RS50435B - Signalne sekvence za proizvodnju leu-hirudina pomoću sekrecija e.coli u medijumu kulture - Google Patents
Signalne sekvence za proizvodnju leu-hirudina pomoću sekrecija e.coli u medijumu kultureInfo
- Publication number
- RS50435B RS50435B YUP-146/02A YUP14602A RS50435B RS 50435 B RS50435 B RS 50435B YU P14602 A YUP14602 A YU P14602A RS 50435 B RS50435 B RS 50435B
- Authority
- RS
- Serbia
- Prior art keywords
- hirudin
- sequence
- leu
- expression
- primer
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Prekursor hirudina, naznačen time, što sadrži signalnu sekvenciju izabranu iz grupe, koja sadrži signalne sekvencije spoljašnjeg membranskog proteina iz Serratia marcescenes, oprF-proteina iz Pseudomonas fluorescens, i fumarat-reduktaze iz Shewanella putrfaciens, na koju je dodata C-terminalno sekvencija Leu-hirudina.Prijava sadrži 2 nezavisna i 2 zavisna zahteva.
Description
Preparat Refludan<®>, koji potiče od pijavice, pokazuje pri kliničkim ispitivanjima dobra terapeutska svojstva (The Lancet, Vol.353, p.429-438). To dozvoljava da se zaključi, da se u budućnosti može očekivati velika potrošnja ovog preparata. Biološki aktivna supstanca u navedenom preparatu je, kako je opisano u evropskom patentu 0 324 712, [Leu<1>, Thr^-63-desulfato-hirudin, nadalje kratko označen kao „Leu-hirudin".
U evropskom patentu 0 448 093 opisan je postupak za proizvodnju hirudina. U tom patentu data je prednost dobianju hirudina, čija se N-terminalna aminokiselina sastoji od alanina. Ako se spoji ovaj hirudin sa signalnom sekvencijom oc-ciklodekstringlikozil-transferaze (CGTase) i ako se ugradi jedan kodirajući ekspresioni vektor ovog fuzionog proteina, kako je opisano u patentu, uE. colisekretni mutant, tada može da se proizvede Ala-hirudin sa prinosom od 2 g/L. Evropski patent 0 549 915 opisuje varijante Ala-hirudina, čija je stabilnost poboljšana. Ako se ove varijante Ala-hirudina proizvedu sa sekretorskim sistemom odE. coli,postižu se prinosi od više grama po litri. Na taj način su prinosi znatno veći nego što su ih opisali Dodtet. al.z& varijante hirudina HV1 (FEBS LETERS vol. 202, 373-377, 1986). U poredjenju sa tim neznatno povećanje prinosa opisano je u US Patent 5,573,929 , u kojem je umesto preko vektora pBR322 koji su izveli Doth et.al., na poznati način pomoću vektora pUC preneta genetska informacija. Bender et al. (Appl. Microbiol Biotechnol 34, p.203-207, 1990) opisuju izlučivanje pomoćuStreptomyces lividansThr-hirudina, koji je opisan u evropskom patentu 0 171 024. Ali i tu su prinosi znatno manji u poredjenju sa onim prinosima navedenim u patentima 0 448 093 i 0 549 915. Ovo važi i za ekspresiju uE. coliB, kako su je zapazili P. de Taxis du Poetet. al.pri izlučivanju varijante hirudina HV1 pomoću signalne sekvencije Ompa izE. coli.Autori su našli prinose od 300 mg/L hirudina u periplazmi i oko 40 mg/L u ostatku ćelije. Ekspresija u ćelijskim sistemima insekata, koja je istovremeno opisana u navedenom radu, je neznatna (400 u.g/L).
Sa ekspresionim sistemima kvasacaHansenula polymorphiliPichia pastorispostignuti prinosi su najpribližniji onim prinosima opisanim u evropskim patentima 0 448 093 i 0 549 915, suprotno onim vrednostima postignutim saS. cerevisiae.
Rosenfeldet. al.(Protein Expression and Purification 8, 476-482, 1996) opisuju ekspresiju i izlučivanje hirudina pomoću kvascaPichia pastoris.Pri tome su postignuti prinosi od oko 1,5 g/L podloge. Sličan red veličine može da se postigne sa kvascemHansenula polymorpha(Appl.Microbiol.Biotechnol. 44, 377-385, 1995). Znatan nedostatak takvih ekspresionih sistema su značajno duža vremena fermentacije u odnosu na sistemeE. coli.Postigla bi se dakle prednost, ako bi se Leu-hirudin proizveo kao Ala-hiruđin lučenjem pomoćuE. coli.
Ovo medjutim nije uspelo sa sistemom opisanim u evropskom patentu 0 448 093. Zbog toga je u patentu predloženo da se sekvencija Leu-hirudina produži za tripeptid Ala-Thr-Arg, tako da nastane prekursor Leu-hirudina, koji najzad posle reakcije sa tripsinom prelazi u agens Leu-hirudin u njegovom prirodnom obliku. Ako se sledi ovaj pređlog, tada se pri vodjenju eksperimenta u vibrirajućem kolbenu dobijaju dosta lošiji prinosi, nego što je opisano za Ala-hirudin. Na taj način jednoznačna prednost u odnosu na kasnije eksprcsione sisteme kvasaca nije više očevidna.
Osnovni zadatak u ovom pronalasku je zbog toga bio, da se proizvede fuzioni protein, kod kojeg kombinacija signalne sekvencije i Leu-hirudina omogućava direktno procesiranje u Leu-hirudin i najzad primenomE. coliizlučivanje sa velikim prinosom Leu-hirudina, u njegovom prirodnom obliku.. Ovo je predpostavka za razvoj postupka, koji se preko povećane izlazne koncentracije hirudina, kako tokom fermentacije, tako i tokom uključenog procesa prečišćavanja, odražava pozitivno na cenu proizvodnje refludana.
