenja se mogu izvesti iz jedinjenja strukture (I), gde je R<2>H, a R je CH2-CH(OH)-R", R" je linearan ih razgranat alkil ili supstituisan linearan ili razgranat alkil.
Od jedinjenja strukture (I"), poželjna su ona gde je A (i) aril ili supstituisan aril, poželjno fenil ili supstituisan fenil, poželjno supstituisan fenil koji sadrži jednu ili više alkil. halogen, haloalkil, alkoksi, amino ili nitro grupa; (ii) naftil; (iii) heteroaril grupa koja sadrži N, uključujući one koje mogu biti kondenzovane sa benzenovim prstenom; (iv) heteroaril grupa koja sadrži S; i (v) heteroaril grupa koja sadrži O. Posebno poželjna jedinjenja od ovih sadrže R" koje je (i) co-amino-alkil sa mono ili disupstituisanom amino grupom, ili (ii) co-amino alkil sa mono ili disupstituisanom amino grupom, a i supstituisanom alkil grupom, poželjno je da alkil grupa co-amino-alkila (i) i (ii) sadrži 1-5 ugljenikovih atoma. Naročito su poželjna co-amino-alkil grupa sa disupstituisanom amino grupom, gde supstituenti, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, poželjno 5-7 članova. Heterocikličan prsten može da sadrži dodatne heteroatome.
U ovim co-amino-alkil grupama, poželjno je da amino-supstituent bude linearna ili razgranata alkil grupa ili cikloalkil. U jedinjenjima opšte formule (I") R<1>je vodonik, nesupstituisan ili supstituisan linearan ili razgranat alkil, cikloalkil, nesupstituisan aralkil ili aralkil supstituisan u aril- i/ili alkil delu.
Jedinjenja strukture (I") mogu se dobiti zatvaranjem prstena između atoma N(4)-C(5). Zahtevani derivati otvorenog lanca su jedinjenja strukture (I) gde je Z kovalentna veza, X je =NR1R<2>, gde jc R<l>je kao što jc definisan u vezi sa jedinjenjima formule (I") gore, R<2>je H, a R je grupa formule -CH2-CHY<5->R", gde Y5 predstavlja odlazeću grupu, npr., halogen atom. Takvi derivati bi mogli da se dobiju odgovarajućih jedinjenja sa Y<5>=OH sa neorganskim halogenirajućim agensima, npr., tionil hloridom ili fosfor pentahloridom. Halogenacija se može sprovoditi sa ili bez inertnog rastvarača kao što su npr. benzen, hloroform, tetrahidrofuran, itd., obično bez ključanja. Posle uklanjanja viška reagensa npr., uparavanjem tionil hlorida, sirov halogeni derivat se ciklira - bilo posle, bilo bez izolovanja ili prečišćavanja - obradom jakom bazom, npr., kalijum butoksidom u t-butanolu da bi se dobilo jedinjenje I", koje se konačno izoluje ili prečisti standardnim procedurama (ekstrakcija, rekristalizacija, itd).
U jednom neograničavajućem izvođenju derivata hidroksilamina strukture (I), Z je kiseonik, aX je OQ, gde je Q alkil, supstituisan alkil, aralkil, ili aralkil sa supstituisanim arilom ili supstituisanom alkil grupom. Alkil ili supstituisani alkil koji je Q ima poželjno 1-4 atoma ugljenika. Od ovih jedinjenja, poželjna su ona koja imaju A koje je alkil ili supstituisani alkil, poželjno sa 1-4 atoma ugljenika, ili aralkil ili aralkil sa supstituisanim arilom ili supstituisanom alkil grupom. Od ovih jedinjenja, poželjna imaju R koje je (i) co-amino-alkil, (ii) co-amino-alkil sa mono ili disupstituisanom amino grupom; (iii) co-amino alkil sa supstituisanom alkil grupom; (iv) co-amino alkil sa mono ili disupstituisanom amino grupom, kao i supstituisanom alkil grupom, sa hidroksi ili aciloksi grupom kao poželjnim supstituentima za alkil grupu.
Ovi derivati hidroksilamina strukture (I), gde je Z kiseonik, a X je OQ, mogu se dobiti u reakciji O-supstituisanih hidroksilamina strukture 6 (videti npr., Ger. Off. 2,651,083 (1976)) i ortoestara strukture 7. Kondenzacija se obično sprovodi u samom reagensu, kao što je rastvarač, poželjno ključanjem. Posle uparavanja, proizvod se izoluje kristalizacijom, ponekad, (ako postoji amino grupa u bočnom lancu R) u vidu kisele adicione soli.
U jednom neograničavajućem izvođenju derivata hidroksilamina strukture (I), Z je kiseonik, a X je NR<]>R<2>, gde su R<1>i R<2>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, supstituisan linearan ili razgranat alkil, cikloalkil, aril, supstituisan aril, ili R<1>i R<2>, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju zasićen prsten sa 3 do 7, poželjno 5-7 članova. Od ovih jedinjenja, naročito su poželjna ona gde je R (i) co-amino-alkil, (ii) co-amino-alkil sa mono ili disupstituisanom amino grupom; (iii) co-amino alkil sa supstituisanom alkil grupom; (iv) co-amino alkil sa mono ili disupstituisanom amino grupom, kao i supstituisanom alkil grupom, sa hidroksi ili aciloksi grupom kao poželjnim supstituentima za alkil grupu. Od co-amino-alkil grupa iz (i) do (iv), pogotovo su poželjne one sa alkil grupom od 3-8 atoma ugljenika. U ovim jedinjenjima, poželjno je da je A (i) alkil ili supstituisani alkil; (ii) aralkil ili aralkil sa supstituisanim arilom i/ili supstituisanom alkil grupom; ili (iii) arili ili supstituisani aril, poželjno fenil ili supstituisani fenil.
Dobijanje jedinjenja može biti kao što je opisano niže, gde postupci zavise od prirode X, naime, da lije X nesupstituisan amino (NHj) ili supstituisana amino grupa. (i) Dobijanje jedinjenja gde je X NH2može se postići adicijom hidroksilamina strukture 6 na organski cijanat strukture A-O-CN (videti, npr., Chem. Ber. 98, 144 (1965)). Reakcija se poželjno izvodi u inertnom organskom rastvarač, obično na sobnoj temperaturi. Izolovanje često zahteva hromatografsko prečišćavanje. (ii) Jedinjenja sa X koje je monosupstituisana amino grupa (npr., NHR<1>) se dobijaju iz poznatih haloformimidata strukture 9 (videti npr. Houben- Weil, "Methoden del' Organischen Chemie," Band E/4, p. 544 (1983)) i jedinjenja strukture 6, u prisustvu organske baze (npr., trietilamina) ili neorganske baze, kao što je natrij um karbonat u inertnom rastvaraču, kao što je benzen, tetraMdrofuran, itd., iza čega slede standardne procedure obrade i prečišćavanja. (iii) Derivati u kojima je X disupstituisana amino grupa se dobijaju reakcijom sekundarnih amina strukture 5 sa jedinjenjem strukture I, gde je Z kiseonik, a X OQ (dobijanje ovih derivata opisano gore). Ove reakcije aminacije se izvode u polarnim organskim rastvaračima, npr., etanolu, refluksovanjem, ako je potrebno.
U jednom drugom neograničavajućem izvođenju derivata hidroksilamina strukture (I), Z je =NR<3>, gde je R3 je vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril, aralkil, ili aralkil sa supstituisanom aril ili supstituisanom alkil grupom; a X je NR'r<2>, gde su R<5>i R<2>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan iii razgranat alkil, supstituisan linearan ili razgranat alkil, aril ili supstituisani aril, cikloalkil, ili R<1>i R<2>, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju zasićen prsten sa 3 do 7, a poželjno sa 5 do 7 članova.
Od ovih jedinjenja, dalje je poželjno daje A alkil, supstituisani alkil, aralkil, aralkil sa supstituisanom aril ili supstituisanom alkil grupom, aril, ili supstituisana aril grupa. Poželjni R za jedinjenja koja pripadaju ovoj grupi derivata hidroksilamina su (i) co-amino-alkil, (ii) co-amino-alkil sa mono ili disupstituisanom amino grupom; (iii) co-amino alkil sa supstituisanom alkil grupom; (iv) co-amino alkil sa mono ili disupstituisanom amino grupom, kao i supstituisanom alkil grupom, sa hidroksi ili aciloksi grupom kao poželjnim supstituentima za alkil grupu. Poželjno je da alkil deo iz co-amino-alkil grupe iz (i) do (iv) ima 3-8 ugljenikovih atoma.
Derivati hidroksilamina strukture (I), gde je Z NR<3>, a X NR<l>R<2>, mogu se dobiti aminolizom odgovarajućih derivata izouree, koji pripadaju grupi jedinjenja opisanih gore (ova grupa odgovara derivatima hidroksilamina strukture (I) koji imaju kiseonik na mestu Z, a X je NR'R<2>) sa amonijakom ili primarnim ili sekundarnim aminom. Reakcija se poželjno izvodi u polarnom rastvaraču, npr., vodi ili etanolu, uz amin u višku. Alternativno, haloformamidi strukture 10 (Houben- Weil "Methoden der Organischen Chemie," Band E/4, strana 553
(1983)) mogu da reaguju sa jedinjenjem strukture 6 u prisustvu organske ili neorganske baze, da bi dala jedinjenja iz ove grupe. Reakcija se izvodi u inertnom organskom rastvaraču, obično na sobnoj temperaturi.
Jedinjenja gde je R grupa formule (b), gde je R<7>acil, se dobijaju esterifikovanjem odgovarajućih jedinjenja koja imaju vodonik na mestu R<7>, Alkil- ili aril estri se obično dobijaju upotrebom kiselog hlorida ili anhidrida u prisustvu tercijernog amina ili neorganske baze, poželjno u inertnom rastvaraču.
Jedna druga grupa derivata hidroksilamina korisna u ovom pronalasku ima strukturu (II), koja predstavlja tautomeran oblik jedinjenja strukture (I). U neograničavajućem izvođenju derivata hidroksilamina strukture (II), Z je kovalentna veza, a X je kiseonik. Poželjna jedinjenja koja pripadaju ovoj grupi imaju A koje je (i) alkil, aralkil ili aralkil sa supstituisanim aril ili alkil delom; (ii) aril ili supstituisan aril, poželjno fenil ili supstituisani fenil sa jednim ili više supstituenata, poželjne supstituentne grupe uključuju alkil, haloalkil ili alkoksi grupu; (iii) heteroaril grupa koja sadrži N, poželjno piridil; ili (iv) heteroaril grupa koja sadrži S. Za jedinjenja koja pripadaju ovoj grupi, poželjno Rje (i) co-amino-alkil, (ii) co-amino-alkil sa mono ili disupstituisanom amino grupom; (iii) co-amino alkil sa supstituisanom alkil grupom; (iv) co-amino alkil sa mono ili disupstituisanom amino grupom, a takođe supstituisanom alkil grupom, sa hidroksi ili aciloksi grupom kao poželjnim supstituentima za alkil grupu. Od co-amino-alkil grupa iz (i) do (iv), naročito su poželjne one gde alkil grupa ima 3-8 ugljenikovih atoma. Poželjna jedinjenja ove grupe imaju R' koje je vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril, aralkil, ili aralkil sa supstituisanim aril ili alkil delom.
Jedinjenja koja pripadaju ovoj grupi su opisana u mađarskoj Patent Application No.
2385/1992. Načini njihovih dobijanja su opisani tamo, najpoželjnije, mogu se dobiti acilacijom O-supstituisanih derivata hidroksilamina strukture 6 (videti i, npr., Ger. Off. 2,651,083 (1976)) sa kiselim hloridom strukture II. Ovaj način se može koristiti i za dobijanje onih novih derivata, gde R' nije vodonik, upotrebom jedinjenja strukture 12 umesto strukture 6 kao početnog materijala.
U jednom drugom neograničavajućem izvođenju derivata hidroksilamina strukture (II), Z je hemijska veza; X je =NR<4>, gde je R<4>H, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril, aralkil, aralkil sa supstituisanom aril ili supstituisanom alkil grupom, cikloalkil; a R' je alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril, aralkil, ili aralkil sa supstituisanom aril ih supstituisanom alkil grupom. Među ovim jedinjenjima, poželjna su ona gde je A (i) aralkil ili aralkil sa supstituisanom aril grupom, poželjno fenil alkil ili fenil alkil sa jednim ili više supstituenata, poželjno alkoksi; (ii) aril ili supstituisan aril, poželjno fenil ili supstituisan fenil, poželjno supstituisan fenil sa jednom ih više alkil, haloalkil ili nitro grupa; (iii) naftil; (iv) heteroaril grupa koja sadrži N, poželjno piridil; ili (v) heteroaril grupa koja sadrži S. Poželjna jedinjenja koja pripadaju ovoj grupi imaju kao R (i) co-amino-alkil, (ii) co-amino-alkil sa mono ili disupstituisanom amino grupom; (iii) co-amino alkil sa supstituisanom alkil grupom; (iv) co-amino alkil sa mono ili disupstituisanom amino grupom, a takođe supstituisanom alkil grupom, sa hidroksi ili aciloksi grupom kao poželjnim supstituentima za alkil grupu. Od co-amino-alkil grupa iz (i) do (iv), naročito su poželjna ona gde alkil deo ima 3-8 ugljenikovih atoma.
Ova jedinjenja se mogu dobiti bilo O-alkilacijom N,N' -disupstituisanog amidoksima strukture 13 sa hemijskim jedinjenjem strukture 2 (za uslove reakcije, videti dobijanje jedinjenja strukture I, gde je Z kovalentna veza, X NR'R<2>), ili O-acilovanjem N,0-disupstituisanog hidroksilamina formule 12 sa imidoil halidom formule 16, gde se reakcija odvija u inertnom rastvaraču, poželjno u prisustvu organskog ili neorganskog skevendžera kiseline.
Jedinjenja gde je R grupa formule (b), gde je R<7>acil, se dobijaju esterifikacijom odgovarajućih jedinjenja koja imaju vodonik kao R<7>. Alkil- ili aril estri se obično dobijaju uz upotrebu kiselog hlorida ili anhidrida u prisustvu tercijemog amina ili neorganske baze, poželjno u inertnom rastvaraču.
U još jednom neograničavajućem izvođenju derivata hidroksilamina strukture (II), Z je kiseonik i X je kiseonik. Poželjna jedinjenja koja pripadaju ovoj grupi imaju A koje je alkil, supstituisani alkil, aralkil, ili aralkil sa supstituisanom aril ili alkil grupom. Poželjno je da R bude (i) co-amino-alkil, (ii) co-amino-alkil sa mono ili disupstituisanom amino grupom; (iii) co-amino alkil sa supstituisanom alkil grupom; (iv) co-amino alkil sa mono ili disupstituisanom amino grupom, a takođe supstituisanom alkil grupom, sa hidroksi ili aciloksi grupom kao poželjnim supstituentima za alkil grupu. Od co-amino-alkil grupa iz (i) do (iv), naročito su poželjna ona gde alkil deo ima 3-8 ugljenikovih atoma. Poželjna jedinjenja ove grupe imaju R' koje je vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril, aralkil, ili aralkil sa supstituisanom aril ili alkil grupom.
Jedinjenja koja pripadaju ovoj grupi su opisana u mađ. Patent Application No. 1756/95 (zavedenoj 15. juna, 1995). Ona se dobijaju acilacijom hidroksilamina strukture 6 ili strukture 12 hloroformatom strukture 14, na sličan način kao sa običnim hloridima, kao što je opisano za sintezu jedinjenja strukture IL gde je Z kovalentna veza, a X kiseonik. Reakcija zahteva prisustvo baze, neorganske ili organske i može da se odvija u inertnom rastvaraču, npr., u hloroformu. So koja je bočni proizvod se ukloni, npr., ekstrakcijom vodom i proizvod se izoluje iz organskog rastvora.
A u još jednom neograničavajućem izvođenju derivata hidroksilamina strukture (II), Z je kiseonik; X je =NR<4>, gde je R<4>alkil, supstituisan alkil, aralkil, aralkil sa supstituisanom aril ili alkil grupom, aril, supstituisan aril, heteroaril ili supstituisana heteroaril grupa. U ovim jedinjenjima poželjno je da je A alkil, supstituisan alkil, aril, supstituisan aril, najpoželjnije nesupstituisan ili supstituisan fenil, aralkil ili aralkil sa supstituisanom aril ili alkil grupom, a poželjno je da je R co-amino alkil, koji pogodno sadrži hidroksi ili aciloksi grupu u alkilnom lancu i opciono je supstituisan na azotu amina, gde alkilni lanac navedene co-amino alkil grupe poželjno sadrži 3-8 ugljenikovih atoma. U ovim jedinjenjima, poželjan R'je alkil, aril ili aralkil, koji mogu biti nesupstituisani ili supstituisani.
Ova jedinjenja su N-supstituisani analozi derivata hidroksilamina strukture (I), gde je Z kiseonik, a X je NR'R<2>i mogu se dobiti na sličan način iz haloformimidata strukture 9 i hemijskog jedinjenja strukture 12, u prisustvu organske baze (npr., trietilamina) ili neorganske baze, npr. natrijum karbonata u inertnom rastvaraču, kao što je benzen, tetrahidrofuran itd., iza čega slede standardne procedure obrade i prečišćavanja.
A u još jednom neograničavajućem izvođenju derivata hidroksilamina strukture (II), Z je =NR , gde je R je odabran iz grupe koju čine vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril, aralkil i aralkil sa supstituisanom aril ili alkil grupom; a X je kiseonik. Poželjna jedinjenja iz ove grupe imaju A koje je (i) aralkil ili aralkil sa supstituisanom aril ili alkil grupom, poželjno fenilalkil ili fenilalkil sa jednim ili više supstituenata: (ii) aril ili supstituisan aril, poželjno fenil ili supstituisan fenil, poželjno supstituisan fenil sa jednim ili više alkil, alkoksi, halogen, haloalkil ili nitro grupa; (iii) heteroaril grupa koja sadrži N; ili (iv) alkil ili supstituisani alkil, linearan ili razgranat, poželjno sa 4 do 12 ugljenikovih atoma, ili (v) cikloalkil grupa. Poželjna jedinjenja koja pripadaju ovoj grupi imaju (i) co-amino-alkil, (ii) co-amino-alkil sa mono ili disupstituisanom amino grupom; (iii) co-amino alkil sa supstituisanom alkil grupom; (iv) co-amino alkil sa mono ili disupstituisanom amino grupom, a takođe supstituisanom alkil grupom, sa hidroksi ili aciloksi grupom kao poželjnim supstituentima za alkil grupu. Od co-amino-alkil grupa od (i) do (iv), naročito su poželjne one sa alkil grupom sa 3-8 ugljenikovih atoma. U ovim jedinjenjima poželjan R' je vodonik, alkil, supstituisani alkil, aralkil ili aralkil sa supstituisanom aril ili alkil grupom, aril, supstituisan aril, acil ili supstituisana acil grupa.
Ova jedinjenja su opisana u mađarskoj patentnoj prijavi koja je u toku Patent Application No. 1756/95 i mogu se dobiti reakcijom hidroksilaminskog jedinjenja strukture 6 ili strukture 12 sa izocijanatom strukture 15, u inertnom rastvaraču, obično jednostavnim mešanjem smesc 2-24 sata na sobnoj temperaturi. Konačno, proizvodi se izoluju - posle uparavanja rastvarača - poželjno kristalizacijom.
U jednom neograničavajućem izvođenju derivata hidroksilamina strukture (II), Z je =NR<3>, gde je R3 je odabran iz grupe koju čine vodonik, alkil, supstituisan alkil, aril, supstituisan aril, aralkil, i aralkil sa supstituisanom aril ili alkil grupom; X je =NR<4>, gde je R<4>H, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril, aralkil, aralkil sa supstituisanom aril ili supstituisanom alkil grupom, cikloalkil, a R' je alkil, supstituisani alkil, aralkil, ili aralkil sa supstituisanom aril ili alkil grupom, ili aril ili supstituisani aril. Poželjna jedinjenja koja pripadaju ovoj grupi imaju kao R<3>vodonik, alkil ili supstituisani alkil. R4 je vodonik ili aril grupa, A je alkil, supstituisani alkil, aril ili supstituisani aril, ili aralkil, koji može biti supstituisan u aril i/ili alkil grupi. Od ovih jedinjenja, poželjna imaju R koje je (i) co-amino-alkil. (ii) co-amino-alkil sa mono ili disupstituisanom amino grupom; (iii) co-amino alkil sa supstituisanom alkil grupom; (iv) co-amino alkil sa mono ili disupstituisanom amino grupom, a takođe supstituisanom alkil grupom, sa hidroksi ili aciloksi grupom kao poželjnim supstituentima za alkil grupu. Od co-amino-alkil grupa iz (i) do (iv), naročito su poželjne one sa alkil grupom sa 3-8 ugljenikovih atoma.
Dobijanje jedinjenja koja pripadaju ovoj grupi može se postići aminolizom odgovarajućih derivata izouree (jedinjenja sa strukturom (II), gde je Z je kiseonik, X je NR<4>) primarnim ili sekundarnim aminom ili amonijakom. Reakcija se poželjno izvodi u polarnom rastvaraču, npr., vodi ili etanolu, uz višak amina. Alternativno, halogeni formamidini strukture 10 mogu da reaguju sa jedinjenjem strukture 12 u prisustvu organske ili neorganske baze u inertnim rastvaračima, obično na njihovoj tački ključanja.
Jedno neograničavajuće izvođenje derivata hidroksilamina strukture (I) definiše novu grupu jedinjenja, gde je X halogen, poželjno hlor ili brom; Z je hemijska veza, a A je grupa formule (a), gde je Y<]>je halogen, alkoksi, nitro grupa ili haloalkil grupa, poželjno haloalkil sa 1-4 ugljenikovih atoma; a nje 1, 2, ili 3; ili heteroaril koji sadrži O, poželjno furil, heteroaril koji sadrži S (poželjno tienil), ili heteroaril grupa koja sadrži N (poželjno piridil, hinolil, ili izohinolil) koja može biti kondenzovana sa benzenovim prstenom, a R je grupa strukture (b), gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, poželjno supstituisan linearan ili razgranat alkil, poželjno Cm alkil, ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, a poželjno sa 5 do 7 članova, Y<6>je -OR<7>, gde je R<7>H ili acil grupa, poželjno alkil karbonil, supstituisan alkil karbonil, aril karbonil ili supstituisan aril karbonil, ili aminoacil ili supstituisan aminoacil; k je 1,2 ili 3 i m je 1, 2, ili 3, uz uslov da, kad je A piridil ili naftil, ili grupa formule (a) gde je Y" halogen ili alkoksi, onda R<7>nije H. Ova jedinjenja mogu opciono da sadrže kao A heteroaromatičnu grupu koja sadrži N sa N-kvaternarnim Cm alkilom ili oksid navedene heteroaromatične grupe koja sadrži N i/ili R, gde je prsten, koji formiraju terminalne grupe R<6>i R7, N-kvaternaran ili N-oksidovan zasićen heterocikličan prsten. Poželjna su, među ovim jedinjenjima, ona gde je A grupa formule (a), gde je Y<]>trifluorometil. Ova grupa derivata hidroksilamina formule (I) uključuje i optički aktivne stereo izomere jedinjenja gde je X halogen, A piridil, Z hemijska veza, a R je grupa formule (b), gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearni ili razgranati alkil, poželjno Cmalkil ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju heterocikličan prsten sa 3 do 7, a poželjno sa 5 do 7 članova, Y<6>je -OR<7>, gde je R<7>aminoacil, k je 1,2 ili 3 i m je 1, 2 ili 3.
Ova nova jedinjenja mogu se dobiti korišćenjem procedura analognih onima koje su opisane u U.S. Patent Nos. 5,147,879; 5,328,906 i 5,296,606. Na primer: (i) Derivati u kojima nijedan od R<5>i R<6>nije vodonik, se dobijaju diazotizacijom odgovarajućih NH2derivata (derivati hidroksilamina strukture (I), gde je Z kovalentna veza, a X je NH2) u prisustvu odgovarajućeg halogenovodonika, slično postupku opisanom u U.S. Patent Nos. 5,147,879; 5,328,906 i 5,296,606. Početna jedinjenja se takođe mogu dobiti poznatim postupkom opisanom, npr., u mađarskom Patent No. 177578, naime, spajanjem amidoksima strukture 1, gde su R<1>i R<2>strukture 1 H, sa npr. reaktivnim derivatom strukture 2 u prisustvu baze, i mogu se diazotizovati obično bez izolovanja ili prečišćavanja. (ii) Ako je u željenoj strukturi R<7>H, a m je 1, sinteza se može postići reakcijom oksirana strukture 3 i amina strukture 4. Ovaj postupak se može koristiti i za sintezu derivata sa R<5>=H. (iii) Jedinjenja gde je R grupa strukture (b) i gde je R<7>u ovoj grupi acil grupa, dobijaju se esterifikacijom odgovarajućih derivata sa R<7->H. Alkil ili aril estri se obično dobijaju uz upotrebu kiselog hlorida ili anhidrida u prisustvu tercijernog amina ili neorganske baze, poželjno u inertnom rastvaraču, ili u nekim slučajevima Schotten-Bauman-ovom procedurom, uz upotrebu vodene neorganske baze u dvofaznom sistemu. Za dobijanje aminoacil estara, karboksil-aktivirani N-zaštićeni aminokiselinski derivati (npr., aktivni estri) se koriste kao reagensi u postupcima načelno poznatim iz peptidne hernije. Ovo spajanje takođe zahteva prisustvo baze (npr. trietilamina). Izolovanje i prečišćavanje proizvoda se vrše korišćenjem standardnih preparativnih tehnika; konačan preparat je često u obliku soli sa odgovarajućom neorganskom ili organskom kiselinom. Počev od hiralnih aminokiselina, proizvodi su često dijastereomeri, koji imaju drugi hiralni centar u R grupi. Tokom izolovanja, ovi dijastereomeri se često razdvoje i proizvod se može dobiti stereo-čistoj formi.
Jedinjenja strukture (I), gde je Z hemijska veza, a X je halogen, poželjno hlor ili brom, A je grupa formule (c), a R je grupa formule (d); jedan ili oba Y<2>i Y<3>, od kojih bar jedan mora biti prisutan u molekulu, su kiseonik, ili alkil ili supstituisan alkil sa 1-4 ugljenikovih atoma; k je 1, 2, ih 3 i m je 1, 2, ili 3, Y i Y su spojeni isprekidanom linijom, koja označava opciono prisustvo ovih supstituenata, su takođe novi derivati hidroksilamina. Kad je jedinjenje jedno- ili dvovalentan katjon, njegov anjon je jedan ili dva halogenida, poželjno jodidni jon.
Ovi derivati hidroksilamina se dobijaju hemijskim modifikacijama (tj., N-oksidacijom ili kvaternerizacijom) terminalnih piridinskih i/ili piperidinskih grupa u njihovim nesupstituisanim prekursorima. Za oksidaciju, poželjno je da se koriste perkiseline, npr. supstituisane perbenzoične kiseline, u inertnim rastvaračima (npr., hloroform, dihlorometan). Ako su obe oksidzabilne grupe prisutne u molekulu, mogu se obrazovati mono- ili dioksidi, u zavisnosti od upotrebljene količine reagensa. Na kraju reakcije, višak reagensa se razgradi i proizvod se izoluje uparavanjem. Kvaternerizacija se može postići alkil halogenidima (npr.. metil jodidom), poželjno refluksovanjem reagensa u pogodnom rastvaraču, npr., acetonu. Proizvod je često nerastvorljiv u medijumu i može se izolovati prostom filtracijom.
Još jedan nova grupa jedinjenja koja pripadaju derivatima hidroksilamina strukture (I) su ona gde je Z hemijska veza, A je aralkil, supstituisan aralkil, poželjno fenilalkil koji može imati jednu ili više alkoksi, poželjno alkoksi sa 1 do 4 ugljenikova atoma, fenil, supstituisani fenil sa jednim ili više supstituenata, poželjne supstituentske grupe uključuju alkil, poželjno alkil ili haloalkil sa 1 do 4 ugljenikova atoma, halo, acilamino ili nitro grupu; ili heteroaril grupa koja sadrži N, koja može biti kondenzovana sa benzenovim prstenom, koji je poželjno pirolil, piridil, izohinolil ili hinolil, ili heteroaromatična grupa koja sadrži sumpor, poželjno tienil, gde heteroaril grupe mogu biti supstituisane jednim ili više alkila, poželjno alkilom sa 1 do 4 ugljenikova atoma; X je -NR<l>R<2>, gde su R<1>i R<2>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, supstituisan linearan ili razgranat alkil, poželjno alkil sa 1 do 6 ugljenikovih atoma, cikloalkil, ili R<l>i R<2>, zajedno sa vezanim atomom azota, mogu da formiraju zasićen heteroprsten sa 3 do 7, a poželjno sa 5 do 7 članova; R je grupa formule (e), gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, ili supstituisan linearan ili razgranat alkil, poželjno alkil sa 1 do 4 ugljenikova atoma, ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju zasićen heteroprsten sa 3 do 7, a poželjno sa 5 do 7 članova, koji može da ima dodatne hetero atome i supstituente, gde su poželjni supstituenti alkili sa 1 do 4 ugljenikova atoma; Y<*>je H, ili alkil ih supstituisan alkil sa 1-4 ugljenikova atoma; Y<5>je H, ili alkil ili supstituisan alkil sa 1-4 ugljenikova atoma, ili OR<7>, gde je R<7>H ili acil; k je 1, 2, ili 3 i m je 1, 2, ili 3, uz uslov da
kad je A fenil koji je nesupstituisan ili supstituisan halogenom ili alkoksi, ili fenilalkil supstituisan alkoksi, ili piridil grupa i R<7>je H, onda bar jedan od R<1>i R<2>nije H, ili kad je A fenil koji je nesupstituisan ili supstituisan halogenom ili alkoksi; fenilalkil supstituisan alkoksi; ili piridil, i kad su obaR<l>iR<2>H, onda R<7>nij<e>H.
Jedinjenja gde je X derivat NH2, se dobijaju - slično gorepomenutoj proceduri - reakcijom odgovarajućih intermedijera strukture 1, gde su R<l>i R<2>strukture 1 H, sa jedinjenjem strukture 2. Alkilujuće sredstvo (strukture 2) može da sadrži hidroksil i/ili amino supstituente. Reakcija zahteva prisustvo neorganske ili organske baze, rastvor alkoholnog alkoholata se koristi kao međijum i baza na poželjan način. Proizvodi se često izoluju u vidu soli sa pogodnim organskim ili neorganskim kiselinama.
Još jednu grupu gornjih novih jedinjenja karakterišuR<1>iR<2>, gde bar jedan od njih nije H u ovim derivatima. Takve strukture se mogu dobiti na jedan od dva načina: (i) Amidoksim strukture 1, koji već sadrži zahtevanc supstituente R<1>i/ili R<2>, može da reaguje sa reaktivnim jedinjenjem strukture 2, slično postupku opisanom u prethodnom paragrafu. Supstituisani amidoksimi strukture I, korišćeni kao početni materijali, su poznati iz literature [Chem. Rev. 62^155-183 (1962)]. (ii) Supstitucija halogenih atoma u jedinjenjima strukture (1), gde je Z kovalentna veza i X je halogen, aminom strukture 5 može isto tako da da slična jedinjenja. U slučaju derivata koji imaju OH supstituent u R grupi (Y<4>=OH), ova hidroksilna grupa mora da bude zaštićena ranije i da joj se skine zaštita posle reakcije supstitucije, inače se favorizuje formiranje cikličnih derivata strukture (1'). Za zaštitu su se pokazale kao najbollje zaštitne grupe acetilnog tipa, npr,, tetrahidropiranil grupa. Zaštita se izvodi reakcijom nezaštićenog jedinjenja dihidropiranom, posle čega se vrši zamena halogen/amin, što obično zahteva refluksovanje u rastvaraču, npr., u alkoholu. Konačno skidanje zaštite sa proizvoda može se postići obradom kiselinom, npr., ključanjem etanolnog rastvora u prisustvu npr. p-toluensulfonske kiseline.
Kao što je pomenuto, jedna grupa novih jedinjenja takođe uključuje ona gde je Y<5>aciloksi grupa. Ona se mogu dobiti acilacijom odgovarajućih Y<5>-OH derivata, koji su ili poznati iz literature (npr., mađ. Patent No. 177578) ili opisana u ovom pronalasku. Reakcije se mogu izvesti identično postupku koji je opisan za analogne halogene derivate, gde je R<7>acil grupa (postupak (iii)).
Novi derivati hidroksilamina formule (I) uključuju i one gde je Z kiseonik ili =NR<3>grupa, gde je R<3>nesupstituisana ili supstituisana alkil grupa, X jc -NE^R<2>, R<1>i R<2>su, nezavisno jedan od drugog, vodonik, nesupstituisan ili supstituisan linearan ili razgranat alkil, nesupstituisan ili supstituisan aril, poželjno fenil ili nesupstituisana ili supstituisana aralkil grupa ili R<1>i R<2>, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, a poželjno sa 5 do 7 članova, koji opciono sadrži jedan ili više hetero atoma. U ovim jedinjenjima, A je nesupstituisan ili supstituisan alkil ili nesupstituisan ili supstituisan aril, poželjno fenil ili supstituisan fenil grupa ili nesupstituisana ili supstituisana aralkil grupa, a R je grupa formule (b), gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, poželjno Cj^ alkil, ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, a poželjno sa 5 do 7 članova, Y6 je H ili -OR<7>, gde je R<7>H ili acil, poželjno nesupstituisan ili supstituisan alkilkarbonil ili arilkarbonil, k je 1, 2 ili 3 i m je 1,2 ili 3.
Novi derivati hidroksilamina, gde je Z kiseonik i X je -OR, gde je Q nesupstituisana ili supstituisana alkil ili nesupstituisana ili supstituisana aralkil grupa, A je nesupstituisana ili supstituisana alkoksi grupa ili nesupstituisana ili supstituisana aralkil grupa, a R je grupa formule (b), gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, poželjno Cmalkil, ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, a poželjno sa 5 do 7 članova, Y<6>je H ili -OR<7>, gde je R<7>H ili acil, poželjno nesupstituisan ili supstituisan alkilkarbonil ili arilkarbonil 1, k je 1, 2 ili 3 i m je 1, 2 ili 3, spadaju takođe u opseg jedinjenja formule (I).
Jedna druga grupa novih derivata hidroksilamina formule (I) je predstavljena onima gde je A nesupstituisan ili supstituisan aril, poželjno fenil ili heteroaromatčna grupa koja sadrži N, poželjno piridil ili heteroaromatična grupa koja sadrži S, Z je hemijska veza, X je -OQ, gde je Q Cm alkil, aRje grupa formule (b), R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, poželjno Cm alkil ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju heterocikličan prsten sa 3 do 7, a poželjno sa 5 do 7 članova, Y* je H, k je 1,2 ili 3 i m je 1,2 ili 3.
Ova jedinjenja se dobijaju reakcijom odgovarajućih derivata hidroksilamina formule (I), gde je X halogen i odgovarajućih alkoholata, poželjno u alkoholu odgovarajućem alkoholatu, poželjno refiuksovanjem. Reakciona smesa se obrađuje postupcima poznatim u struci i proizvod s izoluje hromatografijom ili obrazovanjem soli.
Novi derivati hidroksilamina formule (II) su takođe uključeni u grupu jedinjenja gde je X kiseonik, A je C1-20linearan ili razgranat alkil, nesupstituisan ili supstituisan aril, poželjno fenil ili halofenil, nesupstituisan ili supstituisan aralkil, naftil ili heteroaromatična grupa koja sadrži N, poželjno piridil, Z je hemijska veza, R'je H, Cm alkil ili aralkil, poželjno fenilalkil, R je grupa formule (b), gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, poželjno Cm alkil ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju heterocikličan prsten sa 3 do 7, a poželjno sa 5 do 7 članova, Y6 je H ili -OR<7>, gde je R<7>H, k je 1,2 ili 3 i m je 1, 2 ili 3, uz uslov da, kad A nije alkil, a R'je H, R6 je H.
Nova jedinjenja, gde je Z kovalentna veza, kiseonik ili =NR<3>grupa, gde je R<3>vodonik ili nesupstituisana ili supstituisana alkil grupa, X je =NR<4>, gde je R<4>vodonik, nesupstituisan ili supstituisan alkil ili nesupstituisan ili supstituisan aril, poželjno fenil, ili supstituisan ili nesupstituisan aralkil, poželjno fenilalkil, spadaju takođe u opseg jedinjenja formule (II), uz uslov da, kad je R<4>H, R nije co-amino-alkil disupstituisan u amino grupi u kojoj dva amino supstituenta, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju 3- do 7-člani prsten koji sadrži dodatni(e) hetero atom(e). U ovim jedinjenjima, A je nesupstituisan ili supstituisan alkil ili nesupstituisan ili supstituisan aril, poželjno fenil ili supstituisan fenil, ili nesupstituisan ili supstituisan aralkil, poželjno fenilalkil, ili cikloalkil, R'je nesupstituisan ili supstituisan alkil ili nesupstituisan ili supstituisan aril, poželjno fenil, ili nesupstituisan ili supstituisan aralkil, poželjno fenilalkil, R je grupa formule (b), gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, poželjno Cm alkil ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju heterocikličan prsten sa 3 do 7, a poželjno sa 5 do 7 članova, Y6 je H ili -OR<7>, R7 je H ili acil, poželjno nesupstituisan ili supstituisan alkilkarbonil ili arilkarbonil, k je 1, 2 ili 3 i m je 1, 2 ili 3, uz uslov da,
kad je A fenil, fenil supstituisan halogenom ili alkoksi, ili fenilalkil supstituisan alkoksi ili piridil grupa i R<7>je H, R<4>nije H,
kad je A fenil, fenil supstituisan halogenom ili alkoksi, ili fenilalkil supstituisan alkoksi ili piridil grupa i R<4>je H, R<7>nije H.
