ES2309508T3 - Vectores de expresion que comprenden el promotor de mcmv-ie2. - Google Patents

Abstract

Un vector de expresión que comprende un promotor mCMV-IE2 constituido por un fragmento funcional promotor de la expresión de SEQ ID NO:1, en donde: (i) el vector de expresión no contiene ningún gen completo del mCMV; y (ii) dicho promotor de mCMV-IE2 está enlazado operativamente a una secuencia de DNA que codifica un polipéptido.

Description

Vectores de expresión que comprenden el promotor de mCMV-IE2.

Campo de la invención

La invención se refiere a vectores de expresión que comprenden el promotor del gen de mCMV-IE2, o un fragmento funcional promotor de la expresión del mismo, en donde el vector de expresión no contiene ningún gen completo del mCMV, a células hospedadoras que contienen tales vectores, a métodos de producción de polipéptidos deseados por utilización de estos vectores de expresión, y a usos de dichos vectores de expresión.

Vectores de expresión que comprenden el promotor de mCMV IE2 y el promotor de mCMV IE1, opcionalmente junto con el nuevo intensificador de mCMV IE2, se prefieren de acuerdo con la invención, particularmente si ambos promotores están dispuestos en una arquitectura bidireccional.

Antecedentes de la invención

Desde hace décadas, se han utilizado vectores de expresión como vehículos para la expresión de genes o cDNAs que codifican polipéptidos o proteínas de interés en células hospedadoras. Los promotores fuertes virales o celulares están siendo utilizados para expresar el gen de interés a niveles altos por utilización de transfección transitoria o estable de DNA recombinante en las células hospedadoras. Se ha demostrado que la región inmediata temprana (IE) del citomegalovirus humano (hCMV) es particularmente adecuada a este respecto, y se conocen vectores de expresión que comprenden elementos génicos derivados de esta región, v.g. por el documento EP0323997B1.

Hasta hoy, las secuencias reguladoras génicas del citomegalovirus murino (mCMV) han sido utilizadas rara vez, aunque elementos reguladores derivados de mCMV se identificaron como muy potentes e incluso más fuertes que la contrapartida humana (Kim et al. 2002).

El documento US 4.963.481 (de Villiers) describe vectores de expresión que tienen un DNA que codifica una proteína heteróloga bajo el control transcripcional de fragmentos de DNA derivados de la región del gen IE de mCMV que incluye un fragmento de la endonucleasa de restricción PstI de aproximadamente 2270 pares de bases (pb) aislado del genoma viral. Una versión truncada de 1387 pb de este fragmento dio como resultado una mejora significativa en la eficacia del fragmento de DNA como promotor para la expresión de la proteína heteróloga.

El documento US 4.968.615 (Kozinowski) describe moléculas de DNA recombinante que contienen intensificadores de la transcripción del citomegalovirus murino (mCMV) que pueden utilizarse para mejorar la transcripción de genes estructurales en células eucariotas. Se decía que el intensificador de mCMV está localizado dentro del fragmento PstI de 2,27 kb identificado por de Villers (documento US 4.963.481).

Manning y Mocarski (1988) analizaron la importancia funcional de la región IE2 de mCMV para la replicación del citomegalovirus murino. A este fin, se construyó un virus recombinante que tenía el gen informador lacZ bajo el control transcripcional del intensificador/promotor IE de mCMV, rompiendo así el gen IE2. De hecho, no pudo observarse expresión alguna del gen IE2, y el virus se replicaba normalmente. Los autores dedujeron por ello que el gen IE2, que no está conservado entre los citomegalovirus tales como el mCMV y el hCMV, no era esencial para replicación del virus. No fue descrita ni sugerida indicación de utilidad particular alguna de la región intensificadora/promotora de IE2 por Manning y Mocarski.

Bibliografía más reciente indica una diferencia adicional entre la región IE de CMV de ratón y humano. El locus de ratón expresa un segundo mRNA mayor en la dirección opuesta del primer gen IE. Este segundo gen inmediato precoz se designó IE2, y se hace referencia a su secuencia promotora como el promotor IE2 (Masserie et al., 1991).

La región IE2 del mCMV no ha sido utilizada en vectores para expresión de proteínas heterólogas hasta ahora.

Sumario de la invención

La presente invención está basada en el descubrimiento de que un vector que tiene un elemento de DNA que comprende la región promotora IE2 del mCMV puede conducir eficientemente la expresión de un gen de interés en células hospedadoras transfectadas.

La invención describe adicionalmente la identificación de un nuevo intensificador en la región IE2 del mCMV, que se designa en esta memoria como el intensificador IE2 de mCMV. Este intensificador cumple los criterios aplicados comúnmente para definición de intensificadores, es decir la intensificación de la expresión independientemente de (1) la localización, (2) la orientación, y (3) la intensificación de la expresión de un promotor heterólogo.

Por esta razón, un primer aspecto de la invención se refiere a un vector de expresión que comprende un promotor de mCMV-IE2 constituido por un fragmento funcional promotor de la expresión SEQ ID NO: 1, en donde el vector de expresión no contiene ningún gen completo del mCMV y en donde dicho promotor IE2 de mCMV está enlazado operativamente a una secuencia de DNA que codifica un polipéptido.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a una célula hospedadora que comprende un vector de acuerdo con la invención.

Un tercer aspecto de la invención se refiere a un proceso para la producción de un polipéptido de interés que comprende el paso de transfectar una célula hospedadora con un vector de acuerdo con la invención.

En un cuarto aspecto, la invención se refiere a un proceso para la producción de un polipéptido de interés que comprende el paso de cultivar la célula hospedadora de la invención.

Un quinto aspecto de la invención se refiere al uso de un vector de acuerdo con la invención para la expresión de uno o más genes o cDNAs de interés.

En un sexto aspecto, la invención se refiere al uso de un vector de la invención para selección de clones que expresan cantidades elevadas de un gen de interés.

Un séptimo aspecto se refiere al uso de un vector de acuerdo con la presente invención en terapia basada en DNA.

Un octavo aspecto se refiere a un vector de expresión que comprende un promotor IE2 de mCMV constituido por un fragmento funcional promotor de la expresión en donde dicho promotor está constituido por una secuencia seleccionada del grupo constituido por (i) el promotor IE2 de núcleo; (ii) el promotor IE2 de núcleo y una secuencia de 100 a 200 nucleótidos aguas arriba de dicho promotor de núcleo; y (iii) la secuencia de SEQ ID NO: 1.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1 muestra la secuencia de un elemento bidireccional de DNA derivado de la región IE de mCMV para uso en construcciones de expresión. Se indican respectivamente los sitios +1 y las secuencias TATA de los promotores IE2 e IE1. Los promotores de núcleo para ambos genes se muestran en un recuadro. Los sitios de restricción por HpaI y XhoI se muestran en negrita. Se indica la posición -682 con respecto a +1 de IE1.

Fig. 2 muestra las construcciones informadoras A a G. El gen informador de luciferasa se muestra como una línea negrita y los promotores se indican como flechas huecas.

A:

el control negativo sin promotor (pGL3 Basic).

B:

un vector informador de luciferasa conducido por el promotor/intensificador de SV40 (pGL3 Control).

C:

el promotor conducido IE1 de expresión de luciferasa (pmCMV Luciferasa, IE1 conducido).

D:

el promotor conducido IE2 de expresión de luciferasa (prevmCMV Luciferasa, IE2 conducido).

E:

el promotor IE2 de expresión de luciferasa conducido, promotor IE1 delecionado (prevmCMV Luciferasa, \DeltaXhoI), IE2 conducido, IE1 menos).

F:

el promotor IE1 de expresión de luciferasa conducido, y el promotor IE2 delecionado (pBS.mCMV3 Luciferasa, IE1 conducido (1,4 kb), IE2 menos).

G:

una versión corta del promotor IE1 que conduce la expresión de luciferasa (p-680 Luciferasa, IE1 conducido (versión corta, 0,68 kb)).

Fig. 3 muestra una construcción bidireccional similar a la construcción C de Fig. 2 (construcción C-2) con la secuencia codificante para IL-18bp (línea en negrilla) enlazada al promotor IE2. Así, en esta construcción, el promotor IE1 de mCMV conduce la expresión de luciferasa, y simultáneamente el promotor IE2 de mCMV conduce la expresión de IL-18BP. Triángulo: intrón. Óvalos cerrados: poliA.

Fig. 4 muestra la expresión del gen informador de luciferasa desde las construcciones de los diferentes informadores que se representan en Fig. 2, construcciones A a G. Las células CHO-S que crecían en un medio exento de suero (SFM) se transfectaron transitoriamente con las construcciones A a G, o se transfectaron falsamente. La actividad de luciferasa se expresa como RLU = unidades relativas de luz.

Fig. 5 muestra la expresión de luciferasa medida como RLU en agrupaciones estables de células CHO-S transfectadas. Las células se dejaron crecer en SFM después de transfección con las construcciones D, C, F y E, como se representa en Fig. 2. La expresión de luciferasa se evaluó después de 21 días de selección.

Fig. 6 muestra la expresión de luciferasa medida como RLU después de transfección transitoria con 900, 500, 300 y 100 ng de la construcción bidireccional C-2 que se muestra en Fig. 3.

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Fig. 7 muestra la cantidad de IL-18BP en ng/l en los sobrenadantes del cultivo de células del experimento de transfección transitoria de acuerdo con Fig. 6 (construcción C-2).

Fig. 8 muestra la relación de las cantidades de IL-18BP frente a luciferasa medidas en el experimento de acuerdo con Figs. 6 y 7.

Fig. 9 muestra las cantidades de luciferasa en RLU (eje Y izquierdo) e IL-18BP en ng/ml (eje Y derecho) expresadas por 48 clones individuales que se seleccionaron 8 días después de la transfección con la construcción bidireccional C-2 (como se muestra en Fig. 3). El límite de detección para luciferasa era aproximadamente 500 RLU, y 2,5 ng/ml para IL-18BP. Cada incremento en el eje X representa un solo clon.

Fig. 10(a) muestra las construcciones informadoras H a N. El gen informador de luciferasa (Luc) se representa como una línea en negrilla y los promotores IE1 e IE2 respectivos se indican como flechas huecas. Los intensificadores se representan como óvalos grises: gris claro para el intensificador conocido IE1, y gris oscuro para el nuevo intensificador IE2.

