PL195634B1

PL195634B1 - Zastosowanie pochodnych hydroksyloaminy do wytwarzania środka farmaceutycznego, pochodne hydroksyloaminy i środek farmaceutyczny je zawierający

Info

Publication number: PL195634B1
Application number: PL96322015A
Authority: PL
Inventors: Laszló Vigh; Nagy Péter Literati; Jeno Szilbereky; Laszló Ürögdi; Andrea Jednakovits; Laszló Jaszlits; Katalin Biró; Ede Marvanyos; Mihaly Barabas; Erzsébet Hegedüs
Original assignee: Biorex Kutato Fejlesztoe Kft
Priority date: 1995-11-02
Filing date: 1996-11-01
Publication date: 2007-10-31
Also published as: ZA969249B; RU2206320C2; HUT76659A; ES2176502T3; EP0801649A2; CA2209167A1; PL322015A1; BR9607565B1; US7148239B2; HU222994B1; PT801649E; WO1997016439A1; KR19980700976A; UA61050C2; EP0801649B1; US20100267711A1; DK0801649T3; BG101713A; EE9700146A; SK88197A3

Abstract

1. Zastosowanie pochodnych hydroksyloaminy do wy- twarzania srodka farmaceutycznego do zwi ekszania eks- presji cz asteczkowego bia lka opieku nczego eksprymowa- nego przez komórk e wystawion a na stres fizjologiczny ponad ilosc indukowan a przez stres fizjologiczny, przy czym jako pochodn a stosuje si e pochodn a hydroksyloami- ny, której postaci tautomeryczne przedstawiaj a wzory (I) i (II), albo jej sól i/lub dowolny optycznie czynny stereoizo- mer, przy czym w tautomerze o wzorze (I) a) gdy A oznacza pirydyl (ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku) Z oznacza wi azanie chemiczne; R oznacza CH 2 -CH(Y 6 )CH 2 -NR 5 R 6 albo CH 2 -C(Y 4 Y 5 )-CH 2 - NR 5 R 6 , gdzie NR 5 R 6 oznacza piperydynyl, ewentualnie pod- stawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku albo piperazynyl (ewentualnie podstawiony na atomie N C 1-4 alkilem); …………………………………….. PL PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są zastosowanie pochodnych hydroksyloaminy do wytwarzania środka farmaceutycznego, pochodne hydroksyloaminy i środek farmaceutyczny je zawierający.

Cząsteczkowe białka opiekuńcze są mediatorami fałdowania białek. Wiążą się one niekowalencyjnie z wyeksponowanymi powierzchniami białek świeżo zsyntetyzowanych albo zdenaturowanych lub nieprawidłowo pofałdowanych i ułatwiają ich pofałdowanie się w prawidłowej konformacji. Cząsteczkowe białka opiekuńcze odgrywają również rolę w szeregu procesów komórkowych, takich jak synteza białek, translokacja białek i replikacja DNA.

Do cząsteczkowych białek opiekuńczych należą białka szoku cieplnego będące białkami, których ekspresja w komórkach znacząco zwiększa się po narażeniu na nienormalnie podwyższoną temperaturę (szok cieplny) lub na działanie wielu różnych stresów fizjologicznych. Ten wzrost ekspresji cząsteczkowego białka opiekuńczego zapewnia z kolei komórce ochronę przed niekorzystnym wpływem hipertermii, czego dowodzi wykazywanie przez komórki odporności cieplnej na działanie temperatury, która normalnie byłaby zabójcza, po poddaniu tych komórek wstępnemu kondycjonowaniu poprzez krótkotrwałe oddziaływanie wysokiej temperatury.

Do stresów fizjologicznych wywołujących ekspresję białek szoku cieplnego należy wiele różnych stanów patologicznych związanych z wieloma chorobami. Synteza białek szoku cieplnego w komórkach wystawionych na takie stresy, wskazuje na istnienie ochrony komórki przed stresami fizjologicznymi, podobnie jak w przypadku reakcji na szok cieplny.

Jednym z takich stanów patologicznych związanych z indukowaniem cząsteczkowych białek opiekuńczych jest uszkodzenie wynikające z niedokrwienia. Takie niedokrwienne uszkodzenie tkanek wynika z pogorszenia się dopływu krwi z dowolnych możliwych powodów. Przykładowo przedłużające się zatkanie naczyń wieńcowych powoduje silne uszkodzenie mięśnia sercowego prowadzące do martwicy mięśnia sercowego, zmniejszające szansę przywrócenia normalnego działania nawet po przywróceniu przepływu krwi. W mózgu znaczące uszkodzenia mogą często być spowodowane niedokrwieniem prowadzącym do śmierci tkanki mózgowej.

Zaobserwowano, że ilość białek szoku cieplnego hsp70 w mięśniu sercowym zwiększa się w czasie niedokrwienia prowadzącego do martwicy nawet wówczas, gdy stan niedokrwienia trwa krótko. W takich przypadkach, podobnie jak przy szoku cieplnym, zwiększona zawartość hsp70 w komórkach chroni je przed konsekwencjami następnego niedokrwienia, które mogłoby bez tego doprowadzić do martwicy (D.K. Das i inni, Cardiovascular Res.: 578, 1993). Zaobserwowano to także w przypadku niedokrwienia wywołanego w hodowli komórek szczura. J. Clin. lnvest., 93: 759-767 (1994). Tak więc białka szoku cieplnego zsyntetyzowane w komórkach mięśnia sercowego zapewniają ochronę przed uszkodzeniami niedokrwiennymi.

Sytuacja w tkance mózgowej jest podobna, gdyż niedokrwienie mózgu powoduje wzrost ekspresji białek szoku cieplnego w tkance mózgowej. Doświadczalnie potwierdzono, że wstępne wywołanie subletalnego niedokrwienia u zwierząt indukuje ekspresję białka szoku cieplnego (hsp70), co chroni mózg przed następnymi silniejszymi atakami niedokrwiennymi (Simon i inni, Neurosci. Lett., 163: 135-137 (1993)).

Jeszcze inny przykład stresu fizjologicznego oddziaływującego na tkanki i narządy, związanego z indukowaniem cząsteczkowych białek opiekuńczych, stanowią choroby zapalne. Zapalenie stanowi nieswoistą reakcję komórek gospodarza na pojawienie się obcego materiału, jak to dzieje się w przypadku infekcji różnymi patogenami bakteryjnymi i wirusowymi, i w jego przebiegu występuje agregacja i uaktywnienie się leukocytów w miejscu uszkodzenia, co z kolei prowadzi do produkcji i uwalniania w duż ych iloś ciach reaktywnych substancji tlenowych i cytokin. Takie cytokiny i reaktywne rodniki tlenowe atakują patogen, lecz uszkadzają także tkanki gospodarza (Jaquier, Sarlin, Experientia, 50: 1031-1038 (1994)). Sądzi się, że w celu ochrony przed tymi toksycznymi mediatorami zapalenia tkanki gospodarza zwiększają produkcję cząsteczkowych białek opiekuńczych. Tak powstałe cząsteczkowe białka opiekuńcze chronią komórki gospodarza przed uszkodzeniem powodowanym przez reaktywne substancje tlenowe i chronią komórki przed cytotoksycznością TNF (czynnika martwicy nowotworu) i innych cytokin i reaktywnych rodników tlenowych. W badaniach na zwierzętach wykazano, że wstępne poddanie zwierzęcia szokowi cieplnemu wywołującemu wzrost ekspresji białka szoku cieplnego (hsp70) powoduje znaczące zmniejszenie zapalenia płuc. Tak więc cząsteczkowe białka opiekuńcze pełnią funkcję substancji przeciwzapalnych.

Powyższe przykłady ilustrują zdolność cząsteczkowych białek opiekuńczych do ochrony komórek przed różnymi stresami fizjologicznymi zakłócającymi homeostatyczną równowagę komórkową

PL 195 634 B1 i powodują cymi uszkodzenie komórek. Wykazano takż e, ż e czą steczkowe biał ka opiekuń cze odgrywają również korzystną rolę w leczeniu nowotworów. Doniesiono przykładowo, że jeśli przeprowadzi się transfekcję komórek nowotworowych genem kodującym cząsteczkowe białko opiekuńcze (hsp65 kD), ich rakotwórczość znika lub zostaje znacząco osłabiona (zgłoszenie międzynarodowe nr PCT/GB93/02339). Doniesiono ponadto, że komórki nowotworowe w reakcji na szok cieplny eksprymują w zwiększonej ilości cząsteczkowe białka opiekuńcze. Jednakże znajdują się one nie w cytoplazmie, lecz na powierzchni błon komórkowych (Ferrarini M. i inni, Int. J. Cancer, 51: 613-619 (1992)). Istnieje korelacja między obecnością cząsteczkowych białek opiekuńczych na powierzchniach komórek i zwiększoną wrażliwością NK (komórek zabójców) w stosunku do komórek nowotworowych, co ułatwia docieranie i wnikanie komórek NK do komórek nowotworowych i uśmiercanie ich przez komórki NK (Kurosawa S. i inni, Eur. J. Immunol. 23:1029 (1993)).

W świetle korzyści związanych ze zwiększoną ekspresją cząsteczkowych białek opiekuńczych w komórkach wysoce pożądany byłby sposób zwiększenia takiej ekspresji lub zwiększenia aktywności cząsteczkowych białek opiekuńczych.

W pierwszej postaci wynalazek dotyczy zastosowania zwią zku do wytwarzania ś rodka farmaceutycznego do zwiększania ekspresji cząsteczkowego białka opiekuńczego eksprymowanego przez komórkę wystawioną na stres fizjologiczny ponad ilość indukowaną przez stres fizjologiczny, przy czym jako związek chemiczny stosuje się pochodną hydroksyloaminy, której postaci tautomeryczne przedstawiają wzory (I) i (II), albo jej sól i/lub dowolny optycznie czynny stereoizomer, przy czym w tautomerze o wzorze (I)

a) gdy A oznacza pirydyl (ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku)

Z oznacza wiązanie chemiczne;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶ albo CH2-C(Y⁴Y⁵)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl, ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci

N-tlenku albo piperazynyl (ewentualnie podstawiony na atomie N C1-4-alkilem);

Y⁴, Y⁵ oznacza C1-4-alkil;

Y⁶ oznacza H, OH, O-acetyl, O-benzoil (ewentualnie podstawiony CF3, Cl, metoksylem), OCO-pirydynyl, O-furoil, O-palmitoil, O-tenoil;

X oznacza Cl, NR¹R² (gdzie R¹ i R² niezależnie oznaczają H albo C1-6-alkil, albo C3-8-cykloalkil), OC1-4-alkil;

b) gdy A oznacza fenyl (ewentualnie podstawiony Cl, CF3, grupą acetamidową, NO2, C1-4-alkilem)

Z oznacza wią zanie chemiczne, -NH-;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl albo R⁵, R⁶ oznaczają niezależnie H, C1-4-alkil, C3-8-cykloalkil;

Y⁶ oznacza H, OH;

X oznacza Cl, NR¹R² (R¹ i R² oznaczają niezależ nie H albo C1-6-alkil);

c) gdy A oznacza chinolil, furyl, izochinolil, pirolil (ewentualnie podstawiony dwoma grupami metylowymi), tienyl

Z oznacza wią zanie chemiczne;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl;

Y⁶ oznacza OH;

X oznacza Cl, NH2;

d) gdy A oznacza C1-20-alkil;

Z oznacza O;

X oznacza etoksyl;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl;

Y⁶ oznacza OH; a w tautomerze o wzorze (II)

e) gdy A oznacza fenyl (ewentualnie podstawiony Cl, CF3, NO2) albo naftyl

Z oznacza wią zanie chemiczne, NH;

X oznacza =O, =NPh;

R' oznacza H, Ph;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl albo R⁵, R⁶ oznaczają niezależnie H, C1-4-alkil;

Y⁶ oznacza H, OH;

PL 195 634 B1

f) gdy A oznacza C1-20-alkil, C3-8-cykloalkil

Z oznacza wiązanie chemiczne, O, NH, N(C1-6-alkil);

X oznacza =O, =NPh;

R' oznacza H, Me;

Y⁶ oznacza H, OH.

Korzystnie komórką eukariotyczną wystawioną na stres fizjologiczny jest komórka ssaka.

Korzystniej komórką ssaka jest komórka ludzka, a zwłaszcza komórka żywego organizmu.

Korzystnie komórką jest neuron, komórka mięśniowa, komórka ścianek naczyń, zwłaszcza komórka śródbłonka, komórka nabłonka albo komórka układu immunologicznego.

W szczególnej postaci stresem fizjologicznym jest stres metaboliczny, oksydacyjny lub miejscowy stres mechaniczny albo stres wywołany przez niedotlenienie, niedokrwienie, szok cieplny, promieniowanie lub materiały toksyczne, zwłaszcza stres wywołany przez cukrzycę.

W szczególnej postaci stres fizjologiczny powoduje wzrost iloś ci reaktywnych wolnych rodników lub cytokiny w przestrzeni otaczającej komórkę.

W szczególnej postaci stres fizjologiczny prowadzi do wystą pienia chorób ukł adu sercowonaczyniowego, chorób naczyń, chorób mózgu, alergii, chorób immunologicznych i chorób autoimmunologicznych, chorób pochodzenia wirusowego lub bakteryjnego, chorób nowotworowych, chorób skóry i/lub śluzówki lub chorób nabłonka kanalików nerwowych.

Zwłaszcza choroba układu sercowo-naczyniowego jest spowodowana miażdżycą tętnic, chorobą wieńcową, hipertonią lub hipertonią płucną wywołanymi przez stres fizjologiczny.

Zwłaszcza choroba mózgu jest spowodowana przez niedokrwienie naczyń mózgowych, udarem, urazem głowy, neurodegeneratywną chorobą starczą, zwłaszcza otępieniem starczym, otępieniem związanym z AIDS, otępieniem alkoholowym, chorobą Alzheimera, chorobą Parkinsona lub padaczką wywołanymi przez stres fizjologiczny.

Zwłaszcza choroba skóry i/lub śluzówki jest spowodowana dermatozą lub chorobą wrzodową układu żołądkowo-jelitowego wywołanymi przez stres fizjologiczny.

Korzystnie cząsteczkowym białkiem opiekuńczym jest białko szoku cieplnego (hsp), a zwłaszcza hsp70 lub hsp72.

Korzystnie stosuje się hydroksyloaminę o wzorze (I), w którym

Z oznacza wią zanie chemiczne;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶ gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl (ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku) albo piperazynyl (ewentualnie podstawiony na atomie N metylem);

X oznacza Cl, NR¹R² (R¹ i R² oznaczają niezależnie H albo C1-6-alkil, albo C3-8-cykloalkil), OC1-4-alkil;

b) gdy A oznacza fenyl (ewentualnie podstawiony Cl, CF3, grupą acetamidową, NO2, C1-4-alkilem), to

Z oznacza wią zanie chemiczne, -NH-;

Y⁶ oznacza H, OH;

X oznacza Cl, NR¹R² (R¹ i R² oznaczają niezależ nie H albo C1-6-alkil);

Z oznacza wią zanie chemiczne;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl;

Y⁶ oznacza OH;

X oznacza Cl, NH2;

d) gdy A oznacza C1-6-alkil, to

Z oznacza O;

X oznacza etoksyl;

PL 195 634 B1

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl;

Y⁶ oznacza OH.

Korzystniej Z oznacza wiązanie chemiczne, a A oznacza fenyl ewentualnie podstawiony C1-4-alkilem, trifluorometylem, grupą nitrową, grupą acetamidową lub Cl, tienyl, furyl lub pirolil ewentualnie podstawiony dwoma grupami metylowymi, pirydyl ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku, chinolil albo izochinolil, a zwł aszcza A oznacza fenyl ewentualnie podstawiony Cl, C1-4-alkilem, trifluorometylem lub grupą nitrową, tienyl, furyl albo pirolil ewentualnie podstawiony dwoma grupami metylowymi, pirydyl ewentualnie podstawiony metylem lub w postaci N-tlenku, chinolil albo izochinolil.

Korzystniej Z oznacza wiązanie chemiczne;

X oznacza C1-4-alkoksyl;

A oznacza tienyl, furyl albo pirolil ewentualnie podstawiony dwoma grupami metylowymi, pirydyl ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku, chinolil albo izochinolil, korzystnie pirolil ewentualnie podstawiony dwoma grupami metylowymi, pirydyl ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku, chinolil albo izochinolil.

Korzystniej Z oznacza wiązanie chemiczne;

X oznacza -NR¹R², gdzie R¹ i R² oznaczają niezależnie H, C1-6-alkil albo C3-8-cykloalkil; i

A oznacza pirydyl ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku.

Korzystnie pochodną hydroksyloaminy jest związek o wzorze (II), w którym

a) gdy A oznacza fenyl (ewentualnie podstawiony Cl, CF3, NO2) albo naftyl Z oznacza wią zanie chemiczne, NH;

X oznacza =O, =N-fenyl;

R' oznacza H, Me, fenyl;

Y⁶ oznacza H, OH; albo

b) gdy A oznacza C1-20-alkil, C3-8-cykloalkil

Z oznacza wiązanie chemiczne, O, NH, N(C1-6-alkil);

X oznacza =O, =N-fenyl;

R' oznacza H, Me;

Y⁶ oznacza H, OH.

Korzystniej Z oznacza wiązanie chemiczne;

X oznacza O;

R' oznacza H albo metyl; i

A oznacza fenyl ewentualnie podstawiony grupą nitrową lub Cl.

Korzystniej A oznacza fenyl ewentualnie podstawiony CF3.

Korzystniej Z oznacza wiązanie chemiczne;

X oznacza =N-fenyl;

R' oznacza metyl; i

A oznacza fenyl ewentualnie podstawiony grupą nitrową lub Cl.

Korzystniej Z oznacza O, X oznacza O, R' oznacza H lub metyl, i A oznacza prostołańcuchowy lub rozgałęziony C1-20-alkil.

Korzystniej Z oznacza O, X oznacza =N-fenyl, a R' oznacza metyl.

Korzystniej Z oznacza =NR³, gdzie R³ oznacza H lub metyl, X oznacza O, R' oznacza H, metyl, i A oznacza C1-20-alkil lub fenyl, a zwłaszcza A oznacza C4-12-alkil, fenyl ewentualnie podstawiony Cl, CF3 lub grupę nitrową.

Korzystnie Z oznacza =NR³, gdzie R³ oznacza H lub metyl;

X oznacza =N-fenyl;

R' oznacza metyl; i

A oznacza C1-20-alkil albo fenyl ewentualnie podstawiony grupą nitrową lub Cl.

W drugiej postaci wynalazek dotyczy zastosowania związku do wytwarzania środka farmaceutycznego do zwiększania aktywności cząsteczkowego białka opiekuńczego w komórce eukariotycznej wystawionej na stres fizjologiczny w stopniu wyższym niż indukowany przez stres fizjologiczny, przy czym jako ten związek chemiczny stosuje się pochodną hydroksyloaminy, której postaci tautomeryczne

PL 195 634 B1 przedstawiają wzory (I) i (II), albo jej sól i dowolny optycznie czynny stereoizomer, przy czym w tautomerze o wzorze (I)

Z oznacza wią zanie chemiczne;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶ albo CH2-C(Y⁴Y⁵)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl, ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku albo piperazynyl (ewentualnie podstawiony na atomie N C1-4-alkilem);

Y⁴, Y⁵ oznacza C1-4-alkil;

X oznacza Cl, NR¹R² (R¹ i R² oznaczają niezależ nie H albo C1-6-alkil, albo C3-8-cykloalkil), OC1-4-alkil;

Z oznacza wią zanie chemiczne, -NH-;

Y⁶ oznacza H, OH;

X oznacza Cl, NR¹R² (R¹ i R² oznaczają niezależ nie H albo C1-6-alkil);

Z oznacza wią zanie chemiczne;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl;

Y⁶ oznacza OH;

X oznacza Cl, NH2;

d) gdy A oznacza C1-20-alkil

Z oznacza O;

X oznacza etoksyl;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl;

Y⁶ oznacza OH; a w tautomerze o wzorze (II)

e) gdy A oznacza fenyl (ewentualnie podstawiony Cl, CF3, NO2) albo naftyl, to

Z oznacza wią zanie chemiczne, NH;

X oznacza =O, =NPh;

R' oznacza H, Ph;

Y⁶ oznacza H, OH;

f) gdy A oznacza C1-20-alkil, C3-8-cykloalkil, to

Z oznacza wiązanie chemiczne, O, NH, N(C1-6-alkil);

X oznacza =O, =NPh;

R' oznacza H, Me;

Y⁶ oznacza H, OH.

PL 195 634 B1

Korzystnie stosuje się hydroksyloaminę o wzorze (I), w którym

Z oznacza wią zanie chemiczne;

Z oznacza wią zanie chemiczne, -NH-;

Y⁶ oznacza H, OH;

X oznacza Cl, NR¹R² (R¹ i R² oznaczają niezależ nie H albo C1-6-alkil);

Z oznacza wią zanie chemiczne;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl;

Y⁶ oznacza OH;

X oznacza Cl, NH2;

d) gdy A oznacza C1-6-alkil, to

Z oznacza O;

X oznacza etoksyl;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl;

Y⁶ oznacza OH.

Korzystniej Z oznacza wiązanie chemiczne;

X oznacza C1-4-alkoksyl;

PL 195 634 B1

Korzystniej Z oznacza wiązanie chemiczne;

Korzystnie pochodną hydroksyloaminy jest związek o wzorze (II), w którym

X oznacza =O, =N-fenyl;

R' oznacza H, Me, fenyl;

Y⁶ oznacza H, OH; albo

b) gdy A oznacza C1-20-alkil, C3-8-cykloalkil

Z oznacza wiązanie chemiczne, O, NH, N(C1-6-alkil);

X oznacza =O, =N-fenyl;

R' oznacza H, Me;

Y⁶ oznacza H, OH.

Korzystniej Z oznacza wiązanie chemiczne;

X oznacza O;

R' oznacza H albo metyl; i

A oznacza fenyl ewentualnie podstawiony grupą nitrową lub Cl.

Korzystniej A oznacza fenyl ewentualnie podstawiony CF3.

Korzystniej Z oznacza wiązanie chemiczne;

X oznacza =N-fenyl;

R' oznacza metyl; i

A oznacza fenyl ewentualnie podstawiony grupą nitrową lub Cl.

Korzystniej Z oznacza O,

X oznacza O,

R' oznacza H lub metyl, i

A oznacza prostoł a ń cuchowy lub rozgałęziony C1-20-alkil.

Korzystniej Z oznacza O,

X oznacza =N-fenyl, a

R' oznacza metyl.

Korzystniej Z oznacza =NR³, gdzie R³ oznacza H lub metyl;

X oznacza =N-fenyl;

R' oznacza metyl; i

W trzeciej postaci wynalazek dotyczy zastosowania związku do wytwarzania ś rodka farmaceutycznego do leczenia choroby związanej z działaniem układu białek opiekuńczych lub związanej z uszkodzeniem bł on komórkowych lub organelli komórkowych, lub ewentualnie zapobiegania takiej chorobie, w którym jako ten związek chemiczny stosuje się pochodną hydroksyloaminy, której postacie tautomeryczne przedstawiają wzory (I) i (II), albo jej sól i/lub dowolny optycznie czynny stereoizomer, przy czym w tautomerze o wzorze (I)

Z oznacza wią zanie chemiczne;

Y⁴, Y⁵ oznacza C1-4-alkil;

PL 195 634 B1

Z oznacza wią zanie chemiczne, -NH-;

Y⁶ oznacza H, OH;

X oznacza Cl, NR¹R² (R¹ i R² oznaczają niezależ nie H albo C1-6-alkil);

Z oznacza wią zanie chemiczne;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl;

Y⁶ oznacza OH;

X oznacza Cl, NH2;

d) gdy A oznacza C1-20-alkil

Z oznacza O;

X oznacza etoksyl;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl;

Y⁶ oznacza OH; a w tautomerze o wzorze (II)

e) gdy A oznacza fenyl (ewentualnie podstawiony Cl, CF3, NO2) albo naftyl

Z oznacza wią zanie chemiczne, NH;

X oznacza =O, =NPh;

R' oznacza H, Ph;

Y⁶ oznacza H, OH;

f) gdy A oznacza C1-20-alkil, C3-8-cykloalkil

Z oznacza wiązanie chemiczne, O, NH, N(C1-6-alkil);

X oznacza =O, =NPh;

R' oznacza H, Me;

Y⁶ oznacza H, OH.

W szczególnej postaci stan patologiczny jest wybrany z grupy obejmującej niedokrwienie, chorobę nowotworową, infekcję spowodowaną przez patogeniczny mikroorganizm, chorobę autoimmunologiczną i dermatozę.

Korzystnie związek stosuje się do wytwarzania środka farmaceutycznego do ochrony mięśnia sercowego, tkanki mózgu i tkanki nerek przed uszkodzeniem tkanek i/lub nekrozą wywołaną niedokrwieniem, w którym związkiem chemicznym jest pochodna hydroksyloaminy, której postacie tautomeryczne przedstawiają wzory (I) i (II), albo jej sól i/lub dowolny optycznie czynny stereoizomer, przy czym A, Z, R i X mają powyżej podane znaczenie.

Korzystnie związek stosuje się do leczenia chorób mózgu, alergii, chorób immunologicznych, chorób autoimmunologicznych, chorób wywoływanych przez infekcje wirusowe lub bakteryjne, chorób skóry i/lub błony śluzowej lub komórek nabłonkowych kanalików nerkowych.

Korzystnie stosuje się hydroksyloaminę o wzorze (I), w którym

Z oznacza wią zanie chemiczne;

PL 195 634 B1

Z oznacza wią zanie chemiczne, -NH-;

Y⁶ oznacza H, OH;

X oznacza Cl, NR¹R² (R¹ i R² oznaczają niezależ nie H albo C1-6-alkil);

Z oznacza wią zanie chemiczne;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl;

Y⁶ oznacza OH;

X oznacza Cl, NH2;

d) gdy A oznacza C1-6-alkil, to

Z oznacza O;

X oznacza etoksyl;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl;

Y⁶ oznacza OH.

Korzystniej, Z oznacza wiązanie chemiczne;

X oznacza C1-4-alkoksyl;

Korzystniej Z oznacza wiązanie chemiczne;

Korzystnie pochodną hydroksyloaminy jest związek o wzorze (II), w którym a) gdy A oznacza fenyl (ewentualnie podstawiony Cl, CF3, NO2) albo naftyl Z oznacza wią zanie chemiczne, NH;

X oznacza =O, =N-fenyl;

R' oznacza H, Me, fenyl;

Y⁶ oznacza H, OH; albo

b) gdy A oznacza C1-20-alkil, C3-8-cykloalkil

Z oznacza wiązanie chemiczne, O, NH, N(C1-6-alkil);

X oznacza =O, =N-fenyl;

R' oznacza H, Me;

Y⁶ oznacza H, OH.

Korzystniej Z oznacza wiązanie chemiczne;

X oznacza O;

R' oznacza H albo metyl; i

A oznacza fenyl ewentualnie podstawiony grupą nitrową lub Cl.

Korzystniej A oznacza fenyl ewentualnie podstawiony CF3.

Korzystniej Z oznacza wiązanie chemiczne;

X oznacza =N-fenyl;

PL 195 634 B1

R' oznacza metyl; i

A oznacza fenyl ewentualnie podstawiony grupą nitrową lub Cl.

Korzystniej Z oznacza O, X oznacza =N-fenyl, a R' oznacza metyl.

Korzystniej Z oznacza =NR³, gdzie R³ oznacza H lub metyl;

X oznacza =N-fenyl;

R' oznacza metyl; i

W czwartej postaci wynalazek dotyczy pochodnej hydroksyloaminy o wzorze (I), w którym a) X oznacza Cl;

Z oznacza wią zanie chemiczne;

A oznacza grupę o wzorze (a), gdzie Y¹ oznacza trifluorometyl, grupę nitrową , i n oznacza 1, albo furyl, tienyl, pirydyl, chinolil lub izochinolil, korzystnie pirydyl, chinolil lub izochinolil; i

R oznacza grupę o wzorze (b), gdzie k i m oznaczają 1, R⁵ i R⁶ niezależnie oznaczają C1-C8-alkil, korzystnie C1-C4-alkil, C3-C8-cykloalkil, albo R⁵ i R⁶ wraz z sąsiadującym atomem N, tworzą pierścień piperydynowy ewentualnie podstawiony na atomie N C1-6-alkilem i ewentualnie w postaci N-tlenku, Y⁶ oznacza -OR⁷, gdzie R⁷ oznacza H albo C1-16-alkanoil, albo benzoil, z tym, ż e gdy A oznacza pirydyl lub grupę o wzorze (a), gdzie Y¹ oznacza Cl, to wówczas R⁷ ma znaczenie inne niż H, lub

b) X oznacza -NR¹R², gdzie R¹ i R² niezależnie oznaczają H albo C1-6-alkil;

A oznacza fenyl;

Z oznacza =NH; i

R oznacza grupę o wzorze (b), gdzie R⁵ i R⁶ niezależnie oznaczają H albo C1-C8-alkil, korzystnie C1-C4-alkil, albo R⁵ i R⁶ wraz z sąsiadującym atomem N, tworzą pierścień piperydynowy, Y⁶ oznacza -OH, k oznacza 1, i m oznacza 1, lub

c) X oznacza -OQ, gdzie Q oznacza C1-6-alkil;

A oznacza C1-6-alkil;

Z oznacza O; i

R oznacza grupę o wzorze (b), gdzie R⁵ i R⁶ wraz z są siadującym atomem N, tworzą pierścień piperydynowy, Y⁶ oznacza -OH, k oznacza 1, i m oznacza 1.

Korzystnie A oznacza grupę o wzorze (a), a Y¹ oznacza trifluorometyl.

W pią tej postaci wynalazek dotyczy pochodnej hydroksyloaminy o wzorze (I), w którym

X oznacza -NR¹R², gdzie R¹ i R² niezależnie oznaczają H, C1-6-alkil albo C3-C8-cykloalkil;

A oznacza fenyl ewentualnie podstawiony 1-3 grupami wybranymi z grupy obejmują cej C1-6-alkil, korzystnie C1-C4-alkil, trifluorometyl i grupę nitrową, lub pirolil, pirydyl chinolil albo izochinolil, korzystnie pirolil, pirydyl, izochinolil, lub chinolil;

Z oznacza wią zanie chemiczne; i

R oznacza grupę o wzorze (e), gdzie R⁵ i R⁶ niezależnie oznaczają H, C1-8-alkil, korzystnie C1-C4-alkil, lub C3-C8-cykloalkil, lub R⁵ i R⁶ wraz z sąsiadującym atomem N, tworzą pierścień piperydyny lub piperazyny ewentualnie podstawiony na atomie N C1-6-alkilem, Y⁴ oznacza H lub C1-C4-alkil, Y⁵ oznacza H lub C1-C4-alkil, lub -OR⁷, gdzie R⁷ oznacza H lub C1-16-alkanoil, lub benzoli;

k oznacza 1, i m oznacza 1, z tym, ż e gdy R⁷ oznacza H, to wówczas co najmniej jeden z podstawników R¹ i R² ma znaczenie inne niż H, i gdy R¹ i R² oznaczają H, to wówczas R⁷ ma znaczenie inne niż H.

W szóstej postaci wynalazek dotyczy pochodnej hydroksyloaminy o wzorze (II), w którym a) X oznacza O;

A oznacza C1-C20-alkil, fenyl ewentualnie podstawiony CF3, korzystnie fenyl;

Z oznacza wią zanie chemiczne;

R' oznacza H;

PL 195 634 B1

R oznacza grupę o wzorze (b), gdzie R⁵ i R⁶ niezależ nie oznaczają H, C1-8-alkil, korzystnie C1-4-alkil, albo R⁵ i R⁶ wraz z sąsiadującym atomem N, tworzą pierścień piperydynowy, Y⁶ oznacza H albo -OR⁷, gdzie R⁷ oznacza H, k oznacza 1, i m oznacza 1, z tym, ż e gdy A ma znaczenie inne niż alkil i R' oznacza H, to wówczas Y⁶ oznacza H, lub b) X oznacza =NR⁴, gdzie R⁴ oznacza fenyl;

A oznacza fenyl;

Z oznacza wią zanie chemiczne;

R' oznacza fenyl; i

R oznacza grupę o wzorze (b), gdzie R⁵ i R⁶ wraz z są siadującym atomem N, tworzą pierścień piperydynowy, Y⁶ oznacza -OR⁷, gdzie R⁷ oznacza H, k oznacza 1, i m oznacza 1.

W siódmej postaci wynalazek dotyczy środka farmaceutycznego do leczenia chorób układu sercowo-naczyniowego, chorób naczyń, chorób mózgu, alergii, chorób immunologicznych i chorób autoimmunologicznych, chorób na tle infekcji wirusowej lub bakteryjnej, chorób nowotworowych oraz chorób skóry lub śluzówki, zawierającego substancję czynną oraz farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i substancje pomocnicze, charakteryzującego się tym, że jako substancję czynną zawiera w iloś ci 0,5 - 99,5% wagowych pochodną hydroksyloaminy o wzorze (I), w którym

a) X oznacza Cl;

Z oznacza wią zanie chemiczne;

A oznacza grupę o wzorze (a), gdzie Y¹ oznacza trifluorometyl, grupę nitrową, i n oznacza 1, albo furyl, tienyl, pirydyl, chinolil lub izochinolil, korzystnie pirydyl, chinolil lub izochinolil; i

R oznacza grupę o wzorze (b), gdzie k i m oznaczają 1, R⁵ i R⁶ niezależnie oznaczają C1-C8-alkil, korzystnie C1-C4-alkil, C3-C8-cykloalkil, albo R⁵ i R⁶ wraz z sąsiadującym atomem N, tworzą pierścień piperydynowy ewentualnie podstawiony na atomie N C1-6-alkilem i ewentualnie w postaci N-tlenku, Y⁶ oznacza -OR⁷, gdzie R⁷ oznacza H albo C1-16-alkanoil, albo benzoli, z tym, ż e gdy A oznacza pirydyl lub grupę o wzorze (a), gdzie Y¹ oznacza Cl, to wówczas R⁷ ma znaczenie inne niż H, lub

A oznacza fenyl;

Z oznacza =NH; i

c) X oznacza -OQ, gdzie Q oznacza C1-6-alkil;

A oznacza C1-6-alkil;

Z oznacza O; i

W ósmej postaci wynalazek dotyczy środka farmaceutycznego do leczenia chorób układu sercowo-naczyniowego, chorób naczyń, chorób mózgu, alergii, chorób immunologicznych i chorób autoimmunologicznych, chorób na tle infekcji wirusowej lub bakteryjnej, chorób nowotworowych oraz chorób skóry lub śluzówki, zawierającego substancję czynną oraz farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i substancje pomocnicze, charakteryzującego się tym, że jako substancję czynną zawiera w ilości 0,5 - 99,5% wagowych pochodną hydroksyloaminy o wzorze (I), w którym

A oznacza fenyl ewentualnie podstawiony 1-3 grupami wybranymi z grupy obejmującej C1-6-alkil, korzystnie C1-C4-alkil, trifluorometyl i grupę nitrową, lub pirolil, pirydyl chinolil albo izochinolil, korzystnie pirolil, pirydyl, izochinolil, lub chinolil;

Z oznacza wią zanie chemiczne; i

R oznacza grupę o wzorze (e), gdzie R⁵ i R⁶ niezależnie oznaczają H, C1-8-alkil, korzystnie C1-C4-alkil, lub C3-C8-cykloalkil, lub R⁵ i R⁶ wraz z sąsiadującym atomem N, tworzą pierścień piperydyny lub piperazyny ewentualnie podstawiony na atomie N C1-6-alkilem, Y⁴ oznacza H lub C1-C4-alkil, Y⁵ oznacza H lub C1-C4-alkil, lub -OR⁷, gdzie R⁷ oznacza H lub C1-16-alkanoil, lub benzoil;

PL 195 634 B1

W dziewią tej postaci wynalazek dotyczy ś rodka farmaceutycznego do leczenia chorób ukł adu sercowo-naczyniowego, chorób naczyń, chorób mózgu, alergii, chorób immunologicznych i chorób autoimmunologicznych, chorób na tle infekcji wirusowej lub bakteryjnej, chorób nowotworowych oraz chorób skóry lub śluzówki, zawierającego substancję czynną oraz farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i substancje pomocnicze, charakteryzującego się tym, że jako substancję czynną zawiera w iloś ci 0,5 - 99,5% wagowych pochodną hydroksyloaminy o wzorze (II), w którym

a) X oznacza O;

A oznacza C1-C20-alkil, fenyl ewentualnie podstawiony CF3, korzystnie fenyl;

Z oznacza wią zanie chemiczne;

R' oznacza H;

R oznacza grupę o wzorze (b), gdzie R⁵ i R⁶ niezależnie oznaczają H, C1-8-alkil, korzystnie C1-4-alkil, albo R⁵ i R⁶ wraz z sąsiadującym atomem N, tworzą pierścień piperydynowy, Y⁶ oznacza H albo -OR⁷, gdzie R⁷ oznacza H, k oznacza 1, i m oznacza 1, z tym, ż e gdy A ma znaczenie inne niż alkil i R' oznacza H, to wówczas Y⁶ oznacza H, lub b) X oznacza =NR⁴, gdzie R⁴ oznacza fenyl;

A oznacza fenyl;

Z oznacza wią zanie chemiczne;

R' oznacza fenyl; i

Wynalazek jest oparty, co najmniej w części, na nieoczekiwanym odkryciu, że pochodne hydroksyloaminy o budowie określonej powyżej, użyte do traktowania komórek, są zdolne do zwiększania ilości cząsteczkowych białek opiekuńczych wytwarzanych przez komórki lub do wzmagania ich aktywności. Działanie to jest szczególnie silne, gdy komórka znajduje się pod działaniem stresu fizjologicznego wywołującego ekspresję cząsteczkowych białek opiekuńczych. W takich przypadkach związek chemiczny wzmaga ekspresję cząsteczkowych białek opiekuńczych w komórce ponad ilość indukowaną przez sam stres fizjologiczny. Jest to znaczące odkrycie w świetle roli, jaką odgrywają cząsteczkowe białka opiekuńcze w bronieniu się samych komórek przed patologicznymi skutkami różnych chorób. Tak więc jeśli jakiś związek będzie mógł zwiększyć ilość lub wzmóc aktywność cząsteczkowych białek opiekuńczych eksprymowanych przez komórki, umożliwi to komórkom ochronę przed szkodliwym oddziaływaniem chorób i naprawę spowodowanych przez nie uszkodzeń.

