RS50219B - Sistem analize - Google Patents

Abstract

Opitna kaseta (52, 53), naznačena time, što sadrži najmanje dve komore (57-62) i jednu pipetu (55) koja se može postavljati u najmanje dve komore, pri čemu ta pipeta ima zadnji kraj i prednji kraj (56), pri čemu je prednji kraj zatvoren jednom membranom koja propušta tečnost Prijava sadrži još 26 patentnih zahteva.

Description

Ovaj se pronalazak odnosi na poboljšanja sistema za vršenje analiza, posebno na sisteme za dijagnostičke analize koje se mogu vršiti na mestu gde se vrši lečenje, na primer u ordinaciji lekara ili neposredno pored ležaja pacijenta.

Mnoge dijagnostičke analize danas stoje na raspolaganju, na primer za utvrđivanje trudnoće, šećera u krvi, homocisteina, transferina bez ugljovodonika, koagulacije krvi, nivoa holesterola u krvi, itd. Neke od tih analiza može da vrši pacijent, a neke pacijentov lekar, ali mnoge od njih, naročito one koje daju kvantitativni rezultat, moraju se danas vršiti u nekoj laboratoriji udaljenoj i od pacijenta i od lekara, tako da nastaju značajna zadržavanja između uzimanja uzoraka i analiza pa obično pacijent mora još jednom ići kod lekara da sazna rezultate analize. To ne samo da je neprijatno za pacijenta već i povećava troškove pacijenta ili organizacije koja plaća za održavanje pacijenta.

Zbog toga postoji stalna potreba za sisteme za vršenje analiza, posebno za one koji obezbeđuju kvantitativne rezultate, a koje može koristiti lekar ili njegove kolege na mestu lečenja pacijenta.

Kvantitativni analitički sistemi često zahtevaju veoma precizne uređaje za merenje zapremine, nekoliko reagensa i detektore za očitavanje rezultata specifičnih za datu analizu, a nepraktično je da se izrađuju namenski analitički aparati za široku lepezu različitih analitičkih sistema na mestu lečenja, i zbog potrebnog prostora, i zbog troškova.

Zbog toga su prijavioci razvili analitički aparat koji se, kod preporučljivih izvođenja, može koristiti na mestu lečenja, koji može vršiti izvestan broj različitih analiza, koji može dati kvantitativne rezultate analize, i koji je relativno jeftin.

Prema jednom svom vidu, pronalazak obezbeđuje jedan analitički aparat, poželjno jedan dijagnostički analitički aparat, koji obuhvata: i) opitnu kasetu koja ima bar dve komore i jednu pipetu koja se može postaviti u bar dve od pomenutih komora, pri čemu ta pipeta ima bliži kraj i dalji kraj, s tim što je pomenuti dalji kraj zatvoren jednom membranom propustljivom za tečnost,

ii) držač za prihvatanje pomenute kasete,

iii) pogonsku napravu koja može postavljati pipetu u izabrane komore pomenute kasete,

iv) uređaj za dovod gasa pod pritiskom koji se može priključiti na pomenutu pipetu da bi se izazvao protok tečnosti kroz pomenutu membranu,

v) detektor zračenja koji može otkriti zračenje iz komore u pomenutoj kaseti ili iz pomenute pipete, i, eventualno, ali poželjno,

vi) jedan izvor elektromagnetskog zračenja.

Prema jednom drugom svom vidu, pronalazak obezbeđuje jednu opitnu kasetu koja ima bar dve komore i jednu pipetu koja se može postaviti u bar dve od pomenutih komora, pri čemu ta pipeta ima bliži kraj i dalji kraj, s tim što je pomenuti dalji kraj zatvoren jednom membranom propustljivom za tečnost.

Pipeta je jedna cev sa otvorom na jednom kraju (daljem, odnosno prednjem kraju) u koju može da ulazi neka tečnost kod delovanja sniženim pritiskom na drugom kraju (bližem, odnosno zadnjem kraju). Kod aparata pomenutog u prethodim odeljcima, prednji kraj pipete ima na vrhu (zatvoren je) jednu membranu koja propušta tečnost. Zadnji kraj ove pipete može biti otvoren ili zatvoren, a ako je zatvoren jasno je da mora postojati neki način da se omogući primena pritiska potrebnog da pipeta funcioniše kao pipeta. Kod jednog kasnije opisanog izvođenja, zadnji kraj pipete sa membranom na vrhu hermetički je zatvoren jednom probojnom samozaptivnom membranom (na primer gumenim zatvaračem), pa se može delovati pritiskom kroz jednu šuplju iglu utaknutu u membranu. Alternativno, zadnji kraj može biti zatvoren odvojivom kapicom ili čepom koji se uklanja da se omogući delovanje pritiskom, ili nekom lomljivom zaptivkom koja se lomi da se omogući delovanje pritiskom.

Prema jednom svom drugom vidu, pronalzak obezbeđuje jedan analitički uređaj koji obuhvata: a) držač kasete za prihvatanje jedne opitne kasete prema pronalasku, b) pogonsku napravu koja može postavljati pipetu u pomenutu kasetu u izabrane komore pomenute kasete, c) uređaj za delovanje gasom pod pritiskom koji se može priključiti na pipetu pomenute kasete tako da izaziva protok tečnosti u nju, d) detektor zračenja koji može otkrtiti zračenje iz komore u pomenutoj kaseti ili iz njene pipete, i, eventualno, ali poželjno, e) jedan izvor elektromagnetskog zračenja.

Na taj način, kombinovanje naprave i kasete prema pronalasku obezbe-đuje analitički aparat prema pronalasku.

Opitna kaseta poželjno se isporučuje korisniku prethodno napunjena reagensima potrebnim za određenu analizu ili analize kote treba izvršiti korišćenjem te kasete. Kada su potrebna dva ili više reagensa a koji se ne mogu mešati pre nego što se vrši analiza, oni moraju biti prethodno uneti u različite komore u kaseti. Opšte uzev, ti će reagensi biti uneti u komore u merenim količinama. Ovi reagensi mogu biti tečnosti, praškovi, zrna, premazi na zidovima komora, premazi na zrncima, ili materijali impregnisani na membrani ili imobilisani na membrani pipete. Kada su reagensi tečni ili kada su podložni razlaganju u dodiru sa vazđuhom ili vlagom, kaseta se može hermetički zatvoriti da se spreči gubitak tečnosti ili pristup vazduha ili vlage osetljivom reagensu. Ovo se hermetičko zaptivanje Iako postiže obrazovanjem kasete sa telom u kojoj se nalaze komore i poklopcem za pokrivanje komora, i, ako je potrebno, postavljanjem neke zaptivke koja ne propušta fluid, na primer nekog O-prstena, između otvora u telu i poklopca komora, i, ako je poželjno, postavljanjem neke uklonljive zaptivke, npr. neke lepljive zaptivne trake, spolja oko spoja između poklopca i tela. Kod jednog poželjnijeg izvođenja, jedna ili više komora mogu pre upotrebe biti hermetično zatvorene zaptivnim folijama. Kod tog je izvođenja poklopac komora poželjno izveden sa sekačima zaptivnih folija kojima se prosecaju zaptivne folije koje pokrivaju komore da bi se omogućilo umetanje pipete u te komore. Alternativno, poklopac može imati neki elastični materijal na mestima koja odgovaraju gornjim otvorima komora (ili samo kod komora ispunjenih tečnošću) tako da, kada se poklopac i telo pritisnu jedno uz drugo, na gornjim krajevima komora obrazuju se zaptivke koje ne propuštaju tečnost. Takav materijal može biti neki sloj nanet na poklopac, ili diskovi ili zaptivke pričvršćene (npr. zavarene ili zalepljene) na poklopac. Kod jednog izvođenja je donja površina izvedena sa elastičnim ispupčenjima koja mogu da funkcionišu kao zapušači za komore. Na taj način, zapušači služe da drže poklopac i osnovu zajedno pre no što se kaseta koristi u nekoj analizi, a posle izvođenja analize poklopac i telo se mogu hermetički zatvoriti radi odlaganja u otpad jednostavnim pritiskivanjem kako bi zapušači ponovo zatvorili komore. To je posebno pogodno u slučaju da komore po obavljenoj analizi sadrže toksične ili potencijalno infektivne materijale. Ti se poklopci mogu, ako se želi, ukloniti pre upotrebe, ali kod jednog pogodnog izvođenja poklopac služi da drži pipetu i, eventualno, da obezbedi priključak za dovod gasa pod pritiskom. Kod takvog jednog izvođenja pogonska naprava može služiti za pomeranje tela u odnosu na poklopac tako da postavlja pipetu u željene komore u različitim stepenima analize.

Opšte uzev, a posebno kada je poklopac kasete izveden sa elastičnim zapušačima za komore u telu kasete, aparat i uređaj prema pronalasku obuhvataju sredstvo za razdvajanje poklopca od tela tako da se kaseta može postaviti u uređaj hermetički zatvorena. Kod jednog izvođenja to sredstvo obuhvata jedan klin koji se pomera pored napunjene kasete i zahvata ispuste, npr. prirubnice, na poklopcu i na bazi da bi ih razdvojio. Poželjno je da se ovo sredstvo za razdvajanje automatski aktivira posle postavljanja kasete, na primer, kao reakcija na zatvaranje poklopca na komori koja sadrži napunjenu kasetu ili po prenošenju kasete u komoru, na primer korišćenjem jednog transportera koji može isto tako da ukloni kasetu iz komore posle dovršene analize.

Za različite analize, npr. za različite analite, mogu se obezbediti različite opitne kasete, ali kasete mogu biti projektovane za vršenje dveju ili više različitih analiza. U ovom drugom slučaju, često će biti poželjno da kaseta obuhvata dve ili više pipeta sa vrhovima pokrivenim membranama, tj. tako da se po jedna posebna pipeta može koristiti za svaku od analiza.

Komore u kaseti mogu se obezbediti u bilo kojoj željenoj šemi, npr. u dvodimenzionalnom rasporedu (npr. kao kod konvencionalnih ploča sa više čašica), u linearnom rasporedu ili u kružnom rasporedu. Korišćenje kružnog a posebno linearnog rasporeda posebno je pogodno pošto je mehanizam potreban za pomeranje kasete između unapred određenih položaja pojednostavljen, tj. pogonsko sredstvo u tom slučaju može pomerati kasetu po jednoj linearnoj putanji ili je rotirati.

Primena linearnog rasporeda komora posebno je pogodna, naročito raspored koji obuhvata, prema jednom redosledu: komoru koja sadrži materijal (u kojoj je, eventualno, pre korišćenja smeštena jedna pipeta sa kapilarnim vrhom uklonljivo pričvršćena na poklopcu kasete ili koja je prilagođena da tokom upotrebe prihvati jednu pipetu sa kapilarnim vrhom koja se može postaviti na poklopac kasete), komoru u kojoj je pre upotrebe smeštena pipeta sa membranom na vrhu, ili još jedna pipeta sa kapilarnim vrhom postavljena na poklopcu kasete, i jedna ili jedan niz od dve ili više (npr. do šest) komora za vršenje analiza i za očitavanje rezultata analize - te komore mogu sadržati reagense i pre upotrebe te komore koje sadrže reagense mogu biti hermetički zatvorene nekom folijom a jedna od tih komora može biti sa otvorenim krajem ili otvorenom stranom radi olakšavanja očitavanja rezultata. Kod takve jedne konstrukcije mogu sc poklopac i telo poželjno razdvojiti pre no što počne analiza, a ponovo sastaviti samo kada je analiza dovršena. Očitavanje rezultata kod ovog izvođenja vrši se dok su poklopac i telo međusobno razdvojeni. Kod ove konstrukcije su poklopac i telo najbolje međusobno zabravljeni, npr. nekom uskočnom zaporkom. Komora koja sadrži materijal može, na primer, sadržati suvi reagens za mešanje tokom izvođenja analize, neki filter za izdvajanje uzorka (npr. radi uklanjanja eritrocita iz uzorka krvi), ili još jednu pipetu koja se može spariti sa pipetom iigrađenom na poklopac (npr. pipeta sa kapilarnim vrhom).

Mada kaseta mora imati bar dve komore, jedan ili više položaja u nizu komora jedne kasete sa više komora mogu biti sa otvorenim krajem ili sa otvorenom stranom tako da se olakšava otkrivanje zračenja iz pipete kada se ona nalazi na takvom položaju. Ako treba da se otkrije zračenje iz pipete u nekoj komori, tada bar deo zida komore mora biti propustljiv za vrstu zračenja koje treba detektovati.

