RS50977B - Replikaciono defektni rnk-virusi kao vakcine - Google Patents

Abstract

Rekombinantni negativni lanac RNK-virusa koji sadrži virusni genom sa mutacijom u genu P, koja dovodi do gubljenja sposobnosti replikacije bez gubljenja sekundarne sposobnosti transkripcije.Prijava sadrži još 36 patentnih zahteva.

Description

[0001]Ovaj pronalazak se tiče transkripciono kompetentnog negativnog lanca RNK-virusa sa defektnom replikacijom, koji se može koristiti za ekspresiju prenosnih gena i specijalno za oblast razvoja vakcina.

[0002]Imunizacije živim vakcinama podržavaju prirodnu infekciju i izazivaju sveobuhvatan imuni odgovor. Prilikom vakcinacije se koriste oslabljeni virusi koji su ipak sposobni za umnožavanje. Umnožavanje virusa vakcine mora da usledi tako polako, daje time garantovan imunološki odgovor a time i kontrola umnožavanja odnosno eliminacije virusa. Koncept živih vakcina se mnogostruko dokazao kod različitih starosnih grupa. U svakom slučaju postoje važne ciljne grupe kod kojih su imunizacije živim vakcinama problematične i zahtevaju dodatne mere sigurnosti, antitela majke štite dojenčad u prvim mesecima života. Oni istovremeno predstavljaju barijeru koja kod živih imunizacija mora da se savlada, a da pri tome sa druge strane ne srne da dođe do prekomernog umnožavanja virusa vakcine i sa time povezanim štetnim dejstvima vakcinacije. Drugu ciljnu grupu predstavljaju stariji ljudi čiji imuni sistem više ne funkcioniše tako dobro, tako da vakcinacijom može doći do prevelikog opterećenja i šteta od vakcinacije usled povećanog umnožavanja virusa vakcine. Dakle, postoji problem, da se imunološki izuzetna živa vakcina načini još sigurnijom za primenu kod određenih ciljnih grupa ali isto tako da se poveća profil sigurnosti za opštu primenu.

[0003] Negativni lanac RNK-virusa, npr. kao kod virusa besnila ili sendai virusa (SeV), od pre nekoliko godina mogu da se ciljno usmereno menjaju reverznom tehnologijom gena. EP-A-0-702 085 opisuje produkciju rekombinantnih. infektivnih, replicirajućih nesegmentarnih negativnih lanaca RNK-virusa iz klonirane cDNK. EP-A-0-863-202 opisuje rekombinantni sendai virus, u čiji genom je insertiran heterologni gen ili izbrisan gen ili inaktiviran, čija je replikacija genoma ipak još intaktna.

[0004] Kao osnova vakcina posebno su pogodni RNK-virusi negativnog lanca, jer se njihovo umnožavanje u citoplazmi odvija na RNK-nivou i geni u okviru virusnog genoma mogu jednostavno da se razmenjuju. Tako je upra\o uspelo da se sa uspehom produkuju rekombinantni virusi sa površinom proteina različitih tipova virusa i da se upotrebe kao vakcine u eksperimentima sa životinjama (Schmiđt et. Al., J. Virol. 75 (2001), 4594-4603 i WO 01/42442). Rekombinantnom ugradnjom F- i HN-proteina humanog virusa parainfluence tip 3 (HPIV 3) i G- ili F-proteina respriatornog syncytial virusa (RSV) ujedan vektor na bazi goveđeg virusa parainfluence tip 3 (BPIV 3) mogao je posle aplikacije u hrčka da se dokaže imuni odgovor sluzokože na HPIV 3 i RSV. Na taj način je postignut bivalentni antigenitet ove žive vakcine testirane u eksperimentima na životinjama.

[0005]Radi uključivanja barijere vrste ovaj goveđi virus parainfluence sa humanim PIV 3 i RSV-površinskim genima treba za primenu u humanoj oblasti dovoljno da se razblaži. Reverzije u divlji tip se ne očekuju, jer su razmenjeni kompletni geni za virusne površinske proteine. Već se počelo sa kliničkim ispitivanjem vakcine.

[0006]Pošto su opisani mutanti virusa ipak replikaciono kompententni kod vakcinisanih sigurno dolazi do umnožavanja virusa, čiji intenzitet modifikacijom virusa doduše slabi, ali nije u potpunosti isključen. Jačina viremije koja se može očekivati, a time i opterećenje vakcinisanih sporednim pojavama, pri tome zavisi od individualnih faktora.

[0007]U okviru postojećeg pronalaska treba pokušati da se materijalno smanje ugrožavanja od vakcinacije živom vakcinom, posebno ugrožavanje vakcinisanih iz određenih ciljnih grupa.

[0008]Uz ovo postoji mogućnost potiskivanja replikacije virusnih genoma posle aplikacije vakcina. Na taj način nezavisno od imunološke sposobnosti vakcinisanog ne može doći do umnožavanja virusa i odgovarajućih šteta od vakcinisanja.

[0009]Kod ove mogućnosti postoji principijelna poteškoća da virusna RNK-polimeraza sprovodi dve funkcije, sintezu virusne iRNK i umnožavanje virusnih genoma. Ovo povezivanje mora da se otkloni u novim vakcinama, jer vakcina srne da bude u stanju samo još za sintezu virusnih iRNK.

[0010]Drugi problem postoji u tome da rekombinantni virus mora da izaziva efikasnu sintezu iRNK, kako bi uopšte bio pogodan kao živa vakcina. Time postoje dva principijelno protivrečna zahteva, koji daju mogućnost da se očekuju znatne poteškoće kod proizvodnje sigurnih, ali efikasnih živih vakcina na bazi negativnog lanca RNK-virusa.

[0011] Shoji et al. (Virology 318 (2004), 295-305) opisuju produkciju i karakterizaciju P-gena nepotpunog virusa besnila. Produkcija virusa sledi pomoću P-proteina eksprimiranih pomoćnih ćelija. Virusi su bez de novo-sinteze P-proteina sposobni samo za primarnu transkripciju. Minimalna virusna ekspresija gena pokazala se kao veoma slab signal za N-protein u imunofluorescenciji i kod samo malog broja ćelija, uverljivi dokaz ovih minimalnih virusnih ekspresija gena će biti izveden tek PCR-analizom. Korišćenje ovih virusnih mutanata u Challenge-eksperimentu na modelu miša treba da pokaže zaštitu, svakako nedostaje kontrolni eksperiment sa transkripciono aktivnim virusom i interval za virusne Challenge je odmeren suviše kratko. Trajanje takozvane zaštite se ne istražuje. Korišćenje takvih virusnih mutanata za razvoj razblažene vakcine protiv besnila na taj način izgleda odgovarajuće uspešno.

[0012]U okviru istraživanja koja treba da se sprovedu iz postojećeg pronalaska pronađeno je da se kod paramikso virusa na taj način može postići razdvajanje funkcija, replikacije i transkripcije, da se supstance polimeraze, koje su esencijalne za funkciju replikacije genoma, delimično odstranjuju. Pri tome se može raditi o virusnom proteinu P ili o specijalnom funkcionalnom domenu jednog takvog proteina.

[0013]Na iznenađujući način je pronađeno da se mutacijama, kod kojih funkcija proteina kodiranih od virusog gena P nije jasna, već delimično izbrisana, mogu produkovati RNK-virusi sa defektnom replikacijom, koji poseduju dovoljnu funkciju transkripcije da bi bili pogodni za produkciju živih vakcina.

[0014]Predmet ovog pronalaska je time rekombinantni negativni lanac RNK virusa, koji je replikaciono nepotpun i transkripciono kompetentan. Virus prema pronalasku sadrži virusni genom sa mutacijom u genu P, pri čemu mutacija vodi gubitku replikacije genoma bez gubitka sekundarne sposobnosti transkripcije.

[0015] Virus je prema pronalasku uslov za proizvodnju živih vakcina, posebno za proizvodnju živih vakcina sa povećanim profilom sigurnosti, koja je specijalno pogodna za primenu kod rizičnih pacijenata sa slabim ili oštećenim imunim sistemom.

[0016]Pronalazak se odnosi takođe i na nukleokapside rekombinantnog virusa, obuhvatajući virusni negativni lanac RNK, kompleksnim proteinima N, L i P kao i negativni lanac RNK rekombinantnog virusa u izolovanoj formi.

[0017]Drugi predmet pronalaska je cDNK, koja za negativni lanac RNK prema pronalasku, kodira posebnu virusnu RNK ili/i uz to komplementarnu RNK.

[0018]Još jedan predmet pronalaska je ćelijska linija za umnožavanje rekombinantnog negativnog lanca RNK-virusa prema pronalasku.

[0019]Rekombinantni negativni lanac RNK-virusa prema pronalasku se može dobiti mutacijom početnog virusa li genu P. Početni virus može biti prirodni negativni lanac RNK-virusa, posebno iz familijaparamy. xoviridaeilirhahdoviridaeili rekombinantne varijante istih. Posebno povoljni predstavnici su paramikso virusi, npr. sendai virus, humani ili goveđi virus parainfluence, npr. humani virus parainfluence (hPIV) tip 1.2.3,4a ili 4b. Newcastle Disease-virus, virus zauški. virus malih boginja (morbila) ili humani respiratorni svnctial virus (hRSV) ili rabdo virusa, npr. virus vezikularnog stomatitisa (VSV). Posebno povoljan virus je sendai virus, npr. Stamm Fushimi (ATCC VRI 05). Dalje su pronalaskom obuhvaćeni i rekombinantne varijante prethodno pomenutih virusa, kao što su npr. opisani u EP-A 702 085, EP-A 863 202 iuli WO 01/42445.

[0020]Drugi povoljan negativni lanac RNK-virusa su predstavnicirhabdoviridae, filoviridae, bomaviridae, arenaviridaeilibunyaviridae,npr. VSV

[0021]Sendai virus je - isto kao i drugi paramikso virusi - virus sa omotačem sa heliksnim nukleokapsidom (slika 1). Omotač se sastoji od lipidne membrane, koja potiče od plazma membrane ćelije domaćina, iz koje je oslobođen virus. U virusnom omotaču su usidreni transmembranski glikoproteini, naime, fuzioni protein (F) i hemoaglutinin-neuramidaza (HN). Matični protein (M) oblaže unutrašnju stranu membrane. Nukleokapsid koji se sadrži u omotaču sastoji se od pojedinačnog lanca RNK u kompleksu sa nukleoproteinom (N), pri čemu je po 6 nukleotida RNK vezano jednim N-proteinom, RNK-polimerazom (L) zavisnoj od RNK i kofaktorom fosfoproteina (P).

[0022]Negativni lanac RNK-genoma sendai virusa sadrži gene 6 strukturnih proteina u redosledu: 3'-N-P/C-M-F-HN-L-5' (slika 2). P/C-gen kodira za ukupno 8 proteina, strukturni fosfoprotein i sve ostale do sada poznate nestrukturne proteine.

[0023]Proteini P, N i L su bitni za funkcionalu transkripciju i replikaciju (Lamb rt. Al., Paramyxoviridae; The Viruses and their Replication. Fields Virology, 4. Izdanje (2001), Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, 1305-1340).

[0024]Rekombinantni negativni lanac RNK-virusa prema pronalasku sadrži mutaciju u genu P. Mutacija u genu P može biti delecija, supstitucija ili/i insercija, koja izaziva nepotpunu replikaciju virusa, koja ipak ne uništava sposobnost za transkripciju. Mutacija se odnosi pre svega na delimičnu sekvencu proteina koji je kodirao gen P, koji je neophodan za replikaciju, dok druge, za transkripciju neophodne delimične sekvence, ostaju funkcionalne.

[0025]Rekombinantni virus u pronalasku ukazuje na mutaciju u genu P i to u N-terminalnoj delimičnoj sekvenci gena P. Mutacija se odnosi pre svega na područje aminokiselina 33-41 proteina P, koje su bitne za sposobnost replikacije. Dalje je povoljno, da C-terminalno područje (od aminokisleine 320) nema mutacije koje su ugrožene funkcijom transkripcije. Posebno je povoljna mutacija, vodeća mutacija za gubitak sposobnosti replikacije u području aminokiselina 2-77, na primer delecija (a) proteina aminokiselina 2-77 kodiranog od strane gena P ili (b) delimične sekvence koja vodi gubitku sposobnosti replikacije dovoljno delimičnih sekvenci iz (a). Odgovarajuće mutacije mogu da uslede i u P-proteinima drugih negativnih lanaca RNK-virusa, npr. drugih paramikso virusa, npr. hPIV3.