H:

construcción bidireccional con la expresión de luciferasa conducida el promotor IE2;

I:

la expresión de luciferasa estaba conducida por el promotor IE2, y el promotor IE1 se delecionó;

J, K, L, M, N: las construcciones contenían promotores mCMV acortados, correspondiendo las posiciones al número de pares de bases de mCMVp, con relación al +1 de IE2 como referencia;

J:

desde -1076

K:

desde -783

L:

desde -587

M:

desde -387

N:

desde -189

Fig. 10(b) muestra la expresión de luciferasa en RLU a partir de las construcciones informadoras H a N de acuerdo con Fig. 10 (a), después de transfección transitoria de células CHO-S que se dejaron crecer en un medio exento de suero.

Fig. 11(a) muestra construcciones informadoras adicionales O a Y que combinaban el nuevo intensificador IE2 (óvalo gris) con el promotor SV40. El óvalo gris representa el intensificador IE2 desde -587 a -189, el óvalo gris medio representa el intensificador IE2 desde -387 a -189. La flecha sobre el intensificador IE2 indica la dirección de la secuencia intensificadora. El gen informador de luciferasa se muestra como una línea en negrilla, y el promotor SV40 se indica como una flecha hueca. Ovalo negro: poliA.

O:

secuencia intensificadora IE2 larga (-587/-189) clonada en 5' del promotor SV40;

P:

secuencia intensificadora IE2 corta (-387/-189) clonada en 5' del promotor SV40;

Q:

secuencia intensificadora IE2 larga (-587/-189) clonada en 5' del promotor SV40 en la orientación inversa;

R:

secuencia intensificadora IE2 corta (-387/-189) clonada en 5' del promotor SV40 en la orientación inversa;

S:

secuencia intensificadora IE2 larga (-587/-189) clonada en 3' del gen de luciferasa;

T:

secuencia intensificadora IE2 corta (-387/-189) clonada en 3' del gen de luciferasa;

U:

secuencia intensificadora IE2 larga (-587/-189) clonada en 3' del gen de luciferasa en la orientación inversa;

V:

secuencia intensificadora IE2 corta (-387/-189) clonada en 3' del gen de luciferasa en orientación inversa;

W:

control, promotor SV40 e intensificador SV40 en 3' de la secuencia codificante de luciferasa;

X:

control, expresión de luciferasa conducida por el promotor SV40 sin intensificador alguno;

Y:

control negativo, sin promotor alguno.

Fig. 11(b) muestra la expresión de luciferasa a partir de las construcciones informadoras O a Y como se muestra en Fig. 11(a). Células CHO-S que crecían en un medio exento de suero (SFM) se transfectaron transitoriamente con las construcciones O a Y. La actividad de luciferasa se expresa como número de veces de inducción en comparación con el control X (valor 1), es decir la expresión conducida por el promotor SV40 sin intensificador alguno. Barras huecas: intensificador IE2 largo (-587 a -189), barras sombreadas: intensificador IE2 corto (-387 a -189). El eje X es una escala logarítmica.

Fig. 12 muestra un experimento que compara el nuevo intensificador IE2 con el intensificador hCMV conocido. Las células se transfectaron con la construcción de control A (pGL3 básica, véase Fig. 2, sin promotor), la construcción de control B (pGL3 ctrl, véase Fig. 2, el promotor SV40 con la secuencia intensificadora de SV40 en 3' de la región codificante de luciferasa), la construcción de control X (SV-Luc+, véase Fig. 11.a, promotor de SV40 sin intensificador), así como las construcciones O y Q (véase Fig. 11a) o las construcciones O-2 y Q-2, en las cuales la secuencia intensificadora de IE2 (versión larga, -587 a -189) estaba reemplazada por la secuencia intensificadora de hCMV conocida (SEQ ID NO: 2). La luciferasa se midió en RLU (eje x). Barras sombreadas: con el intensificador hCMV conocido. Barras grises: con el nuevo intensificador IE2.

Fig. 13 muestra el vector bidireccional utilizado para expresión simultánea de IL-18BP y luciferasa. Los promotores IE1 e IE2 se indican como flechas huecas. El triángulo representa el intrón A de la región IE de hCMV, y el óvalo gris la señal de poliadenilación. El cuadrado compacto representa el péptido de señal.

Construcción #26:

luciferasa expresada a partir del promotor IE1 e IL-18BP por el promotor IE2. La secuencia entre ambos promotores es como en la construcción H de Fig. 10.a.

Construcción #140:

luciferasa expresada a partir del promotor IE2 e IL-18BP por el promotor IE1. El intensificador IE2 (-587 a -189) está localizado entre los dos promotores.

Fig. 14 muestra las cantidades de luciferasa expresada (RLU, eje Y izquierdo) e IL-18 BP (ng/ml, eje Y derecho) después de transfección transitoria de células CHO que crecían en medio exento de suero con cualquiera de las construcciones #26 o #140 de acuerdo con Fig. 13. Barras: expresión de luciferasa, rombos compactos: expresión de IL-18BP.

Fig. 15 muestra la expresión de luciferasa (RLU, eje Y izquierdo) e IL-18BP (ng/ml, eje Y derecho) en agrupaciones estables transfectadas con cualquiera de las construcciones #26 o #140 de acuerdo con Fig. 13. La expresión se midió 7 semanas después de la transfección. Las células se mantuvieron bajo selección de puromicina (+puro), o durante 3 semanas sin selección de puromicina (-puro). Barras: expresión de luciferasa, rombos compactos: expresión de IL-18BP.

Fig. 16 muestra la evolución temporal de la expresión de luciferasa como en el experimento de Fig. 15. El eje x representa el tiempo en semanas. Los datos que se muestran en Fig. 15 corresponden a la fecha de tres semanas en Fig. 16. Rombo compacto: #26 + puro, cuadrado pequeño: #140 + puro, triángulo compacto: #26 - puro, cuadrado grande: #140 - puro.

Fig. 17: muestra la evolución temporal de la expresión de IL-18BP en el experimento de acuerdo con Fig. 16, leyenda como en Fig. 16.

Fig. 18 se analizaron protoclones individuales respecto a expresión de luciferasa (cuadrados) en RLU (eje Y izquierdo) y la expresión de IL-18BP (rombos) en ng/ml (eje Y derecho). Cada incremento en el eje x representa un proto-clon individual. Los protoclones se establecieron a partir de células CHO transfectadas establemente con la construcción #26 y se mantuvieron bajo selección de puromicina.

Fig. 19: como Fig. 18, pero los protoclones se establecieron a partir de células transfectadas con la construcción #140.

Fig. 20: los protoclones transfectados con cualquiera de las construcciones #26 o #140 se analizaron respecto a expresión de luciferasa en un formato de 96 pocillos, vista ChemiDoc invertida.

Descripción detallada de la invención

De acuerdo con la presente invención, se ha encontrado sorprendentemente que el promotor del gen dos inmediato precoz (IE2) del citomegalovirus murino (mCMV) es eficiente en la promoción de la expresión de un polipéptido de interés que no es la proteína IE2 de mCMV propiamente dicha, es decir, de un polipéptido o proteína heterólogo. Este vector de expresión no se supone que sea el citomegalovirus murino propiamente dicho, o que contenga cualesquiera genes virales mCMV completos, sino que es un vector ideado para expresión recombinante de proteínas.

Por tanto, la invención se refiere a un vector de expresión que comprende un promotor del gen de mCMV-IE2 constituido por un fragmento funcional promotor de la expresión de SEQ ID NO: 1 en donde el vector de expresión no contiene ningún gen completo del mCMV, y en donde dicho promotor de mCMV IE2 está enlazado operativamente a una secuencia de DNA que codifica un polipéptido. La invención se refiere adicionalmente a un vector de expresión que comprende un promotor IE2 de mCMV constituido por un fragmento funcional promotor de la expresión en donde dicho promotor está constituido por una secuencia seleccionada del grupo constituido por (i) el promotor IE2 de núcleo; (ii) el promotor IE2 de núcleo y una secuencia de 100 a 200 nucleótidos aguas arriba de dicho promotor de núcleo; y (iii) la secuencia de SEQ ID NO: 1.

Además de esto, ha sido identificado un nuevo intensificador en la región IE2 de mCMV, que se designa en esta memoria como el intensificador IE2 de mCMV, o el intensificador IE2. Este intensificador intensifica la expresión con indiferencia de su localización u orientación frente al gen, e intensifica la expresión de promotores heterólogos, cumpliendo así los criterios generales de un intensificador.

Se describe también en esta memoria un vector de expresión que comprende el intensificador del gen IE2 de mCMV, o un fragmento funcional intensificador de la expresión del mismo, en donde el vector de expresión no contiene ningún gen completo del mCMV.

Las personas expertas en la técnica apreciarán que el vector de la invención puede comprender el promotor IE2 de mCMV solo, o en combinación con cualquier intensificador conocido apropiado. Adicionalmente, el vector de la invención puede comprender el promotor IE2 de mCMV en combinación con el intensificador IE2 de mCMV.

El gen IE2 de mCMV propiamente dicho es conocido, v.g. por Messerie et al., 1991.

El término "promotor" tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una región de DNA que funciona para controlar la transcripción de una o más secuencias de DNA, y que se identifica estructuralmente por la presencia de un sitio de fijación para RNA-polimerasa dependiente de DNA y de otras secuencias de DNA, que interaccionan para regular la función del promotor. Un fragmento funcional promotor de la expresión de un promotor es una secuencia promotora acortada o truncada que retiene la actividad como promotor. La actividad como promotor puede medirse en cualquiera de los ensayos conocidos en la técnica, v.g. en un ensayo con informador que utiliza luciferasa como gen informador (Word, 1991; Seliger y McElroy, 1960; de Wet et al. (1985), o disponible comercialmente de
Promega®).

De acuerdo con la presente invención, el promotor IE2 puede comprender p.ej. una secuencia que abarca desde la posición +1 a la secuencia TATA como se indica en Fig. 1. El promotor IE2 puede comprender también una secuencia denominada en esta memoria "promotor de núcleo" que abarca desde el nucleótido 1 al 39 de la secuencia representada en Fig. 1 (recuadro). Las personas expertas en la técnica apreciarán que la secuencia del promotor IE2 de mCMV puede ser más larga o más corta que el promotor de núcleo, con tal que la misma conduzca la transcripción de una secuencia de DNA enlazada operativamente a ella. Por ejemplo, el promotor IE2 puede comprender también 100-200 pares de bases aguas arriba del promotor de núcleo. Dicha región promotora se denomina también como el "promotor proximal". Las personas expertas en la técnica apreciarán adicionalmente que los términos "promotor" e "intensificador" (véase más adelante) no están definidos exactamente y por tanto el promotor puede comprender regiones intensificadoras, o las regiones intensificadoras pueden comprender regiones promotoras, dependiendo de la nomenclatura y el contexto.

