RS50364B - Modifikovani faktor viii - Google Patents

Abstract

DNK kojom se kodira aminokiselinska sekvenca POL1212 prikazana u SEQ ID No:38. Prijava sadrži još 5 nezavisnih i 6 zavisnih patentnih zahteva.

Description

Zgrušavanje krvi počinje kad trombociti prionu za oštećeni zid povređenog krvnog suda na mestu lezije. Nakon toga, u nizu enzimski regulisanih reakcija, molekuli rastvorljivog fibrinogena, pod dejstvom enzima trombina, prelaze u nerastvorljive niti fibrina, koji trombocite povezuje u tromb. Na svakom koraku tog niza reakcija, prekursor proteina se konvertuje u proteazu, koja čepa sledeći proteinski prekursor u nizu. U većini koraka je neophodno učešće kofaktora.

Faktor VIII cirkuliše u krvi, čvrsto i nekovalentno vezan za fon Vilebrandov faktor, kao neaktivni prekursor. Faktor VIII proteolitički aktivira trombin ili faktor Xa, koji ga odvaja od fon Vilebrandovog faktora i aktivira njegovu prokoagulantnu funkciju u nizu reakcija. U aktivnom obliku proteinski faktor VIII predstavlja ko-faktor, koji više-struko povećava katalitičku efikasnost faktora IXa u aktivaciji faktora X.

Ljudi sa manjkom faktora VHI ili antitelima na faktor VTU, koji u terapiji ne dobi-jaju faktor VEI, pate od nekontrolisanih unutrašnjih krvarenja, koja mogu da izazovu či-tav niz simptoma, od zapaljensMh reakcija na zglobovima do prevremene smrti. Pacijenti sa teškom hemofilijom, kojih u SAD ima oko 10 000, mogu da se leće infuzijom humanog faktora VTJI, koji će ponovo uspostaviti normalnu sposobnost koagulacije krvi ako se primenjuje dovoljno često i u dovoljnoj koncentraciji. Klasična definicija faktora VTJI je da je to supstancija prisutna u zdravoj krvnoj plazmi, koja koriguje defekt koagulacije u plazmi osoba sa hemofilijom A.

Stvaranje antitela ('inhibitora1' ili 'irdubitornih antitela"), koja inhibišu aktivnost faktora Vm, predstavlja ozbiljnu komplikaciju i lečenju pacijenata sa hemofilijom. Kod oko 20% pacijenata sa hemofilijom tipa A, kao reakcija na terapijske infuzije faktora Vm, dolazi do stvaranja antitela. Kod pacijenata sa hemofilijom tipa A, koji prethodno nisu primali terapiju, kod kojih su se stvorili inhibitori, do stvaranja inhibitora dolazi u roku od godinu dana po uvođenju terapije. Pored toga, ponekad se i kod osoba sa prethodno normalnim nivoom faktora VTJI stvaraju antitela koja inaktivišu faktor VTH. Ukoliko je titar inhibitora dovoljno nizak, kod takvih pacijenata se lečenje može uspe-šno nastaviti povećavanjem doze faktora VTJI. Često je, međutim, titar inhibitora toliko visok da ga je nemoguće savladati faktorom VTH. Alternativna terapijska strategija sastoji se u zaobilaženju potrebe za faktorom VUI tokom normalne hemostaze, primenom preparata kompleksa faktora IX (npr. KONYNE<®>, Proplex<®>), ili rekombinantnog humanog faktora Vila. Osim toga, s obzirom na to da je reaktivnost svinjskog faktora VTJI sa mhibitorima obično znatno manja od reaktivnosti humanog faktora VUI, korišćen je delimično prečišćen preparat svinjskog faktora VTJI (HYATE:C<®>). Svinjskim faktorom VTJI uspešno su lečeni mnogi pacijenti kod kojih su se stvarala inhibitoma antitela na humani faktor VTJI, a takvu terapiju su dugo dobro podnosili. Ipak, ni primena svinjskog faktora VTU ne predstavlja potpuno rešenje, jer kod nekih pacijenata može doći do stvaranja inhibitorruh antitela na svinjski faktor VTJI posle jedne ili dve primljene infuzije.

Na tržištu je, za lečenje hemofilije, nekoliko preparata faktora VTU dobijenog iz

■humane plazme, različitog stepena prečišćenosti. Među tim preparatima je i

delimično prečišćeni faktor VTfl iz krvi prikupljene od velikog broja davalaca, koja je termički i hemijski obrađena na viruse, ali sadrži značajan nivo antigenskih proteina; faktor VTJI prečišćen monoMonalnim antitelima, sa niskim nivoom antigenskih nečis-toća i virusne kontaminacije, kao i rekombinantni humani faktor VTJI, za koji su klinička ispitivanja u toku. Na žalost, pri fiziološkim koncentracijama i pH, humani faktor VUI je nestabilan, prisutan je u krvi u izuzetno niskim koncentracijama (0,2 ug/ml plazme), a specifična aktivnost koagulacije mu je niska. Briga zdravstva zbog rizika prenošenja virusa ili drugih kontaminanata putem krvi, ograničila je i korišćenje svinjskog faktora VTU prečišćenog iz svinjske krvi.

Hemofiličarima je neophodna svakodnevna supstitucija faktora VTTJ da bi se sprečila krvarenja i posledična, degenerativna hemofilična artropatija. Ponuda je, me-đutim, nedovoljna, a problemi terapijske primene nastaju kao posledica problema izo-lovanja i prečišćavanja, imunogenosti, kao i potrebe za eurninisanjem rizika od ATDS-a i hepatitisa. Korišćenje rekombinantnog humanog faktora VTJI ili delimično prečiš-ćenog svinjskog faktora VTTJ neće rešiti sve probleme.

Problemi koji prate primenu najčešće korišćenog, komercijalnog faktora VTJI, dobijenog iz plazme, podstakli su značajno interesovanje za formulisanjem boljeg proizvoda faktora VUI. Potreban je snažniji molekul faktora VUI, koji bi omogućio oslo-bađanje više jedinica koagulacione aktivnosti po molekulu, molekul faktora VUI stabilan pri odabranim vrednostima pH i fiziološkoj koncentraciji, molekul faktora VTU sa manje izraženom sklonošću ka stvaranju inhibitornih antitela odnosno molekul faktora VTU koji, kod pacijenata koji su već stekli antitela na humani faktor VUI, imunološki sistem neće otkriti.

Jedan od ciljeva ovog pronalaska je, stoga, da obezbedi faktor VUI koji koriguje hemofiliju kod pacijenata sa manjkom faktora VTU ili onih kod kojih su stvorena inhibitoma antitela na humani faktor VTU.

Dalji cilj ovog pronalaska je da ponudi metode za lečenje hemofiličara.

Još jedan od ciljeva ovog pronalaska je da da faktor VTU koji je stabilan pri odabranim vrednostima pH i u fiziološkoj koncentraciji.

Među cujevima ovog pronalaska je i obezbeđivanje faktora VIII sa koagulan-triirn dejstvom jačim od dejstva humanog faktora VUI.

Osim toga, cilj ovog pronalaska je da ponudi faktor VUI na koji će se stvarati manje antitela.

A dalji cilj ovog pronalaska je da obezbedi metod za dobijanje rekombinantnog svinjskog faktora VUI i specifično modifikovanog svinjskog faktora VUI.

REZIME PRONALASKA

Ovde izloženo određivanje celokupne sekvence DNK kojim se kodira svinjski faktor VUI, prvi put je omogućilo sintezu kompletnog svinjskog faktora VTJI, ekspresijom DNK kojom se kodira svinjski faktor VTJJ u pogodnu ćeliju domaćina. DNK kojom se kodira svaki od domena svinjskog faktora VTJI, kao i svaki njegov specifični fragment, može da se eksprimira na sličan način. Osim toga, svinjski faktor VTTJ kod kojeg je izbrisan deo ili ceo domen B (svinjski faktor VTTJ lišen B-domena), postao je dostu-pan kao deo ovog pronalaska, ekspresijom kođirajuće DNK svinjskog faktora VTJI kod koje je izbrisan jedan ili više kodona B-domena.

Prezentovane su, osim toga, i farmaceutske formulacije, kao i metodi za lečenje pacijenata sa deficijencijom faktora VTJI, koji podrazumevaju primenu rekombinantnog svinjskog faktora VTJI, ili modifikovanog rekombinantnog svinjskog faktora VTTJ, a konkretno svinjskog faktora VTJI iišenog B-domena.

KRATAK OPIS CRTEŽA

Slike 1A - IH zajedno omogućavaju paralelno poređenje arrtmokiselinskih sekvenci humanog, svinjskog i mišjeg faktora VTJI.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

Ukoliko nije drukčije određeno ili napomenuto,'faktor VUI", u smislu u kojem se ovde koristi, označava svaki funkcionalni proteinski molekul faktora VUI, bilo kojeg sisara.

U smislu u kojem se ovde koristi, "faktor VTJI sisara" obuhvata faktor VUI sa aminokiselinskom sekvencom dobijenom od bilo kojeg, ne-humanog sisara, pod uslovom da nije drukčije određeno. U smislu u kojem se ovde koristi, "životinjski" se odnosi na svinju i druge ne-humane sisare.

"Fuzioni protein" ili "fuzioni faktor VUI ili njegov fragment", u smislu u kojem se ovde koristi, predstavlja proizvod hibridnog gena u kojem je kodna sekvenca nekog proteina izmenjena, npr. povezivanjem jednog njegovog dela za kodnu sekvencu drugog proteina iz nekog drugog gena, u nizu koji se pravilno čita, tako da može da se vrši neometana transkripcija i translacija spojenih segmenata i dobije hibridni gen koji kodira fuzioni protein.

"Odgovarajuća" nukleinska ili amino kiselina ili sekvenca neke od njih, u smislu u kojem se ovde koristi, predstavlja (kiselinu) prisutnu na mestu u molekulu faktora VTU ili njegovog fragmenta, čija je struktura i/ili funkcija ista kao i ona na mestu u molekulu faktora VTU neke druge vrste, i pored toga što se broj nukleinske ili amino kiseline ne mora podudarati. Sekvenca DNK koja "odgovara" sekvenci drugog faktora VUI, u značajnoj meri odgovara toj sekvenci, i se sa sekvencom izabranog SEQ TJD br. pod strogo kontrolisanim uslovima. Sekvenca DNK koja "odgovara" sekvenci drugog faktora VUI obuhvata, takođe, i sekvencu koja rezultuje ekspresijom faktora VTU ili njegovog fragmenta, i hibridizovala bi se na izabrani SEQ ID br., da nema viška genet-skog koda.

jedinstveni" aminokiselinski reziduum ili sekvenca, u smislu u kojem se ovde koristi, odnosi se na aminokiselinsku sekvencu ili reziduum u molekulu faktora VUI jedne vrste, koji se razlikuje od homolognog reziduuma ili sekvence u molekulu faktora VUI druge vrste.

"Specifična aktivnost", u smislu u kojem se ovde koristi, odnosi se na aktivnost koja će korigovati defekt koagulacije plazme kojoj nedostaje humani faktor VTJL Speci-fična aktivnost se meri jedinicama koagulacione aktivnosti po mg ukupnog proteina faktora VTJI u standardnom testu, u okviru kojeg se vreme koagulacije humane plazme deficijentne u faktoru VUI, poredi sa vremenom koagulacije zdrave humane plazme. Jedna jedinica aktivnosti faktora VUI predstavlja aktivnost sadržanu u jednom ml zdrave humane plazme. U samom testu, kraće vreme fonruranja ugruška označava veću aktivnost analiziranog faktora VUI. Svinjski faktor VUI poseduje koagulacionu aktivnost u testu humanog faktora VUI.

"Ekspresija" se odnosi na niz procesa, preko kojih se genetska informacija koristi za stvaranje proizvoda. DNK kojom se kodira aminokiselinska sekvenca svinjskog faktora VUI može da se "eksprimira" u ćeliju sisara-domaćina da bi se dobio svinjski protein faktora VTU. Materijali, genske strukture, ćelije-domaćini i uslovi koji dopuštaju pojavu ekspresije date DNK sekvence dobro su poznati u struci, i njima se može mani-pulisati i uticati na vreme i razmere ekspresije, kao i na intracelulamo ili vanćelijsko razmeštanje eksprirniranog proteina. Uključivanjem, npr., DNK kojom se kodira signalni peptid na 5' završetku DNK koja kodira svinjski faktor VUI (pošto je, po konvenciji, 5' završetak, onaj kojim se kodira NH-j završetak proteina), eksprimirani protein se eksportuje iz unutrašnjosti ćelije-domaćina u hranljivu podlogu. Dobijanje kombinacije DNK kojom se kodira signalni peptid i DNK kojom se kodira svinjski faktor VUI veoma je korisno, jer se eksprimirani faktor VUI eksportuje u hranljivu podlogu, čime se po-jednostavljuje proces prečišćavanja. Najpogodniji signalni peptid za ovaj postupak je signalni peptid faktora VUI sisara.

U SE Q TD br: 1 odnosno 2 prikazani su cDNK nukleotid humanog faktora VTU i predviđene sekvence amino kiselina. Faktor VUI se sintetiše kao protein (300 kDa) jednostrukog lanca, sa homologijom unutrašnje sekvence, koja određuje sekvencu "domena" NIVA1-A2-B-A3-C1-C2-COOH. U molekulu faktora VUI, "domen" u smislu u kojem se ovde koristi, predstavlja kontinuiranu sekvencu amino kiselina, defmisanu identitetom unutrašnje sekvence amino kiselina i mestima proteolitičkog cepanja pod dejstvom trombina. Ukoliko nije drugačije naglašeno, u odnosu na humanu sekvencu amino kiselina, domeni faktora VIJI obuhvataju sledeće reziduume amino kiselina (SED ID Br.:: 2): Al, reziduumi Alal-Arg372; A2, reziduumi Ser373-Arg740; B, reziduumi Ser741-Argl648; A3, reziduumi Serl690-Ile2032; Cl, reziduumi Arg2033-Asn2172; C2, reziduumi Ser2173-Tyr2332. Niz A3-C1-C2 uključuje reziduume Serl690-Tyr2332. Preostali segment, tj, reziduumi Glul649-Argl689, obično se pominje kao aktivacioni peptid lakog lanca faktora VDL Faktor VUI proteolitički aktivira trombin ili faktor Xa, koji ga odvaja od fon Vilebrandovog faktora, formirajući faktor VHIa sa prokoagulantnom funkcijom. Biološka funkcija faktora VHIa je da višestruko poveća katalitičku efikasnost faktora Ka u aktiviranju faktora X. Trombin om aktivirani faktor VHIa je A1/A2/A3-C1-C2 heterotrimer (160 kDa), koji sa faktorom TXa i faktorom X obrazuje kompleks na površini trombocita ili monocita. 'Parcijalni domen", u smislu u kojem se ovde koristi, predstavlja kontinuiranu sekvencu amino kiselina, koje obra-zuju deo domena.

U smislu u kojem se ovde koristi, pojam "podjedinice" humanog ili životinjskog faktora VUI označava teške i lake lance proteina. Teški lanac faktora VUI sadrži tri domena - Al, A2 i B. I laki lanac faktora VUI sadrži tri domena, tj. domene A3, Cl i C2.

Pojmovi "epitop", "antigensko mesto" i "antigenska determinanta" se, u smislu u kojem še ovde koriste, koriste kao sinonimi i definišu se kao deo humanog ili životinj-skog faktora VUI ili njegov fragment, koji antitelo specifično prepoznaje. Može da ga čini svaki broj airurtokiselinskih reziduuma, a može da zavisi od primarne, sekundarne ili tercijeme strukture proteina.

Pojam "imunogeno mesto", u smislu u kojem se ovde koristi, definiše se kao deo humanog ili životinjskog faktora VM, ili njegov fragment, koji specifično pokreće proiz-vodnju antitela na faktor VTU ili njegov fragment kod ljudi ili životinja, mereno rutinskim protokolima, npr. imunološkim testovima, kao što su. ELISA ili Betezda test, opisanim u ovom izlaganju. Može da ga čini svaki broj reziduuma aminokiselina, i može da zavisi od primarne, sekundarne ili tercijeme strukture proteina. U nekim oblicima je hibrid ili faktor VTU - ekvivalent hibrida, ili pak njegov fragment, ne-imunogen ili manje imunogen kod životinja ili kod ljudi od humanog ili svinjskog faktora VUI.