Komore u kaseti mogu ostati nepokretne tokom analize, ali, pošto može biti potrebno da se koristi detektor da bi se pratilo napredovanje analize, obično je poželjno da se može koristiti pokretačko sredstvo za pomeranje kasete između dva ili više unapred određenih položaja, tako da detektor može otkriti zračenje iz različitih komora kasete. Alternativno, ali manje poželjno, samo detektor se može pomerati između unapred određenih položaja ili se mogu postaviti pomerljiva ogledala koja omogućuju da se putanja svetlosti iz kasete do detektora menja kako bi se ostvarilo isto dejstvo.

Na taj način, kod jednog preporučljivog izvođenja pogonsko sredstvo će delovati tokom analize tako da odigne poklopac kasete i pipetu od tela koja sadrži komore (ili, poželjnije, da ispusti osnovu dalje od poklopca), da pomera telo u odnosu na poklopac (poželjno pomeranjem tela, npr. linearno ili obrtanjem) da bi se pipeta poravnala sa željenom komorom, i da pomera zajedno poklopac i kasetu da se postavi pipeta u željenu komoru, i tako redom sve dok se ne završi analiza.

Kod nekih analiza može biti poželjno da se komore nagnu prilikom prenošenja tečnosti ili da se u nekoj komori promeša tečnost pa je, prema tome, poželjno da pogonska naprava može da nagne ili meša (na primer ljulja ili vibrira) bar deo kasete koji sadrži komoru.

Pogonska naprava može biti na ručni pogon, npr. mehanički pogon, ili može biti na pogon motorom koji u svakom stepenu aktivira operator. Poželjno je, međutim da to bude neki pogonski motor koji se aktivira da izvrši traženu aktivnost pomoću nekog spoljneg računara ili, poželjnije, unutrašnjeg računara koji upravlja radom analitičkog aparata. Komore u kaseti mogu biti bilo kog željenog oblika ili zapremine, ali je poželjno da budu cilindrične ili, manje poželjno, konične. Poprečni presek takvih cilindričnih komora može biti bilo kog oblika, npr. cilindričnog, ovalnog, višeugaonog (npr. pravouglog), polukružnog, itd. Dno komore može biti ravno ili zakrivljeno, ali za komore koje se prate odozdo tokom ili pri kraju analize, poželjno je da je dno komore ravno. Kod jednog posebno poželjnog izvođenja, dno komore je ravno i nagnuto, tj. nije horizontalno. Komore mogu biti unutar čvrstog tela ili, alternativno i manje pogodno, mogu biti povezane u nekoj traci, ploči, disku, u obliku savijene lepeze, itd. Zidovi komore, na primer čvrstog tela koje sadrži komore, biće poželjno od plastičnog materijala, naročito providnog plastičnog materijala, na primer akrilne, vinilne, stirenske ili olefinske plastične mase. Izbor određene plastične mase zavisiće ipak, što je uobičajeno, od prirode reagensa koji će se koristiti. Utvrđeno je da je posebno pogodno da se koriste plastične mase dobrih optičkih svojstava i male propustljivosti za gas i/ili tečnost. U tu su svrhu posebno preporučljivi kopolimeri alfa-olefina (npr. etilen i propilen, posebno etilen) i cikličnih olefina (npr. norbornen), npr. proizvod koji se prodaje pod trgovačkim nazivom Topas<*>8007, proizvodi Ticona GmbH, Frankfurt, Nemačka (Topas<®>8007 je jedan etilen/norborenski kopolimer). Poželjno je da ti kopolimeri imaju svetlosnu provodljivost (merenu prema ASTM D1003 za debljinu zida od 2 mm) od najmanje 80%, najbolje od najmanje 90%, a provodljivost vodene pare (na 23°C i relativnoj vlažnosti od 85%, mereno prema DIN 53122 na uzorku veličine 80 x 80 x 1 mm) manju od 0,2 g.mm.m'V, najbolje manju od 0,05 g.mm.m 2d \

Tipično, komore će imati unutrašnje prečnike od 3 do 20 mm, naročito od

5 do 15 mm, i zapremine od 0,1 do 5 mL, naročito 0,5 do 1,5 mL.

Pipeta sa vrhom pokrivenim membranom u kaseti prema pronalasku poželjno je cilindrična a membrana se nalazi kod jednog kraja, a najbolje je da ga pokriva. Drugi je, otvoreni, kraj poželjno oblikovan za u suštini hermetičan priključak, nepropustljiv za gas, na uređaj za primenu gasa pod pritiskom. Pipeta može biti od bilo kog odgovarajućeg materijala, međutim, najpogodniji su providna plastika ili staklo. Membrana može biti postavljena na pipetu na bilo koji odgovarajući način, npr. zavarivanjem (ultrazvukom ili toplotom), lepljenjem, stapanjem granulastog pripremka membrane, itd.

Sama membrana može biti od bilo kog odgovarajućeg materijala, npr. plastike (najlona, polisulfona, itd.), stakla (npr. staklenih vlakana), metala, itd. Međutim, celulozne membrane (npr. ojačana nitroceluloza) posebno su pogodne pošto je relativno jednostavno da se antitela ili drugi opitni reagensi imobilišu na takvim materijalima.

Kod raznih izvođenja pronalaska membrana je poželjno ravna i upravna na osu pipete, i takve su membrane posebno pogodne za uklanjanje tečnosti iz komora sa ravnim ih' konkavnim dnom.

Alternativno, i poželjnije, membrana može biti ravna ali nagnuta pod nekim uglom u odnosu na osu pipete npr. do 85°, poželjno 20 do 80°, poželjnije 50 do 70°, najbolje pod uglom od oko 60° u odnosu na osu pipete. Kada je pipeta i jedna ili više komora pravougaonog poprečnog preseka (npr. četvrtastog), poželjno je da membrana bude postavljena koso i da dno jedne ili više komora takođe bude zakošeno tako da je u suštini paralelno dnu membrane kada je pipeta u toj komori.

Primena zakošene membrane posebno je pogodna jer za neku datu površinu poprečnog preseka pipete veličina površine membrane se povešava što više odstupa od horizontale, tako da se dobija veća površina za očitavanje ili za praćenje tokom analize. Najneočekivanije je to, da zakošena membrana omogućuje ne samo da se sav sadržaj odgovarajuće oblikovane komore može preuzeti kroz membranu, već i da je to preuzimanje ravnomerno po celoj membrani (tj. ako se neki bojeni analit zaustavi na membrani, membrana biva ravnomerno bojena). Druga je prednost to, što se membrana može posmatrati sa strane izbegavajući rizik da kapljice sa uzorka, regensa, itd. padnu na optiku aparata. Sledeća je prednost to, što se membrana može lako osvetliti a da ne izazove veliko reflektovanje svetlosti za osvetljavanje u detektor svetlosti. Druga je jedna prednost to, što se i kod obojenog uzorka (npr. krvi) može pratiti površina membrane kroz bočni zid komore i tako prekinuti bilo koji stepen reakcije kada se ostvari željena promena u površini membrane pošto odstojanje od membrane do zida komore može biti manje nego što je za slučaj horizontalne membrane u komori koja sadrži tečnost. Još je jedna prednost to što je obrazovanje mehurića između membrane i naspramnog zida komore smanjeno u odnosu na horizontalne membrane tako da se smanjuje potreba za naginjanje ili vibritranje tela kasete.

Smatra se da je primena pipeta sa zakošenom membranom na vrhu novina, pa prema jednom svom sledećem vidu, pronalazak daje jednu pipetu čiji je prednji kraj cilindričan a na vrhu ima jednu poroznu membranu čija je spoljna površina nagnuta od površine upravne na osu cilindra pomenutog prednjeg kraja, pri čemu ta pipeta poželjno predstavlja deo kasete za dijagnostičke analaze.

Primena pravougaonog poprečnog preseka za komoru posebno je pogodna jer smanjuje učestanost nagomilavanja tečnih reagensa na gornjim krajevima komora usled kapilarnog dejstva posle obrtanja opitnih kaseta tokom transporta ili uskladištenja. Uglovi sučeljavanja zidova komora poželjno su što je moguće oštrije načinjeni, posebno na gornjim krajevima, tako da, na primer, imaju poluprečnik krivine od 0,5 mm ih manji, npr. 0,1 mm ili manji. Međutim, da bi se sprečilo da tečnosti sa dna komora "puze" naviše duž uglova bušotie, poželjno je da na donjem kraju komore uglovi budu zakošeni ili više zaobljeni, na primer da imaju poluprečnik krivine najmanje 0,5 mm, poželjno bar 0,8 mm.

Kada je potrebno da se neka komora koristi za očitavanje rezultata analize, npr. gde treba meriti apsorpciju svetosti koja prolazi kroz neku tečnost u komori, takođe je posebno pogodno da se koristi komora pravougaonog poprečnog preseka za zakošenim dnom. Na taj način, uz odgovarajuće maskiranje dela komore izložene detetktoru, može se birati da li će se meriti svetio propušteno po celoj širini komore ili kroz manju širinu pri dnu komore (tj. između jednog bočnog zida i zakošenog dna). Na taj se način dužina putanje svetlosti kroz komoru može povećati ili smanjiti pomeranjem vidljive sekcije nagore ili nadole. Na taj se način može, na primer, birati kraća putanja ako je optička gustina sadržaja komore velika.

Pored toga, merenje intenziteta prolaska svetlosti na dve ili više dužina putanje (npr. unutar i iznad zakošenog donjeg dela zidova komore), doprinos zidova komore otkrivenom signalu može se odrediti i korigovati.

Ako treba detektovati rasejano svetio (npr. kada uzorak koji se očitava sadrži čestice ili aglomerate ili je fluorescentan ili fosforescentan), opet će biti poželjno da se koriste komore pravougaonog poprečnog preseka pri čemu se upadna svetlost usmerava upravno na jedan par zidova komore dok se rasejana svetlost odkriva jednim detektorom (npr. digitalnom kamerom) usmerenim na jedan od drugih zidova. Ako kaseta ima linearan raspored komora, komora za za očitavanje kod merenja rasejavanja svetlosti poželjno je na jednom kraju tog niza komora.

Ova primena komora sa zidovima pod nekim uglovima takođe je nova i

predstavlja sledeći vid pronalaska.

Prema tom svom sledećem vidu pronalazak daje analitički aparat koji

obuhvata:

i) opitnu kasetu koja ima bar jednu komoru i jednu pipetu koja se može postaviti u tu bar jednu komoru, pri čemu ta pomenuta bar jedna od ovih komora ima dva paralelna ravna bočna zida, povezana jednim donjim zidom koji ima bar jednu ravnu površinu, pri čemu je normala na njegovu površinu koplanarna sa normalama na paralelne ravne površine pomenutih bočnih zidova, ali nije upravna na njih,

ii) držač za prihvatanje pomenute kasete,

iii) pogonsku napravu koja može postavljati pomenutu pipetu u izabrane komore pomenute kasete,

iv) uređaj za dovod gasa pod pritiskom koji se može priključiti na pomenutu pipetu da bi se izazvao protok tečnosti kroz pomenutu membranu, i

v) detektor zračenja koji može otkrtiti zračenje iz komore u pomenutoj kaseti ili iz pomenute pipete.

U ovom je vidu telo najbolje ravno, postavljeno pod nekim uglom u odnosu na horizontalu kako je napred opisano, a komora ima pravougaoni poprečni presek. Sem toga, kaseta poželjno ima bar jednu pipetu sa kapilarnim vrhom i/ili jednu pipetu sa membranom na vrhu, opet kao što je napred opisano.

U svom sledećem vidu pronalazak obezbeđuje jednu opitnu kasetu koja obuhvata najmanje jednu komoru i jednu pipetu koja se može staviti u pomenutu bar jednu komoru, pri čemu ta bar jedna komora ima dva paralelna ravna bočna zida, povezana jednim donjim zidom koji ima bar jednu ravnu površinu, pri čemu je normala na njegovu površinu koplanarna sa normalama na paralelne ravne površine pomenutih bočnih zidova, ali nije upravna na njih.