Krótki opis figur

Figura 1 przedstawia zmiany w poziomie hsp w poddanym szokowi cieplnemu mięśniu sercowym szczura H9c2, wywołane zastosowaniem maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu. Związek ten oznaczono jako B na figurach i dalej nazywa się go związkiem B.

Figura 2 przedstawia wyniki powyższego doświadczenia uzyskane w analizie metodą blottingu western, oparte na ocenie densytometrycznej.

Figura 3 przedstawia wyniki analizy hsp70 mRNA metodą blottingu northern, uzyskane podczas badania wpływu związku B na ekspresję hsp w komórkach na poziomie transkrypcyjnym.

Figura 4 przedstawia wyniki analizy hsp26 mRNA metodą blottingu northern, uzyskane dla komórek Saccharomyces cerevisiae podczas badania wpływu związku B na aktywację hsp.

Figura 5 przedstawia wpływ alkoholu benzylowego na aktywację cyklazy adenylanowej i stan błon plazmatycznych.

Figura 6 przedstawia szybkość ekspresji genu hsp w komórkach HeLa w teście z użyciem lucyferazy jako genu reporterowego.

Figura 7 przedstawia wpływ związku B na ekspresję hsp72 na powierzchni komórek linii K562.

Figura 8 przedstawia współoddziaływanie związku B z różnymi błonami lipidowymi wykazujące wzrost ciśnienia powierzchniowego.

Figura 9 przedstawia wpływ związku B w stężeniu 10 mM i 100 mM na przejście fazowe biwarstwa (La) faza heksagonalna (H_II) dla dużych jednowarstewkowych pęcherzyków wytworzonych z dipalmitoilo-fosfatydyloetanoloaminy.

Figura 10 przedstawia diagram wpływu związku B na poziom TNF w surowicy u szczurów zdrowych i szczurów z cukrzycą STZ.

Figura 11 przedstawia działanie związku B przeciw działaniu cykloheksyimidu hamującemu wzrost keratynocytów.

PL 195 634 B1

Figura 12 przedstawia działanie związku B przeciw działaniu cykloheksyimidu uszkadzającemu komórki śródbłonka.

Figura 13 przedstawia cytoochronne działanie związku B przeciw działaniu cykloheksyimidu uszkadzającemu komórki linii HeLa.

Figura 14 przedstawia działanie związku B przeciw działaniu cykloheksyimidu hamującemu wzrost komórek mięśnia sercowego szczura H9c2.

Figura 15 przedstawia wpływ związku B na aktywność czynnika transkrypcji P1 w komórkach drożdży AB 1380.

Figura 16 przedstawia wpływ związku B na aktywność czynnika transkrypcji AP1 w komórkach drożdży JF1.

Figura 17 przedstawia wpływ związku B na aktywność czynnika transkrypcji P1 w komórkach drożdży AB 1380.

Figura 18 przedstawia wyniki testu uzyskane na modelu wyizolowanego funkcjonującego serca szczura z niedokrwieniem, w którym ten model poddano działaniu związku B, uzyskane metodą blottingu western w 2 godziny po niedokrwieniu.

Figura 19 przedstawia wyniki testu uzyskane na modelu wyizolowanego funkcjonującego serca szczura z niedokrwieniem, w którym model poddano działaniu związku B, uzyskane metodą blottingu western w 3 godziny po niedokrwieniu.

Figura 20 przedstawia gojenie się rany u szczurów z cukrzycą STZ po szoku cieplnym, leczonej kremem zawierającym 1% związku B.

Figura 21 przedstawia gojenie się rany u szczurów z cukrzycą STZ po szoku cieplnym, leczonej kremem zawierającym 2% związku B.

Figura 22 przedstawia gojenie się rany u szczurów z cukrzycą STZ po szoku cieplnym, leczonej kremem zawierającym 4% związku B.

Figura 23 przedstawia gojenie się rany u szczurów z cukrzycą STZ po szoku cieplnym, leczonej kremem zawierającym 1% związku B, lecz oceniane wzrokowo.

Figura 24 przedstawia gojenie się rany u szczurów z cukrzycą STZ po szoku cieplnym, leczonej kremem zawierającym 2% związku B, lecz oceniane wzrokowo.

Figura 25 przedstawia gojenie się rany u szczurów z cukrzycą STZ po szoku cieplnym, leczonej kremem zawierającym 4% związku B, lecz oceniane wzrokowo.

Figura 26 przedstawia porównawcze fotografie (rana leczona i kontrolna) z powyższych testów, wykonane techniką cyfrowej mikroskopii epiluminescencyjnej.

Figura 27 przedstawia wartości poziomu hsp72 w próbkach uzyskanych w powyższych testach, oznaczone metodą blottingu western przy leczeniu kremami zawierającymi 1, 2 i 4% związku B.

Figura 28 przedstawia wartości poziomu hsp72 oznaczone metodą analizy immunohistochemicznej (zwierzęta leczone i kontrolne) u myszy SCID poddanych działaniu promieniowania UV-B, leczonych związkiem B.

Figura 29 przedstawia oznaczone metodą blottingu western wartości poziomu hsp72 w próbkach z biopsji skóry myszy SCID poddanych działaniu promieniowania UV-B, leczonych związkiem B.

Określenie „alkil” oznacza proste lub rozgałęzione grupy alkilowe o krótkich lub długich łańcuchach.

Typowa liczba atomów węgla w korzystnych krótkołańcuchowych grupach alkilowych wynosi 1-8, zatem może to być metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, izobutyl, sec-butyl, pentyl, t-pentyl, heksyl, heptyl, oktyl itp., a jeszcze korzystniej 1-6, zatem może to być metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, izobutyl, sec-butyl, pentyl, t-pentyl i heksyl.

Typowa liczba atomów węgla w korzystnych długołańcuchowych grupach alkilowych wynosi 9-21, zatem może to być nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, heksadecyl, heptadecyl, oktadecyl, nonadecyl, ejkozyl, henejkozyl itp., a jeszcze korzystniej 9-17, zatem może to być nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, heksadecyl i heptadecyl.

Korzystny cykloalkil stanowi grupa cykloalkilowa o małym pierścieniu cykloalkilowym zawierającym 3-8 atomów węgla, taka jak cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cykloheksyl, cykloheptyl, cyklooktyl itp., a jeszcze korzystniej 3-7, zatem może to być cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cykloheksyl lub cykloheptyl.

Korzystny acyl, samoistnie lub jako część grupy zacylowanej, stanowi acyl będący krótkołańcuchowym alkanoilem (takim jak formyl, acetyl, propionyl, butyryl itp.), krótkołańcuchowym alkoksykarbonylem (takim jak metoksykarbonyl, etoksykarbonyl, propoksykarbonyl, butoksykarbonyl, tert-butoksykarbonyl itp.), krótkołańcuchowym alkilosulfonylem (takim jak metylosulfonyl, etylosulfonyl itp.),

PL 195 634 B1 arylosulfonylem (np. fenylosulfonylem itp.), aroilem (takim jak benzoli, naftoil itp.), arylo-(krótkołańcuchowym alkanolilem) (takim jak fenyloacetyl, fenylopropionyl itp.), cyklo(krótkołańcuchowo-alkilo)-(krótkołańcuchowo-alkanoilem) (takim jak cykloheksyloacetyl itp.), arylo-(krótkołancuchowo alkoksy)karbonylem (takim jak benzyloksykarbonyl itp.), arylokarbamoilem (takim jak fenylokarbamoil, naftylokarbamoil itp.), cykloalkilokarbamoilem (takim jak cykloheksylokarbamoil itp.), względnie heteromonocyklicznym-sulfonylem (takim jak tienylosulfonyl, furylosulfonyl itp.), przy czym ten acyl może być ewentualnie podstawiony 1-3 podstawnikami określonymi powyżej jako „ewentualne podstawniki”.

W razie potrzeby wolne zasady o wzorach (I) i (II) moż na przekształ cić w sole addycyjne z kwasami, w reakcji z kwasami organicznymi, zatem będą one tworzyć octany, maleiniany itp., lub w reakcji z kwasami nieorganicznymi, zatem b ę d ą one tworzyć chlorowodorki, bromowodorki, jodowodorki, siarczany, fosforany itp., bądź też w reakcji z aminokwasami, zatem będą one tworzyć sole argininy, sole kwasu glutaminowego itp.

Pewne typy pochodnych hydroksyloaminy o wzorze (I), zawierających wiązanie kowalencyjne jako Z i atom chlorowca jako X, ujawniono w US 5147879, US 5328906 i US 5296606. Związki te można wytwarzać sposobami podanymi w tych opisach patentowych, korzystnie przez diazowanie odpowiednich pochodnych, w których X = NH2, w obecności odpowiedniego chlorowcowodorku. Wyjściowe związki można wytwarzać znanymi sposobami opisanymi np. w węgierskim opisie patentowym nr 177578 (1976), a konkretnie przez sprzęganie amidoksymu o wzorze 1 (R¹ = R² = H) np. z reaktywną pochodną o wzorze 2 w obecności zasady, przy czym diazowanie można zazwyczaj prowadzić bez wydzielania lub oczyszczania. Końcowe grupy A i R w związkach można w zależności od potrzeb amidować lub przekształcać w pochodne.

Pochodne hydroksyloaminy o wzorze (I) mające wiązanie kowalencyjne jako Z i OQ jako X ujawniono w węgierskim zgłoszeniu patentowym nr 2385/1992. Związki te można wytworzyć z odpowiednich chlorowcowanych pochodnych hydroksyloaminy o wzorze (I), w którym Z oznacza wiązanie kowalencyjne, a X oznacza atom chlorowca, sposobem opisanym w węgierskim zgłoszeniu patentowym nr 2385/1992, np. drogą reakcji z alkoholanami albo zamknięcia pierścienia w warunkach zasadowych w przypadku cyklicznych związków o wzorze (I').

Do pochodnych hydroksyloaminy o wzorze (I) zawierających wiązanie kowalencyjne jako Z i NR¹R² jako X należą zarówno znane, jak i nowe pochodne. Zwią zki, w których X oznacza NH2, ujawniono w węgierskim opisie patentowym nr 177578 (1976), przy czym można je wytwarzać przez alkilowanie niepodstawionych pochodnych amidoksymowych o wzorze 1 (wzór 1, w którym R¹=R²=H), z reaktywną pochodną o wzorze 2, w obecności zasady.

Specjalna grupa pochodnych hydroksyloaminy o wzorze (I), w którym Z oznacza wiązanie kowalencyjne, a X oznacza NR¹R², przedstawiona jest wzorem (I). Wzór (I) przedstawia cykliczną postać związku o wzorze (I), będącą pierścieniem zamkniętym poprzez grupę NR¹R². Związki takie można otrzymać ze związków o wzorze (I), w którym R² oznacza H, a R oznacza CH2-CH(OH)-R. R może oznaczać liniowy lub rozgałęziony alkil lub podstawiony liniowy lub rozgałęziony alkil.

Związki o wzorze (I) można wytwarzać przez zamknięcie pierścienia pomiędzy atomami N(4) i C(5). Pożądanymi pochodnymi z otwartym ł a ń cuchem są zwią zki o wzorze (I), w którym Z oznacza wiązanie kowalencyjne, X oznacza grupę =NR¹R², w której R¹ ma znaczenie podane dla związków o wzorze (I), R² oznacza H, a R oznacza grupę o wzorze -CH2-CHY⁵-R, w której Y⁵ oznacza grupę ulegającą odszczepieniu, np. atom chlorowca. Pochodne takie można otrzymać z odpowiednich związków, w których Y⁵ = OH, w reakcji z nieorganicznymi środkami chlorowcującymi, np. z chlorkiem tionylu lub pentachlorkiem fosforu. Chlorowcowanie można prowadzić bez rozpuszczalnika lub w obojętnym rozpuszczalniku, np. w benzenie, chloroformie, tetrahydrofuranie itp., zazwyczaj w temperaturze wrzenia. Po usunięciu nadmiaru reagentu, np. przez odparowanie chlorku tionylu, surową pochodną chlorowcową cyklizuje się, po wydzieleniu lub oczyszczeniu lub bez wydzielania, przez działanie mocną zasadą, np. butanolanem potasowym w t-butanolu, z wytworzeniem związku o wzorze (I), który na koniec wydziela się i oczyszcza znanymi sposobami (np. przez ekstrakcję, rekrystalizację itp.).

Pochodne hydroksyloaminy o wzorze (I), w którym Z oznacza atom tlenu, a X oznacza grupę OQ, można wytwarzać w reakcji O-podstawionych hydroksyloamin o wzorze 6 (patrz np. DE nr 2651083 (1976)) z ortoestrami o wzorze 7. Kondensację zazwyczaj prowadzi się w samym reagencie jako rozpuszczalniku, korzystnie we wrzeniu. Po odparowaniu produkt wydziela się przez krystalizację, czasami (gdy w bocznym łańcuchu R znajduje się funkcyjna grupa aminowa) w postaci soli addycyjnej z kwasem.

PL 195 634 B1

Pochodne hydroksyloaminy o wzorze (I), w którym Z oznacza atom tlenu, a X oznacza grupę NR¹R² można wytwarzać sposobami opisanymi poniżej, przy czym sposoby te zależą do charakteru X, a mianowicie od tego, czy X oznacza niepodstawioną grupę aminową (NH2), czy też podstawioną grupę aminową.

(i) Związki, w których X oznacza NH2, można wytworzyć dodawszy hydroksyloaminy o wzorze 6 do cyjanianu organicznego o wzorze A-O-CN (patrz np. Chem. Ber. 98, 144 (1965)). Reakcję korzystnie prowadzi się w obojętnym rozpuszczalniku organicznym, zwykle w temperaturze pokojowej. Wydzielanie często wymaga oczyszczania chromatograficznego.

(ii) Związki, w których X oznacza monopodstawioną grupę aminową (czyli NHR¹), wytwarza się ze znanych chlorowcoformimidanów o wzorze 9 (patrz np. Houben-Weil, „Methoden der Organischen Chemie”, Band E/4, str. 544 (1983) i związku o wzorze 6, w obecności zasady organicznej (np. trietyloaminy) lub zasady nieorganicznej, takiej jak węglan sodowy, w obojętnym rozpuszczalniku, takim jak benzen, tetrahydrofuran itp., po czym prowadzi się zwykłą obróbkę i oczyszczanie.

(iii) Pochodne, w których X oznacza dipodstawioną grupę aminową, wytwarza się w reakcji drugorzędowej aminy o wzorze 5 ze związkiem o wzorze I, w którym Z oznacza atom tlenu, a X oznacza grupę OQ (wytwarzanie tych pochodnych opisano powyżej). Takie reakcje aminowania prowadzi się w polarnych rozpuszczalnikach organicznych, np. w etanolu, w razie potrzeby w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin.

Pochodne hydroksyloaminy o wzorze (I), w którym Z oznacza NR³, a X oznacza NR¹R², można wytworzyć drogą aminolizy odpowiednich pochodnych izomocznikowych należących do grupy związków opisanych powyżej (ta grupa odpowiada pochodnym hydroksyloaminy o wzorze (I), w którym Z oznacza atom tlenu, a X oznacza NR¹R²) z uż yciem amoniaku albo pierwszorzę dowej lub drugorzę dowej aminy. Reakcję prowadzi się korzystnie w rozpuszczalniku polarnym, np. wodzie lub etanolu, z użyciem nadmiaru aminy. Alternatywnie chlorowcoformamidy o wzorze 10 (Houben-Weil, „Methoden der Organischen Chemie”, Band E/4, str. 553 (1983)) można poddać reakcji ze związkiem o wzorze 6 w obecności zasady organicznej lub nieorganicznej, również z wytworzeniem związków z tej grupy. Reakcję prowadzi się w obojętnym rozpuszczalniku organicznym, zwykle w temperaturze pokojowej.

Związki, w których R oznacza grupę o wzorze (b), w którym R⁷ oznacza acyl, wytwarza się drogą estryfikacji odpowiednich związków, w których R⁷ oznacza atom wodoru. Estry alkilowe i arylowe wytwarza się zazwyczaj z użyciem chlorku kwasowego lub bezwodnika kwasu w obecności trzeciorzędowej aminy lub zasady nieorganicznej, korzystnie w obojętnym rozpuszczalniku.

Związki, pochodne hydroksyloaminy o wzorze (II), w którym Z oznacza wiązanie kowalencyjne, a X oznacza atom tlenu, ujawniono w wę gierskim zgł oszeniu patentowym nr 2385/1992. Opisano tam sposoby ich wytwarzania, przy czym najkorzystniej wytwarza się je drogą acylowania O-podstawionych pochodnych hydroksyloaminy o wzorze 6 (patrz także DE nr 2651083 (1976)) z użyciem chlorku kwasowego o wzorze 11. Ten sposób można zastosować także w celu wytworzenia tych nowych pochodnych, w których R' ma znaczenie inne niż atom wodoru, przy czym wówczas jako związek wyjściowy stosuje się związek o wzorze 12 zamiast związku o wzorze 6.

Pochodne hydroksyloaminy o wzorze (II), w którym Z oznacza wiązanie chemiczne, X oznacza NR⁴, można wytworzyć albo drogą O-alkilowania N,N'-dipodstawionego amidoksymu o wzorze 13 z użyciem związku chemicznego o wzorze 2 (w warunkach reakcji podanych w odniesieniu do wytwarzania związków o wzorze (I), w którym Z oznacza wiązanie kowalencyjne, a X oznacza NR¹R²), albo drogą O-acylowania N,O-dipodstawionej hydroksyloaminy o wzorze 12 z użyciem halogenku imidoilu o wzorze 16, przy czym reakcję prowadzi się w obojętnym rozpuszczalniku, korzystnie w obecności organicznego lub nieorganicznego akceptora kwasu.

Pochodne hydroksyloaminy o wzorze (II), w którym Z oznacza atom tlenu i X oznacza atom tlenu, ujawniono w węgierskim zgłoszeniu patentowym nr 1756/95 (złożonym 15 czerwca 1995 r.). Wytwarza się je przez acylowanie hydroksyloaminy o wzorze 6 lub o wzorze 12 z użyciem chloromrówczanu o wzorze 14, podobnie jak w reakcji z prostymi chlorkami kwasowymi, jak to opisano w odniesieniu do wytwarzania związków o wzorze (II), w którym Z oznacza wiązanie kowalencyjne, a X oznacza atom tlenu. Reakcję trzeba prowadzić w obecności zasady, nieorganicznej lub organicznej, ewentualnie w obojętnym rozpuszczalniku, np. w chloroformie. Stanowiącą produkt uboczny sól usuwa się, np. drogą ekstrakcji wodą, i produkt wyodrębnia się z roztworu organicznego.

Pochodne hydroksyloaminy o wzorze (II), w którym Z oznacza atom tlenu, X oznacza =NR⁴ są N-podstawionymi analogami pochodnych hydroksyloaminy o wzorze (I), w którym Z oznacza atom tlenu, a X oznacza NR¹R², i można je podobnie wytwarzać z chlorowcoformidanów o wzorze 9

PL 195 634 B1 i zwią zku chemicznego o wzorze 12, w obecnoś ci zasady organicznej (np. trietyloaminy) lub zasady nieorganicznej, takiej jak węglan sodowy, w obojętnym rozpuszczalniku, takim jak benzen, tetrahydrofuran itp., po czym prowadzi się zwykłą obróbkę i oczyszczanie.

Pochodne hydroksyloaminy o wzorze (II), w którym Z oznacza =NR³, a X oznacza atom tlenu, ujawniono w węgierskim zgłoszeniu patentowym nr 1756/95, a można je wytworzyć drogą reakcji związku hydroksyloaminowego o wzorze 6 lub o wzorze 12 z izocyjanianem o wzorze 15, w obojętnym rozpuszczalniku, zwykle przy zwykłym mieszaniu mieszaniny reakcyjnej w temperaturze pokojowej przez 2-24 godziny. Produkty wyodrębnia się po odparowaniu rozpuszczalnika, korzystnie przez krystalizację.

Pochodne hydroksyloaminy o wzorze (II), w którym Z oznacza =NR³, X oznacza =NR⁴ można wytworzyć drogą aminolizy odpowiednich pochodnych izomocznikowych (związki o wzorze (II), w którym Z oznacza atom tlenu, a X oznacza NR⁴) z użyciem pierwszorzędowej lub drugorzędowej aminy albo amoniaku. Reakcję prowadzi się korzystnie w rozpuszczalniku polarnym, np. wodzie lub etanolu, z uż yciem nadmiaru aminy. Alternatywnie chlorowcoformamidyny o wzorze 10 mo ż na poddać reakcji ze związkiem o wzorze 12 w obecności zasady organicznej lub nieorganicznej w obojętnym rozpuszczalniku, zwykle w temperaturze wrzenia.

Nowe pochodne hydroksyloaminy o wzorze (I), w którym X oznacza atom chlorowca, A oznacza grupę o wzorze (a), a R oznacza grupę o wzorze (b), można wytworzyć sposobami analogicznymi do opisanych w US 5147879, 5328906 i 5296606. Przykładowo:

(i) Pochodne, w których i R⁵ i R⁶ mają znaczenie inne niż atom wodoru, wytwarza się drogą diazowania odpowiednich NH2-pochodnych (pochodnych hydroksyloaminy o wzorze (I), w którym Z oznacza wiązanie kowalencyjne, a X oznacza NH2) w obecności odpowiedniego chlorowcowodoru, podobnie jak w sposobach opisanych w US 5147879, 5328906 i 5296606. Związki wyjściowe można wytworzyć także z użyciem znanych sposobów, np. opisanych w węgierskim opisie patentowym nr 177578, a mianowicie drogą sprzęgania amidoksymu o wzorze 1, w którym R¹ i R² oznaczają atomy wodoru, np. z reaktywną pochodną o wzorze 2, w obecności zasady, a następnie poddać je diazowaniu, zazwyczaj bez wyodrębniania i oczyszczania.

(ii) Gdy w pożądanym związku R⁷ oznacza atom wodoru, a m oznacza 1, syntezę można przeprowadzić drogą reakcji oksiranu o wzorze 3 z aminą o wzorze 4. Tę procedurę można zastosować także w przypadku syntezy pochodnych, w których R⁵ oznacza atom wodoru.

(iii) Związki, w których R oznacza grupę o wzorze (b), w którym R⁷ oznacza acyl, wytwarza się drogą estryfikacji odpowiednich pochodnych, w których R⁷ oznacza atom wodoru. Estry alkilowe lub arylowe wytwarza się zazwyczaj z użyciem chlorku kwasowego lub bezwodnika kwasu w obecności trzeciorzędowej aminy lub zasady nieorganicznej, korzystnie w obojętnym rozpuszczalniku, a w pewnych przypadkach według procedury Schotten-Baumana, z użyciem wodnego roztworu zasady nieorganicznej w układzie dwufazowym. W celu wytworzenia estrów aminoacylowych jako reagenty stosuje się pochodne aminokwasów N-zabezpieczonych w grupie aminowej i ze zaktywowaną grupą karboksylową (np. aktywnych estrów), z użyciem procedur znanych z chemii peptydów. Takie sprzęganie wymaga także obecności zasady (np. trietyloaminy). Wyodrębnianie i oczyszczanie produktów prowadzi się znanymi technikami preparatywnymi, a końcowy produkt ma często postać soli z odpowiednim kwasem nieorganicznym lub organicznym. Gdy jako związki wyjściowe stosuje się chiralne aminokwasy, produkty są często diastereoizomerami mającymi drugie centrum chiralności w grupie R. Podczas wyodrębniania te diastereoizomery często ulegają rozdzieleniu i produkt można otrzymać w postaci czystego stereoizomeru.

Nowymi pochodnymi hydroksyloaminy są również związki o wzorze (I), w którym Z oznacza wiązanie chemiczne, X oznacza atom chlorowca, A oznacza grupę o wzorze (c), a R oznacza grupę o wzorze (d). Te pochodne hydroksyloaminy wytwarza się drogą chemicznej modyfikacji (to jest utleniania przy atomie azotu lub czwartorzędowania) terminalnych ugrupowań pirydyny i/lub piperydyny w ich niepodstawionych prekursorach. W reakcji utleniania stosuje się korzystnie nadtlenokwasy, np. podstawione kwasy nadbenzoesowe, w obojętnych rozpuszczalnikach (np. w chloroformie, dichlorometanie). Gdy w cząsteczce znajdują się obie utlenialne grupy, mogą powstawać mono- lub ditlenki, w zależ noś ci od uż ytej iloś ci reagenta. Po zakończeniu reakcji nadmiar reagenta rozkł ada się i produkt wyodrębnia się przez odparowanie. Czwartorzędowanie można przeprowadzić z użyciem halogenków alkilu (np. jodku metylu), korzystnie w temperaturze wrzenia reagenta w odpowiednim rozpuszczalniku, np. acetonie, w warunkach powrotu skroplin. Produkt jest często nierozpuszczalny w środowisku reakcji i można go wyodrębnić przez zwykłe odsączenie.

PL 195 634 B1

Związki, w których X oznacza NH2 wytwarza się podobnie do sposobu opisanego powyżej, drogą reakcji odpowiednich związków o wzorze 1, w którym R¹ i R² oznaczają atomy wodoru, ze związkiem o wzorze 2. Środek alkilujący (o wzorze 2) może zawierać podstawniki hydroksylowe i/lub aminowe. Reakcję trzeba prowadzić w obecności zasady nieorganicznej lub organicznej, korzystnie w alkoholowym roztworze alkoholanu stanowiącym środowisko reakcji, i zasadę. Produkty wyodrębnia się często w postaci soli z odpowiednim kwasem nieorganicznym lub organicznym.

Inną grupę nowych związków tworzą te, w których jeden z podstawników R¹ i R² lub oba te podstawniki mają znaczenie inne niż atom wodoru. Takie związki można wytwarzać dwoma sposobami:

(i) Amidoksym o wzorze l, zawierający już żądane podstawniki R¹ i/lub R², można poddać reakcji z reaktywnym związkiem o wzorze 2, podobnie jak w procedurze opisanej uprzednio. Wyjściowe podstawione amidoksymy o wzorze l są znane z literatury [Chem. Rev., 62, 155 - 183 (1962)].

(ii) Podobne związki można wytworzyć drogą podstawienia atomów chlorowca w związkach o wzorze (I), w którym Z oznacza wiązanie kowalencyjne, a X oznacza atom chlorowca, drogą reakcji z aminą o wzorze 5. W przypadku pochodnych zawierających podstawnik hydroksylowy w grupie R (Y⁴ oznacza OH), tę grupę hydroksylową należy najpierw zabezpieczyć, a odbezpieczyć po reakcji podstawienia, gdyż inaczej konkurencyjna będzie reakcja tworzenia cyklicznych pochodnych o wzorze (I'). Stwierdzono, że zadowalającymi grupami zabezpieczającymi są ugrupowania acetylowe, np. tetrahydopiranyl. Zabezpieczanie prowadzi się drogą reakcji nie zabezpieczonego związku z dihydropiranem, a nastę pnie realizuje się podstawienie atomu chlorowca z uż yciem aminy, co zwykle wymaga ogrzewania w rozpuszczalniku, np. w alkoholu, w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin. Wreszcie odbezpieczenie produktu można zrealizować działaniem kwasem, np. przez utrzymywanie etanolowego roztworu we wrzeniu w obecności np. kwasu p-toluenosulfonowego.

Jak już wspomniano, grupa nowych związków obejmuje także te, w którym Y⁵ oznacza acyloksyl. Można je wytworzyć drogą acylowania odpowiednich pochodnych, w których Y⁵ oznacza hydroksyl, albo znanych z literatury (np. opisanych w węgierskim opisie patentowym nr 177578), albo opisanych w niniejszym opisie. Reakcję można prowadzić identycznie jak tę opisaną w odniesieniu do wytwarzania analogicznych chlorowcopochodnych, w których R⁷ oznacza acyl (sposób (iii)).

Inną grupę nowych pochodnych hydroksyloaminy o wzorze (I) tworzą związki, w których A oznacza korzystnie fenyl lub pirydyl, Z oznacza wiązanie chemiczne, X oznacza -OQ, a R oznacza grupę o wzorze (b). Związki te wytwarza się drogą reakcji odpowiednich pochodnych hydroksyloaminy o wzorze (I), w którym X oznacza atom chlorowca, i odpowiednich alkoholanów, korzystnie w odpowiadającym alkoholanowi alkoholu, korzystnie w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin. Mieszaninę reakcyjną poddaje się znanej obróbce i produkt wyodrębnia się drogą chromatografii i wysalania.

Pochodne hydroksyloaminy są użyteczne w zwiększaniu ekspresji cząsteczkowych białek opiekuńczych w komórkach, polegającym na tym, że komórki i tkanki traktuje się skuteczną ilością pochodnej hydroksyloaminy, przy czym stosować można pochodne hydroksyloaminy, których postacie tautomeryczne są przedstawione wzorami (I) lub (II). Budowę związków o wzorach (I) i (II) opisano szczegółowo powyżej.

Pochodne hydroksyloaminy są użyteczne w zwiększaniu ekspresji cząsteczkowego białka opiekuńczego w komórkach wystawionych na stres fizjologiczny, przy czym komórki wystawione na stres fizjologiczny, który wywołuje ekspresję cząsteczkowych białek opiekuńczych w tych komórkach, traktuje się skuteczną ilością pochodnych hydroksyloaminy, których postacie tautomeryczne są przedstawione wzorami (I) lub (II), po wystąpieniu stresu. Pochodne hydroksyloaminy zwiększają ekspresję cząsteczkowych białek opiekuńczych w komórkach ponad ilość wywoływaną przez stres fizjologiczny.

Pochodne hydroksyloaminy stosuje się do traktowania komórek przed poddaniem ich stresowi fizjologicznemu. Pochodne hydroksyloaminy zwiększają ekspresję cząsteczkowych białek opiekuńczych w komórkach ponad ilość wywoływaną przez stres fizjologiczny.

W uż ytym znaczeniu okreś lenie „czą steczkowe biał ko opiekuń cze odnosi się do biał ek, które towarzyszą innym białkom w fałdowaniu się w sposób zapewniający prawidłowe lub aktywne konformacje, zazwyczaj wiążąc się niekowalencyjnie z białkami. Cząsteczkowe białka opiekuńcze nie tylko uczestniczą w korygowaniu i odtwarzaniu białek nowo zsyntetyzowanych, ale również tych, które zostały zdenaturowane lub nieprawidłowo pofałdowały się. Do cząsteczkowych białek opiekuńczych należą między innymi białka szoku cieplnego (hsp), spośród których szczególne znaczenie w związku z wynalazkiem mają hsp70 i hsp72, a takż e biał ko wiążące ciężki ł a ń cuch IgG (BiP) oraz białka

PL 195 634 B1 regulowane przez glukozę (grp). Jako przykłady hsp i grp wymienić można, ale nie wyłącznie, białka należące do klas hsp70, hsp60, hsp90, grp94, grp80 i hsp27.

Korzystnie komórkami eukariotycznymi, na które działa się pochodnymi hydroksyloaminy są komórki ssaka, a jeszcze korzystniej komórki ludzkie. Określenie „komórka eukariotyczna” odnosi się zarówno do komórek eukariotycznych in vitro (komórek znajdujących się poza żywym organizmem, np. w stanie hodowli), jak i in vivo (komórek znajdujących się w żywym organizmie, np. komórek tworzących tkanki i narządy).

Spośród komórek eukariotycznych żywych organizmów stosując pochodne hydroksyloaminy według wynalazku korzystnie traktować można neurony, komórki mięśni, komórki ścianek naczyń, zwłaszcza komórki śródbłonka, komórki nabłonka oraz komórki układu immunologicznego. Komórki roślin, w tym komórki żywych organizmów roślinnych, można równie korzystnie traktować pochodnymi hydroksyloaminy według wynalazku.

W użytym znaczeniu określenie „stres fizjologiczny” obejmuje warunki lub czynniki wpływające na komórkę, które mogą wywołać w komórce „reakcję stresową”, np. zainicjować syntezę białka opiekuńczego. Do stresów fizjologicznych należą czynniki, które powodują uszkodzenie komórek lub zakłócają homeostatyczną równowagę komórek. Należą do nich np. stresy metaboliczne, oksydacyjne, miejscowe stresy mechaniczne lub stresy wywołane przez niedotlenienie, niedokrwienie, szok cieplny, promieniowanie lub materiały toksyczne. Ważna postać stresu fizjologicznego wywoływana jest przez cukrzycę.

Inną ważną postać stresów fizjologicznych stanowią te stresy, które prowadzą do powstania wolnych rodników lub do wzrostu ilości cytokin w otoczeniu komórek. Uszkodzenia w komórkach związane z różnymi stanami patologicznymi stanowią przykłady stresów fizjologicznych.

Stresem fizjologicznym wywołującym w komórkach ekspresję cząsteczkowego białka opiekuńczego jako reakcję na stres fizjologiczny jest stres wywołany przez choroby układu sercowonaczyniowego, naczyń, mózgu, alergie, choroby immunologiczne i choroby autoimmunologiczne, infekcje bakteryjne i wirusowe, choroby skóry i śluzówki lub choroby nabłonka kanalików nerkowych lub stany przyczynowe wymagające zabiegów kosmetycznych.

Do takich chorób układu sercowo-naczyniowego należą najkorzystniej miażdżyca tętnic wywołana stresem fizjologicznym, choroby wieńcowe lub choroby układu sercowo-naczyniowego powodowane przez hipertonię lub hipertonię płucną.

Do charakterystycznych chorób mózgu należą między innymi te, które powodowane są przez niedokrwienie naczyń mózgu wywołane przez stres fizjologiczny, udar, urazowe uszkodzenie głowy, neurozwyrodnieniowe choroby starcze, zwłaszcza otępienie starcze, otępienie związane z AIDS, otępienie alkoholowe, choroba Alzheimera, choroba Parkinsona i padaczka.

Do charakterystycznych chorób skóry i śluzówki należą dermatozy i choroby wrzodowe układu żołądkowo-jelitowego.

W powyższych chorobach stres fizjologiczny wywołuje ekspresję cząsteczkowego białka opiekuńczego w komórkach, z tym że działanie to nie wystarcza do zapewnienia ochrony przed uszkodzeniem komórek powodowanym przez choroby. Zastosowanie powyższych pochodnych hydroksyloaminy, które związane jest ze zwiększeniem ekspresji cząsteczkowego białka opiekuńczego lub zwiększeniem aktywności cząsteczkowego białka opiekuńczego, umożliwia wyeliminowanie strukturalnych odchyleń powodowanych przez chorobę, a tym samym regenerację komórek.

Stres fizjologiczny stanowi szok cieplny lub narażenie na nienormalnie podwyższone temperatury. Stres fizjologiczny stanowi też uszkodzenie komórek związane z niedokrwieniem. Uszkodzenie niedokrwienne komórek, zwłaszcza komórek mięśnia sercowego i mózgu, spowodowane jest zaburzeniami układu sercowo-naczyniowego wywołanymi przez zatkanie lub pękanie naczyń, takie jak wieńcowa lub mózgowa zakrzepica lub zamknięcie tętnic, udar, zator albo przewlekły skurcz naczyń. Niedokrwienie wywołuje „reakcję stresową” w komórkach, co powoduje wzrost ilości hsp, które z kolei chroni komórki przed szkodliwymi skutkami niedokrwienia (R. Mestril i inni, J. Mol. Cell. Cardiol. 27: 45 (1995).

Działając na takie komórki skuteczną ilością pochodnych hydroksyloaminy można zwiększyć w tych komórkach ekspresję cząsteczkowego białka opiekuńczego ponad poziom wywołany przez niedokrwienie, a ponadto zwiększyć można aktywność cząsteczkowych białek opiekuńczych.

Pobranie od istoty żywej narządu do wykonania przeszczepu samo w sobie stanowi stres fizjologiczny powodujący uszkodzenie komórek wchodzących w skład tego narządu, wywołujące ekspresję cząsteczkowego białka opiekuńczego. W takim przypadku podanie pochodnych hydroksyloaminy przed lub po pobraniu narządu może zwiększyć ilość cząsteczkowego białka opiekuńczego wytwarzanego przez komórki narządu, albo też uaktywnić to białko, co zapewnia działanie cytoochronne.

PL 195 634 B1

Uszkodzenia neuronów, oprócz tych wynikających z niedokrwienia, mogą być wywoływane również przez wiele innych stresów, które powodują wytwarzanie cząsteczkowego białka opiekuńczego w komórkach neuronowych. Także uszkodzenia neuronów wskutek pobudzającego działania toksyn powodują wytwarzanie cząsteczkowych białek opiekuńczych przez neurony, przy czym oddziaływania takie są również objęte zakresem określenia „stres fizjologiczny”.

Inny przykład stanowi stres fizjologiczny powodowany przez toksyczne mediatory zapalenia, takie jak utleniające rodniki i cytokiny, takie jak TNF, wytwarzane przez makrofagi. Stwierdzono, że w komórkach narażonych na działanie zwiększonych ilości takich toksycznych mediatorów zachodzi ekspresja zwiększonych ilości hsp, co z kolei zapewnia ochronę takich komórek przed toksycznością (S. Kantengwa i inni, Semin. Immun. 3: 49-56 (1991)). Różne choroby zapalne, w tym zapalne stany płuc, takie jak zespół ostrego wyczerpania oddechowego dorosłych, obejmują ekspresję hsp przez komórki, co z kolei zapewnia działanie cytoochronne (M.R. Jacquier-Salin i inni, Experientia 50: 1031-1038 (1994)). Gdy ilość cząsteczkowych białek opiekuńczych w komórkach zwiększa się ponad poziom wywoływany przez TNF lub reaktywne fragmenty tlenowe, komórki mogą być lepiej chronione przed takimi czynnikami cytotoksycznymi oraz mogą łatwiej naprawiać wywołane przez nie uszkodzenia.

Czynniki wpływające na stan fizjologiczny błon komórkowych, w tym płynność błon komórkowych, stanowią także przykłady stresu fizjologicznego. Wzrost ekspresji cząsteczkowego białka opiekuńczego w takich komórkach powyżej poziomu wywoływanego przez zakłócenie stanu fizjologicznego błon komórkowych może zapewnić lepszą ochronę oraz umożliwić naprawę przez komórki błon komórkowych.

Określenie „skuteczna ilość pochodnych hydroksyloaminy” użyte w opisie w związku ze zwiększonym wytwarzaniem cząsteczkowego białka opiekuńczego w komórkach w warunkach stresu fizjologicznego lub w komórkach, które zostaną następnie narażone na stres fizjologiczny, odnosi się do ilości, która będzie zwiększać ekspresję cząsteczkowego białka opiekuńczego ponad poziom wywoływany przez sam stres fizjologiczny. Ilość taka może być łatwo ustalona przez specjalistę. Korzystnie w przypadku komórek in vitro skuteczna ilość wynosi 10^-6 - 10^-3 M. Jeszcze korzystniej skuteczna ilość wynosi 10^-6 - 5x10^-4 M.