Sada je neočekivano pronadjeno, da postoje signalne sekvencije, koje dozvoljavaju direktno izlučivanje Leu-hirudina prekoE. colii pri tome je zapaženo čak delotvornije izlučivanje nego što je opisano u evropskom patentu 0 448 093. Na taj način može da bude razvijen postupak, koji dozvoljava da bez velikih troškova budu dostupne velike količine Leu-hirudina. To je predmet ovog pronalaska.
Da bi se pronašle pogodne signalne sekvencije, primenjena je metoda Signalsequenz-Screening oslonjena na PCR. Ova metoda koristi kao matricu kodiranu DNA, koja je od interesa za protein, i jednu definisanu reverznu PCR-početnicu (praimer), kao i različite napred usmerene početnice, koje dozvoljavaju sintezu DNA-segmenta, koji kodira signalnu sekvenciju povezanu na gen od interesa. Reakcija se odvija prema šemi prikazanoj na slici 1. Stručnjaku je jasno, da prema dužini signalne sekvencije. koja treba da bude sintetizovana, broj reakcionih koraka može da varira. Kratke signalne sekvencije mogu da budu proizvedene sa jednim reakcionim korakom, duže sekvencije sa dve, tri ili više reakcija. Osim toga broj reakcija zavisi i od uređaja koji je upotrebljen za sintezu oligonukleotida koji se koristi kao početnica. Tako sintetizovan spoj signalni peptid - gen može tada da bude ciljano cepan sa enzimima koji prepoznaju restrikciona mesta 1 i 2 i da se ugradi u odgovarajuće otvoreni ekspresioni vektor. Ovaj sistem će biti od opšteg značaja, ako se kao gen od interesa izabere hirudin. Pri tome N-terminalna aminokiselina hirudina može da bude izabrana kao promenljiva. To, doduše, može na izvestan način da ima uticaja na vezivanje hirudina na trombin (promena konstante vezivanja), ipak ostaje merljiv inhibitorski efekat hirudina ua aktivnost trombina.
Patentni spis EP-B1 0 448 093 opisuje sekreciju hirudina u medijum kulture. Koncentracija hirudina se tamo direktno određuje preko poznatog testa za sprečavanje aktivnosti trombina. Koncentracija hirudina je direktna mera za efikasnost sekrecije, a samim tim i otcepljenja signalne sekvencije. Međutim patent opisuje i da npr. hirudin, koji započinje aminokiselinom leucin, ne može preko signalne sekvencije CGT-aze da bude efikasno prenet u medijum. Pomoću gore opisane metode moguće je da se traže signalne sekvencije, koje će to efikasno omogućiti. Na sličan način moguće je izučavati sekreciju hirudina, koja započinje sa nekom od preostalih 19 aminokiselina. Na taj način se dobija uvek spektar signalnih sekvencija koje omogućavaju efikasno procesiranje karboksiterminalne aminokiseiine signalnog peptida i na njega povezanog peptiđnog ostatka. Na taj način je moguće izvršiti prethodni izbor signalnih peptida za efikasnu sekreciju bilo kojeg proteina u periplazmu i tako povećati mogućnost za razvoj uspešnog procesa proizvodnje tog proteina. To je takođe predmet ovoga pronalaska. Moguće je da se postupak ubrza, odnosno, automatizuje na taj način što se transformaciona smeša, koja se sastoji od ligacionih dodataka i kompetentnih ćelija kao tečne kulture u izabranoj sredini, mućka preko noći i sledećeg dana se ođredjenim alikvotom ćelija zasejc medijum kao što je opisan u primeru 11, koji sadrži induktor za sprovodjenje indukcije, ali najveći deo kulture se centrifugira i peleti ćelija se zamrzavaju. Ako se pri ekspresiji ustanovi aktivnost hirudina, tada može ponovo da se izoluje iz ćelija odgovarajući ekspresioni plazmid, da se linearizira i primenom gelelektroforeze razdvoji od mogućih autoligjranih produkata. Linearni plazmid DNA se tada seče i ponovo uvodi u čelije-domaćine. Sada mogu da se izoluju pojedinačne kolonije i da se testira njihov ekspresioni kapacitet. Pri tome može tako da se radi, da postupak testiranja ispunjava kriterijume koji dozvoljavaju upotrebu kao terapeutskog sredstva.
Dalja prednost postupka sastoji se u tome, što se mogu različite varijante signalnog peptida, kako nastaju tokom evolucije izmenom aminokiselina izmedju pojedinačnih specija, da ispituju jedna pored drugih u pogledu njihove podobnosti za efikasnu sekreciju hirudina.
Isto tako ovaj postupak ima prednost u odnosu na primenu kompjuterskih programa koje su opisali Nielsenet. al.(Protein Engineering 10, 1-6, 1997), pomoću kojih se mogu predviđeti mesta cepanja izmedju signalne sekvencije i proteina, koji je od interesa. Medjutim, pokazano je, da na taj način dobijena predvidjanja ne odgovaraju za svaki slučaj, tako da povoljne kombinacije mogu Iako da se previde. Osim toga ne postoji veza izmedju predvidjanja korektnog procesiranja i stvarno postignutog prinosa. Predmet pronalaska odnosi se na hirudinski prekursor koji sadrži signalnu sekvenciju izabranu iz grupe koja sadrži signalne sekvencije proteina spoljašnjeg dela membrane izSerratia marcescens,oprF-proteina izPseudomonas fluorescens,i fumarat-reduktaze izShewanella putrifaciens,prvenstveno se bira iz grupe koja sadrži signalnu sekvenciju proteina spoljašnjeg dela membrane izSerratia marcescens ifumarat reduktaze izShewanella putrifaciens,na koju je C-terminalno spojena sekvencija Leu-hirudina. Dalji predmet ovog pronalaska odnosi se na postupak za proizvodnju Leu-hirudina, u kojem se kao medjustupanj kao što je gore opisano javlja jedan hirudinski prekursor, u kojem
(a) je proizveden jedan ekspresioni plazmid koji sadrži DNA-sekvenciju kodirajuću za
hirudinski prekursor;
(b) ekspresioni plazmid prema (a) prenosi genetsku informaciju u pogodnu ćelijuE.
coli;(c) se hirudinski prekursor izlučuje izE. colii istovremeno procesira;
i
(d) se Leu-hirudin direktno izdvaja iz medijuma kulture.
