RS51191B - Derivati aminofenila kao novi inhibitori histon deacetilaze - Google Patents

Description

Ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenja koja imaju inhibitorsko delovanje protiv histonske deacetilaze (HDAC). Takođe, ovaj pronalazak se odnosi na procese za njihovu preparciju, na kompozicije koje ih sadrže, kao i na njihovu upotrebu u uslovimain vitroiin vivo,sa ciljem inhibiranja HDAC i kao lek za, na primer inhibiranje proliferativnih stanja, kao rak ili psorijaza.

Jedrini histoni su poznati kao integralne i dinamičke komponente mašinerije koja je odgovorna za regulisanje genske transkripcije i drugih procesa u kojima je molekul DNK kalup kao replikacija, popravak, rekombinacija i hromosomska segregacija. Oni su predmet post-translacijskih modifikovanja uključujući acetailaciju, fosforilaciju, metilaciju, ubikvitinaciju i ADP-ribozilaciju.

Histonska(e) deacetilaza(e), ovde označeni kao „HDAC" su enzimi koji katalizuju odstranjivanje acetilske modifikacije sa lizinskih ostataka u belančevinama, uključujući centralne nukleosomalne histone H2A, H2B, H3 i H4. Zajedno sa histonskim acetiltransferazama, ovde označenima kao „HAT", HDAC regulišu nivo acetilacije histona. Balans acetilacije nuklesomalnih histona ima važnu ulogu u transkripciji mnogih gena. Hipoacetilacija histona je povezana sa kondenzovanim hromatinskim strukturama, a koje dovodi do represije genske transkripcije, pri čemu se acetilovani histoni povezuju sa labavom hromosomskom strukturom i aktivacijom transkripcije.

Jedanaest strukturno povezanih HDAC je opisano, a podeljeni su i dve klase. Klasa I HDAC se sastoji od HDAC 1, 2, 3, 8 i 11 dok klasa II HDAC se sastoji od HDAC 4, 5, 6, 7, 9 i 10. Članovi treće klase HDAC strukturno nisu povezani sa klasom I i II HDAC. Klase I/II HDAC deluju uz pomoć mehanizama koji su zavisni o cinku, dok klasa III HDAC je zavisna o NAD.

Osim histona, druge belančevine su takođe supstrat za acetilaciju, tako na primer transkripcijski faktori kao p53, GATA-1 i E2F; jedrini receptori kao receptor glukokortikoida, tiroidni receptori, estrogeni receptori; belančevine koje regulišu ćelijski ciklus kao pRb. Acetilacija belančevina je povezana sa stabilizovanjem belančevina, na primer stabilizovanje p53, regrutovanje kofaktora i povećano vezanje na DNK. P53 je tumor supresor koji je uključen u zaustavljanju ćelijskog ciklusa ili apoptozi kao odgovor na brojne stresne signale, kao oštećenje na DNK. Glavni cilj p53 tokom indukovanja zaustavljanja ćelijskog ciklusa se čini daje gen p21. Osim aktivisanja s p53, p21 je identifikovan u asocijaciji sa ciklin/ciklin zavisnim kompleksima kinaza gde dovodi do zaustavljanje ćelijskog ciklusa u Gl i G2 faza, njegova povećana regulacija tokom starenja ćelija i njegova interakcija sa nuklearnim antigenom ćelija koje proliferiraju.

Ispitivanje inhibitora HDAC navodi da isti imaju važnu ulogu u zaustavljanju ćelijskog ciklusa, ćelijske diferencijacije, apoptoze i reverzije fenotipova transformiranosti.

Inhibitor Trihostatin A (TSA), na primer, dovodi do zaustavljanje ćelijskog ciklusa u fazama Gl i G2, uzrokuje reverziju fenotipa transformiranosti različitih ćelijskih linija i indukuje diferencijaciju ćelija Friend leukemije i dr. TSA (i suberoilanilid hidroksamična kiselina SAHA) inhibiraju rast ćelija, dovode do termalne diferencijacije i vrše prevenciju nastanka tumora u miševa (Finnin et al., Nature, 401: 188-193, 1999).

Trihostatin A je također koristan u tretmanu fibroze, na primer fibroze džigerice i hirhoze džigerice. (Geerts et al., European Patent Application EP 0 827 742, objavljeno 11 marta 1998).

Farmakofor za HDAC inhibitore se sastoji od domena za vezanje metala, koji reaguje sa aktivnim mestom HDAC koje sadrži cink, domena sa linkerom i domena za površinsko prepoznavanje ili region za kapovanje, koji reaguje sa ostatkom na rubu aktivnog mesta.

Inhibitori HDAC takođe indukuju ekspresiju gena p21. Transkripcijsko aktivisanje gena p21 od strane ovih inhibitora je ubrzano uz pomoć hromatinskog re-modelovanja, a posle toga sledi acetilacija histona H3 i H4 u regionu promotora gena p21. Aktivisanje p21 nastupa nezavisno o p53 pa su inhibitori HDAC aktivni u ćeliji u kojoj je mutiran gen p53, šta je oznaka mnogih tumora.

Dodatno, inhibitori HDAC mogu da imaju indirektne aktivnosti kao na primer povećanje imunog odgovora domaćina i inhibiranje tumorske angiogeneze pa tako mogu da suprimiraju rast primarnih tumora i uspore metastazu (Mai et al., Medical Research Revievvs, 25: 261-309, 2005).

U vezi sa gore rečenim, inhibitori HDAC mogu da imaju veliki potencijal za tretman stanja u kojima dolazi do proliferacije ćelija, uključujući tumore sa imitiranim genom p53.

Patentna aplikacija EP 1472216, publikovana 14 avgusta 2003 razotkriva bicikličke hidroksamate kao inhibitore histonskih deacetilaza.

Patentne aplikacije EP1485099, EP1485348, EP1485353, EP1485354, EP1485364, EP1485365, EP1485370, EP1485378, publikovane 18 septembra 2003, među ostalima, razotkrivaju supstituisane piperazinilpirimidinilhidroksamične kiseline kao inhibitore histonske deacetilaze, a dodatno EP 1485365 razotkriva R306465.

Patentna aplikacija EP1492534 publikovana 9 oktobra 2003 razotkriva jedinjenja karbamične kiseline koja se sastoje od piperazinskog povezivanja, kao inhibitore HDAC.

Patentna aplikacija EP 1495002 publikovana 23 oktobra 2003 razotkriva supstituisana jedinjenjapiperazinil fenil benzamida, kao inhibitore histonske deacetilaze.

Patentna prijava EP1501508 publikovana 13. novembra 2003., otkriva benzamide kao inhibitore histon deacetilaze.

Patentna aplikacija WO04/009536 publikovana 29 januara 2004 razotkriva derivate koje sadrže alkilni linker među arilne grupe i hidroksamata, kao inhibitore histonske deacetilaze.

Patentna aplikacija EP1525199 publikovana 12 februara 2004 razotkriva (hetero)arilalkenil supstituisane bicikličke hidroksamate, kao inhibitore histonske deacetilaze.

Patentna prijava EP1572626 publikovana 24. juna 2004., otkriva derivate arilen-karboksilna kiselina (2-amino-fenil)-amida kao farmakološke agense.

Patentna aplikacija EP1581484 publikovana 29 jula 2004 razotkriva derivate od derivata N-hidroksi-benzamida sa delovanjem protiv zapaljenja i tumora.

Patentna aplikacija EP1585735 publikovana 29 jula 2004 razotkriva supstituisane derivate aril hidroksamata kao inhibitore histonske deacetilaze.

Patentna prijava EP1592667 publikovana 19. augusta 2004., otkriva derivate mono-aciliranih O-fenilendiamina kao farmakološke agense.

Patentna prijava EP 1590340 publikovana 19. augusta 2004., otkriva derivate diaminofenilena kao inhibitore histon deacetilaze.

Patentna prijava EP1592665 publikovana 26. augusta 2004., otkriva derivate benzamida kao inhibitore histon deacetilaze.

Patentna aplikacija WO04/072047 publikovana 26 avgusta 2004 razotkriva indole, benzimidazole i naftimidazole kao inhibitore histonske deacetilaze.

Patentna aplikacija EP 1608628 publikovana 30 septembra 2004 razotkriva hidroksamate vezane na ne-aromatski heterociklički prstenski sistem kao inhibitore histonske deacetilaze.

Patentna prijava EP 1613622 publikovana 14. oktobra 2004., otkriva derivate oksima kao inhibitore histon deacetilaze.

Patentna aplikacija WP1611088 publikovana 28 oktobra 2004 razotkriva derivate hidroksamata kao inhibitore histonske deacetilaze.

Patentna aplikacija V/O05/028447 publikovana 31 marta 2005 razotkriva benzimidazole kao inhibitore histonske deacetilaze.

Patentne aplikacije WO05/030704 i WO05/030705 publikovane 7 aprila 2005 razotkrivaju benzamide kao inhibitore histonske deacetilaze.

Patentna aplikacija WO05/040101 publikovana 6 maja 2005 razotkriva hidroksamate povezane na acilureu i povezane na sulfonilureu kao inhibitore histonske deacetilaze.

Patentna aplikacija WO05/040161 takođe publikovana 6 maja 2005 razotkriva hidroksamate vezane na biaril kao inhibitore histonske deacetilaze.

Patentna prijava EP1613622 publikovana 14. oktobra 2004., otkriva derivate oksima kao inhibitore histon deacetilaze.

Patentna prijava WO05/075469 publikovana 18. augusta 2005., otkriva tiazolil hidroksamične kiseline i tiadiazolil hidroksamične kiseline kao inhibitore histon deacetilaze.

Patentna prijava WO05/086898 publikovana 22. septembra 2005., otkriva heteropentaciklične hidroksamične kiseline kao inhibitore histon deacetilaze.

Patentna prijava WO05/092899 publikovana 6. oktobra 2005., otkriva alkenilbenzamide kao histon deacetilaze.

Jedinjenja iz ovoga pronalaska se razlikuju od struktura prijašnje tehnike u svojoj farmakološkoj aktivnosti i/ili farmakološkog potencijala.

Problem koji treba da se reši je da se osiguraju inhibitori histonske deacetilaze sa visokom enzimskom i ćelijskom aktivnošću, koji imaju povećanu biodostupnost i/iliin vivopotencijal.

Nova jedinjenja iz ovoga pronalaska rešavaju gore pomenuti problem. Jedinjenja ovog pronalaska pokazuju korisnu ćelijsku aktivnost. Poseduju visok kapacitet aktiviranja gena p21, na nivou ćelije kao i na nivou in vivo. Mogu da imaju poželjan farmakokinetički profil i nizak afinitet prema P450 enzimima, čime se umanjuje rizik od štetnih lek-lek međudejstava, dopuštajući takođe i širu bezbednosnu granicu. Osobine koje daju prednost ovim jedinjenjima su metabolička stabilnost, rastvorljivost i/ili kapacitet za indukovanje p21. Još određenije, jedinjenja ovog pronalaska imaju povećanu rastvorljiivost u vodenim rastvorima i/ili imaju poboljšane mogućnosti indukovanja p21 promotora in vivo.

Pronalazak se odnosi na jedinjenja sa formulom (I)

iV-oksid forme, farmaceutski prihvatljive adicijske soli i njihove stereohemijske izomerne forme, gde

nje ceo broj sa vrednošću 0, 1 ili 2 i kada je n jednak 0 naznačena je direktna veza;

m je ceo broj sa vrednošću 1 ili 2;

XjeNili CH;

YjeO, Sili NR8; u čemu

R<8>je vodonik, Ci_6alk.il, Ci-6alkiloksiC|_6alkil, C3-6cikloalkil, C3.6cikloalkilme.il, fenilCi-6alkil, -C(0)-CHR<9>R<10>ili -S(=0)2-N(CH3)2; u čemu

je svaki R<9>i R<10>nezavisno vodonik, amino, Ci_6alkil ili aminoCi_6alkil; i

kada je Y jest NR<8>i R<2>na poziciji 7- ili je indolil, tadaR<2>iR<8>mogu zajedno da formiraju bivalentni radikal

-(CH2)2- (a-l),ili

-(CH2)3- (a-2);

R.1 je vodonik, Ci-ćalkil, hidroksiCi_6alkil, cijanoCi^alkil, Ci^alkilsulfonil, Ci.6alkilkarbonil ili mono- ili di(Ci-6alkil)aminosulfonil;

R<2>je vodonik, hidroksi, amino, halo, Ci^alkil, cijano, C2-6alkenil, polihaloC|.6alkil, nitro, fenil, Ci_6alkilkarbonil, hidroksikarbonil, Ci.6alkilkarbonilamino, Ci-6alkiloksi ili mono- ili di(Ci-6alkil)amino;

R je hidroksi ili amino;

R<4>je vodonik, tienil, furanil ili fenil i svaki tienil, furanil ili fenil može po izboru da se supstituiše sa halo, amino, nitro, cijano, hidroksi, fenil, Ci-6alkil, (diCi-6alkil)amino, Ci.6alkiloksi, fenilCi-ćalkiloksi, hidroksiC|.6alkil, Ci_6alkiloksikarbonil, hidroksikarbonil,C\.ćalkilkarbonil, polihaloCi^alkiloksi, polihaloCi^alkil, Ci-6alkilsulfonil, hidroksikarbonilCi.6alkil, Ci-galkilkarbonilamino, aminosulfonil, aminosulfonilCi^alkil, izoksazolil, aminokarbonil, fenilC2-6alkenil, fenilC3.6alkinil ili piridinilC3-6alkinil;

R\ 5 R° 6 i R7' su svaki nezavisno vodonik, amino, nitro, furanil, halo, C^alkil, Ci^alkiloksi, trifluorometil, tienil, fenil, Ci_6alkilkarbonilamino, aminokarbonilCi^alkil ili -C=C-CH2-R<11>.

Termin „inhibitor histonske deacetilaze" se koristi da se identifikuje jedinjenje koje je sposobno da reaguje sa histonskom deacetilazom i da inhibira njenu aktivnost, detaljnije njenu enzimatsku aktivnost. Inhibiranje enzimatske aktivnosti histonske deacetilaze redukuje sposobnost histonske deacetilaze da odstranjuje acetilnu grupu sa histona. Poželjno, takva inhibicija je specifična, na primer inhibitor histonske deacetilaze redukuje sposobnost histonske deacetilaze da odstrani jednu acetilnu grupu sa histona pri koncentraciji koja je niža od koncentracije inhibitora koji je potreban da uzrokuje neki drugi, neočekivani biološki efekat.

