RS50488B - Vektori ekspresije koji sadrže mcmv ie2 promotor - Google Patents

Vektori ekspresije koji sadrže mcmv ie2 promotor

Info

Publication number
RS50488B
RS50488B YUP-2005/0687A YUP20050687A RS50488B RS 50488 B RS50488 B RS 50488B YU P20050687 A YUP20050687 A YU P20050687A RS 50488 B RS50488 B RS 50488B
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
promoter
expression
mcmv
vector according
vector
Prior art date
Application number
YUP-2005/0687A
Other languages
English (en)
Inventor
Markus Imhof
Philippe Chatellard
Original Assignee
Laboratoires Serono Sa.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Laboratoires Serono Sa. filed Critical Laboratoires Serono Sa.
Publication of RS20050687A publication Critical patent/RS20050687A/sr
Publication of RS50488B publication Critical patent/RS50488B/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus
    • C07K14/04—Varicella-zoster virus
    • C07K14/045—Cytomegalovirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/16143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/20—Vector systems having a special element relevant for transcription transcription of more than one cistron
    • C12N2830/205—Vector systems having a special element relevant for transcription transcription of more than one cistron bidirectional
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Vektor ekspresije koji obuhvata promoter mCMV-IE2 koji se sastoji od fragmenta SEQ ID NO.1 za promociju funkcionalne ekspresije, naznačeno time da:(i) vektor ekspresije ne sadrži nijedan kompletan gen mCMV, i(ii) pomenuti promotor mCMV-IE2 je operabilno povezan sa DNK sekvencom koja kodira polipeptid.Prijava sadrži još 8 nezavisnih i 31 zavisnih patentnih zahteva.