Przy podawaniu istocie żywej skuteczna ilość zmienia się w zależności od różnych czynników, takich jak sposób podawania, z tym, że ustalenie skutecznej ilości może być dokonane przez specjalistę bez potrzeby przeprowadzania zbędnych doświadczeń. Przykładowo przy podawaniu dożylnym pochodnej hydroksyloaminy skuteczna dawka wynosi korzystnie 0,1 - 10 mg/kg masy ciała, a jeszcze korzystniej 0,5 - 2,0 mg/kg masy ciała, a przy podawaniu doustnym skuteczna dawka wynosi korzystnie 10 - 500, a jeszcze korzystniej 50 - 100 mg/kg masy ciała.

Zwiększoną ekspresję cząsteczkowego białka opiekuńczego w komórkach można wykryć wykorzystując dobrze znane procedury laboratoryjne, takie jak blotting northern lub western.

Poniżej podano przykład techniki blottingu western, którą można wykorzystać: Komórki hoduje się in vitro w 37°C w pożywce Eagle'a z modyfikacją Dulbecco (DMEM) uzupełnioną 10% płodową surowicą cielęcą (GIBCO), w atmosferze z 5% CO2. Pochodne hydroksyloaminy, których tautomeryczne postacie przedstawione są wzorami (I) i (II), można dodać do hodowli komórek np. w stężeniu 10^-5 M, wprowadzając związek do komórek na 16 godzin przed stresem fizjologicznym, albo po upływie pewnego okresu czasu od stresu fizjologicznego. Jednakże stężenie pochodnej hydroksyloaminy oraz moment podawania związku mogą zmieniać się w zależności od wymagań zaprojektowanego doświadczenia.

W 6 godzin po szoku cieplnym komórki przemywa się dwukrotnie fizjologicznym roztworem soli buforowanym fosforanem (PBS), po czym zdrapuje się je do PBS z powierzchni płytek do hodowli.

Następnie komórki odwirowuje się przez 5 minut przy szybkości 1500 obrotów/minutę i wprowadza się do 100 μm zmodyfikowanego buforu rozpuszczającego (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, red, Sambrook, Fritsche, Maniatis, Bold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) zawierającego 50 mM Tris-HCl o pH 8,0, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 15 Tritox N-100, 1 PMFS, 2 μg/ml aprotyniny, 1 μg/ml chymostatyny, 1 μg/ml pepstatyny, oraz poddaje się obróbce ultradźwiękowej 3 x 20 s (z przerwami 2-minutowymi, nastawa 8).

Następnie oznacza się stężenie białka w 5 μl próbkach wykonując test Bradforda (M.M. Bradford, Anal. Biochem., 72: 248-254 (1976) dla 3 równoległych próbek. Próbki doprowadza się do stężenia białka 100 μg/30 ml z wykorzystaniem powyższego buforu i następnego buforu, tak aby ostateczne stężenia składników buforu w próbce były następujące: 110 mM Tris-HCl o pH 6,8, 8,3 mM merkaptoetanol, 3% SDS, 3% gliceryny oraz pewna ilość błękitu bromofenolowego. Próbkę wytrząsa się

PL 195 634 B1 w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Uzyskaną próbkę można następnie zastosować w celu wykonania elektroforezy na żelu.

Gdy wpływ pochodnych hydroksyloaminy według wynalazku na zwiększenie ekspresji cząsteczkowego białka opiekuńczego bada się na komórkach in vivo, u zwierząt wywołuje się stres fizjologiczny, np. niedokrwienie lub cukrzycę wywołaną przez STZ. W przypadku niedokrwienia wywołać można u zwierząt niedokrwienie mięśnia sercowego w sposób opisany w przykładzie 8, a stan cukrzycy wywołać można w sposób opisany w przykładzie 10. Pochodną hydroksyloaminy według wynalazku można podać zwierzęciu przed narażeniem na stres fizjologiczny, podczas stresu lub po stresie. Jak to zaznaczono powyżej, moment podawania można zmieniać w zależności od zaprojektowanego doświadczenia.

Następujące etapy preparowania białek z odpowiednich tkanek pobranych od zwierzęcia poddanego działaniu związku, przeprowadza się w 0-4°C. Tkanki, np. tkanki wątroby (około 15-20 g) homogenizuje się w mikserze stosowanym w gospodarstwie domowym przez 2 minuty w 80 ml roztworu buforu lizującego zawierającego 50 mM Tris-HCl o pH 8,0, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% środka Triton X-100 oraz 1 mM inhibitorów proteazy (PMSF, benzamidyna, kwas aminokapronowy). Homogenizat odwirowuje się przy 20000 x g przez 30 minut w wirówce Sorvall RC 28S.

Stężenie białka w preparacie oznacza się w teście Bradforda i nastawia się na 5 mg/ml. Próbki zawierające 1,8 mg białka rozpuszcza się przed elektroforezą na żelu w 0,6 ml buforu zawierającego 110 mM Tris-HCl o pH 6,8; 8,3 mM merkaptoetanol, 3% SDS, 3% gliceryny oraz pewna ilość błękitu bromofenolowego, po czym próbkę wytrząsa się w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Próbki białka uzyskanego z hodowli komórek lub z tkanki zwierzęcej w sposób opisany powyżej poddaje się elektroforezie, a następnie immunoblottingowi (przy czym obydwie techniki są dobrze znane i opisane w Molecular Cloning, A Laboratory Manual, red Sambrook, Fritsche, Maniatis; Bold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Protein Blotting Protocols for the Immobilion-P Transfer Membrane, 3. Laboratory Manual, Millipore; oraz U.K. Laemmli, Nature 227: 680-685 (1970)).

Tak więc np. elektroforezę można przeprowadzić w sposób opisany przez Laemmli'ego (U.K. Laemmli, Nature 227: 680-685 (1970)) na 8-18% żelu poliakryloamidowym pod stałym napięciem 50 V, prowadząc proces przez noc. Białka barwi się barwnikiem Coomassie Brilliant Blue R-250 lub przenosi na Immobilone PVDF (Millipore) przy stałym natężeniu prądu (300 mA) przez 3 godziny w 4°C, w buforze przenoszenia (10 mM CAPS o pH 11, 10% metanolu) (Protein Blotting Protocols for the Immobilion-P Transfer Membrane, 3. Laboratory Manual, Millipore). Po przeniesieniu miejsca niespecyficzne na błonie blokuje się 2% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w TPBS (buforowany fosforanem fizjologiczny roztwór soli z 0,1% środka Tween 20) przez noc w 4°C. Blot można następnie inkubować z przeciwciałem skierowanym przeciw czą steczkowemu biał ku opiekuń czemu, np. z monoklonalnym przeciwciałem grp94 (SPA-850, StressGen) rozcieńczonym w stosunku 1:3000, monoklonalnym przeciwciałem hsp60 (SPA-600, StressGen) rozcieńczonym w stosunku 1:2700, monoklonalnym przeciwciałem hsp72 (C92F34-5, StressGen) rozcieńczonym w stosunku 1:1250, monoklonalnym przeciwciałem hsp90 (AC88, StressGen) rozcieńczonym w stosunku 1:2000, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie membranę przemywa się buforem TPBS przez 1 godzinę i inkubuje dodatkowo przez 1 godzinę z drugorzędowym przeciwciałem, przeciwszczurzym (Sigma, rozcieńczenie 1:4000 w przypadku grp94) albo przeciwmysim (Sigma, zaadsorbowane na ludzkich i szczurzych biał kach surowiczych, rozcieńczenie 1:3000, w przypadku hsp60, hsp72 lub hsp90), przy czym obydwa te przeciwciała są skoniugowane z peroksydazą chrzanową. Po kolejnym przemyciu TPBS membranę wywołuje się techniką ECL (wzmocnionej chemiluminescencji) (Amersham).

Zmiany w zawartości białka stresowego można oznaczać ilościowo stosując densytometr BioRad (Model 1650) z integratorem Hewlett-Packard (HP 3394A). Przygotowuje się kolejne rozcieńczenia preparatów z roztworu białka zawierającego znaną ilość cząsteczkowego białka opiekuńczego i powyż szą procedurę powtarza się dla różnych rozcieńczeń; stężenie cząsteczkowego białka opiekuńczego w badanych próbkach wyznacza się z krzywej kalibracji uzyskanej z testów rozcieńczania.

Hybrydyzacja northern stanowi inną dostępną doświadczalną procedurę określania wzmocnienia cząsteczkowego białka opiekuńczego przez pochodne hydroksyloaminy według wynalazku (na podstawie pomiaru poziomu mRNA). Komórki lub tkanki można otrzymać w sposób opisany w związku z procedurą blottingu western. RNA z komórek lub tkanek można wyekstrahować za pomocą środków RNAgent (Promega), zgodnie z instrukcjami producenta (Protocols and Application Guide, 2 wyd., 1991, Promega Corporation). Zamroż one próbki tkanki (każ da po oko ł o 50-100 mg) homogenizuje się w 1,0 roztworu denaturującego, 4M tiocyjanian guanidyny; 42 mM cytrynian sodowy; 0,83 m

PL 195 634 B1 β-merkaptoetanol; 0,1% Nonidet P-40 w 4°C (homogenizacja Brinkmana). Następnie dodaje się 1/10 objętości 3M octanu sodowego (pH 4,0) i homogenizat poddaje się ekstrakcji kwaśnym fenolem (fenol:chloroform:alkohol izoamylowy 25:24:1) przez 10 s w mikserze. Próbkę inkubuje się w lodzie przez 15 minut, po czym wiruje się (4°C, 20 minut, 10000 x g). Fazę wodną przenosi się do nowej probówki Eppendorfa, procedurę powtarza się i fazę wodną wytrąca się w -20°C przez noc za pomocą równej objętości izopropanolu. Po odwirowaniu (4°C, 20 minut, 10000 x g) wytrącony produkt przemywa się dwukrotnie 95% etanolem i suszy w temperaturze pokojowej. RNA zawiesza się w 20 μΐ wody z dodatkiem pirowęglanu dietylu (DEPC) i stężenie oznacza się spektrofotometrycznie przy 260-280 nm. 8 μg pełnego RNA wprowadza się na żel z agarozy usieciowanej formaldehydem metodą transferu kapilarnego; bloty RNA na żelu przenosi się na membranę poliamidową zgodnie z instrukcjami producenta (Zeta-Probe GT, BioRad).

W poszczególnych próbkach zawartość mRNA cząsteczkowego białka opiekuńczego porównuje się z poziomem mRNA genu dehydrogenazy 3-fosforanu aldehydu glicerynowego (GAPDH) w próbkach. Sondy cDNA (np. pełnej długości ludzki cDNA hsp70 w przypadku, gdy sondowany mRNA stanowi hsp70, oraz fragment Apa-Ncol cDNA GAPDH szczura) znakuje się a-³²P CTP stosując zestaw Random Prime DNA Labeling Kit (USB). Radiologicznie znaczone fragmenty DNA oczyszcza się w kolumnach Sephadex G-50 (Pharmacia) w opisany sposób (Ausubel i inni (red): Current Protocols in Molecular Biology: John Wiley & Sons: 1987).

Wstępną hybrydyzację prowadzi się w 65°C w buforze H (0,25 M Na2HPO4 o pH 7,2, 7% SDS) przez 15 minut. Hybrydyzację prowadzi się przez noc (65°C, bufor H) z izotopowo znaczoną sondą cDNA o stężeniu co najmniej 10⁶ zliczeń/ml. Następnie membranę przemywa się 20 mM Na2HPO4 o pH 7,2, 7% SDS (65°C, 2 x 15 minut) i ocenia metodą autoradiografii. Tą samą membranę wykorzystuje się do sondowania mRNA hsp70, wykorzystując oznaczone GAPDH i mRNA jako wzorce wewnętrzne.

Pochodne hydroksyloaminy, których tautomeryczne postacie przedstawione są wzorami (I) i (II) stosuje się do leczenia lub zapobiegania różnym stanom patologicznym, np. chorobom związanym z działaniem układu białka opiekuńczego oraz uszkodzeniami w błonach komórek i organelli komórkowych, przy czym leczenie to polega na podawaniu skutecznej ilości tych pochodnych hydroksyloaminy w celu zwalczania stanów patologicznych w organizmach. W stanach patologicznych w komórkach wywoływana jest charakterystyczna ekspresja cząsteczkowego białka opiekuńczego. Zwiększenie ekspresji cząsteczkowego białka opiekuńczego w tych komórkach może ułatwić naprawę uszkodzeń spowodowanych przez stany patologiczne oraz przywrócić homeostatyczną równowagę komórkową.

Do takich stanów patologicznych należy niedokrwienie, choroby nowotworowe, infekcje spowodowane przez chorobotwórcze drobnoustroje, choroby autoimmunologiczne oraz dermatozy.

W użytym znaczeniu „leczenie” oznacza złagodzenie stanu klinicznego u osobnika i nie musi oznaczać, że osiąga się pełne wyzdrowienie. Łagodzenie oznacza skrócenie czasu trwania choroby lub jej ostrości, albo subiektywną poprawę jakości życia pacjenta lub przedłużenie życia pacjenta.

W odniesieniu do pochodnych hydroksyloaminy według wynalazku określenie „ilość skuteczna do leczenia” odnosi się do ilości wystarczającej do osiągnięcia złagodzenia stanu klinicznego opisanego powyżej. Skuteczna dawka zależy od takich czynników jak sposób podawania i może być łatwo określona przez specjalistę. Pochodne hydroksyloaminy według wynalazku można podawać pozajelitowo lub doustnie, korzystnie doustnie, oraz miejscowo, przy czym skuteczna dawka wynosi 10 - 500 mg/kg masy ciała. Jeszcze korzystniej skuteczna dawka wynosi 20 - 100 mg/kg masy ciała.

Stosując pochodne hydroksyloaminy według wynalazku w leczeniu można chronić mięsień serca, tkankę mózgową oraz nerki przed uszkodzeniami lub martwicą tkanki w wyniku niedokrwienia, przy czym pochodne te podaje się osobnikowi w skutecznej ilości w celu osłabienia, zapobieżenia lub odwrócenia niepożądanych skutków przedłużonego niedokrwienia.

Pochodne hydroksyloaminy, których tautomeryczne postacie przedstawione są wzorami (I) i (II), stosuje się do wytwarzania leku do leczenia stanów patologicznych opisanych powyżej.

Do oznaczania działania ochronnego pochodnych hydroksyloaminy wykorzystuje się następujący test prowadzony na zwierzętach. Szczury usypia się pentobarbitalem sodowym (Nembutal, 60 mg/kg masy ciała, dootrzewnowo) i sztucznie wentyluje powietrzem z otoczenia (2 ml/100 g, 54 uderzenia/minutę) przez wykonaną tracheotomię. Następnie wykonuje się cewnikowanie prawej tętnicy szyjnej i łączy się cewnik z przetwornikiem ciśnienia (BPR-01, Stoelting) w celu wykonywania pomiarów ustrojowego tętniczego ciśnienia krwi (BP) za pomocą wstępnego wzmacniacza (Hg-02, Experimetria). Pochodne hydroksyloaminy według wynalazku podaje się przez cewnik do żyły szyjnej (i.v.) lub doustnie (p.o.). Częstość akcji serca (HR) mierzy się kardiotachometrem (HR-01, Experimetria),

PL 195 634 B1 a elektrokardiogram (ECG, odprowadzenie standardowe II) rejestruje się za pomocą urządzeń rejestrujących (MR-12, Medicor), stosując elektrody w postaci podskórnych igieł stalowych. Otwiera się klatkę piersiową wykonując lewą tracheotomię, po czym odsłania się serce łagodnie naciskając na prawą stronę użebrowania. Wykonuje się ucisk pod główną lewą tętnicą wieńcową w sposób opisany przez Seyle'a i innych (1960). Serce ostrożnie umieszcza się ponownie w klatce piersiowej i zwierzę pozostawia się do przebudzenia. Rejestruje się temperaturę odbytu utrzymując ją na stałym poziomie 37°C. Procedurę doświadczenia rozpoczyna 15-minutowy okres stabilizacji. W przypadku przedłużającego się spadku ciśnienia poniżej 70 mm Hg lub zaobserwowania arytmii w tym okresie zwierzę wyklucza się z dalszej części doświadczenia. Następnie wywołuje się niedokrwienie mięśnia sercowego przez wywołanie 5-minutowej niedrożności wieńcowej, po której następuje 10-minutowa reperfuzja.

Przez cały czas trwania doświadczenia rejestruje się ciśnienie krwi (BP), częstość akcji serca (HR) oraz EKG za pomocą rejestratora multiscriptor (R61-6CH, Medicor*). Pochodne hydroksyloaminy podaje się i.v. lub p.o. na 5-60 minut przed wywołaniem niedrożności. Dawki pochodnej hydroksyloaminy mogą wynosić 0,5, 0,75 lub 1,0 mg/kg i.v. lub 100 mg/kg masy ciała p.o. Substancję odniesienia, Bepridil, podaje się w dawce 1,0 mg/kg i.v. Mierzy się i analizuje średni czas trwania częstoskurczu komorowego (VT) i/lub migotanie komór (VF) w ciągu pierwszych 3 minut reperfuzji.

Utrzymywanie płynności błony komórkowej, która to płynność błony komórkowej została zakłócona na skutek stresu fizjologicznego, polega na tym, że działa się na komórkę lub organellum komórki o zmienionej płynności błony komórkowej skuteczną ilością pochodnych hydroksyloaminy w celu odtworzenia płynności tej błony. Stosowną procedurę doświadczalną podaną w przykładzie 9 (anizotropia fluorescencji DPH w stanie ustalonym) można wykorzystać do określania wpływu pochodnej hydroksyloaminy według wynalazku na płynność błony komórkowej.

Pochodne hydroksyloaminy, których tautomeryczne postacie przedstawione są wzorami (I) i (II) można stosować do wytwarzania leku do leczenia stanów patologicznych związanych z błoną komórkową lub błoną organellum komórkowego. Jeden z przykładów takiego stanu patologicznego stanowi cukrzyca, a także choroby związane z uszkodzeniem mitochondrium, takie jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS), choroba Alzheimera, choroba Parkinsona, choroba Huntingtona (HD), pewne kardiomiopatie, takie jak związane z toksycznością spowodowaną przez alkohol lub metale ciężkie, kardiomiopatia zapalna lub wirusowa, albo kardiomiopatia autoimmunologiczna.

W leczeniu chorób nowotworowych polegającym na podawaniu skutecznej ilości pochodnych hydroksyloaminy do organizmu nowotworowego w celu zapobieżenia powstawaniu lub wzrostowi guzów można stosować pochodne hydroksyloaminy, których tautomeryczne postacie przedstawione są wzorami (I) i (II).

Jak już wspomniano, pochodne hydroksyloaminy o ogólnych wzorach (I) i (II), w tym ich optycznie czynnych stereoizomerów, stosuje się do wytwarzania środków farmaceutycznych użytecznych w leczeniu chorób układu sercowo-naczyniowego, chorób naczyń, chorób mózgu, alergii, chorób immunologicznych i chorób autoimmunologicznych, chorób pochodzenia wirusowego lub bakteryjnego, chorób nowotworowych, chorób skóry i/lub śluzówki lub chorób śródbłonka kanalików nerkowych, wywołanych przez stres fizjologiczny, a także wywołanych przez stres fizjologiczny stanów nadających się do leczenia drogą zabiegu kosmetycznego, przy czym tymi związkami o wzorze (I) lub (II), ich solami albo ich optycznie czynnymi stereoizomerami są związki, których definicje podano powyżej.

Z użyciem tych związków można wytworzyć środki do stosowania w leczeniu i profilaktyce, które po podaniu ludziom lub zwierzętom albo zastosowaniu u ludzi lub zwierząt mogą być użyteczne w zapobieganiu lub zwalczaniu uszkodzeń komórek powodowanych przez powyższe choroby, a zatem mogą osłabiać lub eliminować patologiczny stan w organizmie.

Te środki można wytworzyć z użyciem znanych sposobów stosowanych przy produkcji farmaceutyków, poprzez zmieszanie substancji czynnej i odpowiednich nośników i/lub substancji pomocniczych. Środki ogólnie zawierają 0,5 -99,5% wagowych substancji czynnej. Ilość substancji czynnej w środku zależy od charakteru i nasilenia choroby, wieku pacjenta i sposobu leczenia. Pochodne hydroksyloaminy o wzorze (I) i (II) można formułować z wytworzeniem środków do stosowania doustnego i pozajelitowego, a także miejscowego.

Dzienna dawka substancji czynna wynosi około 10 - 500 mg/kg, korzystnie 20 - 100 mg/kg, przy czym, zwłaszcza w przypadku środków doustnych, podaje się w 2 - 3 porcjach.

Dla otrzymania preparatów doustnych środkom nadaje się postać drażetek, granulatów lub, w razie potrzeby, roztworów lub zawiesin. Do preparatów pozajelitowych należą wodne zawiesiny

PL 195 634 B1 i jał owe roztwory do wstrzyknięć, a preparatami doodbytniczymi są mię dzy innymi czopki, preparatami do stosowania miejscowego zaś są maści, kremy, emulsje i żele.

Dla wytworzenia tabletek substancję czynną miesza się z odpowiednimi nośnikami, takimi jak skrobia, żelatyna, laktoza, stearynian magnezu, talk, guma arabska i żel krzemionkowy, mieszaninę granuluje się i granulat sprasowuje się w tabletki.

Przy wytwarzaniu drażetek mieszaninę podobną do powyższej wytwarza się z substancji czynnej i substancji pomocniczych, mieszaninę tę granuluje się i granulat sprasowywuje się w rdzenie, które powleka się cukrem, np. z użyciem zawierającego cukier wodnego roztworu poliwinylopirolidonu.

W celu wytworzenia kapsuł ek substancję czynną miesza się z substancjami pomocniczymi, takimi jak skrobia, talk, krzemionka i celuloza mikrokrystaliczna, po czym mieszaniną napełnia się twarde lub miękkie kapsułki żelatynowe.

Do tych środków doustnych można wprowadzać dodatki przyśpieszające lub opóźniające ich wchłanianie.

Syropy lub eliksiry albo krople można wytwarzać z użyciem, obok substancji czynnej, słodzików, metylo- lub propylo-parabenu i, w razie potrzeby, dodatków smakowych, przez zmieszanie z nimi wodnego roztworu substancji czynnej.

Czopki do podawania doodbytniczego można sporządzać z użyciem odpowiednich substancji pomocniczych, takich jak masło kakaowe lub glikol polietylenowy.

Środkami odpowiednimi do podawania pozajelitowego mogą być preparaty do wstrzyknięć otrzymywane przez rozpuszczenie substancji czynnej w jałowym izotonicznym roztworze soli, albo wodne zawiesiny, które można wytworzyć z użyciem odpowiednich dyspergatorów i zwilżaczy, takich jak glikol propylenowy lub glikol butylenowy.

Kremy i maści do stosowania miejscowego można wytworzyć z użyciem pierwszorzędowych lub drugorzędowych alkoholi, takich jak alkohol cetylowy, alkohol stearylowy, gliceryna, naturalne tłuszcze i oleje, np. oliwa z oliwek, olej z kiełków pszenicznych, lanolina, dłuższe węglowodory, takie jak wazelina, a także pochodne celulozy. Te preparaty mogą też zawierać konserwanty, takie jak p-hydroksybenzoesan metylu.

Środki przeznaczone do stosowania jako kosmetyki lub kosmetyki lecznicze można wytwarzać podobnie. Korzystnie lipofilowe składniki miesza się, a składniki rozpuszczalne w wodzie rozpuszcza się w wodzie, ewentualnie przy umiarkowanym ogrzewaniu. W razie potrzeby odczyn takiego roztworu doprowadza się do właściwej wartości pH i tak otrzymaną emulsję miesza się do ochłodzenia. Do powstałej mieszaniny dodaje się substancji czynnej w postaci wodnego roztworu.

Środki farmaceutyczne zawierające nowe pochodne hydroksyloaminy, opisane szczegółowo powyżej, można także wytworzyć powyższymi sposobami. Również te środki stanowią przedmiot wynalazku.

Postacie wynalazku ilustrują bardziej szczegółowo następujące przykłady. Należy jednak rozumieć, że zakres ochrony nie jest ograniczony do tych szczególnych postaci przedstawionych w przykładach.

1. Przykłady chemiczne

P r z y k ł a d 1

Monochlorowodorek chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-2-tiofenokarboksyimidoilu

W 19 ml wody rozpuszczono 5,0 g (15,6 mmola) monochlorowodorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-2-tiofenokarboksyimidoamidu (przykład 44), a potem dodano 6,1 ml stężonego kwasu solnego. Roztwór ochłodzono do -5°C, a następnie wkroplono zimny roztwór 4,4 g (63,8 mmola) azotynu sodowego w 2,4 ml wody. Podczas trwania reakcji temperatura wewnętrzna wynosiła 0°C. Po zakończeniu dodawania mieszaninę mieszano przez 1 godzinę. Do tej mieszaniny dodano zimnego benzenu (60 ml) i zalkalizowano ją przez powolne dodanie zimnego roztworu 3,2 g (80 mmoli) wodorotlenku sodowego w 45 ml wody. Fazę organiczną oddzielono i przemyto ją 20 ml porcjami wody do osiągnięcia wartości pH < 9 (3-5 razy). Roztwór organiczny wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodowym, poddano działaniu węgla drzewnego, przesączono i odparowano pod próżnią (t < 45°C), w wyniku czego otrzymano 2,6 g oleju. Tę pozostał o ść rozpuszczono w 5 ml alkoholu izopropylowego i zakwaszono do pH 2 z użyciem alkoholu izopropylowego zawierającego bezwodny kwas chlorowodorowy. Produkt poddano krystalizacji z n-heksanu i otrzymano szarawą substancję. Wydajność: 2,0 g (38%)

T.t. = 115 - 123°C

Z użyciem powyższego sposobu otrzymano nastę pujące związki:

PL 195 634 B1

P r z y k ł a d 2

Monochlorowodorek chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-1-izochinolinokarboksyimidoilu

Związek wyjściowy: przykład 46

Wydajność: 48%

T.t. = 168 - 172°C

IR (KBr): 3425, 3128, 2947, 2866, 2650, 2540, 1622, 1597, 1556, 1452, 1385, 1364, 1329, 1296, 1281, 1240, 1117, 1092, 1024, 1015, 978, 953, 903, 881, 795, 743, 718, 658, 559 cm^-1.

P r z y k ł a d 3

Maleinian chlorku (1:1) N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-chinolinokarboksyimidoilu

Związek wyjściowy: przykład 42

W tym przypadku produkt końcowy wyodrębniono w ostatnim etapie obróbki przez rozpuszczenie surowej zasady w acetonie i dodanie równoważnej ilości kwasu maleinowego.

Wydajność: 67%

T.t. = 159 - 162°C

IR (KBr): 3427, 3019, 2947, 2886, 2689, 1583, 1477, 1450, 1352, 1293, 1221, 1194, 1132, 1072, 1045, 939, 919, 872, 833, 754, 650, 557 cm^-1.

P r z y k ł a d 4

Monochlorowodorek chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-nitrobenzenokarboksyimidoilu

Związek wyjściowy: przykład 40

Wydajność: 58%

T.t. = 185 - 189°C

P r z y k ł a d 5

Monochlorowodorek chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-4-nitrobenzenokarboksyimidoilu

Związek wyjściowy: przykład 43

Wydajność: 47%

T.t. = 180 - 182°C

IR (KBr): 3331, 2953, 2853, 2735, 2654, 2577, 2548, 1605, 1568, 1516, 1456, 1348, 1261, 1165, 1119, 1072, 1059, 1007, 960, 933, 862, 849, 754, 719, 690, 673, 627, 581, 550, 478 cm^-1.

P r z y k ł a d 6

Monochlorowodorek chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-2-nitrobenzenokarboksyimidoilu

Związek wyjściowy: przykład 45

Wydajność: 50%

T.t. = 159 - 162°C

IR (KBr): 3298, 2983, 2932, 2746, 1593, 1574, 1535, 1445, 1391, 1354, 1317, 1288, 1242, 1198, 1117, 1092, 1069, 1020, 968, 947, 914, 852, 793, 756, 708, 577 cm^-1.

P r z y k ł a d 7

Monochlorowodorek chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-2-furanokarboksyimidoilu

Procedura:

W wodzie (1,8 ml) rozpuszczono 1-chloro-2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propan [J. Org. Chem. 33(2) s. 523-30 (1968)] (3,0 g, 116,9 mmola), a potem dodano stałego NaOH (1,19 g, 29,8 mmola) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Do tej mieszaniny dodano N-hydroksy-2-furanokarboksyimidoamidu (1,92 g, 15,2 mmola) i całość mieszano w temperaturze pokojowej w ciągu nocy. Dodano stężonego kwasu solnego (2,1 ml) w celu doprowadzania odczynu roztworu do pH około 4, a potem roztwór odparowano do sucha.

Pozostałość (5,4^g) rozpuszczono w stężonym HCl (37 ml) i ochłodzono do 0 - 5°C, a następnie w ciągu 30 minut wkroplono wodny roztwór NaNO2 (5,6 g, 80 mmoli w 23 ml wody). Roztwór zalkalizowano z użyciem 2N roztworu NaOH (102 ml) do wartości pH = 10, a potem wyekstrahowano octanem etylu (2 x 130 ml). Połączone fazy organiczne przemyto wodą, wysuszono nad bezwodnym (Na2SO4) i odparowano. Pozostałość (2,0 g) ponownie rozpuszczono w małej objętości octanu etylu (20 ml) i produkt wytrącono z użyciem izopropanolowego roztworu HCl (3,2N roztwór, 3 ml). Otrzymany biały osad odsączono, przemyto go i poddano rekrystalizacji z izopropanolu.

Wydajność: 11%

PL 195 634 B1

T.t. = 139 - 141°C

IR (KBr): 3427, 3267, 3094, 2955, 2922, 2964, 2745, 1637, 1584, 1479, 1452, 1391, 1319, 1281, 1259, 1157, 1117, 1074, 1024, 999, 980, 943, 887, 854, 843, 743, 710, 596 cm^-1.

Z użyciem powyższego sposobu otrzymano następujący związek:

P r z y k ł a d 8

Maleinian chlorku (1:1) N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-4-pirydynokarboksyimidoilu

Wydajność: 25%

T.t. = 165,5 - 169°C

P r z y k ł a d 9

Monochlorowodorek chlorku N-[3-[(1,1-dimetyloetylo)amino]-2-hydroksypropoksy]-3-trifluorometylobenzenokarboksyimidoililu

Procedura:

a) W mieszaninie sulfotlenku dimetylu i 170 ml wody rozpuszczono 50 g (0,245 mola) m-trifluorometylobenzamidoksymu i 33,7 g (0,6 mola) wodorotlenku potasowego i mieszaninę ochłodzono do 0°C. Dodano 48 ml (0,6 mola) epichlorohydryny i mieszaninę reakcyjną mieszano w 0°C przez 5 godzin, a następnie trzymano ją w lodówce przez noc. Następnego dnia dodano 250 ml wody i mieszaninę wyekstrahowano octanem etylu (4 x 250 ml). Połączone fazy organiczne przemyto wodą, wysuszono, poddano działaniu węgla drzewnego i odparowano do sucha, w wyniku czego otrzymano m-trifluorometylo-N-(2,3-epoksypropoksy]benzamidynę w postaci bezbarwnego oleju.

Wydajność: 61 g (96%)

b) Do otrzymanego oleju dodano 400 ml 18% roztworu kwasu solnego i 60 ml eteru i w trakcie mieszania ochłodzono mieszaninę do -5°C. W ciągu 40 minut dodano powoli 17,4 g (0,25 mola) azotynu sodowego rozpuszczonego w 60 ml wody i mieszaninę reakcyjną mieszano jeszcze przez 20 minut. Mieszaninę wyekstrahowano eterem (2 x 160 ml) i połączone fazy organiczne przemyto dwukrotnie wodą. Do tego eterowego roztworu dodano 340 ml 20% roztworu wodorotlenku sodowego i ten dwufazowy układ mieszano przez 1 godzinę w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin. Fazy rozdzielono i warstwę organiczną przemyto solanką do zobojętnienia, wysuszono i odparowano do sucha, w wyniku czego otrzymano chlorek m-trifluorometylo-N-(2,3-epoksypropoksy]benzimidoilu w postaci bezbarwnego oleju.

Wydajność: 30,5 g (45%)

c) Mieszaninę 1,19 g (4,2 mmola) chlorku N-[(2,3-epoksy)propoksy]-3-trifluorometylobenzenokarboksyimidoilu i 0,89 ml (8,5 mmola) t-butyloaminy w 12 ml alkoholu izopropylowego ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin przez 2 godziny. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w octanie etylu, dodano 0,98 ml metanolowego roztworu chlorowodoru (4,3N) i mieszaninę zatężono do małej objętości pod próżnią, a następnie rozcieńczono ją eterem. Wytrącony osad wyodrębniono i przemyto go zimnym eterem, a potem wysuszono.

Wydajność: 0,48 g (32%)

T.t. = 150 - 153°C

IR (KBr): 3423, 3233, 2978, 2880, 2784, 1620, 1570, 1479, 1441, 1400, 1383, 1340, 1238, 1167, 1128, 1101, 1072, 1038, 982, 930, 897, 804, 787, 714, 694 cm^-1.

Z użyciem powyższego sposobu otrzymano następujące związki:

P r z y k ł a d 10

Monochlorowodorek chlorku N-[2-hydroksy-3-[(1-metyloetylo)amino]propoksy]-3-trifluorometylobenzenokarboksyimidoilu

Wydajność: 30%

T.t. = 105 - 108°C

IR (KBr): 3358, 2984, 2883, 2804, 1595, 1441, 1383, 1335, 1238, 1184, 1171, 1121, 1099, 1074, 1011, 995, 947, 906, 891, 798, 779, 696, 681, 567 cm^-1.

P r z y k ł a d 11

Monochlorowodorek chlorku N-[3-(cykloheksyloamino)-2-hydroksypropoksy]-3-trifluorometylobenzenokarboksyimidoilu

Wydajność: 35%

T.t. = 147 - 149,5°C

PL 195 634 B1

IR (KBr): 3381, 2951, 2860, 2820, 1580, 1439, 1344, 1246, 1161, 1126, 1099, 1074, 1003, 986, 932, 903, 872, 802, 787, 716, 692, 681, 648 cm^-1.

P r z y k ł a d 12

Monochlorowodorek chlorku N-[3-(dietyloamino)-2-hydroksypropoksy]-3-trifluorometylobenzenokarboksyimidoilu

Wydajność: 21%

T.t. = 121 - 128°C

IR (KBr): 3425, 3289, 2951, 2667, 1818, 1443, 1337, 1238, 1178, 1115, 1078, 1049, 997, 910, 804, 781, 696, 683 cm^-1.

P r z y k ł a d 13

Monochlorowodorek chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-trifluorometylobenzenokarboksyimidoilu

Wydajność: 13%

T.t. = 119 - 123°C

IR (KBr): 3366, 2937, 2854, 2737, 2673, 2538, 1616, 1570, 1439, 1404, 1337, 1290, 1236, 1199, 1165, 1129, 1101, 1074, 1030, 984, 972, 933, 901, 829, 804, 788, 717, 699, 685, 646 cm^-1.

P r z y k ł a d 14

Chlorek N-[2-hydroksy-3-(piperydyno-1-oksyd-1-ylo)propoksy]-N'-oksy-3-pirydynokarboksyimidoilu

Procedura:

Do roztworu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (5,0 g, 17,1 mmola) w chloroformie (50 ml) dodano małymi porcjami kwasu m-chloronadbenzoesowego (7,0 g, 40 mmoli) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Rozpuszczalnik usunięto, a pozostałość rozpuszczono w 80 ml octanu etylu, wyekstrahowano wodą, wysuszono i odparowano. Otrzymany oleisty produkt poddano krystalizacji z acetonu i otrzymano produkt w postaci szarawej substancji stałej.

Wydajność: 2,21 g (6,7 mmola, 40%)

T.t. = 140 - 142°C

IR (KBr): 3437, 3071, 2943, 2880, 2590, 1801, 1578, 1475, 1454, 1433, 1375, 1294, 1259, 1194, 1165, 1121, 1088, 1043, 1011, 995, 924, 905, 888, 845, 808, 710, 671, 554, 513, 413 cm^-1.

P r z y k ł a d 15

Chlorek N-[2-hydroksy-3-(piperydyno-1-oksyd-1-ylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu

Procedura:

Do roztworu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (2,0 g, 6,8 mmola) w chloroformie (20 ml) dodano kwasu m-chloronadbenzoesowego (1,6 g, o czystości 70%, 6,5 mmola) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Roztwór zalkalizowano 10% roztworem wodorotlenku sodowego, a następnie warstwy rozdzielono i warstwę organiczną przemyto solanką, wysuszono i odparowano. Stałą pozostałość poddano rekrystalizacji z octanu etylu i otrzymano produkt w postaci białej substancji stałej.

Wydajność: 1,03 g (48%)

T.t. = 121 - 130°C

IR (KBr): 3454, 2988, 2945, 2880, 2585, 1585, 1512, 1479, 1443, 1416, 1393, 1350, 1331, 1289, 1183, 1134, 1072, 1051, 1030, 997, 953, 939, 879, 847, 808, 702, 519, 417 cm^-1.

P r z y k ł a d 16

Dijodek chlorku N'-[2-hydroksy-3-(1-metylo-1-piperydynio-1-ilo)propoksy]-N-metylopirydynio-3-karboksyimidoilu

Procedura:

Mieszaninę chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (1,0 g, 3,4 mmola) i 1,2 ml (20 mmoli) jodku metylu w acetonie (10 ml) ogrzewano w atmosferze azotu i w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin przez 2 godziny. Powstały ciemnożółty osad odsączono, przemyto acetonem i otrzymano surowy produkt (1,8 g), który poddano rekrystalizacji z 20 ml etanolu.

Wydajność: 1,2 g (60%)

T.t. = 153 - 157°C

IR (KBr): 3462, 3406, 3317, 3040, 2941, 2878, 2831, 1729, 1636, 1589, 1504, 1462, 1378, 1350, 1290, 1209, 1171, 1121, 1069, 1047, 1030, 1001, 941, 897, 868, 818, 706, 673, 635, 589 cm^-1.

PL 195 634 B1

P r z y k ł a d 17

Maleinian chlorku (1:1) N-[2-acetoksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu

Procedura:

W 5 ml bezwodnika octowego rozpuszczono 1,48 g (5,0 mmoli) chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu. Temperatura reakcji wzrosła do 40°C. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej rozpuszczalnik usunięto całkowicie pod próżnią, a pozostałość rozpuszczono w 30 ml eteru dietylowego, poddano działaniu węgla drzewnego, przesączono i rozpuszczalnik usunięto pod próżnią, w wyniku czego otrzymano 1,74 g pomarańczowego oleju.

