RS50835B - Hemostatički aktivni preparat koji sadrži vwf i postupak njegovog pripremanja - Google Patents

Abstract

Postupak za pripremanje hemostatički aktivnog preparata koji sadrži von Willebrand-ov faktor (vWF) iz frakcije humane plazme, naznačen time, što se obavlja putemI. hromatografskog prečišćavanja plazma frakcije koja sadrži vWF na anjon-izmenjivačkom materijalu koji ima anjon-izmenjivačke grupe na kalemljenim polimernim strukturama (tentakularni materijal), sakupljajući frakciju koja sadrži vWF, praćenoII. prečišćavanjem pomenute frakcije korišćenjem hromatografije na molekularnim sitima za pripremu prečišćenog termalno stabilnog preparata koji sadrži vWF; iIII. preparat se u liofiliziranom stanju zagreje do temperature veće od 80°C radi inaktiviranja virusa.Prijava sadrži još 1 nazavisan i 12 zavisnih patentnih zahteva.

Description

Priloženi pronalazak se odnosi na postupak pripreme virus-inaktivisanog, hemostatički aktivnog preparata koji sadrži von Willebrand-ov faktor (vWF) iz frakcije humane plazme, i na hemostatički aktivni preparat koji sadrži vWF a koji se dobija postupkom u skladu sa pronalaskom.

Von Willebrand-ova bolest je poremećaj u koagulaciji krvi koji se, za razliku od

hemofilije A ili B, manifestuje kao krvavljenje iz mekih tkiva, naročito mukoznog. Nedostatak takozvanog von VVillebrand-ovog faktora (vWF) je uzrok ove bolesti. Do danas, ovaj faktor daje se pacijentima kroz preparate faktora VIII u kojim se takođe nalazi i vWF, ali često samo sa nezadovoljavajućim kvalitetom i u nezadovoljavajućoj količini. Mada je proizvodnja vWF genetičkim inženjeringom zadovoljavajuća, još uvek postoji velika potreba za primenu poboljšanih načina prečišćavanja za pripremanje vWF iz krvi ili plazme donatora.

STANJE TEHNIKE

U EP-A-0 934 748 opisan je veoma čist vWF sa sadržajem od najmanje 15% vWF multimera, koji sadrži 13 ili više promotora (HMW-VWF multimera). On je dobijen u višestepenom hromatografskom prečišćavanju, gde filtriranje gela u grupnoj separaciji može da se inicijalno izvede umesto krioprecipitacije. Da bi se inaktivisali virusi, na primer, opisan je tretman sa rastvaračima ideterdžentima itretman sa visokom temperaturom u liofilizovanom stanju u toku 72 h na 80°C.

Josic i sar., 'Prečišćavanje faktora VIII i vWF faktora za humane* plazme anjon-izmenjivačkom hromatografijom',Journal of Chromatography B,662 (1994), 181-190, i Schvvinn i sar., 'Rastvaračem/deterdžentom tretiran, pasterizovan, visoke čistoće faktor VIII koncentrat',Arzneimittel- Forschung 1 Drug Research44 (1), 2, 188-191 (1994), odnose se na prečišćavanje kompleksa VIIIA/VVF faktora, utiču na prečišćavanje preko jon-izmenjivačkog materijala i predstavljaju dva nezavisna koraka za inaktivaciju virusa. Utiče se na tretman sa rastvarač/deterdžentom i pasterizacijom (10 h na 63°C) u prisustvu stabilizatora. Mada se faktor VIII teško denaturiše pasterizacijom (95% rezidualne aktivnosti), vWF-u se menja aktivnost i distribucija multimera (85% rezidualnog antigena), i pojavljuje se gubitak multimera velike molekulske težine, što rezultuje u odnosu antigen/aktivnost od 2.2 kod vWF (aktivnost/antigen = 0.5).

US-A-5,714,590 opisuje prečišćavanje kompleksa faktora VIII jon-izmenjivačkom hromatografijom. Tako je uključen EMD-TMAE-Fractogel materijal kolone koji se takođe koristi za propustljivost gela. Za inaktivaciju virusa predložen je tretman sa rastvaračem/deterdžentom. Tretman visokim temperaturama nije opisan. Produkt koji se dobije takođe sadrži vWF, samo se potvrđuje antigenost vVVF.

Cilj pronalaska je da se dobije novi postupak za prečišćavanje vWF iz humane plazme. Ovim postupkom dobija se vWF boljeg kvaliteta i efikasnosti.

OPIS PRONALASKA

Cilj pronalaska je postignut postupkom za pripremanje hemostatički aktivnog preparata koji sadrži von VVillebrand-ov faktor (VVVF) iz frakcije humane plazme, karakterističnim po tome da se izvodi hromatografsko prečišćavanje plazma faktora koji sadrži vVVF na anjon-izmenjivačkom materijalu koji ima anjon-izmenjivačke grupe nakalemljene na polimernim strukturama (tentakularnom * materijalu), sakuplja se frakcija sa vWF-om, što je praćeno prečišćavanjem frakcija koje koriste propustljivost gela i preparat se greje da bi se inaktivisali virusi. Tentakularni materijali koji se mogu upotrebiti u postupkifprema ovom pronalasku objavljeni su, posebno, u EP-A-0337 144. Ova publikacija je uključena ovde po referenci. Navedeni matreijali su poželjno poliakrilamidni tentakularni polimeri nakalemljeni na diole Fractogel-a koji su dobijeni od Merck-a, Darmstadt, Nemačka.

Slika 1 pokazuje stabilnost proizvoda koji se dobija u skladu sa pronalaskom u poređenju sa proizvodima prečišćenim samo pomoću anjon-izmenjivačke hromatografije.

Ova procedura iznenađujuće rezultuje u proizvodu sa visokom količinom vVVF kada se uporedi sa F VIII. Zbog koraka propustljivosti gela, sekvenca po ovom pronalasku rezultuje u uklanjanju inhibitora inter-a-tripsina kao i drugih faktora koji mogu da doprinesu redukciji kvaliteta proizvoda u poznatim načinima pripremanja. Sekvenca koraka u hromatografiji po pronalasku dovodi do proizvodnje vVVF koji je iznenađujuće stabilan. Iznenađujuće, vWF frakcija koja se dobija korišćenjem načina po pronalasku je esencijalno stabilna u vodenom rastvoru na sobnoj temperaturi u produženom vremenskom periodu (do jedne nedelje). Nadalje, preparat u skladu sa pronalaskom sadrži vVVF u prirodnoj formi i nema fragmente.

Preferencijalno, termalno stabilni preparat i zagrejani preparat prikazuju samo jedan pik u filtracionoj analizi HPLC gela.

U skladu sa postupkom termalno stabilni preparat može se zagrevati i na temperature više od 80°C u liofiliziranom stanju. U drugoj realizaciji postupka u skladu sa pronalaskom, preparat se zagreva na temperature više od 90°C, naročito na 100°C. U skladu sa pronalaskom, zagrevanje se vrši u periodu od •* najmanje 1 h do 5 h, naročito od 2 do 3 h. Tako se inaktiviraju svi transfuziono-relevantni virusi, naričito virusi bez lipidnog omotača, kao što su parvovirusi ili virusi hepatitisa A. Ono što zadivljuje je to da proizvod dobijen rfačinom opisanom u ovom pronalasku podnosi ove zahtevne tretmane visoke temperature bez substancijalnog gubitka aktivnosti.

Prema pronalasku, na prečišćavanje frakcije koja sadrži vVVF može se dodatno uticati najmanje jednim tretmanom adsorbcione i/ili afinitetne hromatografije.

Prema pronalasku, frakcija koja sadrži vVVF dobijena iz zalihe humane plazme takođe se može prečistiti u ovom procesu.

Ovaj pronalazak takođe se odnosi na hemostatički aktivni preparat koji sadrži vVVF, koji se dobija u postupku koji je opisan u pronalasku.

Preparat u skladu sa pronalaskom je oslobođen od infektivnih virusa koji se pojavljuju u krvi, naročito HIV, HBV, HCV, HAV i parvovirusa.

Naročito, preparact u skladu sa pronalaskom sadrži vVVF sa velikom molekularnom težinom koji pokazuje minimum 13-16 multimernih traka posle elektroforetske analize. Broj multimera i njihovih distribucionih šema je mera sličnosti vVVF preparata sa prirodnom vVVF iz plazme. Nadalje, odnos ristocitin kofaktora kao surogat markera za aktivnost vWF i vWF antigena u preparatu u skladu sa pronalaskom je najmanje 0.8. Ovo je drugi način merenja integriteta vWF molekula.

Preparat u skladu sa pronalaskom poželjnono nadalje sadrži faktor VIII u prirodnoj formi. Korišćenje kompleksa F VIII i vWF pokazalo se naročito korisnim za tretiranje von Willebrand-ove bolesti.

Nadalje, sledeći proteini su uklonjeni iz preparata u skladu sa pronalaskom sve do ispod granice imunohemijske detekcije: imunoglobulini, fibrinogen, fibronektin i inter-a-tripsin inhibitor. Ovo je naročito razlog za veoma visoku'stabilnost produkta prema pronalasku.

Pronalazak će dalje biti ilustrovan sledećim Primerima.

Primeri

Oko 47 kg krioprecitipata tretirano je sa 15% (w/w) 2% rastvora (w/w) aluminijum hlorida. Posle centrifugiranja, uzorak je virus-inaktiviran sa 0.3% TnBP/1% Triton x 100. Uljana ekstrakcija praćena je anjon-izmenjivačkom hromatografijom na Fractogel-u EMD TMAE (tentakularni gel dobijen od Merck, Darmstadt, Nemačka).

Bufer uslovi bili su kao sto sledi:

Bufer AM, prvi stepen ispiranja;

120 mM NaCI, 10 mM Na citrata, 120 mM glicina, 1mM CaCI2, pH 6.9-7.1; osmolalitet. 360-400 mosmol/kg.

Bufer BM, drugi stepen ispiranja:

235 mM NaCI, 10 mM Na citrata, 120mM glicina, 1 mM CaCI2, pH 6.9-7.1; osmolalitet: 570-610 mosmol/kg.

Bufer CM, elucija:

700 mM NaCI, 10 mM Na citrata, 120 mM glicina, 1mM CaCI2, pH 6.9-7.1; osmolalitet: 1380-1480 mosmol/kg.

Bufer DM, treći stepen ispiranja:

1.5 M NaCI.

Frakcije koje pokazuju vVVF/FVIII aktivnost podvrgnute su hromatografiji isključivanja u zavisnosti od veličine na Fractogel-u EMD Bio SEC (gel dobijen od Merck-a, Darmstadt, Nemačka). Posle ultra-/diaflitracije, na formulaciju se utiče sledećim sastavom: 400 mM NaCI, 10 mM Na citrata, 1 mM CaCI2, 133 mM glicina, 1% saharoze.

Ovo je praćeno sterilnom filtracijom. Preparat se puni u sudove i liofilizuje, što je praćeno tretmanom sa visokom temperaturom od 100°C. Tretman visokom temperaturom traje 120 minuta.

Slika 1 pokazuje stabilnost produkta dobijenog prema pronalasku kada se uporedi sa produktima pročišćenim samo anjon-izmenjivačkom hromatografijom. Posle anjon-izmenjivačke hromatografije, produkt je prema pronalasku, tretiran hromatografijom isključivanja u zavisnosi od veličine. Pronađeno je da produkt prema pronalasku još uvek ispoljava aktivnost od 80% posle skladištenja sa ili bez heparina u vodenom rastvoru na sobnoj temperaturi, dok produkti koji kod kojih nije primenjivana hromatografijom isključivanja u zavisnosi od veličine pokazuju aktivnost od samo 20% posle 7 dana.

Claims (14)

1. Postupak za pripremanje hemostatički aktivnog preparata koji sadrži von Willebrand-ov faktor (vWF) iz frakcije humane plazme,naznačen time,što se obavlja putem I. hromatografskog prečišćavanja plazma frakcije koja sadrži vVVF na anjon-izmenjivačkom materijalu koji ima anjon-izmenjivačke grupe na kalemljenim polimernim strukturama (tentakularni materijal), sakupljajući frakciju koja sadrži vVVF, praćeno II. prečišćavanjem pomenute frakcije korišćenjem hromatografije na molekularnim sitima za pripremu prečišćenog termalno stabilnog preparata koji sadrži vVVF; i III. preparat se u liofiliziranom stanju zagreje do temperature veće od 80°C radi inaktiviranja virusa.

2. Postupak u skladu sa zahtevom 1,naznačen time,što termalno stabilni preparat i zagrejani preparat prikazuje samo jedan pik u HPLC gel filtracionoj analizi.

3. Postupak u skladu sa zahtevom 2,naznačen time,što se preparat zagreva na temperaturi većoj od 90°C, naročito na 100°C.

4. Postupak u skladu sa zahtevom 2 ili 3,naznačen time,što se preparat zagreva bar 1 sat do 5 sati, preferencijalno 2-3 sata.

5. Postupak u skladu sa bilo kojim od zahteva 1 -4,naznačen time,što se frakcija dodatno prečišćava najmanje jednom adsorpcionom i/ili afinitetnom hromatografijom.

6. Postupak u skladu sa bilo kojim od zahteva 1 -5,naznačen time,što je pomenuto prečišćavanje pomoću hromatografije na molekularnim sitima obavljeno kao poslednja mera u prečišćavanju proteina.

7. Postupak u skladu sa bilo kojim od zahteva 1 -6,naznačen time,što se navedena frakcija prečišćava iz zalihe humane plazme.

8. Hemostatički aktivni preparat koji sadrži vVVF,naznačen time,što se može dobiti u skladu sa zahtevima od 1 do 7.

9. Preparat u skladu sa zahtevom 8,naznačen time,što pomenuti preparat ne sadrži nijedan infektivni virus koji se pojavljuje u krvi, naročito HIV, HBV, HCV, HAV i parvoviruse.

10. Preparat u skladu sa zahtevima 8 ili 9,naznačen time,što sadrži vVVF u obliku velike molekularne težine i pokazuje minimum 13 do 16 multimer traka posle elektroforetske analize.

11. Preparat u skladu sa bilo kojim od zahteva 8-10,naznačen time,što je odnos vVVF aktivnosti, merene kao ristocitin kofaktor spram vVVF antigena, najmanje 0,8.

12. Preparat u skladu sa bilo kojim od zahteva 8-11,naznačen time,što nadalje sadrži faktor VIII u prirodnom obliku.

13. Preparat u skladu sa bilo kojim od zahteva 8-12,naznačen time,što sadrži imunoglobuline, fibrinogen, fibronektin i inter-a-tripsin inhibitor na nivou nižem od limita imunohemijske detekcije.

14. Preparat u skladu sa bilo kojim od zahtev 8-13,naznačen time,što sadrži vVVF u prirodnoj formi i bez fragmenata.