"Đeficijencija faktora VUT", u smislu u kojem se ovde koristi, obuhvata manjak koagulantne aktivnosti, koja je posledica produkovanja manjkavog faktora VTJI, nedo-voljne produkcije ili izostanka stvaranja faktora VUI, ili delimične ili potpune inhibicije faktora VTJI inhibitornim antitelima. Hemofilija A je vrsta deficijencije faktora VTU koja je posledica defekta X-vezanog gena i odsustva ili deficita proteina faktora VTJI, koji taj gen kodira.

U smislu u kojem se ovde koristi, pojam "dijagnostički testovi" obuhvata testove koji, na neki način, koriste reakciju antigen-antitelo pri određivanju i/ili kvantifikovanju količine određenog antitela, prisutne u ispitivanom uzorku, a u cilju olakšavanja izbora medicinske terapije. Kvalifikovanim ljudima iz struke su poznati mnogobrojni takvi testovi. U smislu u kojem se ovde koristi, DNK humanog, svinjskog ili modifikovanog svinjskog faktora VTJI ili njen fragment, kao i iz nje eksprimiran protein, mogu da se, u celini ili delom, supstituišu odgovarajućim reagensima u poznatim testovima, i na taj način modifikovani testovi mogu da se koriste za otkrivanje i/ili kvantifikaciju antitela na faktor VTJI. Primena takvih reagensa, DNK faktora VUJ ili njegovog fragmenta, ili iz nje eksprimiranog proteina, omogućava modifikovanje poznatih testova za detekciju antitela na humani ili životinjski faktor VTJI. U pomenute testove spadaju ELISA testovi, imunodifuzioni i imunoblot testovi, ali ne samo oni. Ljudi iz struke poznaju metode pogodne za sprovođenje ma kojeg od ovih testova. U smislu u kojem se ovde koristi., kao dijagnostički reagens može da se koristi faktor VUI ili njegov fragment koji poseduje bar jedan epitop proteina. Primer drugih testova u kojima se može koristiti humani, svinjski ili modifikovani svinjski faktor VTU ili njegov fragment su Betezda test i anukoagulacioni testovi.

Pojam "DNK kojom se kodira protein, npr. svinjski faktor VTU" označava poli-dezoksinukleinsku kiselinu, čija nukleotidna sekvenca prenosi ćeliji-domaćinu kodnu informaciju redosleda amino kiselina u sekvenci konkretnog proteina, npr. svinjskog faktora VTU, a prema poznatim vezama/odnosima u genetskom kodu.

"Proizvod ekspresije" DNK kojom se kodira humani ili životinjski faktor VTU ili modifikovani faktor VUI, predstavlja produkt dobijen ekspresijom referentne DNK u pogodnu ćeliju-domaćina, uključujući karakteristike pre- ili post-translacione modi-

fikacije proteina, koje kodira referentna DNK, uključujući i glikozilaciju, proteolitičko cepanje i slično. U struci se zna da su takve modifikacije moguće i da se mogu pone-što razlikovati, zavisno od tipa ćelije-domaćina i drugih činilaca, a da mogu dati molekularne izoforme produkta, uz zadržavanje prokoagulantne aktivnosti.V.,npr. u Lind, P. i sar.,Eur. J, Biochem.232:1927 (1995), koji je referentni sastavni deo ovog izlaganja.

"Vektor ekspresije" je element DNK često cirkularne strukture, sa sposobnošću da se autonomno replikuje u željenu ćeliju-domaćina, ili da se ugradi u genom ćelije-domaćina; poseduje, takođe, i izvesna dobro znana svojstva, koja dozvoljavaju ekspresiju kodirajuće DNK, umetnute u sekvencu vektora na pravom mestu i sa pravilnom orijentacijom. Ta svojstva mogu da obuhvataju jednu ili više promoterskih sekvenci za usmeravanje inicijacije transkripcije kodirajuće DNK i drugih elemenata DNK, npr. po-jačivača, mesta poliadenilacije, i si., struci dobro poznate. Pojam "vektor ekspresije" koristi se za označavanje vektora koji u svojoj sekvenci sadrži ugrađenu kodirajuću sekvencu DNK koja se eksprimira, kao i vektora koji poseduje neophodne elemente kontrole ekspresije, i to tako postavljene u odnosu na mesto ugradnje da taj vektor može da služi za ekspresiju svake kodirajuće DNK ugrađene ta tom mestu, što je takođe blis-ko postojećem stanju tehnike. Stoga, npr. vektor kome nedostaje promoter može da postane vektor ekspresije, ako se u njega ugradi promoter kombinovan sa kodira-jućom DNK

OPŠTI OPIS METODA

Patent U.S.5,364,771 opisao je otkriće molekula hibridnog humanog/svinjskog faktora VUI sa koagulantnom aktivnošću, u kojem su elementi molekula humanog ili svinjskog faktora VUI supstituisani odgovarajućim elementima molekula faktora VTU drugih vrsta. U.S. patent 5,663,060 opisuje prokoagulantne molekule hibrida humano/ životinjskog i hibridnog ekvivalenta faktora VUL u kojima su elementi molekula faktora VUI jedne vrste supstituisani odgovarajućim elementima molekula faktora VUI druge vrste.

S obzirom na to da aktuelna saznanja ukazuju da B domen nema inhibitomi epitop i da je bez poznatog efekta na funkciju faktora VTJI, u nekim molekulima je B domen potpuno ili delimično izbrisan iz molekula aktivnog hibrida ili hibridu ekvivalent-nog faktora VUI, ili iz njihovih fragmenata ("B(-) faktor VUI"), dobijenih nekim od ovde opisanih metoda.

Gen humanog faktora VUI je izolovan i eksprimiran u ćelije sisara, prema Toole, J.J. i sar, (1984)Nature312:342-347 (Genetics Institute); Gitschier, J. i sar. (1984)Nature312: 326-330 (Genentech); Wood, W.I. i sar. (1984)Nature312:330-337 (Genentech); Vehar, GJLi sar. (1984)Nature312:337-342 (Genentech); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; U.S. patent br. 4,757,006, a aminokiselinska sekvenca je izvedena iz cDNK. U.S. patent br. 4,965,199 Kapona i saradnika, otkriva metod rekombinantne DNK za stvaranje faktora VTU u ćeUjama-domaćinima sisara, i prečiš-ćavanje humanog faktora VUI. Prezentovani su rezultati ekspresije humanog faktora VUI na ćelije CHO (ovarijuma kineskog hrčka) i BHKC (ćelije bubrega mladunca hrčka). Humani faktor VTU je modifikovan u cilju brisanja dela ili celokupnog B domena (U.S. patent br. 4,868,112), a izveden je pokušaj zamene B domena humanog faktora<V>UI B domenom humanog faktora V (U.S. patent br. 5,004,803). Sekvenca cDNK kojom se kodira humani faktor VTU i predviđena aminokiseliriska sekvenca prikazani su na SEQ U) br. 1 odnosno 2. Kod SEQ TD br. 1, kodna zona počinje na nukleotidnoj poziciji 208, a trojka GCC je kodon za aminokiselinu broj 1 (Ala) zrelog proteina, kao na SEQ UD br. 2.

Svinjski faktor Vffl je izolovan iz plazme [Fass, D.N. i sar. (1982)Blood59:594]. Parcijalnu aminokiselinsku sekvencu svinjskog faktora VTU, koja odgovara delovima sekvence N-terminalnog lakog lanca, homolognog ceruloplazminu i faktoru koagulacije V, opisali su Church i sar. (1984)Proc. NatL AcadL Sci, USA81:6934. Toole, J.J. i sar, (1984)Nature312:342-347.opisali su delimično formiranje sekvence na N-terminalnom završetku četiri aminokiselinska fragmenta svinjskog faktora Vffl, ali nisu karakterisali fragmente prema njihovim položajima u molekulu faktora VUI. Aminokiselinsku sekvencu domena B i dela domena A svinjskog faktora Vffl prikazali su Toole, J.J. i sar. (1986)Proc. Natl. Acad. Sci, USA83:5939-5942. Sekvenca cDNK koja kodira kompletan domen A2 svinjskog faktora VUI i predviđenu sekvencu aminokiselina, i hibridni humani/svinjski faktor VUI sa supstitucijama svih domena, sve podjedinice, kao i specifične sekvence amino kiselina prezentovani su u otkriću iz U.S. patenta br. 5,364,771, pod naslovom "Hibridni humaru/svinjski faktor VUr, izdatom 15. 11 1994., i u WO 93/20093, objavljenom 14.10.1993.godine. Sekvenca cDNK koja kodira domen A2 svinjskog faktora VUI, koji odgovara reziduumima 373-740 kod zrelog humanog faktora VUI, prikazanog na SEQ UD br. 1, kao i predviđena sekvenca amino kiselina, prikazani su na SEQ UD br. 3 odnosno 4. Novijeg datuma je otkriće nukleotida i odgovarajućih sekvenci dela domena Al, kojima nedostaje prvih 198 amino kiselina, i odgovarajućih elemenata domena A2 svinjskog faktora VUI, prezentovano i u WO 94/11503, objavljeno 26.05.1994.godine. Celokupna sekvenca nukleotida kojom se kodira svinjski faktor VUI, uključujući i čitav domen Al, aktivacioni peptid, domene A3, Cl i C2, kao i kodiranu sekvencu amino kiselina, dobio je konačno Lollar, što otkriva u U.S. patentu 5,859,204 od 12.01.1999.godine i u WO 97/49725, objavljenom 31.12.1997., koji su referentni sastavni deo ovog izlaganja.

I svinjski i humani faktor VTU su izolovani iz plazme kao protein sa dve podjedinice. Poznate kao teški i laki lanac, podjedinice su vezane ne-kovalentnom vezom, koja zahteva prisustvo kalcijuma ili drugih dvovalentnih jona metala. Teški lanac faktora VUI sadrži tri kovalentno vezana domena - Al, A2 i B. Laki lanac faktora VUI takođe sadrži tri domena, označena sa A3, Cl i C2. Domen B nema poznatu biološku funkciju i može se, proteolotički ili metodima tehnologije rekombinantne DNK, odstraniti ili delom odstraniti iz molekula, bez značajnije promene bilo kojeg od merljivih parametara faktora VTU. Humani rekombinantni faktor VUI ima strukturu i funkciju slič-nu faktoru VUI iz plazme, iako se ne glikoziluje dok se ne eksprimira u ćelije sisara.

I humani i svinjski aktivirani faktor VUI ("faktor VUIa") imaju po tri podjedinice zbog deobe teškog lanca između domena Al i A2. Ova struktura se označava sa A1/A2/A3-C1-C2. Humani faktor VTUa nestabilan je u uslovima koji stabilišu svinjski faktor VUIa, po svoj prilici zbog slabije vezanosti podjedinice A2 humanog faktora VUIa. Odvajanje podjedinice A2 humanog i svinjskog faktora VUIa prati gubitak aktivnosti molekula faktora VUIa. Yakhyasrv, A i sar. (1997)Blood90:SuppL 1, Sažetak #126 donosi saznanja o vezivanju domena A2 proteinom receptomog lipoproteina male gustine, koji navodi na zaključak da, ovim vezivanjem posredovano, ćelijsko preuzima-nje A2 deluje smanjivanjem aktivnosti faktora VUI.

Ekspresija "faktora VUI lišenog domena B" pojačava se uključivanjem delova domena B. Uključivanjem onih delova domena B, označenih sa "SQ" [Lind, P. i sar.

(1995)supra]postiže se povoljna ekspresija. "SQ" strukturama nedostaje ceo humani domen B, s izuzetkom 5 amino kiselina N-završetka domena B i 9 amino kiselina C-završetka domena B.

Imunoreaktivnost i koagulaciona aktivnost prečišćenog hibridnog faktora VUI ili njegovog fragmenta mogu se ispitati standardnim testovima, uključujući i test faktora VUI bez plazme, jednofazni test koagulacije, kao i ELISA test, koristeći prečišćeni rekombinantni humani faktor VUI kao standard.

Za ekspresiju strukture rekombinantnog gena u eukariotske ćelije, zavisno od izbora i suda kvalifikovanog stručnjaka, mogu da se koriste i drugi vektori, uključujući i plazmidne i eukariotske virusne vektore (v. npr. Sambrook i sar., Poglavlje 16). Drugi vektori i ekspresioni sistemi, uključujući i ćelijske sisteme bakterija, kvasaca i inse-kata, mogu da se koriste, ali se ne smatraju najpogodnijim zbog razlika u glikozilaciji, ili izostanka glikozilacije.

Protein rekombinantnog faktora VUI može da se eksprimira u različite ćelije, najčešće korišćene za kulturu i ekspresiju rekombinantnog proteina sisara. Konkretno, zaključeno je da su brojne ćelijske linije glodara posebno korisni domaćini za ekspresiju velikih proteina. Pogodne ćelijske, linije kojima raspolaže Američka zbirka tipskih kultura u Rokvilu, Merilend, obuhvataju ćelije bubrega mladunaca hrčka i ovarijalne ćelije kineskog hrčka (CHO), koje se kultivišu uz korišćenje rutinskih postupaka i podloga.

Osnovu veće koagulacione aktivnosti svinjskog faktora VUI izgleda da čini spontano odvajanje humane podjedinice A2 sa humanog faktora VUIa, koje je brže od odvajanja svinjske podjedinice A2 od svinjskog faktora VUIa. Odvajanje podjedinice A2 vodi gubitku aktivnosti [Lollar, P. i sar. (1990) /.Biol. Chem.265:1688-1692; Lollar, P. i sar. (1992) /Biol. Chem.267:23652-23657; Fay, P.J. i sar. (1992) /.Biol. Chem.267:13246-132501.

Molekuli faktora VUJ sa smanjenom imunoreakitvnošću;

Karakterizacija epitopa sposobnih za imunoreaktivnost sa antitelima koja inhi-bišu koagulantno dejstvo faktora VUI ("inhibitori'' ili '"inhibitorna antitela"), zasniva se na poznatim odnosima strukrura-funkcija u faktoru Vffl. Inhibitori, najverovatnije, deluju razaranjem ma koje od makromolekularnih interakcija domenske strukture faktora VUI ili njegovih veza sa fon VUebrandovim faktorom, trombinom, faktorima Xa, Ka ili X. Ve-ćina inhibitornih antitela na humani faktor Vffl, međutim, deluje vezivanjem za epitope smeštene u 40 kDaltonskom domenu A2 ili 20 kDaltonskom domenu C2 faktora VUI, uništavajući specifične funkcije vezane za ove domene, kao što su opisali Fulcher i sar. (1985)Proc. NaitAcad. Sci USA82:7728-7732, i Scandella i sar. (1988)ProcNatl. Acad. Sci USA85:6152-6156. Prema Scandella i sar. (1993)Blood82:1767-1775, pored epitopa u domenima A2 i C2, treći epitop bi mogao da postoji u domenu A3 ili Cl lakog lanca faktora Vffl. Značaj ovog predpostavijenog trećeg epitopa nije poznat, ali izgleda da je on odgovoran za manji deo reaktivnosti epitopa kod faktora VUI.

Anti-A2 antitela blokiraju aktivaciju faktora X, što su pokazali LoUar i sar. (1994)]. Clm. lnvesL93:2497-2504). Prethodna istraživanja genskih mapa delecionom mutagenezom, koja su opisali Ware i sar. (1992)Blood. CoaguLFibrinofysis3:703-716, locirala su epitop A2 u 20 kDaltonskoj zoni NHj-terminalnog kraja 40 kDaltonskog domena A2. Imunoradiometrijski testovi kompeticije su pokazali, prema opisu Scandella i sar.

(1992)Throm. Haemostas67:665-671 i navodima U.S. patenta 5,859,204, da inhibitori A2 prepoznaju ili zajednički epitop ili zbijene skupine epitopa.

Manja antigenost i/ili imunogenost molekula životinjskog ili modifikovanog životinjskog faktora Vffl može se ispitati u okviru kliničkih ispitivanja kod ljudi. U okviru jednog tipa ispitivanja, čiji je cilj da se odredi da li postoji imunoreaktivnost faktora Vffl sa inhibitomim antitelima, faktor Vffl je primilo, uglavnom intravenskom infuzijom, 25 pacijenata sa deficijencijom faktora Vffl i antitelima koja inhibišu koagulacionu aktivnost terapijski primenjenog humanog faktora Vffl. Raspon doziranje životinjskog ili modifikovanog životinjskog faktora vTfl bio je između 5 i 50 J po kilogramu telesne mase, bolje 10-50 J/kg, a najbolje 40 J/kg telesne mase. Približno 1 sat posle svake primene u uzorcima krvi je, jednofaznim testom koagulacije, mereno prisustvo faktora VOL Postupak uzimanja uzoraka krvi i merenja ponovljen je približno 5 sati posle infuzije. Ukup-no prisustvo i brzina nestajanja faktora VUI iz uzoraka predstavljaju pokazatelje titra antitela i inhibitorne aktivnosti. Ako je titar antitela visok, prisustvo faktora VUI je, obič-no, nemerljivo. Rezultati merenja prisustva su poređeni sa rezultatima merenja prisustva kod pacijenata koji su primali humani faktor VUI dobijen iz plazme, rekombinantni humani faktor VUI ili supstitute faktora VUI.