Description

POLJE TEHNIKE
Ovaj pronalazak se odnosi na vektore ekspresije koji sadrže promotor mCMV-IE2 gena, ili njegov funkcionalni fragment koji vrši promociju ekspresije, i/ili pojačivač mCMV-IE2 gena, ili neki njegov funkcionalni fragment koji pojačava ekspresiju, što je naznačeno time da vektor ekspresije ne sadrži bilo koji kompletan gen mCMV, na ćelije domaćine koje sadrže takve vektore, na metode proizvodnje željenih polipeptida uz pomoć ovih vektora ekspresije i na upotrebu navedenih vektora ekspresije.
Vektori ekspresije koji sadrže mCMV IE2 promotor i mCMV IE1 promotor, opciono zajedno sa novim mCMV IE2 pojačivačem su prema ovom pronalasku preferentni, posebno ukoliko su oba promotora raspoređena u vidu dvosmerne strukture.
STANJE TEHNIKE
Već decenijama se vektori ekspresije koriste kao nosači za ekspresiju gena ili polipeptida ili proteina od interesa koje kodiraju cDNKs u ćelijama domaćinima. Snažni virusni ili ćelijski promotori i pojačivači se koriste za ekspresiju visokih nivoa gena od interesa primenom prolazne ili stabilne transfekcije rekombinantne DNK u ćelije domaćine. Pokazalo se da je neposredni rani (IE) region humanog citomegalovirusa (hCMV) posebno pogodan u tom smislu, a poznati su vektori ekspresije koji obuhvataju elemente gena izvedenog iz ovog regiona, npr. iz EP0323997B1.
Do danas su genske regulatorne sekvence iz mišjih citomegalovirusa (mCMV) retko korišćene iako je utvrđeno da su regulatorni elementi izvedeni iz mCMV veoma moćni pa čak i jači od humanog pandana (Kim et al. 2002).
US 4,963,481 (de Villiers) otkriva vektore ekspresije koji imaju DNK koja enkodira heterologni protein pod transkriptivnom kontrolom fragmenata DNK izvedenog iz mCMV IE genskog regiona koji uključuje približno 2270 baznih parova (bp) Pstl fragmenta restrikcione endonukleaze, izolovanih iz virusnog genoma. Skraćena verzija ovog fragmenta sa 1387 bp dovela je do značajnog poboljšanja efikasnosti ovog fragmenta DNK kao promotora ekspresije ovog heterolognog proteina.
US 4,968,615 (Kozinovvski) opisuje molekule rekombinantne DNK koji sadrže pojačivače transkripcije iz mišjeg citomegalovirusa (MCMV) koji se mogu koristiti za pojačanje transkripcije strukturnih gena u eukariotskim ćelijama. Navedeno je da se pojačivač mCMV nalazi u okviru Pstl fragmenta sa 2.27 kb koje je identifikovao de Villiers (US 4,963,481).
Manning i Mocarski (1988) su analizirali funkcionalni značaj mCMV IE2 regiona za replikaciju mišjeg citomegalovirusa. U tom smislu konstruisan je jedan rekombinantni virus koji ima lacZ reporterski gen pod transkripcionom kontrolom mCMV IE pojačivača/promotera, što dovodi do disrupcije IE2 gena. Naravno, ne može se primetiti ekspresija IE2 gena a virus je repliciran normalno. Autori su stoga zaključili da IE2 gen, koji nije konzerviran među citomegalovirusima kao što su mCMV i hCMV, nije bio suštinski važan za replikaciju virusa. Manning i Mocarski nisu ukazali ili otkrili neku posebnu korist IE2 pojačivačkog/promoterskog regiona.
Novija literature pokazuje dalje razlike između mišjeg i humanog CMV IE regiona. Mišji lokus eksprimira drugu po veličini mRNK u suprotnom pravcu u odnosu na privi IE gen. Ovaj drugi neposredni rani gen je nazvan IE2, a njegova promoterska sekvenca se naziva IE2 promoter (Messerle et al. 1991).
IE2 region iz mCMV do sada nije korišćen za ekspresiju heterolognih proteina.
KRATAK PRIKAZ PRONALASKA
Ovaj pronalazak se zasniva na nalazu da vektor koji ima neki DNK element koji sadrži IE2 promoterski region mCMV može efikasno da inicira ekspresiju gena od interesa u transfektovanim ćelijama domaćinima.
Ovaj pronalazak se dalje zasniva na identifikaciji jednog novog pojačivača u mCMV IE2 regionu, koji se ovde naziva mCMV IE2 pojačivač. Ovaj pojačivač ispunjava kriterijume koji se obično primenjuju za definisanje pojačivača, tj. pojačanu ekspresiju nezavisno od (1) lokacije, (2) orijentacije i (3) pojačanja ekspresije iz nekog heterolognog promotera.
To znači da se prvi aspekt ovog pronalaska odnosi na vektor ekspresije koji sadrži promoter mCMV-IE2 gena ili njegov funkcionalni fragment koji vrši promociju ekspresije, i/ili pojačivač mCMV-IE2 gena, ili neki njegov funkcionalni fragment koji pojačava ekspresiju, što je naznačeno time da vektor ekspresije ne sadrži bilo koji kompletan gen mCMV.
U drugom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na ćeliju domaćina koja obuhvata neki vektor prema ovom pronalasku
Treći aspekt ovog pronalaska se odnosi na proces proizvodnje polipeptida od interesa koji sadrži korak transfekcije ćelije domaćina nekim vektorom u skladu sa ovim pronalaskom.
U četvrtom aspekt, ovaj pronalazak se odnosi na proces proizvodnje polipeptida
od interesa koji sadrži korak kultivacije ćelije domaćina iz ovog pronalaska.
Peti aspekt ovog pronalaska se odnosi na upotrebu vektora u skladu sa ovim
pronalaskom za ekspresiju jednog ili više gena ili cDNKs od interesa.
U šestom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu vektora iz ovog
pronalaska za selekciju klona koji eksprimiraju velike količine gena od interesa.
Sedmi aspekt se odnosi na upotrebu vektora u skladu sa ovim pronalaskom u terapiji zasnovanoj na DNK
KRATAK OPIS CRTEŽA
SI. 1 pokazuje sekvencu dvosmernog elementa DNK izvedenog iz mCMV IE regiona za upotrebu u ekspresivnim sastavima. Naznačena su mesta +1 i TATA kućice IE2 i IE1 promotera. Najvažniji promoteri oba gena su prikazani u kućici. Hpal i Xhol mesta restrikcije su prikazana tamnim slovima. Položaj -682 je naznačen u odnosu na+1 IE1.
SI. 2 pokazuje reporterske konstrukcije A do G. Reporterski gen luciferaze je prikazan u vidu tamnije linije a promoteri su označeni otvorenim strelicama.
A: Negativna kontrola bez promotera (pGL3 Bazični).
B: Jedan SV40 promoter/pojačivač koji pokreće reporter vektor luciferase (pGL3
kontrola).
C: Ekspresiju luciferaze koju pokreće IE1 promoter (pmCMV Luciferaza,
pokrenuta sa IE1).
D: Ekspresiju luciferaze koju pokreće promoter IE2 (prevmCMV Luciferaza,
pokrenuta sa IE2).
E: Ekspresiju luciferaze koju pokreće promoter promoter IE2, dok jr IE1 promoter
izbrisan (prevmCMV Luciferase (AXhol), IE2 pokretač, IE1 minus).
F: Ekspresiju luciferaze koju pokreće promoter IE1 dok jr IE2 promoter izbrisan
(pBS.MCMV3 Luciferaza, IE1 pokretač (1.4 kb), IE2 minus).
G: Jedna kratka verzija IE1 promotera koji pokreće ekspresiju luciferaze (p-680
Luciferaze, IE1 pkretač (kratka verzija, 0.68 kb)).
SI. 3 pokazuje dvosmernu konstrukciju sličnu konstrukciji C na SI. 2 (konstrukcija C-2) sa kodirajućom sekvencom za IL-18BP (podebljana linija) povezanom sa IE2 promoterom. To znači da u ovom konstruktu, mCMV IE1 promoter pokreće ekspresiju luciferaze a istovremeno mCMV IE2 promoter pokreće ekspresiju IL-18BP. Trougao: intron. Zatvoreni oval: poliA.
SI. 4 pokazuje ekspresiju reporterskog gena luciferaze iz različitih reporterskih konstrukta koji su prikazani na SI. 2, konstrukti A do G. CHO-S ćelije uzgajane na podlozi bez seruma (SFM) su prolazno transficirane konstruktima A do G, ili je izvršena imitacija transfekcije. Aktivnost luciferaze je eksprimirana u vidu RLU = relativno lake jedinice.
SI 5 pokazuje ekspresiju luciferaze merenu u vidu RLU u stabilnim pulovima transfektovanih CHO-S ćelija. Ove ćelije su odgajene u SFM posle transfekcije konstruktima D, C, F i E, kako je prikazano na SI. 2. Ekspresija luciferaze je procenjivana posle 21 dan selekcije.
SI. 6 pokazuje ekspresiju luciferaze merene u vidu RLU posle prolazne transfekcije sa
900, 500, 300 i 100 ng dvosmernog konstrukta C-2 koji je prikazan na SI. 3.
SI. 7 pokazuje količinu IL-18BP u ng/l u supernatantima ćelijske kulture iz eksperimenta
prolazne transfekcije prema SI. 6 (konstrukt C-2).
SI. 8 pokazuje odnos količina IL-18BP prema Luciferazi merenoj u eksperimentu prema
Slikama 6 i 7.
SI. 9 pokazuje količine Luciferaze u RLU (leva y osa) i IL-18 BP u ng/ml (desna y osa)
koju eksprimira 48 individualnih klonova koji su ubrani 8 dana posle transfekcije sa dvosmernim konstruktom C-2 (kako je prikazano na SI. 3). Granica detekcije Luciferaze je bila oko 500 RLU, odnosno 2.5 ng/ml za IL-18BP. Svako pomeranje na X osi predstavlja jedan pojedinačni klon.
SI. 10 (a) pokazuje reporterske konstrukte H do N. Reporterski gen luciferaze (Luc) je prikazan u vidu podebljane linije a odgovarajući IE1 i IE2 promoteri su označeni otvorenim strelicama. Pojačivači su prikazani u vidu sivih ovalnih linija: Svetio siva pokazuje poznati IE1 pojačivač a tamno siva novi IE2 pojačivač.
H: Dvosmerni konstrukt sa ekspresijom luciferaze koju pokreće IE2 promoter;
I: Ekspresiju luciferaze pokreće IE2 promoter, a IE1 promoter je obrisan;
J, K, L, M, N: konstrukti koji se nalaze u skraćenim mCMV promoterima, pozicije koje odgovaraju broju baznih parova od mCMVp, u odnosu na +1 IE2 kao reference: J: od -1076
K: od-783
L: od - 587
M: od - 387
N: od -189
SI. 10 (b) pokazuje ekspresiju luciferaze u RLU iz reporterskih konstrukta H do N prema SI. 10 (a), posle prolazne transfekcije CHO-S ćelija koje su odgajene na podlozi bez seruma.
SI. 11 (a) pokazuje dalje reporterske konstrukcije O do Y koje kombinuju novi IE2
pojačivač (sivi oval) sa SV40 promoterom. Ovaj sivi oval predstavlja IE2 pojačivač od -587 do -189, polovina sivog ovala predstavlja IE2 pojačivač od - 387 do -189. Strelica iznad IE2 pojačivača pokazuju pravac sekvence pojačivača. Reporterski gen luciferaze je prikazan u vidu podebljane linije, SV40 promoter je označen otvorenom strelicom. Crni oval: poliA.
O: dugačka IE2 sekvence pojačivača (-587/-189) klonirani 5' SV40 promotera;
P: kratka IE2 sekvence pojačivača (-387/-189) klonirani 5' SV40 promotera;
Q: dugačka IE2 sekvence pojačivača (-587/-189) klonirani 5' SV40 promotera u
obrnutom smeru;
R: kratka IE2 sekvence pojačivača (-387/-189) klonirani 5' SV40 promotera u
obrnutom smeru;
S: dugačka IE2 sekvence pojačivača (-587/-189) klonirani 3' gena Luciferase;
T: kratka IE2 sekvence pojačivača (-387/-189) klonirani 3' gena luciferaze;
U: dugačka IE2 sekvence pojačivača (-587/-189) klonirani 3' gena luciferaze u obrnutom smeru;
V. kratka IE2 sekvence pojačivača (-387/-189) klonirani 3' gena luciferaze u
obrnutom smeru;
W: Kontrola, SV40 promoter i SV40 pojačivač u 3' sekvence koja kodira
luciferazu
X: Kontrola, Ekspresija luciferaze inicirana SV40 promoterom bez bilo kakvog
pojačivača
Y: negativna kontrola, potpuno bez promotera.
SI 11 ( b) pokazuje ekspresiju luciferaze iz reporterskih konstrukcija O do Y kako je prikazano na SI. 11 (a). CHO-S ćelije odgajene na podlozi bez seruma (SFM) su prolazno transfektovane konstruktima O do Y. Aktivnost luciferaze je eksprimirana u vidu višestruke indukcije u odnosu na kontrolu X (vrednost 1), tj. ekspresijom koju pokreće SV40 promoter bez ikakvog pojačivač. Otvorene crtice: dugačak IE2 pojačivač (-587 to -189), šrafirane crtice: kratki IE2 pojačivač (-387 do -189). X osa je logaritamska skala.
SI. 12 pokazuje jedan eksperiment u kome je poređen novi IE2 pojačivač sa poznatim hCMV pojaćivačem. Ćelije su transfektovane kontrolnim konstruktom A (pGL3 bazični, videti SI. 2, bez promotera), kontrolni konstrukt B (pGL3 ctrl, videti SI. 2, SV40 promoter sa SV40 sekvencom pojačivača u 3' regiona koji kodira luciferazu), kontrolni konstrukt X (SV-Luc+, videti SI. 11.a, SV40 promoter bez pojačivača), kao i konstrukti O i Q (videti SI. 11 a) ili konstrukti 0-2 i Q-2, u kojima je IE2 sekvenca pojačivača (dugačka verzija, -587 do -189) je replicirana poznatom hCMV sekvencom pojačivača (SEQ ID NO: 2). Luciferaze su merene u RLU (x osa). Šrafirane crtice: sa poznatim hCMV pojaćivačem. Sive crtice: sa novim IE2 pojaćivačem.
SI 13 pokazuje the dvosmerni vektor korišćen za istovremenu ekspresiju IL-18BP i Luciferaze. IE1 i IE2 promoteri označeni u vodu otvorenih strelica. Trougao predstavlja intron A iz hCMV IE regiona, a sivi oval poliadenilacioni signal. Zatvoreni kvadrat predstavlja signalni peptid.
Konstrukt #26: Luciferaza eksprimirana iz IE1 promotera i IL-18BP iz IE2 promotera. Sekvenca između oba promotera je ista kao kod konstrukta H na SI 10.a.
Konstrukt #140: Luciferaza eksprimirana IE2 promoterom i IL-18BP iz IE1 promotera. IE2 pojačivač (- 587 to -189) je lociran između ova dva promotera.
SI 14 pokazuje količine eksprimirane Luciferaze (RLU, leva y osa) i IL-18BP (ng/ml,
desna Y osa) posle prolazne transfekcije CHO ćelije odgajene na podlozi bez seruma sa konstruktom #26 ili #140 prema SI. 13. Crtice: Ekspresija luciferaze,
zatvoreni romboidi: IL-18BP ekspresija.
SI 15 pokazuje ekspresiju luciferase (RLU, leva y osa) i IL-18BP (ng/ml, desna y osa) u stabilnim pulovima transfektovanim sa konstruktom #26 ili #140 prema SI. 13. Ekspresija je merena 7 nedelja posle transfekcije. Ćelije su držane pod selekcijom sa puromicinom (+ puro), ili tokom 3 nedelje bez puromicinske selekcije (- puro). Crtice: Ekspresija luciferaze, zatvoreni rombovi: IL-18BP ekspresija.
S116 pokazuje vremenski tok ekspresije luciferaze kao u eksperimentu na SI. 15. X osa predstavlja vreme u nedeljama. Podaci prikazani na SI. 15 odgovaraju datumu posle 3 nedelje na SI. 16. Zatvoreni romb: #26 + puro, mali kvadrat: #140 + puro, zatvoreni trougao: #26 - puro, veliki kvadrat: #140 - puro.
SI 17: pokazuje vremenski tok IL-18BP ekspresije u eksperimentu prema SI. 16.
objašnjenja ispod slike su ista kao i kod SI. 16.