Novi derivati hidroksilamina su i oni čija je formula (II) gde je X kiseonik, A je nesupstituisan ili supstituisan alkil, nesupstituisan ili supstituisan aralkil, poželjno fenilalkil, Z je kiseonik, R' je alkil ili aralkil, poželjno fenilalkil, R je grupa formule (b), gde su R<5>i R6, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, poželjno Cm alkil ili cikloalkil, ili R<5>i R6, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju heterocikličan prsten sa 3 do 7, a poželjno sa 5 do 7 članova, Y<*>je H ili -OR<7>, R<7>je H ili acil, poželjno nesupstituisan ili supstituisan alkilkarbonil ili arilkarbonil, k je 1, 2 ili 3 i m je 1, 2 ili 3. Jedinjenja hidroksilamina formule (II), gde je X kiseonik i Z je =NH, su takođe nova jedinjenja.
Jedna grupa ovih jedinjenja se formira iz onih gde je A nesupstituisan ili supstituisan alkil, cikloalkil, nesupstituisan ili supstituisan aralkil, poželjno fenilalkil, nesupstituisan fenil ili fenil supstituisan halogenom, alkil, haloalkil, alkoksi ili nitro, R je grupa formule (b), gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od dragog, H, linearan ili razgranat alkil, poželjno Cmalkil ili cikloalkil, ili R5 i R<6>, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju heterocikličan prsten sa 3 do 7, a poželjno sa 5 do 7 članova, Y* je H ili -OH, k je 1,2 ili 3 i m je 1, 2 ili 3.
Jedna druga grupa ovih jedinjenja se formira iz onih gde je A grupa formule (a), gde je Y' je haloalkil, poželjno trifluorometil i n je 1, 2 ili 3, R' je H, a R je grupa formule (b), gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, poželjno Cm alkil ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju heterocikličan prsten sa 3 do 7, a poželjno sa 5 do 7 članova, Y6 je H ili -OH, k je 1, 2 ili 3 i m je 1, 2 ili 3.
Novi derivati hidroksilamina prema pronalasku uključuju i ciklična jedinjenja formule
(I"), gde je A nesupstituisan fenil ili fenil supstituisan halogenom ili nitro, ili heteroaril koji sadrži N, R<1>je H, a R" je co-amino-alkil grupa mono- ili disupstituisana na amino grupi, čiji alkilni lanac ima 1 do 5 ugljenikovih atoma, a amino supstituenti, nezavisno jedan od drugog, mogu biti jedan ili dva linearna ili razgranata alkila ili cikloalkila, ili dva amino supstituenta, zajedno sa susednim atomom azota, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, a poželjno sa 5 do 7 članova, ili njegov Cm alkil N-kvaternaran derivat, uz uslov da, kad je A 3-piridil, R" nije 1-piperiđinilmetil.
4.2 POSTUPAK POVEĆAVANJA EKSPRESIJE MOLEKULSKIH ŠAPERONA U ĆELU AMA
Ovaj pronalazak se odnosi na postupak povećanja ekspresije molekulskih Šaperona u ćelijama, tretiranjem ćelija i tkiva efektivnom količinom hiđroksilamin derivata. Derivati hidroksilamina, čiji su tautomemi oblici predstavljeni formulom (I) ili (II), mogu se koristiti u ovom postupku. Strukture formula (I) i (II) su diskutovane detaljno u odeljku 4.1.
U jednom neograničavajućem izvođenju ovog pronalaska, dat je postupak povećanja ekspresije molekulskih šaperona u ćelijama izloženim stresu. U ovom postupku, ćelije izložene fiziološkom stresu koji indukuje ekspresiju molekulskih šaperona u ćelijama tretirane su efektivnom količinom derivata hidroksilamina, čiji su tautomemi oblici predstavljeni formulama (I) i (II), posle pojave stresa. Derivati hidroksilamina povećavaju ekspresije molekulskih šaperona u ovim ćelijama iznad količine indukovane fiziološkim stresom.
Termin "molekulski šaperon", kao što se ovde koristi, odnosi se na protein koji pomaže drugim proteinima da se saviju u pravilne ili aktivne konformacije, obično nekovalentnim vezivanjem za te proteine.
Šaperoni ne samo da pomažu popravljanju i obnavljanju tek sintetisanih proteina, nego i onih koji su se denaturisali ili se pogrešno uvili. Molekulski šaperoni uključuju, između ostalih, proteine toplotnog stresa ili hit šok proteine (Hsp), od kojih su Hsp70 i Hsp 72 posebno važni u vezi sa pronalaskom, kao i protein koji vezuje težak lanac IgG (BiP) i proteine regulisane glukozom (grp). Primeri Hsp i grp uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji pripadaju sledećim klasama: Hsp70, Hsp60, Hsp90, grp94, grp80 i Hsp27.
Poželjno je da eukariotske ćelije koje se tretiraju derivatima hidroksilamina budu sisarske ćelije, poželjnije humane ćelije. Termin "eukariotska ćelija" se odnosi i nain vitroeukariotske ćelije (ćelije koje su izvan živog organizma, npr. u uslovima ćel. kulture) i na onein vivo(ćelije u okviru živog organizma, npr., ćelije u sastavu tkiva i organa).
Od eukariotskih ćelija živog organizma, neuroni, mišićne ćelije, ćelije zidova krvnih sudova, posebno enđotelne ćelije, epitelne ćelije i ćelije imunog sistema se prvenstveno mogu tretirati u skladu sa postupkom iz ovog pronalaska. Biljne ćelije, uključujući ćelije živog biljnog organizma, mogu se prvenstveno tretirati u skladu sa postupkom iz ovog pronalaska.
Pod terminom "fiziološki stres," kao što se ovde koristi, podrazumevaju se uslovi ili faktori koji utiču na ćelije koji bi indukovali "stresni odgovor" ćelija, npr., indukcija sinteze šaperonskih proteina. Fiziološki stresovi uključuju faktore koji izazivaju ozlede ćelija ili one koji remete homeostatsku ravnotežu ćelija. To su, na primer, metabolički, oksidativni, lokalni mehanički stresovi ili stresovi izazvani hipoksijom, ishemijom, toplotnim udarom, radijacijom ili toksičkim materijalima. Važan vid metaboličkog stresa uzrokuje diabetes mellitus.
Još jedan važan vid pojave fizioloških stresova uključuje one koji dovode do formiranja slobodnih radikala ili povećavaju količinu citokina u okruženju ćelija. Ozlede u ćelijama koje su vezane za razna patološka stanja pružaju primere fizioloških stresova.
U jednom neograničavajućem izvođenju ovog pronalaska, fiziološki stres je onaj koji indukuje ćelije da eksprimiraju molekulske Šaperone kao odgovor na fiziološke stresove koji dovode do kardiovaskularnih, vaskularnih, cerebralnih, alergijskih, imunih, autoimunih oboljenja, virusnih i bakterijskih infekcija, oboljenja kože i sluzokože ili oboljenja renalnih tubula epitelnog porekla ili izaziva stanja koja treba tretirati kozmetičkim intervencijama.
Takva kardiovaskularna oboljenja uključuju na prvom mestu aterosklerozu izazvanu fiziološkim stresom, koronarna oboljenja, ili kardiovaskularna oboljenja izazvana hipertonijom ili pulmonarnom hipertonijom.
Karakteristična cerebralna oboljenja su, između ostalih, ona izazvana cerebrovaskularnom ishemijom indukovanom fiziološkim stresom, udarom, traumatskom povredom glave, senilna neurodegenerativna oboljenja, naročito senilna demencija, demencija usled SJBA-e, alkoholna demencija, Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest ili epilepsija.
Karakteristična oboljenja izazvana kožnim i mukoznim oboljenjima su dermatološka oboljenja ili ulcerozna oboljenja gastrointestinalnog sistema.
U toku gornjih oboljenja, fiziološki stres indukuje ekspresiju šaperona u ćelijama, međutim, ovaj efekat nije dovoljan da zaštiti ćelije od ozleda izazvanih oboljenjima. Tretman gornjim derivatima hidroksilamina, koji je povezan sa pojačanjem ekspresije šaperona ili povećanjem aktivnosti šaperona omogućava eliminaciju strukturnih devijacija izatvanih bolešću i time regeneraciju ćelija.
U jednom neograničavajućem primeru ovog pronalaska, fiziološki stres je toplotni udar ili izlaganje ćelija neobično visokoj temperaturi. U jednom drugom neograničavajućem primeru ovog pronalaska, fiziološki stres je ćelijskaozleda vezana za ishemiju. Ishemična lezija ćelija, naročito srčanog mišića i cerebralnih ćelija, je izazvana kardiovascularnim poremećajima usled vaskularne okluzije ili pucanja, kao što su koronarna ili cerebralna tromboza ili vaskularna okluzija, udar, embolija, ili hroničan vaskularni spazam. Ishemija indukuje "stresni odgovor" u ćelijama, čiji je rezultat povećana količina Hsp, koja sa svoje strane štiti ćelije od štetnih efekata ishemije. (Mestril, R. et al,.J.Mol. Cell. Cardiol.27: 45 (1995)).
Tretiranjem ovih ćelija efektivnom količinom derivata hidroksilamina za ove ćelije, ekspresija molekulskih šaperona u ćelijama može se povećati iznad količine indukovane ishemičnim stanjem, a i aktivnost molekulskih šaperona može biti pojačana.
U vezi sa ovim, kad se organ izvadi iz životinje zbog transplantacije, takvo uklanjanje je fiziološki stres koji izaziva ozlede ćelija u sastavu tog organa, uključujući ekspresiju šaperona. U tom slučaju, davanje derivata hidroksilamina pre ili posle uklanjanja organa bi moglo da poveća količinu Šaperona koje proizvode ćelije organa ili njihovu aktivnost, obezbeđujući time citoprotektivan efekat.
Neuronske povrede, pored ishemije, mogu biti izazvane i mnogim drugim stresovima, koji indukuju proizvodnju molekulskih šaperona u neuronskim ćelijama. Pored toga, ekscitoksične neuronske povrede takođe indukuju proizvodnju molekulskih šaperona u neuronskim ćelijama i uključene su u termin "fiziološki stres."
A u još jednom primeru ovog pronalaska, fiziološki stres prave toksični medijatori inflamacije, kao što su oksidativni radikali i citokini, kakav je TNF, koje proizvode macrofazi. Pokazano je da ćelije izložene povećanoj količini ovih toksičnih medijatora eksprimiraju povećanu količinu Hsp, koja zauzvrat ovim ćelijama obezbeđuje zaštitu od toksičnosti.
(Kantengwa, S. et al,Semin. Immun.3: 49-56 (1991)). Različita inflamatorna oboljenja, uključujući pulmonaraa inflamatorna stanja kao što je distres sindrom odraslih, indukuju ekspresiju Hsp u ćelijama, koja zauzvrat ispoljava citozaštitan efekat. (Jacquier-Salin, M.R. et al.,Eksperientia50: 1031-1038 (1994)). Kad se količina molekulskih šaperona u ćelijama poveća iznad one indukovane TNF-om i reaktivnim kiseonikovim vrstama, ćelije mogu da budu bolje zaštićene od ovih citotoksičnih faktora i omogućena im je bolja popravka povreda
nanesenih ovima.
Faktori koji utiču na fiziološko stanje ćelija membrane, uključujući fluidnost ćelija membrane, takođe su primeri fiziološkog stresa. Povećanje ekspresije molekulskih šaperona u ovim ćelijama iznad one indukovane poremećajem fiziološkog stanja ćelijske membrane, mogu da obezbede bolju zaštitu i da omoguće ćelijama da poprave ćelijske membrane.
Fraza "efektivna količina derivata hidroksilamina", kao što se ovde koristi u vezi sa pojačanjem proizvodnje molekulskih šaperona u ćelijama pod fiziološkim stresom, ili ćelijama koje će sledeće biti izložene fiziološkom stresu, odnosi se na količinu koja će povećati ekspresiju molekulskih šaperona iznad nivoa indukovanog samim fiziološkim stresom. Tu količinu stručnjak može lako odrediti. Poželjno je da, za ćelijein vitro,efektivna količina bude između IO"<6>i IO"3 M. Poželjnije, efektivna količina je između IO"6 i 5x10^ M.
Kad se daje životinji, efektivna količina varira u zavisnosti od različitih faktora, kao što je način davanja, ali određivanje efektivnog opsega je u okviru znanja stručnjaka i ne zahteva nepotrebno eksperimentisanje. Na primer, kad se derivat hidroksilamina daje intravenozno, efektivna količina je prvenstveno od 0,1 - 10 mg/kgtt, još pogodnije od 0,5 - 2,0 mg/kgtt i kad se daje oralno, pogodna efektivna količina je od 10-500 mg/kgtt, još poželjnije od 50 - 100 mg/kgtt. Povećanje ekspresije molekulskih šaperona u ćelijama može se odrediti dobro utvrđenim laboratorijskim procedurama, kao što su Northern ili Western blot procedure.
Primer Western blot tehnike koja se može upotrebiti je iznet ovde. Ćelije se kultivišuin vitrona 37°C u Dulbecco-voj modifikaciji Eagle-ovog medijuma (DMEM), obogaćenoj 10%-nim fetalnim telećim serumom (GJJBCO) u 5%-nom CO2. Derivati hidroksilamina, čije su tautomerne forme predstavljene formulama (I) i (II), mogu se dodati ćelijama kulture, na primer, IO"<5>M jedinjenja se dodaje ćelijama 16 sati pre fiziološkog stresa, ili posle perioda koji sledi fiziološki stres. Međutim, koncentracija derivata hidroksilamina, kao i vreme primene tog jedinjenja, mogu da se menjaju prema eksperimentalnom dizajnu.
Šest sati posle toplotnog udara, ćelije se peru dva puta u slanom rastvoru puferisanom fosfatom (PBS), zatim se sastružu sa površine posuda za kulturu u PBS. Zatim se ćelije centrifugiraju 5 min. na 1500 rpm i sipaju u 100 p.1 modifikovanog solubilizujućeg pufera( Molecular Cloning, A Laboratory Manual,Ed. Sambrook, Fritsche, Maniatis, Bold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) sa 50 mM Tris-HCl, pH 8,0; 5 mM EDTA; 150 mM NaCl; 15 Triton X-100; 1 PMSF; 2 u.g/ml aprotinina; 1 |ig/ml himostatina; 1 pg/ml pepstatina i sonifikuje se 3 x 20 s (intervali od 2 min., na 8).
Koncentracija proteina se zatim određuje iz uzoraka od po 5 ul Bradford-ovim testom (M.M. Bradford,Anal. Biochem.,72: 248-254 (1976)) u tri paralelna uzorka. Uzorci se podese do koncentracije proteina od 100 p.g/30 ul gornjim puferom i sledećim puferom, tako da je konačna koncentracija komponenata u puferu u uzorku: 110 mM Tris-HCI, pH 6.8, 8,3 mM merkaptoetanola, 3% SDS, 3 % glicerola i nešto bromofenolnog plavog i mućkaju na sobnoj temperaturi 30 minuta. Ovako dobijen uzorak se zatim može koristiti za gel elektroforezu.
Kad se ispituje efekat derivata hidroksilamina ovog pronalaska na povećanje šaperona u ćelijamain vivo,primenjuje se fiziološki stres na životinju, npr., ishemija ili diabetes indukovan pomoću STZ. U slučaju ishemije, miokardijalna ishemija se može indukovati u životinji kao što je opisano u Primeru 8, a diabetičko stanje condition se može indukovati kao što je opisano u Primeru 10. Derivat mdroksilamina iz ovog pronalaska se može dati životinji pre nego što je ona izložena fiziološkom stresu, za vreme stresa ili posle njega. Kao što je ranije rečeno, vreme davanja se može menjati prema eksperimentalnom dizajnu.
Sledeći koraci dobijanja proteina iz relevantnih tkiva dobijenih iz životinja tretiranih na ovaj način se sprovodr na 0-4 °C. Tkiva, kao što su tkiva jetre (oko 15-20 g) se homogenizuju mikserom za domaćinstvo 2 minuta u 80 ml puferskog rastvora za liziranje, koji sadrži 50 mM Tris-HCI na pH 8,0, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1 % SDS, 1 % Triton X-I00 i 1,1 mM inhibitora proteaze (PMSF, benzamidin, amino-kapronska kiselina). Homogenat se zatim centrifugira na 20000xg 30 minuta u Sorvall RC 28S centrifugi.
Koncentracija proteina preparata se određuje Bradford-ovim testom i podešava se na 5 mg/ml. Uzorci sa 1,8 mg proteina se solubilizuju pre gel-elektroforeze sa 0,6 ml pufera koji sadrži 110 mM Tris-HCI pH 6,8, 8,3 mM merkaptoetanola, 3% SDS, 3 % glicerola i nešto bromofenolnog plavog i mućkaju na sobnoj temperaturi 30 minuta. Proteinski uzorci dobijeni iz ćelijskih kultura ili iz životinjskih tkiva, pri čemu su oba opisana gore, koriste se za elektroforezu i naredni imunoblot (obe procedure su dobro poznate u struci i opisane detaljno uMolecular Cloning, A Laboratory Manual,Ed. Sambrook, Fritsche, Maniatis, Bold Spring Harbor Laboratorv Press (1989);Protein Blotting Protocols for the Immobilon- P Transfer Membrane,3. Laboratorv Manual, Millipore; i U.K. Laemmli,Nature:227: 680-685 (1970)).
Na primer, elektroforeza se može sprovoditi prema Laemmli-ju (U.K. Laemmli,Nature,227:680-685 (1970)) na 8-18 %-nom poliakrilamidnom gelu pri konstantnom naponu od 50 V preko noći. Proteini se ili boje pomoću Coomassie Brilliant Blue R-250 ili se prebace na Irnmobilone PVDF (Millipore) pri konstantnoj struji (300 mA) na 3 sata na 4 °C u prenosnom puferu (10 mM CAPS, pH 11, 10 %-ni metanol)( Protein Blotting Protocols far the Immobilon-P Transfer Membrane,3. Laboratorv Manual, Millipore). Posle prenosa, nespecifična mesta na membrani se blokiraju 2 %-nim albuminom iz goveđeg seruma (BSA) u TPBS (fosfatno puferisan slani rastvor sa 0,1 % Tween 20) preko noći na 4 °C. Membrana (blot) se zatim može inkubirati sa antitelom na molekulski šaperon, npr. monoklonsko antitelo na GRP94 (SP A-850, StressGen) razblaženo 1:3000, sa monoklonskim antitelom na Hsp60 (SP A-600, StressGen) u razblaženju 1:2700, sa monoklonskim antitelom na Hsp72 (C92F34-5, StressGen) razblaženim 1:1250 ili sa monoklonskim antitelom na Hsp90 (AC88, StressGen) razblaženim 1:2000, 1 sat na sobnoj temperaturi. Zatim je membrana prana TPBS puferom jedan sat i inkubirana još 1 sat sa sekundarnim antitelom na pacovski grp-94 (Sigma, razblaženje 1:4000) ili sekundarnim antitelima na mišji Hsp60, Ffsp72 ili Hsp90 (Sigma, adsorbovanim sa humanim i pacovskim serumskim proteinima, razblaženje 1:3000) konjugovanim sa peroksidazom rena. Posle uzastopnih pranja TPBS-om, membrana se razvije pomoću ECL (pojačana hemiluminescencija) sistema (Amersham).
Promene u sadržaju stresnih proteina mogu se kvantitativno odrediti Bio-Rad denzitometrom (Model 1650) i Hewlett-Packard Integratorom (HP 3394A). Serije razblaženja se dobijaju iz proteinskog rastvora koji sadrži poznatu količinu šaperona, gornji proces razblaživanja se ponavlja i koncentracije šaperona testiranih uzoraka se određuju iz kalibracione krive dobijene iz testova razblaženja.
"Northern" hibridizacija je još jedna eksperimentalna procedura dostupna za određivanje nivoa povećanja molekulskih šaperona (merenjem nivoa iRNK) pomoću derivata hidroksilamina iz ovog pronalaska. Ćelije ili tkiva se mogu dobiti kao što je opisano u vezi sa VVestem blot postupkom. Ukupna RNK iz tih ćelija i tkiva se može ekstrahovati upotrebom RNKgents-a (Promega) prema uputstvu proizvođača (Protocols i Applications Guide, 2™<1>edition, 1991, Promega Corporation). Smrznuti uzorci tkiva (od oko 50 do 100 mg) se homogenizuju u 1,0 ml denaturišućeg 4M-nog guanidin-tiocijanata; 42 mM natrijum citrata; 0,83 mM p-merkaptoetanola; 0,1% Nonidet P-40) na 4°C (Brinkman-homogenizacija). Zatim se doda 1/10 zap. 3M natrijum acetata (pH 4,0) i homogenat se ekstrahuje kiselim fenolom (fenol:hloroform:izoamilalkohol 25:24:1) 10 sekundi na vorteksu. Uzorak se inkubira na ledu 15 minuta, a zatim centrifugira (4 °C; 20 min., 10,000 x g). Vodena faza se zatim prebaci u novu Eppendorf epruvetu, proces se ponavlja i vodena faza se precipituje na -20°C preko noći sa jednakom zapreminom izopropanola. Posle centrifugiranja (4 °C; 20 min. 10,000 xg),
precipitat se dvaput ispire 95%-nim etanolom i suši na sobnoj temperaturi. RNK se suspenduje u 20 ul vode tretirane dietil-pirokarbonatom (DEPC) i koncentrat se meri na 260-280 nm spektrofotometrijom. Osam jag ukupne RNK je propušteno kroz formaldehid-agarozni gel kapilarnim transferom, RNK na gelu je "blotovano" na najlonsku membranu prema uputstvu proizvođača (Zeta-Probe GT, BioRad).
U pojedinačnim uzorcima, sadržaj iRNK za molekulski šaperon je upoređeno sa nivoom iRNK za gliceraldehid-3-fosfat debidrogenazu (GAPDH) u uzorcima. cDNK probe (na primer, cela dužina humane cDNK za Hsp70 kađ je testirana iRNK za Hsp70 i Apa-Ncol fragment pacovske cDNK GAPDH) su obeležene pomoću alfa-<32>P CTP iz Random Prime DNK Labeling Kit (USB). Radioaktivno obeleženi fragmenti DNK su prečišćeni na Sefadex G-50 (Pharmacia) koloni kao što je opisano (Ausubel et al. (eđs)): Current Protocols in Molecular Biologv: JOHN WILEY&SONS: 1987).
Prethodne hibridizacije se vrše na 65 °C u H-puferu (0,25M Na2HP04, pH 7,2, 7% SDS) 15 minuta. Hibridizacije se izvode preko noći (65 °C; H-pufer) cDNK probama obeleženim izotopom, čija je koncentracija najmanje IO<6>cpm/ml. Membrana se zatim ispire 20 mM-nim NajHPO*), pH 7,2 , 5% SDS (65 °C; 2 x 15 min.) i određuje autoradiografijom. Ista membrana se koristi za testiranje iRNK za Hsp70, a merenja GAPDH i iRNK se koriste kao interni standard.
Ovaj pronalazak dalje uključuje postupak za tretiranje ili sprečavanje različitih patoloških stanja, tj. oboljenja vezanih za funkcionisanje šaperonskog sistema i oštećenja u membranama ćelija i ćelijskih organela, davanjem efektivne količine derivata hidroksilamina, čiji su tautomemi oblici predstavljeni strukturama (I) i (II), da bi se kontrolisala patološka stanja u organizmu. U patološkim stanjima, indukuje se karakteristična ekspresija molekulskih šaperona u ćelijama. Povećana ekspresija molekulskih šaperona u tim ćelijama može da im pomogne u popravljanju oštećenja izazvanih patološkim stanjima, kao i u obnavljanju ćelijske homeostatske ravnoteže.
Takva patološka stanja uključuju ishemiju, tumorska oboljenja, infekcije izazvane patogenim mikroorganizmima, autoimuna oboljenja i dermatoze.
Kao što se ovde koristi, "tretiranje" se odnosi na poboljšanje kliničkog stanja subjekta i ne znači nužno daje postignuto potpuno izlečenje. Poboljšanje se odnosi na smanjeno trajanje bolesti ili smanjenu jačinu bolesti, ili subjektivno poboljšanje kvaliteta života subjekta ili produženje života pacijenta.
Efektivna količina hidroksilamina iz ovog pronalaska za tretiranje se odnosi na količinu dovoljnu da dovede do poboljšanje kliničkog stanja kao što je opisano gore. Efektivna količina zavisi od faktora kao što su način davanja i stručnjak je može lako odrediti. Derivati hidroksilamina iz ovog pronalaska mogu se davati parenteralno ili oralno, poželjno oralno ili topično, a efektivna količina je 10-500 mg/kgtt. Još je poželjnije da efektivna količina bude 20-100 mg/kgtt.
Upotrebom postupka tretiranja prema ovom pronalasku, miokard, moždana tkiva i bubreg mogu se zaštititi od oštećivanja tkiva ili nekroze izazvane ishemijom, gde se postupak sastoji od davanja subjektu efektivne količine derivata hidroksilamina iz ovog pronalaska za smanjenje, sprečavanje, ili revertovanje štetnog efekta produžene ishemije.
Ovaj pronalazak uključuje upotrebu derivata hidroksilamina, čiji su tautomemi oblici predstavljeni formulama (I) i (II), za proizvodnju leka za tretiranje patoloških stanja opisanih ovde.
U postupku za merenje zaštitnog efekta derivata hidroksilamina, korišćen je test na životinjama kao što je niže izloženo. Pacovi su anestezirani natrijum pentobarbitalom (Nembutal 60 mg/kg telesne težine, i.p.) i veštački ventilirani sobnim vazduhom (2 ml/100 g; 54 udara/minut) traheotomijom. Desna karotidna arterija je zatim kateterizovana i povezana sa transduktorom pritiska (BPR-01, Stoelting) za merenje sistemskog arterijskog krvnog pritiska (BP) pomoću predamplifikatora (Hg-02, Eksperimetria). Derivati hidroksilamina iz pronalaska se daju preko kanule u vratnu venu (i.v.) ili oralno (p.o.). Puls (HR) se meri kardiotahometrom (HR-01, Eksperimetria); i elektrokardiogram (ECG standard, olovo II) snima se na uređaj za snimanje (MR-12, Medicor) pomoću subkutanih čeličnih igala - elektroda. Grudni koš se otvara preko leve torakotomije i srce se zatim eksteriorizuje blagim pritiskom na desnu stranu rebara. Primenjuje se kompresija ispod glavne leve koronarne arterije kao što je opisao Selye et al.
(1960). Srce se pažljivo vraća u grudni koš i životinja se ostavi da se oporavi. Rektalna temperatura se prati i drži konstantnom na 37 °C. Eksperimentalni protokol se započinje sa periodom stabilizacije od 15 minuta. Ako je krvni pritisak manji od 70 mm Hg ili se primeti aritmija tokom ovog perioda, životinja se isključuje iz daljeg eksperimenta. Miokardijalna ishemija se zatim 5 minuta indukuje koronarnom okluzijom i dozvoli se reperfuzija od 10 minuta.
Tokom celog eksperimenta, krvni pritisak (BP), srčana frekvenca (HR) i EKG se stalno registruju na multiskriptoru (R61-6CH, Medicor<*>). Derivati hidroksilamina se daju na 5 do 60 minuta pre okluzije i.v. ili p.o. postupkom. Doze derivata hidroksilamina mogu biti 0,5; 0,75; 1,0 mg/kg i.v. i 100 mg/kg telesne težine p.o., dok se referentna supstanca Bepridil daje u dozi od 1,0 mglkg i.v. Srednje trajanje ventrikularne tahikardije (VT) i/ili ventrikulame fibrillacije (VF) tokom prva 3 minuta reperfuzije se meri i analizira.
Ovaj pronalazak uključuje i postupak održavanja fluidnosti ćelijske membrane, kad fiziološki stres utiče na fluidnost ćelijske membrane, postupak obuhvata tretman ćelije ili ćelijske organele, kojoj je izmenjena fluidnost membrane, efektivnom količinom derivata hidroksilamina za obnavljanje fluidnosti navedene membrane. Eksperimentalni protokol, dat u vezi sa Primerom 9 (Steadv State DPH fluorescence anisotropv), može se koristiti za određivanje efekta derivata hidroksilamina iz pronalaska na fluidnost ćelijske membrane.
Kao što je pomenuto, ovaj pronalazak uključuje postupak tretiranje patološkog stanja vezanog za membranu ćelije ili membranu ćelijske organele. Jedan primer takvog patološkog stanja je diabetes mellitus, kao i oboljenja vezana za oštećenje mitohondrija, kao što je ALS (amiotrofna lateralna skleroza), Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest, Huntingtonova bolest (HD), određene kardiomiopatije, kao što su one toksičkog porekla, izazvane alkoholom ili teškim metalima, inflamatorna ili virusna kardiomiopatija ili autoimuna kardiomiopatija.
Derivati hidroksilamina, čiji su tautomemi oblici predstavljeni strukturama (1) i (II), mogu se koristiti u ovom postupku.
Postupak iz ovog pronalaska može se upotrebljavati u tretiranju tumorskih oboljenja, gde se postupak sastoji od davanja efektivne količine derivata hidroksilamina tumoroznom organizmu da bi se sprečilo formiranje ili rast tumora. Derivati hidroksilamina, čiji su tautomemi oblici predstavljeni strukturama (I) i (II), mogu se koristiti u ovom postupku.
4.3. FARMACEUTSKE I KOZMETIČKE KOMPOZICIJE KOJE SADRŽE DERIVATE HIDROKSILAMINA
Kao što je već pomenuto, ovaj pronalazak se takođe odnosi na upotrebu derivata hidroksilamina opštih formula (I) i (II), uključujući njihove optički aktivne strereoizomere, u dobijanju farmaceutskih kompozicija (i opciono kozmetičkih kompozicija) korisnih u tretiranju kardiovaskularnih, vaskularnih, alergijskih, imunih i autoimunih oboljenja, oboljenja izazvanih virusnim ili bakterijskim infekcijama, tumorskih oboljenja, oboljenja kože i sluzokože i oboljenja renalnih tubula izazvanih fiziološkim stresom, kao i onih stanja takođe izazvanih fiziološkim stresovima, koja se mogu tretirati kozmetičkim intervencijama, gde su formule (I) i
(II), ili njihove soli, uključujući njihove optički aktivne strereoizomere,
A je alkil, supstituisan alkil, aralkil, aralkil supstituisan u aril i/ili alkil grupi, aril, supstituisan aril, heteroaril ili supstituisana heteroaril grupa,
Z je kovalentna veza, kiseonik ili =NR<3>, gde je R<3>odabran iz grupe koju Čine vodonik, alkil, supstituisan alkil, aril, supstituisan aril, aralkil, ili aralkil supstituisan u aril i/ili alkil grupi,
R je alkil ili supstituisan alkil,
X u tautomeru formule (I) je halogen ili supstituisan hidroksi ili amino, monosupstituisana amino ili disupstituisana amino grupa, a
X u tautomeru formule (II) je kiseonik, imino ili supstituisana imino grupa i R'je vodonik, alkil, supstituisan alkil, aril, supstituisan aril, aralkil, aralkil sa supstituisanom aril i/ili alkil grupom, acil ili supstituisana acil grupa,
i jedinjenja formule (I) opciono sadrže intramolekulski prsten strukture formirane spajanjem X i reaktivnog supstituenta.
Upotrebom ovih jedinjenja, mogu se dobiti kompozicije i za u preventivne i u terapijske svrhe, koje, kad se daju ili primene na humanom ili životinjskom organizmu, mogu biti korisne u sprečavanju ili kontrolisanju oštećenja ćelija izazvanih gornjim oboljenjima, time olakšavajući ili eliminišući patološko stanje organizma,
Ove kompozicije se mogu dobiti postupcimapoznatim perseu dobijanju kozmetičkih i farmaceutskih kompozicija, mešanjem aktivnog materijala i odgovarajućih nosača i/ili pomoćnih supstanci. Kompozicije uglavnom sadrže 0,5 do 99,5 težinskih % aktivnog jedinjenja. Količina aktivnog materijala u kompoziciji je određena prirodom i ozbiljnošću oboljenja, starošću pacijenta i načina tretmana. Derivati hidroksilamina formula (I) i (II) se mogu formulisati u kompozicije za oralnu i parenteralnu upotrebu, ako i topičnu.
Dnevna doza aktivnog jedinjenja je oko 10 do 500 mg/kg, poželjno 20 do 100 mg/kg, koja je, naročito u slučaju oralnih kompozicija, raspodeljenih na 2-3 davanja.
Za svrhe oralnog davanja, kompozicije se formulišu u dražeje, granule, ako se želi, u rastvor ili suspenziju. Parenteralne kompozicije uključuju vodene suspenzije i sterilne injektabilne rastvore, dok su oblici za rektalno davanje, između ostalih, supozitorije, a topički oblici uključuju pomade, kreme, emulzije i gelove.
Za dobijanje tableta, aktivni sastojak se meša sa pogodnim nosačima, kao što su škrobni želatin, laktoza, magnezijum stearat, talk, gumarabika i silika gel, smesa se granuliše i presuje u
tablete.
U dobijanju đražeja, smesa slična gornjoj se đobija od aktivnog sastojka i pomoćnih supstanci, smesa se granuliše, granulat se presuje u jezgro, koje se zatim oblaže šećerom, npr. pomoću vodenog rastvora polivinilpirolidona koji sadrži šećer.
Za dobijanje kapsula, aktivan sastojak se meša sa pomoćnim supstancama, kao što su škrob, talk, silika, mikrokristalna celuloza i smesa se sipa u tvrde ili meke želatinske kapsule.
Ove oralne kompozicije mogu se upotpuniti dodacima za pojačavanje ili usporavanje apsorpcije.
Sirupi ili eliksiri ili kapi mogu se dobiti upotrebom, pored aktivnog sastojka, zaslađivača, metil- ili propil-parabena i, po želji, aditiva za ukus, mešanjem vodenog rastvora aktivnog sastojka sa njima.
Za rektalno davanje, supozitorije se mogu dobiti upotrebom pogodnih pomoćnih supstanci, kao što je kaokao puter ili polietilen glikol.
Kompozicije pogodne za parenteralno davanje mogu biti injekcije, dobijene rastvaranjem aktivnog sastojka u sterilnom izotoničnom slanom rastvoru, ili vodene suspenzije, koje se mogu dobiti upotrebom pogodnih sredstava za disperzije i za kvašenje, kao što su propilen glikol ili butilen glikol,
Kreme i pomade za topičku upotrebu mogu se dobiti upotrebom primarnih ili sekundarnih alkohola, kao što su cetil alkohol, stearil alkohol, glicerin, prirodne masti i ulja, kao što je maslinovo ulje, ulje iz pšeničnih klica, lanolin, dužih ugljovodonika, kao što je vazelin, kao i celuloznih derivata. Ove kompozicije mogu da sadrže i prezervative, kao što je metil-p-hidroksi benzoat.
Kompozicije za upotrebu kao kozmetička ili medicinska kozmetička sredstva mogu se dobiti na sličan način. Poželjno, lipofilne komponente se mešaju, a komponente rastvorljive u vodi se rastvore u vodi, može i uz blago zagrevanje. Po želji, pH rastvora se podesi na pogodnu vrednost i tako dobijena emulzija se meša dok se ne ohladi. Aktivan sastojak se doda smesi koja je na ovaj način dobijena u formi vodenog rastvora.
Farmaceutske i kozmetičke kompozicije, koje sadrže nove derivate hidroksilamina opisane detaljno u odeljku 4.1. ove specifikacije, mogu se takođe dobiti u skladu sa gornjim postupcima. Ove kompozicije su takođe predmet ovog pronalaska.
Jedan oblik farmaceutskih i kozmetičkih kompozicija prema pronalasku sadrži derivate hidroksilamina u skladu sa formulom (I), u količini od 0,5 do 99,5 težinskih % zajedno sa nosačima i pomoćnim supstancama koje se uopšteno koriste u takvim kompozicijama, gde je
a) X halogen, poželjno hlor ili brom,
Z je hemijska veza, a
al) A je grupa formule (a), gde je Y' je halogen, alkoksi, haloalkil ili nitro, a nje 1, 2 ili 3, ili heteroaril grupa koja sadrži 0, poželjno furil, heteroaril koji sadrži S, poželjno tienil, ili heteroaromatična grupa koja sadrži N, opciono kondenzovana sa benzenovim prstenom, ili kvaternarni derivat alkila N-Cj.4ili njegov N-oksid, poželjno piridil, hinolil ili izohinolil,
R je grupa formule (b), gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearni ili razgranati alkil, prvenstveno Cmalkil ili cikloalkil, ih R<5>i R<6>, zajedno sa susednim N atomom, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, prvenstveno sa 5 do 7 članova, Y<*>je -OR<7>, gde je R7 H ili acil, prvenstveno nesupstituisani ili supstituisani alkilkarbonil, arilkarbonil ili aminoacil, k je 1, 2 ili 3 i m je 1, 2 ili 3, ili je kvaternarni derivat N-Cm alkila ili njegov N-oksid, uz uslov da kad je A piridil ili naftil, ili grupa formule (a) gde je Y<!>je halogen ili alkoksi, ondaR<7>n<i>je H, ili
a2) A je grupa formule (c),
R je grupa formule (d), a opcioni supstituenti Y<2>i Y<3>, od kojih jedan mora biti prisutan u molekulu, je kiseonik, ili Cm alkil, k je 1, 2 ili 3 i m je 1, 2 ili 3, i kad je jedinjenje jedno- ili dvovalentan katjon, anjon je jon sa jednim ili dva halogena, prvenstveno jodid, ili b) X je -NR'R<2>, gde su R<1>i R<2>, nezavisno jedan od drugog, H, nesupstituisan ili supstituisan linearan ili razgranat alkil, nesupstituisan ili supstituisan aril, poželjno fenil, nesupstituisan ili supstituisan aralkil, ili R<1>i R<2>, zajedno sa susednim atomom N, formiraju heterocikličan prsten sa 3 do 7, poželjno sa 5 do 7 članova, koji može imati jedan ili više dodatnih hetero atoma
A je nesupstituisan ili supstituisan aril, poželjno fenil, ili nesupstituisan ili supstituisan aralkil,
Z je kiseonik ili =NR<3>, gde je R<3>H ili nesupstituisan ili supstituisan alkil, a
R je grupa formule (b), gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, prvenstveno Cm alkil ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa susednim N atomom, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, prvenstveno sa 5 do 7 članova, Y* je -OR<7>, gde je R<7>H ili acil, poželjno nesupstituisan ili supstituisan alkilkarbonil ili arilkarbonil, k je 1,2 ili 3 i m je 1, 2 ili 3, ili
c) X je -0Q, gde je Q nesupstituisan ili supstituisan alkil ili aralkil,
Z je kiseonik, a
R je grupa formule (b), gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, prvenstveno Cm alkil ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa susednim N atomom, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, prvenstveno sa 5 do 7 članova, Y* je -OR<7>, gde je R<7>H ili acil, poželjno nesupstituisan ili supstituisan alkilkarbonil, arilkarbonil ili aminoacil, k je l, 2 ili 3 i m je 1,2 ili 3, ili d) A je nesupstituisan ili supstituisan aril, poželjno fenil ili heteroaromatična grupa koja sadrži N, poželjno piridil ili heteroaromatična grupa koja sadrži S,
Z je hemijska veza,
X je -OQ, gde je Q Cm alkil, a
R je grupa formule (b), gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, prvenstveno Cm alkil ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa susednim N atomom, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, prvenstveno sa 5 do 7 članova, Y* je H, k je 1, 2 ili 3 i m je 1, 2 ili 3.