Kako se koristi u ranijim definicijama i dalje u tekstu, halo je generičko ime za fluoro, hloro, bromo i jodo. Ci^alkil defmiše radikale zasićenih ugljovodonika ravnog lanca koji imaju 1 ili 2 atoma ugljenika, kao što su npr. metil ili etil; Cj.6alkil defmiše Ct_2alkil i radikale zasićenih ugljovodonika ravnog i račvastog lanca koji imaju od 3 do 6 atoma ugljenika, kao što su npr. propil, butil, 1-metiletil, 2-metilpropil, pentil, 2-metilbutil, heksil, 2-metilpentil i slične; polihaloCi-ealkil definiše Ci^alkil koji sadrži tri identična ili različita halo supstituenta, na primer trifluorometil; C2-6alkenil definiše radikale ugljovodonika ravnog i račvastog lanca koji sadrže jednu dvostruku vezu i imaju od 2 do 6 atoma ugljenika, kao što su na primer etenil, 2-propenil, 3-butenil, 2-pentenil, 3-pentenil, 3-metil-2-butenil i slične; C3-6alkinil definiše radikale ugljovodonika ravnog i račvastog lanca koji sadrže jednu trostruku vezu i imaju od 3 do 6 atoma ugljenika, kao što su na primer 2-propinil, 3-butinil, 2-butinil, 2-pentinil, 3-pentinil, 3-heksinil i slične; C3.7cikloalkil uključuje ciklične ugljovodonične grupe koje imaju od 3 do 7 atoma ugljenika, kao što su ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, ciklopentenil, ciklohekcil, cikloheksenil, cikloheptil i slične.

Farmaceutski prihvatljive adicijske soli obuhvataju farmaceutski prihvatljive kisele adicijske soli i farmaceutski prihvatljive bazne adicijske soli. Farmaceutski prihvatljive kisele adicijske soli kao šta su pomenuti dalje u tekstu trebaju da obuhvataju terapeutski aktivne ne-toksične forme kiselih adicijskih soli, koje jedinjenja sa formulom (I) mogu da oforme. Jedinjenja sa formulom (I) koja imaju bazne karakteristike mogu da se konvertiraju u njihove farmaceutski prihvatljive kisele adicijske soli uz pomoć tretiranja pomenutih baznih formi sa odgovarajućom kiselinom. Odgovarajuće kiseline obuhvataju, na primer, anorganske kiseline kao vodoničnohalnih kiselina, na primer hloro-vodonična kiselina ili bromo-vodonična kiselina; sulfurna; nitratna; fosforna i si. kiseline; ili organske kiseline kao na primer octena, trifluorooctena, propanoična, hidroksioctena, mlečna piruvična, oklasalna, malonska, sukcinska (na primer butandioična kiselina), maleična, fumarna, malična, tartarna, citrička, metansulfonska, etansulfonska, benzensulfonska,/7-toluensulfonska, ciklamna, salicilna,p-amino-salicilna, pamoična i si. kiseline.

Jedinjenja sa formulom (I) koja imaju kisele karakteristike mogu da se konvertiraju u njihove farmaceutski prihvatljive bazne adicijske soli uz pomoć tretmana pomenutih kiselina sa odgovarajućim organskim ili anorganskim bazama. Odgovarajući forme baznih soli obuhvataju, na primer, amonijumske soli, soli alkalnih ili zemno-alkalnih metala, na primer soli litijuma, natrijuma, kalijuma, magnezijuma, kalcijuma i si., soli sa organskim bazama, na primer sa benzatinom, iV-metil-D-glukamin, soli hidrabamina i soli sa amino kiselinama kao na primer sa argininom, lizinom i si.

Termin „kisele i bazne adicijske soli" takođe obuhvata hidrate i rastvorive adicijske forme koje su jedinjenja sa formulom (I) sposobna da oforme. Primeri takvih formi su na primer, hidrati, alkoholati i si.

Termin „stereohemijski izomerne forme jedinjenja sa formulom (I)", kako se ovde koristi definiše sva moguća jedinjenja koja su sastavljena od istih atoma vezanima istom sekvencom veza, ali koja imaju različite tri-dimenzionalne strukture, koje nisu međusobno izmjenjiva, a koje jedinjenja sa formulom (I) mogu da poseduju. Osim ako nije pomenuto drugačije, hemijska oznaka jedinjenja obuhvata mešavinu svih mogućih stereohemijskih izomernih formi, koje pomenuto jedinjenje može da poseduje. Pomenuta mešavina može da sadrži sve dijastereoizomere i/ili enantiomere osnovne molekularne strukture pomenutog jedinjenja. Sve stereohemijski izomerne forme jedinjenja sa formulom (I), u čistoj formi ili u međusobnoj mešavini su obuhvaćeni okvirima ovoga pronalaska.

iV-oksidne forme jedinjenja sa formulom (I) trebaju da obuhvate ona jedinjenja sa formulom (I) gde jedan ili nekoliko azotnih atoma je oksidirano u takozvane iV-okside, posebno oneN-okside gde jedan ili više piperidin-piperazin ili piridazinil-azoti su A'-oksidirani.

Neka od jedinjenja sa formulom (I) mogu da postoje u svojim tautomernim formama. Takve forme, mada nisu posebno navedene u gornjim formulama, treba da budu uključene u okvire ovoga pronalaska.

Bilo gde da se u daljnjem tekstu koristi, termin ,jedinjenja sa formulom (I)" uključuje takođe farmaceutski prihvatljive adicijske soli i sve stereoizomerne forme.

Kako se ovde koristi, termini „histonska deacetilaza" i „HDAC" trebaju da se odnose na bilo koju familiju enzima koji odstranjuju acetilne grupe sa s-amino grupa u lizinskim ostacima na N-terminusu histona. Osim ako nije drugačije navedeno, termin „histon" treba da se odnosi na bilo koju histonsku belančevinu, uključujući Hl, H2A, H2B, H3, H4 i H5 iz bilo koje vrste. Humane HDAC belančevine ili genski produkti, uključuju, ali time nisu ograničeni HDAC-1, HDAC-2, HDAC-3, HDAC-4, HDAC-5, HDAC-6, HDAC-7, HDAC-8, HDAC-9, HDAC-10 i HDAC-11. Histonska deacetilaza može takođe da se derivira iz protozoa i gljiva.

Prva grupa zanimljivih jedinjenja se sastoji od onih jedinjenja for mule (I) u kojoj R<4>nije vodonik.

Druga grupa zanimljivih jedinjenja se sastoji od onih jedinjenja formule (I) na koju se odnose jedno ili više sledećih ograničenja: a) nje 0 ili 1; b) m je 1 ili 2; c) XjeNiliCH; d) Y je NR<8>u čemu je R<8>vodonik, Ci-6alkil, C^cikloalkil ili C3_6cikloalkilmetil; e) R<1>je vodonik, Ci.6alkil, hidroksiCi.6alkil ili Ci.6alkilsulfonil; f) R je vodonik ili halo; g) R3 je amino;

h) R4 je vodonik ili tienil; i

i) R<5>, R<6>i R<7>su svaki vodonik.

Treća grupa zanimljivih jedinjenja se sastoji od onih jedinjenja formule (I) na koju se odnose jedno ili više sledećih ograničenja: a) nje 0 ili 1; b) m je 1 ili 2; c) XjeNiliCH; d) Y je NR<8>u čemu je R<8>vodonik, Ci__alkil, C3.6cikloalkil ili C3.6cikloalkilmetil; e) R<1>je vodonik, Ci-ealkiI, hidroksiCi.6alkil, Ci-6alkilkarbonil ili Ci^alkilsulfonil; f) R<2>je vodonik ili halo; g) R3 je amino;

h) R<4>je vodonik; i

i)R5, R<6>i R<7>su svaki vodonik.

Četvrta grupa zanimljivih jedinjenja se sastoji od onih jedinjenja formule (I) na koju se odnose jedno ili više sledećih ograničenja:

a) nje 0 ili 1; b) m je 1 ili 2; c) XjeNiliCH; d) Y je NR<8>u čemu je R<8>vodonik, Ci-6alkil, C3-6cikloalkil ili C3-6cikloalkilmetil; e) R<1>je vodonik, Ci-6alkil, hidroksiC].6alkil, Ci-6alkilkarbonil ili Ci-6alkilsulfonil; f) R<2>je vodonik ili halo; g) R3 je amino;

h) R4 je vodonik ili tienil; i

i)R5, R<6>i R<7>su svaki vodonik.

Poželjna grupa zanimljivih jedinjenja se sastoji od onih jedinjenja formule (I) na koju se odnose jedno ili više sledećih ograničenja: a) njel; b) m je 1 ili 2; c) XjeNiliCH; d) Y je NR8 u čemu je R<8>Ci.6alkil, na primer metil ili etil; e) R<1>je vodonik, hidroksiCi^alkil ili C|_6alkilsulfonil; f) R 2 je vodonik i*li halo, na primer fluoro ili hloro, posebno na poziciji 4-, 5-, ili 7-; g) R3 je amino;

h) R4 je vodonik ili tienil; i

i■ ) R ^ , R f> i R 7 su svaki vodonik.

Najpoželjnija grupa jedinjenja sastoji se od onih jedinjenja formule (I) na koju se odnose jedno ili više sledećih ograničenja: a) njel; b) mje 1; c) XjeN; d) Y je NR<8>u čemu je R<8>metil; e) R<1>je vodonik; f) R<2>je vodonik ili halo, na primer fluoro ili hloro, posebno na poziciji 4-, 5-, ili 7-; g) R<3>je-NH2;

h) R4 je vodonik ili 2-tienil; i

i) R<5>, R<6>i R<7>su svaki vodonik.

Posebno poželjno jedinjenje formule (I) je Jedinjenje br. 2, to jest, jedi nj enje formule

Jedinjenja sa formulom (I) i njihove farmaceutski prihvatljive soli i N-oksidi i njihove stereohemijske izomerne forme mogu da se pripreme na konvencionalni način. Početni materijali i neki od međuprodukata su poznata jedinjenja i komercijalno su dostupni ili mogu da se pripreme prema konvencionalnim reakcijskim postupcima kako je opšte poznato u struci, ili kako je prikazano u patentnim prijavama EP1485099, EP1485348, EP1485353, EP1485354, EP1485364, EP1485365, EP1485370 i EP1485378. Neke metode pripreme će detaljnije da budu opisane u daljem tekstu. Druge su metode za dobijanje finalnih jedinjenja formule (I) opisane u primerima.

Jedinjenja formule (I) mogu da se pripreme reagovanjem međuprodukta formule (II) u čemu M predstavlja vodonik ili alkalni metal, na primer natrijum ili litijum, sa jedinjenjem formule (III) u prisustvu baze, kao što je na primer trietilamin i benzotriazol-l-iloksi-tripirolidino-fosfonijum heksafluorofosfat (PyBOP). Navedena reakcija provodi se u pogodnom rastvaraču, kao na primer tetrahidrofuranu ili dihlorometanu ili u njihovoj smeši.

Alternativno, jedinjenja formule (I) mogu da se pripreme konvertovanjem jedinjenja formule (II) u kiseli hlorid, na primer tretmanom sa sulfonil hloridom (SOCl2) u pogodnom rastvaraču kao što je dihlorometan, zatim reagovanjem nastalog kiselog hloridnog jedinjenja sa jedinjenjem formule (III) u prisustvu baze kao što je piridin, u pogodnom rastvaraču kao što je dihlorometan ili THF.

Jedinjenja formule (I) također mogu da se konvertuju međusobno putem reakcija poznatih u struci ili transformisanjem funkcionalnih grupa, zavisno o osetljivosti ostalih grupa u molekulu, na primer hidrolizom karboksilnih estra do odgovarajuće karboksilne kiseline ili alkohola; hidrolizom amida do odgovarajućih karboksilnih kiselina ili amina; hidrolizom nitrila do odgovarajućih amida; amino grupe na fenilu mogu da se zamene vodonikom reakcijama diazotizacije poznatima u struci, te naknadnom zamenom diazo-grupe vodonikom; alkoholi mogu da se konvertuju u estre i etre; primarni amini mogu da se konvertuju u sekundarne ili tercijarne amine; dvostruke veze mogu da se hidrogenišu do odgovarajuće jednostruke veze; jodo radikal na fenilnoj grupi može da se konvertuje u grupu estra umetanjem ugljenog monoksida u prisustvu pogodnog paladijumovog katalizatora.

Međuprodukti formule (II) mogu da se pripreme reagovanjem međuprodukta formule (III) sa pogodnim kiselim rastvorom, npr. hlorovodonične kiseline, ili pogodnom bazom alkalnog metala, npr. natrijum hidroksida, u pogodnom rastvaraču kao što je etanol, uglavnom pod refluksom.

Međuprodukti formule (III) mogu da se pripreme reagovanjem etilnog estra karboksilne kiseline formule (IV) sa pogodnim karboksaldehidom formule (V) u čemu je t 0 ili 1, u prisustvu pogodnog reagensa kao što je natrijum borohidrid, npr. natrijum tetrahidroborat, u pogodnom rastvaraču kao što je alkohol, npr. metanol.

Međuprodukti formule (III) mogu da se pripreme na analogni način reagovanjem međuprodukta formule (IVa) sa međuproduktom formule (Va), kako je gore opisano.

Međuprodukti formule (III) mogu takođe da se pripreme reagovanjem međuprodukta formule (IV) sa međuproduktom formule (VI) u čemu je W pogodna odlazna grupa, kao što je na primer halo, npr. fluoro, hloro, bromo ili jodo, ili sulfoniloksi radikal kao što je metilsulfoniloksi, 4-metilfenilsulfoniloksi i slično. Reakcija može da se provodi u reakciono inertnom rastvaraču kao što je na primer alkohol, npr. metanol, etanol, 2-metoksi-etanol, propanol, butanol i slično; eter, npr. 4,4-dioksan, l,l'-oksibispropan i slično; keton, npr. 4-metil-2-pentanon ili N,N-dimetilformamid, nitrobenzene, acetonitril i slično. Dodavanje pogodne baze kao što je na primer karbonat ili hidrogenkarbonat alkalnog ili zemnoalkalnog metala, npr. trietilamin ili natrijum karbonat, može da se koristi kako bi se uklonila kiselina koja se oslobađa tokom reakcije. Mala količina pogodnog metalnog jodida, npr. natrijum ili kalijum jodida, može da se doda kako bi se podstakla reakcija. Mešanje može da ubrza reakciju. Reakcija pogodno može da se sprovodi na temperaturi u rasponu između sobne temperature i temperature refluksa reakcione smeše i, ako se želi, reakcija može da se provodi pri povećanom pritisku.

Međuprodukti formule (III) mogu da se pripreme na analogni način reagovanjem međuprodukta formule (VII) sa međuproduktom formule (VIII), u čemu je W pogodna odlazna grupa kako je gore opisano.