Pored jedne pipete sa membranom na vrhu, kasete prema pronalasku mogu sadržati jednu ili više drugih pipeta, takođe pričvršćenih na poklopcu kasete, na primer za odmeravanje tačne zapremine reagensa ili uzorka ili za mešanje reagensa i uzoraka. Kod jednog preporučljivog izvođenja, kaseta obuhvata jednu pipetu sa kapilarnim vrhom koja usisava jednu željenu količinu fluida iz nekog uzorka zahvaljujući svom kapilarnom delovanju. Posebno je pogodno što ima kapilarni otvor do jedne komore većeg unutrašnjeg prečnika tako da to kapilarno delovanje izaziva punjenje samo kapilarnog vrha. Kada se vrh izvuče iz okolne tečnosti, sadržaj se vrha može ubrizgati pod pritiskom u neku komoru kasete ili se može usisati dalje u pipetu iza kapilarnog vrha komore.

Prema drugom vidu pronalasku, kaseta može sadržati jednu pipetu sa kapilarnim vrhom umesto pipete sa membranom na vrhu. Kao što će kasnije biti rasmatrano, takva kaseta se može koristiti u analizi vremena koagulacije.

Spoljni prečnik pipete sa membranom na vrhu jednak je, poželjno, manji za najmanje 0,8 mm, npr. 1 do 5 mm, naročito 1,5 do 2,4 mm od unutrašnjeg prečnika komora, tako da se olakšava protok gasa između zida komore i pipete prilikom prenosa tečnosti kroz membranu pipete kao i da se obezbedi u suštini potpuno vađenje tečnosti iz komora. Zazor takođe omogućuje da komora sadrži i tečnost (npr. 200/xL) i membranu sa membranom na vrhu pre uvlačenja tečnosti u pipetu.

Mađa pipeta i komore mogu imati isti oblik poprečnog preseka (npr. kružni, četvrtast, itd), ponekad može biti pogodnije da se oblici nešto malo razlikuju, npr. jedan da bude kružni a drugi eliptičan, jer se time smanjuje rizik da se pipeta sa membranom na vrhu zadrži nastalim vakuumom na komori. Taj se problem može slično rešiti tako što će vrh pipete ili dno komore biti izvedeni malo nepravilno, na primer sa udubljenjima ili ispupčenjima.

Kod jednog posebno pogodnog izvođenja, kaseta obuhvata: telo koje sadrži više, npr. 2 do 8 ili 10, komora, od kojih su najmanje dve a poželjno najmanje 3 bez tečnih reagensa i od kojih bar jedna sadrži neki tečan reagens, i poklopac koji nosi pipetu sa membranom na vrhu tako da je njen kraj sa membranom postavljen u jednu od praznih komora dok je njen otvoren kraj pristupačan na spoljnoj strani pokrivača, i ima otvor za rad na uzorku kroz pokrivač da bi se uspostavila veza sa drugom od komora bez tečnosti. Poželjno se koriste uklonljive zaptivke za pokrivanje otvorenih krajeva pipeta i otvora za primenu uzorka. Ukoliko poklopac ne nosi samozaptivne zatvarače, ili ako komore nisu hermetički zatvorene kako je napred opisano, jedna druga uklonljiva zaptivka će biti postavljena da okruži spoljne spojeve poklopca i tela, a O-prstenovi ili druge zaptivke će biti postavljene između poklopca i tela bar oko komora koje sadrže tečnost. U oba rešenja unutrašnjost kasete je izolovana od vazduha i vlage pre upotrebe. Telo i poklopac imaju udubljenja i ispupčenja za spajanje sa držačem kasete i pogonskim sredstvom, kako bi se obezbedilo korektno uklapanje između poklopca i tela tokom izvođenja analize, a ako poklopac nosi zapušače za zaptivanje komora, ista služe za sprezanje sa jednim separatorom kao što je napred opisan, a koji razdvaja poklopac i telo da bi se omogućilo izvođenje analize.

Telo i poklopac su poželjno takvi da se pipeta sa membranom na vrhu može uneti u "komoru za očitavanje" ili u neki položaj van komore u kome je zračenje iz pipete dostupno do detektora. Takva komora za očitavanje može imati, na primer, ravno dno koje propušta svetlost ili sekciju ravne strane komore kroz koju može da prođe svetio do detektora. U slučaju kada se očitavanje vrši van komore, to može biti jedan otvor kroz osnovu ili deo tela kod koga je bočni zid uklonjen ili udubljen, tako da svetlost iz pipete može stići do detektora a da ne prolazi kroz materijal od koga je obrazovana telo.

Korišćenje "komore za očitavanje" je pogodnije pošto smanjuje mogućnost kapanja reagensa ili uzorka u telo aparata za analizu. Ako je potrebno da se očita jedna nagnuta membrana, korišćenje posebne komore za očitavanje se može izbeći jednostavnim podizanjem membrane iz tečnosti u nekoj komori, ili usisavanjem tečnosti kroz membranu u pipetu, tako da površina membrane bude izložena za očitavanje.

Kod jednog izvođenja telo može biti oblikovana tako da obezbeđuje jednu reflektujuću površinu (npr. površinu plastične prizme) ispod dna komore za očitavanje, koja reflektuje svetio ispod dna komore za očitavanje, npr. iz vertikalnog u horizontalan pravac. Na ovaj način detektor ne mora biti postavljen ispod kasete a problemi padanja prašine ili tečnosti na detektor mogu se izbeći. Kao kod Frenelovog sočiva, može se jedna prizma obrazovati kao integralna kombinacija paralelnih elemenata prizme. Takva se struktura prizme ovde označava kao "Frenelova prizma", a takve prizme i njihove primene, npr. modifikatori putanje u optičkim priborima, na primer aparata za analizu, čine sledeći vid ovog pronalaska. Poremećaj slike usled poremećaja površine, koji se često sreće u plastičnim odlivcima debljine veće od nekolilo milimetara, smanjen je ili izbegnut primenom plastične Frenelove prizme umesto konvencionalne plastične prizme koja ima istu površinu na koju upada svetlost. Zbog toga je primena Frenelove prizme obrazovane u telu kasete posebno pogodna u uređajima prema pronalasku. Tipična je "Frenelova prizma" jedna struktura od providnog materijala sa jednim stepeničastim delom sa jedne strane i ravnim sa druge - svetlost koja upada normalno na horizontalan deo jednog stepenika interno se odbija od ravne površine i normalno izlazi kroz vertikalan deo stepenika. Zbog toga ona u stvari funkcioniše kao ogledalo. Kod nagnute membrane, međutim, takva Frenelova prizma obično neće biti potrebna. Kod kaseta prema pronalasku, bliži, odnosno zadnji, ili "otvoreni" kraj bar jedne pipete poželjno je hermetički zatvoren jednom elastičnom samozaptivnom membranom, na primer gumenom membranom, koja se može probušiti nekom šupljom iglom da omogući primenu gasa pod pritiskom. Kod ovog je izvođenja u pipeti obrazovan jedan rezervoar za otpatke između vrha pipete i elastične membrane. Sa ovakvim se izvođenjem tečnost u kaseti može usisati u rezervoar za otpatke tokom ili na kraju izvođenja analize, tako da se upotrebljena kaseta može ukloniti i odbaciti a da ne dođe do curenja otpadaka.

Uređaj za dovod gasa pod pritiskom u aparat prema pronalasku može, na primer, obuhvatati jednu pumpu i vod od pumpe do priključka na kaseti, i eventualno bar jedan rezervoar i dva ili više pozicionih ventila. Uključivanje jednog rezeroara, npr. zapremine od jednog ili više litara, a najbolje bar dva rezervora, omogućuje da se primenjuju na pipetu pritisci iznad i/ili ispod spoljneg pritiska vazduha u kratkom trajanju, a uz vremenski zanemarljive varijacije primenjenog pritiska zbog mogućnosti da se pipeta izoluje od pumpe kao i zbog relativno malih promena pritiska u rezervoaru tokom perioda primene pritiska (kao rezultat relativno velikog rezervoara). Između primena pristiska pumpa se može koristiti da vrati pritisak u rezervoaru na željeni nivo. Pošto može biti poželjno da se pipeta svede atmosferski pritisak i/ili da se u pipeti obezbede pritisci iznad i ispod spoljneg pritiska, poželjno je da se u vod ispred pipete postavi jedan višepoložajni ventil koji će omogućiti takve različite primene pritiska. Ventilom, koji takođe treba da ima i jedan zatvoren položaj da bi se sprečio protok gasa do pipete ili iz pipete, poželjno se upravlja preko računara. Korišćenje rezervoara pritiska kako su napred opisana zahteva relativno mnogo prostora za aparat i uređaj prema pronalasku. Kako je uređaj poželjno prenosiv, poželjno je da se umesto rezervoara koristi neka klipna pumpa (npr. jedna brizgalica) spojena preko nekog voda (poželjno minimalne zapremine) sa priključkom na kaseti. Zapravo je posebno pogodno imati grupu priključenih klipnih pumpi, od koji je svaka priključena na jedan odvojen priključak na kaseti tako da, kada je kaseta na svom mestu, rad motora pumpi pokreće rad svih pumpi. Kod ovog izvođenja, kaseta je opremljena neaktivnim i aktivnim elementima za povezivanje sa pomenutim priključcima, pri čemu neaktivni elementi za povezivanje jednostavno dozvoljavaju da se pripadajuća klipna pumpa provetrava. Kod određenih izvođenja, na primer kod merenja vremena koagulacije ili kada je potrebno da se neki analit veže na neki ligand imobilisan na membrani pipete, može biti potrebno da se ubrza ili uspori prolaz naniže tečnosti pod uticajem uređaja za primenu pritiska, što se, u ovom uslovima, može, na primer, ostvariti ubrzavanjem ili usporavanjem kretanja klipova u klipnoj pumpi.

Uređaj za primenu pritiska priključuje se neposredno na otvoren kraj pipete, pri čemu se može, alternativno ali manje poželjno, priključiti neposredno na jednu komoru u kaseti s tim što je otvoren kraj pipete otvoren za pritisak okolne sredine.

Kod jednog posebnog izvođenja, jedan (poželjno pokretljiv) instrument za primenu pritiska obezbeđen je za svaku komoru ili za položaj za očitavanje van komore na kaseti, a kaseta je opremljena neaktivnim i aktivnim elementima za povezivanje sa svakim od tih priključaka. Na taj se način može izbeći potreba za pažljivo usmeravanje kasete prilikom postavljanja u držač - kaseta se može postaviti u bilo koji, prethodnim podešavanjem odobren, položaj a poklopac aparata zatvoriti da bi se priključci automatski spojili sa neaktivnim i aktivnim elementima za povezivanje na kaseti. Prepoznavanje kasete (što će kasnije biti rasmatrano) od strane aparata omogućiće da se kaseta automatski pomeri u pravilno usmerenje za početak analize. Ovo se, međutim, posebno zahteva samo kada je potrebno da se skrati vreme potrebno za postavljanje kasete ili ako je kaseta projektovana za korišćenje kod višestrukih analiza (tj. ima više pipeta).

Detektor u aparatu prema pronalasku može biti bilo koji odgovarajući detektor zračenja, npr. detektor radioaktivnog zračenja ili detektor elektromagnetskog zračenja. Alternativno, aparat može obuhvatati dva ili više detektora sposobnih za otkrivanje različitih vrsta zračenja. Međutim, sa gledišta održa-vanja, pogodno je da taj detektor bude jedan detektor elektromagnetskog zračenja a još specifičnije, detektor koji može otkriti zračenje u bar delu opsega od UV do IC, posebno od blizu UV do blizu IC opsega, naročito u vidljivom opsegu. (Izraz svetlost ovde se koristi u smislu elektromagnetskog zračenja u UV do IC opsegu.) U tu svrhu posebno je pogodno koristiti jednu digitalnu kameru kao detektor.

Primena digitalne kamere kao detektora posebno je pogodna pošto ona može funcionisati nc samo kao detektor svetlosti već i kao analizator strukture neke slike. Tako, na primer, nepravilnosti u slici neke membrane na pipeti mogu se otkriti i korigovati.

Između detektora i kasete može bit poželjno da se postave, pomerljivo ili fiksno, elementi koji služe bilo da biraju energiju zračenja kojoj se dopušta da prođe do detektora (npr. filtri, prizme, itd.) bilo da smanje uticaj rasejanog zračenja na detektor (npr. blende i svetlosne zamke).

