RS50275B

RS50275B - Derivati caloporosida, postupak za njihovu proizvodnju i njihova primena

Info

Publication number: RS50275B
Application number: YU67203A
Authority: RS
Inventors: Claudia Eder; Michael Kurz; Luigi Toti; Mark Brönstrup
Original assignee: Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh.,
Priority date: 2001-03-09
Filing date: 2002-02-23
Publication date: 2009-07-15
Also published as: PE20020895A1; PL363320A1; HK1061655A1; CN1499976A; US20020193316A1; ES2242011T3; AR035437A1; EP1372670B1; IL157793A0; NO329936B1; DE10111682A1; RU2282634C2; MXPA03007550A; NZ528070A; KR20030084973A; PT1372670E; BG108151A; CZ20032426A3; JP2004521137A; SK287405B6

Abstract

Jedinjenja formule I naznačena time, što u njoj znači: R1, R2 i R3, nezavisno jedan od drugog H ili acil - ostatak sa 1 do 10 C- atoma; i R4 H ili -C(O)(CH2)n COOH, gde je n jednako 1 do 7; sa izuzetkom da R1 R2, R3 i R4, ne znače svi H; kao i njihove fiziološki prihvatljive soli. Prijava sadrži još 15 patentnih zahteva.

Description

Derivati caloporosida, postupak za njihovu proizvodnju i njihova primena

Ovaj pronalazak se odnosi na nove aktivne supstance (derivate caloporosida), koje se stvaraju pomoću mikroorganizma Gloeoporas dichrous Bres. ST001714, DSM 13784, tokom fermentacije, na postupak za njihovu proizvodnju, na njihovu primenu kao medikamenta, na lekove koji sadrže derivate caloporosida kao i na sam mikroorganisam Gloeoporas dichrous Bres. ST001714, DSM 13784.

Caloporosid je prvi put opisan 1994 kao inhibitor tbsfolipaze C (W. Weber etal. J. Antibiotics, 47, 1188 - 1194). Iste godine izolovana su dva dalja slična sekundarna metabolita (R. Shan et al. Nat. Prod. Lett., 4, 171 - 178). Jedinjenja formule I (dole) koja su definisana ovim pronalaskom razlikuju se po svojoj strukturi od supstanci koje su tamo opisane.

Rak je jedna bolest ljudi i životinja koja nejčešće dovodi do smrti, a prouzrokovana je nekontrolisanim rastom sopstvenih ćelija tela. Rak je oznaka za stvaranje zloćudnih grizlica (malignoma), izraštaja (tumora odnosno carcinoma) ili za malignu degeneraciju, isto tako i za smetnje u sazrevanju belih krvnih zrnaca (leukemija, rak krvi). Ćelije raka ili tumora nastaju preobražajem sopstvenih ćelija organizma. Zloćudnost ćelija raka izražava se u autonomnosti rasta, to jest u njihovoj sposobnosti da infiltrirajući se rastu neometano i ne raspoređujući se po planu izgradnje organa i uz očtećenje tkiva. Siguran znak malignosti je stvaranje novih udaljenih staništa tumora (metastaza) posle širenja ćelija tumora po organizmu putem krvi ili limfe. Rak pripada najčešćim uzrocima smrti ljudi i stoga postoji velika potreba za metodama i sredstvima za lecenje i tretman malignih degeneracija.

Mogućnost neke terapije malignog tumora obuhvata pored - ako je moguće radikalnog - operativnog odstranjivanja tumora, radiološku terapiju sa rentgenskim zračenjem, a-, P-,"/-zračenje, imunoterapiju i hemoterapiju. Imunoterapija je sada primenljiva samo u ograničenoj meri. Pod hemiterapija tumora podrazumeva se davanje otrova za ćelije (eitostatici) u cilju tretmana tumora i preostalih ćelija tumora posle lokalne hiruške obrade ili zračenja. Ove supstance napadaju specifično u određenim procesima deobe ćelija, tako da tkiva sa velikim udelom ćelija koje se dele, kao što su brzo rastuća tkiva tumora, osetljivijereaguju. Za ovu primenu dolaze u obzir alkilirajuća jedinjenja, kao naprimer cvklophosphamiđ

(The Merck Inđex, 12. Ed. strana 463), antimetaboliti, kao što je methotrexat (The Merck Index, 12. Ed. strana 1025), alkaloidi, kao što je vincristin (The Merck Indes, 12. Ed, strana 1704) i antibiotici, kao što je daunomvcin (The Merck Index, 12. Ed. strana 479) isto tako i adriamvcin (The Merck Index, 12. Ed. strana 581 - 582). Međutim, sve ove supstance, zbog ogromnih sporednih dejstava, imaju velike nedostatke, tako da smrt obolelog može samo da se odloži, ali međutim ne može da se otkloni. Osim toga nastaju kod degenerisanih (rak-) ćelija rezistencije na primenjena sredstva. Sadašnji medikamenti ne deluju tada više citostatički, nego toksično što je posledica sporednih dejstava. Osim toga pokazalo se, da jedna kombinovana, odnosno sekvencijalna primena citostatika prevazilazi dejstvo pojedinačnog citostatika (mono terapija) i stoga je moguće, da se znatni sporedni efekti primenom polihemiterapije ne adiraju. Iz svih tih razloga potrebna su hitno nova sredstva za hemiterapiju i stoga se traže širom sveta.

Cvclin-zavisne kinaze (cvclin-dependent kinases = CDKs) imaju centralnu ulogu pri regulaciji ćelijskog ciklusa. One katališu reakcije fosforizacije i stavljaju samim tim u pokret jednu kaskadu reakcija, koja inicira u ćeliskom ciklusu prelaz od Gl-faze (faza rasta 1) u S-fazu (faza sinteze). Cvclin-zavisne kinaze predstavljaju stoga dobar terapeutski ciljni materijal za lečenje raka i drugih oboljenja sa nekim patološkim smetnjama proliferacije ćelija. Niskomolekulami inhibitori, koji regulišu ciklus ćelija i sprečavaju nekontrolisanu deobu ćelija, bili bi lekovite supstance od velike pomoći pri lečenju pacijenata koji imaju rak.