Tę pozostałość rozpuszczono w 10 ml acetonu i dodano roztworu 0,6 g (5,17 mmola) kwasu maleinowego w 10 ml acetonu. Krystaliczny produkt odsączono i przemyto go acetonem, w wyniku czego otrzymano 1,43 g szarawej substancji. Po rekrystalizacji i odbarwieniu z 9 ml alkoholu izopropylowego otrzymano związek tytułowy.

Wydajność: 1,22 g (54%)

T.t. = 143 - 144°C

P r z y k ł a d 18

Maleinian chlorku (1:1) (S)-N-[2-[2-(R)-(1,1-dimetyloetyloksykarbonyloamino)-3-fenylopropionyloksy]-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu

Procedura:

W 50 ml dichlorometanu rozpuszczono 6,7 g (25,5 mmola) N-(t-butoksykarbonylo)-D-fenyloalaniny. Roztwór ochłodzono do 0°C i wkroplono 4,0 ml trietyloaminy, a potem 2,5 ml (26 mmoli) chloromrówczanu etylu. Mieszaninę mieszano w 0°C przez 20 minut, a następnie w ciągu 30 minut dodano roztworu 7,5 g (26 mmoli) chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu w 50 ml dichlorometanu. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę . Roztwór wyekstrahowano najpierw 10% roztworem kwasu octowego (2 x 100 ml), a następnie wodą, wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodowym i odparowano do sucha. Pozostałość (10,7 g) rozpuszczono w 71 ml acetonu i dodano 1,53 g (13 mmoli) kwasu maleinowego. Powstałą substancję stałą odsączono i przemyto acetonem.

Wydajność: 4,0 g (6,0 mmola, 23%)

T.t. = 146,5 - 148°C

[a]_D = + 21,5° (c = 1 MeOH).

IR (KBr): 3393, 2978, 1744, 1697, 1582, 1518, 1468, 1454, 1420, 1381, 1358, 1313, 1290, 1256, 1213, 1169, 1126, 1099, 1084, 1045, 1016, 930, 908, 870, 750, 690, 575 cm^-1.

Z użyciem powyższego sposobu otrzymano następujący związek:

P r z y k ł a d 19

Maleinian chlorku (1:1) (R)-N-[2-[2-(S)-(1,1-dimetyloetyloksykarbonyloamino)-3-fenylopropionyloksy]-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu

Wydajność: 25%

Ten związek miał takie same dane fizyczne (t.t., IR), jak w przykładzie 18.

[a]_D = -23,6° (c = 1, MeOH).

P r z y k ł a d 20

Maleinian (1:1) N-[2-benzoiloksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoamidu

Procedura:

W 300 ml benzenu rozpuszczono 20,9 g (75,0 mmoli) N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoamidu [węgierski opis patentowy nr 177578 (1976)]. Do tego roztworu dodano 150 ml 1N roztworu wodorotlenku sodowego, a następnie wkroplono 19,5 ml (168 mmoli) chlorku benzoilu. Mieszaninę mieszano intensywnie przez 2 godziny, a następnie dodano 7,1 g (67 mmoli) węglanu sodowego, a potem jeszcze porcję chlorku benzoilu (9,75 ml, 84 mmoli) i mieszanie kontynuowano przez noc. Fazy rozdzielono i warstwę organiczną wyekstrahowano 1N roztworem wodorotlenku sodowego i wodą, wysuszono i odparowano ją do sucha. Pozostałość (41 g oleju) rozpuszczono w 150 ml acetonu i dodano 8,7 g (75 mmoli) kwasu maleinowego. Otrzymany osad odsączono, przemyto acetonem i wysuszono.

Wydajność: 29,1 g (78%)

T.t. = 194 - 195°C

Z użyciem powyższego sposobu otrzymano następujący związek:

PL 195 634 B1

P r z y k ł a d 21

Maleinian chlorku (1:1) N-[2-benzoiloksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu

Związek wyjściowy: opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5147879 (1992)

Wydajność: 64%

T.t. = 134 - 136°C

IR (KBr): 2955, 2939, 2517, 1718, 1583, 1477, 1452, 1410, 1370, 1354, 1317, 1268, 1209, 1173, 1117, 1057, 1043, 998, 968, 939, 903, 870, 748, 723, 714, 652, 582 cm^-1.

P r z y k ł a d 22

Monochlorowodorek N-[2-palmitoiloksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoamidu

Procedura:

W 160 ml chloroformu rozpuszczono 14,7 g (52,8 mmola) N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoamidu [węgierski opis patentowy nr 177578 (1976)] i dodano 7,7 ml (55 mmoli) trietyloaminy, a następnie wkroplono roztwór chlorku palmitoilu (14,7 g 56,5 mmola) w 85 ml chloroformu. Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez noc. Następnego dnia dodano jeszcze 3,8 ml trietyloaminy, a potem 7,4 g chlorku palmitoilu i mieszanie kontynuowano jeszcze przez jeden dzień. Roztwór wyekstrahowano kolejno wodą, 5% kwasem octowym i wodą, wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodowym i odparowano do sucha. Pozostałość (28,2 g, olej) rozpuszczono w octanie etylu i produkt wytracono z użyciem 30 ml 1N roztworu HCl/octanie etylu. Gę sty biały osad odsączono, przemyto go octanem etylu i wysuszono.

Wydajność: 10,9 g (37%)

T.t. = 110 - 113°C

Z użyciem powyższego sposobu otrzymano nastę pujące związki:

P r z y k ł a d 23

Dichlorowodorek chlorku N-[2-palmitoiloksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu

Uwaga: reakcję przeprowadzono w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin.

Wydajność: 72%

T.t. = 69 - 73,5°C

IR (KBr): 3425, 2922, 2853, 2648, 2544, 1742, 1632, 1468, 1416, 1377, 1287, 1183, 1113, 1087, 1032, 984, 708, 675 cm^-1.

P r z y k ł a d 24

Maleinian (1:1) N-[2-(2-furoiloksy)-3-(1-piperydynylo)propoksy-3-pirydynokarboksyimidoamidu

Uwaga: produkt wyodrębniono w postaci soli kwasu maleinowego.

Wydajność: 52%

T.t. = 167 - 171,5°C

P r z y k ł a d 25

Monochlorowodorek N-[2-(o-chlorobenzoiloksy)-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoamidu

Wydajność: 50%

T.t. = 91 - 94°C

P r z y k ł a d 26

Monochlorowodorek N-[2-(p-metoksybenzoiloksy)-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoamidu

Wydajność: 71%

T.t. = 152 - 155°C

P r z y k ł a d 27

Monochlorowodorek N-[2-(m-triflurometylobenzoiloksy)-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoamidu

Wydajność: 45%

T.t. = 144 - 147°C

PL 195 634 B1

P r z y k ł a d 28

Maleinian (1:1) N-[2-(2-tenoiloksy)-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoamidu

Uwaga: reakcję przeprowadzono w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin i produkt wyodrębniono w postaci soli kwasu maleinowego.

Wydajność: 58%

T.t. = 168 - 176°C

P r z y k ł a d 29

Monochlorowodorek N-[2-acetoksy-3-[(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoamidu

Procedura:

W 27 ml chloroformu rozpuszczono 2,5 g (9,0 mmoli) N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoamidu, dodano 1,6 g (16 mmoli) bezwodnika octowego i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Mieszaninę reakcyjną odparowano do sucha i rozpuszczono ją w alkoholu izopropylowym zawierającym równomolową ilość (9 mmoli) bezwodny kwas chlorowodorowy. Roztwór ochłodzono, a substancję stałą odsączono i poddano ją rekrystalizacji z alkoholu izopropylowego, w wyniku czego otrzymano biały krystaliczny związek.

Wydajność: 1,9 g (59%)

T.t. = 107°C

P r z y k ł a d 30

Maleinian (1:1) N-[2-(3-pirydynylokarbonyloksy)-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoamidu

Procedura:

Do roztworu N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoamidu (1,68 g, 6 mmoli) w bezwodnej pirydynie 1,68 g (7,4 mmola) dodano bezwodnika nikotynowego i cał o ść pozostawiono w temperaturze pokojowej na noc. Mieszaninę odparowano, a pozostałość rozpuszczono w 30 ml octanu etylu i przesączono. Przesącz wyekstrahowano 10% roztworem NaHCO3, wysuszono i odparowano. Otrzymany olej rozpuszczono w 20 ml acetonu i dodano 0,53 g kwasu maleinowego, w wyniku czego wytrącił się osad. Produkt odsączono i przemyto acetonem.

Wydajność: 1,84 g (61%)

T.t. = 157 - 160°C

P r z y k ł a d 31

Dichlorowodorek N-[3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoamidu

Procedura:

W 20 ml absolutnego etanolu rozpuszczono 2,86 g (51,1 mmola) wodorotlenku potasowego, a następnie dodano 6,45 g (47,0 mmoli) N-hydroksy-3-pirydynokarboksyimidoamidu i 7,7 g (47,7 mmola) 1-chloro-3-(1-piperydynylo)propanu i całość ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin przez 9 godzin. Substancję stałą odsączono i przesącz odparowano. Ten surowy produkt rozpuszczono w 100 ml chloroformu, przemyto kolejno 1N roztworem wodorotlenku sodowego, a potem trzykrotnie wodą. Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodowym, a przesącz i rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciś nieniem. Pozostał o ść rozpuszczono w małej iloś ci absolutnego etanolu i dodano alkoholu izopropylowego zawierającego bezwodny kwas chlorowodorowy (pH 2), w wyniku czego otrzymano szarawe kryształy.

Wydajność: 4,8 g (38%)

T.t. = 95 - 100°C (rozkład).

IR (KBr, zasada): 3422, 3294, 3107, 2984, 2937, 2870, 2818, 1649, 1616, 1593, 1479, 1462, 1441, 1381, 1309, 1194, 1123, 1094, 1059, 1042, 982, 910, 858, 816, 712, 559 cm^-1.

Z użyciem powyższego sposobu otrzymano nastę pujące związki:

P r z y k ł a d 32

Monochlorowodorek N-[3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-trifluorometylobenzenokarboksyimidoamidu

Wydajność: 42%

T.t. = 116 - 119°C

IR (KBr, zasada): 3412, 3082, 2949, 2874, 2827, 1655, 1485, 1447, 1383, 1325, 1283, 1171, 1121, 1094, 1072, 986, 920, 905, 808, 700, 677, 627 cm^-1.

P r z y k ł a d 33

Dichlorowodorek N-[3-(1-piperydynylo)propoksy]-(3,4-dimetoksyfenylo)metanokarboksyimidoamidu

Wydajność: 35%

T.t. = 207 - 209°C

PL 195 634 B1

P r z y k ł a d 34

N-[2,2-Dimetylo-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoamid Wydajność: 38% (olej).

IR (KBr): 3323, 2935, 2888, 2785, 1637, 1477, 1393, 1360, 1157, 1111, 1057, 995, 943, 860,

814, 789, 708, 627 cm^-1.

P r z y k ł a d 35

Monochlorowodorek N-[3-(4-metylo-1-piperazynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoamidu

Wydajność: 23%

T.t. = 127 - 130°C

IR (KBr): 3387, 2947, 2878, 2802, 1730, 1639, 1450, 1389, 1283, 1242, 1194, 1150, 1083, 1015, 964, 933, 814, 710 cm^-1.

P r z y k ł a d 36

Monochlorowodorek N-[3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-nitrobenzenokarboksyimidoamidu

Wydajność: 51%

T.t. = 158 - 162°C

P r z y k ł a d 37

Dichlorowodorek N-[3-(1-piperydynylo)propoksy]benzenokarboksyimidoamidu

Wydajność: 64%

T.t. = 207 - 209°C

P r z y k ł a d 38

N-[2-Hydroksy-3-[(1-piperydynylo)propoksy]-2,4,6-trimetylobenzenokarboksyimidoamid

Wydajność: 44%

T.t. = 199 - 201°C

IR (KBr): 3410, 3103 2943, 2912, 2814, 2791, 1634, 1582, 1441, 1383, 1350, 1321, 1304, 1254, 1204, 1146, 1111, 1099, 1065, 993, 878, 851, 785, 754, 525 cm^-1.

P r z y k ł a d 39

Monochlorowodorek N-[2-hydroksy-3-[(1-piperydynylo)propoksy]-4-acetoaminobenzenokarboksyimidoamidu

Wydajność: 25%

T.t. = 133 - 137°C

P r z y k ł a d 40

Dichlorowodorek N-[2-hydroksy-3-[(1-piperydynylo)propoksy]-3-nitrobenzenokarboksyimidoamidu

Wydajność: 38%

T.t. = 190 - 193°C

P r z y k ł a d 41

Monochlorowodorek N-[2-hydroksy-3-[(1-piperydynylo)propoksy]-2-(1,5-dimetylo)pirolokarboksyimidoamidu

Wydajność: 20%

T.t. = 144 - 147°C

IR (KBr zasada): 3458, 3369, 2930, 2849, 1622, 1587, 1502, 1468, 1437, 1396, 1354, 1323, 1279, 1254, 1200, 1157, 1115, 1078, 1042, 988, 962, 930, 870, 856, 758, 737, 694, 609 cm^-1.

P r z y k ł a d 42

Dichlorowodorek N-[2-hydroksy-3-[(1-piperydynylo)propoksy]-3-chinolinokarboksyimidoamidu

Wydajność: 36%

T.t. = 210 - 211°C

P r z y k ł a d 43

Dichlorowodorek N-[2-hydroksy-3-[(1-piperydynylo)propoksy]-4-nitrobenzenokarboksyimidoamidu

Wydajność: 77%

T.t. = 184 - 189°C

P r z y k ł a d 44

Dichlorowodorek N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-2-tiofenokarboksyimidoamidu

Wydajność: 73%

T.t. = 157 - 170°C

IR (KBr): 3280(b), 2940, 1655, 1420, 1120, 1018, 1002, 857, 710 cm^-1.

PL 195 634 B1

P r z y k ł a d 45

Dichlorowodorek N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksyl]-2-nitrobenzenokarboksyimidoamidu

Wydajność: 47%

T.t. = 200 - 208°C

IR (KBr): 3300(b), 2960, 1670, 1535, 1347, 1155, 1020, 1002, 860, 800, 753 cm^-1.

P r z y k ł a d 46

Dichlorowodorek N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-1-izochinolinokarboksyimidoamidu

Wydajność: 56%

T.t. = 208 - 216°C

P r z y k ł a d 47

Dichlorowodorek N-[3-[(1,1-dimetyloetylo)amino]-2-hydroksypropoksy]-3-trifluorometylobenzenokarboksyimidoamidu

Procedura:

Mieszaninę 21,0 g (80,8 mmola) m-trifluorometylo-N-(2,3-epoksypropoksy)benzamidyny (przykład 9a), 105 ml t-butyloaminy, 210 ml eteru i 84 ml 4N roztworu wodorotlenku sodowego ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin przez 5 godzin. Fazy rozdzielono i fazę eterową przemyto solanką, wysuszono i odparowano do sucha. Powstały olej (25,8 g) rozpuszczono w 250 ml acetonu i poddano działaniu węgla drzewnego, a następnie dodano 39 ml 4N roztworu HCl/octanie etylu i w trakcie mieszania wytrącił się osad w postaci białej substancji stałej, który odsączono i przemyto acetonem.

Wydajność: 22,8 g (70%)

T.t. = 186 - 192°C (rozkład).

IR (KBr): 3418, 2984, 2785, 2625, 2527, 2401, 1664, 1585, 1487, 1437, 1381, 1329, 1173, 1155, 1130, 1078, 905, 874, 820, 692, 642, 594 cm^-1.

P r z y k ł a d 48

Monochlorowodorek N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-N'-butylo-3-pirydynokarboksyimidoamidu

Procedura:

a) Wytwarzanie chlorku N-[2-[(2-tetrahydropiranyl)oksy]-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu

W 500 ml chloroformu rozpuszczono chlorek (21,3 g, 71,4 mmola) N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu i całość zakwaszono do pH = 3 eterowym roztworem kwasu chlorowodorowego, a następnie dodano 32,6 ml (0,357 mola) 3,4-dihydro-2H-piranu. Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 20 godzin, przemyto ją trzykrotnie 200 ml porcjami 2N roztworu wodorotlenku sodowego i czterokrotnie 200 ml porcjami wody. Fazę organiczną wysuszono nad siarczanem sodowym, przesączono i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Oleistą pozostałość rozpuszczono w 600 ml octanu etylu i przemyto czterokrotnie 150 ml porcjami roztworu buforowego o pH = 5. Organiczny roztwór wysuszono, przesączono i odparowano.

Wydajność: 24,5 g (90%)

b) Mieszaninę 3,7 g (9,66 mmola) chlorku N-[2-[(2-tetrahydropiranyl)oksy]-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu i 40 ml (0,41 mola) n-butyloaminy ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin przez 3 godziny. Nadmiar aminy odparowano pod próżnią i otrzymano ciemnobrązowy olej, który rozpuszczono w 40 ml etanolu zawierającego 3,0 g kwasu 4-toluenosulfonowego i mieszaninę ogrzewano w 60°C przez 1 godzinę. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość zalkalizowano do pH 10 z użyciem 2N roztworu wodorotlenku sodowego, a następnie wyekstrahowano trzykrotnie chloroformem. Organiczny roztwór wysuszono nad siarczanem sodowym, przesączono, a rozpuszczalnik odparowano pod próżnią. Ciemną oleistą pozostałość oczyszczono drogą chromatografii i otrzymano czystą zasadę, którą rozpuszczono w 20 ml etanolu i zakwaszono ją równoważną ilością bezwodnego kwasu chlorowodorowego rozpuszczonego w alkoholu izopropylowym, w wyniku czego otrzymano związek tytułowy w postaci bladożółtej krystalicznej substancji stałej.

Wydajność: 1,22 g (34%)

T.t. = 120 - 122°C

IR (KBr zasada): 3319, 3293, 3040, 2959, 2928, 2854, 2842, 2552, 1612, 1580, 1450, 1427, 1399, 1333, 1315, 1221, 1196, 1171, 1126, 1103, 1051, 1022, 964, 928, 899, 858, 829, 719, 692, 602 cm^-1.

Z użyciem powyższego sposobu otrzymano następujący związek:

PL 195 634 B1

P r z y k ł a d 49

Monochlorowodorek N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-N'-cykloheksylo-3-pirydynokarboksyimidoamidu

Wydajność: 0,89 g (24%)

T.t. = 130 - 134°C

IR (KBr): 3280, 2935, 2853, 2640, 1720, 1619, 1551, 1514, 1452, 1404, 1313, 1236, 1194, 1155, 1124, 1111, 1090, 1040, 978, 828, 735, 627 cm^-1.

P r z y k ł a d 50

N-[2-Hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-N'-(1,1-dimetyloetylo)benzenokarboksyimidoamidu

Procedura:

Do roztworu 0,92 g (5,2 mmola) 1-chloro-2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propanu w 2 ml wody dodano 0,42 g (10,4 mmola) wodorotlenku sodowego i całość mieszano przez 1 godzinę. Do tej mieszaniny dodano 1,0 g (5,2 mmola) N-hydroksy-N'-(1,1-dimetyloetylo)benzenokarboksyimidoamidu rozpuszczonego w 20 ml etanolu i całość ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin przez 4 godziny. Rozpuszczalnik odparowano, dodano 50 ml wody i trzykrotnie wyekstrahowano z użyciem 50 ml porcji chloroformu. Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodowym, przesączono, a rozpuszczalnik odparowano pod próżnią. Żółta oleista pozostałość powoli wykrystalizowała w lodówce. Otrzymane kryształy roztarto w eterze dietylowym i odsączono.

Wydajność: 0,55 g (31%)

T.t. = 134 - 137°C

IR (KBr): 3427, 3254, 2929, 2853, 2814, 1739, 1603, 1510, 1445, 1391, 1367, 1302, 1281, 1190, 1140, 1117, 1094, 1067, 1036, 993, 963, 922, 841, 789, 716, 675 cm^-1.

P r z y k ł a d 51

Monochlorowodorek N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-N',N'-dietylo-3-pirydynokarboksyimidoamidu

Procedura:

W 25 ml absolutnego etanolu rozpuszczono 0,66 g (16,6 mmola) wodorotlenku sodowego, a następnie dodano 1,61 g (8,3 mmola) N-hydroksy-N',N'-dietylo-3-pirydynokarboksyimidoamidu i 1,48 g (8,3 mmola) 1-chloro-2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propanu i całość ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin przez 5 godzin. Rozpuszczalnik odparowano, a potem dodano 50 ml wody i trzykrotnie wyekstrahowano z użyciem 50 ml porcji chloroformu. Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodowym, przesączono, a rozpuszczalnik odparowano pod próżnią. Żółtą oleistą pozostałość oczyszczono drogą chromatografii i otrzymano czystą zasadę, którą rozpuszczono w 20 ml octanu etylu i zakwaszono równoważną iloś cią bezwodnego kwasu chlorowodorowego rozpuszczonego w octanie etylu, w wyniku czego otrzymano związek tytułowy w postaci białej krystalicznej substancji stałej.

Wydajność: 1,3 g (42%)

T.t. = 113 - 117°C

P r z y k ł a d 52

Monochlorowodorek N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]heksadekanoamidu

Procedura:

W 20 ml chloroformu rozpuszczono 1,74 g (10 mmoli) 1-aminoksy-2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propanu i całość ochłodzono do 0°C, a następnie wkroplono w ciągu 10 minut roztwór chlorku palmitoilu (2,85 g, 10 mmoli) w 10 ml chloroformu. Po mieszaniu mieszaniny przez 15 minut otrzymano biały osad, który odsączono, przemyto go chloroformem i wysuszono.

Wydajność: 3,2 g (71%)

T.t. = 147 - 150°C

IR (KBr): 3242, 3090, 2951, 2916, 2849, 1730, 1653, 1520, 1472, 1439, 1371, 1300, 1229, 1169, 1136, 1099, 1070, 1009, 993, 962, 928, 858, 760, 719, 602, 471 cm^-1.

Z użyciem powyższego sposobu otrzymano nastę pujące związki:

P r z y k ł a d 53

N-[3-(1-Piperydynylo)propoksy]-3-trifluorometylobenzamid

Związek wyjściowy: EP 365364 (1990)

Wydajność: 69% (olej).

IR (KBr): 3425, 2941, 2864, 2775, 1674, 1614, 1566, 1520, 1483, 1441, 1393, 1337, 1319, 1277, 1187, 1129, 1072, 922, 914, 750, 698, 650 cm^-1.

PL 195 634 B1

P r z y k ł a d 54

N-[2-Hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]naftaleno-1-karboksyamid

Wydajność: 54%

T.t. = 104 - 107°C

IR(KBr): 3375, 2934, 1641, 1593, 1564, 1439, 1340, 1325, 1113, 1026, 941, 810, 779 cm^-1.

P r z y k ł a d 55

N-[2-Hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-N'-heptylomocznik

Procedura:

Do roztworu 1,23 g (7,1 mmola) 1-aminoksy-2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propanu rozpuszczonego w 20 ml chloroformu dodano 1,0 g (7,1 mmola) izocyjanianu heptylu i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 20 godzin. Rozpuszczalnik odparowano pod próżnią, a pozostałość oczyszczono drogą chromatografii i otrzymano czysty bezbarwny olej, po którego roztarciu z eterem naftowym otrzymano biały krystaliczny produkt.

Wydajność: 81%

T.t. = 49 - 51°C

Z użyciem powyższego sposobu otrzymano następujące związki:

P r z y k ł a d 56

N-[2-Hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-N'-propylomocznik

Wydajność: 50% (olej).

IR (KBr): 3319, 2934, 2878, 2802, 1666, 1551, 1456, 1393, 1308, 1155, 1092, 1040, 993, 889, 793 cm^-1.

P r z y k ł a d 57

N-Cykloheksylo-N'-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]mocznik

Wydajność: 67%

T.t. = 108 - 110°C

IR (KBr): 3319, 3287, 3188, 2930, 2853, 2797, 1637, 1574, 1452, 1354, 1331, 1300, 1101, 1098, 991 cm^-1.

P r z y k ł a d 58

N-Heksylo-N'-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]mocznik

Wydajność: 27%

T.t. = 50 - 52°C

IR (KBr): 3310, 2932, 2658, 2804, 1666, 1551, 1454, 1377, 1306, 1092, 1040, 995, 791, 725, 604 cm^-1.

P r z y k ł a d 59

N-(3-Chlorofenylo)-N'-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]mocznik

Wydajność: 34%

T.t. = 117 - 118°C

IR (KBr): 3250, 2939, 2900, 1670, 1597, 1551, 1491, 1429, 1329, 1252, 1119, 972, 775, 718, 700 cm^-1.

P r z y k ł a d 60

N-Cykloheksylo-N'-[2-hydroksy-3-[N-cykloheksylokarbamoilo-N-(1,1-dimetyloetylo)amino]propoksy]mocznik

Wydajność: 44%

T.t. = 151 - 152°C

IR (KBr): 3312, 2932, 2854, 1668, 1616, 1555, 1450, 1393, 1364, 1354, 1252, 1220, 1130, 941, 891 cm^-1.

P r z y k ł a d 61

N-Heksylo-N'-[3-(1-piperydynylo)propoksy]mocznik

Wydajność: 85% (olej).

IR (KBr): 3354, 2932, 2856, 2810, 2777, 1666, 1543, 1486, 1377, 1308, 1155, 1134, 1076 cm^-1.

P r z y k ł a d 62

N-t-Butylo-N'-[(2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy)]mocznik

Wydajność: 38%

T.t. = 71 - 73°C

IR (KBr): 3314, 2945, 2916, 1651, 1555, 1460, 1393, 1384, 1335, 1254, 1111, 988, 903, 839, 781 cm^-1.

PL 195 634 B1

P r z y k ł a d 63

N-(3-Nitrofenylo)-N'-[(2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]mocznik

Wydajność: 54%

T.t. = 137 - 139°C

IR (KBr): 3261, 2943, 2618, 1672, 1607, 1560, 1529, 1486, 1437, 1354, 1283, 1115, 802, 739 cm^-1.

P r z y k ł a d 64

5,6-Dihydro-5-(1-piperydynylo)metylo-3-(3-pirydylo)-4H-1,2,4-oksadiazyna

Procedura:

a) W 50 ml chlorku tionylu rozpuszczono 17,5 g (0,05 mola) dichlorowodorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoamidu i całość ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 1 godzinę, a następnie mieszaninę odparowano do sucha. Pozostałość rozpuszczono w 300 ml metanolu, poddano działaniu węgla drzewnego i po przesączeniu rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w minimalnej ilości etanolu i po umieszczeniu w lodówce otrzymano krystaliczny dichlorowodorek N-[2-chloro-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoamidu jako związek pośredni.

Wydajność: 13,2 g (71%)

T.t. = 127 - 145°C

b) Do roztworu 16,5 g (143,5 mmola) t-butanolanu potasowego rozpuszczonego w 150 ml t-butanolu dodano 13,2 g (35,7 mmola) dichlorowodorku N-[2-chloro-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoamidu. Mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 6 godzin, a następnie odparowano ją pod próżnią. Dodano 100 ml 5% roztworu wodorotlenku sodowego i mieszaninę trzykrotnie wyekstrahowano 300 ml porcjami octanu etylu. Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodowym, przesączono i odparowano do sucha. Pozostałość roztarto z eterem dietylowym i otrzymano związek tytułowy w postaci białych kryształów.

Wydajność: 3,5 g (38%)

T.t. = 157,5 - 158°C

P r z y k ł a d 65

N-[3-[(1,1-Dimetyloetylo)amino]-2-hydroksypropoksy]-3-trifluorometylobenzamid

Procedura:

W trakcie mieszania do roztworu 1,6 ml (15,2 mmola) t-butyloaminy w 8 ml etanolu dodano w temperaturze poniżej 20°C w ciągu 10 minut 1,3 ml (15,2 mmola) epichlorohydryny i całość odstawiono na trzy dni. Oddzielnie 0,8 g (14,3 mmola) wodorotlenku potasowego rozpuszczono w mieszaninie 20 ml etanolu i 3 ml wody, a następnie do tego roztworu dodano 3,42 g (15,2 mmola) soli potasowej N-hydroksy-3-(trifluorometylo)benzamidu i wcześniej przygotowanego roztworu epichlorohydryny i t-butyloaminy. Mieszaninę reakcyjną mieszano i ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 10 godzin, a następnie rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość roztarto w 20 ml dichlorometanu i 10 ml wody. Fazę organiczną oddzielono, przemyto ją 5 ml wody i 5 ml nasyconego roztworu chlorku sodowego, wysuszono nad siarczanem sodowym, przesączono i odparowano. Oleistą pozostałość poddano krystalizacji z mieszaniny acetonu i heksanu, w wyniku czego otrzymano związek tytułowy w postaci białego proszku.

Wydajność: 0,85 g (17,3%)

T.t. = 156 - 158°C

IR (KBr): 2976, 2858, 1612, 1556, 1379, 1352, 1313, 1273, 1165, 1130, 1072, 694 cm^-1.

P r z y k ł a d 66

Maleinian (1:1) metylo-N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidanu

Procedura:

W 60 ml absolutnego metanolu rozpuszczono 11,4 g (38,2 mmola) chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu, a następnie wkroplono w ciągu 5 minut 25 ml (0,1 mola) 25% metanolowy roztwór metanolanu sodowego. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze wrzenia przez pół godziny, a potem ją odparowano. Pozostałość mieszano z 210 ml dichlorometanu przez pół godziny, chlorek sodowy odsączono, a przesącz przemyto 50 ml wody, a następnie 50 ml nasyconego roztworu chlorku sodowego, wysuszono nad siarczanem magnezowym i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Ten surowy produkt (9,8 g) oczyszczono drogą chromatografii i otrzymano związek tytułowy w postaci bladożółtego oleju.

Wydajność: 2,9 g (29%)

PL 195 634 B1

Analiza elementarna dla C15H23N3O3:

	Obliczono	Stwierdzono
C%	61,4	61,2
H%	79,0	79,1
N%	14,3	14,5.
P r z y k ł a d 67

N-[2-Hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]iminowęglan dietylu

Procedura:

Mieszaninę 0,87 g (5 mmoli) 1-aminoksy-2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propanu i 1,1 g (5,5 mmola) ortowęglanu tetraetylu mieszano w 100°C przez 3 godziny w obecności katalitycznej ilości kwasu p-toluenesulfonowego. Po odparowaniu pozostałość oczyszczono drogą chromatografii kolumnowej (Merck Kieselgel 60) z elucją chloroformem/metanolem/stężonym roztworem NH4OH (30:5:0,2) i otrzymano związek tytułowy w postaci bladożółtego oleju.

Wydajność: 27,7% (olej) ¹³C-NMR (d, CDCl₃): 154,9 (s, C=N), 76,5 (t, N-OCH₂), 66,6 (d, CHOH), 64,5 (t, CH₃CH₂), 64,1 (t, CH₃CH₂), 61,5 (t, CHCH₂N), 54,8 (t, piperydyna), 26,0 (t, piperydyna), 24,2 (t, piperydyna), 14,9 (q, CH3), 14,1 (q, CH3).

P r z y k ł a d 68

N-[3-[(1,1-Dimetyloetylo)amino]-2-hydroksypropoksy]-O-etylo-N'-fenyloizomocznik

Procedura:

W 200 ml tetrahydrofuranu rozpuszczono 18,4 g (0,1 mola) N-fenylochloroformimidanu etylu (F. Lengfeld i J. Stieglitz: Am. Chem. J. 16, 70 (1894)) i 16,2 g (0,1 mola) 1-aminoksy-2-hydroksy-3-[(1,1-dimetyloetylo)amino]propanu (DE OF nr 2651083), a potem dodano 13,9 ml (0,1 mola) trietyloaminy i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 10 godzin. Powstały chlorowodorek trietyloaminy odsączono, przesącz odparowano pod próżnią, a pozostałość rozpuszczono w 200 ml chloroformu i przemyto 50 ml wody. Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodowym, przesączono i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Oleistą surową pozostałość oczyszczono drogą chromatografii i otrzymano związek tytułowy w postaci bladożółtego oleju.

Wydajność: 18,5 g (59,8%)

Analiza elementarna dla C16H27N3O3:

Obliczono Stwierdzono

C%	62,1	62,3
H%	8,8	8,5
N%	13,6	13,7
P r z y k ł a d 69

N-[3-(1-Piperydynylo)propoksy]-O-fenyloizokarboksyamid

Procedura:

W 50 ml benzenu rozpuszczono 3,16 g (20 mmoli) 1-aminoksy-3-(1-piperydynylo)propanu, a potem dodano 2,4 g (20 mmoli) cyjanianu fenylu i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Dodano dodatkowo 0,16 g (1,3 mmola) cyjanianu i mieszaninę mieszano jeszcze przez 12 godzin. Po odparowaniu pozostałość rozpuszczono w metanolu, a roztwór sklarowano z użyciem węgla aktywnego i odparowano. Produkt poddano krystalizacji z octanu etylu/alkoholu etylowego i otrzymano białą substancję.

Wydajność: 46,9%

T.t. = 63 - 70°C (octan etylu) ¹³C-NMR (d, D2O): 152,4; 129,9; 125,8; 119,9; 70,3; 57,4; 54,3; 53,2; 23,0; 22,7; 21,0.

P r z y k ł a d 70

N-[2-Hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-N'-pentametyleno-O-etyloizomocznik

Procedura:

W 40 ml tetrahydrofuranu rozpuszczono 2,7 g (0,01 mola) N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]iminowęglanu dietylu (patrz przykład 67) i 0,99 ml (0,01 mola) piperydyny i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a następnie odparowano ją do sucha. Pozostałość oczyszczono drogą chromatografii i otrzymano związek tytułowy w postaci oleju.

Wydajność: 2,1 g (67,1%)

PL 195 634 B1

Analiza elementarna dla C16H31N3O3:

	Obliczono	Stwierdzono
C%	61,3	61,1
H%	10,0	9,8
N%	13,4	13,6.
P r z y k ł a d 71

Chlorowodorek N,N-dimetylo-N'-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-N-fenyloguanidyny

Procedura:

W chloroformie rozpuszczono 1150 mg (6,58 mmola) 1-aminoksy-2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propanu (DE OF nr 2651083) i dodano 750 mg Na2CO3, a następnie wkroplono roztwór 1206 mg (6,58 mmola) N,N-dimetylo-N'-fenylochloroformamidyny (BR 888646 (1959), Bayer, autorzy: Kijhle i Eue L.: CA 57, 136961 (1962)) w 10 ml chloroformu. Po 5 godzinach substancję stałą odsączono, a przesącz odparowano. Pozostałość (1800 mg, olej) rozpuszczono w 10 ml octanu etylu i produkt wytrącono przez dodanie 10,46 ml 0,54N roztworu HCl w octanie etylu. Żółty osad odsączono, przemyto i poddano rekrystalizacji z octanu etylu, a potem acetonu.

Wydajność: 28%

T.t. = 127 - 129°C

IR (KBr): 3220, 2093, 2840, 2690, 2620, 1608, 1580, 1475, 1433, 1375, 1250, 1070, 1050, 1000, 925, 900, 760, 705 cm^-1.

P r z y k ł a d 72

N-[3-[(1,1-Dimetyloetylo)amino]-2-hydroksypropoksy]-N'-fenyloguanidyna

Procedura:

W 20 ml tetrahydrofuranu rozpuszczono 3,1 g (0,01 mola) N-[3-[(1,1-dimetyloetylo)amino]-2-hydroksypropoksy]-O-etylo-N'-fenyloizomocznika (patrz przykład 68), a potem dodano 200 ml 25% roztworu wodorotlenku amonowego i 0,26 g (5 mmoli) chlorku amonowego i mieszaninę utrzymywano w temperaturze pokojowej przez 15 godzin. Mieszaninę odparowano do sucha i oczyszczono drogą chromatografii, w wyniku czego otrzymano związek tytułowy w postaci oleju.

Wydajność: 1,7 g (60,7%)

Analiza elementarna dla C14H24N4O2:

Obliczono Stwierdzono

C%	60,0	60,2
H%	8,6	8,9
N%	20,0	19,8
P r z y k ł a d 73

Chlorowodorek N,N'-difenylo-N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]benzenokarboksyamidyny

Procedura:

W 2,5 ml wody rozpuszczono 3,55 g (20 mmoli) 3-piperydyno-2-hydroksy-1-propanu, dodano 0,8 g (20 mmoli) NaOH i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Do tej mieszaniny wkroplono roztwór 6,49 g (20 mmoli) chlorowodorku N,N'-difenylo-N-hydroksybenzenokarboksyamidyny w 60 ml alkoholu etylowego, a potem 0,8 g (20 mmoli) NaOH. Otrzymaną żółtą suspensję ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 2 godziny. Wytrącony chlorek sodowy odsączono i przemyto go alkoholem etylowym. Rozpuszczalnik odparowano, dodano 40 ml octanu etylu i dwukrotnie wyekstrahowano 40 ml porcjami wody destylowanej. Fazę organiczną wysuszono nad siarczanem sodowym i przesączono. Produkt wytrącono przez dodanie 5,5 ml 3,67N roztworu HCl w octanie etylu. Wytrącony produkt odsączono, przemyto i poddano rekrystalizacji z metanolu/eteru.

Wydajność: 42%

T.t. = 151 - 155°C (metanol/eter) ¹³C-NMR (d, CDCl3): 159,6, 148,0, 140,9, 131,0, 129,7, 129,3, 128,9, 128,5, 127,9, 127,5, 64,2, 60,2, 54,5, 22,7, 21,9.

P r z y k ł a d 74

N-[3-(1-Piperydynylo)propoksy]-N-metylo-N'-fenylo-O-etyloizokarboksyamid

Sposób wytwarzania tego związku był taki sam jak w przykładzie 68, lecz jako związki wyjściowe zastosowano 1-metyloaminoksy-2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propan i N-fenylochloroformimidan etylu.

Wydajność: 56% (olej)

PL 195 634 B1

Analiza elementarna dla C17H29N3O3:
	Obliczono	Stwierdzono
C%	66,4	66,2
H%	9,5	8,9
N%	13,7	13,9.

P r z y k ł a d 75

N-[2-Hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-N-metylo-N'-fenyloguanidyna

Sposób wytwarzania tego związku jest taki sam jak w przykładzie 72, lecz jako związek wyjściowy zastosowano N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-N-metylo-N'-fenylo-O-etyloizomocznik (patrz przykład 74).

