RS51180B - Interleukin-10 antitela - Google Patents

Abstract

Molekul humanizovanog rekombinantnog antitela koji vezuje IL-10 ili njegov vezujući fragment, naznačen time što sadrži:najmanje jedan varijabilni region lakog lanca antitela ili njegov vezujući fragment, koji sadrži polipeptid koji ima varijabilni region SEQ ID NO: 4; inajmanje jedan varijabilni region teškog lanca antitela, ili njegov vezujući fragment, koji sadrži polipeptid koji ima varijabilni region SEQ ID NO: 9.Prijava sadrži još 17 patentnih zahteva.

Description

INTERLEUKIN-10 ANTITELA

Oblast pronalaska

[0001]Predstavljeni pronalazak se generalno odnosi na interleukin-10 (IL-10) specifična antitela i njihovu primenu. Naročito, pronalazak se odnosi na humanizovana antitela koja prepoznaju humani IL-10 i moduliraju njegovu aktivnost, naročito kod autoimunih poremaćaja.

Osnova pronalaska

[0002]Početno poznat kao faktor inhibicije sinteze citokina ili CSIF, interleukin-10 (IL-10) je snažan imunomodulator hematopoetskih ćelija, naročito imunih ćelija. Ćelije, kao što su aktivirane Th2 ćelije, B ćelije, keratinociti, monociti i makrofage, proizvode IL-10. Videti, npr., Moore et al., Annu. Rev. Immunol. 11:165 (1993). IL-10 inhibira aktivaciju i efektorne funkcije određenog broja ćelija koje obuhvataju T ćelije, monocite i makrofage. Naročito, IL-10 inhibira sintezu citokina, uključujući IL-1, IFN-y i TNF, od strane ćelija kao što su Thl ćelije, ćelije prirodne ubice, monociti i makrofage. Videti, npr., Fiorentino et al., J. Exp. Med., 170:2081-2095 (1989); Fiorentino et al., J. Immunol. 146:3444 (1991); Hsu et al., Int. Immunol. 4:563 (1992); Hsu et al., Int. Immunol. 4:563 (1992); D'Andrea et al., J. Exp. Med. 178:1041 (1993); de Waal Malefvt et al., J. Exp. Med. 174:915 (1991); Fiorentino et al., J. Immunol. 147:3815(1991).

[0003]Višestruki patogeni, naročito unutarćelijski patogeni, indukuju proizvodnju IL-10 da bi usporili ili potpuno zaustavili efikasno uklanjanje patogena preko imunog odgovora. Moore et al., Annu. Rev. Immunol. 11:165 (1993). Na primer, u limfocitima krvi od pacijenata sa HlV-om, leprom ili tuberkulozom, limfociti periferne krvi su tipično neaktivni ili ne daju odgovorin vitrokada im je dodat patogen. Međutim, neutralizacija IL-10 ovde je pokazala daje aktivni efektorni odgovor, tj., Thl rcaktivnost, bio prisutan u ovim ćelijama. Na taj način, vcruje se da patogen efikasno regrutuje IL-10 da bi olakšao njegovo infektivno stanje.

[0004]IL-10 je takođe povezan sa autoimunitetomin vivo.Autoimunitet nastaje razvojem od autoantitela, autoreaktivnih T ćelija ili neke njihove kombinacije koja ciljno deluje na normalno tkivo. Jedan primer autoimune bolesti je sistemski lupus eritematodes (SLE), hronična reumatska bolest kod koje vezivno tkivo u ćelom telu postaje upaljeno. Autoantitela koja napadaju normalno tkivo kao daje u pitanju invazija iz spoljašnje sredine imaju za rezultat karakterističnu inflamaciju. Iako se tačan uzrok ne razume u potpunosti, istraživači veruju da ima i genetičke i sredinske komponente. Naročito, hiperaktivnost B-ćelija i prisustvo različitih autoantitela karakterišu SLE. Tipično, IgG autoantitela reaktivna prema DNK sa dvostrukim lancem (IgG anti-dsDNA abs) povišena su kod pacijenata sa SLE. Između 60 i 70% SLE pacijenata proizvode IgG anti-dsDNA abs, od kojih su neki nefrotoksični. SLE je deset puta zastupljeniji kod žena nego kod muškaraca, sa simptomima u opsegu od osipa po licu do disfunkcije organa koji može da dovede do invaliditeta i koji je potencijalno opasan po život. On sc može razviti u bilo kojoj životnoj dobi, ali je najčešći kod mlađih odraslih osoba.

[0005]Brojna ispitivanja podržavaju ulogu IL-10 u patologiji povezanoj sa SLE. Na primer, dok IL-10 tipično ne proizvode ćelije bez odgovarajuće stimulacije, i B ćelije i makrofage iz SLE pacijenata spontano proizvode visoke nivoe IL-10in vitro.Llorente, et al., Arthritis Rheum. 40:249-60 (1997). U nekoliko studija, istraživači su pokazali korelaciju između nivoa IL-10 u serumu i aktivnosti bolesti. Pored toga,in vivoiin vitrostudije su pokazale da blokada proizvodnje IL-10 može da ublaži kliničke manifestacije SLE. Videti, npr., Gonzalez-Amaro, et al. J. Autoimmunitv 11:395-402 (1998).

[0006] Do danas, jedna od manifestacija SLE, lupus nefritis, tretirana je preko primene imunosupresivnih terapija, npr., kortikosteroida i ciklofosfamida. Iako efikasne, ove terapije su nespecifične i imaju značajnu toksičnost koja sprečava dugotrajnu terapiju. Na taj način, specifična neutralizujuća antitela mogu biti efikasni antagonisti IL-10, omogućavajući uklanjanje supresivnih efekata IL-10, ostavljajući istovremeno ostali deo imunog odgovora intaktnim. DE 19529 026 opisuje mišja antitela protiv IL-10. Najznačajnije ograničenje kod primene antitela kao terapeutskog sredstvain vivoje imunogenost antitela. Kako se većina monoklonalnih antitela izvodi od glodara, ponavljana primena kod ljudi ima za rezultat stvaranje imunog odgovora protiv terapeutskog antitela. Takav imuni odgovor ima za rezultat gubitak terapeutske efikasnosti na minimumu i potencijalni fatalni anafilaktički odgovor na maksimumu. Početni napori za smanjenje imunogenosti antitela glodara obuhvatali su proizvodnju himcrnih antitela, u kojima su mišji varijabilni regioni bili fuzionisani sa humanim konstantnim regionima. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439 (1987). Međutim, miševi koji su primali injekcije sa hibridima humanih varijabilnih regiona i mišjih konstantnih regiona razvijaju snažan anti-antitelo odgovor usmeren protiv humanog varijabilnog regiona, što sugeriše da zadržavanje celog Fv regiona glodara u takvim himemim antitelima može i dalje da ima za rezultat neželjenu imunogenost kod pacijenata.

[0007] Generalno se veruje da petlje regiona koji određuje komplementarnost (CDR) varijabilnih domena sadrže mesto vezivanja molekula antitela. Prema tome, graftovanje CDR petlji glodara na humane okvirne regione (tj., humanizacija) pokušano je da bi se dodatno smanjile sekvence glodara. Jones et al., Nature 321:522 (1986); Verhoeven et al., Science 239:1534 (1988). Međutim, izmene CDR petlje još uvek ujednačeno ne daju antitelo sa istim osobinama vezivanja kao početno antitelo. Promene u ostacima okvirnih regiona (FR), ostacima uključenim u pomoćne regione CDR petlje, u humanizovanim antitelima takođe su potrebne za očuvanje afiniteta vezivanja antitela. Kabat et al., J. Immunol. 147:1709 (1991). Iako je već objavljeno korišćenje graftovanja CDR i očuvanje ostataka regiona osnove u određenom broju humanizovanih konstrukata antitela, teško je predvideti da li će određena sekvenca dati antitelo sa željenim vezivanjem i nekada i biološke osobine. Videti, npr., Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029 (1989), Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181 (1991), i Hodgson, Bio/Technology 9:421 (1991). Pored toga, većina ranijih ispitivanja koristila je različite humane sekvence za varijabilne sekvence teškog i lakog lanca životinja, stavljajući pod znak pitanja prediktivnu prirodu takvih ispitivanja. Korišćene su sekvence poznatih antitela ili, tipičnije, onih antitela koja imaju poznate rendgenske strukture, antitela NEW i KOL. Videti, npr., Jones ct al., supra; Verhoeven et al., supra; i Gorman et al., supra. Tačna informacija sekvence objavljena je za samo nekoliko humanizovanih konstrukata.

Kratak rezime pronalaska

[0008] Predstavljeni pronalazak se odnosi na molekule humanizovanog rekombinantnog antitela koji vezuje IL-10 ili njegove vezujuće fragmente, koji sadrže: najmanje jedan varijabilni region lakog lanca antitela, ili njegov vezujući fragment, koji sadrži polipeptid koji ima varijabilni region SEQ ID NO: 4; i najmanje jedan varijabilni region teškog lanca antitela, ili njegov vezujući fragment, koji sadrži polipeptid koji ima varijabilni region SEQ ID NO: 9.

[0009]Antitela mogu dalje da sadrže konstantni region teškog lanca, pri čemu konstantni region teškog lanca sadrži yl, y2, y3 ili y4 konstantni region humanog teškog lanca ili njegovu varijantu.

[0010]Pronalazak takođe daje izolovane nukleinske kiseline koje kodiraju odgovarajuće polipeptide, kao i ekspresione vektore koji sadrže nukleinsko kiselinsku sekvencu funkcionalno vezanu za kontrolne sekvence koje prepoznaje ćelija domaćin transficirana vektorom i ćeliju domaćina koja sadrži ove vektore.

[0011]Prema jednom aspektu, ove ćelije domaćini se mogu koristiti u postupcima za proizvodnju polipeptida, koji sadrže kultivisanje ćelije domaćinain vitropod uslovima u kojima je nukleinsko kiselinska sekvenca eksprimirana, na taj način proizvodeći polipeptid, i dobijanjem polipeptida iz ćelije domaćina.

[0012]U sledećem aspektu pronalazak daje kompozicije koje sadrže antitelo, ili njegov vezujući fragment, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili razblaživačem, pri čemu je antitelo - antitelo kao što je definisano u prethodnom tekstu.

[0013]Prema sledećoj varijanti pronalazak daje primenu antitela specifičnog za IL-10, ili njegovog vezujućeg fragmenta, u količini koja je efikasna da blokira biološku aktivnost IL-10 za pripremu leka za supresiju imunog odgovora kod humanog subjekta, pri čemu je antitelo - antitelo kao što je definisano u prethodnom tekstu i gde subjekat ima sistemski lupus eritematodes ili lupus nefritis.

[0014]U jednoj varijanti, antitela opisana u prethodnom tekstu dalje sadrže konstantni region teškog lanca, pri čemu konstantni region teškog lanca sadrži yl, y2, y3 ili y4 konstantni region humanog teškog lanca ili njegovu varijantu. U jednoj varijanti, antitela opisana u prethodnom tekstu dalje sadrže konstantni region lakog lanca, pri čemu konstantni region lakog lanca sadrži konstantni region lambda ili kapa humanog lakog lanca. U nekim varijantama, vezujući fragment ovih antitela je fragment antitela izabran iz grupe koju čine Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2i dvojna antitela.

[0015]Ovde je data kompozicija koja sadrži antitelo, ili njegov vezujući fragment, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili razblaživačem, pri čemu je antitelo jedno od antitela navedenih u prethodnom tekstu.

[0016]Ovde je dalje data izolovana nukelinska kiselina koja kodira polipeptid antitela navedenih u prethodnom tekstu. Ovde je takođe dat ekspresioni vektor koji sadrži izolovanu nukleinsko kiselinsku sekvencu funkcionalno vezanu za kontrolne sekvence koje prepoznaje ćelija domaćin transficirana sa vektorom. Ovde je data ćelija domaćin koja sadrži vektor koji sadrži izolovanu nukleinsko kiselinsku sekvencu. Ovde je dalje dat postupak za proizvodnju polipeptida, koji sadrži kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži vektor pod uslovima u kojima se nukleinsko kiselinska sekvenca eksprimira, na taj način proizvodeći polipeptid, i dobijanje polipeptida iz ćelije domaćina.

[0017]Ovde je data izolovana nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira antitelo specifično za IL-10 koje sadrži laki lanac koji ima nukleinsko kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19 i težak lanac koji ima nukleinsko kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20. U daljim varijantama, laki lanac ima kod American Type Culture Collection (ATCC) broj za deponovanje PTA-5923 i težak lanac ima ATCC broj za deponovanje PTA-5922.