Isto tako predmet ovog pronalaska je primena hirudinskog-prekursora kao što je gore opisan, za proizvodnju Leu-hirudina, prvenstveno po postupku kako je gore opisano.
Primera radi treba da se opiše sinteza signalnih sekvencija, koje omogućavaju efikasnu sintezu i sekreciju Leu-hirudina. Isto tako će biti opisane sinteze drugih signalnih sekvencija, koje ne dovode ili u odnosu na prinos dovode do loših rezultata. Primeri treba pri tome da objasne smisao pronalaska preko izbora signalnih sekvencija pomoću Leu-hirudina, ali se neće na tome ograničiti.
Opisani postupci mogu biti primenjeni za prečišćavanje refludana; ovo je primera radi opisano u primera 11.
Primer 1. Sinteza fuzionog gena kodirajućeg za fuzioni protein, koji se sastoji od Leu-hirudina i od signalne sekvencije proteina spoljašnjeg dela membrane izSerratia
marcescens
Kao ekspresioni plazmid primenjen je vektor pJF118 koji je opisan u evropskom patentu 0 468 539 na slici 1, pošto je ovaj uzimajući u obzir njegov osnovni sklop identičan sa vektorom pCM7053 opisanim u evropskom patentu 0 448 093.
Kao matrica upotrebljen je plazmid pK152 naveden u evropskom patentu 0 448 093 u primeru 1, koji nosi hirudinsku sekvenciju koja je u skladu sa evropskim patentom 0 171 024.
Membranski protein opisali su Braun, G. i Cole, S.T. (Mol. Gen.Genet. 195,321-328,1984).
Radi sinteze željenog DNA-segmenta proizvedene su tri oligonukleotidne sekvencije.
Oligonukleotiđ hirrev ima sekvenciju :
Početnica (prajmer) hibridizira uz regjon 227-2lObp gena hirudina prikazanog u Tabeli 1.
Početnica smompafl ima sekvenciju:
Početnica hibridizira naspram nukleotida 1-19 hirudinske sekvencije prikazane u Tabeli 1. Hibridizirajući deo sekvencije početnice prikazan je simbolično malim slovima. Ostatak sekvencije hibridizira naspram regiona 229bp-263bp sekvencije koju su publikovali Braun,G. i Cole,S.T. (Mol.Gen.Genet.195, 321-328,1984).
Početnica smompaf2 ima sekvenciju:
Od pozicije 13bp hibridizira sekvencija početnice sa sekvencijom, koju su objavili Braun i Cole, od 201bp-245bp i na taj način preklapa se sa sekvencijom početnice smompaf2. Pozicija 1-12 početnice sadrži mesto prepoznavanja za restrikcioni enzimEcoRikao i susednih šest T-nukleotida, da bi se omogućilo da ga enzim prepozna.
U standardnoj PCR (kao npr. 94°C:10", 50°C:30", 72°C:45", 25 ciklusa) sa DNA plazmida pK152 kao matrice, koji nosi sekvenciju opisanu u Tabeli 1, i početnicama hirrev i smompafl produžuje se hirudinska sekvencija za deo bakterijske signalne sekvencije. Dobij eni reakcioni produkt, kao matrica, reaguje tada pod istim uslovima u drugoj PCR sa početnicama hirrev i smompaf2. Kao reakcioni produkt nastaje DNA-fragment, koji kodira za fuzioni protein, koji se sastoji od hirudinske sekvencije produžene za željenu signalnu sekvenciju. Na završetku 5' nalazi se mesto prepoznavanja za restrikcioni enzim£coRI,a na završetku 3' mesto prepoznavanja za enzimHindUL
Reakcioni produkt iz druge PCR se u dodatku za dvostruku fermentaciju konvertuje sa oba restrikciona enzima i kaoEcoKU HindlUfragment uvodi se preko jedne T4-DNA-ligaza-reakcije u vektor DNA, koji je otvoren pomoću oba enzima. Podesne ćelije sojaE. coliMcl06lili sekreta-mutanta WCM100 transformišu se pomoću ligacione smeše i pod određenim pritiskom umnožavaju se na podlozi koja sadrži ampicilin. Sledećeg dana se odvija ekspresija u skladu sa primerom 6, radi poređenja sa ekspresijom Ala-hirudina, sa sojemE. coliWCM\ OQ/pCM7053. Primećuje se da se postiže 1,5 puta bolja ekspresija nego u uporednom eksperimentu.
Primer 2: Sinteza fuzionog proteina iz Leu-hirudina i signalne sekvencije oprF-gen produkta izPseudomonas jluorescens
Konstrukcija se odvija u skladu sa šemom opisanom u primeru 1 sa izuzetkom, što se umesto početnice smompafl/f2 koriste dve nove početnice, koje prema svojoj specifičnosti za gen hirudina i svojoj sekvenciji za prepoznavanje od strane restrikcionog enzimaEcoRlpokazuju iste karakteristike kao smompa-početnica, ali kodiraju za željenu signalnu sekvencu oprF-gena (De,E.et. al. ;FEMSMicrobial.Lett. 127, 267-272, 1995).