El vector de la invención comprende preferiblemente un fragmento que comprende el promotor IE2 de núcleo. Más preferiblemente, el vector de la invención comprende adicionalmente una secuencia de 100 a 200 nucleótidos aguas arriba de dicho promotor de núcleo.

El término "vector" hace referencia a cualquier portador de DNA o RNA exógeno que es útil para transferir DNA exógeno a una célula hospedadora para replicación y/o expresión apropiada del DNA exógeno por la célula hospedadora.

El término "enlazado operativamente", como se utiliza en esta memoria, significa la fusión funcional de un promotor con un gen estructural o cDNA o cualquier otra secuencia de DNA a transcribir en el marco apropiado para expresar el gen, cDNA u otro DNA bajo control del promotor. El término enlazado operativamente, como se utiliza en esta memoria, no se limita por tanto a una fusión directa de secuencias de DNA.

El término "gen completo del mCMV" se refiere a un gen viral del citomegalovirus murino que tiene sus propios elementos de regulación (endógeno, viral) 5' y 3'.

Una "región intensificadora" hace referencia a una región de DNA que funciona para aumentar la transcripción de uno o más genes. Más específicamente, el término "intensificador", como se utiliza en esta memoria, es un elemento regulador de DNA que intensifica, incrementa, aumenta, o mejora la expresión de un gen con indiferencia de su localización y orientación frente al gen a expresar, y puede ser intensificador, incrementador, aumentador, o mejorador de la expresión de más de un promotor. Preferiblemente, el intensificador aumenta la expresión de más de un promotor simultáneamente. Un fragmento funcional que intensifica la expresión de un intensificador es una secuencia intensificadora acortada o truncada que retiene la actividad de intensificación.

El vector de la invención comprende preferiblemente un fragmento que incluye los nucleótidos -387 a -189 de la región aguas arriba IE2 de mCMV, numerándose los nucleótidos con relación a +1 del gen IE2. Este fragmento tiene función intensificadora, y se denomina también en esta memoria versión corta del intensificador IE2.

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En una realización preferida adicional, el vector comprende un fragmento que incluye los nucleótidos -587 a -189 de la región aguas arriba IE2 de mCMV, numerándose los nucleótidos con relación a +1 del gen IE2. Este fragmento tiene función intensificadora, y se designa también en esta memoria como versión larga del intensificador IE2.

El vector de la invención puede comprender también un intensificador adicional IE de mCMV, o un fragmento funcional intensificador de la expresión del mismo, denominado en esta memoria el "intensificador IE1 de CMV".

Un intensificador IE1 de mCMV de este tipo se conoce en la técnica, v.g. por el documento US 4.968.615. El mismo puede abarcar v.g. desde la posición -587 a -147, o desde la posición -682 a -147 de la secuencia representada de Fig. 1, efectuándose la numeración con relación a la posición +1 del gen IE1. El intensificador IE1 de mCMV que puede utilizarse de acuerdo con la presente invención puede comprender además una secuencia que abarca desde el par de bases -1330 a -488, con relación a la posición +1 del IE1 en Fig. 1. La región intensificadora puede comprender asimismo la totalidad o parte de un promotor.

Por la utilización de un intensificador de mCMV además del promotor IE2, puede incrementarse adicionalmente la expresión del polipéptido de interés.

De acuerdo con la presente invención, el vector comprende además un promotor que es diferente del promotor IE2 de mCMV, o un fragmento funcional promotor de la expresión del mismo.

En una realización preferida, el vector de la invención comprende un primer y un segundo promotor de origen viral, celular o artificial, o un fragmento funcional promotor de la expresión del mismo.

De acuerdo con la presente invención, se ha demostrado que la presencia de un segundo promotor conduce a la expresión eficiente de un polipéptido de interés por el promotor IE2 de mCMV. Por tanto, en una realización preferida, el vector comprende el promotor IE2 de mCMV en combinación con un segundo promotor, o un fragmento funcional promotor de la expresión del mismo. Ejemplos de promotores adecuados adicionales incluyen el promotor hCMV, el promotor de metalotioneína (MT), el promotor SV40, o un promotor artificial. Preferiblemente, el segundo promotor es una copia adicional del promotor IE2 de mCMV. Tales promotores adicionales pueden promover expresión constitutiva o regulada. La expresión regulada puede ser expresión inducible o reprimible, o ambas cosas a la vez.

Preferiblemente, un segundo promotor de este tipo es el promotor del gen IE1 de mCMV, o un fragmento funcional promotor de la expresión del mismo. Por tanto, se prefiere particularmente que el primer promotor sea el promotor IE2 de mCMV, o un fragmento funcional promotor de la expresión del mismo, y que el segundo promotor sea el promotor IE1 de mCMV, o un fragmento funcional promotor de la expresión del mismo.

El promotor IE1 de mCMV es conocido v.g. por el documento WO 87/03905. El mismo puede comprender el promotor de núcleo que contiene los últimos 47 pb de la secuencia de Fig. 1 (recuadro), o secuencias adicionales 100 a 200 pb aguas arriba (es decir, el promotor proximal), o puede comprender la región intergénica entera hasta la posición -1330 (con relación a la posición +1 del IE1, véase Fig. 1).

En una realización preferida, el vector comprende una secuencia de DNA de SEQ ID NO: 1, con inclusión de ambos promotores IE1 e IE2 así como el intensificador IE1 y el nuevo intensificador IE2, o cualquier fragmento funcional promotor de la expresión de los mismos.

En una realización muy preferida, en el vector de acuerdo con la invención, el promotor, o un fragmento funcional promotor de la expresión del mismo, está enlazado operativamente a una secuencia de DNA que codifica al menos un polipéptido. En una realización adicional de la invención, el intensificador de la invención está presente en el vector de expresión junto con una secuencia de DNA que codifica al menos un polipéptido.

Preferiblemente, la secuencia de DNA codifica una proteína de interés.

Adicionalmente, se prefiere que la secuencia de DNA codifique una proteína marcadora, o sea un gen amplificable.

Se prefiere también que la secuencia de DNA codifique una proteína informadora.

En caso de que el vector de la invención contenga más de un promotor, puede expresarse a partir del mismo plásmido cualquier combinación o sub-combinación de proteína de interés, marcador, informador, gen amplificable, etc.

De acuerdo con la presente invención, el polipéptido de interés puede ser cualquier polipéptido que, a diferencia del polipéptido IE2 propiamente dicho, sea una proteína extracelular tal como hormonas peptídicas, citoquinas o factores de crecimiento, o una proteína transmembranal tal como receptores de factores de crecimiento o receptores de hormonas, o proteínas intracelulares tales como quinasas, fosfatasas, o proteínas de fijación de DNA, dependiendo del uso propuesto del polipéptido de interés o la célula hospedadora en la que se exprese el mismo.

Proteínas marcadoras adecuadas de acuerdo con la presente invención son p.ej. marcadores de selección negativos o positivos, o genes amplificables. Ejemplos incluyen proteínas seleccionadas de adenosina-desaminasa (ADA), aminoglicosido-fosfotransferasa (NEO), dihidrofolato-reductasa (DHFR), higromicina-B-fosfotransferasa (HPH), timidina-quinasa (tk), xantina-guanina-fosforribosiltransferasa (gpt), gen de resistencia a fármacos múltiples (MDR), ornitina-descarboxilasa (ODC) y resistencia a N-(fosfonacetil)-L-aspartato (CAD), o puromicin-acetiltransferasa (TAC). Ejemplos adicionales incluyen genes utilizados para selección por el uso de caminos metabólicos particulares tales como galactoquinasa (Schumperli et al., 1982), el receptor de folato (Zhu et al., 2001), o el vehículo de folato reducido (Assaraf et al., 1992).

En otra realización preferida adicional, el polipéptido de interés es un gen informador.

El término "gen informador" o "proteína informadora", como se utiliza en esta memoria, tiene por objeto significar un gen que codifica un producto génico que puede identificarse utilizando métodos o reactivos simples y económicos, y que puede estar enlazado operativamente a una región promotora de la invención o un fragmento activo de la misma. Los genes informadores pueden utilizarse para determinar la actividad de transcripción ensayos de cribado (véase, por ejemplo, Goeddel (compilador), Methods Enzymol., vol. 185, San Diego, Academic Press, Inc., (1990)), v.g. utilizando luciferasa como gen informador (Wood, 1991; Seliger y McElroy, 1960; de Wet, et al., (1985), o disponible comercialmente de Promega®).

Ejemplos se seleccionan de luciferasa, proteína fluorescente verde, fosfatos alcalinos, O-galactosidasa, o peroxidasa de rábano picante o combinaciones intramoleculares con otras proteínas, tales como p.ej. la Proteína Fluorescente Verde (GFP), o GFP mejorada (EGFP) con el gen de puromicina-acetiltransferasa (Abbate et al., 2001) o combinaciones de los mismos.

Los datos experimentales en que se basa la presente invención han demostrado que la expresión simultánea y eficiente de polipéptidos de interés puede conseguirse con el promotor IE2 y el promotor IE1, presentes ambos en el mismo plásmido. Por esta razón, en una realización preferida adicional, tanto el promotor IE2 de mCMV, como el promotor IE1 de mCMV, o el o los fragmentos funcionales promotores de la expresión de los mismos, están enlazados operativamente a un polipéptido, respectivamente.

Pueden alcanzarse niveles elevados de expresión si ambos promotores están presentes en una arquitectura bidireccional. Por esta razón, el promotor IE2 de mCMV, o fragmento funcional de promoción de la expresión del mismo, y un promotor, en particular el promotor IE1 de mCMV, o un fragmento funcional promotor de la expresión del mismo, están dispuestos bidireccionalmente.

La expresión "dispuesto bidireccionalmente", como se utiliza en esta memoria, tiene por objeto significar que los promotores conducen la transcripción en direcciones opuestas. A esta configuración del DNA plasmídico se hace referencia también como una "arquitectura bidireccional" del vector.

Los promotores del gen IE1 de mCMV o IE2 de mCMV, o los fragmentos funcionales promotores de la expresión de los mismos, o cualquier promotor adicional que pueda utilizarse en combinación con el promotor IE2 de MCVM, o en combinación con el intensificador de IE2, pueden incluir adicionalmente una señal de iniciación de la traducción.