[0018]Ovde je data izolovana nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira antitelo specifično za IL-10 koje sadrži laki lanac koji ima nukleinsko kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21 i težak lanac koji ima nukleinsko kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22. U sledećoj varijanti, laki lanac ima ATCC broj za deponovanje PTA-5925 i težak lanac ima ATCC broj za deponovanje PTA-5924.

[0019]Ovde je dalje data izolovana nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira vezujući fragment antitela koje kodiraju prethodno navedene nukleinsko kiselinske sekvence. U jednoj varijanti, vezujući fragment je fragment antitela izabran iz grupe koju čine Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv i F(ab')2.

Kratak opis crteža

[0020]Slika 1A prikazuje dodeljivanje broja ostataka i numeričke ocene za potencijalnu akceptorsku sekvencu klicine linije u odnosu na varijabilni deo lakog lanca anti-humanog IL-10 antitela, 12G8.

[0021]Slika 1B prikazuje dodeljivanje broja ostataka i numeričke ocene za potencijalnu akceptorsku sekvencu klicine linije u odnosu na varijabilni deo teškog lanca anti-humanog IL-10 antitela, 12G8.

[0022]Slika 1C prikazuje dodeljivanje broja ostataka i numeričke ocene za potencijalnu akceptorsku sekvencu klicine linije u odnosu na varijabilni deo lakog lanca anti-humanog IL-10 antitela, 11D8.

[0023]Slika ID prikazuje dodeljivanje broja ostataka i numeričke ocene za potencijalnu akceptorsku sekvencu klicine linije u odnosu na varijabilni deo teškog lanca anti-humanog IL-10 antitela, 12D8.

[0024]Slika 2A je profil koncentracije-vremena za 12G8 antitelo primenjivano i.v. kao što je opisano u Primeru III.

[0025]Slika 2B je profil koncentracije-vremena za 12G8 primenjen s.c. kao što jc opisano u Primeru III.

[0026]Slika 3 A prikazuje da primena humanizovanog anti-IL-10 antitela, SCH708980, daje otpornost na infekciju uzorkovanuLeishmania majorkod IL-10 transgenih miševa. Infekcija je određena merenjem otoka na tabanu pomoću šestara u naznačenim vremenima. 12G8 antitelo je primenjivano kao što je opisano u Primeru VI.

[0027]Slika 3B prikazuje da primena pacovskog anti-IL-10 antitela, 12G8, daje otpornost na infekciju uzrokovanuLeishmania majorkod IL-10 transgenih miševa. Infekcija je određivana merenjem otoka na tabanu šestarom u naznačenim vremenima. 12G8 antitelo je primenjivano kao što je opisano u Primeru VI.

Detaljan opis pronalaska

[0028]Radi jasnoće opisa, a ne radi ograničenja, detaljan opis pronalaska je podeljen u pod-delove koji slede.

A. Definicije

[0029]Osim ukoliko nije naznačeno drugačije, svi tehnički i naučni termini koji su ovde korišćeni imaju ista značenja kao što to obično podrazumeva stručnjak iz date oblasti tehnike kojoj ovaj pronalazak pripada. Ako je definicija koja je navedena u ovom delu suprotna ili na drugi način nije u skladu sa defincijom navedenom u patentima, prijavama, objavljenim prijavama i drugim objavama čije su reference ovde obuhvaćene, definicija data u ovom delu ima prednost u odnosu na definiciju koja je ovde obuhvaćena referencom.

[0030]Kao što je ovde korišćeno, "a" ili "an" označava "najmanje jedan" ili "jedan ili više."

[0031]Kao što je ovde korišćen, termin "antitelo" označava bilo koji oblik antitela ili njegov fragment koji ispoljava željenu biološku aktivnost. Na taj način, on se koristi u najširem smislu i naročito pokriva monoklonalna antitela (uključujući monoklonalna antitela cele dužine), poliklonalna antitela, multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela) i fragmente antitela sve dok oni ispoljavaju željenu biološku aktivnost.

[0032]Kao što je ovde korišćen, termin "IL-10 vezujući fragment" ili „njegov vezujući fragment" obuhvata fragment ili derivat antitela koji još uvek značajno zadržava svoju biološku aktivnost inhibicije aktivnosti IL-10. Prema tome, termin "fragment antitela" ili IL-10 vezujući fragment označava deo celog antitela, generalno njegov fragment koji se vezuje za antigen ili njegov varijabilni region. Primeri fragmenata antitela obuhvataju Fab, Fab', F(ab')2i Fv fragmente; dvojna antitela; linearna antitela; jednolančane molekule antitela, npr., sc-Fv; i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela. Tipično, vezujući fragment ili derivat zadržava najmanje 50% svoje IL-10 inhibitome aktivnosti. Poželjno, vezujući fragment ili derivat zadržava najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ili 100% svoje IL-10 inhibitome aktivnosti. Takođe je određeno da IL-10 vezujući fragment može da obuhvata konzervativne aminokiselinske supstitucije koje značajno ne menjaju njegovu biološku aktivnost.

[0033]Termin "monoklonalno antitelo", kao što je ovde korišćen, označava antitelo dobijeno iz populacije značajno homogenih antitela, tj., pojedinačna antitela koja populacija sadrži identična su, osim mogućih prirodnih mutacija koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonalna antitela su visoko specifična, usmerena protiv jednog antigenog epitopa. Nasuprot tome, uobičajeni preparati (poliklonalnih) antitela tipično obuhvataju veliki broj antitela usmerenih protiv (ili specifičnih za) različite epitope. Reč "monoklonalan" označava karakter antitela kao dobijen od značajno homogene populacije antitela, i ne bi ga trebalo tumačiti takvim da zahteva proizvodnju antitela pomoću bilo kog određenog postupka. Na primer, monoklonalna antitela koja se koriste u skladu sa predstavljenim pronalaskom mogu se napraviti pomoću hibridoma postupka koji su prvi opisali Kohler et al., Nature 256: 495 (1975), ili se može napraviti pomoću postupaka rekombinantne DNK (videti, npr., U.S. Pat. br. 4,816,567). "Monoklonalna antitela" takođe mogu biti izolovana iz biblioteka fagnih antitela korišćenjem tehnika opisanih u Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) i Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), na primer.

[0034]Monoklonalna antitela ovde naročito obuhvataju "himerna" antitela (imunoglobuline) u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan sa ili homolog odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz određenih sekvenci ili koja pripadaju određenoj klasi ili podklasi antitela, dok je preostali deo lanca (lanaca) identičan sa ili homolog odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim od druge biološke vrste ili koja pripadaju drugoj klasi ili podklasi antitela, kao i fragmente takvih antitela, sve dok oni pokazuju željenu biološku aktivnost (U.S. Pat. br. 4,816,567; i Morrison et al.. Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)). [0035|Kao što je ovde korišćen, termin "jednolančano Fv" ili "scFv" antitelo označava fragmente antitela koji sadrže VH i VL domene antitela, pri čemu su ovi domeni prisutni u jednom polipeptidnom lancu. Generalno, Fv polipeptid dalje sadrži polipeptidni linker između VH i VL domena koji omogućava da sFv formira željenu strukturu za vezivanje antigena. Za prikaz sFv, videti Pluckthun, THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

[0036]Kao što je ovde korišćen, termin "dvojna antitela" označava male fragmente antitela sa dva mesta za vezivanje antigena, gde ti fragmenti sadrže varijabilni domen teškog lanca (VH) povezan za varijabilni domen lakog lanca (VL) u istom polipeptidnom lancu (VH-VL). Korišćenjem linkera koji je prekratak da omogući sparivanje između dva domena na istom lancu, domeni su prinuđeni da se sparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i stvaraju dva mesta za vezivanje antigena. Dvojna antitela su potpunije opisana u, npr., EP 404,097; WO 93/11161; i Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).

[0037]Kao što je ovde korišćen, termin "humanizovano antitelo" označava oblike antitela koji sadrže sekvence iz nehumanih (npr., mišjih) antitela kao i humanih antitela. Takva antitela su himerna antitela koja sadrže minimalnu sekvencu izvedenu iz ne-humanog imunoglobulina. Uopšteno, humanizovano antitelo će sadržati uglavnom sve od najmanje jednog, i tipično dva, varijabilna domena, u kojima sve ili značajno sve od hipervarijabilnih petlji odgovaraju onima kod ne-humanog imunoglobulina i sve ili značajno sve od FR regiona su one od humane imunoglobulinske sekvence. Humanizovano antitelo izborno će takođe sadržati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično humanog imunoglobulina.

[0038]Kao što je ovde korišćen, termin "hipervarijabilni region" označava aminokiselinske ostatke antitela koji su odgovorni za vezivanje antigena. Hipervarijabilni region sadrži aminokiselinske ostatke iz "regiona koji određuje komplementarnost" ili "CDR"

(tj. ostaci 24-34 (LI), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) u varijabilnom domenu lakog lanca i ostatke 31-35 (Hl), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) u varijabilnom domenu teškog lanca; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National lnstitutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) i/ili one ostatke iz "hipervarijabilne petlje" (tj. ostaci 26-32 (LI), 50-52 (L2) i 91-96 (L3) u varijabilnom regionu lakog lanca i 26-32 (Hl), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) u varijabilnom regionu teškog lanca; Chothia and Lesk, J. Mol.

Biol. 196: 901-917 (1987)). Kao što jc ovde korišćen, termin "okvirni region" ili "FR" ostaci označava one ostatke varijabilnog regiona osim ostataka hipervarijabilnog regiona đefinisane ovde kao CDR ostaci.

[0039] Kao što je ovde korišćen, termin "konzervativna supstitucija" označava supstitucije aminokiselina koje su poznate stručnjacima iz date oblasti tehnike i mogu biti napravljene generalno bez promene biološke aktivnosti dobijenog moiekula. Stručnjaci iz date oblasti tehnike prepoznaju da, uopšteno, pojedinačne aminokiselinske supstitucije u ne-esencijalnim regionima polipeptida značajno ne menjaju biološku aktivnost (videti, npr., Watson, et al., Molecular Biologv of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Edition 1987)). Takvi primeri supstitucija poželjno se stvaraju u skladu sa onima navedenim u TABELI 1 kao što sledi:

[0040]Druge supstitucije su takođe dozvoljene i mogu se odrediti empirijski ili u skladu sa poznatim konzervativnim supstitucijama.

[0041] Kao što je ovde korišćen, termin "izolovani molekul nukleinske kiseline" označava molekul nukleinske kiseline koji je identifikovan i odvojen od najmanje jednog kontaminirajućeg molekula nukleinske kiseline sa kojim je obično vezan u prirodnom izvoru nukleinske kiseline antitela. Izolovani molekul nukleinske kiseline je u obliku ili postavci koji se razlikuju od onoga u kome se nalazi u prirodi. Izolovani molekuli nukleinske kiseline prema tome se razlikuju od molekula nukleinske kiseline po tome što on postoji u prirodnim ćelijama. Međutim, izolovani molekul nukleinske kiseline obuhvata molekul nukleinske kiseline sadržan u ćelijama koje obično eksprimiraju antitelo gde, na primer, molekul nukleinske kiseline je na mestu u hromozomu koje se razlikuje od onoga kod prirodnih ćelija.

[0042] Izraz "kontrolne sekvence" označava DNK sekvence neophodne za ekspresiju funkcionalno vezane kodirajuće sekvence u određenom organizmu domaćinu. Kontrolne sekvence koje su pogodne za prokariote, na primer, obuhvataju promotor, izborno operator sekvencu, i mesto za vezivanje ribozoma. Poznato je da eukariotske ćelije koriste promotore, poliadenilacione signale i pojačivače.

[0043] Nukleinska kiselina je "funkcionalno vezana" kada je postavljena u funkcionalnu vezu sa drugom nukleinsko kiselinskom sekvencom. Na primer, DNK za presekvencu ili sekretornu vodeću sekvencu funkcionalno je vezana za DNK za polipeptid ako je on eksprimiran kao preprotein koji učestvuje u izlučivanju polipeptida; promotor ili pojačivač je funkcionalno vezan za kodirajuću sekvencu ako utiče na transkripciju sekvence; ili mesto za vezivanje ribozoma funkcionalno je vezano za kodirajuću sekvencu ako je postavljeno tako da olakša translaciju. Generalno, "funkcionalno vezan" označava da su DNK sekvence koje su vezane - kontinuirane, i, u slučaju sekretorne vodeće sekvence, kontinuirane i u fazi čitanja. Međutim, pojačivači ne moraju biti kontinuirani. Vezivanje je postignuto ligacijom na prikladnim restrikcionim mestima. Ako takva mesta ne postoje, sintetički oligonukleotidni adapteri ili linkeri se koriste u skladu sa uobičajenom praksom.