Početnica pfufl ima sekvenciju:
Početnica pfuf2 ima sekvenciju:
Pri tome se početnica pfufl isto kao u primeru 1 koristi u PCR1, a početnica pfuf2 odgovarajuće u PCR2. Ekspresija se odigrava na isti način kao ekspresija Ala-hirudina sa sojem fi.co/AVCMlOO/ pCM7053. Proizilazi da se postiže ekspresija 1,1 puta bolja, nego u uporednom eksperimentu. Posle izdvajanja gelelektroforezom u SDS-PAGE sistemu izolovana je hirudinska traka i odredjena je N-terminalna sekvencija hirudina. Pokazuje se, da je sekvencija potpuno čitava i da započinje sa aminokiselinom leucin. Ovaj rezultat je neočekivan, pošto program za identifikaciju pretpostavljenog mesta prepoznavanja signalne peptidaze predviđja produžavanje hirudina za valin.
Primer 3: Sinteza fuzionog proteina iz Leu-hirudina i signalne sekvencije lamB-genskog produkta izE. coli
Konstrukcija se odvija u skladu sa šemom opisanom u primeru 1 sa izuzetkom, što se umesto početnice smompafl/f2 koriste dve nove početnice, koje prema svojoj specifičnosti za gen hirudina i svojoj sekvenciji koju prepoznaje restrikcioni enzimEcoRlpokazuju ista svojstva kao smompa-početnica, ali kodiraju za željenu signalnu sekvenciju lamB-gena (ClementJ.M. i Hofnung,M.:Cell 27. 507-514,1981).
Početnica lambbfl ima sekvenciju:
Početnica lambbf2 ima sekvenciju:
Pri tome se početnica lambbfl, isto kao u .primeru 1, koristi u PCR1, a početnica lambbf2 odgovarajuće u PCR2. Ekspresija se odigrava u skladu sa ekspresijom Ala-hirudina sa sojemE. coliWCM100 / pCM7053. Proizilazi daje postignuta ekspresija iste veličine kao u uporednom eksperimentu. Posle izdvajanja gelelektroforezom u SDS-PAGE sistemu izolovana je hirudinska traka i odredjena je N-terminalna sekvencija hirudina. Uočava se, da je sekvencija potpuno čitava i da započinje sa aminokiselinom leucin. Ovaj rezultat je neočekivan, pošto program za identifikaciju pređpostavljenog mesta prepoznavanja signalne peptidaze ne predviđa direktno procesiranje hirudina.
Primer 4: Sinteza fuzionog proteina iz Leu-hirudina i signalne sekvencije prekursora fumarat reduktaze flavoprotein podjedinice izShevvanella putrefaciens
Konstrukcija se odvija prema šemi koja je opisana u primeru 1 sa izuzetkom, što se umesto početnice smompafl/f2 koriste dve nove početnice, koje prema svojoj specifičnosti za gen hirudina i svojoj sekvenciji koju prepoznaje restrikcioni enzimEcoRlpokazuju ista svojstva koja ima smompa-početnica, ali kodiraju za željenu signalnu sekvenciju izShewanella putrefaciens(Pealing,S.Let. al. :Biovhemistrv 31, 1232 - 1240, 1992). Pošto ta publikacija opisuje samo proteinsku sekvenciju, sekvencija aminokiseline je prevedena u skladu sa kodon-Tabelama u DNA-sekvenciju,lako da se za početnicu spfccfl dobij a sledeća sekvencija:
Početnica spfccf2 ima sekvenciju:
Pri tome se početnica spfccfl koristi isto kao u primeru 1 u PCR1, a početnica spfccf2 odgovarajuće u PCR2. Ekspresija se odigrava na isti način kao pri ekspresiji Ala-hirudina sa sojemE. coliWCM100 / pĆM7053. Proizilazi da se postiže ekspresija 1,5 puta bolja nego u uporednom eksperimentu. Posle izdvajanja gelelektroforezom u SDS-PAGE sistemu izolovana je hirudinska traka i odredjena je N-terminalna sekvencija hirudina. Pokazano je, daje sekvencija potpuno čitava i da započinje sa aminokiselinom leucin. Ovaj rezultat je neočekivan, pošto program za identifikaciju predpostavljenog mesta koje prepoznaje signalna peptidaza predvidja procesiranje u cistein u poziciji 6 hirudinske sekvencije, pri čemu su karboksi-grupe postojane..
Primer 5 : Sinteza fuzionog proteina iz Leu-hirudina i signalne sekvencije prekursora P-laktamaze iz pBR322
Konstrukcija sledi prema šemi koja je opisana u primeru 1 sa izuzetkom, što su umesto početnice smompafl/£2 korišćene dve nove početnice, koje prema svojoj specifičnosti za gen hirudina i svojoj sekvenciji koju raspoznaje restrikcioni enzimEcoRl,pokazuju iste karakteristike kao i smompa-početnica, ali kodiraju za željenu signalnu sekvenciju P-laktamaze - proteinskog prekursora. ( Sutcliffe J.G.: Cold Spring Harbor Symp.
Quant. Biol. 43, 77-90 (1978).)
Početnica blatfl ima sledeću sekvenciju:
Početnica blatf2 ima sekvenciju:
Pri tome se početnica blaftl, isto kao u primeru 1, primenjuje u PCR1, a početnica blaft2 na isti način u PCR2. Ekspresija se izvodi na isti način kao i ekspresija Ala-hirudina sa sojemE. coliWCM100 / pCM7053. Pokazuje se, da ostvareni prinos ekspresije iznosi samo 50 do 90% od ostvarenog prinosa u uporednom eksperimentu. Posle razdvajanja gelelektroforezom u SDS PAGE sistemu izolovana je traka hirudina i određena je N-terminalna sekvencija hirudina. Proizilazi, da je sekvencija potpuno čitava i da započinje sa aminokiselinom leucin. Ovakav rezultat je predviđen programom za identifikaciju predpostavljenog mesta koje prepoznaje signalni peptid.