Neočekivano je pronađeno, da rod mikroorganizma Gloeoporas dichrous (Fr.: Fr. ) Bres. ST 001714, DSM 13784, je u stanju da stvara đeiotvome nove citostatike. koji u vrlo malim koncentracijama inhibiraju ciclin-zavisne kinaze.

Sledstveno tome predmet ovog pronalska su aktivne supstance (derivati caloporosida) koje stvara rod Gloeoporas dichrous (Fr.: Fr.) Bres. ST 001714, DSM 13784, kao i njihove fiziološki prihvatljive soli, estri i očevidni hemijski ekvivalenti

Ovaj pronalazak se odnosi samim tim na jedinjenja opšte formule I

pri Čemu označavaju

Ri, R2i R3, nezavisno jedan od drugog, H ili acil - ostatak sa 2 - 10 C- atoma, prvenstveno sa 2 do 6 atoma, naročito prioritetno sa 2 atoma; i R4H ili -C{0)(CH2)nCOOH, gde je n jednako 1 do 7, prvenstveno 1 do 3, naročito prioritetno 1 ili 2;

sa izuzetkom da Rl5R2, R3i R4, ne znače svi H;

kao i na njihove fiziološki prihvatljive soli.

Acil - ostaci jeđinjenja formule I mogu da budu linearni ili razgranati, zasićeni ili da budu sa jednom ili sa dve nezasićene veze.

Pod acil - ostatak sa 2 C- atoma podrazumeva se primera radi acetilni ostatak.

Primeri za acil - oatatke koji su zasićeni i nerazgranati su ostatak sirćetne kiseline (C = 2), ostatak propionske kiseline (C = 3), ostatak buterne kiseline (C = 4), ostatak valerijanske kiseline (C = 5), ostatak kapronske kiseline (C = 6), ostatak heptanske kiseline (C = 7), ostatak kaprilne kiseline (C = 8), ostatak pelargonske kiseline (C = 9) i ostatak kaprinske kiseline (C = 10).

Primeri za nerazgranate acil -ostatke sa jednom nezasićenom vezom su ostatak akrilne kiseline (C = 3), ostatak krotonske kiseline (C = 4) i ostatak vinil-sirćetne kiseline (C - 4).

Jedan primer za nerazgranati acil- ostatak sa dve nezasićene veze je ostatak sorbinske kiseline (C = 6).

Caloporosidi su antibiotici slabog dejstva, koji se sastoje od jedne salicilne kiseline i nekog disaharida. Obe strukturne jedinice su povezane preko jednog alkilnog lanca. Šećerni deo jedinjenja formule I može da bude jedan disaharid, koji se sastoji uvek od jedne D-piranoze neke aldoheksoze (kao naprimer jedne D-glukopiranoze ili jedne D-galaktopiranoze) i od on-kiseline neke aldoheksoze (naprimer od D-glukonske kiseline). Prioritet ima šećerni deo D-manopiranozil-D-manonska kiselina koja može da bude nesupstituisana ih supstituisana preko R2, R3i /ili R4kako je gore definisano.

Pronalazak se odnosi na ovo dalje

a) jedno jedinjenje formule I pri čemu je Ri = acetil; R2= R3= R4= H

(= caloporosiđ B: bruto formula: C38H620i6, molarna masa 774,9) kao i na

njegove fiziološki prihvatljive soli;

b) jedno jedinjenje formule I pri čemu je Rt= R3= acetil: R2= H; R, = malonil

(= caloporosiđ C: bruto formula: C^H^Om, molama masa 902,99) kao i na njegove fiziološki prihvatljive soli;

c) jedno jedinjenje formule I pri čemu je Rt= R2= H; R3= acetil; R4= malonil (= caloporosiđ D: bruto formula: C41H64O19, molama masa 806,96) kao i mi

njegove fiziološki prihvatljive soli;

d) jedno jedinjenje formule I pri čemu je Ri = R3= H; R2= acetil; R4= ma lonil (= caloporosiđ E: bruto formula: C41H64O19, molarna masa 806,96) kao i na

njegove fiziološki prihvatljive soli;

e) jedno jedinjenje formule I pri čemu je Ri= R2= R4= H; R3= acetil (= caloporosiđ F: bruto formula: C3gH62016, molama masa 774,9) kao i na

njegove fiziološki prihvatljive soli.

Centri hiralnosti u jedinjenjima formule I mogu, ako nije drugačije navedeno, da se nalaze u R- ili u S- konfiguraciji. Pronalazak se odnosi kako na optički Čista jeđinjenja tako isto i na smeše stereoizomera kao smeše enantiomera i smeše diasteromera.

Jeđinjenja formule I defmisana ovim pronalaskom mogu da se dobiju pri fermentaciji pomoću Gloeoporas dichrous (Fr.: Fr.) Bres. ST 001714, DSM 13784, ili negog od njegovog varijateta ili mutanata pod pogodnim uslovima u nekom medijumu kulture, sve dog se jedan ili više derivata caloposida formule I ne nakupe u medijumu kulture. Na kraju izolovanjem jeđinjenja i u đatom slučaju njegovim pievođenjem u hemijske ekvivalente, kao i u njegove fiziološki prihvatljive soli dobijaju se derivati caloporosida.