Jedinjenja sa formulom (I) i neki intermedijeri mogu da imaju najmanje jedan stereogeni centar u svojoj strukturi. Ovaj stereogeni centar može da bude prisutan u R ili S konfiguraciji.

Jedinjenja sa formulom (I) kako su prezentovani u ovde opisanim procesima su opšte uzeto racemične smese enantiomera, koji mogu da budu odvojeni jedan od drugoga uz pomoć procedura koje su poznate stanju tehnike. Racemična jedinjenja sa formulom (I) mogu da budu konvertovana u odgovarajuće forme dijastereoizomernih soli uz pomoć reakcije sa odgovarajućom hiralnom kiselinom. Pomenute forme dijastereoizmernih soli se naknadno odvajaju, na primer, selektivno ili frakcionim kristalizovanjem, a enantiomeri su oslobođeni od njih uz pomoć alkalija. Alternativan način separiranja enentiomernih formi jedinjenja sa formulom (I) uključuje tekuću hromatografiju uz pomoć hiralne stacionarne faze. Pomenute čiste stereohemijski izomerne forme mogu takođe da se deriviraju iz odgovarajućih čistih stereohemijskih izomernih formi odgovarajućeg startnog materijala uz uslov da reakcija nastupa stereospecifično. Poželjno je da kada se derivira neki specifični stereoizomer, pomenuto jedinjenje da se sintetiše uz pomoć stereospecifičnih metoda pripreme. Ovi metodi uključuju enentiomerno čist početni materijal.

Jedinjenja sa formulom (I), farmaceutski prihvatljive kisele adicijske soli i njihove stereoizomerne forme imaju vredne farmakološke karakteristike u tome da poseduju inhibitorni efekat protiv histonske deacetilaze (HDAC).

Ovaj pronalazak donosi jedinjenja formule (I) za inhibiranje abnormalnog rasta ćelija, uključujući transformisane ćelije, primenom delotvorne količine jedinjenja ovog pronalaska. Nenormalan rast ćelija se odnosi na rast ćelija koji je nezavisan od normalnih regulatornih mehanizama (na primer, nestanak kontaktne inhibicije). Ovo uključuje inhibiciju rasta tumora direktno ili preko kočenja rasta, terminalne diferencijacije i/ili apoptoze tumorskih ćelija i indirektno preko inhibiranja neovaskulizacije tumora.

Ovaj pronalazak takođe donosi jedinjenja formule (I) za inhibiranje rasta tumora primenom delotvorne količine jedinjenja ovog pronalaska na subjektu, npr. na sisaru (i još određenije na čoveku) kojem je takav tretman neophodan. Određenije, ovaj pronalazak donosi jedinjenja formule (I) za inhibiranje rasta tumora primenom delotvorne količine jedinjenja ovog pronalaska. Primeri tumora koji mogu da budu inhibirani, bez da se pronalazak ograničava samo na njih, su rak pluća (na primer, adenokarcinom i rak velikih ćelija pluća), rak pankreasa (na primer, rak pankreasa kao, na primer egzokrini karcinom pankreasa), rak debelog creva (na primer, kolorektalni karcinomi, kao na primer adenokarcinom debelog creva i adenom debelog creva), rak prostate uključujući napredne bolesti, hematopoetske tumore limfalne linije (na primer, limfocitna leukemija, limfom B-ćelija, Burkitov limfom), mijeloidne leukemije (na primer, akutna mielogena leukemija (AML)), tiroidni folikularni rak, mielodisplastični sindrom (MDS), tumori mezenhimalnih organa (na primer, fibrosarkomi i rabdomiosarkomi), melanomi, teratokarcinomi, neuroblastomi, gliomi, benigni tumor kože (na primer, keratokantomi), rak dojke (na primer, napredni rak dojke), karcinom bubrega, karcinom jajnika, karcinom bešike i epidermalni karcinom.

Jedinjenje u skladu sa pronalaskom može da se koristi za druge terapeutske svrhe, na primer: a) senzitizacija tumora za radioterapiju uz pomoć davanja jedinjenja u skladu ovoga pronalaska, tokom ili posle zračenja tumora za tretiranje raka; b) tretiranje artropatija i osteopatoloških stanja kao reumatoidnog artritisa, osteoartritisa, juvenilnog artritisa, giht, poliartritis, psorijazni artritis, ankilozni spondilitis i sistemski lupus eritematozis; c) inhibiranje proliferiranja ćelija maznih mišića uključujući vaskularne proliferativne poremećaje, ateroskleroze i restenoze; d) tretiranje stanja zapaljenja i dermalnih stanja kao ulcerativni kolitis, Kronovu bolest, alergijski rinitis, graft-naspram-host reakcije, konjuktivitisa, astme, ARDS, Beketova bolest, odbacivanje transplantata, urtikarija, alergijski dermatitis, alopecia areta, eksantem, ekcem, dermatomizitis, akne, dijabetes, sistemski lupus eritematosis, Kavasaki bolest, multipla skleroza, emfizem, cistička fibroza i hronični bronhitis; e) tretiranje endometroze, uterine fibroze, disfunkcionalno uterino krvarenje i endometrijaske hiperplazije; f) tretiranje okularnu vaskulizaciju uključujući vaskulopatiju koja delije na retinalne i horoidalne krvne sudove; g) tretiranje kardijačnu disfunkciju; h) inhibiranje imunosupresivnih stanja kao na primer tretman HIV infekcija; i) tretiranje renalnu disfukciju; j) supresiranje endokrinih poremećaja; k) inhibiranje disfunkcije glukoneogeneze; 1) tretiranje neuropatologiju, na primer Parkinsonovu bolest ili neuropatologiju koja dovodi do kognitivne poremećaje, na primer Alchajmerova bolest ili neuronske bolesti koje su povezane sa poliglutaminom;

m) tretiranje psihijatrijskih poremećaja, na primer šizofreniju, bipolarni poremećaj,

depresiju, napetost i psihozu;

n) inhibiranje neuromuskularne patologije, na primer, amilotropnu lateralnu sklerozu;

o) tretiranje spinalnu muskularnu atrofiju;

p) tretiranje drugih patogenih stanja prikladna za tretman uz pomoć pojačavanja

ekspresije nekog gena;

q) pojačavanje genske terapije;

r) inhibiranje adipogeneze;

s) tretiranje parazitoze kao na primer malariju.

Tako, ovaj pronalazak razotkriva jedinjenja sa formulom (I) za upotrebu kao lek, a takođe i upotrebu ovih jedinjenja sa formulom (I) za proizvodnju leka za tretman jednoga ili više od pomenutih stanja.

Jedinjenja sa formulom (I), njihove farmaceutski prihvatljive kisele adicijske soli i stereoizmerne forme mogu da poseduju vredne dijagnostičke karakteristike u tome da isti mogu da se koriste za detektovanje ili identifikovanje HDAC u biološkom uzorku što obuhvata detektovanje ili merenje formiranja kompleksa među označenog jedinjenja i HDAC.

Metodi detektovanja ili identifikovanja mogu da koriste jedinjenja koja su označena sa agensima za označavanje kao na primer radioizotopima, enzimima, fluorscentnim supstancijama, luminoznim supstancijama i si. Primeri za radioizotope uključuju<l25>I,<I3>,1,<3>H i<14>C. Enzimi su obično detektabilni uz pomoć konjugacije odgovarajućeg supstrata koji tokom katalize stvara vidljivu reakciju. Takvi primeri uključuju, na primer, beta-galaktozidazu, beta-glukozidazu, alkalnu fosfatazu, peroksidazu i malat dehidrogenazu, poželjno peroksidazu iz hrena. Luminozne supstancije uključuju, na primer, luminol, derivate luminola, luciferin, aekvorin i lucifarazu.

Biološki primerci mogu da se definišu kao telesna tkiva ili telesne tečnosti. Primeri telesnih tečnosti su cerebrospinalna tečnost, krv, plazma, serum, urin, sputum, pljuvačka i si.

U vezi sa njihovim korisnim farmakoloških karakteristika, pomenuta jedinjenja mogu da se formulišu u različite farmaceutske forme sa ciljem primene na pacijentu.

Da se pripreme farmakološke kompozicije iz ovoga pronalaska, efektivna količina pojedinog jedinjenja, u formi bazne ili kisele adicijske soli, kao aktivan sastojak treba da se kombinuje, u formi dobre mešavine, sa farmaceutski prihvatljivim kerijerom, koji može da bude zastupljen u mnogim formama u zavisnosti o formi preparata koji je poželjan za administraciju. Ove farmaceutske kompozicije su poželjne u unitarnim doznim formama, koje su prikladne, poželjno za oralnu administraciju, rektalnu, perkutanu ili uz pomoć parenteralne injekcije. Na primer, kod pripremanja kompozicija u formi oralnih doza, bilo koji od opštih farmaceutskih medijuma može da se primeni, kao na primer, voda, glikoli, ulja, alkoholi i slično u slučaju oralnih tečnih preparata kao suspenzija, sirupa, eliksira i rastvora; ili tvrdih kerijera kao škrob, šećeri, kaolin, lubrikanti, binderi, agensi za raspadanje i slično u slučaju pripreme prahova, pilula, kapsula i tableta.

Zbog njihove primene u administraciji, tablete i kapsule predstavljaju naj-naprednije oralne dozne forme gde se upotrebljavaju tvrdi farmaceutski kerijeri. Za parenteralne kompozicije, kerijeri će obično da obuhvataju sterilnu vodu, najmanje u velikom dijelu, ali takođe mogu da budu upotrebljeni i drugi sastojci, kako bi se na primer dobila rastvorivost. Rastvori za injektiranje, na primer, mogu da se pripreme sa kerijerima koji sadrže slani rastvor, rastvor glikoze ili mešavine slanog rastvora i rastvora glikoze. Suspenzije za injektiranje mogu takođe da se pripreme, ali tada se koriste odgovarajući tečni kerijeri, agensi za suspendovanje i si. U kompozicijama koje su pogodne za perkutanu administraciju, kerijer ponekad obuhvata agens za pojačavanje penetracije i/ili odgovarajući agens za navlaživanje, koji je ponekad kombinovan sa pogodnim aditivima bilo koje prirode u manjim količinama, a koji ne uzrokuju signifikantan negativni efekat za kožu. Pomenuti aditivi mogu da ubrzaju administraciju kroz kožu i/ili mogu da pomognu za pripremanje željenih kompozicija. Ove kompozicije mogu da se administriraju na različite načine, na primer kao transdermalni flaster, lokalni ili u obliku masti.

Posebno je korisno da se već pomenuta farmaceutska kompozicija formuliše u doznoj jedinici za jednostavnu administraciju i uniformnosti doze. Dozna jedinica kako se koristi u specifikaciji i zahtevima, odnosi se na fizički diskretne jedinice koje su pogodne za unitarno doziranje, a svaka jedinica sadrži već određenu količinu aktivnog sastojaka, izračunatu da produkuje željeni terapijski efekat, u asocijaciji sa potrebnim farmaceutskim kerijerom. Primeri takvih formi doznih jedinica su tablete (uključujući izračunate ili zamotane tablete), kapsule, pilule, pakete sa prahom, vafere, rastvori za injektiranje ili suspenzije, čajne kašike, kašike za supu i si. i njihove manje količine.

Stručnjaci mogu jednostavno da odrede efektivnu količinu uz pomoć rezultata testova koji su ovde prezentovani. Opšte uzeto, smatra se da terapeutski efektivna količina iznosi od 0.005 mg/kg do 100 mg/kg od telesne težine, a posebno količina od 0.005 mg/kg do 10 mg/kg telesne težine. Može da bude prikladno da se željena doza administrira na dva, tri ili više puta u manjim sub-dozama tokom odgovarajućih intervala tokom jednog dana. Pomenute sub-doze mogu da budu formulisane kao dozne jedinice, na primer koje sadrže 0.5 do 500 mg, a posebno od 10 mg do 500 mg aktivnog sastojaka po jedinične dozne forme.

Drugi aspekt ovoga pronalaska je kombinacija HDAC-inhibitor sa drugim agensom protiv raka, posebno za upotrebu kao lek, još specifičnije u tretmanu raka ili sličnih bolesti.

Za tretman već pomenutih stanja, jedinjenja iz ovoga pronalaska mogu da obuhvate kombinaciju s jednim ili više drugih medicinskih agenasa, posebno, sa drugim agensima protiv raka. Primeri agenasa protiv raka su: - jedinjenja sa platinom, kao na primer cisplatina, karboplatina ili aksaloplatina; - taksan jedinjenja, na primer paklitaksel ili docetaksel; inhibitore topoizmeraze I kao na primer kamptotecin jedinjenja , na primer irinitekan ili topotekan; inhibitore topoizmeraze 11, kao na primer anti-tumor podofilotoksin derivate, na primer etoposid ili teniposid; anti-tumorski vinka alkaloidi, na primer vinblastin, vinkristin ili vinorelbin; - anti-tumorski derivati nukleozida, na primer 5-fluorouracil, gemcitabin ili kapecitabin; alkilirajući agensi kao azotni senf ili nitrozourea, na primer ciklofosfamid, hlorambucil, karmustin ili lomustin; anti-tumorski derivati antraciklina, na primer daunorubicin, doksorubicin, idarubicin ili mitoksantron; - HER2 antitela, na primer trastuzumab; antagonisti estrogenskog receptora ili modulatori selektivnog estrogenskog receptora, na primer tamoksifen, toremifen, droloksifen, faslodeks ili raloksifen; inhibitori aromataze, kao na primer eksemestan, anastrozol, letrazol i vorozol; agensi za diferenciranje kao na primer vitamin D i agensi blokatori metabolizma retinoične kiseline (RAMBA), na primer akutan; - inhibitori DNK metil transferaza, na primer azacitidin; inhibitori kinaze, na primer flavoperidol, imatinib mesilat ili gefitinib; - inhibitori farneziltransferaze; - drugi HDAC inhibitori;

inhibitori ubikvitin-proteosomskog puta, na primer Velkad; ili

Jondelis.

Termin „platinsko jedinjenje" ovde se koristi da se označi bilo kakvo inhibiranje rasta neke tumorske ćelije uz pomoć jedinjenja koje sadrži platinu u formi jona.

Termin „toksan jedinjenja" indicira klasu jedinjenja koja imaju toksanski prsten i su povezana sa ili su derivirana iz ekstrakta nekih vrsta tise( Taxus).