Wydajność: 43% (olej)

Analiza elementarna dla C16H26N4O2:

Obliczono Stwierdzono

C%	62,7	62,2
H%	8,5	8,8
N%	18,3	18,4

P r z y k ł a d 76

N,N,N'-Trimetylo-N'-[3-(1-piperydynylo)propoksy]-N-fenyloguanidyna

Procedura:

W chloroformie rozpuszczono 344 mg (2,0 mmole) 1-metyloaminoksy-2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propanu i dodano 220 mg Na2CO3, a potem wkroplono roztwór 438 mg (2,0 mmole) chlorowodorku N,N-dimetylo-N'-fenylochloroformamidyny w 3 ml chloroformu. Po 8 godzinach substancję stałą odsączono i przesącz odparowano. Pozostałość rozpuszczono w octanie etylu i produkt wyekstrahowano przez dodanie roztworu HCl (pH = 1) do wody. Fazę wodną zalkalizowano do pH 11 przez dodanie 2N roztworu NaOH i wyekstrahowano ją octanem etylu. Fazę organiczną odparowano i oczyszczono drogą chromatografii kolumnowej i otrzymano związek tytułowy w postaci żółtego oleju.

Wydajność: 10% (olej) ¹³C-NMR (d, CDCl3): 156,6, 150,5, 128,4, 121,4, 120,5, 70,0, 55,9, 54,4, 40,6, 39,4, 25,8, 25,6, 24,3

P r z y k ł a d 77

Maleinian (1:1) chlorku (R)-(+)-N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu

Procedura:

W 40 ml metanolu przeprowadzono w stan suspensji 2,16 g (3,26 mmola) maleinianu (1:1) chlorku (S)-N-[2-[2-(R)-(1,1-dimetyloetyloksykarbonyloamino)-3-fenylopropionyloksy]-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (patrz przykład 18) i całość ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 1 godzinę, a potem odparowano do sucha. Pozostałość roztarto z 20 ml octanu etylu, a wytrącony osad odsączono i przemyto go octanem etylu. Ten surowy produkt poddano rekrystalizacji z alkoholu izopropylowego i otrzymano związek tytułowy.

Wydajność: 1,16 g (85%)

T.t. = 136 - 137°C

[a]_D: + 5,6° (c = 1, MeOH, t = 27°C)

P r z y k ł a d 78

Dichlorowodorek chlorku N-(3-piperydyno-1-propoksy)-3-pirydynokarboksyimidoilu

Mieszaninę 10 ml wody destylowanej i 4,36 ml stężonego kwasu solnego ochłodzono do 0°C i dodano do niej w trakcie mieszania 2 g (7,62 mmola) N-(3-piperydyno-1-propoksy)-3-pirydynokarboksyamidyny (patrz przykład 31). Do tego żółtego roztworu wkroplono w -5°C w ciągu 30 minut 2,7 g (3,81 mmola) azotynu sodowego rozpuszczonego w 10 ml wody. Zielonkawy roztwór mieszano w -5°C przez 1,5 godziny, po czym odczyn roztworu doprowadzono do pH 10 przez dodanie w trakcie chłodzenia 1N wodnego roztworu wodorotlenku sodowego. Roztwór trzykrotnie wyekstrahowano 40 ml chloroformu. Fazę organiczną przemyto 20 ml wody, wysuszono nad siarczanem sodowym i odparowano. Pozostałość oczyszczono drogą chromatografii kolumnowej (Merck Kieselgel 60) z elucją chloroformem/metanolem (1:1) i otrzymano 1,7 g (79,2%) zasady odpowiadającej związkowi tytułowemu.

Tytułowy chlorowodorek wytworzono z otrzymanej zasady przez dodanie etanolowego roztworu chlorowodoru.

T.t. = 165 - 167°C

IR (KBr) 3015, 2945, 2617, 2515, 2088, 1982, 1600, 1570, 1437, 1402, 1200, 1060, 988, 912,

806 cm^-1.

PL 195 634 B1

Powyższy związek wyjściowy można wytworzyć następującym sposobem:

W 20 ml absolutnego etanolu rozpuszczono 2,86 g (51,06 mmola) wodorotlenku potasowego i w trakcie mieszania dodano porcjami 6,45 g (47,0 mmoli) oksymu 3-pirydynokarboksyamidu, a potem wkroplono 7,7 g (47,66 mmola) 1-(3-chloropropylo)piperydyny rozpuszczonej w 5 ml etanolu. Po trwającej 9 godzin reakcji wytrącony chlorek potasowy odsączono, a etanolowy roztwór sklarowano z użyciem węgla aktywnego i odparowano. Pozostałość roztworzono w 100 ml chloroformu, przemyto trzykrotnie 100 ml porcjami 1N roztworu wodorotlenku sodowego, a potem 50 ml wody. Po rozdzieleniu, warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodowym, przesączono i odparowano. Oleista pozostałość wykrystalizowała po ochłodzeniu. Kryształy roztarto z 20 ml eteru, odsączono i wysuszono, w wyniku czego otrzymano beżowy produkt.

Wydajność: 4,8 g (38,9%)

IR (KBr): 3422, 3107, 2937, 2870, 2819, 1640, 1479, 1391, 1309, 1194, 1123, 1059, 1042, 982, 916 cm^-1.

Z użyciem powyższego sposobu otrzymano nastę pujący związek:

P r z y k ł a d 79

Chlorowodorek chlorku O-(3-piperydynopropylo)-3-nitrobenzhydroksyimoilu Wydajność: 50%

T.t. = 173 - 175°C

IR (KBr): 3420, 2926, 2953, 2649, 2546, 1514, 1591, 1533, 1452, 1354, 1259, 1252, 1049, 994, 733 cm^-1.

2. Przykłady preparatów P r z y k ł a d 1: Tabletka

Tabletkę zawierającą 50 mg substancji czynnej wytworzono z następujących składników:

Monochlorowodorek chlorku

N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-2-tiofenokarboksyimidoilu 50,0 mg

Skrobia kukurydziana 100,0 mg

Laktoza 95,0 mg

Talk 4,5 mg

Stearynian magnezowy 0,5 mg

Tę substancję czynną zmielono drobno, zmieszano z dodatkami, mieszaninę zhomogenizowano i zgranulowano. Granulaty sprasowano w tabletki.

P r z y k ł a d 2: Tabletka

Tabletkę zawierającą 5 mg substancji czynnej wytworzono z następujących składników:

Monochlorowodorek chlorku

N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-2-nitrobenzimidoilu 5,0 mg

Skrobia kukurydziana 75,0 mg

Laktoza 7,5 mg

Krzemionka koloidalna 7,5 mg

Stearynian magnezowy 5,0 mg

Środek wytworzono z powyższych składników sposobem z przykładu 1.

P r z y k ł a d 3: Tabletka

Maleinian (1:1)

N-[2-benzyloksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidamidu 5,0 mg Skrobia kukurydziana 75,0 mg

Żelatyna 7,5 mg

Celuloza mikrokrystaliczna (Apical) 25,05 mg

Stearynian magnezowy 2,5 mg

Środek wytworzono z powyższych składników sposobem z przykładu 1.

PL 195 634 B1

10	mg
80	mg
25	mg
3	mg
3	mg
2	mg

P r z y k ł a d 4: Kapsułka

Kapsułkę zawierającą 10 mg substancji czynnej wytworzono z następujących składników: Monochlorowodorek

N-[2-palmitoiloksy-3-(piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoamidu Laktoza

Skrobia kukurydziana Talk

Krzemionka koloidalna Stearynian magnezowy

Tę substancję czynną zmieszano z dodatkami, mieszaninę zhomogenizowano i napełniono nią żelatynowe kapsułki.

P r z y k ł a d 5: Kapsułka

Kapsułkę zawierającą 20 mg substancji czynnej wytworzono z następujących składników: Monochlorowodorek chlorku

N-[2-hydroksy-3-(piperydynylo)propoksy]-2-tiofenokarboksyimidoilu 20 mg

Celuloza mikrokrystaliczna (Apical) 99 mg

Bezpostaciowa krzemionka 1 mg

P r z y k ł a d 6: Drażetka

Drażetkę zawierającą 25 mg substancji czynnej wytworzono z następujących składników: Chlorowodorek N-{3-[(1,1-dimetyloetylo)amino]-2-hydroksypropoksy}-3-trifluorometylobenzamidyny 25 mg

Karboksymetyloceluloza 295 mg

Kwas sterynowy 20 mg

Acetoftalan celulozy 40 mg

Substancję czynną zmieszano z karboksymetylocelulozą i kwasem stearynowym i mieszaninę zgranulowano w roztworze octanoftalanu celulozy w 200 ml etanolu-octanu etylu. Granulat sprasowano w rdzeń, który powleczono roztworem poliwinylopirolidonu zawierającego 5% cukru.

P r z y k ł a d 7: Preparat do wstrzyknięć

Preparat do wstrzyknięć wytworzono z następujących składników:

Chlorek N-[2-hydroksy-3-(piperydynylo)-propoksy]-2-nitrobenzimidoilu 5,0 mg

Jałowy roztwór soli fizjologicznej 2,0 ml

P r z y k ł a d 8: Maść

Maść wytworzono z następujących składników:

Monochlorowodorek chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-2-tiofenokarboksyimidoilu 7,5 g

Kwas stearynowy 18,0 g

Alkohol cetylostearylowy 15,0 g

Monostearynian gliceryny 4,0 g

Laurylosiarczan sodowy 1,5 g p-Hydroksybenzoesan metylu 0,2 g

Woda destylowana 150 ml

Kwas stearynowy, alkohol cetylostearylowy i monostearynian gliceryny stopiono razem. Laurylosiarczan sodowy i p-hydroksybenzoesan metylu rozpuszczono w 100 ml wody w trakcie lekkiego ogrzewania, a następnie dodano do składników lipofilowych i całość mieszano do uzyskania temperatury pokojowej, a potem dodano roztworu substancji czynnej w 50 ml wody i całość dokładnie zmieszano.

P r z y k ł a d 9: Maść

Maść wytworzono z następujących składników:

Monochlorowodorek chlorku N-[2-hydroksy-3-piperydynylopropoksy]-2-nitrobenzimidoilu 7,0 g Polisorbat 4,0 g

Ciekła parafina 4,0 g

Alkohol cetylostearylowy 12,0 g

Wazelina biała 20,0 g

Monostearynian gliceryny 4,0 g p-Hydroksybenzoesan metylu 0,2 g

PL 195 634 B1

Alkohol etylowy 1,8 g

Woda destylowana 150 ml

Środek wytworzono sposobem opisanym w przykładzie 8.

P r z y k ł a d 10: Krem

Krem wytworzono z następujących składników:

Maleinian (1:1) N-[2-hydroksy-3-piperydynylopropoksy]-4-pirydynokarboksyimidoilu 10,0 g

Wazelina biała 90,0 g

Wosk biały 3,0 g

Alkohol cetylostearylowy 3,0 g

Tetraboran sodowy 4,0 g p-Hydroksybenzoesan metylu 0,2 g

Woda destylowana 90 ml

Roztwór rozpuszczalnych w wodzie składników dodano do ciepłej mieszaniny lipofilowych składników sposobem podobnym jak w przykładzie 8, a następnie do końcowej emulsji dodano wodnego roztworu substancji czynnej.

P r z y k ł a d 3. Wpływ maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu na ekspresję hsp w komórkach (badanie na poziomie translacyjnym)

3.1 Tło

Doświadczenia opisane w tej części prowadzono w celu określenia, czy maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu działa w kierunku zwiększenia ekspresji cząsteczkowego białka opiekuńczego przez komórkę. Akumulację różnych białek szoku cieplnego po okresie wystawienia na sam szok cieplny oraz na szok cieplny w połączeniu z podawaniem maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu badano dodając 10^-5 M maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu przed hipertermicznym zabiegiem, podczas zabiegu lub natychmiast po zabiegu na miogennych komórkach serca (komórki H9c2).

3.2 Materiały i metody

3.2 (a) Warunki hodowli komórek

Linię komórek pochodzącą z serca embrionu szczura H9c2 otrzymano z European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) (88092904). Komórki utrzymywano w temperaturze 37°C w pożywce Eagle w modyfikacji Dulbecco (DMEM) uzupełnionej 10% płodowej surowicy cielęcej (GIBCO) w termostacie JOUAN C02 (5% CO2).

3.2 (b) Działanie maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy)-3-pirydynokarboksyimidoilu i warunki szoku cieplnego

Szok cieplny wywołano w temperaturze 43°C w termostacie CO2 w danych odcinkach czasowych (20, 40, 60, 90 i 120 minut). Komórki trzymano następnie w temperaturze 37°C przez 6 godzin i białka ekstrahowano do badania metodą SDS-PAGE. Gdy przed szokiem cieplnym stosowano maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu, 10^-5 M maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu podawano na 16 godzin przed stresem. W innym zestawie doświadczeń maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu dodawano w stężeniu 10^-5 M zaraz po stresie cieplnym, podczas sześciogodzinnego okresu regeneracji. Doświadczenia powtarzano trzykrotnie.

3.2 (c) Metoda blottingu western

Dla celów SDS-PAGE, komórki hodowano na 6 cm szalkach Petriego. Ilość komórek na początku doświadczenia wynosiła 8 x 10^-5 i były one nadal w stanie przed zlaniem, gdy ekstrahowano białka. Po 6 godzinach regeneracji komórki przemyto dwa razy w PBS i zdrapano z powierzchni szalek do PBS. Z kolei komórki odwirowywano przez 5 minut przy 1500 obrotach na minutę i rozpuszczono w 100 μΐ zmodyfikowanego rozpuszczającego buforu (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, wyd. Sambrook, Fritsche, Maniatis, Bold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) zawierającego 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 15 Tritox N-100, 1 PMSF, 2 μg/ml aprotyniny, 1 μg/ml chymostatyny, 1 μg/ml pepstatyny, i poddano sonifikacji przez 3 x 20 s (przerwy 2 minuty, ustawienie 8).

Stężenie białka określono z próbek 5 μl w próbie Bradforda (M. M. Braford, Anal. Biochem., 72: 248-254 (1976)) w trzech równoległych zestawach. Próbki dopełniono do 100 μg/30 μl powyższym buforem i następnym buforem tak, aby stężenie buforu w próbce wynosiło: 110 mM Tris-HCl pH 6,8,

8,3 mM merkaptoetanolu, 3% SDS, 3% gliceryny i pewna ilość błękitu bromofenolowego, a potem całość wytrząsano w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

PL 195 634 B1

Elektroforezę prowadzono według Laemmli (U.K. Laemmli, Nature, 227:680-685 (1970)) na dwu żelach poliakryloamidowych 8-18% przy stałym napięciu 50 V przez noc. Białka zabarwiano Coomassie Brilliant Blue R-250 lub przenoszono na membranę Immobilone PVDF (Millipore) przy stałym natężeniu prądu (300 mA) przez 3 godziny w temperaturze 4°C w buforze przenoszenia (10 mM CAPS, pH 11, 10% metanolu) (Protein Blotting Protocols for the Immobilon-P Transfer Membrane, 3, Laboratory Manual, Millipore). Po przeniesieniu niespecyficzne miejsca membrany zablokowano 2% BSA w TPBS (fizjologiczny roztwór soli buforowany fosforanem z 0,1% Tween 20) przez noc w temperaturze 4°C. Plamę inkubowano z monoklonalnym przeciwciałem grp94 (SPA-850, StressGen) rozcieńczonym 1:3000, z monoklonalnym przeciwciałem hsp60 (SPA-600, StressGen) rozcieńczonym 1:2700, z monoklonalnym przeciwciałem hsp72 (C92F34-5, StressGen) rozcieńczonym 1:1250 lub z monoklonalnym przeciwciałem hsp90 (AC88, StressGen) rozcieńczonym 1:2000, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie przemywano ją buforem TPBS przez 1 godzinę i inkubowano ze sprzężonym z peroksydazą chrzanową drugim przeciwciałem anty-szczurzym (Sigma, rozcieńczenie 1:4000, dla grp94) lub anty-mysim (Sigma, adsorbowane w ludzkie i szczurze białka surowicy, rozcieńczenie 1:3000 z użyciem hsp60, hsp72 lub hsp90) przez 1 godzinę. Po kolejnym przemyciu TPBS membranę rozwinięto z użyciem układu ECL (Amersham).

Serie rozcieńczeń całkowitego białka poddano blottingowi, rozwijając równolegle z próbkami za każdym razem, i obliczono krzywą kalibracji. Zmiany w zawartości białka stresu określano ilościowo stosując gęstościomierz Bio-Rad (Model 1650) i Hewlett-Packard Integrator (HP 3394A) i korygowano zgodnie z krzywą kalibracji. Przy obliczeniach dane densytometryczne dla danego pasma białka w temperaturze 37°C bez działania maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu przyjmowano za 100% i wszystkie inne natężenia porównywano z tą próbką.

3.2 (d) Analiza statystyczna

Dane podano jako średnie ± błąd standardowy. Statystyczne porównanie i obliczenie przeprowadzono metodą jednokierunkowej analizy wariancji z testem Posthoc Newmana-Keulsa (Pharmacological Calculation System). Statystyczną istotność zdefiniowano jako P <0,05.

3.3 Wyniki hsp60: Działanie maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu przeprowadzone w temperaturze 37°C nie miało mierzalnego wpływu na poziom tego hsp. Sam szok cieplny w temperaturze 43°C, trwający 20 minut, może zwiększać ilość hsp60 prawie dwukrotnie. Przedłużając czas działania ciepłem nie zauważono żadnego dalszego podwyższenia poziomu tego białka. Gdy dodawano maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu w stężeniu 10^-5 M 16 godzin przed stresem cieplnym, ilość hsp60 wzrastała około pięciokrotnie (w porównaniu z próbą kontrolną w temperaturze 37°C), nawet gdy próbki wystawiano na 20 minut działania ciepła. Ten wpływ maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu na poziom hsp60 był także widoczny w próbkach potraktowanych ciepłem odpowiednio przez 40 i 60 minut, jednak później zaczynał się zmniejszać. Maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu dodawany podczas fazy regeneracji był także skuteczny, ale w znacznie mniejszym stopniu, niż przy dodawaniu tego związku przed stresem.

hsp72: Ilość spoczynkowego hsp72 była raczej niska w komórkach H9c2, jednakże wpływ różnych zabiegów na poziom hsp70 był bardzo silny. Znaczący wzrost nastąpił już po 20 minutach szoku cieplnego, a po 40 minutach działania ciepłem ilość była prawie 10 razy wyższa, niż wykrywana w kontrolnych komórkach. Dział anie ciepł em przez dł u ż szy czas nie dał o znaczą cych zmian w porównaniu z próbką dla 40 minut. Podawanie maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu przed stresem cieplnym miało bardzo istotny wpływ. Przy 60 minutach stresu cieplnego poziom hsp72 wzrósł około 50 razy w porównaniu z próbkami dla 37°C, lecz znaczący wzrost można było wykryć już dla stresu cieplnego trwającego 40 minut. Te znaczne indukowane ilości hsp72 utrzymywały się trwale w komórkach po 120 minutach szoku cieplnego. Maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu dodawany podczas fazy regeneracji był także skuteczny, lecz w mniejszym stopniu.

hsp90: Po 20 minutach działania ciepłem sam szok temperaturowy nie potrafił podwyższyć poziomu hsp90, jednakże jeśli przed stresem cieplnym dodano maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu, poziom hsp90 wzrastał około pięciokrotnie. Największy wpływ preinkubacji można było zaobserwować przy połączeniu tego zabiegu z 60 minutami działania ciepłem. Interesujące jest spostrzeżenie, że w przypadku hsp90 dodanie maleinianu chlorku

PL 195 634 B1

N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu po ogrzewaniu przez 60 minut w temperaturze 43°C było tak skuteczne (jeśli nie bardziej), jak dodanie przed stresem temperaturowym. Oczywiście, inkubacja w temperaturze wyższej dłuższa niż 90 minut powoduje zanik wpływu maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu.

grp94: Indukcja tworzenia białka stresu grp94 występowała po 20 minutach szoku cieplnego. Wpływ ten miał maksimum przy działaniu ciepłem przez 60 minut, z ostrym spadkiem w przypadku próbek z próby z czasem 90 minut. Zdolność maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu do indukowania wzrostu stężenia grp94 występowała najsilniej gdy tego związku dodawano przed stresem, ale znaczący wzrost pojawiał się, gdy wstępne dodawanie leku łączono z 20 minutami szoku cieplnego (wzrost czterokrotny w porównaniu z działaniem przy 43°C). Z drugiej strony dodatek związku podczas regeneracji ze stresu cieplnego trwającego 40 lub 60 minut był prawie równie skuteczny jak podawanie maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu na 16 godzin przed stresem.

Figura 2 pokazuje analizę blottingu western białka z komórek H9c2. Użytymi sondami są: przeciwciało hsp60, pokazane na (1); przeciwciało hsp72, pokazane na (2); przeciwciało hsp90, pokazane na (3) i przeciwciało grp94, pokazane na (4). Ścieżka (-) reprezentuje komórki trzymane pod nieobecność maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu w temperaturze 37°C, a ścieżka (+) reprezentuje komórki trzymane w jego obecności (stężenie 10^-5 M przez 16 godzin). Szok cieplny w temperaturze 43°C przeprowadzono dla czasu wskazanego na rysunku. Maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu w stężeniu 10^-5 M dodano 16 godzin przed podziałaniem ciepłem (ścieżka (B)) lub podczas okresu regeneracji (ścieżka (A)).

Przegląd wpływu różnych zabiegów na ilość różnych hsp w komórkach serca H9c2 podano na Fig. 1. Ilość białka stresu w komórkach wystawionych tylko na stres cieplny (43°C) jest reprezentowana przez (A); ilość białka stresu w komórkach traktowanych 10^-5 M maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu przed działaniem ciepłem jest reprezentowana przez (B), a ilość białka stresu w komórkach potraktowanych 10^-5 M maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu podczas sześciogodzinnego okresu regeneracji jest reprezentowana przez (C). Oś pozioma reprezentuje czas trwania działania ciepłem, a oś pionowa reprezentuje względną ilość białka stresu.

Samo działanie ciepłem indukowało wszystkie rodzaje badanych hsp. Wzrost był mniej wyraźny dla hsp60. Poziom hsp60 podnosił się około dwukrotnie po wystawieniu komórek na działanie ciepła przez 20 minut, nie można było natomiast wykryć dalszego wzrostu po dłuższym działaniu ciepłem. Największy wpływ stresu cieplnego można było zauważyć w przypadku hsp72, ponieważ jego ilość wzrastała około 12 razy. Gdy dodawano maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu na 16 godzin przed działaniem ciepłem, poziom wszystkich hsp wzrastał dalej co najmniej dwukrotnie w porównaniu z obserwowanym przy stresie cieplnym. Było także jasne, że wśród hsp poziom hsp72 wzrastał w znacznie większym stopniu przy łączeniu stresu cieplnego i działania maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu w porównaniu z indukcją wykrywaną dla samego stresu cieplnego. Gdy maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu podawano podczas fazy regeneracji, prawie we wszystkich badanych przypadkach zawartość hsp wzrastała, ale i w tych próbach wzrost ilości hsp72 był największy.

3.4 Omówienie

Analiza metodą blottingu western wyjawiła zaskakującą akumulację różnych klas badanych hsp po wystawieniu komórek serca na szok cieplny. Dodatek maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu przed lub po stresie wysokotemperaturowym wzmacniał wpływ działania ciepłem na wytwarzanie hsp. Tak więc maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu działa w synergii ze stresem temperaturowym, indukując tworzenie wszystkich klas cząsteczkowych białek opiekuńczych.

P r z y k ł a d 4. Wpływ maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu na ekspresję hsp w komórkach (badanie na poziomie transkrypcyjnym)

4.1 Tło

Krótkie wystawienie na niedokrwienie (np. przez powtarzalne ogłuszanie) może przygotować serce i ochronić je przed kolejnym śmiertelnym niedokrwieniem, na co wskazuje spadek występowania migotania komór, zmniejszone rozmiary zawału i lepsza regeneracja regionalnych funkcji mięśnia sercowego podczas reperfuzji niedokrwionego serca. Wykazano, że takie przygotowanie indukuje

PL 195 634 B1 ekspresję hsp, szczególnie hsp72. W tej sekcji opisano badania wpływu maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu na ekspresję hsp72 drogą określenia akumulacji mRNA w komórce po niedokrwieniu i porównania jej z sytuacją, gdy niedokrwienie łączy się z podawaniem maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu.

4.2 Materiały i metody

4.2 (a). Indukcja stresem cieplnym

Doświadczenia prowadzono na samcach szczurów SPRD. Zwierzęta znieczulono Nembutalem w dawce 60 mg/kg dootrzewnowo. Temperaturę ciała szczurów utrzymywano przy pomocy lampy podczerwonej umieszczonej na tułowiu i mierzono temperaturę w odbycie. Po okresie 25-40 minut temperatura szczurów wzrastała do 42,0-42,2°C i tę temperaturę utrzymywano przez 15 minut. Po okresie regeneracji (2 godziny) próbki tkanek pobrano z lewej i prawej komory.

4.2 (b) Indukcja niedokrwienia serca

Doświadczenia prowadzono na samcach szczurów SPRD. Zwierzęta znieczulono Nembutalem w dawce 60 mg/kg dootrzewnowo. Po otwarciu klatki piersiowej i osierdzia, tętnicę wieńcową LAD okludowano na 5 minut i następnie badano występowanie i czas trwania komorowego częstoskurczu i migotania w okresie reperfuzji (10 minut). Próbki tkanki pobierano z lewej i prawej komory.

4.3 (c) Metoda blottingu northern

Całość RNA ekstrahowano stosując zestaw RNAgents (Promega) zgodnie z wskazówkami producenta (Protocols and Applications Guide. Wyd. 2, 1991, Promega Corporation). W skrócie, zamrożone próbki tkanki (próbki tkanki z lewej i prawej komory szczurów poddanych stresowi cieplnemu lub niedokrwieniu serca) ważące 50-100 mg homogenizowano w 1,0 ml denaturującego roztworu w temperaturze +4°C metodą homogenizacji Brinkmana. Następnie dodawano 1/10 (objętościowo) 3M octanu sodu (pH 4,0) i homogenizat ekstrahowano kwasowym fenolem (fenol:chloroform:alkohol izoamylowy 25:24:1) przez 10 s w wirówce. Próbkę inkubowano na lodzie przez 15 minut, a następnie odwirowano (4°C; 20 min, 10000 x g). Wodną fazę przenoszono do nowej probówki Eppendorfa, proces powtarzano i część wodną wytrącano w temperaturze -20°C przez noc. Po odwirowaniu (4°C; 20 min, 10000 x g) osad przemywano dwukrotnie 95% etanolem i osuszano w temperaturze pokojowej. RNA umieszczano w zawiesinie w 20 μΐ potraktowanej DEPC wody. 8 μg całkowitego RNA przepuszczano przez żel formaldehydowo-agarozowy metodą przenoszenia kapilarnego i RNA na żelu nanoszono na nylonową membranę zgodnie z instrukcjami wytwórcy (Zeta-Probe GT, BioRad).

Zawartość mRNA hsp72 w indywidualnych próbkach porównano z poziomem mRNA genu dehydrogenazy gliceryloaldehydo-3-fosforanu (GAPDH) w odpowiednich sondach. Sondy DNA (pełnej długości ludzki cDNA hsp70 i fragment Apa-NcoI szczurzego cDNA GAPDH) znakowano alfa-³²P CTP stosując Random Primed DNA Labeling Kit (USB). Radioznakowane fragmenty DNA oczyszczono na kolumnie Sephadex G-50 (Pharmacia) zgodnie z opisem (Ausubel i in. (wyd.)): Current Protocols in Molecular Biology: JOHN WILEY & SONS: 1987).

Prehybrydyzację prowadzono w temperaturze 65°C w buforze H (0,25 M Na2HPO4, pH 7,2, 7% SDS) przez 15 minut. Hybrydyzację prowadzono przez noc (65°C; bufor H) przy stężeniu znakowanej izotopem sondy co najmniej 10⁶ cpm/ml. Membranę przemyto 20 mM Na2HPO4, pH 7,2, 5% SDS (65°C; 2 x 15 min.) i oceniono metodą autoradiografii. Tej samej membrany użyto dla sondy hsp70, a także do pomiaru GAPDH i mRNA użytych jako wewnętrzne wzorce.

4.4 Wyniki

Okluzja wieńcowa przez 5 minut poprzedzała reperfuzję, która prowokowała komorowy częstoskurcz i migotanie komór u szczurów. Wstępne potraktowanie maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (0,5, 0,75, 1,0 mg/kg masy ciała dożylnie na 5 minut przed okluzją) zmniejszyła znacząco średni czas trwania komorowego częstoskurczu i zwiększyła szansę przeżycia zapobiegając migotaniu komór.

Podczas gdy wszystkie zwierzęta (n=6) z grupy kontrolnej zmarły podczas fazy reperfuzji, potraktowane maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (100 mg/kg doustnie) nie tylko przeżyły reperfuzję po 5 minutach okluzji, ale w preparatach ich mięśnia sercowego wykryto silnie zwiększoną ekspresję genu hsp72.

Figura 3 przedstawia analizę metodą blottingu northern całkowitego RNA wydzielonego z lewej komory serca szczura, ilustrującą wyniki otrzymane w doświadczeniu. Próba kontrolna (ścieżka 1); zabieg ciepłem (ścieżka 2); operacja sham (ścieżka 3); niedokrwienie (ścieżka 4); maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu plus niedokrwienie (ścieżka 5);

PL 195 634 B1 i maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (ścieżka 6). GADPH mierzono jako wewnętrzną sondę. Przy szoku cieplnym temperaturę w odbycie utrzymywano na poziomie 42°C przez 15 minut.

Należy zauważyć, że pod nieobecność stresu, podawanie samego maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu nie mogło aktywować genu hsp72.

P r z y k ł a d 5. Ochronny wpływ pochodnych hydroksyloaminy według wynalazku przy niedokrwieniu serca

Samce szczurów Sprague-Dawley (380-450 g) znieczulono pentobarbitalem sodu (Nembutal 60 mg/kg masy ciała, dootrzewnowo) i po tracheotomii sztucznie wentylowano powietrzem z otoczenia (2 ml/100 g; 54 uderzenia/minutę). Prawą arterię szyjną cewnikowano i połączono z przetwornikiem ciśnienia (BPR-01, Stoelting) w celu pomiaru układowego ciśnienia tętniczego krwi (BP) za pośrednictwem wzmacniacza wstępnego (Hg-02, Experimetria). Pochodne hydroksyloaminy opisane w przykładzie 5 podawano przez kaniulę żylną do żyły szyjnej (dożylnie) i doustnie. Szybkość pracy serca (HR) mierzono za pomocą kardiotachometru (HR-01, Experimetria). Elektrokardiogram (standardowe odprowadzenie II ECG) rejestrowano na rejestratorze (MR-12, Medicor) z użyciem podskórnych igłowych elektrod. Klatkę piersiową otworzono metodą torakotomii z lewej strony i serce wydobyto naciskając łagodnie na prawą stronę klatki piersiowej. Szybko umieszczono jedwabny szew 4-0 pod lewą główną arterią wieńcową zgodnie z opisem Selye i in. (1960). Serce ostrożnie umieszczono znów w piersi i pozostawiono zwierzę do regeneracji. Temperaturę odbytu obserwowano i ustalono na 37°C. Protokół doświadczalny rozpoczęto 15 minutami stabilizacji, podczas której zaobserwowanie trwałego ciśnienia krwi mniejszego niż 70 mmHg i/lub wystąpienia arytmii prowadziło do odrzucenia. Niedokrwienie mięśnia sercowego indukowano okluzją wieńcową przez 5 minut i reperfuzją przez 10 minut.

Podczas całego doświadczenia BP, HR i ECG rejestrowano w sposób ciągły na wielościeżkowym rejestratorze (R61-6CH, Medicor). Pochodne hydroksyloaminy, których tautomeryczne postacie przedstawiają wzory (I) i (II), podawano 5 do 60 minut przed okluzją odpowiednio po zabiegu dożylnym i doustnym. Dawki pochodnych hydroksyloaminy z przykładu 5 wynosiły 0,5; 0,75; 1,0 mg/kg dożylnie i 100 mg/kg masy ciała doustnie, podczas gdy odnośnikową substancję Bepridil podawano w dawce 1,0 mg/kg dożylnie.

Średni czas trwania częstoskurczu komór (VT) i/lub migotania komór (VF) podczas pierwszych 3 minut reperfuzji analizowano metodą jednokierunkowej analizy wariancji. Częstość wystąpienia VF analizowano stosując test χ-kwadrat. Zmienne hemodynamiczne analizowano stosując test χ-kwadrat. Zmienne hemodynamiczne analizowano stosując test t Studenta. Krytyczny poziom istotności ustawiono na p<0,05. Wszystkie wyniki wyrażono jako średnie ± błąd standardowy. Leki podawano dożylnie w dawce 1 mg/kg masy ciała na 5 minut przed okluzją.

Pochodne hydroksyloaminy szczególnie korzystne jako substancje chroniące zwierzęta przed uszkodzeniem niedokrwieniowym/reperfuzyjnym wymieniono poniżej w tabeli 1. Przeżycie (%) wskazuje procent zwierząt, które przeżyły wpływ 5 minut wieńcowej okluzji.

T a b e l a 1

Kod	Przeżycie (%)
1	2
Przykład 77 dożylnie 1 mg/kg	67
Przykład 78 dożylnie 1 mg/kg	100
Przykład 8 dożylnie 1 mg/kg	100
Przykład 13 dożylnie 1 mg/kg	60
Przykład 9 dożylnie 1 mg/kg	100
Przykład 10 dożylnie 1 mg/kg	67
Przykład 5 dożylnie 1 mg/kg	80
Przykład 6 dożylnie 1 mg/kg	100
Przykład 79 dożylnie 1 mg/kg	100

PL 195 634 B1 ciąg dalszy tabeli 1

1	2
Przykład 1 dożylnie 1 mg/kg	100
Przykład 16 dożylnie 1 mg/kg	67
Przykład 65 dożylnie 1 mg/kg	78
Przykład 54 dożylnie 1 mg/kg	80
Przykład 20 dożylnie 1 mg/kg	100
Przykład 22 dożylnie 1 mg/kg	100
Przykład 47 dożylnie 1 mg/kg	100
Przykład 39 dożylnie 1 mg/kg	60
Przykład 51 dożylnie 1 mg/kg	75
Przykład 64 dożylnie 1 mg/kg	100
Przykład 56 dożylnie 1 mg/kg	67
Przykład 57 dożylnie 1 mg/kg	67
Przykład 58 dożylnie 1 mg/kg	100
Przykład 59 dożylnie 1 mg/kg	86
Przykład 60 dożylnie 1 mg/kg	60
Przykład 61 dożylnie 1 mg/kg	83
Przykład 55 dożylnie 1 mg/kg	80
Przykład 66 dożylnie 1 mg/kg	57
Przykład 62 dożylnie 1 mg/kg	57
Przykład 63 dożylnie 1 mg/kg	50
Przykład 4 dożylnie 1 mg/kg	50
Kontrolne (nie potraktowane) n=24	10

Poza powyższymi związkami następujące związki okazały się dawać korzystne wyniki: maleinian chlorku (1:1) N-[2-hydroksy-3-(pirolidyn-1-ylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (opis patentowy US nr 5328906, przykład 12, 1 mg/kg masy ciała, % przeżywalności 67);

chlorowodorek chlorku (1:1) N-[2-hydroksy-3-(dietyloamino)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (opis patentowy US nr 5328906, przykład 11, 1 mg/kg masy ciała, % przeżywalności: 62);

maleinian chlorku (1:1) N-[2-hydroksy-3-(prop-2-yloamino)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (opis patentowy US nr 5328906, przykład 13/4, 1 mg/kg masy ciała dożylnie, % przeżywalności: 60); maleinian chlorku (1:1) N-[2-hydroksy-3-(morfolin-1-ylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyamidoilu (opis patentowy US nr 5328906, przykład 12, 1 mg/kg masy ciała dożylnie, % przeżywalności: 71);

chlorek N-[2-hydroksy-3-(1-piperydylo)propoksy]-a-(3,4-dimetoksyfenylo)acetimidoilu (opis patentowy US nr 5328906, przykład 14, 1 mg/kg masy ciała dożylnie, % przeżywalności: 67);

maleinian chlorku (1:1) N-[2-hydroksy-3-(t-butyloamino)propoksy]-3-pirydynokarboksyamidoilu (opis patentowy US nr 5328906, przykład 13/5, 1 mg/kg masy ciała dożylnie, % przeżywalności: 57); chlorowodorek chlorku kwasu O-(3-piperydyno-2-hydroksy-1-propylo)benzhydroksymowego (opis patentowy US nr 5147879, przykład 1, 1 mg/kg masy ciała dożylnie, % przeżywalności: 100);

maleinian chlorku (1:1) N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (opis patentowy US nr 5147879, przykład 2, 1 mg/kg masy ciała dożylnie, % przeżywalności: 100, 20 mg/kg masy ciała doustnie, % przeżywalności: 100).

PL 195 634 B1

P r z y k ł a d 6. Wpływ maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu na naprawę błon komórkowych i zachowanie płynności błony

6.1 Zmiany płynności błony komórkowej związane z uszkodzeniem komórki indukowanym stresem pozbawienia surowicy i wpływ maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu na odwrócenie zmian płynności

6.1 (a) Tło

Jednym z podejść do modelowania patofizjologicznych zdarzeń powodowanych przez stres upośledzenia metabolizmu towarzyszący cukrzycy jest obniżanie poziomu insuliny w pożywce hodowli. Ponieważ insuliny dostarcza uzupełniona surowica, częściowe lub całkowite jej pozbawienie wydaje się być optymalnym narzędziem detekcji zmian w różnych poziomach regulacji komórki.

Pozbawianie surowicy jest szeroko stosowanym sposobem zatrzymania komórek w fazie G1/S, to jest synchronizacji cyklu komórek (Ashihara, T. Methods of Enzymology, 58:248-249 (1979)). Zaobserwowano, że hodowane komórki podlegają apoptotycznym procesom pod nieobecność dodatku surowicy (Cohen, i in., Adv. In Immunology 50: 50-85 (1991)) i badano to jako szok alternatywny do szoku związanego z działaniem inhibitorów staurosporyny lub topoizomerazy w komórkach Balb/3T3 (Kulkarni, G.V. i in., J. Cell. Sci. 107:1169-1179 (1994)) oraz szoku cieplnego i związanego z pozbawieniem glutaminy w komórkach Ehrlicha (Rowlands, A.G. i in., Eur. J. Biochem., 175: 93-99 (1988)), dla zbadania syntezy białka inhibitowanej przez fosforylowanie eukariotycznego czynnika inicjującego (elF2 alfa). Ponadto istnieją dowody na indukcję ochrony cytologicznej w komórkach pozbawionych surowicy przez podawanie z zewnątrz hsp72 (Johnson, A.D. i in., In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 29A: 807-812 (1993)). Wykazano także zwiększenie względnej syntezy hsp82 i hsp72 dzięki pozbawieniu surowicy (Toye, P. i in., Mol. Biochem. Parasitol. 35, 11-10 (1989)).

