RS50140B - Postupak za dobijanje perkihinina i njegova upotreba - Google Patents

Abstract

Perkihinin, jedinjenje formule: i njegove farmaceutski prihvatljive soli. Prijava sadrži još 6 zavisnih patentnih zahteva.

Description

Postupak dobijanja Perkihinin i njegova upotreba kao farmaceutskog preparata.

Ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenje pod nazivom Perkihinin, koji se dobijaju gajenjem kultureBasidiomiceta Stereum complicatumST 001837 (DSM 13303) i njegove farmaceutski prihvatljive soli i derivate. Pronalazak se odnosi i na postupak dobijanja Perkihinina, na gljivice ST 001837 (DSM 13303), upotrebu Perkihinina i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli i derivata kao farmaceutskih preparata tačnije upotrebu kao inhibitora lipaze i na farmaceutski preparat koji se sastoji od Perkihinina i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli ili derivata.

Metabolizam Hpida obično održava delikatnu ravnotežu između sinteze i degradacije. Kad je ova ravnoteža poremećena, može doći do hiperlipidermje, koja dalje može prouzrokovati pojavu teroskleroze, hipertenzije, dijabetesa ild. Od modulatora metabolizma lipida se očekuje da budu korisni u kontroli ovih oboljenja, inhibicijaiipolizeje ne-insulin-zavistan dijabetes mellitus (NIDDM) koji bi trebalo da redukuje hiperglikemiju. Polazna tačka u iskorišćenju masti kao izvora energije je hidroliza triacilglicerola lipazama, npr. hormon sensitivna lipaza i monoacilglicerol lipaza. Hidrolizom triacilglicerola dolazi do povećanja nivoa glicerola i masnih kiselina u krvi.Od lipaza inhibitora se očekuje da redukuju i nivo masnih kiselina u plazmi i hiperglikemiju uz smanjene nepoželjne efekte.

Gojaznost i hiperholasterolemija su do određenog stepena povezne sa povećanim nutncionim unošenjem masti. Kl jučni enzim apsorpcije triglicenda unetioh hranom je pankreatna lipaza. Inhibicija pankreatne lipaze može dovesti do inhibieije apsorpcije masti.

Otkriveno je da novo jedinjenje nazvano Perkihinin inhibira lipolizu. Ovaj pronalazak se dakle, odnosi na Perkihinin, jedinjenje formule:

i njegove farmaceutski prihvatljive soli i derivate, kao što su estri, etri i očigledni hemijski ekvivalenti, uključujući sve stereoizomerne oblike i sve tautomerne oblike.

Perkihinin ima molekulsku fomulu Cul l»;0< (208 Da) i može se okarakterisati na osnovu jedne ili više fizičko hemijskih i spektralnih osobina prikazanih u daljem tekstu, kao što su !H NMR spektoskopski podaci i<L>,C NMR spektroskopski podaci, prikazanih u Tabeli 1 i 2.

Perkihinin se može opisati kao novi p-lakton sa aneliranim petočlanim prstenom koji sadrži hidroksimetilni deo i 2,3-izopentenil sporedni lanac na a-mestu u laktonu. Perkihinin ima neprijavljenu novu srukturu. Pretraživanje po literaturi hemijskih apstrakata je pokazalo daje Perkihinin novo jedinjenje. Nema jedinjenja koja pokazuju stmlctume karakteristike Perkihinina.

Perkihinin se dobija gajenjem kulture miroorganizama označenim kao br. ST 001837 (u đaljemtekstu označeno kao ST 001 837). Ove gljivice korišćene za proizvodnju Perkihinina su gajene na Percy Quinn, Mississippi State Park in Pike Countrv, SAD. Gljivice ST001837 pripadaju redu Basidiomvcetes vrsteSterum complicatumi prilo\ena je 1 1-og februara 2000 kod German Collection of Microorganisms and Cell CuHures (DSMZ- Deutshe Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), Đraunschvveig, Nemačka i dat joj je pristupni broj DSM No. 13303.

Ovaj pronalazak opisuje i postupke za dobijanje novog jedinjenjanazvanog Perkihinin od Basidiomicetnih vrsta ST 001387, njegovih mutanata i alternativa, pod aerobnim uslovima u hranljivom medijumu koji asdrži jedan ili više izvora ugljenika i jedan ili više izvora azota i po potrebi hranljive neorganske soli i/ili elemenata u tragovima, nakon čega sledi izolacija datog jedinjenja i prečišćavanje na način prilagođen jedinjenju i njegovim osobinama.