Ovaj pronalazak se stoga odnosi nadalje na postupak za proizvodnju nekog jeđinjenja formule I, naznačen time, što mikroorganizam Gloeoporas dichrous (Fr.: Fr.) Bres. ST 001714, DSM 13784, ili jedna od njegovih varijanti ili mutanata fermentira u pogodnim uslovima u nekom medijumu kulture, sve dok se jedno ili više željenih jeđinjenja ne nakupi u medijumu kulture i na kraju izoluje iz medijuma kulture i u datom slučaju se prevede u hemijske ekvivalente i/ili fiziološki prihvatljive soli.

Prioritetno fermentiše soj ST 001714, DSM 13784, njegovi mutanti i/ili varijante u nekom hranljivom rastvoru ili u čvrstom medijumu (označeni i kao medijum kulture) koji sadrži izvor ugljenika i izvor azota kao i uobičajene neorganske soli, sve dok se jeđinjenja đefinisana ovim pronalaskom ne nagomilaju u medijumu kulture, na kraju se jeđinjenja izoluju iz medijuma kulture i u đatom slučaju razdvoje u pojedinačne aktivne komponente.

Postupak definisan ovim pronalaskom može da se koristi za fermentaciju u laboratorijskom obimu ( zapremine u opsegu od mililitra do litre) i u industrijskom obimu (zapremina reda kubnog metra).

Soj mikroorganizma Gloeoporas dichrous (Fr.: Fr.) Bres. ST 001714 je razmnožen u jednoj pređkulturi. Jedan izolat je prema pravilima Budimpeštanskog ugovora đeponovan 14. Decembra 1999 u Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, D 3300 Braunschvveig, Deutschland, pod sledećim brojem: DSM 13784.

Gloeoporas dichrous (Fr.: Fr.) Bres. ST 001714, DSM 13784, ima belu micelu i spore purpurne boje. On uspeva prvenstveno na brezi, ali zaposeda i druge vrste naprimer jovu (alnus). vrbu (salis), topolu (populus), brest (ulmus) i prunus.

Umesto mikroorganizama soja Gloeoporas dichrous (Fr.: Fr.) Bres. ST 001714, DSM 13784, mogu se primeniti i njegovi mutanti i varijateti, koji sintetizuju jedno ili više jeđinjenja koja su đefinisana ovim pronalaskom. Takvi mutanti mogu đa se proizveđu na poznate načine primenom fizičkih sredstava, primera radi, primenom zračenja, kao što je sa ultravioletnim ili rentgenskim zračenjem, ili primenom hemijskih mutagena, kao primera radi primenom etiimetan-sulfonata (EMS), 2-hidroksi-4-metoksi-benzofenoria (MOB) ili N-metil-N'-nitro-N-nitrozogvanidina

(MNNG).

Postupak ispitivanja u pogledu mutanata i varijateta, koji sintetišu jedno ili više jeđinjenja definisanih ovim pronalaskom, odvija se po sleđećoj šemi: liofilizacija kultura na pločama;

ekstrakcija liofolizata primenom nekog organskog rastvarača;

ekstrakcija jeđinjenja iz filtrata kulture primenom čvrste faze;

analitika primenom HPLC, DC ili testiranjem biološke aktivnosti.

Uslovi fennentacije koji su nadalje opisani važe za Gloeoporas dichrous (Fr.: Fr.) Bres. ST 001714, za predati izolat DSM 13784 isto tako i za njihove mutante i varijatete.

U hranljivom rastvoru, koji sadrži neki izvor ugljenika i neki izvor azota kao i uobičajene neorganske soli, stvara Gloeoporas dichrous (Fr.: Fr.) Bres. ST 001714, DSM 13784, derivate caloporosida.

U svojstvu prioritetnih izvora ugljenika za aerobnu fermentaciju dolaze u obzir ugljeni hidrati i alkoholi iz šećera, koji se mogu lako asimilovati, kao što su glukoza, laktoza, saharoza ili D-manit, kao i prirodni produkti koji sadrže ugljene hidrate, kao naprimer ekstrakt slada. U svojstvu hranljivih supstanci koje sadrže azot dolaze u obzir: aminokiseline, peptidi i proteini, isto tako i njihovi produkti razgradnje, kao što su kazein, peptoni ili triptoni, dalje ekstrakti mesa, ekstrakti kvasca, samleveno semenje, primera radi od kukuruza, pšenice, pasulja. soje ili biljke pamuka, ostaci od destilacije pri proizvodnji alkohola, mesna brašna ili ekstrakti kvasca, ali i soli amonijaka i nitrati, ali naročito i peptidi koji su dobijeni putem sinteze odnosno biosinteze. Od neorganskih soli može hranljivi rastvor da sadrži primera radi hloride, karbonate, sulfate ili fosfate alkalnih metala ili zemnoalkalnih metala, gvožđa, cinka, kobalta i mangana .

Stvaranje jeđinjenja đefinisanih ovim pronalaskom odvija se naročito dobro u hranljivom rastvoru, koji sadrži otprilike 0,05 do 5 % prvenstveno od 1 do 2 % ekstrakta slada, oko 0,05 do 3 %, prvenstveno 0,05 do 1 % ekstrakta kvasca i 0,2 do 5 %, prvenstveno 0,5 đo 2 % glukoze, od 0,5 do 3 %, prvenstveno od 0,5 do 3 % sprašene celuloze i tragove amonijum-sulfata. Podaci u procentima su uvek obračunati na masu ukupnog hranljivog rastvora,

U tom hranljivom rastvoru stvara Gloeoporas dichrous (Fr.: Fr.) Bres. ST 001714, DSM 13784, jednu smešu derivata caloporosida. U zavisnosti od sastava hranljivog rastvora može da varira maseni uđeo jednog ili više derivata caloporosida, koji su đefinisani ovim pronalaskom. Osim toga moguće je da se preko sastava medijuma usmerava sinteza pojedinih derivata caloporosida, tako da mikroorganizam neki derivat caloporosida uopšte ne proizvede ili proizvede u nekoj količini ispod granice detekcije.