En una realización preferida adicional, el promotor del gen IE2 de mCMV, o un fragmento funcional promotor de la expresión del mismo, está enlazado a otros elementos que regulan o influyen en la transcripción. Tales elementos pueden afectar al procesamiento, la estabilidad o la eficiencia de traducción del RNA. Ejemplos de elementos adecuados se seleccionan del grupo constituido por 5'UTRs, intrones, 3'UTRs (véase v.g. Mazumder et al., 2003), secuencias de procesamiento del extremo 3' de mRNA (v.g. sitios de poliadenilación), y secuencias IRES para expresión policistrónica (véase v.g. Mountford y Smith, 1995).

Se prefiere utilizar un elemento IRES para expresión de mRNAs policistrónicos, en los cuales las secuencias codificantes están separadas por el IRES. La ventaja es que pueden expresarse varios polipéptidos de interés a partir del mismo mRNA y por tanto del mismo promotor.

En otra realización preferida adicional, el promotor del gen IE2 de mCMV solo, o en combinación con el promotor del gen IE1 de mCMV, o cualquier otro promotor natural o artificial, puede estar enlazado a secuencias adicionales promotoras de la expresión tales como aisladores, elementos DE límite, LCRs (v.g. descritos por Blackwood y Kadonga (1998)) o regiones de fijación matriz/entramado (v.g. descritas por Lee et al., 1999).

Las personas expertas en la técnica pueden apreciar que el vector de la presente invención puede contener también otros intensificadores, tales como v.g. el intensificador bien conocido SV40 o el intensificador de hCMV.

De acuerdo con la presente invención, el polipéptido enlazado operativamente a un primer promotor, preferiblemente el promotor IE2 de mCMV, y el polipéptido enlazado operativamente a un segundo promotor, preferiblemente el promotor IE1 de mCMV, puede ser el mismo. En este caso, están presentes dos copias del mismo gen en el mismo vector, pero bajo el control de dos promotores diferentes. Por tanto, puede ser posible alcanzar una tasa de expresión superior a la expresión de una sola copia de un gen que codifica un polipéptido de interés.

En una realización alternativa, el polipéptido enlazado operativamente a un primer promotor, preferiblemente el promotor IE2 de mCMV, y el polipéptido enlazado operativamente a un segundo promotor, preferiblemente el promotor IE1 de mCMV, son diferentes. La invención proporciona por tanto un vector eficiente para coexpresión de dos polipéptidos diferentes, tales como marcadores de selección y proteínas de interés, coexpresión de dos o más subunidades de la misma proteína, o incluso de dominios diferentes de la misma proteína, en caso de que sea deseable expresar los mismos por separado uno de otro, pero en la misma célula hospedadora.

Las personas expertas en la técnica apreciarán que varios vectores de expresión de acuerdo con la presente invención pueden co-transfectarse en la misma célula y servir para la expresión de proteínas y/o subunidades múltiples de proteínas multímeras muy complejas.

Se prefiere que el polipéptido enlazado operativamente a un primer promotor, v.g. el promotor IE2 de mCMV, sea una primera subunidad de una proteína dímera o multímera y el polipéptido enlazado operativamente a un segundo promotor, preferiblemente el promotor IE1 de mCMV, sea una segunda subunidad en una proteína dímera o multímera. La coexpresión de las dos subunidades de una proteína dímera se prefiere de acuerdo con la presente invención. La coexpresión de dos subunidades de la misma proteína es particularmente ventajosa dado que la expresión de ambos promotores puede dar como resultado la producción de cantidades similares de subunidades, o de relaciones predeterminadas de ambos polipéptidos, dependiendo de la fuerza de los promotores utilizados. Las subunidades pueden ensamblarse luego en la misma célula para formar una proteína madura.

Ejemplos preferidos de proteínas dímeras adecuadas para ser expresadas utilizando un vector de la invención son la cadena alfa y la cadena beta de una hormona peptídica tal como FSH humana, LH humana, TSH humana y CG humana. Cualquiera de las dos subunidades puede estar enlazada a un promotor de acuerdo con la invención, preferiblemente el promotor IL2 de mCMV. Las personas expertas en la técnica apreciarán que pueden utilizarse igualmente hormonas de otras especies de acuerdo con la presente invención, tales como hormonas de equino, porcino y bovino, por ejemplo, dependiendo del uso pretendido del polipéptido recombinante.

En otra realización de la invención, la primera subunidad es la cadena pesada, y la segunda subunidad es la cadena ligera de una inmunoglobulina, o viceversa. Un ejemplo preferido de una inmunoglobulina adecuada es una IgG. Tales inmunoglobulinas pueden, v.g., ser anticuerpos humanizados o humanos para uso terapéutico. Un ejemplo muy preferido de un anticuerpo humanizado de este tipo es un anticuerpo humanizado anti-CD11 que tiene el nombre comercial Raptiva®.

Muchos polipéptidos de interés pueden expresarse utilizando un vector de la invención. En realizaciones preferidas, el polipéptido se selecciona del grupo constituido por gonadotropina coriónica, hormona estimuladora de los folículos, hormona lutropin-coriogonadotrópica, hormona estimuladora del tiroides, hormona de crecimiento humano, interferones (v.g., interferón beta-1a, interferón beta-1b), receptores de interferón (v.g., receptor de interferón gamma), receptores p55 y p65 de TNF, interleuquinas (v.g., interleuquina-2, interleuquina-11), proteínas de fijación de interleuquina (v.g., la proteína de fijación de interleuquina-18), anticuerpos anti-CD11a, y muteínas, fragmentos, formas solubles, derivados funcionales, y proteínas de fusión de los mismos.

Otros polipéptidos preferidos de interés incluyen, v.g., eritropoyetina, factor estimulador de colonias de granulocitos, factor estimulador de colonias granulocitos-macrófagos, hormonas peptídicas de la hipófisis, gonadotropina menopáusica, factores de crecimiento semejantes a la insulina, (v.g., somatomedina-C), factor de crecimiento de los queratinocitos, factor neurotrófico derivado de líneas de células gliales, trombomodulina, factor de crecimiento básico de los fibroblastos, insulina, factor VIII, somatropina, proteína-2 morfogenética de los huesos, factor de crecimiento derivado de las plaquetas, hirudina, epoyetina, proteína de fusión recombinante LFA-3/IgG1, glucocerebrosidasa, y muteínas, fragmentos, formas solubles, derivados funcionales, y proteínas de fusión de los mismos.

El segundo aspecto de la invención se refiere a una célula hospedadora transfectada con al menos un vector arriba descrito. Las personas expertas apreciarán que la célula hospedadora puede cotransfectarse igualmente con dos o más vectores de acuerdo con la presente invención.

Muchas células hospedadoras son adecuadas de acuerdo con la presente invención, tales como líneas de células primarias o establecidas a partir de una gran diversidad de eucariotas con inclusión de células de plantas y animales, células de mamífero o células humanas. Por ejemplo, células hospedadoras adecuadas incluyen células CHO, células COS, células CV1, células L de ratón, células HT1080, células BHK-21, células HEK293, células NIH-3T3, células LM, células YI, células NS0 y células de hibridoma de ratón SP2/0 y análogas, células Namalwa, células RPMI-8226, células Vero, células WI-38, células MRC-5 u otras células inmortalizadas y/o transformadas.

Preferiblemente, la célula hospedadora es una célula CHO, y más preferiblemente una célula CHO-S, descrita v.g. por Shotwell et al. (1982), J. Biol. Chem. 257: 2974-2980). Las células CHO fueron cultivadas por primera vez por Puck (J. Exp. Med. 108, 945, 1958) a partir de una biopsia de un ovario de un hámster chino hembra. A partir de estas células originales se prepararon varias sub-líneas con diversas características. Una de estas líneas de células CHO, CHO-K1, requiere prolina y es diploide para el gen de la dihidrofolato-reductasa (DHFR). Otra línea derivada de esta línea de células es una línea de células CHO deficiente en DHFR (DHO DUK B11) (PNAS77, 1980, 4216-4220), que se caracteriza por la pérdida de la función DHFR como consecuencia de una mutación en un gen DHFR y la pérdida subsiguiente del otro gen.

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Todas estas células pueden transfectarse con los vectores de la presente invención, sea transitoriamente o de manera semi-estable (v.g., si el vector es episómico), o estable (v.g. integrado en el genoma). Se prefiere la transfección estable a fin de establecer clones que expresen continuamente el polipéptido de interés.

El promotor IE2 de la presente invención puede utilizarse como elementos reguladores en el marco de una tecnología denominada "Activación Endógena de Genes". El vector de la invención puede comprender estar introducido en el locus del genoma que se supone es activado por recombinación homóloga, enlazando así operativamente la secuencia reguladora (promotor IE2) con el gen de interés, cuya expresión se requiere introducir. La tecnología se describe v.g. en el documento WO 91/09955.

En un tercer aspecto, la invención se refiere a un proceso para la producción de un polipéptido de interés que comprende el paso de transfectar una célula hospedadora con un vector de acuerdo con la invención.

Dependiendo de la naturaleza del polipéptido de interés, el proceso de acuerdo con la invención conduce a una proteína o polipéptido secretado que puede cosecharse a partir del sobrenadante del cultivo de células, o a una proteína de la membrana celular o proteína intracelular que puede aislarse de las células por métodos conocidos. El polipéptido producido de acuerdo con la presente invención puede servir para cualquier finalidad, y preferiblemente es una proteína terapéutica destinada a administración a humanos o animales.

Dependiendo del uso propuesto, la célula propiamente dicha que tiene el polipéptido integrado puede ser el producto del proceso de acuerdo con la invención. Una célula de este tipo puede utilizarse v.g. para terapia basada en células.

En un cuarto aspecto, la invención se refiere un proceso para la producción de un polipéptido de interés que comprende el paso de cultivar una célula hospedadora de acuerdo con la invención.

En una realización preferida, el proceso comprende adicionalmente el paso de aislar el polipéptido de interés a partir de las células hospedadoras o de un sobrenadante de cultivo de células. Este paso es particularmente ventajoso y fácil de llevar a cabo para proteínas secretadas que pueden aislarse simplemente del sobrenadante del cultivo de células. Sin embargo, este paso es igualmente aplicable al aislamiento de polipéptidos a partir de membranas celulares, o compartimientos intracelulares, que pueden ser aislados de las células hospedadoras.