Poželjno je da hranljivi medij um sadrži izvore ugljenika, azota i hranljive neorganske soli Uzvor ugljenika su, na primer, škrob, glukoza, sukroza, dekstrin, fruktoza, molasa, glicerol, laktoza ili ga laktoza, a poželjna je glukoza. Izvori azota su, na primer, sojino brašno, brašno od kikirikija, ekstrakt kvasca, goveđi ekstrakt, pepton, ekstrakt slada, kukuruzno močilo, želatin ili kazamionska kiselina, a poželjan je ekstrakt slada i ekstrakt kvasca. Hranljive neorganske soli su, na primer, natrij um hidrogen fosfat, kalij um hi dro gen fosfat, amonijum hidrogen fosfat, natrij um hlorid, kalcijum hlorid, .kalcij um karbonat, kali j um nitrat, amonijum sulfat ili magnezijum sulfat, a poželjan je amonijum hidrogen fosfat.

Kultivacija ST 001837 može se odvijati na temperaturi između 20-35°C i pH između 3.0 i 8.0. Poželjni usllovi za kultivaciju ST 001837 su: 25°C (± 1°C) i pH između 3 i 5.

Kultivacija ST001837 se odvija u trajanju od 96-300 sati kad je optimalna količina lipaze inhibitora Perkihinina stvorena. Naročito je poželjno da se kultivacija femrntacijom odvija u trajanju od 216-264 sati uronjeno na primer u sudovima za mućkanje kao i laboratorijskim sudovima za fermentaciju. Progres fermantacije i fomiranja Perkihinina može se detektovati tečnom hromatografijom pod visokim pritiskom (HPLC) i merenjem bioaktivnosti kultivtsane tečnosti. (J kultivisanoj tecnosti Perkihinin je prisutan u filtratu kao i u micelijumu; a poželjno je u micelijumu.

Perkihinin se može izolovati poznatim tehnikama za odvajanje. Tako se može regenerisati iz filtrata ekstrakci jom sa rastvaračima koji se ne mešaju sa vodom, kao što je etil acetat, dihlormetan, hlorofonrt ili butanol na pH 5-8 ili hromatografijom zasnovanom na hidrofobnirn interakcijama, konšćenjem polimernih smola kao što je

«Diaion HP-20*» ili «MC1<*>gel CHP-20P» (Mitsubishi Chemical ndustries Limited, Japan), «Amberlite XAD">> (Rohm and Hass Industries U.S.A), aktivni ugalj ili ionoizmenjivačkom hromatografijom na pH 5-8. Poželjan metod je hromatografija na MCI* gelu CH.P-20P. Aktivni materijal se takođe može regenerisati iz miceliuma ekstrakcijom sa rastvaračem koji je meša sa vodom kao što je metanol, aceton, acetonitnl, n-propanol ili izo-propanol ili sa rastvaračima koji se ne mešaju sa vodom kao stoje etil acetat, dihlorometan, hloroform ili butanol na pH 5-8, a poželjna je ekstrakcija metanolom. Koncentrovanje i liofilizacija ekstrakta daje attivnu sirovinu.

Inhibitor Perkihinin se može regenerisati iz sirovog materijala na sledeći način: Frakcionisanjem konšćenjem jedne od sledećih tehnika: normano-fazna hromatografija (korišćenjem aluminijumoksida ili silika gela kao stacionarnu fazu i eluente kao što je petrol etar, etil acetat, metilen hlorid, aceton, hlorofom, metanol ili njihova kombinacija i dodatak amin kao što je NetO, reverzno-fazna hromatografija (upotreba reverzno faznog silika gela kao što je dimetiloktadecilsilil-silika gel, takođe poznat kao RP-18 ili dimetiloktilsilil silika gel poznat pod imenom RP-8 kao stacionarna faza i eluenti poput vode, pufera, fosfata, acetata citrata (pH 2-8) i organskih rastvarača poput metanola, acetonitrila, acetona, tetrahidrofurana ili njihova kombinacija), gel permeabima hromatografija korišćenjem smola poput ® Sephadex LH-20 (Phannacia Chemical Industries, Svveden), TSKgel ®Toyopearl HW (TosoHaas, Tosoh Corporation, Japan) u rastvaračima poput metanola, hloroforma, acetona, etil .acetata ili njihova kombinacija ili ®Sephadex G-10 i G-25 u vodi, ili protiv-strujna hromatograija koaiišćenjem bifasnog eluentnog sistema napravljenom od dva ili više rastvarača kao što je voda, metanol, etanol, izo-propanol, n-propanol, tetrahidrofuan, aceton, acetonitril, metilen hlorid, hlroform, etil acetat, petol-etar, bezen i toluen. Ove tehnike se mogu više puta upotrebiti ili se može koristiti kombinacija različitih tenika. Poželjan postupak je reversno fazna hromatografija na silika gelu (R.P-18).