Primer 6: Sinteza fuzionog gena iz Leu-hirudina i signalne sekvencije prekursora alkalne fosfataze izE. coli
Konstrukcija sledi prema šemi opisanoj u primeru 1, sa izuzetkom, što su umesto početnice smompafl / f2 korišćene dve nove početnice, koje prema svojoj specifičnosti za gen hirudina i svojoj sekvenciji koju prepoznaje restrikcioni enzimEcoRlpokazuju iste karakteristike kao i smompa-početnica, ali kodiraju za željenu signalnu sekvencijuu alkalnog proteina fosfataze izE. coli(Shutteleworth,H. Tavlor, J. And Minton, N. : Nucleic Acids Res. 144(21), 8689 (1986) ).
Početnica linkphoafl ima sledeću sekvenciju:
Početnica Hnkphoaf2 ima sekvenciju:
Obe početnice su optimizirane da vrše izbor kodona zaE. coli,odnosno one ne odgovaraju potpuno prirodnoj sekvenciji polaznog gena.
Pri tome se početnica linkphoafl, isto kao u primeru 1, primenjuje u PCR1, a početnica linkphoaf2 odgovarajuće u PCR2. Ekspresija se izvodi na isti način kao i ekspresija Ala-hirudina sa sojemE. coliWCM100 / pCM7053. Pokazuje se, da ostvareni prinos ekspresije iznosi samo jedan deo od prinosa ekspresije ostvarene u uporednom eksperimentu. Razdvajanjem pomoću gelelektroforeze u SDS PAGE sistemu izdvojena je traka hirudina i određena N-terminalna sekvencija hirudina. Pokazalo se, da je sekvencija potpuno čitava i da započinje sa aminokiselinom leucin. Ovaj rezultat je predpostavljen programom za identifikaciju predviđenog mesta koje prepoznaje signalna peptidaza. Medjutim, mali prinos predstavlja iznenadjenje.
Primer 7: Sinteza fuzionog gena iz Leu-hirudina i signalne sekvencije prekursora alkalne fosfataze izE. fergusonii
Konstrukcija sledi prema šemi opisanoj u primeru 1, sa izuzetkom, što su umesto početnice smompafl / f2 korišćene dve nove početnice, koje prema svojoj specifičnosti za gen hirudina i svojoj sekvenciji koju prepoznaje restrikcioni enzim£coRIpokazuju iste karakteristike kao i smompa-početnica, ali kodiraju za željenu signalnu sekvenciju proteina alkalne fosfataze izE. fergusonii( Du Bose, R.F. and Hartl, D.L.: Mol. Biol. Evol. 7, 547-577,1990).
Ova signalna sekvencija se razlikuje na pet pozicija od signalne seicvence aiKalne fosfataze izE. Coli.
Početnica fergusfl ima sledeću sekvenciju:
Početnica fergusO ima sledeću sekvencu:
Obe početnice su optimizirane u odnosu na izbor kodona zaE. Coli,što znači da ne odgovaraju potpuno prirodnoj sekvenciji polaznog gena. Pri tome se početnica fergusfl, isto kao u primeru 1, primenjuje u PCR1, a početnica fergusf2 odgovarajuće u PCR2. Ekspresija se izvodi u skladu sa ekspresijom Ala-hirudina sa sojemE. coliWCM100 / pCM7053. Pokazalo se da ostvareni prinos ekspresije iznosi samo jedan deo prinosa ekspresije ostvarene u uporednom eksperimentu. Prinos je još za polovinu manji od prinosa koji se uočava za spoj iz signalnog peptida alkalne fosfatase odE. Colii Leu-hirudina.
Primer 8 : Sinteza fuzionog gena iz Leu-hirudina i signalne sekvencije prekursora ciklodekstrin glukanotransferaze izPaenibacillus macerans.
Konstrukcija sledi prema šemi opisanoj u primeru 1, sa izuzetkom, što su umesto početnice smompafl / f2 korišćene dve nove početnice, koje prema svojoj specifičnosti za gen hirudina i svojoj sekvenciji koju prepoznaje restrikcioni enzim£coRIpokazuju iste karakteristike kao i smompa-početnica, ali kodiraju za željenu signalnu sekvenciju gena ciklodekstrin glukanotransferaze izPaenibacillus macerans(Takano, T., Fukuda,M., Monma,M., Kobayashi,S., Kainuma,K. and Yamahe,K. J. :Bacteriol. 186, 1118-1122 (1986)).
Početnica baccdefl ima sledeću sekvenciju:
Početnica baccdgf2 ima sekvenciju:
Pri tome se početnica baccđgfl, isto kao u primeru 1, primenjuje u PCR1, a početnica baccdg£2 odgovarajuće u PCR2. Ekspresija se izvodi na isti način kao i ekspresija Ala-hirudina sa sojemE. coliWCM100 / pCM7053. Pokazuje se, da ostvareni prinos ekspresije iznosi oko 1/4 prinosa ekspresije ostvarene u uporednom eksperimentu. Sintetizovani hirudin se u testovima za sprečavanje trombina ponaša kao Leu-hirudin. To znači da je signalni peptid korektno procesiran. Ovo nije u skladu sa očekivanjima na osnovu teorijske analize, koja ukazuje na N-terminus koji bi trebalo da bude produžen za 8 aminokiselina ili alternativno skraćen za dve aminokiseline.