El proceso puede utilizarse en sistemas de expresión transitorios, estables, episómicos o virales. Como se muestra más adelante en los ejemplos, el vector de la invención daba como resultado una expresión particularmente fuerte de la proteína deseada si se utilizaba en un sistema de expresión estable. Por consiguiente, en una realización preferida la transfección es transfección estable.

En un quinto aspecto, el vector de acuerdo con la invención se utiliza para expresión de un gen de interés. Genes de interés pueden ser v.g. los genes que codifican cualquiera de los polipéptidos de interés arriba mencionados. El vector de la invención puede utilizarse también para expresión de genes marcadores, genes informadores, genes amplificables, o análogos.

Preferiblemente, el vector se utiliza para expresión simultánea de dos o más genes o cDNAs de interés. El mismo puede utilizarse también para expresión simultánea de un gen de interés y un gen marcador o gen informador o gen amplificable, o análogos.

Dentro del marco de la presente invención se ha demostrado, sorprendentemente, que un vector de la invención, en particular un vector que comprende el promotor IE2, el intensificador IE2, y el promotor IE1, daba como resultado la identificación de clones que expresaban fuertemente un gen informador y un gen de interés. Por esta razón, en un sexto aspecto, la invención se refiere al uso de un vector de acuerdo con la invención para selección de clones que expresan cantidades elevadas de un gen de interés.

En un séptimo aspecto, la invención se refiere al uso de un vector de la invención para la fabricación de un medicamento para uso en terapia basada en plásmidos o DNA o terapia génica.

En un octavo aspecto, la célula hospedadora de la invención se utiliza para la fabricación de un medicamento para terapia basada en células. En caso de que la terapia basada en células tenga por objeto tratamiento de humanos, se prefiere que la célula hospedadora sea una célula o línea de células humana, más preferiblemente una célula o línea de células derivada del paciente que debe someterse a tratamiento.

Si bien esta invención se ha descrito en conexión con realizaciones específicas de la misma, se entenderá que la misma es susceptible de modificaciones adicionales.

La referencia a pasos de métodos conocidos, pasos de métodos convencionales, métodos conocidos o métodos convencionales, no es en absoluto reconocimiento de que ningún aspecto, descripción o realización de la presente invención se describa, se proponga o se sugiera en la técnica pertinente.

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La descripción que antecede de las realizaciones específicas revelará tan detalladamente la naturaleza general de la invención que otras personas pueden, aplicando su conocimiento dentro de la experiencia de la técnica (con inclusión de los contenidos de las referencias citadas en esta memoria), modificar y/o adaptar fácilmente para diversas aplicaciones tales realizaciones específicas sin experimentación excesiva, sin desviarse del concepto general de la presente invención. Por consiguiente, se entenderá que dichas adaptaciones y modificaciones están comprendidas dentro del significado y campo de equivalencia de las realizaciones descritas, basándose en la doctrina y las orientaciones presentadas en esta memoria. Debe entenderse que la fraseología o terminología de esta memoria tiene por objeto servir de descripción y no de limitación, de tal modo que la terminología o fraseología de la presente memoria descriptiva debe ser interpretada por el técnico experto a la vista de la doctrina y orientaciones presentadas en esta memoria, en combinación con el conocimiento de una persona con experiencia ordinaria en la técnica.

Ejemplos Ejemplo 1 Evaluación de vectores de expresión en transfecciones transitorias Materiales y Métodos Materiales

Células: CHO-S, origen Gibco/Invitrogen (Cat. No. 11619).

DNAs plasmídicos construidos como se representa en Figs. 2 y 3 se aislaron de cultivos estándar de crecimiento nocturno con el kit Nucleobond PC 500 (Macherey-Nagel Cat. No. 740 574) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Transfección

Lipofectamina (Invitrogen, Cat. No. 18324-012)

Formato: placas de 24 pocillos

Células: células CHO-S

Formato: placas de 24 pocillos.

Células: células CHO-S en fase de crecimiento exponencial se sometieron a pasos 24 h antes de la transfección. Para evitar una fase estacionaria a baja densidad de células, las células se diluyeron a 0,75 x 10^{6} células/ml. La cantidad total de células a transfectar era 1,5 x 10^{5}, resuspendidas en 100 \mul de medio SFM II exento de suero (Invitrogen, Cat No 12052-114) por pocillo, en placas de 24 pocillos.

Las mezclas de transfección eran como sigue:

A)

lipofectamina: 2 \mul

Medio SFM II: 48 \mul

Volumen total 50 \mul

B)

DNAs: 1 \mug (50 ng vector de expresión + 950 ng plásmido vehículo, pBluescript II KS (+), Stratagene, Cat 212205-1

Medio SFM II: complemento hasta 50 \mul.

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Se mezclaron las soluciones A y B, y se incubaron durante 30 min a la temperatura ambiente.

Se añadió esta mezcla a los 100 \mul de medio SFM II que contenían 1,5 x 10^{5} células. Las células se pusieron de nuevo en la incubadora y se incubaron a 37ºC, 5% CO_{2} durante 3 horas.

A continuación, se añadieron 400 \mul de medio SFM II a fin de diluir la lipofectamina. Seguidamente, se incubaron las células durante 48 horas más antes de la toma de muestras para el análisis. Todas las transfecciones se realizaron por triplicado.

Medida de luciferasa

Se utilizó el sistema de ensayo de luciferasa Bright-Glo de Promega, Cat No E2610 se utilizó para la medida de luciferasa de acuerdo con las directrices del fabricante.

Resumidamente, la suspensión de células se homogeneizó por pipeteado hacia arriba y hacia abajo varias veces, y se tomó una parte alícuota de 50 \mul, que se puso en una placa blanca de 96 pocillos (Nunc, Cat No 236108). A continuación, se añadieron 50 \mul de reactivo Bright-Glo reconstituido y se incubó durante 5 minutos a la temperatura ambiente. Se midió la emisión de luz en un luminómetro Centro LB 960 (Berthold Technologies) durante 5 segundos de tiempo de adquisición.

Resultados

Las construcciones de vector de expresión que se utilizaron en un sistema de expresión transitorio basado en células CHO-S se representan en Fig. 2. En esta serie de experimentos, se utilizó luciferasa como gen informador para evaluación de la expresión génica. Se utilizaron como controles vectores que no tenían promotor alguno (construcción A) o el promotor/intensificador SV40 (construcción B), que no es muy activo en células CHO-S.

Los resultados de los experimentos de transfección transitoria con los vectores A a G se muestran en Fig. 4. En las construcciones C y F, la expresión de luciferasa está conducida por el promotor IE1. Ambas construcciones dieron como resultado expresión de luciferasa. La construcción C contenía además el promotor IE2 dispuesto bidireccionalmente con relación al promotor IE1. Esta disposición bidireccional reducía la eficiencia de la expresión del promotor IE1, construcción C, en comparación con el uso del promotor IE1 solo, construcción F. Una versión corta de 0,68 kb del promotor IE1 (construcción G) era menos eficiente que la versión más larga (construcción F).

Con indiferencia de la presencia o ausencia de un segundo promotor en la misma construcción, el promotor IE2 conducía eficientemente la expresión de luciferasa (construcciones D y E) y puede utilizarse por tanto como elemento promotor en vectores de expresión para la expresión de polipéptidos de interés.

En contraste con el promotor IE1, el promotor IE2 era menos eficiente si se utilizaba solo (construcción E) que si se utilizaba en una arquitectura bidireccional (construcción D). Por consiguiente, el mismo es particularmente adecuado para uso en vectores de expresión bidireccionales.

Ejemplo 2 Evaluación de vectores de expresión en transfección estable Materiales y métodos Métodos

Células: CHO-S, de Gibco/Invitrogen (Cat No 11619).

Se aislaron DNAs plasmídicos (de acuerdo con Fig. 2) a partir de cultivos estándar de crecimiento nocturno con el kit Nucleobond PC 500 (Macherey-Nagel Cat. No 740 574) de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante.

Transfección

Lipofectamina (Invitrogen, Cat. No 18324-012)

Para transfecciones estables, se utilizaron matraces T75. Se sometieron a pasos las células CHO-S en fase de crecimiento exponencial 24 h antes de la transfección. Para evitar una fase estacionaria con densidad de células baja, se diluyeron las mismas a 0,75 x 10^{6} células/ml. La cantidad total de células a transfectar era 5 x 10^{6}, resuspendidas en 7 ml de medio SFM II (Invitrogen Cat No 12052-114) en un matraz T75.

Las mezclas de transfección eran como sigue:

A)

Lipofectamina: 52,1 \mul

Medio SFM II: 517,9 \mul

El volumen total es 570 \mul.

B)

DNAs: 10 \mug de DNA plasmídico linealizado (9 \mug vector de expresión Luc + 1 \mug plásmido para selección: SV40 promotor de dirección del gen de resistencia a la puromicina. Todos los plásmidos se linealizaron con PvuI)

El medio SFM II se complementó hasta 570 \mul.

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Se mezclaron A y B, y se incubaron durante 30 min a la temperatura ambiente. Se añadieron 7 ml que contenían 5 x 10^{6} células y las células se pusieron de nuevo en una incubadora a 37ºC y 5% de CO_{2} durante 3 horas. A continuación se centrifugó el cultivo a 800 g durante 3 minutos, y el sedimento de células se resuspendió en 5 ml de EX-CELL 325 (JRH, Cat No 14335-1000M), suplementado con 1X HT y L-glutamina 4,5 mM (100X HT, Invitrogen, Cat No 11067-030, L-glutamina 200 mM, Sigma G-7513). Se añadieron 5 ml de EX-CELL 325 directamente al matraz T75 a fin de resuspender las células adherentes, y se añadieron la suspensión. En total, se encontraban 5 x 10^{6} células en 10 ml de medio EX-CELL 325.

Procedimiento de Selección

Se aplicó selección 48 horas después de la transfección por cambio del medio y dilución hasta 1 x 10^{6} células/ml en EX-CELL 325 que contenía 10 \mug/ml de puromicina (Sigma, P 8833). Cada dos días, se contaron las células, se centrifugaron, y se resuspendieron en medio selectivo reciente a 1 x 10^{6} células vivas/ml. La viabilidad se comprobó en dichos momentos. Después de 21 a 35 días se completó la selección, y la viabilidad de las células era mayor que 80%.