Po identifikaciji klinički značajnih epitopa mogu se, uin vitroispitivanjima na širokom spektru inhibitomih plazmi, eksprimirati molekuli rekombinantnog faktora VUI sa ukrštenom reaktivnošću manjom od, ili jednakom onoj kod svinjskog faktora VUI iz plazme. U cilju smanjena ukrštene reaktivnosti može se izvršiti dodatna mutageneza u zonama epitopa. Iako poželjna, smanjena ukrštena reaktivnost nije neophodna za dobijanje proizvoda koji bi mogao imati prednosti u odnosu na postojeći koncentrat svinjskog faktora VTU iz plazme, zbog toga što i on može da proizvede neželjene efekte, zbog prisustva kontantinantnih svinjskih proteina ili kontaminacije uzročnicima infek-cije, npr. virusima ili prionima. Molekul rekombinantnog svinjskog ili modifikovanog svinjskog faktora VUI neće sadržati strane svinjske proteine.

Dijagnostički testovi

U testovima se, kao dijagnostički reagensi za detekciju inhibitornih antitela na humani ili životinjski faktor VUI ili modifikovani životinjski faktor VUI u supstratima kao što su uzorci seruma i telesnih tečnosti pacijenata sa deficijencijom faktora VUI, mogu koristiti cDNK faktora VUI i/ili iz nje eksprimiran protein. Ovi testovi obuhvataju ELISA testove, imunoblotove, RIA testove, imunodifuzione testove i test biološke aktivnosti faktora VUI (npr. testom koagulacije). Načini pripreme ovih reagensa i metodi njihove primene poznati su ljudima iz struke. Na primer, imunološki test za detektovanje inhibitomih antitela u uzorku seruma pacijenta može da uključi i reakciju ispitivanog uzorka sa dovoljnom količinom ispitivanog faktora VUL tako da je merljfvi kompleks koji se može fonrdrati sa iiuhibitomim antitelima iz uzorka ispitivanog faktora VUI, zaista antigen.

Na bazi niza cDNK hibridnog faktora VTJI, molekula proteina ili njihovih fragmenata mogu se formirati sonde nukleinske ili amino kiseline. U nekim oblicima, ove sonde se markiraju bojama ili komercijalnim erizirnskuTi, fluorescentnim, hemolumine-scentnim ili radioaktivnim markerima. Aminokiselinske sonde se mogu koristiti za npr. pregled seruma ili drugih telesnih tečnosti u slučajevima kada se sumnja na prisustvo inhibitornih antitela na humani, životinjski ili hibridni humani/životinjski faktor VUI. Nivoi inhibitora kod pacijenata se mogu meriti i porediti sa nivoima kod zdravih ljudi, a mogu se koristiti pri, na primer, odlučivanju o tome da li se u lečenje pacijenta sa deficijencijom faktora VUI može uključiti životinjski ili modifikovani životinjski faktor VUI. Ove cDNK sonde se mogu koristiti i za istraživanja, pri pregledu DNK datoteka.

Farmaceutske formulacije

Farmaceutske formulacije koje sadrže samo rekombinantni svinjski ili modifikovani svinjski faktor VUI, ili ove faktore u kombinaciji s odgovarajućim farmaceutskim stabilizatorima, transportnim vehu^umima i nosačima, pripravljaju se prema poznatim metodima, npr. prema metodu izRemingtor<i>s Pharmaceutical Sciencesod E.W. Martina.

TJ jednoj od povoljnih formulacija, adekvatni vehikulumi za intravensku infuziju su fiziološki rastvor ili fosfatni puferovani fiziološki rastvor.

U drugoj odgovarajućoj formulaciji se, kao adekvatni stabilizatori i veliikulumi, nalaze drugi humani ili životinjski proteini, npr. albumin.

Fosfolipidne vezikule ili lipozomske suspenzije smatraju se pogodnim i farma-ceutski prihvatljivim nosačima ili fcansportrtim vehikulumima. Mogu se pripravljati prema metodima koje poznaje struka, i mogu da sadrže, npr. fosfatidU-seirn/fosfatidil-holin ili druge mešavine fosfolipida ili deterdžente, koji zajednički stvaraju negativni napon na površini, pošto se faktor VUI vezuje za fosfolipidne membrane negativnog naelektrisanja. Lipozomi se mogu pripraviti rastvaranjem odgovarajućig lipida (npr. stearoil fosfatidil etaiiolarruna, stearoil fosfatidil-holina, arahadoil fosfatidil-holina i holesterola) u neorganskom rastvaraču; neorganski rastvarač ispari, ostavljajući na zi-dovima suda tanak film osušenog lipida. Potom se u sud naspe vodeni rastvor hibridnog faktora VUI. Sadržina suda se promeša kružnim pokretom, čime se sa stranica su-da oslobađa lipidni sloj, a agregati lipida rasipaju, obrazujući tako lipozomsku suspenziju.

Rekombinantni svinjski ili modifikovani svinjski faktor VUI može da se kombi-nuje i sa drugim pogoclnim stabihzatorskim jedinjenjima, vehikulurnima i nosačima, kao što su vitamin K-zavisni faktori koagulacije, tkivni faktor, fon Vllebrandov faktor (vWf) ili fragment vWf koji sadrži mesto vezivanja faktora VUI, kao i polisaharidi, npr. saharoza.

Rekombinantni svinjski ili modifikovani svinjski faktor VM može se prenositi i genskom terapijom, na isti način na koji se može prenostiti i humani faktor VM, koriš-ćenjem retrovirusnih vektora u ulozi sredstava transporta. Ovaj metod se sastoji od ugradnje željene strukturne cDNK faktora VM u humane ćelije, koje se transplantiraju direktno u organizam pacijenta sa deficijencijom faktora VM ili se smeštaju u sredstvo pogodno za implantaciju, koje propušta molekule faktora VM, ali je za ćelije nepro-pusno, i takvo sredstvo se potom transplantira pacijentu. Pogodan metod bi bio genski transfer posredovan retrovirusom. U okviru tog metoda se egzogeni gen (npr. cDNK faktora Vffl) klonira u genom modifikovanog retrovirusa. Gen se virusnim mehanizmi-ma ugrađuje u genom ćelije-domaćina, gde ga ćelija i eksprimira. Retrovirusni vektor je tako modifikovan da ne stvara virus, čime se sprečava virusna infekcija domaćina. Opšti principi ovog tipa terapije su poznati ljudima iz struke i obrađeni su u literaturi [npr. Kohn, D.B. i sar. (1989)Transfusion29:812-820].

Svinjski ili modifikovani svinjski faktor VM može da se čuva vezan za vWf da bi se produžio poluživot i rok trajanja hibridnog molekula. Osim toga, Uofilizacijom faktora VM, može se poboljšati prinos aktivnih molekula u prisustvu vWf. Važeći metodi ču-vanja humanih i životinjskih faktora VM, koje koriste komercijalni snabdevači, mogu da se primene i na čuvanje rekombinantnog faktora VM. Ovi metodi obuhvataju: (1) liofilizaciju faktora VM u delimično prečišćenom stanju (kao "koncentrata" faktora Vffl, koji se, bez dodatnog prečišćavanja, može dati irifuzijom); (2) imunoafinitetno prečišćavanje faktora VUI Zirrunermanovirn metodom i liofilizaciju u prisustvu albumina, koji stabilizuje faktor VTU; (3) liofilizaciju rekombinantnog faktora VUI u prisustvu alburruna.

Osim toga, saznanja pokazuju da svinjski ili modifikovani svinjski faktor VUI ostaje neograničeno vreme stabilan na temperaturi od 4°C u 0,6 M NaCl, 20 raM MES i S mM CaClj, na pH 6,0, kao i da se u ovim puferima može čuvati u smrznutom stanju, i odmrzavati uz minimalan gubitak aktivnosti.

Terapijski metodi

Rekombinantni svinjski ili mc^Jifikovani svinjski faktor VTU se koristi za lečenje nekontrolisanog krvarenja zbog nedostatka faktora VUI (npr. intraartikulame, intrakra-nijalne ili gastrointestinalne hemoragije) kod hemofiličara sa irihibitornim antitelima ili bez njih, kao i kod pacijenata sa stečenom deficijencijom faktora VUI, kao posledicom stvaranja inhibitornih antitela. Aktivne supstancije je najbolje primenjivati intravenskim putem.

Osim toga, rekombinantni svinjski ili modifikovani svinjski faktor VTU može da se primeni i putem transplantata ćelija, genetski izmenjenih tako da stvaraju protein, i implantacijom sredstva koje sadrži takve ćelije, kao što je već opisano.

U pogodnom obliku, farmaceutske formulacije rekombinantnog svinjskog ili modifikovanog svinjskog faktora VUI, samog ili u kombinaciji sa stabihzatorima, transportnim vehikulumima, i/ili nosačima, daju se pacijentima intravenskom infuzijom, po istoj proceduri koja se koristi za infuziju humanog ili životinjskog faktora VUI.

Terapijske doze formulacije rekombinantnog svinjskog ili modifikovanog svinjskog faktora VUI, koje se moraju dati pacijentu kojem je takva terapija neophodna, razlikovaće se u zavisnosti od težine deficijencije faktora VUI. Nivo doziranja se, generalno, podešava u pogledu učestalosti primene, trajanja primene i broja datih jedinica, a u skladu sa težinom i trajanjem epizode krvarenja svakog pacijenta. Shodno to-me, faktor VTU se u nosaču, transportnom vehikulumu ili stabilizatoru nalazi u količini dovoljnoj da pacijentu obezbedi terapijski efikasnu količinu proteina za zaustavljanje krvarenja, što se mari standardnim testovima koagulacije.

Faktor VUI se klasično definiše kao supstancija prisutna u normalnoj krvnoj plazmi, koja ispravlja defekt koagulacije u plazmi osoba sa hemofilijom A. Za izraču-navanje doze faktora VUI za potrebe infuzija kod ljudi koristi sein vitrokoagulaciona aktivnost prečišćenog i delimično prečišćenog oblika faktora VTJI. Ta aktivnost je i po-uzdan pokazatelj aktivnosti izmerene u plazmi pacijenta, kao i korekcije defekta krvarenjain vivo.Nisu uočene razlike između ponašanja novih molekula faktora VTJI u standardnim testovimain vitroi njihovog ponašanja u modelu infuzije kod psa ili kod pacijenata [Lusher, J.M. i sar. 328New EngLJ. Med.328:453-459; Pittman, DJO. i sar. (1992)Blood79:389-397; i Brinkhous i sar. (1985)Proc. Natl. Acad. Sci.82:8752-8755].

Željeni nivo aktivnosti faktora VTJI plazme, koji kod pacijenta treba postići primenom rekombinantnog svinjskog ili modifikovanog svinjskog faktora VUI, obično je u rasponu od 30 do 100% normalnog nivoa U okviru pogodnog načina primene terapijskog faktora VUI, formulacija se primenjuje intravenski, u odgovarajućem rasponu do-za, tj- u rasponu od 5 do 50 jedinica po kg telesne mase, još bolje u rasponu od 10 do 50 J/kg telesne mase, a najbolje u dozi od 20-40 J/kg telesne mase; interval između do-za je od oko 8 do 24 sata (kod teških hemofiličara), a trajanje terapije izraženo u dani-ma je od 1 do 10 dana, ili do okončanja epizode krvarenja.Videti,npr. Roberts, H.R. i MJR. Jones, "Hemofilija i srodne bolesti - urođene deficijencije protrombina (Faktora U, Faktora V i Faktora od VU do XU)," Poglavlje 153, 1453-1474, 1460, u Hematoloov, VTilliams, WJ. i sar., izdanje (1990). Količine rekombinantnog svinjskog ili modifikovanog svinjskog faktora VUI, potrebne pacijentima sa inhibitornim antitelima, mogu se razlikovati od potrebnih količina prethodno korišćenog oblika faktora VUI. Na primer, pacijentima može biti potrebna manja količina rekombinantnog svinjskog ili modifikovanog svinjskog faktora VUL zbog njegove veće specifične aktivnosti od aktivnosti humanog faktora VUI i smanjene reaktivnosti antitela. Kao i u terapiji humanim ili svinjskim faktorom VUI iz plazme, količina terapijskog faktora VUI koji će se dati infuzijom definiše se jednofaznim testom koagulacije i, u određenim slučajevima, prisustvoin vivose određuje merenjem faktora VTU u plazmi pacijenta posle primljene infuzije. Podrazumeva se da se, za svakog pojedinog pacijenta, specifični režimi doziranja moraju, s vremenom, podešavati prema mdividualnim potrebama i profesionalnom sudu

lica koje primenjuje ili nadgleda primenu formulacija, kao i da su rasponi koncentracija izneti u ovom izlaganju samo kao primeri, a nije im svrha da ograniče domet niti primenu predmetne formulacije u praksi.

Prema potrebi, terapija se može dati u obliku jednokratne intravenske primene formulacije, ili u obliku periodične ili kontinuirane primene tokom dužeg vremenskog perioda. Terapijska formulacija faktora VUI može se, alternativno, primeniti supkutano ili peroralno sa upozomima, u obliku jednokratne doze ili višekratnih doza u različitim vremenskim intervalima.

Rekombinantni svinjski ili modifikovani svinjski faktor VUJ može da se, takođe, koristi i za lečenje nekontrolisanog krvarenja zbog pomanjkanja faktora VUI kod hemo-filičara, kod kojih su se stvorila antitela na humani faktor VUI. U takvom slučaju nije neophodna koagulaciona aktivnost koja bi bila jača od aktivnosti samog humanog ili živo-tinjskog faktora VUI. Biće korisna i koagulaciona aktivnost slabija od aktivnosti humanog faktora VTU (tj. manja od 3000 jedinica/mg), ako tu aktivnost ne neutrališu antitela u plazmi pacijenta.

Ovde je već pokazano da se rekombinantni svinjski i modifikovani svinjski faktori VUI mogu razlikovati od humanog faktora VUI po svojoj specifičnoj aktivnosti. Proteini faktora VUL sa većom prokoagulantnom aktivnošću od humanog faktora VUI, od koristi su u lečenju hemofilije, zbog toga što su, za korekciju deficita faktora VTU, potrebne manje doze. Faktori VUI sa nižom prokoagulantnom aktivnošću od humanog faktora VUI, takođe su pogodni za terapijsku primenu, pod uslovom da imaju bar 1% specifične aktivnosti humanog faktora VUI. Faktor VUI ovog pronalaska, koji poseduje prokoagulanmu aktivnost, definisan je, stoga, kao faktor VTU sa najmanje 1% specifične aktivnosti humanog faktora VUI.

U svim sledećim primerima, i ne samo njima, podrazumeva se da je u pitanju već opisani molekul rekombinantnog svinjskog ili modifikovanog svinjskog faktora VTU i metodi njegove izolacije, karakterizacije, dobijanja i primene.

Primer 1: Test svinjskog faktora VUI i hibridnog humano- svinjskog faktora VUI

Koagulaciona aktivnost svinjskog faktora VUI je, na osnovu specifične aktivnosti molekula, veća od aktivnosti humanog faktora VUI. Ovaj zaključak se zasniva na ko-rišćenju odgovarajućih stanciardnih krivih, koje omogućavaju prilično precizna pore-đenja humanog i svinjskog faktora VUI. Testovi koagulacije se oslanjaju na sposobnost faktora VTU da skraćuje vreme koagulacije plazme dobijene od pacijenata sa hemofilijom A. Korišćena su dva tipa testova: jednofazni i dvofazni.

Za jednofazni test koagulacije se 0,1 ml hemofilične A plazme (George King Biochemical, Inc.) S minuta inkubira na 37°C, u vodenom kupatilu, sa 0,1 ml aktiviranog parcijalnog tromboplastinskog reagensa (APTT) (Organon Teknika) i 0,01 ml uzorka ili standarda, koji čini razblažena, citratisana plazma zdravog čoveka. Posle inkubacije se dodaje 0,1 ml 20 mM CaClj, a vreme potrebno za formiranje fibrinskog ugruška se određuje vizuelnim pregledom.