Termin „inhibitori topoizmeraze" se koristi da se označe enzimi koji su sposobni menjanja DNK topologiju u eukariotskim ćelijama. Oni su kritični za neke važne ćelijske funkcije i ćelijsku proliferaciju. Postoje dve klase topoizomeraza u eukariotskim ćelijama, pit I i tip II. Topoizomeraza I je monomerni enzim sa molekularnom masom od otprilike 100.000. Enzim se veže za DNK i uvodi prolazni jedno-lančani lom, odmotava dvostruku zavojnicu (ili dozvoljava da se ista odmota) i posle toga ponovno zatvara lom pre disociranja sa DNK lanca. Topoizmeraza II ima slični mehanizam delovanja koji uključuje uvođenje lomova u DNK lanac ili nastanak slobodnih radikala.

Termin „kamptotecin jedinjenja" se koristi da se navedu jedinjenja koja su povezana sa ili su derivirana iz osnovnog jedinjenja kamptotecin koje je alkaloid koji ne može da se rastvori u vodi derivirano iz kineskog drvetaCamptothecin acuminatai iz indijskog drveta

Nothapodytes foetida.

Termin „podofilotoksin jedinjenja" se koristi da se navedu jedinjenja koja su povezana sa ili su derivirana iz osnovnog jedinjenja podofilotoksina. koje je ekstrahovano iz mandragore.

Termin „anti-tumorski vinka alkaloidi" se koristi da se navedu jedinjenja koja su povezana sa ili su derivirana iz ekstrakta iz biljkeVinca rosea.

Termin „alkilirajući agensi" obuhvata šaroliku grupu hemikalija koje imaju zajedničku karakteristiku da imaju kapacitet dodavati, u fiziološkim uslovima, alkilne grupe biološkim vitalnim makro-molekulima kao šta je DNK. Kod najvećeg broja najvažnijih agenasa, kao na primer azotnog senfa i nitrozourea, aktivni alkilirajući ostaci se stvarajuin vivonakon složenih degenerativnih reakcija, od kojih su neke enzimatske. Najvažnija farmakološka delovanja alkilirajućih agenasa su ona koja narušavaju fundamentalne mehanizme koje se odnose na ćelijsku proliferaciju, posebno na sintezu DNK i deobu ćelije. Kapacitet alkilirajućih agenasa da interferiraju sa funkcijom i integritetom DNK u tkivima koje brzo proliferiraju osigurava bazu za njihovu terapeutsku primenu i za mnogo od njihovih toksičnih karakteristika.

Termin „anti-tumor antraciklin jedinjenja" obuhvata antibiotike koji su dobiveni iz gljiveStrep. peuticus var. caesusi njihovih derivata, a karakteristika je da imaju tetraciklinski prsten sa neobičnim šećerom, daunosaminom, povezan sa glikozidnom vezom.

Amplifikovanje humanog receptora 2 za epidermalni faktor rasta (HER 2) u primarnim karcinomima dojke korelira sa slabom kliničkom prognozom nekih pacijenata. Trastuzumab je visoko purifikovano humanizirano monoklonsko IgGl kapa antitelo dobiveno iz rekombinantne DNK koje se veže sa visokim afinitetom i je specifično za ekstracelularni domen HER 2 receptora.

Mnogu karcinomi dojke imaju estrogene receptore i rast ovih tumora može da bude stimulisan uz pomoć estrogena. Termini „antagonisti estrogenskih receptora" i „selektivni modulatori estrogenih receptora" se koriste da se navedu kompetetivni inhibitori estradiola koji se vežu na estrogene receptore (ER). Selektivni modulatori estrogenih receptora, kada su vezani na ER, dovode do promena u tri-dimenzionalnoj formi receptora, modulirajući njegovu sposobnost vezanja na estrogene responsivne elemente (ERE) na DNK.

Kod žena koje su prošle menopauzu, osnovni izvor estrogena je konverzija adrenalnih i ovarijskih androgena (androstenedion i testosteron) u estrogene (estron i estradiol) uz pomoć enzima aromataza u perifernim tkivima. Gubitak estrogena kroz inhibiciju aromataze ili inaktivaciju efektivnog ili selektivnog tretman kod nekih pacijentica koje su prošle menopauzu sa rakom dojke koji je ovisan o hormonima.

Termin „antiestrogen agens" se koristi da se navedu ne samo antagonisti estrogenih receptora i selektivni modulatori estrogenih receptora već takođe i inhibitori aromataze kao šta je ranije diskutovano.

Termin „agensi za diferenciranje" obuhvata jedinjenja koja, na različite načine, inhibiraju proliferaciju ćelija i dovode do diferencijacije. Vitamin D i retinoidi su poznati kao važni regulatori rasta i diferencijacije veoma širokog raspona normalnih ili malignih tipova ćelija. Agensi za blokiranje metabolizma retinoičke kiseline (RAMBA) povećavaju nivo endogene retinoičke kiseline uz pomoć inhibiranja katabolizma retinoičke kiseline koji se provodi preko citohroma P450.

Promene u metilaciji na DNK spadaju među najčešće abnormalnosti u humanim neoplazijama. Hipermetilacija u promotoru nekih gena obično je povezana sa inaktivacijom isti gena. Termin „inhibitori DNK metil transferaze" se koristi da se navedu jedinjenja koja deluju kroz farmakološke inhibicije DNK metil transferaze i reaktivacije ekspresiju tumor-supresorskih gena.

Termin „inhibitori kinaze" obuhvata potentne inhibitore kinaza koji su involvirani u progresiji ćelijskog ciklusa i programiranoj smrti ćelija (apoptoza).

Termin „inhibitori farneziltransferaze" se koristi da se navedu jedinjenja koja su dizajnirana da spreče farnezilaciju Ras i drugih intercelularnih belančevina. Isti imaju efekat na proliferaciju malignih ćelija i na preživljavanje.

Termin „drugi inhibitori HDAC" obuhvata, ali time nije ograničen:

- karboksilate, na primer butirat, cinamičnu kiselinu, 4-fenilbutirat ili valproičnu kiselinu;

hidroksamične kiseline, na primer suberoilanilid hidroksamička kiselina (SAHA),

analozi SAHA koji sadrže piperazin, biaril hidroksamat A-161906 i njihovi karbozolileter-, tetrahidropiridin- i tetralon- analozi, biciklički aril-TV-hidroksikarboksamide, piroksamide, CG-1521, PXD-101, sulfonamid hidroksamična kiselina, LAQ-824, LBH-589, trihistatin A (TSA), okamflatin, skriptaid, triciklički molekuli koji su povezani sa skriptaidom, m-karboksi cinamična kiselina, bihidroksamična kiselina (CBHA), hidroksamične kiseline koje su slične CBHA, analog trapoksin-hidroksamične kiseline, CRA-024781, R306465 i njemu slične benzolil- i heteroalril-hidroksamične kiseline, aminosuberati i malonildiamidi;

ciklički tetrapeptidi, na primer trapoksin, apidicin, depsipeptid, jedinjenja povezana sa spiruhistatinom, RedFK-228, ciklički tetrapeptidi koji sadrže sulfhidril (SCOP), ciklički tetrapeptidi koji sadrže hidroksamičku kiselinu (CHAP), TAN-174 i azumamidi;

- bezamidi, na primer MS-275 ili CI-994, ili

depudecin.

Termin „inhibitori ubikvitinskog-proteosomatskog puta" se koristi da se navedu jedinjenja koja inhibiraju ciljno mjesto ćelijskih proteina u proteosomu, uključujući proteine regulatore ćelijskog ciklusa.

Za tretman raka, jedinjenja u skladu sa pronalaskom mogu da se administriraju pacijentu kako je ranije opisano, zajedno sa zračenjem. Zračenje znači jonizacijsko zračenje, a posebno gama zračenje, ono koje nastaje emisijom linearnih akceleratora ili radionuklida koji su u opštoj upotrebi danas. Zračenje tumora sa radionuklidima može da bude spoljno ili unutrašnje.

Ovaj pronalazak takođe se odnosi na kombinacije, u skladu sa istim, anti-tumorskog agensa sa inhibitorom HDAC u skladu sa ovim pronalaskom.

Ovaj pronalazak takođe se odnosi na kombinacije, u skladu sa istim, koje se koriste u medicinskoj terapiji, na primer za inhibiranje rasta tumorskih ćelija.

Ovaj pronalazak takođe se odnosi na kombinacije, u skladu sa istim, koje se koriste za inhibiciju rasta tumorskih ćelija.

Ovaj se pronalazak takođe odnosi na jedinjenja formule (I) koja inhibiraju rast tumorskih ćelija u humanom subjektu, što obuhvata primenu na subjektu delotvorne količine kombinacije prema ovom pronalasku.

Ovaj pronalazak nadalje donosi jedinjenja formule (I) za inhibiranje abnormalnog rasta ćelija, uključujući transformisane ćelije, primenom delotvorne količine kombinacije prema ovom pronalasku.

Drugi medicinski agens i HDAC inhibitor mogu da budu administrirani simultano (na primer, u odvojenim ili unitarnim kompozicijama) ili jedan posle drugoga u bilo kojem redosledu. U poslednjem slučaju, dva jedinjenja će da budu administrirana tokom nekog perioda u količini i tako da ih je dovoljno da osiguraju da se postigne napredan ili sinergističan efekat. Treba da se razume da će poželjan metod i način administrirani a i odgovarajuće dozne količine i režimi za svaku komponentu iz kombinacije da zavise o pojedinom drugom medicinskom agensu i inhibitoru HDAC koji se administrira, njihove rute administrirani a, pojedinog tumora koji se tretira i pojedinom domaćinu koji se tretira. Optimalan metod i način administrirani a i dozne količine mogu da se lako odrede od strane stručnjaka uz pomoć konvencionalnih metoda u skladu sa informacijama koje su ovde prezentovane.

Platinska jedinjenja se administriraju u dozi od 1 do 500 mg po kvadratnom metru (mg/m<2>) telesne površine, na primer 50 do 400 mg/m<2>, posebno za cisplatinu u dozama od oko 75 mg/m 2 , a za karboplatinu u dozama od oko 300 mg/m ~) tokom tretmana.

Taksanska jedinjenja se administriraju u dozama od oko 50 do 400 mg po kvadratnom metru (mg/m ) telesne površine, na primer 75 do 250 mg/m , posebno za paklitaksel u dozama od oko 175 do 250 mg/m<2>, a za docetaksel u dozama od oko 75 do 150 mg/m<2>tokom tretmana.

Kamptotecinska jedinjenje se administrira u dozama od 0.1 do 400 mg po kvadratnom metru (mg/m<2>) telesne površine, na primer 1 do 300 mg/m<2>, posebno za irinotekan u dozama od oko 100 do 350 mg/m<2>i za topotekan u dozama od oko 1 do 2 mg/m<2>tokom tretmana.

Anti-tumorski derivati podofilotoksina se daju u dozama od 30 do 300 mg po kvadratnom metru (mg/m 2 ) telesne površine, na primer od 50 do 250 mg/m 2, posebno za etoposid u dozama od oko 35 do 100 mg/m i za teniposid u dozama od oko 50 do 250 mg/m tokom tretmana.

Anti-tumorski vinka alkaloidi se administriraju u dozama od 2 do 30 mg po kvadratnom metru (mg/m<2>) telesne površine, posebno za vinblastin u dozi od oko 3 do 12 mg/m<2>, za vinkristin u dozi od oko 1 do 2 mg/m<2>, a za vinorelbin u dozi od oko 10 do 30 mg/m<2>tokom tretmana.

Anti-tumorski derivati nukleozida se administriraju u dozama od 200 do 2500 mg po kvadratnom metru (mg/m<2>) telesne površine, na primer 700 do 1500 mg/m<2>, posebno za 5-FU u dozi od 200 do 500 mg/m<2>, za gemcitabin u dozi od oko 800 do 1200 mg/m<2>, a za kapecitabin u dozi od oko 1000 do 2500 mg/m<2>tokom tretmana.

Alkilirajući agensi kao na primer azotni senf ili nitrozourea se administriraju u dozama od 100 do 500 mg po kvadratnom metru (mg/m<2>) telesne površine, na primer 120 do 200 mg/m<2>, posebno za ciklofosfamid u dozi od oko 100 do 500 mg/m<2>, za hlorambucil u dozi od oko 0.1 do 0.2 mg/kg. Za karmustin u dozi od oko 150 do 200 mg/m<2>, a za lomustin u dozi od oko 100 do 150 mg/m<2>tokom tretmana.

Anti-tumorski derivati antraciklina se administriraju u dozama od 10 do 75 mg po kvadratnom metru (mg/m 2 ) telesne površine, na primer 15 do 60 mg/m 2, posebno za doksirubicin u dozi od oko 40 do 75 mg/m<2>, za daunorubicin u dozi od oko 25 do 45 mg/m<2>, a za idarubicin u dozi od oko 10 do 15 mg/m<2>tokom tretmana.

Trastuzumab se administrira u dozi od 1 do 5 mg po kvadratnom metru (mg/m ) telesne površine, posebno 2 do 4 mg/m<2>tokom tretmana.

Antiestrogen agens se administrira u dozi od oko 1 do 100 mg po danu u zavisnosti o pojedinom agensu i stanju koje se tretira. Tamoksifen se administrira oralno u dozi od 5 do 50 mg, poželjno od 10 do 20 mg dva puta na dan, pod uslovom da se terapija nastavlja tokom dovoljno vremena da se postigne i održi terapeutski efekat. Toremifen se administrira oralno u dozama od oko 60 mg po danu, uz uslov da se terapija nastavlja tokom dovoljno vremena da se postigne i održi terapeutski efekat. Anastrozol se administrira oralno u dozama od oko 1 mg po danu. Doroloksifen se administrira oralno u dozama od oko 20-100 mg dva puta na dan. Raloksifen se administrira oralno u dozama od oko 60 mg jednom na dan. Eksemesten se administrira oralno u dozama od oko 25 mg po danu.

Ove doze mogu da se administriraju na primer jednom, dva puta ili više puta tokom tretmana, koji može da se ponovi na primer svakih 7, 14,21 ili 28 dana.

Prema njihovim korisnim farmakološkim karakteristikama, jedinjenja iz kombinacija u skladu sa ovim pronalaskom, na primer drugi medicinski agens i inhibitor HDAC mogu da se formulišu u različite farmaceutske forme sa ciljem primene. Komponente mogu da se formulišu odvojeno u individualnim farmaceutskim kompozicijama ili u unitarnim farmaceutskim kompozicijama koje sadrže obe komponente.

Ovaj pronalazak zbog toga se takođe odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata drugi medicinski agens i inhibitor HDAC zajedno sa jednim ili više farmaceutskih kerijera.