Elementi za smanjenje rasejanog zračenja posebno su važni kada je zračenje koje treba otkriti slabo (npr. koje potiče od hemoluminescencije ili od fluorescencije) ili je stimulisano ili potiče od transmisije ili je reflektovano od zračenja merljivog detektorom. U takvim okolnostima, svetlosne barijere ili kolimatori takođe se mogu postaviti negde u aparatu ili unutar kasete.

Opšte uzev, aparat prema pronalasku biće opremljen izvorima elektromagnetskog zračenja (npr. izvorima vidljive svetlostu od blizu IC do blizu UV), postavljene da izazovu zračenje emitovano, odbijeno ili preneseno željenim komorama kasete ili pipetom đa prođe do detektora. Kao rezultat, takođe je pogodno da kaseta, držač kasete i detektor budu postavljeni u neku mračnu komoru u aparatu i da aparat bude opremljen nekim pristupnim otvorom koji se može zatvoriti, npr. nekim poklopcem, a kroz koji se postavlja kaseta.

Posebno je korisno da se postavi jedan izvor svetlosti tako da se, kada je kaseta postavljen na svoje mesto, između njega i detektora nalazi jedna komora, tako da se, npr., može odrediti propuštanje svetlosti u komori. U tu svrhu kaseta može imati jedan otvor u koji se svetlosni izvor može umetnuti kod punjenja kasete, pri čemu je pogodno da je to jedan aksijalno izveden otvor kada su komore u kaseti postavljene oko jedne središne ose. Podrazumeva se da se detektor može postaviti u odnosu na komoru u izvor svetlosti tako da otkriva prenetu, reflektovanu, rasejanu ili emitovanu svetlost.

Ako je detektor jedna digitalna kamera (ili laser za skeniranje), može se koristiti i za identifikovanje analize. Tako se prugasti kod, ili sličan kod koji se može mašinski očitavati, može postaviti na opitnu kasetu tako da, očitavši kod, računar koji upravlja aparatom može da identifikuje prirodu analize a time i stepene analize koje treba izvesti. Korisnik analize može na sličan način, postavljajući neki prugasti kod ili kod koji mašina može očitati na opitnu kasetu, đa identifikuje pacijenta tako da aparat može da generiše izveštaj u kome će identifikovati pacijenta i analizu, ili može generisati ulaz u pacijentov kompjuterizovan dosije, ili pripremiti materijal za taj dosije. Sistemi očitavanja kodova i očitavanja rezultata ove vrste rasmotreni su, na primer, u WO 99/32004.

Kako je napred pomenuto, kasete u kojima je postavljena pipeta sa kapilarnim vrhom umesto pipete sa membranom na vrhu mogu se pogodno koristiti za analizu vremena koagulisanja u krvi ih' u plazmi (poželjnije u krvi). Pipeta obuhvata, redom, vrh kapilare, jednu komoru i drugu kapilaru koja može biti nelinearna, npr. sinusoidalna, ako se to želi. Otvaranjem kasete i umakanjem kapilarnog vrha u uzorak krvi izaziva punjenje kapilare do spoja sa komorom, tj. uzimanje jedne unapred određene zapremine uzorka. Potom se kaseta može zatvoriti i postaviti u opitni uređaj. Druga kapilara ili jedna od komora u kaseti obložena je sredstvom za pospešivanje koagulisanja (npr. faktorom tkiva) a tečni uzorak može doći u dodir sa njime primenom nižeg ili višeg pritiska u odnosu na pritisak okolne sredine na otvorenom kraju pipete. U prvom slučaju, sniženi pritisak izaziva izvlačenja uzorka kroz komoru u drugu kapilaru i njegovog dovođenja u dodir sa sredstvom za podsticanje koagulisanja. 1J drugom slučaju, povišeni pritisak istiskuje uzorak u obloženu komoru. Ako se želi, u ovom drugom slučaju, uzorak i sredstvo za podsticanje koagulacije mogu se pomešati tako što se usisaju natrag u pipetu pa se opet istiskuju, jednom ili više puta. Posle toga se uzorak izvlači kroz kapilarni vrh i komoru u drugu kapilaru. U oba se slučaja detektorom prati kretanje uzorka u drugoj kapilari pod primenjenim pritiskom sve dok koagulacija ne dostigne dotle da se kretanje više ne može otkriti. To može zahtevati da se uzorak pomera napred-nazad u drugoj kapilari naizmeničnim delovanjem pritiskom nižim i višim od pritiska okolne sredine.

Očigledno je iz svega napred rečenog, da se ista kapilara može koristiti za uzimanje uzorka (npr. krvi), i za njegovo mešanje sa jednim ili više reagenasa (na primer pumpanjem istog u i iz jedne komore u kasetu).

TJ svakom slučaju, za merenje vremena koagulacije važno je da se kontroliše temperatura uzorka pa je zbog poželjno da uređaj, npr. u držaču kasete, bude opremljen regulatorom temperature, na primer vrućom pločom sa termostatom, izvorom vrućeg vazduha, itd.

Kod jednog alternativnog izvođenja, vreme koagulacije u krvi ili plazmi može se odrediti stavljanjem uzorka u komoru koja sadrži neko sredstvo za penušanje i praćenjem brzine podizanja proizvedenih mehurića korišćenjem digitalne kamere.

Ako se koristi pipeta sa kapilarnim vrhom, može biti poželjno da ona bude priložena nezavisno od kasete, a oblikovana tako da se može postaviti u neku komoru i da se može priključiti na uređaj za dovod gasa pod pritiskom.

Takve pipete sa kapilarnim vrhom i njihova primena u vezi sa opitnim kasetama obrazuju sledeće vidove pronalaska.

Tako je, kao sledeći vid pronalaska ostvaren analitički aparat koji sadrži: i) jednu opitnu kasetu koja obuhvata bar jednu, poželjno bar dve komore i jednu pipetu koja se može postaviti bar u jednu, poželjno bar u dve od pomenutih komora, pri čemu ta pipeta ima kapilarni vrh,

ii) držač postavljen da prihvati pomenutu kasetu,

iii) pogonski uređaj koji može postaviti pomenutu pipetu u izabrane komore pomenute kasete,

iv) uređaj za dovod gasa pod pritiskom koji se može priključiti na pomenutu pipetu i tako izazvati protok tečnosti kroz pomenutu membranu, i

v) detektor zračenja koji može otkriti zračenje iz neke komore ili iz pomenute pipete.

TJ jednom svom sledećem vidu, pronalazak takođe obezbeđuje jednu opitnu kasetu koja obuhvata bar jednu, poželjno bar dve komore i jednu pipetu koja se može postaviti bar u jednu, poželjno bar u dve od pomenutih komora, pri čemu ta pipeta ima kapilarni vrh.

Koristeći pipete u opitnim kasetama prema pronalasku, moguće je uneti uzorke za ispitivanje u komore kasete, mešati reagense ili reagense i uzorak u kaseti, prebacivati tečnosti iz jedne komore u drugu, itd. Pumpanjem tečnosti u i iz pipete u neku komoru moguće je poboljšati homogenost mešanja a pumpa-jem tečnosti nazad i napred kroz membranu pipete koja nosi reagens moguće je povećati opseg reagovanja sa reagensom. Menjanjem brzine kojom je tečnost pumpana kroz membranu pipete koja nosi reagens, takođe je moguće menjati granicu do koje reagens reaguje. Prema tome, format pipete i kasete omogućuje veliku raznovrsnost izvođenja analiza.

Ako opitna kaseta obuhvata pipetu sa kapilarnim vrhom, npr. za preno-šenje uzoraka krvi, često je poželjno da se ukloni višak fluida sa spoljne površine kapilare. TJ takvim je slučajevima pogodno da jedna od komora ima jedan apsorpcioni brisač pipete preko kojeg se može prevući kapilarni vrh tako da brisač apsorbuje svu tečnost na spoljnoj površini kapilare. Ovaj brisač može, npr., imati oblik jednog apsorpcionog jastučeta kod gornjeg kraja, ili blizu gornjeg kraja komore, na primer jednog U-oblikovanog jastučeta, rasečenog na dnu U-oblika. Kod takvog jednog izvođenja, kada se kapilara izvlači iz komore može se pomeriti ustranu tako da kapilara zahvati ivicu proreza. Kako se ovo pomeranje može desiti pre no što je pipeta sa membranom na vrhu potpuno izvušena iz komore u kojoj se nalazi, može biti potrebno da se komore projektuju tako da se spreči da pipeta sa membranom na vrhu bude naterana na bočni zid komore. Tako može komora za pipetu sa membranom na vrhu da bude veće širine ili, alternativno, njen bočni zid može biti delimično uklonjen na gornjem kraju komore.

Umesto brisanja kapilarnog vrha da bi se uklonio višak uzorka sa spoljne strane vrha, jedno je rešenje da se kapilarni vrh umetne u jedno apsorpciono područje postavljeno paralelno sa osom kapilarnog vrha, npr. da upijajuća vlakna budu paralelna sa vrhom ili da površine listova upijajućeg materijala (npr. papira) budu paralelne osi kapilarnog vrha. Kako otvoren vrh kapilare neće doći u dodir sa upijajućim materijalom, sadržaj kapilare se neće ukloniti dok će spoljna strana kapilare biti očišćena od viška tečnosti. To je posebno važno za uzorke krvi. Tako, na primer, jedna kapilara zapremine 1ju,L nema dovoljnu preciznost ukoliko se krv zalepljena na spoljnu površinu kapilare ne ukloni. Jedna prosečna kapilara od 1 /zL ima oko 0,25fxLna spoljnoj strani. Bez uklanjanja krvi nalepljene na spoljnu površinu, utvrđen je CV (koeficijent varijacije) od oko 7-8% (zapremina isporučene krvi). Efikasnim uklanjanjem krvi sa spoljne strane CV se smanjuje na 1,0-1,5%.

Kada se brisanje kapilare odvija kao deo vršenja analize, vremensko kašnjenje pre samog brisanje može dovesti do sušenja krvi na spoljnoj površini kapilare. Ako se to desi, krv uopšte neće biti upijena i može se rastvoriti prilikom sledećeg stepena razređivanja. Ako korisnik čeka jedan minut od uzimanja krvi u kapilaru do uključivanja instrumenta, brisanje će biti u izvesnoj meri neefikasno. Ako se sačekaju tri minuta uopšte neće biti upijanja krvi. Zbog toga je veoma važno da se brisanje kapilare vrši neposredno po uzimanju uzorka krvi pomoću kapilare. To se može ostvariti postavljanjem u komoru u koju se stavlja kapilara jednog apsorpcionog područja kako je napred opisano, npr. trake papira savijene u obliku slova V pri čemu se kroz otvoreni kraj V-oblikovanog papira umeće kapilarni vrh. Papir se može postaviti i stabilno držati u komori bilo korišćenjem sila papira koje ga potiskuju na zidove komore ili, ako je potrebno, postavljanjem papira na neki noseći okvir. Kada korisnik uvede držač kapilare u kasetu, kapilara će potisnuti oba gornja kraka u stranu i kapilara će klizati na dole u dodiru sa papirom na svoje dve naspramne strane. Ova konstrukcija sa papirom paralelnim kapilari obezbeđuje da krv neće biti upijena iz unutrašnjosti kapilare a sem toga, kapilara nikad neće udariri na donji deo presavijenog papira. Korišćenjem kapilare od 1/u.L i krvi sa svim sastojcima postignuta je sa ovom konstrukcijom CV (zapremina krvi) od 0,75%.

Kod jednog drugog preporučljivog izvođenja, opitna je kaseta isporučena korisniku sa jednom pipetom sa kapilarnim vrhom, za uzimanje uzoraka, bilo odvojenom, bilo rastavljivo postavljenom na kasetu, npr. u jednoj krajnjoj komori jednog linearnog rasporeda komora. Kod tog je izvođenja na kapilarnom vrhu, tj. na prednjem kraju pipete, postavljena jedna čaura koja tesno naleže na kapilarni vrh i poravnana je sa otvorenim krajem kapilarnog vrha. Kod uzimanja uzorka kapilarom, sav višak spoljne tečnosti lepiće se na spoljnu površinu čaure a ne na spoljnu površinu same kapilare. Čaura je izvedena, npr. na svojoj spoljnoj površini, sa elementima za zahvatanje unutrašnje ili gornje površine jedne komore u kaseti (na primer neka prirubnica koja se može izobličiti, i si.) tako da kada se napunjena pipeta sa kapilarnim vrhom pritisne u takvu komoru, pipeta sa kapilarnim vrhom može se izvaditi iz komore (npr. na početnu odvijanja automatizovane analize) ostavljajući čauru i višak spoljne tečnosti u komori. Eksperimenti su pokazali da se kod prenošenja uzorka krvi od 1/xL koristeći takvu kapilaru zaštićenu jednom čaurom, može ostvariti CV (zapremina krvi) isto tako niska kao ona koja se može postići brisačem od presavijenog papira opisanim u predhodnom paragrafu.