Jedinica faktora VUI se definiše kao količina prisutna u 1 ml citratisane zdrave humane plazme. Korišćenjem humane plazme kao standarda, direktno su poređene aktivnosti humanog i svinjskog faktora VTU. Standard plazme ili prečišćeni proteini se rastvaraju u 0,15 M NaCl, 0,02 M HEPES, pri pH 7,4. Standardna kriva je konstruisana na osnovu 3 ili 4 razblaženja plazme, sa najvećim razblazenjem 1/50, i na osnovu log10vremena koagulacije u odnosu na log10koncentracije u plazmi, čime je dobijen linear-ni grafikon. Jedinice faktora VUI u nepoznatom uzorku su određene interpolacijom u odnosu na standardnu krivu.

Jednofazni test se oslanja na endogenu aktivaciju faktora VUI pod dejstvom ak-tivatora, koji se foirniraju u hemofiličnoj A plazmi, dok dvofazni testovi određuju prokoagulantnu aktivnost prethodno aktiviranog faktora VUI. U dvofaznom testu se uzorci, koji sadrže faktor VUI koji je reagovao sa trombinom, dodaju smeši aktiviranog parcijalnog tromboplastina i humane hemofilične A plazme, prethodno inkubirane 5 minuta na temperaturi od 37°C. Izmerena vremena zgrušavanja se zatim konvertuju u jedinice po ml, prema već opisanoj krivoj humanog standarda. Relativna aktivnost u dvofaznom testu bila je veća u odnosu na aktivnost u jednofaznom testu zbog toga što je faktor VUI unapred aktiviran.

Primer 2: Karakterizacija funkcionalne razlike između humanog i svinjskog

faktora VIII

Izolovanje svinjskog i humanog faktora VUI iz plazme, kao i humanog rekombinantnog faktora VUI, opisano je u literaturi kod Fulcher, CA i sar. (1982)ProcJtfatl. Acad. Sci. USA79:1648-1652; Toole i sar. (1984)Nature302:342-347 (Genetics Institute); Gitschier i sar. (1984)Nature312:337-342 (Genentech); Wood i sar. (1984)Nature312:330-337 (Genentech); Vehar i sar. 312Nature312:337-342 (Genentech); Fass i sar.

(1982)Blood59:594; Toole i sar. (1986)ProcNatl. Acad. Sci. USA83:5939-5942. Ovo se može postići na nekoliko načina. Svi pomenuti preparati su slični po sastavu podjedi-rtica, iako postoje funkcionalne razlike u pogledu stabilnosti između humanog i svinjskog faktora VUI.

U cilju poređenja humanog rekombinantnog i svinjskog faktora VUI, preparati visoko prečišćenog humanog rekombinantnog faktora VUI (Cutter Laboratories, Berkelev, CA) i svinjskog faktora VTU [imunološki prečišćeni, shodno opisu kod Fass i sar. (1982)Biood59:594] podvrgnuti su HPLC sa Mono Q™ (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) anjon-izmenjivačkom kolonom (Pharmacia, Inc.). Cilj Mono Q™ HPLC faze bila je eliminacija manjih nečistoća razmene humanog i svinjskog faktora VUI u zajedničkom puferu za potrebe komparacije. Sadržaj bočica sa 1000 i 2000 jedinica faktora VUI rekonstituisan je sa 5 ml HjO. Zatim je dodavan Hepes (2 M, pH 7,4), do ko-načne koncentracije od 0,02 M. Faktor VUI je aplikovan na Mono 0™ HR 5/5 kolonu, ekvilibrisanu u 0,15 M NaCl, 0,02 M Hepes, 5 mM CaCL,, pH 7,4 (Pufer A plus 0,15 M NaCl); ispran je sa 10 ml Pufera A + 0,15 M Na Cl, pa odvojen od apsorbensa sa 20 ml linearnog gradijenta, 0,15 M do 0,90 M NaCl u Puferu A, pri brzini protoka 1 ml/min.

Za potrebe komparacije humanog faktora VUI iz plazme (prečišćen pomoću Mono Q<TM>HPLC) i svinjskog faktora VUI, imunoafinitetno prečišćen svinjski faktor VUI iz plazme je razblažen u odnosu 1:4 sa 0,04 M Hepesa, 5 mM CaC^, 0,01% Tween-80, pH 7,4, pa podvrgnut Mono Q™ HPLC pod uslovima istim kao u prethodnom opisu, kad se radilo o humanom faktoru VTJI Opisani postupci za izolovanje humanog i svinjskog faktora VUI smatraju se, među ljudima iz struke, standardnim.

Aktivnost faktora VUI određivana je analizom frakcija kolone pomoću jednofaznog testa koagulacije. Srednje vrednosti rezultata testova, izražene jedinicama aktivnosti po A^o materijala, prikazane su u Tabeli U, u ukazuju na to da, kad se koristi jednofazni test, svinjski faktor VUI ima bar šest puta veću aktivnost od humanog faktora vm

Primer 3: Poređenje stabilnosti humanog i svinjskog faktora VIII

Rezultati jednofaznog testa za faktor VUI odražavaju aktivaciju faktora VUI u uzorku, u faktor VUIa, i mogući gubitak aktivnosti formiranog faktora VUIa. Sprovedeno je direktno poređenje stabilnosti humanog i svinjskog faktora VUL Uzorci iz Mono Q™ HPLC (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ) razblaženi su do iste koncentracije i sastava pufera i dovedeni u reakciju sa trombinom. Uzorci za dvofazni test koagulacije su uzi-mani u različita vremena. Uočeno je da je, kao po pravilu, vršna aktivnost (2. minut) svinjskog faktora VUIa bila 10 puta veća od aktivnosti humanog faktora VUIa, a da su aktivnosti oba faktora posle toga opadale, s tim što je aktivnost humanog faktora VUIa opadala brže.

Generalno gledano, pokušaji da se izoluje stabilan humani faktor VUIa nemaju uspeha, čak i kad se obezbede uslovi uslovi koji daju stabilan svinjski faktor VUIa. Kao dokaz ovoga, humani faktor VUL prečišćen pomoću Mono Q™HPLC, aktiviran je trombinom i podvrgnut Mono S™ kation-izmenjivačkoj HPLC (Pharmacia, Inc.), pod iislovima pod kojima nastaje stabilni svinjski faktor VUIa, kako opisuju Lollar i sar.

(1989)Biochemistry28:666.

Humani faktor VUL 43 ug/ml (0,2 uM) u 0,2 M Na Cl, 0,01 M Hepes, 2,5 mM CaCla, pH 7,4, i 10 ml ukupne zapremine, reagovao je 10 minuta sa trombinom (0,036 uM), a u tom periodu je dodat FPR-CtLCl D-ferul-prolH-arginu-Morometilski keton u koncentraciji od 0,2 uM, u cilju ireverzibilnog inaktivisanja trombina. Smeša je, potom, razblažena u odnosu 1:1 sa 40' mM 2-(N-morfolino) etan sulfonskom kiselinom (MES), 5 mM CaClj, pH 6,0, pa prebačena brzinom od 2 ml/min na Mono S™ HR 5/5 HPLC kolonu (Pharmacia, Inc.), ekvilibrisanu u 5 mM MES, 5mM CaClapH 6,0 (Pufer B) plus 0,1 M NaCl. Faktor Vnia je izdvojen bez ispiranja kolone pomoću 20 ml gradijenta iz 0,1 M NaCl u 0,9 M NaCl u Puferu B, brzinom od 1 ml/min.

Frakcija sa koagulantnom aktivnošću u dvofaznom testu, pod ovim uslovima je eluirala kao pojedinačni pik. Specifična aktivnost pik frakcije bila je približno 7,500 J/Aga,. Natrijum dodecil sulfat-pohakrilamidna gel elektroforeza (SDS-PAGE) Mono S™ pika faktora VUIa, nakon koje je usledilo bojenje proteina srebrom, otkrila je dve trake koje odgovaraju heterodimemom (A3-C1-C2/A1) derivatu faktora VUI. Iako bojenje srebrom pod ovim uslovima nije identifikovalo A2 fragment zbog njegove niske koncentracije, ovaj fragment je identifikovan kao oligosastojak pomoću markiranja sa12Sj

Za razliku od rezultata dobijenih sa humanim faktorom VUI, svinjski faktor VUIa, izolovan pod istim uslovima pomoću Mono S™ HPLC, imao je specifičnu aktivnost 1,6 x 10<6>J/Ajgp. SDS-PAGE analiza svinjskog faktora VTUa pokazala je prisustvo 3 fragmenta koji odgovaraju podjedinicama Al, A2 i A3-C1-C2, što pokazuje da svinjski faktor VUIa poseduje tri podjedinice.

Rezultati Mono S™ HPLC preparata humanog, trombinom aktiviranog faktora VUI pri pH 6,0, ukazuju na to da je humani faktor VUIa nestabilan pod uslovima koji da-ju stabilni svinjski faktor VUIa. Međutim, iako je identifikovano prisustvo A2 fragmenta u tragovima u pik frakciji, utvrđivanje toga da li koagulantna aktivnost potiče od malih količina heterotrimemog faktora VUIa ili od heterodimernog faktora VUIa male speci-fične aktivnosti, nije bilo moguće samo na osnovu ovog metoda.

Odgovor na ovo pitanje bi mogao da pruži način za izolovanje humanog faktora VUIa pre nego što izgubi svoju podjedinicu A2. Sa tim ciljem je ostvarena izolacija, postupkom koji uključuje smanjenje vrednost pH Mono S™ pufera na pH 5. Humani faktor VULprečišćen pomoću Mono Q™ (0,5 mg), razblažen je vodom da se dobije ko-načni sadržaj od 0,25 mg/ml (1 u) faktora VUI u 0,25 M NaCl, 0,1 M Hepes, 2,5 mM CaClg, 0,005% Tween-80, pH 7,4 (ukupne zapremine 7,0 ml). Dodavanjem trombina dobijena je konačna koncentracija od 0,72 um i ostavljena da reaguje 3 min. Zatim je trombin inaktivisan sa FPR-CILC1 (0,2 um). Potom je smeša razblažena u odnosu 1:1 sa 40 mM natrijum acetata, 5 mM CaCl^, 0,01% Tween-80, pH 5,0, i preneta brzinom od 2 mVmin na Mono S™HR 5/5 HPLC kolonu, ekvilibrisanu u 0,1 mM natrijum acetata, 5 mM CaCljj, 0,01% Tween-80, uz pH 5,0, i dodatak 0,1 M NaCl. Faktor VUIa je odvojen od apsorbensa bez ispiranja kolone, uz pomoć 20 ml gradijenta, sa 0,1 M naCl u 1,0 M NaCl u istom puferu i brzinom od 1 ml/min. Ovo je za posledicu imalo povraćaj koagu-lantrte aktivnosti u piku, koji je sadržao merljive količine fragmenta A2, što su pokazali SDS-PAGE i bojenje srebrom. Specifična aktivnost frakcije pika bila je desetostruko veća od ponovo uspostavljene aktivnosti uz pH 6,0 (75000 J/A^v. 7500 J/A^. Među-tim, za razliku od svinjskog faktora VTUa izolovanog pri pH 6,0, koji je neograničeno stabilan na 4°C, aktivnost humanog faktora VUIa je neumoljivo opadala tokom nekoliko sati posle izdvajanja sa Mono S™. Pored toga, specifična aktivnost faktora VUIa pre-čišćenog pri pH5,0 i testiranog neposredno potom, iznosila je svega 5% specifične aktivnosti svinjskog faktora VUIa, što ukazuje na to da se pre izvođenja testa javlja značaj-na disocijacija.

Navedeni rezultati pokazuju da se i humani i svinjski faktor VUIa sastoje od po 3 podjedinice (Al, A2 i A3-C1-C2). Odvajanje podjedinice A2 odgovorno je za gubitak aktivnosti i humanog i svinjskog faktora VUIa pod određenim uslovima kao što su fizio-loška jonska snaga, pH i koncentracija. Relativna stabilnost svinjskog faktora VUIa pod određenim uslovima, posledica je čvršće veze podjedinice A2.

Primer 4: Izolacija i sekvenciranje DNK kojom se kodira domen A2 svinjskog

faktora Vm

Ranije sekvenciranje samo za sekvence nukleotida, kojim se kodira domen B i deo domena A2 svinjskog faktora VUI [Toole i sar. (1986)Proc. NatlAcad. Sci. USA83:5939-5942]. cDNK i predviđene aminokiselinske sekvence i (SEQ UD br: 3 odnosno 4) celokupnog domena A2 svinjskog faktora VUI izneti su ovde.

Domen A2 svinjskog faktora VUI kloniran je reverznom transkripcijom celokupne RNK svinjske slezine i pojačavanjem PRC; korišćeni su degenerisani prajmeri, koji se zasnivaju na sekvenci cDNK poznatog humanog faktora VUI i jedan ispravan prajmer, zasnovan na delu sekvence svinjskog faktora VUI. Izolovan je PCR produkt (1 kb) i pojačan ubacivanjem u fagemidni vektor BluescriptTM (Stratagene).

Svinjski domen A2 je potpuno sekvenciran didezoksi sekvenciranjem. Sekvence cDNKi očekivane ammokiselinske sekvence opisani su na SEQ TD br: 3 odnosno 4.

Primer 5: Potpuna sekvenca DNK kojom se kodira svinjski faktor VUI

Klenow fragment, fosforilisaneClal veze(linkeri),Noti linkeri,T4 ligaza iTaqDNK polimeraza nabavljeni su od Promega (Madison, VVisconsin). Polinukleotidna ki-naza je pribavljena od Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Marvland.- f^ P- KTP(Redivue, >5000C i/mmol) potiče iz Amershama. pBluescript U KS- i Epicurean XL1-Blue ćelijeE. colidobijeni su od Stratagene (La Jolla, Califomia). Sintetički oligonu-kleidi su kupljeni od Life Technologies, Inc. ili Cruachem, Inc. 5'-fosforilisani prajmeri su korišćeni prilikom proizvodnje PCR produkata za potrebe Moniranja. Nukleotidno (nt) obrojčavanje oligonukleotida, korišćenih u ulozi prajmera za pojačavanje reakcije lanca polimeraze (PCR) cDNK svinjskog faktora VUI ili genomske DNK, koristilo je cDNK humanog fVTfl kao referentni (standard) (Wood i sar. (1984)supra).

Ukupna RNK svinjske slezine izolovana je gvanidinium tiocijanat-fenol-hloro-form kiselinskom ekstrakcijom [Chomczvnski i sar. (1987)Anal. Biochem.162:156-159]. Ako nije drugačije naglašeno, svinjska cDNK je dobijena iz ukupne RNK slezine pomo-ću reverzne transkriptaze Moloney virusa rrdsje leukemije (RT) i slučajno odabranih heksamera za pokretanje reakcije (First-Strand cDNA Svnthesis Kit, Pharmacia Bio-tech). Reakcije RT su sadržale 45 mM Tris-Cl, ph 8,3, 68 mM Kcl, 15 mM DTT, 9 mM MgClg, 0,8 mg/ml goveđeg serumskog albumina i 1,8 mM dezoksinukleotidne trifosfa-taze (dNTP). Svinjska genomska DNK je izolovana iz slezine primenom standardne procedure (Strauss, W.M. (1995) u Current Protocols in Molecular Bioloav. F.M. Ausubel i sar., urednici, John Wiley & Sons, pp. 2.21-2.2.3). Izolovanje DNK iz agaroz-nog gela obavljeno je korišćenjem Geneclean II (Bio 101) ili Quiex n Gel Extradion Kit (Ciagen).

Reakcije PCR su izvedene pomoću Hvbaid OmniGene termociklatora. Za izvo-đenje PCR reakcija u kojima učestvujeTagDNK polimeraza, reakcije su uključivale 0,6 mM MgClg, 0,2 mM dNTPova, 0,5 uM oligonukleotidnih prajmera, 50 J/ml polimeraze i 0,1 zapreminski deo reakcione smeše prvog lanca cDNK. Ukoliko nije drugačije naglašeno, produkti PCR su izdvajani pomoću gela, krajevi su im zaobljeni pomoću Kleow fragmenta, istaloženi su sa etanolom, pa vezani na EcoRV mesto defosforili-sanog pBluescript II KS- ili vezani sa fosforihsanim Clal vezama pomoću T4 ligaze, obrađeni sa Clal, prečišćeni Sephacrvl S400 hromatografijom, pa vezani na, pomoću Clal presečen, defosforilisan pBluescript II KS-. Ligacija je obavljena uz pomoć T4 DNK ligaze (Rapid DNA ligation kit, Boehringer Mannheim), osim ako nije drugačije naglašeno. Plazmidi pBluescript II KS- sa umemutimm delom korišćeni su za trans-formisanje Epicurean XL1-Blue ćelijaE. coli.