Jedinjenje Perkihinin može se konvertovati u farmaceutski prihvatljivu so i derivate, poput estara i etara i drugih hemijskih ekvivalenata koji su deo ovog pronalaska. Soli i derivati mogu se dobiti standardnim tehnikama poznatim prosečnom stručnjaku. Soli kao natrij um ili kalij um, na primer, mogu se dobiti tretiranjem Perkihinina pogodnim bazama natrijuma ili kalijuma.

Estri i etri mogu se dobiti postupcima opisanim u literaturi, na primer, u Advanced Organic Svnthesis 4<th>edition, J, March, John Wiley & Sons., 1992. Estri se mogu dobiti reakcijom sa karboksilnim kiselinama ili npr. amino kiselinama, npr leu.cin.om, glicinom ili alaninom. Sa amino grupa u amino kiselinama može se ukloniti zaštita posle esterifikacije ili se mogu zaštiti npr. formil grupom. Esterifikacija se može obaviti u prisustvu dehidratacionih agenasanpr. dicikloheksilkarbodiimid (DCC) kao stoje opisano u literaturi (Smith et al, J.Am. Chem. Soc. 1958, 80, 6204; Aiiietaet al Synth. Commun 1983, 13,471).

Dvostruke veze se mogu redukovati postupcima opisanim u literaturi, na primer, u Advanced Organic Svnthesis, 4th Edition, J March, John Vvilev & Sons., 1992, p.771 -775 ili u R. Bloch et al., J Org Chem. 1987,52,4603-4605. mogu se hidrohalogenirati po postupcima opisanim od strane H.0 House u "Modem Synthetic Reactions", W.A. Benjamin, Inc., New York (1972), pp 446-452 Hidroksilovani derivati se mosu dobiti reakcijom trostrukih veza sa reagensima poput Os04 kao što je opisano u literaturi npr. u Chem, Rev. 1980, 80, 187.

Derivati se takođe mogu dobiti konverzijom dvostrukih veza u epokside oksidacijom npr. sa MCPBA kao Stoje opisano u Advanced Organic Synthsis, 4<Ul>Edition, J. March, John VVilev & Sons., 1992, p.826 ili u A.J. Pearsons et al., J.Org.Chem. 1986, 51, 2505-2511. Derivati se mogu dobiti ozonolizom dvostruke veze izopentenilnih bočnih lanaca. U zavisnosi od procedure može se dobiti aldehid (npr. sa Zn/HOAc ili dimetilsulfid/metanol), do karboksilne kiseline (npr. sa H202) ili do alkohola (npr. sa IJA1H4 ili NaBH4) kao fukcionalnim gru<p>ama [w. Cumithers, " Some Modem Methods of Organic Svnthesis'<*>, Cambridge University Press (1971), Chpt.6< White, king and O'Brien, Tetrahedron Lett. 3591 (1971); Bailev. P.S., " Ozonization in Organic Chemistrv", Vol i and Vol.2, New York, Academic Press (1978, 1982)]. Reakcijom ovago dobijenih aldehida sa fosforanima kao što je poznato u literaturi kao VVittig-ova reakcija, može se uvesti bočni lanac sa 4 do 10 ugljemkovih atoma. Novouvedeni bočni lanci mogu nositi npr. ORI (Rl = H ili alkil sa 1 do 4 ugljenikaova atoma), NR2R3 (R2R3 = h ili alkil ostatak sa 1 do 4 ugljenikova atoma), F, Cl, Br ili I kao funkcionalne grupe kao što je i opisano u: H.J. Bestmann et al., ''Selected topics of th e Witting Reaction in the Svnthesis of Natural Products", Topics in Current Chemistrv 109, 85

(1983).