Za neke određene analize može biti poželjno da se izvrši razdvajanje uzorka, npr. da se stvori uzorak plazme iz prvobitnog uzorka krvi. U takvim slučajevima može biti poželjno da se postavi neki filtar u jednu od komora. On može biti uklonljiv ili, alternativno, može obrazovati deo jednog integralnog produžetka pipete postavljen u komoru. Takav produžetak pipete može, na primer, obuhvatati jedan cilindar otvoren na svom gornjem kraju gde je oblikovan za zahvatanje pipete postavljene na poklopcu čaure, dok je na svom donjem kraju ispunjen staklenim vlaknima. Kod takvog jednog izvođenja, uzorak može biti unet u pipetu sa kapilarnim vrhom postavljenu na poklopac kapilare kada su poklopac i telo razdvojeni ili u pipetu sa kapilarnim vrhom koja se može postaviti u poklopac kasete. Tada se, kada su poklopac i telo spregnuti, uzorak može pod đejstvom pritiska vazduha istisnuti u cilindar produžetka pipete, pa će filtrat proći na dno komore. Druga pipeta sa kapilarnim vrhom, postavljena na poklopac, može se koristiti za izvlačenje filtrata nakon što se pipeta i produžetak pipete izvuku iz komore. Na taj se način, polazeći od uzorka krvi, može dobiti nerazblažen uzorak plazme.

Isto kao produžeci pipeta, brisači kapilara, itd., i drugi se elementi i reagensi mogu staviti u komore kasete. Tako, na primer, komora za prihvatanje kapilare za uzimanje uzoraka može sadržati sledeću nepokretnu ili pomerljivu komoru koja sadrži neki suvi reagens, tako da se uzorak i taj reagens mogu mešati na početku izvođenja analize.

Aparat, uređaj i kasete prema pronalasku koriste se kod analitičkih postupaka. Ti postupci koji koriste aparat, uređaj ili kasete prema pronalasku predstavljaju sledeći vid ovog pronalaska. Mada je pronalazak posebno pogodan za medicinske dijagnostičke analize, može se isto tako koristiti za druge analize, npr. okolne sredine, ishrane, itd., uključujući analize uzoraka iz proizvodnih procesa. Posebno je pogodan za takve primene pošto se i kasete i uređaji mogu proizvesti dovoljno mali da bi bili potpuno prenosivi, npr, maksimalnih dimenzija uređaja (bez priključaka za spoljnu opremu ili izvore energije) ne većih od 30 cm, poželjnije ne većih od 20 cm.

Primena pipeta sa membranama na vrhovima u analizama takođe je novina i predstavlja jedan sledeći vid pronalaska. Prema tom svom vidu, pronalazak obezbeđuje postupak analize kod koga se neka tečnost prenosi iz jednog kontejnera u jednu pipetu, naznačen time što se kraj pomenute pipete kroz koji ulazi tečnost hermetički zatvara jednom membranom koja propušta tečnost.

Prema jednom svom drugom vidu, pronalazak takođe obezbeđuje primenu aparata prema pronalasku za ispitivanje nekog analita u biološkom ili svojstava nekog biološkog uzorka, npr. za analizu vremena koagulisanja nekog uzorka krvi ili nekog uzorka izvedenog iz krvi ili za analizu nekog proteinskog analita u nekom uzorku telesnog fluida ili uzorku izvedenom iz telesnog fluida.

Dokumenti na koje se ovde poziva uključeni su kao literatura.

Primeri aparata i postupaka prema pronalasku biće dalje ilustrovani sa pozivom na sledeće neograničujuće primere i na priložene crteže, gde

- slika 1 prikazuje, šematski, presek kroz jednu kasetu prema pronalasku, - slika 2 prikazuje, šematski, delimičan presek kroz jednu kasetu prema pronalasku, - slika 3 prikazuje, šematski, delimičan presek kroz jednu kasetu prema pronalasku,

- slika 4 predstavlja šematski crtež aparata prema pronalasku,

- slika 5 prikazuje, šematski, presek kroz jednu kasetu prema pronalasku, - slike 6 i 7 prikazuju dijagrame doza-reagovanje za analize iz Primera 1 i 2,

- slika 8 prikazuje rezultate analize iz primera 3,

- slike 9 do 19 predstavljaju šematske prikaze drugih izvođenja kaseta prema pronalasku kod kojih su komore u linearnom rasporedu, - slika 20 predstavlja šematski prikaz na kome se vidi kako se jedan pomerljivi magnet može koristiti za izdvajanje magnetnih polimcrnih granula iz jednog uzorka u komori jedne kasete prema pronalasku, - slika 21 predstavlja, šematski, kako se jedna papirna traka može koristiti da izbriše višak tečnosti sa spoljne površine sa jedne pipete sa kapilarnim vrhom u kaseti prema pronalasku, - slika 22 predstavlja šematski prikaz kako membranom zatvoren rezervoar za otpatke može obrazovati deo jedne pipete u kaseti prema pronalasku, a - slika 23 prikazuje, šematski, poprečni presek jedne pipete sa kapilarnim vrhom koja se koristi u jednoj opitnoj kaseti prema pronalasku.

Prema slici 1, prikazano je providno plastično cilindrično telo 1 kasete koje sadrži cilindrične komore 2 (od kojih su prikazane samo dve) raspoređene kružno oko ose 3 kasete. Iznad tela 1 kasete postavljen je poklopac 5 kasete. Otvori svake od komora su zatvoreni čepovima 4 pričvršćenim na poklopac 5. Poklopac 5 takođe nosi pipetu 6, koja ima produžetak 7 za priključivanje uređaja za dovod gasa pod pritiskom na spoljnoj strani poklopca i vrh sa membranom 8 postavljen u jednu komoru 2 u telu 1. Otvor 9 za unošenje uzorka takođe se nalazi u poklopcu 5. Otvor 9 i pipeta 6 poravnani su sa komorama 2 pomoću ispusta i udubljenja 10, 11, 12, 13 za pozicioniranje. Slični pozicioni ispusti i/ili udubljenja 14 (ovde prikazani kao udubljenja) izvedeni su u telu 1 i poklopcu 5 da omoguće telu i poklopcu da se spregnu se držačem kasete i napravom za pomeranje (nisu prikazani) analitičkog aparata. Telo i poklopac izvedeni su sa prirubnicama 13 za sprezanje sa razdvajačem (nije prikazan) koji razdvaja telo i zaptivku 16 poklopca pre početka izvođenja analize. Priroda analize za koju je kaseta namenjena identifikuje se oznakom 17 prugastog koda na strani tela. Pipeta i otvor za unošenje uzorka prikazani su hermetički zatvoreni uklonljivim trakastim zaptivačima 16. Oni se uklanjaju pre korišćenja kasete.

Na slici 2 kaseta sa slike 1 prikazana je različito orijentisana radi očita-vanja rezultata analize na kraju izvođenja analize. Pri ovoj orijentaciji, komore 18 i 19 prikazane su drugačije od komora 2 na slici 1. Komora 18 je "komora za očitavanje" i ima plastičnu prizmu 20 postavljenu na njeno dno a deo putanje svetlosti od membrane do detektora prikazan je kao tačkasta linija 21. Pipeta 7 prikazana je kako sadrži iskorišćen reagens 22. Svetlosni je izvor 44 prikazan postavljen unutar aksijalnog kanala 45 u telu kasete.

Na slici 3 prikazano je jedno drugo izvođenje kasete sa slike 2 kod kojeg je dno komore 18 za očitavanje stepeničasto a osnova ispod komore 18 za očitavanje je nagnuta tako da zajedno obrazuju Frenelovu prizmu 29. Svetlosni je izvor 46 postavljen da osvetljava membranu. Kod ovog je izvođenja pipeta 7 takođe prikazana sa komorom 47 relativno velike zapremine. To olakšava zadr-žavanje u pipeti tečnosti koje se koriste pri analizi.

Na slici 4 su komponente aparata prema pronalasku prikazane šematski. Kaseta 23 (sa telom 1, poklopcem 6 i pipetom 6) drži se držačem 24 i pokreće pogonskim sredstvom 25. Pipeta 6 priključena je vodovima 26 sa klipnim pum-pama 27 pokretanim motorom 28. Jedan detektor, digitalna kamera 32, postavljen je da detektuje svetlost iz komore za očitavanje kasete 23 kada je analiza završena a isvori svetlosti, 44 i 46, sa izvorom 34 energije, postavljeni su da osvetle komoru za očitavanje.

Pogonskim sredstvom 25, motorom 28, kamerom 32 i izvorom 34 energije upravlja se računarom 35 koji je povezan sa monitorom/štampačcn 36 ili sa nekim udaljenim računarom 37 (npr. preko infracrvene bežične veze). Kamera 32, izvori 44 i 46 svetlosti, držač 24 i kaseta 23 smešteni su u mračnu komoru 38 opremljenu otvorom 39 za unošenje i vađenje kasete.

Slika 5 prikazuje uzdužni presek jedne alternativne pipete sa kapilarnim vrhom koja se može koristiti u kasetama ptrema pronalasku.

Otvoren kraj 39 pipete prilagođen je za priključenje uređaja za delovanje gasom pod pritiskom. Drugi je kraj pipete izveden sa kapilarnim vrhom 40 koji je povezan sa komorom 41 a potom preko sledeće sinusoidne kapilare 42 sa otvorenim krajem 39. Deo 43 dna komore 2 obložen je nekim sredstvom za podsticanje koagulacije, npr. faktorom tkiva. Umakanjem kapilarnog vrha 40 u krv ili plazmu izaziva uvlačenje jedne određene zapremine uzorka kapilarnim delovanjem. Izvlačenje pipete iz uzorka a potom isbacivanje sadržaja u komoru obloženu sredstvom za podsticanje koagulacije pa potom usisavanjem uzorka natrag u kapilaru, ili usisavanjem uzorka pored faktora tkiva u kapilari, ubrzava početak koagulisanja pa se digitalna kamera može koristiti za određivanje vremena za koje protok uzorka duž kapilare stvarno prestaje, tj. vreme koagulisanja.

Slike 9 do 19 prikazuju alternativna izvođenja jedne opitne kasete u kojoj su komore linearno raspoređene.

Slika 9 prikazuje odvojenu pipetu 50 sa kapilarnim vrhom koja se može potopiti u neku tečnost da bi uzela jedan uzorak. Napunjena pipeta se može potom umetnuti u otvor 51 u poklopcu 52 kasete tako đa kapilarni vrh dospe u jednu krajnju komoru u telu 53 kasete. Otvoren gornji kraj pipete 50 izveden je sa urezima 54, tako da ako operator poveže pipetu sa poklopcem kasete i sa njenim telom pritiskujući na gornji kraj pipete, to neće podići pritisak u pipeti i neće pre vremena istisnuti deo uzorka ili celokupan uzorak. Slika 10 prikazuje kasetu sa slike 9 sklopljenu nakon umetanja pipete za uzimanje uzorka, tj. u stepenu kada je kaseta spremna da buda stavljena u aparat prema pronalasku.

Tokom vršenja analize, poklopac i telo kasete biće razdvojeni otvaranjem zapornog mehanizma 84. Razdvojena kaseta prikazana je na slici 11. Poklopac 52 prikazan je sa pipetom 50 sa kapilarnim vrhom i pipetom 55 sa membranom na vrhu. Pipeta 55 sa membranom na vrhu ima pravougaoni poprečni presek i zakošen vrh 56. Radi jasnijeg prikazivanja, membrana koja pokriva otvoren donji kraj pipete 55 nije prikazana. Telo 53 kasete prikazano je sa šest komora 57-62, sve uglavnom sa pravougaonim poprečnim presekom. Da bi se omogućilo brisanje kapilarnog vrha, deo je gornje sekcije zida između komora 57 i 58 uklonjen. Kao što se vidi na slici 12, dna 63 komora 59 do 62 zakošena su tako da su paralelna vrhu 56 pipete sa membranom na vrhu. Komore 59 do 62 su hermetički zatvorene folijama na svojim gornjim krajevima. Zaptivne se folije probijaju tokom izvođenja analize probojcima 64 ranije postavljenim na poklopcu kasete (videti sliku 13). Pojedinačni su probojci spojeni zajedno u jednu traku 65 prikazanu na slici 14. Svaki od probojaca, koji može biti metalan ali je bolje da je plastičan, jeste jedan šupalj cilindar pravougaonog poprečnog preseka sa oštricom 66 na donjoj ivici i prirubnicama 67 na gornjoj ivici, što čini da se probojac zadrži na telu kasete nakon što bude pritisnut u spoj sa telom (kao što je prikazano na slici 15). Unutrašnji je poprečni presek probojaca oblikovan tako da deluje kao vodica za pipete.

Slika 16 prikazuje poklopac i telo razdvojene uz pomeranje u stranu da bi kapilarni vrh pipete 50 došao u dodir sa upijaćim brisačem 68 postavljenim na vrhu komore 57. Kako je prikazano, pipeta 55 sa membranom na vrhu delimično je pomerena iz komore 58 u komoru 57.

Slike 17 i 18 prikazuju u rastavljenom obliku sklop poklopca i tela kasete sa produžecima 69 i 70 pipete koji će tokom korišćenja biti postavljeni u komoru (57) u koju je pipeta 50 za uzimanje uzorka prvobitno postavljena. Prema slici 18, produžetak 70 pipete služi da pretvori pipetu za uzimanje uzorka u pipetu sa membranom na vrhu, npr. da se omogući filtriranje uzorka.

Slika 19 prikazuje donje krajeve tri komore pripremljene za vršenje analize koagulisanja krvi, koje na slikama 19a i 19b imaju čeličnu kuglicu 72 koja se može pomerati duž dna komore, a na slici 19c jednu polimernu kuglicu 73 koja će plivati na površini uzorka dok je on još tečan.

Po završetku analize u kojoj su korišćene kasete sa slika 9 do 19, jedna upijaća traka umeće se u otvor 71 u poklopcu kasete kako bi se sprečilo curenje bilo kog fluida zaostalog u komorama 58 do 62. Alternativno, otvor može biti zatvoren jednim duguljastim "klipom" koji se koristi 4a pritisne probojce krz zaptivne folije komora 53 do 62.

Na slici 20 prikazana je komora 75 u jednoj kaseti prema pronalasku. Ta komora sadrži tečnost 73 u kojoj se nalaze magnetne polimerne granule. Da bi se granule odvojile od tečnosti tokom vršenja analize (npr. kako je prikazano u sledećem Primeru 12), magnet 77 se pomera iz položaja (A) u kome je udaljen od komore do položaja (B) u kome dodiruje zid komore. Potom se može u komoru umetnuti jedna pipeta sa membranom na vrhu i koristiti za izvlačenje tečnosti pri čemu magnetne granule ostaju u komori.

Na slici 21 šematski je prikazana kaseta 78 prema pronalasku sa linearnim rasporedom komora 79-84, od koji je krajnja komora 79 prilagođena da prihvati kapilaru za uzimanje uzorka od koje je prikazan samo vrh 85. Unutar komore 79 postavljen je V-oblikovan, savijen upijaći papir 86, tako da umetanje kapilarnog vrha 85 u komoru 79 izaziva brisanje spoljne površine kapilare.

Na slici 22 prikazana je delimično i šematski kaseta 87 prema pronalasku, koja u poklopcu 90 kasete ima pipete 88 i 89 sa kapilarnim vrhom, odnosno sa membranom na vrhu. Pipeta 89 sa membranom na vrhu ima kod svog zadnjeg kraja rezervoar 91 za tečne otpatke a kada je na svom mestu unutar poklopca 90 kasete rezervoar je zatvoren samozaptivnom gumenom zaptivkom 92. Kada treba da se dovede gas pod pritiskom u zadnji kraj pipete 89 sa membranom na vrhu, to se izvodi bušenjem zaptivke 93 šupljom iglom 93 povezanom sa uređajem za dovod gasa pod pritiskom (nije prikazan).

Na slici 23 prikazana je pipeta 94 sa kapilarnim vrhom koja se daje kao deo opitne kasete prema pronalasku. Korisniku se pipeta 94 isporučuje odvojivo umetnuta u jednu od komora, npr. kao pipeta 50 u komori 57 izvođenja prikazanog na slici 11. Na prednjem kraju 95 pipete 94 postavljena je jedna čaura 96 koja tesno naleže na kraj pipete i poravnana je sa samim vrhom kapilare. Gornja je ivica čaure 96 opremljena prirubnicom 97 koja se može izobličiti i koja se može proterati pored jedne odgovarajuće prirubnice u komori, tako da zabravi čauru u komori. U toku rada, pipeta sa kapilarnim vrhom vadi se iz kasete zajedno sa postavljenom prirubnicom 96, umoči se u tečan uzorak da uzme tečnost u kapilarni vrh, pa se vrati u komoru i pritisne da zabravi čauru u bušotini. Potom se kaseta može uneti u ispitni uređaj i u toku analize razdvajanje poklopca i tela kasete služi da odvoji čauru od kapilare.

Primer 1

Provera na C- reaktivni protein u serumu

Uzorci od 1 ju-L čovečije krvi, dopunjeni sa prečišćenim C-reaktivnim proteinom (CRP) do koncentracija u opsegu od 0 do 160 mg/1 stavljeni su komoru sa zaobljenim dnom unutrašnjeg prečnika 9 mm (u opitnoj kaseti jedna-koj kaseti sa slike 1) koja je sadržala 200 jaL vodenog rastvora tečnosti za razre-đivanje (30 mM boratnog pufera, pH 8,0 koji sadrži 0,02 mas/zapr natrijum citrata, 0,02 mas/zapr NaN3i deoksiholat).

Pipeta sa membranom na vrhu, spoljneg prečnika 7,2 mm, spušta se u komoru u kojoj se nalazi uzorak, pa se na otvoreni kraj pipete deluje sniženim pritiskom što izaziva protok sadržaja komore kroz membranu u pipetu. U ovom primeru membrana pipete je jedna nitrocelulozna pločica na kojoj je imobilisano jedno monoklonsko anti-CRP antitelo (pripremljeno konvencionalnom tehni-kom). Pipeta se potom vadi iz komore i spušta se u drugu komoru istog oblika koja sadrži 200ynLvodene disperzije zlatnih mikročestica (prosečan prečnik 4,5 nm, koncentracija (optička gustina na 540 nm) oko 3, što odgovara koncentraciji antitela od oko 50/xL u 50 mM boratnog pufera, pH 8,05, koji sadrži 20 mM NaCl, 0,05% mas/zapr NaN3i 0,1% mas/zapr BSA) konjugovan na konven-cionalan način na jedno monoklonsko anti-CRP antitelo. Opet se primenjuje sniženi pritisak na otvorenom kraju pipete što izaziva prolaz tečnosti iz komore u pipetu pri čemu se membrana zasiti zlatnim konjugatom.

Pipeta se potom vadi iz druge komore i spušta se u treću komoru, opet iste konfiguracije, koja sadrži 200yuLvodenog rastvora tečnosti za razređivanje (viđeti napred). Na otvoreni kraj pipete deluje se sniženim pritiskom kako bi se povukao reagens za ispiranje u pipetu. Na taj se način nevezani zlatni konjugat uklanja sa membrane.

Pipeta se potom vadi iz treće komore i postavlja u četvrtu praznu komoru, untrašnjeg prečnika veličine 9 mm, sa ravnim dnom. Za ovu analizu ta je četvrta komora komora za očitavanje. Membrana pipete se osvetli (na primer zelenom svetlošću od jedne svetleće diode) kroz providno telo sa komorama opitne kasete pa se svetlost od 540 nm odbijena od membrane detektuje pomoću jednog detektora (npr. digitalne kamere ili neke fotodiode).

Izvođenje analize zahteva oko 40 sekundi od dodavanja seruma do određivanja koeficijenta refleksije.

Primer 2

Ispitivanje sadržaja belančevine u humanom serumu u urinu

Iz čovečijeg je urina izvučena belančevina u čovečijem serumu (HSA) ultrafiltriranjem a potom je dopunjena prečišćenom HSA u koncentracijama između 0 i 200 mg/L.

Uzorak od 10llLurina prenet je u jednoj kapilari u jednu komoru sa okruglim dnom, unutrašnjeg prečnika 9 mm (u opitnu kasetu ekvivalentnu kaseti sa slike 1) koja je sadržala 200ju.Lvodenog rastvora natrijun fosfatnog pufera, pH 5,6, koji je sadržao 4,0% zapr. propan-l-ola, 0,05% zapr. NaN3. 0,003% mas/zapr Tropeolin-O i 0,5% mas/zapr BSA. Urin je pomešan sa razređivačkim poferom tako što je upumpavan i ispumpavan iz kapilare tri puta. Kapilara je uklonjena a pipeta sa membranom na vrhu spuštena je u komoru. Kod ove analize membrana je jedna nitrocelulozna pločica na kojoj je imobilisano jedno monoklonsko anti-HSA antitelo. Razređeni je uzorak usisan u pipetu kao u Primeru 1.

Pipeta je potom izvađena iz komore i spuštena u sledeću komor u koja ima istu konfiguraciju ali sadrži 200^tL disperzije konjugata zlatnih mikročestica-antitela (kao u Primeru 1 ali sa anti-HSA umesto sa anti-CRP antitelom, 50 mM boratnim puferom, pH 7,8, 0,05% zapr. NaN3i 0,2% mas/zapr BSA). Sadržaj komore je usisan u pipetu kao u Primeru 1 i kao u Primetru 1 pipeta je potom preneta u treću komoru (za pranje) pa u četvrtu komoru (za očitavanje). Kod ove je analize reagens za ispiranje PBS, pH 7,4.

Slika 7 priloženih crteža predstavlja dijagram doza-reagovanje za ovu analizu.

Primer 3

Provera na glikatovan hemoglobin u krvi

1/ sLkrvi sa svim sastojcima uzet je iz uzorka krvu koristeći kapilaru postavljenu na vrh jedne obrnute konične posude zapremine oko 500/uJL, tj. jedne levkaste naprave na čiji je gornji kraj priključen uređaj za dovod gasa pod pritiskom.

Kapilara se spušta u komoru sa zaobljenim dnom, unutrašnjeg prečnika 9 mm, u opitnoj kaseti (kako je opisano u prethodnim primerima) koja sadrži 200( jlLkonjugatskog rastvora borne kiseline.

Konjugatski rastvor sadrži 0,25 mM konjugata ksilen-cijanol borne kiseline (Primer 18 iz US-A-5631364), 0,07% mas/zapr Triton-a X-100, 9 mM cinkhlorida i 100 mM HEPES pufera, pH 8,15.

Uzorak krvi je ispumpan u komoru i pomešan sa rastvorom konjugata borne kiseline pumpanjem rastvora u koničnu posusdu i iz nje tri puta. Kapilara se uklanja a sadržaj komore se pušta da se inkubira dva minuta. To omogućuje detergentu da uništi krvne ćelije, cinku da istaloži hemoglobin a konjugatu borne kiseline da se veže za glikatovani hemoglobin.

Potom se pipeta sa membranom na vrhu spušta u komoru i sadržaj komore se dovodi na sniženi pritisak, tako da tečnost iz komore prelazi u pipetu a hemoglobin se zadržava na membrani. U ovoj analizi membrana je porozni filtar koji ima pore veličine 1 jam.

Pipeta se izvlači iz komore i stavlja u drugu komoru istog oblika koja sadrži 200 plL vodenog rastvora jednog reagensa za pranje (50 mM morfolinskog pufera, pH 9,4, koji sadrži 200 mM NaCl, 0,5% mas/zapr Triton-a X-100, 0,1% mas/zapr glicerola i 0,0% mas/zapr. NaN3). Pipeta se stavlja pod sniženi pritisak tako da se reagens za pranje i nevezan konjugat borne kiseline uvlače u pipetu.

Pipeta se potom vadi i spušta u praznu komoru za očitavanje, unutrašnjeg prečnika 9 mm, ravnog dna, u kaseti radi reflektometrijskog merenja hemoglobina zadržanog na membrani pipete. Ukupan se hemoglobin meri koristeći plavu svetlost na 460 nm a glikatovan hemoglobin koristeći crvenu svetlost na 620 nm (npr. koristeći crvene i plave svetleće diode). Odnos glikatovanog hemoglobina prema ukupnom hemoglobinu (ponekad označen kao %HblAc) određuje se od-nosom merenih reflektansi, kalibrisanih prema uzorcima sa poznatim %HblAc.

Slika 8 priloženih crteža prikazuje rezultate analize iz ovog primera za 6 uzoraka krvi analiziranih na %Hb2Ac 24 časa ranije korišćenjem IIPLC (Variant, BioRad).

Primer 4

Efikasnost sakupljanja tečnosti pipeta sa membranom na vrhu

Efikasnost sakupljanja tečnosti iz različitih komora ispitivana je za jednu pipetu sa ravnom nitroceluloznom membranom na vrhu kako je opisana u Primeru 1 poređenu sa jednom standardnom koničnim pipetom sa otvorenim vrhom. U svim je slučajevima trebalo izvući 200 ju,L tečnosti iz komore unutra-šnjeg prečnika 9 mm, sa ravnim ili zaobljenim dnom u mekom ili tvrdom plasti-čnom telu (LDPE i polistiren). Rezultati su prikazani u sledećoj tabeli 1.

Primer 5

Ispitivanje vremena koa<g>ulisanja krvi

Pipeta sa slike 5 korišćena je za uzimanje jednog uzorka krvi od oko 2/ jlL.Kaseta je potom ponovo sastavljena i pušten je gas pod pritiskom u pipetu kako bi se krv ubacila u komoru kasete, čije je dno obloženo jednim agensom za podsticanje koagulacije (npr. faktorom tkiva). Potom je primenjen sniženi pritisak da bi se uzorak ponovo usisao u pipetu, prošao kroz komoru u pipeti i dos-peo do sinusoidalne kapilare. Uzorak je potom šetan napred-nazad u sinusnoj kapilari primenom natpritiska i potpritiska, pa je pomoću digitalne kamere odre-đeno vreme od trenutka dodira uzorka krvi sa agensom za podsticanje koagulacije pa do stvarnog prestanka kretanja uzorka krvi. To obično traje oko 40 sek..

Primer 6

Ispitivanje vremena koagulisanja krvi sa svim sastojcima ili plazme

Koristi se opitna kaseta tipa prikazanog na slici 11. Jedna od komora 53 do 62 sadrži sušen faktor tkiva i kalcijum hlorid ili glukonat kao i jednu čeličnu lopticu, npr. prečnika 2 mm (videti sliku 19a).

Aparat u koji treba da se postavi kaseta opremljen je jednim grejačem za održavanje sadržaja kasete na oko 37°C i sa jednim magnetom radi pomeranja čelične kuglice duž dna komore u koju je stavljena.

U komori 57 nalazi se pomerljiva pipeta sa kapilarnim vrhom koja može uzeti jednu unapred određenu zapreminu uzorka, npr. 1 do 15/xL, najbolje 10/xL, krvi sa svim sastojcima, citrirane venske krvi, plazme ili citrirane plazme.

Uzorak se uzima pipetom sa kapilarnim vrhom koja se potom stavlja u kasetu koja se zatim stavlja u analitički aparat. Uzorak se potom prebacuje u komoru koja sadrži čeličnu kuglicu i meša.

Kaseta se potom pomera napred-nazad u odnosu na magnet a u horizon-talnom pravcu paraleno vrhu komore u kojoj se nalazi kuglica. (Može se pomerati kaseta kao celina ih se može pomerati magnet - bolje je, međutim, da se pomera kaseta a da magnet u početku služi da odražava čeličnu kuglicu nepokretnom.)

Digitalna se kamera koristi da prati položaj čelične kuglice. Kada smeša počinje da koaguliše, kuglica prestaje da bude nepokretna u odnosu na magnet a to kamera otkriva tako da se vreme koagulisanja (počev od kontakta uzorka sa rastvorom soli kalcijuma) može odrediti.

Kod jednog alternativnog, ali manje prihvatljivog izvođenja, magnet ispod kasete se izostavlja a kuglica se stavlja u komoru sa kosim dnom (npr. kako je prikazano na slici 19b). Naglo pomeranje kasete u smeru donjeg kraja dna, npr. mehaničkog udara ili aktiviranjem jednog elektromagneta na strani komore, izaziva pomeranje kuglice naviše uz nagnuto dno i, pre no što dođe do koagulacije, kuglica se vraća na donji kraj dna pod dejstvom sile teže.

Primer 7

Ispitivanje vremena koagulisanja krvi sa svim sastojcima ili plazme

Opitna kaseta kao što je ona iz primera 6 koristi se sa jednom kuglicom od polimera male gustine (npr. polistirenska kuglica prečnika 3-5 mm) umesto čelične kuglice. Ta se kuglica, najbolje, nalazi u komori okruglog poprečnog preseka sa ravnim ili zaobljenim dnom (videti sliku 19c).

Uzorak se uzima i meša kao u Primeru 6 a potom se stavlja u komoru koja sadrži kuglicu gde će kuglica ploviti na površini uzorka. Kuglica se više puta uzastopno potiskuje ispod površine uzorka i pušta da ponovo izroni na površinu. Kako se uzorak koaguliše, kuglica će se vraćati na površinu sve sporije a onda se više neće vraćati.

Kuglica se može gurati ispod površine pritiskom iz vrha pipete ili, alternativno, može se koristiti jedna magnetski pokretljiva kuglica a magnetno se polje može uključivati i isključivati da bi povuklo kuglica a onda je oslobađalo. Takve kuglice koje reaguju na magnet mogu se pripremati stavljanjem superparamag-netičkih kristala u polimernu kuglicu (npr, kao u magnetskim granulama koje prodaje Dynal Biotech, Oslo, Norveška).

Primer 8

Ispitivanje vremena koagulisanja plazme

Koristi se opitna kaseta slična onoj prikazanoj na slici 11. Kao i u Primeru 6, jedna od komora 59 do 62 sadrži jedan citratni pufer, druga sadrži fibrinogen i koagulacioni faktor V a treća rastvore neke soli kalcijuma. Komora 57 sadrži jednu pipetu sa kapilarnim vrhom dok komora 58 sadrži jedan filtarski nastavak kako je prikazano na slici 18.

Jedan se uzorak usisa u pipetu sa kapilarnim vrhom koja se potom stavi u komoru 57 pa se kaseta stavi u analitički aparat i potom zagreje na 37°C. Potom se uzorak prenosi u komoru koja sadrži pufer i meša. Celokupna mešavina, ili neki unapred određen njen deo potom se prenese u filtarski produžetak pipete i razblažena plazma bez ćelija pumpa se na dno komore. Unapred određena zapremina plazme bez ćelija se prenese u komoru koja sadrži hibrinogen koristeći sledeću pipetu sa kapilarnim vrtom, a ta sledeća pipeta takođe se koristi za prenošenje jedne unapred određene zapremine rastvora soli kalcijuma u komoru koja sadrži fibrinogen/plazmu da bi se inicirala reakcija koagulacije. Komora je osvetljena a koristi se jedna digitalna kamera da bi se zabeležila zamućenost mešavine u komori. Vreme od dodavanja kalcijuma do povećanja zamućenosti do jedne unapred definisane vrednosti smatra se kao vreme koagulacije.

Primer 9

Analiza koagulacije u krvi sa svim sastojcima ili u plazmi

Koristi se opitna kaseta kao što je ona prikazana na slici 11 i opisana u primeru 8. Kao i u primeru 8, jedna od komora 59 do 62 sadrži citriran pufer a druga rastvor soli kalcijuma, ali je komora sa kuglicom izostavljena a u mesto koagulacionog faktora V i fibrinogena, "reagenska" komora sadrži sušenu, trombinski specifičnu, hromogensku supstancu (npr. Nvcotest Chrom (opisali Janson et ah, Thrombostasis and Haemostasis 62: 530 (poster 1677) (1989) i Jonker et al, Research in Clinic and Laboratorv 20: 45-57 (1990) ili jednu od hromogenskih supstanci rasmatranih u DE-A-3I13350, DE-A-3413311, DE-A-3311287, US-A-4458015 ili US-A-4784944).

Uzorak se uzima i meša analogno proceduri u Primeru 7. Proces koagulacije dovodi do obrazovanja trombina a time i do oslobađanja neke boje iz hromogenske supstance (npr. žutog para-nitroanilina iz Nvcotest Chrom-a).

Primer10

Ispitivanje na C- reaktivni protein ( CRP) u krvi sa svim sastojcima korišćenjem

enzimskog konjugata ( ELISA)

Koristeći pipetu sa kapilarnim vrhom iz kasete, 1/xL krvi sa svim sastojcima doda se jednoj komori (na primer komori 59) jedne kasete slične onoj sa slike 11a koja sadrži 200/ xhjednog rastvora i tečnost za razaranje ćelija (30 mM boratnog pufera, pH 8,0, koji sadrži 0,01% mas/zapr natrijum citrata, 0,02% mas/zapr NaN3i deoksiholat). Komore kasete imaju pravougaoni poprečni presek unutrašnjih dimenzija 5,0 x 6,5 mm. Ravno dno komore nagnuto je pod 30° u odnosu na uzdužnu osu komore.

Pravougaona pipeta sa membranom na vrhu (spoljnih dimenzija 3,7 x 4,2 mm, opremljena nitroceluloznom membranom, obloženom jednim anti CRP antitelom, postavljenom pod 30° u odnosu na uzdužnu osu membranske cevi) spušta se u komoru i rastvor umrtvljenih krvnih ćelija apsorbuje se kroz membranu kada se primeni sniženi pritisak na unutrašnjost pipete sa membranom na vrhu. Kada je sva tečnost apsorbovana, primeni se natpritisak da bi se tečnost po drugi put proterala kroz membrabu i natrag u komoru. Dvostruko prolaženje rastvora CRP kroz membranu povećava efikasnost zadržavanja CRP.

Potom se pipeta sa membranom na vrhu pomera do slične komore (npr. komore 60) u kaseti koja sadrži jedan rastvor alkalne fosfataze (ALP) konjugo-vane na jedno anti CRP antitelo (približno 40/xg/ml ALP i 40 tig/ml antitela u 50 mM boratnom puferu, pH 8,0, koji sadrži 0,02% mas/zapr NaN3i 0,5% mas/zapr BSA). Konjugatski rastvor je apsorbovan kroz membranu i pumpan natrag u komoru primenom niza potpritiska i natpritiska unutar pipete sa membranom na vrhu a kako je napred opisano za hvatanje antigena.

U sledećem stepenu, pipeta sa membranom na vrhu pomera se u sledeću komoru (npr. u komoru 61) u kaseti koja sadrži 200/jJL rastvora za ispiranje (50 mM boratnog pufera, pH 8,0, koji sadrži 0,01% mas/zapr NaN3, 0,5% mas/zapr BSA i deoksiholat). Ovaj se stepen ispiranja ponavlja dva puta pomeranjem pipete sa membranom na vrhu u dve dodatne komore (nisu prikazane na slici 11 ali su ekvivalentne komori 61) koja takođe sadrži rastvor za ispiranje. Ukupno tri ciklusa ispiranja obezbeđuju uklanjanje nevezanog konjugata.

Najzad se pipeta sa membranom na vrhu pomera u sledeću komoru (npr. u komoru 62) koja sadrži 300[ jlLpara nitrofenil fosfata supstrata alkalne fosfataze (1,0 mg/ml pNPP u 1,0 M dietanolaminskom puferu, pH 9,6, koji sadrži 0,5 mM MgCl2i 0,025 % mas/zapr NaN3). Žuti proizvedeni enzim para-nitrofenol dobije je pumpanjem rastvora supstrata u i iz pipete sa membranom na vrhu u trajanju od dva minuta. Inkubacija se završava ispumpavanjem celoku-pne tečnosti natrag u komoru i vađenjem pipete sa membranom na vrhu iz rastvora supstrata. Korišćenjem 300 ju-L rastvora supstrata visina punjenja je oko 3 mm iznad vrha nagnutog dela komore što omogućuje da se boja meri kroz paralelne zidove komore.