Sekvenciranje plazmidne DNK obavljeno je pomoću automatskog uređaja za sekvenciranje Applied Svstems 373a i seta za uklanjanje boje PRISM, ili pak ručno, uz korišćenje seta za sekvenciranje Seguenase v. 2.0 (Amersham Corporation). Direktno sekvenciranje produkata PCR, uključujući i završno markiranje završetka nukleotida sa 3aP, obavljeno je primenom protokola sekvenciranja ciklusa (dsDNA Cycle Seguen-cing System, Life Technologies).

Izolacija klonova cDNK svinjskog MH koji sadrže kodone 5' UTR sekvence.signalnoo

peptida i domena Al

5' domena A2 cDNK svinjskog fVTH pojačana je usađenom RT-PCR ukupne RNK slezine ženke svinje, korišćenjem protokola 5' brze amplifikacije završetaka cDNK (S'-RACE) (MaraHion cDNA Amplification, Clontech, Version PR55453). To je

obuhvatilo sintezu prvog lanca cDNK uz pomoć oligo(dT) prajmera za vezivanje i fiksi-ranje [Borson, N.D. i sar. (1992)PCR. MethodsJippl.2:144-148], sintezu drugog lanca cDNK uz korišćenje DNK polimeraze IE. coli,i vezivanje sa adapterom dvostrukog lanca, proširenim sa 5', SEQID Br.:5.

čiji je kraći lanac blokiran na 3' završetku jednom amino grupom radi redukovanja ne-specifičnog prajmiranja PCR, a komplementaran je grupi od 8 nukleotida na 3' zav-ršetku (Siebert, P.D. et al. (1995)NucleicAcids. Res.23:1087-1088). U prvoj seriji obav-ljenih PCR korišćeni su oligonukleotidi specifični za adapter, SEQ ID Br.: 6 odnosno 5'-CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC-3' (označen sa AP1) kao sens prajmer, i oligonukleotid specifičan za A2-domen svinjskog fVTJI, SEQ IN br.: 7 5-CCA TTG ACA TGA AGA CCG TTT CTC-3' (nt 2081.2104) kao antisens prajmer. Druga serija PCR koristila je usađeni, adapter-specifični oligonukleotid, SEQ ID br.: 8 5-ACT CAC TAT AGG GCT CGA GCG GC-3' (označen sa AP2), kao sense prajmer, i usađene, za svinjski domen A2 specifične oligonukleotide, SEQ ID br.: 9 S'-GGG TGC AAA GCG CTG ACA TCA GTG-3 (nt 1497-1520), kao antisense prajmer. PCR su rađe-ne uz pomoć komercijalnog seta (Advantage cDNK PCR ćore kit), koji obuhvata pro-tokol brzog starta posredovanog antitelima [Kellogg, D.E. i sar. (1994)BioTechniques16:1134-1137]. Uslovi PCR su podrazumevali denaturaciju na 94°C tokom 60 sekundi, nakon koje je usledilo 30 ciklusa (prva serija PCR) odnosno 25 ciklusa (druga serija PCR) od po 30 sek. denaturacije na 94°C, očvršćavanje (30 sek.) na 60°C, i 4-minutna elongacija na 68°C, uz korišćenje uređaja za temperaturnu kontrolu. Ovim postupkom je dobijen ispupčen (=1.6 kb) proizvod, usklađen s amplifikacijom fragmenta, koji zalazi oko 150 bp u 5' UTR. Produkt PCR je kloniran u pBluescript pomoću Clal linkera. Četiri ubačena klona su sekvencirana u oba pravca.

Sekvenca ovih klonova obuhvata zone koje odgovaraju 137 bp 5TJTR, signalnog peptida domena Al i dela domena A2. Usaglašenost je postignuta na najmanje 3 od 4 mesta. Klonovi su, ipak, sadržali u prošeku 4 očigledne mutacije koje je dala PCR, verovatno zbog većeg broja serija PCR, koje su bile potrebne za generisanje proizvoda koji se može klonirati. Stoga su, za stvaranje sens lanca fosforilisanog prajmera PCR, korišćene sekvence iz regije signalnog peptida, SEQ ID br.: 10 5-CCT CTC GAG CCA TGT CGA GCC ACCATGCAG CTA GAG CTC TCC ACC TG-3', označene sa RENEOPIGSP, za sintezu drugog produkta PCR u cilju potvrđivanja sekvence i za kloniranje u vektor ekspresije. Masnim slovima označen red označava polazni kodon. Sekvenca 5' ovde predstavlja sekvencu identičnu 5' mesta ugradnje u ekspresioni vektor sisara ReNeo, korišćen za ekspresiju fVTII (Lubin i sar. (1994)supra).Ova lokacija uključuje i mesto cepanja Xhol (podvučeno). RENEOPIGSP i nukleotid nt 1497-1520 korišćeni su za pokretanjeTaqDNK-polimerazom posredovane PCR reakcije u kojoj se, kao kliše, koristi cDNK ženke svinje. DNK polimeraza drugih proizvođača nije omogućila dobijanje merljivog proizvoda. Uslovi PCR su uključivali denaturisanje na 94°C (4 min), 35 ciklusa 1-minutnog denaturisanja na 94°C, očvršćavanje (2 min) na 55°C, i elongaciju 2 min. na 72°C, a zatim završnu fazu elongacije (5 rriin. na 72°C). Produkt PCR je Moniran u pBluescript pomoću Clal veza. Umetci ova dva klona su sekvencirani u oba pravca i odgovarali su dogovorenom nizii.

Izolacija klonova cDNK svinjskog fVHI, koii sadrže kodone domena A3.Cl i 5' polovinu

domena C2

Na početku su klonirana dva produkta RT-PCR svinjske slezine, koja odgovaraju fragmentu domena B-A3 (nt 4519-5571) i fragment domena C1-C2 (nt 6405-6990). Dobijem završetak 3' domena C2 zalazio je u regiju eksona 26, a to je terminalni ekson u fVTII. Produkt B-A3 je dobijen korišćenjem prajmera specifičnog za svinjski B domen, SEQ ID br: 11 S'-CGC GCG GCC GCG CAT CTG GCA AAG CTG AGT T 3', u kojem podvučena regija odgovara regionu u svinjskom fVUI koji se poklapa sa nt 4519-4530 u humanom fvTJI. Regija 5' oligonukleotida obuhvata Noti mesto koje je bilo predviđeno za svrhu Moniranja Antisens prajmer korišćen za stvaranje B-A3 produkta, SEQ TD br: 12 5-GAA ATA AGC CCA GGC TTT GCA GTC RAA-3', bazirao se na obrnutom kom-plementu niza cDNA humanog rVUI na nt 5545-5571. Reakcija PCR obuhvatila je 50 mM KC1, 10 mM Tris-Cl, pH 9,0, 0,1% Triton X-100, 1,5 mM MgCl,, 3,5 mM dNTPova, 20 uM prajmere, 25 jedinica/mlTaqDNK polimeraze i 1/20 zaprernine RT reakcione smeše. Uslovi PCR su uključivali denaturisanje na 94°C tokom 3 min, zatim 30 ciklusa 1-minutnog denaturisanja na 94°C, očvršćavanje (2 min) na 50°C, i elongaciju 2 min. na 72°C. Proizvodi PCR su fosforilisani uz pomoć T4 DNK kiriaze i dodati su Noti linkeri. Posle isecanja pomoću Noti, PCR fragmenti su klonirani u Noti lokaciju BlueScript U KS- i transformisani uXLl-Blue ćelije.

C1-C2 proizvod je napravljen korišćenjem poznate sekvence humane cDNK za sintetisanje sens i antisens prajmera, SEQ ID br: 13 5'-AGG AAA TTC CAC TGG AAC CTT N-3' (nt 6405-6426) odnosno SEQ ID br: 14 5'-CTG GGG GTG AAT TCG AAG GTA GCG N-3' (obrnutog komplemeta nt 6966-6990). Uslovi PCR su bili identični uslovima za generisanje B-A2 proizvoda. Dobijeni fragment je vezan na pNOT vektor kloniranja pomoću Prime PCR Cloner Cloning System (5 Prime-3, Prime, Inc., Boulder, Colora-do) i uzgajen u JM109 ćelijama.

Plazmidi B-A3 i C1-C2 su delimično sekvencirani da bi se dobili specifično svinjski sens i antisens oligonukleotidi SEQ TD br.: 15 5-GAG TTC ATC GGG AAG ACC TGT TG-3' (nt 4551-4573) odnosno SEQ TD br.: 16 5'-ACA GCC CAT CAA CTC CAT GCG AAG-3' (nt 6541-6564). Ovi oligonukleotidi su korišćeni kao prajmeri za stvaranje 2013 bp produkta RT-PCR uz pomoć seta Clontech Advantage cDNA PCR. Ovaj produkt, koji odgovara humanom nt 4551-6564, uključuje i regiju koja odgovara aktiva-cionom peptidu lakog lanca (nt 5002-5124), domenu A2 (nt 5125-6114) i većem delu domena Cl (nt 6115-6573). Sekvenciranjem klona C1-C2 utvrđeno je da su humana i svinjska cDNK, od nt 6564 do 3' završetka domena Cl, identične. Produkt PCR je kloniran u EcoR mesto pBluescript II KS-. Četiri klona su potpuno sekvencirana u oba pravca. Usaglašenost je postignura u bar 3 od 4 mesta.

Izolacija klonova cDNK svinjskog fVffl, koii sadrže 3' polovinu kodona domena C2

Domen C2 humanog fVUI (nukleotidi 6574-7053) smešten je u eksone 24-26 (Gitschier J. i sar. (1984)Nature312:326-330). Humani ekson 25 sadrži 1958 bp, što odgovara nukleotidima 6901-8858. Sadrži 1478 bp 3' netransplantiranog niza. Pokušaji da se klonira cDNK eksona 26 koja odgovara 3' završetku domena C2 i 3' UTR pomoću 3' RACE [Siebert i sar. (1995)supra],inverzne PCR [Ochman, H. i sar. (1990)Bio-technology ( N. Y.)8:758-760], PCR restrikcionog mesta [Sarkar, G. i sar. (1993)PCRMethAppl.2:318-322], '"nepredvidivo prajmirane" PCR pominguez, O. i sar. (1994)NucleicAcids. Res.22:3247-3248] i pregledom biblioteke cDNK svinjske jetre, nisu imali uspeha. Pokušavalo se sa 3' RACE, uz korišćenje iste biblioteke za adapter vezane cDNK dvostrukog lanca, koja je s uspehom korišćena za kloniranje 5' završetka cDNK svinjskog fVUI. Neuspeh ovog metoda nije, stoga, bio posledica odsustva cDNK koja odgovara eksonu 26.

Za kloniranje 3' polovine domena C2 korišćena je PCR procedura preklapanja ciljnog gena [Parker, J. i sar. (1991)NucleicAcids. Res.19:3055-3060]. Svinjski specifi-čan sens prajmer, SEQ TD br:17 5'-TCAGGGCAATCAGGACTCC-3' (NT 6904-6924) sintetisan je na bazi inicijalne sekvence domena C2 i korišćen u PCR reakciji sa ne-specifičnim prajmerima koji se preklapaju, izabranim među oligonukleotidima kojima je laboratorija raspolagala. Proizvodi PCR su zatim izdvajani pomoću analize ekstenzije prajmera [Parker i sar. (1991)BioTechniques10:94-101], primenom svinjski speci-fičnog internog prajmera, markiranog na ^P završetku, SEQ ID br: 18 5-CCGTGG TGAACGCTCTGG-ACC-3' (NT 6932-6952). Zanimljivo je da su, od 40 ispitivanih ne-specifičnih prajmera, samo dva dala pozitivne proizvode na analizu ekstenzije prajmera, i da su ta dva odgovarala pravilnoj i degenerisanoj humanoj sekvenci na 3' za-vršetku domena C2: SEQ ID br: 19 5'-GTAGAGGTCCTGTGCCTCGCAGCC-3' (nt 7030-7053) i SEQ ID br: 20 5-GTA GAGSTSCTGKGCCTCTCAKCCYAG-3' (nt 7027-7053). Ovi prajmeri su, u početku, bili namenjeni dobijanju proizvoda primenom kon-vencionalne RT-PCR, ali nisu dali dovoljno proizvoda koji bi se mogao uočiti pomoću vezivanja etidijum-bromid-ne boje. PCR proizvod se može, međutim, identifikovati osetljivijim metodom ekstenzije prajmera. Proizvod je prečišćen gelom i direktno sekvenciran. Ovo je proširilo niz svinjskog iVUI do nt 7026.

Drugi niz je dobijen analizom ekstenzije prajmera primenjenom na usađeni proizvod PCR, dobijen korišćenjem biblioteke za adapter vezane cDNK dvostrukog lanca, koja je korišćena u prethodno opisanom 5'- RACE protokolu. Prva serija reakcije koristila je ispravan svinjski prajmer SEQ Id br: 21 S'-CTTCGCATGGAGTTGATGGGC TGT-3' (nt 6541-6564) i AP1 prajmer. TJ drugoj seriji reakcije korišćen je SEQ ID br. 22 S'-AATCAG GACTCCTCCACCCCCG-3' (nt 6913-6934) i AP2 prajmer. Direktno PCR sekvenciranje je proširilo sekvencu 3' do kraja domena C2 (nt 7053). Sekvenca domena C2 bila je jedinstvena, osim na nt 7045, kod 3' završetka domena C2. Analiza ponovljenih PCR reakcija je davala na tom mestu A, G ili udvojeno A/G.

Sekvenciranje je zašlo i u 3' UTR pomoću dva dopunska prajmera, SEQ IN br.: 23 5'-GGA TCC ACC CCA CGA GCT GG-3' (nt 6977-6996) i SEQ ID br.: 24 5'-CGC CCT GAG GCT CGA GGT TCT AGG G-3' (nt 7008-7031). Dobijeno je približno 15 bp 3' UTR sekvence, iako je sama sekvenca na nekoliko mesta bila nejasna. Zatim je, na osnovu najboljih procena 3' UTR, sintetisano nekoliko antisens prajmera. Ti prajmeri su sadržali obrnuti komplement TGA zaustavnog kodona na 3' završecima. PCR proizvodi su dobijeni iz genomske DNK svinjske slezine i cDNK svinjske slezine, koje su visuelizovane agaroza gel elektroforezom i bojenjem etidijum bromidom, pomoću specifičnog sens prajmera SEQ ID bn 25 5'-AAT CAG GAC TCC TCC ACC CCC G-3'

(nt 6913-6934) i 3' UTR antisens prajmera SEQ ID br: 26 5'-CCTTGCAGGAATTCG ATTCA-3'. Za dobijanje dovoljne količine materijala za svrhe kloniranja, izvršena je druga serija PCR uz pomoć usađenog sens prajmera SEQ TD br.: 27 5'-CCGTGG TGAACGCTCT GGACC-3' (nt 6932-6952) i isti antisens prajmer. Dobijeni 141 bp proizvod PCR kloniran je u EcoRV-isečen pBluescript IIKS-. Za tri klona dobijena iz genomske DNK i tri klona iz cDNK uzete su sekvence u oba pravca. Sekvence su bile jasne, osim na nt 7045, gde je genomska DNK bila uvek A a cDNK uvek G.

Aranžmani više sekvenci DNK humanog, svinjskog i mišjeg NHL ( SI. 1A- 1H)

Aranžmani signalnog peptida i regiona Al, A2, A3, Cl i C2 urađeni su uz po-moć CLUSTALVV programa [Thompson, J.D. i sar. (1994)NucIeicJlcids. Res.22:4673-4680]. Kazne za nezatvoren niz i prazninu u ekstenziji bile su 10 odnosno 0,5. Aranž-mani humanog, svinjskog i mišjeg B domena opisani su prethodno [Elder i sar. (1993)supra].Humani niz A2 odgovara amino kiselinama 373-740 u SEQ ID br:2. Svinjska aminokiselinska sekvenca A2 data je u SEQ ID br:4, a sekvenca amino kiselina domena A2 miša predstavljena je na SEQ ID br:28, amino kiseline 392-759.