Perkihinin inhibira lipazu sa IC50od 2pM (NBD-analiza, pogledaj Primer 6).

Pronalazak se takođe odnosi na upotrebu Perkihinina u obliku racemata, racemskih smeša i čistih enantiomera i njihove dijastereoizomere i njihove smeše.

Farmaceutski prihvatljive soli su naročito pogodne za upotrebu u medicini zbog njihove veće rastvorljivosti u vodi u poređenju sa jedinjenjima na kojima su bazirana. Ove soli moraju imati farmaceutski prihvatljiv anion ili kation. Pogodne farmaceutski prihvatljive kiseline Perkihinina su soli neorganskih kiselina kao što je hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, fosforna, metafosforna, azotna i sumporna kiselina, i organske kiseline poput sirćetne kiseline, benzensulfonske kiseline, bezojeve, limunske, etansulfonske, fumarne, glukonska, glikolna, izetionska , mlečna, laktobionska, maleinskajabučna, metansulfonska, ćihbama, p-toluensulfonska, tartama i trifluorsirćetna kiselina Naročito je popularna upotreba hlorida u medicinske svrhe. Pogodne farmaceutski prihvatljive bazne soli su amonijum soli, soli alkalnih metala (kao što je natrij umova ili kalij umova so) i soli zemalja alkalnih metala (kao što su magnezijumove i kalcij umove soli).

Soli sa farmaceutski ne prihvatljivim anionom su takođe obuhvaćene ovim pronalaskom i to kao korisni intermedijeri za dobijanje ili prečišćavaje farmaceutski prihvatljivih soli i/ili za upotrebu u ne-terapeutske svrhe, na primer za primene in vitro.

Ovde korišćen izraz " fiziološki funkcionalan deri vat" se odnosi na fiziološki podnošljiv derivat jedinjenjenja ovog pronalaska, na primer, estar koji može po davanju sisanma, na primer, čoveku, da formira (direktno ili indirektno) takvo jedinjenje ili njegov aktivni metabolit.

Sledeći aspekt ovog pronalaska se ogleda u u upotrebi prolekova Perkihinina. Ovi prolekovi mogu biti metabolisaniin vivou Perkihinin. Ovi polekovi mogu sami biti aktivni ili ne

Perkihinin se takođe može javiti u različitim polimorfnim oblicima, na primer, kao amorfni i kristalni amorfni oblik, Svi polimorfni oblici Perkihinina su obuhvaćeni ovim pronalaskom i daljim aspektima ovog pronalaska.

Sve reference na Perkihinin se odnose na Perkihinin kao što je prethodno opisan i na njegove soli, solvate i fiziološki funkcionalne derivate.

Količina Perkihinina koja je potrebna da bi se postigli željeni biološki efekti zavisi od brojnih faktora, na primer, odabrana specifična jedinjenja, svrha konšćenja, način

davanja i kliničko stanje pacijenta. Dnevna doza se generalno kreće u opsegu od 0.3mg do 1 OOmg (obično od 3 mg do 50mg) na dan i po kilogramu telesne težine, na primer 3-1 Omg/kg/đan. Intravenozna doza može biti, na primer, u opsegu od 0.3mg do 1 .Omg/kg, koja se može dati infuzijom od lOng do lOOng po kilogramu u minuti. Infuzioni rastvor pogodni za ovu svrhu mogu na primer sadržati odO. 1 ng do 1 Omg, obično od 1 ng do 1 Omg po mililitru. Jedinična doza može sadžati, na primer, od lmg do lOg aktivne komonente.