Primer 9: Sinteza fuzionog gena iz Leu-hirudina i signalne sekvencije prekursorskog proteina PCFO20 fimbrilina (fotA) izE. coli
Konstrukcija sledi prema šemi opisanoj u primeru I, sa izuzetkom, što su umesto početnice smompafl / f2 korišcene dve nove početnice, koje prema svojoj specifičnosti za gen hirudina i svojoj sekvenciji koju raspoznaje restrikcioni enzimEcoKJpokazuju iste karakteristike kao i smompa-početnica, ali kodiraju za željenu signalnu sekvenciju prekusorskog-proteina PCFO20 fimbrilina izE. coli(Viboud, G.I., Jonson, G., Dean-Nvstrom, E. and Svennerholm, A.M.: Infect. Immun. 64 (4), 1233-1239 (1996)).
Početnica pcfl-ala ima sledeću sekvenciju:
Početnica p-pcf2 ima sekvenciju:
Pri tome se početnica pcfl -ala, isto kao u primeru 1, primenjuje u PCR1, a početnica p-pcf2 odgovarajuće u PCR2. Ekspresija se izvodi u skladu sa ekspresijom Ala-hirudina sa sojemE. coliWCM100 / pCM7053. Proističe da ostvareni prinos ekspresije iznosi oko 40 % prinosa ekspresije ostvarene u uporednom eksperimentu.
Primer 10: Sinteza fuzionog gena iz Leu-hirudina i signalne sekvenceS. typhimuriumOuter Membrane Protein (fimD)
Konstrukcija sledi prema Šemi opisanoj u primeru 1, sa izuzetkom, što su umesto početnice smompafl / f2 korišćene dve nove početnice, koje prema svojoj specifičnosti za gen hirudina i svojoj sekvenciji koju raspoznaje restrikcioni enzimEcoRlpokazuju iste karakteristike kao i 'smompa-početnica, ali kodiraju za željenu signalnu sekvencijuS. typhimuriumOuter Membrane Proteina (Rioux, C.R., Friedrich, M.J. and Kadner, RJ. J.Bacteriol. 172(11), 6217-6222 (1990)).
Početnica styfimfl ima sledeću sekvenciju:
Počenica styfim£2 ima sekvenciju:
Pri tome se početnica styfimfl, isto kao u primeru 1, koristi u PCR1, a početnica styfimf2 odgovarajuće u PCR2. Ekspresija se izvodi na isti način kao i ekspresija Ala-hirudina sa sojemE. coliWCM100 / pCM7053. Pokazuje se, da ostvareni prinos ekspresije iznosi oko 10 % prinosa ekspresije ostvarene u uporednom eksperimentu.
Primer 11:Ekspresija u E. coli
Primer opisuje ekspresiju hirudina. U tu svrhu se 1 - 5 mL LB-medijuma, koji sadrži 25 mg/L ampicilina i 0,5 - 2 mM IPTG (izopropanol p-D-tiogalaktopiranozida) zaseje ćelijama nekog transformanta i mućka 20 časova pri 28°C u mućkalici pri 220 obrta u minutu. Na kraju se posle određivanja optičke gustine suspenzija ćelija centrifugira i u preostalom prozračnom rastvoru određuje se sadržaj hirudina.
Paralelno sa ekspresijom refluđana izvedena je i ekspresija Ala-hirudina, koji je opisan u evropskom patentu 0 448 093, preko plazmida pCM7053 u sekretorski mutant NVCM100, koji je opisan u patentu. Na ovaj način je omogućeno direktno poređenje brzina ekspesije.
Ekspresija u većem obimu se može izvesti u skladu sa US Patent 5,616,476. Refludan može tada da bude prečišćen primenom metode, koja je opisana u ovom patentu u primerima 5 i 6.
Primer 12. Ođredjivanje koncentracije hirudina
Određivanje koncentracije hirudina se izvodi po metodi Griessbach-a i saradnika.
(Thrombosis Research 37, 347-350, 1985 ). Za određivanje se koristi kalibraciona kriva u potrebnom opsegu, koja je konstruisana korišćenjem niza definisanih količina standarda refluđana. Time je dobijena mogućnost da se prinos izražava direktno u mg/L.
Claims (5)
1. Prekursor hirudina, naznačen time, što sadrži signalnu sekvenciju izabranu iz grupe, koja sadrži signalne sekvencije spoljašnjeg membranskog proteina izSerratia marcescenes,oprF-proteina izPseudomonas fluorescens,i fumarat-reduktaze izShewanella putrfaciens,na koju je dodata C-terminalno sekvencija Leu-hirudina.
2. Prekursor hirudina, prema Zahtevu 1, naznačen time, što je signalna sekvencija izabrana iz grupe koja sadrži signalnu sekvenciju spoljašnjeg membranskog proteina izSerratia marcescensi fumarat reduktaze izShewanella putrifaciens.
3. Postupak za proizvodnju Leu-hirudina, naznačen time, što se u njemu kao međustupanj pojavljuje prekursor hirudina deflnisan prema jednom od Zahteva 1 ili 2, gde (a) je proizveden ekspresioni plazmid koji sadrži jednu DNA-sekvenciju kodirajuću za prekursor hirudina; (b) je ekspresioni plazmid definisan u skladu sa (a) i prenosi genetsku informaciju u pogodnu ćelijuE. coli;(c) se prekursor hirudina izlučuje iz E.coli i istovremeno procesira i (d) se Leu-hirudin izoluje iz medijuma kulture.