Ovaj pronalazak također se odnosi na kombinaciju u skladu sa pronalaskom u formi farmaceutske kompozicije koja obuhvata anti-tumorski agens i inhibitor HDAC u skladu sa pronalaskom zajedno sa jednim ili više farmaceutskih kerijera.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na upotrebu kombinacije u skladu sa pronalaskom u proizvodnji farmaceutske kompozicije za inhibiranje rasta tumorskih ćelija.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na produkt koji sadrži kao prvi aktivni sastojak HDAC inhibitor u skladu sa pronalaskom, a kao drugi aktivni sastojak jedan anti-tumorski agens, kao kombinovana preparacija za simultano, odvojeno ili pojedinačno korišćenje u tretmanu pacijenta koji pati od raka.

Eksperimentalni deo

U daljem tekstu, pojam 'K2CO3' znači kalijum karbonat, 'CH2CI2' znači dihlorometan, 'MgS04' znači magnezijum sulfat, 'DIPE' znači diizopropilni eter, 'THF' znači tetrahidrofuran, 'EtOAc' znači etilni acetat, 'DMF' znači N, AMimetilformamid, 'DMSO' znači dimetilsulfoksid, 'Et3>J' znači trietilamin, 'NaBH,)' znači natrijum tetrahidroborat(-l), 'NaBH3CN' znači natrijum cijanoborohidrid, 'PyBOP' znači benzotriazol-1-iloksi-tripirolidino-fosfonijum heksafluorofosfat, 'DIPEA' znači A?-etil-Ar-(l-metiletil)-2-propanamin, 'NH4OH' znači amonijum hidroksid, 'CH3OH' znači metanol, 'NH4HCO3' znači amonijum hidrogenkarbonat i T.T.' znači tačka topljenja.

A. Priprema međuprodukata

Primer Al

a)Pripremameđuprodukta 1

Rastvor 2-[2-(5-hloro-lH-indolil-3-il)etil]-lH-izoindol-l,3(2H)-diona (0.017 mol) u DMF (17 ml) doda se na sobnoj temperaturi suspenziji natrijum hidrida (0.034 mol) u DMF (11 ml), pod tokom N2. Smeša se na sobnoj temperaturi meša tokom 1 sata. Kapajući se doda 1-jodopropan (0.034 mol). Smeša se na sobnoj temperaturi meša tokom 2 sata, ulije u H2O i NaCl, te ekstaktuje sa EtOAc.Organski sloj se ispere sa H20, osuši (MgS04), profiltrira, pa se upari rastvarač, čime se dobije 7.77 g međuprodukta 1. b) Priprema međuprodukta 2

Smeša međuprodukta 1 (0.021 mol) i hidrazina/t.20 (0.106 mol) u etanolu (100 ml)

meša se i refluksuje tokom 2 sata, zatim se ohladi na sobnu temperaturu, ulije u H2O i ekstraktuje sa CH2CI2. Organski sloj se razdvoji, osuši (MgS04), profiltrira, pa se upari rastvarač, čime se dobije 5 g (100 %) međuprodukta 2.

Primer A2

a) Priprema međuprodukta 3

Rastvor etilnog estra 2-(metilsulfonil)-5-pirimidinkarboksilne kiseline (0.094 mol) u acetonitrilu (40 ml) doda se na 10°C suspenziji 4-piperidinmetanola (0.086 mol) i K2CO3(0.172 mol) u acetonitrilu (200 ml), pod tokom N2. Smeša se dovede na sobnu temperaturu, zatim meša tokom 4 sata, ulije u H20 i ekstraktuje s EtOAc. Organski sloj se razdvoji, osuši (MgSO-O, profiltrira, pa se upari rastvarač. Ostatak (23 g) se kristalizuje iz acetonitrila/dietilnog etra. Izvorišni sloj se upari, pa se dobijeni ostatak prečisti stubastom hromatografijom na silika gelu (eluent: CH2Cl2/CH3OH/NH4OH 97/3/0.1; 20 - 45 nm). Čiste se frakcije sakupe, pa se upari rastvarač, čime se dobije 4.6 g (20 %) (T.T.: 129 °C) međuprodukta 3.

b) Priprema međuprodukta 4

Rastvoru etandiol dihlorida (0.061 mol) u CH2C12(110 ml) doda se pod tokom N2DMSO (0.127 mol) na -78 °C. Smeša se meša tokom 15 minuta. Doda se rastvor međuprodukta 3 (0.051 mol) u CH2C12(200 ml). Smeša se meša na -78 °C tokom 1 sata i 30 minuta. Kapajući se doda Et3N (0.26 mol). Smeša se meša na -78 °C tokom 15 minuta, zatim se zagreje na sobnu temperaturu tokom 2 sata i 30 minuta. Doda se H20. Smeša se ekstraktuje sa CH2C12. Organski sloj se razdvoji, osuši (MgS04), profiltrira, pa se upari rastvarač. Ostatak (14 g) se prečisti stubastom hromatografijom na silika gelu (eluent: cikloheksan/EtOAc 70/30; 20 - 45 [ im). Čiste se frakcije sakupe, pa se upari rastvarač, čime se dobije 7.6 g (57 %) međuprodukta 4. c) Priprema međuprodukta 5

NaBH3CN (0.034 mol) i sirćetna kiselina (0.023 mol) dodaju se pod tokom N2rastvoru

međuprodukta 2 (0.021 mol) i međuprodukta 4 (0.021 mol) u CH3OH (500 ml). Smeša se

meša tokom 72 sata, ulije u 10 % rastvor K2C03, te ekstaktuje sa EtOAc. Organski sloj se razdvoji, osuši (MgS04), profiltrira, pa se upari rastvarač. Ostatak (10.4 g) se prečisti stubastom hromatografijom na silika gelu (eluent: CH2CI2/CH3OH/NH4OH 97/3/0.1; 15-40 um). Čiste se frakcije sakupe, pa se upari rastvarač, čime se dobije 5.5 g (54 %) međuprodukta 5.

d) Priprema međuprodukta 6

Smeša međuprodukta 5 (0.001 mol) i natrijum hidroksida (0.004 mol) u etanolu (50 ml) se

meša i refluksuje tokom 5 sati, zatim se ohladi na sobnu temperaturu i upari do suva. Ostatak se rastvori u dietilnom etru. Talog se profiltrira i osuši, čime se dobije 0.407 g (85 %) (T.T.: > 260 °C) međuprodukta 6 kao soli natrijuma (.Na).

Primer A3

a) Priprema međuprodukta 7

Smeša etilnog estra 2-[4-(aminometil)-l-piperidinil]-5-pirimidinkarboksilne kiseline (0.0076 mol) i l-metil-lH-indol-3-karboksaldehida (0.0114 mol) u CH3OH (80 ml) se meša i refluksuje tokom 15 sati, zatim se ohladi na sobnu temperaturu. Postepeno se doda NaBH4(0.012 mol). Smeša se meša preko noći na sobnoj temperaturi, ulije u H20, te ekstaktuje sa EtOAc. Organski sloj se razdvoji, osuši (MgS04), profiltrira, pa se upari rastvarač. Ostatak (3.2 g) se prečisti stubastom hromatografijom na silika gelu (eluent: CH2Cl2/CH30H/NH40H 95/6/0.5; 15-40 um). Čiste se frakcije sakupe, pa se upari rastvarač, čime se dobije 1.6 g (53 %) međuprodukta 7. b) Priprema međuprodukta 8

Smeša međuprodukta 7 (0.0037 mol) i natrijum hidroksida (0.0074 mol) u etanolu (60 ml) se

meša na 50 °C tokom 15 sati, zatim se ohladi na sobnu temperaturu pa se upari rastvarač do suva, čime se dobije 1.5 g (100 %) međuprodukta 8 kao soli natrijuma (.Na).

Primer A4

a) Priprema međuprodukta 9

Natrijum hidroksid (0.0026 mol, 60 % u ulju) se doda postepeno rastvoru 5-fluoro-lH-indol-3-karboksaldehida (0.0024 mol) u DMF (8 ml) pod tokom N2. Smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Kapajući se doda 1-jodopropan (0.0029 mol). Smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 2 sata i ulije u vodu s ledom. Talog se profiltrira, ispere se sa H20 i osuši, čime se dobije 0.44 g (88 %) međuprodukta 9.

Primer A5

a) Priprema međuprodukta 10

Smeša etilnog estra 2-[4-(aminometil)-l-piperidinil]-5-pirimidinkarboksilne kiseline (0.0053

mol), međuprodukta 9 (0.008 mol) i MgS04(1.5 g) u CH3OH (100 ml) se meša i refluksuje preko noći pod tokom N2, zatim se ohladi na 5 °C. Doda se NaBF.4 (0.0091 mol). Smeša se meša tokom 4 sata na sobnoj temperaturi, ulije u H20, te ekstaktuje sa CH2C12. Organski sloj se razdvoji, osuši (MgS04), profiltrira, pa se upari rastvarač. Ostatak (3.4 g) se prečisti stubastom hromatografijom na silika gelu (eluent: CH2C12/CH30H/NH40H 97/3/0.5; 15-40

um). Čiste se frakcije sakupe, pa se upari rastvarač, čime se dobije 1.3 g (54 %) međuprodukta 10.

b) Priprema međuprodukta 11

Smeša međuprodukta 10 (0.0029 mol) i natrijum hidroksiđa (0.0057 mol) u etanolu (50 ml)

meša se na 60 °C preko noći, zatim se ohladi na sobnu temperaturu pa se upari rastvarač, čime se dobije 0.8 g (54 %) međuprodukta 11 kao soli natrijuma (.Na).

Primer A6

a) Priprema međuprodukta 12

Rastvor 4-piperidinmetanola (0.033 mol) u CH2CI2(80 ml) se doda na sobnoj temperaturi rastvoru metilnog estra 2-hloro-5-pirimidinkarboksilne kiseline (0.066 mol) i DIPEA (0.083 mol) u CH2CI2(100 ml), pod tokom N2. Smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 3 sata i 30 minuta, ulije u vodu s ledom, pa se ekstaktuje sa CH2C12. Organski sloj se razdvoji, osuši (MgS04), profiltrira, pa se upari rastvarač. Ostatak se rastvori u pentanu. Talog se profiltrira i osuši, čime se dobije 7.88 g (95 %) međuprodukta 12. b) Priprema međuprodukta 13

Rastvoru etandiol dihlorida (0.0278 mol) u CH2CI2(50 ml) se pod tokom N2kapajući doda

DMSO (0.058 mol) na -78 °C. Smeša se meša tokom 15 minuta. Kapajući se doda rastvor međuprodukta 12 (0.023 mol) u CH2CI2(200 ml). Smeša se meša na -78 °C tokom 1 sata i 30 minuta. Kapajući se doda E.3N (0.118 mol). Smeša se meša na -78 °C tokom 1 sata, ulije u H2O i ekstraktuje sa CH2CI2- Organski sloj se razdvoji, osuši (MgS04), profiltrira, pa se upari rastvarač. Ostatak se kristalizuje iz dietilnog etra. Talog se profiltrira i osuši, čime se dobije 3.06 g (54 %) međuprodukta 13.

c) Priprema međuprodukta 14

Rastvoru međuprodukta 13 (0.0125 mol) i lH-indol-3-etanamina (0.0125 mol) u CH3OH (250 ml) postepeno se, pod tokom N2i na 5 °C , doda NaBlTjCN (0.019 mol). Doda se sirćetna kiselina (1 ml). Smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 48 sati. Doda se 10 % K2CO3. Smeša se ekstaktuje sa CH2C12. Organski sloj se razdvoji, osuši (MgS04), profiltrira, pa se upari rastvarač. Ostatak (5 g) se prečisti stubastom hromatografijom na silika gelu (eluent: CH2CI2/CH3OH/NH4OH 96/4/0.3; 15-40 um). Čiste se frakcije sakupe, pa se upari rastvarač, čime se dobije 3 g (60 %) međuprodukta 14. d) Priprema međuprodukta 15 Smeša međuprodukta 14 (0.0064 mol) i natrijum hidroksida (0.025 mol) u etanolu (80 ml) meša se preko noći na 80°C, zatim se ohladi na sobnu temperaturu i upari. Ostatak se rastvori u dietilnom etru. Talog se profiltrira i osuši, čime se dobije 2 g (78 %) međuprodukta 15 kao soli natrijuma (.Na). Primer A7 a) Priprema međuprodukta 16 Smeša etilnog estra 2-[4-(aminometil)-l-piperidinil]-5-pirimidinkarboksilne kiseline (0.0049 mol), lH-indol-3-etanol metansulfonata (0.0054 mol) i K2C03(0.01 mol) u acetonitrilu (20 ml) se meša i refluksuje preko noći, zatim se ohladi, ulije u vodu s ledom, pa ekstaktuje sa CH2CI2. Organski sloj se razdvoji, osuši (MgS04), profiltrira, pa se upari rastvarač. Ostatak (2.2 g) se prečisti stubastom hromatografijom na silika gelu (eluent: CH2CI2/CH3OH/NH4OH 96/4/0.2; 15-40 um). Čiste se frakcije sakupe pa se upari rastvarač, čime se dobije 0.442 g (22 %) međuprodukta 16. b) Priprema međuprodukta 17 Rastvoru međuprodukta 16 (0.0012 mol) i Et3N (0.0036 mol) u CH2C12(15 ml) se na sobnoj temperaturi kapajući doda metansulfonil hlorid (0.0018 mol). Smeša se meša na sobnoj temperaturi preko noći, ulije u H2O i ekstraktuje sa CH2CI2. Organski sloj se razdvoji, osuši (MgS04), profiltrira, pa se upari rastvarač, čime se dobije 0.6 g (100 %) međuprodukta 17. c) Priprema međuprodukta 18

Smeša međuprodukta 17 (0.012 mol) i natrijum hidroksida (0.036 mol) u etanolu (40 ml) se meša na 60 °C tokom 5 sati, pa se upari do suva. Ostatak se rastvori u dietilnom etru. Smeša se upari do suva, čime se dobije 0.6 g (100 %) međuprodukta 18 kao soli natrijuma (.Na).

Primer A8

a) Priprema međuprodukta 19

Rastvoru međuprodukta 16 (0.0012 mol) u Et3N (0.5 ml) i CH2C12(15 ml) se na 0 °C doda propanoil hlorid (0.0018 mol). Smeša se meša preko noći na sobnoj temperaturi, ulije u vodu s ledom i ekstraktuje sa CH2C12. Organski sloj se ispere vodom, osuši (MgSO/t), profiltrira, pa se upari rastvarač, čime se dobije 0.56 g (100 %) međuprodukta 19. Ovaj se produkt koristi direktno u sledećem koraku reakcije. b) Priprema međuprodukta 20

Smeša međuprodukta 19 (0.0012 mol) i natrijum hidroksida (0.15 g) u etanolu (50 ml) se

meša na 60 °C tokom 6 sati, zatim se ohladi na sobnu temperaturu i upari. Ostatak se rastvori u dietilnom etru. Smeša se upari do suva, čime se dobije 0.55 g (100 %) međuprodukta 20 kao soli natrijuma (.Na). Ovaj se produkt direktno koristi u sledećem koraku reakcije.