Primer 6: Ekspresija aktivnog, rekombinantnog svinjskog faktora VUI lišenog

domena B ( PB~)

Materijali:

Citratisana humana hemofilična A i zdrava donatorska plazma su nabavljene od George King Biomedical, Inc. Fetalni goveđi serum, geneticin, penicilin, streptomi-cin i podloge DMEM/F12 i AIM-V isporučila je Life Technologies, Inc.TaqDNK polimeraza kupljena je od firme Promega,VentDNK polimeraza od New England Biolabs,PfuDNK polimeraza i fagemidni pBlueScript II KS" od Stratagene. Sintetski oligonukleotidi su kupljeni od Life Technologies ili Cruachem, Inc., restrikcioni enzimi od New England Biolabs ili Promega. TJ proizvodnji PCR produkata za potrebe Mortiranja korišćeni su S'-fosforilisani prajmeri. Za nukleolidno (nt) obeležavanje oligonukleotida korišćenih u ulozi prajmera za PCR pojačavanje cDNK svinjskog fVTII ili genomske DNK, korišćena je cDNK humanog fVTJI kao referentni standard [Wood i sar. (1984)Nature312:330-337], Ekspresioni vektor rVUI, označen sa HBTReNeo isporučio je Biogen, Inc. HB~/ReNeo sadrži gene ampicilinske i geneticinske rezistencije i cDNK humanog fVTJJ, kojoj nedostaje čitav domen B, definisanoj kao Ser741-Argl648 fragment cepanja pod dejstvom trombina. Za pojednosetvljivanje mutageneze domena C2 cDNK humanog fVnL koji se nalazi na 3' završetku umetka FVTJI u ReNeo, ubačeno je Noti mesto od dve 3<*>baze pre zaustavnog kodona HBTReNeo, pomoću mutageneze omo-tavanjem ekstenzijom koja se preklapa (SOE). [Horton, RM. i sar. (1993)Methods. Enzymol.217:270-279]. Ova struktura je obeležena sa HB"ReNeo/NotI.

Ukupna RNK je izolovana ekstrakcijom gvanidinuijum tiocijatat-fenol-hlorofor-mom [Chomczvinski, P. i sar. (1987)AnaLBiochem.162:156-159], cDNK je sintetisana iz mRNK pomoću reverzne transkriptaze (RT) Moloney-evog virusa mišje leukemije i slučajno odabranih heksamera, u skladu sa uputstvom proizvođača (First-Strand cDNK Svnthesis Kit, Ciagen, Inc.). Za izvođenje PCR reakcija korišćen je Hvbaid OmniGene termociklator koji koristiTaq, VentiliPfuDNK polimeraze. Produkti PCR su prečišćeni gelom, istaloženi sa etanolom, i vezani u plazmidnu DNK pomoću T4 DNK ligaze (Rapid DNK ligation kit, Boehringer Mannheim). Plazmidi sa umetkom su korišćeni za transformaciju Epicurean XL1-Blue ćelija. Sve nove sekvence DNK faktora VTU stvore-ne pomoću PCR, potvrđene su didezoksi sekvenciranjem pomoću automatskog uređa-ja za sekvenciranje Applied Biosvstems 373a i seta za eliminaciju boje PRISM.

Konstrukcija ekspresionog vektora hibridnog fvTJI.HP20.koji sadrži svinjski domen C2

cDNK svinjskog fVTfl, koja odgovara 3' završetku domena Cl i čitavom domenu C2, klonirana je u pBluescript pomoću RT-PCR iz ukupne RNK slezine, uz pomoć prajmera, baziranih na poznatoj sekvenci cDNK svinjskog fVTJI [Healev, J.F. i sar.

(1996)Blood88:4209-4214], Ova struktura i HBTReNeo su korišćeni kao klišei za dobijanje proizvoda fuzije humanog Cl-svinjskog C2 u pBluescript-u pomoću SOE mutageneze. Fragment C1-C2 iz ovog plazmida je odstranjen uz pomoćApaliNoti,i vezan uApal //Voft-presečen HB'/ ReNeo/ Notl,čime je dobijen HP20/ReNeo//Vbč/.

Konstrukcija hibridnog humano/svinjskog faktora VUI bez B domena,

koji sadrži svinjski laki lanac ( HP18)-

Laki lanac humanog fVTII sastoji se od annmokiselinskih reziduuma Aspl649-Tyr2332. Odgovarajući reziduumi cDNK svinjskog fVTJI zamenjeni su ovim regionom HB'da bi se dobio molekul hibridnog humano/svinjskog fvTJL označen kao HP18. To je izvršeno supstitucijom PCR produkta koji odgovara svinjskom regionu A2, domena A3 i Cl, kao i dela domena C2 u odgovarajući regiju HP20. Da bi se postupak konstrukcije olakšao, u nt 2273 je SOE mutagenezom uvedeno sinonimnoAvrUmesto, na spoju domena A2 i A3 HP20.

Konstrukcija hibridnog humano/ svinjskog faktora VUI bez B domena, koji

sadrži svinjski signalni peptid i domene Al i A2 ( HP22)-

Signalni peptid i domeni Al i A2 humanog fvTfl sastoje se od ammokiselinskih reziduuma Met(-19)-Arg740. Odgovarajući reziduumi cDNK svinjskog fVTfl zamenjeni su ovim regionom HB"da bi se dobio molekul označen sa HP22. Osim toga, u nt 2273 uvedeno je istoznačnoAvrUmesto, na sastavu domena A2 i A3 HP22. HP22 je konstruisan stapanjem fragmenta svinjskog signalnog peptida-Al-dela A2 u pBluescript [Healv i sar. (1996)supra]sa hibridnim humano/svmjskim faktorom VUI bez B domena, koji sadrži svinjski domen A2, označen sa HP1 [Lubin i sar. (1994)supra].

Konstrukcija svinjsko<g>faktora VUI lišeno<g>domena B ffVTJI- fPB ) 1

Fra<g>ment Spel/Notl HP18/BS(+ AvrII)kondenzovan jepomoću AvrU/ Notli po-vezan u HP22/BSi+ Avrl)kondenzovanompomoću AvrU/ Notlda bi se dobila struktura PB~/BS(+ AvrII),koja se sastoji od svinjskog fVTJI kojem nedostaje čitav B domen. PB' je kloniran u ReNeo vezivanjemXba/ NotIfragmenta PB'/BS (+AvrII) u HP22/ReNeo

/ Noti (+ AvrU).

Ekspresija molekula rekombinantnog fVTJI

PB'/ReNeo/NotI(+ AvrU)i HP22/ReNeo/iVot/(+ AvrII)su na kratko ubačeni u COS ćelije i eksprmurani kao što je već ranije opisano [Lubin, J.M. i sar. (1994)J. Biol. Chem.269:8639-86411. HBTReNeo/Notl i lažna DNK su ubačeni u ulozi kontrole.

Hromogeni test je korišćen za određivanje fVTJI (koagulacione) aktivnosti PB", HP22 i HB", na sledeći način. Uzorci fVTII u supematantima COS ćelijske kulture su aktivirani pomoću 40 nM trombina u 0,15 M NaCl, 20 mM HEPES, 5 mM CaCLj, 0,1% Tween-80, pH 7,4 u prisustvu 10 nM faktora Ka, 425 nM faktora X i 50 uM jednola-melamih fosfatidu-serm/fosfatiđu-hoUnskih(25/75w/w) vezikula. Nakon 5 minuta, reakcija je prekinuta pomoću 0,05 M EDTA i 100 nM rekombinantnog desutfatohiruđina, a dobijeni faktor Xa je meren testom hromogenog supstrata. U toku testa hromogenog supstrata je dodato 0,4 mM Spectrozvme Xa, a brzina oslobađanja paranitroanilida je određivana merenjem apsorbanse rastvora na 405 nm.

Rezultati nezavisno ubačenih supematanta duplikatne ćelijske kulture (apsorbansa na 405 nm po minutu)

HB": 13,9

PB': 139

HP22:100

surogat: < 0,2

Ovi rezultati pokazuju da su svinjski fVm bez domena B i fVTJI bez domena B, a koji se sastoji od podjedinica Al i A2, aktivni i ukazuju na to da je njihova aktivnost veća od aktivnosti humanog MH bez domena B.

PB- je delimično prečišćen i koncentrovan iz hranljive podloge heparin-Sepharose hromatografijom. Heparin-Sepharose (10 ml) je ekvilibrisana sa 0,075 M NaCl, 10 mM HEPES, 2,5 mM CaCljj, 0,005% Tween-80, 0,02% natrijum-azida, pH 7,40. Podloga (100-200 mi) ekspruTurartih ćelija se nanosi na heparin-Sepharose, koja se potom ispira sa 30 ml ekvilibracionog pufera bez natrijum-azida. PB" je izdvojen pomoću 0,65 M NaCl, 20 mM HEPES, 5 mM CaClg, 0,01% Tween-80, pH 7,40, i čuvan na temperaturi od -80°C. Prinos koagulacione aktivnosti fVTJI bio je, po pravilu, 50-75%.

Stabilna ekspresija svinjskog fVTII bez domena B ( PB")

Transfektirane ćelijske linije su čuvane u Dulbecco-voj modifikovanoj Eagle podlozi-F12, koja sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma, 50 J/ml penicilina i 50 ug/ml streptomicina. Pre upotrebe je fetalni goveđi serum 1 sat termički inaktivisan (50°C). HB /ReNeo iPB/ReNeo/AfotfC+AvrU)su stabilno transfektovani u BHK ćelije i birani po geneticinskoj rezistenciji prema opštem, prethodno opisanom protokolu [Lubin i sar. (1994)BioLChem.269:8639-8641], s tom razlikom što su ekspresivne ćelije gajene u hranljivoj podlozi koja je sadržala 600 ug/ml geneticina. Ćelije iz Corning T-75 normalnog suda, dorasle do spajanja, prenete su u Nunc trostruki sud u podlozi sa 600 ug/ml geneticina, i puštene da se spoje. Zatim je podloga uklonjena i zamenjena ATM-V podlogom bez seruma (Life Technologies, Inc.) i bez geneticina. Ekspresija faktora VUI je praćena preko jednofazne koagulacione aktivnosti faktora VUI (v. gore), a jednom dnevno je, tokom 4 do 5 dana, uzimano po 100-150 ml podloge. Maksimalni nivoi ekspresije HB i PB"u podlozi bili su 102 J/ml odnosno 10-12 J/ml koagulacione aktivnosti faktora VUL

Prečišćavanje PB"

PB"je istaložen iz supematanta kulture pomoću 60% zasićenog amonijum-sulfata, a zatim prečišćavan pomoću V73-3 imunoafinitetne hromatografije i Mono 0 HPLC, kao što je prethodno navedeno kad je bilo reći o prečišćavanju svinjskog faktora VTJI iz plazme [Lollar i sar. (1993) Factor VUI/factor VUIa.Methods. Enzymol.222:128-143]. Specifična koagulaciona aktivnost PB- je merena jednofaznim testom koagulacije [Lollar i sar. (1993)supra].

Analiziran SDS-pohakruamidnom gel elektroforezom, preparat PB- je sadržao tri trake uočljivih molekularnih masa 160 kDa, 82 kDa i 76 kDa. Trake od 82 kDa i 76 kDa su prethodno opisane kao heterodimeri, koji sadrže domene A1-A2 i ap-A3-Cl-C2 (gde seapodnosi na aktivacioni peptid) [Toole i sar. (1984)Nature312:342-347]. Tra-ka od 160 kDa je preneta na poBviniuden-fluoriđnu membranu u podvrgnuta se-kvenciranju NH2 završetka, koje je dalo Arg-fle-Xx-Xx-Tyr (gde Xx označava nepoznato), što je sekvenca NH2 završetka faktora VUI jednostrukog lanca [Toole i sar.

(1984)supra].PB" je, tako, delimično prerađen rascepom između domena A2 i A3, i to tako da ga čine dva oblika, protein jednostrukog lanca Al-A2-ap-A3-Cl-C2 i heterodi-mer Al-A2/ap-A3-Cl-C2. Postoje podaci o sličnoj obradi za rekombinantni HB [Lind i sar. (1995)Eur. J. Biochem.232:19-27].

Karakterizaciia svinjskog faktora VTJI

Utvrdili smo sekvencu cDNK svinjskog fVTJI koja odgovara 137 bp 5' UTR, regije kojom se kodira signalni peptid (57 bp), kao i domene Al (1119 bp), A3 (990 bp), Cl (456 bp) i C2 (483 bp). Zajedno sa prethodno objavljenom sekvencom domena B i regiona aktivacdonog peptida lakog lanca [Toole i sar. (1986)supra]i domena A2 [Lubin i sar. (1994)supra],sekvenca koja se ovde iznosi kompletira određivanje cDNK svinjskog fVTJI, koja odgovara izmenjenom proizvodu. Fragment koji obuhvata regiju 5' UTR signalni peptid i domen Al cDNK, kloniran je uz pomoć 5'-RACE RT-PCR protokola. Prajmer koji se bazira na sekvenci humanog C2 pokazao se uspešnim za dobijanje RT-PCR proizvoda koji je doveo do kloniranja domena A3, Cl i 5' polovine domena C2. Pošto se Moniranje cDNK, koja odgovara 3' polovini domena C2 i 3' UTR cDNK, pokazalo teško izvodljivim, preostali deo domena C2 je, na kraju, kloniran PCR procedurom preklapanja ciljnog gena [Parker i sar. (1991)supra].

Sekvenca SEQ TD bn 29 bila je potpuno jasna osim na nt 7045, uz 3' završetak domena C2, koji je ili A ili G, kao što je napred izneto. Odgovarajući kodon je GAC (Asp) ili AAC (Asn). Humani i mišji kodoni su GAC odnosno CAG (Gln). Ostaje nepoznato da li je u pitanju polimorfizam ili PCR proizvod koji se ponavlja. cDNK rekombinantnog hibridnog humano/svinjskog fVTJI, koja sadrži supstitute svinjskog domena C2 koji odgovara i kodonu GAC i kodonu AAC, stabilno su eksprirairane bez merljivih razlika u pogledu prokoagulantne aktivnosti, što ukazuje na to da nema nikakve funkcionalne razlike između ove dve varijante domena C2.

Poredak predviđene sekvence amino kiselina pune dužine svinjskog fVTfl SEQ TD br: 30, zajedno sa publikovarum humanim [Wood i sar. (1984)supra]i mišjim [Elder i sar. (1993)supra]sekvencama, prikazan je na SI. 1A-1H, zajedno sa mestima za iz-mene posle pretvaranja, proteolitičkog rascepa i prepoznavanja od strane drugih ma-kromolekula. Stepen podudaranja ovih sekvenci je prikazan u Tabeli VII. Kao što je već naglašeno, domeni B ovih vrsta se više razlikuju nego domeni A ili C. Ovo se sasvim slaže sa zapažanjem da domen B, i pored svoje veličine, nema poznate funkcije [Elder i sar. (1993)supra;Toole i sar. (1986)supra].Rezultati ovog pronalaska potvrđuju da za aktivnost svinjskog fVTII, domen B nije ni potreban. Na osnovu ovde iznetih poda-taka sekvenciranja, može se sintetizovati svinjski rVUI kod kojeg je uklonjen ceo domen B ili deo tog domena, i to ekspresijom DNK kojom se kodira svinjski fVTJI, iz koje je uklonjen ceo domen B ili deo kodona svinjskog domena B. Postoje, takođe, veće razlike među sekvencama koje odgovaraju domenu Al peptida cepanja APC/faktora Ka (reziduumi 337-372) i aktivacionog peptida lakog lanca (Tabela VII). Mesto cepanja trombina na poziciji 336, da bi se generisao 337-372 peptid, kod miša, očigledno, ne postoji, pošto je taj reziduum glutamin, a ne arginin [Elder i sar. (1993)supra].Relativno brzo razdvajanje peptida cepanja trombina (ili, možda, u mišjem fVTJI rudimen-tarni aktivacioni peptid 337-372), zapaženo je ranije kod fibrinopeptida [Creighton, T.E. (1993) u Proteins: Structures and Molecular Properti. es. W.H. Freeman, New York, s. 105-138]. Manjak biološke funkcije ovih peptida posle cepanja naveden je kao mo-gući uzrok brzog razdvajanje. Smatralo se da je Arg562 u humanom fVHI značajnije mesto cepanja aktiviranog proteina C u toku inaktivisanja fVTJI i fVTIIa [Fay, P.J. i sar.

(1991)J. BioLChem.266:20139-20145]. Ovo mesto je očuvano i u humanom, i u svinjskom i u mišjem faktoru VUI.