Još jedna grupa farmaceutskih i kozmetičkih kompozicija prema pronalasku uključuje one koje, zajedno sa farmaceutski i kozmetički prihvatljivim nosačima i/ili pomoćnim sredstvima sadrže, u količini od oko 0,5 do 99,5 težinskih %, derivate hidroksilamina formule (I) ili njihove soli i/ili optički aktivne stereoizomere, gde je
X -NR<!>R<2>, gde su R<l>i R<2>, nezavisno jedan od drugog, H, nesupstituisan ili supstituisan linearan ili razgranat alkil, poželjno Ci_6alkil ili cikloalkil, ili R<l>i R<2>, zajedno sa susednim atomom N, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, poželjno sa 5 do 7 članova,
A jc nesupstituisan ili supstituisan aralkil, poželjno fenilalkil supstituisan sa jednom ili više alkoksi grupa, poželjno Cm alkoksi, nesupstituisan fenil ili fenil supstituisan jednim ili sa više halogena, alkil ili haloalkil, acilamino ili nitro, ili nesupstituisana ili supstituisana heteroaromatična grupa koja sadrži N koja je opciono kondenzovana sa benzenovim prstenom, poželjno pirolil, piridil, izohinolil ili hinolil, ili heteroaril grupa koja sadrži S, poželjno tienil, gde heteroaril grupe mogu imati jedan ili više supstituenata, poželjno jedan ili više alkila, poželjno Cm alkil
Z je hemijska veza, a
R je grupa formule (e), gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, prvenstveno Cm alkil ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa susednim N atomom, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 đo 7, prvenstveno sa 5 do 7 članova, koji može imati jedan ili više dodatnih hetero atoma i može imati supstituente, poželjno Cmalkil, Y<4>je H, nesupstituisan ili supstituisan Cm alkil, Y<5>je H, nesupstituisan ili supstituisan Cmalkil, -OR<7>, gde je R<7>H ili acil, a k je 1,2 ili 3 i m je 1,2 ili 3, uz uslov da
kad je A nesupstituisan fenil ili fenil supstituisan halogenom ili alkoksi ili fenilalkil supstituisan alkoksi ili piridil grupom i R7 je H, bar jedan od R<1>i R<2>nije H, a
kad je A nesupstituisan fenil ili fenil supstituisan halogenom ili alkoksi ili fenilalkil supstituisan alkoksi ili piridil grupom, i R<1>i R<2>su oba H, R<7>nije H.
Još jedna grupa farmaceutskih i kozmetičkih kompozicija prema pronalasku uključuje one koje, zajedno sa farmaceutski i kozmetički prihvatljivim nosačima i/ili pomoćnim sredstvima sadrže, u količini od oko 0,5 do 99,5 težinskih %, derivate hidroksilamina formule (II) ili njihove soli i/ili optički aktivne stereoizomere, gde je
a) X kiseonik,
A je Ci-20linearan ili razgranat alkil, nezasićen ili zasićen aril, poželjno fenil ili
haloalkilfenil, nesupstituisan ili supstituisan aralkil, naftil ili heteroaromatična grupa koja sadrži N, poželjno piridil,
Z je hemijska veza,
R'je H, Cmalkil ili aralkil, poželjno fenilalkil, a
R je grupa formule (b), gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, prvenstveno Cmalkil ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa susednim N atomom, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, prvenstveno sa 5 do 7 članova, Y<6>je H ili - OR7, gde je R7H, k je 1,2 ili 3 i m je 1, 2 ili 3, uz uslov da
kad A nije alkil i R'je H, Y* je H, ili
b) X je =NR<4>, gde je R<4>H, nesupstituisan ili supstituisan alkil ili nesupstituisan ili supstituisan aril, poželjno fenil, ili nesupstituisan ili supstituisan aril, poželjno fenilalkil,
A je nesupstituisan ili supstituisan alkil ili nesupstituisan ili supstituisan aril, poželjno fenil ili supstituisan fenil, ili nesupstituisan ili supstituisan aralkil, poželjno fenilalkil, ili cikloalkil,
Z je hemijska veza, kiseonik ili =NR<3>, gde je R<3>H ili nesupstituisan ili supstituisan alkil,
R' je nesupstituisan ili supstituisan alkil ili nesupstituisan ili supstituisan aril, poželjno fenil, ili nesupstituisan ili supstituisan aralkil, poželjno fenilalkil, a
R je grupa formule (b), gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, prvenstveno Cmalkil ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa susednim N atomom, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, prvenstveno sa 5 do 7 članova, Y<*>je H ili -OR<7>, gde je
R<7>H ili acil, poželjno nesupstituisan ili supstituisan alkilkarbonil ili arilkarbonil, k je 1, 2 ili 3 i mje 1, 2 ili 3, ili
c) jeX kiseonik,
A je nesupstituisan ili supstituisan alkil, nesupstituisan ili supstituisan aralkil, poželjno
fenilalkil,
Z je kiseonik,
R'je alkil ili aralkil, poželjno fenilalkil,
R je grupa formule (b), gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, prvenstveno Cm alkil ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa susednim N atomom, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, prvenstveno sa 5 do 7 članova, Y<6>je H ili - OR<7>, gde je R<7>H ili acil, poželjno nesupstituisan ili supstituisan alkilkarbonil ili arilkarbonil, k je l, 2 ili 3 i mje 1,2 ili 3, ili
d) je X kiseonik,
Zje=NH, a
dl) A je nesupstituisan ili supstituisan alkil, cikloalkil, nesupstituisan ili supstituisan aralkil, poželjno fenilalkil, nesupstituisan fenil ili fenil supstituisan halogenom, haloalkilom, alkoksi ili nitro,
R'je alkil ili aralkil, poželjno fenilalkil, a
R je grupa formule (b), gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, prvenstveno Cm alkil ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa susednim N atomom, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, prvenstveno sa 5 do 7 članova, Y<6>je H ili - OH, k je 1, 2 ili 3 i mje 1, 2 ili 3, ili
d2) A je grupa formule (a) gde je Y<y>haloalkil, poželjno trifluorometil i nje 1, 2 ili 3, R'jeH,a
R je grupa formule (b), gde su R<3>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, prvenstveno Cm alkil ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa susednim N atomom, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, prvenstveno sa 5 do 7 članova, Y<*>je H ili - OH.kje 1,2 ili 3 i mje 1,2 ili 3.
Još jedna grupa farmaceutskih i kozmetičkih kompozicija prema pronalasku uključuje one koje, zajedno sa farmaceutski i kozmetički prihvatljivim nosačima i/ili pomoćnim sredstvima sadrže, u količini od oko 0,5 do 99,5 težinskih %, derivate hidroksilamina formule (I") ili njihove soli i/ili optički aktivne stereoizomere, gde je
A nesupstituisan fenil ili fenil supstituisan halogenom ili nitro ili heteroaril grupa koja sadrži N, poželjno piridil,
R'jeH,a
R" je to-aminoalkil grupa koja može biti mono- ili disupstituisana, gde alkilni lanac sadrži l do 5 ugljenikovih atoma i gde su amino supstituenti, nezavisno jedan od drugog, jedan ili dva linearna ili razgranata alkila ili cikloalkila, ili gde dva amino supstituenta, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju heterocikličan prsten sa 3 do 7, prvenstveno sa 5 do 7 članova, ili njegov kvaternarni derivat N-Ch alkila, uz uslov da
kad je A piridil, R" nije 1-piperidinilmetil.
Oblici pronalaska su ilustrovani u sledećim primerima više detaljno. Podrazumeva se, međutim, da opseg zaštite nije ograničen na specifična izvođenja data u Primerima.
5. HEMIJSKI PRIMERIIPRTMERI KOMPOZICIJA
Primer 1:
N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-2-tiofenkarboksimidoil hlorid monohidrohlorid
5,0 g (15,6 mmola) N-[2-hidroksi-3-(l-piperidiniI)propoksi]-2-tiofenkarboksimidamid monohidrohlorida( Primer44) je rastvoren u 19 ml vode, a zatim je dodato 6,1 ml koncentrovane hlorovodonične kiseline. Rastvor je ohlađen do -5°C, a zatim je kap po kap dodat hladan rastvor 4,4 g (63,8 mmola) natrijum nitrita u 2,4 ml vode. za sve vreme reakcije, interna temperatura je održavana na 0 °C. Kad je dodavanje završeno, smesa je mešana još jedan sat Dodat je hladan benzen (60 ml) i smesa je zaalkaljena sporim dodavanjem hladnog rastvora 3,2 g (80 mmola) natrijum hidroksida u 45 ml vode. Organska faza je odvojena i oprana sa više porcija od po 20 ml vođe dok pH<9 (3-5 puta). Organski rastvor je osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata, tretiran ugljem, profiltriran i uparen na vakuumu (t < 45°C) da bi se dobilo 2,6 g ulja. Ovaj ostatak je rastvoren u 5 ml izopropil alkohola i zakišeljen (pH 2) izopropil alkoholom sa suvom hlorovodoničnom kiselinom. Proizvod je iskristalisan iz n-heksana da bi se dobio zagasitobeli materijal.
Prinos: 2,0 g (38 %)
T.t.: 115-123 °C
Sledeći postupak opisan u prethodnom primeru, dobijena su sledeća jedinjenja:
Primer 2:
N-[2-hidroksi-3-(l -piperidinil)propoksi]-l -izohinolinkarboksimidoil hlorid monohidrohlorid Počemi materijal:Primer 46
Prinos: 48 %
T.t.: 168-172 °C .
IR(KBr): 3425, 3128,2947, 2866, 2650, 2540, 1622, 1597, 1556, 1452, 1385, 1364, 1329, 1296,1281, 1240,1117, 1092,1024, 1015, 978, 953, 903, 881, 795, 743, 718, 658, 559 cm-<1>
Primer 3:
N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-hinolinkarboksimidoil hlorid (Z)-2-butendioat (1: 1)
Početni materijal:Primer 42
U ovom slučaju, konačan proizvod je izolovan na kraju postupka obrade rastvaranjem sirove baze u acetonu i dodavanjem ekvivalentne količine maleinske kiseline.
Prinos: 67 %
T. t: 159-162 °C
IR(KBr): 3427, 3019, 2947, 2886, 2689, 1583, 1477, 1450, 1352, 1293, 1221, 1194, 1132, 1072,1045, 939, 919, 872, 833, 754, 650, 557 cm-<1>
Primer 4: N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-nitro-benzenkarboksimidoil hlorid monohidrohlorid
Početni materijal:Primer 40
Prinos: 58 %
T. t.: 185-189 °C
Primer 5:
N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-4-nitro-benzenkarboksimidoil hlorid monohidrohlorid Početni materijal:Primer 43
Prinos: 47 %
T. t: 180-182 °C
IR (KBr): 3331, 2953, 2853, 2735, 2654,2577, 2548,1605,1568, 1516,1456, 1348, 1261,1165, 1119, 1072, 1059,1007, 960, 933, 862, 849, 754, 719, 690, 673, 627, 581, 550, 478 crn1
Primer 6:
N- r2- hidroksi- 3-( l- piperidinil) propok$ i1- 2- m hlorid
monohidrohlorid
Početni materijal:Primer 45
Prinos: 50 %
T. t.:
159-162 °C
IR (KBr): 3298, 2983, 2932, 2746, 1593, 1574, 1535, 1445, 1391, 1354, 1317, 1288, 1242, 1198, U17,1092, 1069,1020, 968, 947,914, 852, 793, 756, 708, 577 cm"<1>
Primer 7:N- r2- hidroksi- 3-( l- piperidimQpropoks^ hlorid monohidrohlorid
Procedura:
l-hloro-2-hidroksi-3-(l-piperidinil)-propan [J.Org.Chem. 33(2) str. 523-30 (1968)]
(3,0 g, 116,9 mmola) je rastvoren u vodi (1,8 ml). Dodat je čvrst NaOH (1,19 g, 29,8 mmola) i smesa je mešana na sobnoj temperaturi 1 sat. Dodat je N-hidroksi-2-furankarboksimidamid (1,92 g, 15,2 mmola) i smesa je držana na mešanju na sobnoj temperaturi preko noći. Dodata je koncentrovana HCI (2.1 ml) da bi se podesio pH na pribl. 4 i rastvor je uparen na vakuumu do suvog.
Ostatak (5,4 g) je rastvoren u cc. HCI (37 ml), ohlađen do 0 - 5 °C i vodeni rastvor NaN02(5,6 g, 80 mmol u 23 ml vode) je dodat kap po kap tokom 30 min. Rastvor je zatim zaalkaljen dodatkom 2N rastvora NaOH (102 ml) do pH = 10 i ekstrahovan etil acetatom (2 x 130 ml). Kombinovane organske faze su oprane vodom, osušene preko anh. Na2S04i uparerte. Ostatak (2,0 g) je ponovo rastvoren u maloj zapremini etil acetata (20 ml) i proizvod je precipitiran dodatkom izopropanolnog HCI rastvora (3,2 N,3 ml). Posle filtriranja, dobijeni beli precipitat je opran i konačno rekristalisan iz izopropanota.
Prinos: 11 %
T.t.: 139-141 °C
IR (KBr): 3427, 3267, 3094, 2955, 2922, 2964, 2745, 1637, 1584, 1479, 1452, 1391, 1319, 1281, 1259,1157, 1117,1074, 1024,999, 980, 943, 887, 854,843,743, 710, 596 cm"<1>
Sledeći postupak opisan u prethodnom primeru, dobijena su sledeća jedinjenja:
Primer $ :
N-[2-Wdxoksi-3-(I-piperiđiml)propoksi]-4-pirithnIcarboksinudoil hlorid (Z)-2-butendioat (1:1)
U ovom slučaju, konačan proizvod je izolovan na kraju postupka obrade rastvaranjem sirove baze u acetonu i dodavanjem ekvivalentne količine maleinske kiseline.
Prinos: 25 %
T.t: 165,5 - 169 °C
Primer 9:N- P- Fd, 1 - dimetiletil) amino]- 2- hidroksipropoksi1- 3- lfuorometilbenzenkarboksimidoil hlorid
monohidrohlorid
Procedura:
a) 50 g (0,245 mola) m-trifluorometil-benzamidoksima i 33,7 g (0,6 mola) kalijum hidroksida je rastvoreno u smesi đimetil sulfoksida i 170 ml vode i smesa je ohlađena do 0 °C.
Dodato je 48 ml (0,6 mola) epihlorohidrina i reakciona smesa je mešana na 0 °C 5 sati, a zatim čuvana u frižideru preko noći. Sledećeg dana, dodato je 250 ml vode i smesa je ekstrahovana etil acetatom (4 x 250 ml). Kombinovane organske faze su oprane vodom, osušene, tretirane ugljem i uparene do suvog, da daju m-trifluorometil-N-(2,3-epoksipropoksi)-benzamidin u vidu bezbojnog ulja.
Prinos: 61 g (96 %)
b) Dobijenom ulju dodati su 400 ml 18 %-nog rastvora hlorovodonične kiseline i 60 ml etra i smesa je ohlađena do -5 °C, uz mešanje. 17,4 g (0,25 mola) natrijum nitrita,
rastvoreno u 60 ml vode je dodato polako tokom 40 minuta i reakciona smesa je mešana još 20 minuta. Smesa je zatim ekstrahovana etrom (2 x 160 ml) i kombinovane organske faze su
dvaput oprane vođom. Etarskom rastvoru je dodato 340 ml 20 %-nog rastvora natrijum hidroksida i dvofazni sistem je refluksovan 1 sat, uz mešanje. Zatim su faze razdvojene, organski sloj je opran slanim rastvorom do neutralnosti, osušen i uparen do suvog da da m-trifluorometil-N-(2,3-epoksipropoksi)-benzimidoil hlorid u vidu bezbojnog ulja.
Prinos: 30,5 g(45%)
c) Smesa 1,19 g (4,2 mmola) N-[(2}3-epoksi)propoksi]-3-trifluorometilbenzenkar-boksimidoil hloriđa i 0,89 ml (8,5 mmola)ferc-butilamina u 12 ml izopropil alkohola je
refluksovana 2 sata. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom. Ostatak je rastvoren u etil acetatu i dodato je 0.98 ml metanolnog rastvora hlorovodonika (4,3 N) i smesa je koncentrovana do male zapremine u vakuumu, a zatim razblažena etrom. Precipitat koji je formiranje sakupljen, opran hladnim etrom i osušen.
Prinos: 0,48 g (32 %)
T.t: 150-153 °C
IR (KBr): 3423, 3233,2978, 2880,2784, 1620,1570,1479, 1441,1400, 1383, 1340,1238, 1167,1128, 1101,1072,1038,982,930, 897,804,787,714,694 cm1
Sledeći proceduru opisanu u prethodnom primeru, dobijena su sledeća jedinjenja:Primer 10:N- r2- hidroksi- 3- rfl- metiletil) amino1propoksil- 3- trifluorometil- benzenkarboksimidoil hlorid
monohidrohlorid
Prinos: 30 %
T.t: 105-108 °C
IR (KBr): 3358, 2984, 2883, 2804, 1595, 1441, 1383, 1335, 1238,1184, 1171, 1121,1099, 1074,1011,995, 947,906, 891, 798, 779,696,681, 567 cm'<1>
Primer U:N- r3-( cikloheksilamino)- 2- hidroksipropoksi1- 3- trilfuorometil- benzenkarboksimidoil hlorid
monohidrohlorid
Prinos: 35 %
T.t: 147-149,5 °C
IR (KBr): 3381,2951,2860,2820,1580,1439,1344,1246,1161,1126,1099, 1074,1003, 986,932, 903, 872, 802, 787, 716, 692, 681, 648 cm"<1>
Primer 12:N- f3-( dietilamino)- 2- m hlorid
monohidrohlorid
Prinos: 21 %
T.t: 121-128 °C
IR(KBr): 3425, 3289,2951,2667,1818,1443,1337,1238,1178,1115, 1078, 1049, 997, 910, 804, 781, 696,683 cm"<1>
Primer 13:N- r2- Mdroksi- 3- fl- piperidiniff^ hlorid
monohidrohlorid
Prinos: 13 %
T.t: 119-123 °C
IR (KBr): 3366,2937,2854, 2737, 2673, 2538, 1616,1570, 1439, 1404, 1337, 1290, 1236, 1199,1165, 1129,1101, 1074, 1030, 984, 972, 933, 901, 829, 804, 788, 717, 699, 685, 646 cm"<1>
Primer 14:N- f 2- hidroksi- 3-( piperidin- 1 - oksid- 1 - il) propoksi]- N'- oksi- 3- piridinkarboksimidoil hlorid
Procedura:
Rastvoru N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorida (5,0 g; 17,1 mmola) u hloroformu (50 ml), dodata je m-hloroperbenzoeva kiselina (7,0 g; 40 mmola) u malim porcijama i smesa je mešana na sobnoj temperaturi 2 sata. Rastvarač je uklonjen, ostatak je rastvoren u 80 ml etil acetata, ekstrahovan vodom, osušen i uparen. Dobijen uljaru proizvod je konačno iskristalisan acetonom da da proizvod u vidu zagasitobele Čvrste supstance.
Prinos: 2,21 g (6,7 mmola; 40 %)
T.t: 140-142 °C
IR(KBr); 3437,3071,2943,2880,2590,1801,1578,1475,1454,1433,1375, 1294,1259, 1194,1165, 1121, 1088,1043,1011, 995,924, 905, 888, 845, 808, 710, 671, 554, 513,413 cm"1
Primer 15:
N- r2- todroksi- 3-( piperidin- l-^^ hlorid
Procedura:
Rastvoru N-[2-hidroksi-3-(l -piperidinil)propoksi]-3-piridinekarbok5imidoil hlorida (2,0 g; 6,8 mmola) u hloroformu (20 ml) dodata je m-hloroperbenzoeva kiselina (1,6 g čistoće 70 %; 6,5 mmola) i smesa je mešana na sobnoj temperaturi 30 minuta. Rastvor je zaalkaljen pomoću 10 % natrijum hidroksidnog rastvora, zatim razdvojen i organski sloj je opran slanim rastvorom, osušen i uparen. Čvrst ostatak je rekristalisan etil acetatom i posle filtriranja, precipitat je opran i osušen, da da proizvod koji je bela čvrsta supstanca.
Prinos: 1,03 g (48 %)
T.t.: 127-130 °C
IR (KBr): 3454, 2988, 2945, 2880, 2585, 1585, 1512, 1479, 1443, 1416, 1393, 1350, 1331, 1289,1183, 1134, 1072, 1051, 1030, 997, 953, 939, 879, 847, 808, 702, 519, 417 cm"<1>
Primer 16:N'- r2- m'( iroksi- 3-( l- meitl- 1- pipm
midoil hlorid diiodid
Procedura:
Smesa N-[2-Mdroksi-3-(l-piperidinil)propoksil:N-metil-piridinium-3-karboksi-midoil hlorida (1,0 g; 3,4 mmola) i 1.2 ml (20 mmola) metil jodida je refluksovana u acetonu (10 ml) u atmosferi azota 2 sata. Dobijem rastvor je profiltriran i tamnožut precipitat je opran acetonom da da sirov proizvod (1,8 g), koji je zatim rekristalisan iz 20 ml etanola.
Prinos: 1,2 g (60%)
T.t: 153-157 °C
IR (KBr): 3462, 3406, 3317, 3040, 2941, 2878, 2831, 1729, 1636, 1589, 1504, 1462, 1378, 1350, 1290, 1209, 1171, 1121, 1069, 1047, 1030, 1001, 941, 897, 868, 818, 706, 673, 635, 589 cm"<1>
Primer 17:
N-| 7- acetoksi- 3-( l- piperidinil) propoks^ hlorid ( Z)- 2- butendioat ( 1:
U
Procedura:
1,48 g (5,0 mmola) N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridiri-karboksimidoil hlorida je rastvoreno u 5 ml acet ahbidrida. Temperatura reakcije je podignuta do 40°C. Posle 30 minuta na sobnoj temperaturi, rastvarač je potpuno uklonjen na vakuumu, ostatak je rastvoren u 30 ml dietil etra, tretiran ugljena, profiltriran i rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom da da 1,74 g narandžastog ulja.
Ostatak je rastvoren u 10 ml acetona i dodat je rastvor 0,6 g (5,17 mmola) maleinske kiseline u 10 ml acetona. Kristalan proizvod je uklonjen filtracijom i opran acetonom da da 1.43 g zagasitobelog materijala. Rekristalizacija, sa obezbojavanjem, iz 9 ml izopropil alkohola je dala naslovno jedinjenje.
Prinos: 1,22 g (54%)
T.t.: 143-144 °C
Primer 18:fSVN-[ 2-[ 2- ®- flJ- dimetiletiloksikarborulaminoV3- fenilpropioniloksil- 3- flpiperidinil)
propoksiT,- 3- piridinkarboksimidoil hlorid ( Z)- 2- butendioat ( 1:1)
Procedura:
6,7 g (25,5 mmola) N-(terc-butoksikarbonil)-D-feniialanina je rastvoreno u 50 ml dihlorometana. Rastvor je ohlađen do 0 °C i 4,0 ml trietilamina, a zatim 2,5 ml (26 mmola) etil hloroformata je dodato kap po kap. Smesa je mešana 20 minuta na 0°C, a zatim je dodavan rastvor 7,5 g (26 mmola) N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorida u 50 ml dihloroAietana tokom 30 minuta. Reakciona smesa je mešana na sobnoj temperaturi 1 sat. Rastvor je ekstrahovan prvo 10 %-nom sirćetnom kiselinom (2 x 100 ml), a zatim vodom, osušen pomoću anhidrovanog natrijum sulfata i uparen do suvog. Ostatak (10,7 g) je rastvoren u 71 ml acetona i dodato mu je 1,53 g (13 mmola) maleinske kiseline. Posle filtriranja, do »jeni talog je opran acetonom.
Prinos: 4,0 g (6,0 mmola; 23 %)
T.t: 146,5-148 °C
[a]D = + 21,5°(c = l,MeOH)
IR (KBr): 3393, 2978, 1744, 1697, 1582, 1518, 1468, 1454, 1420, 1381, 1358, 1313, 1290, 1256,1213,1169,1126,1099,1084,1045,1016, 930, 908, 870, 750, 690,575 cm"<1>
Sledeći proceduru opisanu u prethodnom primeru, dobijena su sledeća jedinjenja:Primer 19:( R)- N- f2-[ 2-( SV( l J- dimetjletiloksikarbonilaminoV3- fenilpropiomloksi1- 3-( lpiperidinil^
propoksil- 3- piridinkarboksirnidoil hlorid ( Z)- 2- butendioat ( 1:11
Prinos: 25 %
Ovo jedinjenje ima iste fizičke podatke (T.t.; IR) kao što je napisano u Primeru 18.
[a]D = -23,6°(c=l,MeOH)
Primer 20:
N-[ 2- benzoiloksi- 3-( l- piperidinil) propoksn- 3- piridinkarboksimidamid ( Z)- 2- butendioat ( 1: 11
Procedura:
20,9 g (75,0 mmola) N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piirdin-karboksimi-damida [mađ. Pat. 177.578 (1976)] je rastvoreno u 300 ml benzena. Ovom rastvoru je dodato 150 ml 1 N rastvora natrijum hidroksida, a zatim kap po kap 19.5 ml (168 mmola) benzoil hlorida. Posle intenzivnog mešanja smese 2 sata, 7,1 g (67 mmola) natrijum karbonata i još benzoil hlorida (9,75 ml; 84 mmola) je dodato i mešanje je nastavljeno preko noći. Faze su zatim razdvojene, organski sloj je ekstrahovan 1 N natrijum hiđroksidnim rastvorom i vodom, osušen i uparen do suvog. Ostatak (41 g ulja) je rastvoren u 150 ml acetona i dodato je 8,7 g (75 mmola) maleinske kiseline. Posle filtriranja, dobijeni precipitat je opran acetonom i osušen.
Prinos: 29,1 g(78%)
T.t.: 194-195 °C
Sledeći proceduru opisanu u prethodnom primeru, dobijena su sledeća jedinjenja:Primer 21:N- r2- benzoiloksi- 3-( 1 - piperidirdl) propoksi}- 3- piridinkarboksimidoil hlorid f ZV2- butendioat
fl: n
Početni materijal: U.S. Patent 5,147,879 (1992)
Prinos: 64 %
T.t: 134-136 °C
IR (KBr): 2955, 2939, 2517, 1718, 1583, 1477, 1452, 1410, 1370, 1354, 1317, 1268, 1209, 1173,1117,1057, 1043, 998, 968, 939, 903, 870, 748, 723, 714, 652, 582 cm"<1>
Primer 22:N- f2- palmitoiloksi- 3-( 1 - piperidirul) propoksi1- 3- piridirA monohidrohlorid
Procedura:
14,7 g (52,8 mmola) N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridin-karboksmiidarm [mađ. Pat. 177.578 (1976)] je rastvoren u 160 ml hloroforma. Dodato je 7,7 ml (55 mmola) trietilamina, a zatim kap po kap rastvora palmitoil hlorida (14,7 g; 56,5 mmola) u 85 ml hloroforma. Smesa je mešana preko noći na sobnoj temperaturi. Sleđećeg dana, dodato je još 3,8 ml trietilamina i 7,4 g palmitoilhlorida i mešanje je nastavljeno još jedan dan. Rastvor je zatim ekstrahovan vodom, 5 %-nom sirćetnom kiselinom i vodom, sukcesivno, osušen preko anh. natrijum sulfata i uparen do suvog.
Ostatak (28,2 g ulja) je rastvoren u etil acetatu i proizvod je precipitiran dodatkom 30 ml 1 NHCl/etil acetata. Posle filtriranja, gust, beli precipitat je opran etil acetatom i osušen.
Prinos: 10,9 g (37%)
T.t: 110-113 °C
Sledeći proceduru opisanu u prethodnom primeru, dobijena su sledeća jedinjenja:Primer 23:N- f2-<p>alrnitoiloksi- 3-(l-<p>i<p>eridirul) propoksi1-3-<p>iridmkarboksimidonhIori
Početni materijal: U.S. Patent 5,147,879 (1992)
Komentar: reakcija se odvijala refluksovanjem.
Prinos: 72 %
T.t: 69-73.5 °C
IR (KBr): 3425, 2922, 2853, 2648, 2544, 1742, 1632, 1468, 1416, 1377, 1287, 1183, 1113, 1087,1032, 984, 708,675 cm"<1>
Primer 24:
N- 12-( 2- fimnloksi- 3-( lpiperidfo^^ ( Z)- 2- butendioat ( 1:1)
Komentar: proizvod je izolovan u vidu maleatne soli.
Prinos: 52 %
T.t.: 167-171.5 °C
Primer 25:N- r2-( o- hlorobenzoiloksi)- 3- n- pipe
monohidrohlorid
Komentar: reakcija se odvijala refluksovanjem.
Prinos: 50 %
T.t.: 91 - 94°C
Primer 26:N- r2-( r>metoksiberrzoiloksiy3-( l- piperi
monohidrohlorid
Komentar: reakcija se odvijala refluksovanjem.
Prinos: 71 %
T.t: 152 - 155°C
Primer 27:N- r2-( m- triflurometilberizoi^^
monohidrohlorid
Komentar: reakcija se odvijala relfuksovanjem.
Prinos: 45 %
T.t: 144 - 147°C
Primer 28:
N-[ 2-( 2- tenoiloksiV3-( i- pfe fZ)- 2- butendioat ( 1:
D
Komentar: reakcija se odvijala refluksovanjem i proizvod je izolovan u vidu maleatne soli.
Prinos: 58 %
T.t: 168-176°C
Primer 29:
N- f 2- acetoksi- 3 - f ( 1 - piperidimTmropoksil - 3- piridirikarboksimidamid monohidrohlorid
Procedura:
2,5 g (9,0 mmola) N-[2-Mdroksi-3-(l-piperidirul)p^^ je rastvoreno u 27 ml hloroforma, dodato je 1,6 g (16 mmola) sirćetnog anhidrida i mešano je na sobnoj temperaturi 1 sat. Reakciona smesa je uparena do suvog i rastvorena u izopropil alkoholu sa ekvimolarnom količinom (9 mmola) suvog hlorovodonika. Rastvor je ohlađen i profiltriran. Rekristalizacija iz izopropil alkohola je dalabelo kristalno jedinjenje.
Prinos: 1,9 g (59%)
T.t: 107°C:
Primer 30:N- f2-( 3- piirdirikarboniloksiV3-( l- piperidinil) lpropoksi- 3- piirdinkarboksimidamid ( Z)- 2-butendioatCl: 1)
Procedura:
Rastvoru N-[2-hidroksi-3-( 1 -pipeir(hml)propoksi]-3-piridinkarboksimid-amida (1,68 g; 6 mmola) u suvom piridinu je dodato 1,68 g (7,4 mmola) nikotinskog anhidrida i držanje na sobnoj temperaturi preko noći. Smesa je uparena, ostatak je rastvoren u 30 ml etil acetata, profiltriran, filtrat je ekstrahovan 10 %-nim rastvorom NaHCC>3, osušen i uparen. Dobijeno ulje je rastvoreno u 20 ml acetona i dodato je 0.53 g maleinske kiseline da bi se desila precipitacija. Posle filtriranja, proizvod je opran acetonom.
Prinos: 1,84 g (61 %)
T.t: 157-160 °C
Primer 31:
N-[ 3-( l- piperidinii>propo1ž^
Procedura:
2,86 g (51,1 mmola) kalijum hidroksida je rastvoreno u 20 ml apsolutnog etanola, a onda su dodati 6,45 g (47,0 mmola) N-Wdroksi-3-piridinkarboksimidamida i 7,7 g (47,7 mmola) l-hloro-3-(lpiperiđinii)-propana i refluksovano je 9 sati. Talog je uklonjen filtracijom i filtrat je uparen. Sirovi proizvod je rastvoren u 100 ml hloroforma, opran 1 N-nim rastvorom natrijum hidroksida, a onda tri puta vodom. Organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, profiltriran i rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom. Ostatak je rastvoren u maloj količini aps. etanola i dodat je izopropil alkohol sa suvom hlorovodoničnom kiselinom (pH 2) da bi se dobili zagasitobeli kristali.
Prinos: 4,8 g (38 %)
T.t: 95-100 °C (razgr.)
IR (KBr, baza): 3422, 3294, 3107, 2984, 2937, 2870, 2818, 1649, 1616, 1593, 1479, 1462, 1441,1381,1309, 1194,1123, 1094,1059, 1042,982, 910, 858, 816, 712, 559 cm1
Sledeći proceduru opisanu u prethodnom primeru, dobijena su sledeća jedinjenja:Primer 32:N- f3-( l- piperidinilVropoksi1- 3- trifluorometil- benzenkarboksimidamidmonoMdrohlori
Prinos: 42 %
T.t: 116-119 °C
IR (KBr, baza): 3412, 3082, 2949, 2874, 2827, 1655, 1485, 1447,1383, 325, 1283, 1171, 1121,1094,1072, 986, 920, 905, 808,700, 677, 627 cm'<1>
Primer 33:N- f3- n- piperidimT) propoksiH3, 4- dimeto
Prinos: 35 %
T.t.: 207-209 °C
Primer 34:
N-[ 2. 2- dimehl- 3-( l- piperidinil) propoksil- 3- piridinkarboksimidamid
Prinos: 38 % (ulje)
ER (KBr): 3323, 2935, 2888, 2785, 1637, 1477, 1393,1360, 1157, 1111, 1057, 995, 943, 860, 814,789,708, 627 cm"<1>
Primer 35:
N- f3- f4- metil4- piperazinU) propoksi1- 3- piridirikar^
Prinos: 23 %
T.t: 127-130 °C
IR (KBr): 3387, 2947, 2878, 2802, 1730, 1639, 1450, 1389, 1283, 1242, 1194, 1150, 1083, 1015, 964,933,814, 710 cm"<1>
Primer 36:
N- f 3-( 1 - piperidimDpropoksil- S- nitro- benzenkarboksimidarnid monohidrohlorid
Prinos: 51 %
T.t: 158-162 °C
Primer 37:
N- f3- d - pipeirdininpropoksil- benzenkarboksimidamid dihidrohlorid
Prinos: 64 %
T.t: 207-209 °C
Primer 38:
N- r2- hidroksi- 3- r( l- piperidinil) propolcsi]- 2. 4. 6- tirmetil- beri2cnkarboksimidamid
Prinos: 44 %
T.t.: 199-201 °C
IR (KBr): 3410, 3103, 2943, 2912, 2814, 2791, 1634, 1582, 1441, 1383, 1350, 1321, 1304, 1254, 1204, 1146, 1111,1099,1065,993, 878, 851, 785, 754, 525 cm"<1>
Primer 39:
N-[ 2- hidroksi- 3-[( l- piperidinil) propoksi]- 4- acetamino- benzenkarboksimidamid
monohidrohlorid
Prinos: 25 %
T.t: 133-137<6>C
Primer 40:
N- f 2- hidroksi- 3 - F ( 1 - piperidiniDpropoksi] - 3 - nitro- benzenkarboksimidamid dihidrohlorid
Prinos: 38 %
T.t.: 190-193 °C
Primer 41:N- f 2- hidroksi- 3- f( 1 - piperidinil) propoksil- 2-( U5- dimetilVoirolkarboksimidamid
monohidrohlorid
Prinos: 20 %
T.t.: 144-147 °C
IR (KBr, baza): 3458, 3369, 2930, 2849, 1622, 1587, 1502, 1468, 1437, 1396, 1354,1323, 1279, 1254, 1200, 1157, 1115, 1078, 1042, 988, 962, 930, 870, 856, 758, 737, 694, 609 cm"'
Primer 42:
N- F2- Mdroksi- 3-[( l- piperidimDpropoksil- 3- hinolinkarboksirmdamiddiMdrohlori
Prinos: 36 %
T.t.: 210-211 °C
Primer 43:
N- r2- hidroksi- 3-[ n- piperidinil) propoksil- 4- nitro- benzenkarboksimidamid dihidrohlorid
Prinos: 77 %
T.t.: 184-189 °C
Primer 44:
N- F2- hidroksi- 3- r( l- piperidinil) propoksil- 2- tiofenkarboksimidamid dihidrohlorid
Prinos: 73 %
T.t.: 157-170 °C
IR (KBr): 3280 (b), 2940,1655, 1420,1120, 1018, 1002, 857, 710 cm"<1>
Primer 45;
N- r2- hidroksi- 3- fn- piperi^ dihidrohlorid
Prinos: 47 %
T.t.: 200-208 °C
IR (KBr): 3300 (b), 2960,1670,1535, 1347,1155, 1020,1002,860, 800, 753 crn<1>
Primer 46:
N- f2- mdroksi- 3- rn^ piperidim^
Prinos: 56 %
T.t.: 208-216 °C
Primer 47: N-[3-[( 1,1 -dimetiletil)amino]-2-hidroksipropoksi] -3-trifluorometil-benzenkarboksimidamid dihidrohlorid
Procedura:
Smesa 21,0 g (80,8 mmola) m-trifluorometil-N-(2,3-epoksipropoksi)-benzamidina { Primer 9/ a),105 ml ferc-butilamina, 210 ml etra i 84 ml 4 N natrijum hidroksidnog rastvora je refluksovano 5 sati. Faze su razdvojene, etarski sloj je opran slanim rastvorom, osušen i uparen do suvog. Dobijeno ulje (25.8 g) je rastvoreno u 250 ml acetona, tretirano ugljem, a zatim je dodato 39 ml 4 N HCl/etil acetatnog rastvora, uz mešanje, što je dovelo do precipitacije bele čvrste supstance, koja je, posle filtriranja, oprana acetonom.