Gajenje mikroorganizma odvija se aerobno, dakle primera radi potopljenog u kolbenu ili fermentatoru uz mućkanje ili mešanje, u đatom slučaju uz uvođenje vazduha ili kiseonika, ali i na čvrstom medijumu.. Može da se izvodi u temperaturnom opsegu od oko 18 °C đo 35 °C, prvenstveno pri temperaturi oko 20 °C đo 30 °C, naročito pri 25 °C do 30 °C. Opseg pH vređnosti trebalo bi da se nalazi između 5 i 8, prvenstveno između 5,5 i 6,5. Vrši se gajenje mikroorganizma pod ovim uslovima uopšteno u trajanju od 24 đo 720 sati, prvenstveno tokom 288 do 576 sati.

Prevashodno se vrši gajenje u više stupnjeva, tj. proizvede se najpre jedna ili više pređkultura u nekom tečnom hranljivom medijumu za kulturu, koja se onda ponovo zaseje u pravom produkcionom medijumu, glavna kultura, primera radi u zapreminskom odnosu 1 : 10. Pređkultura se dobija, naprimer, kada se jedna micela zaseje u nekom hranljivom rastvoru i ostavi se da raste tokom vremena od oko 36 do 120 sati, prvenstveno tokom 48 đo 72 sata. Micela se može dobiti primera radi, ako se pusti da soj raste tokom otprilike 3 do 40 dana, prvenstveno tokom 10 do 30 dana na nekoj čvrstoj ili u tečnoj hranljivoj podlozi, primera radi kao što je slad-kvasac-agar ili krompir-đekstroza-agar.

Odvijanje fermentacije može da se nadgleda preko pH - vrednosti kulture ili preko zapremine micele, ali i pomoću hromatografških metoda, kao što je naprimer visoko rezolutna tečna hromatografija (HPLC) ili ispitivanjem biološke aktivnosti.

Postupak izolovanja koji je nadalje opisan služi za prečišćavanje derivata caloporosida, koji su definisani prema ovom pronalasku.

Izolovanje odnosno prečišćavanje derivata caloporosida, koji su definisani prema ovom pronalasku, iz medijuma za kulturu odvija se po poznatim metodama pri čemu se uzimaju u obzir hemijska, fizička i biološka svojstva prirodnih supstanci. U cilju ispitivanja koncentracije svakog derivata caloporosida u medijumu za kulturu ili u pojedinačnim stupnjevima izolovanja može da se koristi HPLC, pri tome se količina stvorene supstance upoređuje svrsishodno sa nekim bažđamim rastvorom.

U cilju izdvajanja jeđinjenja, koja su đefinisana prema ovom pronalasku, izvrši se hofilizacija fermentacione tečhosti ili kulture zajedno sa čvrstim medijumom, na kraju se izvrši ekstrakcija derivata caloporosida iz liofilizata primenom nekog organskog rastvarača koji može da se meša sa vodom. Organska faza rastvarača sadrži prirodne supstance definisane ovim pronalaskom, zatim se vrši njeno koncentrisanje u vakuumu i dalje prečišćavanje.

Dalje prečišćavanje jednog ili više jeđinjenja, koja su đefinisana prema ovom pronalasku, odvija se primenom hromatografije na pogodnim materijalima, prvenstveno naprimer na molekulskim sitima, na silikagelu, na aluminijum-oksidu, na jonskim izmenjivačima ili na adsorpcionim smolama odnosno korišćenjem reversnih faza (reversed phase, RP). Pomoću ovih hromatografških postupaka razdvajaju se derivati caloporosida. Hromatografija derivata caloporosida odvija se primenom puferovanih vodenih rastvora ili korišćenjem smeša vodenih i organskih rastvora.

Pod smeša vodenih ili organskih rastvora podrazumeva se svaki organski rastvarao koji može da se meša sa vodom, prvenstveno metanol, propanol i acetonitril, u nekoj koncentraciji od 5 % do 80 % rastvarača, prvenstveno od 20 % đo 50 % rastvarača ali isto tako svi puferni vodeni rastvori, koji mogu da se mesaju sa organskim rastvaračima. Puferi, koji mogu da se koriste, su isti kao što su gore navedeni.

Razdvajanje derivata caloporosida na osnovu njihove različite polarnosti odvija se pomoću Reversed Phase Chromatograpie, primera radi na MCI® (ađsorpciona smola od Mitsubishi, Japan) ili na Amberlite XAD® (TOSOHAAS), na drugim hidrofobnim materijalima, kao naprimer na RP-8- ili RP-18-fazama. Osim toga može razdvajanje da se vrši pomoću normalne fazne hromatograflje, naprimer na silika gelu, na aluminijum-oksidu i na sličnim supstancama.

Hromatografija derivata caloporosida izvodi se sa pufernim ili zakišeljenim vodenim rastvorima ili sa smešama vodenih rastvora sa alkoholima ili sa drugim organskim rastvaračima, koji mogu da se mešaju sa vodom. U svojstvu organskog rastvarača koriste se prvenstveno propanol i acetonitril.

Pod puferni ili zakišeljeni vođeni rastvori podrazumeva ju se naprimer voda, fosfatni pufer, amonijum-acetat, citratni pufer u nekoj koncentraciji od 0 do 0,5 M kao i mravlja kiselina, sirćetna kiselina, trifluor-sirćetna kiselina, ali i sve trgovački uobičajene kiseline, koje stručnjak poznaje, prv enstveno u nekoj koncentraciji od 0 do 1 %. Od pufernih vodenih rastvora posebno se ceni 0,1 % amonijum-acetat.

Hromatografija se izvodi primenom jednog gradijenta, koji počinje sa 100 % vodom i završava se sa 100 % rastvaračem, prvenstveno se radi sa linearnim gradijentom od 20 % do 100 % propanola ili acetonitrila.

Alternativno može da se izvrši i gel-hromaotgrafija ili hromatografija na hidrofobnim fazama.

Gel-hromatografija se izvodi na poliakrilamiđnom gelu ili gelima mešanih polimera, kao što je naprimer Biogel-P 2® (Fa. Biorad) ili Fractogel TSK HW 40® (Fa. Merck, Deutschland ili Toso Haas, USA).

Redosled napred navedenih hromatografija može da se preokrene.

Jeđinjenja, koja su đefinisana prema ovom pronalasku, su stabilna u čvrstom stanju i u rastvorima u opsegu vrednosti pH između 3 i 8, naročito između 5 i 7, i mogu samim tim đa se prerađuju u uobičajene galenske preparate.

Jedno ili više jeđinjenja od jeđinjenja definisanih ovim pronalaskom pogodna su na osnovu svojih cenjenih farmakoloških osobina za primenu u svojstvu medikamenta u humanoj ili veterinarskoj medicini.

Ovaj pronalazak se odnosi samim tim na primenu jeđinjenja formule I ili na primenu neke njegove fiziološki prihvatljive soli za proizvodnju jednog citostatika za lečenje obolelih sa tumorima.

Ovaj pronalazak se odnosi nadalje na sve očigledne hemijske ekvivalente jeđinjenja Formule I koja su đefinisana ovim pronalaskom. Takvi ekvivalenti su jeđinjenja koja se neznatno hemijski razlikuju, dakle koji imaju isto dejstvo ili pri blagim uslovima mogu da budu prevedeni u jeđinjenja đefinisana ovim pronalaskom. U navedene ekvivalente spadaju naprimer i soli, redukcioni produkti, estar, etar, acetali ili amidi jeđinjenja definisanih ovim pronalaskom, kao i ekvivalenti koje može stručnjak da proizvede primenom standardnih metoda, nadalje svi optički antipodi, diastereomeri i svi stereomemi oblici.

Pod fiziološki prihvatljive soli jeđinjenja formule I podrazumevaju se kako njihove organske tako isto i njihove neorganske soli, kako su one opisane u "Remingtaf s Pharmaceutical Sciences" (17. izdanje, strana 418 (1985)). Na osnovu fizičke i hemijske stabilnosti i rastvorljivosti su cenjene za kisele grupe između ostalog natrijum-, kalijum-, kalcijum- i amonijum- soli; za bazne grupe cenjene su između ostalog soli hlorovodonične kiseline, sumporne kiseline, fosforne kiseline ili kartonskih kiselina, kao naprimer sirćetne kiseline, limunske kiseline, benzoeve kiseline, maleinske kiseline, fumame kiseline, vinske kiseline i p-toluolsulfonske kiseline.

Esbri, etri i acetali mogu đa budu proizvedeni po postupcima koji su opisani u literaturi, naprimer u "Advanced Organic Svnthesis", 4<th>Edition, J. March, John Wiley & Sons, 1992 ili u "Protective Groups in Organic Svnthesis" 3<rd>Edition, T. W. Greene & P. G. M. Wuts, John Wiley & Sons, 1999.

Karboksilna grupa može, primera radi, da bude redukovana u alkohol pomoću LiALH*.

Od jeđinjenja formule I može najpre da bude odcepljen glikozidni deo primenom alkalne hidrolize (W. Weber et al. J. Antibiotics, 47, 1188 - 1194). Zatim mogu primenom glikozilacije (naprimer Koenigs - Knon"- reakcija) da se uvedu bilo koji ostaci šećera. Odgovarajuće metode su opisane u literaturi naprimer u "Carbohvdrate Chemistrv", J. F. Kennedv, Osfbrd University Press, 1988.

Mehanizam delovanja derivata caloporosida je nepoznat, međutim mogao je da bude dokazan njihov značajan efekat.

U cilju dokazivanja inhibitora na CDKs koristi se jedan test, pri kojem se meria brzina fosforizacije specifičnog p<q>3tidnog substrata primenom cyclin - zavisnih kinaza. Cvclin - zavisne kina ze aktiviraju se vezivanjem na svaki cvclin. [y-P]-ATP prenosi pomoću enzima [y-P]-fbsfat na supstrat peptida. Test se izvodi u mikrotitarskoj ploči sa 96 udubljenja (96-well). Određuje se radioaktivnost [ j- P}-fosfata koji je prenet na substrat.

Vrednosti IC50za derivate caloporosida navedene su u tabeli 1; to je koncentracija pri kojoj dolazi do inaktivacije CDK-4 na 50 %.

Dalje se ovaj pronalazak odnosi na lek koji sadrži neku količinu najmanje od jednog jeđinjenja definisanog ovim pronalaskom.

Jedno ili više jeđinjenja od derivata caloporosida, koji su definisani ovim pronalaskom, mogu u osnovi kao takva supstanca da budu davani pacijentu. Prioritetna je primena u smeši sa pogodnim pomoćnim supstancama ili nosačem. U svojstvu nosača mogu u lekovima da se primene uobičajeni farmakološki prilivatljivi materijali za nosače tiili pomoćna sredstva.

Lekovi definisani ovim pronalaskom se generalno doziraju orakio ili parenteralno, ali isto tako i rektalna primena je principijelno moguća. Podesni čvrsti ili tečni oblici galenskih preparata su, primera radi, granulati, prašak, tablete, đražeje, (mikro-)kapsule, čepići, sirupi, emulzije, suspenzije, aerosoli, kapi ili rastvori u ampulama koji se mogu dati preko injekcija, kao i preparati sa produženim oslobađanjem aktivne supstance, pri čijoj proizvodnji nalaze primenu uobičajeni nosači i ađitivi i/ili pomoćna sredstva kao što su sredstva za rasprskavanje, za vezivanje, za prevlake, za bubrenje, klizna sredstva ili sredstva za podmazivanje, sredstva za poboljšanje ukusa, zaslađivači ili posrednički rastvarači. Kao najčešće upotrebljavani nosači i pomoćna sredstva trebalo bi da budu napomenuti naprimer magnezijum-karbonat, titan-dioksid, laktoza, manit i drugi šećeri, talk, mlečne belančevine, želatin, škrob, vitamini, celuloza i njeni derivati, životinjska ili biljna ulja, polietilenglikoli i rastvarači, kao što su otprilike sterilna voda, alkoholi, ghcerin i viševalentni alkoholi.

U datom slučaju mogu jedinice za doziranje za oralno davanje da budu mikrokapsulirane, kako bi se oslobađanje odgodilo ili produžilo tokom dužeg vremenskog perioda, kao primera radi prevlačenjem ili ugradnjom aktivne supstance u obliku čestica u podesan polimer, vosak ili tome slično.

Prvenstveno se farmaceutski preparati proizvode u pojedinačnim dozama i tako daju obolelom, pri čemu svaka jedinica sadrži kao aktivnu komponentu jednu određenu dozu jednog ili više jeđinjenja derivata caloporosida, definisanih po ovom pronalasku. Kod čvrstih jedinica za doziranje, kao što su tablete, kapsule i supozitoriji može ova doza da iznosi oko 500 mg, prvenstveno međutim oko 0,1 mg đo 200 mg, i kod rastvora u ampulama za injekciono davanje sve đo oko 200 mg, ali prevashođno oko 0,5 mg do 100 mg, na dan.

Dnevna doza koja treba da se uzme zavisi od telesne mase, starosti, pola i stanja sisara. Pod određenim uslovima mogu međutim da se uzimaju veće ili manje dnevne doze. Doziranje dnevne doze može da se odvija kako uzimanjem odjednom u vidu pojedinačne jedinične doze ili u vidu više manjih jediničnih doza, ali i višekratnim uzimanjem podeljene doze u određenim vremenskim intervalima.

Lekovi, koji su definisani ovim pronalaskom, proizvode se na taj način, što se jedno ili više jeđinjenja definisanih ovim pronalaskom zajedno sa uobičajenim nosačem kao i sa u ovom slučaju dodacima i/ili pomoćnim sredstvima oblikuju u neki pogodan oblik za određeno doziranje.

U sleđećim navedenim primerima ovaj pronalazak je šire objašnjen.

Podaci navedeni u procentima odnose se na masu. Odnosi u smešama kod tečnosti odnose se na zapreminu, ako nije drugačije naznačeno.

Primeri

Primer 1: Proizvodnja jedne glicerinske kulture mikroorganizma Gloeoporas

dichrous (Fr.: Fr.)Bres. ST001714, DSM 13784

100 mL hranljivog rastvora (ekstrakt slada 2,0 %, ekstrakt kvasca 0,2 %, glukoza 1,0 %, (NH4)2HP040,05 %, pH 6) u jednom sterilnom erlenmajerovom sudu zapremine 300 mL se zaseje sa sojem Gloeoporas dichrous (Fr.: Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784, i ivrši se inkubacija tokom 7 dana pri temperaturi od 25 °C i 140 obrta/min na rotirajućoj mućkalici. 1,5 mL ove kulture se na kraju razblaži sa 2,5 mL 80 % glicerina i čuva se pri temperaturi ođ -135 °C.

Primer 2: Proizvodnja u erlenmajerovom sudu jedne predkulture mikroorganizma

Gloeoporas dichrous (Fr.: Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784

30 mL hranljivog rastvora (ekstrakt slađa 2,0 %, ekstrakt kvasca 0,2 %, glukoza 1,0 %, (NFL,)2HP040,05 %, pH 6) u jednom sterilnom erlenmajerovom sudu zapremine 100 mL se zaseje sa sojem Gloeoporas dichrous (Fr.: Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784, ivrši se inkubacija tokom 4 dana pri temperaturi ođ 25 °C i 140 obrta/min na rotirajućoj mućkalici. Najzad su uvek sa po 2 mL ove predkulture zasejane ploče pri proizvodnji glavne kulture.

Primer 3: Proizvodnja na čvrstim medij umskim pločama glavne kulture

Gloeoporas dichrous (Fr.: Fr.) Bres. ST001714,DSM 13784.

Sterilne ploče 25 x 25 cm (Fa. Nunc) prelivene su sa 200 mL sledećeg hranljivog rastvora 20 g/L ekstrakta slada, 2 g/L ekstrakta kvasca, 10 g/L glukoze, i 0,5 g/L (NH4)2HP04, pH 6. Ove ploče su zasejane uvek sa 2 mL jedne predkulture. Maksima lana proizvodnja jednog ili više jeđinjenja definisanih ovim pronalasom je postignuta posle oko 480 sati.

Primer 4: Proizvodnja derivata caloporosida

Proizvedeno je 50 ploča 25 x 25 cm i zasejano je sa pređkulturom:

Hranljivi rastvor:

20 g/L ekstrakta slađa

2 g/L ekstrakta kvasca

10 g/L glukoze

0,5g/L(NH4)2HPO4

pH 6 (pre sterilizacije)

vreme inkubacije: 480 sati

temperatura tokom inkubacije: 25 °C

Primer 5: Odvajanje derivata caloporosida iz kultura na pločama od

Gloeoporus dichrous (Fr.: Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784

Posle završene fermentacije pomoću Gloeoporus dichrous (Fr.:Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784, izvrši se liofilizacija kulture na pločam, koje su dobijene prema primeru 3, i zatim izvrši ekstrakcija liofilizata sa 5 litara metanola. Metanolni rastvor, koji sadrži aktivne supstance, oslobodi se od ostatka primenom flltraeije i koncentriše se u vakuumu. Koncentrat se razblaži sa vodom i nanese se na jednu pređhođno pripemljeno punjenje kolone ođ 1,0 litra MCI GEL, CHP20P. Eluira se uz gradijent polazeći ođ vođe ka 100 % acetonitrilu. Rastvor koji protiče kroz kolonu (25 mL po minutu) se fiakciono hvata (uvek po 25 mL) i frakcije koje sadrže derivate caloporosida (od 40 % do 100 % acetonitrila) se spoje. Koncentrovanje u vakuumu na kraju liofilizacija daju 8,5 g praha žuto-braon boje.