S118 Individualni proto-klonovi su analizirani po pitanju ekspresije luciferaze (kvadrati) u RLU (leva y osa) i IL-18BP ekspresije (rombovi) u ng/ml (desna y osa). Svako povećanje na x osi predstavlja jedan proto-klon. Protoklonovi su ustanovljeni iz CHO ćelija koje su stabilno transfektovane sa konstruktom #26 i držane pod puromicinskom selekcijom
SI 19: Kao i SI. 18, ali su protoklonovi osnovani iz ćelija transficiranih sa konstrukt om
#140.
SI. 20: Protoklonovi transficirani konstruktom #26 ili #140 su analizirani po pitanju ekspresije luciferaze u formatu sa 96 otvore, obrnuta ChemiDoc perspektiva.
DETALJNI OPIS PRONALASKA
U skladu sa ovim pronalaskom, iznenađujuće je utvrđeno da je promoter direktna rana dva (IE2) gena mišjeg citomegalovirusa (mCMV) efikasan za promociju ekspresije polipeptida od interesa koji nije sam mCMV IE2 protein, tj. za heterologni polipeptid ili protein. Ne pretpostavlja se da je ovaj vektor ekspresije sam mišji citomegalovirus ili da sadrži bilo koji kompletan mCMV virusni gen, već da je to vektor sačinjen za ekspresiju rekombinantnog proteina.
Stoga se ovaj pronalazak odnosi na neki vektor ekspresije koji sadrži promoter mCMV-IE2 gena ili njegov funkcionalni fragment koji vrši promociju ekspresije, što je naznačeno time da vektor ekspresije ne sadrži bilo koji kompletan gen mCMV.
Osim toga je identifikovan novi pojačivač u mCMV IE2 regionu, koji se ovde naziva mCMV IE2 pojačivač ili IE2 pojačivač. Ovaj pojačivač pojačava ekspresiju bez obzira na svoju lokaciju ili orijentaciju vis-a-vis gena i pojačava ekspresiju iz heterolognih promotera i tako ispunjava opšte kriterijume nekog pojačivača.
Ovaj pronalazak se stoga takođe odnosi na neki vektor ekspresije koji sadrži pojačivač mCMV-IE2 gena ili na neki njegov funkcionalni fragment koji pojačava ekspresiju, što je naznačeno time da vektor ekspresije ne sadrži bilo koji kompletan gen mCMV.
Stručnjak iz ove oblasti će uzeti u obzir da vektor iz ovog pronalaska može da obuhvata samo mCMV IE2 promoter ili u kombinaciji sa bilo kojim odgovarajućim poznatim pojaćivačem. Stručnjak iz ove oblasti će takođe znati da vektor iz ovog pronalaska može da obuhvata samo mCMV IE2 pojačivač ili u kombinaciji sa bilo kojim odgovarajućim pojaćivačem. Osim toga, vektor iz ovog pronalaska može da obuhvata mCMV IE2 promoter u kombinaciji sa mCMV IE2 pojaćivačem.
Sam mCMV IE2 gen je poznat npr. iz rada Messerle et al., 1991.
Termin "promoter" u smislu u kome je ovde korišćen odnosi se na region DNK koji funkcioniše tako da kontroliše transkripciju jedne ili više sekvenci DNK, i koji se strukturno identifikuje po prisustvu mesta vezivanja namenjenog za DNK-zavisnu RNK-polimerazu i druge DNK sekvence, koje stupaju u interakciju da bi regulisale funkciju promotera. Funkcionalna ekspresija fragmenta promotera koji vrši promociju je skraćenja i zasećena sekvenca promotera koja zadržava promotersku aktivnost. Promoterska aktivnost se može meriti u bilo kom od eseja koji su poznati u ovoj stručnoj oblasti, npr. u nekom reporterskom eseju uz korišćenje luciferaze kao reporterskog gena (Wood, 1991; Seliger and McEIrov, 1960; de VVet et al. (1985), ili u komercijalno dostupnom Promega®).
U skladu sa ovim pronalaskom, IE2 promoter može npr. da obuhvata sekvencu koja se prostire od položaja +1 do TATA kućice, kako je pokazano na SI. 1. IE2 promoter može takođe da obuhvata sekvencu koja se ovde naziva "osnovni promoter" i koja se prostire od nukleotida 1 do 39 sekvence koja je prikazana na SI. 1 (kućica). Stručnjak iz ove oblasti će znati da sekvenca mCMV IE2 promotera može biti duža ili kraća od osnovnog promotera, sve dok ona podstiče transkripciju DNK sekvence koja je funkcionalno za nju vezana. Na primer, IE2 promoter može takođe da obuhvata 100-200 baznih parova u gornjem delu osnovnog promotera. Takav promoterski region se takođe naziva "proksimalni promoter". Stručnjak iz ove oblasti će takođe znati da termini "promoter" i "pojačivač" (videti dole) nisu tačno definisani i da stoga ovaj promoter može da obuhvata pojačivačke regione, ili pojačivački regioni mogu da obuhvataju promoterska regione, u zavisnosti od nomenklature i konteksta.
Termin "vektor" odnosi se na bilo koji nosač egzogene DNK ili RNK koji je koristan za prenos egzogene DNK u ćeliju domaćina radi replikacije i/ili odgovarajuću ekspresiju egzogene DNK od strane ćelije domaćina.
Termin "operativno povezan" u smislu u kome je ovde korišćen označava funkcionalno spajanje nekog promotera sa strukturnim genom ili cDNK ili sa bilo kojom drugom DNK sekvencom da bi bio transkribovan u odgovarajućem okviru za ekspresiju gena, cDNK ili druge DNK pod kontrolom promotera. Termin operativno povezan, u smislu u kome je ovde korišćen stoga nije ograničen na direktnu fuziju DNK sekvence.
Termin "kompletan gen mCMV" odnosi se na virusni gen mišjeg citomegalovirusa koji ima svoje sopstvene (endogene, virusne) 5' i 3' regulacione elemente.
Izraz "pojačivački region" odnosi se na region DNK koji ima funkciju povećanja transkripcije jednog ili više gena. Preciznije, termin "pojačivač", u smislu u kome je ovde korišćen predstavlja regulatorni element DNK koji pojačava, povećava, poboljšava ili ublažava ekspresiju nekog gena bez obzira na svoju lokaciju u orijentaciju naspram gena koji treba eksprimirati a to može da bude pojačanje, povećanje, poboljšanje ili ublažavanje ekspresije više od jednog promotera. Preferentno je da pojačivač pojačava istovremeno ekspresiju iz više promotera. Fragment pojačivača koji pojačava funkcionalnu ekspresiju predstavlja skraćenu uli zasečenu sekvencu pojačivača koja zadržava svoju aktivnost pojačivača.
Vektor iz ovog pronalaska preferentno obuhvata neki fragment koji uključuje nukleotide -387 do -189 uzlaznog regiona mCMV IE2, a broj nukleotida zavisi od +1 IE2 gena. Ovaj fragment ima pojačivačku funkciju i on se ovde naziva IE2 pojačivač, kratka verzija.
U narednom preferentnom aspektu, ovaj vektor obuhvata jedan fragment koji uključuje nukleotide -587 to -189 uzlaznog regiona mCMV IE2, a broj nukleotida zavisi od +1 IE2 gena. Ovaj fragment ima pojačivačku funkciju i on se ovde naziva IE2 pojačivač, dugačka verzija.
Vektor iz ovog pronalaska može takođe da obuhvata još neki dodatni mCMV IE pojačivač, ili neki njegov funkcionalni fragment koji pojačava ekspresiju, koji se ovde naziva "CMV IE1 pojačivač".
Takav mCMV IE1 pojačivač je poznat u ovoj stručnoj oblasti, npr. iz US 4,968,615. On može npr. da se proteže od položaja-587 do -147 ili od položaja -682 do -147 sekvence prikazane na SI. 1, a broj zavisi od +1 položaja IE1 gena. mCMV IE1 pojačivač koji se može koristiti u skladu sa ovim pronalaskom može dalje da obuhvata sekvencu koja se prostire od baznog para -1330 do -488, u zavisnosti od pozicije +1 IE1 na SI. 1. Ovaj pojačivački region može takođe da obuhvata neki ceo promoter ili njegov deo.
Upotrebom nekog mCMV pojačivača osim IE2 promotera, ekspresija polipeptida od interesa može dalje da se poveća.
U skladu sa ovim pronalaskom, ovaj vektor dalje obuhvata neki promoter koji se razlikuje od mCMV-IE2 promotera, ili njegov funkcionalni fragment koji vrši promociju ekspresije.
Prema jednom preferentnom aspektu, vektor iz ovog pronalaska obuhvata prvi i drugi promoter virusnog, ćelijskog ili veštačkog porekla, ili njegov funkcionalni fragment koji vrši promociju ekspresije.
U skladu sa ovim pronalaskom, pokazano je da prisustvo drugog promotera dovodi do efikasne ekspresije polipeptida od interesa iz mCMV IE2 promotera. Stoga, prema jednom preferentnom aspektu, ovaj vektor obuhvata mCMV IE2 promoter u kombinaciji sa drugim promoterom, ili njegov funkcionalni fragment koji vrši promociju ekspresije. U promere dodatnih pogodnih promotera spadaju hCMV promoter, metalotoineinski promoter (MT), SV40 promoter ili veštački promoter. Poželjno je da drugi promoter bude dodatna kopija mCMV IE2 promotera. Takvi dodatni promoteri mogu da vrše promociju konstitutivne ili regulisane ekspresije. Regulisana ekspresija može biti inducibilna ili represibilna ekspresije, ili obe.
Preferentno, takav drugi promoter je promoter mCMV-IE1 gena ili njegov funkcionalni fragment koji vrši promociju ekspresije. Stoga je posebno poželjno da prvi promoter bude mCMV-IE2 promoter, ili njegov funkcionalni fragment koji vrši promociju ekspresije, a drugi promoter mCMV-IE1 promoter, ili njegov funkcionalni fragment koji vrši promociju ekspresije.
mCMV-IE1 promoter je poznat npr. iz WO 87/03905. On može da obuhvata osnovni promoter koji sadrži sekvencu poslednjih 47 bp sa SI. 1 (kućica), ili dodatnih 100 do 200 bp u uzlaznom delu sekvence (tj. proksimalni promoter), ili on može da obuhvata the celokupan intergeni region do pozicije -1330 (u zavisnosti od pozicije +1 IE1, videti SI. 1).
Prema jednom preferentnom aspektu, ovaj vektor obuhvata DNK sekvencu od SEQ ID NO: 1, uključujući i IE1 i IE2 promoter o i IE 1 pojačivač i novi IE2 pojačivač, ili bilo koji njihov funkcionalni fragment koji promoviše ekspresiju.
Prema jednom veoma poželjnom aspektu, u vektoru prema ovom pronalasku, promoter ili njegov funkcionalni fragment koji vrši promociju ekspresije, je operativno povezan sa nekom DNK sekvencom koja kodira najmanje jedan polipeptid. Prema narednom aspektu ovog pronalaska, pojačivač iz ovog pronalaska je prisutan na vektoru ekspresije zajedno sa DNK sekvencom koja kodira najmanje jedan polipeptid.
Preferentno, DNK sekvenca kodira protein od interesa.
Dalje je poželjno da DNK sekvenca kodira neki marker protein, ili da predstavlja gen koji se može amplifikovati.
Takođe je poželjno DNK sekvenca kodira neki reporterski protein.
Ukoliko vektor iz ovog pronalaska sadrži više od jednog promotera, bilo koja kombinacija ili pod-kombinacija proteina od interesa, markera, reportera, gena koji se može amplifikovati itd., može se eksprimirati iz istog plazmida,
U skladu sa ovim pronalaskom, polipeptid od interesa može biti bilo koji polipeptid koji se razlikuje od samog IE2 polipeptida, što može da bude neki ekstracelulami protein kao što su peptidni hormoni, citokini ili faktori rasta, ili neki transmembranski protein kao što su receptori faktora rasta ili hormonski receptori ili intracelulami proteini, kao što su kinaze, fosfataze ili proteina koji vezuju DNK, u zavisnosti od planirane upotrebe polipeptida od interesa ili ćelije domaćina u kojoj se on eksprimira.
Markerski proteini koji su pogodni u skladu sa ovim pronalaskom su npr. markeri negativne ili pozitivne selekcije ili gena koji se može amplifikovati. Primeri uključuju proteine odabrane između adenozin deaminaze (ADA), aminoglikozid fosfotransveraze (neo), dehidrofolat reduktaze (DHFR), higromicin-B-fosfotransveraze (HPH), timidin kinaze (tk), ksantin-guanin fosforiboziltransferaze (gpt), gena višestruke rezistencije na lekove (MDR), ornitin dekarboksilaze (ODC) i rezistencije na N-(fosfonacetil)-L-aspartat (CAD) ili puromicin aktiltransferaze (PAC). Dalji primeri uključuju gene korišćene za selekciju upotrebom posebnih metaboličkih puteva kao što su galaktokinaza (Schumperli et al., 1982), folatni receptor (Zhu et al., 2001), ili smanjeni folatni nosač (Assaraf et al., 1992).
Prema još jednom dodatnom preferentnom aspektu polipeptid od interesa je reporterski gen.
Termin "reporterski gen" ili "reporterski protein", u smislu u kome je ovde korišćen , treba da označava gen koji enkodira neki genski proizvod koji se može identifikovati uz pomoć jednostavnih, jeftinih metoda ili reagensi i koji se može operativno povezati sa nekim promoterskim regionom iz ovog pronalaska ili nekim njegovim aktivnim fragmentom. Reporterski geni se mogu koristiti za određivanje transkripcione aktivnosti u kontrolnim esejima (videti, na primer, Goeddel (ed.), Methods Enzvmol., Vol. 185, San Diego. Academic Press, Inc. (1990)), npr. uz korišćenje luciferaze kao reporterskog gena (Wood, 1991; Seliger and McEIrov, 1960; de Wet et al. (1985), ili komercijalno dostupnog od Promega®).
Primeri su odabrani između luciferaze, zelenog fluorescentnog proteina, alkalne fosfataze, O-galaktozidaze, ili peroksidaze rena ili intramolekularnih kombinacija sa drugim proteinima, kao npr. zelenog fluorescentnog proteina (GFP) ili pojačanog GFP (EGFP) sa genom puromicin acetiltransferaze (Abbate et al., 2001), njihovim kombinacijama.
Eksperimentalni podaci na kojima se zasniva ovaj pronalazak su pokazali da se efikasna istovremena ekspresija polipeptida od interesa može postići iz IE2 i IE1 promotera, koja su oba prisutna na istom plazmidu. Stoga su u narednom preferentnom aspektu, i mCMV IE2 promoter i mCMV-IE1 promoter, ili njihovi funkcionalni fragmenti koji promovišu ekspresiju operativno povezani sa nekim polipeptidom.
Visoki nivoi ekspresije se mogu postići ukoliko su oba promotera prisutna u dvosmernoj arhitekturi. Stoga, mCMV-IE2 promoter, ili njegov funkcionalni fragment koji promoviše ekspresiju i neki promoter, posebno mCMV-IE1 promoter ili njegov funkcionalni fragment koji vrši promociju ekspresije, su dvosmerno raspoređeni.
Termin "dvosmerno raspoređeni", u smislu u kome je ovde korišćen , treba da znači da ovi promoteri pokreću transkripciju u suprotnom smerovima. Ovaj raspored plazmida DNK se takođe naziva "dvosmerna arhitektura" vektora.
Promoteri mCMV-IE1 ili mCMV-IE2 gena ili njihovi funkcionalni fragmenti koji promovišu ekspresiju ili bilo koji dodatni promoter koji se može koristiti u kombinaciji sa mCMV-IE2 promoterom ili u kombinaciji sa IE2 pojaćivačem, mogu dalje da uključuju neki signal inicijacije translacije.