Prinos: 22,8 g (70 %)
T.t.: 186-192 °C (razgr.)
IR (KBr): 3418, 2984, 2785, 2625, 2527, 2401, 1664, 1585, 1487, 1437, 1381, 1329, 1173, 1155,1130,1078, 905, 874, 820, 692,642, 594 cm"'
Primer 48: N-[2-hidroksi-3-[(1-piperidim^jpro^
Procedura:
a) Dobijanje N-[2-[(2-tetrahio!ropiranil)oksi]-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piirdirucarbo midoil hlorida
21,3 g, 71,4 mmol N-[2-hidroksi-3-(lpiperidinil)propoks^ hlorida je rastvoreno u 500 ml hloroforma, zakišeljeno etarskim rastvorom hlorovodonične kiseline do pH=3, a onda je dodato 32,6 ml (0,357 mola) 3,4-đihidro-2H-pirana. Smesa je mešana na sobnoj temperaturi 20 sati, oprana 3 puta porcijama od po 200 ml 2N natrijum hidroksidnog rastvora i 4 puta istom količinom vode. Organska faza je osušena preko natrijum sulfata, profiltrirana i uparena pod sniženim pritiskom. Uljni ostatak je rastvoren u 600 ml etil acetata i opran 4 puta porcijama od po 150 ml puferskog rastvora pH=5. Organski rastvor je osušen, profiltriran i uparen.
Prinos: 24,5 g (90 %)
b) Smesa 3,7 g (9,68 mmola) N-[2-[(2-tetrahidropiranil)oksi]-3-(lpiperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorida i 40 ml (0,41 mola) n-butilamina je refluksovana 3 sata. Višak
amina je uparen na vakuumu dajući tamnobraon ulje, koje je rastvoreno u 40 ml etanola sa 3,0 g 4-toluensulfonskom kiselinom i smesa je zagrevana na 60°C jedan sat. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom, ostatak zaalkaljen (pH 10) 2N natrijum hidroksidnim rastvorom, a zatim ekstrahovan 3 puta hloroformom. Organski rastvor je osušen preko natrijum sulfata, profiltriran i rastvarač je uparen na vakuumu. Taman uljni ostatak je prečišćen hromatografijom da bi dao čistu bazu, koja je rastvorena u 20 ml etanola i zakišeljena ekvivalentnom količinom suve hlorovodonične kiseline rastvorene u izopropil alkoholu, da bi se dobilo naslovno jedinjenje u vidu bledožute kristalne supstance.
Prinos: 1,22 g (34%)
T.t.: 120-122 °C
IR (KBr, baza): 3319, 3293, 3040, 2959, 2928, 2854, 2842, 2552, 1612, 1580, 1450, 1427, 1399, 1333, 1315, 1221, 1196, 1171, 1126, 1103, 1051, 1022, 964, 928, 899, 858, 829, 719, 692,602 cm"<1>
Sledeći proceduru opisanu u prethodnom primeru, dobijena su sledeća jedinjenja:
Primer 49:
N-[2-Mdroksi-3-(l-piperimnil)propoksi]-N'-cikloheksil-3-piirdinkarboksimidamid monohidrohlorid
Prinos: 0,89 g (24%)
T.t.: 130-134 °C
IR (KBr): 3280, 2935, 2853, 2640, 1720, 1619, 1551, 1514, 1452, 1404, 1313, 1236, 1194, 1155,1124,1111,1090,1040, 978, 828, 735, 627 cm"<1>
Primer 50: N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]- N'-(l ,l-dimetiletil)-benzenkarboksimidamid
Procedura:
Rastvoru 0,92 g (5,2 mmola) l-hloro-2-hidroksi-3-(l-piperidinil)-propana u 2 ml vode dodato je 0,42 g (10,4 mmola) natrijum hidroksida i mešano jedan sat. Ovoj smesi je dodat 1,0 g (5,2 mmola) N-hidroksi-N<1->(l,l-dimetiletil)-benzenkarboksimidamida rastvoren u 20 ml etanola i refluksovana je 4 sata. Rastvarač je uparen, dodato je 50 ml vode i 3 puta je ekstrahovana porcijama od po 50 ml hloroforma. Organska faza je osušena preko natrijum sulfata, profiltrirana i rastvarač je uparen na vakuumu. Žut uljni ostatak je polako iskristalisan u frižideru. Kristali su triturisani dietil etrom i profiltrirani.
Prinos: 0,55 g (31 %)
T.t.: 134-137 °C
IR (KBr): 3427, 3254, 2929, 2853, 2814, 1739, 1603, 1510, 1445, 1391, 1367, 1302, 1281, 1190, 1140, 1117,1094,1067,1036,993, 963,922, 841,789, 716, 675 crn 1
Primer 51:
N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-N',N'-dietil-3-piridinkarboksimidamid monohidrohlorid
Procedura:
0,66 g (16,6 mmola) natrijum hidroksida je rastvoreno u 25 ml aps. etanola, onda su dodati 1,61 g (8,3 mmola) N-hidroksi-N',N' -dietil-3-piridinkarboksimidamida i 1,48 g (8,3 mmola) l-hloro-2-hidroksi-3-(l-piperidinil)-propana i refluksovan je 5 sati. Rastvarač je uparen, dodato je 50 ml vode i 3 puta je ekstrahovana porcijama od po 50 ml etil acetata. Organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, profiltriran i rastvarač je uparen na vakuumu. Žut uljni ostatak je prečišćen hromatografijom da bi dao čistu bazu koja je rastvorena u 20 ml etil acetata i zakišeljena ekvivalentnom količinom suve hlorovodonične kiseline rastvorene u etil acetatu, da bi se dobilo naslovno jedinjenje u vidu bele kristalne supstance.
Prinos: 1,3 g (42%)
T.t: 113-117 °C
Primer 52:
N-[2-hidroksi-3-( 1 -piperidinil)propoksi] -heksadekanska kiselina-amid monohidrohlorid
Procedura:
1,74 g (10 mmola) l-aminooksi-2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propana je rastvoreno u 20 ml hloroforma i ohlađeno do 0 °C. Rastvor palmitoilhlorida (2,85 g; 10 mmola) u 10 ml hloroforma je dodat kap po kap tokom 10 minuta. Posle mešanja smese 15 minuta, rastvor je profiltriran, dobijen beli precipitat je opran hloroformom i osušen.
Prinos: 3,2 g (71 %)
T.t.: 147-150 °C
IR (KBr): 3242, 3090, 2951, 2916, 2849, 1730, 1653, 1520, 1472, 1439, 1371, 1300, 1229, 1169,1136,1099,1070, 1009,993, 962, 928, 858, 760,719, 602, 471 cm"'
Sledeći proceduru opisanu u prethodnom primeru, dobijena su sledeća jedinjenja:
Primer 53:
N-[3-(l-piperidinil)propoksi]-3-trifluorometil-benzamid
Početni materijal: EP 365,364 (1990)
Prinos: 69 % (ulje)
IR (KBr): 3425, 2941, 2864, 2775,1674, 1614, 1566, 1520, 1483, 1441, 1393, 1337, 1319, 1277,1187, 1129,1072,922, 914, 750,698, 650 cm'<1>
Primer 54:
N-[2-hidroksi-3-( 1 -piperidinil)propoksi]-naftalen-1 -karboksarnid
Prinos: 54 %
T.t.; 104 - 107°C
JJR. (KBr): 3375, 2934, 1641,1593,1564,1439, 1340,1325,1113, 1026, 941, 810, 779 cm-<1>
Primer 55:
N-[2-hidroksi-3-( 1 -piperidirril)propoksi]-N'-heptil-urea
Procedura:
Rastvoru 1,23 g (7,1 mmola) l-aminooksi-2-hidroksi-3-(l-piperidiriil)-propana rastvorenom u 20 ml hloroforma dodat je 1,0 g (7,1 mmola) heptil izocijanata i reakciona smesa je mešana 20 sati. Rastvarač je uparen na vakuumu i ostatak je prečišćen hromatografijorn da bi dao čisto bezbojno ulje. Beli kristalni proizvod je dobijen triturisanjem petrol etrom.
Prinos: 81 %
T.t.: 49-51°C
Sledeći proceduru opisanu u prethodnom primeru, dobijena su sledeća jedinjenja:
Primer 56:
N-[2-hiđroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-N,-propil-urea
Prinos: 50 % (ulje)
IR (KBr): 3319, 2934, 2878, 2802, 1666, 1551, 1456, 1393, 1308, 1155, 1092, 1040, 993, 889, 793 cm<-1>
Primer 57:
N -cikloheksil-N'-[2-hidroksi-3-(l -piperidinil)propoksi]-urea
Prinos: 67 %
T.t.: 108-110 °C
IR (KBr): 3319, 3287, 3188, 2930, 2853, 2797, 1637, 1574, 1452, 1354, 1331, 1300, 1101, 1098,991 cm"<1>
Primer 58:
N -heksil-NL[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-urea
Prinos: 27 %
T.t.; 50-52 °C
TR (KBr): 3310, 2932, 2858, 2804, 1666, 1551, 1454, 1377, 1306, 1092, 1040, 995, 791, 725, 604 cm"1
Primer 59:
N-(3-hlorofenil)-N'-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-urea
Prinos: 34 %
T.t: 117-118 °C
IR (KBr): 3250, 2939, 2900, 1670, 1597, 1551, 1491, 1429, 1329, 1252, 1119, 972, 775, 718, 700 cm"<1>
Primer 60: N-ciMoheksil-N'-[2-lrick^ 1 -dimetiletil)amino]propoksi]-urea
Prinos: 44 %
T.t: 151-152 °C
IR(KBr): 3312, 2932, 2854, 1668, 1616, 1555, 1450, 1393, 1364,1354, 1252, 1220, 1130, 941, 891 cm"<1>
Primer 61:
N-heksil-N'-[3-( 1 -pip eridinil)propoksi] -urea
Prinos: 85 % (ulje)
IR (KBr): 3354,2932,2856,2810,2777,1666,1543,1486, 1377,1308, 1155, 1134, 1076 cm'<1>
Primer 62:
N-ierc-butil-N'-[2-rudroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-urea
Prinos: 38 %
T.t: 71-73 °C
IR (KBr): 3314, 2945, 2916, 1651, 1555, 1460, 1393, 1384, 1335, 1254, 1111, 988, 903, 839, 781 cm"<1>
Primer 63:
N-(3-mtro-feml)-N'-[2-M^
Prinos: 54 %
T.t.: 137-139 °C
IR (KBr): 3281, 2943, 2818, 1672, 1607, 1560, 1529, 1486, 1437, 1354, 1283, 1115, 802, 739 cm"1
Primer 64:
5,6-dMdro-5-(l-piperidmil)meti^^
Procedura:
a) 17,5 g (0,05 mola) N-[2-hidroksi-3-(l-piperidiml)propoksi]-3-piridinkarboksimidamid dihidrohlorida je rastvoreno u 50 ml tionil hlorida, kljucalo je jedan sat, a zatim je smesa
uparena do suvog. Ostatak je rastvoren u 300 ml metanola, tretiran ugljem i posle filtracije, rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom. Ostatak je rastvoren u minimalnoj količini etanola i hlađen u frižideru da da kristalan N-[2-hloro-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidamid dihidrohlorid kao intermedijerno jedinjenje.
Prinos: 13,2 g (71 %)
T.t.: 127-145 °C
b) 13,2 g (35,7 mmola) N-[2-hloro-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidamid dihidrohlorida je dodato rastvoru 16.5 g (143,5 mmola) kalijum terc-butoksida rastvorenom u
150 ml terc-butanol. Smesa je ključala 6 sati, a onda je uparena na vakuumu. 100 ml 5 %-nog natrijum hidroksidnog rastvora je dodato i smesa je ekstrahovana 3 puta porcijama od po 300 ml etil acetata. Organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, profiltriran i uparen do suvog. Ostatak je triturisan dietil etrom da da naslovno jedinjenje u vidu belih kristala.
Prinos: 3,5 g (38%)
T.t.: 157.5-158 °C
Primer 65:
N-[3-(l,l-m^etileitl)amino]-2-Wdroksipropoksi]-3-trifluorometil-benzamid
Procedura:
I, 3 ml (15,2 mmola) epiMorohidrina je dodato rastvoru 1,6 ml (15,2 mmola)terc-butilamina u 8 ml etanola tokom 10 minuta uz mešanje i uz održavanje temperature ispod 20°C i ostavljen je da stoji 3 dana.
Odvojeno, 0,8 g (14,3 mmola) kalijum hidroksida je rastvoreno u smesi 20 ml etanola i 3 ml vode i u ovaj rastvor su dodati 3,42 g (15,2 mmola) N'hidroksi-3(trifluoromctil)-benzamid kalijumove soli i prethodno dobijen rastvor epihlorohidrina iferc-butilamina. Reakciona smesa je mešana i ključala je 10 sati, a onda je rastvarač uparen. Ostatak je triturisan sa 20 ml dihlorometana i 10 ml vode, organska faza je odvojena, oprana sa 5 ml vode i 5 ml zasićenog rastvora natrijum hlorida, osušena preko natrijum sulfata, pro filtrirana i uparena. Uljni ostatak je iskristalisan u smesi aceton-heksan da da beli prah kao naslovno jedinjenje.
Prinos: 0,85 g (17,3 %)
T.t.: 156-158 °C
IR (KBr): 2976,2858,1612, 1556,1379,1352,1313, 1273, 1165, 1130,1072, 694 cm'<1>
Primer 66:
Metil-N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piirdinkarboksimidat (Z)-2-butenedioat (1: 1)
Procedura:
II, 4 g (38,2 mmola) N-[2-m^roksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorida je rastvoreno u 60 ml of aps. metanolu, a zatim je kap po kap dodato 25 ml (0,1 mol) 25 %-nog metanolnog rastvora natrijum metoksida tokom 5 minuta. Reakciona smesa ključala pola sata i uparena je. Ostatak je mešan sa 210 ml dihlorometana pola sata, natrijum hlorid je profiltriran i filtrat je opran sa 50 ml vode, pa sa 50 ml zasićenog rastvora natrijum hlorida, osušen preko magnezijum sulfata i uparen pod sniženim pritiskom. Sirov proizvod (9,8 g) je prečišćen hromatografijom da da naslovno jedinjenje kao bledožuto ulje.
Prinos: 2,9 g (29 %)
Elementarna analiza za C15H23N3O3
Primer 67:
Dietil-N-[2-mdroksi-3-(l-pipeirdinil)propoksi]-iminokarbonat
Procedura:
Smesa 0,87 g (5 mmola) l-ammcK3ksi-2-Mdroksi-3-(l-piperidiriil)-propana i 1,1 g (5,5 mmola) tetraetil ortokarbonata je mešana na 100°C 3 sata u prisustvu katalitičke količine p-toluensulfonske kiseline. Posle uparavanja, ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni (Merck Kieselgel 60; eluent: hloroform/metanol-cc. NKjOH 30:5:0,2) da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao bledožuto ulje.
Prinos: 27,7 % (ulje)
,<3>C-NMR (d, CDCI3)): 154.9 (s, C=N), 76.5 (t, N-OCH2), 66.6 (d, CHOH), 64.5 (t, CH3CH2), 64.1 (t, CH3CH2), 61.5 (t, CHCH2N), 54.8 (t, piperiđin), 26.0 (t, piperidin), 24.2 (t, piperidin), 14.9 (q, CH3), 14.1 (q, CH3)
Primer 68:
N-[3 -[(1,1 -dimetiletil)amino]-2-hidroksipropoksi] -O-etil-N'-fenil-izourea
Procedura:
18,4 g (0,1 mol) etil N-fenil-hloroformimidata (F. Lengfeld and J. Stieglitz: Am. Chem. J. 16. 70 (1894)) i 16,2 g (0,1 mol) l-aminooksi-2-hidroksi-3-[(l,l-dimetiletil)amino]-propana [Ger.Off. 2651 083] su rastvoreni u 200 ml teu^Wdrofurana, dodato je 13,9 ml (0,1 mol) trietilamina i smesa je mešana na sobnoj temperaturi 10 sati. Obrazovani trietilamin hidrohlorid je profiltriran i filtrat je uparen na vakuumu, ostatak je rastvoren u 200 ml hloroforma i opran sa 50 ml vode. Organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, profiltriran i uparen pod sniženim pritiskom. Sirov uljni ostatak je prečišćen hromatografijom da da naslovno jedinjenje kao bledožuto ulje.
Prinos: 18,5 g (59,8%)
Elementarna analiza za C16H27N3O3
Primer 69:
N-[3-[(l-pipeirdiml)-propoksi]-0-fenilizokarboksamid
Procedura:
3,16 g (20 mmola) l-aminooksi-3-(l-piperidinil)-propana je rastvoreno u 50 ml benzena, dodato je 2,4 g (20 mmola) fenil cijanata i smesa je mešana na sobnoj temperaturi 12 sati. Još 0,16 g (1,3 mmola) cijanata je dodato i smesa je mešana još 12 sati. Posle uparavanja, ostatak je rastvoren .u metanolu i rastvor je izbistren aktivnim ugljem i uparen. Proizvod je iskrtstalisan iz etil acetat/etil alkohola da da beli materijal.
Prinos: 46,9%
T.t.: 63-70 °C (etil acetat)
<l3>C-NMR (d, D20): 152,4; 129,9; 125,8; 119,9; 70,3; 57,4; 54,3; 53,2; 23,0; 22,7; 21,0.
Primer 70:
N-[2-mdroksi-3-(l-pi<p>eri(3inil)-pTopoksi]-N'-pentametilen-0-etil-izourea
Procedura:
2,7 g (0,01 mol) clietil-N-[2-mdroksi-3-(l-piperid (videti u Primeru 67) i 0,99 ml (0,01 mol) piperidina je rastvoreno u 40 ml tetrahidrofurana i mešano na sobnoj temperaturi 2 sata, a zatim upareno do suvog, Ostatak je prečišćen hromatografijom da da naslovno jedinjenje kao ulje.
Prinos: 2,1 g (67,1 %)
Elementarna analiza za C16H31N3O3
Primer 71:N, N- dimetil- N'- r2- h^ hidrohlorid
Procedura:
1150 mg (6,58 mmola) l-arnmooksi-2-hidroksi-3-(l-piperiđiml)-propana (Ger. Off. 2 651 083) je rastvoreno u hloroformu i dodato je 750 mg Na2C03, a zatim je kap po kap dodat rastvor 1206 mg (6,58 mmola) N,N-dimetil-N'-fenil-hloroformamidina (BR 888646 /1959/, Bayer, aut.: Ktihle and Eue L.; CA 57, 136961/1962/) u 10 ml hloroforma. Posle 5 sati, čvrsto stanje je dobijeno filtriranjem i filtrat je uparen. Ovaj ostatak (1800 mg ulja) je rastvoren u 10 ml etil acetata i proizvod je precipitiran dodatkom 10,46 ml 0,54 N HCl/etil acetata. Rastvor je profiltriran, žut precipitat je opran i konačno rekristalisan iz acetona, posle etil acetata.
Prinos: 28 %
T.t.: 127 129°C
ER (KBr): 3220, 2093, 2840, 2690, 2620, 1608, 1580, 1475, 1433, 1375, 1250, 1070, 1050, 1000, 925, 900, 760, 705 cm-<1>.
Primer 72:
N- r3- r( l. l- dimetiletil) amino1- 2- hidroksipropoksi1- N'- fenil- guanidin
Procedura:
3,1 g (0,01 mol) N-[3-[(l,l-dimetiletil)amino]-2-hidroksipropoksi]-0-etil-N'-fenilizouree (videti u Primeru 68) je rastvoren u 20 ml tetrahidrofurana i dodati su 200 ml 25%-nog amonijum hidroksidnog rastvora i 0,26 g (5 mmola) amonijum hlorida i smesa je držana na sobnoj temperaturi 15 sati. Smesa je uparena do suvog i prečišćena hromatografijom da da naslovno jedinjenje kao ulje.
Prinos: 1,7 g (60,7%)
Elementarna analiza za C14H24N4O2
Primer 73:NJfrP - difenil- N- f2- Mdroksi- 3-( l- pro^
Procedura:
3,55 g (20 mmola) 3-piperidino-2-hiđroksi-l-propana je rastvoreno u 2,5 ml vode, dodato je 0,8 g (20 mmola) NaOH i smesa je mešana na sobnoj temperaturi 1 sat. Zatim je kap po kap dodat rastvor 6,49 g (20 mmola) N,N'-difenil-N-hidroksi-benzenkarboksamidin hidrohlorida u 60 ml etil alkohola i još 0,8 g (20 mmola) NaOH. Dobijena žuta suspenzija je ključala 2 sata. Onda je rastvor profiltriran, a preciphiran natrijum hlorid je opran etil alkoholom. Rastvarač je uparen, dodato je 40 ml etil acetata i dva puta je ekstrahovan porcijama od po 40 ml destilovane vode. Organska faza je osušena preko natrijum sulfata, profiltrirana. Proizvod je precipitiran dodatkom 5,5 ml 3,67N HCl/eril acetata. Rastvor je profiltriran, precipitat je opran i konačno rekristalisan iz metanol/etra.
Prinos: 42%
T.t.: 151-155°C(metanol/etar)
<u>C-NMR(d, CDCI3): 159.6, 148.0, 140.9, 131.0, 129.7, 129.3, 128.9, 128.5, 127.9, 127.5, 64.2, 60.2, 54.5,22.7,21.9.
Primer 74:
N- r3-( l- piperidinilVpropoksi1- N- meitl- N'- fenil- 0- etil- izokarboksamid
Procedura za dobijanje ovog jedinjenja je ista kao što je napisano u Primeru 68, korišćeni su l-metilaminooksi-2-hidroksi-3-(l-piperiđinil)-propan i etil-N-fenil-hlorofor-mimidat kao početni materijali.
Prinos: 56 % (ulje)
Elementarna analiza za C17H29N3O3
Primer 75:
N- f2- hidroksi- 3-( l- piperidinilVpropoksiyN- metil- N'- feniI- guanidin
Procedura za dobijanje ovog jedinjenja je ista kao što je napisano u Primeru 72, koriŠćen je N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-N-mctil-N'-fenil-0-etil-izourea (videti Primer 74) kao početni materijal.
Prinos: 43 % (ulje)
Elementarna analiza za C16H-26N4O2
Primer 76:
N. N , N'- trimetil- N'- r3-( l- piperidinil)- propoksi1- N''- feniI- guanidin
Procedura
344 mg (2,0 mmola) l-metilaminooksi-2-hidroksi-3-(l-piperidinil)-propana je rastvoreno u hloroformu i dodato je 220 mg Na2CC<3, a zatim je kap po kap dodat rastvor 438 mg (2,0 mmola) N,Nm^etil-N,-fenil-hloroformamidin hidrohlorida u 3 ml hloroforma. Posle 8 sati, rastvor je profiltriran i filtrat (čvrsto stanje) je uparen. Ovaj ostatak je rastvoren u etil acetatu i proizvod je ekstrahovan dodavanjem HCI rastvora (pH=4) u vodu. Vodena faza je onda zaalkaljena dodatkom 2N NaOH rastvora do pH=l 1 i ekstrahovana acetatom. Organska
faza je uparena i dalje prečišćavanje je urađeno hromatografijom na koloni da bi se dobilo naslovno jedinjenje kao žuto ulje.
Prinos: 10% (ulje)
<13>C-NMR (d, CDCI3): 156.6, 150.5, 128.4, 121.4, 120.5, 70.0, 55.9, 54.4, 40.6, 39.4, 25.8, 25.6, 24.3.
Primer 77:
/ M+)- N-~ r2- liidroksi- 3-( l- piperid^ hlorid ( ZV2-butendioat ( 1: 1)
Procedura:
2,16 g (3.26 mmola) (S)-N-[2-[2-(R)-(l,l-dimetiletiloksikarbonilamino)-3-feniI propiomloksi)-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid (Z)- 2-butendioata (1:1) (videti Primer 18) je suspendovano u 40 ml metanola i ključalo je 1 sat, a zatim je upareno do suvog. Ostatak je triturisan sa 20 ml etil acetata, talog dobijen filtriranjem je opran etil acetatom. Ovaj sirovi proizvod je rekristalisan u izopropil alkoholu da da naslovno jedinjenje.
Prinos: 1,16 g (85%)
T.t.: 136-137 °C
[a]D: +5,6<0>(c=l, MeOH, t=27 °C)
Primer 78:
N- n- piperidino- l- propoksil- S- piridinkarboksimidoil hlorid dihidrohlorid
Posle hlađenja do 0°C, smesa 10 ml destilovane vode i 4,36 ml koncentrovane hlorovodonične kiseline, 2 g (7,62 mmola) N-(3-piperidino-l-propoksi)-3-piridinkar-boksamidina (videti Primer 31) su dodati uz mešanje. Žutom rastvoru je dodato kap po kap 2,7 g (3,81 mmola) natrijum nitrita rastvorenog u 10 ml vode na -5°C tokom 30 rninuta. Posle 1,5 sata mešanja zelenkastog rastvora na -5°C, pH rastvora je podešen na 10 dodatkom IN vodenog rastvora natrijum hidroksida uz hlađenje, onda je rastvor ekstrahovan 3 puta sa 40 ml hloroforma. Organska faza je oprana sa 20 ml vode, osušena preko natrijum sulfata i uparena. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni (Merck Kieselgel 60; eluent: hloroforrn/metanol 1 : 1) da bi se dobilo 1,7 g (79,2%) baze koja odgovara naslovnom jedinjenju.
Naslovni hidrohlorid se dobij a iz baze dobijene dodavanjem etanolnog rastvora hlorovodonika, t.t.: 165-167°C.
IR (KBr): 3015, 2945, 2617, 2515, 2088, 1982, 1600, 1570, 1437, 1402, 1200, 1060, 988, 912, 808 cm"<1>.
Gornji početni materijal se može dobiti na sledeći način:
Posle rastvaranja 2,86 g (51,06 mmola) kalijum hidroksida u 20 ml aps. etanola, 6,45 g (47,0 mmola) 3-piridinkarboksamid oksima se dodaje deo po deo uz mešanje. Posle rastvaranja, 7,7 g (47,66 mmola) l-(3-hloropropil)piperidina rastvorenog u 5 ml etanola se doda kap po kap. Posle devetočasovne reakcije, nataloženi kalijum hlorid se isfiltrira iz rastvora, etanolni rastvor se izbistri aktivnim ugljem i upari. Posle preuzimanja u 100 ml hloroforma, ostatak uparavanja se opere 3 puta sa po 100 ml IN natrijum hidroksidnog rastvora, zatim sa 50 ml vode. Posle razdvajanja, organska faza se osuši preko natrijum sulfata, profiltrira i upari. Uljni ostatak postaje kristalan pri hlađenju. Kristali se triturišu sa oko 20 ml etra i posle filtriranja se osuše da daju bež proizvod u prinosu od 4,8 g (38,9%). fR(KBr): 3422, 3107, 2937, 2870, 2819, 1640, 1479, 1391, 1309, 1194, 1123, 1059, 1042, 982, 916 cm"1.
Sledeći proceduru opisanu u prethodnom primeru, dobijena su sledeća jedinjenja:
Primer 79:
Q- 0- piperidinopropilV3- nitro- benzhidroksimoiI hlorid hidrohlorid
Prinos: 50%
T.t.: 173-175 °C
IR(KBr): 3420, 2926, 2953, 2649, 2546, 1514, 1591, 1533, 1452, 1354, 1259, 1252, 1049, 994, 733 cm"1.
5.2. PRIMERI FORMULACIJA
Primer 1: Tableta
Tableta koja sadrži 50 mg aktivnog materijala se dobija iz sleđećih komponenata:
N-[2-hiđroksi-3-(l-piperidirul)-propoksi]-2-tiofen-^ hlorid
Aktivno jedinjenje se fino samelje, pomeša sa aditivima, smesa se homogenizuje i granuliše. Granulati se presuju u tablete.
Primer 2: Tableta
Tableta koja sadrži 5 mg aktivnog materijala se dobija iz sleđećih komponenata: N-[2-hidroksi-3-( 1 -piperidinil)-propoksi]-2-nitro-benzimidoil
Kompozicija se dobija iz gornjih komponenata u skladu sa primerom 1.
Primer 3: Tableta
Tableta koja sadrži 5 mg aktivnog materijala se dobija iz sleđećih komponenata: N-[2-benziloksi-3-(l-pipeirdinil)-propoksi]-3-piridin-karboksimidamid
Kompozicija se dobija iz gornjih komponenata u skladu sa primerom 1.
Primer 4: Kapsula
Kapsula koja sadrži 10 mg aktivnog materijala se dobija iz sleđećih komponenata:
Aktivni materijal se pomeša sa aditivima, smesa se homogenizuje i puni u želatinske kapsule.
Primer 5: Kapsula
Kapsula koja sadrži 20 mg aktivnog materijala se dobija iz sleđećih komponenata:
Aktivni materijal se pomeša sa aditivima, smesa se homogenizuje i puni u želatinske kapsule.
Primer 6: Dražeja
Dražeja koja sadrži 25 mg aktivnog materijala se dobija iz sleđećih komponenata:
Aktivni materijal se pomeša sa karboksimetil celulozom i stearinskom kiselinom i smesa se granuliše u rastvoru acetata Salata celuloze u 200 ml etanol-etil acetata. Jezgro se presuje iz granulata koji se pokriva vodenim rastvorom polivinilpirolidona koji sadrži 5% šećera.
Primer 7: Injekcija
Injekcioni rastvor se dobija iz sleđećih komponenata:
Primer 8: Mast
Mast se dobija iz sleđećih komponenata:
Stearinska kiselina, cetil stearil alkohol i glicerin monostearat se istope zajedno. Natrijum lauril sulfat i metil-p-hidroksi benzoat se rastvore u 100 ml vode uz blago zagrevanje i onda se dodaju lipofilnim komponentama uz mešanje dok se temperatura ne spusti do sobne. Zatim se doda rastvor aktivnog jedinjenja u 50 vode i dobro se promeša.
Primer 9: Mast
Mast se dobija iz sleđećih komponenata:
Kompozicija je dobijena kao što je opisano u Primeru 8.
Primer 10: Krema
Krema se dobija iz sleđećih komponenata:
Rastvor komponenata rastvorljivih u vodi je dodat toploj smesi lipofilnih komponenata kao u Primeru 8 i vodeni rastvor aktivnog jedinjenja je dodat konačnoj emulziji.
PRIMER 6: EFEKAT N-[2-HroROKSI-3-(l-PIPERIDIML)PROPOKSI]-3-PnaDIN
KARBOKSMIDOIL HLORID MALEATA NA ĆELHSKU EKSPRESIJU Hsp (ISPITANO NA TRANSLACIONOM NIVOU)
6.1
Uvod
Eksperimenti prikazani u ovom odeljku su vođeni da bi se odredilo da li N-[2-hidYoksi-3-(l-piperiđiml)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat deluje na povećanje ekspresije molekulskih šaperona u ćeliji. Akumulacija različitih proteina toplotnog stresa odmah posle perioda izlaganja samom toplotnom stresu i toplotnom stresu u kombinaciji sa davanjem N-[2-Mdroksi-3(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata, je ispitana dodavanjem IO"<5>M N-[2-Mdrolcsi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata pre, za vreme ili odmah posle hipertermičkog tretmana srčanih miogenih ćelija (H9c2 ćelije).
6.2
6.2
Materijali i postupci
6.2 (a) Uslovi za ćelijske kulture:
Embrionska ćelijska linija H9c2 izvedena iz srca pacova je dobijena od Evropske kolekcije životinjskih ćelijskih kultura (ECACC) (88092904). Ćelije su održavane na 37°C u Dulbecco-voj modifikaciji Eagle-ovog medijuma (DMEM), obogaćenom 10%-nim fetalnim goveđim serumom (GIBCO) u JOUAN C02 termostaru (5% C02). 6.2 (b) Tretiranje N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom i uslovi toplotnog stresa: Toplotni stres je izveden na 43°C u CO2termostatu u datim vremenskim intervalima (20, 40, 60, 90 i 120 min.). Ćelije su zatim vraćene na 37°C 6 sati i proteini su ekstrahovani za SDS-PAGE. Kad je N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat dodat pre toplotnog stresa, IO"<5>M N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimiđoil hlorid maleata je dat 16 sati pre stresa. U drugom skupu eksperimenata, N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridirikarboksimidoil hlorid maleat je dodat u koncentraciji od IO"<5>M odmah posle toplotnog stresa, tokom 6 sati perioda oporavka. Eksperimenti su ponovljeni tri puta.
6.2 (c) VVestem blot
Za SDS-P AGE, ćelije su gajene u petri Šoljama od 6 cm. Količina ćelija na početku eksperimenta je bila 8 x 10<5>i još uvek nisu bile konfluentne kad su proteini ekstrahovani. Posle 6 sati oporavka, ćelije su oprane dvaput u PBS, zatim sastrugane sa površine šolja u PBS. Zatim su ćelije centrifugirane 5 minuta na 1500 rpm i preuzete u 100 ul modifikovanog solubilizirajućeg pufera (Molecular Cloning, A Laboratorv Manual, Ed. Sambrook, Fritsche, Maniatis, Bold Spring Harbor Laboratorv Press (1989)) koji sadrži 50 mM Tris-HCI, pH 8,0; 5 mM EDTA; 150 mM NaCI; 15 Triton X-100; 1 PMSF; 2^g/ml aprotinina; 1 ug/ml himostatina; 1 ug/ml pepstatina i sonifikovan je 3 x 20 sec (intervali od po 2 min., na 8).
Koncentracija proteina je određena iz uzoraka od po 5 ul Bradford-ovim testom (M.M. Braford,Anal. Biochem.,72: 248-254 (1976)) u tri paralelne probe. Uzorci su podešeni do 100 p.g/30 ul gornjim puferom i sledećim puferom, tako da koncentracija pufera u uzorku bude: 110 mM Tris-HCI pH 6,8; 8,3 mM merkaptoetanol, 3% SDS, 3 % glicerol i nešto bromofenolnog plavog i mućkani su na sobnoj temperaturi 30 min.
Elektroforeza je sprovedena prema Laemmli-ju (U.K. Laemmli,Nature,227:680-685
(1970)) na dva 8-18 %-na poliakrilamidna gela pri konstantnom naponu od 50 V preko noći. Proteini su ili bojeni pomoću Coomassie Brilliant Blue R-250 ili prebačeni na PVDF membranu lmmobilone (Millipore) pri konstantnoj struji (300 mA) 3 sata na 4°C u puferu za prenos (10 mM CAPS, pH II, 10 % metanol){ Protein Blotting Protokols for the Immobilon- P Transfer Membrane,3. Laboratorv Manual, Millipore). Posle prenosa, nespecifična mesta na membrani su blokirana pomoću 2 % BSA u TPBS (slani rastvor sa fosfatnim puferom sa 0.1 % Tween 20) preko noći na 4 °C. Membrane (blotovi) su inkubirane sa monoklonskim antitelom na GRP94 (SPA-850, StressGen), razblažene 1:3000, sa monoklonskim antitelom na Hsp60 (SPA-600, StressGen) sa razblaženjem 1:2700, sa monoklonskim antitelom na Hsp72 (C92F34-5, StressGen) razblažene 1:1250 ili sa monoklonskim antitelom na Hsp90 (AC88, StressGen) razblažene 1 :2000, 1 sat na sobnoj temperaturi. Zatim su jedan sat prane TPBS puferom i još 1 sat inkubirane sa sekundarnim antitelom na pacovski Grp-94 (Sigma, razblaženje 1:4000) ili sa sekundarnim antitelom na mišji Hsp60, Hsp72 ili Hsp90 (Sigma, ađsorbovanim sa humanim i pacovskim serumskim proteinima, razblaženje 1:3000), konjugovanim sa peroksidazom rena. Posle uzastopnih pranja TPBS-om, membrana je razvijena pomoću ECL sistema (Amersham),
Serija razblaženja ukupnih proteina je "blotirana" i razvijena paralelno sa uzorcima svaki put i napravljena je kalibraciona kriva. Promene u sadržaju stresnih proteina su kvantitativno određene Bio-Rad denzitometrom (Model 1650) i Hewlett-Packard Integratorom (HP 3394A) i korigovane prema kalibracionoj krivoj. U računanju, denzitometrijski podaci date trake proteina na 37°C bez tretmana N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom su uzimani za 100 % i svi drugi intenziteti su poređeni sa tim uzorkom.
6.2 (d) Statistička analiza
Podaci su dati kao srednje vrednosti + S.E.M. Statističko poređenje i računanje su rađeni pomoću jednosmeme analize varijansi sapost hocNewman-Keuls-ovim testom (Pharmacological Calculation Svstem). Statistička značajnost je definisana kao p <0.05.
6.3 Rezultati
HspćO: Tretman N-[2-Mdroksi-3-(l-piperimnil)propoksi]-3-piridinkarb hlorid maleatom, rađen na 37°C nema nikakav merljiv efekat na nivo ovog Hsp. Sam toplotni udar na 43°C, u trajanju od 20 minuta može da poveća količinu Hsp60 skoro dva puta. Produžavanjem dejstva toplote, nije se mogao primetiti dalji porast nivoa ovog proteina. Kad je dodat N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat u koncentraciji od IO"<5>M 16 sati pre toplotnog stresa, količina Hsp60 se povećala oko pet puta (u poređenju sa kontrolom na 37°C), čak i u uzorcima izloženim dejstvu toplote 20 minuta. Ovaj efekat N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata na nivo Hsp60 je bio očigledan i u uzorcima izloženim toploti po 40 i 60 minuta, međutim, posle je počeo da opada. N-[2-hidroksi-3-(l-piperidiniI)propoksi]-3-piriđinkarboksimidoil hlorid maleat dodat tokom faze oporavka je takođe bio efektivan, mada u znatno manjoj meri nego što je nađeno kad je ovo jedinjenje dodato pre stresa.