Tako, atnpule za injekciju mogu sadržati, na primer, od l mg do 1 OOmg, a formulacije za jediničnu dozu koja se oralno daje, kao na primer, tablete ili kapsule, može sadržati od 1.0 do 1 OOOmg. U slučaju farmaceutski prihvatljive soli, prethodno pomenuti podaci su zasnovani na težini iona aminotiazola izvedenog iz soli. Perkihinin se može koristiti za profilaksu ili u terapiji prethodno pomenutih oblika jedinjenja, ali je poželjno da su u obliku farmaceutskog prepaata sa kompatibilnim nosačem. Nosač mora biti kompatibilan u smislu kompatibilnosti sa drugim komponentama preparata i da ne ugrožava zdravlje pacijenta. Nosač može bti u čvsrtom stanju ili tečnom ili oba i poželjno je daje formulisan sa jedinejnjem kao jediničnom odzom, na primer, kao tableta, koja može sadržati od 0.05% so 95% (težinskih) aktivne komponente. Farmaceutska komponenta se može dobiti jednim od poznatih farmaceutskih postupaka koja se u suštini sastoji od mešanja komponenata sa farmakološki prihvatljivim nosačem i/ili puniocem.

Farmaceutski preparati su pogodni za oralnu, rektalnu, topikalnu, peroralnu (npr. sublingualnu) i parenteralnu (npr.subkutalnu, intramuskulamu, intradermalnu ili

intravenoznu) primenu, mada najpogodniji način davanja zavisi od prirode i ozbiljnosti svakog individulanog stanja koji se tretira i od prirode Perkihinina koji se tom prilikom koristi. Preparati sa oblogama i preparati sa oblogama za postepeno ispuštenje takođe su opisani ovim i pronalaskom. Poebno su popularni preparati otporni na kiseline i želudačnu tečnost. Pogodni površinski sloj za presvlačenje koji je otporan na želudačnu tečnost je: acetat ftalatna celuloza, acetat ftalatni polivinil, hidroksipropilmetilceluolza flalat i anionski polimeri ili metakrilna kislina metil metakrilat.

Fannacenutska jedinjenja pogodna za oralno davanje mogu biti u obliku odvojenih jedinjenja , kao što su na primer, kapsule, pastile ili tablete, od kojih svaka sadrži đefinisanu količinu Perkihinina; u obliku praha ili granula; kao rastvor ili suspenzija u ne vodeno) ili ne vodenoj tečnosti; ili kao ul jana ili vodena emulzija. Kao što je ranije rečeno, ovi se preparati mogu dobiti pogodnim farmaceutskim postupkom koji obuhvata fazu u kojoj su aktivna komponenta i nosač (koji može imati jedan ili više dodatnih komponenata) dovedene u kontakt. Generalno, preparati se dobijaju uniformnim i homogenim mešanjem aktivne komponente satečnošću i/ili fino dispergovanim čvrstim nosačem, nakon čega se proizvod po potrebi modulira. Tako, na primer, tableta se može po potrebi dobiti kompresijom praha ili granul a jedinjenja sa jednim ili više aditiva u odgovarajući oblik. Kompresovane tablete mogu se dobiti tabletiranjem jedinjenja u tečljivu formu, kao sto je na primer, poput praha ili granula, i po potrebi umešati vezujuće sredstvo, sredstvo za podmazivanje, inertni razblaživaČ i/ili jedan (ili više) površinski aktivnilvđisperzivnih agenasa u pogodnoj mašini. Oblikovane tablete mogu se dobiti presovanjem jedinjenja u obliku praha koje je navlažen inertnim tečnim rastvaračem, u odgovarajućoj mašini.

Farmaceutski preparati pogodni za peroralno (sublinguinalno) davanje obuhvata tablete za sisanje koje sadže Perkihinin uz dodatak aditiva za poboljšanje ukusa, obično sukroze i gumi arabike ili tragakant i pastile koje sadrže jedinjen je u inertnom želatinu i glicerolu ili sukrozi i gumi arabici.

Pogodan farmaceutski preparat za patenteralno davanje pođrazumeva sterilni vodeni preparat Perkihinina, koji je po potrerbi izotoničan sa krvlju pacijenta. Poželjno je ove

preparate davati intravenozno, mada se može davati i subkutalnim, intramuskularnim ili intraderrnalnim injekcijama. Ovi preparati mogu se dobiti mešanjem jedinjenja sa vodom i pravljenjem dobijenog rastvora sterilnim i izotomčnim sa krvlju. Preparat koji se može dati injekcijom, prema ovom pronalasku, generalno sadrži od 0.1 so 5% (težinskih) aktivnog jedinjenja.