Niedokrwieniowe i niedotlenieniowe uszkodzenie mięśnia sercowego i innych organów jest mediowane postępującą dysfunkcją i uszkodzeniem błony komórkowej. Wykazano także, że zmiana płynności błony zachodzi podczas metabolicznego upośledzania komórek serca (Buja L. M. i in., In vivo 5: 233-238 (1991)). Płynność błony odzwierciedla przede wszystkim orientację i szybkość poruszania się lipidowych składników błony i każda zmiana jej poziomu silnie wpływa na fundamentalną funkcję błony (Quinn, P.J. i in. Prog. Biophys. Molec. Biol. 53: 71-103 (1989); Schlame, M. i in., Biochim. Biophys. Acta, 1045: 1-8 (1990)).

W tym doświadczeniu określano, czy zmiany w płynności błony mają swój udział w uszkodzeniach komórek indukowanych przez pozbawienie surowicy i czy zmiana płynności błony indukowana pozbawieniem surowicy może być odwrócona podawaniem maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu.

6.1 (b) Materiały i metody

Doświadczenia prowadzono stosując mysi włókniakomięsak WEH1 i linię komórek H9c2 mięśnia sercowego szczura podzielonych na trzy grupy:

• kontrolną (10% FCS, pł odowej surowicy cielę cej), • pozbawioną surowicy i • potraktowaną maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (10^-5 M) i pozbawioną surowicy.

6.1 (b) (1) Pozbawianie surowicy i test MTT

Próby skriningowe przeprowadzono dla różnych linii komórkowych, stężeń leków, czasów wstępnej obróbki i czasów pozbawiania, i znaleziono najwłaściwsze warunki jak następuje: 5x10^-4/ml komórek H9c2 mięśnia sercowego szczura (n=6) i mysi włókniakomięsak WEHI (n=7) umieszczono na 24-studzienkowych płytkach w 10% FCS DMEM (pożywka Eagle w modyfikacji Dulbecco) i inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37°C, 5% CO2. Pożywkę usuwano i zastępowano 10% FCS DMEM zawierającym 10^-5 M maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu. Po dalszej inkubacji w powyższych warunkach przez 6 godzin, płytki przemywano intensywnie PBS i pozbawiano surowicy. Wstępnie potraktowanym komórkom podawano maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu do końca doświadczenia. Według obserwacji mikroskopowej po 18 godzinach głodzenia większość komórek odłączyła się, to jest umarła, w kulturze pozbawionej surowicy, podczas gdy kultury wstępnie potraktowane maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu wyglądały podobnie do komórek kontrolnych. Żywotność komórek mierzono w teście MTT opartym na sposobie Plumba i in. (Cancer Res. 49: 4435-4444 (1989)). Sposób z solą tetrazoliową obejmujący konwersję MTT (bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowego) w zabarwiony formazan przez żywe komórki,

PL 195 634 B1 służył jako pośredni pomiar żywotności komórki. MTT dodawano bezpośrednio do pożywki w stężeniu 1 mg/ml. Po 2 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C w ciemności, supernatant usuwano i dodawano natychmiast do komórek 200 μl 0,05 M HCl w izopropanolu. O.D. płytek odczytywano przy 570 nm na czytniku płytek ELISA (Labsystems Multiskan Biochromatic typ 348). Doświadczenia prowadzono w każdym przypadku co najmniej trzykrotnie. Względną żywotność komórki obliczano definiując grupę kontrolną jako 100%.

6.1 (b) (2) Określanie anizotropii fluorescencji w stanie ustalonym

Zawiesiny komórek 1x10⁵ komórek/ml w PBS oznakowane dodatkiem DPH-PA (kwas 3-[p-(6-fenylo)-1,3,5-heksatrienylo]fenylopropionowy) rozpuszczono w tetrahydrofuranie do uzyskania końcowego stężenia 0,1 μM i inkubowano przez 10 minut w temperaturze 37°C. Ilość dodanego organicznego rozpuszczalnika wynosiła 0,05% dla uniknięcia jego wpływu na komórki błony. Wybrano sondę błony DPH-PA dla jej właściwości elektrycznych, które pozwalają DPH-PA lokalizować się głównie w zewnętrznej warstwie błony plazmatycznej, z rodnikiem difenylo-heksatrienowym wstawionym pomiędzy górne części łańcuchów tłuszczowego acylu (Kitagawa, S. i in. J. Membrane Biol. 119: 221-227 (1991)). DPH-PA wykazuje silne zwiększenie fluorescencji po związaniu z lipidami, dając możliwość ocenienia anizotropii fluorescencji jako funkcji uporządkowania lipidów. Pomiary fluorescencji prowadzono w temperaturze 37°C stosując spektrometr luminescencyjny Quanta Master QM-1 T-format (Photon Technology Int. Inc. NJ, USA) wyposażony w polaryzatory na wzbudzeniu i dwie drogi emisji światła. Długości fali wzbudzenia i emisji wynosiły odpowiednio 360 nm (szerokość szczeliny 5 nm) i 430 nm (szerokość szczeliny 5 nm). Zmierzone natężenie fluorescencji korygowano na tło fluorescencji i rozpraszanie światła z nieznakowanej próbki. Anizotropię fluorescencji obliczono jako rs = (IVV - G.IVH)/(IVV + (2 x G x IVH)) gdzie IVV i IVH oznaczają obserwowane natężenia mierzone polaryzatorami odpowiednio równoległymi i prostopadłymi do pionowo spolaryzowanego promienia pobudzającego. Czynnik G równa się IVH/IHH i koryguje na niezdolność instrumentu do transmisji różnie spolaryzowanego światła jednakowo i na różnicę w czułości dwóch kanałów emisji (Kitagawa, S. i in. J. Membrane Biol. 119:221-227 (1991)). IHV i IHH oznaczają natężenia fluorescencji określone w pozycjach pionowej i poziomej polaryzatora emisji, gdy polaryzator wzbudzający jest ustawiony poziomo.

6.1 (b) (3) Analiza statystyczna

6.1 (c) Wyniki

6.1 (c) (1) Pozbawianie surowicy jako model do testowania cytoochronnego wpływu maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu

Pozbawione surowicy komórki WEHI i H9c2 wykazały odpowiednio 74,8% i 50,5% względną żywotność komórek. Gdy w pożywce komórki występowało 10^-5 M maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu, podawanie go powodowało prawie całkowite przeżycie WEHI (93%) i znaczną ochronę komórek H9c2 mięśnia sercowego (82,75%). Spadek względnej żywotności komórki przez pozbawienie surowicy i jej ochrona przez maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu w obu liniach komórek były znaczące.

6.1 (c) (2) Wpływ maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu na płynność w pozbawionych surowicy komórkach ssaka

W celu zbadania wpływu pozbawienia surowicy na płynność błony plazmatycznej hodowanych komórek ssaka dokonano pomiarów anizotropii fluorescencji stosując sondę z błony plazmatycznej DPH-PA. Fizyczne właściwości plazmatycznych błon komórek znacznie zmieniły się wskutek pozbawienia surowicy. Pozbawienie surowicy spowodowało znaczny spadek anizotropii fluorescencji DPH-PA, to jest nienormalny wzrost płynności błony plazmatycznej w obu badanych modelach komórek. Po dodatku maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu zaobserwowano prawie całkowite zachowanie stanu fizycznego błony. Te zmiany były oczywiście spójne z tendencjami opisanymi przy żywotności komórki.

PL 195 634 B1

6.1 (d) Dyskusja

Zubożenie normalnej pożywki kultury w przypadku obu typów badanych komórek zmniejszało ich żywotność na skutek upośledzenia metabolizmu, co wykazano w testach MTT. Ten wpływ był prawie w pełni odwracalny po dodaniu maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu. Pozbawienie surowicy indukowało także znaczne zmiany w płynności błony plazmatycznej, co odgrywa rolę w dysfunkcji błony towarzyszącej uszkodzeniu mięśnia sercowego. Z kolei pozbawione surowicy komórki, hodowane w obecności maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu, mogły częściowo zachować (lub utrzymać) normalny stan fizyczny ich błony plazmatycznej.

P r z y k ł a d 7. Wpływ insuliny i maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu na poziom grp94 w wątrobie szczura z cukrzycą STZ.

7.1 Tło

Anoksja, głód glukozy i kilka innych stanów wpływających niekorzystnie na działanie siateczki endoplazmatycznej (ER) indukują syntezę regulowanej glukozą klasy białek stresu (grp) (Lin. H.Y. i in. Mol. Biol. Cell. 4:1109-1119 (1993)). Członek tej grupy grp o masie 94 kDa, grp94, w 50% homologiczne z białkiem stresu 90 kDa, jest białkiem ER wiążącym wapń w świetle naczynia. Wraz z innymi białkami ER, grp94 wydaje się działać jako cząsteczkowe białko opiekuńcze (Nigem S. K. i in. J. Biol. Chem. 263: 1744-1749 (1994)). Zakłada się, że akumulacja cząsteczkowego białka opiekuńczego grp94 powinna mieć korzystny wpływ na naprawę uszkodzeń komórek indukowanych przez cukrzycę STZ u szczurów. Tak więc w przedstawionych tu doświadczeniach porównano różne stężenia grp94 w wątrobach szczurów zdrowych i diabetycznych, traktowanych maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu oraz insuliną i maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu.

7.2 Materiały i metody

7.2 (a) Badane substancje: maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (BIOREX Ltd.)

Insulina (Protophane HM do wstrzyknięć)

7.2 (b) Zwierzęta: samce szczurów Wistar Crl (VAF plus, 250-300 g)

Zwierzęta umieszczono po 7 w klatce w temperaturze 23-25°C przy względnej wilgotności 50-60% z cyklem dzień/noc 12/12 godzin. Zwierzęta miały swobodny dostęp do pokarmu i wody pitnej.

7.2 (c) Indukcja cukrzycy: Podano pojedynczą dawkę STZ (45 mg/kg dożylnie) wyposzczonym zwierzętom.

7.2 (d) Zwierzęta podzielono na następujące grupy:

a. Zdrowe zwierzęta

1. Zdrowe traktowane fizjologicznym roztworem soli przez 1 tydzień (n=5)

2. Zdrowe traktowane fizjologicznym roztworem soli przez 2 tygodnie (n=5)

3. Zdrowe traktowane fizjologicznym roztworem soli przez 4 tygodnie (n=5)

4. Traktowane maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu przez 1 tydzień (n=7)

5. Traktowane maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu przez 2 tygodnie (n=7)

6. Traktowane maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu przez 4 tygodnie (n=7)

b. Zwierzęta z cukrzycą STZ

7. Diabetyczne traktowane fizjologicznym roztworem soli przez 1 tydzień (n=5)

8. Diabetyczne traktowane fizjologicznym roztworem soli przez 2 tygodnie (n=5)

9. Diabetyczne traktowane fizjologicznym roztworem soli przez 4 tygodnie (n=5)

10. Diabetyczne traktowane maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu przez 1 tydzień (n=7)

11. Diabetyczne traktowane maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu przez 2 tygodnie (n=7)

12. Diabetyczne traktowane maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu przez 4 tygodnie (n=7)

c. Insulinizowane zwierzęta z cukrzycą STZ

13. Diabetyczne traktowane insuliną przez 1 tydzień (n=7)

14. Diabetyczne traktowane insuliną przez 2 tygodnie (n=7)

PL 195 634 B1

15. Diabetyczne traktowane insuliną przez 4 tygodnie (n=7)

d. Zwierzęta diabetyczne traktowane maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu i insulinizowane

16. Diabetyczne traktowane maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu i insuliną przez 1 tydzień (n=7)

17. Diabetyczne traktowane maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu i insuliną przez 2 tygodnie (n=7)

18. Diabetyczne traktowane maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu i insuliną przez 4 tygodnie diabetyczne (n=7)

Po zabiegach wątrobę usunięto, i natychmiast zamrożono w temperaturze -70°C w ciekłym azocie. Działanie maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (w przypadku jego stosowania): 20 mg/kg dziennie, doustnie. Działanie insuliną: dwa razy dziennie w dawce koniecznej do zachowania normalnego poziomu glukozy.

7.2 (e) Określenie poziomu grp94

Ekstrakcja całkowitego rozpuszczalnego białka z wątroby szczura

Wszystkie etapy prowadzono w temperaturze 0-4°C. Wątroby szczurów (około 15-20 g) homogenizowano domowym mikserem przez 2 minuty w 80 ml zmodyfikowanego roztworu pojedynczego detergentowego buforu lizy zawierającego 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1% SDS,1% Triton X-100 i 1-1 mM inhibitorów proteazy (PMSF, benzamidyna, kwas aminokapronowy). Homogenizat odwirowywano przy 20000 x g przez 30 minut w wirówce Servile RC 28S. Większość supernatantu zamrażono jako zapas w temperaturze -20°C), a 1 ml używano do analizy.

Stężenie białka określano w próbie Bradforda (Guide to Protein Purification, Methods in Enzimology, tom 182, M.P. Deutscher (wyd.), Academic Press (1990)) równolegle potrójnie i ustawiono na 5 mg/ml.

Elektroforeza i immunoblotting

Techniki laboratoryjne elektroforezy i immunoblottingu opisano szczegółowo w Molecular Cloning, A Laboratory Manual, wyd. Sambrook, Fritsche, Maniatis. Bold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Protein Blotting Protocols for the Immobilon-P Transfer Membrane, 3. Laboratory Manual, Millipore; i U.K. Laemmli, Nature: 227: 680-685 (1970). Każdą próbkę zawierającą 1,8 mg białka rozpuszczano do żelowej elektroforezy w 0,6 ml buforu zawierającego 110 mM Tris-HCl pH 6,8, 8,3 mM merkaptoetanolu, 3% SDS, 3% gliceryny i nieco błękitu bromofenolowego i wytrząsano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Elektroforezę prowadzono na 8% żelu poliakryloamidowym z 30 μg białka na ścieżkę przy stałym napięciu 50 V przez noc. Białka były barwione Coomassie Brilliant Blue R-250 lub przenoszone na błony Immobilone PVDF (Millipore) przy stałym natężeniu prądu (300 mA) przez 3 godziny w temperaturze 4°C w buforze przenoszenia (10 mM CAPS pH 11, 10% metanolu). Niespecyficzne miejsca błony blokowano 2% BSA w TPBS (fizjologiczny roztwór soli buforowany fosforanem z 0,1% Tween 20) przez noc w temperaturze 4°C. Plamę inkubowano z monoklonalnym przeciwciałem grp94 (SPA-850, StressGen) rozcieńczonym 1:3000 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie przemywano ją buforem TPBS przez 1 godzinę i inkubowano ze sprzężonym z peroksydazą chrzanową drugim przeciwciałem anty-szczurzym (Sigma, rozcieńczenie 1:4000) przez 1 godzinę. Po kolejnym przemyciu TPBS membranę rozwijano z użyciem układu ECL (Amersham).

Serie rozcieńczeń (próbka 9/1) całkowitego białka poddano blottingowi, rozwijając równolegle z próbkami za każdym razem, i obliczono krzywą kalibracji. Zmiany w zawartości białka stresu określano ilościowo stosując gęstościomierz Bio-Rad (Model 1650) i Hewlett-Packard Integrator (11P 3394A) i korygowano zgodnie z krzywą kalibracji.

Analiza statystyczna

7.3 Wyniki

Znaczący spadek względnej zawartości grp94 obserwuje się w czasie 1 tygodnia, 2 tygodni i 4 tygodni u diabetycznych szczurów. Efekt ten w czasie 1 tygodnia i 2 tygodni u diabetycznych zwierząt można kompletnie odwrócić działaniem maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu. Podawanie insuliny, samej lub w połączeniu z maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu, w próbkach jednotygodniowych i dwutygodniowych prawie podwoiła poziom tego białka w porównaniu ze stanem kontrolnym.

PL 195 634 B1

W przeciwieństwie do poprzednich ustaleń, działanie na szczury diabetyczne przez 4 tygodnie samym maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu nie spowodowało znaczącej zmiany względnej ilości grp94. Ponadto, w obu insulinizowanych grupach, niezależnie od traktowania maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu, zaobserwowano regenerację grp94 do poziomu kontrolnego.

P r z y k ł a d 8. Wpływ maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu na ochronę komórek naskórka przed uszkodzeniami spowodowanymi wystawieniem na ciepło i nadfiolet

8.1 Materiały i metody

Linia komórek HaCaT jest spontanicznie unieśmiertelnioną, ankuploidalną ludzką linią komórkową keratynocytów pochodzących z normalnej ludzkiej skóry dorosłego (Boukamp i in., J. Cell Biol., 106:761-771 (1988)). HaCaT jest linią komórek z pełną zdolnością różnicowania naskórkowego, z normalną keratynizacją i bez charakteru nowotworowego. Ta szybko mnożąca się keratynocytowa linia ze znaczną wrażliwością na ditarnol charakteryzuje się także obecnością receptorów steroidowych. Komórki HaCaT (4 x 10⁵ komórek na szalce Petriego o średnicy 35 mm) zaszczepiono i hodowano w DMEM uzupełnionym 5% płodowej surowicy cielęcej (Gibco, Cat. No. 011-6290H) w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 w temperaturze 37°C. W 24 godziny po nałożeniu na płytki hodowle przemyto PBS i potraktowano ciepłem lub światłem.

Zlane hodowle komórek wystawiono na działanie ciepła (42, 44, 46, 47, 48°C) lub nadfioletu (UVA 1, 2, 4, 6 J/cm²). Działanie ciepła zapewniło użycie łaźni wodnych z cyrkulacją. Jako źródło nadfioletu zastosowano Waldmann PUVA 4000 z widmem energetycznym o końcowej długości od 320 do 390 nm, ze szczytem 365 nm. Wydajność energetyczną obserwowano radiometrem IL-1700 z czujnikiem UVA i UVB.

Morfologię komórek obserwowano stosując mikroskop z kontrastem fazowym (Opton Axioplan Microscope, z obiektywami z kontrastem fazowym Plan-Apochromat Ph). Następujące czynniki wzięto pod uwagę jako wskaźniki cytotoksyczności: (a) zmniejszoną gęstość przylegających komórek; (b) utratę regularnego wzoru „kostki” z powiększeniem odstępów międzykomórkowych; (c) zmianę kształtu komórki, np. zahamowane rozprzestrzenianie się komórek, pęcznienie, zgęszczające kurczenie, fragmentacja; i (d) zmiany cytoplazmatyczne, np. kondensacja lub wakuolizacja. Badano także żywotność komórki, stosując test wykluczania z błękitem trypanowym.

8.2 Wyniki

Wrażliwość keratynocytów HaCaT na stres cieplny określono badając ich żywotność. Wyniki wskazały, że 24 godziny po wystawieniu na działanie ciepła w temperaturze 48°C, nie było praktycznie żywych komórek (2,7%) w porównaniu z kontrolnymi (100%) w temperaturze 37°C. Żywotność keratynocytów HaCaT 24 godziny po działaniu ciepłem w temperaturze 45°C wynosiła 59%. Nie było żadnych morfologicznych zmian w kulturze HaCaT w 1 godzinę po wystawieniu na działanie ciepła. W 24 godziny po podziałaniu ciepłem w temperaturze 46°C lub wyższej zachodzą znaczące (p<0,01) odrywania komórek i zmiany morfologiczne, takie jak utrata regularnego wzoru „kostki” z powiększeniem odstępów międzykomórkowych, pęcznieniem, zgęszczającym kurczeniem i wakuolizacją keratynocytów HaCaT. Po wystawieniu na działanie UV, stwierdzono, że zmniejszenie ilości żywych komórek było bezpośrednio skorelowane z dawką UVA.

Wstępne traktowanie komórek ciepłem (42°C przez 1 godzinę) lub maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (w stężeniu 5x10^-5 M przez jedną godzinę) zabezpieczyło komórki przed działaniem ciepła w temperaturze 48°C. Gdy komórki badano w 24 godziny po podziałaniu ciepłem w temperaturze 48°C, odkryto, że żywotność tych komórek wzrosła, w porównaniu z żywotnością komórek nie potraktowanych, do 48% (dla wstępnego traktowania temperaturą 42°C) i 84% (dla wstępnego traktowania maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu). Najwyraźniejszą ochronę (wzrost żywotności o 140%) można zaobserwować w przypadku połączonego traktowania (42°C i maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu).

Wstępne traktowanie komórek ciepłem w temperaturze 42°C, ale nie 44°C i 45°C, indukowało znaczną redukcję cytotoksyczności pod działaniem nadfioletu. Traktowanie w temperaturze 42°C dało ochronę przed działaniem 2 i 4 J/cm². Żywotność wstępnie potraktowanych keratynocytów HaCaT wzrastała do 132% (przy 2 J/cm²) i do 218% (przy 4 J/cm²) w porównaniu z komórkami potraktowanymi UV bez wstępnego potraktowania (100%).

PL 195 634 B1

P r z y k ł a d 9. Wpływ maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu na indukcję ekspresji cząsteczkowego białka opiekuńczego w tkankach ludzkiej skóry

Ultrafiolet UVB (290-320 nm) jest jednym ze składników światła słonecznego i jest znaną przyczyną uszkodzeń skóry. Zbadano rolę maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu w zmniejszaniu uszkodzeń tkanek skóry pod działaniem UVB, jak też wpływ maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu w zwiększaniu ekspresji cząsteczkowego białka opiekuńczego w tkankach skóry.

9.1 Materiały i metody

Tkanki ludzkiej skóry zaszczepiono na myszach z niedoborem odporności (SCID). Doświadczalny protokół obejmował traktowanie jednej grupy myszy maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (5,0 mg/kg dootrzewnowo), a drugiej roztworem

NaCl (300 μΐ) przez 7 dni. W 8. dniu obie grupy myszy wystawiono na działanie światła UVB (100 mJ/cm²), a w 24 godziny po podziałaniu, dokonano biopsji skóry do badania histologicznego (przekroje barwione hematoksyliną i eozyną) i immunohistologicznego (pośrednia immunoflurescencyjna technika z monoklonalnym przeciwciałem mAB).

9.2 Wyniki

U naświetlanych UV myszy wstępnie traktowanych maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu nie zaobserwowano klinicznych oznak uszkodzeń wskutek działania UV. W przeciwieństwie do tego wyniku, u jednego z nie traktowanych zwierząt zaobserwowano reakcję krostowacenia na transplantowanej powierzchni. Ponadto badania pośredniej immunofluorescencji z użyciem mAB hsp72 wykazały intensywne liniowe zabarwienie wzdłuż strefy błony podstawnej ludzkiej i mysiej skóry u zwierząt potraktowanych maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu. Takiej samej reakcji nie można było zaobserwować na skórze nie traktowanych zwierząt. Ponadto w kroście występował przezroczysty typ zabarwienia granulocytów (zapalna reakcja skóry) u nie traktowanego zwierzęcia.

Tak więc działanie maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu na tkanki skóry spowodowało zwiększone tworzenie hsp72 w tkankach skóry i dostarczyło ochrony przed uszkodzeniami związanymi z działaniem UV.

9.3 Określanie poziomu hsp-70 w skórze: analiza metodą blottingu western białek pochodzących z potraktowanej UVB i UVB + maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu ludzkiej skóry zaszczepionej na myszy SCID.

Sposoby:

a. Ekstrakcja całkowitego rozpuszczalnego białka ze skóry

Wszystkie etapy prowadzono w temperaturze pokojowej. Skórę (około 9-35 mg) pocięto na maleńkie kawałki i homogenizowano tłuczkiem z matowego szkła w probówkach Eppendorfa przez 2 minuty w podwójnej ilości (2 μ^ skóry) stężonego buforu Laemmli (65 mM Tris-HCl, pH 6,8; 5% β-merkaptoetanolu; 2% SDS; 10% gliceryny; 0,1% błękitu bromofenolowego; wszystkie te materiały pochodziły z Sigma). Następnie próbki roztwarzano przez 60 minut przez ciągłe wytrząsanie. Homogenizaty odwirowywano przy 10000 obrotów na minutę przez 10 minut przed umieszczeniem na żelu.

b. Elektroforeza i immunoblotting [5, 7, 8]

Elektroforezę prowadzono na 8% żelu poliakryloamidowym z 10 μΐ próbkami na ścieżkę przy stałym napięciu 50 V przez noc. Białka barwiono Coomassie Brilliant Blue R-250 lub przenoszono na błony Immobilone PVDF (Millipore) przy stałym natężeniu prądu (300 mA) przez 3 godziny w temperaturze 4°C w buforze przenoszenia (10 mM CAPS pH 11, 10% metanolu).

Niespecyficzne miejsca błony blokowano 2% BSA w TPBS (fizjologiczny roztwór soli buforowany fosforanem z 0,1% Tween 20) przez noc w temperaturze 4°C. Plamę inkubowano z monoklonalnym przeciwciałem hsp-70 (SPA-850, StressGen) rozcieńczonym 1:1500 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie przemywano ją trzykrotnie buforem TPBS przez 1 godzinę i inkubowano ze sprzężonym z peroksydazą chrzanową drugim przeciwciałem anty-mysim (Sigma, rozcieńczenie 1:1500) przez 1 godzinę. Po kolejnym przemyciu TPBS membranę rozwijano z użyciem układu ECL (Amersham).

P r z y k ł a d 10: Wpływ maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu na aktywację tworzenia hsp i ochronę utleniającej fosforylacji

10.1 Tło

Wykazano, że wystawienie komórek Saccharomyces cerevisiae na szok cieplny (5 minut w temperaturze 42-44°C) powodowało upośledzenie sprzęgania utleniającej fosforylacji i mitochondrialnego układu transportu elektronów, wpływając na zdolność komórki do syntezy ATP (Patriarca i in., Biochemistry and

PL 195 634 B1

Cell Biology, 70: 207-214, 1992). Jednak gdy komórki potraktowano wstępnie maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu w temperaturze 37°C na krótko przed szokiem cieplnym, zmniejszyło to upośledzenie sprzęgania i zabezpieczyło mitochondrialną syntezę ATP. Hamowanie syntezy cytoplazmatycznego RNA lub białka podczas szoku cieplnego wydaje się zapobiegać tej ochronie aktywności mitochondrialnej. Tak więc jedną z ról hsp wydaje się być ochrona sprzęgania utleniającej fosforylacji i mitochondrialnego układu transportu elektronów, zakłócanych w przypadku gdy komórki wystawia się na fizjologiczny stres, np. szok cieplny.

Maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu podawano do komórek przed ich wystawieniem na szok cieplny i badano jego wpływ na ochronę sprzęgania utleniającej fosforylacji z mitochondrialnym układem transportu elektronów w funkcji stresu cieplnego.

Zbadano także, czy aktywność czynników transkrypcyjnych AP-1 i P 1 może być modulowana przez maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu w komórkach drożdży wystawionych na różne warunki stresu.

10.2 Materiały i metody

Doświadczalny protokół określania upośledzenia utleniającej fosforylacji i mitochondrialnej syntezy ATP w Saccharomyces cerevisiae podali Patriarca i in. Biochemistry and Cell Biology, 70:207-214, 1992, wymienionym tu jako odnośnik.

Do komórek S. cerevisiae utrzymywanych w temperaturze 25°C wprowadzano w różnym stężeniu maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (stężenie 10 - 100 μM), a następnie komórki inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 25°C w obecności maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu. Temperaturę podwyższono potem do 42°C i prowadzono pomiary oksygraficzne jak opisano w Patriarca.

Komórki potraktowane maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu zbadano na towarzyszącą indukcję genów hsp, stosując procedurę blottingu northern. Sposób ekstrakcji, oczyszczania mRNAs z eukariotycznych komórek i analizy tak otrzymanego RNA z użyciem procedury blottingu northern jest dobrze znany i opisany przez Maniatisa, Maresca i in., Archives Medical Research 24: 247-249 (1993), przytaczanym tu jako odnośnik. Protokół metody blottingu northern opisano także w przykładzie 7, podanym powyżej. Jako sondy użyto sekwencji DNA hsp26 i hsp70.

10.3 Wyniki

10.3.1

Figura 4 przedstawia wyniki analizy metodą blottingu northern hsp26 mRNA indukowanego w S. cerevisiae. Wskazano stężenie związku chemicznego podawanego komórkom i czas trwania inkubacji w związku.

W komórkach inkubowanych w obecności maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (10-100 μM) przez od 5 minut do 1 godziny, w temperaturze 25°C, zaobserwowano indukcję hsp26. Wyniki wydają się także wykazywać, że indukcja zachodzi nawet po 5 minutach inkubacji.

Odkryto ponadto, że testowany związek w stężeniu 10 i 100 μM skutecznie zmniejsza upośledzenie sprzęgania pomiędzy utleniającą fosforylacją i mitochondrialnym układem transportu elektronów w wyniku szoku cieplnego. Ochrona przed upośledzeniem syntezy mitochondrialnego ATP mieściła się w zakresie otrzymanym przy indukcji termotolerancji metodą wstępnego traktowania komórek przez wystawianie ich na pośrednią temperaturę 37°C (40-60% ochrony).

10.3.2

Wpływ alkoholu benzylowego na (a) aktywność cyklazy adenylanowej i (b) stan fizyczny błon plazmatycznych bydlęcej tarczycy pokazano na Fig. 5. Zmianę aktywności cyklazy adenylanowej (a) pokazano dla aktywności enzymu podstawowego (o-o), stymulowanego TSH (-), stymulowanego forskoliną (Δ-Δ), stymulowanego choleratoksyną i stymulowanego fluorkiem (◊-◊). Błony inkubowano z lekami przed dodaniem czynników sprzęgających. Stan fizyczny błony określono stosując anizotropię fluorescencji w stanie ustalonym (b) kilku fluoroforów wstawionych w błony: DPH (o-o), 12-AS (-) i TMA-DPH (Δ-Δ). Pomiary prowadzono w temperaturze 37°C. Stosunek molowy fluorofor/lipid wynosił zawsze 1:500.

PL 195 634 B1

10.3.3

Doświadczenia wykazały, że maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu wywiera znaczący wpływ na aktywność AP-1, przy czym ten wpływ jest określany przez rzeczywisty metaboliczny stan komórki. Chociaż maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu zwiększa aktywność AP-1, gdy pożywka jest zubożona w środki odżywcze, w bogatej pożywce zmniejsza on aktywność tego czynnika. Wpływ leku jest silniejszy w gęstych hodowlach w późnej fazie logarytmicznej. Przeciwną tendencję można było zauważyć dla P 1. Jego aktywność spadała, gdy maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu podawano komórkom w pożywce minimalnej. Jest do pomyślenia, że regulacja P-1 w dół została wywołana przez te właśnie zmiany w mechanizmie antystresowym komórek, które spowodowała indukowana maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu aktywacja AP-1. Należy zauważyć, że P-1 odpowiadał na wszystkie typy stresów, ale na jego aktywność nie wpływała testowana substancja. Nasze ważne odkrycia, szczególnie z AP-1, mogłyby wyjaśnić wiele aspektów aktywności in vivo leku i zostaną one przedyskutowane szczegółowo.

Wpływ maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (B) na ekspresję genu hsp w hodowli tkankowej pokazano na Fig. 6. Komórki HeLa transfekowano konstruktem plazmidu reporterowego, w którym promotor ludzkiego genu hsp70 poddano fuzji z genem reporterowym lucyferazy. Wpływ szoku cieplnego i/lub maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu na promotor hsp określono mierząc aktywność lucyferazy w luminometrze i określając poziom białka hsp (ekspresja z genu chromosomowego) metodą blottingu western.

Próbkami były:

1: próbka kontrolna bez DNA; 2: 10 μg transfekowanego DNA w t₀, bez szoku cieplnego; 3: 10 μg transfekowanego DNA w t0, 60 minut szoku cieplnego w 24 godziny później; 4: jak wyżej + maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (B) w t₀; 5: 10 μg transfekowanego DNA w t0 + maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (B) w t₀; 6: 10 μg transfekowanego DNA w t₀, 60 minut szoku cieplnego w 24 godziny później, maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (B) dodany w czasie szoku cieplnego; 7: 10 μg transfekowanego DNA w t₀, 60 minut szoku cieplnego w 24 godziny później, maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (B) dodany w czasie 0 i w czasie szoku cieplnego; 8: 10 μg transfekowanego DNA w t0, bez szoku cieplnego, maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (B) dodany w czasie 0 i w 24 godziny później.

P r z y k ł a d 11. Wpływ maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu na indukcję cząsteczkowego białka opiekuńczego w komórkach nowotworowych

Szok cieplny nie prowadzący do śmierci zwiększa wrażliwość na lizę mediowaną przez komórki NK półtora raza, a taki sam szok cieplny plus traktowanie maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu ma synergistyczny wpływ na zdolność lizy komórek K562. Ten dodatkowy efekt przypisywany maleinianowi chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu wyraźnie wynikał z podwyższonej ekspresji hsp72 w błonie plazmatycznej, ponieważ badania in vivo hamowania przeciwciał (z użyciem specyficznego monoklonalnego Ab hsp72) ujawniły silne hamowanie lizy przez NK.

Na fig. 7 pokazano wpływ maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (B) na indukowany szokiem cieplnym poziom hsp72. Sam maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu nie podwyższa poziomów hsp72, ale połączenie szoku cieplnego z traktowaniem maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu spowodowało znaczny wzrost ekspresji hsp72 w porównaniu z samym szokiem cieplnym.

11.1 Tło

Białka szoku cieplnego znajdują się w cytoplazmie, gdzie spełniają wiele funkcji towarzyszących. Jednakże w komórkach nowotworowych hsp ma podlegać ekspresji także na powierzchni błony komórkowej (Ferrarini M. i in., Int. J. Cancer, 51, 613-619, (1992)). Doświadczenia wydają się wskazywać, że podwyższony hsp (np. hsp70) na powierzchni komórki jest indukowany przez wystawienie komórek nowotworu na szok cieplny nie prowadzący do śmierci i to podwyższenie koreluje ze zwiększoną wrażliwością specyficznych dla IL-2, naturalnych komórek-zabójców CD-3 (NK) na komórki

PL 195 634 B1 nowotworowe. Ponieważ komórki NK mają brać udział w infiltracji i zabijaniu komórek nowotworowych in vivo (Kurosawa S. i in. Eur. J. Immunol. 23: 1029, (1993)), ta wzrastająca wrażliwość komórek NK na komórki nowotworowe pozwala na lepsze znajdowanie komórek nowotworowych przez komórki NK. Tak więc jeśli ekspresja hsp może być indukowana w komórkach nowotworowych, ze zwiększoną ilością hsp na powierzchni komórek, może to pozwolić na lepsze znajdowanie i zabijanie tych komórek przez komórki NK. W tej części badano wpływ maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu w indukowaniu ekspresji hsp72 w komórkach nowotworowych.

11.2 Materiały i metody

Zastosowano ludzkie komórki K562, mykloidowej linii komórek nowotworowych pochodzących od pacjenta z chroniczną białaczką szpikową w fazie blastocytarnej (ATCC, CCL243) (Lozzio BC i Lozzio BB, Blood 45:321, 1975). Wykładniczo rosnące komórki potraktowano 5x10^-5 M maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu przy działaniu temperatury nie grożącej śmiercią (42°C) przez 2 godziny. Po okresie regeneracji przez 16 godzin w temperaturze 37°C komórki zbadano na poziom hsp72 metodą cytometrii przepływowej (Multhoff i in., Int. J. Cancer: 61, 272-279, (1995)). Potraktowanie maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu dało zwiększony poziom hsp72 w komórkach nowotworowych.

P r z y k ł a d 12. Oddziaływanie maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu z błonami lipidowymi. Badanie monowarstwy

12.1 Tło

Mechanizm(y) detekcji stresu (fizycznego, patofizjologicznego, itp.) jako sygnału i przekazu do aparatu transkrypcyjnego jest jak dotąd nieznany. Założono, że stan fizyczny matrycy lipidowej błony, określający strukturę i funkcję związanych z błoną białek, jest bezpośrednio zaangażowany w percepcję zmian temperatury i że w warunkach szoku cieplnego (HS) zaburzenie struktury błony powoduje przekazywanie sygnału indukującego transkrypcję genów HS. Równolegle z indukcją tolerancji stresu, maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu okazał się polepszać skuteczność komórek w wykrywaniu i sygnalizacji różnych warunków stresu przez regulację w górę ekspresji genów pewnych białek opiekuńczych.

Wiadomo, że technika monowarstwowa z użyciem warstw monocząsteczkowych lipidów rozprowadzonych na powierzchniach powietrze/woda jest skutecznym narzędziem weryfikacji obecności oddziaływań pomiędzy błonami i środkami aktywnymi błon. Zachowanie dwuwarstwowego układu jest bardzo podobne do zachowania odpowiedniego układu monowarstwy w wielu aspektach (pole cząsteczkowe składników błony, działanie fosfolipazy, orientacja wstawionego białka, itp.). Mierząc zmiany napięcia powierzchniowego powodowane przez cząsteczki wstawione w monowarstwy można obserwować cząsteczkowy wymiar interakcji.

Istotnym wstępnym warunkiem założenia, że mediowane maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu wczesne początkowe wydarzenia w odpowiedziach stresowych mogą zachodzić w błonie komórki, jest dostarczenie dowodów na bezpośrednie fizyczne oddziaływanie maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu ze składnikami błony. Celem obecnego badania było zbadanie oddziaływania maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu z błonami w przypadku różnych lipidowych monowarstw jako modeli układu błon biologicznych.