Hsp72: Bazalna količina Hsp72 je bila prilično mala u H9c2 ćelijama, međutim, efekat različitih tretmana na nivo Hsp70 je bio dramatičan. Već je bilo značajno povećanje pri dejstvu toplote od 20 minuta, a pri dejstvu toplote od 40 minuta, količina je bila skoro 10 puta veća nego što je detektovana u kontrolnim ćelijama. Duže trajanje dejstva toplote nije dovelo ni do kakvih značajnih promena u poređenju sa uzorcima na 40 minuta. Davanje N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata pre toplotnog stresa imala je vrlo jak efekat. Pri šezdesetominutnom toplotnom stresu, nivo Hsp72 je porastao oko 50 puta u poređenju sa uzorcima na 37°C, ali je znatno povećanje moglo da se detektuje već pri toplotnom stresu od 40 minuta. Ove jako indukovane količine Hsp72 su bile stabilne u ćelijama izloženim toploti 120 minuta. N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat dodat tokom faze oporavka je takođe bio efektivan, mada u manjoj meri.
Hsp90: Pri dejstvu toplote od 20 minuta, sam stres visokom temperaturom nije bio sposoban da indukuje povišen nivo Hsp90, međutim, ako je N-[2-hidroksi-3-(l-piperiđinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat bio dodat pre toplotnog stresa, nivo Hsp90 se povećao oko pet puta. Najveći efekat predinkubacije sa lekom je mogao da se primeti posle njegovog kombinovanja sa toplotnim dejstvom od 60 min. Bilo je zanimljivo primetiti daje, u slučaju Hsp90, dodavanje N-[2-hidroksi-3-(l- piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata posle toplotnog dejstva od 60 minuta na 43°C, bilo isto toliko efektivno (ako ne i više) kao kad je on dodat pre stresa visokom temperaturom. Očigledno, pri inkubaciji na visokoj temperaturi duže od 90 min. efekat N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata opada.
Grp94: Stvaranje stresnog proteina Grp94 je indukovano posle toplotnog stresa od 20 min. Ovaj efekat ima maksimum pri termalnoj obradi od 60 min., dok je oštar pad već bio detektovan u slučaju uzoraka sa 90 min. Sposobnost N-[2-hidroksi-3-(lpiperidinil)propoksi]3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata da indukuje stvaranje Grp94 je bio najizraženiji u slučaju kad je jedinjenje dodato pre stresa, ali je značajan porast mogao da se vidi ako je dodavanje leka pre stresa kombinovano sa toplotnim stresom od 20 minuta (gde je porast bio 4 puta u odnosu na tretman na 43°C). S druge strane, dodavanje jedinjenja tokom oporavka od toplotnog stresa u trajanju od 40 ili 60 minuta je bilo skoro isto toliko efektivno kao i davanje N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata u trajanju od 16 sati pre stresa.
Slika 2 pokazuje VVestem blot analizu proteina iz H9c2 ćelija. Probe koje su korišćene su: antitelo na Hsp60, prikazano u (1); antitelo na Hsp72, prikazano u (2); antitelo na Hsp90, prikazano u (3) i antitelo na grp94, prikazano u (4). Linija (-) predstavlja ćelije koje su držane bez N-[2-hidroksi-3-(lpiperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata na 37°C; a linija (+) predstavlja ćelije koje su držane sa njim (koncentracija IO"<5>M, 16 sati). Trajanja toplotnog stresa na 43°C su naznačena na slici. IO"<5>M-ni N-[2-hidroksi-3-(l-piperidmil)propoksi]-3piridinkarboksimidoil hlorid maleat je dodat 16 sati pre izlaganja toploti (linija (B)) ili tokom perioda oporavka (linija (A)).
Pregled efekata različitih tretmana na količine različitih Hsp u H9c2 ćelijama srca je dat na SI. 1. Količina stresnih proteina u ćelijama izloženim samo toplotnom stresu (43°C) je predstavljena sa (A); količina stresnih proteina u ćelijama tretiranim IO"<5>molarnim N-[2hidroksi-3-(l-piperiđinil)propoksi]-3-piridinkarboksimiđoil hlorid maleatom pre toplotne obrade je predstavljena sa (B) i količina stresnih proteina u ćelijama tretiranim IO"<5>molarnim N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom tokom šest sati perioda oporavka je predstavljena sa ©. Horizontalna osa predstavlja vreme delovanja toplote, a vertikalna osa predstavlja relativnu količinu stresnih proteina.
Samo delovanje toplote indukuje sve vrste Hsp-ova ispitanih u ovoj studiji. Povećanje je najmanje izraženo u slučaju Hsp60. Nivo Hsp60 se podigao oko dva puta posle izlaganja ćelija toploti 20 minuta, pri čemu dalje povećanje pri dužem delovanju toplote nije primećeno. Najveći efekat toplotnog stresa je mogao da se vidi za Hsp72, jer je njegova količina porasla oko 12 puta. Kad je N-[2-m^oksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat dodat 16 sati pre delovanja toplote, nivoi svih Hsp-ova je još porastao bar dva puta u odnosu na onaj viđen za toplotni stres. Bilo je jasno i da se nivo Hsp72 povećao u mnogo većoj meri među Hsp-ovima kombinovanjem toplotnog stresa i N-[2hidroksi-3-(lpiperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata u odnosu ponovo na indukciju detektovanu za sam toplotni stres. Kad je N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksi-midoil hlorid maleat dodat u toku faze oporavka, sadržaj Hsp-ova je povećan u skoro svim slučajevima koji su ispitivani, ali opet je porast Hsp72 bio najizraženiji.
6.4 Diskusija
Westem blot analiza je otkrila značajnu akumulaciju različitih klasa Hsp-ova ispitanih posle izlaganja ćelija srca toplotnom udaru. Dodavanje N-[2-hidroksi-3-(lpiperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata bilo pre, bilo posle stresa visokom temperaturom, umnogostručio je efekat delovanja toplote na proizvodnju Hsp-ova. U skladu s tim, N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridin-karboksimidoil hlorid maleat deluje u sinergiji sa temperaturnim stresom indukujući formiranje svih klasa molekulskih šaperona.
PRIMER 7: EFEKAT N-[2-HroROKSI-3-(l-PIPERIDINIL)-PROPOKSI]-3-PIRIDINK7\R-BOKSIMIDOIL HLORID MALEATA NA ĆELIJSKU EKSPRESIJU Hsp (ISPITANO NA TRANSLACIONOM NIVOU)
7.1 Uvod
Kratko izlaganje ishemiji (npr., ponavljanim stresiranjem) može da pripremi srce i zaštiti ga od kasnije letalne ishemije, kao što je dokazano smanjenom incidencijom ventrikulame fibrillacije, smanjenom jačinom infarkta i boljim oporavkom regionalne miokardijalne funkcije tokom reperfuzije ishemičnog srca. Pokazano je da takvo preduslovljavanje indukuje ekspresiju Hsp, naročito Hsp72. U ovom odeljku, efekat N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3piridinkarboksimiđoil hlorid maleata na ekspresiju Hsp72 je istražen preko ispitivanja akumulacije iRNK u ćeliji koja prati ishemiju i upoređivanjem te sa situacijom u kojoj je ishemija kombinovana sa davanjem N-[2-hidroksi-3-(l-pip6ridinil)propoksi]-3-pMdirucaTboksimidoil hlorid maleata.
7.2 Materijali i postupci
7.2 (a). Indukcija toplotnog stresa
Eksperimenti su sprovođeni na mužjacima SPRD pacova. Životinje su anestezirane Nembutalom u dozi od 60 mg/kg/i.p. Telesna temperatura pacova je održavana infra lampom stavljenom preko abdomena i merena je rektalna temperatura. Posle perioda od 25-40 minuta, temperatura pacova je porasla do 42,0-42,2 °C i ova temperatura je održavana 15 minuta. Posle perioda oporavka (2 sata), uzeti su uzorci tkiva iz leve i desne komore.
7 .2 (b)Indukcija srčane ishemije
Eksperimenti su sprovođeni na mužjacima SPRD pacova. Životinje su anestezirane Nembutalom u dozi od 60 mg/kg/i.p. Posle otvaranja grudnog koša i perikardijuma, LAD koronarna arterija je blokirana 5 minuta, a zatim su ispitani incidencija i trajanje ventrikularne tahikardije i fibrilacija u reperfuzionom periodu (10 minuta). Uzeti su uzorci tkiva iz leve i desne komore.
7.3 Postupak Northern blot
Ukupna RNK je ekstrahovana pomoću kompleta RNKgents (Promega) prema uputstvimau proizvođača (Protokols and Applications Guide, drugo izdanje, 1991, Promega Corporation). Ukratko, zamrznuti uzorci tkiva (uzorci tkiva iz leve i desne komore pacova podvrgnutih toplotnom stresu ili srčanoj ishemiji). Uzorci tkiva od po 50 do 100 mg su homogenizovani u 1,0 ml rastvora za denaturisanje na + 4°C Brinkman-ovom homogenizacijom. Zatim je dodata 1/10 zapremine 3M natrijum acetata (pH 4,0) i homogenat je ekstrahovan kiselim fenolom (fenokhloroform: izoamilalkohol, 25:24:1) 10 sekundi na vorteksu. Uzorak je inkubiran na ledu 15 minuta, a zatim centrifugiran (4 °C; 20 min, 10000 x
g). Vodena faza je prebačena u novu Ependorf epruvetu, proces je ponovljen i vodena faza je taložena na -20 °C preko noći. Posle centrifugiranja (4 °C; 20 min. 10000 x g), precipitat je
opran dva puta 95%-nim etanolom i osušena na sobnoj temperaturi. RNK je suspendovana u 20 ul vode, tretirane DEPC-om. Osam p,g ukupne RNK je propušteno kroz formaldehid-agarozni gel kapilarnim transferom, RNK na gelu je prenesena na najlonsku membranu prema uputstvu proizvođača (Zeta-Probe GT, BioRad).
Sadržaj iRNK za Hsp72 pojedinačnih uzoraka je upoređen sa nivoom iRNK za gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu (GAPDH) u odgovarajućim probama. Uzorci DNK (cela dužina humane cDNK Hsp70 i Apa-Ncol fragment GAPDH cDNK pacova) je obeležena sa alfa-<32>P CTP pomoću kompleta Random Primed DNK Labeling Kit (USB). Radioaktivno obeleženi fragmenti DNK su prečišćeni na Sefadex G-50 (Farmacia) koloni kao što je opisano (Ausubel et al. (eds)): Current Protokols in Molekular Biology: JOHN WILEY & SONS: 1987).
Prethodne hibridizacije su vršene na 65 °C u H-puferu (0,25 M Na2HP04, pH 7,2, 7% SDS) 15 minuta. Hibridizacije su izvođene preko noći (65 °C; H-pufer) cDNK probama obeleženim izotopom, čija je koncentracija najmanje IO<6>cpm/ml. Membrana je zatim isprana 20 mM-nim Na2HP04, pH 7,2, 5% SDS (65 °C; 2 x 15 min.) i određena autoradiografijom. Ista membrana je korišćena za testiranje iRNK za Hsp70, kao i za merenja GAPDH i iRNK koja su korišćena kao interni standard.
7.4 Rezultati
Koronarna okluzija od 5 minuta je praćena reperfuzijom, koja je izazvala ventrikulamu tahikardiju i fibrillaciju u pacovima. Prethodni tretman N-[2-hidroksi-3-(lpiperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom (0,5-,0,75-, 1,0 mg/kg telesne težine i.v. 5 min. pre okluzije) je značajano smanjio srednje trajanje ventrikularne tahikardije i popravio stepen preživljavanja sprečivši ventrikulamu fibrilaciju.
Dok su sve životinje (n=6) iz kontrolne grupe umrle u fazi reperfuzije, one koje su tretirane N-[2hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom (100 mg/kg p.o.) ne samo što su preživele reperfuziju posle 5 min. okluzije, nego je u preparatima njihovih srčanih mišića detektivana jako povećana ekspresija Hsp72 gena.
Slika 3 je Northern blot analiza ukupne RNK izolovane iz levih komora srca pacova, ilustrujući rezultate dobijene u eksperimentu. Kontrola (linija 1); izlagani toploti (linija 2); lažno operisani (linija 3); ishemija (linija 4); N-[2-hidroksi-3-(l-piperidiniI)propoksi]-3piridinkarboksimidoil hlorid maleat plus ishemija (linija 5) i N-[2-hidroksi-3-(lpiperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat (linija 6). GADF je meren kao interna proba. For toplotni udar, rektalna temperatura je održavana na 42°C 15 minuta.
Primećeno je da u odsustvu stresa, samo davanje N-[2-hidroksi-3-(l-piperidirul)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata nije bilo sposobno da aktivira Hsp72 gen.
PRIMER 8: ZAŠTITNI EFEKAT DERIVATA HIDROKSILAMINA IZ PRONALASKA OD SRČANE ISHEMIJE
Mužjaci Sprague-Dawley pacova (380-450g t. t.) su anestezirani natrijumpentobarbitalom (Nembutal 60mg/kg telesne težine, i.p.) i veštački ventilirani sobnim vazduhom (2 ml/100 g; 54 udara/minut) preko traheotomije. Desna karotidna arterija je kateterizovana i povezana sa transduktorom pritiska (BPR-01, Stoelting) za merenje sistemskog arterijskog krvnog pritiska (BP) pomoću predamplifikatora (Hg-02, Eksperimetria). Derivati hidroksilamina opisani u Primeru 5 su dati preko venske kanule u vratnu venu (i.v.) ili oralno (p.o.). Puls (HR) je meren kardiotahometrom (HR-01, Eksperimetria). Elektrokardiogram (ECG standard, olovo II) je sniman na uređaj za snimanje (MR-12, Medicor) pomoću subkutanih čeličnih igala - elektroda. Grudni koš je otvoren preko leve torakotomije i srce je zatim eksteriorizovano blagim pritiskom na desnu stranu rebara. 4-0 svilena sutura je brzo postavljena ispod glavne leve koronarne arterije kao što je opisao Selye et al. (1960). Srce je pažljivo vraćeno u grudni koš i životinja je ostavljena da se oporavi. Rektalna temperatura je praćena i držana konstantnom na 37 °C. Eksperimentalni protokol je započet periodom stabilizacije od 15 minuta, tokom kog je nalaz da krvni pritisak ne prelazi 70 rnrnHg ili pojava aritmije dovodio do isključenja. Miokardijalna ishemija je zatim 5 minuta indukovana koronarnom okluzijom i dozvoljena je reperfuzija od 10 minuta.
Tokom celog eksperimenta, BP, HR i EKG su stalno registrovali na multiskriptoru (R61-6CH, Medicor<*>). Derivati hidroksilamina, čiji su tautomemi oblici predstavljeni formulama (I) i (II), su davani 5 do 60 minuta pre okluzije, posle i.v. i p.o. tretmana, respektivno. Doze derivata hidroksilamina iz Primera 5 su bile 0,5; 0,75; 1,0 mg/kg i.v. i 100 mg/kg telesne težine p.o., dok je referentna supstanca Bepridil davana u dozi od 1.0 mg/kg i.v.
Srednje trajanje ventrikularne tahikardije (VT) i/ili ventrikularne fibrilacije (VF) tokom prva 3 minuta reperfuzije su analizirani jednosmernom analizom of varijanse. Incidencija VF je analizirana ći-kvadrat testom. Hemodinamičke varijable su analizirane Studentovim "t"-testom. Kritički nivo značajnosti je postavljen na p<0,05. Svi rezultati su izraženi kao srednje vrednošti ± S.E.M. Lekovi su davani i.v. u dozi od 1 mg/kg1.1. 5 min. pre okluzije.
Derivati hidroksilamina, za koje je nađeno da su naročito pogodni za zaštitu životinje od ishemičnih/reperfuzionih ozleda su nabrojani niže. Preživljavanje (%) označava procenat životinja koje su preživele efekte petominutne koronarne okluzije.
Kao dodatak gornjim jedinjenjima, nađeno je da i sledeća jedinjenja daju dobre rezultate: N-[2-m^oksi-3-(pkolidin-l-il)-porpoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid (Z)-2-butendioat (1:1) (U.S. 5,328,906, Primer 12,1 mg/kg t.t. i.v, preživljavanje %: 67); N-{2-hidroksi-3-(đietil-amino)-propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid hidrohlorid (1: 1)
(U.S. 5,328,906, Primer 11,1 mg/kg t.t. i.v., preživljavanje %: 62);
N-[2-hidroksi-3-prop-2-il-amino)-propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid
(Z)-butendioat (1 : 1) (U.S. 5,328,906, Primer 13/4,1 mg/kg t.t. i. v., preživljavanje %: 60); N-[2-hiđroksi-3-(morfolin-l-il)-propoksi]-3-piridinkarboksamidoil hlorid
(Z)-2-butendioat (1:1) (U.S. 5,328,906, Primer 12, lmg/kg t.t. i.v., preživljavanje %: 71); N-[2-hiđroksi-3-(l-piperiđil)-propoksi]-a-(3,4-dimetoksi -femTj-acetimiđoil
hlorid (U.S. 5,328,906, Primer 14, lmg/kg t.t. i.v, preživljavanje %: 67); N-[2-Wdroksi-3-(/erc-butiI-amino)-propoksi]-3-piridinkarboksamidoil hlorid (Z)-2-butendioat (1 :1) (U.S. 5,328.906, Primer 13/5,1 mg/kg t.t. i.v, preživljavanje %: 57); 0-(3-piperidino-2-hidroksi-1 -propii)-benzhidroksimna kiselina
hlorid hidrohlorid (U.S. 5,147,879, Primer l, 1 mg/kg t.t. i.v., preživljavanje %: 100); N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi3-3-piridinkarboksimidoil hlorid (Z)-2-butendioat (1 : 1) (U.S. 5,147,879, Primer 2, lmg/kg t.t. i.v., preživljavanje %: 100, 20 mg/kg t.t. p.o. preživljavanje %: 100).
PRIMER 9: EFEKAT N42-HmOKSI-3-(l-PIPERIDrNIL)PROPOKSI]-3-PIRIDrNKAR-BOKSTMIDOIL HLORID MALEATA NA POPRAVLJANJE ĆELIJSKE MEMBRANE i OČUVANJE FLUIDNOSTI MEMBRANE 9.1 PROMENE FLUIDNOSTI ĆELIJSKE MEMBRANE VEZANE ZA ĆELIJSKE OZLEDE IZAZVANE STRESOM ZBOG GUBITKA SERUMA I EFEKAT N-[2HIDROKSI-3<l-PIPERID]NIL)PROPOKSI]-3-PIRIDINKARBOKSIMroOIL HLORID MALEATA NA VRAĆANJE ALTERACHE U FLUIDNOSTI
9.1 (a) Uvod
Jedan pristup modelovanju patofizioloških događaja izazvanih stresom metaboličkog poremećaja koji prati diabetes je da se smanji nivo insulina u medijumu za kulturu. Pošto je insulin obezbeđen iz obogaćenog seruma, delimično ili totalno lišavanje se čini kao optimalan način za detekciju promena u različitim regulatornim nivoima ćelije.
Deprivacija seruma je široko korišćen postupak za zaustavljanje ćelija u Gl/S fazi, tj, za sinhronizaciju ćelijskog ciklusa (Ashihara, T.Methods of Enzymology,58: 248-249 (1979)). Primećeno je da ćelije u kulturi podležu apoptotičkim procesima u nedostatku obogaćenja seruma (Cohen, et al.,Adv. In Immunology50:50-85 (1991)) i to je proučavano kao alternativni stres onom staurosporinom ili inhibitorima topoziomeraze u Balb/3T3 ćelijama (Kulkarni, G.V. et al, J. Ćelij. Sci. 107: 1169-1179 (1994)) ili toplotnom stresu i deprivaciji glutamina u Ehrlich-ovim ćelijama (Rowlands, A.G. et al,Eur. J. Biochem.175: 93-99 (1988)), da se ispita inhibicija sinteze proteina preko fosforilacije eukariotskog inicijacijonog faktora (eIF2 alfa). Pored toga, postoje dokazi o indukciji ćelijske zaštite u ćelijama lišenim seruma dodavanjem spoljnog Hsp72 (Johnson, A.D. et al,In Vitro Ćelij Dev. Biol. Anim.29A: 807-812 (1993)). Povećanja u relativnoj sintezi Hsp82 i Hsp72 lišavanjem seruma (Toye, P. et al.Mol. Biochem. Parasitol.35, 11-10 (1989)) je takođe pokazano.
Ishemične i hipoksične ozlede miokarda i drugih organa su posredovane progresivnom disfunkcijom membrane i oštećenjem. Takođe je pokazano da se u metaboličkom poremećaju srčanih ćelija javlja promena u fluidnosti membrane (Buja L.M. et al,In vivo5: 233-238
(1991)). Fluidnost membrane primamo odražava orijentaciju i brzinu kretanja lipida u sastavu membrane i bilo kakva promena njenog nivoa jako utiče na osnovne funkcije membrane (Ouinn, P. J. et al,Prog. Biophys. Molec. Biol.53: 71-103 (1989); Schlame, M. et al,Biochim. Biophys. Acta,1045: 1-8 (1990)).
U ovom eksperimentu, sprovedeno je istraživanje da bi se odredilo da li promene u fluidnosti plazma membrane učestvuju u razvoju ćelijskog oštećenja izazvanog lišavanjem seruma i da U promene fluidnosti izazvane lišavanjem seruma mogu da se vrate davanjem N-[2-
hiđroksi-3-(1 -piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata.
9.1 (b) Materijali i postupci
Eksperimenti su vršeni korišćenjem ćelijskih linija mišjeg fibrosarkoma WEH1 i srčanog mišića pacova H9c2, podeljenih u tri grupe:
kontrolna (10% FCS fetalni teleći serum)
lišena seruma
lišena seruma i tretirana N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksi-midoil hlorid maleat (10"5 M)
9.1 (b) (1) Lišavanje seruma i MTT test
Pretražili smo različite ćelijske linije, koncentracije leka, vremena prethodnog tretiranja i deprivacije i našli smo da su najpogodniji uslovi sledeći: 5xl0"<4>/ml H9c2 ćelija srčanog mišića pacova (n=6) i ćelija fibrosarkoma miša WEHI (n=7) su stavljene na ploče sa 24 mesta u 10% FCS DMEM (Dulbecco-va modifikacija Eagle-ovog medijuma) i inkubirane 2 sata na 37 °C, 5% C02. Medijum je odbačen i zamenjen 10%-nim FCS DMEM koji sadrži IO"<5>M N-[2-Wdroksi-3-(l-piperiđiml)propoksi]-3-pmdinkarboksimidoil hlorid maleat. Posle još 6 sati inkubacije u gornjim uslovima, ploče su intenzivno prane PBS-om i ukinut je serum. Prethodno tretiranim ćelijama je dodat N-[2-mdroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimiđoil hlorid maleat do kraja eksperimenta. Posle 18 sata gladovanja, većina ćelija se otkačila, tj, umrla, što je viđeno mikroskopski, u kulturi bez seruma, dok su kulture prethodno tretirane N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3piridinkarboksimidoil hlorid maleatom pokazale sličnu sliku kao kontrolne ćelije. Vijabilnost ćelija je merena MTT testom, zasnovanom na postupku Plumb-a i sar.( Cancer Res,49: 4435-4444 (1989)). Postupak tetrazolijumove soli koji uključuje konverziju MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijum bromid) u obojeni formazan u živim ćelijama, poslužio je kao indirektno merenje ćelijske vijabilnosti. MTT je dodat direktno u medijum u koncentraciji od 1 mg/ml. Posle 2 sata inkubacije na 37°C u mraku, supernatant je uklonjen i 200 ul 0,05 M HCI u izopropanolu je odmah dodato ćelijama.
Optička gustina ploča je Čitana na 570 nm, na čitaču ploča ELISA (Labsvstems Multiskan Biochromatic type;348). Eksperimenti su u svakom od slučajeva rađeni bar u triplikatima. Relativna ćelijska vijabilnost je računata u odnosu na kontrolnu grupu koja je defimsanakao 100%.
9.1 (b) (2) Određivanje fluorescentne anizotropije stacionarnog stanja
Ćelijske suspenzije od 1 x IO<5>ćelija/ml u PBS su obeležene dodatkom DPH-PA (3-[p-(6-fenil)~l,3,5-heksatrienil] fenilpropionska kiselina) rastvorenim u tetrahidrofuranu u konačnoj koncentraciji od 0,1 pM i inkubirane 10 min. na 37 °C. Količina organskog rastvarača koja je dodata je 0,05 % da bi se izbegao njegov efekat na ćelijske membrane. Membranska proba DPH-PA je odabrana prema osobinama naelektrisanja probe koja omogućuju DPH-PA da se lokalizuje prvenstveno unutar spoljnog sloja plazma membrane, sa difenil-heksatrien grupom umetnutom između gornjih delova lanaca masnih kiselina (Kitagawa, S, et al,J. Membrane Biol.119:221 227 (1991)). DPH-PA ispoljava veliko pojačanje fluorescencije po vezivanju za lipide, dajući način za određivanje fluorescentne anizotropije kao funkcije uređivanja lipida. Merenja fluorescencije su vršena na 37 °C, upotrebom Quanta Master QM- 1 T-format luminescentni spektrometar (Photon Technologv Int. Ine, NJ, USA), opremljen polarizatorima u ekscitacionom i dva emisiona svetlosna puta. Ekscitaciona talasna dužina je bila 360 nm (širina proreza 5 nm), a i emisiona 430 nm (širina proreza 5 nm). Izmereni intenziteti fluorescencije su korigovani za pozadinsku fluorescenciju i rasejanje svetlosti sa neobeleženog uzorka. Fluorescentna anizotropija je izračunata kao
rs= (IVV - G.rVH) / (IVV + (2 x G x IVH))
gde su IVV i IVH intenziteti izmereni polarizatorom paralelnim i normalnim na vertikalno polarizovan ekscitujući snop, respektivno. Faktor G je jednak IVH/IHH i koriguje na nesposobnost instrumenta da jednako transmituje različito polarizovane svetlosti i na razliku u osetljivosti dva emisiona kanala (Kitagawa, S, et al.J. Membrane Biol.119:221 227 (1991)). IHV i IHH su intenziteti fluorescencije određeni na vertikalnom i horizontalnom položaju emisionog polarizatora kad je ekscitacioni polarizator namešten horizontalno.
9.1 (b) (3) Statistička analiza
Podaci su dati kao srednje vrednosti ± S.E.M. Statističko poređenje i računanje su rađeni pomoću jednosmerne analize varijansi sapost hocNewman-Keuls-ovim testom (Pharmacological Calculation Svstem). Statistička značajnost je definisana kao p <0,05.
91 ( 0 Rezultati
9.1 (C) (1) Lišavanje seruma kao model da se testira citoprotektivan efekat N-[2-hidroksi-3-(l-
piperidmil)pro<p>oksi]-3<p>iridinkarboksirnidoil hlorid maleata
WE HI i H9c2 ćelije lišene seruma su pokazale 74,8% i 50,5% relativnu ćelijsku vijabilnost, respektivno. U slučaju kad je 10"<5>M N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat bio prisutan u medij umu kulture, davanje je dovelo do skoro potpunog preživljavanja WE HI (93%) i visoke zaštite u H9c2 ćelijama srčanog mišića (82,75%). Smanjenje relativne ćelijske vijabilnosti lišavanjem seruma i njena zaštita pomoću N-[2-hidroksi-3-(lpiperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata u obe ćelijske linije su bili značajni.
9.1 (c) (2) Efekat N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3piriđinkarboksimidoil hlorid maleata na fluidnost sisarskih ćelija lišenih seruma
Da bi se ispitao efekat lišavanja seruma na fluidnost plazma membrane sisarskih ćelija u kulturi, izvršena su merenja fluorescentne anizotropije uz upotrebu probe za plazma membranu DPH-PA. Fizičke osobine ćelijske plazma membrane su značajno izmenjene lišavanjem seruma. Lišavanje seruma je prouzrokovalo izraženo smanjenje fluorescentne anizotropije DPH-PA, koje je abnormalno povećanje fluidnosti plazma membrane u oba ispitana ćelij ska modela. Po dodavanju N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3piridinkarboksimidoil hlorid maleata, uočili smo skoro kompletno očuvanje fizičkog stanja membrane. Ove promene su očigledno konzistentne sa opisanim tendencijama ćelijske vijabilnosti.
9.1 (d) DISKUSIJA
Stvarajući metaboličke poremećaje, lišavanje normalnog medijuma za kulture u oba proučavana tipa ćelija, je smanjilo njihovu vijabilnost, što je testirano MTT postupkom. Ovaj efekat je skoro potpuno poništen dodavanjem N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3piridinkarboksimidoil hlorid maleata. Lišavanje seruma je izazvalo i znatne promene fluidnosti plazma membrana, za koje se zna da doprinose disfunkciji membrane koja prati miokardijalnu ozledu. Nasuprot tome, ćelije lišene seruma, kultivisane u prisustvu N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata, su bile u stanju da delimično očuvaju (or zadrže) normalno fizičko stanje svoje plazma membrane.
PRIMER10:EFEKAT INSULINAiN-[2-HIDROKSI-3-(l-PIPERIDrNIL)PROPOKSI]-3-PIJAIDmKARBOKSIMIDOLL HLORID MALEATA NA NIVO GRP-94 U STZ
DIABETIĆKOJ JETRI PACOVA
10.1 Uvod
Aneksija, odsustvo glukoze i nekoliko drugih stanja koja nepovoljno utiču na funkciju endoplazmatičnog retikuluma (ER), izazivaju sintezu klase stresnih proteina regulisanih glukozom (GRP)(Lin, H.Y, et al.Mol Biol. Cell. 4:1109-1119 (1993)). Član GRP klase od 94 kDa, GRP-94, 50% homologan sa stresnim proteinom od 90 kDa, je cevast protein ER-a koji vezuje kalcijum. Zajedno sa drugim proteinima ER-a, izgleda da GRP-94 funkcioniše kao molekulski šaperon (Nigem, S.K, et al.,J. Biol. Chem.263: 1744-1749 (1994)). Smatra se da bi akumulacija molekulskih šaperona GRP-94 trebalo da ima povoljan efekat na popravljanje ćelijskih oštećenja izazvanih STZ dijabetesom u pacovima. U skladu s tim, u eksperimentima izloženim ovde, poredili smo razne nivoe GRP-94 u jetrama iz pacova koji su zdravi, dijabetični, tretirani N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom i tretirani insulinom plus N-[2 hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom.
10.2 Materijali i postupci
10.2 (a) Testirane supstance: N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridin karboksimidoil hlorid maleat (BIOREX Ltd.)
insulin (Protophane HM inj.)
10.2 (b) Životinje: Crl (V AF plus) mužjaci pacova Wistar (250-300 g)
Životinje su čuvane po 7 u kavezu na 23-25 °C sa relativnom vlažnošću vazduha 50-60%, uz ciklus svetlost-tama 12/12 sati. Imale su slobodan pristup hrani (chow) i vodi (iz vodovoda)
10.2 (c) Indukcija dijabetesa: jedna doza STZ (45 mg/kg i.v.) je data u stanju redukovane ishrane
10.2 (d) Životinje su podeljene u sledeće grupe:
a. Zdrave životinje
1. zdrave, tretirane slanim rastvorom 1 nedelju (n-5)
2. zdrave, tretirane slanim rastvorom 2 nedelje (n=5)
3. zdrave, tretirane slanim rastvorom 4 nedelje (n=5)
4. tretirane N-[2-hidrok5i-3<l-piperidiml)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom 1
nedelju (n=7)
5. tretirane N-[2-hichoksi-3-(l-piperidinil)propoksi>^ hlorid maleatom 2 nedelje (n=7) 6. tretirane N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom 4 nedelje (n=7)
b. STZ-dijabetične životinje
7. dijabetične, tretirane slanim rastvorom 1 nedelju (n=5)
8. dijabetične, tretirane slanim rastvorom 2 nedelje (n=5)
9. dijabetične, tretirane slanim rastvorom 4 nedelje (n=5)
10. dijabetične, tretirane N42-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom 1 nedelju (n=7) 11. dijabetične, tretirane N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom 2 nedelje (n=7) 12. dijabetične, tretirane N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridirukarboksimidoil hlorid maleatom 4 nedelje (n=7)
c. Insulinizovane STZ-dijabetične životinje
13. dijabetične, tretirane insulinom 1 nedelju (n=7)
14. dijabetične, tretirane insulinom 2 nedelje (n=7)
15. dijabetične, tretirane insulinom 4 nedelje (n=7)
d. Insulinizovane dijabetične životinje tretirane N-[2-hidroksi-3-(l -piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom
16. dijabetične, tretirane insulinom i N-[2-hidroksi-3-(l-piperidiniI)propoksi]-3-piridin karboksimiđoil hlorid maleatom 1 nedelju (n=7) 17. dijabetične, tretirane insulinom i N-[2-hidroksi-3-(l-piperidiniI)propoksi]-3-piridin karboksimiđoil hlorid maleatom 2 nedelje (n=7) 18. dijabetične, tretirane insulinom i N-[2-hidroksi-3-(l-piperidiniI)propoksi]-3-piridin karboksimiđoil hlorid maleatom 4 nedelje (n=7)
Posle tretmana, uklonjena je jetra i odmah je smrznuta na -70 °C u tečnom azotu.
Tretman N-[2-hiđroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimiđoiI hlorid maleatom (gde god je primenljiv): 20 mg/kg/dan, p.o. Tretman insulinom: dva puta dnevno u dozi da se održi normalan nivo glukoze.
10.2 (e) Određivanje nivoa Grp-94
Ekstrakcija ukupnih rastvorljivih proteina iz jetre pacova
Svi koraci su sprovođeni na 0-4 °C. Jetre pacova (oko 15-20 g) su homogenizovane kućnim mikserom 2 minuta u 80 ml modifikovanog puferskog rastvora za liziranje sa jednim deterdžentom koji sadrži 50 mM Tris-HCI pH 8,0; 5 mM EDTA, 150 mM NaCI, 0,1% SDS, 1% Triton X-100 i 1-1 mM inhibitora proteaze (PMSF, benzamiđin, amino-kapronska kiselina). Homogenat je centrifugiran na 20000 x g 30 minuta u Servile RC 28S centrifugi. Glavnina supematanta je smrznuta do -20 °C kao matični rastvor), 1 ml je upotrebljen za analizu.
Koncentracija proteina je određivana Bradford-ovim testom (Guide to Protein Purification.Methods in Enzimology,vol. 182, M.P. Deutscher (Ed.), Academic Press (1990)) u tri paralelna uzorka i podešavana na 5 mg/ml,
Elektroforeza i imunobloting
Laboratorijske tehnike za elektroforezu i imunobloting su opisane detaljno uMolecular Cloning. A Laboratory Manual,Ed. Sambrook, Fritsche. Maniatis. Cold Spring Harbor Laboratorv Press (1989);Protein Blotting Protokols for the Immobilon- P Transfer Membrane,3. Laboratorv Manual, Millipore; i U.K. Laemmli,Nature:227: 680-685 (1970). Svaki uzorak, koji je sadržao po 1,8 mg proteina, je solubilizovan za elektroforezu na gelu pomoću 0,6 ml pufera koji sadrži 110 mM Tris-HCI pH 6,8; 8,3 mM merkaptoetanola, 3% SDS, 3% glicerola i nešto bromofenolnog plavog i mućkan je na sobnoj temperaturi 30 minuta. Elektroforeza je vršena na 8%-nom poliakrilamidnom gelu sa 30 u.g proteina po traci na konstantnom naponu od 50 V preko noći. Proteini su ili bojeni pomoću Coomassie Brilliant Blue R-250 ili prebačeni na Immobilone PVDF membranu (Millipore) pri konstantnoj struji (300 mA) 3 sata na 4 °C u puferu za prenos (10 mM CAPS pH 11, 10% metanol). Nespecifična mesta na membrani su blokirana pomoću 2% BSA u TPBS (slani rastvor sa fosfatnim puferom sa 0,1% Tween 20) preko noći na 4 °C. Membrana (blot) je inkubirana sa monoklonskim antitelom na GRP94 (SPA-850, StressGen), sa razblaženjem 1:3000, 1 sat na sobnoj temperaturi. Zatim je prana TPBS puferom još jedan sat i inkubirana jedan sat sa sekundarnim antitelom za pacova (Sigma, razblaženje 1:4000) konjugovanim sa peroksidazom rena. Posle uzastopnih pranja TPBS-om, membrana je razvijena pomoću ECL sistema (Amersham).
Serija razblaženja ukupnih proteina (9/1 uzorak) je "blotirana" i razvijena paralelno sa uzorcima svaki put i napravljena je kalibraciona kriva. Promene u sadržaju stresnih proteina su kvantitativno određene Bio-Rad denzitometrom (model 1650) i Hewlett-Packarđ Integratorom (HP 3394A) i korigovane prema kalibracionoj krivoj.
Statistička analiza
Podaci su dati kao srednje vrednosti ± S.E.M. Statističko poređenje i računanje su rađeni pomoću jednosmerne analize varijansi sapost hocNewman-Keuls-ovim testom (Pharmacological Calculation System). Statistička značajnost je đefinisana kao p <0,05.
10.3 Rezultati
Značajno smanjenje relativnog sadržaja GRP-94 je uočeno kod dijabetičnih pacova posle 1 nedelje, 2 nedelje i 4 nedelje. Ovaj efekat u diabetičnim životinjama posle 1 nedelje i 2 nedelje je mogao potpuno da se poništi tretmanom N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom. Administracija samog insulina ili u kombinaciji sa N-[2-hidroksi-3-(l-pi<p>eridinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom u zorcima od 1 nedelje i 2 nedelje je skoro duplirala nivoe ovog proteina u poređenju sa kontrolnim stanjem.
Nasuprot prethodnim nalazima, tretman dijabetičnih pacova 4 nedelje samim N-[2-hidroksi-3-(lpiperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom nije dovelo ni do kakvih značajnih promena u relativnoj količini GRP-94. Štaviše, u obema insulinizovanim kategorijama, bez obzira da li su tretirane N-[2-hidroksi-3-(l-piperidiniI)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom ili ne, videli smo oporavak GRP-94 do kontrolnog nivoa.