[0026] Rekombinantni virus prema pronalasku je replikaciono defektan i transkripciono kompetentan. Gubitak sposobnosti replikacije znači da u jednoj ciljanoj ćeliji (jednoj ćeliji, koja ne stavlja na raspolaganje mutacijom izgubljene funkcijein trans)nije pronađeno umnožavanje virusnog genoma koje se može dokazati, pri čemu za razliku u odnosu na smanjenu odn. kondicionalnu nepotpunu replikaciju isto tako ne postoje permisivni uslovi, pod kojima može da se odvija replikacija. Određivanje gubitka sposobnosti replikacije može da usledi kako je opisano u primeru 8. Virus prema pronalasku je ipak u stanju da posle infekcije" u ciljanoj ćeliji transkribuje genprodukte koje je kodirao, tako da može uslediti ekspresija virusnih proteina uključujući jedan ili više heterolognih genprodukata u ciljanoj ćeliji. Bitno je da rekombinantni virus prema pronalasku poseduje sposobnost za sekundarnu transkripciju , tj. da virusni genprodukti, koji nastaju primarnom transkripcijom sa komponentama proteina koje su se prvobitno sadržale u nukleokpasidu, su u stanju da sami izazovu sekundarnu transkripciju ili/i da je podrže. Obim sekundarne transkripcije pri tome vodi sintezi proteina od prvenstveno minimum 1 %, minimum 2 %, minimum 3 %, minimum 4 % ili minimum 5 % u odnosu na odgovarajući soj divljeg virusa, tj. u odnosu na virus bez mutacije u genu P. Sposobnost za sekundarnu transkripciju može u odnosu na odgovarajući soj divljeg virusa da bude umanjena, pre svega najviše za faktor 20, posebno povoljno maksimalno za faktor 10. Sposobnost za sekundarnu transkripciju može kao u primeru 7.1 ili/i 7.3 kvantitativnim određivanjem ekspresije da ustanovi heterologni genprodukt, npr. informacioni protein.

[0027] Pored mutacije rekombinantni virus prema pronalasku sadrži prvenstveno minimum jedan prenosni gen, tj. minimum jednu kodiranu sekvencu za heterologni genprodukt. Heterologni genprodukt može biti protein, na primer informacioni protein, npr. fluorescentni protein kao što je GFP ili njegov derivat, ili antigen, na koji treba da se produkuje imuni odgovor, ili terapeutski protein, npr. protein za viroterapiju ili takođe funkcionalni RNK-molekul, npr. antisenze RNK, ribocim ili siRNK-molekul sposobasn za RNK-interferenciju. Povoljan je heterologni genprodukt jedan antigen, koji potiče od patogena, kao stoje virus, od bakterije ili gljivice ili protozoa, antigen tumora ili autoantigen. Posebno povoljan antigen je jedan virusni antigen, koji potiče od heterolognog negativnog lanca RNK-virusa. kao što je humani virus parainfluence ili RSC, npr. hP!V3 i UN odn. hRSV F i G. Virus prema pronalasku može da sadrži jednu ili više, npr. dve ili 3 za heterologni genprodukt kodirajuće sekvence.

[0028]Za heterologne genprodukte kodirajuće sekvence mogu da se umetnu u genom rekombinantnog virusa. Sa druge strane homologni genprodukti kodirajućih sekvenci mogu npr. geni F ili/i FIN, da budu takođe substituirane sekvencama, koje kodiraju za heterologne genprodukte, npr. himerne genprodukte. Takođe su moguće kombinacije umetnutih i substituiranih prenosnih gena.

[0029]Tako na primer sekvence sendai virusa mogu delimično ili potpuno da se zamene heterelognim sekvencama drugih negativnih lanaca RNK-virusa, npr. sekvencama virusa parainfluence, npr. hPIV3, ili/i sekvencama RSV. Posebno povoljno se primenjuju himerne sekvence, tj. sekvence, koje se sastoje od segmenata genoma baznog virusa i od segmenata genoma heterlognog virusa. Na primer himerni geni F ili/i HN mogu da se koriste u genomu virusa, koji se sastoje od sekvenci genom baznog virusa, npr. sendai virusa i od heterolognih sekvenci, npr. iz humanih virusa parainfluence kao stoje hPIV3, ili/i RSV.

[0030]Rekombinantni virus može da sadrži jedan ili više različitih prenosnih gena. Ako postoji više prenosnih gena, isti mogu da imaju isto ili različito poreklo, koji npr. mogu da potiču iz jednog jedinog ili više patogena, npr. virusa. Tako prenosni geni mogu da postoje iz više, npr. 2 ili 3 različita patogena, pre svega virusa, posebno povoljnog negativnog lanca RNK-virusa.

[0031]Ugradnja prenosnih gena u paramikso viruse je na primer opisana kod Hasan et. Al.

(J. Gen. Virol. 78 (1997), 2813-2820), Bukrevev et al., (J. Virol. 70 (1996), 6634-6641), Yu et al. (Genes Cells 2 (1997), 457-466), Masaki et al. (FASEBVB J. 15 (2001), 12945-1296), Shiotani et.al. (Gene Therapy 8 (2001), 1043-1050 i Bitzer et al. (Mol. Therapy 7 (2003), 210-217). Prenosni geni se prvenstveno inseriraju u 3'-područje virusnog genoma. Insercija se na primer vrši u formi transkripcionih kaseta, pri čemu na nivou vektora (tj. na nivou vektora, npr. plazmid-vektora, koji kodira za negativni lanac RNK) direktno prema lider-području nanosi jedna ili više transkripcionih kaseta sa singularnim restriktivnim sistemima povezivanja za integraciju čitačkih okvira. Integracija više prenosnih gena sledi pre svega u nezavisnim transkripcionim kasetama. Jedna transkripciona kaseta sadrži pre svega sekvencu koja kodira za heterologni genprodukt u operativnom povezivanju sa jednom transkripcionom startnom sekvencom ijednom transkripcionom terminalnom sekvencom i pre svega signalima prenošenja.

[0032] Drugi predmet postojećeg pronalaska je pojedinačni lanac ili dvostruki lanac DNK-molekula, npr. jedan cDNK-molekul, koji kodira za rekombinantni negativni lanac RNK-virusnog genoma prema pronalasku ili prvi stadijum istog ili virus-atigenom ili prvi stadijum istog. Pojam „prvi stadijum" znači u ovoj povezanosti da DNK-molekul ne sadrži sekvencu koja kodira za heterologni genprodukt, već samo mesto kloniranja za uvođenje jedne takve sekvence. Mesto kloniranja može biti restriktivni sistem povezivanja, na primer singularni ili nesingularni sistem povezivanja u DNK ili multiple mesto kloniranja, sadržavajući više restriktivnih sistema povezivanja koji slede jedan za drugim, pre svega singularni restriktivni sistemi povezivanja. Za virusni genom ili/i komplementarnu sekvencu u operativnom povezivanju sa pogodnim ekspresionim kontrolnim sekvencama postoji kodirajući DNK-molekul.

[0033] DNK-molekul je prvenstveno vektor, na primer plazmid-vektor, koji je pogodan za umnožavanje u pogodnoj ćeliji domaćinu, tj. u nekoj vektor ili plazmid ćeliji za umnožavanje, pre svega u prokariotskoj ćeliji, ali takođe i u eukariotskoj ćeliji, posebno u ćeliji sisara, pogodan je i za ovo neophodne genetske elemente, kao što je prednost replikacije, sekvenca integracije ili/i selekcione marker sekvence.

[0034] DNK-molekul sadrži u sebi kodirajuću sekvencu za rekombinantni virus ili komplementarnu sekvencu, pre svega pod kontrolom transkripcionog signala, tako da transkripcija sa DNK-zavisnom RNK-polimerazom može biti oblikovana u jednoj ćeliji domaćinu pogodnoj za produkciju virusa, tj. u ćeliji koja produkuje virus, koja može oblikovati negativni lanac RNK. Transkripcioni signal se bira tako da u primenjenoj ćeliji domaćinu omogućava efikasnu transkripciju DNK. U tu svrhu se može upotrebiti i ćelija heterolognog transkripcionog signala npr. promotor bakteriofaga, kao T7- ili SP6-promotor (aktivator), pri čemu ćelija koja produkuje virus onda u sebi mora da sadrži odgovarajuću heterolognu RNK-polimerazu zavisnu od DNK npr. T7- ili SPS-RNK-polimerazu, koja izaziva transkripciju. Dalje DNK-molekul sadrži u sebi pored transkripcionog signala pre svega na 3'-kraju za rekombinantni virus kodirajuće sekvence transkripcioni terminator i ribocim sekvencu, koja omogućava cepanje transkripta na kraju virusne sekvence. Ćelija koja produkuje virus je pre svega eukariotska ćelija, a posebno ćelija sisara.

[0035] Pored kodirajuće DNK za replikaciono defektni paramikso virus ćelija koja produkuje viruse prema pronalasku na osnovu toga u sebi sadrži sekvence pomagača, čiji genprodukti omogućavaju sakupljanjein transprema pronalasku rekombinantnih RNK-virusa. U tu svrhu ćelija može, npr. da sadrži jedan ili više vektora . kojiin transstavljaju na raspolaganje N-protein. P-protein ili/i L-protein. Time se omogućava skupljanje nukleokapsida prema pronalasku rekombinantnog virusa u produkcionoj ćeliji.

[0036] Umnožavanje rekombinantnog virusa sakupljenog inicijalno u ćeliji koja produkuje virus sledi u ćeliji za umnožavanje virusa, koja je inficirana virusom prema pronalasku. Ćelija za umnožavanje virusa u sebi dodatno sadrži sekvence pomagača kako je gore pomenuto, radi o stavljanja na raspolaganje N-proteina, ili/i P proteinain trans.Pre svega se koristi ćelija za umnožavanje virusa, u kojoj se vrši stabilna ekspresija sekvenci pomagača, npr. genomskom integracijom. Ćelija za umnožavanje virusa je pre svega ćelija sisara. Posebno pogodna ćelija za umnožavanje je od 293-ćelije, jednog humanog embrionalnog fibroblastnog-lanca bubrežnih ćelija izvedena ćelija H29 ili od toga izvedena ćelija. Ćelija H29 je 05.11.2004.

(DSM ACC 2702) deponovana prema odrednicama Budimpeštanskog ugovora kod Deutschen Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschvveig, Maschorder Weg. Dalje su takođe pogodne Vero-ćelije, izvedene od lanaca bubrežnih ćelija afričkih zelenih majmuna, ili ćelije izvedene od LLCMK2-ćelija, lanac bubrežnih ćelija rezus majmuna, koje su stabilno transficirane odgovarajućim sekvencama pomagača, npr. SeV N i P-genima.

[0037]Dalji predmet pronalaska je stoga ćelija, pre svega eukariotska ćelija i posebno pogodna ćelija sisara, koja (i) u sebi sadrži DNK-molekul, koji kodira za genom prema pronalasku rekombinantnog virusa ili/i komplementarnu sekvencu istog ili prvi stadijum istog, ili/i (ii) sadrži RNK-genom virusa prema pronalasku. Ćelija može, kako je pre toga objašnjeno, da bude vektor-ćelija umnožavanja, ćelija koja produkuje virus ili ćelija za umnožavanje virusa.

[0038]Ako je ćelija vektor-ćelija umnožavanja, npr. plazmid-ćelija umnožavanja, može se za umnožavanje odgovarajućeg vektora upotrebiti pogodna ćelija po želji, npr. i prokariotska ćelija kao što je transformisana E. coli ćelija.

[0039]Ako je ćelija produkciona ćelija virusa ili ćelija za umnožavanje virusa, onda ona u sebi sadrži proteine virusa N, P ili/i Lin trans.DNK koja je uvedena u ćeliju koja produkuje virus pre svega stoji pod kontrolom heterolognog transkripcionog signala, pri čemu ćelija na pogodan način i nadalje sadrži DNK, koja kodira heterlognu RNK-polimerazu zavisnu od DNK, koja prepoznaje hetereologni transkripcioni signal i izaziva transkripciju za rekombinantni negatvini lanac RNK-virusa kodirajuću DNK.

[0040] Ako je ćelija ćelija za umnožavanje virusa, onda je ona inficirana genomskim virusnim RNK-molekulom, npr. u obliku nukleokapsida i u sebi sadrži sekvence pomagača u stabilnoj formi koja se može iskazati.

[0041]Još jedan drugi predmet postojećeg pronalaska je postupak za produkciju prema pronalasku rekombinantnog negativnog lanca RNK-virusa, obuhvatajući faze: (a) stavljanje na raspolaganje jedne ćelije koja produkuje virus, koja je transficirana DNK-molekulom, koji kodira za genom negativnog lanca RNK-virusa, sadržavajući u sebi mutacije u genu P, koji vodi gubitku sposobnosti replikacije genoma bez gubitka sposobnosti transkripcije i ako je potrebno minimum jednu za heterologni genprodukt kodirajuću skevencu, i (b) kultivisanje ćelije domaćina pod uslovima daje transkripcija DNK-molekula usledila prema (a), a rekombinantni negativni lanac RNK-virusa inicijalno oblikovan. Ćelija domaćin je pre svega u stanju da N-protein, P-protein i/ili L-proteinin transstavi na raspolaganje, npr. transfekcija odgovarajućim pomoćnim plazmidima, koji u sebi sadrže za proteine N, P ili/i L kodirajuće sekvence.

[0042]Za produkciju većih količina nukleokapsida odn. virusnih čestica se pre svega koristi jedna ćelija, koja konstitutivno ili indukativno stabilno eksprimira proteine N, + ili/i P, pre svega barem protein P negativnog lanca RNK-virusa. Pronalazak se tako odnosi i na postupak za umnožavanje prema pronalasku rekombinantnog negativnog lanca RNK-virusa, obuhvatajući faze: (a) stavljanje na raspolaganje jedne ćelije za umnožavanje virusa, koja je inficirana genomom negativnog lanca RNK-virusa, sadržavajući mutaciju u genu P, koja vodi gubitku sposobnosti replikacije genoma bez gubitka sposobnosti transkripcije i ako je potrebno minimum jednu za heterologni genprodukt kodirajuću skevencu, i (b) kultivisanje ćelije domaćina pod uslovima da se vrši umnožavanje virusa.

[0043]Još jedan drugi predmet postojećeg pronalaska je farmaceutski sastav, koji rekombinantni, replikaciono defektni i transkripciono kompententni negativni lanac RNK-virusa, kako je napred navedeno, ili čiji nukleokapsid u sebi sadrži kao aktivnu supstancu kao i po mogućstvu kao farmaceutski uobičajene nosioce materije ili/i pomoćne materije. Farmaceutski sastav je pogodan za primenu u humanoj i veterinarskoj medicini. On se posebno može primeniti kao cepivo ili terapija protiv tumora, posebno kod pacijenata sa rizikom , kao što su deca, starije osobe ili/i osobe sa oštećenim ili oslabljenim imunim sistemom. Farmaceutski sastav pri tome može u sebi može da sadrži negativni lanac RNK-virusa u njegovom nativnom virusnom omotaču.

[0044]Posebno je povoljna primena kao cepiva, npr. kao cepivo protiv uzročnika bolesti, kao što su virusi, bakterije ili protozoe. Ako rekombinantni virus u sebi sadrži prenosni gen ili više prenosnih gena istog porekla, npr. iz jednog jedinog uzročnika bolesti, onda se radi o monovalnentnoj vakcini . Ako rekombinantni virus sadrži prenosne gene različitog porekla, onda se može upotrebiti kao polivalentna vakcina, npr. kao bivalnenta ili trivalentna vakcina. Na primer polivalentna vakcina može da se proizvede protiv više patogenih virusa, npr. protiv više patogenih negativnih lanaca RNK- virusa, kao što je humani virus parainfluence i RSV.

[0045]Cepivo prema pronalasku je u stanju da aktivira humoralni imuni odgovor, pre svega stvaranje novosintetisanih antitela. ili/i imuni odgovor T-ćelije. Posebno povoljno se aktiviraju humoralni imuni odgovor i imuni odgovor T-ćelije.

[0046] Farmaceutski sastav može da postoji u obliku rastvora, suspenzije, liofilizata ili u nekom drugom pogodnom obliku. Pored aktivne supstance sastav u sebi može da sadrži sredstvo za podešavanje pH-vrednosti, pufer, sredstvo za podešavanje toniciteta, sredstvo za umrežavanje i tome slično, kao i sredstva za pojačavanje dejstva. Davanje može da se vrši uobičajenim putem, npr. oralno, lokalno, nazalno, pulmonalno itd. u obliku aerosola, tečnosti, praha itd. Pri tome se pacijentima daju terapijski aktivne doze virusa, pri čemu ove doze zavise od primene (npr. terapije virusima ili vakcinama) od vrste oboljenja, zdravstvenog stanja i težine pacijenata, vrste davanja i formulacije itd. Uobičajeno se daje po aplikaciji IO<3>do IO7 čestica virusa, posebno povoljno oko IO<4>do 10<6>virusnih čestica. Ako je potrebno mogu se davati zajedno više različitih čestica virusa, npr. u slučaju kombinacije cepiva. Davanje može, u zavisnosti od potrebe, da se vrši jedanput ili više puta.

[0047] Povoljna područja primene su npr. preventiva, odn. terapija respiratornih virusnih oboljenja.

[0048] Dalje pronalazak treba da se objasni sledećim slikama i primerima.

Primeri

1. Opšte

[0049] Slika 1 pokazuje morfologiju jednog sendai virusa (SeV) prema Fields-u (Virologv. Lippincott, Williams i Wilkins (2001.) 4. Izdanje; modifikovano). Genom se sastoji od pojedinačnog lanca RNK, koji sa proteinima N, P i L postoje u obliku nukleokapsida. Nukleokapsid je okružen membranskim omotačem, u koji su uskladišteni proteini HN i F ( sastoji se od Fj- i F2- podjedinice). Sa unutrašnjom stranom membrane je povezan protein M, koji istovremeno postoji i u vezi sa komponentama nukleokapsida.

[0050] Pojedinačni lanac negativno orijentisanog RNK-genoma sendai virusa-divlji soj se sastoji od 15384 nukleotida. Geni 6 strukturnih proteina postoje na tome u redosledu 3'-N-P/C-M-F-HN-L-5' (slika 2). Između gena leže prelazi od 50-80 nukleotida, koji sadrže veoma konzervativni region od 22 nukleotida; signal terminacije prethodnog gena, intergensku sekvencu i startni signal za sledeći gen. Jedinica iz startnog signala, otvorenog čitačkog okvira (ORF), u datom slučaju netranslatirajućih regiona se označava kao transkripciona kaseta. Ispred N-gena se nalazi 55 nukleotida dugačka lider-sekvenca (Id), koja transkribuje, u svakom slučaju ne translatira. Iza L-gena se nalazi 54 nukleotida duga trejler sekvenca (tr). Id i tr-.region ima funkciju genomskog i antigenomskog informatora za replikaciju genoma odn. antigenoma. Transkripcijom stvoreni iRNK-molekuli su sa izuzetkom P/C-RNK monocistronični.

[0051] Ciklus umnožavanja sendai virusa obuhvata ulazak u ćeliju domaćina, transkripciju i translaciju kao i replikaciju i sazrevanje virusa sa oslobađanjem novo produkovanih virusa posle toga. U procesu transkripcije posebno učestvuju proteini N, P i L, pri čemu je virusno PvNK-zavisna RNK -plimeraza predstavljena sa svim katalitičkim aktivnostima. Pošto genom sendai virusa postoji u orijentaciji negativnog lanca, virusna RNK ne može direktno da se prevede u proteine. Najpre sledi primarna transkripcija u iRNKs pomoću RNK-polimeraze, koja se unosi u ćeliju sjedinjena sa nukleokapsidom.

[0052] Slika 3 pokazuje šematski prikaz modusa transkripcije sendai virusa. Pri tome kompleks polimeraze, koji se sastoji od jednog L-proteina i jednog homotetramera iz P-proteina, putuje duž RNK upakovane sa proteinima u smeru 5'-kraja. Pri tome se genetska informacija očitava na genomskom negativnom lancu RNK i transkribuje u pozitivnom lancu iRNK.

[0053] Replikacija genoma obuhvata produkciju novih genoma virusa sa negativnim polaritetom. Ovde se najpre stvaraju antigenomi, koji onda služe kao matrice sa stvaranje genoma. Pošto transkripcija počinje na 3'-kraju genoma (ld) potrebno je prebacivanje modusa transkripcije u modus replikacije. Ovo prebacivanje određuje količina slobodnog N-proteina u ćeliji. Tek kada se stvori dovoljno N-proteina posle translacije iz iRNK-molekula, može da usledi replikacija. Posle toga antigenom, koji je ćelom svojom dužinom kompleksiran N-proteinima, ova matrica može da služi za produkciju drugih genoma. Iste se isto tako direktno pakuju sa N-proteinima . Za proces replikacije su opet odgovorni proteini N, P i L (slika 4).

[0054] Za vreme replikacije virusa se povećanjem broja iRNK-molekula sve više sintetišu virusni proteini. Onda se kompleksi iz virusne RNK i virusnih proteina (nukleokapsidi) transportuju u obliku sekrecionih vezikula do membrane citoplazme, gde dolazi do stvaranja omotača sa virusnim površinskim proteinima i bespolno umnožavanje virusnih čestica.

[0055] U okviru ovog pronalaska stavljaju se na raspolaganje rekombinantni mutanti virusa, kod kojih su odvojene funkcije transkripcije i replikacije. tj. virusi su transkripciono kompetentni, ali replikaciono defektni. Nedostajuća funkcija replikacije genoma mora da se kompenzira radi produkcije čestica virusa odn. njihovih nukleokapsida preko ćelija pomagača, kojein transkomplementiraju nedostajući ili funkcionalno defektni virusni protein. Jedna takva povoljna ćelija pomagač je lanac ćelija 1129 (Willenbrick i Ncubert. J. Virol. 69 (1994). 9413-8417). Ovaj lanac ćelija je u okviru postojeće prijave deponovan prema odrednicama Budimpeštanskog ugovora pod oznakom spisa DSM ACC2701 05,11.2004. Za produkciju replikaciono defektnih, ali transkripciono kompetentnih virusa kodirajući gen za P-protein nije u potpunosti odstranjen, već samo za replikaciju genoma esencijalni domen. Tako je bilo poznato iz ranijih radova (Curran, Virologv 221 (19969, 130-140; Curran et al. J. Virol. 69 (1995), 849-855), da se u jednomin vitrosistemu prilikom probe izostavljanja aminokiselina 2-77 proteina P inhibira replikacija genoma, dok virusna transkrpicija ostaje aktivna.

[0056] Slika 5 pokazuje šematski prikaz P-proteina sa njegovim N- i C-terminalnim domenima (PNT, PCT), domena tetrameriziranja (amino kiseline 320-446), P:L domena (amino kiseline 311-445) i P:RNP- domena vezivanja (amino kiseline 479-568). Za isključivanje virusne funkcije replikacije genoma uz istovremeno zadržavanje sposobnosti za virusnu iRNK-sintezu odabrano je izostavljanje prvih 77 amino kiselina proteina P. Pri tome je po prvi put produkovan odgovarajući mutant sendai virusa (SeV-PA2-77), kod koga je izostavljeno 5'-terminalno područje P-ORF. Od ovih virusa mogu da se kodiraju samo N-terminalni skraćeni P-proteini. Studije infekcija su pokazale, da mutanti virusa uz kultura ćelija nisu sposobni za umnožavanje. Pomoću lanca ćelija pomagača H 29 (DSM ACC2702), koji pored ostalog stavlja na raspolaganje P-protein-divljeg soja, umnožavanje može postići mutante virusa. Efikasnost umnožavanja virusa iznosi ca. 45 % u poređenju sa divljim sojem sendai-virusa.

[0057] Posle infekcije mutant virusa prema pronalasku je u stanju da u inficirnim ćelijama eksprimira virusno kodirane prenosne gene. Skraćeni protein P koga je na raspolaganje stavio mutant virusa dovoljno podržava sekundarnu virusnu iRNK-sintezu. Sinteza virusno kodiranih proteina se širi u inficiranim ćelijama više dana i u odnosu na divlji soj virusa je redukovan samo za faktor ca. 10, tako da se pri upotrebi mutanta kao vakcine sigurno može očekivati zadovoljavajući imuni odgovor.

2. Produkcija konstrukta za replikaciono defektne vektore sendai-virusa (SeVV)

2.1 Produkcija cDNK-nacrta pSeV-X

[0058] U 3'-oblast SeV, Stamm Fushimi (ATCC VR105) ubačena je kodirajuća transkripciona kaseta. Kod svih manipulacija genoma mora se obavezno voditi računa da ukupan broj nukleotida rekombinantnog SeV genoma bude deljiv sa šest(„ rule of six").

[0059] Polazeći od toga da je kao matrica upotrebljena cDNK pSeV stavljena su na raspolaganje dva PCR-fragmenta PCR X i PCR X II za produkciju pSeV-X (slika 6).

[0060] PCR X (370 bp) sastoji se od sekvence T7-aktivatora (T7-Prom), lider (ld)-sekvence,

N-startnog gena sa 5'NTR do ispred StartCodon N-ORF-a (Open Reading Frame). Preko reverznog-prajmera-a XI (+) (tabela 3) su dodati singularni M?r/-restrikcioni sistem povezivanja i 24 nukleotida N-gen sekvence zaustavljanja. 24 nukleotida N-gen sekvence zaustavljanja PCR XI, ubačene pomoću mutagenih prajmera XI (+), služe u fazi fuzije koja nakon toga sledi kao područje koje se preklapa sa PCR XII.

[0061] PCR XII (970 bp) sastoji se od sekvence N-početnog gena i prve trećine N-ORF.

Preko forward- praimerXII postavljena je sekvenca 3'-NTR N -a i sekvenca zaustavljanja

gena od N, kao i intergeni region (IR). Reverzni prajmer XII (+) povezuje u prvoj trećini M-ORF-a odmah iza SeV genoma singularne>S/?/?/-sisteme povezivanja. Amplikon PCR XI je u 3'-području bio komplementaran sa 5-područjem PCR-a XII. Pomoću ova dva preklapajuća područja mogla su da se fuzionišu oba fragmenta PCR XI i XII. Posle izvršenog PCR mogao je produkt fuzije (1310 bp) da se restrikcionim cepanjem sa enzimimaMluliSphlubace u isto tako saMluliSphltretiranim vektorom pSeV. Iz dobijenih klona je pomoću plazmid-pripreme izolovan plazmid-DNK i restriktivnom analizom i sekvenciranjem ispitan na korektnu insereiju transkripcione kasete. Time je cDNK konstrukt pSeV-X bio na raspolaganju.

[0062] Da bi se produkcija rekombinantnih virusa mogla lako da prati sada je gen za

enhancedgreen jluorescentprotein(eGFP) ubačen u praznu kasetu pSeV-X-a. eGFP-ORF je proširen sa PCR iz ekspresionog plazmida pEGFP-Nl (Fa. Clonrech), pri čemu mutagenim prajmerom postignuto održavanje„ rule of sixlii dodavanje dva propratna A/b//-sistema povezivanja Nastali 771 bp veliki PCR-fragment je cepan restrikcionim enzimom a 738 bp veliki fragment izolovan gel-ispiranjem, koji je preko iVo/V-sistema povezivanja pSeV-X postavljen u njegovu „praznu" transkripcionu kasetu. Posle transformacijeE. coli,plazmid-priprema i sekvenciranje nakon toga preko PCR ubačenog eGFP-čitačkog okvira na raspolaganju je bio cDNK konstrukt pSeV-eGFP.

2.2 Produkcija cDNK-konstrukta pSeV-X-X

[0063] Preko konstrukta pSeV-X-X trebalo bi da budu date na raspolaganje dve dodatne

transkripcione kasete, u koje mogu da se ugrade dva prenosna gena. Primena pSeV-X-X kao osnovnog vektora za produkciju replikaciono defektnih vektora bi trebala da omogući, da se isključi vektor sa multivalnentnim. npr. trivalentnim. osobinama.

[0064]pSeV-X-X je proizveden preko PCR-reakcije, kod koje je pSeV-X služio kao šablon (slika 7). Prajmer XX-forward ukršten sa pSeV-X u području 7Vo/r-sistema povezivanja i 3'-NTR druge transkripcione kasete koju treba integrisati. Singularni Sg/viZ-restrikcioni sistem povezivanja je uveden pomoćuXX- forwardprajmera izmeđuNo/r-sistemapovezivanja i 3'-NTR. On služi kao singularni restrikcioni sistem povezivanja za kasniju inserciju ORF-a nekog prenosnog gena. U PCR-produktu XX slede zaustavni gen, intergeni region (IR), početni gen i 5'-NTR. Preko prajmera XX (+), koji je ukršten sa 5'-NTR, su ubačeni singularni restrikcioni sistemi povezivanjaFseliNru I. FseZ-sistempovezivanja služi za ugradnju ORF-a jednog drugog prenosnog gena. SingularniNru/-sistem povezivanja je unapred kloniran, kako bi mogao u slučaju potrebe da bude integrisan kao treća transkripciona kaseta. Prajmer XX (+) u 3'-području se ukršta sa sekvencom iVo/Z-sistema povezivanja pSeV-X-a. PCR-produkt XX (220 bp) je tretiran restrikcionim enzimomNotii izolovan je jedan fragment 144 bp gel-ekstrakcijom. Ovaj fragment, koncipiran uz pridržavanje„ rule of six",} Gmogao onda da se ugradi u plazmid pSeV-X koji je isto tako tretiranNotl- om.Posle provere korektne orijentacijeNotiPCR-fragmenta XX i verifikacije sekvence plazmid pSeV.X-X je bio spreman. U singularnim sistemima povezivanjaSgrAliFselse mogu integrisati prenosni geni po želji.

[0065] Za istraživanja na ovom radu obe transkripcione kasete (X) pSeV-X-X-a su bile opremljene čitačkim ramovima od dva različita fluorescentna proteina. Zajedanje čitački ram proširen za fluorescentni protein eGFP iz ekspresionog plazmida pEGFP-Nl PCR-reakcijom uz pridržavanje„ riđe of six",pri čemu su pomoću mutagenog prajmera postavljena dva pomoćna SgrAl-sistema povezivanja. Posle restrikcionog cepanja saSgrAli gel-ispiranjem mogao je da se ugradi oko 738 bp veliki fragment u prvu transkripcionu kasetu pSeV-X-X (pSeV-eGFP-X). Na isti način je za drugi ORF fluorescentnog proteina DsRed (iz plazmida „pDsRed", Fa. Clontech) uz pridržavanje„ rule of six"preko PCR-reakcije opremljen sa restrikcionim sistemima povezivanjaFsel,koji cepaju DNK, gel-ispiraju i ovaj fragment (702 bp) posle toga kloniraju u drugu transkripcionu kasetu sa 3'-područjem pSeV-eGFP-X-a. Nastaje genomski SeV cDNK konstrukt pSeV-eGFP-DsRed.

3.Produkcijareplikacionodefektnihvektora sendai virusa (SeVV)

[0066] Proizvedeni su cDNK konstrukti pSeVV-eGFP-AP, koji kodiraju za replikaciono defektne sendai viruse, u kojima je uklonjen gen za protein P. Uz to, uz pridržavanjerule ofsix jemorao da ukloni čitački ram gena P, pri čemu nekodirajuća transkripciona kaseta treba da ostane na odgovarajućoj poziciji (slika 8A).

[0067] Ugradnjom restrikcionog sistema povezivanja umesto uklonjenog ORF treba u cDNK konstruktu pSeVV-eGFP-AP da bude na raspolaganju za dalju upotrebu i dalje funkcionalna transkripciona kaseta, u koju u slučaju potrebe može da se umetne drugi prenosni gen.

[0068] Kao druga varijanta replikaciono defektnog SeVV produkovan je delecioni mutant pSeVV-eGFP-PA2-77, koji kodira za N-terminal skraćeni P protein, kome nedostaju amino kiseline 2 do 77 (slika 8B).

[0069] Kloniranje pSeVV-eGFP-AP će biti opširno opisano u sledećem stavu.

3.1 Kloniranje cDNK- konstrukta pSeVV-eGFP-AP i pSeVV-eGFP-PA2-77

[0070] ORF P-proteina je odstranjen iz cDNK konstrukta replikaciono kompententnog virusa pSeV-eGFP, kako bi se produkovala nova cDNK pSeVV-eGFP-AP, koja kodira za replikaciono defektne viruse. Umesto P-ORF umetnut je A7zo/-restriktivni sistem povezivanja.

[0071] Za kloniranje pSeVV-eGFP-AP su produkovana dva PCR-fragmenta po imenu PCR AP I i PCR AP II i posle toga su fuzionisani. Kao šablon za obe PCR-reakcije služio je pSeV-eGFP. Kod fragmenta PCR AP I (1272 bp) je preko/onvarfr-prajmera AP I (= N-578; tabela 3) postignuto ukrštanje sa šablonom u području N ORF ispred singularnogSphl- mesla. Reverzni- prajm& r API(+) se ukršta sa šablonom u 5'-NTR području P-gena do ispred ATG-kodona od P i tamo umeće restrikcioni sistem povezivanjaXliol.

[0072] Fragment PCR AP II se sastoji od 1938 bp, kao šablon i ovde služi pSeV.Fonvard-prajmer od PCR AP II (+) povezuje u ORF F gena iza singularnogEco47l\mesta i ima dodatno veštačko Mw/-mesto.

[0073] Oba PCR-fragmenta API i AP II su kombinovana preko Xhol-mesta, Produkt fuzije - sastoji se iz delimične sekvence N ORF-a, nekodirajuće P-transkripcione kasete sa umetnutim A7?o/-restrikcionim sistemom povezivanja, M kao i četvrtine F ORF-a -. je cepan sa restrikcionim enzimimaSphliMlul,međukloniran i sekventno verifikovan. Iz jednog subklona sa korektnom sekvencom je isečen 3006 bp velikiSphl- Eco41\ lfragment, koji je u identično tretiranom vektoru pSeV-eGFP potisnut u stranu. Odgovarajući pSeVV-eGFP-AP klon (genomska virusna cDNK) posle kontrole sekvence sada stoji spremna za produkciju replikaciono defektnog SeVV-eGFP-AP (slika 9).

[0074] Za konstrukciju delecionog mutanta pSeVV-eGFP-P02-77 korišćen je PCR sa mutagenim prajmerima.Fonvard prajmer . MolPA2-77"' u sebi sadrži A7vo/-mesto, koje sledi ATG-startni kodon kao i kodoni za amino kiseline 78 do 86 P proteina. Reverzni prajmer „PA2-77 (+)XhoFsadrži u sebi zadnjih 10 kodona P proteina i jednoXhol- mesto.Čitački ram N-terminala za 76 aminokislena skraćnog P-proteina je proizveden pomoću PCR, na osnovu šablona pSeV, uz pridržavanjerule of six.Xhol-cepani, 1488 bp veliki fragment je umetnut preko dve faze kloniranja u nekodirajući transkripcionu kasetu pSeVV-eGFP-AP na poziciju prvobitnog P-ORF. Posle provere sekvence bio je takođe spreman genomski cDNK klon za produkciju replikacioni defektnog SeVV-eGFP-P A2-77.

[0075]Izostavljanje kodona 2 do 77 u P ORF ima za posledicu, da je slučaju nestrukturnih proteina skraćen i N-terminal V i W proteina, a da od C-familije je još samo C - isto tako zamenjeh - ostao kodirajući; proteini C, Yl i Y2 na osnovu nedostajućeg startnog kodona više ne može da prevodi skraćena iRNK.

[0076]Sekvence prajmera za kloniranje pSeVV-eGFP-AP su specificirani u specifikaciji primenjenih DNK-oligonukeotida(tabela3). Proizvedeni PCR-produkti PCR I i PCR II su fuzionisani i pomoću foravvard-prajmera od PCR I i reverznog-prajmera od PCR II prošireni. Posle toga su PCR-produkti fuzije cepani restrikcionim enzimima, koji u pSeV-eGFP uspevaju singularno i koji dozvoljavaju inserciju odgovarajućeg produkta fuzije u pSeV-eGFP (npr.Narlkod kloniranja pSeVV-eGFP-AN, vidi tabelu 1). Pročišćeni produkt cepanja je umetnut preko utiskivanja u, isto tako sa odgovarajućim enzimima svarenim, vektor pSeV-eGFP.

[0077]E. colićelije su jednim delom nastavkom ligacije transformisane, a plazmid-DNK izolovao dobijene klone preko plazmid-mini-pripreme. Posle provere korektne sekvence restrikcionom analizom i sekvenciranjem je od pozitivnog klona napravljena je plazmid-priprema (DNK Maci Prep-Kit, Qiagen), i tako je bio spreman pSeVV-eGFP-AP za produkciju rekombinantnih delicionih mutanata.

4. Produkcija replikaciono defektnih mutanata virusa

[0078] Iz cDNK su proizvedeni konstrukti pSeVV-eGFP-AP u kulturi ćelija replikaciono defektnih SeV-vektora (SeVV-eGFP-AX).

4.1 Inicijalna produkcija SeVV-VV-eGFP-AP

[0079] Za produkciju rekombinantnih SeV sa potpunim genomom će

ili linija ćelija „BSR-T7", koje T7 RNK-polimerazu stabilno eksprimiraju /Buchholz et al:

(1999) J.Virol. 73,251-259)

ili kulture ćelija biti inficirane sa rekombinantnim Vaccina-virusom MVA-T7, koji T7

RNK-polimerazu eksprimiraju (Sutter et al. (1995) FEBS 371, 9-12), i

transficirane sa cDNK virusnog genoma (pSeV) kao i plazmid-kodirajućim genima N, P i L (pTM-N-P,L; Elroy-Stein et al. (1989) PNAS 86, 6126-6130). T7-polimeraza transkribuje sada virusni antigenom ili/i komplementarnu sekvencu i gene N, P i L. Preko pTM-N eksprimiran N-protein pakuje sintetizovanu virusnu antigenomsku ili/i komplementarnu DNK, a ovaj nukleokapsid-Core (RNP) čini zajedno sa proteinima P i L replikacioni kompleks preko koga se opet produkuje genomska RNK i može da pakuje u nukleokapside (Levrer et al., J. Virol. Meth. 75 (1998), 47-55). U nastavku sledi transkripcija svih virusnokodiranih proteina i replikacija ostalih virusnih genoma (slika 10).

[0080] Za razliku od opisane produkcije rekombinantnih SeV vvt sa potpunim genomom u plazmid-kodiranoj cDNK od pSeVV-eGFP-AP nedostaje genetska informacija za gen P. Usled toga su inicijalno produkovani nukleokapsidi samo u stanju da eksprimiraju gene N i L. Količina nedostajućih proteina potrebna za umnožavanje ScVV-eGFP-AP nukleokapsida zbog toga mora da isključivo preko ekspresije upravljane preko T7-promotora da stavi na raspolaganje plazmid-kodirani gen P.

[0081] Produkcija replikaciono defektnog SeVV-eGFP-AP je usledila analogno prema produkciji replikaciono kompetentnih SeV varijanti u HeLa-ćelijama (ATCC CCL2) ili BSR-T7-ćelijama. Posle 48-časovne inkubacije HeLa-ćelija analizirano je da li su virusne čestice SeVV-eGFP-AP predate ostacima kulture i koliko je nastalo inicijalno delecionih mutanata.

4.2 Detekcija inicijalno produkovanog SeVV-eGFP-AP

[0082]Ostaci HeLa-ćelija ili BSR-T7-ćelija, u kojima je trebalo da bude inicijalno produkovan SeVV-eGFP-A, ispitane su na prisustvo ovih virusnih vektora. SeVV-eGFP-AP je naprotiv integrisan u rekombinantni SeV wt, u 3'-području informacionog gena za eGFP. Ovaj detekcioni marker je sada primenjen da bi se analiziralo kako su oblikovni mnogi SeVV-eGFP-AP.

[0083]U paralelnim nastavcima su 5xl0<5>vero-ćelije (ATCC CCL18) ko-inficirane sa 1 ml ostatka kulture ćelija kod inicijalne produkcije SeVV-eGFP-AP transficiranih HeLa-ćelija i istovremeno sa SeV wt (MOI = 3) za transkomplementaciju nedostajućeg proteina. Kao kontrola vero-ćelije su inficirane ili sa 1 ml inicijalno produkovanog SeV GFP ili takođe sa inicijalno produkovanim SeV-eGFP i istovremeno sa SeV wt (MOI = 3).

[0084]Rezultat ko-infekcije ćelija sa ostacima kulture produkcije SeVV-eGFPAP u SeV wt pokazuje da mutant virusa SeVV-eGFP-AP može inicijalno daoe produkuje i posle inicijalne produkcije je takođe u stanju da inficira ćelije, što se može detekiovati dokazivom eFGP-ekspresijom prenosnih gena. Inicijalno se mogu produkovati oko 13x10 SeV-eGFP, 3,2 x 10 SeVV-eGFP-AP virusnih mutanata.

5. Umnožavanje SeVV-eGFP-AP

[0085]Istraživano je, da li se vektori SeVV-eGFP-AP mogu umnožavati, tj. da li su biološki funkcionalni. Sposobnost replikacije bi trebala pre svega da bude istražena stavljanjem na raspolaganje proteina nedostajućeg gena P preko virusne transkoplementacije sa SeV.

5.1 Dokaz mogućnosti umnožavanjaSeVV-eGFP-AX

[0086]Najpre mora da se dokaže da su mutanti kod odgovarajuće transkomplementacije preko SeV wt virusa u stanju da se umnožavaju i da pri tom inficiraju okolne ćelije. Za istraživanje mogućnosti umnožavanja SeVV-eGFP-AP opet se nude ko-infekcije ćelija sa SeVV-eGFP-AP i SeV wt. Ćelije su u ovom eksperimentu inficirane sa SeV wt i niskim MOI, ko-inficirane sa SeVV-eGFP-AP i inkubirane više dana, kako bi moglo de se detektuje rasprostiranje SeVV-eGFP-AP vektora preko sve većeg broja fluorescentnih ćelija.

[0087] 5 x IO5 vero-ćelija je istovremeno inficirano sa prosečno 100 inicijalno produkovanih SeVV-eGFP-AP i SeV wt (MOI = 0,2). Kao pozitivna kontrola služila je ko-infekcija vero-ćelija sa oko 100 čestica replikaciono kompententnog virusa SeV-eGFP i SeV wt. Za vreme 48-časovne faze inkubacije moglo je da se posmatra umnožavanje sva tri deleciona mutanta: Najpre su fluorescirale samo pojedine vero-ćelije, koje su bile ko-inficirane sa SeVV-eGFP-AP i SeV wt. Posle 24 sata su iz ovih ćelija otpuštene novo sintetizovane čestice virusa, koje su sada bile u stanju da prodru u okolne ćelije. Ako bi ove ćelije opet istovremeno bile inficirane sa SeVV-eGFP-AP i SeV wt, u takvim ćelijama isto tako dolazi do detektuju'će pojave fluorescencije. Umnožavanje SeW-eGFP-AP, u ćelijama ko-inficiranim sa wt mogle su ovim „stvaranjem lutanja" 48 h posle inkubacije da se na osnovu toga detektuju.

[0088] Ovim eksperimentom je garantovano, da su genomski cDNK- konstrukti, iz kojih je nastao SeVV-eGFP-AP, funkcionalni. Nadalje je moglo da se pokaže, da je moguće umnožavanje mutanata virusa uz dodatak nedostajućeg virusnog proteina. Protein (npr. P) koji na raspolaganje isključivo stavlja wt virus je dovoljan,da bi se umnožila oba, mutant za istrebljenje i wt, tj. po mogućstvu suboptimalnu količinu P-proteina vodi ka stvaranju funkcionalnog nukleokapsida od SeV wt i SeVV-eGFP-AP. Stavljanjem na raspolaganje nedostajućeg proteina preko transkomplementarnog partnera SeV wt moglo je da se postigne vidljivo umnožavanje SeVV-eGFP-AP, mereno porastom fluorescentnih ćelija u klicama kulture.

5.2 Određivanje potrebnih proteina za umnožavanje SeVV-eGFP-AP

[0089] Kao sledeće bilo je istraživano, koji proteini u slučaju umnožavanja SeVV-eGFP-AP , moraju da budu stavljeni na raspolaganje preko ćelije pomoćnika, trebaju li SeV proteini N, P i L da mogu da se sintetizuju nezavisno jedan od drugog. Za nezavisnu sintezu SeV proteini N, P i L su slali na raspolaganje tri rekombinantne Vaccina viruse (VV) W-N, W-pm W-L. koji rekombinantno eksprimiraju SeV proteine N, P ili L (Graef, H. (1994) Funkcionalna karakterizacija rekombinantnog sendai-virusa Large (L) proteina. Disertacija Eberhard-Karis-Univerzitet, Tibingen).

[0090] Ko-inficirano je simultano 1 x 10(<1>vero-ćelija sa SeVV-eGFP-AP ili SeV-eGFP (MOI = = 01^ i VV. W-n, -P i -L su pri tome umetnuti pojedinačno ili u kombinacijama (MOI = 0,54). Posle jednočasovnog vremena apsorpcije usledila je razmena medija sa DMEM + 10 % sa kiselinom fetusa teleta (FKS) + cistosin-arabinozid (AraC) (100 u,g/ml) i ćelije su u periodu od 72 sata inkubirane na 33° C, pri čemu je medijum menjan svakog dana, kako bi se dodao novi AraC.

[0091]Rasprostiranje SeVV-eGFP-AP je anlizirano preko eGFP-ekspresije posle 72 sata. U tom vremenu se u pozitivnim klicama pokazalo umnožavanje zeleno fluorescentnih ćelija od jedne inicijalne ćelije za 10-30 susednih, fluorescentnih ćelija.

[0092]Rezultati istraživanja, za koja su neophodni SeV proteini, da bi se SeVV-eGFP-AP umnožavao u vero-ćelijama, su rezimirani utabeli2. SeVV-eGFP-AP može sam da se umnožava u vero-ćelijama ekspresijom SeV P-proteina uz pomoć VV-P.

[0093]Za razmnožavanje SeVV-eGFP-AP je dovoljna ekspresija SeV P-proteina u pomoćnoj ćeliji.

5.3 Podrška ampflikacije SeVV-eGFP-AP putem H29 pomoćnih ćelija

[0094] Da bi se ispitalo razmnožavanje SeVV-eGFP-AP pomoću linije ćelija H29 inficirano je 1 x 106 H29 ćelija u četiri različita zametka sa ca. 100 inicijala - AP virusnih partikula proizvedenih u HeLa-ćelijama odn. kao kontrola za uspešno razmnožavanje SeV koje su sposobne za replikaciju u H29 ćelijama oko 100 SeV-eGFP partikula virusa. U periodu od 1 do 10 dana nakon infekcije usledilo je ispitivanje kako se razmnožavaju SeVV-eGFP-AP dokazivanjem sumporastog širenja fluorescentnih ćelija (formiranje plakova), počevši od jedne inicijalno inficirane ćelije H29.

[0095] U kontrolnom zametku je moglo da se posmatra razmnožavanje SeV-eGFP, počevši od pojedinačnih fluoroscentnih ćelija. 1 dan nakon infekcije prema plaku, pa do 50 fluoroscentnih ćelija 3 dana nakon infekcije. Time je osigurano da će u odabranoj konfiguraciji ogleda doći do razmnožavanja SeV. (0096] U zametku SeW-eGFP-AP moglo je 1 dan nakon infekcije da se pronađe na hiljadu inicijalno inficiranih pojedinačnih ćelija. Tri dana nakon infekcije razvilo se oko 70% fluorescentnih pojedinačnih ćelija u plak, pa sve do 30 fluorescentnih ćelija. Na taj načinje jasno moglo da se posmatra širenje SeVV-eGFP-AP na okolne ćelije H29. Pored H29 (derivata humanih 293- bubrežnih ćelija) za razmnožavanje virusa su podesni i derivati vero-ćelija (bubrežne ćelije afričke zelene morske mačke) i derivati LLCMK2-ćelija (bubrežne ćelije rezus-majmuna), stabilno trans- ficirane SeV P-genom ili SeV P- i N-genima. Tako je po prvi put moguće da se razmnoži virusni SeV vektor, čiji je P-ORF uklonjen. U sledećoj podtački se treba upustiti u karakteristike razmnožavanja SeVV-eGFP-AP.

5.4 Razmnožavanje SeVV-eGFP-AP u ćelijama H29

[0097] SeVV-eGFP-AP može da se ampflicira putem SeV P-proteina koje proizvode pomoćne ćelije H29. Oslobođeni P-uklonjeni mutanti su u poziciji da inficiraju okolne ćelije H29. Trebalo bi analizirati širenje SeVV-eGFP-AP u poređenju sa širenjem replikaciono-kompetentnog SeV-eGFP.

[0098] Uz to je inficirano 1 x 106 H29 ćelija prosečno sa 100 SeVV-eGFP-AP ili sa SeV-eGFP. 3,5 i 10 dana nakon infekcije pomoću fluorescentnog mikroskopa je obavljena detekcija zelenih fluoroscentnih ćelija.

[0099] Razmnožavanje SeVV-eGFP- AP je moglo uspešno da se obavi ćelijskom pripremom SeV P-proteina. U svim periodima ispitivanja je moglo da se vidi da su se SeVV-eGFP-AP i SeV-eGFP efikasno razmnožili u ćelijama H29.

[0100] Nasuprot tome nije moglo da se posmatra širenje SeVV-eGFP-AP u ćelijama koje ne stavljaju na raspolaganje manjkavi P protein („ciljne ćelije", npr. vero-ćelije), što potvrđuje nepotpunu replikaciju SeVV-eGFP-AP (vidi tačku 8).

5.5 Ekspresija gena SeVV-eGFP-AP u inficiranim ciljnim ćelijama

[0101] Moglo je da se potvrdi da je izostalo razmnožavanja SeVV-eGFP-AP u tipovima ćelija, koje ne stvaraju P proteinin trans.Istovremeno snaga ekspresije je bila daleko ispod očekivane.

[0102] Slično kao i u slučaju virusa besnila AP mutanti (Shoji et al. (2004) Virologv 318, 295-305) samo mali broj inficiranih ćelija je pokazao slabu eGFP-fluorescenciju (manje od 5%: vidi sliku 11). mada je statistički kod ćelija inficiranih sa MOI = 1 stvarno inficirano ca. 70% ćelija česticom virusa. I ako je veći MOI = 5 treba u SeVV-eGFP-AP da se posmatratraju samo pojedine zelene svetleće vero-ćelije (vidi sliku 12, gore levo).

[0103] Ovo potvrđuje pretpostavku daje nakon infekcije ćelije virusom kome nedostaje P gen moguća samo primarna transkripcija u uvedenom polimeraznom kompleksu iz partikule virusa. U slučaju SeV AP - mutanta samo kod malog procenta inficiranih čestica dolazi do ekspresije gena i to u slučaju kada ima istovremeno više transkribovanih nukleokapsida u ćeliji i u tom slučaju se one mogu posmatrati.

[0104] Čini se daje snaga ekspresije suviše slaba za terapijsku primenu ovog replikaciono-g defektnog SeVV, odn. trebalo bi aplicirati nesrazmerno mnogo čestica SeW AP po pacijentu. Iz tog razloga je poželjno primeniti replikaciono defektnu SeV varijantu kod koje dolazi i do sekundarne transkripcije. Ovo vodi razvoju drugih modifikovanih polimeraznih kompleksa, koje virusni gen ne može da replicira, ali može da pojača ekspresiju terapeutskog gena odn. antigena.

6. Stvaranje modifikovanog SeVV-eGFP-AP cDNK konstrukta

[0105] Da bi se eventualno poboljšala snaga transkrpcije P gena - koji nedostaje u ciljnoj ćeliji SeVV, izgrađen je drugi rekombinantni kompleks, koji na poziciji prvobitnog P-čitačkog okvira kodira za 76 aminokiselina kraći oblik P - proteina na N-kraju („pSeVV-eGFP-PA2-77"; vidi tačku 3.1 i sliku 8B).

[0106] Stvaranje čestica SeVV-eGFP-AP i njihovo razmnožavanje je obavljeno analogno tački 4.1 i 5.4

6.1 Postupak rasta SeW-eGFP-PA2-77 u pomoćnim ćelijama H29

[0107] U inficiranim H29 pomoćnim ćelijama SeVV-eGFP- PA2-77 je na N-kraju za 76 aminokiselina kraći i virusno kodirani PA2-77 protein se sintetiše zajedno sa ćelijski kodiranim P-proteinom.

[0108] Da bi se ispitao uticaj ekspresije skraćenog P-proteina PA2-77 na virusnu replikaciju; izvršena je infekcija (MOI=3) H29 ćelija SeVV-eGFP- PA2-77, SeV-eGFP-AP ili sa kontrolnim virusom SeV-eGFP, analogno postupku koji je opisan pod brzina rasta SeVV-eGFP-AP. Ostaci pojedinih zametaka su određeni u periodu od 120 h. putem testa ćelijske infekcije titre i broja eGFP- eksprimiranih ćelija.

[0109]Iz jedne SeV-eGFP inficirane H29-ćelije (pozitivna kontrola) u periodu od 120 h u prošeku se oslobađa 80 čestica virusa, pri tom u ovom slučaju nije bila potrebna transkomplementacija P-proteina kroz H29 ćelije. SeVV-eGFP-PA2-77 se u H29 -transkom-plementacionom sistemu mogla razmnožavati sa istim efektom kao i SeVV-eGFP-AP: Iz H29 inficiranih ćelija je posle 120 h oslobođeno oko 20 x 106 partikula virusa SeVV-eGFP-AP ili SeVV-eGFP- PA2-77, što odgovara broju od oko 40 oslobođenih partikula virusa P-mutanta po H29 ćeliji.

7. Upoređivanje ekspresije gena SeVV-GFP-AP i SeVV-eGFP- PA2-77 i kvantifikovanje sinteze proteina u inficiranim ciljnim ćelijama

[0110] Da bi se ispitalo da li vektor SeVV-eGFP- PA2-77 u inficiranim ciljnim ćelijama pokazuje pojačanu ekspresiju transgena - u poređenju sa SeVV-eGFP-AP, detaljno je opisana virusno kodirana ekspresija reporter-gena EGFP kao i HN proteina.

[0111] 5 x 10J vero ćelija je inficirano SeVV-eGFP- PA2-77 (MOI = 1), pri tom drugog dana nakon inficiranja moglo je da se posmatra ca. 70% fluorescentnih vero ćelija (nisu prikazane). To znači daje skoro svaki RNP-kompleks ove virusne vektor varijante u poziciji da indukuje mernu transkripciju u ciljnoj ćeliji.

7.1 Kvantifikacija eGFP-ekspresije putem FACS-analize

[0112] Transkripcioni aparat SeVV-eGFP- PA2-77 u koji je ubačen reporter-gen eGFP treba da kodira antigen patogena u kasnijim primenama u oblasti medicine, npr. željenog virusa. Ekspresija antigena mora da bude dovoljna, da bi kod pacijenta izazvala zaštitni imuno-odgovor.

[0113] Da bi se osiguralo da svaki SeVV-eGFP- PA2-77 nukleokapsid, koji inficira ciljnu ćeliju, bude u poziciji da obavi detektovanu ekspresiju transgena, trebalo bi da isti broj H29 i vero ćelija bude inficiran istom količinom partikula virusa i da se putem FACT( fluorescent activated cell sorting)- analize primenom FACT-kalibrisanih protočnih citometara uporediti broj eGFP- eksprimiranih H29 odn. vero ćelija. Podaci su dobijem putem kompjuterskog histograma, pri čemu su fluorescentni signali inficiranih ćelija dati u odnosu na ukupan broj ćelija.

[0114] 2,5 x IO<5>vero ćelija ili H29 ćelije su inficirane SeVV-eGFP- PA2-77 ili SeVV-eGFP-AP kojem nedostaje P gen sa MOI = 1. FACS-analiza probe je obavljena 24h nakon infekcije. Inficirane ćelije su uzete u PBS i citometrijski je ispitan broj fluorescentnih ćelija. Rezultat je dat na slici 11 kao deo (%) fluorescentnih vero- i H29 ćelija.

[0115] 24 h nakon infekcije H29 pomoćnih ćelija SeVV-eGFP-AP, 86% eGFP-eksprimiranih H29 ćelija je otkriveno putem FACS-analize. Ovde ćelijska sinteza P-proteina podržava stvaranje novog P:L-kompleksa a time i stvaranje novog mRNK, što dovodi do sinteze eGFP-proteina u inficiranoj ćeliji. Kada se vero ćelije inficiraju SeVV-eGFP- AP ni 24h nakon infekcije a ni u kasnijim eksperimentima nije mogla da se dokaže ekspresija eGFP-proteina. Nukleokapsidi transferovani putem SeVV-eGFP-AP P:L kompleksa u slučaju infekcije sa MOI = 1 ne mogu da se otkriju u inficiranim vero ćelijama.

[0116] 24 h nakon SeVV-eGFP- PA2-77 infekcije moglo je putem FACS-analize da se identifikuju jedva 80% eGFP-eksprimiranih H29 ćelija i takođe 75% eGFP-eksprimiranih vero ćelija. Kod infekcije H29 ćelija dolazi do transkripcije eGFP mRNK putem ćelijske sinteze P- proteina a time i putem novog P:L.kompleksa. Kod infekcije vero ćelija SeVV-eGFP- PA2-77 pojačava se transkripcija de novo N-kraja skraćenog P-proteina PA2-77.

[0117] Na osnovu ovih rezultata može da se izvede važna informacija o broju SeVV-eGFP-PA2-77 koji su sposobni za transkripciju: H29 ćelije i vero ćelije su inficirane jednim MOI od 1. Teoretski višestruka infekcija jedne ćelije je statistički malo verovatna. 24 h nakon infekcije je moglo da se inficira jedva 80% eGFP-eksprimiranih H29 ćelija i oko 75% eGFP-eksprimiranih vero ćelija. Iz toga može da se izvede zaključak da svaki RNP- kompleks sa skraćenim P-oblikom PA2-77, koji je sposoban za ekspresiju transgena u P-pomoćnoj ćeliji takođe može da dovede do ekspresije transgena u inficiranoj ciljnoj ćeliji. Nasuprot tome SeVV-eGFP- AP kojem kompletno nedostaje P ORF ne ispunjava ovo svojstvo.

7.2 Funkcionalni test eksprimiranog HN-proteina u inficiranim ciljnim ćelijama

[0118] Pomoću testa hemadsorpcije (HAD) pronađena je mogućnost za vezivanje humanih eritrocita a time i uspeh prezentacije virusnih HN-proteina na pojedinačne inficirane ćelije (slika 12).

[0119] 5 x 10<5>vero ćelija je inficirano sa SeVV-eGFP- PA2-77 niskim MOI = 0,5. Nasuprot tome u slučaju SeVV-eGFP-AP vero ćelije je trebalo inficirati sa 10 puta većim MOI = 5, da bi se uopšte mogle posmatrati pojedinačne fluorescentne ćelije. Posle jednočasovne adsorpcije usledila je promena medijuma sa DMEM + 10% FKS. Na kraju uzorci su više dana inkubirani na 33° C. Ekspresija transgena oba vektor-modela je prvo praćena preko eGFP-fluorescencije. Petog i devetog dana nakon infekcije obavljeno je niz HAD-testova, da bi se analizirala ekspresija virusnih HN-proteina vezivanjem humanih eritrocita.

[0120] U slučaju SeVV-eGFP-AP, ako je sa MOI = 5 statistički trebalo da bude inficirano 99,3% vero ćelija, pod mikroskopom je moglo da se posmatra samo 0,01% eGFP-pozitivnih ćelija (slika 12 gore levo). Naspram toga, shodno očekivanjima sa SeVV-eGFP- PA2-77 treba da se vidi očekivana zelena fluorescencija u 40% ćelija ako je MOI = 0,5 (slika 12 dole levo).

[0121] Dva dana nakon infekcije sa SeVV-eGFP-AP samo polovina eGFP-pozitivnih ćelija (25 od 5x 105 inficiranih) je mogla da vezuje eritrocite na gornjoj površini (slika 12 gore u sredini). Posle dalje inkubacije i ponovljenog HAD-testa više nije bilo adsorpcije eritrocita na inficiranim ćelijama. Sa drugim replikacijsko-defektnim SeVV oblikom SeVV-eGFP- PA2-77 su mogli da se postignu znatno bolji rezultati: 5 dana nakon infekcije ca. 40% inficiranih ćelija (MOI = 0,5) je bilo u poziciji da vezuje eritrocite na gornjoj površini (slika 12 dole u sredini). Tom prilikom je u pojedinačnim ćelijama mogla da se posmatra različita aktivnost vezivanja od 10 do 70 kompleksiranih ćelija crvenih krvnih zrnaca. Pokazano je da su ćelije inficirane SeVV-eGFP- PA2-77 u poziciji da 5 dana nakon infekcije eksprimiraju HN-proteine na površini ćelije, pri čemu funkcionalni ITAD-test može da se oceni kao pozitivan. Istovremeno je pomoću različite količine vezanih eritrocita mogla da se ispita sposobnost ekspresije HN-proteina u inficiranim ćelijama.

[0122] Inficirane ćelije su i dalje inkubirane na 33° C, pri čemu je aktivnost neuraminidaze HN- proteina dovela do izdvajanje vezanih eritrocita u inficiranim ćelijama. Ćelije su isprane da bi se odstranili izdvojeni eritrociti i da bi se još 4 dana inkubirale na 33° C. Devetog dana nakon infekcije je ponovljen HAD-test. Otkriveno je oko 30% HAD-pozitivnih vero ćelija. Broj vezanih crvenih krvnih zrnaca je opao 5 do 20 eritrocita po ćeliji.

[0123] Dakle i 9 dana nakon infekcije još uvek je sintetizovan dovoljno funkcionalan HN putem replikacijsko-defektne varijante SeVV-eGFP- PA2-77. Nasuprot tome oblik SeVV-eGFP-AP kome kompletno nedostaje P ORF nije ispunio ovo svojstvo.

7.3 Kvantifikacija eGFP ekspresije putem Western Blot analize

[0124] Izvršena je semi-kvantitativna procena cGFP-ekspresije replikacijsko-defektnog SeV-vektora u poređenju sa replikacijsko- kompetentnim SeV-eGFP, \Vestern Blot analizom, pomoću serijskog niza razređenih ukupnih ćclijskih proteina.

[0125] 5 x 105 vero ćelija je inficirano sa SeV-eGFP ili SeVV-eGFP- PA2-77 (MOI = 3). 24 h nakon infekcije obavljeno je razbijanje ćelija; ekstrakti ćelija su razdvojeni u serijske proređene nizove (1:2) od 20 p.g do 2,5 ug-ukupne količine u jednom SDS-PAGE. Proteini su transferovani na PVDF-membranu, pri čemu je prvo Western Blot analizom dokazano prisustvo virusno kodiranog eGFP-proteina (26 kDa) (slika 13).

[0126] Pomoću Western Blot analize mogao je da se dokaže fluorescentni protein eGFP kako u SeV- eGFP tako i u SeVV-eGFP- PA2-77 inficiranim vero ćelijama. Poređenje intenziteta eGFP-signala pokazuje daje ekspresija - posredovana putem replikacijsko-defektnog SeVV-eGFP-PA2-77 - redukovana otprilike za faktor 16 u poređenju sa SeV-eGFP.

[0127] Redukcija za faktor 16 je pri tom neznatna i dopušta da se izjavi, da SeVV-eGFP-PA2-77, uprkos modifikovanom P-proteinu može da da veoma efikasnu sekundarnu transkripciju.

7.4 Ocena HN-ekspresije putem Western Blot analize

[0128] SeV HN-protein je, za razliku od eGFP-proteina, površinski protein koji je stalno prisutan na membrani i predstavlja važnu antigen-determinantu. Kroz relativnu kvantifikaciju jačine ekspresije HN-proteina u ćelijama inficiranim SeVV-eGFP- PA2-77 moguće je dobiti informacije o jačini ekspresije SeV HN-antigena.

[0129] Izvršena je semi-kvantitativna procena HN-ekspresije replikacijsko-defektnog SeV-vektora, u poređenju sa replikacijsko kompetentnim SeV-eGFP Western Blot analizom, pomoću serijskog niza razređenih ukupnih ćelijskih proteina. Po 5 x 105 vero ćelija je inficirano sa SeV-eGFP ili SeVV-eGFP- PA2-77 (MOI = 1), u 2 paralelna uzorka i inkubirano 24 h odn. 48 h. Tada je obavljeno razbijanje ćelija; ekstrakti ćelija su razdvojeni u serijski proređene nizove (1:2) od 16 ug do 2 ug-ukupne količine u jednom SDS-PAGE. Proteini su transferovani na PVDF- membranu a pomoću monoklonskog antitela dokazan je virusno kodirani HN-protein (60 kDa) (slika 14).

[0130] Posle oba perioda inkubacije, HN-protein je efikasno otkriven, u tragovima, u vero ćelijama koje su inficirane SeV-eGFP (16 do 2 ug ukupnog proteina; tragovi 2-5 levo i desno). U slučaju SeVV-eGFP- PA2-77 još uvek je vidljiva veza HN-proteina, u tragovima, sa ukupnim proteinom 16 i 8 ug (trag 7, 8), ali slabijeg intenziteta. Relativna kvantifikacija HN-ekspresije u vero ćelijama inficiranim SeVV-eGFP- PA2-77 u odnosu na SeV-eGFP obavljena je upoređivanjem tragova sa 16 i 8 ug vs.2 ug ukupnog proteina (tragovi 7 i 8 vs. 5, levo i desno) i omogućava da se proceni redukcija HN-ekspresije za faktor 8-16 P-nedostajućeg oblika, nezavisno od perioda inkubacije. Ovo dopušta da se na relativno visokoj stopi transkripcije zatvore ciljne ćelije inficirane SeVV-eGFP- PA2-77 i to na generalno visokom nivou ekspresije transgena virusno replikacionog-defektnog vektora.

[0131] Uzimajući u obzir oba merenja (eGFP- i HN-protein) može da se pođe od prosečne redukcije ekspresije za faktor 10.

8. Replikacijski defekt SeVV-eGFP- PA2-77 u ciljnoj ćeliji

[0132] Ako se vero ćelije inficiraju replikaciono-kompetentnim, SeV-eGFP, tokom dva naredna dana će se oko inficiranih, jako fluorescentnih ćelija pojaviti plak sa do hiljadu drugih fluorescentnih ćelija. Da bi se dokazala replikacijska defekcija SeVV-eGFP- PA2-77 u vero ćelijama, treba da se potvrdi da dolazi do izostanka povećanja zelenih fluorescentnih ćelija oko inicijalne inficirane ćelije, uzimajući u obzir prirodnu stopu deobe vero ćelija. Vero ćelije se u prošeku dele svaka 24 h. Ako se vero ćelije inficiraju SeVV- eGFP- PA2-77, pojaviće se ekspresija posle 24 h. Nakon sledećih 24 h inkubacije iz ove početno inficirane, fluorescentne vero ćelije, na osnovu prirodne deobe u nekim slučajevima će nastati dve (slabije) fluorescentne ćerke ćelije. Ovo zapaženje nema veze sa razmnožavanjem virusa, kod kojih se iz jedne inficirane ciljne ćelije otpušta između 101 do 104 partikula virusa, koje potom inficiraju okolne ćelije. Ova prirodna stopa deobe inficiranih ćelija sa druge strane utiče na jačinu ekspresije eGFP koja opada sa rastućim brojem deoba ćelija. Ova zapažanja pokazuju daje virusni vektor SeVV- eGFP- PA2-77 genski repkijacijski defekt, dakle ne sintetišu se novi geni. Ako više deoba ćelija jedne inficirane ćelije, koje slede jedna za drugom, vode kontinuiranom primanju intenziteta fluorescencije, do trenutka umiranja ćelija, razmnožavanje virusa se isključuje.

[0133] Da bi se konačno potvrdila replikacijska defekcija SeVV- eGFP- PA2-77 u ciljnima ćelijama, obavljeno je poslednje ispitivanje. Postavljena je T75-boca sa - 20 x 106 sa vero ćelijama. Na početku inkubacije ćelije su gusto zasejane. a shodno tome nisu više aktivne za deobu. Ove vero ćelije su inficirane SeVV- eGFP- PA2-77. količinom MOI od 0,001. Medijumska promena po DMEM sa 5% FKS (za smanjenu aktivnost deobe) je usledila posle jednočasovnog perioda inkubacije a vero ćelije su inkubirane na 33°C (Pl). Dva dana nakon infekcije, shodno izabranom MOI, moglo je da se posmatra više hiljada pojedinačno inficiranih, fluorescentnih vero ćelija. Zbog velike gustine ćelija, u sledeća 4 dana perioda inkubacije jedva dolazi do deobe ćelija, tj. broj početno inficiranih ćelija, detektovanih fluorescencijom ostaje konstantan. Daje u ovom periodu došlo do obrazovanja čestica virusa, okolne ćelije bi se inficirale, što bi se odrazilo na povećanje fluorescencije. Posle 8 dana moglo je da se isključi širenje virusnog vektora jer nije bilo nove infekcije okolnih ćelija. Da bi se ćelije snabdele svežim medijumom uklonjen je višak ćelija prevučenih novim medijumom. 12 dana od početka inkubacije na podlozi iz kulture su se izdvojile vero ćelije. U toku kompletnog ispitivanja nije bilo moguće posmatrati replikaciju virusnog vektora u vidu umnožavanja fluorescentnih ćelija. Širenje SeVV- eGFP- PA2-77 sa primarno inficiranih ćelija na okolne vero ćelije putem produkcije novih genoma virusa kao i partikula virusa je time bilo isključeno. Iz tog razloga se SeVV- eGFP- PA2-77 označava kao replikacijsko-defektni virusni vektor.

Činjenice:

[0134]Gore navedeni rezultati pokazuju da ciljne manipulacije na genima za komponente polimeraznog -kompleksa mogu da proizvedu replikacijsko-defektni negativni lanac RNK-virusa, koji su još u poziciji da transkribuju virusno kodirane gene, ali više ne mogu da repliciraju virus genoma.

[0135] U slučaju sendai-virusa bliže su ispitane dve varijante, u kojima je gen za polimerazu - kofaktor fosfoprotein ili kompletno uklonjen („SeVV-eGFP-AP") ili su eliminisani kodoni za aminokiseline 2 do 77 („SeVV- eGFP- PA2-77"). Oba SeV vektora su replikacijski defektna u ćelijama, koje protein P,in transne stavljaju na raspolaganje (tkz. ciljne ćelije), ali se znatno razlikuju na osnovu svoje genex-presije.

[0136]Mada u slučaju SeVV-eGFP-AP sa MOI - 5, statistički samo 0,7% vero ćelija ostaje ne inficirano - 99,3% bi trebalo da sadrži RNP-kompleks - samo 0,01% eGFP pozitivnih ćelija je moglo da se posmatra pod mikroskopom. Iz toga sledi da do transgene ekspresije dolazi samo ako se 15 ili više RNPs SeVV-eGFP-AP istovremeno nalazi u inficiranoj ciljnoj ćeliji.

[0137]Ovaj SeVV kome nedostaje P gen pokazuje sličnu slabu ekspresiju kao analogno besnilo AP-varijanti (shoji et al. Supra). Oba vektora su u inficiranoj ciljnoj ćeliji sposobna samo za primarnu transkricpciju preko uvedenog polimeraznog kompleksa iz partikule virusa. Za terapeutsku primenu vektora poželjna je jaka ekspresija kodiranog transgena odn. antigena. Ovaj uslov može da se ispuni pomoću replikacijsko-defektne varijante SeVV- eGFP- PA2-77, koja u ciljnim ćelijama pokazuje smanjeni efekat ekspresije u poređenju sa replikacijsko-kompetentnim SeV. Prisustvom gena P-proteina koji je skraćen na N-kraju, u genu vektora onemogućena je i primarna i sekundarna transkripcija. Ovo će se ostvariti kroz novonastale, modifikovane polimerazne-komplekse, koji sadrže vektor-kodirani PA2-77 protein; ali ovaj ne podržava replikacioni model polimeraza.

[0138]Kvantifikacijom sinteze proteina u inficiranim ćelijama je dokazano, da je replikacijsko- defektni vektor SeVV- eGFP- PA2-77 u poziciji da obavi efikasnu transkripciju i ekspresiju virusno kodiranih gena. Tom prilikom se efikasno ne sintetiše samo 3'-proksimalni transgen (eGFP), i ITN-gen koji se nalazi na poziciji 6 na genu a koji se transkribuje najmanje 9 dana nakon infekcije a protein se eksponira funkcionalno na inficiranim ciljnim ćelijama.

9. Određivanje indukovanog imuno-odgovora na modelu miša putem replikacijsko-defektne RNK-vakcine

[0139]Moglo je da se pokaže da je prvenstveno putem uklanjanja u P-genu („PA2-77") nastao izmenjeni virusno polimerzni-kompleks, koji više ne dopušta sintezu novih gena. Posle infekcije ovakvim replikacijsko-defektnim virusima njihova genska ekspresija u ciljnoj ćeliji je samo ca. 10x manja u poređenju sa infekcijom replikacijsko-kompetentnog virusa.

[0140]Da bi se dokazalo imunogeno svojstvo replikacijsko-defektnog RNK-virusa kao vektora za vakcinaciju, umetnuti su antigeni odn. antigene determinante dva heterologna virusa (humani parainfluentni virus tip 3, hPIV3, i respiratorni sinzicijalni virus, RSV) u gen virusa: Konstruisan je replikacijsko-defektni SeV PA2-77, u kome su geni prvobitnih proteina sa gornje površine F i FTN zamenjeni genima koji kodiraju proteine F i HN za himeru. !!>>:•,era F-protein sadrži 558 aminokiselina i sastoji se od ekstra ćelijskih domena hPIV3 (493 aminokiseline), transmembranskih domena SeV (23 aminokiseline) i citoplazmatičnih domena SeV (42 aminokiseline). Himerni HN-protein ima 579 aminokiselina i sastoji se od citoplazmatičnih domena SeV (35 aminokiselina), transmembranskih domena Sev (25 aminokiselina) kao i ekstra ćelijskih domena hPIV3 (519 aminokiselina). Sekvence aminokiselina himernog F-proteina i himernog HN-proteina su prikazane u specifikaciji sekvenci kao SEQ ID br. 27 i 28.

[0141]Ubacivanjem himernih gena u gen virusa stvoren je novi antigen a istovremeno efikasna zajednička izgradnja partikula vakcine čija je proizvodnja obezbeđena.

[0142]U dodatnom aparatu za ekspresiju koji je umetnut između dva virusna gena obavljeno je kodiranje proteina gornje površine F sa RSV, čime je proširen konstrukt za bivalentnu vakcinu.

[0143]Ova vakcina je testirana na modelu životinja. Grupe balb/c miševa su tri puta u razmaku od dve nedelje, sa dva različita virusna preparata (grupa A odn. C, po 104 infekcionih jedinica) intranasalno vakcinisane, kontrolna grupa (B) je primila PBS umesto vakcine. Posle treće vakcinacije na analizu je dat mukozalni imuno-odgovor nazalne tečnosti za pranje (NW) a obavljena su i bronho-alveolna ispiranja (BAL), a za analizu je izolovan serum humoralnog imuno- odgovora. Preko ELISA je određena količina indukovanih imunoglobulina IgA i lgG posebno u odnosu na hPIV3 kao i RSV. Replikacijsko-defektni prototip vakcine je pospešio jasnu indukciju lgG, posebno u odnosu na hPIV3 (si. 15A), indukcija anti-RSV IgA-antitela je bila manja (nije prikazano). Indukcija humoralnog imuno-odgovora na spoljnu površinu antigena oba virusa je data uporedivanjm titre, količina specifičnog IgG se razlikuje za faktor 2 (si. 15B). Analiza anti-hPIV3-IgG je dalje pokazala da indukovana antitela pokazuju svojstva neutralizatora (titra 1/64). Nasuprot tome - kao što se i očekivalo - kod kontrolne grupe nije mogla da se utvrdi IgA- odn. IgG-indukacija.

[0144]Ova otkrivena vakcina je mogla da indukuje specifični mukozalni i humoralni imuno-odgovor na heterologne virusne antigene. Dodatni eksperimenti su pokazli da limfociti vakcinisanih miševa proizvode interferon-y , dok IL-5 nije mogao da se dokaže. Ovaj nalaz ukazuje na to daje bivalentna, replikacijsko-defektna RNK-vakcina u poziciji da izazove T-imuno odgovor ćelija, a to je preduslov da se imunitet dugo očuva.

V

Činjenice

[0145]Nakon što su pokusne životinje inficirane modifikovanim vektorom, u njih su unete kodirane sekvence antigene dva heterologna virusa i dokazana je indukcija neutralizovanih antitela. To pokazuje potencijal replikacijsko-defektnog negativnog lanca RNK-virusa za razvoj novih vrsta vakcina.

10.Prikaz primenjenih DNK-oligonukleotida

[0146]U tabeli 3 su dati oligonukleotidi koji su korišćeni u gornjim primerima

Claims (37)

1. Rekombinantni negativni lanac RNK-virusa koji sadrži virusni genom sa mutacijom u genu P, koja dovodi do gubljenja sposobnosti replikacije bez gubljenja sekundarne sposobnosti transkripcije.

2. Virus prema zahtevu 1,naznačen timeda je paramiksovirus.

3. Virus prema zahtevu 1 ili 2,naznačen timedaje sendai-virus .

4. Virus prema zahtevu 1,naznačen timeda se mutacija odnosi na N- terminalnu delimičnu sekvencu proteina koji kodira gen P.

5. Virus prema zahtevu 4,naznačen timeda mutacija obuhvata : deleciju aminokiselina 2-77 proteina koji kodira gen P ili delimične sekvence od (a) dovoljne za gubljenje sposobnosti replikacije (b) delimične sekvence od (a) dovoljne za gubitak replikacione sposobnosti.

6. Virus prema jednom od zahteva 1 do 5,naznačen timeda virusni genom sadrži najmanje jednu sekvencu koja kodira heterologni gen produkt.

7. Virus prema zahtevu 6,naznačen timedaje heterologni gen produkt protein, ribozom, antisensni molekul ili siRNK-molekul.

8. Virus prema zahtevu 6 ili 7,naznačen timedaje heterologni gen produkt reporter-protein, antigen ili terapeutski protein.

9. Virus prema jednom od zahteva 6 do 8,naznačen Umedaje heterologni gen proizvod antigen heterolognog patogena, izabran iz virusa, bakterija i protozoa

10. Virus prema jednom od zahteva 6 do 9,naznačenlimedaje heterologni gen virusni antigen.

11. Virus prema zahtevu 10,naznačen timeda virusni genom za mnoge heterologne antigene kodira iz istih ili različitih virusa.

12. Virus prema jednom od zahteva 6 do 11,naznačen timedaje sekvenca koja kodira za najmanje jedan heterolgni proizvod insertovana u virusni genom ili/i supsituiše sekvence koje kodiraju za homolgni gen produkt.

13. Virus prema jednom od zahteva 1 do 12,naznačen timeda virus u poređenju sa divljim tipom pokazuje sposobnost transkripcije umanjenu najviše za faktor 20

14. Nukleokapsid negativnog lanca RNK-virusa kao prema jednom od zahteva 1 do 13.

15 Genom negativnog lanca RNK-virusa prema jednom od zahteva 1 bis 13.

16. DNK-molekul koji kodira za genom ili/i antigenom negativnog lanca RNK-virusa kao prema jednom od zahteva 1 do 13.

17. DNK-molekul prema zahtevu 16,naznačen timedaje operativno vezan sa transkripcionim signalom.

18. DNK-molekul prema zahtevu 17,naznačen timedaje transkripcioni signal promoter bakteriofaga, naprimer promoter T7 ili SP6.

19. Ćelija koja sadrži virus prema jednom od zahteva 1 do 13, nukleokapsid prema zahtevu 14, genom prema zahtevu 15 ili DNK-molekul prema jednom od zahteva 16 do 18.

20. Ćelija prema zahtevu 19,naznačena timeda je ona ćelija uvećanje vektora.

21. Ćelija prema zahtevu 19,naznačena timedaje ona ćelija za proizvodnju virusa.

22. Ćelija prema zahtevu 21,naznačena timeda ona dalje sadrži DNK-molekul koji kodira heterolognu RNK polimerazu zavisnu od DNK, koji izaziva transkripciju DNK-molekula koji kodira rekombinantni negativni lanac RNK -virusa.

23. Ćelija prema zahtevu 19,naznačena timeda je ona ćelija za umnožavanje virusa.

24. Ćelija prema zahtevima 19 do 23,naznačena timeda dalje sadrži DNK-molekule koji kodiraju virusne P-proteine.

25. Postupak za proizvodnju negativnog lanca RNK-virusa prema jednom od zahteva do 14, koji obuhvata korake: (a) Pripremu ćelije, koja je transficirana DNK-molekulom, koji kodira za genom negativnog lanca RNK-virusa, sadrži mutaciju u genu P, koja dovodi do gubljenja virusne replikacijske sposobnosti genoma bez gubljenja sekundarne sposobnosti transkripcije eventualno najmanje za sekvencu koja kodira heterolgni produkt gena i (b) kultivisanje ćelije pod uslovima da se vrši transkripcija DNK prema (a) i da se obrazuje rekombinovani negativni lanac RNK-virusa.

26. Postupak prema zahtevu 25, dalje obuhvatajući dobijanje nukleokapsida ili virusnog genoma iz negativnog lanca RNK-virusa.

27. Postupak za umnožavanje negativnog lanca RNK-virusa prema jednom od zahteva 1 do 13, obuhvatajući korake: (a) Priprema ćelije koja je inficirana negativnim lancem RNK virusa sadržeći mutaciju u genu P, koja dovodi do gubljenja virusne replikacijske sposobnosti genoma bez gubljenja sekundarne sposobnosti transkripcije eventualno najmanje za sekvencu koja kodira heterolgni produkt gena i (b) kultivisanje ćelije pod uslovima da se vrši umnožavanje virusa

28. Farmaceutski sastav,naznačen timeda sadrži rekombinaciju negativnog lanca RNK-virusa prema jednom od zahteva 1 do 13, nukleokapsid prema zahtevu 14 ili virusni genom prema zahtevu 15 kao supstancu kao i eventualno farmaceutski uobičajene noseće i/ili pomoćne materije.

29. Farmaceutski sastav prema zahtevu 28 za primenu kao vakcina.

30. Farmaceutski sastav prema zahtevu 29 kao monovalentna ili polivanetna vakcina.

31. Farmaceutski sastav prema zahtevu 29 ili 30 kao vakcina protiv virusnih infekcija naprimer kao vakcina protiv infekcija sa patogenim negativnim lancem RNK-virusa.

32. Farmaceutski sastav prema zahtevu 28 za primenu kao terapija protiv tumora.

33. Farmaceutski sastav prema jednom od zahteva 28 do 32 za primenu kod rizičnih pacijenata.

34. Farmaceutski sastav prema jednom od zahtevu 28 do 33, obuhvatajući nukleokapsid u nativnom virusnom omotaču. -

35. Korišćenje ćelije koja protein P negativnog lanca RNK-virusa konstitutivno ili induktivno stabilno eksprimira za proizvodnju ili umnožavanje rekombinovanih negativnih lanaca RNK-virusa prema jednom od zahteva 1 do 13, nukleokapsida prema zahtevu 14 ili virusnih genoma prema zahtevu 15.

36. Korišćenje prema zahtevu 35,naznačeno timeda je ćelija ćelija sisara.

37. Korišćenje prema zahtevu 35 ili 36,naznačeno timeda je ćelija izabrana iz ćelije H29 (DSM ACC2702) ili ćelije izvedene iz nje.