U narednom preferentnom aspektu, promoter mCMV-IE2 gena ili njegov funkcionalni fragment koji vrši promociju ekspresije ili mCMV IE2 pojačivač je povezan sa drugim elementima koji regulišu ili utiču na transkripciju. Takvi elementi mogu da utiču na obradu, stabilnost ili efikasnost translacije RNK. Primeri pogodnih elemenata su odabrani između grupe koja se sastoji od 5'UTRs, introna, 3'UTRs (videti npr. Mazumder et al, 2003), mRNK 3' krajnje procesne sekvence (npr. mesta poliadenilacije) i IRES sekvence za policistronsku ekspresije (videti npr. Mountford and Smith, 1995).
Poželjno je koristi neki IRES element za ekspresiju policistronskih mRNKs, u kojima su kodirajuće sekvence razdvojene sa IRES. Prednost predstavlja to što se nekoliko polipeptida od interesa može eksprimirati iz iste mRNK pa stoga i iz istog promotera.
Prema još jednom preferentnom aspektu, promoter sam promoter mCMV-!E2 gena ili u kombinaciji sa promoterom mCMV IE1 gena ili bilo koji drugi prirodni ili veštački promoter ili IE2 pojačivač, može da bude povezan sa dodatnom sekvencom koja promoviše ekspresiju kap što su izolatori, granični elementi, LCRs (npr. oni koje su opisali Blackvvood and Kadonga (1998)) ili regioni vezivanja matrice/pomoćne strukture (npr. oni koje su opisali Li et al.,1999).
Stručnjak iz ove oblasti može da zna da vektor iz ovog pronalaska može takođe da sadrži dodatne pojačivače, kao što je npr. dobro poznati SV40 pojačivač ili hCMV pojačivač.
U skladu sa ovim pronalaskom, polipeptid operativno povezan za prvim promoterom, preferentno mCMV IE 2 promoterom, i polipeptid operativno povezan sa drugim promoterom, preferentno mCMV IE1 promoterom, može da bude isti. U tom slučaju, su prisutne dve kopije istog gena na istom vektoru ali pod kontrolom dva različita promotera. Stoga, može da se postigne brzina ekspresije koja je veća od ekspresije iz jedne kopije gena koji enkodira polipeptid od interesa.
Prema jednom alternativnom aspektu, polipeptid operativno povezan za prvi promoter, preferentno mCMV IE2 promoter i polipeptid operativno povezan za drugi promoter, preferentno mCMV IE1 promoter, se razlikuju. Ovaj pronalazak stoga obezbeđuje jedan efikasan vektor za ko-ekspresiju dva različita polipeptida, kao što su selekcioni markeri i proteini od interesa, ko-ekspresiju dve ili više pod-jedinice istog proteina ili čak različitih domena istog proteina, za koje je poželjno da imaju međusobno odvojenu ekspresiju ali u istoj ćeliji domaćinu.
Stručnjak iz ove oblasti će znati da se nekoliko vektora ekspresije u skladu sa ovim pronalaskom može ko-transfektovati u istu ćeliju i služiti za ekspresiju više proteina i/ili podjedinica prilično složenih multimernih proteina.
Poželjno je da polipeptid operativno povezan za prvi promoter, npr. mCMV IE2 promoter, bude prva podjedinica dimernog ili multimernog proteina a da polipeptid operativno povezan za drugi promoter, preferentno mCMV IE1 promoter, bude druga podjedinica nekog dimernog ili multimernog proteina. Ko-ekspresija ove dve pod-jedinice nekog dimernog proteina je preferentna prema ovom pronalasku. Ko-ekspresija dve pod-jedinice istog proteina ima posebnu prednost obzirom da ekspresija iz oba promotera može da dovede do produkcije sličnih količina pod-jedinice, ili prethodno određenih odnosa oba polipeptida, u zavisnosti od jačine korišćenih promotera. Ove pod-jedinice mogu potom da se uklope u istu ćeliju kako bi formirale zreli protein.
Preferentni primeri dimernih proteina koji su pogodni za ekspresiju uz pomoć vektora iz ovog pronalaska su alfa-lanac i beta-lanac peptidnih hormona kao što su humani FSH, humani LH, humani TSH i humani CG. Bilo koja od ove dve pod-jedinice može da bude povezana sa nekim promoterom u skladu sa ovim pronalaskom, preferentno sa mCMV IE2 promoterom. Stručnjak iz ove oblasti će imati u vidu da se hormoni drugih vrsta mogu podjednako koristiti prema ovom pronalasku, kao što su konjski, svinjski i goveđu hormon, na primer, u zavisnosti od planirane upotrebe rekombinantnog polipeptida.
Prema narednom aspektu ovog pronalaska, prva pod-jedinica je težak lanac a druga pod-jedinica je laki lanac nekog imunoglobulina, ili obrnuto. Jedan preferentni primer pogodnog imunoglobulina je IgG. Takvi imunoglobulini mogu npr. da budu humanizovana ili humana antitela za terapijsku upotrebu. Jedan visoko preferentni primer takvog jednog humanizovanog antitela je humanizovano anti-CD11 antitelo čije je komercijalno ime Raptiva®.
Mnogi polipeptidi od interesa mogu se eksprimirati uz pomoć vektor iz ovog pronalaska. Prema preferentnim konceptima, ovaj polipeptid se bira iz grupe koja se sastoji od horionskog gonadotropina, hormona koji stimuliše folikule, lutropin-horiogonadotropnog hormona, hormona koji stimuliše tiroideu, humanog hormona rasta, interferona (npr., interferon beta-1a, interferon beta-1b), i receptora interferona (npr., receptor interferona gama), TNF receptora p55 i p65, interleukina (npr., interieukin-2, interleukin-11), proteina koji vezuju interleukin (npr., protein koji vezuje interleukin-18), anti-CD11a antitela, i muteini, fragmenti, rastvorljivi oblici, funkcionalni derivati, i njihovi fuzioni proteini.
Drugi preferentni polipeptidi od interesa obuhvataju, npr., eritropoetin, faktor stimulacije granulocitnih kolonija, faktor stimulacije granulocitnih-makrofagnih kolonija, pituitarni peptidni hormoni, menopauzalni gonadotropin, faktori rasta nalik na insulin (npr., somatomedin-C), faktor rasta keratinocita, neurotropni faktor izveden iz loze giijalnih ćelija, trombomodulin, faktor rasta bazičnih fibroblasta, insulin, Faktor VIII, somatropin, koštani morfogenetski protein-2, faktor rasta izveden iz trombocita, hirudin, epoietin, rekombinantni LFA-3/lgG1 fuzioni protein, glucocerebrosidaza i muteini, fragmenti, rastvorljivi oblici, funkcionalni derivati i njihovi fuzioni proteini.
Drug aspekt trećeg aspekta ovog pronalaska se odnosi na ćeliju domaćina koja je transfektovana sa najmanje jednim vektorom koji je gore opisan. Stručnjak će uzeti u obzir da ćelija domaćin može podjednak oda bude ko-transfektovana sa dva ili više vektora u skladu sa ovim pronalaskom.
Mnoge ćelije domaćini su pogodne u skladu sa ovim pronalaskom, kao što su primarne ili uspostavljene ćelijske loze iz širokog spektra eukariota uključujući biljne i životinjske ćelije, ćelije sisara ili humane ćelije. Na primer, pogodne ćelije domaćini obuhvataju CHO ćelije, COS ćelije, CV1 ćelije, mišje L ćelije, HT1080 ćelije, BHK-21 ćelije, HEK293 ćelije, NIH-3T3 ćelije, LM ćelije, Yl ćelije, NSO i SP2/0 mišje hibridoma ćelije i slično, Namalwa ćelije, RPMI-8226 ćelije, Vero ćelije, VVI-38 ćelije, MRC-5 ćelije ili druge imortalizovane i/ili transformisane ćelije.
Preferentno, ćelija domaćin je CHO ćelija, a još preferentnije CHO-S ćelija, koju su opisali npr. Shotvvell et al. (1982, J Bioi. Chem. 257:2974-2980). CHO ćelije je po prvi put kultivisao Puck (J.Exp.Med. 108, 945, 1958) iz biopsije ovarijuma kineskog hrčka. Iz ovih originalnih ćelija pripremljen je jedan broj pod-loza sa različitim karakteristikama. Jedna od ovih loza CHO ćelija, CHO-K1, iziskuje prolin i ona je diploidna za gen hidrofolat reduktaze (DHFR). Druga loza izvedena iz ove ćelijske loze je DHFR deficijentna CHO ćelijska loza (CHO DUK B11) (PNAS 77, 1980, 4216-4220), koju karakteriše gubitak DHFR funkcije kao posledica mutacije u jednom DHFR genu i naknadnog gubitka drugog gena.
Sve ove ćelije mogu se transfektovati različitim vektorima iz ovog pronalaska bilo prolazno, polu-stabilno (npr., ukoliko je vektor is epizomalni) ili stabilno (npr. sa integracijom u genom). Stabilna transfekcija je preferentna kako bi se zasnovali klonovi koji kontinuirano eksprimiraju ovaj polipeptid od interesa.
IE2 promoter iz ovog pronalaska, ili IE2 pojačivač, mogu se koristiti kao regulatorni elementi u okviru tehnologije koja se naziva "Endogena genska aktivacija". Vektor iz ovog pronalaska može biti uveden u lokus genoma za koji se pretpostavlja da je aktiviran homolognom rekombinacijom, stoga postoji operativno vezivanje regulatorne sekvence (IE2 promoter i/ili pojačivač) sa genom od interesa, čiju je ekspresiju potrebno indukovani ili pojačati. Ova tehnologija je opisana u npr. u VVO 91/09955.
Prema trećem aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na proces proizvodnje polipeptida od interesa koji sadrži korak transfekcije ćelije domaćina sa nekim vektorom prema ovom pronalasku.
U zavisnosti od prirode polipeptida od interesa, proces prema ovom pronalasku dovodi do sekrecije proteina ili polipeptida koji se mogu ubrati iz kulture ćelija supernatant, ili do proteina ćelijske membrane ili intracelularnog proteina koje se mogu izolovati iz ovih ćelija poznatim metodama. Polipeptid proizveden u skladu sa ovim pronalaskom može d služi u bilo koje svrhe a preferentno to je jedan terapijski protein namenjen za primenu kod ljudi ili životinja.
U zavisnosti od planirane upotrebe, sama ova ćelija koja ima integrisani polipeptid može da bude produkt procesa prema ovom pronalasku. Takva ćelija se može npr. koristiti za terapiju zasnovanu na ćelijama.
U četvrtom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na proces proizvodnje polipeptida od interesa koji sadrže korak kultivacija ćelije domaćina u skladu sa ovim pronalaskom.
Prema jednom preferentnom aspektu, proces dalje obuhvata korak izolacije polipeptida od interesa iz ćelija domaćina ili kulture ćelija supernatanta. Ovaj korak je posebno pogodan i lako ga je sprovesti kod odabranih proteina koji se mogu jednostavno izolovati iz kulture ćelija supernatanta. Međutim, ovaj korak se podjednako primenjuje i kod izolacije polipeptida iz ćelijskih membrana ili intracelularnih odeljaka koji se mogu izolovati iz ćelija domaćina.
Ovaj proces se može koristiti kod prolaznih, stabilnih, epizomalnih ili virusnih sistema ekspresije. Kako je prikazano u donjim Primerima, vektor iz ovog pronalaska doveo je do posebno snažne ekspresije željenog proteina ukoliko je korišćen u sistemu stabilne transfekcije.
U petom aspektu, vektor prema ovom pronalasku je korišćen za ekspresiju nekog gena od interesa. Geni od interesa mogu biti npr. geni koji kodiraju bilo koji od gore pomenutih polipeptida od interesa. Vektor iz ovog pronalaska može takođe da se koristi za ekspresiju markerskih gena, reporterskih gena, gena koji se može amplifikovati ili slično.
Preferentno, vektor je korišćen za istovremenu ekspresiju dva ili više gena cDNKs od interesa. On takođe može da bude korišćen za istovremenu ekspresiju jednog gena od interesa i jednog markerskog gena ili reporterskog gena ili gena koji se može amplifikovati, ili slično.
U okviru ovog pronalaska, iznenađujuće je dokazano da je vektor iz ovog pronalaska, posebno vektor koji sadrži IE2 promoter, IE2 pojačivač, i IE1 promoter, dovodio do identifikacije klonova koji su imali visoku ekspresiju reporterskog gena i gena od interesa. Stoga, prema šestom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu vektora prema ovom pronalasku za selekciju klona koji eksprimiraju velike količine gena od interesa.
Prema sedmom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu vektora iz ovog pronalaska za proizvodnju medikamenta koji će se koristi u terapiji zasnovanoj na plazmidima ili DNK ili u genskoj terapiji.
Prema osmom aspektu, ćelija domaćin iz ovog pronalaska je korišćen za proizvodnju medikamenta za ćelijski zasnovanu terapiju. Ukoliko ćelijski zasnovana terapija bude imala za cilj tretman ljudi, preferentno je da ćelija domaćin bude humana ćelija ili ćelijska loza, a još preferentnije ćelija ili ćelijska loza izvedena od pacijenta koji će biti podvrgnut tretmanu.
Sada, pošto smo u celini opisali ovaj pronalazak, stručnjaci iz ove oblasti će znati da se isto može sprovoditi u okviru širokog spektra parametara, koncentracija i uslova bez odstupanja od duha i domena ovog pronalaska i bez nepotrebnog eksperimentisanja.
lako je ovaj pronalazak opisan u vezi sa njegovim specifičnim aspektima, jasno je da su moguće i dalje modifikacije. Ova primena ima za cilj da pokrije sve varijacije, upotrebe i adaptacije ovog pronalaska uz poštovanje opštih principa ovog pronalaska u uključujući takva odstupanja od ovog teksta koja spadaju u poznatu i uobičajenu praksu u ovog stručnoj oblasti iz koje je ovaj pronalazak i koja se može primenjivati na esencijalne karakteristike koje su ranije definisane u okviru zahteva koji se nalaze u prilogu.
Sve reference koje su ovde citirane, uključujući članke iz časopisa ili apstrakte, objavljene ili neobjavljene patente iz SAD ili strane patentne zahteve izdate u SAD ili strane patente ili bilo koje druge reference su u celosti ovde date, uključujući i sve podatke, tabele, slike i tekst koji je dat u vidu citiranih referenci u celinu su uključeni u navedenu literaturu.
Pozivanjem na korake poznatih metoda i konvencionalnih metoda, same poznate i konvencionalne metode u bilo kom aspektu ovog pronalaska se ni na koji način ne otkrivaju bilo kakvi aspekti ili opisi koji su dati relevantnoj stručnoj literaturi iz ove oblasti.