[0044] Kao što su ovde korišćeni, izrazi "ćelija," "ćelijska linija," i "ćelijska kultura" koriste se naizmenično i sve te oznake obuhvataju potomstvo. Na taj način, reci "transformanti" i "transformisane ćelije" obuhvataju primarne predmetne ćelije i kulture izvedene od njih bez uzimanja u obzir broja transfera. Takođe se podrazumeva da celokupno potomstvo ne mora biti potpuno identično po DNK sadržaju, kao posledica namernih ili nenamernih mutacija. Obuhvaćeno je mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je pronađeno u originalno transformisanoj ćeliji. Tamo gđe su jasno različite odrednice nameravane, biće jasno iz konteksta.

[0045]Kao što je ovde korišćena, "lančana reakcija polimeraze" ili "PCR" označava postupak ili tehniku u kojoj se male količine specifičnog dela nukleinske kiseline, RNK i/ili DNK, amplifikovane kao što je opisano u, npr., U.S. Pat. br. 4,683,195. Generalno, potrebno je da informacije o sekvenci sa krajeva regiona od interesa ili izvan njega budu dostupne, tako da oligonukleotidni prajmeri mogu biti dizajnirani; ovi prajmeri će biti identični ili slični u sekvenci sa suprotnim lancima obrasca koji će se amplifikovati. 5' terminalni nukleotidi dva prajmera mogu da se poklapaju sa krajevima amplifikovanog materijala. PCR se može koristiti za amplifikaciju specifičnih RNK sekvenci, specifičnih DNK sekvenci iz ukupne genomske DNK, i cDNK transkribovane iz ukupne ćelijske RNK, sekvenci bakteriofaga ili plazmida, itd. Videti uopšteno Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263

(1987); Erlich, ed., PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y., 1989). Kao što je ovde korišćen, PCR se smatra jednim, ali ne i jedinim, primerom postupka reakcije polimerizacije nukleinske kiseline za amplifikaciju test uzorka nukleinske kiseline koji sadrži primenu poznate nukleinske kiseline kao prajmera i polimeraze nukleinske kiseline za amplifikaciju ili stvaranje specifičnog dela nukleinske kiseline.

[0046]Kao što je ovde korišćen, termin "sekvenca klicine linije" označava sekvencu ne-preuređenih imunoglobulinskih DNK sekvenci. Može se koristiti bilo koji pogodan izvor ne-preuređenog imunoglobulina.

[0047]Kao što je ovde korišćen, termin "imunosupresivno sredstvo" označava prirodna ili sintetička sredstva koja suprimiraju ili moduliraju imuni odgovor. Imuni odgovor može biti humoralni ili ćelijski odgovor.

B. IL-10 specifična antitela

[0048]Kompozicije i postupci navedeni ovde odnose se na modulaciju IL-10 aktivnosti, naročito kod imunih odgovora. Naročito, kompozicije i postupci ovde koriste antitela kao što su definisana u prethodnom tekstu specifična za citokin, IL-10. IL-10 je potentni citokin koji modulira T i B ćelijske odgovore preko regulacije rasta, diferencijacije i sinteze citokina različitih ćelijskih tipova uključenih u imune odgovore. Naime, proizvodnja IL-10 je često povezana sa autoimunim bolestima i imunopatologijom koja je indukovana patogenom. Prema tome, kompozicija i njeni postupci, koji moduliraju i inhibiraju aktivnost IL-10, mogu da menjaju razvoj i održavanje autoimune bolesti i povezanih simptoma i da ublaže ili smanje imunopatologiju povezanu sa patogenom.

[0049]Ciljno delovanje na IL-10 aktivnost sa humanizovanim antitelima daje nekoliko jedinstvenih prednosti. Prvo, ciljno delovanje na IL-10 preko antitela omogućava specifičnu supresiju aktivnosti IL-10 ostavljajući istovremeno ostatak imunog odgovora intaktnim. U mnogim slučajevima imunopatologije indukovane patogenom, smanjenje ili eliminacija aktivnosti IL-10 bi trebalo da omogući željeni efektorni imuni odgovor za eliminaciju patogena bez daljeg pogoršanja. Za pacijenta sa autoimunom bolešću, smanjenje ili eliminacija aktivnosti IL-10 trebalo bi da smanji ili eliminiše bolest i/ili njene simptome uz istovremeno održavanje imune kompetencije pacijenta. Drugo, humanizovana IL-10 antitela prevazilaze ograničenja povezana sa imunogenim antitelima glodara. Primena humanih sekvenci eliminiše imunogenost cgzogeno primenjivanih antitela, omogućavajući terapeutsku primenu.

[0050]Humanizovana antitela sadrže sekvence iz ne-humanih kao i iz humanih antitela. Tipično, postupak humanizacije počinje sa stvaranjem ne-humanog antitela koje ima željenu biološku aktivnost, tj., inhibira aktivnost IL-10. Kada je ne-humano antitelo sa odgovarajućim karakteristikama identifikovano, rekombinantna sredstva su zatim korišćena za stvaranje hibridne sekvence primenom ne-humanih i humanih sekvenci.

C. Stvaranje IL-10 specifičnih antitela

[0051]Može se koristiti bilo koji pogodan postupak za stvaranje monoklonalnih antitela. Na primer, primalac može biti imunizovan sa IL-10 ili njegovim fragmentom. Može se koristiti bilo koji pogodan postupak imunizacije. Takvi postupci mogu da obuhvataju adjuvante, druge imunostimulante, ponovljene „booster" imunizacije i primenu jednog ili više načina imunizacije.

[0052]Bilo koji pogodan izvor IL-10 može se koristiti kao imunogen za stvaranje ne-humanog antitela kompozicija i postupaka koji su ovde navedeni. Takvi oblici obuhvataju, ali bez ograničenja na ceo protein, peptid (peptide) i epitope, stvorene preko rekombinantnih, sintetičkih, hemijskih ili enzimskih razlagajućih sredstava poznatih u tehnici. IL-10 je osetljiv na kiselinu, nekovalentan homodimer dva međusobno penetrirajuća polipeptidna lanca. Citokin je dužine od 160 aminokiselina sa dobro očuvanim (konzervativnim) sekvencama koje obuhvataju a-helikoidnu strukturu sličnu interferonima i hematopoetičnim citokinima. Humani i mišji IL-10 imaju 73% aminokiselinske homologije, pri čemu je humani IL-10 aktivan na mišjim i na humanim ćelijama. IL-10 je komercijalno dostupan ili se može proizvesti primenom dobro poznatih tehnika molekularne biologije. cDNK sekvence banke gena su dostupne za čoveka, japanskog makaki rezus, mangabe, rezus i noćnog majmuna, lemura, miša, pacova, zamorče, sirijskog hrčka, zeca, mačku, psa, kao i druge. Rekombinantni humani 1L-10 je 17-18 kDa polipeptid koji nije N-glikozilovan.

[0053] Bilo koji oblik antigena može se koristiti za stvaranje antitela koje je dovoljno za stvaranje biološki aktivnog antitela. Na taj način, izvedeni antigen može biti jedan epitop, višestruki epitopi ili ceo protein sam ili u kombinaciji sa jednim ili više sredstava za pojačanje imunogenosti poznatih u tehnici. Izvedeni antigen može biti izolovan protein cele dužine, protein ćelijske površine (npr., imunizuje se ćelijama transficiranim sa najmanje delom antigena), ili rastvorljivi protein (npr., imunizuje se samo sa delom vanćelijskog domena proteina). Antigen može biti proizveden u genetički modifikovanoj ćeliji. DNK koja kodira antigen može biti genomska ili ne-genomska (npr., cDNK) i kodira najmanje deo vanćelijskog domena. Kao što je ovde korišćen, termin "deo" označava minimalni broj aminokiselina ili nukleinskih kiselina, prikladno, za izgradnju imunogenog epitopa antigena od interesa. Moguće je koristiti bilo koje genetičke vektore pogodne za transformaciju ćelija od interesa, uključujući, ali bez ograničenja na, adenovirusne vektore, plazmide i ne-virusne vektore, kao što su katjonski lipidi.

[0054] Bilo koji pogodan postupak se može koristiti za stvaranje antitela sa željenim biološkim osobinama za inhibiciju IL-10. Poželjno je pripremiti monoklonalna antitela (mAbs) od različitih sisarskih domaćina, kao što su miševi, glodan, primati, ljudi, itd. Opis tehnika za pripremu takvih monoklonalnih antitela može se naći u, npr., Stites, et al. (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (4th ed.) Langc Medical Publications, Los Altos, CA, i referencama koje su u njemu navedene; Harlow and Lane (1988) ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL CSH Press; Goding (1986) MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2d ed.) Academic Press, New York, NY. Na taj način, monoklonalna antitela se mogu dobiti pomoću različitih tehnika poznatih stručnjacima iz date oblasti tehnike. Tipično, ćelije slezine iz životinje imunizovane sa željenim antigenom su imortalizovane, uobičajeno fuzijom sa mijeloma ćelijama. Videti Kohler and Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6:511-519. Alternativni postupci za imortalizaciju obuhvataju transformaciju sa Epstein Barr virusom, onkogenima ili retrovirusima, ili druge postupke poznate u tehnici. Videti, npr., Doyle, et al. (izdanje 1994 i periodične dopune) CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES, John Wiley and Sons, New York, NY. Kolonije koje nastaju iz pojedinačnih imortalizovanih ćelija ispitivane su za proizvodnju antitela željene specifičnosti i afiniteta za antigen, i prinos monoklonalnih antitela proizvedenih od strane takvih ćelija može biti povećan pomoću različitih tehnika, uključujući injektiranje u peritonealnu duplju kičmenjačkog domaćina. Alternativno, moguće je izolovati DNK sekvence koje kodiraju monoklonalno antitelo ili njegov vezujući fragment preko skrininga DNK biblioteke iz humanih B ćelija prema, npr., opštem protokolu navedenom od strane Huse, et al. (1989) Science 246:1275-1281.

[0055]Druge pogodne tehnike obuhvataju selekciju biblioteka antitela u fagnim ili sličnim vektorima. Videti, npr., Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); i Ward et al., Nature 341:544-546 (1989). Polipeptidi i antitela prema predstavljenom pronalasku mogu se koristiti sa ili bez modifikacije, uključujući himerna ili humanizovana antitela. Cesto, polipeptidi i antitela će biti obeleženi spajanjem, ili kovalentno ili ne-kovalentno, supstance koja daje detektabilni signal. Široki opseg različitih obeleživača i tehnika konjugacije je poznat i objavljivan opširno i u naučnoj i u patentnoj literaturi. Pogodni obeleživači obuhvataju radionuklide, enzime, supstrate, kofaktore, inhibitore, fluorescentne grupe, hemiluminiscentne grupe, magnetne čestice i slično. Patenti u kojima se navodi primena takvih obeleživača obuhvata U.S. Patente br. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; i 4,366,241. Takođe, rekombinantni imunoglobulini mogu biti proizvedeni, videti Cabillv U.S. Patent br. 4,816,567; i Queen et al. (1989) Proc. NatT Acad. Sci. USA 86:10029-10033; ili napravljeni u transgenim miševima, videti Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; takođe videti Abgenix and Medarex technologies.

[0056] Antitela ili vezujuće kompozicije protiv unapred određenih fragmenata IL-10 mogu se stvoriti imunizacijom životinja sa konjugatima polipeptida, fragmenata, peptida ili epitopa sa proteinima nosačima. Monoklonalna antitela su pripremljena od ćelija koje izlučuju željeno antitelo. Ova antitela se mogu ispitivati za vezivanje za normalan ili defektan IL-10. Ova monoklonalna antitela će se obično vezivati sa najmanje Kjod oko 1 uM, češće najmanje oko 300 nM, tipično najmanje oko 30 nM, poželjno najmanje oko 10 nM, poželjnije najmanje oko 3 nM ili bolje, obično određeno pomoću ELISA. Pogodna ne-humana antitela takođe se mogu identifikovati primenom bioloških testova opisanih u Delu D u daljem tekstu.

