RS51122B - Primena 5`-metiltioadenozina(mta) kod prevencije i/ili lečenja autoimunih bolesti i/ili pri odbacivanju transplantata - Google Patents

Abstract

Upotreba 5'-metiltioadenozina (MTA), njegovih farmaceutski prihvatljivih soli i/ili prolekova, gde su navedeni prolekovi esteri ili amidi MTA koji, nakon što su primenjeni na osobi, daju MTA, direktno ili indirektno, navedenoj osobi, za pripremu leka za (i) prevenciju i/ili liječenje autoimune bolesti ili za (ii) prevenciju i/ili liječenje odbacivanja transplantata.Prijava sadrži još 6 patentnih zahteva.

Description

Opis Pronalaska

PODRUČJE PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se, u osnovi, na primeni 5'-metilatiodenozina (MTA), njegovih farmaceutski prihavtljivih soli i/ili prolekova kod prevencije i/ili lečenja autoimunih bolesti, kao kod prevencije i/ili lečenja odbacivanje transplantata i, naročito, kod prevencije i/ili lečenju Multiple Skleroze (MS).

POZADINA PRONALASKA

[0002] Autoimune bolesti su ozbiljne bolesti, koji izazivaju značajne zdravstvene i lične probleme i u ovom trenutku pretstavljaju četvrti po ozbiljnosti zdravstveni problem u industrijski razvijenim zemljama. Na primer, Multipla Skleroza (MS) je autoimuna bolest sa velikim zdravstvenim značenjem koji izaziva velike posledice. Slično tome, odbacivanje transplantata, specifični slučaj autoimuniteta pri čemu aktiviranje transplantaciskih antigen-specifičnih T limfocita uzrokuje njihovu eliminaciju što pretstavlja ozbiljnu komplikaciju kod onih pacijenata koji primaju transplantant, sa znatnim ličnim i društvenim troškovima

[0003] Zbog njihovih posebnih karakteristika (mehanizmi i odgovori tretmanu), autoimune bolesti formiraju pod-grupu inflamatornih oboljenja. Kao što je dobro poznato, inaflamatorne bolesti su bolesti kod kojih dominira inflamacija ili kod kojih je lečenje predodređeno za borbu sa unutrašnjom inflamacijom. U svakom slučaju, autoimune bolesti su različite od inflamatornih bolesti, s tim da dominira inflamacija adaptivnog imuniteta (limfociti) dominira; prema tome, klasično anti-inflamatorno lečenje, usmereno je prilagođavanju unutrašnjoj inflamaciji, nije efikasno pri lečenje autoimunih bolesti, naizgled zbog činjenice da, sa ciljem kontroliranja hronične aktivnosti autominog oboljenja neophodno je, kao dopunu suzbijanju lokalne inflamacije, pri I ag odavanje aktivnosti limfocita pomoću imunomodulatora.

[0004] Lečenje autoimunih bolesti je ozbiljan problem, zato što su veliki broj lečenja simptomatična i one terapije koje menjaju tok oboljenja imaju delimičnu efikasnost i sporedni efekat, kao i velike troškove. Kontrola autoimunih bolesti,bazirana je, u principu, na modulaciji aktivnosti T limfocita pomoću imunosuzbijajućeg ili imunomodulacijskog lečenja; ovo je i razlog o neefikasnosti klasičnih anti-inflamatornih terapija.

[0005] Sada, kod lečenja autoimunih bolesti i pri odbacivanju transplantata, upotrebljavaju se tri tipa terapija, i svaka od njih koncentrisana je na ograničavanje aktivacije i efekata autoreaktivnih T-limfocita: a) s jedne strane, administracija kortikoida (pr. prednizon, 5'-metilprednizon, deksametazon i ACTH, između ostalih), ili oralno, podkožno ili intravenozno i u formi bolusa, u kratkom vremenskom intervalu ili nedefinisanom, može da olakša neke od ovih bolesti, čak iako je to samo delimično i sa značajnim dugoročnim, sekundarnim efektima koji ograničavaju njihovu primenu;

b) s druge strane, administracija imunosuzbijača (pr. ciklofosfamid, mitoksantron, metotreksat, azatioprin i ciklosporin A, između ostalih), oralno

ili intravenozno, poboljšavaju većinu bolesti, i pored potencijalno ozbiljnih ili čak i smrtonosnih sporednih efekata, koji u mnogome ograničavaju njihovu primenu; i

c) s druge strane, administracija imunomodulatora (pr. interferon-beta, interfferon-alfa, glatiramer acetat, anti-CD20 ili anti TNFa monoklonalnih

antitela, između ostalih) poboljšavaju kontrolu nad ovim bolestima, čak iako samo delimično, sa habitualnim sporednim efektima i visokim troškovima budući da se radi o biotehnološkim proizvodima.

[0006] Zbog toga, od velikog je interesa pristupiti novom tečenju koje je efikasno u prevenciji limfocitne aktivacije i koje sprečava ili reducira aktivnost autoimunih bolesti i odbacivanje transplantata, sa malim sporednim efektima.

[0007] Danas je poznato da 5'-metiltioadenozin (MTA) može da se primenjuje za prevenciju i/ili lečenje autoimunih bolesti, kak o i za prevenciju i/ili lečenje odbacivanje transplantata, i naročito, za prevenciju i/ili lečenje Multiple Skleroze (MS).

[0008] MTA predstavlja hidrofobični adenin sulfur-nukleozid, u kojem je hidroksilna grupa u 5' poziciji riboza zamenjena sa metiltio grupom. MTA se nalazi u malim proporcijama u svim ćelijnim vidovima, uključujući prokariote, kvasce, biljke i više eukariote, a promatranjem je otkriveno da je prirodno prisutan i u ćelijama sisavaca. MTA je dobro poznati molekul koji ima veoma različite karakteristike pri kontroli raka, regeneracije i unutrašnjih inflamacija.

[0009] Patent br. 4,454,122 iz Sjedinjenih Američkih Država obelodanjuje primenu MTA kao anti-inflamatornog, analgetičkog i anti-piretičkog agensa, naročito, primena MTA za lečenje anti-inflamatornog odgovora kod edema, pleuritisa i granolomskih modela stranih tela. Uloga MTA u suzbijanju limfocitne aktivacije nije analizirana, kao i njegova uloga kao imunomodulator kod autoimunih bolesti pri odbacivanju transplantata.

[0010] Efekti MTA kod raka takođe nije ispitan. Opsežno je ispitano da aktivnost MTAP (5'-metiladenozin fosforilaza) nedostaje kod mnogih malignih ćelija, i da, kod kultura, ovaj MTAP-smanjuje ćelijni sekret MTA umesto da ga metabolizira. Na primer, Međunarodna patentna prijava VVO2004/074325 obelodanjuje primenu jedinjenja koja inhibiraju MTAP enzime pri lečenju raka. Kod eksperimentalnih modela, hemijski inducirana hepatokarcinogeneza, u kojoj je pronađeno da se nivo MTA smanjuje, administracija MTA inducira jednodozno-zavisnu inhibiciju kod pre-neoplastičnih oštećenja jetre i DNA sinteze.

[0011] Sa druge strane, funkcija i proliferacija T limfocita čini se da su naročito osetljive na inhibiciju MTA. Ovojedinjenje inhibira, na reverzibilan, netoksičan i jednodozno-zavisni način, proliferaciju mitogen stimulirane murin limfoidne ćelijne linije i ljudske periferne limfocite. Između MTA efekata koji mogu da budu ometani ćelijnom proliferacijom, citirana je inhibicija proteinske metilacije ili inhibicija fosfodiesterastične aktivnosti. Autori ovog pronalaska obelodanili su, u konferencijskom listu sa naslovom "Metilacijski - inhibitor koji suzbija T ćelijnu Aktivaciju i prevenira Eksperimentalni Autoimuni Encefalomieltis", na 7-om Zasedanju Međunarodnog Udruženja Neuroimunologa, u Veneciji, Septembar 2004 [Abstrakt je objavljen u Novini Neuroimunologa 2004, Vol. 154, brojevi 1-2, strana 85], primenu MTA kao potentnog inhibitora metilacijske reakcije, koja prevenira razvoj autoimunog odgovora kod životinjskog modela Eksperimentalno Autoimunog Encefalomielitisa (EAE), koji uključuje Lewis-ovog miša imuniziran sa mielin osnovnim proteinom (MBP).

SADRŽAJ PRONALASKA

[0012] Iznenađujuća je činjenica da je MTA sposobna da primeni modulatorni efekat za aktivaciju T limfocita, čime postaje sposobna za modifikaciju inflamacije kod autoimune bolesti i odbacivanju trasnplantata, i, zbog toga, može da bude primenjena za prevenciju i/ili lečenje autoimunih bolesti, kao za prevenciju i/ili lečenje odbacivanje tarnsplantata i, naročito, za prevenciju i/ili lečenje MS-e. U tom pogledu, MTA deluje kao imunomodulatorni agent budući da je njegov efekt osobito primenjliv kod limfocita.

[0013] Ova nova primena MTA bazirana je na istraživanju obavljenom sa strane pronalazača na primerku kod životinje sa akutnim EAE i hronično-rekurentnim EAE, kojoj je MTA administrirana. Otkriveno je da životinje koje su lečene sa MTA ili nisu pokazivale nikakve kliničke signale ili bi ukoliko bi se bolest pojavila, smršali značajno tokom trajanja bolesti.

[0014] U tom pogledu, pronalazak se odnosi na primeni MTA u pripremi leka namenjenim za (i) prevenciju i/ili lečenje autoimunih bolesti ili (ii) za prevenciju i/ili lečenje odbacivanje transplantata. U specifičnoj izvedba, ova autoimuna bolest predstavlja MS.

[0015] Dalje, pronalazak se odnosi na postupku prevencije i/ili lečenje autoimunih bolesti kod lica koje ima autoimunu bolest, koji sadrži administraciju terepeutske efektivne količine MTA za to lice. U specifičnoj izvedbi, ovo autoimuna bolest pretstavlja MS.

[0016] Nadalje, pronalazak se odnosi na postupku za prevenciju i/ili lečenje odbacivanje transplantata kod individue koja prima transplanant ili koja potrebuje transplantat, koji sadrži administraciju efektivne terapeutske količine MTA individui.

[0017] Primena MTA za prevenciju i/ili lečenje autoimunih bolesti, naročito MS, i odbacivanje transplantata pretstavlja efekasni način za izbegavanje problema koji se javljaju pomoću aktuelnih terapeutskih strategija, kao što su dugoročni sporedni efekti kortikoida, imunosuzbijača i imunomodulatora primenjenih za lečenje autoimunih bolesti i pri odbacivanju transplantata.

KRATAK OPIS SLIKA

[0018]

Slika 1 je ilustrativni grafik indukcije EAE kod Lewis-ovog miša imuniziran sa MBP68_82od gvinejske svinje. Srednja vrednost dnevnog kliničkog rezultata +S.E.M. prikazan je za svaku grupu miševa, gde (<*>) označava statistički suštinsku razliku na p<0.05 spoređeno sa lečenjem pomoću MTA, i (<**>) označava statistički suštinsku razliku na p<0.05 upoređeno sa lečenjem pomoću MTA. Podaci su prikupljeni iz 3 individualna

eksperimenta.

Slika 2 je ilustrativni grafik indukcije hronično-periodične EAE kod DA miševa sa rMOG. Srednja vrednost dnevnog kliničkog rezultata +S.E.M. prikazan je za svaku grupu miševa, gde (<*>) označava statističku suštinsku razliku na

p<0.005 upoređeno sa lečenjem putem MTA.

Slika 3 je ilustrativni grafik krive peiživljavanja kod DA miševa imunizirani sa MOG dok se ne postigne umerena invalidnost (rezultat = 3.5) (p<0.001 pomoću Breslovv testa) [Slika 3A], i krive preživljavanja DA miševa imunizirani sa MOG dok se ne postigne egzekucija (rezultat = 5) (p=0.02

pomoću Breslovv testa) [Slika 3B].

Slika 4 je bar dijagram koji prikazuje MBP-specifični T-limfocitni odgovor kod Levvis-ovog miša imuniziran sa MBP, 16 dana posle imunizacije. Rezultatiti su izraženi kao srednji indeks stimulacije, gde (<*>) označava

statistički suštinsku razliku na p<0.05 upoređeno sa placebo efektom. Slika 5 je bar dijagram koji prikazuje IL-2, IFN-v, TNF, IL-10 i iNOS mRNA model izražavanja kod splenocite miša sa EAE. Podaci su izraženi u odnosu na nivo 18S rRNA gradbenih gena, gde (<*>) označava statistički suštinsku

razliku na p<0.05upoređeno sa lečenjem putem MTA.

Slika 6 je bar dijagram koji prikazuje histološki rezultat inflamatornih i demijelinacijskih oštećenja, gde (<*>) označava statistički suštinsku razliku na p<0.05 upoređeno sa lečenjem pomoću MTA.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

[0019] Sa jedne strane, pronalazak se odnosi na primenu MTA

Njegovi farmaceutsko prihvatljive soli i/ili prolekovi, za pripremi lekova koji se mogu primeniti za (i) prevenciju i/ili lečenje autoimunih bolesti, ili (ii) prevenciju i/ili lečenje pri odbacivanju transplantata.

[0020] Termin "farmaceutski prihvatljive soli" koji je ovde upotrebljen, odnosi se na MTA koja može da se primeni u pripremi leka. Priroda soli nije kritična, ako je ista farmaceutski prihvatljiva. Prihvatljive farmaceutske soli MTA su kiselinska dodatna so, koja se dobija iz organskih ili neorganskih kiselina, konvencionalnim metodama dobro poznatim stanju tehnike, izvedbom pogodne kiselinske reakcije sa MTA u odgovarajućim stihiometrijskim iznosom. Ilustrirovcani primeri kiselina koje mogu da se upotrebe za dobijanje ove kiselinski dodatne soli uključuju, ali se i ne ograničavaju na, organske kiseline, kao što je, na primer, asorbinska kiselina, limunska kiselina, 1,4-butandisulfonska kiselina, p-toluensulfonska kiselina itd., ili neorganske kiseline, kao što su, na primer, hlorovodorodna kiselina, sulfurna kiselina itd. Kao ilustracija, na primer, MTA hidrohlorid može da se primeni kod injektabolnih formulacija; MTA hlorovodoroda, MTA sulfata, MTA citrata, MTA askorbata, MTA 1,4-butandisulfonat (enterično obložene

tablete), MTA p-toluensulfonat itd, mogu da se primene kod oralnih formulacija.

[0021] Osim toga, oblast pronalaska , uključuje MTA prolekove, Termin "prolek", ovde upotrebljen, predstavlja bilo koje jedinjenje dobijeno od MTA, kao što su, ester, amid, itd., koje, nakon što je administrirano individui, spremno da obezbedi MTA, direktno ili indirektno, pomenutoj individui. Radije, pomenuti derivat predstavlja jedinjenje koje pojačava biodostupnost MTA kada se administrira individui ili koje izaziva oslobođenje MTA u biološkom delu. Priroda ovih derivata nije kritična, a obezbeđuje administriranje individui kao i MTA u individualnom biološkom delu. Priprema pomenutih prolekova može da se izvede konvencionalnim metodama poznati stanju tehnike.

[0022] MTA je komercijalni proizvod koji može da se obezbedi iz kompanije Sigma. Alternativno, pomenuta jedinjenja mogu da se dobiju poznatim metodama, primer, počinjajući sa S-adenozilmetionin (SAM), sledeći proceduru opisanu od strane Schlenk F. Etal., Arch Biochem. Biophis., 1964, 106:95-100, kao što je pomenuto u primeru koji dopunjava ovaj opis.

[0023] Za njegovu administraciju kod prevencije i/ili lečenju autoimune bolesti, kao što je MS i za prevenciju i/ili lečenje i pri odbacivanju transplantata, MTA, njegovi farmaceutsko prihvatljivi soli i/ili prolekovi, treba da seformiluši u prikladnim farmaceutskim sastavima, u terapeutsko efketivnom iznosu, zajedno ili sa jednim ili više farmaceutsko prihvatljivim nosačima, adjuvansima ili eksipiensima.

[0024] Primeri farmaceutskih sastava uključuju bilo koje tvrde (pr. tablete, kapsule, granule, itd.) ili tečne sastave (pr., rastvori, suspenzije, emulzije, itd.) za administraciju putem bilo koje podesne rute, na primer, oralna, potkožna, intraperitonelalno, intravenozno, itd,; tipično, oralno zbog hronične prirode bolesti koja se leči.

[0025] U specifičnoj izvedbi pronalaska, pomenuti farmaceutski sastavi mogu biti oralno administrirani u farmaceutskoj formi, ili u tvrdoj ili tečnoj formi. Primeri oralno administriranih formi uključuju, tablete, kapsule, granule, rastvori, suspenzije itd., i mogu sadržavati konvencionalne ekscipiense, kao što su vezivanje, rastvaranje, raspadanje, podmazivanje, vlaženje, itd., i mogu biti pripremljeni konvencionalnim metodama. Farmaceutski sastavi mogu takođe biti prilogođeni za paranteralnu administraciju, u formi, kao što su na primer, rastvori, suspenzije ili sterilni liofizirani proizvodi, u pogodnoj formi doziranja; u ovom slučaju, pomenuti farmaceutski sastavi trebaju uključivati adekvatne ekscipiense, kao što su, baferi, surfaktanti, itd. U bilo kom slučaju, ekscipiensi trebaju biti izabrani na osnovu izabrane farmaceutske forme. Pregled različitih farmaceutskih formi za administraciju lekova i njihova priprema nalaze se u knjizi "Tratado de Farmacia Galenica", de C.Fauli i Trillo, 10-to izdanje, 1993, Luyan 5, S.A. de Ediciones.

[0026] Za potrebe teraputske primene, MTA trebalo bi radije biti u farmaceutsko prihvatljivoj ili suštinski čistoj formi, pr., MTA bi trebao imati farmaceutsko prihvatljivi nivo čistoće, isključujući farmaceutsko prihvatljive ekscipiense i ne uključujić materijal koji bi biti otrovan pri normalnom nivou doziranja. Povoljno nivo čistoće MTA iznosi iznad 50%, povoljnije, iznad 70%, još povoljnije, iznad 90%. U preferiranoj izvedbi pronalaska,iznad je 95% MTA .

[0027] U celini, terapeutski efektivni iznos MTA za administraciju trebao bi biti zavisan, između ostalih faktora, od individue koja treba biti lečena, ozbiljnost oboljenja kojom je individua pogođena, od izabrane administracije, itd., pomenute doze u ovom pronalasku trebali bi biti uzeti u obzir samostalno kao vodič poznavaocima stanja tehnike, i kasnije trebali bi biti prilagođeni dozama na osnovu pomenutih promenjlivih. U svakom slučaju, MTA može biti administriran jednom ili više puta na dan, na primer, 1, 2, 3 ili 4 puta na dan u tipično ukupne dnevne količine između 25 i 75 mg/kg/na dan.

[0028] MTA, njegovi farmaceutsko prihvatljivi soli i/ili prolekovi, i farmaceutski sastavi koji ga sadrže mogu biti upotrebljeni zajedno ili sa dopunskim lekovima koji su korisni za prevenciju i/ili lečenje autoimune bolesti ili odbacivanje transplantata, na primer, kortikoidi, imunosupresanti, imunomodulatori, itd., sa ciljem obezbediti kombinirano lečenje. Pomenuti dopunski lekovi mogu formirati deo istih farmaceutskih sastava ili, alternativno, mogu biti obezbeđeni u formi odvojenog sastava za istovremenu ili ne-istovremenu administraciju sa farmaceutskim sastavom koji sadrži MTA, ili prolek ili njegovu farmaceutsku prihvatljivu so.

[0029] Kao što je ovde upotrebljeno, "autoimuna bolest" je beolest vezana za aktivnost agresivnih mehanizma za odbranu pacijenata (imuni sistem) protiv njegovog/njenog telesnog tkiva. Naročito, autoimune bolesti su karakteristični po tome da inflamacija adaptivnog imuniteta (još poznat kao specifični ili stečeni imunitet) preovladava, gde je stimulacija imuniteta praćena izlaganjem infektivnim agensima, i po tome da su limfociti glavne komponente. Lista autoimunih bolesti može se pronaći na Internetu strani Američkog Udruženja za Autoimune i slične bolesti [http://www.aarda.org]. Primeri autoimunih oboljenja uključuju, ali nisu ograničeni na: MS, Crohn-ovo oboljenje, reumatski artritis, dijabetis melitustip 1, psorijaza, lupus, ulcerozni kolitis, vitiligo, celijakija, vaskulitis, dermatomiozitis, polimiozitis, tirozitis (Hashimoto, Graves), mijastenija gravis, Guillain-Barrov sindrom, uveitis, lihen planus, temopralni artritis, sarkozi, sindrom suhosti (Sjogren), bronhijalna astma, pemfigus, ankilozantni spondilitis, sklerodermija, fobromijalgija ili reumatska groznica.

[0030] U specifičnoj izvedbi, pronalazak je namenjen za primenu MTA, njegovih farmaceutski prihvatljivih soli, i/ili prolekovi, za pripremu leka predviđen za prevenciju i/ili lečenje MS-a, specifično, u lečenju MS-a, i, još specifičnije, za prevenciju i/ili lečenje MS-a pri odgađanje pojave dopunskog izbijanja, ili progresije oboljenja (progresivna faza) kod individue koja boluje od MS-a, pr., nakon početka MS-a. Ispitivanja koja su izvršena od strane pronalazača pokazali su da, kao dopuna prefentivne efikasnosti MTA za razvoj autoimuniteta, promatrani pri lečenju EAE kod Lewis-ovog miša imuniziran sa MBP (akutni EAE model), MTA takođe poseduje lekoviti efekt za hronični autoimunitet, budući da tretman sa MTA poboljšava kliničke simptome i preživljavanje kada je oboljenje (MS) već počelo, što je i potvrđeno kod CR-EAE modela sa DA miševima imunizirani rMOG-om. Ovaj aspekt je od velikog značaja, uobičajeno, imunomodulatorske terapije mogu biti upotrebljene samo nakon što je bolest počela, bilo bi nemoguće sprovesti preventivno lečenje budući da ne postoje pre-simptomski markeri.

[0031] U drugoj specifičnoj izvedbi, pronalazak se odnosi na upotrebu MTA, njegovif farmaceutsko prihvatljivih soli, i/ili prolekove, za pripremu leka predviđen za prevenciju i/ili lečenje odbacivanje transplantata. MTA, njegove farmaceutsko prihvatljive soli, i/ili prolekovi mogu biti upotrebljeni za prevenciju i/ili lečenje praktično bilo koo transplantata. Primeri vakvih tarnsplantata uključuje ali se ne ograničava na: bubreg, jetru, srce, pluća, creva, hematomska i leđne moždine, koža, limfa, rožnica, pankreas, matične ćelije i ćelijne terapije, presadaka ili bioloških materijala.

[0032] U drugom aspektu pronalazak se odnosi na metod prevencije i/ili lečenje autoimunih bolesti kod individue koja pati od autoimune bolesti, koji sadrži administraciju terapeutsko efektivne količine MTA, ili jedan od njegovih faramceutsko prihvatljivih soli i/ili prolekovi, pomenutoj individui. Gore definirani, Autoimune bolesti koji mogu biti lečeni, karakteristični su po administraciji, farmaceutskom sastavu i terapeutsko efektivnog iznosa MTA-e. U specifičnoj izvedbi, pomenuta autoimuna bolest pretstavlja MS. MTA, njegovi farmaceutsko prihvatljivi soli i/ili prolekovi mogu, u specifičnoj izvedbi, biti upotrebljeni za odgađanje pojave dopunskog izbijanja kod individue koja boluje od MS ili za odlaganje progresije MS-a (progresivna faza) kod individue koja boluje od MS.

[0033] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na metod za prevenciju i/ili lečenje odbacivanje transplantanta kod individue koja treba primiti transplantant ili koja je već primila transplantat, koji se sastoi od administracije terapeutsko efektivne količine MTA, ili jedan od njegovih faramceutsko prihvatljivih soli i/ili prolekovi, pomenutoj individui. Primeri transplantata, ne ograničeni samo tome, odbacivanja koji mogu biti sprečeni ili lečeni pomoću MTA-e, njegovi farmaceutsko prihvatljivi soli i/ili prolekovi već su pomenuti, karakteristični po tipu administracije, farmaceutskom sastavu i terapeutsko efektivnom iznosu MTA. Pomenuti farmaceutski sastav može biti administriran ili pre ili posle transplantacije (za profilaktičke ili teraputske ciljeve) ili osim toga pre i posle transplantacije, pa čak i ako ne postoje inicijalni simptomi odbacivanja (za profilaktičke ciljeve).

[0034] Ovde upotrebljen, termin "individua" odnosi se na bilo koji sisavac i uklljučuje, ali se ne ograničava na, kučne ljubimce, glodare, primate i ljude. Radije,pomenuta individua je ljudsko biće, žena ili muškarac, bilo kojeg uzrasta ili rase.

[0035] U specifičnoj izvedbi pronalaska, administracija MTA je izvršena samostalno ili u kombinaciji sa drugim terapijama ili drugim lekovima, u formi kombinirane terapije.

[0036] Sledeći primer daje prikaz pronalaska i ne treba biti shvaćen kao ograničavanje njegovog opsega.

PRIMER

[0037] Budući da se u 1970-ih, verovalo da je akutni Eksperimentalni Autoimuni Encefalomielitni (EAE) model, model za Multiplu Sklerozu (MS) pa , zbog toga, efikasni tretman akutne EAE bio bi takođe efikasan za MS. U svakom slučaju, ispitana su stotina jedinjenja koja bi bili efikasni u tretmanu akutne EAE, ali ne i za MS (Hohlfield R. & VVekerle H. Proceeding National Academv of Sciences USA, October 2004, Vol. 101, Suppl. 2, page 14,599, heading: MS and EAE, paragraph 3). U odnosu na ovo, kao dopuna predočene efikasnosti za prevenciji akutne EAE, neophodno je pokazati efikasnost pri lečenju hronične - povratne EAE (model za MS u onovi). Sa obzirom na ovo, u ovom Primeru dva ne-ljudska modela životinje upotrebljeni su za prikaz efikasnosti MTA za lečenje autoimune bolesti i, u osnovi, MS-a; specifično, (i) akutna EAE kod Lewis-ovog miša imuniziran sa MBP [model za izbijanje MS i za akutni diseminirani Encefalomielitis (ADE) i (ii) hronični-periodični EAE (CR-EAE) kod Crnih Agouti miševa (DA) imunizirani MOG-om [model za MS].

I. Materijali i Metode

Životinje

[0038] Za potrebu modela akutne EAE dobijene imunizacijom mielin osnovnog proteina (MBP), 6-8-nedelja-star. 175-200 grama, upotrebljen je Charles-River Lewis-ov miš.

[0039] Za potrebu modela hronično-periodične EAE dobijene imunizacijom oligodendrocit glikoprotein (MOG), upotrebljeni su crni Agouti (DA), sa približnom težinom od 200 grama.

[0040] Životinje su udomljene u elastičnim kafezima u sobi sa prirodnim osvetljavanjem i svakodnevno opskrbljeni hranom i vodom.

EAE indukcijairezultati

[0041] Lewis-ovi miševi su imunizirani sa 100ul emulzija koja sadrži rastvor salina i nekompletni Freund-ov adjuvans (IFA) sa 75ug MBP-a (fragment 68 - 82 mielin osnovni protein gvinejske svinje (Sigma), u podjenakom volumenu, i dopunjen sa 4mg/ml Mvcobacterium tuberculosis H37A (Difco). Imunizacija je izvršena u obe stražnje noge.

[0042] DA miševi su imunizirani sa 100ul emulzije koja sadrži salin rastvor i nekompletni Freund-ov adjuvans (IFA) sa 75ug rMOG [ Villoslada, P., et al., J.Exp Med, 2000.191 (10): 1799-806] (pročišćeni u našoj labaratoriji) u jednakom volumenu i takođe dopunjeno sa 4mg/ml Mvcobacterium tuberculosis. Imunizacija je izvršena u obe stražnje noge, kao što je bio slučaj i kod Lewis-ovog miša.

[0043] Životinje su izmerene a klinički simptomi EAE su ispitani svakodnevno pomoću tretmana sa slepim ocenjivačem. Ozbiljnost EAE je merena pomoću sledeće skale: 0 + normalno; 1 = mršavo; 2 = mala parapareza stražnje noge; 3 = nestabilno kretanje, 4 = tetrapareza, 5 = smrt.

Tretmani

[0044] Lewis-ovi miševi imunizirani sa MBP su proizvoljno podeljeni u 2 grupe. Jedna grupa je lečena sa MTA (1 OOum koncentracija) na dozi od 4.3mg / životinja (ekvivalentno na 28.6ug/kg telesne težine). MTA je sintetiziran od SAM(Europharma, Madrid (Spain)), sleđenjem procedure koju je opisao SchlenkF.et al., Arch.Biochem.Biophvs., 1964, 106:95-100, na Hepatološkom odeljenu i odeljenju Genetske terapije katedre Interne mMedicine, CIMA, Universitv of Navarra, rekonstituirani u 10% dimetilsulfoksid (DMSO), dok su ostale placebo grupe tretirani fiziološkim serumom i 10% DMSO putem intraperitonealne injekcije (i.p.) svakodnevno posle imunizacije.

[0045] DA miševi su imunizirani rMOG-om i proizvoljno podeljeni u 2 grupe. Jedna grupa je lečena sa 100um MTA rekonstruirana u 300mM Tris pH = 7.8, dok ostale placebo grupe lečeni su samostalno sa 300 mM Tris-a. Tretmani počinju 15-tog dana posle imunizacije svakodnevno pomoću i.p. injekcija. Rezultati su "slepo ocenjivani" za vreme celog trajanja bolesti.

Primerci tkiva

[0046] Dve grupe Lewis-ovih miševa primili su anestiziju i injektirani putem intrakardijalne rute sa 4% formaldehid u 0.1 M fosfatnom baferu (pH 7.6) 16-tog dana bolesti. Ekstrahirani su delovi moždane, vratne, torakalne i lumbarne kičmene moždine i pričvršćeni tokom noći na 4°C. Posle pričvršćivanja, tkiva su potopljena u parafin za histopatologiju i imunohistohemiju.

[0047] Dve grupe Lewis-ovih miševa takođe su primili anesteziju i injektirani su putem

intrakardijalne rute sa 4% formaldehidom u 0.1 M fosfatnom baferu (pH 7.6) 16-tog dana bolesti. Ekstrahirani su delovi moždane, vratne, torakalne i lumbarne kičmene moždine i pričvršćeni tokom noći na 4°C. Posle pričvršćivanja, tkiva su potopljeni u parafin da bi se obavili histopatološka i imunohistohemijska ispitivanja.

[0048] Od svake životinje uzeti su primerci slezine, jetre, i krvi. Slezine i jetre brzo su zamrznuti u tečnom azotu i čuvani u delovima na -80°C kako bi se omogućilo sprovođenje istraživanja sa RT-PCR (obrnuta transkripciona i polimerna lančana reakcija). Krv je centrifugirana na 800rpm u vremetrajanju od 10 minuta kako bi se doobio serum, koji je nakon toga čuvan na -80°C.

RNA izolacijaicDNA sinteza

[0049] Segmenti tkiva slezine i jetre su homogenizirani u RNA lizin bafer sa 2% (3-merkaptoetanol pomoću ručnog homogenizatora. Celokupna RNA je ekstrahirana pomoću Rneasv Mini Kit (Ouiagen), sledeći upute proizvođača. U toku pročišćavanja RNA, DNA je eliminirana sa Dnase tretmanom. Koncentracija RNA i njena čistoća utvrđeni su merenjem absorbcije na 260nm i 280nm pomoću spektrofotometrije (Eppendorf). Reverzibilna transkripcija ukupne RNA izvršena je upotrebom High Capacitv cDNA Archive Kit (Appied Bioszstems). Reakcija reverzibilne transkripcije je izvršena na 25°C u vremetrajanju od 10 minuta, 37°C u vremetrajanju od 2 časa, i na kraju čuvani na 4°C.

Prajmeriioblik probe

[0050] Upotrebljeni su fluoroscentno formatirani Taqman-ovi sekvencni prajmeri i

korišćene specifične probe (Taqman Gene Expression Assavs) (Applied Biosvstems) na eukariotsku rRNA 18S, interferon-gama (IFN-y), interleukin 2 (IL-2), alfa faktor tumorne nekroze (TNF-a), interleukin 10 (IL-10) i inducirana sintaza natrijumovog oksida (iNOS).

Kvantitavni realnovremenskiPCR

[0051] Za potrebe kvantitavno-vremenskog PCR-a, upotrebjen je TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosvstems). Amplifikacija cDNA izvršena je na ploči sa 96 otvora (MJ Research, Inc.) na Opticon 2 realno vremenski sistem (MJ Research). Reakcija je izvršena na 25ul finalnom rektivnom mešavinom sačinjenom od 1 x Taqman Universal Master Mix, 1 x TaqMan Gene Expression Assaz Mix (0.9uM iz svakog prajmera i 0.35 uM po probi), i 20ng cDNA rastvorena u Rnase i Dnse-slobodnu vodu.

[0052] Uslovi pri kojim se reakcija obavlja su sledeći: 2 min na 50'C, 10 min na 95°C, i 15 ciklusa na 95"C i 1 minuta na 60°C. Svaki primerak je napunjen i tripliciran i, na svakoj ploči, zatemnjen dok endogena kontrola pojačana na različitim pločama.

[0053] Izmereni su iznosi nivoa izražavanja za IL-2, IFN-y, TNF-a, IL-10 i iNOS mRNA u odnosu na rRNA 18S suštinske gene.

Histopatologija,Inflamacija, idemijenilacija

[0054] Histološka procena delova moždane i kičmene moždine izvršena je u parafinu. Delovi su obojeni hematoxilin-eozin (HE) i Luxol fast-blue kako bi bili sposobni za procenu inflamacije i demielinacije tkiva. Ispitani su 24-30 sagitalni delovi svakog miša. Zatemnjena polu-kvantitativna histološka procena inflamacije i demijelinacija izvršena je saglasno prethodnom opisu [Villoslada, P., et al., Exp Med, 2000.191(10): 1799-806].

Imunohistohemija

[0055] Imunohistohemiske procedure su izvršene na 10 pm mozga a delovi moždine potopljeni u parafin. Aktivnost endogene peroksidaze je deaktivirana pomoću 0.3% H202u metanolu u vremetrajanju od 20 minuta.

[0056] Delovi su inkubirani u vremetrajanju od 30minuta u PBS-u sa 0.5% Tween® 20 i 10% kozjim ili konjskim serumom (Vector laboratorios) u vremetrajanju od 2 časa u PBS-u sa 0.5% Tween® 20 dok osnovna antitela u sledećim rastvorima: zečje antiglialno fibrilarno kiselinsko poliklonalno anti-proteinsko antitelo (GFAP), 1:1,000 (Dakocitomacija); mišje beta-amiloid prekusorsko anti-proteinsko antitelo (APP), 1:100 (zmed Laboratorios); mišje anti-lgA antitelo (OX-6), 1:200 (Serotec); mišje anti-CD8 antitelo, 1:250 (Serotec), anti-iNOS antitelo tip II, 1:250 (Serotec); mišje anti-CD68 antitelo (ED1), 1:200 (Serotec) i mišje anti CD-43 antitelo (VV3/13), 1:50 (Serotec). Nakon toga, delovi su oprani sa PBS-om i inkubirani u vremetrajanju od 45 minuta na sobnoj temperaturi sa odgovarajućem biotiliranim sekundanim IgG antitelom (1:100 u PBS-u; Vector Laboratorios), praćeno sa nekoliko pranja u PBS / Tvveen® i 45 minutna inkubacija na sobnoj temperaturi sa kompleksom avidinbiotin peroksidaze (ABC, Vector Laboratorios).

[0057] Posle pranja u PBS/Tween®, imunorekativnost je ustanovljena upotrebom 0.5mg/ml 3,3'-diaminobenzidin tetrahidrohlorat (DAB; Sigma). Imunoreaktivna specifičnost je određena inkubacijom delova bez osnovnih antitela. Slike su dobijene pomoću optičkog mikroskopa.

Test limfocitne proliferacije

[0058] Splenociti su pročišćeni putem Ficoll Hypaque gustom centrifugacijom počevši sa miševima koji imaju EAE i ne-imuniziranim miševima. Test limfocitne proliferacije je izvršen na isti način kao što prethodno opisano [Villoslada, P., et al., Exp Med, 2000.191(10): 1799-806].

[0059] Ukratko, splenociti su postavljeni u kulturi pri koncentraciji od 2 x 10<6>/ml u RPMI 1640 medijumu dopunjen sa 10% serumom goveđeg fetusa i penicilin/sterptomicin u prisustvu ili otsustvu fitohemaglutinin (PHA, 5ug/ml), MBP (10ug/ml), MTA (100uM) i DMSO. Kulture su inkubirani u vremetrajanju od 96 dana na zaobljenoj ploči sa 96 otvora (0.2 ml/otvor) na 37°C. Otvori su glađeni sa 0.5u Ci [<3>H]TdR u vremetrajanju od 18 časova. Očitavanje je izvršeno pomoću tečnog scintilatorskog brojača. Rezultati su izraženi kao srednji stimalacijski indeks triplicirane determinacije.

Statističke analize

[0060] Statistističko upoređenje je izvršeno upotrebom Mann-Whitney dvo jazolnim testom i krive preživljavanja, Vrednosti p<0.05 smatraju se suštinkim razlikama. Statistička procena je obavljena upotrebom statističkog programa SPSS 11.0.

IIRezultati

Efekt MTA na razvoj modela nastanka MS (akutna EAE) kod Lewis-ovih miševa

imunizirani sa MBP

[0061] Počevši istog dana kao i imunizacija, Lewis-ovi miševi, slučajnim putem su postavljeni u grupu miševa lečeni sa MTA ili u placebo grupu, i svaki od njih podvrgnut su intraperitonealnoj (i.p.) administraciji na dnevnoj bazi. Sve životinje koji su dobili placebo lečenje osim jedne razvili su neurološke simptome EAE, koje se sastoje od progresivnog gubljenja težine, slabost u repu i paraliza zadnje noge ili srednja ili ozbiljna paraplegija. Prvi neurološki sistemi pojavili su se 12-tog dana, srednja vrednost dana početka oboljenja 13.6 ± 1.2 (n = 21). Maksimalni postignuti rezultat po individualnu životinju za vreme eksperimenta bio je 1.48 ±1 (Tabela 1).

[0062] Suprotno, one životinje koji si lečeni MTA-om ili nisu pokazali bilo kakve kliničke naznake ili suprotno pokazali su jako mršavljenje za vreme toka bolesti. One lečene životinje koji su razvili kliničke simptome, početak bolesti je odgođen u poređenju sa životinjama iz placebo grupe (dan 15 ± 1.2). Uočeni maksimalni klinički rezultati bitno su manji od one iz placebo grupe (0.14 ± 0.23) (Tabela 1) (Slika 1).

Efekt MTA na razvoj modela nastanka MS (CR-EAE) kod DA miševa imuniziranisa

MOG-om

[0063] Posle odvijanja prvog nastanka [5 dana posle početka prvog nastanka (približno otprilike 15-18 dana posle imunizacije)], DA miševi slučajnim putem su postavljeni u grupu miševa lečeni sa MTA ili u placebo grupu, i svaki od njih podvrgnut intraperitonealnoj (i.p.) administraciji na dnevnoj bazi. Sve životinje koji su razvili drugi nastanak bolesti, pa i razlike između dve grupe u neurološkim simptomima, ozbiljnost drugog nastanka i preživljavanja bila je ozbiljna. Kod onih životinja lečeni sa MTA, početak drugog nastanka bio je odgođen u poređenju sa one iz placebo grupe (dan 23.4 ± 6.54), iako razlike nisu bile značajne. Uočeni maksimalni klinički rezultati buli su manji kod placebo grupe (2.7 ± 1.75) (Tabela 2) (Slika 2). Osim toga, procent preživljavanja je značajno veći kod grupe tretirana sa MTA (Slika 3).

Test limfocitneproliferacije

[0064] Kako bi se odredilo dali lečenje sa MTA modificira odgovor periferialnog imunološkog sistema upotreblen u imunizaciji, izmereni su odgovori proliferacije inducirane MBP u splenocitima životinja lečeni sa MTA i placebo (kod Lewis-ovih miševa). Odgovori proliferacije specifične MBP bili su značajno niži kod one životinje lečeni sa MTA, kao što se može videti na slici 4. Prema tome, indeks stimulacije one grupe lečena sa MTA iznosio je 1.18 ± 0.4 dok kod grupe lečena placeb-om iznosio je 2.13 ± 1.09. To pokazuje da MTA lečenje utiče na odgovore T ćelija. Zbog toga, zapaženo ja da MTA inhibira MBP-specefičnu limfocitnu aktivaciju, koji ističe njegov imunološki efekt.

MTA modifikacije izražavanje citokina i pro-inflamatornih mediatora

[0065] Vršila se procena dali MTA ima kapacitet za modifikaciju izražavanja citokina i ostalih pro-inflamatornih medijatora. IL-2, IFN-y, TNF-a, IL-10 i iNOS izražavanje gena je analizirano pomoću kvantitativnog realno-vremenskog PCR-a (RT-PCR). Relativni nivo mRNA ovih izoliranih gena splenocita kod placebo Lewis-ovih miševa i kod miševa lečeni sa MTA prikazani su na slici 5. mRNA izražavanje pomenutih citokina bilo je manje u poređenju sa životinje iz placebo grupe iako su samo nivo TNF-a nivoa bili suštinsko različiti.

Histološke analize

[0066] Neuropatološka procena potvrđuje utvrđene kliničke zaštite. Isptivanjem kičmene moždine i mozga kod placebo životinja utvrđena je višekratna inflamacija foci. Inflamatorna narušavanja su pronađena kod obe bele ili sive građe vratne, torakalne i lumbarne kičmene moždine, mozga. Kod onih miševa lečeni sa MTA, utvrđeno je snižavanje broja i veličine inflamatornih infiltrata (Slika 6). Postoje suštinske razlike između placebo životinja i one životinje lečeni sa MTA u ozbiljnosti kao i u regionima pod uticajem centralnog nervnog sistema. Tretman sa MTA inhibira razvoj inflamatorne EAE kod Lewis-ovih miševa imunizirani sa MBP. Imunohistohemijska mrlja otkriva prisustvo nekoliko tipova ćelija kod inflamatornih infiltrata, uključujući makrofage i aktivirane mikroglialne ćelije (ED1), T limfociti (W3/13) i B limfociti (OX-6). Broj pozitivnih ED1 i VV3/13 ćelija bio je veći u placebo grupi, dok obe životinjske grupe pokazale su iste proporcije pozitivnih OX-6 ćelija. Otkriveno je da mrlje kod APP i iNOS-a imaju niski nivo detekcije kod obe grupe.

III Diskusija

[0067] EAE je model autoimuniteta koji ima kritičnu zavisnost od aktivacije T ćelija. MBP ili MOG specifične ćelije i CD4+ ćelije, dva CNS autoantigena, mogu inducirati EAE. Limfocitna aktivacija neophodna je za početni ulazak u CNS. Prepoznavanje antigena od strane CD4+ T ćelije iziskiva izražavanje MHC molekule klase II u antigen prisutne ćelije (APC). U normalnim uslovima, CNS ima veoma malo izražavanje ovih molekula. Posredstvom izlučivanja IFN-v, potentni stimulator izražavanja MHC molčekule klasa II kod antigen prisutnih ćelija boravi u CNS-u, tako da mikroglialne ćelije i astrociti, Th1 ćelije prepoznavaju mielin. Zbog toga, lečenje koje dolazi u sukob sa aktivacijom T limfocita može inhibirati razvoj autoimunih oboljenja, kao što je EAE.

[0068] Smanjenje odgovora MBP specifične proliferacije kod Lewis-ovih miševa imunizirani sa MBP-om i lečeni sa MTA otkriva da je metalitacija kritični korak za aktivacije limfocita. Selektivna inhibicija reaktivnih T ćelija protiv MBP štiti aktivaciju autoreaktivnih limfocita i ulazak inflamatornih ćelija u CNS kroz proizvodnju citokina i/ili hemokina. Ovo dovodi, kao posledica, do manje ozbiljnih bolesti kao što se može videti na EAE kliničkoj skali i u histološkim analizama onih životinja lečeni sa MTA. Kumulativna EAE skala kod grupe koja je lečena sa MTA, značajno je manja od one kod placebo grupe a histološke analize pokazuju da je broj inflamatornih povreda smanjen.

[0069] Kao dopuna preventivnog efekta MTA za razvoj autoimuniteta opažen kod prevencije EAE-om kod Lewis-ovih miševa, zapaženo je da MTA takođe poseduje lekovit efekt za hronični autoimunitet. Lečenje MTA-om poboljšava kliničke simptome i preživljavanje otkako je bolest već započela (posle prvog izbijanja), kao što je i potvrđeno kod EAE modela sa DA miševa imunizirani MOG-om. Ovo gledište je od kritičkog značaja za medicinu, budući da imunomodulatorna lečenja u praksi mogu biti upotrebljeni kada je oboljenje već počelo, bez ikakve mogućnosti za momentalno obavljanje preventivnog lečenja, budući da ne postoje pre-simptomatski markeri.

[0070] Citokini koji su stvoreni od strane T ćelija mogu bitno uticati na sami tok bolesti. Kao što se može videti od Slike 5, donje nivo citokinskog izražavanja pronađene je kod onih miševa koji su lečeni sa MTA. Jedna od karakteristika EAE je aktivacija iNOS izražavanja kod različitih tipova ćelija. Pronalazači su opazili da je iNOS izražavanje manje u slezini miševa koji su lečeni sa MTA. TNF pretstavlja citokin koji je prepoznatljiv kao centralni medijator sistemske inflamacije i koji, osim toga, doprinosi za aktivaciju iNOS genetičkog izražavanja. U ovom EAE modelu (CR-EAE), zapaženo je da MTA takođe reducira nivo TNF-a. IL-2 je ključni citokin kod T-zavisnog imunog odgovora zbog njegovu snažnu aktivnost kao faktor razvoja T-ćelija. Dobijeni rezultati pokazuju da MTA smanjuje stvaranje IL-2 limfocita inhibirajući specifičnu aktivaciju T-ćelija. Ipak, ova molekula je sposobna za smanjenje stvaranja IFN-y. Svi ovi MTA efekti pokazuju da su sposobni da modifikuju balans citokina u odnosu na više anti-inflamatornih profila.

[0071] Kao zaključak, izvršena ispitivanja pokazuju da MTA štiti od autoimuniteta EAE modela kod Lewis-ovih miševa imunizirani sa MBP (akutna EAE) i modificira i poboljšava, pr., pokazuju terapeutski efekt na, oboljenja kod (ironičnog EAE modela kod DA miševa inunizirani sa rMOG (CR-EAE). Mehanizam koji je odgovoran za ove zaštitne efekte je inhibicija MBP ili MOG specifična aktivacija T-ćelija, iako ostale regulatorne rute mogu doprineti u zaštiti. Ovi pronalasci otvaraju vrata novim potencijalnim lečenjima autominih bolesti i odbacivanje transplantata primenom leka kojeg je lako sintetizirati, efikasan i sa nekoliko sekundarnih efekta, koji bi pretstavljao značajan progres u lečenju ovih bolesti.

Claims (7)

1. Upotreba 5'-metiltioadenozina (MTA), njegovih farmaceutski prihvatljivih soli i/ili prolekova, gde su navedeni prolekovi esteri ili amidi MTA koji, nakon što su primenjeni na osobi, daju MTA, direktno ili indirektno, navedenoj osobi, za pripremu leka za (i) prevenciju i/ili liječenje autoimune bolesti ili za (ii) prevenciju i/ili liječenje odbacivanja transplantata.

2. Upotreba u saglasnosti za patentnim zahtevom 1, gde je navedena autoimuna bolest Multipla Skleroza (MS), Chronova bolest, reumatoidni artritis, dijabetes melitus tipa 1, psorijaza, lupus, ulcerozni kolitis, vitiligo, celijakija, vaskulitis, dermatomiozitis, polimiozitis, tirozitis (Hashimoto, Graves), mijastenija gravis, Guillain-Barrov sindrom, uveitis, lihen planus, temporalni artritis, sarkoidoza, suhi sindrom (Sjoegren), bronhijalna astma, plikovnjača, ankilozantni spondilitis, sklerodermija, fibromialgija ili reumatska groznica.

3. Upotreba u saglasnosti sa patentnim zahtevom 1, gde je navedena autoimuna bolest Multipla Skleroza (MS).

4. Upotreba u saglasnosti sa patentnim zahtevom 3, gde navedeni lek odgađa nastup početka kod osobe koja boluje od MS-e ili odgađa progresiju MS-e (progresivna faza) kod osobe koja boluje od MS-e.

5. Upotreba u saglasnosti sa patentnim zahtevom 1, gde se navedeni transplantat odabire iz bubrega, jetre, srca, creva, hematopoetske i leđne moždine, kože, uda, rožnice, gušterače, matične ćelije i ćelijne terapije, i presadaka ili bioloških materijala.

6. Upotreba u saglasnosti sa patentnim zahtevom 1, gde je navedeni lek odabran za oralnu, subkutanu, intraperitonealnu ili intravenoznu primenu.

7. Upotreba u saglasnosti sa patentnim zahtevom 1, gde se navedeni lek primenjuje u kombinaciji sa drugim dodatnim lekovima koji su korisni u primeni i/ili lečenju autoimunih bolesti ili odbacivanju transplantata.