Prethodni opis specifičnih aspekata će u celosti otkriti opštu prirodu ovog pronalaska tako da drugi mogu, koristeći znanje iz ove stručne oblasti (uključujući i literaturu koja je ovde citirana), lako da modifikuju i/ili izvrše adaptacije za različite primene tih specifičnih aspekata bez nepotrebnog eksperimentisanja, bez odstupanja od opšteg koncepta. Stoga, takve adaptacije i modifikacije treba da budu u okviru značenja i opsega ekvivalentnih otkrivenih aspekata, zasnovanih na doktrini i smernicama koje su ovde date. Treba imati u vidu da su fraze i termini koji su ovde korišćeni, korišćeni radi opisa i da oni nisu ograničeni tako sa termine i fraze koji su korišćeni u ovom pronalasku stručnjak treba da tumači u kontekstu doktrine i smernica koje su ovde date u kombinaciji sa uobičajenim stručnim znanjem.
PRIMERI
PRIMER 1:Evaluacija vektora ekspresije u prolaznim transfekcijama
Materijal i metode:
Materijal
Ćelije: CHO-S, poreklo Gibco/Invitrogen (Kat. br. 11619).
Plazmidne DNK konstruisane kako je prikazano na SI. 2 i 3 su izolovane iz standardnih kultura koje su gajene preko noći sa Nucleobond PC 500 kitom (Macherev-Nagel Kat. br.740 574) prema protokolu proizvođača.
Transfekcija:
Lipofektamin( Invitrogen, Kat. br. 18324- 012)
Format: pločice sa 24 otvora.
Ćelije: CHO-S ćelije u fazi eksponencijalnog rasta su prenete 24 h pre transfekcije. Da bi se izbegla stacionarna faza pri maloj ćelijskoj gustini, ve ćelije su razblažene do 0.75 x 10<6>ćelija/ml. Ukupna količina ćelija koje će biti podvrgnute transfekciji je bila 1,5 x 10<5>, resuspendovano u 100 u.! podloge bez seruma SFM II (Invitrogen, Kat. br. 12052-114) po otvoru, na pločicama sa 24 otvora.
Transfekcione mešavine su bile sledeće:
A) Lipofektamin: 2 j^l
SFM II Medijum:48 jil
Ukupna zapremina je 50 uJ
B) DNK: 1 jig (50 ng vektor ekspresije + 950 ng plazmida nosača, pBluescript II KS (+), Stratagene, cat. 212205-01
SFM II Medijum: dopuniti do 50 uJ.
Rastvori A i B su pomešani i inkubirani 30 min na sobnoj temperaturi.
Ova mešavine je dodata u 100 nl SFM II Medijuma koji sadrži 1.5 x 10<5>ćelija. Ove ćelije su vraćene u inkubator i inkubirane 3 sata na 37°C, 5% C02. Potom je, 400 uJ SFM II Medijuma dodato da bi se Lipofektamin razblažio. Zatim su ćelije inkubirane tokom narednih 48 sati pre nego što su uzeti uzorci za analizu. Sve transfekcije su izvršene u triplikatu.
Merenje luciferaze.
Bright-Glo Luciferase sistem eseja koji proizvodi Promega, Kat. br. E2610 korišćen je za merenje luciferaze prema uputstvima proizvođača.
Ukratko, ćelijska suspenzija je homogenizovana ponovljenim pipetiranjem nekoliko puta a potom je količina od 50 uJ uzeta u stavljena na belu pločicu sa 96 otvora (Nunc, Kat. br. 236108). Potom je 50 jal rekonstituisanog Bright-Glo Reagens dodato i izvršena je inkubacija tokom 5 min na sobnoj temperaturi. Emisija svetlosti je merena na Centro LB 960 luminometru (Berthold Technologies) tokom 5 sekundi vremena akvizicije.
Rezultati
Konstrukti vektora ekspresije koji su korišćeni u sistemima prolazne ekspresije zasnovanim na CHO-S ćelijama prikazani su na SI. 2. U ovoj seriji eksperimenata, Luciferaza je korišćena kao reporterski gen za evaluaciju genske ekspresija. Vektori koji uopšte nemaju promotere (konstrukt A) ili imaju SV40 promoter/pojačivač (konstrukt B), koji nije visoko aktivan u CHO-S ćelijama, korišćeni su kao kontrole.
Rezultati iz eksperimenata sa prolaznom ekspresijom sa vektorima A to G prikazani su na SI. 4 u konstruktima C i F. Ekspresiju luciferaze pokreće IE1 promoter. Oba konstrukta su dovela do ekspresije luciferaze. Konstrukt C je takođe sadržao IE2 promoter koji je raspoređen dvosmerno u odnosu na IE1 promoter. Ovaj dvosmerni raspored je smanjio efikasnost ekspresije iz IE1 promotera, konstrukt C, u poređenju sa primenom samo IE1 promotera, konstrukt F. Jedna kratka verzija 0.68 kb IE1 promotera (konstrukt G) je bila manje efikasna do duže verzije (konstrukt F).
Bez obzira na prisustvo ili odsustvo drugog promotera u istom konstruktu, IE2 promoter je efikasno pokretao ekspresiju luciferaze (konstrukti D i E) i stoga se on može koristiti kao promoterski element u vektorima ekspresije za ekspresiju polipeptida od interesa.
Nasuprot IE1 promoteru, IE2 promoter je bio manje efikasan ukoliko je korišćen sam (konstrukt E) nego ukoliko je korišćen u dvosmernoj strukturi (konstrukt D). Stoga je on posebno stabilan za upotrebu kod dvosmernih vektora ekspresije.
PRIMER 2:Evaluacija vektora ekspresije kod stabilne transfekcije
Materijal i metode
Metode:
Ćelije: CHO-S, iz Gibco/ Invitrogena (Kat. br. 11619).
Plazmidne DNK (prema SI. 2) su izolovane iz standardnih kultura koje su gajene preko noći sa Nucleobond PC 500 kitom (Macherey-Nagel Kat. br.740 574) prema protokolu koji je dao proizvođač.
Transfekcija:
Lipofektamin( Invitrogen, Kat. br. 18324- 012)
Za stabilne transfekcije su korišćene T75 boce. CHO-S u fazi eksponencijalnog rasta je prenet 24 h pre transfekcije. Da bi se izbegla stacionarna faza pri maloj ćelijskoj gustini, izvršena je dilucija do 0.75 x 10<6>ćelija/ml. Ukupna količina ćelija koje će biti transfektovane je bila 5 x 10<6>, resuspenovana u 7 ml SFM II medijuma (Invitrogen Kat. br. 12052-114) u T75 boci.
Transfekcione mešavine su bile sledeće:
A) Lipofektamin: 52,1yi\
SFM II Medijum:517,9^l
Ukupna zapremina je 570 nl.
B) DNK: 10 u.g linearizovanog plazmida DNK, (9u.g Luc vektora ekspresije + 1u.g plazmida za selekciju: SV40 promoter koji pokreće gen rezistencije na Puromicin. Svi plazmidi su linearizovanai sa Pvul)
SFM II Medijum je dopunjen do 570 uJ.
A i B su pomešani i inkubirani 30 min na sobnoj temperaturi. 7 ml koji sadrže 5 x 10<6>ćelija je dodato a ćelije su vraćene u inkubator tokom 3 sata na 37°C i 5% C02. Tada je kultura centrifugirana na 800g tokom 3 minuta, a peleti ćelija su resuspendovani u 5 ml EX-CELL 325 (JRH, Kat. br. 14335-1000M), kome je dodato 1X HT i 4,5 mM L-Glutamina (100X HT, Invitrogen, Cat.no 11067-030, L-Glutamin 200 mM, Sigma, G-7513). 5 ml EX-CELL 325 je dodato direktno u bocu T75 kako bi se resuspendovale adherentne ćelije i potom dodato u suspenziju. U 10 ml EX-CELL 325 medijuma je bilo ukupno 5 x 106 ćelija.
Postupak selekcije:
Selekcija je urađena 48 sati posle transfekcije zamenom medijuma i razblaženjem do 1 x 10<6>ćelije / ml u EX-CELL 325 koji sadrži 10 p.g/ ml puromicina (Sigma, P-8833). Svaka dva dana, ćelije su brojane, centrifugirane i resuspendovane u svežem selektivnom medijumu na 1 x 10<6>živih ćelije / ml. Vijabilnost je proveravana u ovim tačkama. Posle 21 do 35 dana je selekcija završena a vijabilnost ćelija je bila veća od 80 %.
Merenje luciferaze:
Dva sata pre uzorkovanja kulture, ćelije su brojane a kultura razblažena do 0.2 x 106 živih ćelije/ml.
Bright-Glo sistem za određivanje luciferaze koji proizvodi Promega, Kat. br. E2610 je sproveden prema uputstvima proizvođača.
Ukratko, ćelije su suspendovane višestrukim pipetiranjem, a količina od 50 nl je izvađena u stavljene na belu pločicu sa 96 otvora. (Nunc, Kat. br. 236108). 50^l rekonstituisanog Bright-Glo Reagens je direktno dodato i inkubirano 5 min na sobnoj temperaturi. Emisija svetlosti je merena na Centro LB 960 luminometru (Berthold Technologies) tokom 5 sekundi vremena akvizicije.
Aktivnost luciferaze je tada normalizovana normalnim brojem živih ćelija u ispitivanom uzorku, tj. obično 1 x 104 ćelija.
Rezultati
Konstrukti C, D, E i F (videti SI. 2) su testirani u sistemu stabline ekspresije. Rezultati su prikazani na SI. 5. Konstrukt E, koji sadrži samo IE2 promoter, doveo je do najsnažnije ekspresija luciferaze u ovom sistemu. Ukoliko je bio prisutan zajedno sa IE1 promoterom u dvosmernom rasporedu (konstrukt D), IE2 promoter je i dalje dovodio do ekspresije luciferaze koja je bila bolja od ekspresije koju pokreće IE1 promoter, bilo sam (konstrukt F) ili u dvosmernom rasporedu sa IE2 promoterom (konstrukt C).
PRIMER 3:Ko-ekspresija dva polipeptida od interesa iz dvosmernih vektora
ekspresije
Materijal i metode:
Transfekcije su izvršene kako je opisano u Primerima 1 i 2. Ukratko, CHO-S ćelije (u suspenziji, Gibco SFMII) su prolazno transfektovane sa 900, 500, 300 i 100 ng vektora DNK (konstrukt C-2, videti SI. 3) na pločice sa 24 otvora (svako stanje u triplikatu). Dva dana posle transfekcije, izvršeno je određivanje luciferaze sa ekstraktima ćelija iz triplikata koji su eksprimirani putem (relativno lake jedinice). Supernatanti iz istih otvora su uzeti pre ćelijske lize, objedinjene i podvrgnuti eseju IL18BP uz pomoć Elisa (videti dole).
ELISA IL- 18BP
Količina rekombinantnog humanog IL-18BP (rhlL-18BP) u supernatantu izmerena je standardnom ELISA metodom uz upotrebu protein G-purifikovanog monoklonalnog anti-rh-IL-18BP antitela koje je spareno sa biotinom. Extravidine-HRP (Sigma) je korišćen kao agens za detekciju.
SI 9 pokazuje količine IL-18 BP u ng/ml i luciferaze u RLU eksprimiranih uz pomoć 48 klonova 90 dana posle stabilne transfekcije sa dvosmernim mCMV promoterskim konstruktom (videti SI.3). Granica detekcije za luciferazu je bila oko 500 RLU i 2.5 ng/ml za IL-18BP.
Rezultati
U ovoj seriji eksperimenata, određivana je istovremena ekspresija dva gena iz konstrukta C-2, koji je prikazan na SI. 3. Markerski gen (Luciferaza) je eksprimiran iz IE1 promotera a gen od interesa, IL-18BP gen je eksprimiran uz IE2 promotera. IL-18BP je sekretovani protein. Ovi promoteri su raspoređeni u dvosmernu strukturu, tj. Oba promotera su istovremeno pokretala ekspresiju u suprotnim pravcima.
Rezultati ove studije su prikazani na SI. 6 to 9. SI. 6 pokazuje obim ekspresije luciferaze koja je eksprimirane putem RLU i što je mereno u sistemu prolazne ekspresije. U istom sistemu prolazne ekspresije, IL-18BP je meren uz pomoć ELISA u supernatantima ćelijske kulture. SI. 7 pokazuje rezultat u ng/ml selektovanog IL-18BP. SI. 8 pokazuje odnos IL-18BP i luciferaze u svakom experimentu prolazne ekspresije
Kako je prikazano na SI. 6 to 8, različite količine plazmidne DNK su korišćene za transfekciju. Sve korišćene najbolji rezultati su dobijeni sa najmanjim količinama transfektovane DNK, 100 ng of vektora DNK, što je konzistentno sa IL-18BP i luciferazom.
Takođe, ovaj stabilni kvocijent (SI. 8) ukazuje na konstantni odnos između ekspresivnog potencijala oba promotera.
Da zaključimo, ovi podatci dokazuju da se oba gena istovremeno eksprimiraju iz ove dve promoterske jedinice, što dalje pokazuje da su obe ekspresivne jedinice potpuno funkcionalne dvosmernoj promoterski strukturi.
Potom je konstrukt C-2 stabilno transfektovan, a ekspresija Luciferaze NL18BP je određivana u 48 nezavisnih klonova.
Stabilne transfekcije su izvršene prema protoklonu opisanom u primeru 2, izuzev što je medijum koji je korišćen posle transfekcije bio ProCho5 (Cambrex, cat. 127660.).
Za kloniranje jedne ćelije pul je raspoređen na pločici sa 384 udubljenja (Nunc, cat. 164688) pri gustini od 0.5 ćelija po udubljenju (70 uJ/udubljenje) uz korišćenje Multidrop dispensera (ThermoLabsvstems, cat. 5840150). 8 dana kasnije, 192 klona je nasumično uzeto i analizirano po pitanju ekspresije luciferaze. 48 klonova sa najvišom ekspresijom Luc je odabrano i podvrgnuto ponovnom ispitivanju radi određivanja ekspresije Luciferaze (luminometrija) i IL18 BP (manuelnom ELISA metodom, videti gore).
SI. 9 pokazuje rezultati ovog eksperimenta. Svih 48 klonova je eksprimiralo luciferazu i IL-18BP, iako u različitim količinama.
PRIMER 4:Definisanje minimalne sekvence pojačivača
Materijal i metode
Plazmidne DNK
Grupa vektora koji sadrže skraćene mCMV promotere je sačinjena iz pomoć PCR (Lančana reakcija polimeraze) i sparivanjem specifičnih prajmera duž mCMVp (Tabela 1).
PCR uslovi subili sledeći:
Mešavina:
10 ng DNK plazmida (prevmCMV-Luciferaza (AXhol), konstrukt E sa SI. 2)
50 pmol sens i antisens prajmera (videti tabelu 1 dole, zajednički antisens za sve)
po 200fiM od dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)
1X Dinazimski pufer koji sadrži 1.5 mM MgCI2)
4 jedinice Dinazim II DNK polimeraze (Finnzvmes, cat. F-501S)
Parametri ciklusa:
95°C, 5'
2 ciklusa:
95°C, 30"
52°C, 30"
72°C, 1'30
2 ciklusa:
95°C, 30"
54°C, 30"
72°C, 1'30
10 ciklusa:
95°C, 30"
58°C, 30"
72°C, 1'30
15 ciklusa:
95°C, 30" 60°C, 30" 72°C, 1'30 po5 pJ PCR reakcije je stavljeno na 1% agarozni gel. Trake odgovarajuće dužine su isečene i purifikovane uz pomoć Ojagen Minilute Gel Extraction kita, cat. 28606, pre kloniranja.
Položaji koji odgovaraju broju baznih parova zadržanih iz mCMVp, uzimajući +1 iz IE2 kao referencu, su: -1076, -783, -587, -387 i -189
Strategija kloniranja bilo kog promoterskog fragmenta bila je ista, PCR testovi su urađeni na celoj dužini mCMVp (prevmCMV-Luciferaza (AXhol), tj. konstrukt E sa SI. 2). Ovi fragmenti su potom digestovani uz pomoć Xhol/ EcoRI, dva mesta restrikcije su dodata na krajnjem delu sekvence specifičnog prajmera. Promoterska sekvenca je potom uklonjena iz konstrukta E njenom digestijom uz pomoć Xhol/EcoRI, a kraće verzije su ubačene u potpuno isti lokus.
Evaluacija konstrukta je urađena uz pomoć prolazne transfekcije lipofektamina posle čega je sledilo merenje luciferaze. Dalji materijal i metode bili su kao one opisane u Primeru 1. SFM medijum korišćen u ovom primeru bio je ProCho5, Cambrex, B-12766Q.
Rezultati
Vektori H do N (SI. 10.a) koji sadrže mCMV IE2 promoter koji pokreće gen luciferaze konstruisani su kako bi se odredila minimalna sekvenca potreba za visoke nivoe ekspresije iz IE2 promotera.