12.2 Materiały i metody

Doświadczenia z monowarstwami prowadzono w naczyniu z teflonu, przy objętości 6,5 ml i polu powierzchni 8,8 cm² w temperaturze 25°C w instrumencie KSV 3000 Langmuira-Blodgetta (KSV Instruments Ltd., Helsinki, Finlandia) ściśle zgodnie z opisem. Monocząsteczkowe warstwy lipidu złożone z 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DPPC), fosfatydylogliceryny z żółtka jaja (EggpG) lub kardiolipiny z serca bydlęcego (BHCL) rozprowadzono z chloroformowych roztworów lipidów, z wytworzeniem żądanego początkowego napięcia powierzchniowego w podfazie 10 mM fosforanu Na (pH 7,0). Podfazę mieszano w sposób ciągły mieszadłem magnetycznym. Maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu, rozpuszczony w H2O, wprowadzano pod monowarstwę przez otwór w komorze teflonowej stykającej się z podfazą. Wstrzykiwane objętości były zawsze mniejsze od 1% całej objętości podfazy. Napięcie powierzchniowe mierzono metodą Wilhelmy stosując płytkę platyny. Dane wzrostu napięcia powierzchniowego pobierano z plików z surowymi danymi stosując oprogramowanie LB5000 układu pomiarowego Langmuira-Blodgeta.

PL 195 634 B1

12.3 Wyniki

Oddziaływanie maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu z różnymi fosfolipidami testowano mierząc indukowany lekiem wzrost napięcia powierzchniowego lipidowej monowarstwy rozprowadzonej na powierzchni powietrze/woda (fig. 8). Monowarstwy w niniejszych badaniach wytwarzano z DPPC, EggPG i BHCL i dodawano wzrastające ilości maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu w dwu stężeniach (10^-6 M, 10^-5 M) do podfazy. Dodatek leku pod lipidową monowarstwę powodował wzrost napięcia powierzchniowego zależnie od stężenia maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidolilu w podfazie we wszystkich przypadkach. Wystąpiła jednak wyraźna różnica w profilu napięcia powierzchniowego dla różnych monowarstw lipidowych. W przypadku obojnaczej DPPC, napięcie zmieniało się szybko po wstrzyknięciu maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu, a następnie pozostawało na stałym poziomie. W przypadku monowarstw zawierających ujemnie naładowaną BHCL, profil napięcia powierzchniowego wykazywał typową kinetykę insercyjną, to jest napięcie wzrastało przez około 2 minuty, po czym dochodziło do wartości równowagi. W obecności PG kinetyka insercyjna leku była podobna do obserwowanej dla BHCL, jednakże po uzyskaniu pewnej wartości napięcie zaczynało spadać. Szybkość spadku napięcia zależała od stężenia leku w podfazie. Jedno z możliwych wyjaśnień tego zjawiska to usuwanie kompleksów maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu - EggPG z powierzchni, ponieważ napięcie spadało nawet po uzyskaniu początkowego napięcia czystej lipidowej monowarstwy.

Aby uzyskać dalszy wgląd w specyficzne oddziaływanie maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu z monowarstwami lipidowymi mierzono indukowany lekiem wzrost napięcia powierzchniowego przy różnych wartościach napięcia początkowego (fig. 8). Sposób ekstrapolacji do wysokiego początkowego napięcia powierzchniowego pozwala na ocenienie ograniczającego ciśnienia inercyjnego dla cząsteczki, przy którym nie może się ona wstawić do monowarstwy. Ekstrapolowane ograniczające początkowe napięcie powierzchniowe wynosiło odpowiednio 89 mN/m i 39 mN/m dla BHCL i DPPC. W przypadku monowarstw zawierających ujemnie naładowaną BHCL, wzrost napięcia był zawsze większy od napięcia dla obojnaczego jonu DPPC, co sugeruje znaczącą rolę oddziaływań elektrycznych.

Niniejsze badania dają pierwsze dowody, że po podaniu maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu w fizjologicznie właściwych stężeniach, może on współoddziaływać z lipidowymi błonami w sposób zależny od czołowej grupy.

Na fig. 8 pokazano oddziaływanie maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (B) i monocząsteczkowej warstwy lipidowej. Przy strzałkach podano stężenie, w którym maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu dodawano do podfazy. Na fig. 9 przedstawiono wzrost napięcia powierzchniowego po iniekcji maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (B) pod monowarstwę BHCL lub DPPC przy różnych początkowych wartościach ciśnienia. Stężenie maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu w podfazie wynosiło 10 pmoli. Analiza danych doświadczalnych metodą liniowej regresji dała współczynniki korelacji 0,844 i 0,995 odpowiednio dla BHCL i DPPC.

P r z y k ł a d 13. Ochronne działanie maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu wobec cytotoksycznych cytokin i cykloheksyimidu

13.1 Tło

Przedmiotem tych badań było zbadanie możliwego związku pomiędzy wytwarzaniem cytokin i patofizjologicznymi zmianami, przed którymi wydaje się chronić maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu.

Uzyskane dane sugerują, że maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu jest cytoochronnym środkiem dla komórek hodowanych w tkankach potraktowanych cytotoksycznymi cytokinami. Traktowanie maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu zwiększa stopień zużycia potraktowanych komórek TNF WEHI 164 (i innych komórek ssaków). Wpływ ten był zależny od stężenia, ale nie wprost proporcjonalny do stężenia leku. Zasięg ochrony zapewnianej przez traktowanie maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu zmieniał się dla różnych doświadczeń, chociaż zwiększanie oporności potraktowanych komórek na cytotoksyczne cytokiny stanowiło wyraźną tendencję we wszystkich doświadczeniach. Ochrona zapewniana przez traktowanie maleinianem

PL 195 634 B1 chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu nie jest wysoka, jednak w przypadku żywego zwierzęcia nawet taki stopień ochrony mógłby być dostateczny do złagodzenia lub zapobiegania patofizjologicznym procesom.

13.2. Cel badań

Zmierzono poziom surowicy TNF i zdolności indukcji makrofagów u zwierząt z cukrzycą STZ i zwierząt kontrolnych. Indukowana LPS aktywność TNF w surowicy polepszała się znacząco u szczurów z cukrzycą indukowaną STZ (wiek 6-18 tygodni) w porównaniu ze szczurami bez cukrzycy, w pierwszym miesiącu cukrzycy.

13.3 Wyniki

Średnie stężenie TNF w surowicy (mierzone w próbie radioimmunologicznej) grupy z cukrzycą było znacząco wyższe (480 ± 96 U/ml) niż u zdrowych kontrolnych zwierząt (345 ± 48 U/ml). (Foss i in., 1992 Braz. J. Med. Biol. Res. 25, 239 opisał podobne wyniki u ludzi). W grupie z cukrzycą nie było korelacji pomiędzy poziomami TNF w surowicy i czasem trwania cukrzycy. Nie wykryto biologicznie aktywnego TNF w surowicy zwierząt z cukrzycą w próbie cytotoksyczności na komórkach L929. Różnica pomiędzy pomiarami RIA i cytotoksyczności wskazała na obecność dużych ilości rozpuszczalnych antagonistów receptora TNF (ochronna, przeciwzapalna cząsteczka), sugerując rolę TNF w powikłaniach na tle cukrzycy.

Maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu wykazał niespodziewany namnażający wpływ na komórki drożdży (i na różne hodowane normalne, diploidalne komórki zwierzęce lub ludzkie). Wpływ maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu był szczególnie wyraźny w obecności niewielkich stężeń antybiotyku, cykloheksyimidu o działaniu hamującym wzrost. Kolonie komórek drożdży hodowane w obecności maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu i cykloheksyimidu nie wykazywały większej częstości zmian genetycznych (mutacje oporne na antybiotyk), jedynie wyższą metaboliczną oporność na hamujące działanie cykloheksyloimidu przy syntezie białka.

Według wyników pomiarów wpływ maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu można prześledzić wstecz do zwiększonej aktywności czynnika transkrypcji AP-1, który mediuje działanie obu mitogenicznych czynników i różnych typów stresu. Wyniki te wskazują też, że powyższy testowany związek i podobne związki wpływają na detoksykację AP-1, a zapewne i innych czynników transkrypcji, zachowując wpływ czynników wzrostu i warunki stresu metabolicznego.

Na fig. 10 pokazano indukowane LPS wytwarzanie TNF in vitro w makrofagach pochodzących od (1) zwierząt z cukrzycą STZ i (2) zwierząt normalnych, na fig. 11 indukowaną maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu ochronę keratynocytów przed hamującym wzrost działaniem cykloheksyimidu, na fig. 12 indukowaną maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (B) ochronę komórek (naskórka) przed toksycznym wpływem cykloheksyimidu, na fig. 13 indukowaną maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (B) ochronę ludzkich komórek HeLa szyjki macicy przed hamującym wzrost działaniem antybiotyku, cykloheksyimidu, na fig. 14 indukowaną maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (B) ochronę komórek mięśnia sercowego przed hamującym wzrost działaniem cykloheksyimidu, a na fig. 15 wpływ maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (B) na aktywność czynnika transkrypcji P1 w komórkach drożdży AB1380. Rząd 6 reprezentuje wartości średnie. Rząd 5 jest pusty. Na fig. 16 pokazano wpływ maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu na aktywność czynnika transkrypcji AP-1 w komórkach drożdży JF1. Rząd 11 reprezentuje wartości średnie. Na fig. 17 pokazano wpływ maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (B) na aktywność czynnika transkrypcji P1 komórkach drożdży AB1360. Rząd 6 reprezentuje wartości średnie. Rząd 5 jest pusty.

P r z y k ł a d 14. Działanie ochronne maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu na wyizolowane serca szczurze

14.1

Celem badań było zbadanie działania chroniącego serce i przeciwarytmicznego maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu na wyizolowane pracujące serca szczurze.

PL 195 634 B1

14.2 Sposoby

Po 10 minutach aerobowej roboczej perfuzji, serca (n=10 w każdej grupie) poddano przez 10 minut okluzji wieńcowej i przez 3 minuty reperfuzji w obecności 0,05, 0,5, 5,0, 20,0 i 50 mg/l maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu.

W dalszych badaniach szczury potraktowano wstępnie najbardziej skuteczną dawką (20 mg/kg) maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu, na 1 i 5 godzin przed wyizolowaniem serc. Po wycięciu serc poddano je protokołowi okluzji wieńcowej opisanemu powyżej, w trakcie perfuzji w obecności/nieobecności 20 mg/l maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu.

W oddzielnych doświadczeniach badano wpływ stresu cieplnego, niedokrwienia, maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu i ich kombinacji na zawartość w mięśniu sercowym białka hsp70. Wyizolowane serca poddano 15 minutom stresu cieplnego (42°C), całkowitemu normotermicznemu niedokrwieniu i perfuzji maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu, a następnie odpowiednio 120 i 180 minutom reperfuzji.

14.3 Wyniki

Przed niedokrwieniem maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu zwiększał przepływ wieńcowy (CF), przy czym wykres funkcji stężenie-reakcja miał kształt dzwonu. Inne funkcjonalne parametry pracy serca nie zmieniały się przy niższym stężeniu leku. Maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu w stężeniu 50 mg/litr powodował znaczący rzadkoskurcz, obniżenie przepływu w tętnicach (AF) i +dP/dtmax oraz wzrost końcowego ciśnienia rozkurczowego w lewej komorze (LVEDP) przed niedokrwieniem. W grupie kontrolnej okluzja wieńcowa znacząco obniżała CF, AF i +/-dP/dtmax i zwiększała LVEDP. Maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu łagodził indukowaną niedokrwieniem degradację działania serca przy czym wykres funkcji stężenie-reakcja miał kształt dzwonu. Stężenie 20 mg/l maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu dawało najsilniejsze działanie przeciwniedokrwieniowe. Reperfuzja po 10 minutach okluzji wieńcowej uruchamiała migotanie komór (VF) we wszystkich sercach grupy kontrolnej. Wyższe stężenie maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu dawało zależny od dawki efekt przeciwarytmiczny.

Po 1 godzinie wstępnego traktowania maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu wciąż zapewniał ochronę serca i wzmacniał ostry wpływ związku. Po 5 godzinach od wstępnego traktowania nie obserwowano działania chroniącego serce, jednak zwiększone były pewne ostre wpływy perfuzji maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu.

Sam związek nie zwiększał zawartości hsp70 w mięśniu sercowym. Zawartość hsp70 rosła znacząco wskutek stresu cieplnego, jednak niedokrwienie powodowało niewielkie zwiększenie ilości hsp70. Tym niemniej gdy niedokrwienie indukowano w obecności 20 mg/l maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu, zawartość hsp70 wzrastała do około takiego samego poziomu, jak w przypadku stresu cieplnego.

Można wyciągnąć wniosek, że maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu ma działanie przeciwniedokrwienne i przeciwarytmiczne. Stężenie 20 mg/l powodowało znaczące działanie przeciwniedokrwienne i przeciwarytmiczne na wyizolowanym sercu szczura. Gdy bezpośrednie działanie przeciwniedokrwienne leku zanika po 1 godzinie, stopień ochrony po ostrym potraktowaniu maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu jest nadal podwyższony. Maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu i stres niedokrwienny wspólnie indukują szybką syntezę nowego hsp70 w sercu szczura. Sam maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu nie wpływa na syntezę hsp70.

Na fig. 18-19 pokazano poziomy białka hsp, określane metodą blottingu western u szczurów kontrolnych, po szoku cieplnym, po niedokrwieniu, po potraktowaniu maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (B) oraz po potraktowaniu niedokrwieniem + maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (niedokrwienie+B) i po 2 (fig. 18) lub 3 godzinach (fig. 19) regeneracji.

PL 195 634 B1

P r z y k ł a d 15. Czynnik wzmacniający białko opiekuńcze, maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu, w zapobieganiu i leczeniu uszkodzeń skóry: ochrona przed nadfioletem B ludzkiej skóry przeszczepionej myszom z ostrym złożonym upośledzeniem odporności i przyspieszone leczenie ran u szczura z cukrzycą

15.1 Tło

Białka hsp wydają się odgrywać ogólną rolę w fizjologicznej ochronie skóry przed stresem środowiskowym. Jako cząsteczkowe białka opiekuńcze biorą udział w zapobieganiu i naprawianiu szkód spowodowanych przez różne czynniki, takie jak uraz mechaniczny, uszkodzenia światłem, ciepłem i czynnikami chemicznymi, infekcje itp. (E. V. Maytin, JID 104:448, 1995). Istnieją doniesienia o osłabionym działaniu pewnych hsp w warunkach patologicznych, takich jak cukrzyca (M. Cherian i E.C. Abraham, Biochem. Biophys. Res. Com. 212:184, 1995). Ponieważ maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu okazał się działać jako czynnik wzmacniający białka opiekuńcze (Vigh i in., w przygotowaniu), można się spodziewać, że lek może polepszać bardzo różne mechanizmy ochrony i naprawy.

Celem badań było przetestowanie wpływu podawania (i) układowego i (ii) miejscowego maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu:

(i) w ochronie przed uszkodzeniami skóry indukowanymi światłem UVB na ludzkiej skórze przeszczepionej myszom z ostrym złożonym upośledzeniem odporności (SCID), (ii) w naprawianiu upośledzenia procesu leczenia ran u szczurów z cukrzycą STZ.

(i) Myszy SCID z przeszczepioną ludzką skórą potraktowane maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (5,0 mg/kg dootrzewnowo) lub nośnikiem wystawiono na światło UVB (100 mJ/cm²). Po 24 godzinach dokonano biopsji skóry do badania histologicznego i określenia zawartości hsp72 z użyciem technik immunohistologicznych i blottingu western. Wstępne traktowanie maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu zapobiegało indukowanemu UVB uszkodzeniu skóry, określonemu klinicznie i histologicznie. Z użyciem techniki immunofluorescencji można było stwierdzić intensywne zabarwienie hsp72 liniowej błony podstawnej, a metodą blottingu western stwierdzono zwiększoną ilość hsp72 w potraktowanych maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu próbkach skóry.

15.2 Sposoby (ii) Szczury z cukrzycą indukowaną streptozotocyną (STZ) z cieplnymi ranami o głębokości od częściowej do pełnej, utworzonymi obustronnie na ogolonej skórze klatki piersiowej przy pomocy elektrycznej sondy grzejnej (3 mm średnicy; 60°C; przez 30, 60 i 90 s), potraktowano miejscowo kremem lub nośnikiem zawierającym 1%, 2% lub 4% maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu w celu określenia przebiegu leczenia rany, przy czym ranę kontrolną stanowiła rana u tego samego zwierzęcia, na jego drugim boku. Zamykanie się ran rejestrowano fotograficznie i stosując technikę mikroskopową cyfrowej epiluminescencji. Obszary ran mierzono planimetrycznie w 48 godzin i 21 dni po uszkodzeniu cieplnym.

Poziom hsp72 w biopsyjnych próbkach skóry określano stosując analizę blottingu western.

15.3 Wyniki

Traktowanie kremem zawierającym 4% maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu istotnie (p <0,01) przyspieszało zamykanie ran i podwyższało poziom hsp72 w biopsyjnych próbkach skóry w porównaniu z próbą kontrolną z nośnikiem.

Uzyskane wyniki prowadzą do wniosku, że podawanie maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu zapewnia ochronę przed uszkodzeniami wskutek działania UV i może mieć potencjalne lecznicze zastosowania w klinicznym leczeniu stanów upośledzonego gojenia się ran lub następstw zabiegów chirurgicznych.

Na fig. 20, 21 i 22 przedstawiono wpływ kremu zawierającego 1%, 2% lub 4% maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (B) na leczenie ran. Na fig. 23, 24 i 25 pokazano wyniki według stopnia zranienia.

Na fig. 26 pokazano fotografie ran nie traktowanych i traktowanych maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (B).

Figura 27 pokazuje poziom białka hsp72 w biopsyjnych próbkach z kontrolnych ran potraktowanych 1%, 2% lub 4% maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (B).

PL 195 634 B1

Na fig. 28 pokazano wyniki immunohistochemicznego badania białka hsp72 po potraktowaniu maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (B).

Na fig. 29 pokazano poziom hsp72 w potraktowanych maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (B) i nie traktowanych (kontrolnych) próbkach skóry myszy SCID.

P r z y k ł a d 16. Ocena wpływu stymulującego pochodnych hydroksyloaminy według wynalazku na ekspresję hsp72 w komórkach wystawianych na stresy

a) Warunki hodowli komórek

Wśród zastosowanych komórek mysie fibroblasty 3T3 i L-929 hodowano w pożywce MEM i rosły one w monowarstwie, ludzkie komórki białaczki U-937 utrzymywano w pożywce RPMI-1640, w kulturze zawiesinowej, podczas gdy ludzkie nabłonkowe komórki HeLa hodowano w pożywce DMEM, w postaci monowarstwy. Hodowle komórek utrzymywano według opisu w przykładzie 3.2 (a) z tą różnicą, że komórki hodowano w wyżej opisanych pożywkach hodowlanych.

b) Warunki doświadczeń

Doświadczenia prowadzono stosując stres przed i po potraktowaniu lekiem. Stres prowokowano ciepłem, środkiem chemicznym lub działaniem HgCl2. Testowane związki stosowano w zabiegach w stężeniu 10^-5 M.

Badania cytotoksyczności, które przeprowadzono w próbie 3-dniowej i oceniono metodą MTT (Cytotechnology 11:49-58), wskazały, że wszystkie testowane związki miały 50% wpływ na hamowanie wzrostu w stężeniu ponad 10^-4 M. Tak więc związki w stężeniu użytym w badaniach hsp72 nie miały znaczącego działania cytotoksycznego.

16.1. Doświadczenia ze stresem cieplnym

Doświadczenie przeprowadzono na komórkach mysich fibroblastów 3T3 i L-929, a ponadto na ludzkich komórkach białaczki U-937.

Doświadczenia na komórkach 3T3 ze stosowaniem stresu cieplnego przeprowadzono zgodnie z opisem w punkcie 3.2. (c) w przykładzie 3, z tą różnicą, że stres był indukowany przez 30 minut działaniem temperatury 43°C, a traktowanie testowymi związkami prowadzono na 15 minut przed lub 100 minut po stresie cieplnym.

Immunodetekcję prowadzono stosując specyficzne wobec hsp72 pierwotne przeciwciała SPA 810 (StressGene) i wtórne przeciwciała sprzężone z peroksydazą chrzanową A9044 (Sigma). Ocenę densytometryczną przeprowadzono w densytometrze LKB Ultrascan XL.

Wyniki podsumowano w tabeli 2 i tabeli 3

T a b e l a 2

Stymulujący wpływ pochodnych hydroksyloaminy według wynalazku na indukowane stresem cieplnym wytwarzanie hsp72 w komórkach 3T3 z traktowaniem przed działaniem stresu

Związki	Poziom hsp72 w porównaniu z wynikami próby kontrolnej z wystawieniem na stres
1	2
Maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu	+++
5,6-Dihydro-5-(1-piperydynylo)metylo-(3-pirydylo)-4H-1,2,4-oksadiazyna	+++
Maleinian 3-(3-pirydylo)-5-[(1-piperydynylo)metylo]-5,6-dihydro-6H-1,4,2-dioksazyny (1:1)	++
Monochlorowodorek chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]benzimidoilu	+
Monochlorowodorek N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-N',N'-dietylo-3-pirydynokarboksyimidoamidu	+++
Chlorowodorek 3-(3-pirydylo)-5-dietyloaminometylo-5,6-dihydro-6H-1,4,2-dioksazyny	+

PL 195 634 B1 ciąg dalszy tabeli 2

1	2
Chlorowodorek 3-fenylo-5-[(1-piperydynylo)metylo]-5,6-dihydro-6H-1,4,2-dioksazyny	++
Maleinian chlorku (1:1) (R)-(+)-N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu	+++
Maleinian chlorku (1:1) (-)-N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu	+++
N-(2-Hydroksy-3-(piperydynylo)propoksy)naftaleno-1-karboksyamid	+++
3-(3-Pirydylo)-5-t-butyloamino-5,6-dihydro-6H-1,4,2-dioksazyna	+
N-(2-Hydroksy-3-piperydynopropoksy)etylouretan	+
Monochlorowodorek N-[2-palmitoiloksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoamidu	+++
N-[2-Hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-N'-propylomocznik	+++
N-(3-Chlorofenylo)-N'-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]mocznik	+++
Dichlorowodorek chlorku N-(3-piperydyno-1-propoksy)-3-pirydynokarboksyimidoilu	+++
Chlorowodorek chlorku O-(3-dietyloaminopropoksy)-3-pirydynokarboksyimidoilu	+++
Chlorowodorek chlorku O-(3-piperydynopropylo)-3-nitrobenzhydroksyimoilu	+++
Octan 1-{[3-(t-butylamino)-2-hydroksypropoksy]imino}-1-(m-trifluorometylofenylo)etanu	+++
N-[2-Hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]benzylouretan	0
Dijodek chlorku N'-[2-hydroksy-3-(1-metylo-1-piperydynio-1-ilo)propoksy]-N-metylopirydynio-3-karboksyimidoilu	+++
N-Heksylo-N'-[3-(1-piperydynylo)propoksy]mocznik	++
Chlorowodorek N-cykloheksylo-N'-[2-acetoksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]mocznika	0
Chlorowodorek chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-2-nitrobenzimidoilu	+++
Dichlorowodorek N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-chinolinokarboksyimidoamidu	+++
N-[2-Hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-N,N'-difenylobenzamidyna	0
N,N-Dimetylo-N'-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-N-fenylo- guanidyna	0
Chlorowodorek N,N-dimetylo-N'-fenylo-N-[3-(1-piperydynylo)propoksy]guanidyny	++
Chlorowodorek N-metylo-N-[3-(1-piperydynylo)propoksy]benzamidu	+
Jodek 5,6-dihydro-3-(4-chlorofenylo)-5-[N-metylopiperydynio-1-ilo)metylo-4H-1,2,4-o-ksadiazyny	++
Maleinian {N-[3-(1-piperydynylo)propoksy]}-3-pirydynokarboksyimidanu metylu	0
Chlorowodorek N-metylo-N-[3-(1-piperydynylo)propoksy]-m-trifluorometylobenzamidu	+++
Chlorowodorek N-[3-(1-piperydynylo)propoksy]-N'-tetrametyleno-3-pirydynokarboksamidyny	+++

N-[3-(1-Piperydynylo)propoksy]-N-metylo-N'-(n-heksylo)mocznik

PL 195 634 B1

T a b e l a 3

Stymulujący wpływ pochodnych hydroksyloaminy według wynalazku na indukowane stresem cieplnym wytwarzanie hsp72 w komórkach 3T3 po działaniu stresu

Związki	Poziom hsp72 w porównaniu z wynikami próby kontrolnej z wystawieniem na stres
Maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu	0
Chlorowodorek chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-2-nitrobenzimidoilu	0
5,6-Dihydro-5-(1-piperydynylo)metylo-3-(3-pirydylo)-4H-1,2,4-oksa- diazyna	0
Chlorowodorek chlorku O-(3-piperydynopropylo)-3-nitrobenzhydroksyimoilu	+
Chlorowodorek N-[2-palmitoiloksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoamidu	+
N-Heksylo-N'-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]mocznik	+++
N-[2-Hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]naftaleno-1-karboksyamid	+ +
Maleinian chlorku (1:1) N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-4-pirydynokarboksyimidoilu	+ +
Dijodek chlorku N'-[2-hydroksy-3-(1-metylo-1-piperydynio-1-ilo)propoksy)-N-metylopirydynio-3-karboksyimidoilu	+++
Dichlorowodorek N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-chinolinokarboksyimidoamidu	+++

W tabeli „0” wskazuje, że potraktowanie zmieniło o ±20% indukowany stresem poziom hsp72 w komórkach, podczas gdy +, ++, +++ wskazują odpowiednio 21 - 50%, 51 - 100% i >100% wzrost poziomu hsp72, względem poziomu w komórkach kontrolnych wystawionych na stres.

Doświadczenia z użyciem szoku cieplnego na komórkach białaczki U-937 i mysich fibroblastach L-929 prowadzono podobnie jak opisano powyżej, ale traktowanie lekiem w tych testach zawsze poprzedzało stres cieplny. Maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu testowano w stężeniu 10^-5 M w tych warunkach eksperymentalnych.

Traktowanie spowodowało ponad 50% wzrost poziomu hsp72 indukowanego stresem cieplnym.

16.2. Doświadczenia ze stresem indukowanym środkiem chemicznym

Doświadczenia przeprowadzono na HeLa, ludzkim nabłonku, i U-937, ludzkich komórkach białaczki, z użyciem HgCl2 do indukcji odpowiedzi stresu. Traktowania lekiem dokonywano przed wystawieniem komórek na działanie stresu. Testowe hodowle wytworzono i zabiegi przeprowadzono jak w doświadczeniach z komórkami 3T3. Po potraktowaniu lekiem komórki inkubowano w temperaturze 37°C przez 15 minut, a następnie wszystkie hodowle poza dwiema (nie stresowane kontrolne) wystawiono na działanie stężenia 0,5 μg/ml HgCl₂ i kontynuowano inkubację. Indukowaną ilość hsp72 mierzono w 6 godzin po wystawieniu na stres. Użyte stężenie HgCl2 dało 15-30% maksymalnego poziomu hsp72.

Dla komórek HeLa monochlorowodorek chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]benzimidoilu i monochlorowodorek chlorku N-[3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-nitrobenzimidoilu zwiększył o więcej niż odpowiednio 20% i 50% indukowany stresem poziom hsp72.

W przypadku komórek U-937 potraktowanie maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu polepszyło o więcej niż 20% indukowany stresem poziom hsp72 w porównaniu z poziomem w wystawionych na stres komórkach kontrolnych.

16.3 Doświadczenia na eksplantach pierwotnej tkanki

Doświadczenia przeprowadzono na eksplantach śledziony i jąder szczura, przy czym stres cieplny stosowano po potraktowaniu badanymi związkami. Doświadczenia na zawiesinie komórek śledziony prowadzono jak następuje.

PL 195 634 B1

Śledziony szczurów CFY ważących 200 g usunięto aseptycznie i zhomogenizowano w 10% płodowej surowicy bydlęcej zawierającej pożywkę hodowlaną MEM. Stężenie zawiesiny komórek ustawiono na 50-100 mg/5 ml.

Po 5 ml zawiesiny komórek umieszczono na poszczególnych płytkach do hodowli o średnicy 6 cm i eksplanty inkubowano przez godzinę w wilgotnym powietrzu zawierającym 5% CO2 w temperaturze 37°C, a następnie hodowle potraktowano badanymi związkami w stężeniu 10^-5 M. Po dalszych 15 minutach inkubacji w temperaturze 37°C hodowle wystawiano na szok cieplny w temperaturze 43°C przez 30 minut w inkubatorze. Ilość indukowanego hsp72 mierzono po dalszych 6 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C.

Wyniki przedstawiono w tabeli 4, a zwiększony poziom hsp72 przedstawiono według tej samej skali, jak w tabeli 2 i 3.

T a b e l a 4

Stymulujący wpływ pochodnych hydroksyloaminy według wynalazku na indukowaną stresem cieplnym ekspresję hsp72 w eksplancie śledziony szczura

Związki	Poziom hsp72 w porównaniu z wynikami próby kontrolnej z wystawieniem na stres
N-{3-[(1,1-Dimetyloetylo)amino]-2-hydroksypropoksy}-3-trifluoro- metylobenzamid	+
N-[2-Hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-N'-heptylomocznik	+++
N-(3-Chlorofenylo)-N'-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]- mocznik	+++
5,6-Dihydro-5-(1-piperydynylo)metylo-3-(3-pirydylo)-4H-1,2,4- -oksadiazyna	0

Doświadczenia na eksplantach jąder szczura

Jądra szczurów CFY ważących 200 g usunięto w jałowych warunkach i wyizolowane cewki umieszczono w zawiesinie w 10% płodowej surowicy bydlęcej zawierającej pożywkę hodowlaną MEM, przy czym 5 ml zawiesiny zawierało 50-100 mg tkanki. Eksplanty inkubowano w wilgotnym powietrzu zawierającym 5% CO2 w temperaturze 37°C przez 1 godzinę, a następnie hodowle potraktowano badanymi związkami w stężeniu 10^-5 M. Po dalszych 15 minutach inkubacji w temperaturze 37°C hodowle wystawiono na szok cieplny w temperaturze 43°C przez 30 minut w inkubatorze. Ilość indukowanego hsp72 mierzono po dalszych 6 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C.

Wyniki przedstawiono w tabeli 5, a zwiększony poziom hsp72 przedstawiono według tej samej skali, jak w tabeli 4.

T a b e l a 5

Stymulujący wpływ pochodnych hydroksyloaminy według wynalazku na indukowaną stresem cieplnym ekspresję hsp72 w eksplancie jąder szczura

Związki	Poziom hsp72 w porównaniu z wynikami próby kontrolnej z wystawieniem na stres
1	2
Maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu	+++
5,6-Dihydro-5-(1-piperydynylo)metylo-3-(3-pirydylo)-4H-1,2,4-oksadiazyna	+ +
Chlorowodorek chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]benzimidoilu	+++

PL 195 634 B1 ciąg dalszy tabeli 5

1	2
N-{3-[(1,1-Dimetyloetylo)amino]-2-hydroksypropoksy}-3-trifluorometylo- benzamid	0
Maleinian chlorku (1:1) N-[2-benzyloksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu	+ +
Chlorowodorek 3-(3-pirydylo)-5-dietyloaminometylo-5,6-dihydro-6H-1,4,2-dioksazyny	+ +
Chlorowodorek N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-4-acetamidobenzamidyny	0
3-(3-Pirydylo)-5-t-butyloamino-5,6-dihydro-6H-1,4,2-dioksazyna	0
Chlorowodorek N-[2-palmitoiloksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoamid	0
N-Heksylo-N'-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]mocznik	+ +
Dichlorowodorek chlorku N-(3-piperydyno-1-propoksy)-3-pirydynokarboksyimidoilu	+ +
Chlorowodorek chlorku O-(3-dietyloaminopropoksy)-3-pirydynokarboksyimidoilu	0
Chlorowodorek chlorku O-(3-piperydynopropylo)-3-nitrobenzhydroksymoilu	+ +
Octan 1-{[3-(t-butyloamino)-2-hydroksypropoksy]imino}-1-(m-trifluorometylofenylo)etanu	+
Chlorowodorek chlorku N-{3-[1,1-(dimetyloetylo)amino]-2-hydroksypropoksy}-3-trifluorometylobenzimidoilu	+
Chlorowodorek chlorku N-[3-(dietyloamino)-2-hydroksypropoksy]-3-trifluorometylobenzimidoilu	+
Dichlorowodorek chlorku N-[2-palmitoiloksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu	+++
N-Heksylo-N'-[3-(1-piperydynylo)propoksy]mocznik	0
Chlorowodorek chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-nitrobenzimidoilu	+
Chlorowodorek chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-2-nitrobenzimidoilu	+ +
N-[2-Hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-N'-heptylomocznik	+ +
Dichlorowodorek N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-1-izochinolinokarboksyimidoamidu	+++
Chlorowodorek N-metylo-N-[3-(1-piperydynylo)propoksy]benzamidu	+
Jodek 5,6-dihydro-3-(4-chlorofenylo)-5-[N-metylo]piperydynio-1-ilo]metylo-4H-1,2,4-oksadiazyny	+
Chlorowodorek chlorku N-[3-(1-piperydynylo)propoksy]tiofeno-2-karboksyimidoilu	+ +

PL 195 634 B1

P r z y k ł a d 17. Pomiar poziomu hsp mRNA w aorcie piersiowej szczurów z genetycznym nadciśnieniem

Szczury z genetycznym nadciśnieniem podzielono na 4 grupy po 4. Raz dziennie, doustnie, podawano pierwszej grupie fizjologiczny roztwór soli, a drugiej grupie maleinian chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu (20 mg/kg) przez 8 dni, trzeciej grupie chlorowodorek chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]benzimidoilu (5 mg/kg) przez 20 dni, a czwartej grupie chlorowodorek chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-2-tiofenokarboksymidoilu (5 mg/kg) przez 20 dni. Zwierzęta uśmiercono, aorty wyizolowano, szybko zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -70°C do użycia.

b) Morfologiczne badanie aorty piersiowej

Badanie przeprowadzono zgodnie z opublikowanym sposobem (Br. J. of Pharmacol., 1995:115, 515-420). Obszar 1 mm² aorty piersiowej wycięto i utrwalono w 2,5% aldehydzie glutarowym w temperaturze pokojowej. Dalsze utrwalanie przeprowadzono w 1% czterotlenku osmu przez godzinę. Tkankę odwodniono w etanolu i wtopiono w Durcupan ACM. Fotografie wykonano pod elektronowym mikroskopem Hitachi 7100 i oceniono jakościowo.

Zauważono, że traktowanie maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu, chlorowodorkiem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]benzimidoilu i chlorowodorkiem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-2-tiofenokarboksymidoilu ułatwiło regenerację komórek aorty w stopniu odpowiednio przeciętnym i silnym.

c) Ilościowe pomiary hsp70

Doświadczenia prowadzono metodą ilościowej odwracalnej transkrypcyjnej reakcji łańcuchowej z polimerazą. Sposób opiera się na tym, że jeżeli dwa bardzo podobne, ale odróżnialne wzorce wzmacnia się w tej samej reakcji PCR, stosunek ilości ich produktów nie zmienia się podczas procesu. Gdy znana jest początkowa ilość jednego ze wzorców i względna ilość produktów jest mierzalna, to nieznaną ilość początkowego wzorca można obliczyć. W najczęściej stosowanym sposobie znany wzorzec (współzawodnik) i nieznany wzorzec (docelowy) różnią się tylko długością, przy czym współzawodnik jest krótszy, a produkty PCR odróżnia się na podstawie ich rozmiaru.

RNA wydzielono z tkanek sposobem guanidyniowo-izocyjanianowym (Chomczynski P. i Sacci N.: Anal. Biochem., 162:156, 1981). Stężenie i rodzaj kwasu nukleinowego oceniono metodą spektrofotometryczną i metodą elektroforezy na żelu agarozowym w warunkach denaturujących (Sambrook J. i in.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989). Wydzielony RNA przechowywano w temperaturze -70°C.

Skonstruowano fragment z cDNA genu kodującego hsp-70 wycinając wewnętrzną sekwencję (PCR-splicing, Riedy MC i in.: Biotechniques 18: 70, 1995). Fragment wzmocniono starterami specyficznie wiążącymi się z zewnętrzną częścią konstruktu (Erlich A.: PCR Technology. Principles and Applications for DNA Amplification, Stockton Press, 1989) i po zmierzeniu stężenia produktu przechowywano go w temperaturze -70°C.

Odwrotną transkrypcję przeprowadzono w standardowych warunkach stosując 1 μg wydzielonego RNA/próbkę za pomocą startera oligo dT (dT16). (Sambrook J. i in., jak powyżej).

Równą ilość cDNA wytworzonych z próbek RNA zmieszano z różnymi ilościami syntetycznego współzawodnika (pochodzącymi z seryjnych rozcieńczeń 3, 10 razy) i wzorce wzmocniono metodą reakcji łańcuchowej z polimerazą. Temperatura stosowana podczas cykli była następująca: denaturacja (95°C, 1 minuta), wygrzewanie (58°C, 1 minuta), synteza (72°C, 0,5 minuty).

Po wzmocnieniu PCR produkty oddzielono na żelu agarozowym (1%) i zabarwiono bromkiem etydiowym w standardowych warunkach (Sambrook i in., jak powyżej). Zabarwione fragmenty DNA uwidoczniono w transluminatorze UV do fotografii. Ilość produktów PCR zmierzono densytometrycznie z negatywów fotografii.

Zauważono, że poziom hsp70 w aorcie piersiowej szczurów potraktowanych maleinianem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu, chlorowodorkiem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]benzimidoilu i chlorowodorkiem chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-2-tiofenokarboksymidoilu był ponad 50% wyższy niż poziom hsp70 u zwierząt kontrolnych.

PL 195 634 B1

P r z y k ł a d 18. Badanie hamującego wpływu na starzenie skóry świnki morskiej

Hamujący wpływ związków według wynalazku na starzenie się skóry zbadano na śwince morskiej. Skórę pięciu zwierząt na grupę zdepilowano i powierzchnię 1 cm² naświetlono ze źródła UV-B z natężeniem 100 mJ/cm² po obu stronach. Po naświetleniu jedną stronę skóry potraktowano kremem skomponowanym zgodnie z przykładem 10 i zawierającym 5% (wagowo) maleinianu chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-3-pirydynokarboksyimidoilu, chlorowodorku chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]benzimidoilu lub chlorowodorku chlorku N-[2-hydroksy-3-(1-piperydynylo)propoksy]-2-nitrobenzimidoilu, a drugą stronę potraktowano takim samym kremem bez substancji czynnej. Było to doświadczenie z kontrolą wewnętrzną.

Traktowanie rozpoczęto natychmiast po naświetleniu i prowadzono dwukrotnie każdego dnia przez dwa tygodnie.