Medida de Luciferasa

Dos horas antes de la toma de muestras del cultivo, se contaron las células y se diluyó el cultivo a 0,2 x 10^{6} células vivas/ml.

El sistema de ensayo de luciferasa Bright-Glo de Promega, Cat No E2610 se realizó de acuerdo con las directrices del fabricante.

Resumidamente, se resuspendieron las células por pipeteado hacia arriba y hacia abajo varias veces, y se tomó una parte alícuota de 50 \mul que se puso en una placa blanca de 96 pocillos (Nunc, Cat No 236108). Se añadieron directamente 50 \mul de Reactivo Bright-Glo reconstituido, y se incubó durante 5 min a la temperatura ambiente. La emisión de luz se midió en un luminómetro.

Centro LB 960 (Berthold Technologies) durante 5 segundos de tiempo de adquisición.

La actividad de luciferasa se normalizó luego por el número de células vivas en la muestra testada, es decir típicamente 1 x 10^{4}_{ }células.

Resultados

Las construcciones C, D, E y F (véase Fig. 2) se sometieron a test en un sistema de expresión estable. Los resultados se representan en Fig. 5. La construcción E, que comprendía el promotor IE2 solo, dio como resultado la expresión más fuerte de luciferasa en este sistema. Si estaba presente con el promotor IE1 en disposición bidireccional (construcción D), el promotor IE2 daba todavía como resultado una expresión de luciferasa que era superior a la expresión conducida por el promotor IE1, sea solo (construcción F) o en disposición bidireccional con el promotor IE2 (construcción C).

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Ejemplo 3 Coexpresión de dos polipéptidos de interés a partir de vectores de expresión bidireccionales Materiales y métodos

Las transfecciones se llevaron a cabo como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Resumidamente, células CHO-S (en suspensión, Gibco SFM II) se transfectaron transitoriamente con 900, 500, 300 y 100 ng de DNA vector (construcción C-2, véase Fig. 3) en placas de 24 pocillos (triplicados para cada condición). Dos días después de la transfección, se realizaron ensayos de luciferasa con extractos celulares a partir de los triplicados como se expresaba por RLU (unidades relativas de luz). Los sobrenadantes de los mismos pocillos se tomaron antes de la lisis celular, se agruparon y se ensayaron respecto a IL 18BP por ELISA (véase más adelante).

ELISA de IL-18BP

La cantidad de IL-18BP recombinante humana (rhIL-18BP) en el sobrenadante se midió por ELISA estándar utilizando un anticuerpo monoclonal anti-rh-IL-18BP purificado de proteína G que estaba acoplado a biotina. Se utilizó extravidina-HRP (Sigma) como reactivo de detección.

Fig. 9 muestra las cantidades de IL-18BP en ng/ml y la luciferasa en RLU expresadas por 48 clones el día 90 después de transfección estable con una construcción de promotor mCMV bidireccional (véase Fig. 3). El límite de detección para luciferasa era aproximadamente 500 RLU, y 2,5 ng/ml para IL-18BP.

Resultados

En esta serie de experimentos, se ensayó la expresión concomitante de dos genes de la construcción C-2, representada en Fig. 3. El gen marcador (luciferasa) era expresado por el promotor IE1, y el gen de interés, el gen IL-18BP era expresado por el promotor IE2. IL-18BP es una proteína secretada. Los promotores se dispusieron en arquitectura bidireccional, es decir ambos promotores conducían simultáneamente la expresión en direcciones opuestas.

Los resultados de este estudio se representan en Figs. 6 a 9. Fig. 6 muestra la extensión de la expresión de luciferasa tal como era expresada por RLU medidas en un sistema de expresión transitoria. En el mismo sistema de expresión transitoria, IL-18B se midió por ELISA en los sobrenadantes de cultivo de células. Fig. 7 muestra los resultados en ng/ml de IL-18B secretada. Fig. 8 muestra las relaciones de IL-18B a luciferasa en cada experimento de expresión transitoria.

Como se muestra en Figs. 6 a 8, se utilizaron cantidades diferentes de DNA plasmídico para la transfección. Todas las cantidades de DNA utilizadas daban como resultado la expresión tanto de luciferasa como de IL-18BP. Sorprendentemente, los mejores resultados se obtuvieron con la cantidad mínima de DNA transfectada, 100 ng de DNA vector, consistentemente para IL-18BP y luciferasa.

Adicionalmente, el cociente estable (Fig. 8) indica una relación constante entre el potencial de expresión de ambos promotores.

En conclusión, estos datos demuestran que ambos genes son expresados simultáneamente por las dos unidades promotoras, demostrando además que ambas unidades de expresión son plenamente funcionales en la arquitectura bidireccional de los promotores.

A continuación, se transfectó la construcción C-2 de manera estable, y se ensayó la expresión de luciferasa e IL-18BP en 48 clones independientes.

Se realizaron transfecciones estables de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 2, con la excepción de que el medio utilizado después de la transfección era ProCho5 (Cambrex, Cat. 12766Q).

Para clonación de células simples, la agrupación se dispuso en placas de 384 pocillos (Nunc, Cat. 164688) a una densidad de 0,5 células por pocillo (70 \mul/pocillo) utilizando un dispensador Multidrop (ThermoLabSystems, Cat. 5840150). Ocho días más tarde, se seleccionaron aleatoriamente 192 clones y se analizaron para expresión de luciferasa. Se eligieron 48 clones con la expresión máxima de Luc y se ensayaron de nuevo para la expresión tanto de luciferasa (luminometría) como de IL-18BP (por ELISA manual, véase anteriormente).

Fig. 9 muestra los resultados de este experimento. La totalidad de los 48 clones expresaban luciferasa e IL-18BP, aunque en cantidades variables.

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Ejemplo 4 Definición de la secuencia intensificadora mínima Materiales y métodos DNAs plasmídicos

Se construyeron una serie de vectores que contenían los promotores mCMV acortados utilizando PCR (Reacción en Cadena de Polimerasa) e iniciadores específicos que coincidían a lo largo del mCMVp (Tabla 1).

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Las condiciones de la PCR eran como sigue:

Mezcla

10 ng de plásmido de DNA (prevmCMV-luciferasa (\DeltaXhoI), construcción E de Fig. 2)

50 pmol de iniciadores de sentido y antisentido (véase Tabla 1 más adelante, antisentido común para todos)

200 \muM de cada uno de los dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)

1X tampón Dynazyme, que contenía MgCl_{2} 1,5 mM)

4 unidades de DNA-polimerasa Dynazyme II (Finnzymes, Cat. F-501S)

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Parámetros de las fases cíclicas:

95ºC, 5'

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2 ciclos:

95ºC, 30''

52ºC, 30''

72ºC, 1'30

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2 ciclos:

95ºC, 30''

54ºC, 30''

72ºC, 1'30

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10 ciclos:

95ºC, 30''

58ºC, 30''

72ºC, 1'30

\vskip1.000000\baselineskip

15 ciclos:

95ºC, 30''

60ºC, 30''

72ºC, 1'30

\vskip1.000000\baselineskip

Se cargaron 5 \mul de cada reacción PCR en un gel de agarosa al 1%. Las bandas que tenían la longitud correcta se cortaron y se purificaron utilizando el kit Qiagen Minilute Gel, Cat. 28606, antes de la clonación.

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TABLA 1

1

Las posiciones correspondientes al número de pares de bases mantenidos de mCMVp, considerando la posición +1 de IE2 como referencia, son: -1076, -783, -587, -387 y -189.

La estrategia de clonación para cualquiera de los fragmentos promotores era la misma, y las PCRs se llevaron a cabo sobre mCMVp de longitud total (prevmCMV-Luciferasa (\DeltaXhoI), es decir la construcción E de Fig. 2). Los fragmentos se digirieron luego por XhoI/EcoRI, con dos sitios de restricción añadidos en la extremidad de la secuencia iniciadora específica. La secuencia iniciadora se retiró luego de la construcción E por digestión de la misma con XhoI/EcoRI, y se insertaron versiones más cortas exactamente en el mismo locus.

La evaluación de las construcciones se realizó por transfección transitoria con lipofectamina seguida por medida de luciferasa. Los materiales y métodos ulteriores fueron como se describe en el Ejemplo 1. El medio SFM utilizado en este ejemplo era ProCho5, Cambrex, B-12766Q.

Resultados

Se construyeron los vectores H a N (Fig. 10.a) que comprendían el promotor mCMV IE2 que conducía el gen de luciferasa con objeto de definir las secuencias mínimas requeridas para niveles de expresión altos del promotor IE2.

Las siete construcciones de los vectores de expresión H a N se utilizaron en un sistema de expresión transitoria basado en células CHO-S. Los resultados se representan en la Figura 10.b). La construcción L es la construcción más corta que retiene expresión fuerte de luciferasa en este sistema. La construcción M daba todavía como resultado expresión de luciferasa, cuyo nivel era aproximadamente 30% del nivel de expresión alcanzado con las construcciones H a L. La expresión de luciferasa obtenida con la construcción N era muy baja pero todavía significativa, indicativa de actividad basal del promotor como era de esperar para un sitio productivo de inicio de la transcripción que contenía una secuencia TATA e iniciador.

En conclusión, estos experimentos definen un nuevo intensificador en la región aguas arriba de mCMV IE2, denominado en esta memoria intensificador mCMV IE2. En los experimentos anteriores, el intensificador IE2 aumenta la transcripción del promotor IE2 mínimo retenido en la construcción N. la secuencia mínima requerida para expresión alta del gen informador está dentro del fragmento de pares de bases -587 a -189 (construcción L), y una construcción que comprendía el fragmento de pares de bases de -387 a -189 mejoraba todavía la expresión de luciferasa (construcción M).

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Ejemplo 5 El nuevo intensificador IE2 activa un promotor mínimo de SV40

Se llevaron a cabo experimentos adicionales a fin de evaluar si el nuevo intensificador IE2 satisface de hecho todos los criterios requeridos para actividad intensificadora, es decir mejora de la expresión independientemente de (1) localización, (2) orientación, y (3) identidad promotora. Para hacer esto, se realizaron las construcciones O a V con objeto de comprobar que el nuevo intensificador IE2 podría mejorar la expresión de un promotor heterólogo, el promotor SV40, con independencia de la orientación, distancia y posición (5' o 3'), relativas al promotor SV40. Las construcciones W, X e Y eran los controles, conteniendo W el intensificador SV40, en tanto que X no contenía intensificador alguno, excepto el promotor SV40, e Y no contenía intensificador ni promotor.