4. Upotreba prekursora hirudina, definisanog u skladu sa Zahtevom 1 ili 2, za proizvodnju Leu-hirudina.
5. Upotreba prekursora hirudina, definisanog prema Zahtevu 4, u postupku definisanom prema Zahtevu 3.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19944870A DE19944870A1 (de) | 1999-09-18 | 1999-09-18 | Signalsequenzen zur Herstellung von Leu-Hirudin über Sekretion durch E. coli in das Kulturmedium |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| YU14602A YU14602A (sh) | 2005-07-19 |
| RS50435B true RS50435B (sr) | 2009-12-31 |
Family
ID=7922547
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| YUP-146/02A RS50435B (sr) | 1999-09-18 | 2000-09-01 | Signalne sekvence za proizvodnju leu-hirudina pomoću sekrecija e.coli u medijumu kulture |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7455987B1 (sr) |
| EP (1) | EP1216259B1 (sr) |
| JP (1) | JP4669181B2 (sr) |
| KR (1) | KR100737189B1 (sr) |
| CN (2) | CN1192037C (sr) |
| AR (1) | AR025660A1 (sr) |
| AT (1) | ATE357458T1 (sr) |
| AU (1) | AU775923B2 (sr) |
| BR (1) | BR0014519A (sr) |
| CA (1) | CA2385287C (sr) |
| CZ (1) | CZ2002899A3 (sr) |
| DE (2) | DE19944870A1 (sr) |
| DK (1) | DK1216259T3 (sr) |
| EE (1) | EE05187B1 (sr) |
| HR (1) | HRP20020226B1 (sr) |
| HU (1) | HUP0202596A3 (sr) |
| IL (2) | IL148624A0 (sr) |
| ME (1) | MEP27908A (sr) |
| MX (1) | MXPA02002469A (sr) |
| NO (1) | NO329723B1 (sr) |
| NZ (1) | NZ517825A (sr) |
| PL (1) | PL205117B1 (sr) |
| RS (1) | RS50435B (sr) |
| RU (1) | RU2261867C2 (sr) |
| SK (1) | SK287865B6 (sr) |
| TR (2) | TR200200667T2 (sr) |
| WO (1) | WO2001021662A1 (sr) |
| ZA (1) | ZA200202106B (sr) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7202059B2 (en) | 2001-02-20 | 2007-04-10 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Fusion proteins capable of being secreted into a fermentation medium |
| US7638618B2 (en) | 2001-02-20 | 2009-12-29 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Nucleic acids encoding a hirudin and pro-insulin as superscretable peptides and for parallel improvement of the exported forms of one or more polypeptides of interest |
| US9453251B2 (en) | 2002-10-08 | 2016-09-27 | Pfenex Inc. | Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens |
| CA2546157C (en) * | 2003-11-21 | 2014-07-22 | Dow Global Technolgies Inc. | Improved expression systems with sec-system secretion |
| BRPI0513826A2 (pt) | 2004-07-26 | 2010-06-22 | Dow Global Technologies Inc | processo para expressão de proteìna melhorada através de engenharia de cepa |
| DE102005046113A1 (de) * | 2005-09-27 | 2007-03-29 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Verfahren zur Amidierung von Polypetiden mit C-terminalen basischen Aminosäuren unter Verwendung spezifischer Endoproteasen |
| DE102006044841A1 (de) * | 2006-09-22 | 2008-04-03 | Wacker Chemie Ag | Signalpeptid zur Produktion von rekombinanten Proteinen |
| EP2468869B1 (en) | 2007-01-31 | 2015-03-18 | Pfenex Inc. | Bacterial leader sequences for increased expression |
| US9580719B2 (en) | 2007-04-27 | 2017-02-28 | Pfenex, Inc. | Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins |
| US9394571B2 (en) | 2007-04-27 | 2016-07-19 | Pfenex Inc. | Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins |
| PL2968470T3 (pl) | 2013-03-12 | 2021-05-31 | The General Hospital Corporation | Zmodyfikowane białka stanowiące substancję hamującą rozwój przewodów müllera (mis) i ich zastosowania do leczenia chorób |
| ES2912283T3 (es) | 2013-12-11 | 2022-05-25 | Massachusetts Gen Hospital | Uso de proteínas de tipo sustancia inhibidora mülleriana (SIM) para la anticoncepción y conservación de la reserva ovárica |
| CN108220369B (zh) * | 2017-12-04 | 2021-03-12 | 广东双骏生物科技有限公司 | 一种生产重组水蛭素的方法 |
| CN108359689B (zh) * | 2018-01-19 | 2021-03-23 | 华中农业大学 | 利用抗病基因识别无毒效应蛋白以鉴定具有分泌功能信号肽的方法 |
| CN115572329B (zh) * | 2021-06-21 | 2024-02-06 | 王大勇 | 一组活性增强代谢较慢的菲牛蛭基因重组水蛭素及其制备方法 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3429430A1 (de) * | 1984-08-10 | 1986-02-20 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| IL88925A (en) * | 1985-04-11 | 1995-11-27 | Hoechst Ag | Hirudin derivative and pharmaceutical composition containing same |
| US5084384A (en) * | 1987-04-23 | 1992-01-28 | Monsanto Company | Secretion of insulin-like growth factor-I |
| AU604925B2 (en) * | 1988-02-23 | 1991-01-03 | Schering Aktiengesellschaft | A hirudin derivative |
| DE4009268A1 (de) * | 1990-03-22 | 1991-09-26 | Consortium Elektrochem Ind | Sekretion von hirudinderivaten |
| ES2093717T3 (es) * | 1990-11-08 | 1997-01-01 | Japan Energy Corp | Mutante de hirudina, su produccion, anticoagulante, vector secretor, microorganismo transformado por el indicado vector y produccion de un producto a partir de dicho microorganismo. |
| JPH07119237B2 (ja) * | 1990-11-08 | 1995-12-20 | 株式会社ジャパンエナジー | ヒルジン変異体，その製造法及び抗凝血剤 |
| PT100580A (pt) * | 1991-06-12 | 1993-09-30 | Regeneron Pharma | Producao e recuperacao de neurotrofinas recombinantes |