Konstrukti sedam vektora ekspresije H do N korišćeni su u sistemu prolazne ekspresije zasnovanom na CHO-S ćelija. Rezultati su prikazani na Slici 10.b). Konstrukt L je najkraći konstrukt koji zadržava snažnu ekspresiju Luciferaze u ovom sistemu. Konstrukt M je ipak doveo do ekspresije luciferaze na nivou koji je iznosio oko 30% nivoa ekspresije koji je dostignut sa konstruktima H do L. Ekspresija luciferaze dobijena sa konstruktom N bila je veoma niska pa ipak značajna, ukazivala je na bazalnu promotersku aktivnost koja se očekivala za produktivnu transkripciju početnog mesta koje sadrži TATA kućicu i inicijator.
Da zaključimo, ovi eksperimenti određuju jedan novi pojačivač u uzlaznom regionu mCMV IE2, koji se ovde naziva mCMV IE2 pojačivač. U gornjim eksperimentima IE2 pojačivač povećava transkripciju iz minimalnog IE2 promotera koji je zadržan u konstruktu N. Minimalna sekvenca potrebna za visoku ekspresiju reporterskog gena se kreće od -587 to -189 bp fragmenta (konstrukt L), a konstrukt koji sadrži -387 do -189 bp fragment je i dalje pojačavao ekspresiju luciferaze (konstrukt M).
PRIMER 5:Novi IE2 pojačivač aktivira minimalni promoter SV40
Dalji eksperimenti su sprovedeni kako bi se procenilo da li novi IE2 pojačivač ispunjava sve kriterijume za aktivnost pojačivača, tj za pojačanje ekspresije nezavisno od (1) lokacije, (2) orijentacije i (3) identiteta promotera. Da bi se to uradilo konstruisane su konstante O do V kako bi se procenilo da li novi IE2 pojačivač može da pojača ekspresiju nekog heterolognog promotera, SV40 promotera, nezavisno od orijentacije, razdaljine i položaja (5' ili 3'), u odnosu na promoter SV40. Konstrukti W, X i Y su bili kontrole, W je sadržao SV40 pojačivač, X nije sadržao nikakav pojačivač već promoter SV40 dok Y nije sadržao ni pojačivač ni promoter.
Konstrukcija vektora
Vektor koji se naziva pSV-Luc (konstrukt X sa Figure 11 (a)) koji sadrži samo SV40 promoter je konstruisan iz pGL3-Ctrl (Promega, E 1741), koji sadrži SV40 promoter koji pokreće gen luciferaze i SV40 pojačivač koji je lokalizovan na 3' ovog gena (konstrukt W)i pGL3-Bazični (Promega, E1751), koji nema ni promoter ni pojačivač
(konstrukt Y).
Ukratko, pGL3-ctrl je isečen sa Notl/Xbal kako bi se izolovao fragment koji sadrži SV40 promoter, i zatim gen luciferaze. Na sličan način pGL3-bazični je isečen sa Noti/ Xbal a osnovna struktura vektora koja sadrži poli A region je izolovana bez 3' pojačivača. Kombinovanjem ova dva fragmenta dobijena je pSV-Luc (konstrukt X).
Region 5' SV40 promotera ovog vektora he podvrgnut inžinjeringu kloniranjem IE2 sekvence pojačivača (-587 do -189) u oba pravca, i oni su nazvani p5'enh-SV-Luc (konstrukt O), i p5' obrnuti enh-SV.Luc (konstrukt Q). Takođe, IE2 sekvenca pojačivača (-587 do -189) je takođe klonirana u 3' region gena luciferaze, u oba pravca. Dobijeni vektori su nazvani p3'enh-SV-Luc+ (konstrukt S), i p3' obrnuti enh-SV.Luc. (konstrukt U), Isti postupak je sproveden sa kratkom verzijom IE2 pojačivača, tj. Onom koja ima -387 do-189 umesto-587 do -189, i ti konstrukti su nazvani P, R, T i V, videti SI. 11.a.
Konstrukt O, P. Vektor primalac je bio pSV-Luc+ (konstrukt X of Fig11.a) koji je otvoren digestijom sa Nhel/Smal. Pojačivač pune dužine je izolovan digestijom sa Ndel, posle čega je sledila reakcija tupog kraja uz pomoć Klenow polimeraze, purifikacije i digestije sa Nhel. Ista strategija je primenjena pri konstrukciji kratkog konstrukta pojačivača.
Konstrukt Q, R: Vektor recipijent je bio pSV-Luc+ (konstrukt X sa S111.a) otvoren digestijom sa Xhol/Smal. Pojačivač pune dužine je izolovan digestijom sa Ndel, posle toga je sledila reakcija tupog kraja uz pomoć klenow polimeraze, purifikacija i digestija saXhol. Ista strategija je primenjena za konstrukciju kratkog konstrukta pojačivača.
Konstrukti S, T, U i V: Vektor recipijent je pSV-Luc+ (konstrukt X sa SI. 11.a) otvoren digestijom sa BamHI, posle čega sledi tupi završetak uz pomoć Klenow polimeraze. Pojačivač pune dužine je izolovan digestijom sa Ndel/Nhel, posle toga je sledila reakcija tupog kraja uz pomoć Klenovv polimeraze. Kloniranje omogućilo oba prava što je utvrđeno restrikcionom analizom. Obe orijentacije su sačuvane za analizu Ista strategija je primenjena za konstrukciju kratkog konstrukta pojačivača.
Konstrukti pGL3-Bazični (konstrukt Y) služili su kao kontrole bez ekspresije. pGL3-ctrl (konstrukt W) slučio je kao SV40 vektor promoter/pojačivač. pSV-Luc je bio kontrola i imao je samo SV40 promoter (konstrukt X).
Transfekcije i merenje luciferaza je sprovedeno kao i u prethodnim primerima.
Rezultati
Rezultati dobijeni sa kontruktima O do Y sa SI. 11.a su prikazani na SI. 11.b. Konstrukt SV40 promotera bez pojačivača uzet je kao bazalni za dodatu aktivnost pojačivača, a aktivnost merena sa konstruktom X je definisana kao 1. Svi konstrukti koji su imali bilo duge bilo kratke IE2 pojačivače doveli su do ekspresije reporterskog gena. Dugačka verzija je dosledno dovodila do dugih ekspresija reporterskog gena iz SV40 promotera, koja je bila znatno viša od nivoa ekspresije koji je postignut sa kombinacijom SV40 promotera i SV40 pojačivača (konstrukt O). Stoga, ovaj eksperiment jasno definiše sekvencu -587 do -189 i sekvencu -387 do -189 kao bona fide pojačivače, koji aktiviraju heterologni promoter nezavisno od položaja i orijentacije.
PRIMER 6:poređenje dugačke verzije IE2 pojačivača (-587 to -189) i hCMV
pojačivača
Eksperimentalni protokoli za transfekciju sa Lipofektaminom, praćeni merenjem luciferaze opisani su u Primeru 1.
Rezultati
U ovom eksperimentu, konstrukti O i Q, koji imaju dugačku verziju novog IE2 pojačivača u obe orijentacije na 5' SV40 promotera, su korišćeni za poređenje sa poznatim snažnim pojaćivačem, hCMV (humani citomegalovirus) pojaćivačem. U tom smislu, mCMV IE2 sekvenca je replicirana hCMV sekvencom pojačivača (SEQ 1D NO: 2) in konstruktku O, što je dovelo do konstrukta 0-2. Isto je urađeno i u in konstruktu Q, što je dalo konstrukt Q-2.
hCMV sekvenca pojačivača koja ima Mlul mesta (Mlul=acgcgt) na bočnom delu, koja je korišćena za kloniranje bila je sledeća:
SV-Luc+ je digestovan sa Mlul i tretiran sa goveđom intestinalnom alkalnom fosfatazom kako bi se sprečila samo-ligacija. Sekvenca hCMV promotera je klonirana na Mlul mestu. Klonovi obe orijentacije su sačuvani radi poređenja sa ekvivalentnim IE2 konstruktima.
Rezultati ekspresije luciferaze prikazani su prikazani na SI. 12. Nivo ekspresije luciferaze dobijen sa novim IE2 pojaćivačem (dugačka verzija) bio je najmanje da puta viši od nivoa ekspresije luciferaze koji je dobijen sa klasičnim hCMV pojaćivačem.
PRIMER 7:performanse IE2 pojačivača u dvosmernom konstruktu
Dva naredna konstrukta su kreirana kako bi se testirao novi pojačivač u dvosmernoj strukturi, i oni su nazvani konstrukti #26 i #140 kako je prikazano na SI. 13.
#26: Osnova ovog vektora je bila mCMV-Luc+(konstrukt C, SI 3). On je digestovan sa SacIl/EcoRI. IL-18BP kaseta je uzeta iz phCMV-IL18BP2. Sečenjem ovog vektora sa SacII/EcoRI, izolovan je fragment koji sadrži Intron A posle čega je usledio IL-18BP otvoreni ram čitanja i SV40poliA region.
#140. Osnova ovog vektora je bio konstrukt L of SI 10.a. On je digestovan sa Xhol/Nhel, otvaranjem vektora 5' IE2 pojačivača. Vektor koji eksprimira IL18BP iz IE1 promotera, nazvan pBS.I IL18BP(IE1).I, je korišćen kao donator za inserciju. Digestijom ovog vektora sa Xhol/Spel, izolovan je jedan fragment koji sadrži IE1 promoter iz Xhol (videti SI. 1) a zatim lntronA-IL18BP-SV40poliA kaseta, Dobijeni konstrukt nije imao sekvencu između -589 do Xhol originalne sekvence mCMV promotera.
Stabilne transfekcije i merenje luciferaze su sprovedeni kako je opisano u primeru 2, a IL18BP ELISA kako je opisano u primeru 3.
Međutim, konstrukt #140 ne oslikava tačno konstrukt #26 zato što su IE1 i IE2 promoteri u obrnutoj orijentaciji. Stoga, ekspresiju luciferaze je pokretao IE1 promoter u konstruktu #26 a IE2 promoter u konstruktu #140, a IL18BP ekspresiju je pokretao IE2 promoter u konstruktu #26 i IE1 promoter u konstruktu #140.
Rezultati dobijeni sa oba konstrukta su dole prikazani, obzirom da su oni značajni za istovremeni efekat novog IE2 pojačivača na dva različita promotera u dvosmernom vektoru ekspresije (konstrukt #140).
SI. 14 prikazuje rezultati iz pulova stabilno transfektovan sa konstruktom #26 i #140 po pitanju ekspresije luciferaze i IL-18BP. Konstrukt #140 doveo je do više ekspresije oba markerska gena (Luciferase) i gena od interesa (IL-18BP).
Da bi se procenila stabilnost ekspresije Luciferaze i IL-18BP, pulovi su ili čuvani pod selektivnim uslovima tj. pod puromicinskim tretmanom ili su čuvani bez selektivnog pritiska (bez puromicina) tokom tri nedelje. Rezultati su prikazani na SI. 15 do 17. Nivoi ekspresije reporterskog gena luciferaze i the IL-18BP nisu se značajno promenili tokom vremena, videti SI. 16 i 17.
Stoga, je dokazano da oba konstrukta #26 i #140 ispoljavaju iste nivoe ekspresije tokom vremena, u prisustvu ili odsustvu selekcionog pritiska. To znači da su konstrukti koji imaju ovaj novi IE2 pojačivač pogodni za stabilnu i istovremenu ekspresiju dva gena.
Obzirom da su gornji rezultati dobijeni u pulovima, klonovi su izvedeni ograničavajućom dilucijom sa 0.5 ćelija po otvoru iz oba pula.
Klonovi su kultivisani pod puromicinskom selekcijom, kako bi se procenili nivoi klonalne ekspresije. Tada su izolovani klonovi podeljeni u prisustvu ili odsustvu puromicina da bi se na kraju pratila njihova stabilnost. Rezultati prikazani na SI. 18 i 19 su dobijeni pre nego što su klonovi podeljeni u +/- puromicinskim uslovima. Rezultati o posle 2 nedelje nakon uklanjanja puromicina nisu pokazali značajnu razliku kod oba konstrukta, što ukazuje na stabilnost. Ova studija će se nastaviti tokom dodatnih 10-12 nedelja.
Da bi se procenila ekspresija oba gena korišćen je format visoke propusne moći, naime pločice sa 96 otvora: Dan 1: Dilucija !4 ćelije, 100 u.l ProCho5 podloge za kulturu (bez seruma) + 100 u.l svežeg ProCho5 koji sadrži 5 % serum goveđeg fetusa. Sa 2.5 % finalnom koncentracijom FBS, ćelije su mogle da se spajaju. Nedeljni prolazak pločice za održavanje je vršen sa faktorom dilucije 1/20 sve na ProCho5 podlozi.
Dan 2: Podloga je odbačena, isprana jednom sa 200 n\ 1x PBS (Invitrogen, 10010-015), i dodato je 75 u.l svežeg ProCho5 koji sadrži 5% FBS i potom je inkubiran tokom 24 h pulsa ekspresije.
Dan 3: dobijeno je 50 jal supernatanta i dodato 200 uJ Elisa pufera (1x PBS, 0.1 % w/v BSA, 0.2 % v/v Tvveen 20). 100 jal je analizirano uz pomoć ELISA radi utvrđivanja IL-18BP.
Otvori su isprani sa 200 uJ 1x PBS (odbačeno) i 100 \ i\ Glo Lysis pufera (Promega, E266a) je dodato. Ovi otvori su inkubirani 30 min na sobnoj temperaturi kako bi se obezbedila liza ćelija. Merenje luciferaze je izvršeno uz pomoć 30 \ x\ liziranih ćelija koje su prenete na belu pločicu sa 96 otvora + 30\ i\rekonstituisani Bright-Glo reagens. Emisija svetlosti je merena na Centro LB960 luminometru tokom vremena akvizicije od 5 sekundi.
Analiza klonova dobijenih iz stabilnih transfekcija sa konstruktom #26 je prikazana na SI. 18 a onih koji su dobijeni iz stabilnih transfekcija sa konstruktom #140 na SI. 19.
Klonovi prikazani na SI. 18 i 19 su rangirani po njihovim vrednostima Luciferaze od više ka nižoj. IL18BP ekspresija je označena kao OD vrednost. Obzirom da je Elisa urađena u visoko propusnom formatu, prava kvantifikacija nivoa IL-18BP nije se mogla dobiti. Međutim, kontrole sa 2500 ng/ml i 250 ng/ml kao i šlepa proba uključene su za praćenje varijacija od jedne do druge pločice.
SI. 20 pokazuje ekspresiju luciferaze na pločicama u obrnutoj ChemiDoc perspektivi. Za ovu perspektivu je korišćena CCD kamera (Biorad), što je omogućilo akviziciju signala koji potiču od hemiluminescencije (kao na SI. 20). Softver koji se naziva Quantity One 4.2.3 omogućava upravljanje slikom kao što je inverzija signala, koja je ovde korišćena.
Kako se može videti iz rezultata prikazanih na SI. 18 do 20, konstrukt #140 doveo je do velikog broja ne-ekspresivnih klonova. Međutim, iznenađujuće je da je nekolicina pozitivnih klonova eksprimirala oba gena ekstremno snažno.
Stoga, konstrukt #140 omogućava praćenje veoma snažnih ekspresora u veoma ranoj fazi kloniranja, pa se tako izbegava obavezno testiranje i praćenje velikog broja klonova da bi se identifikovala nekolicina klonova koji vrše visoku ekspresiju oba gena od interesa.
REFERENCES
1. Abbate et al., Biotechniques 2001 Aug;31 (2):336-40
2. Assaraf et al., J Biol Chem 1992 Mar 25;267(9):5776-84
3. Blackvvood EM, Kadonaga JT. Science 1998 Jul 3;281(5373):61-3
4. De Wet et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci USA 82, 7870
5. Dorsch-Haesler, K. et al. (1985). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8325-8329
6. Goeddel Methods Enzvmol., Vol. 185, San Diego
7. Li Q, Harju S, Peterson KR. Trends Genet 1999 Oct;15(10):403-8
8. Manning WC and Mocarski, ES, Virologv 167, 477-484 (1988).
9. Mazumder B, Seshadri V, Fox PL. Trends Biochem Sci 2003 Feb;28(2):91-8
10. Messerle, M. et al. (1991). J. Virol. 65 :1638-1643
11. Kim, S-Y. et al. (2002). J. Biotech. 93:183-187.
12. Mountford PS, Smith AG. Trends Genet 1995 May;11(5): 179-84.
13. Sandford and Bums, Virology 222, 310-317 (1996)
14. Schumperii et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1982 Jan;79(2):257-61
15. Seliger and McElroy (1960) Arch. Biochem. Biophys. 88, 136
16. Shotvvell et al., 1982, J. B. C. 257(6), 2974-80
17. Wood et al., (1991) Biochme. Biophvs. Res. Comm. 124, 592. 18. US patent 4'963'481. 19. US patent 4,968,615
20. Zhu et al., J Ćelija Biochem 2001 Mar 26;81(2):205-19