B. Priprema jedinjenja

Primer BI

a)Priprema jedinjenja1

Rastvoru međuprodukta 6 (0.0008 mol), 1,2-benzendiamin monohidrohlorida (0.0019 mol) i

PyBOP (0.0017 mol) u THF (40 ml) i CH2C12(40 ml) se doda na sobnoj temperaturi Et3N (0.0037 mol). Smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 2 dana, ulije u vodu s ledom i ekstraktuje sa CH2C12. Organski sloj se razdvoji, osuši (MgS04), profiltrira, pa se upari rastvarač. Ostatak (1.2 g) se prečisti stubastom hromatografijom na silika gelu (eluent: CH2Cl2/CH3OH/NH4OH 94/6/0.5; 15-40 um). Čiste se frakcije sakupe, pa se upari rastvarač. Dobijeni ostatak (0.078 g) se prečisti stubastom hromatografijom na silika gelu (eluent: CH2Cl2/CH3OH/NH4OH 98/2/0.2 do 90/10/1; 3.5 um). Čiste se frakcije sakupe, pa se upari rastvarač, čime se dobije 0.049 g (11 %) (T.T.: 80 °C) jedinjenja 1.

Primer B2

a) Priprema jedinjenja 2

Rastvoru međuprodukta 8 (0.0025 mol), 1,2-benzendiamin monohidrohlorida (0.0058 mol) i

PyBOP (0.005 mol) u DMF/filter (50 ml) se na sobnoj temperaturi doda Et3N (0.0108 mol). Smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 48 sati, ulije u H20 i profiltrira. Filtrat se ekstraktuje sa EtOAc, zatim se tri puta ispere sa H20, osuši (MgS04), profiltrira, pa se upari rastvarač. Ostatak (1.8 g) se prečisti stubastom hromatografijom na silika gelu (eluent: CH2Cl2/CH3OH/NH4OH 95/5/0.5; 15-40 um). Čiste se frakcije sakupe, pa se upari rastvarač. Dobijeni ostatak (0.262 g, 22 %) se kristalizuje iz acetonitril/DIPE. Talog s profiltrira i osuši, čime se dobije 0.106 g (T.T.: 142 °C) jedinjenja 2.

Primer B3

a) Priprema jedinjenja 3

Rastvoru međuprodukta 11 (0.0018 mol), 1,2-benzendiamin monohidrohlorida (0.0045 mol) i

PyBOP (0.0036 mol) u THF (20 ml) i CH2C12(20 ml) doda se Et3N (0.0072 mol). Smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 72 sata, ulije u H20 i ekstraktuje sa CH2C12. Organski sloj se ispere sa H20, osuši (MgS04), profiltrira, pa se upari rastvarač. Ostatak (3 g) se prečisti stubastom hromatografijom na silika gelu (eluent: CH2Cl2/CH3OH/NH4OH 93/7/0.5; 15-40 um). Čiste se frakcije sakupe, pa se upari rastvarač, čime se dobije 0.13 g (14 %) (T.T.: 85 °C) jedinjenja 3.

Primer B4

a) Priprema jedinjenja 4

Rastvoru međuprodukta 15 (0.0025 mol), 1,2-benzendiamin monohidrohlorida (0.0057 mol) i

PyBOP (0.005 mol) u THF (15 ml) i CH2C12(15 ml) se na sobnoj temperaturi doda Et3N (0.01 mol). Smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 48 sati, ulije u vodu i ekstraktuje sa CH2C12. Organski sloj se razdvoji, osuši (MgS04), profiltrira, pa se upari rastvarač. Ostatak (0.13 g) se prečisti stubastom hromatografijom na silika gelu (eluent: CH2Cl2/CH3OH/NH4OH 92/8/0.5; 15-40 um). Čiste se frakcije sakupe, pa se upari rastvarač. Ova se frakcija (0.13 g) prečisti reverzno-faznom hromatografijom na silika gelu

(eluent: CH3OH/NH4HCO360/40; 5 um). Čiste se frakcije sakupe, pa se upari rastvarač, čime se dobije 0.07 g (T.T.: 95°C) jedinjenja 4.

Primer B5

a) Priprema jedinjenja 5

Rastvoru međuprodukta 18 (0.001 mol), 1,2-benzendiamin monohidrohlorida (0.0024 mol) i

PyBOP (0.002 mol) u THF (5 ml) i CH2C12(5 ml) se doda Et3N (0.6 ml). Smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 72 sata, ulije u H20 i ekstraktuje sa CH2C12. Organski sloj se razdvoji, osuši (MgS04), profiltrira, pa se upari rastvarač. Ostatak (1.5 g) se prečisti stubastom hromatografijom na silika gelu (eluent: CH2Cl2/CH3OH/NH4OH 98/2/0.2; 15-40Hm). Čiste se frakcije sakupe, pa se upari rastvarač, čime se dobije 0.027 g (5 %) (T.T.: 105 °C) jedinjenja 5.

Primer B6

a) Priprema jedinjenja 6

Rastvoru međuprodukta 20 (0.0012 mol), 1,2-benzendiamina (0.0027 mol) i PyBOP (0.0024 mol) u CH2C12(5 ml) i THF (5 ml) se doda Et3N (0.0048 mol). Smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom 48 sati, ulije u vodu i ekstraktuje sa CH2C12. Organski sloj se razdvoji, osuši (MgS04), profiltrira, pa se upari rastvarač. Ostatak (1.5 g) se prečisti stubastom hromatografijom na silika gelu (eluent: EtOAC/CH3OH/NH4OH 93/7/0.5; 15-40 um). Čiste se frakcije sakupe, pa se upari rastvarač, čime se dobije 0.16 g (25 %) jedinjenja 6.

C. Farmakološki primeri

Test u uslovimain vivoza inhibiciju histonske deacetilaze (vidi primer Cl) meri inhibiciju HDAC enzimatske aktivnosti koja je postignuta asa jedinjenjem sa formulom (I).

Ćelijska aktivnost jedinjenja sa formulom (I) je determinisana na tumorskim ćelijama A2780 uz upotrebu kolorimetrijskog testa za ćelijsku toksičnost ili preživljenje (Mosmann Tim, Journal of Immunological Methods 65: 55-63, 1983) (vidi primer C.2)

Rastvorivost jedinjenja meri njegovu sposobnost da isto ostane u rastvoru. Kroz prvi metod je određena sposobnost jedinjenja da ostane u vodenom rastvoru posle razređivanja (vidi primer C.3.a). Stock rastvori DMSO se razblaže jediničnim vodenim puferskim rastvaračem u različitim uzastopnim koracima. U ovoj metodi se smeše zatim skeniraju u BD Gentest Solubilitv Scaner-u na pojavu taloga. U drugom metodu, rastvorivost nekog jedinjenja kod različitih pH može da se meri uz upotrebu hemiluminiscentnog azotnog detektora (vidi primer C.3.b).

Permeabilnost leka prikazuje njegovu sposobnost da se kreće od jednog u drugi ili kroz neki medijum. Specifično, to je njegova sposobnost da se kreće kroz crevne membrane u krvotok i/ili iz krvotoka u ciljno tkivo. Permeabilnost (vidi primer C.4) može da se izmeri kroz formiranja veštačke membrane, fosfolipidni bisloj koji je imobiliziran na filteru. U testu imobiliziranja veštačke membrane na filteru, nastaje „sendvič" na mikro-pločici sa 96 rupica i filterskoj pločici sa takođe 96 rupica, tako da svaka rupica je podeljena u dve sobice sa donorskim rastvorom pri dnu i akceptorskim rastvorom pri vrhu, koji su odvojeni sa 125 um mikro-filterskim diskom (pore su 0.45 um), zamotan sa 2% (masa/volumen) dodekanskim rastvorom dioleoilfosfatidil-kolina, u uslovima gde multi-lamelarni bislojevi formiraju unutrašnje filterske kanale kada je sistem u kontaktu sa vodenim rastvorom pufera. Permeabilnost jedinjenja kroz ovu veštačku membranu se meri u cm/s. Cilj je da se otkrije zasićenje nekog leka u paralelnu veštačku membranu pri dve različite vrednosti pH: 4.0 i 7.4. Detekcija jedinjenja se provodi sa UV-spektrometrijom pri optimalnoj talasnoj dužini koja se kreće od 250 do 500 nm.

Metabolizam lekova znači da jedinjenje ksenobiotik ili endobiotik, koje je rastvorivo u lipidima bude enzimatski transformisano u polarno jedinjenje, rastvorivo u vodi i metabolit koji može da se izbaci. Glavni organ metabolizma lekova je džigerica. Metabolički produkti su često manje aktivni u uporedbi sa parenteralnim lekovima ili su neaktivni. Međutim, neki metaboliti mogu da poseduju pojačanu aktivnost ili toksične efekte. Tako, metabolizam lekova može da uključuje procese „detoksifikacije" i „toksifikacije". Jedan od glavnih enzimatskih sistema, koji determinišu sposobnost organizma da se spravi sa lekovima i hemikalijama, je predstavljen sa citohrom P450 monooksigenazama, koje su enzimi zavisni o NADPH. Metabolička stabilnost jedinjenja može da se determiniše u uslovimain vitrouz pomoć upotrebe sub-celularnog humanog tkiva (vidi primer C.5.a). Ovde metabolička stabilnost jedinjenja je izražena kao % lekova koji su metabolizovani posle 15 min inkubacije pomenutih jedinjenja u mukrosomima. Kvantifikovanje jedinjenja je određeno uz pomoć LC-MS analize.

Pokazano je da brojni anti-tumorski agensi aktivišu belančevinu p21, uključujući i agense koji oštećuju DNK i inhibitore histonske deacetilaze. Agensi koji oštećuju DNK aktivišu gen p21 kroz tumor supresor p53, dok inhibitori histonske deacetilaze aktivišu gen p21 transkripcijski preko transkripcijskog faktora Spi. Tako, agensi koji oštećuju DNK aktivišu promotor p21 kroz p53 responsivni elemenat, a inhibitori histonske deacetilaze aktivišu p21 promotor kroz spi mesta (locirana u regionu od -60 pb do +40 pb u odnosu na TATA kutiju), a oba procesa dovode do povećanja ekspresije proteina p21. Kada se promotor p21 u ćeliji sastoji od promotorskog fragmenta od 1300 pb koji ne sadrži p53 responsivni elemenat, isti nije osetljiv na agense koji oštećuju DNK. Kapacitet jedinjenja da indukuju p21 može da se odredi testirajući kapacitet jedinjenja da indukuju p21 kao posledicu inhibiranja HDAC na ćelijskom nivou. Ćelije mogu stabilno da se transfeciraju s ekspresionim vektorom koji sadržava 1300 pb dug p21 promotorski fragment koji ne obuhvata elemente koji reaguju na p53, i pri čemu povećanje ekspresije reporter gena, u poređenju sa nivoima kontrole, identifikuje jedinjenje kao ono koje ima kapacitet indukovanja p21. Gen reporter je za fluorescentni protein, pa se ekspresija gena reportera meri kao količina emitovane fluorescentne svetlosti (vidi primer C.6.).

Specifični HDAC inhibitori ne trebaju da inhibiraju druge enzime kao na primer belančevine CYP P450. CYP P450 (eksprimiran uE. coli)belančevine 3A4, 2D6 i 2C9 konvertuju njihove supstrate u fluorescentne molekule. CYP3A4 belančevina konvertuje 7-benziloksi-trifluorometil kumarin (BFC) u 7-hidroksi-trifluorometil kumarin. CYP2D6 belančevina konvertuje 3-[2-(N,N-dietil-N-metilamino)etil]-7-metoksi-4-metilkumarin (AMMC) u 3-[2-(N,N-dietilamino)etil]-7-hidroksi-4-metilkumarin hidrohlorid, a CYP2C9 belančevina konvertuje 7-Metoksi-4-trifluorometil kumarin (MFC) u 7-hidroksi-trifluorometil kumarin. Jedinjenja koja inhibiraju enzimatsku reakciju će da dovedu do pojačavanja fluorescentnog signala.

Primer CL:In vitrotest za inhibiranje histon deacetilaze s fluorescentno označenim

supstratom:

Korišten je test za HDAC fluorescentnu aktivnost/Reakcijski kit za otkrivanje lekova od Biomola (kat. Br. AK-500-0001). Test za HDAC fluorescentnu aktivnost se zasniva na Fluor de Lys (Fluorogenic Histon de Acetylase Lvsvl) supstratu i na kombinaciji za razvijanje. Fluor de Lys supstrat se sastoji od acetilovanog lizina u bočnom lancu. Deacetilacija supstrata dovodi do senzitiranja istoga tako da, u drugom koraku, tretman sa Fluor de Lys produktom za razvijanje dovodi do nastanka fluorofora.

HeLa nuklearni ekstrakti (proizvođač: Biomol) su inkubirani pri koncentraciji od 60 ug/ml sa 75 uM supstrata. Fluor de Lys supstrat je dodan u puferu koji sadrži 25 mM Tris, 137 mM NaCl, 2.7 mM KC1 i 1 mM MgCl2x6H20 na pH 7.4. Posle 30 min, dodan je 1 volumen produkta za razvijanje. Fluorofor je pobuđen sa 355 nm svetla, a emitirano svetio (450 nm) je detektovano na fluorescentnom čitaču.

Za svaki opit, paralelno su korišćene kontrole (HeLa nuklearni ekstrakti i pufer), šlepa proba (pufer, ali bez HeLa nuklearnih ekstrakta) i primerci (jedinjenje rastvoreno u DMSO i dalje razređeno u puferu i HeLa nuklearni ekstrakti). U prvoj instanci, jedinjenja su testirana pri koncentraciji od 10"<5>M. Kada je jedinjenje pokazalo aktivnost pri IO"<5>M, napravljena je kriva koncentracija-odgovor gde su jedinjenja bila testirana pri koncentracijama među IO"<5>M i IO"<9>M. Svi primerci su testirani 4 puta. U svakom testu, šlepa vrednost je oduzeta od vrednosti kontrole i od vrednosti uzorka. Kontrolni uzorak predstavlja 100% deacetilacije supstrata. Za svaki uzorak, fluorescencija je bila izražena kao procenat srednje vrednosti kontrole. Odgovarajuće ICso-vrednosti (koncentracija leka, koja je potrebna da smanji količinu metabolita za 50% u odnosu na kontrolu) su izračunate uz pomoć probit-analize za graduirane podatke. Ovde su efekti testiranih jedinjenja izraženi kao pIC5o(za negativnu log vrednost IC50-vrednosti) (vidi Tabelu F-2).