Kada se pipeta sa membranom na vrhu podigne, apsorpcija svetlosti se meri koristeći jednu plavu svetleću diodu kao izvor svetlosti a digitalnu kameru za merenje propuštene svetlosti.

Primer 11

Ispitivanje na C- reaktivni protein ( CRP) u krvi sa svim sastojcima korišćenjem

merenia rasejavania svetlosti nagomilanih lateksnih zrnaca

Koristeći pipetu sa kapilarnim vrhom iz kasete, 2 llL krvi sa svim sastojcima dodano je u jednu komoru (npr. komoru 62) jedne kasete slične onoj prikazanoj na slici 11 a koja sadrži 120 nm lateksnih granula (0,2% mas/zapr) suspendovanih u 300 ;nL nM boratnog pufera, pH 8,0 koji sadrži 0,01% mas/zapr natrijum citrata, 0,02% mas/zapr NaN3i deoksiholat). Granule su obložene jednostavnom adsorpcijom sa anti CRP antitelima. Komora ima pravougaoni poprečni presek i nalazi se na kraju kasete kako bi se olašalo merenje rasejavanja svetlosti. Svetlost se usmerava na jedan bočni zid komore. Posle početne faze ubijanja ćelija koja traje oko 10 sekundi, povećanje rasejavanja svetlosti meri se pod uglom od 90° na upadnu svetlost. Povećanje rasejavanja svetlosti usled nagomilavanja posredstvom CRP lateksnih granula meri se digitalnom kamerom na talasnoj dužini od 425 nm.

Primer 12

Ispitivanje na belančevine u urinu korišćenjem ma<g>netnih<g>ranula. bojenih

lateksnih granula i reflektometrije

Koristeći pipetu sa kapilarnim vrhom iz kasete, 2fxhurina dodano je u jednu komoru (npr. komoru 62) jedne kasete slične onoj prikazanoj na slici 11a koja sadrži 1000 nm magnetnih polimernih granula (0,2% mas/zapr) i 1000 nm lateksnih granula (0,2% mas/zapr) suspendovanih u 300fiLnM boratnog pufera, pH 5,7 koji sadrži 0,5% mas/zapr BSA i 0,052% mas/zapr NaN3. Magnetne granule (npr. tipa koji se može pribaviti od Dynal Biotech, Oslo, Norveška) obložene su jednim antitelom koje reaguje sa jednom epitopom na molekulu belančevine različitom od epitope koju prepoznaje antitelo naneto na lateksne granule.

Posle 60 sekundi inkubacije, jedan se neodimijumski magnet (10x7x2 mm) pomera iz svog položaja mirovanja (20 nm od najbližeg zida komore) prema komori da bi se magnet doveo u neposredan dodir sa bočnim zidom komore. Magnet dodiruje zid naspram zakošenog zida i pokriva deo komore ispunjen tečnošću (200 jaL). Komora i postavljanje magneta šematski su prikazani na slici 20. U položaju je mirovanja magnetno polje koje deluje na magnetne granule suviše slabo da pomeri granule. Kada je u dodiru sa komorom, rastojanje od magneta do najbližeg i do najdaljeg unutrašnjeg zida komore je 0,8 mm i 6,3 mm. Na tom su odstojanju granule kvantitativno nagomilane na zidu posle 30 s. U prisustvu analita, plavi se lateks vezuje za magnetske čestice i reagovan deo lateksnih granula će se nagomilati na zidu, dok će nereagovane lateksne čestice ostati suspendovane.

Kada je magnet u položaju dodira, pipeta sa kapilarnim vrhom se koristi da usisa tečnost koja sadrži nereagovane čestice lateksa. Posle toga se magnet odvoji od komore u svoj položaj mirovanja.

Cev pipete sa kapilarnim vrhom pomera se u neku praznu komoru (npr. komoru 61) i tečnost se prazni u tu komoru dovođenjem pritiska iz okolne sredinu u unutrašnjost pipete.

Potom se pipeta sa kapilarnim vrhom pomera u sledeću komoru (npr. komoru 60) koja sadrži 500 u-L rastvora ua pranje (PBS, pH 7,4) i uzima 200 u.L. Pipeta sa kapilarnim vrhom se potom vraća do komore u kojoj se nalaze magnetne granule i granule se suspenduju upumpavanjem i ispumpavanjem rastvora za ispiranje u komoru, i to pet puta. Magnet se pomeri u položaj dodira i magnetske granule su puštene da se nagomilaju na zid komore. Posle 30 s rastvor za ispiranje se usisa natrag u pipetu sa kapilarnim vrhom. Potom se magnet pomeri natrag u svoj položaj mirovanja.

Pipeta sa kapilarnim vrhom se u sledećem stepenu pomera do komore koja sadrži prvo površinski aktivno sredstvo (komora 61) i prazni se u tu komoru.

Pipeta sa kapilarnim vrhom potom se pomera do komore koja sadrži rastvor za ispiranje (komora 60) i uzima 200/ jLrastvora.

Pipeta sa kapilarnim vrhom pomera se do komore koja sadrži magnetne granule (komora 65) pa se granule ponovo suspenduju upumpavanjem i ispumpavanjem rastvora za ispiranje ukupno pet puta.

Pipeta sa membranom na vrhu, opremljena jednom 0,45/ immikroporo-znom membranom, pomera se do komore koja sadrži suspendovane magnetne granule (komora 62) i granule se usisavanjem gomilaju na membrani.

Pipeta sa membranom na vrhu izvlači se iz komore 62 a plave lateksne čestice i žuto-mrke magnetne granule kvantifikuju se reflektometrijom koristeći crvenu svetleću diodu za plave lateksne granule i plavu svetleću diodu za magnetne granule. Količina apsorbovane crvene svetlosti prema količini apsorbovane plave svetlosi jeste mera udela plavog lateksa u smeši, a time i mera količine belančevine prisutne u uzorku.

Ista se kaseta može koristiti i za određivanje sadržaja kreatinina u urinu a time i odnos belančevina:kreatinin u uzorku urina. Belančevina u urinu indikator je funkcije bubrega a odnos belančevina:kreatinin može se koristiti za korigo-vanje povećanog mokrenja. Merenje odnosa belancevina:kreatinin opisano je, na primer, u US-A-5385847.

Kod ovog se izvođenja jedan deo uzorka urina meša sa jednim sredstvom za razblaživanje i jednim enzimom ili mešavinom enzima koja reaguje sa kreati-ninom da bi se generisao jedan obojeni analit koji se detektuje korišćenjem jedne digitalne kamere merenjem prolaza svetlosti kroz komoru koja sadrži urin, enzime i sredstvo za razblaživanje.

Claims (27)

1. Opitna kaseta (52, 53), naznačena time, što sadrži najmanje dve komore (57-62) i jednu pipetu (55) koja se može postavljati u najmanje dve komore, pri čemu ta pipeta ima zadnji kraj i prednji kraj (56), pri čemu je prednji kraj zatvoren jednom membranom koja propušta tečnost.

2. Opitna kaseta (52, 53), naznačena time, što sadrži najmanje jednu komoru (57-62) ijednu pipetu (50) koja se može postavljati u najmanje jednu komoru, pri čemu ta pipeta ima kapilarni vrh (95).

3. Opitna kaseta (52, 53) prema zahtevu 2, naznačena time, što je kapilarni vrh (95) opremljen jednom odvojivom čaurom (96).

4. Opitna kaseta (52, 53), naznačena time, što sadrži najmanje jednu komoru (57-62) ijednu pipetu (50) koja se može postavljati u najmanje jednu komoru, pri čemu bar jedna komora ima dva paralelna ravna bočna zida povezana jednim dnom (63) koje sadrži najmanje jednu ravnu površinu čija je normala koplanarna sa normalama na paralelne ravne površine pomenutih bočnih zidova, ali nije upravna na njih.

5. Opitna kaseta (52, 53) prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što se kaseta (52, 53) sastoji od pipete (50) sa kapilarnim vrhom i pipete (55) sa membranom

6. Opitna kaseta (52, 53) prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što kaseta (52, 53) sadrži pipetu (55) čiji je prednji kraj zatvoren jednom nagnutom membranom propustljivom za tečnost.

7. Opitna kaseta (52, 53) prema zahtevu 6, naznačena time, što membrana leži u jednoj ravni pod uglom od 20 do 40° u odnosu na osu pipete (55) na koju je postavljena.

8. Opitna kaseta (52, 53) prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što kaseta sadrži jednu pipetu (55) sa membranom na vrhu čiji je kraj sa membranom na vrhu pravougaonog poprečnog preseka.

9. Opitna kaseta (52, 53) prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što kaseta sadrži razdvojivo telo (53) i poklopac (52), pri čemu su komore raspoređene u telu, a poklopac je prilagođen da nosi pipetu.

10. Opitna kaseta (52, 53) prema zahtevu 9, naznačena time, što poklopac (52) ima elemente za držanje pipete sa kapilarnim vrhom.

11. Opitna kaseta (52, 53) prema jednom od zahteva 9 i 10, naznačena time, što je bar jedna od komora hermetički zatvorena na svom gornjem kraju jednim lomljivim zaptivnim elementom i što je poklopac (52) opremljen jednim sečivom (64) projektovanim da probije zaptivni element.

12. Opitna kaseta (52, 53) prema bilo kom od zahteva 9 do 11, naznačen time, što telo (53) ima jedan upijajući brisač (68) predviđen da izbriše spoljnu površinu jedne pipete sa kapilarnim vrhom koja se umeće u telo.

13. Opitna kaseta (52, 53) prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što pomenuta kaseta obuhvata jednu pipetu (55) sa membranom na vrhu čiji je zadnji kraj zatvoren jednom probojnom samozaptivnom membranom.

14. Opitna kaseta (52, 53) prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što su komore (57-62) u kaseti raspoređene linearno.

15. Opitna kaseta (52, 53) prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time, što bar jedna od komora sadrži neki opitni reagens.

16. Opitna kaseta (52, 53) prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što je dno bar jedne komore u kaseti u ravni i nije upravno na susedne bočne zidove komore.

17. Analitički uređaj, naznačen time, što obuhvata a) jedan držač (24) kasete prilagođen da prihvati opitnu kasetu (23) prema ma kom od zahteva 1 do 16, b) pogonsko sredstvo (25) koje može postavljati pipetu (6) kasete u izabrane komore kasete, c) uređaj (27) za dovod gasa pod pritiskom koji se može priključiti na pipetu kasete čime se izaziva protok tečnosti kroz pipetu, i d) detektor (32) zračenja koji može otkriti zračenje iz neke komore kasete ili iz pipete.

18. Analitički uređaj prema zahtevu 17, naznačen time, što detektor (32) zračenja obuhvata jednu digitalnu kameru.

19. Analitički uređaj prema jednom od zahteva 17 i 18, naznačen time, što dalje sadrži jedan izvor svetlosti postavljen da osvetljava kasetu.

20. Analitiči uređaj prema bilo kom od zahteva 17 do 19, naznačen time, što dalje sadrži jedan magnet (77).

21. Analitički uređaj prema bilo kom od zahteva 17 do 20, naznačen time, što dalje sadrži jedan grejač za zagrevanje kasete.

22. Analitički uređaj prema bilo kom od zahteva 17 do 21, naznačen time, što dalje sadrži jedan upravljački uređaj (35) koji reguliše izvođenje analiza na aparatu.

23. Analitički uređaj prema bilo kom od zahteva 17 do 22, naznačen time, što uređaj za dovod gasa pod pritiskom obuhvata jedan klip smešten u jedno cilindrično kućište i pogonski motor (28) priključen da pokreće klip.

24. Analitički aparat, naznačen time, što se sastoji od (i) analitičkog uređaja prema bilo kom od zahteva 17 do 23 i (ii) uklonjive opitne kasete (52, 53) prema bilo kom od zahteva 1 do 16, koja se u njega stavlja.

25. Primena aparata prema zahtevu 24 za proveru na neki analit u biološkom uzorku ili na svojstva biološkog uzorka.

26. Primena prema zahtevu 25 za ispitivanje vremena koagulacije u uzorku krvi ili u uzorku koji potiče od krvi.

27. Primena prema zahtevu 25 za ispitivanje na neki proteinski analit u uzorku krvi ili u uzorku koji potiče od krvi.