| US5389529A (en) * | 1991-06-12 | 1995-02-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Modified lamβ signal sequence and processes for producing recombinant neurotrophins |
| DE4140381A1 (de) | 1991-12-07 | 1993-06-09 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt, De | Neue synthetische isohirudine mit verbesserter stabilitaet |
-
1999
- 1999-09-18 DE DE19944870A patent/DE19944870A1/de not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-09-01 WO PCT/EP2000/008537 patent/WO2001021662A1/de not_active Ceased
- 2000-09-01 CZ CZ2002899A patent/CZ2002899A3/cs unknown
- 2000-09-01 RU RU2002110278/13A patent/RU2261867C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-09-01 AU AU68421/00A patent/AU775923B2/en not_active Ceased
- 2000-09-01 NZ NZ517825A patent/NZ517825A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-09-01 MX MXPA02002469A patent/MXPA02002469A/es active IP Right Grant
- 2000-09-01 JP JP2001525235A patent/JP4669181B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-09-01 TR TR2002/00667T patent/TR200200667T2/xx unknown
- 2000-09-01 SK SK362-2002A patent/SK287865B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-09-01 EE EEP200200139A patent/EE05187B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-09-01 TR TR2005/01541T patent/TR200501541T2/xx unknown
- 2000-09-01 KR KR1020027003577A patent/KR100737189B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2000-09-01 DE DE50014189T patent/DE50014189D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-01 ME MEP-279/08A patent/MEP27908A/xx unknown
- 2000-09-01 AT AT00956507T patent/ATE357458T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-09-01 CA CA2385287A patent/CA2385287C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-09-01 HR HR20020226A patent/HRP20020226B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-09-01 BR BR0014519-0A patent/BR0014519A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-09-01 HU HU0202596A patent/HUP0202596A3/hu unknown
- 2000-09-01 RS YUP-146/02A patent/RS50435B/sr unknown
- 2000-09-01 EP EP00956507A patent/EP1216259B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-01 DK DK00956507T patent/DK1216259T3/da active
- 2000-09-01 PL PL354444A patent/PL205117B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2000-09-01 CN CNB00812955XA patent/CN1192037C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-09-01 IL IL14862400A patent/IL148624A0/xx unknown
- 2000-09-01 CN CNB2004100346716A patent/CN1269838C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-09-14 AR ARP000104820A patent/AR025660A1/es active IP Right Grant
- 2000-09-18 US US09/664,326 patent/US7455987B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-03-11 IL IL148624A patent/IL148624A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-03-13 NO NO20021254A patent/NO329723B1/no not_active IP Right Cessation
- 2002-03-14 ZA ZA200202106A patent/ZA200202106B/en unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RS50435B (sr) | Signalne sekvence za proizvodnju leu-hirudina pomoću sekrecija e.coli u medijumu kulture | |
| JP3865792B2 (ja) | ペプチド、融合ペプチド、発現ベクター及び組換えタンパク質の製造方法 | |
| US6107059A (en) | Peptide library and screening method | |
| WO1998014591A1 (en) | Novel expression vectors for production of foreign proteins as soluble forms | |
| JP2005516074A (ja) | ビオチン化ドメインを含むタンパク質タグ、及び溶解性を増大させる方法、及び折り畳み状態を決定する方法 | |
| AU2001258105A1 (en) | Chlamydia antigens and corresponding dna fragments and uses thereof | |
| LaVallie et al. | Thioredoxin and related proteins as multifunctional fusion tags for soluble expression in E. coli | |
| JP2005516074A6 (ja) | ビオチン化ドメインを含むタンパク質タグ、及び溶解性を増大させる方法、及び折り畳み状態を決定する方法 | |
| Johnson et al. | Identification of a plastid-specific ribosomal protein in the 30 S subunit of chloroplast ribosomes and isolation of the cDNA clone encoding its cytoplasmic precursor. | |
| JP4405125B2 (ja) | 複数のエピトープと融合した組換えタンパク質の精製 | |
| US6852512B2 (en) | Expression vectors for production of foreign proteins as soluble forms | |
| JPH06315384A (ja) | セリンプロテアーゼインヒビターの産生のための遺伝子組み換え法と、同じ目的に有用なｄｎａ塩基配列 | |
| CA1301096C (en) | High yield protein production system | |
| JP2504723B2 (ja) | 組換体ｄｎａとこれを含むプラスミドベクタ―とこのような組換体ｄｎａを保持する大腸菌 | |
| KR940010862B1 (ko) | 유용한 메탈로프로테이나제 억제제 씨퀀스 재조합 벡터계의 제조를 위한 dna 재조합 방법 | |
| JP2009525749A (ja) | 組換えタンパク質の精製のためのアフィニティーポリペプチド | |
| KR940011339B1 (ko) | 세린프로테아제억제제의 제조를 위한 dna 재조합 방법 | |
| JPH0349685A (ja) | 新規ｄｎａ鎖およびその使用 | |
| Kriel | Development of synthetic signal sequences for heterologous protein secretion from Saccharomyces cerevisiae | |
| Yuwono et al. | The role of amino-terminal and carboxy-terminal extensions in the processing and translocation of a plant proteinase (Actinidin) expressed in the yeast Saccharomyces cerevisiae | |
| JPH02186988A (ja) | 抗ウイルス性タンパク質の製造方法 | |
| EP1792995A3 (en) | Chlamydia secretory locus orf and uses thereof | |
| JPH11239480A (ja) | プレニル２リン酸合成酵素をコードするｄｎａを連結させた組換えｄｎａおよびプレニル２リン酸合成酵素の製造方法 |