Construcción de vectores

Se construyó Un vector denominado pSV-Luc (construcción X de la Figura 11(a)) que contiene únicamente el promotor SV40 a partir de pGL3-Ctrl (Promega, E 1741), que contenía el promotor SV40 que conduce el gen de luciferasa, y el intensificador SV40 localizado en 3' del gen (construcción W), y pGL3-Basic (Promega, E 1751), que carecía tanto de promotor como de intensificador (construcción Y).

Resumidamente, se cortó pGL3-ctrl con NotI/XbaI para aislar un fragmento que contenía el promotor SV40, seguido por el gen de luciferasa. De manera similar, se cortó pGL3-Basic con NotI/XbaI y se aisló la cadena principal del vector que contenía la región poli-A, sin el intensificador 3'. Por combinación de los dos fragmentos, se obtuvo pSV-Luc (construcción X).

La región 5' del promotor SV40 de este vector se modificó por ingeniería genética por clonación de la secuencia intensificadora IE2 (-587 a -189) en ambas orientaciones, denominadas p5'enh-SV-Luc (construcción O), y p5' reverse enh-SV.Luc (construcción Q). Adicionalmente, la secuencia intensificadora IE2 (-587 a -189) se clonó también en la región 3' del gen de luciferasa, en ambas orientaciones. Los vectores resultantes se designaron p3'enh-SV-Luc+ (Construcción S), y p3' reverseanh-SV.Luc. (construcción U).

Se realizó el mismo procedimiento con la versión corta del intensificador IE2, es decir que tenía -387 a -189 en lugar de -587 a -189, y las construcciones se denominaron P, R, T y V, véase Fig. 11.a.

Construcción O, P: El vector receptor era pSV-Luc^{+} (construcción X de Fig. 11a) abierto por digestión con NheI/SmaI. El intensificador de longitud total se aisló por digestión con NdeI, seguida por reacción de formación de extremos romos utilizando polimerasa Klenow, purificación y digestión con NheI. Se aplicó la misma estrategia para la elaboración de la construcción intensificadora corta.

Construcción Q, R: El vector receptor era pSV-Luc^{+} (construcción X de Fig. 11a) abierto por digestión con XhoI/SmaI. El intensificador de longitud total se aisló por digestión con NdeI, seguida por reacción de formación de extremos romos utilizando polimerasa Klenow, purificación y digestión con XhoI. Se aplicó la misma estrategia para la elaboración de la construcción intensificadora corta.

Construcción S, T, U y V: El vector receptor es pSV-Luc^{+} (construcción X de Fig. 11a) abierto por digestión con BamHI, seguida por formación de extremos romos polimerasa Klenow. El intensificador de longitud total se aisló por digestión con NdeI/NheI, seguida por reacción de formación de extremos romos utilizando polimerasa Klenow. La clonación permitía ambas orientaciones, lo que se identificó por análisis de restricción. Se mantuvieron ambas orientaciones para el análisis. Se aplicó la misma estrategia para la elaboración de la construcción intensificadora corta.

La construcción pGL3-Basic (construcción Y) sirvió como control de expresión nula. pGL3-ctrl (construcción W) sirvió como vector promotor/intensificador de SV40. pSV-Luc era el control que tenía el promotor SV40 solo (construcción X).

Las transfecciones y las medidas de luciferasa se llevaron a cabo como en los ejemplos anteriores.

Resultados

Los resultados obtenidos con las construcciones O a Y de Fig. 11a se representan en Fig. 11b. La construcción del promotor SV40 sin intensificador se tomó como línea base para la actividad de intensificador añadida, y la actividad medida con la construcción X se estableció como 1. Todas las construcciones que tenían el intensificador IE2 largo o el corto daban como resultado la expresión del gen informador. La versión larga daba consistentemente como resultado una expresión alta del gen informador por el promotor SV40, que era mucho mayor que el nivel de expresión obtenido con la combinación del promotor SV40 y el intensificador SV40 (construcción O). Por tanto, este experimento define claramente la secuencia -587 a -189 y la secuencia -387 a -189 como intensificadores auténticos, que activan un promotor heterólogo de manera independiente de la posición y orientación.

Ejemplo 6 Comparación entre la versión larga del intensificador IE2 (-587 a -189) y el intensificador hCMV

Los protocolos experimentales para transfección con lipofectamina, seguida por medida de luciferasa, se describen en el Ejemplo 1.

Resultados

En este experimento, las construcciones O y Q, que tenían la versión larga del nuevo intensificador IE2 en ambas orientaciones en 5' del promotor SV40, se utilizaron para comparación con un intensificador fuerte conocido, el intensificador hCMV (citomegalovirus humano). A este fin, la secuencia mCMV IE2 se reemplazó por la secuencia intensificadora hCMV (SEQ ID NO: 2) en la construcción O, dando como resultado la construcción O-2. Se hizo esto mismo en la construcción Q, dando como resultado la construcción Q-2.

La secuencia intensificadora hCMV que tenía sitios MluI (MluI = acgcgt) que la flanqueaban, que se utilizaron para la clonación, era como sigue:

2

Se digirió SV-Luc^{+} con MluI, y se trató con fosfatasa alcalina de intestino de ternero a fin de prevenir la autoligación. La secuencia promotora hCMV se clonó en el sitio MluI. Los clones de ambas orientaciones se mantuvieron para comparación con construcciones IE2 equivalentes.

Los resultados de expresión de luciferasa se muestran en Fig. 12. Los niveles de expresión de luciferasa obtenidos con el nuevo intensificador IE2 (versión larga) eran al menos dos veces mayores que los niveles de expresión de luciferasa obtenidos con el intensificador clásico hCMV.

Ejemplo 7 Eficiencia del intensificador IE2 en una construcción bidireccional

Se diseñaron dos construcciones adicionales para testar el nuevo intensificador en una arquitectura bidireccional, denominados construcciones #26 y #140 como se representa en Fig. 13.

#26: La base de este vector era mCMV-Luc^{+} (construcción C, Fig. 3). Se digirió con SacII/EcoRI. La casete IL-18BP se tomó de phCMV-IL18BP2. Por corte de este vector con SacII/EcoRI, se aisló un fragmento que contenía el intrón A seguido por el marco de lectura abierto de IL-18BP y la región SV40poliA.

#140. La base de este vector era la construcción L de Fig.10.a. Se digirió con XhoI/NheI, abriendo el vector 5' del intensificador IE2. Se utilizó como donante de inserción un vector que expresaba IL-18BP a partir del promotor IE1, denominado pBS.I IL-18BP(IE1).1. Por digestión de este vector con XhoI/SpeI, se aisló un fragmento que contenía el promotor IE1 de XhoI (véase Fig. 1) seguido por la casete IntrónA-IL18BP-SV40poliA. La construcción resultante carecía de la secuencia entre -589 a XhoI de la secuencia promotora mCMV original.

Se llevaron a cabo transfecciones estables y medida de luciferasa como se describe en el Ejemplo 2, y el ELISA de IL18BP como se describe en el Ejemplo 3.

Sin embargo, la construcción #140 no refleja exactamente la construcción #126 en el sentido de que los promotores IE1 e IE2 están en orientación inversa. Así, la expresión de luciferasa estaba conducida por el promotor IE1 en la construcción #26, y en cambio por el promotor IE2 en la construcción #140, y la expresión de IL-18BP estaba conducida por el promotor IE2 en la construcción #26 y por el promotor IE1 en la construcción #q40.

Los resultados obtenidos con ambas construcciones se muestran a continuación, dado que son significativos para el efecto simultáneo del nuevo intensificador IE2 sobre dos promotores diferentes en un vector de expresión bidireccional (construcción #140).

Fig. 14 representa los resultados de agrupaciones transfectadas de manera estable con la construcción #26 y #140 en términos de la expresión de luciferasa e IL-18BP. La construcción #140 daba como resultado una expresión más alta tanto del gen marcador (luciferasa) como del gen de interés (IL-18BP).

Con objeto de evaluar la estabilidad de expresión de luciferasa e IL-18BP, las agrupaciones se mantuvieron o bien en condiciones selectivas, es decir bajo tratamiento con puromicina, o se mantuvieron sin presión selectiva (sin puromicina) durante 3 semanas. Los resultados se muestran en Figs. 15 a 17. Los niveles de expresión del gen informador de luciferasa y el IL-18BP no cambiaban significativamente a lo largo del tiempo, véase Fig. 16 y 17.

Así pues, se demostró que ambas construcciones #26 y #140 exhibían niveles de expresión similares a lo largo del tiempo, en presencia o ausencia de presión de selección. Por tanto, las construcciones que tienen el nuevo intensificador IE2 son adecuadas para expresión estable y simultánea de dos genes.

Dado que los resultados anteriores se obtuvieron en agrupaciones, se derivaron clones por dilución limitante a 0,5 células/pocillo a partir de ambas agrupaciones.

Los clones se cultivaron bajo selección con puromicina, a fin de evaluar los niveles de expresión clonales. A continuación, los clones aislados se dividieron en presencia y ausencia de puromicina para monitorizar eventualmente su estabilidad. Los resultados presentados en Figs. 18 y 19 se tomaron antes de dividir los clones en condiciones +/- de puromicina. Los resultados de dos semanas después de la eliminación de la puromicina no exhibían diferencia significativa alguna para ambas construcciones, lo que sugería su estabilidad. Este estudio se continuará a lo largo de otras 10-12 semanas.

Con objeto de evaluar la expresión de ambos genes se utilizó un formato de alta capacidad, a saber en placas de 96 pocillos:

Día 1: dilución ½ de las células, 100 \mul de medio de cultivo ProCho5 (exento de suero) + 100 \mul de ProCho5 nuevo que contenía 5% de suero bovino fetal. Con 2,5% de concentración final de FBS, las células eran capaces de fijarse. El sometimiento a pasos semanalmente de la placa de mantenimiento se realizó en un factor de dilución 1/20, en todos los casos en medio ProCho5.

Día 2: Se desechó el medio, se lavó una sola vez con 200 \mul de 1x PBS (Invitrogen, 10010-015), y 75 \mul de ProCho5 nuevo que contenía 5% de FBS añadido, y se incubó durante un pulso de expresión de 24 h.

Día 3: Se recuperaron 50 \mul de los sobrenadantes, y se añadieron 200 \mul de tampón Elisa (1 x PBS, 0,1% p/v BSA, 0,2% v/v Tween 20). Se analizaron 100 \mul por ELISA para IL-18BP.

Los pocillos se lavaron con 200 \mul de 1 x PBS (que se desechó) y se añadieron 100 \mul de tampón Glo-Lysis (Promega, E266a). Los pocillos se incubaron durante 30 min a la temperatura ambiente para asegurar la lisis celular. La medida de luciferasa se realizó utilizando 30 \mul de células lisadas transferidas en una placa blanca de 96 pocillos + 30 \mul de reactivo Bright-Glo reconstituido. La emisión de luz se midió en un luminómetro Centro LB960 durante 5 segundos de tiempo de adquisición.

Los análisis de los clones obtenidos a partir de transfecciones estables con la construcción #26 se representan en Fig. 18, y los resultantes de la transfección estable con la construcción #140 en Fig. 19.

Los clones representados en Figs. 18 y 19 se clasificaron por su valor de luciferasa en orden descendente. La expresión de IL18BP se indicó como valor DO. (Dado que el ELISA se llevó a cabo en formato de alta capacidad, no pudo obtenerse la cuantificación real de los niveles de IL-18BP. Sin embargo, se incluyeron controles a 2500 ng/ml y 250 ng/ml y una prueba en blanco para monitorizar la variación de placa a placa.

Fig. 20 muestra la expresión de luciferasa en las placas en vista ChemiDoc invertida. Esta lista utiliza una cámara CCD (Biorad), que permite adquirir señales procedentes de quimioluminiscencia (como en Fig. 20). Un software denominado Quantity One 4.2.3 permite el tratamiento de las imágenes, como inversión de las señales, lo que se empleó en este caso.

Como resulta evidente por los resultados que se muestran en Figs. 18 a 20, la construcción #140 daba como resultado una gran cantidad de clones no expresantes. Sin embargo, sorprendentemente, los pocos clones positivos expresaban ambos genes muy intensamente.

Por consiguiente, la construcción #140 permite el cribado para expresadores muy fuertes en fases de clonación muy tempranas, omitiendo así la necesidad de someter a test y el seguimiento de números elevados de clones a fin de identificar los pocos clones que expresan intensamente ambos genes de interés.

Referencias

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19. US patent 4,968,615

20. Zhu et al., J Cell Biochem 2001 Mar 26;81(2):205-19.

<110> Applied Research Systems ARS Holding N.V.

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<120> VECTORES DE EXPRESIÓN QUE COMPRENDEN EL PROMOTOR DE MCMV IE2

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<130> WO 816

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<150> EP03100617.4

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<151> 11-03-2003

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<160> 2

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 1394

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<212> ADN

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<213> Cytomegalovirus murino

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<220>

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<221> fuente

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<222> (1)..(1394)

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<223> Cytomegalovirus murino

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<400> 1

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100

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<210> 2

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<211> 644

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<212> ADN

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<213> Cytomegalovirus humano

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<400> 2

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102

Claims (40)

1. Un vector de expresión que comprende un promotor mCMV-IE2 constituido por un fragmento funcional promotor de la expresión de SEQ ID NO:1, en donde:

(i)

el vector de expresión no contiene ningún gen completo del mCMV; y

(ii)

dicho promotor de mCMV-IE2 está enlazado operativamente a una secuencia de DNA que codifica un polipéptido.

2. El vector de la reivindicación 1, en donde dicho promotor mCMV-IE2 comprende el promotor de núcleo IE2 que abarca desde el nucleótido 1 al 39 de SEQ ID NO: 1.

3. El vector de la reivindicación 2, en donde dicho promotor mCMV-IE2 comprende adicionalmente una secuencia de 100 a 200 nucleótidos aguas arriba de dicho promotor de núcleo IE2.

4. El vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente un intensificador mCMV-IE2 constituido por un fragmento funcional intensificador de la expresión de SEQ ID NO: 1.

5. El vector de la reivindicación 4, en donde dicho intensificador de mCMV-IE2 comprende los nucleótidos -387 a -189 de la región aguas arriba de mCMV-IE2, numerándose los nucleótidos con relación a +1 del gen IE2.

6. El vector de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicho intensificador mCMV-IE2 comprende los nucleótidos -587 a -189 de la región aguas arriba de mCMV-IE2, numerándose los nucleótidos con relación a +1 del gen IE2.

7. El vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente un promotor diferente de dicho promotor mCMV-IE2.

8. El vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un primer y un segundo promotor de origen viral, celular o artificial.

9. El vector de la reivindicación 8, en donde el primer promotor es el promotor mCMV-IE2, y el segundo promotor es el promotor mCMV-IE1.

10. El vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende la secuencia de DNA de SEQ ID NO: 1.

11. El vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en donde los promotores primero y segundo están enlazados operativamente a secuencias de DNA que codifican al menos un polipéptido.

12. El vector de la reivindicación 11, en donde las secuencias de DNA codifican al menos una proteína de interés.

13. El vector de acuerdo con la reivindicación 11, en donde las secuencias de DNA codifican al menos una proteína marcadora.

14. El vector de acuerdo con la reivindicación 11, en donde las secuencias de DNA codifican al menos una proteína informadora.

15. El vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, en donde el primer promotor y el segundo promotor están dispuestos bidireccionalmente.

16. El vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente uno o más elementos reguladores seleccionados de 5' UTRs, intrones, 3' UTRs, secuencias de procesamiento del extremo 3' de mRNA, sitios de poliadenilación, y secuencias internas de entrada de ribosoma (IRES).

17. El vector de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el elemento regulador es una IRES, que comprende adicionalmente una secuencia de DNA codifica al menos un mRNA policistrónico.

18. El vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente uno o más elementos de DNA seleccionados de aisladores, elementos límite, regiones de locus de control (LCRs), regiones de fijación de matriz (MARs), y elementos para recombinación e intercambio de casetes.

19. El vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, en donde la secuencia de DNA que codifica el polipéptido enlazado operativamente al primer promotor y la secuencia de DNA que codifica el polipéptido enlazado operativamente al segundo promotor codifican el mismo polipéptido.

20. El vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, en donde la secuencia de DNA que codifica el polipéptido enlazado operativamente al primer promotor y la secuencia de DNA que codifica el polipéptido enlazado operativamente al segundo promotor codifican polipéptidos diferentes.

21. El vector de acuerdo con la reivindicación 20, en donde la secuencia de DNA que codifica el polipéptido enlazado operativamente al primer promotor codifica una primera subunidad de una proteína dímera o multímera y la secuencia de DNA que codifica el polipéptido enlazado operativamente al segundo promotor codifica una segunda subunidad de una proteína dímera o multímera.

22. El vector de acuerdo con la reivindicación 21, en donde una subunidad es la cadena alfa y la otra subunidad es la cadena beta de una hormona seleccionada de FSH humana, LH humana, TSH humana y CG humana.

23. El vector de acuerdo con la reivindicación 20, en donde una subunidad es la cadena pesada y la otra subunidad es la cadena ligera de una inmunoglobulina.

24. El vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 23, en donde la proteína de interés se selecciona de FSH, LH, CG, TSH, hormona del crecimiento, interferón, proteína I de fijación de TNF, proteína II de fijación de TNF, Raptiva®, IL-18BP, o muteínas, fragmentos, derivados funcionales, y proteínas de fusión de las mismas.

25. El vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 24, en donde la proteína marcadora se selecciona de adenosina-desaminasa (ADA), aminoglicosido-fosfotransferasa (neo), dihidrofolato-reductasa (DHFR), higromicina-B-fosfotransferasa (HPH), timidina-quinasa (tk), xantina-guanina-fosforribosiltransferasa (gpt), gen de multirresistencia a los fármacos (MDR), ornitina-descarboxilasa (ODC) y resistencia a L-(fosfonacetil)-L-aspartato (CAD), puromicin-acetiltransferasa (PAC), galactoquinasa, receptor de humano folato, o vehículos de folato reducidos.

26. El vector de acuerdo con las reivindicaciones 14 a 25, en donde la proteína informadora se selecciona de luciferasa, proteína fluorescente verde, fosfatos alcalinos, y peroxidasa de rábano picante o combinaciones de los mismos.

27. Un vector de expresión que comprende un promotor mCMV-IE2 constituido por un fragmento funcional promotor de la expresión de SEQ ID NO: 1, en donde dicho promotor está constituido por una secuencia seleccionada del grupo constituido por:

(i)

el promotor IE2 de núcleo que abarca desde el nucleótido 1 al 39 de SEQ ID NO: 1;

(ii)

una secuencia que comprende el promotor IE2 de núcleo que abarca desde el nucleótido 1 al 39 de SEQ ID NO: 1 y una secuencia de 100 a 200 nucleótidos aguas arriba de dicho promotor IE2 de núcleo; y

(iii)

la secuencia de SEQ ID NO: 1.

28. El vector de acuerdo con la reivindicación 27, en donde dicho promotor del gen de mCMV-IE2 o dicho fragmento funcional promotor de la expresión del mismo está enlazado operativamente a una secuencia de DNA que codifica un polipéptido.

29. El vector de acuerdo con la reivindicación 28, en donde dicho polipéptido se selecciona de FSH, LH, CG, TSH, hormona del crecimiento, interferón, proteína I de fijación de TNF, proteína II de fijación de TNF, Raptiva®, IL-18BP, o muteínas, fragmentos, derivados funcionales, y proteínas de fusión de los mismos.

30. Una célula hospedadora transfectada con un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

31. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 30, en donde la célula hospedadora es una célula CHO.

32. Un proceso para la producción de un polipéptido que comprende el paso de transfectar una célula hospedadora con al menos un vector de acuerdo con un cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29.

33. El proceso de acuerdo con la reivindicación 32, en donde la transfección es transfección estable.

34. Un proceso para la producción de un polipéptido que comprende el paso de cultivar una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 30 ó 31 en condiciones que permitan la expresión del polipéptido.

35. El proceso de acuerdo con la reivindicación 32, 33 ó 34, que comprende adicionalmente el paso de aislar el polipéptido de la célula hospedadora o del sobrenadante del cultivo celular.

36. Uso de un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29 para expresión de un gen de interés.

37. Uso de un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29 para selección de clones que expresan cantidades elevadas de un gen de interés.

38. Uso de un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 26 para expresión simultánea de dos o más genes o DNAs de interés.

39. Uso de un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29 para la fabricación de un medicamento para terapia basada en DNA.

40. Uso de una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 30 ó 31 para la fabricación de un medicamento para terapia basada en células.