Potencijalna N-vezana mesta glikozilacije (NXS/T, gde X nije prolin) mogu se videti na SI. 1A-1H. Postoji osam sačuvanih N-vezanih mesta glikozilacije: jedno u domenu Al, jedno u domenu A2, četiri u domenu B, jedno u domenu A3 i jedno u domenu Cl. Cisteini 19A i domena C su očuvani, dok kod cisterna domena B postoji razdvajanje. Na homolognim mestima u faktoru V i cendoplazminu nađeno je šest od sedam di-sulfidnih veza iz fVIII, a obe disulfidne veze C domena se nalaze u faktoru V [McMullen, BJL i sar. (1995)Protein Sci.4:740-746]. Humani fVTH sadrži sulfatisane tirozine na pozicijama 346, 718, 719, 1664 i 1680 rPittman, D.D. i sar. (1992)Biochemistry31:3315-3325; Michnick, DA i sar. (1994)J. BioLChem.269:20095-201021. Ovi reziduumi su očuvani u fVTJI miša i svinjskom fVTJI (SI. 1), iako CLUSTALV7 pro-gram nije uspeo da definiše mišji tirozin, koji odgovara Tyr346 u humanomfVEEL

Plazma miša i svinje može da koriguje defekt koagulacije u humanoj hemofi-iičnoj A plazmi, što je u saglasnosti sa nivoom očuvanosti reziduuma u domenima A i C ovih životinjskih vrsta. Prokoagulantna aktivnost svinjskog fVin veća je od one koju poseduje humani fVTJI [Lollar, P. i sar. (1992) J.Biol.Chem. 267:23652-23657]. I rekombinantni svinjski fVTII (bez domena B), eksprimiran i prečišćen kao što je ovde izneto, budući sličan svinjskom fVTJI iz plazme, takođe ispoljava veću specifičnu koagulantnu aktivnost od humanog fvTJI. To je, možda, posledica smanjene brzine spontane disocijacije podjedinice A2 od aktivnog A1/A2/A3-C1-C2 heterotrimera rVIH. Ostaje nepoznato da li ova razlika u prokoagulantnoj aktivnosti odražava evolucionu pramenu funkcije, kao primer adaptacije vrste [Perutz, M.F. (1996)Adv. Protein. Chem.36:213-244]. Sada, kada je potpuna sekvenca cDNK svinjskog fvTJI, koji odgovara ko-piranom proizvodu, homolog skan mutageneza [Cunningham, B.C., i sar (1989)Science243:1330-1336] mogla bi da obezbedi način za identifikovanje strukturnih razlika između humanog i svinjskog NM, odgovornih za nadmoćnu aktivnost svinjskog fvni.

Svinjski fVIII je, po pravilu, manje reaktivan u prisustvu inhibitornih antitela, koja se stvaraju kod hemofiličara koji su primali infuzije fVHI, ili onih koja nastaju kao autoantitela kod ljudi uopšte. To i predstavlja osnovu za korišćenje koncentrata svinjskog NM u lečenju pacijenata s inhibitonum antitelima [Hav i Lozier (1995)supra].Većina inhibitora je usmerena na epitope smeštene u domenima A2 ili C2 [Fulcher, CA i sar. (1985)Proc. NatLAcad. Sd USA82:7728-7732; Scandella, D. i sar. (1988)Proc. NatiAcad. Sci. USA85:6152-6156; Sandella, D. i sar. (1989)Blood74:1618-1626]. Osim toga, u jednom od domena, A3 ili Cl, identifikovan je i jedan epitop nepoznatog značaja [Scandella i sar. (1989)supra;Scandella, D. i sar. (1993)Blood82:1767-1775; Nakai, H. i sar. (1994)Blood84:225a]. Epitop A2 je mapiran u reziduume 484-508 homolog skan mutagenezom [Healev i sar. (1995)supra].U ovom 25 segmentu reziduuma relativno je mali deo identične sekvence (16/25 ili 64%). Zanimljivo je da je ovaj region koji se, zbog činjenice da su antitela na njega inhibitorna, može smatrati funk-cionalno značajnim, očigledno bio podvrgnut relativno bržem genskom variranju. Aranžman svinjskih domena A2 i A3 ukazuje na to da epitop A2 ne iskazuje merljivu homologiju sa odgovarajućim regionom u domenu A3.

Prema delecionim mapama, predlog je da se predpostavi da je inhibitorni epitop C2 humanog fVTJI smešten u reziduume 2248-2312 [Scandella, D. i sar. (1995)Blood86:1811-1819]. Humani i svinjski NHL su u ovom rezidualnom segmentu 83% identični. Međutim, homolog skan mutageneza ovog regiona, sa ciljem da se krakte-riše epitop C2, otkrila je da se značajna determinanta epitopa C2, neočekivano, nalazi u regionu koji odgovara humanim amino kiselinama 2181-2243 (SWQ ID br.: 2 i SI. IH.

Napred objašnjenom strategijom (Primer 5) formirani su takvi proteini humano/svinjskog hibridnog faktora VUI u kojima su različiti delovi domena C2 humanog faktora VTU zamenjeni odgovarajućim delovima svinjskog faktora VTJI. Sinteza različitih C2-hibridnih faktora VTJI postignuta je konstruisanjem hibridne kodne DNK, pomoću nukleotidnog niza kojim se kodira svinjski region C2, predstavljen sa SEQ TD br: 30. Svaka od hibridnih DNK je eksprimirana u transfektirane ćelije, tako da se hibridni faktori VTJI mogu delimično prečistiti iz hranljive podloge. Aktivnost je, u odsustvu inhibitora, merena jednofaznim testom koagulacije.

Za ispitivanje svakog od hibridnih faktora VTJI korišćena je serija od pet humanih inhibitora. Već je navedeno da inhibitome plazme, koje sadrže anti faktor VUI antitela, napadaju humani C2 domen, što je potvrđeno sposobnošću rekombinantnog humanog domena C2 da neutrališe inhibiciju. U svim ispitivanim plazmama je titar inhibitora neutralisan za više od 79% domenom C2 ili lakim lancem, a manje od 10% preko rekombinantnog humanog domena A2. Osim toga, C2-hibridni faktori VUI su ispiti-vani na mišja monoklonalna antitela, koja vezuju domen C2, i kao i humana C2 inhibitorna antitela, i mišja monoklonalna antitela su onemogućila vezivanje faktora VUI za fosfolipid i fon Vilebrandov faktor.

Upoređivanje titara anhibitorrdh antitela na C2-hibridne faktore VUI pokazalo je da je značajna determinanta epitopa inhibitora humanog C2 region reziduuma 2181-2243 (SEQ ID br. 2; SI. IH). Anti-C2 antitela usmerena na region COOH-završetka reziduuma 2253, nisu identifikovana u serumima četiri od pet pacijenata. Pri poređenju hibrida sa svinjskom sekvencom koja odgovara humanim arriinokiselinskim reziduumima 2181-2199 i 2207-2243, bilo je očigledno da oba regiona doprinose vezivanju antitela. Svinjska aminokiselinska sekvenca, koja odgovara humanim reziduumima 2181-2243 označena je sa 1982-2044 u SEQ UD br: 29.

Na osnovu SI. IH može se zapaziti da u regionu 2181-2243 postoji 16 razlika u amino kiselinama između humane i svinjske sekvence. Razlike su uočene na reziduumima 2181, 2182, 2188, 2195-2197, 2199, 2216, 2222, 2224-2227, 2234, 2238 i 2243. Zamena amino kiselina na jednom ili više od nabrojanih reziduuma, može se sprovesti da bi se dobio modifikovani humani faktor VUI, ne-reaktivan na humana anti-C2 inhibitorna antitela. Alanin skan mutageneza omogućava pogodan metod za stvaranje ala-ninskih supstituta za prirodne reziduume, kao što je prethodno opisano. Sve amino kiseline sem alanina se, takođe, mogu supstituisati.. Alaninski supstituti za pojedine amino kiseline, posebno one koje nisu identične humane/svinjske ili humane/mišje, ili koje će najverovatnije doprineti vezivanju antitela, mogu da daju modifikovani faktor VTU sa smanjenom reaktivnošću na inhibitorna antitela.

Slike 1A-1H zajedno omogućavaju poređenje poravnatih sekvenci amino kiselina humanog, svinjskog i mišjeg faktora VUI. Slika 1 poredi regione signalnog peptida (humani, SEQ TD br: 31; svinjski, SEQ UD br: 30, amino kiseline 1-19; mišji, SEO ID br: 28, amino kiseline 1-19). Upada u oči da su amino kiseline na SI. 1A-1H obrojčane na prvom Alaninu zrelog proteina sa 1, dok su amino kiselinama signalnog peptida dode-ljeni negativni brojevi. Sekvenca humanog fVTU na SEQ ID br: 2 počinje, takođe, sa prvim Alaninom zrelog proteina, kao amino kiselina br. 1. U sekvencama amino kiselina mišjeg fVTU (SEQ ID br: 28) i svinjskog fVTU (SEQ ID br:30), prva amino kiselina (alanin) zrelog niza je amino kiselina br. 20. SI. 1A-1H prikazuje nizanje odgovarajućih sekvenci humanog, mišjeg i svinjskog fVM, takvo da su regioni najveće identičnosti amino kiselina postavljene jedne uz druge. Aminokiselinski brojevi na SI. 1A-1H od-nose se samo na humani fVTfl. Na slici 1B predstavljeni su nizovi amino kiselina za domen Al fVm čoveka (SEQ ID br: 2, amino kiseline 1-372), svinje (SEQ ID br: 30, amino kiseline 20-391) i miša (SEQ TD br: 28, amino kiseline 20-391). Na Si. 1C date su sekvence amino kiselina za domene A2 čoveka (SEQ ID br: 2, amino kiseline 373-740), svinje (SEQ TD br: 30, amino kiseline 392-759) i miša (SEQ ID br: 28, amino kiseline 392-759). Slika ID donosi aminokiselinske sekvence domena B humanog faktora VUI (SEQ TD br: 2, amino kiseline 741-1648), svinjskog fVUI (SEQ TD br: 30, amino kiseline 760-1449) i mišjeg fVUI (SEQ TD br. 28, amino kiseline 760-1640). Slika 1E poredi aminokiselinske sekvence humanih, svinjskih i mišjih aktivacionih peptida fVm lakog lanca (SEQ TD br: 2, amino kiseline 1649-1689; SEQ TD br: 30, amino kiseline 1450-1490; odnosno SEQ ID br: 28, amino kiseline 1641-1678). Na SI. 1F upoređene su sekvence domena A3 faktora VM čoveka, svinje i miša (SEQ TD br: 2, amino kiseline 1690-2019; SEQ TD br. 30, amino kiseline 1491-1820; odnosno SEQ TD br: 28, amino kiseline 1679-2006). Na SI. 1G prikazane su sekvence amino kiselina domena Cl humanog, svinjskog i mišjeg faktora VM (SEQ TD br: amino kiseline 2020-2172; SEQ TD br: 30, amino kiseline 1821-1973; odnosno SEQ TD br: 28, amino kiseline 2007-2159). Slika IH daje podatke o sekvencama za domene C2 humanog, svinjskog i mišjeg faktora VM (SEQ TD br: 2, amino kiseline 2173-2332; SEQ TD br 30, amino kiseline 1974-2133; odnosno SEQ TD br: 28, amino kiseline 2160-2319).

Rombovima su obeležena mesta sulfatisanja tirozina, predložena mesta vezivanja za faktor TXa, fosfolipide i Protein C su dvostruko podvučena, a regioni koji učestvuju u vezivanju anti-A2 i anti-C2 inhibitornih antitela obeleženi su kurzivom. Zvezdicama su istaknute anrunokiselinske sekvence koje su očuvane.V.takođe SEQ TD br: 29 (cDNK svinjskog faktora VM) i SEQ TD br: 30 (logikom izvedena aminokiselinska sekvenca svinjskog faktora Vffl). Sistem obrojčavanja, koji važi za humani fVffl, koristi se kao referentni [Wood i sar. (1984)supra].Domeni Al, A2 i B definisani su mestima trombinskog cepanja na pozicijama 372 i 740, i jednim nepoznatim mestom cepanja proteaze na poziciji 1648, kao reziduumi 1-372, 373-740 odnosno 741-1648 [Eaton, D.L. i sar. (1986)Biochemistry25:8343-8347]. Domeni A2, Cl i C2 definisani su kao reziduumi 1690-2019, 2020-2172 odnosno 2173-2332 jVehar i sar. (1984)supra].Mesta cepanja za trombin (faktor Iia), faktor Ka, faktor Xa i APC [Fay i sar. (1991)supra;Eaton, D. i sar. (1986)Biochemistry25:505-512; Lamphaer, BJ. i sar. (1992)Blood80:3120-3128] prikazana su postavljanjem imena enzima iznad reaktivnog arginrna. Jedan ki-selinski peptid se odcepljuje od lakog lanca faktora VUI uz pomoć trombina, ili od faktora Xa na poziciji 1689. Predložena mesta vezivanja za faktor Ka [Fav, P.J. i sar.

(1994)J. BioLChem.269:29522-20527; Lenting, P.J. i sar. (1994) /.BiolChem.269:7150-7155], fosfolipid (Foster, PA. i sar. (1990)Blood75:1999-2004) i protein C [Walker, F.J. i sar. (1990)/. BiolChem.265:1484-14891 podvučena su dvostrukom linijom. Kurzivom su označeni regioni koji učestvuju u vezivanju anti-A2 [Lubin i sar (1994)supra;Healey i sar. (1995)supra],kao i oni koji su ranije predloženi za anti-C2 inhibitorna antitela. Epitop inhibitora C2, idenufikovan kao što je ovde opisano (humane amino kiseline 2181-2243), istaknut je je jednostrukim podvlačenjem na SI. IH. Mesta sulfatisanja tirozina [Pittman i sar. (1992)supra;Michnick i sar. (1994)supra]obeležena su znakom ♦.

Primer 7: Konstruisanje POL1212 i ekspresija u ćelijama mladunca hrčka

POL1212 je delimično B-bezdomenski svinjski faktor VUI, kod koga je domen B uklonjen, s tim što je zadržano 12 amino kiselina na NH2 završetku domena B, kao i 12 amino kiselina -COOH završetka.

U Primeru 5 je opisan postupak dobijanja cDNK kojima se kodiraju sekvence domena Al, A2,ap-A3-Cli C2 svinjskog faktora VUL Nukleondna sekvenca DNK i izvedena ammokiselinska sekvenca svinjskog faktora VUI, prikazane su kao SEQ TD br: 29 odnosno SEQ ID br: 30. Amplifikovani fragmenti su odvojeno klonirani u plazmidni pBluescript U KS"(pBS).

POL1212 je cDNK kojom se kodira svinjski fVTIL kojoj nedostaje najveći deo domena B, ali koja sadrži sekvencu DNK kojom se kodira 24-aminokiselinska spona između domena A2 iap.POL1212 je konstruisan u ekspresionom vektoru sisara, ReNeo, dobijenom od firme Biogen. ReNeo može da se replikuje u bakteriju, replikuje se kao epizom u COS ćelije u cilju privremene ekspresije faktora VUI ili se može stabilno ugraditi u različite ćelije sisara. ReNeo se sastoji od (1) sekvenci dobijenih iz plazmida pBR322, koji obuhvata poreklo replikacije i gen rezistencije na ampicilin, (2) gen rezistencije na neomicin, čija je ekspresija pod kontrolom SV40 promotera /pojačivača, SV40 malog t introna i SV40 elemenata regulacije signala poliaderdlacije, (3) mesto za umetanje iVUI i njegovog signalnog peptida, čija ekspresija je pod kontrolom SV40 pojačivača, značajnijeg kasnog promotera adenovirusa tipa 2, i sekvence tripartitnog lidera adenovirusa tipa 2. Umesto vektora ReNeo može se koristili svaki vektor sa stičnim funkcionalnim komponentama.