Primer 6: Predhodno razdvajanje derivata caloporosida korišćenjem

RP18 - hromatografije

0,5 g produkta, koji je dobijen prema primeru 4, nanese se na jedno punjenje Nucleosil<®>100-7 C18 HD hromatografske kolone (veličina: 40 mm x 250 mm). Eluira se sa gradijentom od 20 % acetonitrila (+ voda sa dodatkom 0,1 % amonijum-acetata) ka 100 % acetonitril korišćenjem protoka od 35 mL po minutu. Rastvor koji ističe iz kolone se frakciono hvata (35 mL). Uglavnom u frakcijama 39 do 68 nalaze se derivati caloporosida. Oni se sakupe, u vakuumu se oslobode od rastvarača i na kraju liofilizuju. Pri tome su dobijeni galoporosid B (22,4 mg) i F (10,5 mg ) čisti već > 95 %. Caloposid C (frakcija 41; 43,4 mg), D (frakcija 43 - 45; 76,2 mg) i E (frakcija 43 - 45 ; 76,2 mg) dobijene su sa čistoćom od oko 70 % i stoga su još dalje pročišćavane primenom hromatografije.

Primer 7: Prečišćavanje caloporosida C, D i E.

20 mg caloporosida C izolovanog i obogaćenog prema primeru 5 nanese se na jednu kolonu LUNA 5p. Cl8(2) (veličina: 10 mm x 250 mm) i uradi se hromatografija sa gradijentom od 25 do 35 % acetonitrila u 0,1 % amonijum-acetat/vođa. Protok eluenta iznosi 6,5 mL po minutu, zapremina frakcija 6,5 mL. U frakcijama 35 đo 42 nalazi se caloporosiđ C. Liofilizacija navedenih frakcija daje caloporosiđ C čistoće > 95%(7,5 mg). 25 mg smeše caloporosida D i E izolovane i obogaćene prema primeru 5 nanosi se na jednu kolonu LUNA"' 5u, C18(2) (veličina: 10 mm x 250 mm) i uradi se hromatografija sa giadijentom ođ 30 do 40 % acetonitrila u 0,1 % amonijum-acetat/voda. Protok eluenta iznosi 6,5 mL po minutu, zapremina frakcija 6,5 mL. U frakcijama 18 i 19 nalazi se caloporosiđ D, u frakcijama 20 i 21 caloporosiđ E.. Liofilizacija navedenih frakcija daje caloporosiđ D čistoće > 95 % (7,0 mg) i caloporosiđ E (6,0 mg).

Fizičke i hemijske kao i spektroskopske karakteristike substanci koje su definisane ovim pronalaskom prikazane su sažeto kako sledi:

Caloporosiđ B:

Bruto formula: CsgHsiO^

Molekulska masa: 774,9

UV - maksimumi: 208,244,310

<l>H- i<13>C-NMR: viđeti Tabelu 2

Visokorezolutni FAB maseni spektar pokazuje jedan intenzivan MH<+>pri m/z 775,4120 Da, što je u dobroj saglasnosti sa izračunatom masom ( za C^ sHetOu, mono-izotopski) od 775,4116 Da.

Caloporosiđ C:

Bruto formula: CuFIećO^o

Molekulska masa: 902,99

UV - maksimumi: 208,244,310

*H- i<13>C-NMR: viđeti Tabelu 3

Visokorezolutni FAB maseni spektar pokazuje jedan intenzivan M+H<4>pri m/z 903,4264 Da, što je u dobroj saglasnosti sa izračunatom masom ( za C36H71O25, mono-izotopski) od 903,4284 Da.

Caloporosiđ D:

Bruto formu la: C4i 019

Molekulska masa: 860,96

LIV - maksimumi: 208, 244, 310

<1>H- i<13>C-NMR; videti Tabelu 4

Visokorezolutni FAB maseni spektar pokazuje jedan intenzivan M+Na^ pri m/z 883,3942 Da, što je u dobroj saglasnosti sa izračunatom masom ( za GnH^OuNa, mono-izotopski) ođ 883,3939 Da.

Caloporosiđ E:

Bruto formula: C41H64O19

Molekulska masa: 860,96

UV - maksimumi: 208,244,310

<!>H- i<13>C-NMR: viđeti Tabelu 4

Visokorezolutni FAB maseni spektar pokazuje jedan intenzivan M+Na<+>pri m/z 883,3942 Da, što je u dobroj saglasnosti sa izračunatom masom (za C^F^OigNa, mono-izotopski) od 883,3939 Da.

Caloporosiđ F:

Bruto formula: CjsFL^Ok;

Molekulska masa: 774,9

UV - maksimumi: 208,244, 310

<1>H- i<13>C-NMR: viđeti Tabelu 5

Visokorezolutni FAB maseni spektar pokazuje jedan intenzivan M+H<*>pri m/z 775,4128 Da, što je u dobroj saglasnosti sa izračunatom masom ( za C^grl^O^, mono-izotopski) od 775,4116 Da.