PRIMER 11: EFEKAT N-[2-HIJJROKSI-3-(l-PiPERIDINIL)-PROPOKSI]-3-PIRiDINKARBOKSIMIDOIL HLORID MALEATA NA ZAŠTITU EPIDERMNIH ĆELIJA OD OŠTEĆENJA PROUZROKOVANIH IZLAGANJEM TOPLOTI IUV ZRACIMA
11.1 Materijali i postupci
Ćelijska linija HaCaT je spontano imortalizovana, aneuploidna humana keratinocitna
ćelijska linija izvedena iz normalne kože odraslog čoveka (Boukamp et al,J. Cell. Biol.106:761-771 (1988)), HaCaT je ćelijska linija sa punim kapacitetom za epidermnu diferencijaciju, sa normalnom keratinizacijom i netumorogenog karaktera. Ova keratinocitna linija koja se brzo umnožava, visoke osetljivosti na ditarnol, se takođe odlikuje prisustvom steroidnih receptora. HaCaT ćelije (4 x IO<5>ćelija po Petri šolji prečnika 35 mm) je zasejano i kultivisano u DMEM obogaćenom 5%-nim fetalnim telećim serumom (Gibco, Cat. No. 0 11-6290H) u vlažnoj atmosferi 5%-nog C02na 37°C. 24 sata posle stavljanja na ploče, kulture su isprane PBS-om i tretirane toplotom ili svetlošću.
Konfluentne kulture ćelija su izložene toploti (42, 44, 46, 47, 48 °C) ili UV svetlosti (UVA 1, 2, 4, 6 J/cm<2>). Izlaganje toploti je omogućeno u kupatilu sa cirkulišućom vodom. Kao izvor UV svetlosti, korišćena je Waldmann PUVA 4000 sa energijskim spektrom konačnog izlaza između 320 i 390 nm, sa maksimumom na 365 nm. Energijski izlaz je praćen pomoću radiometra IL-1700, opremljenog UVA i UVB senzorima.
Morfologija ćelije je praćena pomoću fazno kontrastne mikroskopije (Opton Axioplan Microscope, sa Plan-Apochromat Ph objektivima za fazni kontrast). Sledeći faktori su smatrani za indikatore citotoksičnosti: (a) smanjena gustina adherovanih ćelija; (b) gubitak pravilne strukture ''kaldrme" sa povećanjem međućelijskih prostora; c) promene oblika ćelija, npr, ometeno rasprostiranje ćelija, bubrenje, piknotičko skupljanje, fragmentacija i (d) promene u citoplazmi, npr, kondenzacija ili vakuolizacija. Ćelijska vijabilnost je takođe ispitivana, pomoću testa isključenja Tripan plavim.
11.2 Rezultati
Osetljivost HaCaT keranitocita na toplotni stres je određivana ispitiivanjem njihove vijabilnosti. Rezultati su ukazali da 24 sata posle izlaganja toploti na temperaturi od 48 °C, praktično više nije bilo živih ćelija (2,7%), u poređenju sa kontrolom (100%) na 37 °C. Pokazalo se daje vijabilnost HaCaT keranitocita 24 sata posle izlaganja toploti na 45 °C 59%. Nije bilo morfoloških promena u HaCaT kulturama 1 sat posle izlaganja toploti. 24 sata posle delovanja toplote na 46 °C ili višoj temperaturi, javilo se značajno (p<0,01) odlepljivanje ćelija i morfološke promene, kao što su gubitak pravilne strukture "kaldrme" sa povećanjem međućelijskih prostora, bubrenje, piknotičko skupljanje i vakuolizacija HaCaT keranitocita. Posle izlaganja UV, nađeno je da je smanjenje vijabilnih ćelija direktno korelisano sa dozom
UVA.
Preduslovljavanje ćelija toplotom (42°C 1 sat) ili N-[2-hidroksi-3-(lpiperidinil)propoksi]-3-piridinkaoroksimidoil hlorid maleatom (u koncentraciji od 5 x IO"<5>M jedan sat) obezbedilo je ćelijama zaštitu od izlaganja toploti na 48 °C. Kad su ćelije ispitane 24 sata posle tretmana na 48 °C, nađeno je da se, u poređenju sa ćelijama koje nisu tretirane, ćelijska vijabilnost povećala do 48% (kad su prethodno držane na 42 °C) i 84% (sa pred-tretmanom N [2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom). Najizraženija zaštita (povećanje vijabilnosti od 140%) je mogla da se vidi u slučaju kombinovane obrade (42 °C i N-[2-mdroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat).
Preduslovljavanje toplotom na 42 °C, ali ne na 44 °C i 45 °C, je indukovalo znatno smanjenje citotoksičnosti zbog UV svetlosti. Tretiranje na 42 °C je obezbedilo zaštitu od izlaganja i na 2 i na 4 J/cm<2>. Vijabilnost prethodno tretiranih HaCaT kerationocita se povećala do 132% (na 2 J/cm<2>) i do 218% (na 4 J/cm<2>) u poređenju sa ćelijama izlaganim UV bez prethodne obrade (100%).
12. PRIMER: EFEKAT N-[2-HIDROKSI-3-(l-PffERTOINIL)-PROPOKSI]-3-PIRroilNlKAJ^OKSIMIDOIL HLORID MALEATA NA ENDUKOVANJE EKSPRESIJE MOLEKULSKIH ŠAPERONA U TKIVIMA HUMANE KOŽE
Ultraljubičasta UVB svetlost (290-320 nm) je jedna od komponenata sunčeve svetlosti i zna se da izaziva oštećenja kože. Uloga N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata u smanjenju oštećenja koja izlaganje UVB izaziva na kožnim tkivima je istraženo, kao i efekat N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata na povećanje ekspresije molekulskih šaperona u kožnim tkivima.
12.1 Materijali i postupci
Humana kožna tkiva su transplantirana na miševe sa imunodeficijencijom (SCED). Eksperimentalni protokol je uključio tretman jedne grupe miševa N-[2-hidroksi-3-(lpiperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom (5,0 mg/kg i.p.) i drage rastvorom NaCI (300 ul) 7 dana. Osmog dana, obe grupe miševa su izložene UVB svetlosti (100 mJ/cm<2>). 24 sata posle izlaganja, uzete su biopsije kože za histološka (delovi obojeni hematoksilinom i eozinom) i imunohistološka ispitivanja (tehnika indirektne
imunofluorescencije sa monoklonskim antitelom, mAB).
12.2 Rezultati
U UV-ozračenim miševima koji su prethodno tretirani N-[2-hidroksi-3-(lpiperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom, klinički znaci ozleda usled izlaganja UV nisu mogli da se vide. Nasuprot tome, na jednoj od netretiranih životinja nađena je gnojna reakcija transplantirane površine. Štaviše, studije indirektne imunofluorescencije pomoću mAB Hsp72 su pokazale intenzivno, linearno bojenje duž donje membranske zone humane i mišje kože životinja tretiranih N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom. Ta reakcija nije uočena u koži netretiranih životinja. Pored toga, bojenje jedarnog tipa u granulocitima je bilo prisutno u pustuli (inflamatorna reakcija kože) netretirane životinje.
U skladu s tim, administracija N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata kožnim tkivima je dovela do povećanog stvaranja Hsp72 u kožnim tkivima i obezbedila zaštitu od ozleda usled izlaganja UV.
12.3 Određivanje nivoa Hsp-70 iz kože: Western blot analiza proteina izvedena iz humane kože transplantirane na SCED-miševe tretirane UVB i UVB + N-[2-hidroksi-3-(lpiperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat
Postupci:
a. Ekstrakcija svih solubilnih proteina iz kože
Svi koraci su izvedeni na sobnoj temperaturi. Koža (oko 9-35 mg) je isečena na sitne komade i homogenizovana ručkom od peskiranog stakla u Ependorf epruvetama 2 minuta u (2 fil/p.g kože) 2 puta koncentrovanom Laemmli-jevom puferu (65 mM Tris-HCI, pH 6,8; 5% p-merkaptoetanol; 2% SDS; 10% glicerol; 0,1 % bromofenol plavo; svi ovi materijali su proizvodi Sigma). Zatim su uzorci solubilizovani sleđećih 60 minuta uz stalno mućkanje. Homogenati su centrifugirani na 10000 rpm 10 minuta pred stavljanja na gel.
b. Elektroforeza i imunobloting [5, 7, 8]
Elektroforeza je izvođena na 8%-nom poliakrilamiđnom gelu sa 10 p.1 uzorka po traci na konstantnom naponu (50 V) preko noći. Proteini su ili bojeni pomoću Coomassie Brilliant
Blue R-250 ili prebačeni na lmmobilone PVDF membranu (Millipore) pri konstantnoj struji (300 mA) 3 sata na 4 °C u pufera za prenos (10 mM CAPS pH 11,10% metanol).
Nespecifična mesta na membrani su blokirana pomoću 2% BSA u TPBS (slani rastvoi sa fosfatnim puferom sa 0,1% Tween 20) preko noći na 4 °C. Membrana (blot) je inkubirana sa monoklonskim antitelom na Hsp-70 (SPA-8dc, StressGen), sa razblaženjem 1:1500, 1 sat na sobnoj temperaturi. Zatim je prana TPBS puferom još jedan sat i jedan sat inkubirana sa sekundarnim antitelom za miša (Sigma, razblaženje 1:1500) konjugovanim sa peroksidazom rena. Posle ponovnog pranja TPBS-om (tri puta), membrana je razvijena pomoću ECL sistema (Amersham).
PRIMER 13: EFEKAT N-[2-HroROKSI-3-(i-PITJERIDrNIL)PROPOKSrj-3(PIRrorNKARBOKSIMTI)OIL HLORID MALEATA NA AKTIVACIJU STVARANJA Hsp I ZAŠTITU OKSIDATIVNE FOSFORILACIJE
13.1 Uvod
Pokazano je da je izlaganje ćelija Saccharomvces cerevisiae toplotnom stresu (5 min. na 42-44°C) dovelo do poremećaja kuplovanja oksidativne fosforilacije i mitohondrijskog sistema za transport elektrona, utičući na sposobnost ćelija da sintetišu ATP (Patriarca et al,Biochemistry and Cell Biology,70:207-214,1992). Međutim, kad su ćelije prethodno tretirane N-[2-rudroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piriđinkarboksimidoil hlorid maleatom kratko na 37 °C pred toplotni stres, to je smanjilo poremećaj kuplovanja i zaštitilo mitohondrijsku sintezu ATP. Izgleda da inhibicija citoplazmatske RNK ili sinteze proteina tokom toplotnog stresa sprečava ovu zaštitu mitohondrijske aktivnosti. U skladu s tim, izgleda daje jedna od uloga Hsp da štiti kuplovanje oksidativne fosforilacije i mitohondrijskog sistema za transport elektrona koje se poremeti kad su ćelije izložene fiziološkom stresu, npr, toplotnom stresu.
U ovom odeljku, N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat je dodat ćelijama pre izlaganja toplotnom stresu i ispitan je njegov efekat na zaštitu kuplovanja oksidativne fosforilacije i mitohondrijskog sistema za transport elektrona od toplotnog stresa.
Ispitano je i da li aktivnost transkripcionih faktora AP-1 i P 1 može da se moduliše N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom u ćelijama kvasca izloženim raznim stresnim uslovima.
13.2 Materijali i postupci
Eksperimentalni protokol za određivanje poremećaja oksidativne fosforilacije i mitohondrijske sinteze ATP uSaccharomyces cerevisiae jedat u Patriarca et al,Biochemistry and Cell Biology,70: 207-214, 1992, pri čemu je navedena referenca inkorporirana ovde u celosti.
ĆelijamaS. cerevisiae,koje su održavane na 25 °C, uvedene su različite koncentracije N-[2-hidroksi-3(l-piperidiml)pro<p>oksi3-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata (koncentracije između 10 i 100 uM), ćelije su zatim inkubirane jedan sat na 25 °C u prisustvu N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi3-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata. Temperatura je zatim podignuta do 42 °C i uzeta su merenja sa oksigrafa kao što je opisano u referenci Patriarca.
Ćelije tretirane N-[2-hidroksi-3-(l -piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimiđoil hlorid maleatom su testirane na prateću indukciju Hsp gena, korišćenjem Northern Blot procedure. Postupak ekstrahovanja, prečišćavanja iRNK iz eukariotskih ćelija i analiziranje ovako dobijene RNK Northern blot procedurom je dobro poznat u struci i opisan u Maniatis, i Maresca, et al.Archives Medical Research24: 247-249 (1993), obe reference su inkorporirane ovde u celosti. Northern blot protokol je takođe opisan u Primeru 7, izloženom gore. Sekvence DNK Hsp 26 i Hsp70 su korišćene kao probe.
13.3 Rezultati
13.3.1
Slika 4 je Northern blot analiza iRNK za Hsp26 indukovane uS. cerevisiae,koja ilustruje rezultate dobijene u eksperimentu. Koncentracija hemijskog jedinjenja uvedenog u ćelije i trajanje inkubacije sa jedinjenjem su označene.
U ćelijama koje su bile inkubirane u prisustvu N-[2-hidroksi-3~(lpiperidinil)propoksi]-3piridinkarboksimidoil hlorid maleata (10-100 uM) 5 min. do 1 sat na 25 °C, primećena je indukcija Hsp 26. Izgleda i da rezultati ukazuju da se indukcija javlja čak posle 5 minuta inkubacije.
Takođe je nađeno da su koncentracije testiranog jedinjenja između 10 i 100 uM bile efektivne u smanjivanju poremećaja kuplovanja oksidativne fosforilacije i mitohondrijskog sistema za transport elektrona koja je posledica toplotnog stresa. Zaštita od poremećaja mitohondrijske sinteze ATP je bila u opsegu dobijenom kad jc stvorena termotolerancija pre-konđicioniranjem ćelija tako što su bile izložene srednjoj temperaturi od 37 °C (zaštita 40-60%).
13.3.2
Efekti benzil alkohola na (a) aktivnost adenilat ciklaze i (b) fizičko stanje goveđih tiroidnih plazma membrana su prikazani na SI. 5. Efekat benzil alkohola na (a) aktivnost adenilat ciklaze i (b) fizičko stanje goveđih tiroidnih plazma membrana. Promena aktivnosti adenilat ciklaze je pokazana za enzimsku aktivnost: (a) bazalnu (o-o), stimulisanu TSH-om (-), stimulisanu forskolinom (A-A), stimulisanu holeratoksinom (V-V) i stimulisanu fluoriđom (0-0). Membrane su inkubirane sa lekovima pre dodavanja faktora kuplovanja, Fizičko stanje membrane je ocenjeno preko fluorescentne anizotropije stacionarnog stanja (b) nekoliko fluorofora ugrađenih u membrane: DPH (o-o), 12-AS ( - ) i TMA-DPH (A-A). Merenja su vršena na 37 °C. Molarni odnos flourofore/lipidi je uvek bio 1:500.
13.3.3
Naši eksperimenti su dokazali da N-[2-hiđroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridin karboksimiđoil hlorid maleat ima značajan uticaj na aktivnost AP-I i njegov efekat je određen postojećim metaboličkim uslovima ćelija. Dok N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat povećava aktivnost AP1 ako je snabdevanje hranom neadekvatno, u bogatom medijumu on smanjuje aktivnost ovog faktora. Efekat leka je najizraženiji u gustim, "late log" kulturama. Suprotna tendencija se može videti za P 1. Njegova aktivnost opada ako je N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat uveden u ćelije u minimalnom medijumu. Može se pretpostaviti daje nishodna regulacija (dovvnregulation) P-l aktivirana upravo promenama u ćelijskoj anti-stres mašineriji izazvanih aktivacijom AP-1 koju je indukovao N-[2hidroksi-3-(l-piperidirul)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat. Primećeno je da je P-l odgovarao na sve tipove stresa, ali na njegovu aktivnost nije uticao testirani materijal. Naši važni nalazi, naročito za AP-1, mogu da objasne mnoge stranein vivoaktivnosti leka i biće diskutovani detaljno.
Efekat N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoiI hlorid maleata (B) na ekspresiju gena za Hsp u kulturi tkiva je pokazan na SI. 6. HeLa ćelije su transfektovane konstruktom reporter plazmida, u kom je promotor humanog gena za Hsp70 fuzionisan sa reporter genom za luciferazu. Efekat toplotnog stresa i/ili N-[2-hidroksi-3-(lpiperidinil)propoksi]-3-piriđinkarboksimiđoil hlorid maleata na promotor Hsp-a je određen merenjem aktivnosti luciferaze u luminometru i određivanjem nivoa proteina Hsp (eksprimiranog iz hromozomskog gena) Westem blotom.
Uzorci su:
1: bez DNK kontrole; 2: 10 p.g transfektovane DNK na to, bez toplotnog stresa; 3: 10 ug transfektovane DNK na to, 60 min. toplotnog stresa posle 24 h; 4: kao ranije + N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat (B) na to; 5: 10 ug transfektovane DNK na to+ N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksiraidoil hlorid maleat (B) na to; 6: 10 p.g transfektovane DNK na to, 60 min. toplotnog stresa posle 24 h, N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piriđin karboksimiđoil hlorid maleat (B) dodat u vreme toplotnog stresa; 7: 10 ug transfektovane DNK na to, 60 min. toplotnog stresa posle 24 h, N-[2-hiđroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat (B) dodat u vremenu 0 i u vreme toplotnog stresa; 8: 10 u,g transfektovane DNK na to, bez toplotnog stresa, N-[2-hiđroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimiđoil hlorid maleat (B) dodat u vremenu 0 i 24 h kasnije.
PRIMER 14: EFEKAT N-[2-HIDROKSI-3-(l-PIPERIDrNIL)PROPOKSI]-3-PIRIDINKARBOKSIMIDOIL HLORID MALEATA NA INDUKCIJU MOLEKULSKIH ŠAPERONA TUMORSKIM ĆELIJAMA
Neletalni toplotni stres 1,5 puta povećava osetljivost na liziranje koje podstiču NK ćelije i takav toplotni stres plus tretman N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridin karboksimiđoil hlorid maleatom ima sinergijski efekat na lizabilnost K562 ćelija. Ovaj dodatni efekat, za koji je odgovoran N-[2-hiđroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat, jasno je nastao zbog povišene ekspresije Hsp72 u plazma membrani, jer su studije sa blokiranjem antitelain vivo(pomoću Hsp72-specificnog monoklonskog Ab) otkrile jaku inhibiciju lize izazvane NK-ćelijama.
Na SI. 7, pokazan je efekat N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata (B) na nivoe Hsp72 indukovane toplotnim stresom. Sam N-t2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat nije not povećao nivoe Hsp72, dok je kombinacija tretmana toplotnim stresom i N-[2-hidroksi-3-(l-piperidiml)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom dala značajan porast ekspresije Hsp72 u odnosu na sam toplotni stres.
14.1 Uvod
Poznato je da su proteini toplotnog stresa locirani u citoplazmi, gde imaju različite šaperonske funkcije. U tumorskim ćelijama, međutim, objavljeno je da je Hsp eksprimiran i na površini ćelijske membrane (Ferrarini, M. et al. Int. J. Cancer, 51,613 619, (1992)). Eksperimenti, izgleda, ukazuju na to da je povećan Hsp (npr, Hsp70) na ćelijskoj površini indukovan izlaganjem tumorske ćelije neletalnom toplotnom stresu i ovo povećanje korelira sa povećanom senzitivnošću IL-2 specifičnih, CD-3 NK ćelija na tumorske ćelije. Pošto je objavljeno da NK ćelije učestvuju u infiltriranju i ubijanju tumorskih ćelijain vivo(Kurosawa,S. et al,Eur. J. Immunol.23: 1029, (1993)), ova povećana senzitivnost NK ćelija prema tumorskim ćelijama omogućuje bolje ciljanje tumorskih ćelija od strane NK ćelija. Dakle, ako ekspresija Hsp može biti indukovana u tumorskim ćelijama, sa povećanim Hsp na ćelijskoj površini, to može omogućiti bolje ciljanje i ubijanje ovih ćelija od strane NK ćelija. U ovom delu je ispitan efekat N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata u indukovanju ekspresije Hsp72 tumorskim ćelijama.
14.2 Materijali i postupci
Korišćene su humane K562 ćelije, mijeloidna tumorska ćelijska linija, izvedena iz pacijenta sa hroničnom mijelocitnom leukemijom u "blast" fazi (ATCC, CCL243) (Lozzio, BC and Lozzio, BB Blood 45:321, 1975). Eksponencijalno rastuće ćelije su tretirane 5 x 10"' M N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom tokom neletalne temperature (42 °C) 2 sata. Posle perioda oporavka od 16 sati na 37 °C, ćelije su testirane na nivo sadržaja Hsp72 protočnom citometrijom (Multhoffet al,Int. J. Cancer.61, 272-279, (1995)). Tretman N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom je dao povećan nivo Hsp72 u tumorskim ćelijama.
PRIMER 15: INTERAKCIJA N-[2-HIDROKSI-3-(l-PIPERIDrNIL) PROPOKSI]-3-PIRJDINKARBOKSIMIDOIL HLORID MALEATA SA LIPIDNIM MEMBRANAMA. STUDIJA NA MONOSLOJU.
15.1 Uvod
Mehanizam(-i) kojim se stres (fizički, patofizioloski, itd.) detektuje kao signal i prenosi do transkripcionog aparata se do danas ne zna. Smatralo se da je fizičko stanje membranske lipidne matrice, koja određuje strukturu i funkciju proteina vezanih za membranu, direktno uključeno u percepciju promena temperature i da, u uslovima toplotnog stresa (HS), poremećaji membranske strukture izazivaju transdukciju signala koja podstiče transkripciju HS gena. Paralelno sa indukcijom stresne tolerancije, pokazano je da N-[2-hiđroksi-3-(l-piperidiml)pro<p>oksi]-3-piriđirikarboksimidoil hlorid maleat pojačava efikasnost ćelija da detektuju i signaliziraju različite stresne uslove regulišući na gore (upregulate) ekspresiju nekih šaperonskih gena.
Zna se daje tehnika monosloja, koja koristi monomolekulske lipidne slojeve prostrte na dodirnoj površini vazduh - voda, efektivno oruđe za utvrđivanje prisustva interakcija između membrana i membranskih aktivnih agenasa. Ponašanje dvoslojnog sistema je vrlo slično onom odgovarajućeg monoslojnog sistema u mnogim aspektima (molekulska površina membranskih konstituenata, delovanje fosfolipaze, orijentacija umetnutih proteina, itd.). Merenjem promena površinskog pritiska izazvanih molekulima umetnutim u monoslojeve, omogućuje se uvid u molekulske dimenzije interakcije.
Suštinski preduslov pretpostavke da neki rani "okidajući" događaji u stresnim odgovorima, aktivirani N-[2-hidroksi-3-(l -piperidinil)propoksi] -3 -piridinkarboksimidoi 1 hlorid maleatom, mogu da se jave u ćelijskoj membrani je da se daju dokazi za direktnu fizičku interakciju N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksi-midoil hlorid maleata i membranskih konstituenata. Cilj ove studije je bio da istraži interakciju N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piriđinkarboksimidoil hlorid maleata i membrana pomoću različitih lipidnih monoslojeva kao model sistema za biološke membrane.
15.2 Materijali i postupci
Eksperimenti sa monoslojevima su vršeni u teflonskoj posudi, zapremine 6,5 ml, i površine 8,8 cm<2>, na 25°C u KSV3000 Langmuir-Blodgett instrumentu (KSV Instruments Ltd., Helsinki, Finland) kao što je suštinski opisano. Monomolekulski lipidni slojevi, koji se sastoje od l,2-dipalmitoil-j«-glicero-3-fosfohoIina (DPPC), fosgatidilglicerola iz šumanca (EggpG) ili kardiolipina iz goveđeg srca (BHCL), su rašireni iz hloroformnih lipidnih rastvora da daju željeni početni površinski pritisak na podfazu 10 mM Na-fosfata (pH 7,0). Podfaza je stalno mešana magnetnom mešalicom. N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi3-3-piridin karboksimiđoil hlorid maleat, rastvoren u HzO, je dodat ispod monosloja kroz rupu u teflonskoj komori vezanoj za podfazu. Injektirane zapremine su uvek bile <1 % ukupne zapremine podfaze. Površinski pritisak je meren Wilhelmy-jevim postupkom pomoću platinske ploče. Podaci o povećanju površinskog pritiska su ekstrahovani iz fajlova sa sirovim podacima pomoću LB5000 programa Langmuir-Blodget-ovog mernog sistema.
15.3 Rezultati
Interakcija N-[2-hidroksi-3-(l-ptperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata sa različitim fosfolipidima je testirana merenjem povećanja površinskog pritiska, indukovanog lekom, lipidnih monoslojeva raširenih po dodirnoj površini vazduh - voda (Slika 8.). Monoslojevi u ovoj studiji su obrazovani iz DPPC, EggPG i BHCL i podfazi su dodate rastuće količine N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata u dve koncentracije (IO"<6>M, IO"<5>M). Dodavanje leka pod lipidni monosloj je dovelo do povećanja površinskog pritiska, koje je zavisilo od koncentracije N-[2-hidroksi-3-(l-piperidiml)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata u podfazi u svim slučajevima. Postojala je, međutim, znatna razlika u profdu površinskog pritiska u različitim lipidnim monoslojevima. U slučaju cviterjonskog DPPC, pritisak se menjao brzo posle injektiranja N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata, a onda je ostajao na konstantnom nivou. Upotrebom monoslojeva koji sadrže negativno naelektrisan BHCL, profil površinskog pritiska je pokazao tipičnu insercionu kinetiku, odnosno, pritisak je porastao oko dva minuta posle kojih je dostigao ravnotežni nivo. U prisustvu PG, inserciona kinetika leka je bila slična onoj viđenoj sa BHCL, međutim, posle dostizanja određene vrednosti, pritisak je počeo da opada. Brzina pada pritiska je zavisila od koncentracije leka u podfazi. Jedno moguće objašnjenje ovog fenomena je uklanjanje kompleksa N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat - EggPG sa dodirne površine, jer se smanjenje pritiska nastavilo, čak i posle dostizanja početnog pritiska čistog lipidnog monosloja.
Da bi se dobio dalji uvid u specifičnu interakciju N-[2-hidroksi-3-(lpiperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata i lipidnih monoslojeva, povećanje površinskog pritiska indukovano lekom je mereno pri različitim početnim površinskim pritiscima (Slika 8). Postupak ekstrapolacije do visokog početnog površinskog pritiska omogućuje procenu ograničavajućih insercionih pritisaka za molekul, pri kojima on više nije sposoban da se ugradi u monosloj. Ekstrapolirani ograničavajući početni površinski pritisci su bili 89 mN/m za BHCL i 39 raN/m za DPPC. U slučaju monoslojeva koji sadrže negativno naelektrisan BHCL, povećanja pritiska su uvek bila veća nego onih nađenih za cviterjonski DPPC sugerišući važnost elektrostatičkih interakcija.
Naša istraživanja daju prve dokaze da je N-[2hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat, kad se uvede u fiziološki relevantnim koncentracijama, sposoban da rnteraguje sa lipidnim membranama, u orijentaciji glava-grupa.
Na SI. 8. pokazana je interakcija N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridin karboksimiđoil hlorid maleata (B) i monomolekulskih lipidnih slojeva. Strelice pokazuju kad je N-[2hidroksi-3-(l-piperiđinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat dodat podfazi u naznačenim koncentracijama. Na SI. 9. povećanje površinskog pritiska je prikazano posle injektiranja N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata (B) ispod monoslojeva BHCL ili DPPC pri različitim inicialnim pritiscima. Koncentracija N-[2hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piriđinkarboksimidoil hlorid maleata u podfazi je bila 10 umol. Analizom eksperimentalnih podataka linearnom regresijom dobijen je koeficijent korelacije 0,844 za BHCL i 0,995 za DPPC monoslojeve.
PRIMER 16: ZAŠTITNI EFEKAT N-[2-HIDROKSI-3-(l-PffERIDINIL)PROPOKSI]-3-PmroiNKARBOKSIMIDOIL HLORID MALEATA OD CITOTOKSIČNTH CITOKINA I CIKLOHEKSIMIDA
16.1 Uvod
Smisao ovih studija je bila da se istraži moguća veza između proizvodnje citokina i patofizioloških promena od kojih izgleda da N-[2-hidroksi-3-(l-piperiđinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat štiti.
Naši podaci sugerišu daje N-[2-hidroksi-3-(l-piperiđinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat citoprotektivan agens za ćelije iz kultura tkiva tretirane citotoksičnim citokinima. Tretman N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom je povećao stepen preživljavanja WEHI 164 (i drugih sisarskih) ćelija tretiranih TNF-om. Ovaj efekat zavisi od koncentracije, ali nije bio direktno proporcionalan koncentraciji leka. Stepen zaštite koju obezbeđuje tretman N-[2-hiđroksi-3-(lpiperidinil)propoksi]-3-piriđin karboksimiđoil hlorid maleatom je varirao od eksperimenta do eksperimenta, mada je povećana otpornost tretiranih ćelija prema ci to toksičnim citokinima bila jasna tendencija u svim eksperimentima. Zaštita koju obezbeđuje tretman N-[2-hidroksi-3-(l-pipeirdinil)propoksi3-3-piridin karboksimiđoil hlorid maleatom nije bila mnogo visoka, međutim, u živoj životinji čak i ovaj stepen zaštite bi mogao da bude dovoljan da ublaži ili spreči patofiziološke procese.
16.2 Cilj studije
Mereni su nivoi TNF-a u serumu i inducibilnost makrofaga iz STZ dijabetičnih i kontrolnih životinja. Aktivnosti serumskog TNF indukovane LPS-om su se značajno povećale STZ-đijabetičnim pacovima (6-18 nedelja starosti) u odnosu na one kod nedijabetičnih pacova, tokom prvog meseca dijabetesa.
16.3 Rezultati
Srednja koncentracija serumskog TNF (merena radioimunoesejem) u dijabetičnim grupama je bila značajno viša (480 ± 96 U/ml) nego u zdravim kontrolama (345 ± 48 U/ml).
(Foss et al. 1992Brat. J. Med. Biol. Res.25,239 su objavili slične rezultate na humanim pacijentima). Unutar dijabetične grupe, nije bilo korelacije između serum nivoa serumskog TNF i trajanja dijabetesa. Nismo našli biološki aktivan TNF u serumima dijabetičnih životinja citotoksičnim esej em na L929 ćelijama. Razlika između RIA i merenja ci to toksičnosti ukazuje na prisustvo visokih nivoa rastvorljivih antagonista receptora TNF-a (zaštitan, antiinflamatoran molekul), sugerišući učešće TNF-a dijabetičkim komplikacijama.
N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat je imao neočekivan proliferativni efekat an ćelije kvasca (i na različite, kultivisane, normalne, diploidne životinjske ili humane ćelije). Uticaj N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata je bio naročito impresivan u prisustvu niskih koncentracija inhibitora rasta, antibiotika cikloheksimida. Kolonije ćelija kvasca koje su gajene u prisustvu N-[2hidrok5i-3-(l-piperidirul)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata / cikloheksimida nisu ispoljile povećanu incidenciju genetskih promena (mutacije rezistentne na antibiotik), samo veću metaboličku otpornost prema inhibitornom efektu cikloheksimida na sintezu proteina.
Prema našim merenjima, efekti N-[2-hiđroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata se mogu svesti na povećanu aktivnost AP-1 transkripcionog faktora, koji posreduje u efektima i mitogenih faktora i različitih tipova stresa. Rezultati takođe ukazuju na to da gornje testirano jedinjenje i slična jedinjenja utiču na AP-1, a možda i na druge transkripcione faktore, održavajući efekte faktora rasta i uslove metaboličkog stresa.
Na SI. 10, pokazana je proizvodnja TNF indukovana LPS-omin vitrou makrofazima izolovanim iz STZ diabetičnih (1) i normalnih (2) životinja, na SI. 11, zaštita keratinocita od inhibitomih efekata cikloheksimida na rast, indukovana N-[2-hidroksi-3-(lpiperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimiđoil hlorid maleatom, na SI. 12, zaštita ćelija (endotelnih ćelija) od toksičnih efekata cikloheksimida, indukovana N-[2-hidroksi-3-(lpiperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom (B), na SI. 13, zaštita humanih cervikalnih HeLa ćelija od inhibitomih efekata antibiotika cikloheksimida na rast, indukovana N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom (B), na SI. 14, zaštita ćelija srčanog mišića od inhibitomih efekata antibiotika cikloheksimida na rast, indukovana N-[2-rudrolcsi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom (B) i na SI. 15, efekat N-f2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata (B) na aktivnost transkripcionog faktora Pl u AB1380 ćelijama kvasca. Red 6. predstavlja srednje vrednosti. Red 5. je prazan. Na SI. 16, prikazan je efekat N-[2-hidroksi-3-(lpiperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata na aktivnost transkripcionog faktora AP1 u JF1 ćelijama kvasca. Red 11. predstavlja srednje vrednosti. Na SI. 17. prikazan je efekat N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksij-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata (B) na aktivnost transkripcionog faktora Pl u AB1380 ćelijama kvasca. Red 6. predstavlja srednje vrednosti. Red 5. je prazan.
PRIMER: KARDIOPROTEKTrVNI EFEKTI N-[HIDROKSI-3-(l-PIPERIDrNIL)PROPOKSIj-3-PmroimARBOKSrMIDOIL HLORID MALEATA U
IZOLOVANIM SRCIMA PACOVA
17.1
Cilj studije je bio da istraži kardioprotektivne i antiaritmičke efekte N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata u izolovanim srcima pacova koja rade.
17.2 Postupci
Posle 10-minutne aerobične radne perfuzije, srca (n=10 u svakoj grupi) su podvrgnuta 10-minutnoj koronarnoj okluziji, a zatim 3-minutnoj reperfuziji u prisustvu 0,05, 0,5, 5,0, 20,0, i 50 mg/L N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimiđoiI hlorid maleata, respektivno.
U daljim studijama, pacovi su prethodno tretirani najefektivnijom (20 mglkg) dozom N-[2hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi3-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata, jedan i pet sati pre izolacije srdaca, respektivno. Posle ekscizije, srca su podvrgnuta protokolu koronarne okluzije datom detaljno gore, dok su perfundovana u prisustvu/odsustvu 20 mg/l N-[2Wdroksi-3-(l-pi<p>eridinil)<p>ro<p>oksi]-3-<pi>ridinkarboksi-imdoilhlorid maleata.
U odvojenim eksperimentima, efekti toplotnog stresa, ishemije, N-[2-hidroksi-3-(lpiperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata i njihovih kombinacija su ispitivani preko miokardijalnog sadržaja proteina Hsp-70. Izolovana srca su podvrgnutal5 minutnom toplotom stresu (42 °C), globalnoj normotermičkoj ishemiji i perfuziji N-[2-hidroksi-3-(l-piperidmil)propoksi]-3-piridirucarboksimidoil hlorid maleatom, praćenoj 120 i 180 minutnom reperfuzijom, respektivno.
17.3
Rezultati
Pre ishemije, N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat je povećao koronarni protok (CF), gde je odnos koncentracija-odgovor zvonasta kriva. Ostali srčani funkcionalni parametri se nisu promenili sa nižim koncentracijama leka. N-[2-hidroksi3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat pri 50 mg/L je izazvao značajnu bradikardiju, smanjenje protoka aorte (AF) i +dP/dtmax, i povećanje dijastolnog pritiska u levoj komori (LVEDP) pre ishemije. U kontrolnoj grupi, koronarna okluzija je primetno smanjila CF, AF, +/-dP/dtmaxi povećala LVEDP. N-[2-hidroksi-3-(lpiperidinil)propoksi]-3piridinkarboksimidoil hlorid maleat je ublažio deterioraciju srčanih funkcija indukovanu ishemijom, sa odnosom koncentracija-odgovor zvonastog oblika. Koncentracija od 20 mg/L N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata je pokazala najizraženiji anti-ishemičan efekat. Reperfuzija posle 10-minutne koronarne okluzije je izazvala ventrikulamu fibrilaciju (VF) u svim srcima kontrolne grupe. Više koncentracije N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata su dovele do antiaritmičkog efekta, koji zavisi od doze.
Posle jednog sata prethodnog tretmana, N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat je još uvek davao kardiozaštitu i pojačavao akutne efekte jedinjenja. Pet sati posle prethodnog tretmana, karđioprotektivan efekat se nije video, međutim, neki od akutnih efekata perfuzije N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata su bili povećani.
Samo jedinjenje nije povećalo miokardijalni sadržaj Hsp-70. Stetiokardijačni sadržaj Hsp-70 je bio znatno povećan zbog toplotnog stresa, međutim, ishemija je dovela do blagog povećanja Hsp-70. Ipak, kad je ishemija indukovana u prisustvu 20 mg/l N-[2-hidroksi-3-(lpiperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata, sadržaj Hsp-70 se povećao do približno istog nivoa kao što je nađeno posle toplotnog stresa.
Zaključujemo da N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat ispoljava anti-ishemički i antiaritmički efekat. Nađeno je da koncentracija od 20 mg/L ima izražen i anti-ishemički i antiaritmički efekat u izolovanom srcu pacova. Kad direktan anti-ishemički efekat leka nestane posle 1 sat, on i dalje povećava stepen zaštite pružen akutnim tretmanom N-[2-hidroksi-3-(l-piperidiniI)propoksi]-3-piridinkarboksimidoiI hlorid maleatom. N-[2-hidroksi-3-(l-piperidiniI)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat i ishemički stres zajedno indukuju brzude novosintezu Hsp-70 u srcu pacova. Sam N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat alone ne utiče na sintezu Hsp-70.
Na SI. 18-19, prikazani su nivoi Hsp proteina, određeni VVestern blot tehnikom, iz kontrolnih, izlaganih toploti, ishemičnih, tretiranih N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom (B) i ishemičnih + tretiranih hidroksi-3-(lpiperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom (ishemija+B) pacova, posle 2 (SI. 18) ili 3 sata (SI. 19) oporavka.