Pogodni farmaceutski preparati za rektal.no davanje su najčešće u obliku supositorija sa jediničnom dozom. Ovi se mogu dobiti mešanjem Perkihinina sajednim ili više konvencionalnih čvrstih nosača, na primer, kakaovo ulje i oblikovanjem dobjiene smeše.

Farmaceutski preparati pogodni za topikalno nanošenje na kožu su najčešće u obliku masti za mazanje, kreme, losiona, paste, spreja, aerosola ili ulja. Nosači koji se mogu koristiti su vaselin, lanolin, polietilen glikoli, alkoholi i kombinacija dveju od navedenih supstanci. Aktivna komponenta je generalno prisutna u koncentraciji od 0.1 do 15%

(težinskih) u preparatu, na primer od 0.5 do 2%,

Transderamlno davanje je takođe moguće. Farmaceutski preparati pogodni za transderamlnu primenu mogu biti u obliku flastera koji su pogodni za duži bliski kontakt sa epidermisom pacijenta. Ovakvi flasteri sadrže aktivnu komponentu u vodenom rastvoru koji je po potrebi puferisan, rastvoren i/ili dispergovan u adhezivnom ili dispergovanom polimeru. Koncentracija odgovarajuće aktivna komponente je oko 1% do 3 5%, a poželjno je oko 3% do 15%. Kao posebna opcija, aktivna komponenta se može osloboditi elektrotransportom ili jonoforezom kao što je opisano u Pharmaceutical Research, 2 (6): 318 (1986).

Slede primeri koji opisuju ovaj pronalazak, ali koji ne limitiraju obim istog:

PRIMER 1

Održavanje kulture ST 001837

a) Sastav medi j uma za održavanje

Nakon potpunog rastvaram'a komponenata zagrevanjem, dobijeni rastvor je sterilisan

20minuta na ] 21 °C i raspoređen u Petri šolje (15ml/šolji). Po očvršćavanju posude su pelcovane polaznom bakterijskom kulturom i inkubirane na 25°C dok nije uočen dobar rastv bakterija. Dobro razvijene bakterijske kulture su korišćene u sledećim fazama konzervacije.

b) konzervacija na -135°C:

1 ,5ml sterilnog 10% rastvora DMSO sipano je u 2ml u kriogene ampule. Iz agame

posude za održavanje, dodato je parče od 2cm" u DMSO rastvor, zatim stupnjevito ohlađen (1°C u minutu) i čuvan na -135°C.

c) konzervacija u tečnom azotu:

1.5ml sterilnog 50% rastvoraglicerola sipanje u kriogene ampule od 2ml.. Iz agarne

posude za održavanje, uzeto je parče od 2cm<2>i dodato u rastvor glicerola, stupnjevito ohlađen (I °C u min) do -80°C i ostavljen u tečnom azotu.

PRIMER 2

Fermantacija kulture no. ST 001 837 u balonu za mućkanje

Pripremanje kulture za klice u balonu za mućkanje

Medijum za klice (pogledati u daljem testu) su raspoređene u porcijama od lOOml u balone za mućkanje od 300ml i obrađen u autoklavu 20minutana 121°C. Baloni su ohlađeni do sobne temperature i kontaminirani komadom agara od 2cm<2>koji je gajen 6 dana ili je dodat sadržaj jedne konzerirane ampule (135°C ili tečni azot). Zatim je inkubirano od 96h na rotirajućoj mućkalici na 140rpm na 25°C.

Uslovi proizvodnje

Medijum za proizvodnju (pogledati u daljem tekstu) je raspoređen u porcijama od lOOml u balone za mućkanje od 300ml i obrađen u autoklavu 20 minuta na 121°C. Baloni su ohlađeni do sobne temperature i kontminiram sa 2ml kulture za klice koja je stara 4 dana. Inkubacija je trajala 240 sati na rotirajućoj mućkalici na 140rpm i 25°C Proizvodnja inhibitora Perkihinina je određena testiranjem bioaktivnosti na suprot inhibiciji lipaze kao stoje opisano (Primer 6) i HPLC analizom.

PRIMER 3

Kultivacija kulture no. ST 001837 u izazivačima fermentacije (12L)

Dobijanje kulture za klice u balonu za mućkanje

Medijum za klice je raspoređen u porcijama od 500ml u erlenmajere od 2L i obrađen u autoklavu 30 minuta na 121°C. Kultura klica je gajenau erlanmajerimakao što je opisano u Primeru 2.

Fermantacija na veliko

Sastav medij uma za proizvodnju:

U posudu za fermentaciju od 12L dodato je 8L međijuma za proizvodnju i lml(/10L izazivača fermentacije) ®Desmophen kao sredstvo protiv penušanja i smeša sterilisana in situ 45minuta na 121°C, ohlađena do 25°C (±1 °C) i zasejano sa 0.5L (6.25% 12L izazivača fermentacije) prethodno pomenute kulture za klice.

Proizvodnja inhibitora lipaze Perkihinina je određena testiranjem inhibicije lipaze kao što je opisano u Primeru 6. Krajnje pH tečnosti kulturnog medija iznosi 3-4. ova tečnost je prikupljena i centrifugirana i jedinjenje Perkihinin je izolovano i prečišćno iz nitrata i micelijuma po postupku opisanom u Primeru 4.

PRIMER 4

Izolacija i prečišćavanje Perkihinina

Tečnost kulturnog medijuma (3 litra) je prikupljena i centrifugirana kako bi se odvojio micelijum (20g) od filtrata. M icelijum je ekstrahovan metanolom (31itra) i aktivni ekstrakt je sakupljen i koncentrovan pod sniženim pritiskom do zapremine od 50ml. Sirov materijal je prečišćen preparatrvnom HPLC pod sledećim uslovima:

1. ) Kolona: MCI<*>Gel CHP -20P (BioCart, 50 x 1 OOmm; Kronlab)

2. ) Eluent: A) H20 B) MeOH

Gradijent:

Protok: 45ml/min

Detekcija: 220 i 254nm

Aktivna frakcija je eluirana posle 17min. Prikupljene frakcije su koncentrovane pod sniženim pritiskom i osušene na temperaturi ispod nule.

Završno prečišćavanje je izvršeno preparativnom HPLC pod sledećim uslovima

I. ) Kolona Purospher Star RP-18e (5u, 125 x 25mm), Merck.

Eluent: A) 0.1TFA B) CH3CN

Gradijent:

Brzina protoka: 38ml/min

Detekcija: 210 i 300nm

Frakcije koje sadrže Perkihinin eluirane su posle 21 min. Prikupljene frakcije su koncentrovane pod sniženim pritiskom i osuešene na temperaturi ispod nule.

2.) Kolona Purospher Star RP-18e (5u, 125 x 25mm), Merck

Eluent: A) 0.1TFA B) CPhCN

Gradijent:

Brzina protoka: 5ml/min

Detekcija: 2'10tvm

Frakcije koje sadrže Perkihinin eluirane su posle 37 min. Prikupljene frakcije su koncentrovane pod sniženim pritiskom i osuešene na temperaturi ispod nule. Ukupan prinos od 20g micelijumaje 2mg jedinjenja Perkihinina.

Fizičko hemijske i spktralne. osobine Perkihinina su date u Tablici 1 i 2.

Primer 5:

Dobijanje i prečišćavanje Lipaze

Adipociti od mužjaka pacova (VVistar 220-250g) su izolovani tretiranjem kolagenazom kao sto je opisano u literaturi. Ćelije masti od 10 pacova su isprane tri puta lota dotacijom sa 50rnl pufera za homogenizaciju (25ml Tris/HCl, pH 7.4, 0.25M sukroza, lmM EDTA, 1 mM DTT, 10u.g/ml leupeptina, lOuL/ml Antipain-a, 20ug/ml Pepstatin-a). Nakon toga dodato je lOml pufera za homogenizaciju. Ćelije masti su homogenizovane uređaju za homogenizaciju od stakla presvučenim teflonom (Braun-Melsungen) na 1500rpm i 15°C H omogeni proizvod je centrifugiran (Sotvall SM 24 epruvete, 500rpm, 10 minuta, 4°C). Slojevi između gornjeg sloja masti i granula su razdvojeni i ponovo centrifugirani. Razdvajanje slojeva je ponovljeno i centrifugirano je treći putna 2000rpm, 45minuta na 4°C. Dobijeni matični sloj je dodat u l g Heparin Sefaroze (Pharmacia-Biotech, CL-6B, ispran 5 puta sa25mM Tris/HCl, pH 7.4, 150mM NaCl). Posie inkubacije od 60 min na 40°C (mućkano u intervalim od 15 minuta), rastvor je centri fugi ran (Sorvall SM24 epmvete, 300rpm, 1 Omin, 4°C). Gornji sloj je podešen do pH 5.2 dodatkom sirćetne kiseline i inkubirano 30min na 4°C. Preeipitati su izolovani centrifugiranjem (Sovall SS34 epruveta, 12000rpm, lOmin, 4°C) i suspendovani u 2.5ml 20mM Tris/HCl, pH 7.0, lmM EDTA, 65mM,NaCI, 13% sukroza, lmM DTTm 1 Opg/ml Leupeptin/PepstatinAntipain. Suspenzija je dializirana špreko noći na 4°C nasuprot 25mM Tris/HClm pH 7 4, 50% glicerola, lmM DTT, lOpg, ml Leupeptm, Pepstatin. Antipain i zatim absorbovana na hidroksiapatit-noj koloni (0.1 g/lml suspenzije ekvilibrisano sa lOmM kalijum fosfata, pH 7.0,30% glicerola, lmM DTT). Kolonaje isprana sa puferom za ekvilibraciju . četiri puta (protok: 20-30 ml/h). Lipaza je eluirana sa 0.5 M Kalijum forfatnim puferom Proizvod je dijaliziran i koncentrovan (5-10 puta) ultrafiltracijom (Amicon Diaflo PM 10) na 4°C. Polučista lipaza može se čuvati 4-6 nedelja na-70°C.

Primer 6:

Određivanje bioaktrvnosti

Fluorescentni analog lipida, mono-NBD-acilglicerol (NAG) je korišćen kao supstrat, koji menja boju po integraciji u vesikulama fosfolipida od 48 lnm do 550nm. Testirano jedinjenje je rastvoreno u DMSO i razblažen puferom za analizu (25mM Tris/HCl, pH 7.4, 1 50mM NaCl) 1:5. U 2.5ul ovog rastvora dodato je I 80pl sonikovanog rastvora supstrate (20pg/ml fosfatidilholina, I Oug/ml fosfatidilinozitola, 50|xg/ml NAG u puferu za analizu). Posle inkubacije na 30°C u trajanju od 1 5 min, dodato je 20(.il rastvora enzima prethodno ravblaženog 1:2 u puferu za analizu i odmah je izmerena apsorpcija na 485nm. Posle 60minutnog inkubiranjana 30°C opet je izmerena apsoipcija. Porasr u absorbanci na 480nm je mera enzimske aktivnosti. Vrednost za IC«je određena iz 10 koncentracija sveže rastvorenog test jedinjenja. Podaci su obrađeni softverom GRAPHIT, Elsvier-Biosof!.

Perkihinin pokazuje inhibiciju lipaze sa IC«) = 2um.

Claims (7)

1. Perkihinin, jedinjenje formule: i njegove farmaceutski prihvatljive soli.

2. Perkihinin, jedinjenje molekulske formule CuHićOj, dobijen gajenjem kulture gljivica ST 001837 (DSM 13303) pod aerobnim uslovima u hranljivom međijumu koji sadrži izvor ugljenika i azota, nakon čega sledi izolacija i prečišćavanje i njegove farmaceutski prihvatljive soli.

3. Postupak dobijanja Perkihinina ili njegovih soli, prema Zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što obuhvata kultivaciju basidomicetne vrste ST001837 (DSM 13303) pod areobnim uslovima u hranljivom mediju koji sadrži izvor ugljenika i azota, nakon čega sledi izolacija i prečišćavanje.

4. Bazidiomicetna vrsta ST001837 (DSM 13303).

5. Upotreba Perkihinina ili njegove farmaceutski prihvatljive soli prema Zahtevu 1 ili 2 kao farmaceutskog preparata.

6. Farmaceutski preparata, nazančen time, što sadrži efektivnu količinu Perkihinina ili farmaceutski prihvatljive soli iz Zahteva 1 ili 2 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

7. Upotreba Perkihinina ili njegove farmaceutski prihvatljive soli prema Zahtevu 1 ili 2, kao inhibitora lipaze.