Primer 8: Biološka istraživanjana uticaja inhibitora na CDK-4

U cilju određivanja IC50-vrednosti proizvedeni su od prirodnih supstanci, koje su definisane ovim pronalaskom, osnovni rastvori u jednoj koncentraciji od 10 mM. Ploče sa 384 udubljenja (384-well) prekriju se u toku 2 sata slojem ođ 50 u-L ( 50 p-g/udubljenju) biotiniranog peptidnog substrata pri sobnoj temperaturi i zatim se 3 x peru sa PBS puferom. Za reakciju se pipetira na ploče 30 uX rastvora derivata caloporosida koji je razblažen sa puferom, i 20 u,L jednog predhodno izmešanog ras<p>ora ATP/cyclinD 1/CDK4 ( koncentracija na kraju: 1 u,Ci 33P-y-ATP, 2 uM ATP i lu,g smeše enzima). Posle izvođenja reakcije u trajanju ođ 2 sata pri temperaturi 37 °C operu se ploče 3 x uvek sa 80 u.L 3 % fosforne kiseline i na kraju vrši se merenje u jednom MicroBeta Counter-u tokom 30 sekundi. Određivanje inhibiranja izraženog u procentima sledi uz pomoć matematičkih jeđnačina. U cilju određivanja IC50- vrednosti testirano je 10 koncentracija nekog sveže razblaženog DMSO - rastvora substance koja je đefinisana ovim pronalaskom.

Claims

1, Jeđinjenja formule I naznačena time, što u njoj znači: Ri, R2i R3, nezavisno jedan ođ drugog H ili acil - ostatak sa 1 do 10 C- atoma; i R4H ili -C(0)(CH2)nCOOH, gdeje n jednako 1 do 7; sa izuzetkom da Rj, R2, R3i R4, ne znače svi H; kao i njihove fiziološki prihvatljive soli. _J -f 4 5 %

2. Jedinjenje formule I đefinisano prema zahtevu 1, naznačeno time, što u njemu označava: Rx, R2i R3, nezavisno jedan od drugog H ili acetil; i R4H ili malonil (n =1); kao i fiziološki prihvatljive soli tog jeđinjenja.

3. Jedinjenje formule I đefinisano prema zahtevu 1 ili2,naznačeno time, što u njemu znače: Ri acetil: i R2?R3iR4H; kao i fiziološki prihvatljive soli tog jeđinjenja.

4. Jedinjenje formule I đefinisano prema zahtevu 1 ili 2, naznačeno time, što u njemu znače: Rii R3 acetil; R2H;i R4malonil; kao i fiziološki prihvatljive soli tog jeđinjenja.

5. Jedinjenje formule I đefinisano prema zahtevu 1 ili 2, naznačeno time, što u njemu znače: RiiR2H; R3acetil; i R4malonil; kao i fiziološki prihvatljive soli tog jeđinjenja.

6. Jedinjenje formule I đefinisano prema zahtevu 1 ili 2, naznačeno time, što u njemu znače: RiiR3H; R2acetil; i R4malonil; kao i fiziološki prihvatljive soli tog jeđinjenja.

7. Jedinjenje formule I đefinisano prema zahtevu 1 ili 2, naznačeno time, što u njemu znače: Ri, R2 i R4 H;i R3acetil; kao i fiziološki prihvatljive soli tog jeđinjenja.

8. Jedinjenje formule I ili neka fiziološki prihvatljiva so tog jeđinjenja, prema jednom ih više zahteva 1-7, naznačeno time, što može da se proizvede dok se pomoću mikroorganizma Gloeoporus dichrous (Fr.: Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784, odnosno nekog od njegovih varijeteta ili mutanata vrši fermentacija pod podesnim uslovima, izoluje se jedno ili više derivata caloporosida i ovi prevedu u datom slučaju u fiziološki prihvatljive soli.

9. Postupak za proizvodnju nekog jeđinjenja formule 1 ili neke njegove fiziološki prihvatljive soli prema zahtevima 1-7, naznačen time, što fermentira mikroorganizam Gloeoporus dichrous (Fr.: Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784, odnosno neki od njegovih varijeteta ili mutanata pod podesnim uslovima, izdvoji se jedno ili više derivata caloporosida i ovi prevedu u datom slučaju u fiziološki prihvatljive soli.

10. Postupak đefinisan prema zahtevu 9, naznačen time, što se izvodi fermentacija u aerobnim uslovima pri nekoj temperaturi u opsegu između 18 i 35 °C i pri nekoj vrednosti pH između 5 i 8.

11. Jedinjenje formule I ili neka fiziološki prihvatljiva so tog jeđinjenja, koje je đefinisano prema jednom ili više zahteva 1 - 8, za primenu u svojstvu leka.

12. Jedinjenje formule I ih neka njegova fiziološki prihvatljiva so prema jednom ili više zahteva 1 - 8 za primenu kao inhibitora CDK.

13. Korišćenje nekog jeđinjenja formule I, ili neke fiziološki prihvatljive soli tog jeđinjenja, koje je đefinisano prema jednom ili više zahteva 1 - 8, za proizvodnju lekova za lečenje raka ili nekog drugog oboljenja sa nekim patološkim oštećenjem proliferacije ćelija.

14. Lekovi, naznačeni time, što sadrže najmanje jedno jedinjenje formule I, ili neku fiziološki prihvatljivu so tog jedinjenje, koje je đefinisano prema jednom ili više zahteva 1-8.

15. Postupak za proizvodnju lekova definisanih prema zahtevu 14, naznačen time, što se najmanje jedno jedinjenje formule I, ili neka fiziološki prihvatljiva so tog jeđinjenja, koje je đefinisano prema jednom ili više zahteva 1-8, oblikuje pomoću podesnih pomoćnih sredstava i/ili nosača u oblik pogodan za davanje leka.

16. Mikroorganizam Gloeoporus dichrous (Fr.: Fr.) Bres. ST001714, DSM 13784.