Naświetlenie UV-B spowodowało ostre uszkodzenia skóry (pęcherzyki, pęcherze, uszkodzenia nabłonka i powstawanie ran), które goiły się 4 dni wcześniej, przy rozmiarach rany znacząco mniejszych, gdy zwierzęta potraktowano związkami według wynalazku. Związki ułatwiały tworzenie nabłonka.

Doświadczenie wykazuje, że potraktowanie zwiększało odporność skóry na naświetlanie UV-B i polepszało regenerację skóry.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie pochodnych hydroksyloaminy do wytwarzania środka farmaceutycznego do zwiększania ekspresji cząsteczkowego białka opiekuńczego eksprymowanego przez komórkę wystawioną na stres fizjologiczny ponad ilość indukowaną przez stres fizjologiczny, przy czym jako pochodną stosuje się pochodną hydroksyloaminy, której postaci tautomeryczne przedstawiają wzory (I) i (II), albo jej sól i/lub dowolny optycznie czynny stereoizomer, przy czym w tautomerze o wzorze (I)

a) gdy A oznacza pirydyl (ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku)

Z oznacza wiązanie chemiczne;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶ albo CH2-C(Y⁴Y⁵)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl, ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku albo piperazynyl (ewentualnie podstawiony na atomie N C1-4-alkilem);

Y⁴, Y⁵ oznacza C1-4-alkil;

Y⁶ oznacza H, OH, O-acetyl, O-benzoil (ewentualnie podstawiony CF3, Cl, metoksylem), OCO-pirydynyl, O-furoil, O-palmitoil, O-tenoil;

X oznacza Cl, NR¹R² (gdzie R¹ i R² niezależnie oznaczają H albo C1-6-alkil, albo C3-8-cykloalkil), OC1-4-alkil;

b) gdy A oznacza fenyl (ewentualnie podstawiony Cl, CF3, grupą acetamidową, NO2, C1-4-alkilem)

Z oznacza wiązanie chemiczne, -NH-;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl albo R⁵, R⁶ oznaczają niezależnie H, C1-4-alkil, C3-8-cykloalkil;

Y⁶ oznacza H, OH;

X oznacza Cl, NR¹R² (R¹ i R² oznaczają niezależnie H albo C1-6-alkil);

c) gdy A oznacza chinolil, furyl, izochinolil, pirolil (ewentualnie podstawiony dwoma grupami metylowymi), tienyl

Z oznacza wiązanie chemiczne;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl;

Y⁶ oznacza OH;

X oznacza Cl, NH2;

d) gdy A oznacza C1-20-alkil;

Z oznacza O;

X oznacza etoksyl;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl;

Y⁶ oznacza OH; a w tautomerze o wzorze (II)

e) gdy A oznacza fenyl (ewentualnie podstawiony Cl, CF3, NO2) albo naftyl

Z oznacza wiązanie chemiczne, NH;

PL 195 634 B1

X oznacza =O, =NPh;

R' oznacza H, Ph;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl albo R⁵, R⁶ oznaczają niezależnie H, C1-4-alkil;

Y⁶ oznacza H, OH;

f) gdy A oznacza C1-20-alkil, C3-8-cykloalkil Z oznacza wiązanie chemiczne, O, NH, N(C1-6-alkil);

X oznacza =O, =NPh;

R' oznacza H, Me;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl albo R⁵, R⁶ oznaczają niezależnie H, C1-4-alkil;

Y⁶ oznacza H, OH.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym komórką eukariotyczną wystawioną na stres fizjologiczny jest komórka ssaka.
3. Zastosowanie według zastrz. 2, w którym komórką ssaka jest komórka ludzka.
4. Zastosowanie według zastrz. 2 albo 3, w którym komórką jest komórka żywego organizmu.
5. Zastosowanie według zastrz. 1 - 4, w którym komórką jest neuron, komórka mięśniowa, komórka ścianek naczyń, zwłaszcza komórka śródbłonka, komórka nabłonka albo komórka układu immunologicznego.
6. Zastosowanie według zastrz. 1 - 5, w którym stresem fizjologicznym jest stres metaboliczny, oksydacyjny lub miejscowy stres mechaniczny albo stres wywołany przez niedotlenienie, niedokrwienie, szok cieplny, promieniowanie lub materiały toksyczne.
7. Zastosowanie według zastrz. 6, w którym stres jest wywołany przez cukrzycę.
8. Zastosowanie według zastrz. 1 - 5, w którym stres fizjologiczny powoduje wzrost ilości reaktywnych wolnych rodników lub cytokiny w przestrzeni otaczającej komórkę.
9. Zastosowanie według zastrz. 1 - 5, w którym stres fizjologiczny prowadzi do wystąpienia chorób układu sercowo-naczyniowego, chorób naczyń, chorób mózgu, alergii, chorób immunologicznych i chorób autoimmunologicznych, chorób pochodzenia wirusowego lub bakteryjnego, chorób nowotworowych, chorób skóry i/lub śluzówki lub chorób nabłonka kanalików nerwowych.
10. Zastosowanie według zastrz. 9, w którym choroba układu sercowo-naczyniowego jest spowodowana miażdżycą tętnic, chorobą wieńcową, hipertonią lub hipertonią płucną wywołanymi przez stres fizjologiczny.
11. Zastosowanie według zastrz. 9, w którym choroba mózgu jest spowodowana przez niedokrwienie naczyń mózgowych, udarem, urazem głowy, neurodegeneratywną chorobą starczą, zwłaszcza otępieniem starczym, otępieniem związanym z AIDS, otępieniem alkoholowym, chorobą Alzheimera, chorobą Parkinsona lub padaczką wywołanymi przez stres fizjologiczny.
12. Zastosowanie według zastrz. 9, w którym choroba skóry i/lub śluzówki jest spowodowana dermatozą lub chorobą wrzodową układu żołądkowo-jelitowego wywołanymi przez stres fizjologiczny.
13. Zastosowanie według zastrz. 1 - 12, w którym cząsteczkowym białkiem opiekuńczym jest białko szoku cieplnego (hsp).
14. Zastosowanie według zastrz. 13, w którym hsp jest hsp70 lub hsp72.
15. Zastosowanie według zastrz. 1 - 14, w których stosuje się hydroksyloaminę o wzorze (I), w którym

a) gdy A oznacza pirydyl (ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku)

Z oznacza wiązanie chemiczne;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶ gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl (ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku) albo piperazynyl (ewentualnie podstawiony na atomie N metylem);

Y⁶ oznacza H, OH, O-acetyl, O-benzoil (ewentualnie podstawiony CF3, Cl, metoksylem), OCO-pirydynyl, O-furoil, O-palmitoil, O-tenoil;

X oznacza Cl, NR¹R² (R¹ i R² oznaczają niezależnie H albo C1-6-alkil, albo C3-8-cykloalkil), OC1-4-alkil;

b) gdy A oznacza fenyl (ewentualnie podstawiony Cl, CF3, grupą acetamidową, NO2, C1-4-alkilem), to

Z oznacza wiązanie chemiczne, -NH-;

PL 195 634 B1

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl albo R⁵, R⁶ oznaczają niezależnie H, C1-4-alkil, C3-8-cykloalkil;

Y⁶ oznacza H, OH;

X oznacza Cl, NR¹R² (R¹ i R² oznaczają niezależnie H albo C1-6-alkil);

c) gdy A oznacza chinolil, furyl, izochinolil, pirolil (ewentualnie podstawiony dwoma grupami metylowymi), tienyl

Z oznacza wiązanie chemiczne;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl;

Y⁶ oznacza OH;

X oznacza Cl, NH2;

d) gdy A oznacza C1-6-alkil, to

Z oznacza O;

X oznacza etoksyl;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl;

Y⁶ oznacza OH.
16. Zastosowanie według zastrz. 15, w którym Z oznacza wiązanie chemiczne, a A oznacza fenyl ewentualnie podstawiony C1-4-alkilem, trifluorometylem, grupą nitrową, grupą acetamidową lub Cl, tienyl, furyl lub pirolil ewentualnie podstawiony dwoma grupami metylowymi, pirydyl ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku, chinolil albo izochinolil.
17. Zastosowanie według zastrz. 16, w którym A oznacza fenyl ewentualnie podstawiony Cl, C1-4-alkilem, trifluorometylem lub grupą nitrową, tienyl, furyl albo pirolil ewentualnie podstawiony dwoma grupami metylowymi, pirydyl ewentualnie podstawiony metylem lub w postaci N-tlenku, chinolil albo izochinolil.
18. Zastosowanie według zastrz. 15, w którym

Z oznacza wiązanie chemiczne;

X oznacza C1-4-alkoksyl;

A oznacza tienyl, furyl albo pirolil ewentualnie podstawiony dwoma grupami metylowymi, pirydyl ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku, chinolil albo izochinolil, korzystnie pirolil ewentualnie podstawiony dwoma grupami metylowymi, pirydyl ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku, chinolil albo izochinolil.
19. Zastosowanie według zastrz. 15, w którym

Z oznacza wiązanie chemiczne;

X oznacza -NR¹R², gdzie R¹ i R² oznaczają niezależnie H, C1-6-alkil albo C3-8-cykloalkil; i

A oznacza pirydyl ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku.
20. Zastosowanie według zastrz. 1-14, w którym pochodną hydroksyloaminy jest związek o wzorze (II), w którym

a) gdy A oznacza fenyl (ewentualnie podstawiony Cl, CF3, NO2) albo naftyl

Z oznacza wiązanie chemiczne, NH;

X oznacza =O, =N-fenyl;

R' oznacza H, Me, fenyl;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl albo R⁵, R⁶ oznaczają niezależnie H, C1-4-alkil;

Y⁶ oznacza H, OH; albo

b) gdy A oznacza C1-20-alkil, C3-8-cykloalkil

Z oznacza wiązanie chemiczne, O, NH, N(C1-6-alkil);

X oznacza =O, =N-fenyl;

R' oznacza H, Me;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl albo R⁵, R⁶ oznaczają niezależnie H, C1-4-alkil;

Y⁶ oznacza H, OH.
21. Zastosowanie według zastrz. 20, w którym

Z oznacza wiązanie chemiczne;

X oznacza O;

R' oznacza H albo metyl; i

A oznacza fenyl ewentualnie podstawiony grupą nitrową lub Cl.

PL 195 634 B1
22. Zastosowanie według zastrz. 20, w którym A oznacza fenyl ewentualnie podstawiony CF3.
23. Zastosowanie według zastrz. 20, w którym

Z oznacza wiązanie chemiczne;

X oznacza =N-fenyl;

R' oznacza metyl; i

A oznacza fenyl ewentualnie podstawiony grupą nitrową lub Cl.
24. Zastosowanie według zastrz. 20, w którym Z oznacza O, X oznacza O, R' oznacza H lub metyl, i A oznacza prostołańcuchowy lub rozgałęziony C1-20-alkil.
25. Zastosowanie według zastrz. 20, w którym Z oznacza O, X oznacza =N-fenyl, a R' oznacza metyl.
26. Zastosowanie według zastrz. 20, w którym Z oznacza =NR³, gdzie R³ oznacza H lub metyl, X oznacza O, R' oznacza H, metyl, i A oznacza C1-20-alkil lub fenyl.
27. Zastosowanie według zastrz. 26, w którym A oznacza C4-12-alkil, fenyl ewentualnie podstawiony Cl, CF3 lub grupę nitrową.
28. Zastosowanie według zastrz. 20, w którym

Z oznacza =NR³, gdzie R³ oznacza H lub metyl;

X oznacza =N-fenyl;

R' oznacza metyl; i

A oznacza C1-20-alkil albo fenyl ewentualnie podstawiony grupą nitrową lub Cl.
29. Zastosowanie pochodnych hydroksyloaminy do wytwarzania środka farmaceutycznego do zwiększania aktywności cząsteczkowego białka opiekuńczego w komórce eukariotycznej wystawionej na stres fizjologiczny w stopniu wyższym niż indukowany przez stres fizjologiczny, przy czym jako pochodną stosuje się pochodną hydroksyloaminy, której postaci tautomeryczne przedstawiają wzory (I) i (II), albo jej sól i dowolny optycznie czynny stereoizomer, przy czym w tautomerze o wzorze (I)

a) gdy A oznacza pirydyl (ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku)

Z oznacza wiązanie chemiczne;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶ albo CH2-C(Y⁴Y⁵)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl, ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku albo piperazynyl (ewentualnie podstawiony na atomie N C1-4-alkilem);

Y⁴, Y⁵ oznacza C1-4-alkil;

Y⁶ oznacza H, OH, O-acetyl, O-benzoil (ewentualnie podstawiony CF3, Cl, metoksylem), OCO-pirydynyl, O-furoil, O-palmitoil, O-tenoil;

X oznacza Cl, NR¹R² (R¹ i R² oznaczają niezależnie H albo C1-6-alkil, albo C3-8-cykloalkil), OC1-4-alkil;

b) gdy A oznacza fenyl (ewentualnie podstawiony Cl, CF3, grupą acetamidową, NO2, C1-4-alkilem)

Z oznacza wiązanie chemiczne, -NH-;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl albo R⁵, R⁶ oznaczają niezależnie H, C1-4-alkil, C3-8-cykloalkil;

Y⁶ oznacza H, OH;

X oznacza Cl, NR¹R² (R¹ i R² oznaczają niezależnie H albo C1-6-alkil);

c) gdy A oznacza chinolil, furyl, izochinolil, pirolil (ewentualnie podstawiony dwoma grupami metylowymi), tienyl

Z oznacza wiązanie chemiczne;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl;

Y⁶ oznacza OH;

X oznacza Cl, NH2;

d) gdy A oznacza C1-20-alkil

Z oznacza O;

X oznacza etoksyl;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl;

Y⁶ oznacza OH; a w tautomerze o wzorze (II)

e) gdy A oznacza fenyl (ewentualnie podstawiony Cl, CF3, NO2) albo naftyl, to

Z oznacza wiązanie chemiczne, NH;

X oznacza =O, =NPh;

PL 195 634 B1

R' oznacza H, Ph;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl albo R⁵, R⁶ oznaczają niezależnie H, C1-4-alkil;

Y⁶ oznacza H, OH;

f) gdy A oznacza C1-20-alkil, C3-8-cykloalkil, to

Z oznacza wiązanie chemiczne, O, NH, N(C1-6-alkil);

X oznacza =O, =NPh;

R' oznacza H, Me;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl albo R⁵, R⁶ oznaczają niezależnie H, C1-4-alkil;

Y⁶ oznacza H, OH.
30. Zastosowanie według zastrz. 29, w którym komórką eukariotyczną wystawioną na stres fizjologiczny jest komórka ssaka.
31. Zastosowanie według zastrz. 30, w którym komórką ssaka jest komórka ludzka.
32. Zastosowanie według zastrz. 30 albo 31, w którym komórką jest komórka żywego organizmu.
33. Zastosowanie według zastrz. 29 - 32, w którym komórką jest neuron, komórka mięśniowa, komórka ścianek naczyń, zwłaszcza komórka śródbłonka, komórka nabłonka albo komórka układu immunologicznego.
34. Zastosowanie według zastrz. 29 - 33, w którym stresem fizjologicznym jest stres metaboliczny, oksydacyjny lub miejscowy stres mechaniczny albo stres wywołany przez niedotlenienie, niedokrwienie, szok cieplny, promieniowanie lub materiały toksyczne.
35. Zastosowanie według zastrz. 34, w którym stres jest wywołany przez cukrzycę.
36. Zastosowanie według zastrz. 29 - 33, w którym stres fizjologiczny powoduje wzrost ilości reaktywnych wolnych rodników lub cytokiny w przestrzeni otaczającej komórkę.
37. Zastosowanie według zastrz. 29 - 33, w którym stres fizjologiczny prowadzi do wystąpienia chorób układu sercowo-naczyniowego, chorób naczyń, chorób mózgu, alergii, chorób immunologicznych i chorób autoimmunologicznych, chorób pochodzenia wirusowego lub bakteryjnego, chorób nowotworowych, chorób skóry i/lub śluzówki lub chorób nabłonka kanalików nerwowych.
38. Zastosowanie według zastrz. 37, w którym choroba układu sercowo-naczyniowego jest spowodowana miażdżycą tętnic, chorobą wieńcową, hipertonią lub hipertonią płucną wywołanymi przez stres fizjologiczny.
39. Zastosowanie według zastrz. 37, w którym choroba mózgu jest spowodowana przez niedokrwienie naczyń mózgowych, udarem, urazem głowy, neurodegeneratywną chorobą starczą, zwłaszcza otępieniem starczym, otępieniem związanym z AIDS, otępieniem alkoholowym, chorobą Alzheimera, chorobą Parkinsona lub padaczką wywołanymi przez stres fizjologiczny.
40. Zastosowanie według zastrz. 37, w którym choroba skóry i/lub śluzówki jest spowodowana dermatozą lub chorobą wrzodową układu żołądkowo-jelitowego wywołanymi przez stres fizjologiczny.
41. Zastosowanie według zastrz. 29 - 40, w którym cząsteczkowym białkiem opiekuńczym jest białko szoku cieplnego (hsp).
42. Zastosowanie według zastrz. 41, w którym hsp jest hsp70 lub hsp72.
43. Zastosowanie według zastrz. 29 - 42, w których stosuje się hydroksyloaminę o wzorze (I), w którym

a) gdy A oznacza pirydyl (ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku)

Z oznacza wiązanie chemiczne;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶ gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl (ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku) albo piperazynyl (ewentualnie podstawiony na atomie N metylem);

Y⁶ oznacza H, OH, O-acetyl, O-benzoil (ewentualnie podstawiony CF3, Cl, metoksylem), OCO-pirydynyl, O-furoil, O-palmitoil, O-tenoil;

X oznacza Cl, NR¹R² (R¹ i R² oznaczają niezależnie H albo C1-6-alkil, albo C3-8-cykloalkil), OC1-4-alkil;

b) gdy A oznacza fenyl (ewentualnie podstawiony Cl, CF3, grupą acetamidową, NO2, C1-4-alkilem), to

Z oznacza wiązanie chemiczne, -NH-;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl albo R⁵, R⁶ oznaczają niezależnie H, C1-4-alkil, C3-8-cykloalkil;

PL 195 634 B1

Y⁶ oznacza H, OH;

X oznacza Cl, NR¹R² (R¹ i R² oznaczają niezależnie H albo C1-6-alkil);

c) gdy A oznacza chinolil, furyl, izochinolil, pirolil (ewentualnie podstawiony dwoma grupami metylowymi), tienyl

Z oznacza wiązanie chemiczne;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl;

Y⁶ oznacza OH;

X oznacza Cl, NH2;

d) gdy A oznacza C1-6-alkil, to

Z oznacza O;

X oznacza etoksyl;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl;

Y⁶ oznacza OH.
44. Zastosowanie według zastrz. 43, w którym Z oznacza wiązanie chemiczne, a A oznacza fenyl ewentualnie podstawiony C1-4-alkilem, trifluorometylem, grupą nitrową, grupą acetamidową lub Cl, tienyl, furyl lub pirolil ewentualnie podstawiony dwoma grupami metylowymi, pirydyl ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku, chinolil albo izochinolil.
45. Zastosowanie według zastrz. 44, w którym A oznacza fenyl ewentualnie podstawiony Cl, C1-4-alkilem, trifluorometylem lub grupą nitrową, tienyl, furyl albo pirolil ewentualnie podstawiony dwoma grupami metylowymi, pirydyl ewentualnie podstawiony metylem lub w postaci N-tlenku, chinolil albo izochinolil.
46. Zastosowanie według zastrz. 43, w którym

Z oznacza wiązanie chemiczne;

X oznacza C1-4-alkoksyl;

A oznacza tienyl, furyl albo pirolil ewentualnie podstawiony dwoma grupami metylowymi, pirydyl ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku, chinolil albo izochinolil, korzystnie pirolil ewentualnie podstawiony dwoma grupami metylowymi, pirydyl ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku, chinolil albo izochinolil.
47. Zastosowanie według zastrz. 43, w którym

Z oznacza wiązanie chemiczne;

X oznacza -NR¹R², gdzie R¹ i R² oznaczają niezależnie H, C1-6-alkil albo C3-8-cykloalkil; i

A oznacza pirydyl ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku.
48. Zastosowanie według zastrz. 29 - 42, w którym pochodną hydroksyloaminy jest związek o wzorze (II), w którym

a) gdy A oznacza fenyl (ewentualnie podstawiony Cl, CF3, NO2) albo naftyl

Z oznacza wiązanie chemiczne, NH;

X oznacza =O, =N-fenyl;

R' oznacza H, Me, fenyl;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl albo R⁵, R⁶ oznaczają niezależnie H, C1-4-alkil;

Y⁶ oznacza H, OH; albo

b) gdy A oznacza C1-20-alkil, C3-8-cykloalkil

Z oznacza wiązanie chemiczne, O, NH, N(C1-6-alkil);

X oznacza =O, =N-fenyl;

R' oznacza H, Me;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl albo R⁵, R⁶ oznaczają niezależnie H, C1-4-alkil;

Y⁶ oznacza H, OH.
49. Zastosowanie według zastrz. 48, w którym

Z oznacza wiązanie chemiczne;

X oznacza O;

R' oznacza H albo metyl; i

A oznacza fenyl ewentualnie podstawiony grupą nitrową lub Cl.
50. Zastosowanie według zastrz. 48, w którym A oznacza fenyl ewentualnie podstawiony CF3.

PL 195 634 B1
51. Zastosowanie według zastrz. 48, w którym

Z oznacza wiązanie chemiczne;

X oznacza =N-fenyl;

R' oznacza metyl; i

A oznacza fenyl ewentualnie podstawiony grupą nitrową lub Cl.
52. Zastosowanie według zastrz. 48, w którym Z oznacza O, X oznacza O, R' oznacza H lub metyl, i A oznacza prostołańcuchowy lub rozgałęziony C1-20-alkil.
53. Zastosowanie według zastrz. 48, w którym Z oznacza O, X oznacza =N-fenyl, a R' oznacza metyl.
54. Zastosowanie według zastrz. 48, w którym Z oznacza =NR³, gdzie R³ oznacza H lub metyl, X oznacza O, R' oznacza H, metyl, i A oznacza C1-20-alkil lub fenyl.
55. Zastosowanie według zastrz. 54, w którym A oznacza C4-12-alkil, fenyl ewentualnie podstawiony Cl, CF3 lub grupę nitrową.
56. Zastosowanie według zastrz. 48, w którym

Z oznacza =NR³, gdzie R³ oznacza H lub metyl;

X oznacza =N-fenyl;

R' oznacza metyl; i

A oznacza C1-20-alkil albo fenyl ewentualnie podstawiony grupą nitrową lub Cl.
57. Zastosowanie pochodnych hydroksyloaminy do wytwarzania środka farmaceutycznego do leczenia choroby związanej z działaniem układu białek opiekuńczych lub związanej z uszkodzeniem błon komórkowych lub organelli komórkowych, lub ewentualnie zapobiegania takiej chorobie, w którym jako pochodną stosuje się pochodną hydroksyloaminy, której postacie tautomeryczne przedstawiają wzory (I) i (II), albo jej sól i/lub dowolny optycznie czynny stereoizomer, przy czym w tautomerze o wzorze (I)

a) gdy A oznacza pirydyl (ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku)

Z oznacza wiązanie chemiczne;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶ albo CH2-C(Y⁴Y⁵)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl, ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku albo piperazynyl (ewentualnie podstawiony na atomie N C1-4-alkilem);

Y⁴, Y⁵ oznacza C1-4-alkil;

Y⁶ oznacza H, OH, O-acetyl, O-benzoil (ewentualnie podstawiony CF3, Cl, metoksylem), OCO-pirydynyl, O-furoil, O-palmitoil, O-tenoil;

X oznacza Cl, NR¹R² (R¹ i R² oznaczają niezależnie H albo C1-6-alkil, albo C3-8-cykloalkil), OC1-4-alkil;

b) gdy A oznacza fenyl (ewentualnie podstawiony Cl, CF3, grupą acetamidową, NO2, C1-4-alkilem)

Z oznacza wiązanie chemiczne, -NH-;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl albo R⁵, R⁶ oznaczają niezależnie H, C1-4-alkil, C3-8-cykloalkil;

Y⁶ oznacza H, OH;

X oznacza Cl, NR¹R² (R¹ i R² oznaczają niezależnie H albo C1-6-alkil);

c) gdy A oznacza chinolil, furyl, izochinolil, pirolil (ewentualnie podstawiony dwoma grupami metylowymi), tienyl

Z oznacza wiązanie chemiczne;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl;

Y⁶ oznacza OH;

X oznacza Cl, NH2;

d) gdy A oznacza C1-20-alkil

Z oznacza O;

X oznacza etoksyl;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl;

Y⁶ oznacza OH; a w tautomerze o wzorze (II)

e) gdy A oznacza fenyl (ewentualnie podstawiony Cl, CF3, NO2) albo naftyl

Z oznacza wiązanie chemiczne, NH;

X oznacza =O, =NPh;

R' oznacza H, Ph;

PL 195 634 B1

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl albo R⁵, R⁶ oznaczają niezależnie H, C1-4-alkil;

Y⁶ oznacza H, OH;

f) gdy A oznacza C1-20-alkil, C3-8-cykloalkil

Z oznacza wiązanie chemiczne, O, NH, N(C1-6-alkil);

X oznacza =O, =NPh;

R' oznacza H, Me;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl albo R⁵, R⁶ oznaczają niezależnie H, C1-4-alkil;

Y⁶ oznacza H, OH.
58. Zastosowanie według zastrz. 57, w którym stan patologiczny jest wybrany z grupy obejmującej niedokrwienie, chorobę nowotworową, infekcję spowodowaną przez patogeniczny mikroorganizm, chorobę autoimmunologiczną i dermatozę.
59. Zastosowanie według zastrz. 57, do wytwarzania środka farmaceutycznego do ochrony mięśnia sercowego, tkanki mózgu i tkanki nerek przed uszkodzeniem tkanek i/lub nekrozą wywołaną niedokrwieniem, w którym pochodną jest pochodna hydroksyloaminy, której postacie tautomeryczne przedstawiają wzory (I) i (II), albo jej sól i/lub dowolny optycznie czynny stereoizomer, przy czym A, Z, R i X mają znaczenie podane w zastrz. 57.
60. Zastosowanie według zastrz. 57 - 59, do leczenia chorób mózgu, alergii, chorób immunologicznych, chorób autoimmunologicznych, chorób wywoływanych przez infekcje wirusowe lub bakteryjne, chorób skóry i/lub błony śluzowej lub komórek nabłonkowych kanalików nerkowych.
61. Zastosowanie według zastrz. 57 - 60, w których stosuje się hydroksyloaminę o wzorze (I), w którym

a) gdy A oznacza pirydyl (ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku)

Z oznacza wiązanie chemiczne;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶ gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl (ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku) albo piperazynyl (ewentualnie podstawiony na atomie N metylem);

Y⁶ oznacza H, OH, O-acetyl, O-benzoil (ewentualnie podstawiony CF3, Cl, metoksylem), OCO-pirydynyl, O-furoil, O-palmitoil, O-tenoil;

X oznacza Cl, NR¹R² (R¹ i R² oznaczają niezależnie H albo C1-6-alkil, albo C3-8-cykloalkil), OC1-4-alkil;

b) gdy A oznacza fenyl (ewentualnie podstawiony Cl, CF3, grupą acetamidową, NO2, C1-4-alkilem), to

Z oznacza wiązanie chemiczne, -NH-;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl albo R⁵, R⁶ oznaczają niezależnie H, C1-4-alkil, C3-8-cykloalkil;

Y⁶ oznacza H, OH;

X oznacza Cl, NR¹R² (R¹ i R² oznaczają niezależnie H albo C1-6-alkil);

c) gdy A oznacza chinolil, furyl, izochinolil, pirolil (ewentualnie podstawiony dwoma grupami metylowymi), tienyl

Z oznacza wiązanie chemiczne;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl;

Y⁶ oznacza OH;

X oznacza Cl, NH2;

d) gdy A oznacza C1-6-alkil, to

Z oznacza O;

X oznacza etoksyl;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl;

Y⁶ oznacza OH.
62. Zastosowanie według zastrz. 61, w którym Z oznacza wiązanie chemiczne, a A oznacza fenyl ewentualnie podstawiony C1-4-alkilem, trifluorometylem, grupą nitrową, grupą acetamidową lub Cl, tienyl, furyl lub pirolil ewentualnie podstawiony dwoma grupami metylowymi, pirydyl ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku, chinolil albo izochinolil.

PL 195 634 B1
63. Zastosowanie według zastrz. 62, w którym A oznacza fenyl ewentualnie podstawiony Cl, C1-4-alkilem, trifluorometylem lub grupą nitrową, tienyl, furyl albo pirolil ewentualnie podstawiony dwoma grupami metylowymi, pirydyl ewentualnie podstawiony metylem lub w postaci N-tlenku, chinolil albo izochinolil.
64. Zastosowanie według zastrz. 61, w którym

Z oznacza wiązanie chemiczne;

X oznacza C1-4-alkoksyl;

A oznacza tienyl, furyl albo pirolil ewentualnie podstawiony dwoma grupami metylowymi, pirydyl ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku, chinolil albo izochinolil, korzystnie pirolil ewentualnie podstawiony dwoma grupami metylowymi, pirydyl ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku, chinolil albo izochinolil.
65. Zastosowanie według zastrz. 61, w którym

Z oznacza wiązanie chemiczne;

X oznacza -NR¹R², gdzie R¹ i R² oznaczają niezależnie H, C1-6-alkil albo C3-8-cykloalkil; i

A oznacza pirydyl ewentualnie podstawiony na atomie N metylem lub w postaci N-tlenku.
66. Zastosowanie według zastrz. 57 - 60, w którym pochodną hydroksyloaminy jest związek o wzorze (II), w którym

a) gdy A oznacza fenyl (ewentualnie podstawiony Cl, CF3, NO2) albo naftyl

Z oznacza wiązanie chemiczne, NH;

X oznacza =O, =N-fenyl;

R' oznacza H, Me, fenyl;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl albo R⁵, R⁶ oznaczają niezależnie H, C1-4-alkil;

Y⁶ oznacza H, OH; albo

b) gdy A oznacza C1-20-alkil, C3-8-cykloalkil

Z oznacza wiązanie chemiczne, O, NH, N(C1-6-alkil);

X oznacza =O, =N-fenyl;

R' oznacza H, Me;

R oznacza CH2-CH(Y⁶)CH2-NR⁵R⁶, gdzie NR⁵R⁶ oznacza piperydynyl albo R⁵, R⁶ oznaczają niezależnie H, C1-4-alkil;

Y⁶ oznacza H, OH.
67. Zastosowanie według zastrz. 66, w którym

Z oznacza wiązanie chemiczne;

X oznacza O;

R' oznacza H albo metyl; i

A oznacza fenyl ewentualnie podstawiony grupą nitrową lub Cl.
68. Zastosowanie według zastrz. 66, w którym A oznacza fenyl ewentualnie podstawiony CF3.
69. Zastosowanie według zastrz. 66, w którym

Z oznacza wiązanie chemiczne;

X oznacza =N-fenyl;

R' oznacza metyl; i

A oznacza fenyl ewentualnie podstawiony grupą nitrową lub Cl.
70. Zastosowanie według zastrz. 66, w którym Z oznacza O, X oznacza O, R' oznacza H lub metyl, i A oznacza prostołańcuchowy lub rozgałęziony C1-20-alkil.
71. Zastosowanie według zastrz. 66, w którym Z oznacza O, X oznacza =N-fenyl, a R' oznacza metyl.
72. Zastosowanie według zastrz. 66, w którym Z oznacza =NR³, gdzie R³ oznacza H lub metyl, X oznacza O, R' oznacza H, metyl, i A oznacza C1-20-alkil lub fenyl.
73. Zastosowanie według zastrz. 72, w którym A oznacza C4-12-alkil, fenyl ewentualnie podstawiony Cl, CF3 lub grupę nitrową.
74. Zastosowanie według zastrz. 66, w którym

Z oznacza =NR³, gdzie R³ oznacza H lub metyl;

X oznacza =N-fenyl;

R' oznacza metyl; i

A oznacza C1-20-alkil albo fenyl ewentualnie podstawiony grupą nitrową lub Cl.

PL 195 634 B1
75. Pochodna hydroksyloaminy o wzorze (I), w którym

a) X oznacza Cl;

Z oznacza wiązanie chemiczne;

A oznacza grupę o wzorze (a), gdzie Y¹ oznacza trifluorometyl, grupę nitrową, i n oznacza 1, albo furyl, tienyl, pirydyl, chinolil lub izochinolil, korzystnie pirydyl, chinolil lub izochinolil; i

R oznacza grupę o wzorze (b), gdzie k i m oznaczają 1, R⁵ i R⁶ niezależnie oznaczają C1-C8-alkil, korzystnie C1-C4-alkil, C3-C8-cykloalkil, albo R⁵ i R⁶ wraz z sąsiadującym atomem N, tworzą pierścień piperydynowy ewentualnie podstawiony na atomie N C1-6-alkilem i ewentualnie w postaci N-tlenku, Y⁶ oznacza -OR⁷, gdzie R⁷ oznacza H albo C1-16-alkanoil, albo benzoil, z tym, że gdy A oznacza pirydyl lub grupę o wzorze (a), gdzie Y¹ oznacza Cl, to wówczas R⁷ ma znaczenie inne niż H, lub

b) X oznacza -NR¹R², gdzie R¹ i R² niezależnie oznaczają H albo C1-6-alkil;

A oznacza fenyl;

Z oznacza =NH; i

R oznacza grupę o wzorze (b), gdzie R⁵ i R⁶ niezależnie oznaczają H albo C1-C8-alkil, korzystnie C1-C4-alkil, albo R⁵ i R⁶ wraz z sąsiadującym atomem N, tworzą pierścień piperydynowy, Y⁶ oznacza -OH, k oznacza 1, i m oznacza 1, lub

c) X oznacza -OQ, gdzie Q oznacza C1-6-alkil;

A oznacza C1-6-alkil;

Z oznacza O; i

R oznacza grupę o wzorze (b), gdzie R⁵ i R⁶ wraz z sąsiadującym atomem N, tworzą pierścień piperydynowy, Y⁶ oznacza -OH, k oznacza 1, i m oznacza 1.

₁
76. Pochodna hydroksyloaminy według zastrz. 75, w której A oznacza grupę o wzorze (a), a Y¹oznacza trifluorometyl.
77. Pochodna hydroksyloaminy o wzorze (I), w którym

X oznacza -NR¹R², gdzie R¹ i R² niezależnie oznaczają H, C1-6-alkil albo C3-C8-cykloalkil;

A oznacza fenyl ewentualnie podstawiony 1-3 grupami wybranymi z grupy obejmującej C1-6-alkil, korzystnie C1-C4-alkil, trifluorometyl i grupę nitrową, lub pirolil, pirydyl chinolil albo izochinolil, korzystnie pirolil, pirydyl, izochinolil, lub chinolil;

Z oznacza wiązanie chemiczne; i

R oznacza grupę o wzorze (e), gdzie R⁵ i R⁶ niezależnie oznaczają H, C1-8-alkil, korzystnie C1-C4-alkil, lub C3-C8-cykloalkil, lub R⁵ i R⁶ wraz z sąsiadującym atomem N, tworzą pierścień piperydyny lub piperazyny ewentualnie podstawiony na atomie N C1-6-alkilem, Y⁴ oznacza H lub C1-C4-alkil, Y⁵ oznacza H lub C1-C4-alkil, lub -OR⁷, gdzie R⁷ oznacza H lub C1-16-alkanoil, lub benzoil; k oznacza 1, i m oznacza 1, z tym, że gdy R⁷ oznacza H, to wówczas co najmniej jeden z podstawników R¹ i R² ma znaczenie inne niż H, i gdy R¹ i R² oznaczają H, to wówczas R⁷ ma znaczenie inne niż H.
78. Pochodna hydroksyloaminy o wzorze (II), w którym

a) X oznacza O;

A oznacza C1-C20-alkil, fenyl ewentualnie podstawiony CF3, korzystnie fenyl;

Z oznacza wiązanie chemiczne;

R' oznacza H;

R oznacza grupę o wzorze (b), gdzie R⁵ i R⁶ niezależnie oznaczają H, C1-8-alkil, korzystnie C1-4-alkil, albo R⁵ i R⁶ wraz z sąsiadującym atomem N, tworzą pierścień piperydynowy, Y⁶ oznacza H albo -OR⁷, gdzie R⁷ oznacza H, k oznacza 1, i m oznacza 1, z tym, że gdy A ma znaczenie inne niż alkil i R' oznacza H, to wówczas Y⁶ oznacza H, lub

b) X oznacza =NR⁴, gdzie R⁴ oznacza fenyl;

A oznacza fenyl;

Z oznacza wiązanie chemiczne;

R' oznacza fenyl; i

R oznacza grupę o wzorze (b), gdzie R⁵ i R⁶ wraz z sąsiadującym atomem N, tworzą pierścień piperydynowy, Y⁶ oznacza -OR⁷, gdzie R⁷ oznacza H, k oznacza 1, i m oznacza 1.

PL 195 634 B1
79. Środek farmaceutyczny do leczenia chorób układu sercowo-naczyniowego, chorób naczyń, chorób mózgu, alergii, chorób immunologicznych i chorób autoimmunologicznych, chorób na tle infekcji wirusowej lub bakteryjnej, chorób nowotworowych oraz chorób skóry lub śluzówki, zawierający substancję czynną oraz farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i substancje pomocnicze, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera pochodną hydroksyloaminy o wzorze (I), w którym A, Z, X i R mają znaczenie podane w zastrz. 75, w ilości 0,5 - 99,5% wagowych.
80. Środek farmaceutyczny do leczenia chorób układu sercowo-naczyniowego, chorób naczyń, chorób mózgu, alergii, chorób immunologicznych i chorób autoimmunologicznych, chorób na tle infekcji wirusowej lub bakteryjnej, chorób nowotworowych oraz chorób skóry lub śluzówki, zawierający substancję czynną oraz farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i substancje pomocnicze, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera pochodną hydroksyloaminy o wzorze (I), w którym A, Z, X i R mają znaczenie podane w zastrz. 77, w ilości 0,5 - 99,5% wagowych.
81. Środek farmaceutyczny do leczenia chorób układu sercowo-naczyniowego, chorób naczyń, chorób mózgu, alergii, chorób immunologicznych i chorób autoimmunologicznych, chorób na tle infekcji wirusowej lub bakteryjnej, chorób nowotworowych oraz chorób skóry lub śluzówki, zawierający substancję czynną oraz farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i substancje pomocnicze, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera pochodną hydroksyloaminy o wzorze (II), w którym A, Z, X, R' i R mają znaczenie podane w zastrz. 78, w ilości 0,5 - 99,5% wagowych.