C. Humanizacija IL-10 specifičnih antitela

[0057JBilo koje pogodno ne-humano antitelo se može koristiti kao izvor za hipervarijabilni region. Izvori ne-humanih antitela obuhvataju, ali bez ograničenja na, miševe, pse, goveda i primate. U najvećem broju slučajeva, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (antitelo primaoca) u kome su ostaci hipervarijabilnog regiona primaoca

zamenjeni ostacima hipervarijabilnog regiona iz ne-humanih bioloških vrsta (antitela davaoca) kao što su miš, pacov, zec ili ne-humani primat koji imaju željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci Fv okvirnih regiona (FR) humanog imunoglobulina zamenjeni su odgovarajućim ne-humanim ostacima. Pored toga, humanizovana antitela mogu da sadrže ostatke koji se ne nalaze u antitelu primaoca ili u antitelu davaoca. Ove modifikacije su napravljene da bi se dodatno usavršio učinak antitela željene biološke aktivnosti. Za dodatne detalje, videti Jones et al., Nature 321: 522-525

(1986); Reichmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596(1992).

[0058]Postupci za rekombinantni inžinjering antitela opisali su, npr., Boss et al. (U.S. Pat. br. 4,816,397), Cabilly et al. (U.S. Pat. No. 4,816,567), Law et al. (Objava evropske patentne prijave br. 438 310) i VVinter (Objava evropske patentne prijave br. 239 400).

[0059]Varijante aminokiselinske sekvence humanizovanog anti-IL-10 antitela su pripremljene uvođenjem odgovarajućih nukleotidnih promena u DNK humanizovanog anti-IL-10 antitela, ili peptidnom sintezom. Takve varijante obuhvataju, na primer, delecije iz, i/ili insercije u i/ili supstitucije, ostataka unutar aminokiselinskih sekvenci prikazanih za humanizovano anti-IL-10 F(ab) (npr. kao u SEQ ID NO 5 i 10). Bilo koja kombinacija delecije; insercije i supstitucije je napravljena da bi se došlo do konačnog konstrukta, uz uslov da krajnji konstrukt poseduje željene karakteristike. Aminokiselinske promene takođe mogu da menjaju post-translacione procese humanizovanog anti-IL-10 antitela, kao što je promena broja ili položaja glikozilacionih mesta.

[0060]Koristan postupak za identifikaciju određenih ostataka ili regiona polipeptida humanizovanog anti-IL-10 antitela koji su poželjna mesta za mutagenezu označen je kao "alanin skenirajuća mutageneza," kao što su opisali Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085 (1989). Ovde su identifikovani ostatak ili grupa ciljnih ostataka (npr., naelektrisani ostaci kao što su arg, asp, his, lys i glu) i zamenjeni neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (najpoželjnije alanin ili polialanin) kako bi se uticalo na interakciju aminokiselina sa IL-10 antigenom. Aminokiselinski ostaci koji pokazuju funkcionalnu osetljivost na supstitucije zatim su prečišćeni uvođenjem dodatnih ili drugih varijanti na, ili za, mesta supstitucije. Na taj način, dok je mesto za uvođenje varijacije aminokiselinske sekvence unapred određeno, priroda mutacije sama po sebi ne mora biti unapred određena. Na primer, za analizu učinka mutacije na datom mestu, alanin skenirajuća ili slučajna mutageneza izvodi se na ciljnom kodonu ili regionu, i eksprimirane humanizovane varijante anti-IL-10 antitela ispitivane su za željenu aktivnost. [0061JInsercije aminokiselinske sekvence obuhvataju amino- i/ili karboksil-terminalne fuzije dužine u opsegu od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotinu ili više ostataka, kao i insercije unutar sekvence pojedinačnih ili višestrukih aminokiselinskih ostataka. Primeri terminalnih insercija obuhvataju humanizovano anti-IL-10 antitelo sa N-terminalnim metionil ostatkom ili antitelo fuzionisano za epitop obeleživač. Druge insercione varijante molekula humanizovanog anti-IL-10 antitela obuhvataju fuziju za N- ili C-terminus humanizovanog anti-IL-10 antitela enzima ili polipeptida koji povećava polu-život antitela u serumu.

[0062]Sledeći tip varijante je varijanta aminokiselinske supstitucije. Ove varijante imaju najmanje jedan aminokiselinski ostatak u molekulu humanizovanog anti-IL-10 antitela uklonjen i drugi ostatak inseriran umesto njega. Mesta od najvećeg interesa za supstitucionu mutagenezu obuhvataju hipervarijabilne petlje, ali su takođe razmatrane FR promene. Tabele 2 i 3 u postupku koji je opisan u daljem tekstu daju uputstvo za ostatke hipervarijabilnog regiona koji mogu biti zamenjeni. Ostaci hipervarijabilnog regiona ili FR ostaci uključeni u vezivanje antigena generalno su supstituisani na relativno konzervativan način.

[0063]Sledeći tip aminokiselinske varijante antitela menja originalan glikozilacioni obrazac antitela. Ovde promena označava deleciju jedne ili više ugljenohidratnih grupa nađenih u antitelu, i/ili adiciju jednog ili više glikozilacionih mesta koja nisu prisutna u antitelu. Glikozilacija antitela je tipično ili N-vezana ili O-vezana. N-vezana označava vezu ugljenohidratne grupe sa bočnim lancem asparaginskog ostatka. Tripeptidne sekvence asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, gđe je X bilo koja aminokiselina osim prolina, su sekvence za prepoznavanje za enzimatsko vezivanje ugljenohidratne grupe za asparaginski bočni lanac. Na taj način, prisustvo bilo koje od ovih tripeptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalno glikozilaciono mesto. O-vezana glikozilacija označava vezu jednog od šećera N-acetilgalaktozamina, galaktoze ili ksiloze sa hidroksiamino kiselinom, najčešće serin ili treonin, iako se takođe mogu koristiti 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin. [0064JAdicija glikozilacionih mesta antitelu pogodno se postiže promenom aminokiselinske sekvence tako da sadrži jednu ili više od prethodno opisanih tripeptidnih sekvenci (za N-vezana glikozilaciona mesta). Promena se takođe može napraviti adicijom, ili supstitucijom sa, jednim ili više serinskih ili treoninskih ostataka u sekvenci originalnog antitela (za O-vezana glikozilaciona mesta).

[0065]Molekuli nukelinske kiseline koji kodiraju varijante aminokiselinske sekvence humanizovanog IL-10 specifičnog antitela pripremljeni su pomoću niza različitih postupaka poznatih u tehnici. Ovi postupci obuhvataju, ali bez ograničenja na, izolaciju iz prirodnog izvora (u slučaju prirodnih varijanti aminokiselinske sekvence) ili pripremu pomoću oligonukleotidno-posredovane (ili na mesto-usmerene) mutageneze, PCR mutageneze i kasetne mutageneze ranije pripremljene varijantne ili ne-varijantne verzije humanizovanog anti-IL-10 antitela. [0066) Obično, varijante aminokiselinske sekvence humanizovanog anti-IL-10 antitela imaće aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 75% identičnosti aminokiselinske sekvence sa aminokiselinskim sekvencama originalnog humanizovanog antitela, i to teškog ili lakog lanca, poželjnije najmanje 80%, poželjnije najmanje 85%, poželjnije najmanje 90%, i najpoželjnije najmanje 95%. Identičnost ili homologija u vezi sa ovom sekvencom ovde je definisana kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidatu koje su identične sa ostacima humanizovanog anti-IL-10, posle poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je neophodno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvenci, i ne uzimajući u obzir bilo kakve konzervativne supstitucije kao deo identičnosti sekvenci. Nijedna od N-terminalnih, C-terminalnih ili unutrašnjih produženja, delecija sekvence ili insercija u sekvencu antitela neće se tumačiti takvom da utiče na identičnost ili homologiju sekvenci.

[0067] Humanizovano antitelo može biti izabrano iz bilo koje klase imunoglobulina, uključujući IgM, IgG, IgD, IgA i IgE. Poželjno, antitelo je IgG antitelo. Može se koristiti bilo koji izotip IgG, uključujući IgGi, IgG2, IgG3i IgG4. Varijante IgG izotipova takođe su razmatrane. Humanizovano antitelo može sadržati sekvence iz više od jedne klase ili izotipa. Optimizacija neophodnih sekvenci konstantnog domena za stvaranje željene biološke aktivnosti lako se postiže skriningom antitela u biološkim testovima koji su opisani u daljem tekstu.

[0068] Slično, svaka klasa lakog lanca se može koristiti u kompozicijama i postupcima koji su ovde dati. Naročito, kapa, lambda ili njihove varijante su korisni u predstavljenim kompozicijama i postupcima.

[0069] Ovde je dat postupak za identifikaciju akceptorske sekvence klicine linije za humanizovano antitelo, pri čemu taj postupak sadrži sledeće korake: a) identifikaciju ne-humanog antitela koje ima željenu biološku aktivnost; b) određivanje aminokiselinske sekvence Vhi Vldomena ne-humanog antitela i c) upoređivanje sekvence nehumanog antitela sa grupom humanih sekvenci klicine linije, pri čemu poredenje sadrži sledeće podkorake: 1) dodeljivanje ostacima nehumane V sekvence brojeva prema Kabat navedenom u prethodnom tekstu; 2) označavanje CDR i FR regiona u sekvenci prema Kabat navedenom u prethodnom tekstu; 3) dodela unapred određene numeričke ocene na specifično mesto ostatka za koje su sekvence ne-humane i humane klicine linije antitela identične; i 4) sabiranje svih ocena ostataka da bi se dobila ukupna ocena za svaku sekvencu humane klicine linije; i

d) identifikacija sekvence humane klicine linije sa najvišom ukupnom ocenom ostatka kao akceptorske sekvence klicine linije. U jednoj varijanti, postupak dalje sadrži sledeće

podkorake: 5) dodela numeričke ocene od 1 za svaki položaj FR ostatka za koji su sekvence ne-humane i humane klicine linije antitela identične koji nije ocenjivan u podkoraku (3) sa sekvencama klicine linije sa identičnim ukupnim ocenama ostataka posle podkoraka (4); 6) sabiranje svih ocena ostataka da bi se stvorila ukupna ocena za svaku sekvencu humane klicine linije. U posebnoj varijanti, ne-humano antitelo je specifično za IL-10 i inhibira biološku aktivnost IL-10. Ovde je takođe dato antitelo stvoreno pomoću prethodno navedenog postupka.

[0070] U jednoj varijanti, IL-10 antitelo je humanizovano primenom sledećeg postupka. Prvo, ne-humani Vli VHdomeni IL-10 antitela su klonirani i sekvencirani, i određena je aminokiselinska sekvenca. Zatim, nehumane Vh sekvence su upoređivane sa grupom od pet humanih Vhaminokiselinskih sekvenci klicine linije. Pet grupa sadrže jednog predstavnika iz podgrupa IGHV1 i IGHV4 i tri predstavnika iz podgrupe IGHV3. Vhpodgrupe su navedene u M.-P. Lefranc, Exp. Clin. Irnmunogenetics, 18:100-116 (2001). Naročito, poređenje sa pet sekvenci klicine linije počinje sa dodelom brojeva ostataka ne-humanoj VH sekvenci prema Kabat sistemu numeracije. Videti Kabat, et al., U. S. Department of Health and Human Services, NIH Pub. 91-3242 (5th Ed., 1991). Ne-humane Vh sekvence su zatim poravnate sa svakom od pet sekvenci humane klicine linije. S obzirom na to da V geni sadrže samo Vhostatke 1-94, samo ovi ostaci se smatraju da su poravnati. Sledeće, regioni koji određuju komplementarnost (CDR) i okvirni regioni (FR) u sekvenci su označeni. CDR i FR su označeni prema kombinaciji definicija datih u Kabat, et al., U. S. Department of Health and Human Services, NIH Pub. 91-3242 (5th Ed., 1991), i C. Chothia & A.M. Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987). Prema tome, korišćena definicija za CDR predstavlja ostatke 26-35 za CDR1, ostatke 50-65 za CDR2, i CDR3 su ostaci 95-102 za CDR3 Vh domena. Sledeći korak obuhvata dodelu numeričke ocene na identifikovanom položaju ostatka gde su ne-humane i humane sekvence identične. Jedan primer ovog ocenjivanja prikazanje u Tabeli 2 u daljem tekstu.

[0071]Pošto su položajima ostataka dodeljene numeričke ocene, sve ocene ostataka su sabrane. Akceptorska sekvenca klicine linije je ona koja ima najvišu ukupnu ocenu. U slučaju gde dve ili više sekvenci klicine linije imaju identične ocene, tada treba dodati 1 za svaki položaj gde su ne-humane i humane sekvence IDENTIČNE za sledeće ostatke: 1, 3, 5-23, 25, 36, 38, 40-43, 46, 66, 68, 70, 72, 74, 75, 77, 79-90 i 92 (maksimalno 49). Ocene ostataka su ponovo sabrane, i akceptorska sekvenca klicine linije sekvenca je ona sa najvišom ukupnom ocenom. Ako dve ili više sekvenci klicine linije i dalje imaju identične ocene, bilo koja od njih se može koristiti kao akceptorska sekvenca klicine linije.

[0072]Ako je VLsekvenca član kapa podklase VL, ne-humana VLsekvenca iz IL-10 specifičnog antitela je upoređivana sa grupom od četiri humane Vlkapa aminokiselinske sekvence klicine linije. Četiri sekvence se sastoje od jednog predstavnika iz svake od četiri ustanovljene humane VLpodgrupe navedene u V. Barbie & M.-P. Lefranc, Exp. Clin. Immunogenetics 15:171-183 (1998) i M.-P. Lefranc, Exp. Clin. Immunogenetics 18:161-174

(2001). Četiri sekvence takođe odgovaraju četiri podgrupe navedene u Kabat et al., U. S. Department of Health and Human Services, NIH Pub. 91-3242, pp. 103-130 (5th Ed., 1991). Poređenje ne-humane sekvence sa četiri sekvence klicine linije počinje sa dodelom brojeva ostataka ostacima ne-humane V[sekvence prema Kabat et al., U. S. Department of Health and Human Services, NIH Pub. 91-3242 (5th Ed., 1991). Ne-humane VLsekvence su zatim poravnate sa svakom od četiri humane sekvence klicine linije. S obzirom na to da V geni sadrže samo V[_ ostatke 1-95, samo ovi ostaci se smatraju poravnatim. Zatim, regioni koji određuju komplementarnost (CDR) i okvirni regioni (FR) su označenui u sekvenci. CDR i FR su označeni prema kombinaciji definicija datih u Kabat et al., U. S. Department of Health and Human Services, NIH Pub. 91-3242 (5th Ed. 1991), i C. Chothia & A.M. Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987). Prema tome, korišćena definicija za CDR predstavljena je ostacima 24-34 za CDR1, ostacima 50-56 za CDR2, i ostacima 89-97 za CDR3 VLdomena. Sledeći korak obuhvata dodelu numeričke ocene na obeleženom položaju ostatka na kome su ne-humane i humane sekvence identične. Jedan primer ovog ocenjivanja prikazan je u Tabeli 3 u daljem tekstu.

[0073] Pošto su položajima ostataka dodeljene numeričke ocene, sve ocene ostataka su sabrane. Akceptorska sekvenca klicine linije je ona sa najvišom ukupnom ocenom. U slučaju gde dve ili više sekvenci klicine linije imaju identične ocene, tada se dodaje 1 za svaki položaj gde su ne-humane i humane sekvence IDENTIČNE za sledeće ostatke: 1, 3, 5-23, 35, 37, 39-42, 57, 59-61, 63, 65-70, 72-86 i 88. Ocene ostataka su ponovo sabrane, i akcpetorska sekvenca klicine linije je ona sa najvišom ukupnom ocenom. Ako dve ili više sekvenci klicine linije i dalje imaju identične ocene, bilo koja od njih se može koristiti kao akceptorska sekvenca klicine linije.

[0074] Za rekombinantnu proizvodnju antitela, nukleinska kiselina koja ga kodira je izolovana i inserirana u vektor koji se može umnožavati za dalje kloniranje (amplifikacija DNK) ili za ekspresiju. DNK koja kodira monoklonalno antitelo lako se izoluje i sekvencira primenom uobičajenih postupaka (npr., primenom oligonukleotidnih proba koje su sposobne da se specifično vezuju za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela). Mnogi vektori su dostupni. Vektorske komponente generalno obuhvataju, ali bez ograničenja na, jedno ili više od sledećih: signalnu sekvencu, oridžin replikacije, jedan ili više marker gena, pojačavajući element, promotor i transkripcionu terminacionu sekvencu.

[0075]U jednoj varijanti, antitelo je molekul humanizovanog rekombinantnog antitela koji vezuje IL-10, ili njegov vezujući fragment, koji sadrži: najmanje jedan varijabilni region lakog lanca antitela, ili njegov vezujući fragment, koji sadrži polipeptid koji ima najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1 (KTSONIFENLA) na CDR1, SEQ ID NO: 2 (NASPLOA) na CDR2 i SEQ ID NO: 3 (HQYYSGYT) na CDR3; i okvirni region, pri čemu je aminokiselinska sekvenca okvirnog regiona cela ili značajno cela od humane imunoglobinske aminokiselinske sekvence; i najmanje jedan varijabilni region teškog lanca antitela, ili njegov vezujući fragment, koji sadrži polipeptid koji ima najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 6 (GFTFSDYHMA) na CDR1, SEQ ID NO: 7 (SITLDATYTYYRDSVRG) na CDR2, SEQ ID NO: 8 (HRGFSVWLDY) na CDR3; i okvirni region, pri čemu je aminokiselinska sekvenca okvirnog regiona cela ili značajno cela od humane imunoglobinske aminokiselinske sekvence. U posebnoj varijanti, laki lanac antitela ili njegov vezujući fragment, sadrži polipeptid koji ima varijabilni region od SEQ ID

NO: 4 (DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKTSQNIFENLAWYQQKPGKAPKLLIY NASPLQAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYSGYTFGPGTKLELKR

T). U jednoj posebnoj varijanti, laki lanac antitela ili njegov vezujući fragment, sadrži polipeptid koji ima varijabilni region i konstantni region od SEQ ID NO: 5. Videti Tabelu 4. U jednoj posebnoj varijanti, težak lanac antitela ili njegov vezujući fragment, sadrži polipeptid koji ima varijabilni region od SEQ ID NO: 9

(QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSDYHMAWV

RQAPGKGLEWVASITLDATYTYYRDSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV

YYCARHRGFSVWLDYWGQGTLVTVSS). U sledećoj naročitoj varijanti, težak lanac antitela, ili njegov vezujući fragment, sadrži polipeptid koji ima varijabilni region i konstantni region od SEQ ID NO: 10. Videti Tabelu 5.

[0076] Plazmidi koji sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju humanizovani 12G8 laki i težak lanac su deponovane u American Type Culture Collection (ATCC) pod brojevima za deponovanje PTA-5923 i PTA-5922, redom.

[0077]U jednoj varijanti, antitelo je molekul humanizovanog rekombinantnog antitela koje vezuje IL-10, ili njegov vezujući fragment, koji sadrži: najmanje jedan laki lanac antitela, ili njegov vezujući fragment, koji sadrži polipeptid koji ima najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu koja je izabrana iz grupe koju čine SEQ ID NO: 11 (RASESVDDYGHSFMH) na CDR1, SEQ ID NO: 12 (CASTLES) na CDR2, i SEQ ID NO: 13 (QQGNEDPWT) na CDR3; i okvirni region, pri čemu je aminokiselinska sekvenca okvirnog regiona cela ili značajno cela od humane imunoglobinske aminokiselinske sekvence; i najmanje jedan težak lanac antitela, ili njegov vezujući fragment, koji sadrži polipeptid koji ima najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 15 (GFSLTNYGVH) na CDR1, SEQ ID NO: 16 (VIWSGGSTDYNAAFIS) na CDR2, i SEQ ID NO: 17 (NRGYDVYFDY) na CDR3; i okvirni region, pri čemu je aminokiselinska sekvenca okvirnog regiona cela ili značajno cela od humane imunoglobinske aminokiselinske sekvence. U jednoj specifičnoj varijanti, laki lanac antitela, ili njegov vezujući fragment, sadrži polipeptid koji ima varijabilni region i konstantni region SEQ ID NO: 14. Videti Tabelu 6. U sledećoj specifičnoj varijanti, težak lanac antitela, ili njegov vezujući fragment, sadrži polipeptid koji ima varijabilni region i konstantni region SEQ ID NO: 18. Videti Tabelu 7. [00781 Plazmidi koji sadrže humanizovane 11D8 teške i lake lance deponovani su u ATCC pod brojevima PTA-5926 i PTA-5927, redom.

[0079J U jednoj varijanti, antitela opisana u prethodnom tekstu dalje sadrže konstantni region teškog lanca, pri čemu konstantni region teškog lanca sadrži yl, y2, y3 ili y4 konstantni region humanog teškog lanca ili njegovu varijantu. U jednoj varijanti, antitela opisana u prethodnom tekstu dalje sadrže konstantni region lakog lanca, pri čemu konstantni region lakog lanca sadrži konstantni region lambda ili kapa humanog lakog lanca. U nekim varijantama, vezujući fragment ovih antitela je fragment antitela izabran iz grupe koju čine Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2i dvojna antitela.

[0080] Ovde je takođe dat molekul himernog rekombinantnog antitela koji vezuje IL-10 ili njegov vezujući fragment, koji sadrži: najmanje jedan varijabilni region lakog lanca antitela, ili njegov vezujući fragment, koji sadrži polipeptid koji ima najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1 na CDR1, SEQ ID NO: 2 na CDR2, i SEQ ID NO: 3 na CDR3; i najmanje jedan varijabilni region teškog lanca antitela, ili njegov vezujući fragment, koji sadrži polipeptid koji ima najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 6 na CDR1, SEQ ID NO: 7 na CDR2 i SEQ ID NO: 8 na CDR3.

[0081] U posebnoj varijanti, molekul himernog rekombinantnog antitela ima laki lanac kao što je navedeno u SEQ ID NO: 23 i težak lanac kao što je navedeno u SEQ ID NO: 24. Videti Tabelu 8. Nukleinske kiseline koje kodiraju teške i lake lance 12G8 himernog antitela deponovane su u ATCC pod brojevima PTA-5925 i PTA-5924, redom.

[0082]Ovde je dalje dat molekul himernog rekombinantnog antitela koji vezuje IL-10, ili njegov vezujući fragment, koji sadrži: najmanje jedan laki lanac antitela, ili njegov vezujući fragment, koji sadrži polipeptid koji ima najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 11 na CDR1, SEQ ID NO: 12 na CDR2, i SEQ ID NO: 13 na CDR3; i najmanje jedan težak lanac antitela, ili njegov vezujući fragment, koji sadrži polipeptid koji ima najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 15 na CDR1, SEQ ID NO: 16 na CDR2, i SEQ ID NO: 17 na CDR3.

[0083]Ovde je dalje data izolovana nukleinska kiselina koja kodira polipeptid antitela navedenih u prethodnom tekstu. Ovde je takođe dat ekspresioni vektor koji sadrži izolovanu nukleinsko kiselinsku sekvencu funkcionalno vezanu za kontrolne sekvence koje prepoznaje ćelija domaćin transficirana vektorom. Ovde je data ćelija domaćin koja sadrži vektor koji sadrži izolovanu nukleinsko kiselinsku sekvencu. Dalje, ovde je dat postupak za proizvodnju polipeptida, koji sadrži kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži vektor pod uslovima u kojima je nukleinsko kiselinska sekvenca eksprimirana, na taj način proizvodeći polipeptid, i dobijanje polipeptida iz ćelije domaćina.

[0084]Ovde je data izolovana nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira antitelo specifično za IL-10 koje sadrži laki lanac koji ima nukleinsko kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19 i težak lanac koji ima nukleinsko kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20. Videti Tabele 4 i 5.

[0085]Ovde je data izolovana nukleinska kiselinska sekvenca koja kodira antitelo specifično za IL-10 koje sadrži laki lanac koji ima nukleinsko kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21 i težak lanac koji ima nukleinsko kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22. Videti Tabele 6 i 7.

[0086]Ovde je dalje data izolovana nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira vezujući fragment antitela koje je kodirano od strane prethodno navedenih nukleinsko kiselinskih sekvenci. U jednoj varijanti, vezujući fragment je fragment antitela izabran iz grupe koju čine Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2i dvojno antitelo. [0087[Bispecifična antitela su takođe korisna u predstavljenim postupcima i kompozicijama. Kao što je ovde korišćen, termin "bispecifično antitelo" označava antitelo, tipično monoklonalno antitelo, koje ima vezujuće specifičnosti za najmanje dva različita antigena epitopa. U jednoj varijanti, epitopi su iz istog antigena. U sledećoj varijanti, epitopi su iz dva različita antigena. Postupci za stvaranje bispecifičnih antitela su poznati u tehnici. Na primer, bispecifična antitela mogu biti proizvedena rekombinantno primenom ko-ekspresije dva imunoglobulinska para teškog lanca/lakog lanca. Videti, npr., Milstein et al., Nature 305: 537-39 (1983). Alternativno, bispecifična antitela mogu biti pripremljena korišćenjem hemijske veze. Videti, npr., Brennan, et al., Science 229: 81 (1985). Bispecifcna antitela obuhvataju fragmente bispecifičnih antitela. Videti, npr., Hollinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6444-48 (1993), Gruber, et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994).