Primer C. 2: Određivanje anti- proliferativne aktivnosti u A2780 ćelijama

Sva testirana jedinjenja su rastvorena u DMSO i dalje razređena u medijumu same kulture. Konačne DMSO koncentracije nikada nisu prevazišle 0.1% (v/v) u testu proliferacije ćelija. Kontrole su sadržavale A2780 ćelije i DMSO bez jedinjenja, a slepe probe su sadržavale DMSO, ali bez ćelija. MTT je rastvoren pri koncentraciji od 5 mg/ml u PBS. Pripremljen je glicinski pufer koji obuhvata 0.1 M glicina i 0.1 m NaCl puferiran do pH 10.5 sa NaOH (IN)

(svi reagenti su bili od Merck).

Humane A2780 ćelije raka jajnika (ljubazan poklon od dr. T.C. Hamilton [Fox Chase Cancer Centre, Pennsylvania, USA] su kultivisane u RPM1 1640 medijumu koji je bio pojačan sa 2 mM L-glutaminom, 50 ug/ml gentamicinom i 10% fetalnim goveđim serumom.

Ćelije su rutinski držane kao monoslojne kulture na 37° C u važnoj atmosferi sa 5% C02. Ćelije su pasažirane jednom nedeljno uz pomoć rastvora tripsin/EDTA u razmeru 1:40. Svi medijumi i suplementi su nabavljeni kod Life Technologies. Ćelije su oslobođene od kontaminacija mikoplazmama uz pomoć Gen-Probe-Mycoplasma Tissue Cultire Kit (proizvođač: BioMerieux).

Ćelije su sađene u NUNC™ pločicama za kulturu sa 96 rupica (proizvođač: Life Technologies) i ostavljene su da se adheriraju za plastiku preko noći. Gustoća koja je korištena za sađenje je bila 1500 ćelija po rupici u totalnom volumenu od 200 ul medijuma. Posle adheriranja ćelija za pločice, medijum je promenjen pa su dodani lekovi i/ili rastvorive materije u finalnom volumenu od 200 ul. Posle četiri dana inkubacije, medijum je zamenjen sa 200 ul svežeg medijuma, a gustoća ćelija i njihova vijabilnost su bili ispitani uz pomoć testa koji se bazira na MTT. U svaku rupicu je dodano 25 ul rastvora MTT, a ćelije su dodatno inkubirane tokom 2 h na 37° C. Medijum je tada pažljivo aspiriran, a plavi produkt MTT-formazan je rastvoren uz dodatak 25 ul glicinskog pufera, a posle toga i 100 ul DMSO. Mikropločice su potresene tokom 10 min na mešalici za mikropločice, a posle toga je određena apsorbancija pri 540 nm uz upotrebu Emax spektrofotometra sa 96 rupica (proizvođač: Sopachem).U jednom opitu, rezultati za sva eksperimentalna stanja su srednja vrednost 3 ponovljenih rupica. Za finalne svrhe ispitivanja, jedinjenja su testirana pri pojedinačnoj fiksnoj koncentraciji od IO"<6>M. Za aktivna jedinjenja, opiti su ponovljeni da se ustvrde potpune krive koncentracija-odgovor. Za svaki opit, kontrole (koje ne sadrže lek) i slepe probe (koje ne sadrže ćelije niti lek) su provedene paralelno. Vrednost slepe probe je oduzeta od vrednosti kontrole i uzoraka. Za svaki uzorak, srednja vrednost za rast ćelija (u jedinicama apsorbancije) je izražena kao procenat srednje vrednosti rasta ćelija u kontroli. Kada je bilo prikladno, IC50-vrednosti (koncentracija leka koja je potrebna da smanji rast ćelija za 50% u odnosu na kontrolu) su određene uz upotrebu probit analize za graduirane podatke (Finnev, D.J., Probit Analvses, 2 Izd. Poglavlje 10, Graded Responses, Cambridge Universitv Press, Cambridge 1962). Ovde, efekti testirani jedinjenja su izraženi kao 1C50(negativna log vrednost ICso-vrednosti) (vidi Tabelu F-2).

Primer C. 3: Rastvorivost

C. 3. a. Kinetička rastvorljivost u vodenim medijima

Stock rastvori DMSO od 5000 - 9.8 uM (1/2 razređenja) se rade od DMSO u pločici s 96 uduljenja za stock rastvor (200 ul po udubljenju). Posle svakog razblažavanja uzorci se promešaju. Alikvoti tih DMSO rastvora (2 ul) se zatim prenesu u 2 druge pločice sa 96 udubljenja, koje sadrže 200 ul vodenog pufera po udubljenju. Svaka od ploča sa puferom sadrži ili vodeni pufer pH 7.4 ili vodeni pufer pH 4.0. Nakon poslednjeg razblažavanja ploče s puferom se promešaju, pa se uzorci stabilizuju na sobnoj temperaturi tokomVisata. Razblažavanje se radi u duplikatu za svako jedinjenje kako bi se izbegle moguće greške. Smeše se zatim skeniraju u BD Gentest Solubilitv Scaner-u na pojavu taloga. Na temelju prisustva/odsustva taloga u smešama, kinetička rastvorljivost se izračuna interpolacijom. Poređenje se sprovodi u 3 klase.

Jedinjenja visoke rastvorljivosti postižu rezultat 3, pa im je rastvorljivost veća od ili jednaka 50 uM. Jedinjenja sa srednjom rastvorljivošću postižu rezultat 2, pa im je rastvorljivost veća od 10 uM i manja od 50 uM. Jedinjenja sa niskom rastvorljivošću postižu rezultat 1, pa je za ta jedinjenja rastvorljivost manja od ili jednaka 10 uM.

Tri jedinjenja su testirana pa su postigla rezultat od 1 pri obe vrednosti pH u testu.

C. 3. b. Rastvorljivost pri pH 2. 3

Rastvorljivost jedinjenja pri pH 2.3 takođe može da se izmeri korištenjem hemiluminiscentni detektor azota (vidi Tabelu F-2).

Primer C. 4: Analiza permeabilnosti paralelne veštačke membrane

Osnovni primerci (alikvoti od 10 jal osnovnog rastvora od 5 mM u 100% DMSO) su razređeni u dubokim rupicama ili Pre-mix pločici koji su sadržali 2 ml vodenog puferskog sistema sa pH 4 ili pH 7.4 (PSR4 System Solution Concentrate (pION)).

Najpre primerci su dodani u referentnu pločicu, dodano je 150 ul pufera u rupice i započeto je slepo merenje sa UV. Posle toga, pufer je odbačen, a pločica je korišćena kao referentna pločica. Sva merenja su provedena u pločicama otpornima na UV (proizvođač: Costar ili Greiner).

Posle slepih merenja referentne pločice, dodano je 150 ul razređenih primeraka u referentnu pločicu i 200 ul razređenih primeraka u donorsku pločicu 1. Akceptorska filter pločica 1 (proizvođač: Millipore, tip: MAIP N45) je zamotana sa 4 ul rastvorom koji formira veštačku membranu (l,2-Dioleoil-sn-Glicer-3-Fosfokolin u dodekanu koji sadrži 0.1% 2,6-Di-tert-butil-4-metilfenol i koji je postavljen na vrh donorske pločice 1 sa ciljem formiranja „sendviča". Pufer (200 ul) je odložen u akceptorske rupice pri vrhu. Sendvič je pokriven sa poklopcem i ostavljen tokom 18 h na sobnoj temperaturi u tamnom.

Slepo merenje akceptorske pločice 2 je izvedeno kroz dodavanje 150 ul pufera u rupice, a posle toga je usledilo UV merenje. Posle slepog merenja akceptorske pločice 2, pufer je odstranjen, a 150 ul akceptorskog rastvora je preneto iz akceptorske filter pločice 1 u akceptorsku pločicu 2. Tada je akceptorska filter pločica 1 odstranjena od sendviča. Posle slepog merenja donorske pločice 2 (vidi ranije), 150 ul donorskog rastvora je bilo preneto sa donorske pločice 1 u donorsku pločicu 2. UV spektar rupica donorske pločice 2, akceptorske pločice 2 i referentne pločice je bio skeniran (sa SpectraMAX 190). Svi spektari su procesirani sa ciljem računanja permeabilnosti uz pomoć PSR4 Command Softvvare. Sva jedinjenja su merena tri puta. Karbamezapin, griseofulvin, acikloguanizin, atenolol, furosemid i hlorotiazid su korišćeni kao standardi u svakom opitu. Jedinjenja su rangirana u 3 kategorije kao takva koja imaju nisku permeabilnost (srednja vrednost < 0.5 x IO"<6>cm/s; rezultat 1), takva koja imaju srednju permeabilnost (1 x IO"<6>cm/s > srednja vrednost >0.5 x IO"<6>cm/s; rezultat 2) i takva sa visokom permeabilnosti (> 1 x IO"<6>cm/s; rezultat 3).

Primer C. 5: Metabolička stabilnost

Sub-celulame tkivne preparacije su bile pripremljene prema Gorrod et. Al. (Xenobiotica 5:453-462, 1975) uz pomoć centrifugalne separacije posle mehaničke homogenizacije tkiva. Tkivo džigerice je bilo isprano u ledenom rastvoru pufera 0.1 M Tris-HCl (pH 7.4) sa ciljem pranja zaostale krvi. Tkivo je tada suvo blotovano, izvagano i grubo iseckano uz pomoć hirurških makaza. Parčići tkiva su homogenizovani u 3 volumena ledenog fosfatnog pufera koncentracije 0.1 M (pH 7.4) uz upotrebu Potter-S (Braun, Italija) koji je bio opremljen sa teflonskim maljem ili Sorvall Omni-Mix homogenizatora tokom 7 x 10 sec. U oba slučaja posuda je držana na ledu tokom procesa homogenizovanja.

Homogenati tkiva su centrifugirani na 9000 x g tokom 20 min pri 4° C uz upotrebu centrifugu Sorvall ili ultracentrifugu Beckman. Nastao supernatant je ostavljen na -80° C uz oznaku ,,S9".

Frakcija S9 dalje može da bude centrifugirana na 100000 x g tokom 60 min (4° C) uz upotrebu ultracentrifugu Beckman. Nastao supernatant je bio pažljivo aspiriran, alikvotiran i označen „citosol". Pelet je re-suspendovan u 0.1 M fosfatnom puferu (pH 7.4) u finalnom volumenu od 1 ml po 0.5 g originalne težine tkiva i označen kao „mikrosome".

Sve sub-celularne frakcije su alikvotirane, odmah zamrznute u tečnom azotu i ostavljene na

-80° C sve do upotrebe.

Za testiranje primeraka korištena je inkubacijska mešavina koja je sadržavala PBS (0.1 M), jedinjenje (5 uM), mikrosome (1 mg/ml) sistem za generisanje NADPH (0.8 mM glikoza-6-fosfat, 0.8 mM magnezijum hlorid i 0.8 jedinica glikoza-6-fosfat dehidrogenaze). Kontrolni primerci su sadržavale isti materijal, ali mikrosome su bile zamenjene mikrosomama koje su prethodno bile inaktivirane toplinom (10 min na 95° C). Oporavak jedinjenja u kontrolnim primercima je uvek bilo 100%.

Mešavine su preinkubirane tokom 5 min na 37° C. Reakcija je otpočeta u vremenu nula (t=0) uz dodavanje 0.8 mM NADP, a primerci su bili inkubirani tokom 15 min (t = 15). Reakcija je terminirana dodavanjem 2 volumena DMSO. Tada su primerci centrifugirani tokom 10 min na 900 x g, a supernatant je ostavljen na sobnoj temperaturi ne duže od 24 h pre same analize. Sve inkubacije su bile provedene dvostruko. Analize supernatanta su provedene uz pomoć LC-MS analize. Elucija primeraka je provedena na Xterra MS Cl8 (50 x 4.6 mm, 5 um, Waters, USA). Korištenje HPLC sistem Alliance 2790 (proizvođač: Waters, USA). Elucija je provedena sa puferom A (25 mM aminoimunoacetat (pH 5.2) u H20/acetonitril (95/5)), rastvarač B koji je acetonitril i rastvarač C metanol uz ratu protoka od 2.4 ml/min. Korišćeni gradijent je dobiven povećavanjem koncentracije organske faze od 0% preko 50% B i 50% C do najviše 100% B tokom 1 min na linearan način, a koncentracija organske faze je održavana stacionarnom tokom dodatnih 1.5 min. Totalni volumen injekcije primeraka je 25 ul.

Kao detektor je korišćen Quattro (proizvođač: Micromass, Manchester, UK) trostruki kvadropol maseni spektrometar koji je opskrbljen sa ESI izvorom. Izvor i temperatura rastvaranja su bili podešeni na 120 i 350° C, a azot je korišćen kao nebulizator i gas za sušenje. Podaci su bili dobiveni u pozitivnom režimu skeniranja (reakcija jednog jona). Voltaža čunja je podešena na 10 V, a vreme boravka je bilo 1 sekund.

Metabolička stabilnost je izražena kao % metabolizma jedinjenja posle 15 min inkubacije u prisutnosti aktivnih mikrosoma (E(akt)) (% metabolizam = 100 % - ((Totalan protok jona (TIC) za E(akt) u t = 15 / TIC za E(akt) u T = 0) x 100). Jedinjenja koja imaju procent metabolizma manji od 20 % definisana su kao visoko metabolički stabilna, pa ostvaruju rezultat 3. Jedinjenja koja imaju metabolizam između 20 % i 70 % definisana su kao srednje stabilna, pa ostvaruju rezultat 2. Jedinjenja koja pokazuju procent metabolizma veći od 70 % definisana su kao slabo metabolički stabilna i ostvaruju rezultat 1. Tri referentna jedinjenja su uvek uključena kada se provodilo ispitivanje metaboličke stabilnosti. Verampil je uključen kao jedinjenje sa niskom metaboličkom stabilnošću (% metabolizam = 73 %). Cisapride je uključeno kao jedinjenje sa srednjom metaboličkom stabilnosti (% metabolizma 45 %) i propanol je uključen kao jedinjenje sa intermedijarnom do visokom metaboličkom stabilnosti (25 % metabolizma). Ova referentna jedinjenja su korišćena da se potvrdi test metaboličke stabilnosti. Dva jedinjenja su testirana pa su ostvarila rezultat 3, odnosno rezultat 2.