POL1212/ReNeo je dobijen u nekoliko faza. Prvo su u pBS zasebno sklopljene cDNK za kodiranje teškog lanca svinjskog fVUI (A1-A2) i cDNK za kodiranje svinjskog fVUI lakog lanca (ap-A2-Cl-C2). Od ovih struktura je, u pBS (PB-/pBS) sastavljena cDNK za kodiranje svinjskog fVUI bez B domena. Ovom obliku svinjskog fVUI nedostaje čitav domen B, definisan kao amino kiseline koje odgovaraju reziduumu 741-1648 u humanom fVUI (humani nukleotidi 2278-5001). Zatim je DNK za kodiranje svinjskog A2 zamenjena humanim domenom A2 u ekspresionom vektoru ReNeo humanog fVTU bez B domena (HB-/ReNeo). DNK za kodiranje ostatka svinjskog teškog lanca i DNK za kodiranje svinjskog lakog lanca zamenjene su humanim domenima, u sledeća dva koraka, uz pomoć prethodno formiranih struktura svinjskog teškog lanca/pBS i PB-/pBS. Fragment humanog domena B kojim se kodiraju 5 C-terminalne i N-terminalne amino kiseline umetnut je između domena A2 i A3, čime je dobijena struktura PSO/ReNeo [Healey i sar. (1998) 92:3701-3709]. Reziduumi Glu2181-Vall2243 sadrže najvažniju determinantu inhibitornog epitopa u domenu C humanog fVHL Ova struktura je iskorišćena kao kliše za dobijanje fragmenta svinjskog domena B kojim se kodiraju 12 C- terminalne i 12 N-terminalne amino kiseline. Fragment je umetnut između domena A2 i A3, čime je dobijena konačna struktura, POL1212/ReNeo.

Spona od 24 amino kiseline POL 1212 sastoji se od prvih 12 i poslednjih 12 reziduuma domena B svinjskog fVTJL Taj POL1212 linker ima sledeću sekvencu:

SFAONSRPPSASAPKPPVLRRHOR. (SEQ ID br: 32)

Nukleotidna sekvenca koja odgovara linkeru 1212 i obližnjim amino kiselinama je:

Linker POL1212 je sintetisan SOE mutagenezom na sledeći način:

Reakcije PCR korišćene za formiranje produkata SOE bile su sledeće:

REAKCIJA #1

S<p>olini prajmer: Rev 4, prajmer svinjskog A2, nukleotidi 1742-1761. (SEQ ID br:29). Sekvenca je bila: S'-GAGGAAAACCAGATGATGTCA-3' (SEQ TD br: 34).

Unutrašnji<p>rajmer: OL12, koji je svinjski reverzni prajmer, koji obuhvata prvih (5<1>) 15 amino kiselina OL1212, i poslednjih (3) 5 aminokiselina svinjskog A2. Sekvenca

je: 5'-CTTTGGAGCGCTCGCACTAGGGGGTCTTGAATTCTGGGCAAAGCTCTC

AGGTTCAATGAC-3' (SEQ ID br: 35).

Kliše: PSQ/ReNeo

Produkt: svinjska DNK od nukleotida 1742 u domenu A2 do nukleotida 2322 u OL1212 580 bp

REAKCIJA #2

Spolini prajmer: P2949 je svinjski reverzni prajmer A3, nukleotidi 2998-3021 SEQ ID bn 29. Sekvenca je: 5'-GGTCACTTGTCTACCGTGAGCAGC-3' (v. SEQ ID bn29)

Unutrašnji<p>rajmer: OL12+, svinjski prajmer koji pokriva poslednjih(3') 16 amino kiselina OL1212 i prvih (5<1>) 6 amino kiselina aktivacionog peptida, nukleotida 2302-2367 SEO TD br. 29. Sekvenca je:

Kliše: PSQ/ReNeo

Produkt: svinjska DNK od nukleotida 2302 u OL1212 to nukleotida 3021 u domenu A3, 719 bp

REAKCIJA SOE

Prajmer: Rev 4, P2949-

Klišei: fragment iz rxn#l (bp) i lakotopivi fragment iz rxn #2 (bp)

Produkt: svinjska DNK od nukleotida 1742 u domenu A2 do nukleotida 3021 u domenu A3 (SEQ ID br: 29), uključujući OL1212, 1279 bp. Produkt reakcije je istaložen s etanolom.

Linker 1212 je umetnut u PSQ/ReNeo isecanjem produkta SOE (umetka) i PSO/ReNeo (vektora)pomoću BsaB I.Vektor i umetak su povezani pomoću T4 ligaze, a produkt je korišćen za transformaciju XL1-Blue ćelijaE. coli.Od nekoliko kolonija je pripremljena plazmidna DNK, a sekvence linkera 1212 i ostale sekvence dobijene putem PCR su potvrđene analizom DNK sekvence.

KULTURA CRL-1632 ĆELIJA BUBREGA MLADUNCA HRČKA (BHK)

Ćelijska linija BHK (kataloška identifikacija CRL-1632) dobijena je iz ATCC, i čuvana na -20°C do upotrebe. Ćelije su odmrznute na 37°C i smeštene u 10 ml kompletne podloge, definisane kao DMEM/F12, 50 J/ml penicilina, 50 ug/ml streptomicina, uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS). FBS je kupljen kod Hvclone, Logan, Utah. Ćelije su centiifugirane 2 minuta brzinom od 300 obrtaja u minutu. Podloga je

aspirirarta, a ćelije su ponovo suspendovane u 2 ml kompletne podloge u T-75 normalnom sudu sa 20 ml kompletne podloge.

POL 1212 je eksprimiran i u ćelijama bubrega mladog hrčka (BHK) i u ćelija-ma ovarijuma kineskog hrčka (CHO). Korišćene su dve linije BHK, i to linija CRL-1632 iz ATCC i druga linija BHK, dobijena od B. Mcgillivray, Univerzitet Britanske Kolumbije [Funk, i sar. (1990)Biochemistry29:1654-1660]. Ova druga kultura je subkuluvisana bez selekcije u laboratoriji pronalazača, i obeležena sa BHK1632 (Emory). Ćelijska CHO linija označena je sa CHO-K1, ATCC kataloški broj CCL-61. Ekspresija proseč-nog klona od Emory-ćelijske linije i CHO-K1 ćelija bila je, prema aktivnosti hromogen-skog testa, nešto viša nego od ćelija CRL-1632. Ćelije koje su se razvijale u T-75 normalnom sudu obrazovale su ujednačen monosloj. Pripremljeno je 60 ml kulture XL1-Bluećelija E. coliu LB/ampicilinu (50 mg/ml) sa POL1212/ReNeo plazmidom

TRANSFEKCIJA CRL-1632 ĆELIJA SA POL1212/ReNeo

DNK celodnevne kulture POL1212/ReNeo XL-1 Blue ćelija pripravijena je pomoću seta pribavljenog od Oiagen, Valencia, CA (Spin Miniprep kit). Sadržaj SRL-1632 ćelija (2 ml) iz normalnog suda podeljen je u dva suda, sud sa osnovnom kul-turom (0,2 ml) i suda sa sadržajem za transfekciju (0,3 ml). Drugi sud je dopunjeni sve-zom hranljivom podlogom, DMEM/F12 + 10% Hvclone FBS + 50 J/ml penicilina i 50 ug streptomicina. CRL-1632 ćelije su razdeljene na 6 petri-kutija sa udubljenjima, sa ciljem da se postigne 50-90%-no slivanje (kulture) za potrebe transfekcije (0,3 ml ćelija iz normalnog suda T-75 u 2 ml 1:5000 Versene [Life Technologies, Gaithersburg, MD] u svakom udubljenju), a korišćen je svež DMEM/F12 + 10% Hyclone FBS + 50 J/ml penicilina, 50 ug streptornicina.

U sterilnim 1-2 ml epruvetama pripravljeni su sledeći rastvori:

A) 48 ul (10 ug) Miniprep POL1212/ReNeo DNK + ul podloge bez seruma (DMEM/F12) plus 10 ul Lipofectina™ (Life Technologies, Gaithersburg, MD). B) Blago je promešano 10 ul Lipofectina sa 190 ul podloge (lažna transfekcija) i ostavljeno da DNK i Lipofecun reaguju 15 minuta, na sobnoj tem temperaturi. U tom vremenu su ćelije dvaput isprane sa 2 ml DMEM/F12. Posle toga je ćelijama dodato još 1,8 ml DMEM/F12. Kompleks DNK/lii<p>ofectm je dodavan ćelijama kap po kap, i lakim kružnim pokretom je promešan sadržaj suda. Ćelije su prenoćile u inkubatoru. Potom je uklonjen kompleks DNK/Lipofectin i dodato još 3 ml podloge sa serumom, ćelije su inkubirane 30-48 sati. Kulture ćelija su podeljenje, u odnosima 1:20, 1:50 i 1:100, 1:250, 1:500, u petri kutije promera 10 cm u koje je nasuto po 10 ml podloge sa serumom koja je sadržala 535 ug/ml geneticina. Tokom sledećih nekoliko dana, ćelije koje nisu prihvatile POL1212/ReNeo plazmid su, zbog prisustva geneticina, uginule. Preostale ćelije su nastavile da se replikuju u geneticinu, obrazujući u petri kutijama vidljive jednoslojne kolonije.

EKSPRESIJA I ANALIZA POL1212 DOBIJENOG IZ BHK CRL-1632 ĆELIJA

Oko kolonija su postavljeni mali plastični, cilindrični prstenovi. Kolonije su odvojeno aspirirane uz korišćenje kompletne podloge i prenete u epruvete. Ove kolonije se nazivaju prsten-Monirane kolonije. Prsten-klonirane kolonije su prenete u zasebne petri kutije sa 24 udubljenja i gajene u kompletnoj hranljivoj podlozi.

ANALIZA HROMOGENOG SUPSTRATA NA EKSPRESIJU FAKTORA VUI U TRANSFEKTOVANIM CRL-1632 ĆELIJAMA

Uzorci POL1212 iz supernatanata ćelijske kulture pomešani su sa 50 nM prečišćenog svinjskog faktora DCa i 0,05 mM vezikula fosfandu-holin/fosfatidil-serina (PCPS) u 0,15 M NaCl, 20 m HEPES, 5 mM CaCL,, 0,01% Tween-80, pH 7,4. Hranljiva podloga lažno transfektovanih ćelija je korišćena kao kontrola. Trombin i faktor X su dodati istovremeno, do postizanja finalne koncentracije od 40 odnosno 425 nM. trombin aktivira faktor VUI, koji potom, zajedno sa PCPS, služi kao kofaktor za faktor IXa u toku aktivacije faktora X.

Aktivacija faktora X kombinacijom faktora IXa/faktora VUIa/PCPS prekinuta je nakon 5 minuta dodavanjem EDTA do finalne koncentracije od 50 mM. U isto vreme je prekinuta i aktivacija faktora VUI trombinom, dodavanjem inhibitora trombina, rekombinantnog desulfatohiradina, do finalne koncentracije od 100 nM. Uzorak reakcione smeše od 25 ul prenet je u udubljenje za mikrotitar, u koje je dodato 74 ul Spectrozvme Xa (America Diagnostica, Greenwich, CT), koji je hromogeni supstrat za faktor Xa. Finalna koncentracija Spectrozvme Xa bila je 0,6 mM. Apsorbansa na 405 nm zbog cepanja Spectrozvme Xa faktorom Xa, praćena je neprekidno 5 minuta pomoću Vmax kinetic Plate Reader-a (Molecular Devices, Inc., Menlo Park, CA). Rezultati su izraženi kao A405/min.

Hromogena analiza faktora VIT deset prsten-kloruranih kolonija:

Ovi rezultati pokazuju da je svih deset izabranih kolonija eksprimiralo aktivnost faktora VUI, koja je najmanje 10 puta veća od polazne.

Aktivnost iz podloge kolonije 8, koja je bila kolonija najveće ekspresije, is-pitivana je dalje pomoću jednofaznog testa faktora koagulacije VUL U tom testu je 50 ml plazme bez faktora VTU (George king Biomedical Overland Park, KA), 5 ml uzorka ili standarda i 50 ml aktiviranog reagensa tromboplastinskog vremena (Organon Teknika, Durham, NC) inkubirano 3 minuta na 37°C. Uzorci su uključivali podlogu kolonije 8, razblaženu u 0,15 M NaCl, mM HEPES, pH 7,4 (HBS) ili, kao kontrolu, kompletnu hranljivu podlogu. Koagulacija je inicirana dodavanjem 50 ml 20 mM CaClg. Vreme koagulacije je mereno pomoću ST4 BIO Coagulation Instrument-a (Diagnostica Stago, Parsippanv, NJ). Standardna kriva je dobijena pravljenjem razblaženja donatorske, citratisane zdrave humane plazme, serija 0641 (George King Biomedical, Overland Park, KA) Koncentracija standarda faktora VUI bila je 0,9 jedinica po mililitru.

Standardna kriva:

Linearna regresija vremena koagulacije u odnosu na logaritam koncentracije standarda dala je koeficijent korelacije od 0,997.

Ispitivane supstancije su dale sledeća vremena koagulacije, pretvorena u jedinice po ml uz pomoć standardne krive:

Ovi rezultati pokazuju da je koagulantna aktivnost kolonije 8 oko 2000 puta veća od one kontrolnog uzorka.

Sekvenca DNK kojom se kodira POL1212 predstavljena je kao SEQ ID br: 37. Kodirana sekvenca amino kiselina POL1212 data je kao SEQ ID br. 38. Dalje prečišćavanje POL1212 može se izvoditi uz pomoć širokog spektra poznatih medoda, npr. imunoafinitetnom hromatografijom i HPLC hromatografijom - v. Primere 2 i 3.

OPŠTE ZAKLJUČNE NAPOMENE

Prihvatiće se da manje varijacije sekvence amino kiselina ili DNK kojom se kodira ta sekvenca povezana sa POL 1212, mogu da se uvedu, bez uticaja na suštinske karakteristike funkcije. Na primer, deo sekvence domena B, zadržan kao linker između domena A2 i aktivacionog peptida može da se povećava ili smanjuje u poznatim granicama. Varijante sekvence mogu da se ubacuju u zoni linkera, a da se pri tom očuvaju istovetne funkcionalne karakteristike POL1212, kao što je ovde objašnjeno, i svinjskog faktora VUI bez domena B, kao što je poznato i ovde objašnjeno. Na osnovu poređenja poznatih sekvenci amino kiselina faktora VUL koje poseduju koagulantnu aktivnost, mogu se - u arnmokiselinskoj sekvenci osnovnog POL1212 - praviti varijacije sekvenci, npr supstitucija pojedinih amino kiselina ili supstitucija peptidnih segmenata sa poznatim funkcionalnim varijantama, a da se pri tom funkcionalne karakteristike plazmida u potpunosti očuvaju. Navedeni tipovi varijacija se ne završavaju gornjim nabrajanjem, već samo služe kao primeri modifikacija sekvenci, koje mogu napraviti stručni ljudi prosečnih sposobnosti, a da se pri tom ne modifikuju značajnije funkcionalne karakteristike proteina. Za sve takve varijacije i modifikacije se smatra da spadaju u domen iznetog pronalaska ili njegovog ekvivalenta.

Lista identiteta sekvenci:

Claims (12)

1. DNK kojom se kodira aminokiselinska sekvenca POL 1212 prikazana u SEQ ID No: 38

2. Ekspresioni vektor koji sadrži DNK prema zahtevu 1.

3. DNK prema zahtevu 1 sa nukleotidnom sekvencom prikazanom u SEQ ID NO: 37.

4. Ekspresioni vektor koji sadrži DNK prema zahtevu 3.

5. Modifikovani svinjski faktor VIII sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom u SEO ID NO: 38

6. Terapijska formulacija, koja sadrži modifikovan svinjski faktor VIII prema zahtevu 5 i fiziološki prihvatljiv nosač.I.

Postupak za dobijanje modifikovanog proteina svinjskog faktora VIII sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom u SEO ID NO: 38, koji obuhvata ekspresiju DNK kojom se kodira aminokiselinska sekvenca, prikazana u SEO ID NO: 38, u sisarskoj ćeliji-domaćinu.

8. Postupak prema zahtevu 7, karakterisan t i m e što DNK, kojom se kodira aminokiselinska sekvenca prikazana u SEO ID NO: 38, takođe kodira i signalni peptid, čime se protein modifikovanog svinjskog faktora VUI eksportuje iz domaćina-ćelije sisara.

9. Postupak prema zahtevu 8, karakterisan time što signalni peptid ima sekvencu amino kiselina 1-19 prikazanu u SEO ID NO: 30

10. Izolovana sisarska ćelija-domaćin, koja sadrži i replikuje ekspresioni vektor, koji se sastoji od DNK kojom se kodira aminokiselinska sekvenca POLI212 prikazana u SEQ ID NO: 38

II. Ćelija sisara prema zahtevu 10, karakterisana time što vektor, koji sadrži DNK ima nukleotidnu sekvencu prikazanu u SEO ID NO: 37.

12. Ćelija prema zahtevu 11, karakterisana time što je ćelija-domaćin BHK CRL-1632