PRIMER 18: STIMULATOR ŠAPERONA N-[2-HIDROKSI-3-(l-PIPERIDrNIL) PROPOKSH3-PIRrDimARBOKSIMrDOIL HLORID MALEAT U PREVENCUI I POPRAVLJANJU OŠTEĆENJA KOŽE: ZAŠTITA OD ULTRALJUBIČASTE SVETLOSTI B U HUMANOJ KOŽI TRANSPLANTIRANOJ NA MIŠEVE SA TEŠKOM
KOMBINOVANOM IMUNODEFICIJENCUOM I UBRZANO ZARASTANJE RANA KOD DUABETIČNIH PACOVA
18.1 Uvod
Izgleda da Hsp-ovi igraju opštu ulogu u fiziološkoj zaštiti kože od stresa okoline. Kao molekulski šaperoni, oni učestvuju u prevenciji i popravljanju štećenja prouzrokovanih različitim izlaganjima, kao što je mehanička trauma, svetlost, toplota i hemijske ozlede, infekcije, itd. (E. V. Mavtin, JID 104:448, 1995.) U patološkim stanjima, kao što jediabetes mellitus,nađena je oslabljena funkcija određenih Hsp-ova (M.Cherian and E.C. Abraham, Biochem. Biophvs. Res. Com. 212: 184, 1995). Pošto je pokazano da N-[2-hidroksi-3-(I-piperidiml)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleat đeluje kao stimulator (booster) šaperona (Vigh et al, u pripremi), očekivali bismo da je ovaj lek sposoban da pojača najtraznovrsnije zaštite i mehanizme popravljanja.
Cilj ove studije je bio da testira efekat sistemskog (i) i topičnog (ii) davanja N-[2-hidroksi-3-(I-piperidmil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata: (i) u zaštiti od rana na humanoj koži transplantiranoj na miševe sa teškim kombinovanom imunodeficijencijom (SCID) indukovanim UVB svetlošću,
(ii) u popravljanju uništenog procesa zarastanja rana u STZ-dijabetičnim pacovima.
(i) scrD miševi sa transplantiranom humanom kožom, tretirani N-[2-hidroksi-3-(lpiperidinil)propoksi]-3piridinkarboksimidoil hlorid maleatom (5,0 mg/kg i.p.) ili nosačem, su izlagani UVB svetlosti (100 mJ/cm<2>). Posle 24 h, uzete su biopsije kože za histološko ispitivanje i za određivanje Hsp72 upotrebom imunohistoloških i VVestern blot tehnika. Prethodni tretman N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoiI hlorid maleatom je sprečio rane na koži indukovane UVB svetlošću, određene klinički i histološki. Intenzivno obeležavanje Hsp72 linearne bazalne membrane je moglo da se vidi tehnikom imunofluorescencije, a povećana količina Hsp72 je merena VVestern blot tehnikom u uzorcima kože tretirane N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom.
18.2 Postupci
(ii) Pacovi sa dijabetesom indukovanim streptozotocinom (STZ) sa termičkim ranama delimične do pune debljine, napravljenim bilateralno na toraksu na depiliranoj koži električnim grejačem (prečnika 3 mm; 60 °C; tokom 30, 60 i 90 sek.), tretirani topičkom primenom kreme sa 1%, 2% ili 4%-nim N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom ili nosačem, su korišćeni za određivanje zarastanja rana, gde je eksperiment bio sam sebi kontrola, jer je poređena jedna strana sa drugom.
Zatvaranje rane je snimljeno fotografski i mikroskopskom tehnikom digitalne epiluminescencije. Površine rana su merene planimetrijski 48 h i 21 dana posle toplotnog ranjavanja. Nivo Hsp72 u uzorcima biopsija kože je određi van pomoću VVestem blot analize.
18.3 Rezultati
Tretman kremom sa 4%-nim N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom značajno (p< 0,01) je ubrzao zatvaranje rana i povećao nivo Hsp72 u uzorcima biopsija kože u odnosu na kontrolne uzorke sa nosačem.
Naši rezultati dovode do zaključka da davanje N-[2-hidroksi-3-(lpiperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleata obezbeđuje zaštitu od rana dobijenih izlaganjem UV i ima potencijalu terapijsku primenu za klinički tretman stanja sa defektom u zarastanju rana ili posle hirurške intervencije.
Na SI. 20,21,22, prikazani su efekti kreme sa 1 %, 2%, 4%-nim N-[2-hidroksi-3-(lpiperidinil)propoksi]-3-piridin karboksimiđoil hlorid maleatom (B) na zarastanje rana.
Na SI. 23,24,25, prikazani su rezultati prema stepenu rana.
Na SI. 26, prikazane su fotografije netretiranih rana i tretiranih N-[2-hidroksi-3-(lpiperidinil)propoksi]3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom (B).
SI. 27 prikazuje nivoe proteina Hsp72 uzoraka biopsije iz kontrolnih rana i tretiranih N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom (B) (1%, 2% i 4%).
Na SI. 28, prikazano je imunhistohemijsko određivanje proteina Hsp72 posle tretmana N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piriđinkarboksimidoil hlorid maleatom (B).
Na SI. 29, prikazani su nivoi Hsp72 iz uzoraka kože SCID miševa, tretiranih N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)propoksi]-3-piridinkarboksimidoil hlorid maleatom (B) i netretiranih (kontrolnih).
19. PROCENA STIMULATIVNOG EFEKTA HIDROKSILAMINE DERIVATA PREMA OVOM PRONALASKU NA EKSPRESIJU Hsp72 U ĆELIJAMA IZLOŽENIM STRESOVIMA
a. ) Uslovi ćelij skm kultura
Od ćelija koje su korišćene, mišji 3T3 i L-929 fibroblasti su gajeni u MEM medijumu i rasli su u monosloju, U-937 humane ćelije leukemije su održavane u RPMI-1640 medijumu, u suspenzionoj kulturi, dok su HeLa humane epitellne ćelije gajene u DMEM medijumu i u monosloju. Ćelijske kulture su održavane kao što je opisano u primeru 6.2 (a), sa tom razlikom što su ćelije gajene u gore pomenutim medijumima za kulture.
b. ) Uslovi eksperimenata
Eksperimenti su vršeni primenom stresa pre i posle tretmana lekom. Stres je izazvan toplotom, chemijskim sredstvom, tretmanom HgCU. Testirana jedinjenja su primenjena u tretmanima u koncentraciji od IO"<5>M.
Citotoksične studije, koje su rađene u vidu trodnevnih testova i određivane pomoću MTT (Cytotechnology 11: 49-58), su ukazale na to da sva testirana jedinjenja imaju 50%-ni inhibitoran efekat na rast od u koncentraciji većoj od IO"<4>M. Usled toga, koncentracija korišćena u studijama sa Hsp72 nema značajan citotoksični efekat.
19.1. Eksperimenti sa toplotnim stresom
Ovi eksperiment su vršeni na 3T3 i L-929 mišjim fibroblast ćelijama, kao i na U-937 humanim leukemičnim ćelijama.
Eksperimenti na 3T3 ćelijama sa primenom toplotnog stresa su vršeni kao što je opisano u tački 6.2. (c) Primera 6, sa tom razlikom što je stres bio indukovan 30-minutnim izlaganjem temperaturi od 43 °C, a tretman testiranim jedinjenjima je bio rađen 15 minuta pre ili 100 minuta posle toplotnog stresa.
Imunodetekcija je rađena uz upotrebu SPA 810 (StressGene) primarnih i A9044 (Sigma) sekundarnih antitela, konjugovanih sa peroksidazom rena, specifičnih za Hsp72. Denzitometrijsko određivanje je rađeno pomoću LKB Ultrascan XL denzitometra.
Rezultati su sumirani u Tabeli 2 i Tabeli 3.
U Tabeli, 0 označava da je tretman promenio nivo Hsp72 indukovan stressom u ćelijama za ±20 %, dok +, ++, +++ označavaju 21-50 %, 51-100 % i >100 % povećanje niova Hsp72, respektivno, u odnosu na nivo u kontroli izloženoj stresu.
Eksperimenti sa primenom toplotnog stresa na U-937 leukemične ćelije i L-929 mišje fibroblastne ćelije su vršeni slično kao što je opisano gore, ali su tretmani lekom u ovim testovima uvek prethodili toplotnom stresu. Jedinjenje N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)-propoksi]-3-piridin-karboksimidoil hlorid maleat je testirano u koncentraciji od 10"<5>M, u ovim eksperimentalnim uslovima.
Tretman je pokazao povećanje više od 50 % u nivou Hsp72 indukovanom toplotnim stresom.
19.2. Eksperimenti sa stresom indukovanim hemijskim agensom
Ovi eksperimenti su vršeni na HeLa, humanim epitelnim i U-937, humanim leukemičnim ćelijama, upotrebom HgCh za izazivanje stresnog odgovora. Tretman lekom je vršen pre nego što su ćelije bile izložene stresu. Testirane kulture su bile pripremljene i tretmani rađeni kao u eksperimentima sa 3T3 ćelijama. Posle tretmana lekom, ćelije su inkubirane na 37 °C 15 minuta, a zatim su sve osim dve (nestresirana kontrola) kulture izložene koncentraciji od 0,5 ug/ml HgCl2i praćena je inkubacija. Indukovana količina Hsp72 je merena 6 sati posle izlaganja stresu. Primenjena koncentracija HgCL;je rezultovala u 15-30% maksimalnog nivoa Hsp72.
U HeLa ćelijama, N-[2-hiđroksi-3-(l-piperidinil)-propoksi-benzimidoil hlorid monohidrohlorid je povećao za više od 20%, a N-[3-(l-piperidinil)-propoksi]-3-nitro-benzimidoil hlorid monohidrohlorid je povećao za više od 50% nivo Hsp72 indukovan stresom.
U U-937 ćelijama, N-[2-hidroksi-3-(l-pipeirdinil)-propoksi-3-piridin-karboksimidoiI-hlorid maleat tretman je povećao nivo Hsp72 indukovan stresom za više od 20 % u odnosu na kontrolu izloženu stresu,
19.3. Eksperimenti na primamim eksplantima tkiva
Ovi eksperimenti su vršeni na eksplantima tkiva slezine i testisa pacova primenom toplotnog stresa posle tretmana eksperimentalnim jedinjenjima. Eksperimenti na suspenziji slezine su vršeni na sledeći način.
Slezine CFY pacova, teške 200 g, su izvađene aseptično i homogenizovane u MEM medijumu za kulture sa 10% fetalnog goveđeg seruma. Koncentracija ćelijske suspenzije je podešena na 50-100 mg/5 ml.
Po pet ml ćelijske suspenzije je stavljeno u svaku od posuda za kulture prečnika 6 cm i eksplanti su inkubirani jedan sat u vlažnom vazduhu sa 5% CO2na 37 °C, a zatim su kulture tretirane testiranim jedinjenjima u koncentraciji od 10"<s>M. Posle još 15 minuta inkubacije na 37 °C, kulture su izložene toplotnom stresu na 43 °C u trajanju od 30 minuta u inkubatoru. Količina indukovanog Hsp72 je merena posle još 6 sati inkubacije na 37 °C.
Rezultati su prikazani u Tabeli 4 i povećanja nivoa Hsp72 su ocenjivana po istoj skali kao u Tabelama 2. i 3.
Eknerimenti na eksplantu testisa pacova su vršeni na sledeći način.
Testisi CFY pacova, težine od 200 g, su uklonjeni u sterilnim uslovima i oslobođene testikularne tubule su suspendovane u u MEM medijumu za kulture sa 10% fetalnog goveđeg seruma, na takav način da je pet ml suspenzije sadržalo 50-100 mg tkiva. Eksplanti su inkubirani u vlažnom vazđuhu sa 5% CO2na 37 °C jedan sat, a zatim su kulture tretirane testiranim jedinjenjima u koncentraciji od IO"<5>M. Posle još 15 minuta inkubacije na 37 °C, eksplant su izloženi toplotnom stresu na 43 °C u trajanju od 30 minuta. Količina indukovanog Hsp72 je merena posle još 6 sati inkubacije na 37 °C.
Rezultati su sumirani u Tabeli 5. i povećanje nivoa Hsp72 je ocenjivano po istoj skali kao u Tabeli 4.
PRIMER 20: MERENJA NIVOA iRNK ZA Hsp U TORAKALNOJ AORTI PACOVA SA GENETSKOM HIPERTENZIJOM
Pacivi sa genetskom hpertenzijom su podeljeni u četiri grupe od po Četiri. Grupe su tretirane svaki dan, oralno, prva grupa fiziološkim slanim rastvorom, druga grupa N-[2m^oksi-3-(l-piperidinil)]-propoksi-3-piridin-karboksimidoi maleatom (20 mg/kg) 8 dana, treća grupa N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)-propoksi]-benzimidoil-hlorid monohidrohloridom (5 mg/kg) 20 dana i četvrta grupa N-[2-hidroksi-3-(l-pipeTidinil)propoksi]-2-tiofen-karboksimidoil hlorid monohidrohloridom (5 mg/kg) 20 dana. Životinje su žrtvovane, aorte su izolovane, trenutno zamrznute u tečnom azotu i čuvane na -70 °C do upotrebe.
b) Morfološko ispitivanje torakalne aorte
Ispitivanje je vršeno prema objavljenim postupcima (Br. J. of Pharmacol, 1995; 115,
515-420). Jedan mm površine torakalne aorte je ekscizirano i fiksirano u 2,5% glutaraldehidu na sobnoj temperaturi. Post-fiksacija je izvedena u 1 % osmijum-tetroksidu jedan sat.
Tkivo je dehidrirano u etanolu i uronjeno u Durcupan ACM. Slike su napravljene na Hitachi 7100 elektronskom mikroskopu i razvijene kvalitativno.
Nađeno je da tretmani N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)-propoksi]-3-piridinkarboksi-midoil-hlorid maleatom, N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)-propoksi]-benzimidoil hlorid monohidrohloridom i N-[2-rudroksi-3-(l-piperidinil)-propoksi]-2-tiofenkarboksimidoil-hlorid monohidrohloridom olakšavaju regeneraciju ćelija aorte na prosečan i jak način, respektivno.
c) Kvantitativno merenje Hsp70
Eksperimenti su vršeni kvantitativnom lančanom reakcijom polimeraze posle reverzne
transkripcije. Princip postupka je u tome da, ako se dve vrlo slične, ali koje se mogu razlikovati, matrice umnožavaju u istoj PCR reakciji, onda se odnos njihovih proizvoda neće promeniti tokom procesa. Kad je početna količina jedne od matrica poznata i relativna količina proizvoda se može meriti, onda se količina nepoznate početne matrice može izračunati. U najčešće korišćenom postupku, poznata matrica (kompetitor) i nepoznata
matrica (meta) se razlikuju samo po dužini, kompetitor je kraći, pa se, prema tome, proizvodi PCR mogu razdvojiti na osnovu njihovih veličina.
RNK je izolovana iz tkiva postupkom sa guaniđin-izocijanatom (Chomczvnski P. and Sacci N.: Anal Biochem. 162: 156,1987). Koncentracija i kvalitet nukleinske kiseline su određeni spektrofotometrom i elektroforezom na agaroznom gelu u uslovima denaturacije (Shambrook J. et al.: Molekulski Cloning. A Laboratorv Manual. Cold Spring Harbour Laboratorv Press, 1989). Izolovana RNK je čuvana na -70 °C.
Fragment je konstruisan iz cDNK koja kodira Hsp-70 gen, iskrajanjem (splicing out) interne sekvence (PCR-splicing, Riedy MC et al.: Biotechniques 18: 70, 1995). Fragment je umnožen prajmerima koji se specifično vezuju za spoljni deo konstrukta (Erlich A.: PCR Tcchnology. Principles and Applications for DNA Amplification. Stockton Press, 1989) i posle merenja koncentracije proizvoda, čuvanje na -70 °C.
Reverzna transkripcija je rađena u standardnim uslovima, korišćenjem 1 ug izolovane RNK/uzorak, uz pomoć oligo dT (dTl6) prajmera. (Shambrook J. et al, isto kao gore)
Jednake količine cDNK, dobijenih iz uzoraka RNK, su pomešane sa različitim količinama sintetičkog kompetitora (dobijenih iz serijskih razblaženja 3, 10 puta) i matrice su umnožene lančanom reakcijom polimeraze. Temperature tokom ciklusa su bile sledeće: denaturacija (95 °C, 1 min.), vezivanje prajmera (58 °C 1 min.), sinteza (72 °C, 0,5 min.).
Posle PCR amplifikacije, proizvodi su razdvojeni na agaroznom gelu (1 %) i obojeni etidijum-bromidom u standardnim uslovima. (Sambrook et al, isto kao gore). Obojeni fragmenti DNK su učinjeni vidljivim pomoću UV-transluminatora za fotografiju. Količina proizvoda PCR je merena denzitometrijom sa negativa fotografija.
Nađeno je da je nivo Hsp-70 u thorakalnoj aorti pacova tretiranih N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinir)-propoksi]-piirdin-karboksimiđoil-hlorid maleatom, N-[2-hidroksi-3-( 1 - piperidiniI)propoksi]-benzimidoil-hlorid monohidrohloridom i N-[2-hidroksi-3-(lpiperidinil)propoksi]-2-tiofen-karboksimidoil-hlorid-monohidrohloridom zaviše od 50% viši nego Hsp-70 u kontrolnim životinjama.
PRIMER 21: ISPITIVANJE INHIBITORNOG EFEKTA NA STARENJE KOŽE ZAMORCA
Inhlbitoran efekat jedinjenja, prema pronalasku, na starenje kože je ispitano na zamorcu. Koža pet životinja po grupi je depilirana i 1 cm<2>površine je ozračen iz UV -B izvora intenziteta 100 mJ/cm<2>na obe strane. Posle ozračivanja, jedna strana kože je tretirana kremom sastavljenom prema Primeru 10 i koja je sadržala 5% (t/t) N-[2-hidroksi-3-(l-piperiđinil)-propoksi]-3-piriđin-karboksimidoil-hlorid maleata ili N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)-propoksij-benzimidoil-hlorid monohidrohlorida ili N-[2-hidroksi-3-(l-piperidinil)-propoksi]-2-nitro-benztmidoil-hlorid monohidrohlorida, dok je druga strana životinje tretirana istom kremom bez aktivnog sastojka. Ovo je bio eksperiment sa sopstvenom kontrolom.
Tretman je počeo odmah posle ozračivanja i vršen je dvaput dnevno tokom dve nedelje.
UV-B ozračivanje je dovelo do teških ozleda kože (plikovi, zadebljanja, ozlede epitela i stvaranje rana), koje su bile zaceljene 4 dana ranije i veličina rana je bila značajno manja, kad su životinje bile tretirane jedinjenjima prema pronalasku. Jedinjenja su olakšala stvaranje epitela.
Eksperiment pokazuje da je tretman povećao otpornost kože prema UV-B zračenju i poboljšao regeneraciju kože.

Claims (47)

1. Upotreba hemijskog jedinjenja za dobijanje farmaceutske kompozicije korisne za povećanje ekspresije molekulskog šaperona eksprimiranog u eukariotskoj ćeliji koja je izložena fiziološkom stresu iznad količine izazvane fiziološkim stresom, gde je hemijsko jedinjenje derivat hidroksilamina čiji su tautomemi oblici predstavljeni formulama (I) i (II), ili njegova so i/ili njegov optički aktivan stereoizomer, gde je A alkil, supstituisana alkil, aralkil, aralkil supstituisana u aril i/ili alkil grupi, aril, supstituisana aril, heteroaril ili supstituisana heteroaril grupa, Z je kovalentna veza, kiseonik ili =NR<3>, gde je R<3>odabran iz grupe koja sadrži vodonik, alkil, supstituisan alkil, aril, supstituisan aril, aralkil i aralkil supstituisan u aril i/ili alkil grupi, X u tautomeru formule (I) je halogen ili supstituisana hidroksi ili amino, monosupstituisana amino ili disupstituisana amino grupa, a X u tautomeru formule (II) je kiseonik, imino ili supstituisana imino grupa i R je alkil ili supstituisan alkil, R' je vodonik, alkil, supstituisan alkil, aril, supstituisan aril, aralkil, aralkil koji ima supstituisanu aril i/ili alkil grupu, acil ili supstituisan acil, i jedinjenja formule (I) opciono sadrže intramolekulske prstenaste strukture formirane spajanjem X i reaktivnog supstituenta. pod us lovom da a) kada je R supstituisani alkil koji je suptsituisan sa bar hidroksi ili aciloksi, tada X nije halo, i b) kadajeX-NH2ili=N-H tada R nije co-amino-alkil disupstituisan u amino grupi u kojoj dva amino supstituenta, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju 3- do 7-člani prsten koji sadrži dodatan(tne) hetero atom(e),
2. Upotreba prema zahtevu 1, kada je patološko stanje odabrano iz grupe koju čine ishemija, neoplastično oboljenje, infekcija izazvana patogenim mikroorganizmom, autoimuno oboljenje i dermatoza.
3. Upotreba prema zahtevu 1, kada je farmaceutska kompozicija korisna za zaštitu miokarda, moždanih tkiva i bubrega od oštećenja tkiva i/ili nekroze izazvanih ishemijom, gde je hemijsko jedinjenje derivat hidroksilamina, čiji su tautomemi oblici predstavljeni formulama (I) i (II), ili njegova so i/ili njegov optički aktivan stereoizomer, gde su A, Z, R, R' i X kao što su defmisani u zahtevu 1.
4. Upotreba hemijskog jedinjenja prema zahtevu 1 za dobijanje farmaceutske kompozicije korisne za tretiranje cerebralnih, alergijskih, imunih, autoimunih oboljenja, oboljenja izazvanih virusnim ili bakterijskim infekcijama, oboljenja kože i/ili sluzokože, kao i oboljenja epitela renalnih tubula ili, opciono, za dobijanje kozmetičkih kompozicija.
5. Upotreba prema bilo kom od zahteva 1-4,naznačena lime, štoderivat hidroksilamina ima formulu (I), gde je R alkil ili supstituisan alkil, a (a) Z je kovalentna veza i X je halogen, R je supstituisan alkil, supstituisan hidroksilnom ili aciloksi grupom; (b) Z je kovalentna veza, a X supstituisana hidroksilna grupa -OQ, gde je Q ugljovodonik, a jedinjenje opciono ima intramolekulski prsten formiran spajanjem X i reaktivnog supstituenta R; (c) Z je kovalentna veza, a X je NR'R<2>, gde su R<l>i R<2>, nezavisno jedan od drugog, H, linearni ili razgranati alkil, supstituisan linearni ili razgranati alkil, cikloalkil, ili R<1>i R<2>, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju zasićen prsten sa 3 do 7 članova, a jedinjenje opciono ima intramolekulski prsten formiran spajanjem X i reaktivnog supstituenta R, uz uslov da kada su i R<!>i R<2>oba H, R nije co-amino-alkil disupstituisan u amino grupi u kojoj dva amino supstituenta, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju 3- do 7-člani prsten koji sadrži dodatni(e) hetero atom(e); (d) Z je kiseonik, a X supstituisana hidroksilna grupa -OQ, gde je Q ugljovodonična grupa; (e) Z je kiseonik, a X je -NR'R<2>, gde su R<1>i R<2>, nezavisno jedan od drugog, H, linearni ili razgranati alkil, supstituisan linearni ili razgranati alkil, cikloalkil, ili R<1>i R<2>, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju zasićen prsten sa 3 do 7 članova, (f) Z je =NR<3>, gde je R<3>H, alkil, supstituisan alkil, aril, supstituisan aril, aralkil ili aralkil koji ima supstituisanu aril ili supstituisanu alkil grupu, a X je NR<!>R<2>, gde su R<1>i R<2>, nezavisno jedan od drugog, H, linearni ili razgranati alkil, supstituisan linearni ili razgranati alkil, cikloalkil, ili R<1>i R<2>, zajedno sa atomom azota za koji su vezani, formiraju zasićen prsten sa 3 do 7 članova.
6. Upotreba prema zahtevu 5,naznačena time, što jeR co-amino-alkil, sa opciono supstituisanom amino i/ili alkil grupom i gde je alkil lanac, koji poželjno sadrži 3 do 8 ugljenikovih atoma, linearan ili razgranat i koji se može supstituisati hidroksi ili aciloksi grupom, pod uslovom da X nije NH2.
7. Upotreba prema zahtevu 5 ili 6,naznačena time, što jeR co-amino-alkil, mono-ili di-supstituisan na amino, gde su amino supstituenti, nezavisno jedan od drugog, jedan ili dva linearna ili razgranata alkila ili cikloalkila, ili dva amino supstituenta, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju 3- do 7-člani, poželjno 5- do 7-člani zasićen heteroprsten, koji može da sadrži dodatni(e) hetero atora(e), pod uslovom da X nije NH2.
8. Upotreba prema bilo kom od zahteva 5 do 7,naznačena time, štoje Z hemijska veza, X je halogen, poželjno hlor ili brom, a A je aralkil, aralkil supstituisan u aril i/ili alkil grupi, aril, supstituisan aril ili heteroaril.
9. Upotreba prema zahtevu 8,naznačena time, štoje A nesupstituisan ili supstituisan fenilalkil, koji može da ima jedan ili više supstituenata, poželjno alkoksi, fenil, fenil supstituisan halogenom, alkil, alkoksi ili haloalkilom, ili nitro, naftil ili heteroaril koji sadrži N i koji može biti kondenzovan sa benzenovim prstenom, poželjno piridil, ili heteroaril koji sadrži S ili O.
10. Upotreba prema bilo kojem od zahteva 5 do 7,naznačena time, štoje Z hemijska veza, X je supstituisana hidroksilna grupa formule -OQ, gde je Q nesupstituisan ili supstituisan linearan ili razgranat alkil, aralkil ili aralkil supstituisan u aril i/ili alkil grupi, a A je heteroaril, poželjno heteroaril koji sadrži N.
11. Upotreba prema bilo kojem od zahteva 1 do 4,naznačena time, štoderivat hidroksilamina ima formulu (I<1>), gde je R" alkil ili supstituisan alkil, a A je nesupstituisan ili supstituisan aril ili heteroaril.
12. Upotreba prema zahtevu 11,naznačen time, što je R"co-amino-alkil opciono supstituisan u amino i/ili alkil grupi i gde je poželjno da alkil lanac ima 1 do 5 ugljenikovih atoma.
13. Upotreba prema zahtevu 11 ili 12,naznačen time, Što je R"co-amino-alkil mono- ili disupstituisan na amino, gde su amino supstituenti, nezavisno jedan od drugog, jedan ili dva linearna ili razgranata alkila ili cikloalkila, ili dva amino supstituenta, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju 3- do 7-člani, poželjno 5- do 7-člani zasićen heteroprsten, koji može sadržati dodatni(e) hetero atom(e).
14. Upotreba prema bilo kojem od zahteva 5 do 7,naznačena time, štoje Z hemijska veza, X je -NR'R<2>, gde su R<1>i R<2>, nezavisno jedan od drugog, H, nesupstituisan ili supstituisan linearan ili razgranat alkil, cikloalkil, ili R<1>i R<2>, zajedno sa susednim atomom azota, formiraju zasićen prsten sa 3 do 7, a poželjno sa 5 do 7 članova i A je aralkil, aralkil supstituisan u aril i/ili alkil grupi, nesupstituisan ili supstituisan aril ili heteroaril, uz uslov da ako su i R<1>i R<2>oba H, R nije co-amino-alkil disupstituisan u amino grupi u kojoj dva amino suspstituenta, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju 3- do 7-člani prsten koji sadrži dodatni(e) hetero atom(e).
15. Upotreba prema zahtevu 14,naznačena time, štoje A fenilalkil, fenilalkil koji može da ima jedan ili više supstituenata, poželjno alkoksi u fenil grupi, fenil, fenil supstituisan jednim ili više alkila, halogena, alkoksi ili haloalkila, nitro ili acilamino, naftil ili heteroaril koji sadrži N i koji može biti kondenzovan sa benzenovim prstenom, prvenstveno piridil, ili heteroaril koji sadrži S ili O.
16. Upotreba prema bilo kojem od zahteva 1 do 4,naznačena time, štoderivat hidroksilamina ima formulu (I"), gde je R" alkil ili supstituisan alkil, A je nesupstituisan ili supstituisan aril ili heteroaril, a Rl je H, nesupstituisan ili supstituisan linearan ili razgranat alkil, cikloalkil, aralkil ili aralkil supstituisan u alkil i/ili aril grupi.
17. Upotreba prema zahtevu 16,naznačena time, štoje R" co-amino-alkil, koji može da bude supstituisan u amino i/ili alkil lancu i gde je poželjno da alkil lanac ima 1 do 5 ugljenikovih atoma.
18. Upotreba prema zahtevu 16 ili 17,naznačena time, štoje R" tu-amino-alkil mono- ili di-supstituisan u amino, gde su amino supstituenti, nezavisno jedan od drugog, jedan ili dva linearna ili razgranata alkila ili cikloalkila, ili dva amino supstituenta, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju 3- do 7-člani, poželjno 5- do 7-člani, zasićen heterocikličan prsten, koji može sadržati dodatni(e) hetero atom(e).
19. Upotreba prema zahtevu 14,naznačena time, štojc A fenil, fenil supstituisan jednim ili više alkila, halogena, alkoksi, haloalkilom ili nitro, naftil ili heteroaril koji sadrži N i koji može biti kondenzovan sa benzenovim prstenom, ili heteroaril koji sadrži S ili O.
20. Upotreba prema bilo kojem od zahteva 5 do 7,naznačena time, štoje Z kiseonik, X je -OQ, gde je Q nesupstituisan ili supstituisan linearan ili razgranat alkil, poželjno Cm alkil, aralkil ili aralkil supstituisan u aril i/ili alkil grupi, a A je nesupstituisan ili supstituisan linearan ili razgranat alkil, aralkil ili aralkil supstituisan u aril i/ili alkil grupi.
21. Upotreba prema bilo kojem od zahteva 5 do 7,naznačena time, štoje Z kiseonik, X je -NR'R<2>, gde su R<1>i R<2>, nezavisno jedan od drugog, H, nesupstituisan ili supstituisan linearan ili razgranat alkil, cikloalkil, ili nesupstituisan ili supstituisan aril, poželjno fenil, ili R i R , zajedno sa susednim atomom azota, formiraju zasićen prsten sa 3 do 7, poželjno sa 5 do 7 članova i A je nesupstituisan ili supstituisan linearan ili razgranat alkil, nesupstituisan ili supstituisan aril, poželjno fenil, aralkil ili aralkil supstituisan u aril i/ili alkil grupi.
22. Upotreba prema bilo kojem od zahteva 5 do 7,naznačena time, što jeZ =NR\ gde je R<3>H, nesupstituisan ili supstituisan linearan ili razgranat alkil, nesupstituisan ili supstituisan aril, aralkil ili aralkil supstituisan u aril i/ili alkil grupi, X je -NR<l>R<2>, gde su R<1>i R<2>, nezavisno jedan od drugog, H, nesupstituisan ili supstituisan linearan ili razgranat alkil, cikloalkil, ili nesupstituisan ili supstituisan aril, poželjno fenil, iii R' i R<2>, zajedno sa susednim atomom azota, foimiraju zasićen prsten sa 3 do 7, poželjno 5 do 7 članova, uz uslov đa ako su i R<1>i R<2>oba H, R nije co-amino-alkil disupstituisan u amino grupi u kojoj dva amino supstituenta, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju 3- do 7-člani prsten koji sadrži dodatni(e) hetero atom(e); A je nesupstituisan ili supstituisan linearan ili razgranat alkil, nesupstituisan ili supstituisan aril, aralkil, ili aralkil supstituisan u aril i/ili alkil grupi.
23. Upotreba prema bilo kojem od zahteva 1 do 4,naznačena time, štoderivat hidroksilamina ima formulu (II), gde je R alkil ili supstituisan alkil, a a) Z je hemijska veza, a X je kiseonik ili b) Z je hemijska veza, a X je =NR<4>, gde je R<4>H ili nesupstituisan ili supstituisan alkil ili cikloalkil, uz uslov da, kad je R<4>H, R nije co-amino-alkil disupstituisan u amino grupi u kojoj dva amino supstituenta, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju 3- do 7-člani prsten koji sadrži dodatni(e) hetero atom(e), c) Z je kiseonik i X je kiseonik, d) Z je kiseonik, a X je =NR<4>, gde je R<4>nesupstituisan ili supstituisan alkil, aralkil ili aril, ili heteroaril, e) Z je =NR<3>, gde je R<3>H, nesupstituisan ili supstituisan alkil, aril ili aralkil, a X je kiseonik f) Z je =NR<3>, gde je R<3>H, nesupstituisan ili supstituisan alkil, aril ili aralkil, a X je =NR<4>, gde je R<4>H, nesupstituisan ili supstituisan alkil ili aralkil, ili cikloalkil.
24. Upotreba prema zahtevu 23,naznačena time, štoje R co-amino-alkil opciono supstituisan na amino i/ili alkil grupi, i gde alkilni lanac, koji poželjno sadrži 3 do 8 ugljenikovih atoma, i koji je linearan ili razgranat, može da bude supstituisan sa hidroksi ili aciloksi pod uslovom da R<4>nije H.
25. Upotreba prema zahtevu 23 ili 24,naznačena time, štoje R co-amino-alkil, mono- ili di-supstituisan na amino, gde su amino supstituenti nezavisno jedan od drugog jedan ili dva linearna ili razgranala alkila ili cikloalkila, ili dva amino supstituenta, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju 3- do 7-člani, poželjno 5- do 7-člani, zasićen heterocikličan prsten, koji može sadržati dodatni(e) hetero atom(e) pod uslovom da R<4>nije H.
26. Upotreba prema bilo kojem od zahteva 23 do 25,naznačena time, štoje Z hemijska veza, X kiseonik, a R' je H, nesupstituisan ili supstituisan linearan ili razgranat alkil, nesupstituisan ili supstituisan aril, aralkil ili aralkil supstituisan u aril i/ili alkil grupi, i A je nesupstituisan ili supstituisan aril ili aralkil, ili heteroaril.
27. Upotreba prema zahtevu 26,naznačena time, štoje A fenil, fenil supstituisan jednim ili više alkila, haloalkila ili alkoksi, aralkil, aralkil supstituisan u aril i/ili alkil delu ili heteroaril koji sadrži N ili heteroaril koji sadrži S.
28. Upotreba prema bilo kojem od zahteva 23 do 25,naznačena time, što jeZ hemijska veza, X je =NR<4>, gde je R<4>H, nesupstituisan ili supstituisan linearan ili razgranat alkil, nesupstituisan ili supstituisan aril, poželjno fenil, aralkil, aralkil supstituisan u aril i/ili alkil delu, ili cikloalkil i R' je nesupstituisan ili supstituisan linearan ili razgranat alkil, nesupstituisan ili supstituisan aril, aralkil ili aralkil supstituisan u aril i/ili alkil grupi, a A je aralkil, aralkil supstituisan u aril i/ili alkil delu, nesupstituisan ili supstituisan aril ili heteroaril.
29. Upotreba prema zahtevu 28,naznačena time, štoje A fenilalkil, fenilalkil supstituisan jednim ili više alkoksi u fenil grupi, fenil, fenil supstituisan jednom ili više alkil, haloalkil ili nitro grupa, naftil ili heteroaril koji sadrži N, poželjno piridil, ili heteroaril koji sadrži S.
30. Upotreba prema bilo kojem od zahteva 23 do 25,naznačena ( ime, štoje Z kiseonik, X je kiseonik, a R' je H, nesupstituisan ili supstituisan linearan ili razgranat alkil, nesupstituisan ili supstituisan aril, aralkil ili aralkil supstituisan u aril i/ili alkil grupi, a A je nesupstituisan ili supstituisan linearan ili razgranat alkil, aralkil ili aralkil supstituisan u aril i/ili alkil grupi.
31. Upotreba prema bilo kojem od zahteva 23 do 25,naznačena time, štoje Z kiseonik, X je =NR<4>, gde je R<4>nesupstituisan ili supstituisan linearan ili razgranat alkil, aralkil, aralkil supstituisan u aril i/ih alkil grupi, nesupstituisan ili supstituisan aril, poželjno fenil ili nesupstituisan ili supstituisan heteroaril, a R' je nesupstituisan ili supstituisan linearan ili razgranat alkil, nesupstituisan ili supstituisan aril, aralkil ili aralkil supstituisan u aril i/ili alkil grupi.
32. Upotreba prema bilo kojem od zahteva 23 do 25,naznačena time, štoje Z =NR<3>, R<3>je H, nesupstituisan! ili supstituisani linearan ili razgranat alkil, nesupstituisani ili supstituisani aril, aralkil ili aralkil supstituisan u aril i/ili alkil grupi, X je kiseonik, aR'je H, nesupstituisani ili supstituisani linearan ili razgranat alkil, nesupstituisani ili supstituisani aril, aralkil ili aralkil supstituisan u aril i/ili alkil grupi, ili acil, a A je nesupstituisani ili supstituisani alkil, aralkil, aril ili heteroaril ili cikloalkil.
33. Upotreba prema zahtevu 32,naznačena time, što jeA nesupstituisan ili supstituisan linearan ili razgranat alkil koji poželjno sadrži 4 do 12 ugljenikovih atoma, cikloalkil, nesupstituisani ili supstituisani fenilalkil, fenil, fenil supstituisan jednim ili više halogena, alkila, haloalkila, alkoksi ili nitro ili heterocilična grupa koja sadrži N.
34. Upotreba prema bilo kojem od zahteva 23 do 25,naznačena time, štoje Z =NR<3>, gde je R3 nesupstituisan ili supstituisan linearan ili razgranat alkil, nesupstituisani ili supstituisani aril, aralkil ili aralkil supstituisan u aril i/ili alkil grupi, X je =NR<4>, gde je R<4>H, nesupstituisani ili supstituisani linearan ili razgranat alkil, nesupstituisan ili supstituisan aril, poželjno fenil, aralkil, ili aralkil supstituisan u aril i/ili alkil delu, ili cikloalkil, poželjno H ili alkil i R' je nesupstituisani ili supstituisani linearan ili razgranat alkil, nesupstituisani ili supstituisani aril, aralkil ili aralkil supstituisan u aril i/ili alkil grupi, a A je nesupstituisani ili supstituisani linearan ili razgranat alkil, ili nesupstituisani ili supstituisani aril, poželjno fenil ili supstituisan fenil.