Claims (40)

1. Vektor ekspresije koji obuhvata promotor mCMV-IE2 koji se sastoji od fragmenta SEQ ID NO.l za promociju funkcionalne ekspresije, naznačeno time da: (i) vektor ekspresije ne sadrži nijedan kompletan gen mCMV, i (ii) pomenuti promotor mCMV-IE2 je operabilno povezan sa DNK sekvencom koja kodira polipeptid.
2. Vektor iz zahteva 1, naznačen time da pomenuti promotor mCMV-lE2 obuhvata jezgreni IE2 promotor koji zahvata nukleotid 1 do 39 SEQ ID NO.l.
3. Vektor iz zahteva 2, naznačen time da pomenuti promotor mCMV-IE2 dalje obuhvata sekvencu od 100 do 200 nukleotida ushodno od pomenutog jezgrenog promotora IE2.
4. Vektor u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, koji dodatno obuhvata mCMV-IE2 pojačivač koji se sastoji od fragmenta SEQ ID NO.l za promociju funkcionalne ekspresije.
5. Vektor iz zahteva 4, naznačen time da pomenuti mCMV-IE2 obuhvata nukleotide -387 do -189 iz mCMV IE2 ushodnog regiona, gde su brojčane oznake nukleotida u odnosu na +1 gena IE2.
6. Vektor u skladu sa zahtevom 5, naznačen time da pomenuti mCMV-IE2 obuhvata nukleotide -587 do -189 mCMV IE2 ushodnog regiona, gde su brojčane oznake nukleotida u odnosu na +1 gena IE2.
7. Vektor u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, koji dodatno obuhvata promotor koji je različit od mCMV-IE2 promotora.
8. Vektor u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, koji obuhvata prvi i drugi promotor virusnog, ćelijskog ili veštačkog porekla.
9. Vektor iz zahteva 8, naznačen time da prvi promotor bude promotor mCMV-IE2, a drugi promotor bude promotor mCMV-IEl.
10. Vektor u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, koji obuhvata SEQ ID NO.l sekvencu DNK.
11. Vektor u skladu sa ma kojim od zahteva od 7 do 10, naznačen time da su prvi i drugi promoteri operabilno povezani sa DNK sekvencom koja kodira najmanje jedan polipeptid.
12. Vektor u skladu sa zahtevom 11, naznačen time da DNK sekvence kodiraju najmanje jedan protein od interesa.
13. Vektor u skladu sa zahtevom 11, naznačen time da DNK sekvence kodiraju najmanje jedan markerski protein.
14. Vektor u skladu sa zahtevom 11, naznačen time da DNK sekvence kodiraju -najmanje jedan reporterski protein.
15. Vektor u skladu sa ma kojim od zahteva od 8 do 14, naznačen time da su prvi promotor i drugi promotor bi-direkciono postavljeni.
16. Vektor u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, koji dodatno obuhvata jedan ili više regulatornih elemenata koji su odabrani između 5'UTRs, introna, 3'UTRs, mRNK 3' krajnje procesne sekvence, mesta poliadenilacije, i internih ribozomskih ulaznih sekvenci (IRES).
17.Vektor u skladu sa zahtevom 16, naznačen time da regulatorni element bude jedan IRES, i dodatno obuhvata jednu DNK sekvencu koja kodira najmanje jednu policistronsku mRNK.
18. Vektor u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, koji dodatno obuhvata jedan ili više elemenata DNK koji su odabrani od insulatora, graničnih elemenata, regiona za kontrolu lokusa (LCR), regiona za vezivanje za matriks (MARs), i elemenata za rekombinaciju i izmenu kasete.
19. Vektor u skladu sa ma kojim od zahteva od 11 do 18, naznačen time da DNK sekvenca koja kodira polipeptid operabilno povezana sa prvim promotorom i DNK sekvenca koja kodira polipeptid operabilno povezana za drugi promotor kodiraju isti polipeptid.
20. Vektor u skladu sa ma kojim od zahteva od 11 do 18, naznačen time da DNK sekvenca koja kodira polipeptid operabilno povezana sa prvim promotorom i DNK sekvenca koja kodira polipeptid operabilno povezana za drugi promotor kodiraju različite polipeptide.
21. Vektor u skladu sa zahtevom 20, naznačen time da DNK sekvenca koja kodira polipeptid operabilno povezana sa prvim promotorom kodira prvu podjedinicu dimernog ili multimernog proteina, a DNK sekvenca koja kodira polipeptid operabilno povezana za drugi promotor kodira drugu podjedinicu dimernog ili multimernog proteina.
22. Vektor u skladu sa zahtevom 21, naznačen time da jedna podjedinica bude alfa lanac i druga podjedinica beta lanac hormona izabranog između humanog FSH, humanog LH, humanog TSH, i humanog CG.
23. Vektor u skladu sa zahtevom 20, naznačen time da jedna podjedinica bude teški lanac, a druga podjedinica laki lanac imunoglobulina.
24. Vektor u skladu sa ma kojim od zahteva od 12 do 23, naznačen time da protein od interesa bude izabran između FSH, LH, CG, TSH, hormona rasta, interferona, TNF vezujućeg proteina I, TNF vezujućeg proteina II, Raptiva®, IL-18BP, ili muteina, fragmenata, funkcionalnih derivata, i njihovih fuzionih proteina.
25. Vektor u skladu sa ma kojim od zahteva od 13 do 23, naznačen time da markerski protein bude izabran između adenozin deaminaze (ADA), aminoglikozid fosfotransferaze (neo), dlhidrofolat reduktaze (DHFR), higromicin-B-fosfotransferaze (HPH), timidin kinaze (tk), ksantin-guanin fosforibozil transferaze (gpt), gena multiple rezistencije na lekove (MDR), ornitin dekarboksilaze (ODC) i N-(fosfonacetil)-L-aspartat rezistencije (CAD), puromicin acetiltransferaze (PAC), galaktokinaze, humanog folatnog receptora, ili redukovanih nosača folata.
26. Vektor u skladu sa ma kojim od zahteva od 14 do 25, naznačen time da reporterski protein bude odabran između luciferaze, zelenog fluorescentnog proteina, alkalne fosfataze, i ren peroksidaze ili njihovih kombinacija.
27. Vektor ekspresije koji uključuje promotor mCMV-IE2 koji se sastoji od fragmenta SEQ ID NO 1 za promociju funkcionalne ekspresije, naznačen time da se pomenuti promotor sadrži od sekvence iz grupe koja se sastoji od: (i) jezgrenog IE2 promotora koji obuhvata nukleotide od 1 do 39 u SEQ ID NO 1; (ii) sekvence koja uključuje jezgreni IE2 promotor koji obuhvata nukleotide od 1 do 39 u SEQ ID NO 1 i sekvence od 100 do 200 nukleotida ushodno od pomenutog jezgrenog IE2 promotora, i (iii) sekvencu SEQ ID NO 1
28. Vektor u skladu sa zahtevom 27, naznačeno time da pomenuti promotor mCMV-IE2 gena ili njegov pomenuti fragment za promociju funkcionalne ekspresije bude operabilno povezan sa sekvencom DNK koja kodira polipeptid.
29. Vektor u skladu sa zahtevom 28, naznačeno time da pomenuti polipeptid bude odabran između FSH, LH, CG, TSH, hormona rasta, interferona, TNF vezujućeg proteina I, TNF vezujućeg proteina II, Raptiva®, IL-18BP, ili muteina, fragmenata, funkcionalnih derivata, i njihovih fuzionih proteina.
30. Ćelija domaćina koja je transfektovana vektorom u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva.
31. Ćelija domaćina u skladu sa zahtevom 30, naznačeno time da ta ćelija domaćina bude ćelija CHO.
32. Postupak za produkciju polipeptida koji uključuje korak transfekcije ćelije domaćina najmanje jednim vektorom u skladu sa ma kojim zahtevom od 1 do 29.
33. Postupak u skladu sa zahtevom 32, naznačeno time da takva transfekcija bude stabilna transfekcija.
34. Postupak za produkciju polipeptida koji uključuje korak gajenja kulture ćelije domaćina u skladu sa zahtevima 30 ili 31, u uslovima koji omogućavaju ekspresiju polipeptida.
35. Postupak u skladu sa zahtevima 32, 33 ili 34, koji dodatno obuhvata korak izolovanja polipeptida iz ćelije domaćina, ili supernatanta kulture ćelija.
36. Upotreba vektora u skladu sa ma kojim zahtevom od 1 do 29 za ekspresiju gena od interesa.
37. Upotreba vektora u skladu sa ma kojim zahtevom od 1 do 29 za selekciju klona koji eksprimiraju visoke količine gena od interesa.
38. Upotreba vektora u skladu sa ma kojim zahtevom od 6 do 28 za istovremenu ekspresiju dva ili više gena ili DNK od interesa.
39. Upotreba vektora u skladu sa ma kojim zahtevom od 1 do 29 za proizvodnju medikamenata za terapiju na bazi DNK.
40. Upotreba ćelije domaćina u skladu sa ma kojim zahtevom od 30 do 31 za proizvodnju medikamenata za terapiju na bazi ćelija.
YUP-2005/0687A 2003-03-11 2004-03-10 Vektori ekspresije koji sadrže mcmv ie2 promotor RS50488B (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP03100617 2003-03-11
PCT/EP2004/050280 WO2004081167A2 (en) 2003-03-11 2004-03-10 Expression vectors comprising the mcmv ie2 promoter