E.Primena humanizovanih anti-IL-10 antitela

[0088]Ovde je data primena antitela specifičnog za IL-10, ili njegovog vezujućeg fragmenta, u količini koja je efikasna da blokira biološku aktivnost IL-10 za pripremu leka za supresiju imunog odgovora kod humanog subjekta, pri čemu je antitelo - antitelo kao što je definisano u prethodnom tekstu i pri čemu subjekat ima sistemski lupus eritematodes ili lupus nefritis.

[0089]Ovde je data kompozicija koja sadrži antitelo ili njegov vezujući fragment, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili razblaživačem, pri čemu je antitelo jedno od antitela definisanih u prethodnom tekstu.

[0090]Svaki subjekat koji bi imao koristi od tretmana sa IL-10 specifičnim antitelima može se tretirati primenom kompozicija i postupaka koji su ovde dati. Svaki subjekat može biti tretiran postupcima i kompozicijama koji su ovde dati. Takav subjekat je sisar, poželjno čovek, sa autoimunom bolešću ili simptomom, ili patogenom-indukovanom imunopatologijom. U jednoj posebnoj varijanti, subjekat ima SLE, lupus nefritis, reumatoidni artritis, ITC, HIV ili hepatitis C. Veterinarske primene navedenih postupaka i kompozicija takođe su razmatrane.

[0091]Kao što je ovde korišćeno, "inhibiranje", "lečenje" ili "tretman" obuhvata odlaganje razvoja simptoma povezanih sa autoimunom bolešću ili patogenom-inđukovanom imunopatologijom i/ili smanjenjem težine takvih simptoma koji će se razviti ili se očekuje da će se razviti. Ovi termini dalje obuhvataju poboljšanje postojećih nekontrolisanih ili neželjenih autoimuno-povezanih ili patogenom-indukovanih imunopatoloških simptoma, sprečavanje pojave dodatnih simptoma, i poboljšanje ili sprečavanje osnovnih uzroka takvih simptoma. Na taj način, ovi termini označavaju da je koristan rezultat obezbeđen kičmenjačkom subjektu sa autoimunom ili patogenom-inđukovanom imunopatološkom bolešću ili simptomom, ili sa potencijalom za razvoj takve bolesti ili simptoma.

[0092]Kao što je ovde korišćen, termin "terapeutski efikasna količina" ili "efikasna količina" označava količinu IL-10 specifičnog antitela koje kada se primenjuje samo ili u kombinaciji sa dodatnim terapeutskim sredstvom na ćeliju, tkivo ili subjekta je efikasna u sprečavanju ili olakšavanju autoimune bolesti, ili bolesti, stanja ili progresije bolesti povezane sa patogenom-inđukovanom imunopatologijom. Terapeutski efikasna doza dalje se odnosi na onu količinu jedinjenja koja je dovoljna da bi se postiglo poboljšanje simptoma, npr., lečenje, isceljenje, prevencija ili poboljšanje relevantnog medicinskog stanja, ili povećanje stope lečenja, isceljenja, prevencije ili poboljšanja takvih stanja. U slučaju pojedinačnog aktivnog sastojka koji se primenjuje sam, terapeutski efikasna doza označava samo taj sastojak. U slučaju kombinacije, terapeutski efikasna doza označava kombinovane količine aktivnih sastojaka koje imaju za rezultat terapeutski efekat, bilo primenjenih u kombinaciji, serijski ili istovremeno.

[0093] Antitelo kao što je definisano u prethodnom tekstu, može se primenjivati na subjekta kod koga postoji potreba za tim, samo, ili u farmaceutskim kompozicijama gde se meša sa pogodnim nosačem ili inertnim puniocem (nosačima ili inertnim puniocima) u dozama za lečenje ili poboljšanje različitih poremećaja. Takva kompozicija može takođe da sadrži (pored proteina i nosača) razblaživače, punjače, soli, pufere, stabilizatore, sredstva za povećanje rastvaranja, i druge materijale koji su dobro poznati u tehnici. Termin "farmaceutski prihvatljiv" označava ne-toksični materijal koji ne remeti efikasnost biološke aktivnosti aktivnog sastojka (sastojaka). Karakteristike nosača će zavisiti od načina primene.

[0094]Farmaceutska kompozicija prema pronalasku takođe može da sadrži druga imunosupresivna ili imunomodulatorna sredstva. Bilo koje pogodno imunosupresivno sredstvo se može koristiti, uključujući, ali bez ograničenja na, anti-inflamatorna sredstva, kortikosteroide, ciklosporine, takrolimus (tj., FK-506), sirolimus, interferone, rastvorljive citokinske receptore (npr., sTNRF i sIL-lR), sredstva koja neutralizuju citokinsku aktivnost

(npr., infliksmab, etanercept), mikofenolat mofetil, 15-deoksispergualin, talidomid, glatiramer, azatioprin, leflunomid, ciklofosfamid, metotreksat i slično. Farmaceutska kompozicija se takođe može koristiti sa drugim terapeutskim modalitetima kao što jefototerapija i zračenje.

[0095] U sledećoj varijanti, dati su kompleti koji sadrže neophodne reagense za izvođenje testova ovde datih postupaka. Ovde je posebno dat pregradni komplet koji sadrži jedan ili više kontejnera, pri čemu prvi kontejner sadrži jedno ili više antitela specifičnih za IL-10, i jedan ili više drugih kontejnera sadrže jedno ili više od sledećih: rekonstitucioni reagensi, reagensi za primenu. Kontejneri mogu biti stakleni, plastični ili trake od plastike ili papira. U jednoj varijanti, komplet takođe sadrži pisana uputstva.

[0096] U izvođenju postupaka za lečenje ili primenu koji su ovde dati, terapeutski efikasna količina antitela koja je ovde data primenjuje se na sisara koji ima stanje pogodno za lečenje sa IL-10. Antitelo se može primeniti u skladu sa postupcima koji su ovde dati ili samo ili u kombinaciji sa drugim terapijama kao što su tretmani koji koriste druge imunomodulatorne faktore (npr., citokini), imunosupresivna sredstva, i slično. Kada se primenjuje zajedno sa jednim ili više biološki aktivnih sredstava, ovde dato antitelo se može primenjivati ili istovremeno sa biološki aktivnim sredstvom (sredstvima), ili uzastopno. Ako se primenjuje uzastopno, nadležni lekar će odlučiti o odgovarajućem redosledu primene proteina prema predstavljenom pronalasku u kombinaciji sa biološki aktivnim sredstvom (sredstvima).

[0097] Toksičnost i terapeutska efikasnost kompozicija antitela, primenjenog pojedinačno ili u kombinaciji sa imunosupresivnim sredstvom, mogu se odrediti pomoću standardnih farmaceutskih postupaka u ćelijskim kulturama ili eksperimentalnim životinjama, npr., za određivanje LD50(doza letalna za 50% populacije) i ED50(doza koja je terapeutski efikasna kod 50% populacije). Odnos doze između toksičnih i terapeutskih efekata je terapeutski indeks i može se izraziti kao odnos između LD50i ED50. Poželjna su antitela koja ispoljavaju visoke terapeutske indekse. Podaci dobijeni iz ovih testova ćelijske kulture i studija na životinjama mogu se koristiti u formulaciji opsega doza za primenu kod čoveka. Doza takvih jedinjenja je poželjno unutar opsega koncentracija u cirkulaciji koje obuhvataju ED5() sa malo ili bez toksičnosti. Doza može da varira unutar ovog opsega u zavisnosti od korišćenog oblika doze i od načina primene koji je korišćen.

[0098] Tehnike za formulaciju i primenu antitela prema predstavljenim postupcima mogu se naći u REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Co., Easton, Pa., poslednje izdanje. Način primene nije posebno značajan. Pogodni načini primene mogu, na primer, da obuhvataju oralnu, rektalnu, transmukozalnu ili intestinalnu primenu; parenteralnu primenu, uključujući intramuskularne, subkutane, intramedularne injekcije, kao i intratekalne, direktne intraventirkularne, intravenozne, intraperitonealnc, intranazalnc ili intraokularne injekcije. Primena antitela korišćenog u farmaceutskoj kompoziciji ili za izvođenje postupka prema predstavljenom pronalasku može se izvesti na različite uobičajene načine, kao što su oralno unošenje, inhalacija, topikalna primena ili kutana, subkutana, intraperitonealna, parenteralna, intraarterijalna ili intravenozna injekcija. Poželjna je intravenozna primena na pacijenta. [0099J Alternativno, moguće je primeniti antitelo pre na lokalni nego na sistemski način, na primer, preko injekcije antitela direktno u artritični zglob ili patogenom-indukovanu leziju koju karakteriše imunopatologija, često u depo formulaciji ili formulaciji sa produženim oslobađanjem. Pored toga, moguće je primeniti antitelo u sistemu za ciljanu primenu leka, na primer, u lipozomu obloženom sa tkivno-specifičnim antitelom, koji ciljno deluje na, na primer, artritični zglob ili patogenom-indukovanu leziju koju karakteriše imunopatologija. Lipozomi će ciljno delovati na pogođeno tkivo i biće selektivno preuzeti od strane tog pogođenog tkiva.

[0100] Farmaceutske kompozicije za primenu u skladu sa predstavljenim postupcima prema tome biće formulisane na uobičajeni način primenom jednog ili više fiziološki prihvatljivih nosača koji sadrže inertne punioce i pomoćna sredstva koji olakšavaju obradu aktivnih jedinjenja u preparate koji se mogu koristiti farmaceutski. Ove farmaceutske kompozicije mogu se proizvesti na način koji je sam po sebi poznat, npr., pomoću postupaka uobičajenog mešanja, rastvaranja, granulisanja, pripreme dražeje, sprašivanja, emulgovanja, inkapsulacije, hvatanja unutar ili liofilizacije. Pogodna formulacija zavisi od izabranog načina primene. Kada se primenjuje u tečnom obliku, može se dodati tečni nosač kao što je voda, petroleum, ulja životinjskog ili biljnog porekla kao što je ulje od kikirikija, mineralno ulje, sojino ulje ili sezamovo ulje, ili sintetička ulja. Tečni oblik farmaceutske kompozicije može dalje da sadrži fiziološki rastvor, dekstrozu ili rastvor drugog saharida, ili glikole kao što su etilen glikol, propilen glikol ili polietilen glikol. Kada se primenjuje u tečnom obliku, farmaceutska kompozicija sadrži od oko 0.5 do 90 težinskih % proteina prema predstavljenom pronalasku, i poželjno od oko 1 do 50% proteina prema predstavljenom pronalasku.

[0101] Kada se terapeutski efikasna količina antitela prema postupcima koji su ovde dati primenjuje preko intravenozne, kutane ili subkutane injekcije, protein prema predstavljenom pronalasku će biti u obliku parenteralno prihvatljivog vodenog rastvora bez pirogena. Priprema takvih parenteralno prihvatljivih proteinskih rastvora, sa odgovarajućom pH vrednošću, izotoničnošću, stabilnošću i slično, u okviru je znanja stručnjaka iz date oblasti tehnike. Poželjna farmaceutska kompozicija za intravenoznu, kutanu ili subkutanu injekciju trebalo bi da sadrži, pored proteina prema predstavljenom pronalasku, izotonični nosač kao što je injekcija natrij um hlorida, Ringer-ova injekcija, injekcija dekstroze, injekcija dekstroze i natrijum hlorida, injekcija rastvora Ringer laktata, ili drugi nosač kao što je poznato u tehnici. Farmaceutska kompozicija prema predstavljenom pronalasku može takođe da sadrži sredstva za povećanje rastvorljivosti, konzervanse, pufere, antioksidante ili druge aditive koji su poznati stručnjacima iz date oblasti tehnike. Za injekciju, sredstva prema pronalasku mogu biti formulisana u vodenim rastvorima, poželjno u fiziološki kompatibilnim puferima kao što su Hank-ov rastvor, Ringer-ov rastvor ili fiziološki rastvor. Za transmukozalnu primenu, u formulaciji se koriste penetrirajuća sredstva odgovarajuća za barijeru kroz koju se želi prodreti. Takva penetrirajuća sredstva su generalno poznata u tehnici.

[0102] Za primenu putem inhalacije, antitela za primenu prema predstavljenim postupcima pogodno se primenjuju u obliku aerosol spreja iz pakovanja pod pritiskom ili nebulizatora, uz primenu pogodnog propelanta, npr., dihlorodifluorometana, trihlorofluorometana, dihlorotetrafluoroetana, ugljen dioksida ili drugog pogodnog gasa. U slučaju aerosola pod pritiskom jedinica doze može biti određena obezbeđivanjem ventila za isporuku odmerene količine. Kapsule i kertridži od, npr., želatina za primenu u inhalatoru ili insuflatoru mogu biti formulisane tako da sadrže mešavinu u prašku od jedinjenja i pogodne baze u prašku kao što je laktoza ili škrob. Jedinjenja mogu biti formulisana za parenteralnu primenu injekcijom, npr., bolus injekcijom ili kontinuiranom infuzijom. Formulacije za injekciju mogu biti predstavljene u obliku jedinične doze, npr., u ampulama ili kontejnerima za višestruke doze, sa dodatim konzervansom. Kompozicije mogu imati takve oblike kao što su suspenzije, rastvori ili emulzije u uljanim ili vodenim nosačima, i mogu da sadrže sredstva za formulisanje kao što su sredstva za suspendovanje, stabilizaciju i/ili raspršiva sredstva.

[0103] Farmaceutske formulacije za parenteralnu primenu obuhvataju vodene rastvore aktivnih jedinjenja u obliku koji je rastvorljiv u vodi. Pored toga, suspenzije aktivnih jedinjenja se mogu pripremiti kao odgovarajuće suspenzije za uljane injekcije. Pogodni lipofilni rastvarači ili nosači obuhvataju masna ulja kao što je sezamovo ulje, ili sintetičke estre masnih kiselina, kao što su etil oleat ili trigliceridi, ili lipozome. Suspenzije za vodene injekcije mogu da sadrže supstance koje povećavaju viskoznost suspenzije, kao što su natrijum karboksimetil celuloza, sorbitol ili dekstran. Izborno, suspenzija može takođe da sadrži pogodne stabilizatore ili sredstva koja povećavaju rastvorljivost jedinjenja da bi se omogućila priprema visoko koncentrovanih rastvora. Alternativno, aktivni sastojak može biti u obliku praška za pripremu sa pogodnim nosačem, npr., sterilnom vodom bez pirogena, pre primene.

[0104]Količina antitela korisnog u navedenim postupcima u farmaceutskoj kompoziciji prema predstavljenom pronalasku zavisiće od prirode i težine stanja koje se leci, i od prirode ranijih tretmana kojima je pacijent bio podvrgnut. Konačno, nadležni lekar će odrediti količinu proteina prema predstavljenom pronalasku sa kojom će lcčiti svakog pojedinačnog pacijenta. Trebalo bi očekivati da će doza varirati prema starosti, telesnoj težini i odgovoru pojedinačnog pacijenta. Početno, nadležni lekar će primenjivati niske doze antitela prema predstavljenim postupcima i posmatraće odgovor pacijenta. Veće doze antitela prema predstavljenom pronalasku mogu se primenjivati sve dok se ne dobije optimalni terapeutski efekat za pacijenta, i tada se doza više ne povećava. Razmatrano je da bi različite farmaceutske kompozicije korišćene za izvođenje postupaka koji su ovde dati trebalo da sadrže oko 0.01 ug do oko 100 mg (poželjno oko 0.1 pg do oko 10 mg, poželjnije oko 0.1 ug do oko 1 mg) antitela prema predstavljenom pronalasku po kg telesne težine. Kada se primenjuje, terapeutska kompozicija za primenu u ovom pronalasku je naravno u fiziološki prihvatljivom obliku bez pirogena. Terapeutski korisna sredstva osim antitela prema predstavljenim postupcima koja takođe mogu biti izborno uključena u kompoziciju kao što je opisana u prethodnom tekstu, mogu se alternativno ili dodatno, primenjivati istovremeno ili uzastopno sa kompozicijom u postupcima prema pronalasku. Tačnu formulaciju, način primene i dozu može izabrati pojedinačni lekar u odnosu na stanje pacijenta. Videti, npr., Fingl et al., THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS (poslednje izdanje). Količina doze i interval doziranja mogu biti podešeni pojedinačno da bi se obezbedili nivoi u plazmi aktivne grupe koji su dovoljni za održavanje željenih terapeutskih efekata, ili minimalna efikasna koncentracija (MEC). MEC će zavisiti za svako jedinjenje ali se može proceniti izin vitropodataka; na primer, kao koncentracija koja je neophodna da bi se postiglo 50-90% inhibicije biološke aktivnosti primenom testova koji su ovde opisani.

[0105]Antitelo koje je ovde dato može se primenjivati samo ili u kombinaciji sa drugim terapeutskim modalitetima. Antitelo koje je ovde obezbeđeno takođe sc može primenjivati samo ili u kombinaciji sa drugim antitelima identifikovanim kao inhibitori aktivnosti IL-10 ili drugim imunosupresivnim sredstvima.

F. Primeri

Primer I Opšti postupci

[0106]Neki od standardnih postupaka su opisani ili citirani iz literature, npr., u Maniatis, et al. (1982) MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratorv, Cold Spring Harbor Press; Sambrook, et al. (1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, (2d ed.), vols. 1-3, CSH Press, NY; Ausubel, et al., BIOLOGY, Greene Publishing Associates, Brooklvn, NY; or Ausubel, et al. (1987 and Supplements) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene/Wiley, New York. Postupci za prečišćavanje proteina obuhvataju takve postupke kao što su precipitacija amonijum sulfatom, hromatografija na koloni, clektroforeza, centrifugiranje, kristalizacija, i drugi. Videti, npr., Ausubel, et al. (1987 i periodični dodaci); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification" in METH. ENZYMOL., vol. 182, i drugi volumeni u ovoj seriji; i literatura koju je dao proizvođač o primeni proizvoda prečišćavanja proteina, npr., Pharmacia, Piscataway, N.J., ili Bio-Rad, Richmond, CA. Kombinacija sa rekombinantnih tehnikama omogućava fuziju sa odgovarajućim segmentima, npr., za FLAG sekvencu ili ekvivalent koji može biti fuzionisan preko sekvence koja se može ukloniti proteazom. Videti, npr., Hochuli

(1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" in Setlow (ed.) GENETIC ENGINEERING, PRINCIPLE AND METHODS 12:87-98, Plenum Press, N.Y.; i Crowe, et al. (1992) QIAEXPRESS: THE HIGH LEVEL EXPRESSION & PROTEIN PURIFICATION SYSTEM, Qiagen, Inc., Chatsworth, CA.

[0107]Kompjuterska analiza sekvenci je izvedena, npr., primenom dostupnih softverskih programa, uključujući one iz GCG (U. VVisconsin) i GenBank izvora. Javne baze podataka sekvenci su takođe korišćene, npr., iz GenBank i drugih.

Primer II Humanizacija anti- humanih IL- 10 antitela

[0108]Humanizacija pacovskog anti-humanog IL-10 antitela, 12G8, izvedena je kao što je opisano u Delu C u prethodnom tekstu. Slika 1 prikazuje dodelu brojeva ostataka i odgovarajuće numeričke ocene za položaje ostataka koji su identični sekvencama klicine linije koje se ispituju. Izračunavanja su prikazana za 12G8 varijabilne regione lakog (Slika 1A) i teškog (Slika 1B) lanca 12G8 anti-humanog IL-10 antitela i za varijabilne regione lakog (Slika 1C) i teškog (Slika ID) lanca 11D8 anti-humanog IL-10 antitela.

Primer III Parmakokinetika 12G8, anti- humanog IL- 10 antitela

[0109]Cilj:Da bi se dobile procenein vivoterminalnih polu-života i subkutane biodostupnosti za 12F8 antitelo u mišjem modelu.

[0110]Antitelo:Antitelo se primenjuje u nosaču od 10 mM Na acetata, 8% saharoze, pH 5.25.

[0111]Miševi:Crl: CD-1® (ICR) BR ženke miševa kupljene su iz Charles River Laboratories.

[0112]Eksperimentalni dizajn:Miševi su primili jednu bolus injekciju antitela ili intravenozno (i.v. u bočnu repnu venu) ili subkutano (s.c. u zatiljak vrata, po sredini lopatice ili u bok). Doze antitela su obuhvatale 0.03, 0.3, 3.0 i 30 mg/kg po mišu. Miševi su posmatrani do 28 dana posle injekcije. Tokom ovog vremenskog perioda, miševima je merena telesna težina i uzimani su uzroci seruma. Uzorci seruma za 12G8 (SCH 708980) grupe (Grupe 1-8) uzimani su na 0.5, 1, 3, 6, 10, 16 časova, dan 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 21 i 28 posle injekcije primenom 5 miševa/vremenskoj tački. U grupi koja prima nosač (Grupa 9), uzorci seruma su uzimani pre injekcije, 1 čas posle injekcije, 14 dana ili 21 dan korišćenjem samo 5 miševa/vremenskoj tački. Nivoi IL-10 u serumu i nivoi 12G8 antitela u serumu određivani su primenom specifičnih ELISA testova.

[0113]Određivanje farmakokinetičkih parametara.Svi parametri su procenjeni ili izračunati primenom WinNonlin Prov 4.0. Za ne-kompartmentalne analize, korišćen je Model 200 (SC) ili Model 201 (IV). Ulazni podaci su po dozi normalizovana grupa aritmetičke sredine podataka koncentracije-vremena. Ulazne doze su bile nominalne doze za Grupe 2-4 i 6-8. Ulazna doza za Grupe 1 i 5 bila je 0.014 mg/kg. Za kompartmentalne analize, korišćen je Model 3 (SC) ili Model 7 (IV). Ulazni podaci su po dozi normalizovani podaci za koncentraciju-vreme za pojedinačne životinje. Za sva fitovanja korišćeno je uniformno ponderovanje (wt=l) za individualne tačke podataka. Ulazne doze su bile nominalne doze za Grupe 2-4 i 6-8. Ulazna doza za Grupe 1 i 5 bila je 0.014 mg/kg. Korektnost fitovanja je procenjivana vizuelnim pregledanjem, poređenjem SE za procenjene/izračunate parametre, ostatake i AIC & SBC kriterijuma. Rezime rekuperovanja doziranog rastvora prikazan je u sledećoj Tabeli.

[0114]Tabele prikazane u daljem tekstu prikazuju podatke iz grupa koje primaju 12G8 antitelo preko i.v. injekcije.

[0115]Tabele prikazane u daljem tekstu prikazuju podatke iz grupa koje primaju 12F8 antitelo preko s.c. injekcije.

[0116]Profili koncentracije-vremena prikazani su za 12F8 antitelo primenom različitih doza i načina primene na Slici 2.

[0117]Zaključci:Doze su bile unutar 20% nominalne vrednosti za sve grupe osim najnižeg nivoa doze. Koncentracije niže od očekivanih, verovatno kao posledica prisustva anti-SCH708980 (humanizovanih 12G8) antitela, zabeležene su od dana 10 posle injekcije u grupama 7 ili 8. (A) Farmakokinetika IV Bolus in jekcije. Polu-životi, klirens i zapreminska distribucija su tipični za one koji koji se mogu videti kod drugih IgGl monoklonalnih antitela. Zapreminska distribucija je približno jednaka ili malo veća od zapremine seruma što sugeriše minimalnu ekstravaskularnu distribuciju. Terminalni polu-životi bili su u opsegu od 10 do 17 dana. Povećanje u AUC bilo je generalno proporcionalno dozi, što sugeriše linearni PK u testiranom opsegu doza. (B) Farmakokinetika SC Bolus injekcije. Maksimalne koncentracije su generalno proporcionalne dozi i dostignute su za 1-2 dana posle doze što sugeriše postojane stope i veličinu (stepen) apsorpcije u testiranom opsegu doza. Povećanje u AUC bilo je generalno proporcionalno dozi što sugeriše linearni PK. Polu-životi terminalne eliminacije bili su u opsegu od 8-14 dana, slično drugim IgGl monoklonalnim antitelima. Apsolutna biodostupnost bila je visoka, opseg = 70-100%, iako procene koje su >90% mogu biti visoke zbog potcenjivanja IV AUC.

Primer IV Određivanje ravnotežne konstantne disocijacije ( Kd) za humanizovano

anti- humano IL- 10 antitelo SCH 708980 ( 12G8) primenom KinExA tehnologije

[0118]Ravnotežna konstanta disocijacije (Kd) za humanizovano antitelo SCH 708980 određena je primenom KinExA 3000 (Sapidvne Instruments Inc.). KinExA koristi princip Kinetic Exclusion Assay postupka zasnovanog na merenju koncentracije antitela van kompleksa u smeši antitela, antigena i kompleksa antitela-antigena. Koncentracija slobodnog antitela merena je izlaganjem smeše antigenu imobilizovanom na čvrstoj fazi tokom veoma kratkog vremenskog perioda. U praksi, ovo se postiže protokom rastvorene faze smeše antigen-antitelo preko čestica obloženih antigenom koje su zarobljene u protočnoj ćeliji. Podaci dobijeni iz instrumenta analizirani su primenom prilagođenog softvera. Ravnotežne konstante su izračunavane primenom matematičke teorije zasnovane na sledećim pretpostavkama:

1. Vezivanje se odigrava prema ravnotežnoj jednačini reverzibilnog vezivanja:

2. Antitelo i antigen se vezuju 1:1, i ukupno antitelo je jednako kompleks antigena-antitela plus slobodno antitelo 3. Signal instrumenta je linearno povezan sa koncentracijom slobodnog antitela

[0119]Korišćeni materijali:Monoklonalno humanizovano antitelo SCH 708980 za rekombinantni humani IL-10 (hl2G8); rekombinantni humani IL-10 (hIL-10); rekombinantni mišji IL-10 (mIL-10), rekombinantni cyno IL-10 (cyno IL-10); PMMA čestice, 98 mikrona (Sapidvne, Cat No. 440198); Neutravidin (Pierce, Cat No. 31000); EZ- link TFP PEO-Biotin (Pierce, Cat No. 21219); Biotinilovani rhIL-10; i Cy5 konjugovani kozji anti-HulgG (H + L)

(Jackson Immunoresearch Laboratories kat. Br. 109-175-088, serija 49069).

[0120]PMMA čestice su obložene sa biotinilovanim rhIL5 prema protokolima proizvođača. Za biotinilaciju je korišćen rhIL5 EZ-link TFP PEO-biotin prema preporukama proizvođača (Pierce bulletin 0874). Svi eksperimentalni postupci su izvedeni prema KinExA 3000 uputstvu.

[0121]Eksperimentalni uslovi:Svi ciklusi su izvedeni u duplikatu. Za hIL-10 cikluse korišćeni su sledeći uslovi:

[0122] Serijska razblaženja antitgena od dva puta pripremljena su i mešana sa antitelom na konstantnoj koncentraciji. Smeša je inkubirana 2 časa na sobnoj temperaturi (RT) da bi se dostigla ravnoteža.

[0123] Za mIL-10 ciklusa korišćeni su sledeći uslovi:

[0124]Serijska razblaženja antigena od dva puta pripremljena su i mešana sa antitelom na konstantnoj koncentraciji. Smeša je inkubirana 2 časa na sobnoj temperaturi da bi se dostigla ravnoteža.

[0125] Za cyno IL-10 cikluse korišćeni su sledeći uslovi:

[0126]Serijska razblaženja antigena od dva puta pripremljena su i mešana sa antitelom na konstantnoj koncentraciji. Smeša je inkubirana 2 časa na sobnoj temperaturi da bi se dostigla ravnoteža.

[0127] Rezultati su prikazani u Tabeli datoj u daljem tekstu.

Primer V Primena kompetitivnog elektrohemiluminiscentnog testa ( ECLA) za

merenje vezivanja anti- hIL- 10 monoklonalnih antitela i hIL- 10- Ra za rekombinantni IL-10

različitog porekla.

[0128]Kratak prikaz tehnologije.Elektrohemiluminiscentna tehnologija je razvijena od strane IGEN, Ine (Gaithersburg, MD) i korišćena je u M-serije M8/384 analizatoru koji se koristi u ovom radu. Elektrohemiluminiscentna tehnologija koristi stabilan rutenijum metal helat (Ori-TAG) koji, u prisustvu tripropilamina (TPA), stvara elektrohemiluminiscenciju prilikom primene voltaže (napona). Paramagnetne kuglice, prečnika u mikronima, ponašaju se kao čvrsta faza i olakšavaju brzu kinetiku testa. Kuglice/kompleks je kanalisan kroz protočnu ćeliju i zarobljen na elektrodi primenom magneta. Primenjena je voltaža (napon) i merena je dobijena elektrohemiluminiscencija.

[0129]Korišćeni materijal.96 komorne polipropilenske ploče (Costar, kat. br. 3365, Fisher Sci. Cat. No. 07200697); test pufer od 0.1% BSA, 0.05% tween 20, PBS pH 7.5; paramagnetne kuglice (Streptavidin-Dvnabeads, Igen, Inc., kat. br. 110029); rekombinantni humani IL-10 dimer (hIL-10-dimer); rekombinantni humani IL-10-monomer (hIL-10-mono); rekombinantni mišji IL-10 (mIL-10); rekombinantni cyno IL-10 (cyno IL-10); i rekombinantni hIL-lORa (hIL-lORa): FLAG-obeležcni protein. Ori-Tag obeležena anti-FLAG M2 monoklonalna antitela pripremljena su primenom Ori-Tag-NHS estra (Igen, Inc. kat. br. 110034 ) prema protokolu proizvođača (OriTag obeleživač: IgG odnos imunizacije 8:1). Anti-Flag M2 monoklonalna antitela su kupljena iz Sigma (kat. br. F3165). Ori-Tag obeležena anti hlgG 1A2 monoklonalna antitela pripremljena su kao u prethodnom tekstu primenom pacovskih anti hlgG monoklonalnih antitela. Ori-Tag obeležena anti pacovska IgG antitela pripremljena su kao u prethodnom tekstu od poliklonalnih kozjih anti pacovskih IgG (H+L) antitela (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc. PA, kat. br. 112-005-143). Biotinilovani rekombinantni humani IL-10 (hIL-10-biotin) pripremljen je primenom TFP-PEO-biotina (Pierce, kat. br. 21219) prema preporukama proizvođača (Pierce bulletin 0874). Pacovska anti hIL-10 mAb 12G8 (rl2G8): JES3.12G8 i humanizovana anti hIL-10 mAb 12G8 (hl2G8-l) pripremljena su kao što je ovde opisano.

[0130]Protolol.1/3 serijska razblaženja u 50 mikrolitara test pufera napravljena su u 96-komornoj mikrotitarskoj ploči za sve neobeležene IL-10 preparate (mlL-10, cyno IL-10, hIL-10 dimer, hIL-10 mono) počevši sa 3 ug/ml u prvoj komorici. Svi uzorci su obrađeni u duplikatu. 50 ug hIL-10-biotina na 25 ng/ml dodato je u svaku komoricu, nakon čega sledi dodavanje ili hIL-lORa (50 ug na 100 ng/ml) ili anti hIL-10 mAb (50 pg na 10 ng/ml). 50 mikrolitara Ori-Tag konjugovanih sekundarnih antitela dodato je u svaku komoricu u koncentraciji od 500 ng/ml. Za hIL-lORa, r!2G8 i hl2G8 korišćena su sledeća Ori-Tag konjugovana antitela: anti-FLAG M2-OriTag, anti-pacovska IgG-OriTag i anti hlgG 1A2-OriTag. Konačno, u svaku komoricu dodato je 50 ug Streptavidin-Dynabeads u 0.1 mg/ml. Posle inkubacije od jednog časa na sobnoj temperaturi ploča je obrađena pomoću M-serije M8/384 analizatora. Procenat inhibicije signala preko neobeleženih IL-10 preparata izračunavan je u odnosu na kontrolne uzorke. Za pravljenje grafikona od dobijenih rezultata i izračunavanje IC50korišćen je GraphPad Prism softver.

[0131]Rezultati su prikazani u Tabeli datoj u daljem tekstu.

[0132]Rezultati karakterizacije pacovskog 12G8 antitela i humanizovanog 12G8 antitela (SCH708980) prikazani su u Tabeli datoj u daljem tekstu.

Primer VI Neutralizujući efekti humanizovanog anti- humanog IL- 10 antitelain

vivo

[0133]In vivoneutralizujuća efikasnost SCH 708980 i JES.12G8 procenjivana je u modeluLeishmania majorkod miševa. U ovom modelu, CB6F1 miševi koji su normalno otporni na parazitsku infekciju su učinjeni podložnim heterozigotnosti za humani IL-10 transgen pod kontrolom MHC klase II promotora. CB6F1 ili CB6Fl-huIL-10Tg miševi su injektirani s.c. sa SCH 708980 ili JES.12G8 jednom nedeljno počevši od tri dana pre izlaganja 15xl06 stacionarne fazeL. majorparazita s.c. u taban. Napredovanje bolesti praćeno je merenjem otoka na tabanu jednom nedeljno. SI. 3 pokazuje da su i SCH708980 (humanizovano 12G8) i parentalni pacovski 12G8 neutralizovali zaštitni efekat IL-10 na način zavistan od doze.

Claims (18)

1. Molekul humanizovanog rekombinantnog antitela koji vezuje IL-10 ili njegov vezujući fragment, naznačen time što sadrži: najmanje jedan varijabilni region lakog lanca antitela ili njegov vezujući fragment, koji sadrži polipeptid koji ima varijabilni region SEQ ID NO: 4; i najmanje jedan varijabilni region teškog lanca antitela, ili njegov vezujući fragment, koji sadrži polipeptid koji ima varijabilni region SEQ ID NO: 9.

2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što dalje sadrži konstantni region teškog lanca, pri čemu konstantni region teškog lanca sadrži yl, y2, y3 ili y4 konstantni region humanog teškog lanca ili njegovu varijantu.

3. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što dalje sadrži konstantni region lakog lanca, pri čemu konstantni region lakog lanca sadrži konstantni region lambda ili kapa humanog lakog lanca.

4. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što je vezujući fragment - fragment antitela izabran iz grupe koju čine Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2i dvojno antitelo.

5. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što laki lanac antitela ili njegov vezujući fragment, sadrži polipeptid koji ima varijabilni region i konstantni region SEQ ID NO: 5.

6. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što težak lanac antitela ili njegov vezujući fragment, sadrži polipeptid koji ima varijabilni region i konstantni region SEQ ID NO: 10.

7. Primena antitela specifičnog za IL-10, ili njegovog vezujućeg fragmenta, u količini koja je efikasna za blokiranje biološke aktivnosti IL-10 za pripremu leka za supresiju imunog odgovora kod humanog subjekta, pri čemu je antitelo - antitelo prema patentnom zahtevu 1 i pri čemu subjekat ima sistemski lupus eritematodes ili lupus nefritis.

8. Primena prema patentnom zahtevu 7, naznačena time što dalje sadrži primenu imunosupresivnog sredstva.

9. Kompozicija naznačena time što sadrži antitelo, ili njegov vezujući fragment, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili razblaživačem, pri Čemu je antitelo - antitelo prema patentnom zahtevu 1.

10. Kompozicija prema patentnom zahtevu 9, naznačena time što dalje sadrži imunosupresivno sredstvo.

11. Izolovana nukleinska kiselina naznačena time što kodira polipeptid prema patentnom zahtevu 1.

12. Ekspresioni vektor naznačen time što sadrži nukleinsko kiselinsku sekvencu prema patentnom zahtevu 11 funkcionalno vezanu za kontrolne sekvence koje prepoznaje ćelija domaćin transficirana sa vektorom.

13. Izolovana ćelija domaćin naznačena time što sadrži vektor prema patentnom zahtevu 12.

14. Postupak za proizvodnju polipeptida, naznačen time što sadrži kultivisanje ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 13in vitropod uslovima u kojima se nukleinsko kiselinska sekvenca eksprimira, na taj način proizvodeći polipeptid, i dobijanje polipeptida iz ćelije domaćina.

15. Izolovana nukleinsko kiselinska sekvenca koja kodira antitelo specifično za IL-10 koja sadrži laki lanac koji ima nukleinsko kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19 i težak lanac koji ima nukleinsko kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20.

16. Nukleinska kiselina prema patentnom zahtevu 15, naznačena time što laki lanac ima ATCC deponujući broj PTA-5923 i težak lanac ima ATCC deponujući broj PTA-5922.

17.Izolovana nukleinska kiselinska sekvenca koja kodira vezujući fragment antitela koji je kodiran od strane nukelinsko kiselinske sekvence prema patentnom zahtevu 15.

18. Nukleinska kiselina prema patentnom zahtevu 17, naznačena time što je vezujući fragment - fragment antitela izabran iz grupe koju čine Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2i dvojno antitelo.