35. Jedinjenje formula (I), (II) ili (I") gde je, kad je formula (I), a) X halogen, poželjno hlor ili brom, Z je hemijska veza, a al) A je grupa formule (a) gde je Y' halogen, alkoksi, haloalkil ili nitro, a n je 1, 2 ili 3, ili je heteroaril koji sadrži 0, poželjno furil, heteroaril koji sadrži S, poželjno tienil, ili je heteroaromatična grupa koja sadrži N i koja može biti kondenzovana sa benzenovim prstenom, ili je kvaternarni derivat alkila N-C1-4 ili njegov N-oksid, poželjno piridil, hinolil ili izohinolil, R je grupa formule (b) gde su R<5>iR<b>,nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, poželjno Cm alkil ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa susednim atomom azota, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, poželjno sa 5 do 7 članova. Y je -OR', gde je R' H ili acil, poželjno nesupstituisan ili supstituisan alkilkarbonil, arilkarbonil ili aminoacil, k je 1, 2 ili 3, a m je 1, 2 ili 3, ili je kvaternarni derivat N-CM alkila ili njegov N-oksid, uz uslov da, kad je A piridil ili naftil, ili grupa formule (a), gde je Yl halogen ili alkoksi, R<7>nije H, ili a2) A je grupa formule (c) R je grupa formule (d) a opcioni supstituenti Y<2>i Y<3>, od kojih jedan mora biti prisutan u molekulu, su kiseonik, ili Cm alkil, k je 1, 2 ili 3 i m je 1, 2 ili 3, i kada je jedinjenje jedno- ili dvovalentan katjon, anjon je jon sa jednim ili dva halogena, poželjno jodiđ; ili b) X je -M^R2, gde su R<1>i R<2>, nezavisno jedan od drugog, H, nesupstituisani ili supstituisani linearan ili razgranat alkil, nesupstituisani ili supstituisani aril, poželjno fenil, nesupstituisani ili supstituisani aralkil, ili R<1>i R<2>, zajedno sa susednim atomom azota, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, poželjno 5 do 7 članova, koji može imati jedan ili više dodatnih hetero atoma, A je nesupstituisani ili supstituisani alkil, nesupstituisani ili supstituisani aril, poželjno fenil ili nesupstituisani ili supstituisani aralkil, Z je kiseonik ili =NR<3>, gde je R<3>H ili nesupstituisani ili supstituisani alkil, a R je grupa formule (b) gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, poželjno Cm alkil ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa susednim atomom azota, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, poželjno 5 do 7 članova, Y<ć>je H ili -OR<7>, gde je R<7>H ili acil, poželjno nesupstituisani ili supstituisani alkilkarbonil ili arilkarbonil; k je 1, 2 ili 3, a mje 1, 2 ili 3, ili c) X je -OQ, gde je Q nesupstituisan ili supstituisan alkil ili aralkil A je nesupstituisan ili supstituisan alkil ili aralkil Z je kiseonik, a R je grupa formule (b) gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, poželjno Cm alkil ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa susednim atomom azota, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, poželjno 5 do 7 članova, Y* je H ili -OR<7>, gde je R<7>H ili acil, poželjno nesupstituisan ili supstituisan alkilkarbonil ili arilkarbonil; k je 1, 2 ili 3, a m je 1, 2 ili 3, ili d) A je nesupstituisan ili supstituisan aril, poželjno fenil ih heteroaromatična grupa koja sadrži N, poželjno piridil ili heteroaromatična grupa koja sadrži S, Z je hemijska veza, X je -OQ, gde je Q CM alkil i R je grupa formule (b), gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, poželjno Ci-4alkil ili cikloalkil, ili R5 i R<6>, zajedno sa susednim atomom azota, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, poželjno 5 do 7 članova, Y6 je H, k je l, 2 ili 3, a mje 1, 2 ili 3, a kad je formula (II), a) X je kiseonik, A je Cj-20 linearan ili razgranat alkil, nesupstituisan ili supstituisan aril, poželjno fenil ili halofenil, nesupstituisan ili supstituisan aralkil, naftil ili heteroaromatična grupa koja sadrži N, poželjno piridil, Z je hemijska veza, R' je H, Cm alkil ili aralkil, poželjno fenilalkil, R je grupa formule (b) gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, poželjno Cm alkil ili cikloalkil, ili Rs i R<6>, zajedno sa susednim atomom azota, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, poželjno 5 do 7 članova, Y<6>je -OR<7>, gde je R<7>H, k je 1, 2 ili 3, a m je 1,2 ili 3, uz uslov da, kad A nije alkil i R' je H, R<6>je H, ili b) X je =NR<4>, gde je R<4>H, nesupstituisan ili supstituisan alkil, nesupstituisan ili supstituisan aril, poželjno fenil ili nesupstituisan ili supstituisan aralkil, poželjno fenilalkil, A je nesupstituisan ili supstituisan aril, poželjno fenil ili supstituisan fenil, ili nesupstituisan ili supstituisan aralkil, poželjno fenilalkil, ili cikloalkil, Z je hemijska veza, kiseonik ili =NR<3>, gde je R<3>H ili nesupstituisan ili supstituisan alkil, R' je nesupstituisan ili supstituisan alkil ili nesupstituisan ili supstituisan aril, poželjno fenil ili nesupstituisan ili supstituisan aralkil, poželjno fenilalkil i R je grupa formule (b), gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, poželjno Cmalkil ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa susednim atomom azota, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, poželjno 5 do 7 članova, Y* je H ili - OR , gde je R H ili acil, poželjno nesupstituisan ili supstituisan alkilkarbonil ili arilkarbonil; k je 1,2 ili 3 i mje 1,2 ili 3. uz uslov da, kad je A fenil, fenil supstituisan halogenom ili alkoksi, ili fenilalkil supstituisan alkoksi ili piridil grupa i R<7>je H, R<4>nije H, kad je A fenil, fenil supstituisan halogenom ili alkoksi, ili fenilalkil supstituisan alkoksi ili piridil grupa i R<4>je H, R<7>nij<e>H, ili c) X je kiseonik, A je nesupstituisan ili supstituisan alkil, nesupstituisan ili supstituisan aralkil, poželjno fenilalkil, Z je kiseonik, R* je alkil ili aralkil, poželjno fenilalkil, R je grupa formule (b), gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, poželjno Cm alkil ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa susednim atomom azota, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, poželjno 5 do 7 članova, Y<6>je H ili -OR<7>, gde j* e R 7 H ih * acil, poželjno nesupstituisan ili supstituisan alkilkarbonil ili arilkarbonil; k je 1, 2 ili 3 i mje 1, 2 ili 3, ili d) X je kiseonik, Zje=NHi dl) A je nesupstituisan ili supstituisan alkil, cikloalkil, nesupstituisan ili supstituisan aralkil, poželjno fenilalkil, fenil ili fenil supstituisan halogenom, alkilom, haloalkilom. alkoksi ili nitro grupom. R'je alkil ili aralkil, poželjno fenilalkil i R je grupa formule (b), gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, poželjno Cmalkil ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa susednim atomom azota, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, poželjno 5 do 7 članova, Y<6>je H ili -OH, k je 1, 2 ili 3 i mje 1, 2 ili 3, kad je formula (I"), A je fenil ili fenil supstituisan halogenom ili nitro grupom, ili heteroaril grupa, poželjno piridil, Rije Hi R" je co-aminoalkil koji je opciono mono- ili disupstituisan na amino grupi, gde je poželjno da alkilni lanac ima 1 do 5 ugljenikovih atoma i amino supstituenti mogu biti, nezavisno jedan od drugog, jedan ili dva linearna ili razgranata alkila ili cikloalkila, ili dva amino supstituenta, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju 3- do 7-člani, poželjno 5- do 7-člani heterocikličan prsten, ili je kvaternarni derivat alkila Cm ili njegov N-oksid, uz uslov da kad je A 3-piridil, R" nije 1-piperidinil-metil.
36. Derivat hidroksilamina prema zahtevu 35 strukture date formulom (I),naznačena time, stojeA grupa formule (a), a Y' je Cmhaloalkil, poželjno trifiuorometil.
37. Optički aktivan stereoizomer derivata hidroksilamina prema zahtevu 35 strukture date formulom (I), gde je X halogen, Z je hemijska veza i R je grupa formule (b) gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, poželjno Cm alkil ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa susednim atomom azota, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, poželjno sa 5 do 7 članova, Y<6>je -OR<7>, gde je R<7>aminoacil, k je 1, 2 ili 3 i mje 1, 2 ili 3.
38. Derivati hidroksilamina formule (1J gde je X -NR'R<2>, gde su R<1>i R<2>, nezavisno jedan od dragog, H ili nesupstituisani ili supstituisani linearan ili razgranat alkil, poželjno Ci_6alkil ili cikloalkil, ili R<1>i R<2>, zajedno sa atomom N za koji su vezani, formiraju zasićen heteroprsten sa 3 do 7, poželjno sa 5 do 7 članova, A je nesupstituisan ili supstituisan aralkil, poželjno fenilalkil supstituisan jednim ili više alkoksi, poželjno Cm alkoksi, fenil, fenil supstituisan jednim ili više halogena, alkila ili haloalkila, poželjno Cm alkila ili haloalkila, ili acilamino ili nitro grupa, ili nesupstituisana ili supstituisana heteroaromatična grupa koja sadrži N i koja može biti kondenzovana sa benzenovim prstenom, poželjno pirolil, piridil, izohinolil ili hinolil, ili heteroaril koji sadrži S, poželjno tienil, gde hetero atomi mogu imati jedan ili više alkilnih supstituenata, prvenstveno Cm alkil Z je hemijska veza, a R je grupa formule (e) gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, poželjno Ci.4alkil ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa susednim atomom azota, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, poželjno sa 5 do 7 članova, koji može imati jedan ili više dodatnih hetero atoma i opcione supstituente, poželjno Cm alkil, Y* je H ili nesupstituisan ili supstituisan Cm alkil,Y5 je H ili nesupstituisan ili supstituisan Cmalkil ili -OR<7>, gde je R<7>H ili acil, kje 1, 2 ili 3 i mje 1, 2 ili 3, pod uslovom da kad je A fenil, fenil supstituisan halogenom ili alkoksi ili fenilalkil supstituisan alkoksi ili piridil grupa, a R<7>je H, bar jedan od R<1>i R<2>nije H i kad je A fenil, fenil supstituisan halogenom ili alkoksi ili fenilalkil supstituisan alkoksi ili piridil grupa, a i R' i R<2>su H, R<7>nije H.
39. Derivati hidroksilamina prema zahtevu 35,naznačena time, štoderivati imaju strukturu datu formulom (II) gde je a) X kiseonik, A je Cj-20linearan ih razgranat alkil, nesupstituisani ili supstituisani aril, prvenstveno fenil ili halofenil, nesupstituisani ili supstituisani aralkil, naftil ili heteroaromatična grupa koja sadrži N, prvenstveno piridil, Z je hemijska veza, R' je H, Cmalkil ili aralkil, prvenstveno fenilalkil, R je grupa formule (b) R je grupa formule (b), gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, poželjno Cm alkil ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa susednim atomom azota, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, poželjno 5 do 7 članova, Y6 je -OR<7>, gde je R7 H, k je 1, 2 ili 3 i mje 1, 2 ili 3, uz uslov da, kad A nije alkil, a R' je H, R<6>je H, ili b) X je =NR<4>, gde je R<4>H, nesupstituisan ili supstituisan alkil, nesupstituisan ili supstituisan aril, prvenstveno fenil, ili nesupstituisan ili supstituisan aralkil, prvenstveno fenilalkil, A je nesupstituisan ili supstituisan aril, prvenstveno fenil ili supstituisan fenil, ili nesupstituisani ili supstituisani aralkil, prvenstveno fenilalkil ili cikloalkil, Z je hemijska veza, kiseonik ili -NR , gde je R H ili nesupstituisani ili supstituisani alkil R<1>je nesupstituisani ili supstituisani alkil ili nesupstituisani ili supstituisani aril, prvenstveno fenil, ili nesupstituisani ili supstituisani aralkil, prvenstveno fenilalkil, a R je grupa formule (b), gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, poželjno Cm alkil ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa susednim atomom azota, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, poželjno 5 do 7 članova, Y6 je H ili - OR<7>, gde je R<7>H ili acil, poželjno nesupstituisan ili supstituisan alkilkarbonil ili arilkarbonil, k je 1, 2 ili 3 i mje 1, 2 ili 3, uz uslov da, kad je A fenil, fenil supstituisan halogenom ili alkoksi ili fenilalkil supstituisan alkoksi ili piriđilna grupa, a R<7>je H, R<4>ruje H, i kada je A fenil, fenil supstituisan halogenom ili alkoksi ili fenilalkil supstituisan alkoksi ili piridil grupom, a R4 je H, R<7>nije H ili c) X je kiseonik, A je nesupstituisani ili supstituisani alkil, nesupstituisani ili supstituisani aralkil, prvenstveno fenilalkil, Z je kiseonik, R'je alkil ili aralkil, prvenstveno fenilalkil, R je grupa formule (b), gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, poželjno Cm alkil ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa susednim atomom azota, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, poželjno 5 do 7 članova, Y<6>je H ili -OR<7>, gde je R<7>H ili acil, poželjno nesupstituisan ili supstituisan alkilkarbonil, k je 1, 2 ili 3 i mje 1,2 ili 3, ili d) X je kiseonik, Z je =NH, a dl) A je nesupstituisani ili supstituisani alkil, cikloalkil, nesupstituisani ili supstituisani aralkil, prvenstveno fenilalkil, fenil ili fenil supstituisan halogenom, alkilom, haloalkilom, alkoksi ili nitro, R'je alkil ili aralkil, prvenstveno fenilalkil, a R je grupa formule (b), gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, poželjno Cm alkil ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa susednim atomom azota, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, poželjno 5 do 7 članova, Y<6>je H ili -OH, k je 1, 2 ili 3 i mje 1, 2 ili 3.
40. Derivati hidroksilamina prema zahtevu 35,naznačena time, štoderivati imaju strukturu datu formulom (I") gde je A fenil, fenil supstituisan halogenom ili nitro grupom, ili je heteroaril grupa koja sadrži N, prvenstveno piridil Rlje H, a R" je co-amino-alkil koji može biti mono- ili disupstituisan u amino grupi u kojoj alkil lanac ima pretežno 1 do 5 ugljenikovih atoma, a amino suspstituenti mogu biti, nezavisno jedan od drugog, jedan ili dva linearna ili razgranata alkila ili cikloalkila, ili dva amino supstituenta, zajedno sa atomom azota vezanim za njih, formiraju heterociklični prsten sa 3 do 7, prvenstveno 5 do 7 članova, ili Cmalkil-kvaternarni derivat ili njegov N-oksid, uz uslov da kad je A 3-piridil, R" nije 1-piperidinil-metil.
41. Farmaceutska i opciono kozmetička kompozicija za tretiranje kardiovaskularnih, vaskulamih, cerebralnih, alergijskih, imunih i autoimunih oboljenja, oboljenja izazvanih virusnim ili bakterijskim infekcijama, tumorskih, oboljenja kože ili sluzokože, kada navedena kompozicija sadrži jedinjenje hidroksilamina formule (I) gde su A, Z, X i R kao što su definisani u zahtevu 35, zajedno sa farmaceutski i/ili kozmetički prihvatljivim nosačima i dodacima.
42. Farmaceutska i opciono kozmetička kompozicija za tretiranje kardiovaskularnih, vaskularnih, cerebralnih, alergijskih, imunih i autoimunih oboljenja, oboljenja izazvanih virusnim ili bakterijskim infekcijama, tumorskih, kožnih ili oboljenja mukoze, kada navedena kompozicija sadrži jedinjenje hidroksilamina formule (I) gde su A, Z, X i R kao što su definisani u zahtevu 38, zajedno sa farmaceutski i/ili kozmetički prihvatljivim nosačima i dodacima.
43. Farmaceutska i opciono kozmetička kompozicija za tretiranje kardiovaskularnih, vaskularnih, cerebralnih, alergijskih, imunih i autoimunih oboljenja, oboljenja izazvanih virusnim ili bakterijskim infekcijama, tumorskih, kožnih ili oboljenja mukoze, kada navedena kompozicija sadrži jedinjenje hidroksilamina formule (I) gde su A, Z, X i R kao što su definisani u zahtevu 39, zajedno sa farmaceutski i/ili kozmetički prihvatljivim nosačima i dodacima.
44. Farmaceutska i opciono kozmetička kompozicija za tretiranje kardiovaskularnih, vaskularnih, cerebralnih, alergijskih, imunih i autoimunih oboljenja, oboljenja izazvanih virusnim ili bakterijskim infekcijama, tumorskih, kožnih ili oboljenja mukoze, kada navedena kompozicija sadrži jedinjenje hidroksilamina formule (I) gde su A, Z, X i R kao što su definisani u zahtevu 40, zajedno sa farmaceutski i/ili kozmetički prihvatljivim nosačima i dodacima.
45. Upotreba hemijskog jedinjenja za dobijanje farmaceutske kompozicije za povećanje aktivnosti molekulskog šaperona eksprimiranog u eukariotskoj ćeliji koja je izložena fiziološkom stresu iznad količine izazvane fiziološkim stresom, kada je hemijsko jedinjenje derivat hidroksilamina, čiji su tautomemi oblici predstavljeni formulama (I) i (TI): gde je A alkil, supstituisani alkil, aralkil, aralkil supstituisan u aril i/ili alkil delu, aril, supstituisani aril, heteroaril ili supstituisana heteroaril grupa, R<1>je vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril, aralkil, aralkil koji ima supstituisanu aril i/ili alkil grupu, acil ili supstituisanu acil grupu, a) Z je kiseonik ili =NR<3>, gde je R<3>odabran iz grupe koju čine vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril, aralkil i aralkil supstituisan u aril i/ili alkil delu, R je alkil ili supstituisani alkil, X u tautomeru formule (I) je halogen ili supstituisana hidroksi ili amino grupa, monosupstituisana amino ili disupstituisana amino grupa i X u tautomeru formule (II) je kiseonik, imino ili supstituisana imino grupa; ili b) Z j e kovalentna veza bi) R je alkil ili supstituisani alkil, X u tautomeru formule (I) je supstituisana hidroksilna, monosupstituisana amino ili disupstituisana amino grupa i X u tautomeru formule (II) je kiseonik ili supstituisana imino grupa; ili b2) R je grupa formule (e): gde su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearni ili razgranati alkil, prvenstveno Cm alkil ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa susednim atomom N, formiraju zasićen heterocikličan prsten sa 3 do 7, prvenstveno sa 5 do 7 članova, koji može imati jedan ili više dodatnih hetero atoma i opciono jedan ili više supstituenata, prvenstveno Cm alkil, V<4>je H ili nesupstituisani ili supstituisani Cm alkil, Ys je H ili nesupstituisani ili supstituisani Cm alkil ili -OR<7>, gde je R<7>acil, k je 1,2 ili 3 i mje 1,2 ili 3, X u tautomeru fonnule (I) je amino grupa, a X u tautomeru formule (II) je imino grupa; i jedinjenja formule (I) opciono sadrže intramolekulske prstenaste strukture formirane spajanjem X i reaktivnog supstituenta, ili njegove soli i/ili njihov optički aktivan stereoizomer.
46. Upotreba prema zahtevu 45, gde se koriste hidroksilamini fonnule (I): gde je R alkil ili supstituisani alkil i (a) Z je kovalentna veza, a X je supstituisana hidroksilna grupa -OQ, gde je Q ugljovodonik, a jedinjenje može imati intramolekulski prsten formiran spajanjem X i reaktivnog supstituenta R; (b) Z je kovalentna veza, a X je mono- ili di- supstituisan arnin formule NR'R<2>, gde su R<1>i R<2>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, supstituisan linearan ili razgranat alkil, cikloalkil, ili R<1>i R<2>, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju zasićen prsten sa 3 do 7 članova, a jedinjenje može imati intramolekulski prsten formiran spajanjem X i reaktivnog supstituenta R, pod uslovom da bar jedan od R<1>i R<2>nije H; (c) Z je kiseonik, a X supstituisana hiđroksilna grupa -OQ, gde je Q ugljovodonična grupa; (d) Z je kiseonik, a X je -NR'R<2>, gde su R<1>i R<2>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, supstituisan linearan ili razgranat alkil, cikloalkil, ili R<1>i R<2>, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju zasićen prsten sa 3 do 7 članova, ili (e) Z je =NR3, gde je R<3>H, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril, aralkil ili aralkil sa supstituisanom aril ili supstituisanom alkil grupom, a X je NR'R<2>, gde su R<1>i R<2>, nezavisno jedan od drugog, H, linearan ili razgranat alkil, supstituisan linearan ili razgranat alkil, cikloalkil, ili R<1>i R<2>, zajedno sa vezanim atomom azota, formiraju zasićen prsten sa 3 do 7 članova.
47. Upotreba hemijskog jedinjenja za dobijanje farmaceutske kompozicije za tretiranje oboljenja vezanih za povećanje ekspresije šaperona ili disfunkciju membrane ćelije ili ćelijske organele, ili opciono za prevenciju ovih oboljenja, kada je hemijsko jedinjenje derivat hidroksilamina, čiji su tautomemi oblici predstavljeni formulom (I): gde je Z hemijska veza, X je halogen, prvenstveno hlor ili brom, a a) A je grupa formule (a): gde je Y<l>halogen, alkoksi, haloalkil ili nitro grupa, a nje 1, 2 ili 3, ili je heteroaril koji sadži O, prvenstveno furil, heteroaril koji sadrži S, prvenstveno tienil, ili je heteroaril grupa koja sadrži N i koja može biti kondenzovana sa benzenovim prstenom, ili kvaternarni derivat alkila N-Cu iii njegov N-oksid, prvenstveno piridil, hinolil ili izohinolil R je grupa formule (b): gđe su R<5>i R<6>, nezavisno jedan od drugog, H, linearni ili razgranati alkil, prvenstveno Cj-4alkil ili cikloalkil, ili R<5>i R<6>, zajedno sa susednim N atomom, formiraju zasićeni heterociklični prsten sa 3 do 7, prvenstveno sa 5 do 7 članova, Y6 je -OR<7>, gde je R<7>H ili acil, prvenstveno nesupstituisani ili supstituisani alkilkarbonil, arilkarbonil ili aminoacil, k je 1, 2 ili 3 i m je 1, 2 ili 3, ili je kvaternarni derivat N-Cm alkila ili njegov N-oksid, uz uslov da kad je A piridil ili naftil, ili grupa formule (a), gde je Y<]>halogen ili alkoksi, R<7>nije H, ili b) A je grupa formule (c): R je grupa formule (d): a opcioni supstituenti Y<2>i Y<3>, od kojih jedan mora biti prisutan u molekulu, je kiseonik, ili Cj.4 alkil, kje 1, 2 ili 3 i mje 1, 2 ili 3, i kad je jedinjenje jedno- ili dvovalentan katjon, anjon je jon sa jednim ili dvahalogena, prvenstveno jodid; i jedinjenja formule (I) opciono sadrže intrarnolekulske prstenaste strrukture formirane spajanjem X i reaktivnog supstituenta, ili njegova so i/ili bilo koji njegov optički aktivan stereoizomer.
YUP-587/96A 1995-11-02 1996-11-01 Upotreba derivata hidroksilamina za dobijanje farmaceutskih kompozicija korisnih za povećanje ekspresije i aktivnosti molekulskih šaperona RS49981B (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU9503141A HU222994B1 (hu) 1995-11-02 1995-11-02 Hidroxilaminszármazékok és azok alkalmazása sejtek molekuláris chaperon-termelésének fokozására alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására
HU9603919 1996-02-09
HU9629820 1996-10-04

Publications (2)

Publication Number Publication Date
YU58796A YU58796A (sh) 1999-09-27
RS49981B true RS49981B (sr) 2008-09-29

Family

ID=27270113

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YUP-587/96A RS49981B (sr) 1995-11-02 1996-11-01 Upotreba derivata hidroksilamina za dobijanje farmaceutskih kompozicija korisnih za povećanje ekspresije i aktivnosti molekulskih šaperona

Country Status (31)

Country Link
US (4) US6653326B1 (sr)
EP (1) EP0801649B1 (sr)
JP (2) JP4531865B2 (sr)
KR (1) KR19980700976A (sr)
CN (1) CN1152871C (sr)
AT (1) ATE221880T1 (sr)
AU (1) AU720195B2 (sr)
BG (1) BG63944B1 (sr)
BR (1) BR9607565B1 (sr)
CA (1) CA2209167C (sr)
CZ (1) CZ295562B6 (sr)
DE (1) DE69622840T2 (sr)
DK (1) DK0801649T3 (sr)
EE (1) EE04239B1 (sr)
ES (1) ES2176502T3 (sr)
HR (1) HRP960508B1 (sr)
HU (1) HU222994B1 (sr)
IL (1) IL121126A (sr)
MX (1) MX9704988A (sr)
NO (1) NO321140B1 (sr)
NZ (1) NZ320523A (sr)
PL (1) PL195634B1 (sr)
PT (1) PT801649E (sr)
RS (1) RS49981B (sr)
RU (1) RU2206320C2 (sr)
SI (1) SI0801649T1 (sr)
SK (1) SK284823B6 (sr)
TR (1) TR199700574T1 (sr)
UA (1) UA61050C2 (sr)
WO (1) WO1997016439A1 (sr)
ZA (1) ZA969249B (sr)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUT78139A (hu) * 1995-12-22 2000-11-28 BIOREX Kutató és Fejlesztő Rt. Készítmény, különösen a bőr öregedési folyamatainak mérséklésére
UA64716C2 (en) * 1996-08-09 2004-03-15 Pharmaceuticals for therapy or prevention of illnesses connected with dysfunction of vascular endothelial cells
WO2000007580A2 (en) * 1998-08-03 2000-02-17 N-Gene Kutató Kft. Pharmaceutical compositions against autoimmune diseases
HU226617B1 (en) * 1998-12-14 2009-04-28 Cytrx Corp Optically active pyridyl-4h-1,2,4-oxadiazine derivatives, and pharmaceutical composition containing the compound as active ingredient
HUP9900475D0 (en) * 1999-02-26 1999-04-28 Biorex Kutato Fejlesztoe Kft O-(3-piperidino-2-hydroxy-1-propyl)-hiyroximic acid-halogenid derivative, it's use for treating insulin resistance, and pharmaceutical compositions containing them as active component
FR2792832B1 (fr) * 1999-04-28 2002-05-10 Codif Internat Sa Procede de protection de la peau pour la prevenir de son vieillissement cellulaire
HUP0001583A2 (hu) * 2000-04-18 2002-11-28 BIOREX Kutató és Fejlesztő Rt. Egy piridin-1-oxid-származék és eljárás annak átalakítására gyógyászati hatású vegyületekké
WO2003000861A2 (en) * 2001-06-22 2003-01-03 The Regents Of The University Of California Eukaryotic genes involved in adult lifespan regulation
HUP0105205A2 (hu) * 2001-11-29 2003-08-28 BIOREX Kutató és Fejlesztő Rt. Metformint és egy hidroxilaminszármazékot tartalmazó, gyógyászati készítmény
JP2005514418A (ja) * 2002-01-11 2005-05-19 ビオレックス クタトー エス フェイレストェー アールテー． カルボキサミジン誘導体及び血管疾患の治療におけるそれらの使用
DE602004022150D1 (de) * 2003-03-27 2009-09-03 Childrens Hosp Medical Center Verfahren und kit zum nachweis des frühstadiums einer nierentubuluszellenverletzung
HUP0303584A3 (en) 2003-10-30 2009-12-28 Cytrx Corp Use of a hydroximic acid halide derivative in the treatment of neurodegenerative diseases
BRPI0509799A (pt) * 2004-04-12 2007-11-13 Torrent Pharmaceuticals Ltd 2-propen-1-onas como indutores de hsp 70
US7786093B2 (en) * 2004-07-07 2010-08-31 Health Wellness Foods Corporation Antistress agent
FR2880022B1 (fr) * 2004-12-24 2007-08-24 Mayoly Spindler Soc Par Action Nouveaux derives de la n-hydroxy-n'-phenyluree et de la n-hydroxy-n'-phenylthiouree et leur utilisation comme inhibiteurs de la synthese de la melanine
WO2008039514A1 (en) * 2006-09-26 2008-04-03 Cytrx Corporation Pharmaceutical compositions and methods for treating diseases associated with neurodegeneration
MX2009005798A (es) * 2006-12-01 2009-08-12 Cytrx Corp Recuperacion de apoplejia.
TW200901958A (en) * 2007-05-04 2009-01-16 Cytrx Corp Diabetic wound healing
AU2008272437A1 (en) * 2007-06-29 2009-01-08 Torrent Pharmaceuticals Ltd. Novel substituted piperidones as HSP inducers
US8540985B2 (en) 2008-06-26 2013-09-24 Orphazyme Aps Use of Hsp70 as a regulator of enzymatic activity
KR101645937B1 (ko) * 2008-11-11 2016-08-08 (주)아모레퍼시픽 육음외사에 의한 피부 변화를 정량하는 방법 및 이를 이용한 피부 개선 물질의 스크리닝 방법
EP2356988A4 (en) * 2008-11-18 2012-05-09 Santen Pharmaceutical Co Ltd THERAPEUTIC FOR CHORIORETINAL DEGENERATION WITH PYRIDINE-3-CARBALDEHYDE O- (PIPERIDIN-1-YL-PROPYL) OXIM DERIVATIVE AS ACTIVE SUBSTANCE
US20110123473A1 (en) * 2009-11-26 2011-05-26 Basf Se Use of highly-branched polycarbonates in cosmetic and dermatological formulations
RU2013125923A (ru) 2010-11-30 2015-01-10 Орфазиме Апс СПОСОБЫ УВЕЛИЧЕНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ АКТИВНОСТИ Hsp70
KR101275264B1 (ko) 2011-08-24 2013-06-17 포항공과대학교 산학협력단 샤프로닌 단백질의 조절 물질 탐색 방법
HUP1100534A2 (en) 2011-09-26 2013-04-29 Balazs Dr Hazay Pharmaceutical composition for the treatment of muscle atrophy
HUP1100535A2 (en) 2011-09-26 2013-04-29 Bracelia Invest Ltd Pharmaceutical composition for enhancement of stem cell treatment
RU2495928C2 (ru) * 2012-01-30 2013-10-20 Сергей Юрьевич Лешков Средство для стимуляции синтеза белков теплового шока hsp 70 в клетках человека и животных; косметическое средство для стимуляции репаративных процессов; косметическое средство для снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур; биологически активная добавка; пищевой продукт; способ снижения побочных эффектов агрессивных косметологических процедур
US10709700B2 (en) 2014-09-15 2020-07-14 Orphazyme A/S Arimoclomol formulation
EP3442530A1 (en) 2016-04-13 2019-02-20 Orphazyme A/S Heat shock proteins and cholesterol homeostasis
KR20210059796A (ko) 2016-04-29 2021-05-25 오르파짐 에이/에스 글루코세레브로시다제 연관 장애를 치료하기 위한 아리모클로몰
WO2018215597A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Orphazyme A/S Heat shock protein inducers and frontotemporal disorders
CN108314630B (zh) * 2018-02-08 2020-11-06 广西民族大学 一种肟醚类衍生物及其制备方法与应用
KR20210015790A (ko) 2018-05-28 2021-02-10 오르파짐 에이/에스 질환의 바이오마커로서 pbmc 샘플에서 hsp70 단백질 수준
HUP1800298A1 (hu) 2018-08-30 2020-05-28 N Gene Res Laboratories Inc Gyógyszerkombináció béta-receptor blokkolók hatásának módosítására és a mellékhatások csökkentésére
CN110048418B (zh) * 2019-05-08 2023-03-24 辽宁工程技术大学 一种基于细胞-组织算法的微电网经济调度方法及装置
DK4171559T3 (da) 2020-06-24 2025-12-15 Zevra Denmark As Arimoclomol til behandling af Gauchers sygdom
CN112094878A (zh) * 2020-08-18 2020-12-18 周银根 一种二步酶提取香菇多糖的方法、香菇多糖提取物及其应用
KR20230128462A (ko) 2020-11-19 2023-09-05 제브라 덴마크 에이/에스 아리모클로몰 시트레이트 및 이의 중간체를 제조하기 위한 공정
WO2022136640A1 (en) 2020-12-24 2022-06-30 Orphazyme A/S Arimoclomol for the treatment of niemann pick disease, type c, in patients with er type missense mutations
AU2022354251A1 (en) * 2021-09-28 2024-04-04 Zevra Denmark A/S Dioxazines and their use in treatment of gba-related diseases

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HU177578B (en) * 1976-08-27 1981-11-28 Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet Process for preparing new 0-/3-amino-2-hydroxy-propyl/-amidoxime derivatives
DE2651083A1 (de) 1976-11-09 1978-05-18 Hoechst Ag Neue o-alkylierte hydroxylamine, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
HU207988B (en) 1988-10-20 1993-07-28 Biorex Kutato Fejlesztoe Kft Process for producing halogenides of o-/3-amino-2-hydroxy-propyl/hydroximic acid and pharmaceutical compositions containing them as active components
HUT54347A (en) 1989-01-10 1991-02-28 Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet Improved process for producing amidoximes
US5334600A (en) 1991-07-30 1994-08-02 Ciba-Geigy Corporation Isoquinolyl substituted hydroxylamine derivatives
HU216830B (hu) 1992-07-21 1999-09-28 BIOREX Kutató és Fejlesztő Rt., N-[2-Hidroxi-3-amino-propoxi]-amidok és -imidátok, valamint dioxazinok, eljárás ezek előállítására, és a vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények
US5919796A (en) * 1994-05-06 1999-07-06 Biorex Kutato Es Fejleszto Rt. Hydroximic acid derivatives, pharmaceutical compositions containing them, and processes for preparing the same
HU9502843D0 (en) * 1995-09-29 1995-11-28 Livigene Ltd Pharmaceutical composition

Also Published As

Publication number Publication date
ZA969249B (en) 1998-03-02
RU2206320C2 (ru) 2003-06-20
HUT76659A (en) 1997-10-28
ES2176502T3 (es) 2002-12-01
EP0801649A2 (en) 1997-10-22
PL195634B1 (pl) 2007-10-31
CA2209167A1 (en) 1997-05-09
PL322015A1 (en) 1998-01-05
BR9607565B1 (pt) 2011-08-23
US7148239B2 (en) 2006-12-12
HU222994B1 (hu) 2004-01-28
PT801649E (pt) 2002-12-31
WO1997016439A1 (en) 1997-05-09
KR19980700976A (sr) 1998-04-30
UA61050C2 (en) 2003-11-17
EP0801649B1 (en) 2002-08-07
US20100267711A1 (en) 2010-10-21
DK0801649T3 (da) 2002-12-02
BG101713A (en) 1998-03-31
EE9700146A (et) 1997-12-15
SK88197A3 (en) 1998-04-08
CA2209167C (en) 2009-05-19
CN1152871C (zh) 2004-06-09
JPH10512590A (ja) 1998-12-02
AU720195B2 (en) 2000-05-25
IL121126A0 (en) 1997-11-20
HRP960508A2 (en) 1998-06-30
HRP960508B1 (en) 2004-10-31
CN1177351A (zh) 1998-03-25
YU58796A (sh) 1999-09-27
AU7326396A (en) 1997-05-22
US7745465B2 (en) 2010-06-29
BR9607565A (pt) 1999-07-20
BG63944B1 (bg) 2003-07-31
ATE221880T1 (de) 2002-08-15
DE69622840D1 (de) 2002-09-12
SI0801649T1 (en) 2002-12-31
EE04239B1 (et) 2004-02-16
NO973059D0 (no) 1997-07-01
NO973059L (no) 1997-09-02
US20040019103A1 (en) 2004-01-29
IL121126A (en) 2002-07-25
HU9503141D0 (en) 1995-12-28
US20040067940A1 (en) 2004-04-08
JP2009108048A (ja) 2009-05-21
US6653326B1 (en) 2003-11-25
CZ207297A3 (cs) 1998-03-18
MX9704988A (es) 1998-07-31
TR199700574T1 (xx) 1999-08-23
CZ295562B6 (cs) 2005-08-17
DE69622840T2 (de) 2003-04-30
JP4531865B2 (ja) 2010-08-25
SK284823B6 (sk) 2005-12-01
NZ320523A (en) 2001-05-25
NO321140B1 (no) 2006-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS49981B (sr) Upotreba derivata hidroksilamina za dobijanje farmaceutskih kompozicija korisnih za povećanje ekspresije i aktivnosti molekulskih šaperona
US5731454A (en) Allosteric modifiers of hemoglobin useful for decreasing oxygen affinity and preserving oxygen carrying capability of stored blood
US5591892A (en) Allosteric modifiers of hemoglobin
JP2004532187A (ja) 三置換カルボサイクリックサイクロフィリン結合化合物とその用途
TW200904805A (en) Antibacterial agents
JPH11139969A (ja) 医薬組成物
ES2210872T5 (es) Acilguanidinas.
WO2020135569A1 (zh) 乙二胺类化合物及其用途
JPS63310820A (ja) ５−リポキシゲナーゼ阻害剤としてのフエノール　チオアルキルアミド化合物
DE69620175T2 (de) Hydroxylamin-derivate mit anti-ischämischer wirkung und pharmazeutische zusammensetzungen diese enthaltend
DE69107851T2 (de) Phenolische thioetheramide als 5-lipoxygenase-inhibitoren.
US8680125B2 (en) Fullerene therapies for inflammation
JPH11511121A (ja) カルコンレチノイドおよびその使用方法
DE69313535T2 (de) N-Benzoylaminosäurederivate, diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen und Verfahren zur deren Herstellung
US5189038A (en) Method of stimulating superoxide generation
US4435591A (en) Compound with analgesic, antiinflammatory and antipyretic activity, and pharmaceutical compositions therefrom
JP2010024203A (ja) 遺伝子発現増強剤およびそれを用いた遺伝子発現増強方法
JPH0517455A (ja) 新規な環状アミン化合物