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RS20050687A RS20050687A (sr) 2007-11-15
RS50488B true RS50488B (sr) 2010-03-02

Family

ID=32981915

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YUP-2005/0687A RS50488B (sr) 2003-03-11 2004-03-10 Vektori ekspresije koji sadrže mcmv ie2 promotor

Country Status (25)

Country Link
US (3) US7824907B2 (sr)
EP (1) EP1601776B1 (sr)
JP (3) JP5171033B2 (sr)
KR (1) KR101180139B1 (sr)
CN (1) CN100429315C (sr)
AT (1) ATE399872T1 (sr)
AU (1) AU2004219917B2 (sr)
BR (1) BRPI0408246A (sr)
CA (1) CA2516157C (sr)
CY (1) CY1108344T1 (sr)
DE (1) DE602004014738D1 (sr)
DK (1) DK1601776T3 (sr)
EA (1) EA010096B1 (sr)
ES (1) ES2309508T3 (sr)
HR (1) HRP20050705B1 (sr)
IL (1) IL170754A (sr)
MX (1) MXPA05009608A (sr)
NO (1) NO333818B1 (sr)
PL (1) PL1601776T4 (sr)
PT (1) PT1601776E (sr)
RS (1) RS50488B (sr)
SI (1) SI1601776T1 (sr)
UA (1) UA88138C2 (sr)
WO (1) WO2004081167A2 (sr)
ZA (1) ZA200506400B (sr)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0216648D0 (en) 2002-07-18 2002-08-28 Lonza Biologics Plc Method of expressing recombinant protein in CHO cells
PT1601776E (pt) * 2003-03-11 2008-09-17 Serono Lab Vectores de expressão que compreendem o promotor ie2 do mcmv
DK1622939T3 (da) * 2003-05-13 2012-04-10 Merck Serono Sa Aktive varianter af det IL-18-bindende protein og medicinske anvendelser deraf
JP4745972B2 (ja) * 2003-10-21 2011-08-10 メルク セローノ ソシエテ アノニム クロマチンインスレーターとして作用する極小ｄｎａ配列、及びタンパク質発現におけるその使用
AU2004291341B2 (en) * 2003-11-05 2010-08-05 Ares Trading S.A. Process for the purification of IL-18 binding protein
PL1720979T3 (pl) * 2004-03-01 2008-03-31 Ares Trading Sa Zastosowanie podłoża pozbawionego surowicy do hodowli komórkowej do wytwarzania IL-18BP w komórkach ssaków
DE602005009827D1 (de) * 2004-06-29 2008-10-30 Ares Trading Sa Verfahren zur aufreinigung von il-18-bindendem protein
EP1819812B1 (en) * 2004-12-02 2012-05-30 Merck Serono SA The lupac bifunctional marker and its use in protein production
US20090181424A1 (en) 2005-04-22 2009-07-16 Fernando Albericio Mammalian Expression Vector Comprising the MCMV Promoter and First Intron of HCMV Major Immediate Early Gene
CA2608656A1 (en) * 2005-05-16 2006-11-23 Morphotek, Inc. Regulated vectors for selection of cells exhibiting desired phenotypes
EP2267024B1 (en) * 2005-06-03 2012-05-09 Ares Trading S.A. Production of recombinant Il-18 binding protein
SI1891088T1 (sl) 2005-06-10 2012-02-29 Ares Trading Sa Postopek za äśiĺ äśenje il-18 vezavnega proteina
EP1760092A1 (en) 2005-08-26 2007-03-07 Applied Research Systems ARS Holding N.V. System for screening cells for high expression of a protein of interest
PT2227549E (pt) * 2007-12-21 2015-10-08 Novartis Ag Sistema de seleção para cultura de células eucarióticas com base num gene de recetor de folato ligado à membrana
JP2009276724A (ja) * 2008-05-19 2009-11-26 Nitto Denko Corp 光導波路装置の製造方法
PT2401377T (pt) 2009-02-27 2016-08-18 Novartis Ag Sistema de vectores de expressão compreendendo dois marcadores de selecção
JP5502406B2 (ja) * 2009-09-14 2014-05-28 ロンザ・バイオロジクス・ピーエルシー Ｃｈｏ細胞において組換えタンパク質を発現する方法
KR101038126B1 (ko) * 2010-11-30 2011-05-31 주식회사 엘지생명과학 새로운 융합 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터
US9249785B2 (en) * 2012-01-31 2016-02-02 Brightsource Industries (Isreal) Ltd. Method and system for operating a solar steam system during reduced-insolation events
HUE026516T2 (en) 2012-09-24 2016-06-28 Lonza Biologics Plc Expression vectors containing chimeric cytomegalovirus promoter and enhancer sequences
ITFI20120221A1 (it) * 2012-10-22 2014-04-23 Nuovo Pignone Srl "exhaust gas collector and gas turbine"
WO2014133468A1 (en) * 2013-02-28 2014-09-04 Agency For Science, Technology And Research Chimeric promoters for high gene expression level and stability in mammalian cells
CN103173480B (zh) * 2013-03-01 2015-06-24 上海中医药大学附属曙光医院 一种利用双荧光素酶报告基因筛选多药耐药相关microRNA的方法
CN103173481A (zh) * 2013-03-01 2013-06-26 上海中医药大学附属普陀医院 一种含有abcb1基因3′utr序列和报告基因的质粒载体及其构建方法和用途
US20160017319A1 (en) 2013-03-11 2016-01-21 Audrey Nommay Method of screening cell clones
RU2716977C2 (ru) 2013-07-31 2020-03-17 Новартис Аг Новые селективные векторы и способы селекции эукариотических клеток-хозяев
EP3604331A1 (en) 2013-12-20 2020-02-05 Novartis AG Novel eukaryotic cells and methods for recombinantly expressing a product of interest
AU2014369177B2 (en) 2013-12-20 2017-04-20 Novartis Ag Novel eukaryotic cells and methods for recombinantly expressing a product of interest
JP6265020B2 (ja) * 2014-04-16 2018-01-24 Jnc株式会社 エビルシフェラーゼの触媒蛋白質の変異遺伝子とその使用法
MX368664B (es) 2014-04-29 2019-10-10 Novartis Ag Células novedosas de vertebrados y métodos para la expresión recombinante de un polipéptido de interés.
WO2015177084A1 (en) * 2014-05-19 2015-11-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for production of polypeptides
KR20160068558A (ko) 2014-12-05 2016-06-15 삼성바이오에피스 주식회사 마우스 cmv 프로모터를 포함하는 융합 폴리뉴클레오타이드 및 이를 이용한 목적 폴리펩타이드의 생산 방법
SG11201706879UA (en) 2015-03-05 2017-09-28 Ab2 Bio Sa Il-18 binding protein (il-18bp) and antibodies in inflammatory diseases
SI3283634T1 (sl) * 2015-04-14 2019-08-30 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Rekombinantni adenovirus, ki izraža dva transgena z dvosmernim promotorjem
JP6937309B2 (ja) 2016-01-27 2021-09-22 ジャスト−エヴォテック バイオロジックス、インコーポレイテッド ハイブリッドプロモーターおよびその使用
WO2017194655A1 (en) 2016-05-12 2017-11-16 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potent and balanced bidirectional promoter
EP3472327B1 (en) 2016-06-20 2020-08-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potent and balanced bidirectional promoter
KR101864581B1 (ko) * 2016-11-04 2018-07-13 국립암센터 양방향 프로모터를 포함하는 렌티바이러스 발현 벡터 및 이의 용도
CN110268061B (zh) 2017-02-09 2024-07-16 扬森疫苗与预防公司 用于表达异源基因的有效的短启动子
EP3692153A1 (en) 2017-10-02 2020-08-12 Astrazeneca AB Cell lines and methods for increased protein production
EP3891278A4 (en) * 2018-12-04 2022-08-31 Catalent Pharma Solutions, LLC PROTEIN MANUFACTURE VECTORS
AU2020288407A1 (en) * 2019-06-07 2021-12-16 Biocon Biologics Limited Mammalian expression vectors

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2007A (en) * 1841-03-16 Improvement in the mode of harvesting grain
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
JPS63502719A (ja) * 1985-12-18 1988-10-13 ジェネティックス・インスチチュ−ト・インコ−ポレ−テッド プロモ−タ−系
US4963481A (en) * 1985-12-18 1990-10-16 Genetics Institute Inc Promoter system
US20020065213A1 (en) * 1998-01-16 2002-05-30 Robert J. Debs Methods and compositions for nonviral gene delivery
CA2401327C (en) * 2000-03-03 2014-05-06 Valentis, Inc. Nucleic acid formulations comprising poly-amino acids for gene delivery and methods of use
CZ300792B6 (cs) * 2000-05-05 2009-08-12 Applied Research Systems Ars Holding N. V. Farmaceutický prostredek
US7812148B2 (en) * 2001-04-05 2010-10-12 Millipore Corporation Vectors comprising CpG islands without position effect varigation and having increased expression
US20040161817A1 (en) * 2001-06-04 2004-08-19 Corixa Corporation Compositions and methods for high-level, large-scale production of recombinant proteins
PT1601776E (pt) * 2003-03-11 2008-09-17 Serono Lab Vectores de expressão que compreendem o promotor ie2 do mcmv
DK1622939T3 (da) 2003-05-13 2012-04-10 Merck Serono Sa Aktive varianter af det IL-18-bindende protein og medicinske anvendelser deraf
JP4745972B2 (ja) 2003-10-21 2011-08-10 メルク セローノ ソシエテ アノニム クロマチンインスレーターとして作用する極小ｄｎａ配列、及びタンパク質発現におけるその使用
AU2004291341B2 (en) 2003-11-05 2010-08-05 Ares Trading S.A. Process for the purification of IL-18 binding protein
PL1720979T3 (pl) 2004-03-01 2008-03-31 Ares Trading Sa Zastosowanie podłoża pozbawionego surowicy do hodowli komórkowej do wytwarzania IL-18BP w komórkach ssaków
DE602005009827D1 (de) 2004-06-29 2008-10-30 Ares Trading Sa Verfahren zur aufreinigung von il-18-bindendem protein
EP1819812B1 (en) * 2004-12-02 2012-05-30 Merck Serono SA The lupac bifunctional marker and its use in protein production
EP2267024B1 (en) 2005-06-03 2012-05-09 Ares Trading S.A. Production of recombinant Il-18 binding protein
SI1891088T1 (sl) 2005-06-10 2012-02-29 Ares Trading Sa Postopek za äśiĺ äśenje il-18 vezavnega proteina
BR112013024781B1 (pt) * 2011-04-01 2021-09-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Métodos de produção de um anticorpo e de uma composição farmacêutica

Also Published As

Publication number Publication date
CN1759184A (zh) 2006-04-12
ATE399872T1 (de) 2008-07-15
JP2015180222A (ja) 2015-10-15
KR20050113193A (ko) 2005-12-01
EA200501444A1 (ru) 2006-02-24
US20070258962A1 (en) 2007-11-08
DK1601776T3 (da) 2008-10-13
MXPA05009608A (es) 2006-03-21
US20110008839A1 (en) 2011-01-13
WO2004081167A3 (en) 2004-11-04
PT1601776E (pt) 2008-09-17
ZA200506400B (en) 2006-12-27
NO333818B1 (no) 2013-09-23
KR101180139B1 (ko) 2012-09-13
IL170754A (en) 2010-11-30
JP2012235787A (ja) 2012-12-06
HRP20050705A2 (en) 2005-12-31
CY1108344T1 (el) 2014-02-12
US9051582B2 (en) 2015-06-09
CA2516157C (en) 2012-09-18
US7824907B2 (en) 2010-11-02
WO2004081167A2 (en) 2004-09-23
RS20050687A (sr) 2007-11-15
JP2006520589A (ja) 2006-09-14
NO20054642L (no) 2005-10-10
PL1601776T4 (pl) 2009-05-29
HRP20050705B1 (hr) 2013-08-31
EA010096B1 (ru) 2008-06-30
JP5171033B2 (ja) 2013-03-27
SI1601776T1 (sl) 2008-10-31
AU2004219917B2 (en) 2008-01-31
US20150252383A1 (en) 2015-09-10
PL1601776T3 (pl) 2008-12-31
AU2004219917A1 (en) 2004-09-23
CN100429315C (zh) 2008-10-29
JP5848202B2 (ja) 2016-01-27
UA88138C2 (en) 2009-09-25
EP1601776A2 (en) 2005-12-07
HK1085766A1 (zh) 2006-09-01
CA2516157A1 (en) 2004-09-23
ES2309508T3 (es) 2008-12-16
BRPI0408246A (pt) 2006-03-01
EP1601776B1 (en) 2008-07-02
DE602004014738D1 (de) 2008-08-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS50488B (sr) Vektori ekspresije koji sadrže mcmv ie2 promotor
Nishimura et al. Development of defective and persistent Sendai virus vector: a unique gene delivery/expression system ideal for cell reprogramming
AU2002310275B2 (en) Chromosome-based platforms
Kaufman Overview of vector design for mammalian gene expression
JP5377806B2 (ja) ベクター構築物の細胞ｄｎａとの非相同組換えによる内因性遺伝子の発現
AU2002310275A1 (en) Chromosome-based platforms
AU2007254508B2 (en) Protein production using eukaryotic cell lines
EP3341484B1 (en) Mammalian expression system
HK1085766B (en) Expression vectors comprising the mcmv ie2 promoter
D'Aiuto et al. Human IL-12 p40 as a reporter gene for high-throughput screening of engineered mouse embryonic stem cells
Toktay Engineering and systematic comparison of constitutive promoters in various lines of chinese hamster ovary cells