Primer C. 6: Kapacitet indukcije p21

Ćelije A2780 (ATCC) su kultivisane u RPMI 1640 medijumu koji je bio pojačan sa 10 % FCS, 2 mM L-glutaminom i gentamicinom pri 37° C u vlažnom inkubatoru sa 5% CO2. Svi rastvori kultura ćelija su dobiveni od Gibco-BRL (Gaithersburg, MD). Ostali materijali su dobiveni kod Nunc.

Genomska DNK je ekstrahovana iz ćelija A2780 koje proliferiraju i ista je korišćena kao matrica za izolaciju promotora p21 uz pomoć umetnuti PCR. Prva amplifikacija je provedena tokom 20 ciklusa pri temperaturi anilinga od 55° C uz upotrebu oligonukleotidnog para GAGGGCGCGGTGCTTGG i TGCCGCCGCTCTCTCACC sa genomskom DNK kao kalup. Nastao fragmenat od 4.5 kb koji sadrži fragmenat od -4551 do +88 u odnosu na TATA kutiju je bio ponovno amplifikovan sa oligonukletidima

TCG GGTACCGAGGGCGCGGTGCTTGG i ATA CTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC

tokom 20 ciklusa sa anilingom pri 88° C šta dovodi do pojave fragmenta od 4.5 kb, a posle toga sa oligonukleotidnim parom TCG GGTACCGGTAGATGGGAGCGGATAGACACATC i ATA CTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC tokom 20 ciklusa sa anilingom pri 88° C šta dovodi do pojave fragmenta od 1.3 kb koji sadrži fragment od -1300 do +88 pb u odnosu na TATA kutiju. Restrikcijska mestaXhoI iKpnI, koja su prisutna u oligonukleotidima (podcrtana sekvenca) su korišćena za subkloniranje.

Luciferazni reporter je bio odstranjen iz pGL3-basic i zamenjen sa ZsGreen reporter (iz pZsGreenl-Nl plazmida) kodKpnI iXbaI restrikcijskih mesta. pGL3-bacis-ZsGreen-1300 je bio konstruisan uz pomoć insercije pomenutog fragmenta od 1.3 kb humanog promotora p21 u pGL3-basic-ZsGreen kodXhoI iKpnI mesta. Svi restrikcijski enzimi su nabavljeni kod Boehringer Manheim (Nemačka). Ćelije A2780 su nasađene na pločicama sa 6 rupica sa gustoćom od 2xl0<5>ćelija, inkubirane su tokom 24 h, a tada su transkfektirane sa 2 ug pGL3-basic-ZsGreen-1300 i 0.2 u<g>; pSV2neo vektora uz pomoć Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Brussels, Belgija) prema instrukcijama proizvođača. Transfektirane ćelije su selektirane tokom 10 dana sa G418 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD), a na kraju su napravljene suspenzije kultura iz rasta jedne jedine ćelije. Nakon tri nedelje, dobiveni su pojedinačni klonovi.

Selektirani klonovi A2780 su ekspandirani i nasađeni pri gustoći od 10000 ćelija po rupici na pločicama sa 96 rupica. 24 h nakon sađenja, ćelije su tretirane tokom dodatnih 24 h sa jedinjenjima (koja deluju na spi mesta u proksimalnom promotorskom regionu p21). Posle toga, ćelije su fiksirane sa 4% PF A tokom 30 min i kontra bojane sa bojom Hoechst. Aktiviranje promotora p21 koja dovodi do produkciju ZsGreen i na taj način do fluorescencije je bila praćena uz pomoć Ascent Fluoroskan (Thermo Labsvstems, Brussels, Belgija).

Za svaki opit, kontrole (koje ne sadrže lek) i slepe probe (koje ne sadrže ćelije niti lek) su provedene paralelno. Šlepa proba je oduzeta od sve vrednosti kontrole i primeraka. Za svaki primerak, vrednost za indukciju p21 je izražena kao procenat vrednosti za p21 koji je prisutan u kontroli. Procenat indukcije koji je veći od 130% je definisan kao signifikantna indukcija.

Primer C. 7: P450 inhibitorski kapacitet

Sva testirana jedinjenja su bila razređena u DMSO (5 mM), a dodatno razređivanje do 5 x 10"<4>M je bilo provedeno u acetonitrilu. Dodatna razređivanja su načinjena u puferu za testiranje (0.1 M NaK fosfatni pufer pH 7.4), a finalna koncentracija razređivača nikada nije bila veća od 2 %.

Test za CYP3A4 belančevinu obuhvata po jednoj rupici 15 pmol P450/mg belančevine (u 0.01 M NaKfosfatnom puferu 4- 1.15 % KC1), sistem za generisanje NADPH (3.3 mM glikoza-6-fosfata, 0.4 U/ml glikoza-6-fosfat dehidrogenaze, 1.3 mM NADP i 3.3 mM MgCl2x6F-20 u puferu za test) i jedinjenje u totalnom volumenu za test od 100 ul. Posle 5 min pre-inkubacije na 37° C, enzimatska reakcija je započeta uz dodavanje 150 uM supstrata sa fluorescentnom probom BFC u puferu za test. Posle inkubacije od 30 min na sobnoj temperaturi, reakcija je bila zaustavljena uz dodavanje 2 volumena acetonitrila. Fluorescentne determinacije su provedene na ekscitacijskoj talasnoj dužini od 405 nm i emisijskoj talasnoj dužini od 535 nm. Ketokonozol (IC50-vrednost = 3 x 10" M) je uključen kao referentno jedi<n>jenje.

Test za belančevinu CYP2D6 obuhvata po rupici 6 pmol P450/mg belančevine (u 0.01 M NaKfosfatnom puferu + 1.15% KC1), sustem za generisanje NADPH (0.41 mM glikoza-6-fosfat, 0.4 U/ml glikoza-6-fosfat dehidrogenaza, 0.0082 mM NADP o 0.41 mM MgCl2x 6H20 u puferu za test) i jedinjenje u totalnom volumenu testa od 100 ul. Posle 5 min pre-inkubacije pri 37° C enzimatska reakcija je započeta uz dodavanje 3 uM supstrata sa fluorescentnom probom AMMC u puferu za test. Posle inkubacije tokom 45 min na sobnoj temperaturi, reakcija je zaustavljena sa 2 volumena acetonitrila. Fluorescentne determinacije su provedene pri ekscitacijskoj talasnoj dužini od 405 nm i emisijskoj talasnoj dužini od 460 nm. Kinitidin (ICso-vrednost < 5 x IO"<8>M) je uključen kao referentno jedinjenje.

Test za belančevinu CYP2C9 obuhvata po rupici 15 pmol P450/mg belančevine (u 0.01 M NaKfosfatnom puferu + 1.15% KC1), sustem za generisanje NADPH (3.3 mM glikoza-6-fosfat, 0.4 U/ml glikoza-6-fosfat dehidrogenaza, 1.3 mM NADP i 3.3 mM MgCl2x 6H20 u puferu za test) i jedinjenje u totalnom volumenu testa od 100 ul. Posle 5 min pre-inkubacije pri 37° C enzimatska reakcija je započeta uz dodavanje 200 uM supstrata sa fluorescentnom probom MFC u puferu za test. Posle inkubacije tokom 30 min na sobnoj temperaturi, reakcija je zaustavljena sa 2 volumena acetonitrila. Fluorescentne determinacije su provedene pri ekscitacijskoj talasnoj dužini od 405 nm i emisijskoj talasnoj dužini od 535 nm. Sulfafenazol (IC50-vrednost < 6.8 x 10" 7 M) j* e uključen kao referentno jedi*njenje.

U svrhu inicijalnog ispitivanja, jedinjenja su testirana pri jednoj fiksnoj koncentraciji od 1 x 10"<5>M. Za aktivna jedinjenja, opiti su ponovljeni sa ciljem utvrđivanja pune krive koncentracija-odgovor. Za svaki opit, kontrole (ne sadrže lek) i slepe probe (ne sadrže enzim niti lek) su provedene paralelno. Sva jedinjenja su testirana četiri puta. Šlepa vrednost je oduzeta od vrednosti svih kontrola i primeraka. Za svaki opit, srednja vrednost P450 aktivnosti primeraka (u relativnim jedinicama fluorescencije) je izražena kao procenat srednje vrednosti P450 aktivnosti kontrole. Procenat inhibicije je izražen kao 100% minus srednja vrednost P450 aktivnosti primerka. Kada je bilo prikladno, izračunate su i ICso-vrednosti (koncentracija leka koje je potrebna da se reducira P450 aktivnost do 50% aktivnosti kontrole).

Tabela F-2 navodi rezultate za jedinjenja koja su testirana prema Primerima Cl., C.2. i C.3.b.

(praznina označava da vrednost nije dostupna za odgovarajuće jedinjenje).

D. Primer kompozicije: Tablete zamotane sa filom

Preparaciia srčike tablete

Mešavina 100 g jedinjenja sa formulom (I), 570 g laktoze i 200 g škroba se dobro meša i posle toga se vlaži sa rastvorom od 5 g natrijum dodecil sulfata i 10 g polivinil-pirolidona u oko 200 ml vode. Vlažna praškasta mešavina se seje, suši i ponovo seje. Tada se dodaje 100 g mikrokristalne celuloze i 15 g hidrogeniranog ulja. Cela mešavina je dobro meša i komprimira u tablete, pri čemu može da se dobije 10000 tableta, od kojih svaka obuhvata 10 mg jedinjenja sa formulom (I).

Premaz

Rastvor od 10 g metil celuloze u 75 ml denaturiranog etanola se dodaje u rastvor 5 g etil celuloze u 150 ml diklorometanu. Tada se dodaje 75 ml diklorometana i 2.5 ml 1,2,3-propantriola, a 10 g poolietilen glikola je stopljeno i rastvoreno u 75 ml diklorometana. Kasniji rastvor je dodan u prethodni, a tada je dodano 2.5 g magnezijum oktadekanoata, 5 g polivinil-pirolidona i 30 ml koncentrirane kolorne suspenzije i sve je homogenizovano. Srčike

tableta su zamotane sa takvom mešavinom u aparatu za zamotanje.

Claims (10)

1. Jedinjenje sa formulom (I), TV-oksidne forme, njegove farmaceutski prihvatljive adicijske soli i stereohemijske izomerne forme,naznačeno time,da nje ceo broj sa vrednošću 0, 1 ili 2 i kada je n jednak 0 naznačena je direktna veza; m je ceo broj sa vrednošću 1 ili 2; XjeNili CH; Yje O, Sili NR8; u čemu R<8>je vodonik, Ci^alkil, Ci.6alkiloksiCi.6alkil, C3.6cikloa.kil, C3-6C.kloalkim.etil, fenilC,.6alkil, -C(=0)-CHR<9>R<10>ili -S(=0)2-N(CH3)2; u čemu svaki je R<9>i R10nezavisno vodonik, amino, Ci^alkil ili aminoCi^alkil; i kada je Y jest NR<8>i R<2>na poziciji 7- ili je indolil, tadaR<2>iR<8>mogu zajedno da formiraju bivalentni radikal -(CH2)2- (a-1), ili -(CH2)3- (a-2); R<1>je vodonik, Ci-6alkil, hidroksiCi_6alkil, cijanoCi^alkil, Ci-6alkilsulfonil, C\.6alkilkarbonil ili mono- ili di(Ci-6alkil)aminosulfonil; R2 je vodonik, hidroksi, amino, halo, Ci^alkil, cijano, C2-6alkenil, polihaloCi-6alkil, nitro, fenil, Ci^alkilkarbonil, hidroksikarbonil, Ci-aalkilkarbonilamino, Ci-6alkiloksi ili mono- ili di(Ci-6alkil)amino; R<3>je hidroksi ili amino; R4 je vodonik, tienil, furanil ili fenil i svaki tienil, furanil ili fenil može po izboru da se supstituiše sa halo, amino, nitro, cijano, hidroksi, fenil, Ci_6alkil, (diCi-ćalkil)amino, Ci^alkiloksi, fenilCi^alkiloksi, hidroksiCi-ćalkil, Ci.6alkiloksikarbonil, hidroksikarbonil, Ci^alkilkarbonil, polihaloC]-6alkiloksi, polihaloCi^alkil, C).ćalkilsulfonil, hidroksikarbonilCi^alkil, Ci^alkilkarbonilamino, aminosulfonil, aminosulfonilCi-ćalkil, izoksazolil, aminokarbonil, fenilC2-6alkenil, fenilC3-6alkinil ili piridinilC3_6alkinil; R , R i R su svaki nezavisno vodonik, amino, nitro, furanil, halo, Ci-6alkil, C\.ćalkiloksi, trifluorometil, tienil, fenil, C|.6alkilkarbonilamino, aminokarbonilCi^alkil ili -C=C-CH2-R".

2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1,naznačeno timeda: a) nje 0 ili 1; b) m je 1 ili 2; c) XjeNiliCH; d) Y je NR8 u čemu je R<8>vodonik, Ci^alkil, C3_6cikloalkil ili C3_6cikloalkilmetil; e) R<1>je vodonik, Ci^alkil, hidroksiCi^alkil, C^alkilkarbonil ili Ci_6alkilsulfonil; f) R2 je vodonik ili halo; g) R3 je amino; h) R<4>je vodonik ili tienil; i i) R<5>, R<6>i R<7>su svaki vodonik.

3. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1,naznačeno timeda: a) njel; b) mje 1; c) XjeN; d) Y je NR<8>u čemu je R<8>metil; e) R<1>je vodonik; f) R je vodonik ili halo; g) R<3>je amino; h) R<4>je vodonik ili 2-tienil; i i) R<5>, R<6>i R<7>su svaki vodonik.

4. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1,naznačeno timeda jedinjenje jeste Jedinjenje br. 2, to jest jedinjenje formule

5. Farmaceutska kompozicija,naznačena time,da obuhvata farmaceutski prihvatljive kerijere i jedan aktivni sastojak sa terapeutski efektivnom količinom jedinjenja prema zahtevima od 1 do 4.

6. Proces pripremanja farmaceutske kompozicije prema zahtevu 5,naznačen time,da su farmaceutski prihvatljivi kerijeri i jedinjenje prema zahtevima od 1 do 4 intimno pomešani.

7. Jedinjenje prema zahtevima od 1 do 4,naznačeno time,da se upotrebljava kao lek.

8. Upotreba jedinjenja prema zahtevima od 1 do 4,naznačena time,da se jedinjenje koristi u proizvodnji leka za tretman proliferativnih bolesti.

9. Kombinacija,naznačena time,da sadrži anti-tumorski agens i inhibitor HDAC prema zahtevima od 1 do 4.

10. Proces za pripremu jedinjenja prema patentnom zahtevu 1 okarakterisan reagovanjem međuprodukta formule (II),naznačen timeda M predstavlja vodonik ili alkalni metal, sa jedinjenjem formule (III) u prisustvu baze: