RS51197B - Anti-dual integrinska antitela, sastavi, metode i njihove upotrebe - Google Patents

Anti-dual integrinska antitela, sastavi, metode i njihove upotrebe

Info

Publication number
RS51197B
RS51197B YUP-94/03A YUP9403A RS51197B RS 51197 B RS51197 B RS 51197B YU P9403 A YUP9403 A YU P9403A RS 51197 B RS51197 B RS 51197B
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
human
cell
cells
antigen
Prior art date
Application number
YUP-94/03A
Other languages
English (en)
Inventor
Jill Giles-Komar
George Heavner
Linda Snyder
Mohit Trikha
Original Assignee
Centocor Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centocor Inc. filed Critical Centocor Inc.
Publication of YU9403A publication Critical patent/YU9403A/sh
Publication of RS51197B publication Critical patent/RS51197B/sr

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P23/00—Anaesthetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P23/00—Anaesthetics
    • A61P23/02—Local anaesthetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/02—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin
    • A61P5/04—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin for decreasing, blocking or antagonising the activity of the hypothalamic hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • A61P5/44—Glucocorticosteroids; Drugs increasing or potentiating the activity of glucocorticosteroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5029—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on cell motility
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70546—Integrin superfamily, e.g. VLAs, leuCAM, GPIIb/GPIIIa, LPAM
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)

Abstract

Izolovano humano monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, koji sadrži varjabilni region teškog lanca amino kiselinske sekvence SEQ ID NO:7 i varjabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8, gde je fragment koji se veže za antigen izabran od Fab, Fab', F(ab')2, facb, Fv ili scFv fragment.Prijava sadrži još 11 nezavisnih i 18 zavisnih patentnih zahteva.

Description

OBLAST PRONALASKA
Ova prijava se delimično bazira na, kao i poziva na prioritet u odnosu na, U.S. Provisional 60/223,363 oblast Avgust 20002, koji je kompletno obuhvaćen ovde sa referencama.
Ovaj pronalazak odnosi se na antitela, uključujući delove ili varijante, specifične za makar jedan alfa-v-beta3, alfa-v-beta5 dual integrin (dual integrin) protein ili njegov fragment, kao i na nukleinske kiseline koje kodiraju ova anti-dual integrinska antitela, uključujući terapeutska uputstva, adsministraciju i sredstva.
SRODNEOBLASTI
Postoje značajni dokazi da progresivan rast tumora zavisi od angiogeneze, formiranja novih krvnih sudova, koji tumore snabdevaju sa hranljivim materijama i kiseonikom, uklanjaju otpadne materije i imaju ulogu u provođenju metastaza ćelija tumora do udaljenih mesta (Gastl et al., Oncol.54:177-184). Skorašnje studije su otišle dalje u definisanju uloga integnna u procesima angiogeneze. Integrini predstavljaju heterodimerne transmembranske proteine koji imaju ključne uloge u ćelijskoj adheziji (lepljenju) za ekstracelularni matriks (ECM), koji zauzvrat posreduje u procesu preživljavanja ćelije, u ćelijskoj proliferaciji i migraciji preko intracelularne signalizacije (intraceilular signaling). Tokom procesa angiogeneze veliki broj integrina koji se eksprimira na površinama aktiviranih endotelijalnih ćelija, reguliše kritične adhezivne interakcije sa različitim ECM proteinima u cilju regulisanja raznolikih i udaljenih procesa kao što su ćelijska diferenci jacija, proliferacija i migracija. Posebno je pokazano da blisko srodni ali različiti integrini aVb3 i aVb5 posreduju u nezavisnim putovima u procesima angiogeneze. Antitelo generisano protiv ttVp3 blokiralo je angiogenezu indukovanu bazičnim fibroblastnim faktorom rasta (bFFR), (bFGF basic fibroblast growth factor), dok je antitelo specifično za aV(35 inhibiralo je angiogenezu indukovanu vaskularnim endotelijalnim faktorom rasta (Elicieri, et al., J. Clin. Invest. 103:1227-1230 (1999): Friedlander et al., Science 270:1500-1502 (1995)).
Sisarska (neljudskog porekla) himerna, poliklonalna (e.g., anti-sera) i/ili monoklonalna antitela (Ma) (monoclonal antibodies - Mabs) i fragmenti (e.g., proteolitičke digestije ili njihovi proizvodi fuzionih proteina) predstavljaju potencijalne terapeutske agense koji se ispituju u nekim slučajevima pokušaja lečenja određenih oboljenja. Međutim neka antitela ili fragmenti mogu izazvati imuni odgovor kada se unesu u čoveka. Ovakav imuni odgovor može rezultirati u imuno-kompleks posredovanom čišćenju antitela i fragmenata iz cirkulacije i tako čineći ponovno davanje neodgovarajućim za terapiju i tako smanjujući pacijentu korist od terapije i limitirajući ponovno davanje antitela ili fragmenta. Na primer ponavljanje davanja antitela ili fragmenata koji sadrže delove neljudskog porekla mogu dovesti do razvoja serumske bolesti (serum sickness) i/ili anafalaksije. U cilju izbegavanja ovakvih i drugih problema, preduzeti su različiti pristupi radi smanjenja imunogenosti ovakvih antitela i njihovih delova , uključujući himerizaciju i humanizaciju, koje su poznate u ovoj oblasti nauke. Ovi kao i drugi pristupi međutim mogu rezultirati u zadržavanju delimične imunogenosti antitela ili fragmenata, kao i u niskoj avidity, ili nastanku problema vezanih za ćelijske kulture, lepljenj (scale up), proizvodnju i/ili niske prinose. Tako da ova antitela ili fragmenti mogu biti i manje od idealnog za proizvodnju i upotrebu kao terapeutski proteini.
Na osnovu ovoga, postoji potreba za da se obezbede anti-dual integrinska antitela ili fragmenti koji prevazilaze jedan od ovih problema, kao i potreba za poboljšanjima već poznatih antitela i njihovih fragmenata.
SADRŽAJ PRONALASKA
Ovaj pronalazak obezbeđuje izolovana humana, primatna, glodarska. sisarska, himerna humanizovana i/ili CDR-grafted (presađena) anti-dual integrinske kompozicije antitela, kodirajuće ili komplementarne amino kiseline, vektore, ćelije domaćine, kompozicije, formulacije, sredstva (uređaji), transgene životinje, transgene biljke, i metode za njihovo dobi janje i upotrebu, kao što je ovde opisano i omogućeno, u kombinaciji sa onim sto je poznato u ovoj oblasti nauke.
Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje makar jedno i/.olovano anti-dual integrinsko antitelo kao što je ovde opisano. Antitelo na osnovu ovog pronalaska uključuje bilo koji protein ili molekul sa peptidom koji sadrži makar deo imunoglobulinskog molekula, kao što je na primer, ali ne limitiran njime, makar jedan region koji određuje komplementarnost (CDR- complementaritv đeterminating region) teškog ili lakog lanca ili deo za vezivanje Uganda, varijabilni region teškog ili lakog lanca, konstantni region teškog ili lakog lanca, "framework" region, ili bilo koji njegov deo, koji se mogu inkorporirati u antitelo i ovog pronalaska. Antitelo iz pronalaska može da uključi ili bude dobijeno iz bilo kog sisara kao što su, ali ne limitiran njime, iz čoveka, miša, zeca, pacova, glodara, primata ili njihove kombinacije i sličnog.
U jednom aspektu ovaj pronalazak obezbeđuje izolovane molekule nukleinske kiseline koje sadrže komplementarne, ili sa njima hibridizovana, polinukleotidna kodirajuća specifična anti-dual integrinska antitela, obuhvatajući makar jednu specifičnu sekvencu, domen, deo ili njegovu drugu varijantu. Dalje, ovaj pronalazak obezbeđuje rekombinantne vektore koji obuhvataju molekule nukleinskih kiselina pomenutog anti-dual integrina, ćelije domaćine koje sadrže ovakve nukleinske kiseline i/ili rekombinantne vektore, kao i metode za dobijanje i/ili upotrebu ovakvih nukleinskih kiselina antitela, vektora i/ili ćelija domaćina.
Makar jedno antitelo iz ovog pronalaska vezuje makar jedan specifičan epitop koji je specifičan makar za jedan dual integrinski protein, subjedinicu, fragment, deo ili njihovu kombinaciju. Makar jedan epitop može da sadrži makar jedan region za vezivanje antitel koji sadrži makar jedan deo pomenutog proteina. Taj epitop poželjno je da sadrži makar 1-5 amino kiselina od makar dela dual integrina, kao stoje, ali nc limitiran njime, (a) 29-48, 58-63, 69-79, 82-85, 88-134, 140-157, 161-183, 186-190, 192-198, 202-212, 215-217, 223-237, 240-244, 248-255, 259-268, 287-301, 313-322, 326-328, 332-344, 348-351, 354Č365, 376-387, 393-401, 407-414, 417-419, 422-433, 443-451, 458-461, 465-469, 472, (b) 32-41, 46-47, 53-55,58-69, 72-74, 77-79, 85-88,91-94, 96-105, 110-113, 117-125, 129-142, 145-153, 155-159, 161-163, 166-170, 172-174, 184-197,200-209,215-218, 221-225, 184-197, 200-209, 215-218, 221-225, 227-250, 259-261, 263-267, 269-270, 275-281;(c) 29-35, 43-45, 48-63, 67-69, 72-74,80-82, 84-87, 95-105, 108-113, 117-142, 145-163, 166-170, 172-176, 184-186, 191-201,204-206,216-219, 224-226, 229-251, 260-262, 264-268, 276-282, 286-288, 294-299, 301-318, 323-325, 328-330, 338-342, 345-349, 353-358, od Seq ID NO: 16, i 17, ili makar jedan, ne limitiran njime, funkcionalan, ekstracelularan, solubilan, hidrofilan spoljašnji ili citoplazmatski domen pomenutog proteina dual integrina, subjedinice ili bilo kog njegovog dela.
Najman je jedno antitelo može opcionalno da sadrži makar jedan pomenut deo makar jednog regiona koji određuje komplementarnost (CDR) ( e.g., CDR1, CDR2 ili CDR3 varijabilnog regiona teškog ili lakog lanca) i/ili makar jedan konstantan ili varijabilan framework (okosnica) region ili bilo koji njegov deo. Makar jedna amino kiselinska sekvenca antitela može dalje opcionalno da sadrži makar jednu određenu substituciju, inserciju ili deleciju kao što je ovde opisano ili poznato u ovoj oblasti.
Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje makar jedno izolovano anti-dual integrinsko antitelo kao što je ovde opisano, naznačeno time da antitelo poseduje makar jednu aktivnost, kao što je, ali ne limitirano inhibicijom vezivanja vitronektina (vitronectin), inhibicija vezivanja alfa-v beta-3 za makar za jedan alfa-v beta-3 ligand ili receptor, inhibicija vezivanja alfa-v bcta-5 za makar za jedan alfa-v beta-5 ligand ili receptor, modulaciju angiogeneze, vezivanje za dual integrin ili pojedinačne (single) integrin eksprimirajuće ćelije. Anti-dual integrinsko antitelo tako može biti provereno za odgovarajuće aktivnosti poznatim metodama, kao što je ali ne njime limitirano, biološka aktivnost dual integrin proteina.
Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje makar jedan dual integrin anti-idiotopsko antitelo za makar jedno dual integrin antitelo iz ovog pronalaska. Anti-idiotop antitelo uključuje bilo koji molekul sa proteinom iil peptidom, koji obuhvata makar jedan deo imunoglobinskog molekula, kao što je ali nije limitiran njime, makar jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog ili lakog lanca ili njegov deo za vezivanje Uganda, varijabilni region teškog ili lakog lanca, framework region, ili bilo koji njegov deo, koji može da se ugradi u antitelo iz ovog pronalaska. Antitelo ovog opisano u ovom pronalasku može da obuhvati ili može biti đobijeno od bilo kog sisara, kao stoje na primer čovek, miš, zec, pacov, glodar, primat, i slično ali nije ograničen na njih.
Ovaj pronalazak obezbeđuje, u jednom svom aspektu, izolovane molekule nukleinskih kiselina koje sadrže, komplementarne ili sa njima hibridizovan polinukleotid koji kodira najmanje jedno dual integrin anti-idiotip antitelo, koje sadrži makar jednu njegovu specifičnu sekvencu, domen, deo ili varijantu. Dalje ovaj pronalazak obezbeđuje rekombinantne vektore koji sadrže pomenute molekulenukleinskih kiselina koje kodiraju dual integrin anti-idiotop antitelo, ćelije domaćine koje sadrže ovakvenukleinske kiseline i/ili rekombinantne vektore, kao i metode za dobijanje i/ili upotrebu ovakvih nukleinskih kiselina anti-idiotip antitela, vektora i ili ćelija domaćina.
Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje najmanje jednu metodu za eksprimiranjc makar jednog anti-dual integrin antitela, ili dual integrin anti-idiotip antitela, u ćeliji domaćinu, koja obuhvata gajenje domaćinskih ćelija kao što je ovde opisano pod uslovima naznačeno time da najmanje jedno anti-dual integrin antitelo se eksprirnira u količinama koje se mogu detektovati i/ili oporaviti.
Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje jednu kompoziciju koja sadrži (a) izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira anti-dual integrinsko antitelo i/ili antitelo koje je ovde opisano, i (b) pogodan nosač ili rastvarač. nosač ili rastvarao opcionalno može biti farmaceutski prihvatljiv, na osnovu već poznatih nosača ili rastvarača. Opcionalno kompozicija može dalje da obuhvati makar još jedno jedinjenje, protein ili kompoziciju.
Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje makar jednu anti-dual integrinsko antitelo metodu ili kompoziciju za administraciju terapeutski efikasne količine u cilju modulacije ili tretiranje makar jednog stanja povezanog sa dual integrinom u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu i/ili, pre, posle ili za vreme trajanja sličnih uslova, kao mšto je poznato u ovoj oblasti i/ili kao što je ovde opisano.
Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje najmanje jednu kompoziciju, sredstvo i/ili metod za dostavu terapeutski ili profilaktički značajne količine makar jednog anti-dual integrin antitela, na osnovu ovog pronalaska.
Dalje ovaj pronalazak obezbeđuje makar jednu anti-dual integrinsko antitelo metodu ili kompoziciju, za dijagnosticiranje makar jednog stanja povezanog sabdual integrinom u ćeliji, tkivu, organu životinji ili pacijentu i/ili pre, posle ili za vreme sličnih uslova, kao što je poznato u ovoj oblasti i/ili je opisano u ovom pronalasku.
Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje makar jednu kompoziciju, sredstvo i/ili metodu za dostavu za dijagnosticiranje makar jednog anti-dual integrinskog antitela, na osnovu ovog pronalaska.
OPIS SLIKA
Slika1 prikazuje grafikon sa duplirajućim razblaženjima anti-aVp3 Ma koja su inkubirana na pločama sa aV(33 tokom 1 časa na sobnoj temperaturi (ST). Pločice su dva puta isprane i urađena je proba sa HRP oobeleženim kozijim anti-humanim IgG kappa specifičnim antitelima tokom 1 sata na ST. Ploče su ponovo isprane, razvijene sa OPD substratom i merena je OD na 490 nm.
Slika2 prikazuje grafikon sa M21 ćelijama obeleženim sa kalceinom (calcein) koje su predinkubirane sa uzorcima antitela u odsustvu i prisustvu P1F6, anti-aVp3 "ascites" (hidroperitoneum) tokom 30 minuta, zatim su prebačene na ploče sa nanešenim vitronektinom i na njima su stajale 45 minuta. Nevezane M21 ćelije ukonjene su ispiranjem sa po 150 ul/bunarčiću sa HBSS uz dodatak kalcijuma. Ploče su očitane na fluorimetru na 485-538nm.
Slika 3 prikazuje grafikon ćelijske adhezije gde MDAMB435L2 ćelije su pokupljene i predinkubirane sa različitim koncentracijama Gen95 tokom 10 minuta. Zatim su ćelije tumora dodane Linbro pločama sa vitronektinom i inkubirane su na 37°C tokom 10 minuta. Bunarčići su isprani tri puta zatim je u svaki dodato ćelijski titar na bazi MTT AQ boja (MTT based Cell Titer AQ ).
Ćelijska adhezija određena je u ELISA čitaču (ELISA plate reader) gde je OD490 nm direktno proporcionalna ćelijskoj adheziji. Ćelijska adhezija sa bunarčićima sa BSA služila je kao negativna kontrola(podaci nisu prikazani). Svaki podatak koji je prikazan tačkom predstavlja srednju vrednost trostruke determinacije.
Slika 4A-D prikazuje grafikon vezivanja antitela za aVp3 gde je ovaj ligand preinkubiran u duplirajućim razblaženjima počevši od 10:g/mL sa 50 mM EDTA u 1% BSA-HBSS (u odsustvu Ca++) ili sa 1%BSA-HBSS (sa Ca++) tokom 30 minuta na 37°C. Mešavine su dodate na ploče sa CNTO 95, C372, c7E3 ili LM609 IgG i inkubirane 1 sat, na 37°C. LM609 ili CNTO 95 20:g./mL dodati su u odgovarajući pufer (+/- Ca++) tokom 30 minuta na 37°C. Pločama su dodate probe anti-mišiji IgG Fc, HRP ili koziji anti-humani IgG Fc, HRP.
Slika 4E-G prikazuje grafikone antitela koja se vezuju za aVp3, gde je ovaj ligand preinkubiran u duplirajućim razblaženjima počevši od 10:g/mL sa 50 mM EDTA u 1% BSA-HBSS (u odsustvu Ca+1) ili sa 1%BSA-HBSS (sa Ca++) tokom 30 minuta na 37°C. Mešavine su dodate na ploče sa CNTO 95,C372, c7E3 ili LM609 IgG i inkubirane 1 sat, na 37°C.VNR 139 10 :g/L dodati su u odgovarajući pufer (+/- Ca++) tokom 30 minuta na 37°C. Pločama je dodata proba, koziji anti-humani IgG Fc, HRP.
Slika 5A-B prikazuje grafikon krive saturacije vezivanja GenO.95 (slika 5A) i ReoPro (slika 5B) na pločama obloženim sa aVp3.
Slika 6A-B prikazuje grafik krive saturacije vezivanja GenO.95 (S1.5A) i ReoPro (S1.5B) na pločama obloženim av(35.
Slika 7A-C prikazuje krive saturacije vezivanja sa graficima vezivanja za (S1.7A): A375S2; (S1.7B): HT-29; (SI. 7C): M21. Ćelije su stavljene na ploče dva dana pre eksperimenta, i bilo je 1 x IO5 ćelija/bunarčiću u vreme studije. Dodato je 125-1 GenO.95 (1 uCi/ug) u 1% medijum za rast i inkubirano sa ćelijama u toku 1.5 h, 37°C. Određeno je nespecifično vezivanje korišćenjem 100 x hlade mAc u medijumu. Ćelije su isprane 3x i očitavana je vezana radioaktivnosti. Svaka kriva predstavlja 4-5 odvojenih ispitivanja i svaka tačka podataka u svakom eksperimentu je bila srednja vrednost trostrukog uzorka.
Slika 8A-C pokazuje krive saturacije vezivanja sa graficima vezivanja za (S1.8A): A375S2; (SI. 8 B): HT-29; (SI. 8C): M21. Ćelije su stavljene na ploče 2 dana pre eksperimenta i bio je 1 x IO5 ćelija po bunarčiću u vreme ispitivanja. Dodato je 125-1 ReoPro (1 u.Ci/ug) u 1% međijum za rast i inkubirano sa ćelijama u toku 1.5 h, 37°C: Određeno je nespecifično vezivanje korišćenjem 100x hladnog mAb u medijunau. Ćelije su isprane 3x i očitavana je vezana radioaktivnost. Svaka kriva predstavlja 4-5 odvojenih ispitivanja i svaka tačka podataka u svakom eksperimentu je bila srednja vrednost trostukog uzorka.
Slika 9 Predstavlja reprezentaciju mikrokapilarnog obrazovanja endotelijalnih ćelija iz MC zrnaca kultivisanih u fibrinskom gelu. Sočiva objektiva: 40x. Test je izveden kao što je opisano u Postupcima Primera 4.
Slika 10 prikazuje grafik kvantifikacije kapilarnog obrazovanja u fibrinskom gelu u medijumu koji sadrži 30 ug/ml bFGF rastvorenog u 0.1% serima. Broj mikrokapilarnih izdanaka je kvantifikovan kao stoje opisano u Postupcima primera 4. Kontrola je bila kontrola nosača, mišijeg (M) i humanog (H) IgG koji su služili kao negativne kontrole. LM-P1F6 je kombinacija oba LM609 i P1F6. Svaki stub predstavlja srednju vrednost 6 buharčića (+/- SD).
Slika 11 prikazuje grafik kvantifikacije kapilarnog obrazovana u fibrinskom gelu u kompletnom medijumu. Broj mikrokapilarnih izdanaka je kvantifikovan kao što je opisano u postupicma primera 4. Kontrola je bila kontrola nosača. Mišiji (m) i humani (h)-IgG su služili kao negativne kontrole. LM-P1F6 je kombinacija oba LM609 i P1F. Svaki stub predstavlja srednju vrednost 6 bunarčića (+/- SD)
Slika 12. HT29 ćelije (Slka 12 A, B i C) eksprimuju avp5, ali ne avfB integrin na njihovoj površini. HUVEC (Slika 12D, E i F) i A375S.2 (Slika 12G. H i I) ćelije eksprimuju avP5 i a\'P3 integrin na njihovoj provršini. Ćelije tumora su obojene imunofluorescencijom i analizirane protočnom citometrijom. Histogram sa leve strane predstavlja fluorescencu pozadine u prisustvu antitela koji odgovara izotipu. Histogram sa desne strane prikazuje pozitivno bojenje. A, D, G, LM609 (Ma usmereno ka aVp3, 10 p.g/ml); B, E, H, PIF6 (Ma usmereno ka aVB5, 10 ug/ml).
Slika 13. Adhezija HUVECS za ploče sa proteinom matriksa. Adhezioni esej je izveden kako je opisano u metodama iz primera 5. Ploča je čitana na fluorometruna 485-538 nm. Ćelijska adhezija za BSA koji se nalazi u bunarčićima poslužila je kao negativna kontrola. Na slici 13 stepen ćelijske adhezije u prisustvu različitih koncentracija antitela je skicirana kao procenat ćelijske adhezije u odsustvu antitela koji se smatra kao 100%. Svaki podatak koji je prikazan tačkom predstavlja srednju vrednost trostruke determinacije (+/- SD).
Slika 14. Adhezija humanih ćelija melanoma za ploče sa matriksnim proteinom. Adhezioni esej je izveden kako je opisano u metodama. Ćelijska adhezija za BSA koji se nalazi u bunarčićima poslužilaje kao negativna kontrola. Na slici 14 stepen ćelijske adhezije u prisustvu različitih koncentracija antitela je skiciran kao procenat ćelijske adhezije u odsustvu antitela koji se smatra kao 100%. Svaki podatak koji je prikazan tačkom predstavlja srednju vrednost trostruke determinacije (+/- SD).
Slika 15. Adhezija humanih ćelija raka debelog creva HT29 za vitronektin. Adhezioni esej je izveden kako je opisano u metodama. Ćelijska adhezija za BSA koji se nalazi u bunarčićima poslužilaje kao negativna kontrola. Podaci na slici 15 su skicirana kao procenat maksimalnog vezivanja (u odsustvu antitela), i predstavlju srednju vrednost trostruke determinacije (+/- SD).
Slika 16A-D Migracija HUVECS ka 2 ug/ml vitronektina. Esej je izveden kako je opisano u metodama i ćelijama je dozvoljeno da migriraju 6 sati. Fotomikrografije predstavljaju karaktristična polja migracija ćelija (sočivo objektiva 10X), na slici 16A, odsustvo antitela, (16B), Gen095 (5ug/ml), (16C), Gen095 (40 ug/ml). Slika 16D je grafički prikaz ćelijske migracije u prisustvu različitih koncentracija Gen095. Podaci su normalizovani do procenta kontrole (bez antitela) što se smatra za 100%, i svaka tačka predstavlja srednju vrednost tri trans bunarska filtera (+/-SD).
Slika 17. Migracija HUVECS ka 2 ug/ml vitronektina u prisustvu antitela na ctVp3 i aVp5. Migracioni esej je izveden kako je opisano u metodama i ćelijama je dozvoljeno da migriraju 6 sati. LM609 i P1F6 su Ma usmerena ka aVp3 i aVp5. Podaci prikazani na slici 17 su normalizovani do procenta kontrole (bez antitela) što se smatra za 100%, i svaka tačka predstavlja srednju vrednost tri trans bunarska filtera (+/- SD). BSA, mišiji IgG i humani IgG služili su kao negativne kontrole. LM609-PIF6 predstavljaju kombinaciju oba antitela. Ova antitela i BSA su korišćeni u koncentraciji od 10 ug/ml.
Slika 18A-E. Migracija HUVECS ka 2% FBS. Migracioni esej je pušten da teče tokom 4 sata i podaci su beleženi kao stoje opisano u metodama. Slika 18(A) je grafički prikaz ćelijske migracije u prisustvu LM609, Pl F6, kombinacije LM609+P1F6, kontrolna antitela koja odgovaraju izotipu (humana i mišija). Antitela i proteini korišćeni su u koncentracijama 10 ug/ml. Slika 18(B) je grafički prikaz ćelijske migracije u prisustvu ReoPro i Gen095. Fotomikrografije predstavljaju karaktristična polja migracija ćelija (sočivo objektiva 10X), na slici 18C, u odsustvo antitela, na slici (18D), Gen095 (5 p-g/ml), na slici (18E), Gen095(20 ).ig/ml). Podaci su normalizovani do procenta kontrole (bez antitela) što se smatra za 100%, i svaka tačka predstavlja srednju vrednost tri trans bunarska filtera (+/- SD).
Slika 19A-E Migracija A375S.2 ćelija ka 10% FBS. Migracioni esej je pušten da teče tokom 4 sata i podaci su beleženi kao što je opisano u metodama. Antitela i proteini korišćeni su u koncentracijama 10 ug/ml. Slika 19(A) je grafički prikaz ćelijske migracije u prisustvu različitih koncentracijaGen095. Slika 19(B) je grafički prikaz ćelijske migracije u prisustvu LM609, P1F6, kombinacije LM609+P1F6, kontrolna antitela koja odgovaraju izotipu (humana i mišija). Podaci su normalizovani do procenta kontrole (bez antitela) što se smatra za 100%, i svaka tačka predstavlja srednju vrednost tri trans bunarska filtera (+/-SD). Fotomikrografije predstavljaju karaktristična polja migracija ćelija (sočivo objektiva 10X), na slici 19C, odsustvo antitela, slici (19D), Gen095 (5 u.g/ml) i na slici (19E), Gen095(20 ug/ml).
Slika 20 A-E. Migracija HUVECS ka vitronektinu u prisustvu bFGF. Donje strane migracione komore obložene su sa 2 u,g/ml vitronektina, i esej je izveden kao što je opisano u metodama. Ćelije su migrirale tokom 6 sati. Na slikama 20A-E svaka tačka predstavlja srednju vrednost tri trans bunarska filtera (+/- SD). Slika 20(A), bFGF; slika 20(B) Gen095 (5 ug/ml); slika 20(C), Gen095 (40 ug/ml); slika 20(D), ne-bFGF. Na slici 20(E), grafički je prikazana inhibicija ćelijske migracije u prisustvu različitih antitela.
Slika 21A-D.Invazija A375S.2 ćelija kroz fibrinski gel (5 mg/ml). Invazioni esej je pušten da se odvija tokom 24 časa i podaci su beleženi kao stoje opisano u metodama. Fotomikrografije predstavljaju karakteristična polja (sočivo objektiva 4X) ćelijske invazije na slici 21 (A) u odsustvu antitela, NA slici 21(B) Gen095 (10 pLg/ml), slike 21(C) i (D) su grafički prikazi ćelijske invazije u prisustvu Gen095, 10E5 F(ab')2, LM609, P1F6, LM-P1F6 (LM609+P1F6), humani i misiji IgG-i (H-IgG i M-IgG). Grafička slika 21(D): koncentracije svih antitela i proteina je 10 |ig/ml. Podaci su normalizovani do procenta kontrole (bez antitela) što se smatra za 100%, i svaka tačka predstavlja srednju vrednost tri trans bunarska filtera (+/- SD).
OPIS PRONALASKA
Ovaj pronalazak obezbeđuje izolovava, rekombinantna i/ili sintetička antidualna integrinska humana, primatna, glodarsdka, sisarsk, himerna, humanizovana ili CDR presađena antitela i dualna integrin anti-idiotipska antitela, kao i kompozicije i kodirajuće molekule nukleinskih kiselina koje sadrže najmanje jedan polmukleotid koji kodira makar jedno anti-dualno antitelo ili anti-idiotipsko antitelo. Ovaj pronalazak dalje obuhvata, ali nije time limitiran, metode za dobijanje i korišćenje ovakvih nukleinskih kiselina i antitela i anti-idiotipskih antitela, uključujući dijagnostičke i terapeutske kompozicije, metode i naprave.
Kao stoje ovde korišćeno, "anti-alfa-v-beta3", "anti-alfa-v-beta5 dualno integrinsko antitelo", "anti-dualno integrinsko antitelo", "deo anti-dualnog integrinskog antitela" ili "fragment ant-dualnog integrinskog antitela" i/ili "varijanta anti-dualnog integrinskog antitela" i slično, uključuju bilo koji protein ili molekul sa peptidom koji sadrži makar deo imunoglobinskog molekula, kao što je, ali nije njime limitiran, makar jedan region za određivanje komplementarnosti (complementaritv deternining region-CDR) teškog ili lakog lanca ili deo za vezivanje Uganda, varijabilan region teškog ili lakog lanca, konstantan region teškog ili lakog lanca, framevvork region, ili njegov deo, ili najmanje jedan deo dual integrinskog receptora ili vezujućeg proteina, koji se može ugraditi u antitelo iz ovog pronalaska. Ovakvo antitelo opcionalno utiče na specifičan ligand, tako što, ali nije limitiran time, antitelo moduliše, smanjuje, povećava, antagonizuje, angonizuje, ublažava, povišava, olakšava, blokira, inhibira, ukida i/ili utiče na makar jednu aktivnost dualnog integrina ili na njegovo vezivanje, ili na aktivnost i vezivanje receptora za dual integrin,in vitro, in situi/iliin vivo.Kao nelimitirajući primer odgovarajuće anti-dualno integrinsko antitelo, određeni delovi ili varijanta ovog pronalaska, može da veže makar jedan dualni integrin, ili njegove određene delove, varijante ili domene. Odgovarajuće anti-dualno integrinsko antitelo, određeni delovi ili varijante mogu takođe opcionalno da utiču makar na jednu funkciju ili aktivnost dualnog integrina, kao što je. ali nije time limitirana, sinteza RNK, DNK ili proteina, oslobađanje dualnog integrina, receptorski "signaling" dualnog integrina, sečenje membrane dualnim integrinom, aktivnost dualnog integrina, proizvodnja i/ili sinteza dualnog integrina. Izraz "antitelo" ima za nameru da dalje obuhvati antitela, digestione fragmente, njihove određene delove i varijante, uključujući oponašanje antitela ili obuhvatajući delove antitela koja oponašaju strukturu i/ili funkciju antitela ili njivovog fragmenta ili dela, uključujući jednolančana antitela i njihove fragment. Funkcionalni fragmenti obuhvataju antigen vezujuće fragmente koji se vezuju za sisarski dualni integrin. Na primer, fragmenti antitela koji su sposobni da se vežu za dualni integrin ili njegov deo, uključujući, iako nisu time limitirani, Fab (e.g., digestijom papainom), Fab' (e.g., digestijom sa pepsinom i đelimičnom redukcijom) i F(ab') (e.g., digestijom sa pepsinom), facb (e.g., digestijom sa plazminom), pFc' (e.g., digestijom sa pepsinom ili plazminom), Fd (e.g., digestijom sa pepsinom, parcijalnom redukcijom i ponovnom agregacijom), Fv ili scFv (e.g., tehnikama molekularne biologije) fragmente, koji su obuhvaćeni ovim pronalaskom (videti, e.g., Colligan Immunologv, supra).
Ovakvi fragmenti mogu se dobiti sečenjem sa enzimima, sintetičkim ili rekombinantnim tehnikama, kao što je poznato u ovoj oblasti i/ili kao što je ovde opisano. Antitela se takođe mogu proizvesti u različitim skraćenim oblicima upotrebom gena za antitela u koje je jedan ili više stop kodona ubačeno uzvodno od prirodnog stop kodona. Na primer, kombinacija gena koji kodiraju deo teškog lanca F(ab')2može se dizajnirati tako da se uključeDNK sekvence koje kodiraju CH1 domen i/ili zglobni (hinge) region teškog lanca, različiti delovi antitela mogu se spojiti hemijskim putem konvencionalnim tehnikama, ili se mogu pripremiti kao jedan protein od nastavljaj ući h različitih đelova pomoću tehnika genetičkog inžinjerstva.
Kao što se ovde koristi, izraz "humano antitelo" odnosi se na antitelo u okviru koga u suštini svaki deo proteina (e.g., CDR, framevvork, CL, CHdomeni (e.g., Q, 1, C„2, CM3), zglob (VL, VH)), je u suštini neimunogen za čoveka, sa minornim promenama u sekvenci ili varijantama. Slično, antitela namenjena primatima (majmunu, babunu, šimpanzi itd.), glodarima (mišu, pacovu, zecu, morskom prasetu, hrčku, i sličnim) i drugim sisarima označava antitela specifična za podvrstu, pod rod, rod, podfamiliju, familiju. Dalje himerna antitela uključuju bilo koju kombinaciju gore opisanih. Ovakve promene ili varijante opcionalno i poželjno je da zadržavaju ili redukuju imunogenost u ljudima ili drugim vrstama u odnosu na nemodifikovano antitela. Tako humano antitelo je različito od himernog ili humanizovanog antitela. Naglašeno je da se humano antitelo takođe može proizvesti u ne-humanoj životinji ili prokanotskoj ili eukariotskoj ćeliji koja je sposobna da eksprimira funksionalno preuređene humane imunoglobulinske (e.g., težak lanac i/ili lak lanac). Dalje, kada je humano antitelo jednolančano antitelo, ono sadrži linker peptid koji se ne nalazi u nativnim humanim antiteliina. Na primer, Fv može da sadrži linker polipeptid, od dva do oko osam glicina ili drugih amino kiselinskih ostataka, koji povezuje varijabilan region teškog lancai varijabilan region lakog lanca. Ovakvi linker peptidi se smatraju da su humanog porekla.
Bispecifična, heterospecifična ili slična antitela mogu se takođe koristiti, ona koja su monoklonalna, poželjno je da su humana ili humanizovana, antitela koja imaju specifičnost vezivanja za makar dva različita antigena. U ovom slučaju jedna od specifičnosti vezivanja je za protein dualni integrin, dok je druga za bilo koji drugi antigen. Metode za proizvodnju bispecifičnih antitela poznate su u ocoj oblasti nauke. Tradicionalno rekombinantna proizvodnja bispecifičnih antitela se bazira na koekspresiji dva imunoglobulinska težak lanac-lak lanac para, gde dva teška lanca imaju različite specifičnosti (Milstein i Cuello, Nature 305:537 (1983)). Zbog slučajnog odabiranja i slaganja imunoglobulinskih teških i lakih lanaca, ovi hibridomi (kvadromi) proizvode potencijalnu mešavinu od 10 različitih molekula antitela, od koji samo jedno ima odgovarajuću bispecifičnu strukturu. Prečišćavanje potrebnog pravog molekula, koje se odigrava najčešće kroz korake afinitativne hromatografije, je poprilično teško, i prinos proizvoda je nizak. Otkrivene su slične procedure, e.g., u WO 93/08829, US Patent Nos, 6210668, 6193967, 6132992, 6106833, 6060285,6037453,6010902, 5989530, 5959084, 5959083, 5932448, 5833985, 5821333,5807706, 5643759, 5601819, 5582996, 5496549, 4676980, WO 91/00360, VVO92/00373, EP 03089, Traunecker et al., EMBO J. 10:3655 (1991), Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986), svaki od njih se nalazi ovde sa referncom.
Anti-dualna integrinska antitela (nazivaju se i dual integrinska antitela) koja su korisna za metode i kompozicije u ovom pronalasku, mogu opcionalno imati osobine kao što su visoki afinitet vezivanja za dualni integrin i opcionalno i poželjno nisku toksičnost. Posebno je korisno u ovom pronalasku, antitelo, određeni fragment ili varijanta pronalaska, gde pojedinačne komponente, kao što su varijabilan region, konstantan region i framevvork, pojedinačno i/ili kolektivno, opcionalno i poželjno sa niskom imunogenošću. Antitela koja se mogu koristiti u ovom pronalasku opcionalno karakteriše njihova sposobnost da se koriste u lečenju pacijenata tokom dužeg vremenskog perioda sa merljivim ublažavanjem simptoma, i niska i/ili prihvatljiva toksičnost. Niska ili prihvatljiva imunogenost i/ili visoki afinitet, kao i druga odgovarajuća svojstva, mogu da doprinesu ostvarenim terapeutskim rezultatima. "Niska imunogenost" je ovde definisan kao značajan porast HAHA, HACA ili HAMA odgovora kod manje od oko 75% ili što je poželjnije kod manje od 50% pacijenata koji su lečeni i/ili porast niskog titra kod tertiranih pacijenata (manje od 300, poželjno manje od oko 100 izmerenih pomoću duplog antigenskog enzimskog imunoeseja) (Elliott et al., Lancet 344:1125-1 127 (1994), kompletno je ovde obuhvaćeno referencom).
KORIST
Izolovane nukleinske kiseline ovog pronalaska mogu se iskoristiti za proizvodnju najmanje jednog anti-dualnog integrinskog antitela ili njegove specificirane varijante, koje se može koristiti za merenje ili mproizvođnju u ćeliji, tkivu, organu ili životinji (uključujući sisare i ljude), za dijagnostifikovanje, monitoring, modulaciju, lečenje, ublažavanje, pomoć u prevenciji incidence, ili redukciji simptoma, najmanje jednog stanja povezanog za dualni integrin, selektovanog od, ali ne njime limitirano, makar jednog imunog poremećaja ili bolesti, kardiovaskularnog poremećaja ili bolesti, infekcije, malignog oboljenja, i/ili neurološkog poremećaja ili bolesti, ili nekog drugog poznatog ili specificiranog stanja povezanog sa dualnim integrinom.
Ovakav metod može da obuhvata administraciju efektivne količine kompozicije ili farmaceutske kompozicije koja sadrži makar jedan antidualni integrin u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu, kome treba modulacija, olakšavanje, umanjenje, prevencija ili redukcija simptoma; efekata i mehanizama. Efektivna količina može da oduhvati količine od oko 0.001 do 500 mg/kg za pojedinačno (e.g., bolus (za gutanje)), više puta ili kontinuirano davanje, ili da bi se dostigla koncentracija seruma od 0.01-5000 mg/ml serumske koncentracije za pojedinačno, više puta i kontinuirano davanje, ili bilo koji efektivan opseg ili vrednost istih, kao što se radi i određuje upotrebom poznatih metoda, što je ovde opisano ili je poznato upućenima u ovu oblast.
CITATI
Sve publikaciej i pomenuti pacijenti su pokriveni ovde referencama, i pokazuju kakva je situacija u ovoj oblasti nauke bila u momentu ovog pronalaska i/ili obezbeđuje opis i omogućava ovaj pronalazak. Publikacije se odnose na bilo koje naučne publikacije ili publikacije pacijenata, ili informacijekoje su dostupne u bilo kom medijskom formatu, uključujući sve zabeležene, elektronske i štampane formate. Sledeće reference su kompletno objedinjena ovde referencama: Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biologv, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbour, NY (1989); Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbour, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Ine, NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, Ine, NY, NY (1997-2001).
ANTITELAIZOVOG PRONALASKA
Makar jedno anti-dual integrinsko antitelo iz ovog pronalaska može biti opcionalno proizvedeno od strane ćelijske linije, mešovite ćelijske linije, besmrtnih ćelija ili klonalne populacije besmrtnih ćelija, što je poznato u ovoj oblasti nauke. Videti e.g., Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biologv, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al.,
Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbour, NY
(1989); Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbour, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Ine, NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, Ine, NY, NY (1997-2001), svaka je objedinjena ovde referencom.
Humana antitela koja su specifična za dual integrinski protein ili njegov fragment, mogu se izazvati protiv odgovarajućeg imunogenog antigena, kao što je izolovani i/ilidualni integrinski protein ili njegov deo (uključujući sintetičke molekule, kao što su sintetički peptidi). Druga specifična ili opšta sisarska antitela mogu se dobiti na sličan način.
Priprema imunogenih antigena, i proizvodnja monoklonalnih antitela može se izvesti primenom bilo koje pogodne tehnike.
Po jednom pristupu, hibridoma se proizvodi fuzijom pogodnih besmrtnih ćelijskih linija (e.g., ćelijske linije mieloma kao što su. ali nisu njima limitirane, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, 1.5, veće od 243, P3X63Ag8.653, Sp2MAl, Sp2 SSI, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-69, MLA 144, NAMAFvVA, NEURO 2A, ili slične, ili heteromilome (heteromylomas), njihovi fuzioni proizvidi, ili bilo koja ćelija ili fuziona ćelija izvedena iz njih, ili neka druga odgovarajuća linija koja je poznata u ovoj oblasti. Videti, e.g..www.atcc.lifetech.com. sa ćelijama koje proizvode antitela, kao što su, bez ograničavanja na njih. izolovane ćelije slezine, iz periferalne krvi, limfe, krajnika, ili druge imune ćelije ili one koje sadrže B limfocite, ili bilo koje ćelije koje eksprimiraju konstantne, varijabilne ili framework ili CDR sekvence teškog ili lakog lanca, ili kao endogene ili heterologne nukleinske kiseline, kao rekombinantne ili endogene viralne, bakterijske, od algi, prokariotske, od vodozemaca, insektske, od gmizavaca, riblje, sisarske, glodarske, konjske, goveđe, jareće, ovčije, primatne, eukariotske, genomske DNK, cDNK, mitohondrijska DNK ili RNK, hloroplastna DNK ili RNK, hnRNK, iRNK, tRNK, jedno, dvo ili trolančana, hibridizovana, ili bilo koja njihova kombinacija. Videti Ausubel, supra, and Collingan, Immunologv. supra, Chapter 2, obuhvaćena ovde referencom.
Ćelije koje proizvode antitela mogu se dobiti iz periferne krvi ili što je poželjnije iz slezine, limfnih čvorava, poreklom od čoveka ili drugh odgovarajućih životinja, koje su imunizovane sa antigenom od interesa. Može se koristiti bilo koja odgovarajuća ćelija domaćin za ekspresiju heterolognih ili endogenih nukleinskih kiselina koje kodiraju antitelo, njegov specificiran fragment ili varijantu, iz ovog pronalaska. Fuzionisane ćelije (hibridome) ili rekombinantne ćelije mogu se
izolovati pomoću uslova selektivnih kultura ili nekim drugim poznatim prigodnim metodama, i takođe mogmogu biti klonirane pomoću ograničavanja razblaženja ili odabira ćelija, ili nekih drugih poznatih metoda. Ćelije koje proizvode antitela sa željenim specifičnostima mogu se selektovati odgovarajućim esejom (e.g., ELISA metodom).
Druge pogodne metode za proizvodnju ili izolaciju antitela željene specifičnosti mogu se koristiti, ukjučujući, ali nisu njima ograničene, metode koje selektuju rekombinantno antitelo izpeptidne ili proteinske biblioteke (e.g., ali nisu njima limitirane, bakteriofagne, ribozomalne, oligonukleotidne, RNK, cDNK ili slične izložene biblioteke; e.g., kao što su dostupne iz Cambridge Antibodv Technologies, Camridgeshire, UK; MorphoSvs, Martinsreid/Planegg, DE; Biovation, Aberdeen, Scotland, UK; Biolnvent, Lund, Sweden; Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Berlkely, CA; Ixsus. Videti e.g., EP 368,684, PCT/GB91/01134; PCT/GB92/01755; PCT/GB92/002240; PCT/GB92/00883; PCT/GB93/00605; US 08/350260(5/12/94); PCT/GB/01422; PCT/GB94/02662; PCT/GB97/01835; (CAT/MRC); WO90/14443; WO90/14424; VVO90/14430; PCT/US94/1234; W092/16619; WO96/07754; (Scripps); EP 614 989 (MorphoSys); WO95/16027 (BioInvent);WO88/06630; VVO90/3890 (Dyax); US 4,704,692 (Ezon); PCT/US91/02989 (Affymax); WO89/06283; EP 371 998; EP 550 400;(Xoma); EP 229 046; PCT/US91/07149 (Ixsys);; ili stohaksički dobijeni peptidi ili proteini - US 5723323, 5763192, 5814476, 5817483, 5824, 5976862, WO 86/05803, EP 590 689 (Ixsys, sada ApphedMolecular Evolution (AME), svaki pojedinačno obuhvaćen ovde referencama) ili rctko po imunizaciji transgenih životinja (e.g., SCID miš, Ngyuen et al., Microbiol. Immunol. 41:901-907 (1997); Sandhu et al.,m Crit. Rev. Biotechnol. 16:95-118 91996); Eren et al., Immunol. 93; 154-161 (1998), svaki pojedinačno potpuno obuhvaćen kao i povezani pacijenti i prijave) koji su sposobni za proizvodnju repertoara humanih antitela, kao što je poznato u ovoj oblasti i/i li kako je ovde opisano. Takve tehnike, uključuju, ali nisu njima limitirane, "ribosomal display" (Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4937-4942 (May 1997); Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14130-14135 (Nov. 1998)(; tehnologije proizvodnje pojedinačne ćelije (e.g., metod selektovanog limfocitnog antitela (selected lymphocyte antybody method -"SLAM") (US pat. No. 5,627,052, wen et al., J.Immunol. 17:887-892 (1987); Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:7843-7848 (1996); "gel microdroplet" i Tlow" (protočna) citometrija (Povvel et al., Biotechnol. 8:333-337 (1990); One Ccll Svstcms, Cambridge, MA; Gray et al., J. Immun.Meth. 182:155-163 (1995) Kenney et al., Bio/Technol. 13: 787-790
(1995)); selekcija B-ćelija (Steenbakkers et al., Molec.Biol.Reports 19:125-134
(1994); Jonak et aaal., Progress Biotech, VoI5,in vitroImmunization in Hvbridoma Technology. Borrebaeck, ed., Elsevier science Publishers B. V., Amsterdam, Netherlands (1988)).
Metode za inžinjering humanizovanih ne-humanih ili huamnih antitela se takođe može koristiti i dobro je poznata u ovoj oblasti. Uopšteno, humanizovana ili isprojektovano antitelo poseduje jdan ili više amino kiselinski ostataka iz izvora nehumanog porekla, e.g., ali nije limitirana samo na miša, pacova, zeca, ne-humanog primata ili druge sisare. Ovi humani amino kiselinski ostaci često se označavaju kao "import" (uvezen)i) ostaci, koji se tipično uzimaju od "import" varijabilnog, konstantnog ili nekog drugog domena poznate humane sekvence. Poznate huamne Ig sekvence su otkrivene, e.g., www.ncbi.nih.gov/entrez/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.htlm; ww.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antybodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/- pedro/research.tools.html;www. mgen.uniheidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm; wwwlibrary.thinkquest.org/12429/immune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab; www.path.cam.ac.uk/- mrc7/mikeimages.html; wwwantibodyresource.com/; wwwharvard.edu/BioLinks/Immunology.html; www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/-hcenter/indeks.html; www.biotech.ufl.edu/-hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html;wwwnal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.rn.ehime-u.ac.jp/-yasuhito/Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/links.html; www.biotesh.ufl.edu/-fcc/protocol.html; www.isacnet.org/sites_geo.html;aximt 1.imt.uni-marburg.de/-rek/ AEPStart.html; baserv.uci.kun.nl/-jraats/loinks.htm; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_ mice.html; imgt.cnusc.fr.8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/-martin/abs/index.htlm; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; wwwunizh.ch/- honegger/AHOseminar/SlideOl .html; www.cryst.bbk.ac.uk/-ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/- mrc7/humanisation/TAHHP.htlm; www.ibt.unam.mx/vir/struvture/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/- fmolina/web-pages/pept/spottech.html; www.jerin.de/fr_products.htm; www.patents.ibm.com/ibm.htm; kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, US. Dept. Health (1983), svaki kompletno obuhvaćen referencom.
Ovako importovane sekvence mogu se koristaiti za smanjenje imunogenosti ili za redukciju, pojačavanje ili modifikovanje vezivanja, afinitativnosti, "on-rate", "off-rate", avidity, specifičnosti, polu-života ili bilo koje druge poželjne karakteristike, što je poznato u ovoj oblasti. Generalno, deo ili čitave ne-humane CDR sekvence sezadržavaju dok se ne-humane sekvence varijabilnih i konstantnih regiona zamenjuju sa humanim ili drugim amino kiselinama. Antitela mogu takođe opcionalno biti humanizovane uz zadržavanje visokog afiniteta za antigen i drugih željenih biološkij osobina. Da bi se ovo postiglo, humanizovana antitela mogu se opcionalno pripremiti procesom analize roditeljskih sekvenci i različitih konceptualnih humanih proizvoda pomoću trodimenzionalnih modela roditeljskih i humanizovanih sekvenci. Trodimenzionalni modeli imunoglobulina su dostupni svima i poznati onima koji se bave ovim delom nauke. Dostupni su kompjuterski programi koji prikazuju i ilustruju pretpostavljene trodimenzionalne konformacione strukture odabranih kandidata imunoglobulinskih sekvenci. Pregled ovih prikaza omogućava analizu pretpostavljene uloge u funkcionisanju kandidata imunoglobulinske sekvence, i.e., analizu ostataka koji utiču na mogućnost imunoglobulinskog kandidata da se veže za antigen. Na ovaj način, Fr ostaci mogu se selektovati i kombinovati iz konsenzusnih i importovanih sekvenci tako daje dobiju željene karakteristike antitela kao što je na primer povećan afinitet za ciljni antigen(e). Generalno ostaci CDR su direktno suštinski uključeni u procese koji utiču na vezivanje antigena. Humanizacija ili konstrukcija antitela iz ovog pronalaska može se uraditi poznatim metodama, kao što suoni opisani u, ali nisu njima limitirani,, Winter (Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chotia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Čarter et al., Proc. Natl.Acad.Sci.USA) 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), US patent Nos: 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5,766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539,; 4816567, PCT/:US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, svaki pojedinačno je ovde kompletno obuhvaćen referencom, uključujući reference koje su citirane u tom smislu.
Anti-dual integrinsko antitelo takođe se može dobiti imunizacijom transgene životinje (e.g., miša, pacova, hrčka, ne-umanog primata, i sličnih) koje su sposobne da proizvedu repertoar humanih antitela, kao što je ovde opisano i/ili ka što je poznato u ovoj oblasti. Ćelije koje proizvode humano anti-dual antitelo mogu se izolovati iz ovakvih životinja i prevesti u besmrtno stanje pomoću odgovarajućih metoda, kao što su one opisane ovde.
Transgcni miševi koji su sposobni da proizvode repertoar humanih antitela koja se vezuju za humane antigene, može se proizvesti poznatim metodama (e.g., ali nije limitirana njima, U.S.Pat.Nos:5,770,428, 5,569,825, 5,545,806, 5,625,825, 5,633,425, 5,661,016 i 5,789,650 izdati Londberg et al.,; Jakobovits et al., VVO98/50433, Jakobovits et al., VV098/24983, Londberg et al., WO 98/24884, Londberg et al., WO 97/13852, Londberg et al., WO/ 94/25585, Kucherlapten et al., WO 96/34096, Kucherlapten et al., EP 0463 151 BI, Kucherlapten et al., EP 0710 719 Al, Surani et al., US. Pat. No. 5,545,807, Bruggemann et al., WO 90/04036, Bruggemann et al., EP 0438 474 BI, Lonbcrg et al., Nature 368:856-859 (1994), Taylor et al., Int. Immunol. 6(4)579-591 (1994), Green et al., Nature Genetics7:13-21 (1994), Mendez et al., Nature Genetics 15:146-159 (1997), Taylor et al., Nucleic Acids Research 20(23):6287-6295 (1992), Tuaillon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(8):3720-3724 (1993), Lonberg et al., Int Rev Immunol 13(1)65-93 (1995) i Fisgvvald et al., Nat. Biotechnol 14(7)845-851
(1996), svaki pojedinačno je ovde kompletno obuhvaćen referencom). Uopšteno, ovi miševi sadrže makar jedan transgen koji ima DNK iz makar jednog humanog imunoglobulinskog lokusa koji je funkcionalno rearanžiran, ili koji može podleći funkcionalnom rearanžiranju. Endogeni imunoglobulinski lokusi kod ovakvog miša mogu biti prekinuti ili deletirani da bi se eliminisala moguživotinje da proizvodiantitela koja su kodirana endogenim genima.
Pregled (screening) antitela na specifično vezivanje za slične proteine ili fragmente može se konvencionalno postići pomoću (peptide display libraries) biblioteka izloženih peptida. Ovaj metod obuhvata skrining ogromnih kolekcija peptida radi pronalaženja pojedinačnih članova koji imaju potrebne funkcije ili strukturu. Skrining antitela preko biblioteka izloženih peptida dobro je poznato u ovoj oblasti. Izložene peptidne sekvence mogu biti dugačke 3 do 5000 ili više amino kiselina, najčešće 5-100 amino kiselina, i često od 8 do oko 25 amino kiselina. Kao dodatak da bi se usmerili hemijske sintetičke metode za dobijanje peptidnih biblioteka, opisano je nekolikometoda rekombinante DNK Jedan tip uključuje izlaganje peptidne sekvence na površini bakteriofaga ili ćelije. Svaki baktcriofag ili ćelija sadrži nuklrotidnu sekvencu koja kodira određenu izloženu peptidnu sekvencu. Ovakve metode su opisane u PCT Patent Publications Nos. 91/17271, 91/18980, 91/19818 i93/08278. Drugi sistemi za dobijanje biblioteka peptida imaju aspekte obe, i hemijske sinteze i rekombinantnih metoda. Videt PCT Patent Publications Nos 92/05258, 92/14843 i 96/19256. takođe videti US Patent Publications Nos 5,658,754; i 5.643,768. Biblioteke izloženih peptida, vektor i kitovi za skrining su komercijalni i dostupni od snabdevača kao što su Invitrogen (Carlsbad, CA) i Cambridge Antibody Technologies (Cambriđgeshire, UK). Videti e.g., U.S. Pat. Nos. 4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621, 5656730, 5763733, 5767260, 5856456, dodeljeno Enzon-u; 5223409, 5403484, 5571698, 5837500, dodeljeno Dyax-u; 5427908, 5580717, dodeljeno Affymax-u; 5885793 dodeljeno Cambridge antibody Technologies;5750373 dodeljeno Genetech-u; 5618920, 5595898,5576195, 5693493, 5698417, dodeljeno Xoma-i, Colligan-u, supra; Ausbel-, supra; ili Sambrook-u, supra, svaki od gore pomenutih patenata i publikacija pojedinačno je ovde kompletno obuhvaćen referencom.
Antitela iz ovog pronalaska mogu se takođe pripremili upotrebom najmanje jedne nukleinske kiseline koja kodira anti-dual integrinsko antitelo da bi se obezbedile transgene životinje ili sisari, kao koze, krave, konji, ovce,i slične, koje proizvode ovakva antitela u svom mleku. Ovakve životinje se mogu obezbediti pomoću poznatih metoda.Videti e.g., bez limitiranja na njih, US Patent nos. 5,827,690, 5,849,992, 4,873,316, 5,849,992, 5,994,616, 5,563,362, 5,304,489, i alične, svaki pojedinačno je ovde kompletno obuhvaćen referencom.
Antitela iz ovog pronalaska mogu se dodatno pripremiti pomoću najmanje jedne nukleinske kiseline koja kodira anti-dual integrinsko antiteloda bi se dobile transgene biljke i gajene biljne ćelije (e.g., bez limitiranja na njih, duvan i kukuruz) koji proizvode takva antitela, specifične delove ili varijante u biljnim delovima ili ćelijskim kulturama od njih. Kao nelimitirajući primer. listovi transgenog duvana koji eksprimiraju rekombinantne proteine uspešno se koriste za dobijanje velikih količina rekombinantnih proteina, e.g., korišćenjem inducibilnog promotora. Videti, e.g., Cramer et al., Curr. Top. Microbiol. immunol. 240:95-118
(1999) i reference citirane u tom radu. takođe transgeni kukuruz korišćen je za
ekspresiju sisarskih proteina za potrebe komercijalne proizvodnje, sa biološkim aktivnostima ekvivalentnim onima proizvedenim u drugim rekombinantnim sistemima ili prečišćenim iz prirodnog izvora. Videti, e.g., Hood et al., Adv. Exp. med. Biol. 464:127-147 (1999) i reference koje su tu citirane.Takođe su antitela proizvedena u velikim količinama iz semena transgertih biljaka uključujući fragmente antitela, kao što su jednolančana antitela (scFv's) uključujući semena duvana i krtole krompira. Videti e.g., Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38:101-109
(1998) i reference koje su tu citirane. Tako antitela iz ovog pronalaska mogu biti proizvedena takođe pomoću transgenih biljaka, na osnovu poznatih metoda. Videti takođe,e.g., Fisher et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108 (Oct. 1999); Maet al., Trends Biotechnol. 13:522-7 (1995); Maet al., Plant Phvsiol. 109:341-6 (1995);Whitelam et al., Biochem. Soc. Trans. 22:940-944 (1994); i reference koje su tu citirane. Videti takođe opšte o biljnoj ekspresiji antitela, ali bez limitiranja na to. Svaka od gore pomenutih referenci je ovde obuhvaćena referencom.
Antitela iz ovog pronalaska mogu vezati humani dual integrin sa širokim opsegomafiniteta (KD). U poželjnijem ostvarenju, najmanje jedno humano Ma
(monoklonalno antitelo) iz ovog pronalaska može opcionalno da veže humani dual integrin sa visokim afinitetom. Na primer, humano Ma može vezati humani dualni integrin sa KDjednakim ili manjim od 10<7>M, kao , bez limitiranja na njega; 0.1-9.9 (ili bilo koji opseg ili vrednost u okviru ovoga) X 107, IO"8, IO"9, 10 10, 10 ", 10 ,2,
10"<13>, ili bilo koji opseg ili vrednost u okviru ovoga.
Afinitet ili aviditv antitela za antigen može se eksperimentalno odrediti pomoću bilo koje prigodne metode. (Videti, na primer, Berzofskv, et al., "Antibodv-Antigen Interactions," U Fundamental Immunologv, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984) Kuby, Janis, Immunologv, W. H. Freeman and Company: New York, NY (1992); i metode opisane u njima). Izmeren afinitet određenog antitela određene antitelo-antigen interakcije može da varira pod različiti uslovima (e.g., koncentracija soli, pH). Zato je poželjno da se merenje afiniteta i drugih parametara vezivanja antigena (e.g.. K0. Ka, K<i) izvodi u standardizovanim rastvorima antitela i antigena, i sa standardizovanim puferom, kao što je pufer koji je opisan ovde.
Molekuli nukleinskih kiselina
Koristeći informacije koje su ovde obezbeđene, kao što su nukleitidne sekvence koje kodiraju najmanje 70-100% dodirujućih amino kiselina najmanje od jednog SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, specificiranog fragmenta, varijanti ili njihovih konsenzus sekvenci, ili deponovanog vektora koji sadrži makar jednu od ovih sekvenci, molekul nukleinske kiseline iz ovog pronalaskakoji kodira najmanje jedno anti-dual integrinsko antitelo mogu se dobiti pomoću metoda opisanim ovde ili onim koje su poznate u ovoj oblasti.
Molekuli nukleinskih kiselina iz ovog pronalaska mogu biti u formi RNK, ka iRNK, hnRNK, tRNK ili drugoj formi, ili u formi DNK, uključujući, ali ne limitirana njima, cDNK i genomska DNK dobijene kloniranjem ili proizvedene sintetički, ili bilo koja njihova kombinacija. DNK može biti trolančana, dvolančana ili jednolančana, ili bilo koja njihova kombinacija. Bilo koji deo makar jednog lanca DNK ili RNK može biti kodirajući lanac, poznat kao "sense" lanac, ili može biti nekodirajući, poznat kao "anti-sense" lanac.
Izolovani molekuli nukleinskih kiselina ovog pronalaska mogu uključiti molekule nukleinskih kiselina koje sadrže otvoren okvir čitanja (ORF, open reading frame), opcionalno sa jednim ili više introna, e.g., ali nisu njima limitirani, makar jedan specificirani deo makar jedne CDR, kao CDR1, CDR2 i/ili CDR3 makar jednog teškog lanca (e.g., SEQ ID NOS: 1-3), ili lakog lanca (e.g., SEQ ID NOS:4-6); molekuli nukleinskih kiselina koji sadrže kodirajuće sekvence za anti-dual integrinsko antitelo ili variajbilni region (e.g., SEQ ID NOS:7,8); i molekuli nukleinskih kiselina koje obuhvataju sekvence suštinski različite od ovde opisanih u tekstu iznad, ali koje usled izrođenosti genetskog koda, ipak i dalje kodiraju anti-dual integrinsko antitelo kao što je ovde opisano i/ili je poznato u ovoj oblasti. Naravno, genetski kod je dobro poznat u nauci. Zato bi bila rutina za nekoga koje obuče za ovu oblast nauke da generiše ovakav izrođene varijante nukleinskih kiselina koje kodiraju specifična anti-dual integrinska antitela iz ovog pronalaska. Videti e.g., Ausubel et al., supra, i takve nuklinsko kiselinske varijante su uključene u ovaj pronalazak. Nelimitirajući primeri izolovanih molekula nukleinskih kiselina iz ovog pronalaska uključuju SEQ ID NOS: 10, 11, 12, 13, 14, 15, koji odgovaraju nelimitirajućim primerima kodiranja nukleinskih kiselina, istim redom, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, HC varijabilan regioni LC varijabilni region.
U drugom aspektu pronalazak obezbeđuje izolovane molekule nukleinskih kiselina koje kodiraju anti-dual integrinsko antitelo sa amino kiselinskoin sekvencom kao onom kodiranom od strane nukleinske kiseline u plazmidu deponovanom kao što su određena imena klonova
i ATCC Deposit Nos.
, tim redom, deponovano na
Kao stoje ovde ukazano, molekuli nukleinskih kiselina iz ovog pronalaska koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira anti-dual integrinsko antitelo može da uključi, ali ne da bude time limitiran, one koje same kodiraju amino kiselinske sekvence fragmenta antitela; kodirajuću sekvencu za cclo antitelo ili njegov deo; kodirajuću sekvencu za antitelo, njegov deo, fragment, kao i dodatne sekvence, kao one kodirajuće sekvence za makar jedan "signal leader" (signalni/lider peptid) ili fuzioni peptid, sa ili bez napred navedenih dodatnih kodirajućih sekvenci, kao što je makar jedan intron, zajedno sa dodatnim, nekodirajućim sekvencam, uključujući, bez limitiranja na njih, nekodirajuće 5' i 3' sekvence, kao transkribovane (one koje se prepisuju), netranslantovane (one koje se ne prevode), sekvence koje imaju ulogu u transkripciji, procesovanju (obradi) iRNK, uključujući splajsing i poliadenilacione signale (na primer- vezivanje ribozoma i stabilnost iRNK); dodatna kodirajuća sekvcnca koja kodira za dodatne amino kiseline, kao one koje obezbeđuju dodatne funkcionalnosti. Tako sekvenca koja kodira dodatne amino kiselinemože se fuzionisati sa marker sekvencom, kao što je sekvenca koja kodira peptid koji olakšava prečišćavanje fuzionisanog antitela koje sadrži njegov deo ili fragment.
Polinukleotidi koji selektivno hibridizuju sa polinukleotidom kao što je ovde opisano
Ovaj prpnalazak obezbeđuje izolovane nukleinskie kiseline koje hibridizuju pod selektivnim uslovima hibridizacije za polinukleotid koji je ovde predtavljen. Tako polinukleotidi ovog ostvarenja mogu se koristiti za izolaciju, detekciju, i/ili kvantiifkaciju nukleinskih kiselina koje sadrže ovakve polinukleotide. Na primer, polinukleotidi iz ovog pronalaska mogu se koristiti za identifikaciju, izolaciju, ili umnožavanje delimičnih klonova, ili onih čitave dužine u deponovanim bibliotekama. U nekim ostvarenjima, polinukleotidi su genomske ili cDNK sekvence izolovane, ili na drugi način komplementarne cDNK iz biblioteka nukleinskih kiselina čoveka ili siara.
Poželjno je da cDNK biblioteka sadrži najmanje 80% sekvenci kompletne dužine, poželjno najmanje 85% ili 90% sekvenci kompletne dužine, i najpoželjnije 95% sekvenci kompletne dužine. cDNK biblioteka može se normalizovati tako da se poveća prisustvo retkih sekvenci. Uslovi hibridizacija niske ili umerene jačine (stringencv) se tipično, ali ne isključivo primenjuju kod sekvenci sa smanjenom identičnošću u odnosu na komplementarne sekvence. Uslovi hibridizacija umerene ili jačine se mogu opcionalno upotrebiti za sekvence sa većom identičnošću. Uslovi niske jačine omogućavaju selektivnu hibridizaciju sekvenci sa 70% identičnosti u sekvenci i mogu se upotrebiti za identifikaciju ortologih ili paralogih sekvenci.
Opcionalno, polinukleotidi iz ovog pronalaska će kodirati makar deo antitela koje je kodirano polinukleotidima koji su ovde opisani. Polinukleotidi iz ovog pronalaskaobuhvataju sekvence nukleinskih kiselina koje se mogu koristiti za selektivnu hibndizaciju za polinukleotidom koji kodira antitelo iz ovog pronalaska. Videti, e.g., Ausubel, supra; Colligan, supra, svaki je ovde obuhvaćen referencom.
Konstruisanje nukleinskih kiselina
Izolovane nukleinske kiseline iz ovog pronalaska mogu se dobiti pomoću (a) rekombinantnih metoda (b) sintetičkim tehnikama (c) tehnikama prečišćavanja, ili njohovim kombinacijama, što je poznato u ovoj oblasti.
Nukleinske kiseline mogu zgodno da sadrže sekvence, dodatne u odnosu na polinukleotid iz ovog pronalaska. Na primer, polilinker, mesto za kloniranja koje sadrži jedno ili više restrikcionih mesta za endonukleaze, može se ubaciti u nukleinsku kiselinu da bi se pomoglo izolaciji polinukleotida. Takođe sevence koje se prevode u procesu translacije mogu se ubaciti da bi se olakšala izolacija translatovanog polinukleotida iz ovog pronalaska. Na primer, heksa-histidin marker sekvenca obezbeđuje zgodan način za prečišćavanje proteina iz ovog pronalaska. Nukleinska kiselina iz ovog pronalaska isključujući kodirajuću sekvencu, je opcionalno vektor, adapter, ili linker za kloniranje i/ili ekspresiju polinukleotida iz ovog pronalaska.
Dodatne sekvence mogu se dodati ovim sekvencama za kloniranje i/ili ekspresiju da bi se optimizovala njihova funkcija u kloniranju i/ili ekspresiji, da bi se pomogla izolacija polinukleotida, ili poboljšalo unošenje polinukleotida u ćeliju. Upotreba vektora za kloniranje, ekspresionih vektora i linkera je poznata u ovoj oblasti. (Videti, e.g., Ausubel, supra; ili Sambrook, supra).
Rekombinantne metode za konstruisanje nukleinskih kiselina
Kompozicije (sastav) izolovanih nukleinskih kiselina iz ovog pronalaska, kao RNK, cDNK, genomska DNK, ili njihova kombinacija, može se dobiti iz bioloških izvora koristeći različit broj metodologija poznatih onima koji se bave ovom oblašću. U nekim ostvarenjima, oligonukleotidne probe koje selektivno hibridizuju, pod "stringent" (strogim) uslovima, sa polinukleotidima iz ovog pronalaska, koriste se za identifikaciju željene sekvence u bibliotekama cDNK ili genomske DNK. Izolacija RNK, i konstruisanje biblioteka cDNK i genomske DNK, je dobro poznat onima sa običnim znanjem u ovoj oblasti (Videti, e.g., Ausubel, supra; ili Sambrook, supra).
Metode skrinovanja i izolacije nukleinskih kiselina
cDNK i genomske biblioteke mogu se skrinovati pomoću probe koja se bazira na sekvenci polinukleotida iz ovog pronalaska, kao što su one otkrivene ovde. Probe se mogu koristiti za hibridizaciju sa sekvencama genomske DNK ili cDNK da bi se izolovali homologi geni u istom ili drugim organizmima. Oni koji se bave ovom oblašću biće zadovoljni time što se može u eseju upotrebiti različiti stepeni "stringencv" hibridizacije; ili hibridizacijaili medijum za ispiranje mogu biti "stringent". Kako uslovi za hibridizaciju postaju sve više "stringent" (strogi), mora postojati viši stepen komplementarnosti između probe i targeta da bi se dogodilo formiranje dupleks formacije. Stepen "stringent" može se kontrolisati jednim ili više parametrom, temperaturom, jonskom jačinom, pH i prisustvom delimično denaturisanim rastvaračem kao što je formamid. Na primer "stringencv" hibridizacije se zgodno menja promenom polariteta rastvora raktanta (reactant solution), kroz na primer manipulaciju koncentracije formamida u opsegu od 0% do 50%. Stepen komplementarnosti (identitet sekvence) koji je potreban za vezivanje koje se može detektovati variraće u skladu sa "stringencv" hibridizacionog medijuma i/ili medijuma za ispiranje. Stepen komplementarnosti bi bio optimalan 100%, ili 70-100%, ili bilo koji opseg ili vrednost u okviru ove. Međutim treba da se razume da male varijacije u sekvenci probe i prajmera mogu se kompenzovati redukcijom "stringencv" medijuma za hibridizaciju i/ili ispiranje.
Metode za umnožavanje RNK ili DNK su dobro poznate u ovoj oblasti i mogu se koristiti na osnovu ovog pronalaska bez preteranog eksperimentisanja, bazirane na učenjima i vodstvu koje je ovde predstavljeno.
Poznate metode DNK ili RNK umnožavanja uključuju ali nisu njima limitirana, reakciju lančane polimeraze (PCR- Polimerase Chain Reaction) i srodni proceci amplifikacije (e.g.., U.S. Patent Nos. 4,683,195,4,683,202,4,800,159,4,965,188, za mullis et al,; 4,795,699 i 5,921,794 za Tabor, et al,; 5,142,033, za Innis; 5,122,464 za VVilson et al,; 5,091,310 za Innis; 5.066.584 za Gvllensten, et al,; 4.889,818 za Gelfand et al,; 4,994,370 za Silver et al; 4,766,067 za Bisvvas; 4,656,134 za Ringold) i RNK posredovana amplifikacija koja upoterbljava anti-sense RNK za ciljnu sekvencu kao matrica za sintezu dvolančane dNK (U.S. Patent No. 5,130,238 za Malek et al sa zaštićenom markom, imenom NASBA), kompletan sadržaj kojih referenci je obuhvaćeno ovde referencama (Videti, e.g.. Ausubel, supra; ili Sambrook, supra).
Na primer, tehnika lančane reakcije polimeraze (PCR) može da se iskoristi za umnožavanje polinukleotidnih sekvenci iz ovog pronalaska i srodnih gena direktno iz cDNK ili genomskih biblioteka. PCR i drugein vitrometode za umnožavanje mogu takođe biti od koristi na primer, za kloniranje sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju proteine koji treba da se eksprimiraju, za stvaranje nukleinskih kiselina koje će služiti kao probe za detekciju prisustva željene iRNK u uzorku, za sekvenciranje nukleinskih kiselina, i druge potrebe. Primeri tehnika koje su dovoljne da usmere obučene ljude iz ove oblasti kroz metode amlifikacije mogu se naći u Berger, supra, Sambrook, supra i Ausubel, supra, kao i Mullis te al., U.S Patent No 4,683,202 (1987); i Innis, et al., PCRProtocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). Komercijalno dostupni kitovi za genomsko PCR umnožavanje poznati su u ovoj oblasti, videti, e.g., Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech). Dodatno, e.g., T4gen 32 protein (Boehringer Manheim) može se koristiti da bi se poboljšao prinos dugih PCR proizvoda.
Sintetičke metode za konstruisanje nukleinskih kiselina
Izolovane nukleinske kiseline iz ovog pronalaska mogu se takođe pripremiti direktnom hemijskom sintezom pomoću poznatih metoda (videti, e.g., Ausubel, et al., supra). Hemijskom sintezom se generalno proizvodi jednolančani oligonukleotid, koji se može prevesti u dvolančanu DNK hibridizacijom sa komplementarnom sekvencom, ili polimerizacijom sa DNK polimerazom koja koristi kao matricu pojedinačan lanac. Neko iz ove oblasti shvatiće daje hemijska sinteza DNK ograničena na sekvence od oko 100 ili više baza, dok se duže sekvence mogu dobiti ligacijom kraćih sekvenci.
Rekombinantne ekspresionekasete
Dalje ovaj pronalazak obezbeđuje rekombinantne ekspresione kasete koje obuhvataju nukleinske kiseline iz ovog pronalaska. Sekvenca nukleinske kiseline iz ovog pronalaska, na primer cDNK ili genomske sekvence koje kodiraju antitelo iz ovog pronalaska, mogu se koristiti za konstruisanje rekombinacionih ekspresionih kaseta koje se mogu ubaciti u makar jednog željenog domaćina. Rekombinaciona ekspresiona kaseta tipično sadrži polinukleotid iz ovog pronalaska operativno povezanog sa regulatornim sekvencama inicijacije transkripcije koje će diktirati transkripciju polinukleotida u željenoj ćeliji domaćinu. Oba promotora, i heterologi i nehetorologi (l.e. endogeni) mogu sc upotrebiti za usmeravanje ekspresije nukleinskih kiselina iz ovog pronalaska.
U nekim ostvarenjima, izolovane nukleinske kiseline služe kao promotor, enhancer (pojačivač) ili neki drugi elementi, mogu se ubaciti na odgovarajući' mesto (uzvodno, nizvodno ili u intron) neheterologe forme polinukleotida iz ovog pronalaska tako da "up" ili "down" regulišu (pojačavaju ili smanjuju) ekspresiju polinukleotida iz ovog pronalaska, na primer, endogeni promotori mogu se promenitiin vivoiliin vitromutacijom, delecijom i/ili substitucijom.
Vektori i ćelije domaćini
Ovaj pronalazak takođe se odnosi na vektore koji uključuju izlovane molekule nukleinskih kiselina iz ovog pronalaska, ćelije domaćine koji su stvorene
genetičkim inžeinjerstvom sa rekombinantnim vektorima, i na proizvodnju makar jednog anti-dual integrinskog antitela rekombinantnim tehnikama, što je poznato u ovoj oblasti. Videti e.g., Sambrook, et al., supra; Ausubel, et al., supra, svaki je obuhvaćen kompletno ovde referencom.
Polinukleotidi mogu opcionalno spojeni sa vektorom koji sadrži selektivni marker za propagaciju u domaćinu, generalno, plazmidni vektor se unosi u precipitat, kao što je precipitat kalcijum fosfata, ili u kopmleksu sa naelektrisanim lipidom. Ako je vektor virus, može se upakovatiin vitropomoću odgovarajuće ćelije za pakovanje i zatim se procesom transdukcije ubaciti u ćelije domaćine. Ubačeno parče DNK trebalo bi biti operativno povezano sa odgovarajućim promotorom. Ekspresioni konstrukti dalje sadrže mesta za inicijaciju transkripcije, terminacije, i region koji se prepisuje (trenskribuje), mesto za vezivanje ribozoma u procesu translacije. Kodirajući deo zrelog transkripta koji se eksprimira od strane konstrukata uključiće (poželjno je) na početku mesto za inicijaciju translacij i terminacioni kodon (e.g., UAA, UAG ili UGA), pozicioniran na odgovarajućem mestu na kraju iRNK koja se prevodi, poželjno sa UAA i UAG za sisarsku ili eukariotsku ekspresiju.
Biće poželjno, ali opcionalno da ekspresioni vektori sadrže makar jedan selektivni marker. Ovakvi markeri uključuju rezistenciju na, e.g., ali nisu limitirani samo na njih, metotreksat (MTX), dihidrofolat reduktazu (DHFR, U.S. Patent Nos. 4,399,216, 4,634,665, 4,656,134, 4,956,288, 5.149,636; 5,179,017, ampicilin, neomicin (G418), mikofenolna kiselina, ili glutamin sintetaza (GS, UP,Pat.Nos. 5,122,464, 5,770,359; 5,827,739) za kulture eukanotskih ćelija, i gene za rezistenciju na tetraciklin ili ampicilinza gajenjeE. colii drugih bakterija ili prokariota (gore pomenuti patenti su kompletno obuhvaćeni ovde referencama). Odgovarajući medijumi za gajenje i uslovi za gore opisane ćelije domaćine poznati su u ovoj oblasti nauke. Pogodni vektori biće već očigledni onima koji se bave ovom oblašću. Na ubacivanje vektorskog konstrukta u ćeliju domaćina može se uticati sa kalcijum fosfatnom transfekcijom, DEAE-dekstran posredovanom transfekcijoni, katjonsko lilidno posredovanom transfekcijom, elektroporacijom, transdukcijom infekcijom ili drugim poznatim metodama. Ove metode su opisane u ovoj oblasti kao kod Sambrook, supra. Poglavlja 1-4 i 16-18; Ausubel, supra, Poglavlja 1,9,13,15,16.
Najmanje jedno antitelo iz ovog pronalaska može se eksprimirati u modifikovanoj formi, kao fuzioni protein, i može uključiti ne samo sekrecione signale, već i dodatne heterologe funkcionalne regione. Na primer, region sa dodatnim amino kiselinama, pogotovu onih sa naelektrisanjem, može se dodati na N-terminus antitela da bi se poboljšala stabilnost i otpornost u ćeliji domaćinu, tokom prčišćavanja, ili tokom kasnijih faza manipulacija i skladištenja. Takođe, peptidni delovi (moieties) mogu se dodati antitelu iz ovog pronalaska da bi se olakšalo prečišćavanje. Ovakvi regioni mogu se ukloniti pre finalne pripreme antitela ili makar njihovi delovi. Ovakve metode su opisane u mnogim standardnim laboratorijskim priručnicima kao kod Sambrook, supra, Poglavlja 17.29-17.42 i 18.1-18.74; Ausubel, supra, Poglavlja 16, 17, i 18.
Oni koji se bave osnovnim problemima u ovoj oblasti su upućeni u ekspresione sisteme koji su dostupni, za ekspresiju nukleinsku kiselinu koja kodira protein iz ovog pronalaska.
Alternativno nukleinske kiseline iz ovog pronalaska mogu se eksprimirati u ćeliji domaćinu pretvaranjem (manipulacijom) u ćeliji domaćinu koja sadrži endogenu DNK koja kodira antitelo iz ovog pronalasku. Ovakve metode su poznate u ovoj oblasti, e.g., kao što su opisane u US Patent Nos. 5,580,734, 5,641,670, 5.733,746 i 5,733,761, savakije obuhvaćen kompletno ovde referencom.
Sisarske ćelije predstavljaju ilustraciju ćelijskih kultura koje su korisne za proizvodnju antitela, njihovih specificiranih delova ili varijanti. Sisarski ćelijski sestemi često će biti u formi "monolavers" tj. ćelija koje su rasporođene u jednom sloju, ali mogu se koristiti i suspenzije ćelija ili bioreaktori. Veliki broj pogodnih domaćinskih ćelijskih linija koje su sposobne da eksprimiraju intaktne glikozilovane proteine razvijeno je u ovoj oblasti, i uključuje COS-1 (e.g., ATCC CRL 1650), COS-7 (e.g., ATCC CRL1651), HEK293, BHK21 (e.g., ATCC CRL - 10), CHO (e.g., ATCC CRL 1610), I BSC-1 (e.g., ATCC CRL -26) ćelijske linije, cos-7 ćelije, CHO ćelije, hep G2 ćelije, P3X63Ag8.653, SP2/0-Agl4, 293 ćelije, HeLa ćelije i slične, koje su već dostupne i mogu se nabaviti od na primer, American Type Culture Collection, Manassas, Va (www.attc.org). Poželjne domaćinske ćelijske linije uključuju one koje vode poreklo iz limfnih organa kao ćelije mieloma ili limfoma. Poželjnije domaćinske ćelijske linije su P3X63Ag8.653 ćelije (ATTC Acession number CRL-1580) i SP2/0-Agl4 (ATTC Acession number CRL-1851). U naročito poželjnijem ostvarenju rekombinantna ćelija je P3X63Ag8.653 ćelija ili SP2/0-Agl4 ćelija.
Ekspresioni vektori za ove ćelije uključuju jednu ili više od sledećih kontrolnih sekvenci, kao stoje, ali nisu limitirane na "origin" replikacije; promotor (e.g., kasne ili rane SV40 promotore, CMV promotor (US. Patent Nos. 5,168,062;
5,385,839), HSV tk promotor, pgk (fosfoglicerat kinaza) promotor, EF-1 alfa promotor (US. Patent No. 5,266,491), makar jedan humani imunoglobulinski promotor; enhancer, i/ili informativna mesta za obradu (processing information sites), kao mesto vezivanja ribozoma, mesta "splajsovanja" RNK, poliadenilovana mesta (e.g., SV40 velika T Ag poli A dodatno mesto - large T Ag poly A adition site), i sekvence za terminaciju transkripcije. Videti, e.g., Ausubelet al., supra; ili Sambrook et al., supra. Druge ćelije koje se mogu koristiti za proizvodnju nukleinskih kiselina ili proteina iz ovog pronalaskatakođe su poznate i/ili dostupne, kao na primer, kod American Type Collection catalogue of cell Lines and Hybridomas (www.atcc.org) ili nekog drugog poznatog izvora.
Kada se upotrebljavaju eukariotske domaćinske ćelije, karakteristično je da se u
vektor ubacuju sekvence za poliadenilaciju ili terminaciju. Primer za sekvencu za terminaciju je poliadenilatna sekvenca iz goveđeg gena za hormon rasta, takođe se mogu uključiti i sekvence za tačno "splajsovanje" transkripta. Primer za sekvencu za splajsovanje je VP1 intron iz SV40 (Sprague, et al., J. Virol. 45:773-781
(1983)). Dodatno genske sekvence za kontrolu replikacije u ćeliji domaćinu takođe se mogu ugraditi u vektor, kao stoje poznato u ovoj oblasti.
Prečišćavanje antitela
Anti-dual integrinsko antitelo može se izdvojiti i prečistiti iz kultura rekombinantnih ćelija poznatim metodama, uključujući, ali ne njima limitiran, prečišćavanje proteinom A, precipitacija amonijum sulfatom ili etanolom, kiselinska ekstrakcija, hromatografija izmenom anjona i katjona, fosfocelulozna hromatografija, hromatografija pomoću hidrofobne interakcije, afinitativna hromatografija, hidroksilapatit hromatografija i lecitinska hromatografija. High performance liquid chromatography (HPLC) (tečna hromatografija visoke performabnse), može se takođe upotrebiti. Videti, e.g., Colligan Current Protocols in Immunology, ili Current Protocols in Protein Science, John Wiley& Sons, NY, NY (1997-2000), e.g., Poglavlja 1, 4, 6, 8, 9, 10, savaki je obuhvaćen kompletno ovde referencom.
Antitela iz ovog pronalaska obuhvataju prirodno prečišćene proizvode, proizvode dobijene hemijskim sintetičkim procedurama, i proizvode dobijene rekombinantnim tehnikama iz eukariotskog domaćina, uključujući, na primer ćelije kvasca, viših biljaka, insekata i sisara. U zavisnosti koji se domaćin koristi u procedurama rekombinantne proizvodnje, antitelo iz ovog pronalaska može biti glikozilovano ili može biti neglikozilovano, ali je glikozilovano poželjnije. Ovakve metode opisane su u mnogim laboratorijskim priručnicima, ka Sambrook, supra, odeljci 17.37-17.42; Ausubel. supra, poglavlja 10, 12, 13, 16, 18 i 20, Colligan, Protein Science, supra, poglavlja 12-14, obuhvaćeni kompletno ovde referencom
Anti-dual integrinska antitela
Izolovana antitela iz ovog pronalaska sadrže amino kiselinske sekvence antitela otkrivene ovde koje su kodirane pogodnim polinukleotidom ili bilo kojim izolovanim ili pripremljenim antitelom. Poželjno je da humano antitelo ili fragment koji vezuje antigen, vezuje humani dualni integrin, i tako delimično ili u potpunosti neutrališe makar jednu biološku aktivnost proteina. Antitelo, ili njigov specificiran deo ili varijanta, koji delimično ili poželjnijeu potpunosti neutrališe makar jednu biološku aktivnost makar jednog dual integrinskog proteina ili njegovog fragmenta, može da vezuje protein ili fragment i tako inhibira aktivnosti posredovane kroz vezivanje dual integrina za receptor za dual integrin ili krozdruge dual integrin-zavisne ili posredovane mehanizme. Ovde upotrebljen izraz "neutrališuće antitelo" odnosi se na antitelo koje može da inhibirabilo koju dual integrin zavisnu aktivnost za oko 20-120%, poželjno za oko 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ili više u zavisnosti od eseja. Kapacitet anti-dual integrinskog antitela da inhibira dual integrin zavisnu aktivnost poželjno je da se proceni makar jednim dual integrin protein ili receptor esejom kao stoje ovde opisano i/ilije poznato u ovoj oblasti. Humano antitelo iz ovog pronalaska može pripadati bilo kojoj klasi (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, itd) ili izotop i može da sadrži kappa ili lambda laki lanac. U jednom ostvarenju, humano antitelo sadrži IgG teški lanac ili njegov definisan deo, na primer, makar jedan od izotipova, IgGl, IgG2, IgG3 ili IgG4. Antitela ovog tipa mogu se pripremiti upotrebom transgenog miša ili drugog transgenog ne-humanog sisara koje sadrži makar jedan humani transgeni lak lanac (e.g., IgG, IgA i IgM (e.g., yl, -y2, y3, y4)) kao što je ovde opisano i/ili poznato u ovoj oblasti. U drugom ostvarenju anti-human dual integrinsko humano antitelo sadrži IgGl teški lanac i IgGl laki lanac.
Makar se jedno antitelo iz ovog pronalaska vezuje za makar jedanspecificiran epitop koji je specifičan za makar jedan dual integrin protein, njegovu subjedinicu fragment, deo ili bilo koju kombinaciju istih. Makar jedan epitop može da sadrži makar jedan region za vezivanje antitela koji sadržimakar jedan deo pomenutog proteina, poželjno je de taj epitop sadrži makar jedan ekstracelularan, solubilan, hidrofilan, eksterni ili citoplazmatski deo pomenutog proteina. Makar jedan specificirani epitop može da sadrži bilo koju kombinaciju makar jedne amino kiselinske sekvence od najmanje 1-3 amino kiseline os sveukupnog specificiranog dela susednih amino kiselina od SEQ TD NOS: 9, 16 ili 17.
Generalno, humano antitelo ili fargment za vezivanje antigena iz ovog pronalaska sadržaće region za vezivanje antigena koji sadrži makar jedan humani region za određivanje komplementarnosti (complementaritv determining region ) (CDR, CDR2 ili CDR3) ili varijantu makar jednog varijabilnog regiona teškog lanca i makar jednog humanog regiona za određivanje komplementarnosti (CDR, CDR2 ili CDR3) ili varijante makar jednog varijabilnog regiona lakog lanca. Kao nelimitirajući primer antitelo ili deo za vezivanje antigena ili varijanta mogu sadržati makar jedan CDR3 teškog lanca sa amino kiselinskom sekvencom SEQ ID NOS:3, i/ili CDR3 lakog lanca sa amino kiselinskom sekvencom SEQ ID NOS:6. U posebnom ostvarenju antitelo ili fargment za vezivanje antigena mogu imati region za vezivanje antigena koji sadrži makar deo makar jednog CDR teškog lanca (i.e., CDR, CDR2 i/ili CDR3) sa aminokiselinskom sekvencom odgovarajućih CDR 1, 2 i/ili 3 (e.g., SEQ ID NOS:l, 2 i/ili 3). U drugom naročitom ostvarenju, antitelo ili deo za vezivanje antigena ili varijanta mogu imati region za vezivanje antigena koji sadrži makar deo makar jednog CDR lakog lanca (i.e., CDR, CDR2 i/ili CDR3) sa aminokiselinskom sekvencom odgovarajućih CDR 1, 2 i/ili 3 (e.g., SEQ ID NOS:4,5, i/ili 6). U poželnijem ostvarenju tri CDR-a teškog lanca i tri CDR-a lakog lanca antitela ili fargmena za vezivanje antigena imaju amino kiselinsku sekvencu odgovarajućeg CDR- od makar jednog od Ma Gen 095, Gen 101, CNTO 95, C372A, kao što je ovde opisano. Ovakva antitela mogu se pripremiti hemijskim pripajanjem različitih delova (e.g., CDR-a, framework) antitela pomoću konvencionalnih tehnika pripremom i ekspresijom (jednog ili više) molekula anuklinskih kiselina koje kodiraju antitelo pomoću konvencionalnih tehnika rekombinantne DNK tehnologije ili pomoću bilo koje druge odgovarajuće metode.
Anti-dual integrinsko antitelo može da sadrži makar jedan od varijabilnih regiona lakog ili teškog lanca sa definisanom amino kiselinskom sekvencom. Na primer, u poželjnom ostvarenju, anti-dual integrinsko antitelo sadrži najmanje jedan varijabilnih region teškog lanca, opcionalno ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NOS:7 i/ili makar jedan varijabilnih region lakog lanca, opcionalno ima aminokiselinsku sekvencuSEQ DD NOS:8. Antitela koja se vezuju za humani dual integrin i koji obuhvataju definisan varijabilnih region teškog lanca ili lakog lancamogu se pripremiti odgovarajućim metodama, kao što je izlaganje faga (phage displav) (Katsube, Y., et al., Int. J. Mol. Med, l(5):863-868 (1998)) ili pomoću metoda sa transgenim životinjama kao one poznate u ovoj oblasti i/ili koje su ovde opisane. Na primer transgeni miš, koji sadrži funkcionalno rearanžiran ttransgen za težak lanac humanog imunoglobulina i transgen koji sadrži DNK iz humanog imunoglobulinskog lokusa za lak lanac koji može podvrći funkcionalnom rearanžiranju, može biti imunizovan sa humanim dualnim integrinom ili njegovim fragmentom da bi se izivala produkcija antitela. Ako je potrebno ćelije koje proizvode antitela mogu se izolovati i hibridome ili druge besmrtne ćelije koje proizvode antitela mogu se pripremiti kao što je ovde opisano iOili kao stoje poznato u ovoj oblasti. Alternativno, antitelo, specificiran deo ili varijanta mogu se eksprimirati pomoću nukleinske kiseline ili njenog dela u pogodnoj domaćinskoj ćeliji.
Ovaj pronalazak odnosi se takođe na antitela, fargmente za vezivanje antigena, imunoglobulinske lance i amino kiseline koje sadrže CDR-e u sekvenci koja je u suštini ista kao amino kiselinska sekvenca ovde opisana. Poželjno je da takva antitela, fargmenti za vezivanje antigena i antitela koja sadrže takve lance ili CDR-e mogu vezati humani dual integrinsa visokim afinitetom (e.g., KDmanja od ili jednaka oko 10<9>M). Sekvence amino kiselina koje su suštinski iste kao sekvenceovde opisane uključuju sekvence koje sadrže konzervativnie substitucije amino kiselina, kao i delecije i/ili insercije amino kiselina. Konzervativnie substitucije amino kiselinaodnosi se na zamenu prve amino kiseline drugom amino kiselinom koja posedujc hemijske i/ili fizičke osobine (e.g., šarža, struktura, polaritet, hidrofobnost/hidrofilnost) slične onima koje poseduje prva amino kiselina. Konzervativne substitucije uključuju zamenu jedne amino kiseline sa drugom u okviru sledećih grupa: lizin (K), arginin (R) i histidin (H); aspartat (D) i glutamat (E); asparagin (N), glutamin (Q), serin (S), treonin (T), tirozin (Y), K, R, H, D i E; alanin (A), valin (V), leucin (L), izoleucin (I), prolin (P), fenilalanin (P), triptofan (W), metionin (M), cistein (C) i glicin (G); F, W i Y; C, S iT.
Amino kiselinskikodovi
Amino kiseline koje ulaze u satav anti-dual integrinskog antitela iz ovog pronalaska se često predstavljaju skraćenicama. Označavanje amino kiselina može biti usmereno ka tome da se svaka amino kiselini predstavi kodom od jednog slova, tri slova, imenom, ili kodonom(ima) od tri nukleotida kao što se radi u ovoj oblasti (see Alberts, B., et al., Molecular Biologv of The Cell, Third Ed., Garland Publishing, Inc., New York, 1994)
Anti-dual integrinsko antitelo iz ovog pronalaska može da uključi jednu ili više amino kiselinskih substitucija, delecija ili adicija, ili usled prirodnih mutacija ili zbog čovekove manipulacije, kao što je ovde specificirano.
Naravno obučena osoba učiniće da broj amino kiselinskih substitucija zavisi od mnogih faktora, uključujući gore opisane. Uopšteno govoreći broj amino kiselinskih substitucija, insercija ili delecija za bilo koje dalo anti-dual integrinsko antitelo neće biti veće od 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, kao 1-30 ili bilo koji opseg u okviru tih vrednosti kao što je ovde specificirano.
Amino kiseline iz anti-dual integrinskog antitela iz ovog pronalaska , koje su esencijalne za njegovo funkcionisanje, mogu se identifikovati metodama koje su poznate u ovoj oblasti, kao stoje "site direeted" mutageneza ili 2alanine-scanning" mutageneza (e.g., Ausubel, supra, Poglavlje 8, 15; Cunningham and VVells, Science 244:1081-1085 (1989). Na osnovu druge procedure uvode se pojedinačne alaninske mutacije na svakom ostatku molekula. Mutantni molekuli koji se dobiju, zatim im se testiraju biološke aktivnosti, kao na primer ali nisu njime limitirane, neutrališuća aktivnost dual integrina. Mesta koja su kritična za vezivanje antitela mogu se takođe identifikovati strukturnom analizom kao kristalizacijom, nukleaernom magnetnom rezonancom ili fotoafinitativnim obeležavanjem (Smith, et al., J. Mol Biol. 224:899-904 (1992) i de Vos et al., Science 255:306-312
(1992)).
Anti-dual integrinsko antitelo iz ovog pronalaska može da uključiti, ali bez limitiranja, makar jedan deo, sekvencu ili kombinaciju od 5 do svih susednih amino kiselina od makar jedne SEQ ID NOS : 1, 2, 3, 4, 5, 6.
Anti-dual integrinsko antitelo može dalje opcionalno da sadrži polipeptid od najmanje 70-100% susednih amino kiselina makar jedne SEQ ID NOS: 7, 8.
U jednom ostvarenju amino koselinska sekvenca imunoglobulinskog lanca, ili njegovog dela (e.g., varijabilni deo, CDR) poseduju 70-100% identičnosti (e.g., 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90^ 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ili bilo koji opseg u okviri tih vrednosti), sa amino kiselinskom sekvencom odgovarajućeg lanca makar jedne SEQ ID NOS :7, 8. Na primer, amino kiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca može se uporediti sa SEQ ID NOS :8, ili se amino kiselinska sekvenca CDR- teškog lanca može se uporediti sa SEQ ID NOS :7. Poželjno je daje određena 70%; amino kiselinske identičnost (i.e., 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ili bilo koji opseg u okviri tih vrednosti) pomoću odgovarajućeg kompjuterskog algoritma, kao što jr poznato u ovoj oblasti.
Uzorak sekvenci varijabilnih regiona teškog i lakog lanca obezbeđeni su u SEQ ID NOS :7, 8. Antitela iz ovog pronalaska, ili njihovi specificirani delovi, mogu da obuhvate bilo koji broj susednih amino kiselinskih ostataka iz antitela iz ovog pronalaska, naznačeno time daje broj odabran iz grupe celih brojeva koja sadrži 10-100% susednih ostataka u anti-dual integrinskom antitelu. Opcionalno, ovaj niz susednih amino kiselina je najmanje 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, ili više amino kiselina u dužini, ili bilo koji opseg ili vrednost u okviru ovoga, dalje, broj ovakvih sekvenci može biti bilo koji celi broj selektovan iz grupe koja se sastoji od 1-20, kao najmanje 2, 3, 4, ili 5.
Oni iz ove oblasti ceniće što ovaj pronalazak uključuje makar jedno biološki aktivno antitelo iz ovog pronalaska. Biološki aktivna antitela imaju specifičnu aktivnost od 20%, 30%, ili 40% , poželjno je 50%, 60%, ili 70%, i najpoželjnije 80%, 90%, ili 95%-1000% od nativnog i (ne-sintetičkog), endogenog ili srodnog i poznatog antitela. Metodi eseja i kavntifikovanje rezultata enzimatske aktivnostii substratne specifičnosti, poznate su onima koji se bave ovom oblašću.
U drugom aspektu, ovaj pronalazak odnosi se na humana antitela i fragmenta za vezivanje antigena, ko što je ovde opisano, koja se modifikovana tako što je kovalentnim vezivanjem dodato organsku polovina. Ovakve modifikacije modu proizvesti antitelo li fragment za vezivanje antigena sa poboljšanim farmakokinetičkim osobinama (e.g., produženin vivopoluživot seruma). Organska polovina može biti linearna ili razgranata hidrofilna polimerna grupa, masno kiselinska grupa, ili masno kiselinska estarska grupa. U posebnom ostvarenju, hidrofilna polimerna grupa može imati molekulsku težinu od 800 do oko 120,000 Daltona i može biti polialkan glikol, (e.g., polietilen glikol (PEG)), polipropilen glokol (PPG), karbohidratni polimer, amino kiselinski polimer ili polivinilni pirolidon, i masna kiselina ili estar masne kiseline množe obuhvatiti od osam do oko četrdeset atoma ugl jenika.
Modifikovana humana antitela i fragmenti za vezivanje antigena iz ovog pronalska mogu da sadrže jedan ili više organskih delova koji su kovalentno vezani, direktno ili indirektno, za antitelo. Svaki organski deo koji je vezan za antitelo ili fragment za vezivanje antigen iz ovog pronalaska može nezavisno biti hidrofilna polimerna grupa, masno kiselinska grupa, ili masno kiselinska estarska grupa. Kao što se ovde koristi izraz "masna kiselina" obuhvata monokarboksilne kiseline i dikarboksilne kiseline. "Hidrofilna polimerna grupa", izraz koji se ovde koristi, odnosi se na organski polimer koji je bolje rastvorljiv u vodi nego u oktanu. Tako antitelo modifikovano kovalentnim vezivanjem polizina je obuhvaćeno ovim pronalaskom. Hidrofilni polimeri pogodni za modifikovanje antitela ovog pronalaska mogu biti linerarni ili razgranati, i oduhvataju na primer, polialkan glikole (e.g., PEG, monometoksi-polietilen glikol (mPEG), PPG i slične), ugljene hidrate (e.g., dekstran, celuloza, oligosaharidi, polipropilen oksid i slični) i polivinil pirolidin. Poželjno je da hidrofilni polimer koji modifikuje antitelo iz ovog pronalaska ima molekulsku težinu od oko 800 do oko 150,000 Daltona kao odvojen molekularni entitet. Može se koristiti na primer PEG50ooi, PEG20.000. naznačeno time da je zbir prosečna molekularna težine polimera u daltonima. Hidrofilna polimerna grupa može se zameniti sa jednom ili oko šest alkil grupa, grupa masnih kiselina ili grupa estara masnih kiselina. Hidrofilni polimeri koji su subtituisani sa grupama masnih kiselina ili estarskim grupama mogu se pripremiti pomoću odgovarajućih metoda. Na primer, polimer koji sadrži amino grupu može se povezatisa karboksilatom masne kiseline ili estra masne kiseline, i aktiviran karboksilat (e.g., aktiviran sa N, N-karbonil diimidazolom) iz masne kiseline ili estra masne kiseline može se povezali hidroksilnom grupom na polimeru.
Masne kiseline ili estri masnih kiselina koji su pogodni za modifikovanje antitela iz ovog pronalaska mogu biti saturisani ili sadrže jednu ili viže jedinica nesturacije. Masne kiseline koje su pogodne za modifikovanje antitela iz ovog pronalaska uključuju, na primer, n-dodekanoat (C]2, laurat), n-tetradekanoat ( Cu, arahidat), n-oktadekanoat (C,8, stearat), n-eikosanoat (C20,arahidat), n-dokosanoat (C22, behenat), n-triakontanoat (C30), n-tetrakontanoat (C40), cis-A9-oktadekanoat (C,8, oleat), svi c/_>-A5,8,l 1,14-eikosatetraenoat (C2U, arahidonat), oktandioična kiselina, tetradekandioična kiselina, oktadekandioična kiselina, dokosandioična kiselina, i slične. Pogodni estri masnih kiselina uključuju mono-estre dikarboksilnih kiselina koje sadrže linearnu ili granajuću nižu alkil grupu, niža alkil grupa može da obuhvati od jedan do oko dvanaest, poželjno je jedan do oko šest atoma ugljenika.
Modifikovana humana antitela i fragmenti za vezivanje antigena mogu se pripremiti pogodnom metodom, kao što je reakcija sa jednim ili više modifikujućih agensa. "Modifikujući agens", izraz koji se koristi ovde, odnosi se na pogodnu organsku grupu (e.g., hidrofilni polimer, masna kiselina, estar masne kiseline) koja sadrži aktivirajući!grupu. "Aktivirajuća grupa" je hemijski deo ili funkcionalna grupa koja može pod odgovarajućim uslovima, može da reaguje sa drugom hemijskom grupom i tako formira kovalentnu vezu između modifikujućeg agensa i druge hemijske grupe. Na primer, amin reaktivne aktivirajuće grupe uključuju elektrofilne grupe kao što su tozilat, mezilat, halo (hloro, bromo, fluoro, jodo), N-hidroksisukcinimidil estri (NHS) i slični. Aktivirajuće grupe koje mogu reagovati sa tiolima, uključuju, na primer, maleimid, jodoacetil, akrilolil, piridil disulfide, tiol 5-tiol-nitrobenzoične kiseline (TNB-tiol), i slični. Aldehidna funkcionalna grupa može se povezati sa molekulima koji sadrže amin- ili hidrazid, i azidna grupa može da reaguje sa trovalentnom fosforskom grupom i dobij a se fosforamiđalna ili fosforimidna povezivanja. Pogodne metode za ubacivanje aktivirajućih grupa u molekule poznati su u ovoj oblasti (videti na primer, Hermanson, G. T., Bioconjugate Tchniques, Academic Press; san Diego, CA
(1996)). Aktivirajuća grupa može direktno biti vezana za organsku grupu (e.g., hidrofilni polimer, masna kiselina, estar masne kiseline), ili preko linkerskog dela, na primer dvovalentne CrCi2grupe, naznačeno time da se jedan ili više atoma ugljenika mogu zameniti heteroatomom kao što je, kiseonik, azot ili sumpor. Pogodan linkerski deo uključuje na primer, tetraetilen glikol , -(CH2)r, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-NH i -CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-NH-. Modifikujući agensi koji sadrže linkerski deo mogu se proizvesti, na primer, reakcijom mono-Boc-alkildiamina (e.g., mono-Boc-etilendiamin, mono-Boc-diaminoheksan) sa masnom kiselinom u prisustvu l-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid (EDC) da bi se formirala amidna veza između slobodnog amina i karboksilata masne kiseline. Boe zaštitna grupa može se ukloniti iz produkta tretiranjem sa trifluoracetilnom kiselinom (TFA) da bi se otkrio primarni amin koji se može povezati sa drugim karboksilatom kao što je opisano, ili može da reaguje sa maleičnim anhidridom i dobijeni proizvod preveden u cikolični oblik (cvelized) da bi se dobio aktiviran malemido derivat masne kiseline. (Videti za primer, Thompson, et al., WO 92/16221 kompletno učenje koje je obuhvaćeno ovde referencom).
Modifikovana antitela iz ovog pronalaska mogu se proizvesti reakcijom humanog antitela ili fragmenta za vezivanje antigena sa modifikujućim agensom. Na primer organski delovi mogu se vezati za antitelo na "non- site" specifični način upotrebom amin-reaktivnog modifikujućeg agensa, na primer, NHS estar ili PEG. Modifikovana humana antitela ili fragmenti za vezivanje antigena mogu se takođe pripremiti redukujući disulfidne veze (e.g., disulfidne veze između lanaca) antitela ili fragmenti za vezivanje antigena. Redukovano antitelo ili fragmenti za vezivanje antigena mogu reagovati sa tiol-reaktivnim modifikujućim agensom da bi se proizvelo modifikovano antitelo iz ovog pronalaska. Modifikovana humana antitela ili fragmenti za vezivanje antigena koji sadrže organski deo koji je vezan za specifično mesto na antitelu iz ovog pronalaska mogu se pripremiti uz pomoć pogodnih metoda, kao što je reverzna proteoliza (Fisch et al., Bioconjugate Chem. 3:147-153 (1992; Werlen et al., Bioconjugate Chem. 5:411-417 (1994); Kumaran et al., Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1997); Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(l):59-68
(1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463( 1997)), i metode opisane u Hermanson, G. T, Bioconjugate Tehniques, Academic Press:San Diego , CA (1996).
ANTI-IDIOTIPANTITELA NA SASTAV ANTI-DUAL INTEGRINSKOG ANTITELA
Pored monoklonalnih ili himernih anti-dual integrinskih antitela, ovaj pronalazak je usmeren takođe ka anti-idiotipskom (anti-Id) antitelu koje je specifično za takva antitela iz pronalaska. Anti-Id antitelo je antitelo koje prepoznaje jedinstvene determinante koje su generalno povezane sa regionom za vezivanje antigena drugog antitela. Anti-Id se može pripremiti imunizacijom životinje iste vrste i genetičkog tipa (e.g., mišija linija) kao što je i izvor Id antitela sa antitelom ili njegovim regionom koji sadrži CDR. Imunizovana životinja će prepoznati i odgovoriti na idiotipske determinante imunizujućeg antitela i proizvoditi anti-Id antitelo. Anti-Id antitelo može se takođe upotrebiti kao "imunogen" za indukciju imunog odgovora u nekoj drugoj životinji, i tako će se proizvesti takozvano anti-anti-Iđ antitelo.
SASTAV ANTI-DUAL INTEGRINSKOG ANTITELA
Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje makar jedan sastav anti-dual integrinsko antitela koji sadrži makar jedno, makar dva, makar tri, makar četiri, makar pet, makar šest ili više anti-dual integrinska antitela od njih, kao što je opisano ovde, i/ili poznato u ovoj oblasti, koja su obezbeđena u kompoziciji, mešavini ili formi koja se ne pojavljuje u prirodi. Ovakve kompozicije obuhvataju kompozicije koje se ne pojavljuju u prirodi koje sadrže makar jednu ili dve kompletne dužine, C-i/ili N- deletirane varijane, domena, fragmenta ili specificirane varijante, anti-dual integrinske amino kiselinske sekvence iz grupe koja se sadrži 70-100% susednih amino kiselina SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili njihovih specificiranih fragmenata, domena ili varijanti. Poželjniji sastavi anti-dual integrinskog antitela uključuje makar jedan ili dva kompletne dužine, fragmenta, domena ili varijante makar jednog CDR ili LBR, koji sadrže delove sekvence anti-dual integrinskog antitela od 70-100% SEQDIDnNOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, ili njihovih specificiranih fragmenata, domena ili varijanti. Još poželjnija kompozicija obuhvata 40-99% makar jedne od SEQnIDDNOS:l, 2, 3, 4, 5, 6, ili njihovih specificiranih fragmenata, domena ili varijanti. Ovakvi kompozicioni procenti su u težini, zapremini, koncentraciji, molantetu ili molalitetu kao tečnih ili suvih rastvora, mešavina, suspenzije, emulzija ili koloida, kao što je poznato u ovoj oblasti ili je ovde opisano.
Kompozicije iz ovog pronalaska anti-dual integrinskog antitela dalje mogu da obuhvate makar jednu od pogodnih i efektivnih količina kompozicije ili farmaceutske kompozicije koja sadrži makar jedno anti-dual integrinsko antitelo od ćelije, tkiva, organa, životinje ili pacijenta sa potrebom za ovakvu modulaciju, tretman ili terapiju, opcionalno dalje sadrži makar jedan selektovam iz makar jednog TNF antagonista (e.g., ali bez limitacije na TNF antitelo ili fragment, solubilan TNF receptor ili fragment, njegov fuzioni proteinjli mali molekul TNF antagonista), antireumatika (e.g., metotreksat, auranofin, aurotioglukoza, azatioprin, etanercept, zlato natrijum tiomalat, hidroksihlorokin sulfat, leflunomid, sulfasalzin), mišićnog relaksanta, narkotika, ne steroidnog anti-inflaminatornog leka (NSAED), analgezika, anestetika, sedativa, lokalnog anestetika, neuromišićnog blokatora, antimikrobialnog (e.g., aminoglikozid, antifungalni, antiparazitski, antiviralni, karbapenem, cefalosporin, flurorkinolon, makrolid, penicilin, sulfonamid, tetraciklin, drugi antimikrobijski), antipsoriatika, kortikosteroida, anaboličkog steroida, agensa povezanog sa dijabetesom, mineralnog, hranljivog, tiroidnog agensa, vitamina, hormona vezanog za kalcijum, antidiarealnog, antitusivnog (antitussive), "antiemetic", antiulceroznog, laksativnog, antikoagulantnog, eritropieitina (e.g., epoetin alfa), "filgastrim" (e.g., G-CSF, Neupogen), sargamostina (GM-CSF, Leukine), imunizacije, imunoglobulina, imunosupresora, (ežg., basilixmab, ciklosporin, daklizumab), hormona rasta, lek za zamenu hormona, modulator hormona za estrogen, midriatik, cikloplegik, alkilirajući agens, antimetabolit, ihibitor mitoze, radiofarmaceutikala, antidepresiva, antimanijačnog agensa, antipsihotika, anksiolitika, hipnotika, simpatomimetika, stimulanata, donepezil, takrin, lekova za astmu, beta antagonista, steroida za udisanje, inhibitora za leukotriena, metilksantina, kromolina epinefrina ili analoga, dornaze alfa (pulmozvme), citokina ili citokin antagonista ili antitela. Nel imitiraj ući primeri ovakvih citokina uključuju ali nisu njima limitirani, bilo koji IL-1, IL-23, JJL-6, anti tumorska antitela, hemoterapeutske agense, ili radiacione terapije. Pogodne doze su poznate u ovoj oblasti. Videti, e.g., Wells et al., eds., Pharmacotherapv handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia (2000), Deluxe edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000), svaka referenca je obuhvaćena ovde referencom.
PREKIDTEKSTA
Ovakve anti-kancerogene ili anti-infektivne mogu uključiti molekule toksina koji su povezani, vezani, ko-formulisani, zajedno se daju, sa makar jednim antitelom iz ovog pronalaska. Toksin opcionalno može da selektivno ubije patološku ćeliju ili tkivo. Ovakvi toksini mogu biti ali nisu njima limitirani, prečišćeni ili rekombinantni toksini ili njihovi fragmenti koji sadrže makar jedan citotoksični domen toksina, e.g., selektovan od jednog od sledećih: toksin ricina, difterije, "venom" (otrov iz zmije, pauka, škorpije i sličnih životinja) toksin ili bakterijski toksin. Izraz toksin takođe uključuje oba endotoksine i egzotoksine koje proizvodi bilo koja prirodna, mutantna ili rekombinantna bakterija ili virusi, koji mogu da izazovu bilo koje patološko stanje u čoveku ili drugim sisarima, uključujući toksinski šok, koji može da se završi smrću. Ovakvi toksini mogu da uključe, ali nisu njima limitirani, enterotoksikogeni toplptno osetljiv enterotoksinE. coli(LT), toplotno stabilan enterotoksin (ST), citotoksin izShigella,enterotoksini izAeromonas- a,toksin-1 toksičnog šok sindroma (TSST-1), stafilokokni enerotoksin A (SEA), B (SEB), ili CD(SEC), streptokokni enterotoksini i slični. Ovakve bakterije uključuju, ali nisu njima limitirane, bakterijske sojeve vrsta enteroksigenskaE. coli(ETEC), enterohemoralgičnaE. coli(e.g., sojevi serotipa 0157:H7),Staphyllococcusspecies (e.g.,Staphyllococcus aureus, Staphyllococcus pyogenes), Shigellaspecies ( e.g.,Shigella dysente. riae, Shigella flexneri, Shigella hoydiiiShigella sonnei), Salmonellaspecies (e.g.,Salmonella typhi, Salmonella cholera- suis, Salmonella eneritidis), Clostridiumspecies (e.g.,
Clostridium perfringes, Clostridium dificile, Clostridium botulinum),
Camphlobacterspecies (e.g.,Camphlobacter je juni, Camphlobacterfetus),Helicobacterspecies (e.g.,Helicobacter pylori), Aeromonasspecies (e.g.,
Aeromonas sobria, Aeromonas hydrophylla, Aeromonas caviae), Pleisomonas
shigelloides, Yersinia enterocolitica, Vibriosspecies (e.g.,Vibrios cholerae, Vibrios parachemolyticus), Klebsiellaspecies,Pseudomonas aeruginosa,iStreptococci.Videti e.g., Stein, ed., INTERNAL MEDICINE, 3rd ed., pp 1-13, Little, Brown and Co., Boston (1990); Evans et al., eds., Bacterial Infectious of Humans: Epidemiologv and Controi, 2nd ed., pp 239-254, Plenum Medcal Book Co., New York (1991); Mandell et al., Principles and Practicc of Infectious Diseases, 3rd Eđ., Churchill Livingstone, New York (1990); Berkow et al., eds., The Merck Manual, 16th edition, Merck anđ Co., Rahway, N.J., 1992; Wood et al., FEMS Microbiology Immunology, 76:121-134 (1991); Marrack et al, Science, 248:705-711 (1990), sadržaj čije su reference kompletno obuhvaćene referencom ovde.
Anti-dual integrinsko antitelo tj njegova jedinjenja, sastav ili njihova kombinacija iz ovog pronalaska može dalje da sadrži makar jedan od pomoćnih delova kao što je, ali nije njime limitiran na razblaživač, onaj koji vezuje "binder", stabilizator, puferi, soli, liofilizovani rastvarači, prezervativi, adjuvant ili slični, poželjne su farmaceutski prihvatljivei pomoćne substance. Nelimitujući primeri i metode za pripremanje ovakvih sterilnih rastvora poznac su u ovoj oblasti, kao na primer, ali bez limitiranja, Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sc iencee, 18th Edition, Mack publishing Co. (Easton, PA) 1990. Farmaceutski prihvatljivi nosači mogu se rutinski selektovani, koji su pogodni za načine administracije, solubilnost i/ili stabilnost anti-dual integrinskog antitela, njegovog fragmenta ili varijante njegove kompozicije kao što je poznato u ovoj oblasti ili je ovde opisano.
Farmaceutski ekspicijeni i aditivi korisni za ovde opisanu kompoziciju uključujuu, bezi limitiranja, proteine, peptide, amino kiseline, lipide, i ugljene hidrate (e.g., šećeri, uključujući monosaharide, di-, tri-, tetra- i oligosaharide; derivate šećera kaošto su alditoli, aldolne kiseline, esterifikovane šećere i slične; i polisaharide ili polimere šećera), koji mogu biti prisutni pojedinačno ili u kombinaciji, sadržavajući sami ili u kombinaciji 1-99.99% po težini ili zapremini. Egzemplarni proteinski ekspicijenti uključuju serum albumin ka humani serum albumin (HSA), rekombinantni humani albumin (rHA), želatin, kazein, i slični. Reprezentativne komponente amino kiseline/antitela, koje takođe mogu funkcionisati u puferskom kapacitetu (buffer capacitv), uključuju alanin, glicin, arginin, betain, histidin, glutaminska kiselina, aspartanska kiselina, cistein, lizin, leucin, izoleucin, valin, metionin, fenilalanin, aspartam, i slične. Jedna amino kiselina koja je poželjna je glicin.
Ugljeno-hidratni ekspicijenti pogodni za upotrebu u ovom pronalasku uključuju, na primer, monosaharide kao fruktoza, maltoza, galaktoza, glukoza D-manoza, sorboza i slični; disaharide kao laktoza, saharoza, trehaloza, celobioza, i slične; polisaharide, kao rafinoza, melezitoza, maltođekstrini, dekstriani, škrobovi, i slični; i alditoli, kao manitol, ksilitol, maltitol, lacitol, ksilitol sorbitol (glucitol), mionozitol i slični. Poželjni ugljohidratni ekspicijenti za upotrebu u ovom pronalasku su manitol, trehaloza i rafinoza.
Kompozicije anti-dual integrinskog antitela može takođe uključiti pufer ili pH podešavajući agens; tipično pufer je so pripremljena iz organske kiseline ili baze. Reprezentativni puferi uključuju soli organskih kiselina kao soli limunske kiseline, askorbinske kiseline, glukonske kiseline, ugljene kiseline, tartarne kiseline, sukcinilne kiseline, sirćetne kiseline, ili ptalične kiseline; Tris, trometamin hidrohlorid ili fosfatni puferi. Poželjni puferi za upotrebu u ovoj kompoziciji su soli organskih kiselina kao na primer citrat.
Dodatno, kompozicije anti-dual antitela iz ovog pronalaska mogu uključiti polimerne ekspicijente /aditive kao polivinilpirolidoni, fikolo (polimerni šećer), dekstarti (e.g., ciklodekstrini, kao 2-hidroksipropil-P-ciklodekstrin), polietilen glikoli, agensi za ukus (flavoring agensi), antimikrobijalni agensi, zaslađivači, antioksidanti, antistatički agensi, "surfactans" (površinski aktivni agensi) (e.g., polisorbati kao "TVVEEN 20" i "TVVEEN 80"), lipidi (e.g., fosfolipidi, masne kiseline), steroidi (e.g., holesterol), helatni agensi (e.g., EDTA).
Ovi i drugi dodatni farmaceutski ekspicijeni i/ili aditivi pogodni za upotrebu za satav anti-dual integrin antitela, njegovog dela ili varijante, na osnovu pronalaska poznati su ovoj oblasti, e.g., navedeno kao "Remington: Science & Practice of Pharmacv" 19th ed., Williams& VVilliams, (1995), i u "Phvsicians Desk Reference", 52nd ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998), otkrića koja su upotpunosti obuhvaćena referencama. Poželjni nosači ili ekspicijenttni materijali su ugljrni hidrati (e.g., saharidi i alditoli) i puferi (e.g., citratni) ili polimerni agensi.
FORMULACIJE
Kao što je notirano u tekstu iznad, ovaj pronalazak obezbeđuje stabilne formulacije, poželjno je fosfatni pufer sa fiziološkim rastvorom ili odabranom solju, kao i konzervirane rastvore koje sadrže konzervanse kao i višenamenske sačuvane formulacije pogodne za upotrebu u farmaciji ili veterini, koji se satoje od makar jednog anti-dual integrinskog antitela u formulaciji koja je farmaceutski prihvatljiva. Konzervirane formulacije sadrže makar jedan poznati konzervans ili opcionalno odabran iz grupe koja se satoji od makar jednog fenola, m-krezola, p-krezola, o-krezola, hlorokrezola, benzil alkohola, fenilživinog nitrata, fenoksietanola, formaldehida, hlorobutanola, magnezijum hlorida (e.g., heksahidrat), alkilparabena (metil, etil, propil, butil i slični), benzalkonijum hlorida, benzetonijum hlorida natrijum dehidroacetat i timerosala, ili njihove me.avine u vodenomrastvaraču. Bilo koja pogodna koncentracija ili mešavina može se upotrebiti kao stoje poznato u ovoj oblasti, kao 0.001-5% ili bilo koji opseg ili vrednost u okviru toga, kao ali bez limitiranja, 0.001, 0.003, 0.005,
0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, koji opseg ili vrednost u okviru toga. Nelimitirajući primeri uključuju, bez
konzervansa, 0.1-2% m-krezol (e.g., 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.9, 1.0%), 0.1-3% benzil alkohol (e.g., 0.5, 0.9, 1.1, 1.5, 1.9, 2.0, 2.5%), 0.001-0.5% timerosal (e.g., 0.005, 0.01), 0.001-2% fenol (0.05, 0.25, 0.28, 0.5, 0.9, 1.0%(, 0.0005-1.0% alkilparabeni (e.g., 0.00075, 0.0009, 0.001, 0.002, 0.005, 0.0075, 0.009, 0.01, 0.02, 0.075, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.75, 0.9, 1.0%) i slični.
Kao što je notirano u tekstu iznad, ovaj pronalazak obezbeđuje član proizvođača, koji se sastoji od materijala za pakovanje i makar jedne vajle koja sadrži rastvor makar jednog anti-dual ntegrinskog antitela sa preporučenim puferima i/ili prezervativima, opcionalno u vođenom rastvaraču, naznačeno time da pomenuti materijal za pakovanje ima etiketu na kojoj se ukazuje na to da se ovakav rastvor može držati tokom perioda od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54. 60, 66, 72 sata ili duže. Ovaj pronalazak dalje obuhvata član proizvođača, koji se sastoji od materijala za pakovanje, prve vajle koja sadrži liofilizovano makar jedno anti-dual integrinsko antitelo i drugu vajlu sa vodenim rastvaračem preporučenog pufera ili konzervansa, naznačeno time da materijal za pakovanje ima etiketu na kojoj se ukazuje pacijentu da rekonstituiše makar jedno anti-dual integrinsko antitelo u vodenom rastvaraču da bi se formirao rastvor koji se može držati tokom perioda od 24 časa ili duže.
Makar jedno anti-dual integrinsko antitelo upotrebljeno u skladu sa ovimpronalaskom, može se proizvesti rekombinantnim načinima, uključujući iz ćelija sisara ili pripremom trensgena, ili može biti pročišćeno iz nekog drugog biološkog izvora, kao što je ovde opisano ili poznato u ovoj oblasti.
Opseg makar jednog anti-dual integrinskog antitela u proizvodu iz ovog pronalaska uključuje količine dobijene po rekonstituciji, u vlažno/suvo sistemu, koncentracije od oko 1.0 |lg/ml do oko 1000 mg/ml, iako se može raditi i sa nižim i višim koncentracijama koje zavise od vozila za dostavu sa kojim se namerava da radi, e.g., formulacije rastvora će se razlikovati kod transdermalnih flastera, pulmonarnog, transmukoznog ili osmotskog ili metoda mikro pumpe.
Poželjno je da, opcionalno vodeni rastvarač dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv konzervans. Poželjni konzervansi uključuju one selektovane iz grupe koja se sastoji od fenola, m-krezola, p-krezola, o-krezola, hlorokrezola, benzil alkohola, alkilparabena (metil, etil, propii, butil, i slični), benzalkonium hlorida, benzetonium hlorida, natrijum dehidroacetata i timerosala ili njihove kombinacije. Koncentracija konzervansa upotreblejnih u formulaciji je koncentracija dovoljna da dovede do enti-mikrobijalnog efekta. Ovakve koncentracije zavise od konzervansa koji je selektovan i već su određene od strane obučenih u ovoj oblasti.
Drugi ekscipijenti, e.g., izotonični agensi, puferi, antioksidanti, enhanceri konzervansa, mogu se opcionalno, a i poželjno je, dodati rastvaraču. Izotonični agens, kao što je glicerin, često se upotrebljava u poznatim koncentracijama. Fiziološki tolerantan pufer poželjno je dodati da bi se obezbedila bolja kontrola pH. Formulacije mogu pokriti širok opseg pH, kao od oko pH 4 do oko pH 10, i poželjnije opsege od oko pH 5 do oko pH 9, i najpoželjnije opseg od oko 6.0 do oko pH 8.0. Poželjno je da formulacije ovog pronalaska imaju pH između oko 6.8 do oko 7.8. Poželjni puferi uključuju fosfatne pufere, najpoželjnije natrijum fosfat, pogotovu fosfat puferovan u fiziološkom rastvoru (phosphate buffered saline
PBS).
Drugi aditivi, kao farmaceutski prihvatljivi rastvarači kao Tween20 (poliksietilen (20) sorbitan monolaurat), Tween 40 (poliksietilen (20) sorbitan monopalmitat, Tween 80 (poliksietilen (20) sorbitan monooelat), Pluronic F68 (polietilksilen polioksipropilen blok kopolimeri), i PEG (polietilen glikol) ili ili nejonski "surfactants" (površinski aktivni agensi) kao polisorbat 20 ili 80 ili poloksamer 184 ili 188, Pluronic<R>polis, drugi blok ko-polimeri, i helatori kao EDTA i EGTA, mogu se opcionalno dodati formulaciji ili kompoziciji da bi se smanjila agregacija. Aditivi su pogotovo korisni ako je pumpa ili plastični kontejner upotrebljen za administraciju formulacije. Prisustvo farmaceutski prihvatljivih "surfactants" (površinski aktivni agensi) ublažuje tendenciju proteina da agregira. Formulacije iz ovog pronalaska mogu se pripremiti procesom koji obuhvata mešanje makar jednog anti-dual integrinskog antitela i konzervansa odabranog iz grupe koja se sastoji od fenola, m-krezola, p-krezola, o-krezola, hlorokrezola, benzil alkohola, alkilparabena (metil, etil, propil, butil, i slični), benzalkonium hlorida, benzetonium hlorida, natrijum dehidroacetata i timerosala ili njihove kombinacije u vodenom rastvoru. Mešanje makar jednog anti-dual integrinskog antitelo sa konzervansom u vodenom rastvaraču izvodi se pomoću konvencionalnih procedura rastvaranja i mešanja. Da bi se pripremila pogodna formulacija, na primer, izmerena količina makar jednog anti-dual integrinskog antitela u rastvoru pufera se kombinuje sa željenim konzervansom u rastvoru pufera u količinama koje su dovoljne da obezbede željene koncentracije proteina i konzervansa. Varijacije u ovom procesu će prepoznati svako koje obučen u ovoj oblasti nauke. Na primer, redosled po kome se komponente dodaju, da li se koriste dodatni aditivi, temperatura i pH na kojoj se priprema formulacija, sve su to faktori koji se mogu optimizovati za koncentraciju i načine administracije koje se upotrebljavaju.
Formulacije za koje je prijavljen patentni zahtev mogu se obezbediti pacijentu kao čisti rastvori ili dve vajle, od jedne vajle liofilizovanog makar jednog anti-dual integrinskog antitela koji se rekonstituiše sa dingom vajlom koja sadrži vodu, konzervans i/ili ekscipijent, poželjno je fosfatni pufer i/ili slani rastvor i odabrana so, u vodenom rastvaraču. Vajla sa jedinstvenim rastvorom ili dve vajle koje zahtevaju rekonstituciju mogu se više puta koristiti i mogu zadovoljiti jedan ili viš ciklusa lečenja pacijenta i tako obezbediti bolju režim lečenja nego što je trenutno dostupan.
Predmeti koji se ovde prijavljuju od strane proizvodjača mogu se upotrebiti za administraciju od momentalnog do 24 časa ili dužeg perioda. Na osnovu toga ovde prijavljeni predmeti od strane proizvodjača pružaju značajne prednosti pacijentu. Formulacije ovog pronalaska mou se opcionalno bezbedno čuvati na temperaturama od oko 2 do 40°C i mogu zadržati biološku aktivnost proteina tokom produženog vremenskog perioda i tako omogućavajući obeležavanje paketa na kome se ukazuje da se rastvor može držati I/ili upotrebiti tokom perioda od 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 ili 96 sati ili duže. Ako se upotrebljkava konzervisani rastvarač, ovakva nalepnica može uključiti upotrebu od 1 do 12 meseci, pola, jedne i po i/ili dve godine.
Rastvori makar jednog anti-dual integrinskog antitela mogu se pripremiti procesom koji obuhvata mešanje makar jednog antitela u vodenom rastvaraču. Mešanje se vrši pomoću konvencionalnih procedura rastvaranja i mešanja. Da bi s pripremio pogodan astvaraČ, na primer, odmerena količina makar jednog antitela u vodi ili puferu se kombinuje u količinama dovoljnim da se obezbedi željena koncentracija proteina i opcionalno konzervansa i pufera. Varijacije ovih procesa bić prepoznate od strane osobe obučene u ovoj oblasti nauke. Na primer, redosled po kome se komponente dodaju, da li se koriste dodatni aditivi, temperatura i pH na kojoj se priprema formulacija, sve su to faktori koji se mogu optimizovati za koncentraciju i načine administracije koje se upotrebljavaju.
Prijavljeni proizvodi mogu se obezbediti pacijentu kao čisti rastvori ili kao duple vajle koje se sastoje od vajle sa liofilizovanim makar jednim anti-dual integrinskim antitelom, koje se rekonstituiše sa drugom vajlom koja sadrži vodeni rastvarač. Cisti rastvori u ovom slučaju mogu biti veličine od jednog litra ili više, obezbedujući veliki rezrevoar iz koga se mogu uzimati manje porcije makat jednog rastvora antitela, jedan ili više puta za transfer u manje vajle i tako kupce i/ili pacijente obezbediti od strane apoteka ili klinika.
Priznata sredstva koja obuhvataju sistem od jedne vajle uključuju one penove (pen injeetor), naprave za dostavu rastvora, kao što su BD Pens, BD Autojector<R>, I4umajectR, NovoPen<R>, B-D<R>Pen, AutoPen<R>, i OptiPen\ GenotropinPen<R>, Genotronorm Pen<R>, HumatroPen<R>, Reco-Pen<R>, Roferon Pen<R>,Biojector<R>, iject<R>, J-tip Needle-Free Injector<R>, Intraject<R>, Medi-Ject, e.g., napravljeni ili razvijeni od strane Becton Dickensen (Franklin Lakes, NJ, www.becktondickenson.com), Disetronic (Burgdorf, Switzerland, www.disetronic.com; Bioject,Portland, Oregon (www.bioject.com); National Medical Products, Weston medical (Peterbourgh, UK, www.Weston-medical.com), Medi-Ject Corp (Minneapolis, MN, www.mediject.com). Poznata sredstva koja sadrže sistem duple vajle uključuju one "pen-injeetor" sisteme za rekonstituciju liofilizovanog leka u pakovanju za dostavu rekonstituisanog rastvora kao što je HumatroPen<R>.
Proizvodi koji se ovde prijavljuju uključuju materijal za pakovanje. Materijal za
pakovanje obezbeđuje, dodatno informaciji koja se zahteva od strane regulatornih agencija, uslov pod kojim se proizvod može koristiti. Materijal za pakovanje ovog pronalaska obezbeđuje uputstva pacijentu kako da rekonstituiše makar jedno anti-dual integrinsko antitelo u vodenom rastvaraču u cilju formiranja rastvora i potrebe da se rastvor iskoristi tokom perioda od 2 do 24 sata ili više za proizvod iz dve vajle, vlažno/suvo. Za pojedinačnu vajlu, proizvod koji je rastvor, nalepnica ukazuje da se ovakav rastvor može upotrebiti tokom perioda od 2 do 24 časa ili više. Ovde prijvljeni proizvodi su korisni za humanu upotrebu farmaceutičkih proizvoda.
Formulacije ovog proizvoda mogu se pripremiti procesom koji obuhvata mešanje makar jednog anti-dual integrinskog antitela i odabranog pufera, poželjno je fosfatnog pufera, fiziološkog rastvora ili odabrane soli. Mešanje makar jednog antitela i pufera u vodenom rastvaraču izvodi se pomoću konvencionalnih metoda rastvaranja i mešanja. Da bi se pripremila pogodn formulacija, na primer, odmerena količina makar jednog antitela u vodi ili puferu s kombinuje sa .eljenim puferskim agensom u vodi, u količinama dovoljnim da se obezbede željene koncentracije proteina i pufera. Varijacije ovog procesa biće prepoznate od osobe koja je obučena u ovoj oblasti nauke. Na primer, redosled komponenti koje se dodaju da li se upotrebljavaju dodatni aditivi, temperatura i pH na kojoj se formulacija priprema, sve su to faktori koji se mogu optimizovati za koncentraciju i način administracije koji je upotrebljen.
Prijavljene stabilne ili konzervirane formulacije mogu se obezbediti pacijentu kao čisti rastvor ili kao duple vajle koje obuhvataju jednu vajlu liofilizovanog makar jednog anti-dual integrinskog antitela koja se rekonstituiše sa drugom vajlom koja sadrži konzervans ili pufer i ekscipijent u vodenom rastvaraču. Vajla sa jedinstvenim rastvorom ili dve vajle koje zahtevaju rekonstituciju mogu se više puta koristiti i mogu zadovoljiti jedan ili viš ciklusa lečenja pacijenta i tako obezbediti bolju režim lečenja nego što je trenutno dostupan.
Makar jedno anti-dul integrinsko antitelo u stabilnoj ili konzervisanoj formulaciji ili rastvoru koji su ovde opisani može se dati pacijentu u skladu sa ovim pronalaskom preko različitih metoda dostave, uključujući SC ili EVI injektiranje; transdermalno, pulmonarno, transmukozalno, kao implant, osmotska pumpa, kaseta, mikropumpa ili drugi načini koji korist obučeni u ovoj oblati kao i oni poznati u ovoj oblasti nauke.
TERAPEUTSKED PRIMENE
Ovaj pronalazak takodje obezbeđuje metod za modulaciju ili lečenje makar jedne bolesti vezane za dual integrin, u ćeilji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu, što je poznato u ovoj oblasti ili opisano ovde, upotrebom makar jednog dual-integrinskog antitela iz ovog pronalaska.
Ovaj pronalazak takodje obezbeđuje metod za modulaciju ili lečenje makar jedne bolesti vezane za dual integrin, u ćeilji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu, uključujući, bez limitiranja na, makar jednu bolest vezanu za prteranu gojaznost, imunitet, kardiovaskularnu bolest, infektivnu bolest, malignu bolest ili neurološku bolest.
Ovaj pronalazak takodje obezbeđuje metod za modulaciju ili lečenje makar jedne bolesti vezane za dual integrin, u ćeilji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu, uključujući, bez limitiranja, makar jedan od reumatidnog artritisa, juvenilnog reumatidnog artritisa, sistemskog "onset" (uključivanja) juvenilnog reumatidnog artritis, psoijatični artritis, ankilozni spondilitis, čir na želudcu, seronegativnma artropatijeza, osteo artritis, inflaminatorna crevna bolest, ulcerativni kolitis, sistemski lupus eritromatozis, ntifosfolipidni sindrom, iridociklitis/uveistis/optički neuritis, idiopatska plućna fibroza, sistemski vaskulitis/vegnerova granulomatoza, sarkoidoza, orhitis/reverzne procedure vazektomije, alergijske/atopijske bolesti, astma, alergijski rimitis, ekcema, alergijski kntaktni dermatitis, alergijski konjuktivitis, hipersenzitivni pneumonitis, transplanti, odbacivanje transplantiranog organa, presadjeno tkivo-versus-domaćin obolenje, sindrom sistemskog inflaminatornog odgovora, sindrom sepse, grampozitivna sepsa, gram negativna sepsa, kulturno negativna sepsa, gljivična sepsa, "neutropenic fewer", uroscpsa, meningokokcmija, trauma/krvarenje, opekotine, izlaganje jonizujućem zračenju, akutni pankreatitis, adultni respiratorni "distress" sindrom, reumatoidni artritis, alkoholom indukovan hepatitis, hronične inflaminatorne patologije, sarkoidoza, kronova patologija, srpasta anemija, dijabetes, nefroza, atopične bolesti, hipersenzitivne reakcije, alergijski rimitis, polenska groznica, perenialni rinitis, konjuktivitis, endometrioza, astma, urtikarija, sistemska anafalaksija, dermatitis, "perniciosus" anemija, hemolitička bolest, trombocitopenija, odbacivanje bilo ko presadjenog organa ili tkiva, odbacivanje presadjenog bubrega, odbacivanje presadjenog srca, odbacivanje presadjene jetre, odbacivanje presadjenog pankreasa, odbacivanje presadjenih pluća, odbacivanje presadjene kosne srži (BMT), odbacivanje kožnog "alograft" (presađeno tkivo), odbacivanje presadjene hrskavice, odbacivanje kosnog grafta, odbacivanje presadjenog dvanaestopalačnog creva, odbacivanje fetalnog timus implanta, odbacivanje paratiroidnog transplanta, odbacivanje ksenografta bilo kog organa ili tkiva, odbacivanje alografta, anti-receptorna hipersenzitivna reakcija, Gravova bolest, Rejnudova bolest, insulin rezistentan dijabetes tipa B, astma, miastenija gravis, citotoksičnost posredovano antitelom, hipersenzitivne reakcije tipa 3, sistemski lupus eritematozus, POEMS sindrom (polineuropatija organomegalija, endokrinopaija, monoklonalna gamopatija, i sinrdom promene kože), polineuropatija organomegalija, endokrinopaija, monoklonalna gamopatija, i sindrom promene kože, antifosfolipidni sindrom, "pemphigus", skleroderma, bolest pomešanog vezivnog tkiva, idiopatska Adisonova bolest, dijabetes mellitus, hronični aktivni hepatitis, primarna bilijarna ciroza, vitiligo, vaskulitis, post-MI kardiotomni sindrom, hipersenzitivnost tipa IV, kontaktni dermatitis, hipersenzitivni pneumonitis, odbacivanje alografta, granulome usled intracelularnih organizama, senzitivnost na lek, metabolički/idiopatski, Vilsonova bolest, hemakromatozis, alfa-l-antitripsin deficijencija, dijabetska retinopatija, Hašimotov tiroiditis, osteoporoza, procena hipotalamične-hipofizne-adrenalne ose, primarna bilijarna ciroza, tiroiditis, encefalomialitis, kaheksija, cistična fibroza, neonatalna hronična bolest pluća, hronična opstruktivna plućna bolest (COPD), familijarna hematofagocitična limfohistiocitoza, dermatološka stanja, psorijaza, alopecija, nefrotični sindom, nefritis, glomerularni nefritis, akutni renalni prestanak rada, hemodijaliza, uremija, toksičnost, preeklamsija, okt3 terapija, anti-cd3 terapija, terapija citokininom, hemoterapija, radiaciona terapija (e.g. uključujući, bez limitiranja, "toast hernija", anemija, kaheksija, i si.), hronična salicilna intoksikacija i slično. Videti, e.g., The Maerck Manual, 12th-17th editions, Merck & Coampanv, Rahvvav, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapv Handbook, Wells et al., Second Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000), svaki kompletno obuhvaćen referencom.
Ovaj pronalazak takodje obezbeđuje metodu za modulaciju ili lečenje makar jedne kardiovaskularne bolesti u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu uključujući, bez limitiranja na njih, makar jedan od: srčani "stun" sindrom, infarkt miokarda, "congestiv hard failure", moždani udar, ishemični moždani udar, izliv krvi, arterioskleroza i arteosleroza, restenoza, dijabeiska arteriosklerotična bolest, hipertenzija, arterijalna hipertenzija, renovaskulatrna hipertenzija, sinkopa, šok, sifilis kadriovaskularnog sistema, prestanak rada srca, "cor pulmonale", primarna plućna hipertenzija, srčana aritmija, ektopični artrijalni otkucaji, artrijalno podrhtavanje, artrijalna fibrilacija (zadržana ili paroksimalna), post perfuzioni sistem, kardiopulmonarni bajpas inflaminatorni odgovor, haotična ili multifokalna aqtrijalna tahikardija, tahikardija sa normalnim uskim QRS, specifična aritmija, ventrikularna fibrilacija, "His bundle" aritmija, atrioventrikularni blok, "bundle branch" blok, miokardijalni ishemični poremećaju, bolest koronarne arterije, angina pektoris, infark miokarda, kardiomiopatija, dilatirana kongestivna kardiomiopatija, restriktivna kardiomiopatija, "valvular" srčano obolenje, endokarditis, perikardijalna bolest, kardijačni tumori, "aordic"i periferalni aneurizmi, diskecija aorte, zapaljenje aorte, okluzija abdominale aorte i njenih grana, periferalni vaskularni poremećaji, okluzivni arterijalni poremećaji, periferalna arterosklerotična bolest, tromboangitis obliterans, funkcionalni periferalni arterijalni poremećaji, Raynaud-ov fenomen i bolest, akrocijanoza, eritromelalgija, bolesti vena, venska tromboza, proširene vene, "arteriovenous" fistula, limfederma, lipedema, nestabilna angina, reperfuziona povreda, "postpump" sindom, ishemija-reperfuziona povreda i slično. Ovakav metod može opcionalno obuhvatiti adminisatrciju efektivne količine kompozicije ili farmaceutske kompozicije koja sadrži makar jedno anti-dula integrinsko antitelo ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu koji ima potrebu za ovakvom modulacijom lečenjem ili terapijom.
Ovaj pronalazak takodje obezbeđuje metod za modulaciju ili lečenje makar jedne infektivne bolesti u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu, uključujući, ali n
limitiran njima, makar jedan od sledećih: akutna ili honična bakterijska infekcija, akutni i hronični parazitski ili infektivni procesi, uključujući bakterijsku, virusnu i gljivičnu infekciju, HIV infekciju/HIV neuropatiju, meningitis, hepatitis (A, B ili C ili slični), septički artritis, peritimtis, upala pluća, piglotitis, Ecoli 0157:117, hemolitički uremični sindrom/trombolitička trombocitopenička purpura, malarija, "dengue" hemoralgična groznica, leišmanijazis, lepra, sindrom toksičnog šoka, streptokokalni miozitis, gas gangrena, mycobacterium tuberculosis, mycobacteriumavium intracellulare. pneumocystis, carinni pneumonija, pelvična inflaminatorna bolest, orhitis/epiddidimitis, legionella, Lajmska bolest, influenca A, Epstein-Barr virus, "vital-asociated" hemofagocitični sindom, "vital" encefalitis/aseptički meningitis i si.;
Ovaj pronalazak takodje obezbeđuje metod za modulaciju i lečenje makar jednog malignog oboljenja u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu uključujući, ali ne limitiran njima, makar jedan od sledećih: leukemija, akutna leukemija, akutna limfoblastna leukemija (ALL), ALL B-ćelija, T-ćelija, ili FAB, akutna miloidna leukemija (AML), hronička mielocitna leukemija (CML), hronična limfocitna lukemija (CLL), "hairvcell" leukemija, mielodiplastični sindrom (MDS), limfoma, Hočkinsonova bolest, maligna limfoma, ne-Hočkinsonova limfoma, Burkitova limfoma, višestruka mieloma, Kapozijeva sarkoma, kolorektalni karcinom, karcinom pankreasa, nazofarilgijalni karcinom, maligna histocitoza, paraneoplastični sindrom/hiperkalcemija malignosti, "solid" tumori, adenokarcinom, sarkom, maligni melanom, hmangioma, bolesti metastaze, resorpcija kosti povezana sa kancerom, bol u kostima povezan sa kancerom i si.
Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje metod za modulaciju i lečenje makar jednog neurološkog oboljenja u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu uključujući, ali ne limitiran njima, makar jedno od sledećih: neurodegenerativne bolesti, multipna skleroza, migrenozne glavobolje, AIDS dementia complex, bolest demijelinizacije, kao što je multipna skleroza ili akutni transferzalni mielitis; ekstrapiramidalni i cerebralni poremećaji kao što su lezije kortikospinalnog sistema; poremećaji bazalnih ganglija ili cerebralni poremećaji; poremećaji hiperkinetičkog kretanja kao što su Hungtintonžs Chorea i senilna chorea; poremećaji kretanja izazvani lekovima, kao što su oni izazvani lekovima koji blokiraju dopaminske receptore CNS-a; poremećaj hipokinetčkog kretanja, kao Parkinsonova bolest; Progresivni "supranucleo Palsy"; strukturalne lezije cerebeluma; spinocerebralne degeneracije, kao spinalna ataksija, Friedrichova ataksija, cerebelarne kortikalne degeneracijem "multiple svstem" degeneracije (Mencel, Dejerine-Thomas, Shi-Drager, i Machado-Joseph); sistemski poremećaji (Refsum-sova bolest, abetalipoprotemia, ataksia, talengiektazija, i mitohondrijalni multi. sistemski poremećaj); poremećaji demijelinizacije "core"-a, kao što su multipna skleroza, akutni transversni mielitis; i poremećaji motornih jedinica kao što su neurogene muskularne atrofije (ćelijska degeneracija prednjeg roga, kao amiotrofna lateralna skleroza, infantilna spinalna muskularna atrofija i juvenilna spinalna muskularna atrofija); Alzhajmerova bolest; Daunov sindrom u srednjim godinama; Diffise Levi bolest tela;senilna demencija "Lewy body" tipa, "wernicke-Korsakoss" sindrom; hronični alkoholizam; Creutsfeld-Jakob bolest; "Subacut selerosing panencephalitis" Hallerrorden-Spatz bolest; i demencia pugilistica i slično. Ovakve metode mogu opcionalno sadržati administraciju efektivne količine kompozicije ili farmaceutske kompozicije koja obuhvata makar jedno TNF antitelo ili njegov specificiran deo ili varijantu,, ćeliji, tkivu, organu, ili pacijentu koji ima potrebu za ovakvom modulacijom, ili terapijom. Videti e.g.. the Merck Manual, 16th Edition, Merck & Company, Rahway, NJ, (1992).
Bilo koja metoda iz ovog pronaklaska može da obuhvati administraciju efektivne kompozicije ili farmaceutske kompozicije koja sadrži makar jedno anti-dual integrinsko antitelo ćeliji, tkivu, organu, životinji, ili pacijentu koji ima potrebu za ovakvom modulacijom, lečenjem ili terapijom. Ovakva metoda dal je može obuhvatiti ko-administraciju ili kombinovanu terapiju za lečenje takve bolesti imuniteta, naznačeno time da administracija pomenutog makar jednog anti-dual inegrinskog antitela, njegovog specifičnog dela ili varijante, dalje sadrži administraciju pojavljivanja pre, uporedo, i/ili posle, makar jednog selektovanog od makar jednog TNF antagonista (e.g., ali nije limitiran na TNF antitelo ili fragment, solubilm TNF fragment, njegov fuzioni protein, mali molekul TNfF antagonist), antireumatika (e.g., metotreksat, auranofin, aurotioglukoza, azatiopiren, etanercept, zlato natrijum tiomalat, hidroksihlorokinsulfat, leflunomid, sulfasazlin), mišićni relaksant, narkotik, nesteroidni anti-inflaminatorni lek (NSAID), analgezik, anestetik, sedativ, lokalni anestetik, neuromišićni blokator, antimikrobialni (e.g., aminoglikozid, antifungalni, antiparazitski, antiviralni, karbapenem, cefalosporin, flurorkinolon, makroiid, penicilin, sulfonamid, tetraciklin, drugi antimikrobijski), antipsoriatika, kortikosteroida, anaboličkog steroida, agensa povezanog sa dijabetesom, mineralnog, hranljivog, tiroidnog agensa, vitamina, hormona vezanog za kalcijum, antidiarealnog, antitusivnog (antitussive), "antiemetic", antiulceroznog, laksativnog, antikoagulantnog, critropieitina (e.g., epoetin alfa), "filgastrim" (e.g., G-CSF, Neupogen), sargamostina (GM-CSF, Leukine), imumzacija, imunoglobulina, imunosupresora, (e.g., basilixmab, ciklosporin, daklizumab), hormona rasta, lek za zamenu hormona, modulator hormona za estrogen, midriatik, cikloplegik, alkilirajući agens, antimetabolit, ihibitor mitoze, radiofarmaceutikala, antidepresiva, antimanijačnog agensa, antipsihotika, anksiolitika, hipnotika, simpatomimetika, stimulanata, donepezil, takrin, lekova za astmu, beta antagonista, steroida za udisanje, inhibitora za leukotriena, metilksantina, kromolina, epinefrina ili analoga, dornaze alfa (pulmozvme), citokin ili citokin antagonist.Videti, e.g., VVells et al., eds., Pharmacotherapv Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000), svaki čija je referenca kompletno obuhvaćena ovde referencom.
TNF antagonisti pogodni za kompozicije, kombinovanu terapiju, ko-administraciju, sredstva i/ili metode iz ovog pronalaska (dalje obuhvataju makar jedno antitelo, njegov specificiran deo ili varijantu, iz ovog pronalaska), obuhvataju, ali nisu limitirana na njih, anti-TNF antitela, njihove fragmente za vezivanje antigena, i receptorne molekule koji se specifično vezuju za TNF; jedinjenja koja sprečavaju i/ili inhibiraju sintezu TNF-a, oslobađanje TNF-a ili njegovo delovanje na ciljne ćelije kao što su talidomid, tenidap, inhibitori fosfodiesteraza (e.g., pentoksifilin i rolipam), agonisti A2b adenozinski receptora i enhanseri A2b adenozinski receptora; jedinjenja koja sprečacaju i/ili inhibiraju signalizaciju TNF receptora, kao inhibitori mitogen aktivirajućih protein kinaza (MAP) jedinjenja koja blokiraju i/ili inhibiraju TNF sečenje membrane, kao što su inhibitori metaloproteinaza; jedinjenja koja blokiraji i/ili inhibiraju aktivnost TNF-a, kao što su inhibitori enzima koji prevodi angiotenzin (ACE angiotensin converting enzyme) (e.g., kaptopril); i jedinjenja koja blokiraju i/ili inhibiraju proizvodnju TNF-a i/ili njihovu sintezu, kao što su inhibitori MAP kinaze.
Kao što se ovde koristi "antitelo faktora nekroze tumora", 'TNF antitelo", TNFa antitelo", ili njegov fragment i slično, smanjuje, blokira, ukida ili interferira sa
TNFa aktivnošćuin vitro, in situi/i 1 i poželjno jein vivo.Na primer pogodno TNF humano antitelo iz ovog pronalaska može da veže TNFa i uključuje anti-TNF antitela, njihovih fragmenata za vezivanje antigena, i specificirane mutante ili domene koji se vezuju specifično za TNFa. Pogodno TNF antitelo ili njegov fragment, može takođe da smanjuje, blokira, ukida ili interferira spreči i/ili inhibira sintezu TNF RNK, DNK ili proteina, oslobađanje TNF-a, signalizaciju TNF receptora, membransko TNF sečenje, aktivnost TNF-a, proizvodnju i/ili sintezu TNF-a.
Himerno antitelo cA2 sastoji se od antigen vezujućeg varijabilnog regiona mišijeg neutrališućeg visokoafinitativnog anti-humanog TNFa IgGl, označen kao A2, i konstantnog regiona humanog IgGl, kappa imunoglobulina. Humani IgGl Ec region poboljšava efektornu funkciju alogenog antitela, povećava polu život cirkulišućeg seruma i smanjuje imunogenost antitela. Aviditv i specifičnost epitopa himernog cA2 antitela je izvedena iz varijabilnog regiona mišijeg antitela A2. U posebnom ostvarenju poželjan izvor nukleinske kiseline koja kodira varijabilan region mišijeg A2 antitela je A2 hibridoma ćelijska linija.
Himerno A2 (cA2) neutrališe citotoksični efekat oba, i prirodnog i rekombinantnog humanog TNFa na način koji zavisi od doze. Iz eseja za vezivanje himernog cA2 antitela i rekombinantnog humanog TNFa, izračunato je daje konstanta afinitativnosti himernog antitela cA2 1.04 X 1010M"'. Poželjne metode za određivanje specifičnosti i afinitativnosti monoklonalnog antitela kompetitivnom inhibicijom može se naći u Harlow, et al., antibodies: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbour Laboratorv Press, Cold Spring Harbour, New York, 1988; Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunologv, Green Publishing Assoc, and Wiley Intcrscience, New York, (1992-2000); Kozber et al., Immunol. Today, 4:72-79 (1983); Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York (1987-2000); i Muller, Metod. Enzymol., 92:589-601 (1993), čije su reference kompletno obuhvaćane ovde referencama.
U posebnom ostvarenju m mišije monoklonalno A2 anittelo se proizvodi od strane ćelijske linije označene kao cl34A. Himerno cA2 antitelo se proizvodi od strane ćelijske linije označene kao cl68A.
Dodatni primeri monoklonalnih anti-TNF antitela koji se mogu upotrebiti u ovom pronalasku opisani su u ovoj oblasti (videti, e.g., U.S. Patent No. 5,231,024; Moller , A. et al., Cvtokine 2(3): 162-169 (1990); U.S Application No. 07/943,852 (popunjen 11 septembra, 1992); Rathjen et al., International Publication No WO 91/02078 (objavljeno 21 februara 191); Rubin et al., EPO Patent Publication No 0 218 868 (objavljeno 22 aprila, 1987); Liang et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 137:847-854 (1986); Meager et al., Hvbridoma 6:305-311 (1987); Fendly et al., Hvbridoma 6:359-369 (1987); Bringman et al., Hybridoma, 6:489-507 (1987); i Hirai et al., J. Immunol. Meth. 96:57-62 (1987), čije su reference kompletno obuhvaćane ovde referencama.
TNF receptorski molekuli
Poželjni TNF receptorski molekuli korisni za ovaj pronalazak su oni koji vezuju TNFa sa visokim afinitetom (videti e.g., Feldman, et al., International Publication No WO 92/07076 (objavljeno 30 aprila 1992); Schall et al., Cell, 61:361-370
(1990); i Loetcher et al., Cell 61:351-359 (1990), čije su reference kompletno obuhvaćane ovde referencama)) i opcionalno poseduju nisku imunogenost. Posebno su korisni za ovaj pronalazak, 55 kDa (p55TNF-R) i 75 kDa (p75TNF-R) ćelijski površinski receptori. Skraćene forme ovih receptora koji sadrže ekstracelularne domene (ECD) receptora ili njegovih funkcionalnih delova (e.g., Corcoran, et al., Eur. J. Biochem. 223:831 840 (1994)), takođe su korisni za ovaj pronalazak. Isečene forme ovih receptora, koji sdrže ECD, detektovana se u mokraći i serumu kao TNFa inhibitorni vezujući proteini od 30 kDa i 40 kDa (Engelman, H. et al., J. biol. Chem. 265:1531-1536 (1990)). Multimerni molekuli TNF receptora i TNF imunoreceptorski fuzioni molekuli, i njihovi derivati i fragmenti, su dodatni primeri TNF receptorskih molekula koji su korisni za metode i kompozicije iz ovog pronalaska. Molekuli TNF receptora koji se mogu koristiti u ovom pronalasku karakterišu se sposobnošću da leče pacijente tokom produžeg vremenskog perioda sa dobrim do odličnim ublažavanjem simptoma i niskom toksičnošču. Niska imunogenost i/ili visoka afinitativnost, kao i druge nedefinisane osobine, mogu da doprinesu ostvarenim terapeutskim rezultatima.
Multimerni molekuli TNF receptora koji su korisni za ovaj pronalazak sadrže sve ili funkcionalni deo ECD jednog ili više TNF receptora povezanih preko jednog ili više polilinkera ili nepeptidnih linkera, kao stoje polietilen glikol (PEG). Multimerni molekuli dalje mogu da sadrže signalni peptid sekretovanog proteina koji usmerava ekspresiju multimernog molekula. Ovi multimerni molekuli i metode za njihovu proizvodnju opisane su u U.S. Application No. 08/437,533 (popunjen 9 maja 1995), čije je sadržaj kompletno obuhvaćane ovde referencama.
TNF imunoreceptorski fuzioni molekuli koji su korisni za metode i kompozicije iz ovog pronalaska obuhvataju makar jedan deo jednog ili više imunoglobulinskoih molekula ili ceo ili funkcionalni deo jednog ili više TNF receptora. Ovi imunoreceptorski fuzioni molekuli mogu se sastaviti kao monomeri, ili hetero- ili homo-multimeri. Imunoreceptorski fuzioni molekuli mogu biti takođe monovalentni ili multivalentni. Primer za ovakav TNF imunoreceptorski fuzioni molekul je TNF receptorski/IgG fuzioni protein. TNF imunoreceptorski fuzioni molekuli i metode za njihovo dobijanje opisani su u ovoj oblasti (Lesslauer, et al., Eur. J. Immunol. 21:2883-2886 (1991); Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10353-10359 (1991); Peppel et al., J. Exp. Med. 174:1483-1489 (1991); Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219 (1994); Butler et al., Cvtokine 6(6):616-623 (1994); Baker et al., Eur. J. Immunol. 24:2040-2048 (1994); Beutler et al., U.S. Patent No. 5,447,851; i U.S Application No. 08/442,1333 (popunjen 16 maja 1995), čije su reference je kompletno obuhvaćane ovde referencama. Metode za proizvodnju imunoreceptorskih fuzionih molekula mogu se takođe naći u Capon et al., U.S. Patent No. 5,116,964; capon et al., U.S. Patent No. 5,225,538; i Capon et al., Nature 337:523-531 (1989), čije su reference je kompletno obuhvaćane ovde referencama.
Funkcionalni ekvivalent, derivat, fragment ili region TNF receptorskog molekula odnosi se na deo TNF receptorskog molekula, ili deo sekvence za TNF receptorski molekul koja kodira TNF receptorski molekul, koja je dovoljna po veličini i sekvencama da funkcionalno liči na TNF receptorski molekul koji se može koristiti u ovom pronalasku (e.g., da se veže za TNFa sa visokim afinitetom i da poseduje nisku imunogenost). Funkcionalni ekvivalent TNF receptorskog molekula takođe uključuje modifikovane receptorske molekule koji funkcionalno liče TNF receptorskim molekulima koji se mogu koristiti u ovom pronalasku (e.g., da se veže za TNFa sa visokim afinitetom i da poseduje nisku imunogenost). Na primer, funkcionalni ekvivalent TNF receptorskog molekula može da sadrži "SILENT" kodon ili jednu ili više amino kiselinskih substitucija, delecija ili adicija (e.g., substitucija jedne kisele amino kiseline drugom kiselom amino kiselinom; ili substitucija jednog kodona koji kodira istu ili različitu hidrofobnu amino kiselinudrugim kodonom koji kodira hidrofobnu amino kiselinu. Videti Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biologv, Green Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, New York (1987-2000).
Citokini uključuju bilo koji poznati citokin. Videti,
e.g.,www.CopewithCytokines.com. Antagonisti citokina uključuju, ali nisu njima limitirani, bilo koje antitelo, njegov fragment ili onoga koji ga oponaša, bilo koji solubilni receptor, fragment ili onaj koji ga oponaša, bilo koji mali molekul antagonist, ili njihova kombinacija.
Terpeutski tretmani.Bilo koji metod iz ovog pronalaska može da sadrže metodu za lečenje poremećaja posredovanih dual integrinom, koja se sastoji od davanja efektivne količine kompozicije ili farmaceutske kompozicije koja sa satoji od makar jednog anti-dual integrinskog antitela ćeliji, organu, tkivu, životinji ili pacijentu koji ima potrebu za ovakvom modulacijom, tretmanom ili terapijom. Ovakva metoda može opcionalno dalje da obuhvati ko-administraciju ili kombinovanu terapiju za lečenje ovakvih obolenja imuniteta, naznačeno time đa administracija pomenutog makar jednog anti-dual integrinskog antitela, njegovog specificiranog dela ili varijante, dalje sadrži administraciju, prc zajedničkog pojavljivanja pre, za vreme, i/ili posle, makar jednog selektovanog iz makar jednog makar jednog selektovanog od makar jednog TNF antagonista (e.g., ali nije limitiran na TNF antitelo ili fragment, solubilni TNF fragment, njegov fuzioni protein, mali molekul TNfF antagonist), antireumatika (e.g., metotreksat, auranofin, aurotioglukoza, azatiopiren, etanercept, zlato natrijum tiomalat, hidroksihlorokinsulfat, leflunomid, sulfasazlin), mišićni relaksant, narkotik, nesteroidni anti-inflaminatorni lek (NSAID), analgezik, anestetik, sedativ, lokalni anestetik, neuromišićni blokator, antimikrobialnog (e.g., aminoglikoziđ, antifungalni, antiparazitski, antiviralni, karbapenem, cefalosporin, flurorkinolon, makrolid, penicilin, sulfonamid, tetraciklin, drugi antimikrobijski), antipsoriatika, kortikosteroida, anaboličkog steroida, agensa povezanog sa dijabetesom, mineralnog, hranljivog, tiroidnog agensa, vitamina, hormona vezanog za kalcijum, antidiarealnog, antitusivnog (antitussive), "antiemetic", antiulccroznog, laksativnog, antikoagulantnog, eritropieitina (e.g., epoetin alfa), "filgastrim" (e.g., G-CSF, Neupogen), sargamostina (GM-CSF, Leukine), imunizacije, imunoglobulina, imunosupresora, (e.g., basilixmab, ciklosporin, daklizumab), hormona rasta, lek za zamenu hormona, modulator hormona za estrogen, midriatik, cikloplegik, alkilirajući agens, antimetabolit, ihibitor mitoze, radiofarmaceutikala, antidepresiva, antimanijačnog agensa, antipsihotika, anksiolitika, hipnotika, simpatomimetika, stimulanata, donepezil, takrin, lekova za astmu, beta antagonista, steroida za udisanje, inhibitora za leukotriena, metilksantina, kromolina, epinefrina ili analoga, dornaze alfa (pulmozvme), citokina ili citokin antagonista.
Tipično, na lečenje patoloških stanja utiče administracija efektivne količine ili doze makar jedne kompozicije anti-dual integrinskog antitela koja ukupno u prošeku je u opsegu od oko 0.01 do 500 miligrama makar jednog anti dual inegrinskog antitela po kilogramu pacijenta po jednoj dozi, i poželjno je od oko 0.1 do 100 miligrama antitela/kilogramu pacijenta po jednoj ili više administracija, u zavisnosti od specifične aktivnosti koja se nalazi u kompoziciji. Alternativno, efektivna koncentracija seruma može da obuhvati 0.1-5000 plg/ml koncentracije seruma po jednoj ili više administracija. Pogodne doze poznate u lekarima i zavisiće naravo, od određenog stanja bolesti, specifične aktivnosti kompozicije koja se daje, i naročito tretmana pod kojim je pacijent. U nekim slučajevima da bi se postigla željena terapeutska količina, neophodno je obezbediti ponavljanje administracije, i.e., ponavljanje pojedinačnog davanja određene monitorovane ili odmerene doze, gde se pojedinačna davanja ponavljaju dok se ne postigne željena dnevna doza ili željeni efekat.
Poželjne doze ocionalno uključuju 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 67, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 i/ili 100-500 mg/kg/davanju, ili bilo koji njihov opseg, vrednost ili fragment, da bi se ostvarila serumsk koncentracija od 0.1, 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.5, 1.9, 2.0, 2.9, 3.0, 3.5, 3.9, 4.0, 4.5,4.9, 5.0, 5.5, 5.9, 6.0, 6.5, 6.9, 7.0,7.5, 7.9,8.0, 8.5,8.9, 9.0, 9.5,9.9, 10.0, 10.5, 10.9, 11.0, 11.5, 11.9, 12.0, 12.5, 12.9, 13.0, 13.5, 13.9, 14.0, 14.5, 14.9, 15.0, 15.5, 15.9, 16.0, 16.5, 16.9, 17.0, 17.5, 17.9, 18.0, 18.5, 18.9, 19.0, 19.5, 19.9, 20.0, 20.5, 20.9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, loo, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 i/ili 5000jLtg/ml koncentracije seruma po jednoj ili više administraci ja ili bilo koji njihov opseg, vrednost ili fragment.
Alternativno, doza koja se dostavlja može da varira u zavisnosti od poznatih faktora, kao što su farmakodinamičke karakteristike određenog agensa, i od načina i puta administracije; godina, zdravlja, i težine recipijenta; priroda i stepen simptoma, vrste uporednog tretmana, frekvence tretmana, i željenog efekta. Uobičajeno doza aktivnog sastojka može biti oko 0.1 do 100 miligrama po kilogramu telesne mase. Uobičajeno 0.1 do 50, poželjno 0.1 do 10 miligram po kilogramu po administraciji ili u formi za odloženo oslobađanje, je dovoljno za dobijanje željenih rezultata.
Kao nelimitirajući primer, lečenje ljudi ili životinja može se obezbediti kao jednokratna ili periodična doza makar jednog antitela iz ovog pronalaska 0.1 do 100 mg/kg, kao što je 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1,5, 1,2, 3,4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, ili 100 mg/kg, po danu, na makar jedan dan 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21,22, 23,24, 25,26, 27,28, 29, 30 ili 40, ili alternativno ili dodatno, makar jedne od nedelje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 ili 52 ili alternativno ili dodatno, makar jedne od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 godina ili bilo koje njihove kombinacije, upotrebom jednokratne ili infuzione ili ponovljenih doza.
Forme doza (kompozicija) pogodne za administraciju generalno sadrže od oko 0.1 miligrama do oko 500 miligramaaktivnog sastojka po jedinici ili kontejneru. U ovim farmaceutskim kompozicijama aktivni satojak uobičajeno će biti prisutni u količini od 0.5-99.999% po težini bazirano na ukupnoj težini kompozicije.
Za parenteralnu administraciju, antitelo se može formulisati kao rastvor, suspenzija, emulzija ili liofilizovan prah u asocijaciji, ili posebno obezbeđen, sa farmaceutski prihvatljivim parenteralnim prevoznim sredstvom (vehicle). Primeri za ovakva prevozna sredstva su voda, fiziološki rasvor, Ringerov rastvor, rastvor dekstroze, i 1-10% humani serum albumin. Takođe se mogu koristiti lipozomi i nevodena prevozvozna sredstva kao fiksirana ulja. Prevozno sredstvo ili liofilizovani prah mogu sadržati aditivi koji održavaju izotoničnost (e.g.. natrijum hlorid, manitol) i hemijsku stabilnost (e.g., puferi i konzervansi). Formulacija se steriliše poznatim ili pogodnim tehnikama.
Pogodni farmaceutski nosači opisani su u najnovijem izdanju Remingtonove Pharmaceutical Sciences, A. Osol, standardni referentni tekst u ovom polju.
Alternativne administracije
Mnoge poznate i razvijene metode mogu se koristiti, na osnovu ovog pronalaska, za administraciju farmaceutski efektivnih količina makar jednog anti-dual integrinskog antitela na osnovu ovog pronalaska. Dok se pulmonarna adminisracija koristi u opisu koji sledi, drugi oblici administracije sa pogodnim rezultatima mogu se koristiti na osnovu ovog pronalaska.
Dual integrinska antitela iz ovog pronalaska mogi se dostaviti u nosaču, kao rastvor, emulzija, koloid ili suspenzija, ili kao suvi prah, koristeći bilo koji od mnogih sredstava i metoda pogodnih za administraciju putem inhalacije ili drugih načina opisanih ovde ili poznatih u ovoj oblasti.
Parenteralne formulacije i administracije
Formulacije za parenteralnu administraciju mogu da sadrže poznate ekspicijente sterilnu vodu ili fiziološki rastvor, polialklen glikole kao što su polietilen glikol, ulja biljnog porekla, hidrogenizovani naftaleni i slični, vodene ili uljane suspenzije za injektiranje mogu se pripremiti upotrebom odgovarajućeg emulzifikatora ili ovlaživača i agensa za rastvaranje na osnovu poznatih metoda. Agensi za injeciranje mogu biti ne-toksični, agens za rastvaranje koji se ne administrira oralno kao vodeni rastvor ili sterilni injektabilni rastvor ili suspenzija u rastvaraču. Kao rastvarač ili prevozno sredstvo koje se koristi, dozvoljeni su voda, Ringerov rastvor, izotonični fiziološki rastvor, itd; kao običan rastvarač ili suspending rastvarač, može se koristiti sterilno "involatile" (esencijalno) ulje. Za ove potrebe mogu se koristiti bilo koja vrsta esencijalnog ulja i masnih kiselina uključujući prirodna ili sintetička ili polusintetička masna ulja ili masne kiseline; prirodni, sintetički ili polusintetički mono-, ili di-, ili tri-gliceridi. "Parental" administracija je poznata u ovoj oblasti i uključuje ali nije njima limitirana, konvencionalne načine injekciranja, sredstvo za injeciranje bez igle pod pritiskom gasa kao što je opisano u U.S. Patent No. 5,851,198 i sredstvo za lasersku perforaciju kao što je opisano u U. S. Pat. No. 5,839,446, kompletno obuhvaćeno ovde referncom.
Alternativne dostave
Ovaj pronalazak dalje se odnosi na administraciju makar jednog anti-dual integrinskog antitela na sledeće načine: subkutanozno, intramuskularno. intravensko, intrartikularno, intrabronhijalno, intraabdominalno, intrakapsularno, intrahrskavičavo, intracavitarno, intracelijarno, intracerebelarno, intracerebroventrikularno, intrakolikalno, intracervikalno, intraintragastrikalno, intrahepatikalno, intramiokardijalno, intraostealno, intrapelvikalno, intraperikardijalno, intraperitonealno, intrapleurealno, intraprostatno, intrapulmonarno, intrarcktalno, intrarenalno, intraretinalno, intraspinalno, intrasinovijalno, intratorakalno, intrauteralno, intravezikularno, bolus (za gutanje), vaginalno, rektalno, bukalno, sublingvalno, intranazalno, ili transdermalno. Makar jedna kompozicija anti-dual integrinskog antitela može se pripremiti za parenteralnu upotrebu (subkulanoznu, intramuskularnu ili intravensku) ili bilo koju drugu administraciju pogotovu u obliku tečnih rastvora ili suspenzija; za upoterbu za vaginalnu ili rektalnu administraciju pogotovu u polu čvrstom stanju kao što su, ali bez limitiranja na njih, kreme i supozitorije; za bukalnu ili sublingvalnu administraciju, kao što su, ali bez limitiranja na njih, u obliku tableta ili kapsula; ili intranazalno kao što su, ali bez limitiranja na njih, forme praha, nazalne kapljice ili aerosoli ili određeni agensi; ili transdermalno, kao što su, ali bez limitiranja na njih, gel, mast, losion, suspenzija ili flasterski sistemi dostave koji sa hemijskim enhanserima kao što je đimetil sulfoksid da bi se ili modifikovala kožna struktura ili povećala koncentracija leka u transdermalnom flasteru (Junginger, et al., u "Drug Permation Enhancement", Hseih, D. S. Eds., pp. 59-90 (Marcel Dekker, Inc. New York 1994, kompletno ovde obuhvaćeni referncom), ili sa oksidujućim agensom koji omogućava primenu formulacija koje sadrže proteine i peptide na koži (WO 98/53847), ili primene električnih polja za kreiranje tranzijentnih transportnih puteva kao što je elektroporacija, ili za povećanje mobilnosti naelektrisanih lekova kroz kožu kao jontoforeza, ili primenu ultrazvuka kao što je sonoforeza (U. S. Pat. Nos. 4,309,989 i 4,767, 402) (gore pomenute publikacije i patenti su kompletno obuhvaćeni ovde referencom).
Pulmonarna (plućna)/nazalna administracija
Za pulmonarnu administraciju, poželjno je da se dostavi makar jedna kompozicija anti-dual integrinskog antitela, određene veličine koja je efektivna za dosezanje nižih disajnih puteva pluća ili sinusa. Na osnovu pronalaska, makar jedno anti-dual integrinsko antitelo može se dostaviti pomoću različitih naprava za inhalaciju ili pomoću nazalnih naprava koje su poznate u ovoj oblasti, za administraciju terapeutskog agensa putem inhaliranja. Ova sredstva za deponovanje aerosolnih formulacija u sinusnu šupljinu ili alveole pacijenta, uključuju aerosolne pumpice (metered dose inhalers), nebulizatore (nebulizers), generatori suvog praha, sprejevi, i slični. Druga sredstva koja su pogodna za usmeravanje plućne ili nazalne administracije antitela poznati su uvoj oblasti. Sva ova sredstva mogu koristiti formulacije pogodne za administraciju za određivanje/raspoređivanje (dispensing) antitela u aerosolu. Ovakvi aerosoli mogu sadržati ili rastvore (obe, i vodene i ne-vodenc) ili čvrste čestice. Aerosolne pumpice (metered dosc inhalers) kao Ventoli<R>Metered dose inhalers, tipično koriste propellent gas i zahteva podstrek tokom inspiracije (videti, e.g., WO 94/16970, WO 98/35888). Inhalatori suvog praha kao Turbuhaler<*>(Astra), Rotahaler<R>(Glaxo), Diskus<R>(Glaxo), Spiros™ inhalator (sredstva označena od strane Inhale Terapeutics, i Spinhaler<R>inhalator praha (Fisions), upotreba "breath actuation" mešanih prahova (US 4668218 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, US 548135 Inhale, WO94/06498 fisons, kompletno obuhvaćeni ovde referencom). Nebulajzeri kao AERx™ Aradigm, Ultraven<R>nebulajzer (Mallinckrodt), i AkronlT nebulajzer (Marquest Medical Products) (US 5404871 Aradigm, WO 97/22376), gore pomenute reference su upotpunosti ovde obuhvaćene referencom, proizvode aerosol iz rastvora, dok aerosolne pumpice (metered dose inhalers), inhalatori suvog praha itd generišu male čestice aerosola. Ovi specifični primeri komercijalno dostupnih sredstava za inhalaciju imaju za cilj da budu predstavnici specifičnih sredstava pogodnih za primenu u ovom pronalasku, i nisu namenjeni da limitiraju područje ovog pronalaska. Poželjno je da se kompozicija koja sadrži makar jedno anti-dual integrinsko antitelo dostavi pomoću inhalatora suvog praha ili spreja. Postoji nekoliko poželjnih osobina koje poseduje sredstvo za inhaliranje za administraciju makar jednog antitela iz ovog pronalaska. Na primer, dostava pomoću sredstva za inhalaciju ima prednost u pouzdanosti, reproducibilnosti i tačnosti. Sredstva za inhalaciju mogu opcionalno da dostave male čestice, e.g., manje od 10 pjn, poželjno 1-5 fim, za dobru respiratornost. ;Administracija kompozicije dual integrinskog antitela u obliki spreja;Sprej sa dual integrin antitelo proteinskom kompozicijom može se proizvesti ušpricavanjem pod pritiskom suspenzije ili rastvora makar jednog anti-dual integrinskog antitela kroz nosnu šupljinu. Veličina i konfiguracija nosa, primenjeni pritisak, i stopa ubacivanja tečnosti (liquid feed), mogu se odabrati da bi se postigao željeni "output" i veličina čestica. Elektrosprej može se proizvesti, na primer, pomoću električnog polja koji je povezan sa kapilarnim ili nosnim ubacivanjem (feed). Sa prednošću, čestice makar jednog kompozicionog proteina anti-dual integrinskog antitela koje se dostavljaju pomoću spreja imaju čestice veličine makar 10 pun, poželjno u opsegu od oko lpim do oko 5 |im, i najpoželjnije od oko 2 pm do oko 3 pm. ;Formulacija kompozicionog proteina anti-dual integrinskog antitela pogodnog za upotrebu u spreju tipično uključuju kompozicioni protein antitela u vodenom rastvoru u koncentracijama od oko 0.1 mg go 100 mg makar jednog kompozicionog proteina anti-dual integrinskog antitela po mililitru rastvora ili mg/ml, ili bilo kog drugog opsega ili vrednosti u okviru toga, e.g, ali bez limitiranja na .1, .2, .3, .4, .5, .6, .7, .8, .9, 1, 2, 3,4, 5,6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, ili 100 mg/ml ili mg/gm. formulacija može da uključi agenseb, kao što su ekspicijent, pufer, izotonični agens, konzervans, "surfactant" (površinski aktivni agens), i poželjno cink. Formulacija takode može da uključi ekpicijent ili agens za stabilizaciju kompozicionog proteina antitela, kao što je pufer, redukujući agens, "bulk" (veliki) protein, ili ugljeni hidrat. "Bulk" (veliki) proteini korisni za formulaciju kompozicionih protena antitela uključuju albumin, protamin, ili slično, tipični ugljeni hidrati korisni za formulaciju kompozicionih protena antitela uključuju saharozu, manitol, laktozu, trehalozu, glukozu i slične. Formulacija kompozicionog proteina anti-dual integrinskog antitela može takođe da uključi "surfactant" (površinski aktivni agens), koji može da redukuje ili spreči površinski- izazvanu agregaciju proteinske kompozicije antitela izazvane atomizacijom rastvora pri formiranju aerosola. Različiti konvencionalni "surfactants" (površinski aktivni agensi) mogu se upotrebiti, kao estri poliksietilen masnih kiselina i alkohola, i stri poliksietilen sorbitol masnih kiselina. Količina će generalno varirati u opsegu između 0.001 i 14% po težini formulacije. Posebno poželjni "surfactants" (površinski aktivni agensi) za potrebe ovog pronalaska su poliksietilen sorbitan monooleat, polisorbat 80, polisorbat 20, i slični. Dodatni agensi poznati u ovoj oblasti za formulaciju proteina kao stoje dual integrinsko antitelo, ili njegove specificirane varijante ili delovi, mogu se takođe uključiti u formulaciju. ;Administracija kompozicije dual integrinskogantitelapomoću nebulizatora;(Nebulizer) ;Kompozicioni protein antitela može se administratirati pomoću nebulizatora, kao što je mlazni nebulizator ili ultrazvučni nebulizator. Tipično, u mlaznom nebulizatora, izvor kompresovanog vazduha se koristi za stvaranje mlaza vazduha velike brzine kroz otvor. Kako se gas širi van nosa, stvara se region niskog pritiska, koji izvlači rastvor kompozicionog protein antitela kroz kapilarnu cev koja je spojena sa rezervoarom sa tečnošću. Struja tečnosti iz kapilarne cevi se raspodeljuje u nestabilne filamente i kapljice kako napušta cev, stvarajući aerosol. opseg konfiguracija, stopa proticanja, i tipovi "baffle" mogu se upotrebiti da bi se postigle željene karakteristike izvođenja iz datih mlaznih nebulizatora. Kod ultrazvučnog nebulizatora koristi se električna energija visoke frekvence da bi se stvorila vibraciona, mehanička energija, tipično se koristi piozoelektrični transducer (provodnik). Ova energija se šalje formulaciji kompozicionog protein antitela bilo direktno ili kroz "coupling" tečnost, stvarajući aerosol uključujući kompozicioni protein antitela. Kao prednost, čestice kompozicionog protein antitela dostavljene pomoću nebulizatora imaju veličinu čestice manje od 10 pm, poželjno u opsegu od oko I pm do oko 5 pm, i najpoželjnije oko 2 pm do oko 3 pm. ;Formulacije makar jednog anti-dual integrinskog antitela pogodne za upotrebu sa nebulizatorom, bilo mlaznim ili ultrazvučnim, tipično uključuje koncentracije od oko 0.1 do oko 100 mg makar jednog proteina anti-dual integrinskog antitela po ml rastvora. Formulaci ja takođe može da uključi agense kao što su. akspicijent, pufer, izotonični agens, konzervans, "surfactant" (površinski aktivni agens), i poželjno je cink. Formulacija takođe može da uključi ekpicijent ili agens za stabilizaciju kompozicionog proteina anti-dual integrinskog antitela, kao što je pufer, redukujući agens, "bulk" (veliki) protein, ili ugljeni hidrat. "Bulk" (veliki) proteini korisni za formulaciju kompozicionih protena anti-dual integrinskog antitela uključuju albumin, protamin, ili slično. Tipični ugljeni hidrati korisni za formulaciju kompozicionih protena anti-dual integrinskog antitela uključuju saharozu, manitol, laktozu, trehalozu, glukozu i slične. Makar jedna formulacija anti-dual integrinskog antitela može takođe da uključi "surfactant"(površinski aktivni agens), koji može da redukuje ili spreči površinski- izazvanu agregaciju makar jednog anti-dual integrinskog antitela izazvane atomizacijom rastvora pri formiranju aerosola. Različiti konvencionalni "surfactants" (površinski aktivni agensi) mogu se upotrebiti, kao estri poliksietilen masnih kiselina i alkohola, i stri poliksietilen sorbitol masnih kiselina. Količina će generalno varirati u opsegu između 0.001 i 14% po težini formulacije. Posebno poželjni "surfactants" ;(površinski aktivni agensi) za potrebe ovog pronalaska su poliksietilen sorbitan monooleat, polisorbat 80, polisorbat 20, i slični. Dodatni agensi poznati u ovoj oblasti za formulaciju proteina kao što je protein antitelo, mogu se takođe uključiti u formulaciju. ;Administracija kompozicije dual integrinskog antitela pomoću aerosolnih;pumpica (Metered Dose inhalors);Kod aerosolnih pumpica (metered dose inhalors-MDI), "propellent" (pokretač), makar jedno anti-dual integrinsko antitelo, i bilo koji ekspicijenti ili aditivi nalaze se u kanisteru, kao mešavinam uključujući gas pod pritiskom u tečnom stanju. Aktivacija tj. odvrtanje "metering" ventila (ventil za odmeravanja) oslobađa mešavinu u obliku aerosola, poželjno je da su čestice koje on sadrži u opsegu veličine manje od oko 10 pm, poželjno oko lv do oko 5v, i najpoželjnije oko 2 pm do oko 3 pm. Željena veličina čestica aerosola može se dobiti upoterbom formulacije kompozicionog proteina antitela, koji se proizvodi različitim metodama poznatim onima koji se bave ovom oblašću nauke, uključujući mlazno drobljenje (jet-milling) u ovoj oblasti, isušivanje sprejom (spray drying), kondenzacija na kritičkoj tački (critical point condensation), i slično. Poželjne aerosolne pumpice uključuju one proizvedene od strane 3M ili Glaxo i upotrebljavaju hidrofluorougljenični propellant. ;Formulacije makar jednog anti-dual integrinskog antitela za upotrebu sa "metered dose" sredstvom za inhaliranje će generalno da sadrži fino razdvojen prah koji sadrži makar jedno anti-dual integrinsko antitelo kao suspenziju u nc-vodenom medijumu, na primer, rastvoreno u propellant-u uz pomoć surfactant-a (površinski aktivni agens). "Propellent" može biti bilo koji kanvencionalni materijal koji se koristi u i tu svrhu, kao hlorofluorougljenik, hidrohlorofluorougljenik, hidrofluorougljenik, ili hidrougljemk, uključujući trihlorofluoromrtan, dihlorodilfuorometan, dihlorotetrafluoroctanol i 1,1,1,2-tetrafluoretan, HFA-134a (hidrofluoroalkan-134a), HFA-227 (hidrofluoroaIkan-227) i shčni. Poželjno je da je propellant hidrofluorougljenik. Surfactant (površinski aktivni agens) može biti odabran da stabiliše makar jedno anti-dual integrinsko antitelo kao suspenziju u propelentu, da bi se zaštitio aktivni agens od hemijske degradacije, i sličnog. Pogodni "surfactans" (površinski aktivni agensi) predstavljaju sorbitan trioleat, sojin lecitin, oleinska kiselina, i slični. U nekim slučajevima poželjno je upotrebiti rastvarači ka što je etanol. Dodatni agensi koji su poznati u ovoj oblasti, mogu se uključiti u formulaciju proteina kao protein, takođe se mogu uključiti u formulaciju. ;Neko ko se bavi ovom oblašću prepoznaće da se metode iz ovog pronalaskase mogu ostvariti plućnom administracijom kompozicije makar jednog anti-dual integrinskog antitela preko sredstava koja nisu ovde opisana. ;Oralne formulacije i administracije;Formulacije za oralno oslanjaju se na ko-administraciju adjuvanta (e.g., resorcinoli i nejonski surfactants (površinski aktivni agensi) kao polioksietilen oleil etar i n-heksadecilpolietilen etar) da bi se veštački povećala propustljivost zidova creva, kao i na ko-administraciju enzimskih inhibitora (e.g., inhibitori pankreasnog tripsina, diizopropilfluorofosfat (DFF) i trazilol)) da bi se inhibirala degradacija enzima. Aktivna konstitutivna substanca čvrstog tipa forme doze (solid-type dosage form) za oralnu administraciju može se pomešati sa najmanje jednim aditivom, uključujući saharozu, laktozu, celulozu, manitol, trehalozu, rafinozu, maltitol, dekstran, škrobove, agar, arginate, hitine, hitosane, pektine, "gum tragacath", "gum arabic", želatin, kolagen, kazein, albumin, sintetičke i polusintetičke polimere, i glicerid. ove forme doza mogu takođe da sadrže drugi(e) tip(ove) aditiva, e.g., inaktivni diluirajući agens, lubrikant kao magnezijum stearat, paraben, konzervans kao sorbinska kiselina, askorbinska kiselina, alfa-tokoferol, antioksidant kao cistein, dezintegrator, vezivač, podebljivač, puferski agens, zaslađivački agens, agens za ukus, parfemski agens itd. ;Tablete i pilule mogu se dalje obraditi i od njih se mogu napraviti obloženi enterosolventni (enteric-coating) preparati.Tečni preparati za oralnu administraciju uključuju emulziju, sirup, suspenziju i rastvor, preparati koji su dozvoljeni za medicinsku upotrebu. Ovi preparati mogu sadržati inaktivne diluirajuće agense koji se obično koriste u pomenutoj oblasti, e.g voda. Lipozomi su takođe opisani kao sistemi za dostavu lekova, insulina i heparina (U.S. Pat. No. 4,239,754). Skorije, mikrosfere veštačkih polimera mešovitih amino kiselina (protenoidi) korišćeni su za dostavu farmaceutskih sredstava (U.S. Pat. No. 4,925,673). Dalje, jedinjenja nosači opisani u U.S. Pat. No.5,879,681 i U.S. Pat. No. 5,5,871,753 koriste se za dostavu biološki aktivnih agenasa oralnim putem i poznati su u ovoj oblasti. ;Mukozne formulacije i administarcija;Za obsorbciju kroz mukoznu površinu, kompozicije i metode adminstracije makar jednog anti-dual integrinskog antitela uključuju emulziju koja sadrži mnoštvo submikronskih čestica, mukoadhezivne makromolekule, bioaktivne pcptide, i vodenu kontinuiranu fazu, koja potpomaže absorbciju kroz mukozalne površine ostvarujući mukoadheziju čestica emulzije (U.S.Patmo. 5,514,670). Mukozne površine pogodne za primenu emulzija iz ovog pronalaska mogu da uključe kornealni, konjuktivalni, bukalni, sublingvalni, nazalni vaginalni, plućni, želudačni, intestinalni, i rektalni put administracije. Formulacije vaginalne ili rektalne administracije, e.g., supozitorije, mogu da sadrže ekcipijcnte, na primer, polialkenglikole, vazeline, kakao puter, i slične. Formulacije za intestinalnu administraciju mogu biti čvrsti i sadržati ekpicijente, na primer, laktozu ili mogu biti vodeni ili uljani rastvori nazalnih kapi. Za bukalnu administraciju ekspicijenti uključuju šećere, kalcijum stearat, magnezijum stearat, preželatinizirani škrob, i slične, (U.S.Pat.No. 5,849,695). ;Transdermalne formulacije i administarcija;Za transdermalnu administraciju, makar jedno anti-dual integrinsko antitelo je inkapsulirano u sredstvu za dostavu kao što je lipozom ili polimerne nanočestice, mikročestice, makrokapsule, ili mikrosfere (odnosu se kolektivno na mikročestice ukoliko nije drugačije naznačeno). Poznat je veliki broj pogodnih sredstava, uključujući mikročestice napravljene od sintetičkih polimera, kao polihidroksilne kiseline, kao poliaktička kiselina, poliglikolna kiselina, i njihovi kopolimeri, poliortoestri, polianhidridi, polifosfazeni, i prirodni polimeri kao kolagen, poliamino koseline, albumin i drugi proteini, alginat i drugi polisaharidi. i njihove kombinacije (U.S.Pat.Nos.5,814,599). ;Produžena administarcija i formulacije;Ponekad može da bude poželjno da se jedinjenja iz ovog pronalaska dostave subjektu tokom produženog vremenskog perioda, na primer, tokom perioda od jedne nedelje do jedne godine, iz pojedinačne administracije. Različite forme doza koje se sporo otpuštaju, depo ili implant forme doza mogu se upotrebiti. Na primer, forma doze može da sadrži farmaceutsko prihvatljivu ne-toksičnu so jedinjenja koje poseduje nizk stepen rastvorljivosti u telesnim tečnostima, na primer, (a) kiselina dodata soli sa polibaznom kiselinom kao što je fosforna kiselina, sumporna kiselina, limunska kiselina, tartarna kiselina, tanična kiselina, pamoična kiselina, algininska kiselina, poliglutaminska kiselina, naftalen mono-ili di- sulfonska kiselina, poligalakturonska kiselina i slične (b) so sa polivalentnim katjonom metala kao što je cink, kalcijum, bizmut, barijum, magnezijum, aluminijum, bakar, kobalt, nikl, kadmijum i slični, ili sa organskim katjonom iz e.g., N,Nž-dibenzil-etilenamid ili etilendiamin; ili (c) kombinacija od (a) i (b) e.g., so zink tanat. Dodatno, jedinjenja iz ovog pronalaska ili poželjno relativno nerastvorljiva so kao one koje su upravo opisane, mogu biti formulisane u gelu, na primer aluminijum stearat gel sa e.g., sezamovim uljem, pogodni za injektiranje. Posebno su poželjne soli, cink tanat soli, pamoatne soli, i slične. Još jedan tip formulacije za sporo otpuštanje depoa za injektiranje sadržao bi jedinjenje ili so dispergovane za enkapsulaciju u sporo razlažućem, ne-toksičnom, ne-antigenom polimeru kao što je polimer polisirćetne kiseline/poliglikolne kiseline na primer kao što je opisano u U.S. Pat. No. 3,773,919. Jedninjenja ili poželjnije relativno nerastvorljive soli, kao one opisane u tekstu iznad, mogu biti formulisana u holesterol matriks silikatnim talozima (pellets), pogotovu za upoterbu u životinjama. Dodatno sporo oslobađanje, formulacija za depo ili implant, e.g., gasni ili tečni lipozomi poznati su u literaturi (U.S. Pat.Nos. 5,770,222 i "Sustained and Controlled release Drug Delverv svstem", J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y.,1978). ;Pošto smo uopšteno opisali pronalazak, isti će se bolje razumeti pomoću referenci iz primera koji slede, koji su dopunjeni sa ilustracijama koje nisu limitirajuće. ;Primer1:Kloniranje i ekspresija dual integrinskog antitela u sisarskim;ćelijama;Tipičan sisarski ekspresioni vektor sadrži makar jedan promotorski element, koji posreduje u inicijaciji transkripcije iRNK, kodirajuću sekvencu za antitelo, i signale potrebne za terminaciju transkripcije i poladenilaciju transkripta. Dodatni elementi uključuju enhancere, kozak sekvence i interventne sekvence okružene donorskim i akceptorskim mestom za splajsovanje RNK. Visoko efikasna transkripcija može se postići sa ranim i kasnim promotorima iz SV40, sa dugim terminalnim ponovcima (DTP) (LTRLJlong terminal repeats) iz retrovirusa, e.g., RSV, HTLVI, HIVI i rani promotor citomegalovirusa (CMV). Međutim, ćelijski elementi mogu se takođe upotrebiti (e.g., humani aktinski promotor). Pogodni ekspresioni vektori za primenu u ovom pronalasku uključuju, na primer vektore kao, pIRESlneo, pRetro Off, pRetro-On, PLXSN, ili pLNX (Clonetech Labs, Palo Alto, CA), pcDNK3.1 (+/-), pcDNK/Zeo (+/-), pcDNK3. l/Hygro (+/-) ;(Invitrogen), PSVL i PMSG (Pharmacia, Uppsala, Svveeden), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) i pBC12M (ATCC 67109). Sisarske domaćinske ćelije koje bi se mogle koristiti uključuju humane Hela 293, H9 i Jurkat ćelije, misije NIH3T3 ćelije i Cl27 ćelije, Cos 1, Cos 7 i CV1, prepeličije QCl-3 ćelije, misije L ćelije i ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO). ;Alternativno, gen se može eksprimirati u srabilnim ćelijskim linijama koje sadrže gene integrisane u hromozomu. Kotransfekcija sa selektivnim markerom kao što je dhfr, gpt, neomicin i higromicin dozvoljavaju identifikaciju i izolaciju transfektovanih ćelija. ;Transfektovani gen može se takođe umnožiti da bi eksprimirao velike količine kodiranog antitela. DHFR (dihidrofolat reduktaza)markcr je koristan za razvoj ćelijskih linija koje imaju nekoliko stotina ili nekoliko hiljada kopija gena od interesa. Još jedan koristan selekcioni marker je enzim glutamin sintaza (GS) ;(Murphy et al., Biochem. J. 227:277-279 (1991); Bebbington, et al., Bio/Technology 10:169-175 (1992). Upotrebom ovih markera, sisarske ćelije gaje se u selektivnom medijumu i ćelije sa najvećom rezistencijom su one koje se selektuju. Ove ćelijske linije sadrže umnožene gen(e) integrisane u hromozom. Ćelije iz jajnika kineskog hrčka (CHO) i NSO ćelije često se koriste za proizvodnju antitela. ;Ekspresioni vektori pCl i pC4 sadrže snažan promotor (LTR) Raus sarkoma virusa (Cullen, et al., Molec. Cell. Biol. 5:438-447 (1985)) plus fragment CMV-enhancera (Boshart, et al., Cell 41:521-530 (1985)). Mesta za višestruka kloniranja e.g., sa mestima za restrikciona sečenja enzima, BamHI, Xbal i Asp718, olakšavaju kloniranje gena od interesa. Vektori dodatno sadrže 3ž intron, signal za poliadenilaciju i terminaciju iz pacovskog preproinsulinskog gena. ;Kloniranje i ekspresija u CHO ćelijama;Vektor pC4 se koristi za ekspresiju dual integrinskog antitela. Plazmid pC4 je derivat plazmida pSV-dhfr (ATCC Acession No 37146). Plazmid sadrži misiji DHFR gen koji stoji pod kontrolom SV40 ranog promotora. Ćelije jajnika kineskog hrčka - ili druge kojima nedostaje dihidrofolatna aktivnost koje se transfektuju sa ovim plazmidima mogu se selektovati gajenjem ćelija na selektivnom medijumu (e.g., alfa minus MEM, Life technologies, Gaithersburg, MD) kome je dodat hematotcrapeutski agens metotrcksat. Amplifikacija DHFR gena u ćelijama rezistentnim na metotreksat (MTX) dobro je dokumentovana (videti, e.g., F. W. Alt et al., J. Biol. Chem. 253:1357-1370 (1978); J. L. Hamlin i C. Ma, Biochem. et Biophvs. Acta 1097:107-143 (1990); i M. J. Page i M. A. Svdenham, Biotechnology 9:64-68 (1991)). Ćelije gajene u povišenoj koncentraciji MTX razvile su rezistenciju na lek previše (over) produkujući ciljni enzim, DHFR, kao rezultat amplifikacije DHFR gena. Ako je drugi gen povezan sa DHFR genom, najčešće se on ko-umnožava i over-eksprimira. Poznato je u oblasti da se ovaj pristup može koristili za razvoj ćelijskih linija koje nose više od 1,000 kopija amplifikovanog(ih) gena. Zatim, kada se povuče metotreksat, dobijene ćelijske linije sadrže umnožen gen koji je integrisan u jedan ili više hromozoma domaćinske ćelije. ;Plazmid pC4 sadrži za ekspresiju gena od interesa, jak promotor dugih terminalnih ponovaka (LTR) Raus sarkoma virusa (Cullen, et al., Molec.Cell.Biol. 5:438-447 ;(1985)) plus fragment izolovan iz enhancera iz momentalnog ranog gena humanog citomegalovirusa (CMV) (Boshart, et al., Cell 41:521-530 (1985)). Nizvodno od promotora su restrikciona mesta za restrikcione enzime BamHI, Xbal i Asp718 koja omogućavaju integraciju gena. Iza ovih mesta za kloniranje plazmid sadrži 3ž intron i poliadenilaciono mesto iz pacovskog preproinsulinskog gena. Drugi visoko efikasni promotori mogu se koristiti za ekspresiju, e.g., promotor humanog b-aktina, SV40 rani ili kasni promotori ili dugi termrminalni ponovci iz drugih retrovirusa, e.g., HrV i HTLVI. Clontech-ovi Tet-on i Tet-off genski ekspresioni sistemi i slični sistemi mogu se iskoristiti za ekspresiju dual integrina na regulisan način u sisarskim ćelijama (M. Gossen, and H. Bujard. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 (1992)). Za poliadenilaciju iRNK mogu se koristiti drugi signali e.g., iz humanog hormona rasta ili globinskih gena. Stabilne ćelijske linije koje nose gen od interesa integrisan u hromozome, mogu se takođe selektovati po kotransfekciji sa sa selekcionim markerom kao gpt, G418 ili higromicin. Upotreba više od jednog selektivnog markera u početku, e.g., G418 plus metotreksat pokazuje prednost. ;Plazmid pC4 se seče (digerira) sa restrikcionim enzimima i zatim defosforiliše pomoću fosfataze iz creva teleta procedurom poznatom u ovoj oblasti. Vektor se tada izoluje iz 1% agaroznog gela. ;Koristi se DNK sekvenca koja kodira kompletno dual integrinsko antitelo, koja odgovara HC i LC varijabilnim regionima dual integrinskog antitela iz ovog pronalaska, na osnovu poznatih koraka u metodi. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira pogodan humani konstantan region (i.e., HC i LC regione) takođe se ovde koristi. ;Izolovana DNK koja kodira varijabilni i konstantni region i defosforilovani vektor se zatim ligiraju sa T4 DNK ligazom.E. coliHB101 ili XL-1 Blue ćelije se zatim transformišu i bakterije koje sadrže plazmid pC4 sa ubačenim fragmentom se detektuju na primer restrikcionom analizom. ;Ćelije iz jajnika kineskog hrčka (CHO) kojima nedostaje DHFR gen korite sc za transfekciju. 5 pg ekspresionog plazmida pC4 se kotransfektuje sa o.5 pg plazmida pSV2-neo pomoću lipofektina. Plazmid pSV2neo sadrži dominantan selektibilni marker, neo gen iz Tn5 koji kodira enzim koji potvrđuje rezistenciju ;na grupu antibiotika uključujući G418. Ćelije se zasejavaju u alfa minus MEM sa 1 pg/ml G418. Posle dva dana ćelije se tripsiniziraju i zasejavaju u hibridoma pločama za kloniranje (greiner, Germanv) u alfa minus MEM sa dodatkom 10, 25 ili 50 ng/ml metotroksata plus 1 pg/ml G418. Posle oko 10-14 dana pojedinačni klonovi se tripsinizuju u zasejavaju na petri šoljama sa 6 bunarčića ili flaskovima od 10 ml upotrebljavajući različite koncentracije metatroksata (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Klonovi koji rastu na najvećim koncentarcijama metotreksatase zatim prebacuju na nove šolje sa 6 bunarčića koje sadrže još veće koncentracije metotreksata (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM). Ista procedura se ponavlja sve dok se ne dobiju klonovi koji rastu na koncentracijama od 100-200 mM. Ekspresija željenog genskog proizvoda se analizira, na primer, pomoću "SDS-PAGE" ili "VVestern blot" analizom ili "reverse phase HPLC" analizom. ;Primer 2: Metod za pravljenje i karakterizaciju nelimitirajućeg primera potpuno humanog dual integrinskog antitela ;Kratak pregled. ( CBA/JxC57/BL6/J)F2hibridni miševi (Tavlor et al., International Immunologv 6:579-591 (1993); Lonberg et al., Nature 368:856-859 ;(1994); neuberger, Nature Biotechnologv 14:826 (1996); Fishvvild et al., Nature Biotechnologv 14:845-851 (1996) koji sadrže transgene humanog konstantnog i varijabilnog regiona za oba i laki i teški lanac imunizovani su sa humanim placentalnim aVp>3. Jedna fuzija je dala 2 potpuno humana aV(33 reaktivna IgG 1k monoklonalna antitela, nazvana GenO.95 i GenO. 101. Potpuno humani anti-aV(33 antitela su dalje karakterisana i za oba je nađeno da su reaktivna na aV(33 i aVf35 heterodimere što ukazuje na specifičnost alfa lanca koja dele, od oba molekula, jedno Mab (MA), GenO.95, takođe poznato kao CNTO 95, inhibira vezivanje oba aVfi3 i aV(35 za vitonektin u esejima koji se baziraju na ćeliji. ;Skraćenice: ;BSA - serum albumin govečeta ;C02 -ugljen dioksid ;DMSO - dimetil sulfoksid ;EIA -enzimski imunoesej ;FBS -fetalni serum govečeta ;H202- vodonik peroksid ;HC - težak lanac ;HRP - peroksiđaza rotkvice ;Ig - imunoglobulin ;IP - intraperitonealno ;IV - intravensko ;Mab - monoklonalno antitelo (Ma) ;OD - optička gustina ;OPD - o-fenilenediamin dihidrohlorid ;PEG - polietilen glikol ;PSA - penicilin, tetraciklin, amfotercin ;ST - sobna temperatura ;SQ - subkutanozno ;TBS - Tris-om puferovan fiziološki rastvor ;v/v - zapremina po zapremini ;w/v - te.ina po zapremini ;Uvod:;Koristili smo transgene miševe koji sadrže humane gene za tažak i lak lanac imunoglobulina da bi se dobila humana monoklonalna antitela koja su specifična na aV integrine. Ova nova antitela mogu se koristiti terapeutski za inhibiciju angiogenskih procesa blokirajući vezivanje aV integrina za njihove odgovarajuće Ugande, i obezbeđuju dodatan alat u lečenju različitih kanccra. ;Materijal i metode;Životinje;Transgeni miševi, koji eksprimiraju imunoglobuline ali ne misiji IgM ili IgK, razvijeni od strane GenPharm International. Ovi miševi sadrže transgene sa humanom sekvencom koja prolazi kroz V(D)J spajanje, promenu klase teškog lanca (heavy chain switching) i somatske mutacije da bi se generisao repertoar sekvenci humanih imunoglobulina (Tavlor, et al., International Immunology 6:579-591 (1993)). Transgen za laki lanac je dobijen delom iz veštačkog hromozomalnog klona kvasca koji uključuje skoro polovinu humanog Vkregiona germinativnih ćelija. Kao dodatak nekoliko VH gena, transgen teškog lanca (TL) ;(heavy chain HC) kodira oba i humani p i humani yl (Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994)) i/ili y3 konstantne regione. Miš dobijen iz HC012 genotipske linije je korišćen za imunizaciju i fuzione procese da bi se dobila ova monoklonalna antitela. ;Prečišćevanje Humanog ccVfi3 ;Humana posteljica (iseckana u mlevilici za meso) ili M21 humane ćelije melanoma koje eksprimiraju aVp3 integrin ekstrahovane su sa fiziološkim rastvorom koji sadrži 20 mM Tris pH 7.5, 1 mM CaCl2, lmM MnCl,, 100 mM oktiltioglukozid (OTG od Pierce), 0.05% natrijum azid i lmM fenilmetilsulfonil florid (Sigma). Mešavina se mešala tokom 1 sata na ST i izbistrena centrifugiranjem na 10,000 x g. Supernatant iz ekstrakta placente je nanesena na afinitativnu kolonu koja se sastoji od Mab (Ma) 10E5 vezane za sefarozu (Pharmacia) da bi se uklonilo GPiIb/IIIa i zatim je primenjen mlaz kroz frakciju (flow through fraction) na afinitativnoj koloni koja se sastoji od Mab (Ma) c7E3 Fab vezanog za sefarozu (Pharmacia) da bi se vezao ocVp3. c7E3 kolona je isprana sa PBS koji sadrži 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2i 0.1% OTG zatim je sledio 0.1 M natrijum acetat pH 4.5, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2 i 0.1% OTG pH3.0. Kolona je eluirana sa 0.1 M glicinom, 2% sirćetnom kiselinom, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2 i 0.1% OTG. Eluat koji sadrži prečišćen aVp3 neutralisan je sa 2 M Tris pH 8.5. Čistoća preparata je karakterisana SDS-page analizom i ELISA testom da bi se eliminisala GPJJb/IIIa kontaminacija (Wayner, et al. J. Cell bol. 113:919-929(1991)). ;Imunizacija ;Hirurški kastrirani mužjak miša, star od petnaest do 17 nedelja, nabavljen od GenPharm je imunizovan IP (200 pl) i na dva mesta SQ (100 pl po mesna) sa ukupno 20 pl placentalnog aVp3 (prep V frakcija, JG21197) emulzifikovanog sa istom zapreminom kompletnog Freund-ovog adjuvanta (dan 0). Miš je imunizovan dve nedelje kasnije na isti način sa aV<p>3 emulzifikovan sa istom količinom nekompletnog Freund-ovog adjuvanta. Tri kasnije 10 pg IP/ 10 pg SQ injekcije sa nekompletnim Freund-ovim adjuvantom date su 28, 42 i 56 dana. □ Miš je iskrvavljen na 42 i 56 dan pomoću retro orbitalne punkture bez anti-koagulanta. Krv je puštena da se zgruša na ST tokom jednog sata i sakupljen je serum i titriran pomoću aVP3 čvrste faze EIA esejom. Fuzija, nazvana GenO, izvedena je kada ponovljena injekciranja nisu izazivala porast titra. U to vreme, mišu sa specifičnim humanim IgG titra 1:1280 nasuprot aVP3, dat je finalni IV "booster" injekcija (revakcinacija) od 10 pl aVp3 diluiran u 100 pl fiziološkog rastvora. Tri dana kasnije, miš je eutanaziran cervikalnom dislokacijom i aseptički je uklonjena slezina i potpoljena u 10 ml hladnog fosfatom puferovanog fiziološkog rastvora (PBS) koji sadrži 100 U/ml penicilina, 100 pg/ml streptomicina, i 0.25 pg/ml amfotercina B (PSA). Splenocite (ćelije slezine) su pokupljene sterilnim ubacivanjem tečnosti, PSA-PBS (perfusing) u slezinu. Ćelije su zatim isprane u hladnom PSA-PBS, prebrojane pomoću ekskluzije Tripan blue bojom i resuspendovane u RPMI 1640 medijumu sa 25 mM HEPES. ;Ćelijske linije;Nesekretujući misiji mijeloma fuzioni partner, SP2/0 primljen je u Cell Biologv Service (CBS) grupi 9-1-93. Ćelijska linija je proširena i aMEM (modifikovani) medijumu (JRH Biosciences) sa dodatkom 10% (v/v) FBS (Cell Culture Labs), 1 mM natrijum piruvat, 0.1 mM NEAA, 2 mM L- glutamin (svi iz JRH Biosciences) i krioprezervirana u 95% FBS i 5% DMSO (Sigma), zatim skladištena u isparljivoj fazi tečnog azota frizeru u CBS. Ćelijska banka je bila sterilna (Quality Control Centocor, Malvern) i bez mikoplazme (Bionique Laboratories). Ćelije su održavane u kulturi u log fazi do fuzije. Isprane su sa PBS, prebrajane, određena im je vijabilnost (veća od 95%) preko ekskluzije pomoć tripan plave boje pre fuzije. ;M21 ćelijska linija, humani melanom koji eksprimira aV(33 i aV(55 integrine, razvijen je i krioprezerviran. Istraživačka ćelijska banka sa 10 vajli primljena je u Cell Biology Service i čuvana u tečnom azotu. Ćelijska banka je bila sterilna i bez mikoplazme (Bionique Laboratories). MDAMB435L2, humani karcinom dojke, je bio poklon od Dr, Jnet Priče (MD Anderson, Houston TX) eksprimira integrin aV(33. Ćelijska linija je krioprezervirana u Cell Biology Service. Ćelijska banka je bila sterilna i bez mikoplazme (Bionique Laboratories). M21 i MDAMB435L2 su otopljene, propagirane u odgovarajućem medijumu i održavane u log fazi tokom nekoliko dana pre upotrebe u bioeseju ili im je dozvoljeno da dosegnu konfluentnost za upotrebu u prečišćavanju aV[33 proteina (M21 ćelije). ;Ćelijska fuzija;Fuzija je izvedena u odnosu 1:1 misije ćelije mieloma (SP2/0) u odnosu na vijabilne ćelije slezine. Ukratko, ćelije slezine i mieloma su zajedno nataložene. Talog je lagano resuspendovan tokom 30 sekundi u 1 mL 0% (w/v) PEG/PBS rastvoru (PEG molekulske težine 3,000, Sigma) na 37°C. Fuzionisanje je zaustavljeno laganim dodavanjem 1 mL Dulbekovog PBS (JRH) (37°C) tokom 1 minuta. Dodatna količina od 19 mL PBS-a je dodata tokom sledećih 90 sekundi, fuzionisane ćelije su centrifugirane tokom 5 minuta na 750 rpm. Ćelije su zatimresuspendovane u HAT medijumu (aMEM medijum koji sadrži 20% fetalni serum govečeta (JRH), 1 mM natrijum piruvat, 2 mM L-glutamin, 0.1 mM neesencijalne amino kiseline, 10 pg/mL gentamicina, 2.5% Origen dodatak za gajenje (Fisher), 50 uM 2-merkaptoetanol, 10 pM hipoksantin, 0.4 pM aminopterin, i 16 pM timidin) i zatim su zasejane u trinaets ploča za gajenje sa ravnim dnom sa 96-bunarčića i to 200 pL/bunarčiću. Ploče su zatim stavljene u inkubator sa regulisanom vlažnošću na 37°C sa 5% C02 i 95% vazduhom tokom 7-10 dana. ;Detekcija humanih IgGanti-aVp3antitela u mišijem serumu;Čvrsta faza EIA upotrebljene su za skrinovanje mišijeg seruma za humana IgG antitela specifična za humani aV|33. Ukratko, na ploče su naneseni aV(33 1 pg/ml u PBS preko noći. Posle ispiranja u 0.15 M fiziološkom rastvoru sa 0.02% (v/v) Tvveen 20, bunarčići su blokirani sa 1% (vv/v) BSA u HBSS ca Ca<++>i Mg<++>, 200 pl/bunarčiću tokom 1 sata na ST. Ploče su odmah upotrebljene ili zamrznute na - 20°C za kasniju upotrebu. Misiji serum je inkibiran u duplirajućim razblaženjima na aVf33 pločama 50 pl/bunarčiću tokom 1 sata na ST. Ploče su zatim isprane i urađene probe sa 50 pl/bunarčiću HRP -obeleženim kozijim anti-humanim IgG, Fc specifičan (Accurate) razblažen 1:30,000 u 1% BSA-PBS tokom lsata na ST. Ploče su ponovo isprane i dodat je 100 pl/bunarčiću substratnim rastvorom citrat fosfata (0.1 M limunska kiselina i 0.1 M natrijum fosfat, 0.01% H202i 1 mg/ml OPD) tokom 15 minuta na ST. Zatim je dodat rastvor za zaustavljanje reakcije (stop solution) (4N sulfurna kiselina) u koncentraciji 25 pl/bunarčiću i očitane su OD na 490 nm preko automatskog "plate" spektrofotometra. ;Detekcija ukupnih humanih imunoglobulina u supernatantu hibridoma;Usled toga što je GenPharm miš sposoban da generiše i mišije i humane imunoglobulinske lance, pozitivne na rast hibridome koje sekretuju kompletne humane imunoglobuline detektovane su pomoću dva odvojena EIA sistema. Ploče su pripremljene kao što je opisano u tekstu iznad i supernatanti hibridoma su inkubirani na pločama jedan sat na 37°C. Ploče su isprane i urađene su probe na ili HRP-obeležena kozija anti-humana kappa (Southern Biotech) antitela razblažena 1:10,000 u 1% BSA-HBSS ili HRP-obeležena kozija anti-humana IgG Fc specifična antitela razblažena 1:10,000 u 1% BSA-HBSS jedan sat na 37°C. Ploče su zatim inkubirane sa substratnim rastvorom kao Stoje opisano u tekstu iznad. ;Određivanje izotipova;Određivanje izotopa antitela je urađeno pomoću EIA u formatu sličnom onom za skrinovanje mišijeg imunog seruma za specifičan titar. aV(33 je nanešen na ploče sa 96 bunarčića kao što je opisano u tekstu iznad i prečišćena antitela 2 pg/mL su inkubirana na pločama tokom jednog sata na ST. Ploče su isprane i urađene su probe na HRP-obeležena kozija anti-humana IgGl (mesto za vezivanje) ili HRP-obeležena kozija anti-humana IgG3 razblažena 1:4000 (Zymed) u 1% BSA-HBSS tokom jednog sata na ST. Ploča je ponovo isprana i inkubirana sa substratnim rastvorom kao što je opisano iznad. ;Karakteristike vezivanja humanih monoklonalnih antitela pomou EIA ;Karakteristike vezivanja za antitela su procenjene pomoću EIA koji zadržava ocV[33 (aVp3 capture EIA). Na "Linbro" ploče su nanesena aVp3 1<p>g/mL u TBS sa 2 mM kalcijumom preko noći na 4°C. Ploče su isprane i blokirane sa TBS/l%BSA/kalcijum tokom najmanje jednog sata na ST. Prečišćena antitela su inkubirana u duplirajućim razblaženjima počevši od koncentracije od 2 pg/mL. Ploče su isprane i dodata su konjugovana antitela (HRP obeležena kozija anti-humana IgG Fc 1:30,000) i inkubirana na pločama tokom jednog sata na ST. Ploče u isprane OPD substrat je dodat bunarčićima. Ploče su očitane preko automatskog spektrifotometra za čitanje ploča. ;Kompeticija vezivanja Gen095 za M21 ćelije od strane različitih komercijalnih anti-integrin Mabs (monoklonalna antitela) ;M21 ćelije su tripsinizovane iz flaskova za gajenje kultura isprane i resuspendovane u HBSS/kalcijum do 2xl0<6>ćelija/ml. Gen95 su obeležene sa FTC-kozijim anti-humanim Fc (Jackson) tokom 30 minuta na ST. 10x koncentracije Gen095 od 200 pg/mL ili 20 pg/mL su inkubirane sa FTC-kozijim anti-humanim IgG pri koncentraciji od 250 pg/mL. Alikvoti od 100 pg/mL M21 ćelija (2xl0<5>) su inkubirane sa 12 pl 10x Gen095 pri visokim (20 pg/mL finalno) i niskim (2 pg/mL finalno) koncetracijama +/- 12 pl sledećih mišijih antitela: m7E3 IgG, anti -aVp3 (klon LM609, Chemicon), anti-aVp5 (klon P1F6, Gibco), anti-<p>3 (Chemicon, AMAC), ili anti-aV (klon VNR139, Gibco) antitela (na 20 pg/mL) tokom 45 minuta na 37°C. Alikovot je uklonjen iz svake tube (epruvete) ;(za dvokolornu analizu) i ostatak je fiksiran sa 1% paraformaldehidom i analiziran sa "flow" citometrom. Za dvokolornu analizu alikvot (50 pl) je inkubiran sa PE-kozijim anti mišijim IgG tokom 30 minuta na ST da bi se obeležila mišija anti-aV<p>3, anti-aV<p>3, anti-<p>3, ili anti-aV antitela za dvokolornu analizu. Sve tube su fiksirane sa 1% paraformaldehidom. ;Inhibicija aVfi3 ili aVP5 zavisnih M21 ćelija ili MDAMB435L2 ćelijska adhezija vitronektinom obloženih ploča sa ccVp3/aVp3 specifičnim Mabs ;(Ma) ;Linbro ploče su obložene tokom 1 sata na sobnoj temperaturi sa 50 pg/bunarčiću vitronektina (Collaborative, Becton Dickinson) pri koncentraciji 5pg/mLu TBS sa 2 mM kalcijumom. Ploče su isprane sa HBSS/kalcijum i blokirane sa TBS koji sadrži 2 mM kalcijum i 1% BSA tokom 30 minuta na ST. M21 ćelije si tripsinizovane, jednom isprane sa medijumom koji sadrži FCS i resuspendovane u 3 ml HBSS bez kalcijuma. Sva ispiranja su urađena u centrifugi sa 10-to minutnim centrifugiranjima na 1000 rpm u Sorval stonoj centrifugi. Za fluorescentno obeležavanje ćelija kalcein (Molecular Probes) (5 mg/ml u DMSO) je dodat ćelijama u finalnoj koncentraciji od 100 pg/mL u koničnim tubama od 50 ml (umotane u foliju). Ćelije su inkubirane 10 do 15 minuta na 37°C. Ćelije obeležene kalceinom jednom su isprane sa HBSS i resuspendovane u HBSS sa dodatkom 0.1% BSA i 1 mM MgCT. Antitela su titrovana (serije od 14 puta razblaženja) u HBSS/0.1%? BSA72 mM kalcijum u 10x koncetraciji. Ćelije (300 pl na 7.5xl0<6>/ml) su preinkubirane sa titracijama antitela (37pl 10x rastvora) +/- anti-aVp5 (P1F6) ascites (hidroperitoneum) (Chemicon) (37 pl 1:600 (10X)) tokom 15 minuta na 37°C. Mešavina ćelija sa antitelima dodata je pločama obloženim sa vitronektinom 100 pl/ bunarčiću u triplikatu (približno 6 x 10<5>ćelija/bunarčiću). Ploče su inkubirane tokom 45 minuta na 37°C. Nevezane ćelije su uklonjene pomoću dva ispiranja sa HBSS/kalcijum (150 pl/bunarčiću). 100 pl HBSS/kalcijum dodato je svakom bunarčiću i ploče su iščitane na Fluorskenu na 485-538 nm. ;U odovojenom eseju, MDABMB435L2 ćelije himanog kancera dojke su pokupljene sa natrijum versenatom (natrijumova so EDTA, "versene") i resuspendovane u medijumu bez seruma na 500,000 ćelija/ml i inkubirane sa različitim koncentracijama Gen095. Posle 10 minuta inkubacije suspenzije tumorskih ćelija (lOOpl) dodata je Lindro pločama obloženim vitronektinom(K) pg/ml) i inkubirano na 37°C. Posle 1 sata bunarčići su isprani tri puta sa medijumom bez seruma (200 pl/ispiranju) i svakom bunarčiću je dodat MTT baziran Cell Titer AQ boja (Promega). Nivo ćelijske adhezije je određen ELISA plate reader-om gde je OD490 direktno proporcionalna ćelijskoj adheziji. Ćelijska adhezija u bunarčićima obloženim sa BSA služila je kao negativna kontrola. ;OdređivanjeCa<++>zavisnosti vezivanja anti-himanih VV33/VV35 Mabs (Ma) za njihove ligande ;Da bi se odredila katjonska zavisnost u vezivanju CNTO 95 i C372 za VV33 ili VV35, EIA tečne faze je primenjen. EIA ploče (Corning) koje su obložene sa CNTO 95, C372, c7E3 ili LM609 IgG Mabs (Ma) 10 :g/ml u "carbonate coating" puferu preko noći na 4EC. Ploče su blokirane sa 1% BSA razblaženim u HBSS u prisustvu ili odsusu 2 mM Ca++ najmanje jedan sat na 37EC. Duplirajuća razblaženja VV33 (log JG52599) ili VV35 (Chemicon) počevši od 10 :g/ml, su preinkubirana sa 50 mM EDTA (Sigma) u 1% BSA/HBSS bez Ca<++>ili sa 1% BSA/HBSS Osa Ca<++>tokom 30 minuta na 37EC. Zatim su dodate pločama mešavine i inkubirane 30 minuta na 37EC. Ploče su zatim isprane i nekompetitivna Mabs (Ma) su dodata pločama na seldeći način: CNTO 95, C372, c7E3 obloženim pločama da bi se detektovalo VV33 vezivanje, Mab (Ma) LM609 je dodat 20 :g/ml u 1% BSA/HBSS V Ca<++>; LM609 obloženim pločama da bi se detektovalo VV33 vezivanje, Mab (Ma) CNTO 95 je dodat 20 :g/ml u 1 % BSA/HBSS V Ca<++>; CNTO 95, C372, c7E3 obloženim pločama da bi se detektovalo VV35 vezivanje, Mab (Ma) VNR139 (Gibco) dodat je 10 :g/ml u 1% BSA/HBSS V Ca<++>i inkubirano je 30 minuta na 37EC. Ploče su ponovo isporane i urađene probe na HRP-om obeležena kozija anti-mišija IgG Fc ili HRP-om obeležena kozija anti-humana IgG Fc u odgovarajućem puferu i nkubirana su 30 minuta na 37EC. Ploče su zatim isprane, OPD substrat je dodat i OD490 je izmerena kao stoje ranije opisan. ;Rezultati i diskusija ;Generisanje ukupnih humanih anti-humanih aV(33 integrinskih monoklonalnih antitela ;Jedna fuzija, nazvana GenO, izvedena je iz GenPharm miša imunizovanog sa aV(33 proteinom. Iz ove fuzije, skrinovana su 129 pozitivnina hibrida koja su izrasla. Identifikovane su dve hibriodoma ćelijske linije identifikovane koje sekretuju ukupna humana IgG antitela reaktivna sa aVp3. Ove dve ćelijske linije, genO.95.9.12 i GenO.101.17.22, svaka sekretuje imunoglobuline humanog IgGlKizotipa i obe su subklonirane dva puta limitirajućim razblaženjima da bi se dobile stabilne ćelijske linije (više od 90% homogenosti). GenO.95.9.12 je dodeljen C-kod#CNTO 95 i GenO. 101.17.22 dodeljen C-kod #C372A. Svaka ćelijska linija je zamrznuta u 12-to vajlnim istraživačkim ćclijskim bankama u LN2. ;Karakteristikevezivanja humanih monoklonainih tela pomoću EIA ;ELISA analiza je potvrdila da prečišćena antitela iz dve hibridome, CNTO 95 i C372A, vezuju aV(33 na način zavistan od koncentracije. Slika 1 prikazuje rezultate relativne efikasnosti vezivanja antitela. Pedeset procenata vezivanja se postiže na 0.07 i 0.7 pg/ml za C372A i CNTO 95, ovim redom. U istom eseju, c7E3 IgG pokazuje pedeseto postotno maksimalno vezivanje na 0.07 pg/ml. ;Kompeticija vezivanja Mab (Ma) Gen095 za M21 ćelije od strane komercijalno dostupnih integrinskih Mabs (Ma) ;Jednokolornom analizom, nijedno od mišijih anti-ocv<p>^, anti-ocv<p>s, anti-av, ili anti-f^, antitela nije kompetiralo sa CNTO 95 za vezivanje za M21 ćelije (tabela 1). Ovaj eksperiment takođe pokazuje da CNTO 95 vezuje M21 ćelije na način koji zavisi od doze. Dvokolorna analiza pokazuje da su, anti-avp3, anti-ccvP.s anti-av, ili anti-p\ antitela bila sposobna de se vežu za M21 ćelije (podaci nisu prikazani). ;Inhibicija aV<p>3 ili aVp5 zavisnih M21 ćelija ili MDAMB435L2 ćelijske adhezije za ploče obložene vitronektinom od strane ocVP3/aVp5 specifičnih Mabs (Ma) ;M21 ćelije lepe se za ploče obložene vitronektinom na način koji je zavistan od aVP3 i aVP5. Zato je neophodna blokada oba i aVp3 i aVp5 da bi se kompletno inhibirala M21 ćelijska adhezija za ploče obložene vitronektinom. C372A nije inhibirao M21 ćelijsku adheziju u prisustvu ili odsustvu P1F6, anti-ocVp5 ascites (slika 2). Gen095 (CNTO 95) je kompletno inhibiralo M21 ćelijsku adheziju za ploče obložene vitronektinom i sa i bez anti-av<p>s (P1F6) "ascites"(hidroperitoneum), što ukazuje na to da antitelo blokira i aVp5. Kao kontrola za parametre eseja, uključen je ReoPro (c7E3 Fab) koji blokira aVp3 (kao dodatak GPUb/IIIa). ReoPro sam je parcijalno inhibirao M21 ćelijsku adheziju, rcoPro u prisustvu anti-ovPs(P1F6) ascites (hidroperitoneum) je u potpunosti inhibirao adheziju, što pokazuje da se M21 ćelije vezuju za vetronektin preko i0tvP3i ocvPs integrina. Podaci su normalizovani do procenta maksimalnog M21 ćelijskog vezivanja u odsustvu antagonista +/- anti-aVp5 (P1F6) ascites. Za antagonističko titriranje bez P1F6, podaci su normalizovani do maksimalnog M21 ćelijskog vezivanja u odsustvi antagonista P1F6. Za antagonističku titraciju u prisusutvu P1F6, podaci su normalizovani na maksimalno vezivanje u odsustvu antagonista ali u prisustvu P1F6. Podaci su grafički prikazani kao procenat maksimalnog vezivanja (bez antitela) i ne linearne regresije izvedene pomoću GraphPadPrism. ;Gen095 Mab (Ma) takođe pokazuju sposobnost da kompletno inhibira MDAMB435L2 ćelijsku adheziju za vitronektin pri minimalnoj koncentraciji od 1.5 pg/ml (slika 3). Ovi podaci u kombinaciji sa podacima koji ukazuju na inhibiciju M21 ćelijske adhezije, potvrđuju sposobnost Gen095 da funkcionalno inhibira ccVP3 i/ili aVp5 receptorske interakcije sa vitronektinom. ;Determinacija Ca<++>zavisnosti u vezivanju anti-humanih VV33/VV35 Mabs (Ma) za njihove ligande ;Poznato je da prisustvo katjona kalcijuma je neophodno za Mab (Ma) c7E3 da vežu VV33 i da to nije zahtev za vezivanje LM609 za ocVp5 kao što je pokazano na slikama 4c i 4d. Ovaj eksperiment je urađen da se procenilo da li kalcijumska zavisnost se takođe primenjuje na karakteristike vezivanja CNTO 95 ili CV372 za VV33 ili VV35 integrine. Višak koncentracije EDTA je primenjen u esej formatu da bi se helatovao Ca prisutan u džepu za vezivanje integrinskih heterođimera i tako bi se vezivanje procenilo u odsustvu katjona. Nađeno je da CNTO 95 i C372 vezivanje za VV33 ne zavisi od prisustva Ca (slika 4a, 4b). Isto je i sa CNTO 95 vezivanjem za VV35 ali nije tako za C372 vezivanje za VV35 (slika 4e, 4f) jer izgleda da se vezivanje pojačava u prisustvu Ca. ;Zaključak;GenO fuzija je nizvedena upotrebom panktreocita (splenocvtes) iz hibridnog miša koji sadrži humane transgene zvarijabilni i konstantni region koji je imunizovan sa aVp3. Generisana su krupna humana aVp3 reaktivna IgG monoklonalna antitela IgGlKizotipa. Ova Mbs su dalje karakterisana i pronađeno je da se oba vezuju za aVP3 i aVp5 integrine. Vezivanje dva Mabs (Ma) pokazano je da ne zavisi od kalcijuma za VV33 i zavisno od kalcijuma za VV35 ali samo za vezivanje C372. Takođe jedno Mab (Ma), Gen095 (CNTO 95), je sposobno da potpuno inhibira vezivanje aVp3 i aVP5 za ligand vitronektina u eseju koji se bazira na ćeliji. Ovo Mab (Ma) može se pokazati kao anti-angiogenik i može imati druge upotrebe vezane za kancer. ;Primer 3: afiniteti za vezivanje za dula integrinsko antitelo;UVOD;GenO.95, takođe poznat kao CNTO 95, je humano monoklonalno antitelo generisano imunizacijom (CBA/J x C57/BL6/J, GenPharm International) F2 hibridnih miševa sa (XvP3integrinom prečišćenim iz humane posteljice. Antitelo se sastoji od humanog varijabilnog i IgGl kappa konstantnog regiona i reaktivno je na oba (XvP3i otvps, ukazujući na to da postoji specifičnost za alfa lanac koju dele oba integrinska molekula. ;CILJ;Cilj ove studije je da se karakteriše afinitet vezivanja GenO.05 za0tvfJ3i otvps prečišćene integrine i za ćelijske linije koje eksprimiraju beta integrin. Za dalju karakterizaciju, vrednosti vezivanja mogu se uporediti između genO.95 i Reo.Pro. ;SKRAĆENICE;Kd, ekvilibrijum konasatna disocijacije, izražena u M ;Bmax=maksimalan broj mesta za vezivanje ;MATERIJAL I METODE;Ćelijske linije;A375S2 ćelije, humane ćelijske linije melanoma koje eksprimiraju av<p>i i ocv<p>5integrine, kultivisane su u Dulbelcco-ovom mininalnom medijumu (DMEM) koji sadrži 1/% fetalni serum govečete (FBS, Cell Culture Labs), 1 mM natrijum piruvat, 0.1 mM neesencijalne amino kieseline, i 2 mM L-glutamin (svi od JRH Biosciences) ;HT29 ćelije, ćelije kancera debelog creva koje eksprimiraju ovPs i minimalno ccvPi(NB 456, p207) su gajene u DMEM koji sadrži 10% FBS, 1 mM natrijum piruvat, 0.1 mM neesencijalne amino kiseline i 2 mM L-glutamin. ;M21 ćelije, ćelije humanog melanoma koje eksprimiraju avp3 i ocvps integrine, dobijene od Dr. J. Jakubovvski (Eli Lilly, Ine), gajene su u RPMI medijumu (JRH Biosciences) koji sadrži 10% FBS, 1 mM natrijum piruvat, 0.1 mM neesencijalne amino kiseline i 2 mM L-glutamin. ;Integrini;avp3"lot" JG22499 je prečišćen na "Centor"-u iz humane placente. Drugi otvP.s "lot" integrina (oktil formulacija, skupina 1910990) je kupljen od Chemicon-a. ocv<p>5 (Triton formulacija, "lot" 20030055, "lot" 1910990 i oktil formulacija, "lot" 19060747) je kupljen od Chemicon-a. ;Antitela;GenO.95 je prčišćen iz supernatanta ćelijske kulture protein A hromatografijom. ReoPro je proizveden u Centocor-u, Inc. LM609, mišije anti-humano0tv<p>3antitelo (191ot" 20020559 i "lot" 1910329) i P1F6, mišije anti-humano avp*5 antitelo (1961 P-K "lot" 17110560) su kupljeni od Chemicon-a.
Radioobeležavanje
Antitela su radioaktivno obeležena sa 125-1 Na (Amersham, IL) pomoću "Iodobeads" (Pierce Chemicals, IL) do specifične aktivnosti od 1-2 pCi/pg. Koncentracija antitela (mg/ml) je određena deljenjem adsorbcije (OD/ml) na 280 nm sa 1.4. Specifična aktivnost jodiranog antitela je određena razblaživanjem antitela i brojanjem alikvota u gama brojaču ili Topcounter-u (Packard).
Esejvezivanja za ploču obloženu integrinom
avP.sili ttvPs integrin je razblažen do 1<p>g/ml u Tris puferovanom fiziološkom rastvoru (TBS, 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.5) koji sadrži kalcijum hlorid (TBS/Ca<++>) i nanesen u vidu obloge 50 pl/bunarčiću na Linbro ploče sa 96 bunarčića (Protok/ICN) preko noći na 4°C. Ploče su isprane sa TBS/Ca<++>i
blokirane sa 1 % fetalnim serumom govečeta (BSA) u TBC/Ca<++>tokom 1 sata na ST. Pedeset mikrolitara razblaženog antitela dodato je u triplikatu obloženim bunarčićima i inkubirano je 2 sata na 37°C. Posle tri ispiranja sa TBS-Tween puferom (TBS + 0.1% Tween 20), dodat je konjugovan sa peroksidazom koziji anli-humani IgG F(abž)2(H+L, Jackson, "lot" 16869), pri 1:40:000 razblaženju u 1% BSA-TBS i inkubirano 1 sat na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane tri puta, i razvijene sa o-fenilendiamin dihidrohlorid substartnim rastvorom (OPD, Sigma) koji se sastoji od 0.1 M liminske kiseline, 0.2 M natrijum fosfata, 0.01% H2o2i 1 mg/ml OPD. Razvijanje boje zaustavljeno je posle 15 minuta na sobnoj temperaturi sa 0.3 N H2S04, i ploče su iščitane na OD490nm u Molecular Dvnamics "plate readre"-u.
Krive vezivanja su urađene pomoću GraphPad PRISM (verzija 3, GraphPad Software). Rezultati su prikazani kao % maksimalnog vezivanja vrednosti saturacije. Kd, ekvilibrijum konstanta disocijacije vezivanja (izražena u M), određena je iz nelinearnog regresionog "fit"-a podataka pomoću PRISM.
Esej ćelijskog vezivanja
Pedeset mikrolitara razblaženog radioaktivno obeleženog antitela u 2% RPMI medijumu koji sadrži 2% goveđi serum albumin (JRH Biosciences) dodato je u triplikatu konfluentnim ćelijama gajenim na pločama za gajenje kultura sa 96 bunarčića (Packard). Ćelije su inkubirane 1.5 sat na 37°C; lagano isprane tri puta sa Hank-ovim puferovanim fiziološkim rastvorom koji sadrži kalcijum i magnezijum (HBSS++, JRH Biosciences) i zatim aspirirane. Sto mikrolitćvra Mvcosinct 20 (Packard) dodato je u svaki bunarčić, i radioaktivnost vezana za ćeliju je kvantifikovana u TopCounter (Packard).
Da bi se odredilo nespecifično vezivanje, izvedeni su eksperimenti sa sličnim razblaženjima u prisustvu 100 puta u višku neobeleženih antitela.
Da bi se odredio broj ćelija u svakom bunarčiću, ćelije iz nekoloko bunarčića su uklonjene sa tripsinom, pulovane i prebrojane pod mikroskopom. Broj receptora po ćeliji je izračunat na sledeći način:
Bmax, maksimalna mesta za vezivanje po ćeliji, i Kd određeni su iz nelinearnog regresionog "fit"-a podataka pomoću PRISM.
Rezultati i diskusija
Određivanje vrednosti afiniteta vezivanja je izvedeno merenjem vezivanja različitih koncentracija GenO.95 (i ReoPro) za prečišćene avP3ili avPs integrine i za površinske receptore pri ekvilibrijumu. Krive saturacije vezivanja su pravougaone hiperbole, što ukazuje na jedno mesto vezivanja GenO.95 i ReoPro (slike 5-6; Motulskv H, 1999). Analize ovih podataka za saturaciju (ponekad se naziva Skathardov eksperiment) izvedene su pomoću "one-site" hiperbole nelinearnog regresionog "fit"-a u PRISM da bi se dobio afinitet, Kd, i broj receptora, Bmax (Motulskv H, 1999).
Nekoliko "lot"-ova GenO.95, ReoPro i prečišćenih integrina upotrebljeno je da bi se osigurala precizna determinacija vrednosti afiniteta vezivanja. Kriva saturacije vezivanja za GenO.95 na pločama obloženim avP3(slika 5A) i kriva vezivanja ReoPro na pločama obloženim ctvP3(slika 5B) predstavljaju srednju vrednost i standardnu devijaciju šest odvojenih eksperimenata. Rezultati dobijeni sa Triton formulacijom avp3pokazali su se reproducibilniji nego oni dobijeni iz oktil (octyl) formulacije. Na pločama obloženim sa avPGenO.95 srednja vrednost Kd je bila 2.1 +/- 1.33 x 10"'°M; a srednja vrednost ReoPro Kd je bila 2.5 +/- 1.46 x
10-'°M.
Kriva sturacije vezivanja GenO.95 na ploči obloženoj sa avPs(slika 6A) i kriva vezivanja ReoPro na pločama obloženim avPs(slika 6B) prikazani su kao srednja vrednost i standardna devijacija šest odvojenih eksperimenata. Rezultati dobijeni sa oktil formulacijom bili su dosledniji nego oni dobijeni sa Triton formulacijom. GenO.95 srednja vrednost Kd na avp5 je bila 2.5 +/- 1.04 x 10"M. ReoPro nije pokazivao nikakvo vezivanje i nikakav odgovor na dozu na ploče obložene sa avPs-
Vrednosti afiniteta vezivanja za pročišćene integrine je upoređena sa vezivanjem za receptore eksprimirane na različitim ćelijskim linijama. Slika 7A-C pokazuje vezivanje 125-1 GenO.95 sa A375S2 ćeliajma koje eksprimiraju avP3i avPs (Slika 7A). Srednje vrednosti afiniteta na Q375S2 ćelijama bile su: Kd=5.2+/-2.04 x 10"<9>M; i 120,000 +/- 37,000 receptora/ćeliji. HT-29 ćelije eksprimiraju avp5. Vrednosti afiniteta za 125-1 GenO.95 vezivanje za HT-29 ćelije bili su: Kd=1.3+/- 3.76 x 10-'°M; i 81,000+/-24,000 receptora/ćeliji (slika 7B). M21 ćelije eksprimiraju ctvP3i avPsintegrine. 125-1 GenO.95 vezivanje za M21 ćelije bili su: Kd=8.5+/-3.03 x IO"<9>M; i 200,000+/-80,000 receptora/ćeliji (slika 7C). Slične studije ćelijskog vezivanja izvedene su sa 125-1 ReoPro na različite ćelijske linije. Slike 8A-C pokazaju vezivanje 125-1 ReoPro za A375S2 ćelije i srednje vrednosti koje su dobijene bile su: Kd=22+/-3.7 x IO"<9>M; i 370,000+/-190,000 receptora/ćeliji (slika 8A). Na HT-29 ćelijama, 125-1 ReoPro je pokazivao minimalno vezivanje (si. 8B). 125-1 ReoPro vezivanje za M21 ćelije pokazivalo je: Kd=10+/-2.00 x IO"<9>M i 660,000+/-120,000 receptora/ćeliji (slika 8C). Vrednosti vezivanja 125-1 ReoPro za M21 ćelije su dosledni vrednostima koje su ranije objavljene (Tam et al., 1998).
Pregled rezultata vezivanja je prikazan na tabelama 2-3
Nekoliko obzervacija je bilo značajno u karakterizaciji vezivanja. Vrednosti afiniteta (kd) GenO.95 na avps su bile niže nego na av{33. Niže Kd vrednosti ukazuju na viši afinitet; prema tome afinitet GenO.95 vezivanja za avPs prečišćeni integrin je bilo oko 8 puta veće nego vezivanje za avP3prečišćeni integrin. Međutim kada su prisutna oba integrinska receptora na istoj ćeliji, vrednost celokupnog afiniteta bliže je aproksimaciji vrednosti koja odgovara integrinu u većoj količini. Prema tome, na A375S2 i M2I ćelijama gde je bilo više avP3, nego avp5, afinitet GenO.95 vezivanja za ove ćelije je bio sličan afinitetu za avP3 , - 7x IO"<9>M. Nasuprot tome, na HT29 ćelijama koje eksprimuju avp5, afinitet GenO.95 je bilo blago viši, I x IO"<9>M. Približno dvostruko neslaganje u mestima receptora po ćeliji između GenO.95 i ReoPro vezivanja može biti objašnjeno razlikom u valenci antitela. GenO.95 (IgG) je bivalentno i pogodno se vezuje za dva susedna receptora, dok je ReoPro(Fab) monovalenatan i može se samo vezati za jedan receptor (BRD930001).
Reference
Fraker DJ, Speck JC. Protein and cell membrane iodination with a sparinglv soluble chloramide l,3,4,5-tetrachloro-3a-diphenyl-glycoluril.Biochem Biophys ResCommun.80:849, 1978.
Motulsky H.,Analyzing Data with GraphPad Prism.GraphPad Softvvare, Inc. San Diego, CA.1999
Tam SH, Sassoli PM, RJordan, MT Nakada,Circulation,1999
Primer 4: Efekat dual integrin antitela na modulacijuangiogeneze
Kratak sadržaj
Gen 095 je humani IgGlk monoklonalno antitelo koje prepoznaje integrine avP3 i avp5. Ovi integrini učestvuju u adheziji endotelijalnih ćelija, migraciji, preživljavanju i proliferaciji, procesima koji su važni za angiogenezu. Endotelijalno ćelijsko isklijavanje oponaša angiogenzuin vitro,jer obuhvata ćelijsku adheziju, migraciju, proliferaciju i preživljavanje. Mi smo koristili test isklijavanja za određivanje da li Gen095 može inhibirati funkciju avp3 i avp5. Ovi primeri opisuju daje Gen095 inhibitor isklijavanja endotelijalnih ćelija koje su gajene u trodimenzionalnom fibrinskom matriksu, i tako demonstrira da ovo antitelo može imati potencijalne osobine anti-angiogenika.
Sada postoji značajan dokaz da progresivan rast tumora zavisi od angiogeneze, formiranja krvnih sudova. Ovi krvni sudovi obezbeđuju tumore sa hranom i kiseonikom, odnose otpadne prizvode i učestvuju kao provodnici metastaza ćelija tumora na udaljena mesta (1). Skorašnje studije su dalje đefinisale različite uloge integrina u angiogenskim procesima. Integrini su heterodimerni transmembranski proteini koji igaraju važnu ulogu u posredovanju ćelijske adhezije, migracije, preživljavanja i proliferacije (2). Ekspresija integrina aVp3 je minimalna na mirujućim ili normalnim krvnim sudovima ali se značajno "up" reguliše (pojačava) na angiogenskim vaskularnim ćelijama (1-3). Za blisko srodni ali različiti integrin ctVp5 takođe je pokazano da posreduje u angiogenskim procesima. Antitelo generisano protiv aVp3 blokiralo je bazični fibroblastni faktor rasta (bFGF-basic fibroblast growth factor) indukovane angiogeneze, gde je antitelo specifično za aVP5 inhibiralo vaskularni endotelijalni faktor rasta (VEGF) indukovane angiogeneze (1-5).
Angiogeneza može biti oponašanain vitroendotelijalnim "sprouting"
(isklijavanje) esejom. Ovaj sistem uključuje migraciju i proliferaciju endotelijalnih ćelija. Gen095 je humano monoklonalno antitelo koje prepoznaje aVp3 i aVp5 integrine, i ovi integrini regulišu migraciju i proliferaciju endotelijalnih ćelija. Tako smo mi odredili da li Gen095 može da inhibira isklijavanje endotelijalnih ćelija. Ovaj primer opisuje eksperimente koji pokazuju da Gen095 inhibira isklijavanje humanih endotelijalnih ćelija koje rastu u fibrinskom matriksu.
Materijali
Humani bazični fibroblastni faktor rasta (bFGF) i humani vaskularni endotelijalni faktor rasta 165 (VEGF165) dobijeni su od R&D Svstems (Minneapolis, MN). MAB 1976Z (LM609), monoklonalno antitelo protiv aVp3 integrina i MAB 1961 (P1F6), monoklonalno antitelo protiv aVP5 integrina su kupljeni od Chemicon (Temecula, CA). ReoPro i Gen095 dobijeni su od Centocoržs Clinical Pharmacologv and Antibodv Technologv Department. Humani fibrinogen (bez plazmogena, više od 95% proteina zgrušavanja) i goveđi kožni želatin kupljeni su od Sigma-e (Saint Louis, MI).
ĆeJijske linije
Huvecs, humane endotelijalne ćelije vene pupčane vrpce kupljene su od CIonetics (Walkersville, MA). Huvecs su gajene u endotelijalnom bazalnom medijum "kit"-u (EBM) (CIonetics) koji sadrži 10% FBS, dugi insulinu-sličan faktor rasta-1, askorbinsku kiselinu, hidrokortizon, humani epidermalni faktor rasta, humani vaskularni endotelijalni faktor rasta, hFGF-b, gentamicin sulfat i amfotercin-B. čelije su inkubirane na 37°C i 5% C02i medijum je menjan svaka 2 do 3 dana. samo pasaži 3-8 su korišćeni u eksperimentima.
Esej izrastanja baziran na fibrinskom mikronosaču (Fibrin Microcarrier-based assay)
Ova je modifikovana metoda Nehls i Drenckhahn (6) upotrebeljena je za merenje formiranja kapilarne tube u trodimenzionalnom matriksu koji se bazira na fibnnu. Citodeks-3 mikronosači obloženi želatinom (MCs, Sigma) pripremljeni su na osnovu preporuke proizvođača. Sveže autoklavirane MCs su potpoljene u EBM-2+20%FBS i endotelijalne ćelije su dodatte u finalnoj koncentraciji 40 ćelija/MC. Ćelije su puštene da se vežu za MCs tokom perioda inkubacije od 4 sata na 37°C. MCs su zatim potpoljeni u veliku zapreminu medijuma i gajene 2 do 4 dana na 37°C u 5% CO2. MCs su povremeno mrdani da bi se sprečila agregacija kuglica (beads) obloženim ćelijama. MCs su uronjeni u fibrinski gel koji je pripremljen na sledeći način: humani fibrinogen (2 mg/ml) je rastvoren u čistom, bFGF ili sa serumom EBM-2 medijumu. Ovaj rastvor takođe je sadržao razna antitela. Da bi se sprečio prevelika fibroliza od strane ćelija obloženih fibrinom, dodat je aprotin u rastvor fibrinogena i medijumu za rast i to 200 U/ml. Mikronosači obloženi ćelijama dodati su u rastvor fibrinogena u gustini 100 do 200 MC s/ml (50-100 kuglica/ po bunarčiću -ploče sa 48 bunarčića) i zgrušavanje je izazvano dodatkom trombina (0.5 U/ml). Kada se zgrušavanje završilo , dodato je 0.5 ml rastvora (koji sadrži sve komponente gore opisane osim fibrinogena i trombina) fibrinskim matricama. Ploče su inkubirane na 37°C i 5% C02tokom 1 do 3 dana. Posle 1-3 dana gelovi su fiksirani sa 3% paraformaldehidom rastvorenim u PBS-u, i broj kapilarnih izdanaka sa dužinom većom od prečnika MC kuglice (150 pm) je kvantifikovan.
Rezultati i diskusija
Huvec- i mogu da formiraju izdanke slične kapilarima kada se gaje u fibrinskom gelu (slika 9). Endotelijalne ćelije migriraju van kuglica obloenih želatinom i izdužuju se u duge filopodije. Dugi izdanci se sastoje od nekoliko ćelija koje formiraju lumen. Ovaj proces podseća na formiranje mikrokapilarain vivo,jer uključuje migraciju endotelijalnih ćelija, invaziju i ćelijsku proliferaciju. Kvantifikacija formiranja izdanaka (sprouts) otkrila je da Gen095 inhibira formiranje izdanaka od endotelijalnih ćelija u bFGF ili kompletnom medijumu (slika 10). Kombinacija LM609 i P1F6 rutinski efektivnije inhibira klijanje (sprouting) nego Gen095 (slika 11).
Zaključak
Formiranje novih krvnih sudova od postojećih krvnih sudova je zaštitni znak/obeležje (hallmark) angiogeneze. Proces može da se oponašain vitroesejom endotelijalnog rasta izdanaka. Ovi izdanci predstavljaju mikrokapilare koji se formiraju kao odgovor na angiogenske stimuluse kao bFGF ili različite stimuluse koji su prisutni u serumu. Gen095 zavisno od doze su inhibirali bFGF i kompletno endotelijalno ćelijsko klijanje stimulisano medijumom, što ukazujeda ova antitela mogu efikasno da inhibiraju aV(33 i aV{35 funkcije. Zšto Geno95 nije isto efikasan kao kombinacija LM609 i P1F6 nije poznato, ali moguće je da gen095 prepoznaje aVp3 i aVp5 sa nižim afinitetom kada se poredi sa LM609 i P1F6. Ukupno, ovi podaci pokazuju Da Gen095 može da inhibira kompleksne procese formiranja mikrokapilarain vitro.
Reference:
1. Gastl G, Hermann T. Steuter M, Zmija J, Gunsilius E, Unger C, and Kraft A. 1997. Angiogenesis as a Target for Tumor Treatment. Oncologv 54:177-184. 2. Eliceiri BP, and Cheresh DA. 1999. The role of aV integrina tokom angiogeneze: insight into potential mechanism of action and clinical development. The Journal of Clinical Investigation 103:1227-1230. 3. Brooks PC, Montgomerv AM, Rosenfeld M, Reisfeld RA, 1994. Integrin aV|33 antagonists promote tumor regression by inducing apoptosis of angiogenic blood vessels. cell 79:1157-1164. 4. Enenstein J, Walweh NS, and Kramer RH. 1992. Basic FGF and TGF-P differentially modulate integrin expression of human microvascular endothelial cells. Exp. Cell Res. 203:499-503. 5. Friedlander M, Brooks PC, Shaffer RW, Kincaid CM, Varner JA, and Cheresh DA. 1995. Definition of two angiogenic pathways by distinct aV integrina. Science 270:1500-1502. 6. Nehls, V and Drenckhahn, D. 1995. A novel, microcarrier-basedin vitroassay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogcnesis. Microvascular Rcs. 50:311-322.
Primer 5: Efekat dual integrinskog antitela na endotelijalnu i tumorskih
ćelija adheziju, migraciju i invaziju
Uvod
(CBA/J x C57/BL6/J) F2 hibridni miševi (1-4) koji sadrži humane transgene za varijabilan i konstantan region antitela za obe i teške i lake lance imunizovani su sa humanim placentalnim ocVP3. Jedna fuzija je dovela do stvaranja totalnih humani aVp3 reaktivnih IgGlKmonoklonalnih tela nazvanih Gen095. Za totalna humana antitela pronađeno je da su reaktivna sa aVp3 i aVp5 integrinima (5). Ovi integrini učestvuju u endotelijalnoj i tumor ćelijskoj adheziji, mograciji i invaziji. Tako smo okarakterisali efekat Gen095 na integrinom posredovanu pokretljivost (motilitv). Gen095 inhibira vezivanje humanih endotelijalnih iz pupčane vrpce (HUVEC) ćelija i humanih ćelija melanoma za vitronektin, denaturisani kolagen, fibrinogen i fibrin, ali ne blokira ćelijsku adheziju za fibronektin i kolagen tipa I. Gen095 takođe inhibira migraciju endotelijalnih ćelija koje su stimulisane sa bazičnim fibroblastnim faktorom rasta i niskom dozom seruma. Gen095 inhibira invaziju tumorskih ćelija kroz fibrinski gel. Kao zaključak, Gen095 blokira aVp3 i aVp5 u različitim esejima baziranim na ćelojama,in vitro.
Skraćenice:
BSA - serum albumin govečeta
C02 -ugljen dioksid
DMSO - dimetil sulfoksid
EIA -enzimski imunoesej
FBS -fetalni serum govečeta
Ig - imunoglobulin
Mab - monoklonalno antitelo (Ma)
OD - optička gustina
ST - sobna temperatura
HUVECS - humane endotelijalne ćelije iz pupčane vrpce
bFGF- goveđi bazični fibroblastni faktor rasta.
Uvod
Sada postoji dovoljno dokaza da progresivni rast tumora zavisi od angiogeneze. Formiranje novih krvnih sudova obezbeđuje tumore sa hranom i kiseonikom, oni odnose otpadne prizvode i učestvuju kao provodnici tumorskih ćelija na udaljena mesta. Nekoliko studija su definisale različite uloge integrina u angiogenskim procesima. Integrini su heterodimerni transmembranski proteini koji imaju važnu ulogu u ćelijskoj adheziji za ekstracelularni matriks (ECM), i posreduju u ćelijskom preživljavanju, proliferaciji i migraciji (6). Tokom procesa angiogeneze, aVP3 i aVp5 su "up" regulisani na površini aktiviranih endotelijalnih ćelija, koje zauzvrat pomažu ovim ćelijama da migriraju i proliferiraju (6). Antitelo generisano protiv aV(33 blokira angiogenezu indukovanu bazičnim fibroblastnim faktorom rasta (bFGF), dok antitelo specifično za ocVP5 inhibira angiogenezu indukovanu vaskularnm endotelojalnim faktorom rasta (VEGF) (6, 7). Kao dodatak regulaciji angiogeneze, aVp3 i aVp5 regulišu tumorsku ćelijsku adheziju, migraciju i invaziju, procese neophodne za tumorske ćelijske metastaze. Prethodne studije pokazale su da se Gen095 vezuje za prečišćene aVP3 i aVP5 integrine, i tako smo mi odredili da li ova antitela mogu funkcionalno blokirati aVp3- i aVP5- posredovanu endotelijalnu i tumor ćelijsku adheziju, migraciju i invaziju.
Materijal i metode
Materijali
Goveđi fibroblastni faktor rasta (bFGF) i humani endotelijalni faktor rasta 165 (VEGFi65) dobijeni su od dobijeni su od R&D Svstems (Minneapolis, MN). MAB 1976Z (LM609), monoklonalno antitelo protiv aVP3 integrina i MAB 1961 (P1F6), monoklonalno antitelo protiv aVp5 integrina su kupljeni od Chemicon (Temecula, CA). ReoPro ("lot" 94A04ZE) i Gen095 ("lot" JG100899) nabavljeni su od Centocor. BIOCOAT inserti ćelijskih kultura (veličina pore: 8pm) kuplejen su od Becton Dicksons (Bedford,nMA). VybrantTM kit za ćelijsku adheziju (V-13181) kupljen je od Molecular Probes (Eugene, OR). Humani bez plazminogena fibrinogen (VWF/Fn depleted) kupljen je od Enzyme Research Labs (South Bend, IN. Goveđi kožni želatin kupljenje od Sigma-c (Saint Louis, MI). Humani vitronektin je kupljen od Promega-e (Madison, WI), i kolagen tipa 1 je kupljen ođ Gibco BRL (Gaithersburg, MD).
Ćelijske linije
Humane endotelijalne ćelije iz vene iz pupčane vrpce (HUVECS), su kupljene od CIonetics (Walkersville, MA) i gajene su u EBM medijumu iz kita (CIonetics) koji sadrži 10% FBS, dugi R insulinu sličan faktor rasta-1, askorbinsku kiselinu, hidrokortizon, humani epidermalni faktor rasta, humani vaskularni endotelijalni faktor rasta, gentamicin sulfat i amfotercin-B. Ćelije su rasle na 37°C i 5% C02 i medijum je menjan na 2 do 3 dana. Ćelije su pasažirane kada su dostigle konfluentnost od 80%. Koripšćeni su pasaži 3-8 u svim eksperimentima.
A375S2 ćelije, humane ćelijske linije melanoma koje eksprimiraju avP3 i (Xvp\s integrine, nabavljene su od Cetor Cell Bank gde su ćelije oslobođene mikoplazmi i bakterijske kontaminacije. Ćelije su gajene u DMEM medijumu sa 10% FBS, 2 mM L-glutaminu, 1 mM natrijum piruvatu i 0.1 mM neesencijalnim amino kiselinama.
Humane HT29 ćelije, ćelije kancer a debelog creva nabavljene su od Centocor Cell Biologv Service Departament, gde su ćelijske linije oslobođene mikoplazmi i bakterijske kontaminacije. Ćelije su kultivisane u cc-MEM medijumu kome je dodato 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1 mM natrijum piruvat, 0.1 mM neesencijalne amino kiseline.
"Flow" (protočna) citometrija
Za detekciju površinskih integrina, ćelije su pokupljene, isprane potopljene u čistom RPMI medijumu, i zatim inkubirane 60 minuta na ledu sa integrinskim mAb (Ma) (10 pg/ml) i FITC-obeleženim kozijim anti-mišijim antitelom (1:100) ili FrrC-obeleženim anti-integrinskim antitelom (10 pg/ml). Odsustvo primarnih antitela ili substitucija primarnih antitela sa odgovarajućim izotopnim antitelima poslužili su kao negativna kontrola. Ćelije su odmah analizirane sa FACS Scan II flow citometrom (Becton Dickinson, Mountain View, CA).
Adhezioni esej
Mikrotitarske ploče (Linbro-Titertek, ICN Biomedicals, INC) su obložene na 4°C preko noći sa vitronektinom (1 pg/ml), želatinom (0.1%), fibrinogenom (100 ug/ml), kolagenom tipa I (10 pg/ml), ili fibronektinom (10 pg/ml). Pre same upotrebe ploče su isprane sa PBS-om i blokirane sa 1% BSA/PBS (pH 7.4) tokom 1 sata. Mikrotitar bunarčići obloženi sa fibrinom su formirani tretmanom sa trombinom (lU/ml) fibrinogena. Adherentne (lepljive) ćelije (HUVECS HT29 i A375S.2) su obeležene sa kalceinskom AM fluorescentnom bojom (Molecular Probes, Eugene, OR) po preporuci proizvođača, pokupljene, dva puta isprane, i suspendovane u 0.1% BSA u DMEM medijumu. Nakon što je podešena gustina ćelija na 5xl0Vml, ćelije su inkubirane sa različitim koncentracijama antitela tokom 15 minuta na 37°C. Mešavina ćelija-antitela je dodata u bunarčiće (lOOpl po bunarčiću) i inkubirana 1 sat na 37°C. Ploče su isprane dva puta sa PBS-om da bi se uklonile nevezane ćelije i adhezija je merena u fluorescentnom čitaču ploča (plate reader) (Fluoroskan) na 495-538 nm. Ćelijska adhezija za bunarčiće obložene sa BSA služila je kao negativna kontrola. Odgovarajuća poklapajuća izotipna antitela služila su kao negativna kontrola.
Esej ćelijske migracije izveden je u "24-Transwell" komore sa polistrenskim membranama (6.5 mm prečnik, 10 pm debljine, veličine pore od 8 pm). Sub-konfluentne 24-časovne ćelijske kulture (HUVECS ili A375S.2) su pokupljene sa tripsin-EDTA, dva puta isprane, i resuspendovane u njihovom medijumu bez seruma koji sadrži 0.1%BSA. Ćelije (100,000/500 pl) su dodate u gornju komoru u prisustvu ili odsustvu antitela. Da bi se olakšala hemolitička migracija ćelija, 750 pl medijuma sa 0.1% BSA i vitronektinom (2 pg/ml) ili serum (2% HUVEC i 10% za A375S2 ćelije) dodato je na dno komora i ploče su stavljene u inkubator za kulture tkiva. Migracija je zaustavljena posle 4 do 8 sati uklanjanjem ćelija na vrhu pomoću štapića sa vatom (za uši) i onda su filteri fiksirani sa 3% paraformaldehidom i obojeni sa Crvstal Violet. Razmera ćelijske migracije određen je svetlosnom mikroskopijom i slike su analizirane pomoću Phase 3 softvera za analizu slike (Glen Mills, PA. Softver analizira ukupnu površinu sa obeleženim ćelijama na donjoj strani filtera i ovo je direktno proporcionalno razmeri migracije ćelija.
"Haptotatic" migracioniesej
Eseji migracije ćelija izveden je pomoću upotrebe "transvvell" komora kao što je gore opisano sa malim modifikacijama. Ukratko, donji deo membrane je obložen sa vitronektinom (2 pg/ml) tokom 60 minuta na sobnoj temperaturi, i zatim blokiran sa rastvorom 1% BSA/PBS na sobnoj temperaturi 60 minuta. Dalje, membrane su isprane sa PBS-om i osušene. Medijum bez seruma (740 pl) koji sadrži 0.1% BSA i bFGF (20 ng/ml) dodati su donjim komorama. Sub-konfluentne 24 časovne kulture su sakupljene sa tripsin-EDTA, dva puta isprane, i resuspendovane u medijumu bez seruma. Ćelije (100,000/500 pl) dodate su u gornju komoru u prisustvu ili odsustvu antitela. Komore su smeštene u inkubator za kulture tkiva i migracija je puštena da se odvija 6 sati. Razmera ćelijske migracije je određena kao što je gore opisano.
Invazioniesej
Fibrinogen (bez plazminogena, 100 pl lOmg/ml) i 100 pl lU/ml trombin su pomešani odmah dodati u gornju komoru 24-transwelI ploča (6.5 mm prečnik, 10 pm debljine i veličine pore od 8 pm, Costar). Ploče su inkubirane na 37°C 30 minuta da bi se formirao fibrinski gel. Konfluentne ćelije tumora (A375S2) su tnpsinizovane, centrifugirane, resuspendovane u bazalnom medijumu kome je dodat 0.1 % BSA i 10 pg/ml plazminogena
(Enzvme Research Labs, South Bend, FN) sa različitim koncentracijama antitela, i inkubiran tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Ćelije (100,000/500 pl) dodate su u gornju komoru u prisustvu ili odsustvu antitela. Donji deo invazione komora je ispunjen sa 0.75 ml 10% FBS-DMEM, koji je služio kao hemoatraktant i ploča je premeštena u inkubator za kulture tkiva. Posle 24 sata invazija je prekinuta uklanjanjem ćelija na vrhu pomoću štapića sa vatom (za uši) i onda su filteri fiksirani sa 3% paraformaldehidom i obojeni sa Crvstal Violet. Razmera ćelijske migracije određen je pomoću Phase 3 softvera za analizu slike kao što je gore opisano.
Rezultati i diskusija
Gen095 inhibira aV(33- i aV(35- posredovanu ćelijsku adheziju
Kako se gen095 vezuje za «Vp3 i ocVp5 integrine, odredili smo da li naše ćelije tumora (A375S.2 i HT29) i endotelijalne ćelije eksprimiraju ove integrine. "Flow" citometrija ukazuje da A375S.2 i HUVEC ćelije eksprimiraju oba aVp3 i aVp5 integrine, ali HT29 ćelije eksprimiraju ccVp5 ali ne i aVp3 integrin (slika 12A-I).
HT29 ćelije (12A, B i C) na svojoj površini eksprimiraju cxVp5 ali ne i ocVp3 integrin. HUVEC (12D, E i F) i A375S.2 (12G, H i I) ćelije na svojoj površini eksprimiraju aVp3 i aVp5 integrine. Ćelije tumora i endotelijalne ćelije su obeležene imunofluorescencijom i analizirane "flovv" citometrijom. Histogram sa leve strane predstavlja pozadinsku fluorescenciju u prisustvu odgovarajućeg izotipa antitela. Histogram sa desne strane prikazuje pozitivno bojenje. A, D, G, LM609 (mAb (Ma) usmeren ka aVp3 10 pg/ml); B, E, H, P1F6 (mAb (Ma) usmereno ka aVp5, 10 pg/ml); i C, F, I, Gen095 (10 pg/ml).
Efekat Gen095 na adheziju HUVEC, A375S.2 i HT29 ćelija za različite proteine matriksa određen je do detalja. Gen095 je kompletno inhibirao adheziju HUVEC i A375S.2 ćelija za vitronektinom, i delimično za fibrinogenom, želatinom i fibrinom obložene ploče, ukazujući na to da antitelo može da blokira cxVP3 i cxV<p>5 (slike 2 i 3, tabela 1 i 2).
Gen095 je potpuno inhibirao HT-29 ćelijsku adheziju za ploče obložene vitronektinom, ukazujući da antitelo blokira avf55. (Slika 4). Gen095 je potpuno inhbirao adheziju HUVEC i A375S.2 ćelija za ploče obložene vitronektinom koje pokazuju da antitelo blokira avp3 i avp5. (Slike 2 i 3). Podaci su grafički prikazani kao procenti maskimalnog vezivanja (bez anitcla) i nelinearne regresije obavljene pomoću GraphPad Prism.
Adhezija HUVfZCS za matriks ploča obloženih proteinom. Test adhezije je obavljen kao što je opisano u Metodama. Ploče su čitana na fluorometru na 485-538 nm. Ćelijska adhezija za BSA obložene bunarčiće je služila kao negativna kontrola. Na slici 13, stepen ćelijske adhezije u prisustvu različitih koncentracija antitela je grafički prikazan kao procenat ćelijske adhezije bez prisustva antitela koje se samatralo kao 100%. Svaka tačka podataka je srednja vrednost trostrukog određivanja (+/- SD).
Adhezija ćelija humanog melanoma za matriks ploča obloženih proteinom. Test adhezije je izvođen kao što opisano u Metodama. Ćelijska adhezija za BSA obložene bunarčiće je služila kao negativna kontrola. Na slici 14 stepen ćelijske adhezije u prisustvu različitih koncentracija antitela je grafički prikazan kao procenat celjske adhezije bez prisustva antitela koja je smatrana za 100%. Svaka tačka podataka je srednja vrednost trostrukog određivanja (+/- SD).
Tabela 4 HUVECs za vitronektin, želatin, fibrinogen, fibrin, fibronektin i kolagen tipa 1. Stepen ćelijske adhezije u prisustvu različitih koncentracija antitela je grafički prikazan kao procenat ćelisjke adhezije bez prisustva antitiela koji je smatran za 100%. Svaka tačka podataka je srednja vrednost trostrukog određivanja (+/- SD). Koncentracija korišćenog antitela je bila 10 pg/ml.
Tabela 5. Adhezija A375S.2 ćelija za vitronektin, želatin, fibrinogen. fibrin, fibronektin i kolagen tipa I. Razmera ćelijske adhezije u prisustvu različitih koncentracija antitela je prikazana kao procenat ćelijske adhezije u odsustvu antitela za koje se smatra da je 100%. Svaka pojedinačna tačka podatka predstavlja triplikatnu determinaciju (+/-SD). Koncentracija antitela koja je upotrebljena je 10<p>g/ml.
Adhezija humanih HT29 ćelija karcinoma debelog creva za vitronektin. Adhezioni esej je izveden kao što je opisano u delu metoda. Ćelijska adhezija za bunarčiće obložene BSA služila je kao negativna kontrola. Podaci na slici 15 su prikazani kao procenat maksimalnog vezivanja (odsustvo antitela), i predstavljaju srednju verdnost triplikatne determinacije (+/-SD).
Gen095 blokira migraciju humanih melanoma i endotelijalnih ćelija
Integrini aVp3 i aVp5 učestvuju u ćelijskoj migraciji, i zato smo mi odredili da li Gen095 može da blokira vitronektinom stimulisanu ćelijsku migraciju. Vitronektinom stimulisana ćelijska migracija uključuje aVp3 i aVp5. Gen095 je zavisno od doze inhibirao migraciju endotelijalnih ćelija kada je vitronektin korišćen kao hemoatraktant (slike 5 & 6). Interesantno je da Gen095 takođe inhibira migraciju i HUVEC i A375S.2 ćelija ka serumu (slike 7-8). Ovi nalazi mogli bi potencijalno biti važni za angiogensku i tumor terapiju jer sugerišu da ciljevi (targets) za Gen095, aVp3 i aVp5 su centralni receptori koji se aktiviraju različitim migratornim faktorima koji su prisutni u serumu.
Migracija HUVECS ka 2 pg/ml vitronektinu. Esej je izveden kao što je opisano u metodama i ćelijama je dozvoljeno da migriraju 6 sati. Fotomikrografije su reprezentativna polja (10x sočivo objektiva) ćelijske migracije na slici 16A, odsustvo antitela (16B), Gen095 (5 pg/ml), (16C), Gen095 (40 pg/ml). Slika 16D je grafički prikaz ćelijske migracije u prisustvu različitih koncentracija Gen095. Podaci su normalizovani do procenta kontrole (bez antitela) za koje se smatra da je 100%, i svaka tačka predstavlja srednju vrednost tri "transweH" filtera (+/-SD).
Migracija HUVEC ka 2 pg/ml vitronektinu u prisustvu antitela za aV(33 i aVp5. Migracioni esej je izveden kao stoje opisano u metodama i ćeJijamaje dozvoljeno da migriraju 6 sati. LM609 i P1F6 su mAb (Ma) usmerena na aV(33 i aVp5. Podaci prikazani na slici 17 su normalizovani do procenta kontrole (bez antitela) za koje se smatra da je 100%, i svaka pravougaona kolona predstavlja srednju vrednost tri "transvvell" filtera (+/-SD). BSA, misiji IgG i humani IgG služili su kao negativne kontrole. LM609-PIF6 predstavljaju kombinaciju oba antitela. Antitela i BSA upotrebljeni su u koncentraciji 10 pLg/ml.
Migracija HUVEC ka2%FBS-u. Migracioni esej je pušten da traje 4 sata i podaci su zadržani kao što je opisano u metodama. Slika 18(A) je grafiki prikaz ćelijske migracije u prisustvu LM609, P1F6, kombinacije LM609+P1F6, odgovarajućih poklapajućih izotipova kontrolnih antitela (humana i mišija). Antitela i proteini su upotrebljeni u koncentracijama od 10 pg/ml. Slika 18(B) je grafički prikaz ćelijske migracije u prisustvu ReoPro i Gen095. Fotomikrografije su reprezentativna polja (10x sočivo objektiva) ćelijske migracije na slici 18(C), odsustvo antitela, slika 18(D), Gen095 (5 pg/ml), slika 18(E), Gen095 (20 pg/ml). Podaci su normalizovani do procenta kontrole (bez antitela) za koje se smatra da je 100%, i svaka tačka predstavlja srednju vrednost tri "transvvell" filtera (+/-SD).
Migracija A375S.2 ćelija ka 10% FBS-u. Migracioni esej je pušten da traje 4 sata i podaci su zadržani kao što je opisano u metodama. Antitela su upotrebljena u koncentracijama od 10 pg/ml. Slika 19(A) je grafički prikaz ćelijske migracije u prisustvu LM609, P1F6, kombinacije LM609+P1F6, odgovarajućih poklapajućih izotipova kontrolnih antitela (humana i mišija). Podaci su normalizovani do procenta kontrole (bez antitela) za koje se smatra da je 100%, i svaka tačka predstavlja srednju vrednost tri "transvvell" filtera (+/-SD). Fotomikrografije su reprezentativna polja (10x sočivo objektiva) ćelijske migracije na slici 19(C), odsustvo antitela, slika 19(D), Gen095 (5pg/ml), slika 19(E), Gen095 (20 pg/ml).
Rezultati gore opisani ukazuju na to da Gen095 blokira tumorsku i endotelijalni! migraciju ka vitronektinu i serumu. Dalje, odredili smo da li antitelo može da inhibira bFGF-stimulisanu ćelijsku migraciju. Kao što je pokazano na slici 9, bFGF je stimulisalo HUVEC ćelijsku migraciju ka vitronektinu. a Gen095 je značajno blokiralo ovu stimulisanu ćelijsku migraciju.
Migracija HUVEC-a ka vitronektinu u prisustvu bFGF. Donji delovi filtera migracione komore su obloženi sa 2 pg/ml vitronektina, i esej je izveden kao što je opisano u metodama. Ćelijama je dozvoljeno da migriraju 6 sati. Na slikama 20A-E svaka tačka predstavlja srednju vrednost tri "transvvell" filtera (+/-SD). Slika 20(A), bFGF; slika 20(B), Gen095 (5 pg/ml); slika 20(C), Gen095 (40pg/ml); slika 20(D), bez bFGF. Slika 20(E),
Inhibicija ćelijske migracije u prisustvu različitih antitela je grafički prikazana.
Gen095 blokira invaziju humanih ćelija meianoma
Rezultati opisani u tekstu iznad ukazuju na to da Gen095 može da inhibira ćelijsku adheziju i migraciju. Zato smo postavili pitanje da li ovo antitelo može da blokira invaziju ćelija tumora, višestepeni proces koji uključuje ćelijsku adheziju, degradaciju matriksa i migraciju ćelija kroz degradirani matriks. Izabrali smo fibrin kao matriks za ćelije tumora jer je Gen095 bilo sposobno da blokira adheziju ćelija tumora za fibrin (slika 3). Kao stoje prikazano na slici 10, invazija A375S.2 ćelija mogla je biti inhibirana sa LM609, što ukazuje na to da je u ovaj proces uključen makar aVp3. Gen095 inhibirao je zavisno od doze invaziju ćelija tumora kroz fibrin. Irelevantni IgG i mAb (Ma) usmereni ka trombocitu GPnb/TFIa (10E5), služili su ako negativna kontrola. Kolektivno, ovi podaci ukazuju da Gen095 može efikasno da blokira invaziju humanih meianoma ćelija.
Invazija A375S.2 ćelija kroz fibrinski gel (5 mg/ml). Invazioni esej je pušten da se odigrava 24 sata i podaci su zabeleženi kao što je opisano u metodama. Fotomikrografije su reprezentativna polja (4x sočivo objektiva) ćelijske invazijena slici 21(A), odsustvo antitela, slika 21(B), Gen095 (10 pg/ml), slika 21(C) i (D) su grafički prikazi ćelijske invazije u prisustvu gen095, 10E5 F(abž)2, LM609, P1F6, LM-P1F6 (LM609+P1F6), humani i mišiji IgG (H-IgG i M-IgG). Grafičaka slika 21(D): koncentracija svih antitela i proteina je 10 pg/ml. Podaci su normalizovani do procenta kontrole (bez antitela) za koje se smatra daje 100%, i svaka tačka predstavlja srednju vrednost tri "transvvell" filtera (+/-SD).
Zaključak
Ćelijska adhezija, migracija i invazija zahteva integrine kao što su aVp3 i aVp5. gen095 je sposobno da funkcionalno blokira aVp3 i aVp5 integrine koji se eksprimiraju u endotelijalnim i tumorskim ćelijama. Gen095 je bilo sposobno da blokira migraciju i invaziju ćelija koje su bile stimulisane sa bFGF ili serumom. Ovi rezultati sugerišu da je Gen095 potentan inhibitor aVP3 i aVP5 integrina koje eksprimiraju tumorske i endotelijalne ćelije.
Reference
1. Tavlor, L. D., C. E. Carmack, D. Huszar, K.M. Higgins, R. Mashavekh, G. Sequar, S. R. Schramm, C-C. Kuo, S. L. OžDonnel, R. M. Kay, C. S. vvoodhouse, and N. Lonberg. 1993. Human immunoglobulin transgenes undergo
rearrangement, somatic mutation and class svvitching in mice that iack endogenous IgM. International Immunologv/ 6:579-591. 2. Lonberg, N., L. D. tavlor, F. A. Harding, M. Trounstine, K. M. Higgins, S. R. Schramm, C-C. Kuo, R. Mashavekh, K. Wymore, J. G. McCabe, D. Munzo-OžRegan, S. L. OžDonnel, E. S. G. Lapachet, T. Bengoechea, D. M. Fishvvild, C. E. Carmack, R. M. Kay, and D. Huszar. 1994. Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature 368:856-859. 3. Neuberger, M. 1996. Generating high-avidity human Mabs in mice. Nature Biotechology 14:826. 4. Fishvvild, D. M., S. L. OžDonnel, T. Bengoechea, D. V. Hudson, F. Harding, S. L. Bernard, D. Jones, R. M. Kay, K. M. Higgins, S. R. Schramm, and N. Lonberg. 1996. High-avidity human IgG monoclonal antibodies from novrl strain of minilocus transgenic mice. Nature Biotechnology 14:845-851. 5. Gastl, G., T. Hermann, M. Steuter, J. Zmija, E. Gunsilus, C. Unger and A. Kraft. 1997. Angiogenesis as a Target for Tumor treatment. Oncology 54:177-184. 6. Eliceiri, B. P., and D. A. Cheresh. 1999. The role of aV integrins during angiogenesis: insights into potential mechanisms of action and clinical development. The Journal of Clinical Investigation 103:1227-1230. 7. Fredhandler, M., P. C. Brooks, R. W. Shaffer, C. M. Kincaid, J. A. Varner, and D. A. Chersh. 1995. Definition of two angiogenic pathways by distinct aV integrins. Science 270:1500-1502.
Biće jasno da ovaj pronalazak može da se primeni na drugi način nego što je opisano u ovim opisima i primerima.
Brojne modifikacije i varijacije ovog pronalaska su moguće u svetlu učenja u tekstu iznad i zato su u ospegu prikačenih patentnih prijava.

Claims (30)

1. Izolovano humano monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, koji sadrži varjabilni region teškog lanca amino kiselinske sekvence SEQ ID NO:7 i varjabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8 , gde je fragment koji se veže za antigen izabran od Fab, Fab', F(ab')2, facb, Fv ili scFv fragment.
2. Izolovano humano monoklonalno antitelo prema zahtevu 1.
3. Izolovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema bilo kom od zahteva 1-2, koji se vezuje za humane alfa V beta 3 ili alfa V beta 5 integrine sa KD od bar 10"<7>M ili nižim.
4. Izolovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema bilo kom od zahteva 1-2, koji se veže za humane alfa V beta 3 i alfa V beta 5 integrine sa KD od 10"<8>M ili nižim.
5. Izolovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema bilo kom od zahteva 1-2, koji se veže za humane alfa V beta 3 i alfa V beta 5 integrine sa KD od 10"<9>M ili nižim.
6. Izolovano humano monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema bilo kom od prethodnih zahteva, dobijeno od hibridoma, gde su hibridome pripremljene iz B ćelija dobijenih od transgene ne-humane životinje koja ima genom koji se sastoji od transgena ili transhromozoma humanog teškog lanca i transgena ili transhromozoma humanog lakog lanca, spojenog za besmrtnu ćeliju.
7. Izolovano humano monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema bilo kom od prethodnih zahteva, što pomenuto antitelo suštinski neutralizuje bar jednu aktivnost humanog alfa V beta 3 i alfa V beta 5 integrinskog proteina ili njegovog fragmenta.
8. Izolovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema bilo kom od prethodnih zahteva koje kompletno inhibira M21 ćelijsku adheziju za vitronektin.
9. Izolovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema bilo kom od prethodnih zahteva, koje sadži humani lgG1 teški lanac i humani lgG1 laki lanac.
10. Izolovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema bilo kom od prethodnih zahteva za primenu u lečenju.
11. Farmaceutska kompozicija, koja sadrži izolovano humano monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema bilo kom od prethodnih zahteva i farmaceutski prihvatljiv nosač.
12. Kompozicija prema zahtevu 11, što dalje sadrži efikasnu količinu bar jednog detektabilnog obeleživača ili reportera, TNF antagonista, antireumatika, mišićnog relaksanta, narkotika, nesteroidnog antiinflamatornog leka (NSAID), analgetika, anestetika, sedativa, lokalnog anestetika, neuromuskularnog blokatora, antimikrobnog sredstva, antipsorijatika, kortikosteroida, anaboličkog steroida, eritropoietina, imunizacije, imunoglobulina, imunosupresiva, hromona rasta, leka za zamenu hromona, radiofarmaceutika, antidepresiva, antipsihotika, stimulanta, leka za astmu, beta agonista, inhalacionog steroida, epinefrina ili analoga, citokina, antagonista citokina, radiofarmaceutika, modulatora receptora estrogena, citotoksina, sredstva protiv raka, alkilacionog sredstva, antimetabolita ili mitotičkog inhibitora.
13. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira humano monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema bilo kom od prethodnih zahteva 1-9.
14. Izolovana nukleinska kiselina prema zahtevu 13, koja kodira humano monoklonalno antitelo koje sadrži SEQ ID NO:7 i SEQ ID NO:8.
15. Izolovani molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 13 ili zahtevu 14, gde je molekul nukleinske kiseline ugrađen u ekspresioni vektor.
16. Ćelija domaćina koja sadrži ekspresioni vektor prema zahtevu 15.
17. Ćelija domaćina prema zahtevu 16, gde je pomenuta ćelija domaćina COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, mieloma, limfoma ili biljna ćelija.
18. Postupak za dobijanje humanog monoklonalnog antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen prema bilo kom od prethodnih zahteva 1-9, koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina prema zahtevu 16 ili zahtevu 17 pod takvim uslovima da se eksprimuje antitelo.
19. Transgena ne-humana životinja ili biljka koja eksprimuje antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema bilo kom od prethodnih zahteva 1-9.
20. Transgena ne-humana životinja prema zahtevu 19, gde životinja ima genom koji sadrži transgen ili transhromozom humanog teškog lanca i transgen ili transhromozom humanog lakog lanca.
21. Upotreba izolovanog antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen prema bilo kom od prethodnih zahteva 1-9 u proizvodnji leka za lečenje ili sprečavanje leukemije, akutne leukemije, akutne leukemije limfoblasta, (ALL), B-ćelija, T-ćelija ili FAB ALL, akutne mijeloidne leukemije (AML), hronične mijelocitne leukemije (CML), hronične limfocitne leukemije (CLL), leukemije dlakastih ćelija, mijelodisplastičnog sindroma (MDS), limfoma, Hodžkinove bolesti, malignog limfoma, ne-Hodžkinsovog limfoma, Burkitovog limfoma, višestukog mijeloma, Kapošijevog sarkoma, kolorektalnog karcinoma, karcinoma pankreasa, karcinoma nazofaringsa, maligne histiocitoze, paraneoplastičnog sindroma/maligne hiperkalcemije, čvrstog tumora, adenokarcinoma, sarkoma, malignog meianoma, hemangioma, bolesti metastaze, kancera u vezi sa resorpcionom kostiju, kancera u vezi sa bolom u kostima ili malignom bolešću.
22. Upotreba prema zahtevu 21, što se lek daje sa efikasnom količinom bar jednog od: detektabilnog obeleživača ili reportera, TNF antagonista, antireumatika, mišićnog relaksanta, narkotika, nesteroidnog antiinflamatornog leka (NSAID), analgetika, anestetika, sedativa, lokalnog anestetika, neuromuskularnog blokatora, antimikrobnog sredstva, antipsorijatika, kortikosteroida, anaboličkog steroida, eritropoietina, imunizacije, imunoglobulina, imunosupresiva, hromona rasta, leka za zamenu hromona, radiofarmaceutika, antidepresiva, antipsihotika, stimulanta, leka za astmu, beta agonista, inhalacionog steroida, epinefrina ili analoga, citokina ili antagonista citokina.
23. Upotreba prema zahtevu 21 ili zahtevu 22, što je pomenuti lek pogodan za parenteralno, subkutanozno, intramuskularno, intravensko, intrartikularno, intrabronhijalno, intraabdominalno, intrakapsularno, intrahrskavično, intrakavitarno, intracelijarno, intracelebelarno, intracelebroventikularno, intrakolikalno, intracervikalno, intragastrično, intrahepatičko, intramioakrdialno, intraostealno, intrapelvično, intraperikaridačno, intraperitonealno, intrapleuralno, intraprostatičko, intraplumolarno, intrarektalno, intrarenalno, intraretinalno, intraspinalno, intrasinovijalno, intratorakalno, intrauteralno, intravezikalno, bolusom, vaginalno, rektalno, bukalno, sublingualno, intranazalno, ili transdermalno davanje.
24. Kombinovani lek koji sadrži antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema bilo kom od zahteva 1-9 i efikasnu količinu bar jednog od detektabilnog obeleživača ili reportera, TNF antagonista, antireumatika, mišićnog relaksanta, narkotika, nesteroidnog antiinflamatornog leka (NSAID), analgetika, anestetika, sedativa, lokalnog anestetika, neuromuskularnog blokatora, antimikrobnog sredstva, antipsorijatika, kortikosteroida, anaboličkog steroida, eritropoietina, imunizacije, imunoglobulina, imunosupresiva, hromona rasta, leka za zamenu hromona, radiofarmaceutika, antidepresiva, antipsihotika, stimulanta, leka za astmu, beta agonista, inhalacionog steroida, epinefrina ili analoga, citokina ili antagonista citokina, za simultanu, odvojenu ili sekvencijalnu upotrebu za lečenje leukemije, akutne leukemije, akutne leukemije limfoblasta, (ALL), B-ćelija, T-ćelija ili FAB ALL, akutne mijeloidne leukemije (AML), hronične mijelocitne leukemije (CML), hronične limfocitne leukemije (CLL), leukemije dlakastih ćelija, mijelodisplastičnog sindroma (MDS), limfoma, Hodžkinove bolesti, malignog limfoma, ne-Hodžkinsovog limfoma, Burkitovog limfoma, višestukog mijeloma, Kapošijevog sarkoma, kolorektalnog karcinoma, karcinoma pankreasa, karcinoma nazofaringsa, maligne histiocitoze, paraneoplastičnog sindroma/maligne hiperkalcemije, čvrstog tumora, adenokarcinoma, sarkoma, malignog meianoma, hemangioma, bolesti metastaze, kancera u vezi sa resorpcionom kostiju, kancera u vezi sa bolom u kostima ili malignom bolešću.
25. Upotreba efikasne količine bar jednog od: detektabilnog obeleživača ili reportera, TNF antagonista, antireumatika, mišićnog relaksanta, narkotika, nesteroidnog antiinflamatornog leka (NSAID), analgetika, anestetika, sedativa, lokalnog anestetika, neuromuskularnog blokatora, antimikrobnog sredstva, antipsorijatika, kortikosteroida, anaboličkog steroida, eritropoietina, imunizacije, imunoglobulina, imunosupresiva, hromona rasta, leka za zamenu hromona, radiofarmaceutika, antidepresiva, antipsihotika, stimulanta, leka za astmu, beta agonista, inhalacionog steroida, epinefrina ili analoga, citokina ili antagonista citokina, u proizvodnji leka za lečenje ili sprečavanje leukemije, akutne leukemije, akutne leukemije limfoblasta, (ALL), B-ćelija, T-ćelija ili FAB ALL, akutne mijeloidne leukemije (AML), hronične mijelocitne leukemije (CML), hronične limfocitne leukemije (CLL), leukemije dlakastih ćelija, mijelodisplastičnog sindroma (MDS), limfoma, Hodžkinove bolesti, malignog limfoma, ne-Hodžkinsovog limfoma, Burkitovog limfoma, višestukog mijeloma, Kapošijevog sarkoma, kolorektalnog karcinoma, karcinoma pankreasa, karcinoma nazofaringsa, maligne histiocitoze, paraneoplastičnog sindroma/maligne hiperkalcemije, čvrstog tumora, adenokarcinoma, sarkoma, malignog meianoma, hemangioma, bolesti metastaze, kancera u vezi sa resorpcionom kostiju, kancera u vezi sa bolom u kostima ili malignom bolešću, gde je pacijent prethodno tretiran sa bar jednim antitelom prema bilo kom od zahteva 1-9.
26. Upotreba prema zahtevu 21, što se pacijent prethodno tretira sa bar jednim jedinjenjem ili proteinom izabranim od detektabilnog obeleživača ili reportera, TNFantagonista, antireumatika, mišićnog relaksanta, narkotika, nesteroidnog antiinflamatornog leka (NSAID), analgetika, anestetika, sedativa, lokalnog anestetika, neuromuskularnog blokatora, antimikrobnog sredstva, antipsorijatika, kortikosteroida, anaboličkog steroida, eritropoietina, imunizacije, imunoglobulina, imunosupresiva, hromona rasta, leka za zamenu hromona, radiofarmaceutika, antidepresiva, antipsihotika, stimulanta, leka za astmu, beta agonista, inhalacionog steroida, epinefrina ili analoga, citokina ili antagonista citokina.
27. Proizvod koji se sastoji od materijala za pakovanje i suda u kome se nalazi rastvor ili liofilizovani oblik bar jednog izolovanog humanog antitela ili njegovog fragmetna koji se veže za antigen prema bilo kom od zahteva 1-9.
28. Proizvod prema zahtevu 27, što je pomenuti sud deo uređaja ili sistema za parenteralno, subkutanozno, intramuskularno, intravensko, intrartikularno, intrabronhijalno, intraandominalno, intrakapsularno, intrahrskavično, intrakavitarno, intracelijarno, intracelebelarno, intracelebroventikularno, intrakolikarno, intracervikalno, intragastrično, intrahepatičko, intramiokardialno, intraostealno, intrapelvično, intraperikaridačno, intraperitonealno, intrapleuralno, intraprostatičko, intraplumolarno, intrarektalno, intrarenalno, intraretinalno, intraspinalno, intrasinovijalno, intratorakalno, intrauteralno, intravezikalno, bolusom, vaginalno, rektalno, bukalno, sublingualno, intranazalno, ili transdermalno davanje.
29. Medicinski uređaj, koji sadrži bar jedno izolovano humano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema bilo kom od zahteva 1-9, što je pomenuti uređaj pogodan za dovođjenje u kontakt ili davanje pomenute bar jedne podjedinice anti-alfa- V antitela na bar jedan način odabran od parenteralnog, subkutanoznog, intramuskularnog, intravenskog, intrartikularnog, intrabronhijalnog, intraandomenalnog, intrakapsularnog, intrahrskavičnog, intrakavitarnog, intracelijarnog, intracelebelarnog, intracelebroventikularnog, intrakolikarnog, intracervikalnog, intragastričnog, intrahepatičkog, intramioakardialnog, intraostealnog, intrapelvičnog, intraperikaridačnog, intraperitonealnog, intrapleuralnog, intraprostatičkog, intraplumolarnog, intrarektalnog, intrarenalnog, intraretinalnog, intraspinalnog, intrasinovijalnog, intratorakalnog, intrauteralnog, intravezikalnog, bolusom, vaginalnog, rektalnog, bukalnog, sublingualnog, intranazalnog, ili transdermalnog davanja.
30. Postupak dobijanja antitela ili njegovog fragmenta prema bilo kom zahtevu od 1-9, koji se sastoji od gajenja transgene životinje ili biljke prema zahtevu 19.
YUP-94/03A 2000-08-07 2001-08-07 Anti-dual integrinska antitela, sastavi, metode i njihove upotrebe RS51197B (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US22336300P 2000-08-07 2000-08-07
US09/920,267 US7288390B2 (en) 2000-08-07 2001-08-01 Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses

Publications (2)

Publication Number Publication Date
YU9403A YU9403A (sh) 2006-05-25
RS51197B true RS51197B (sr) 2010-12-31

Family

ID=26917697

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YUP-94/03A RS51197B (sr) 2000-08-07 2001-08-07 Anti-dual integrinska antitela, sastavi, metode i njihove upotrebe

Country Status (23)

Country Link
US (1) US7288390B2 (sr)
EP (2) EP1309693B1 (sr)
JP (1) JP5014557B2 (sr)
KR (1) KR100832486B1 (sr)
CN (1) CN1468307B (sr)
AT (1) ATE470714T1 (sr)
AU (1) AU8316701A (sr)
BR (1) BR0113112A (sr)
CA (1) CA2418962C (sr)
DE (1) DE60142342D1 (sr)
DK (1) DK1309693T3 (sr)
EA (1) EA007617B1 (sr)
ES (1) ES2346041T3 (sr)
HR (1) HRP20030088B1 (sr)
HU (1) HU229418B1 (sr)
IL (1) IL154326A0 (sr)
MX (1) MXPA03001230A (sr)
NO (1) NO334999B1 (sr)
NZ (1) NZ524146A (sr)
PL (1) PL213030B1 (sr)
PT (1) PT1309693E (sr)
RS (1) RS51197B (sr)
WO (1) WO2002012501A2 (sr)

Families Citing this family (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030059427A1 (en) * 2000-04-28 2003-03-27 Force Walker R. Isolation and characterization of highly active anti-CD40 antibody
US7163681B2 (en) * 2000-08-07 2007-01-16 Centocor, Inc. Anti-integrin antibodies, compositions, methods and uses
US8703126B2 (en) 2000-10-12 2014-04-22 Genentech, Inc. Reduced-viscosity concentrated protein formulations
CA2658221C (en) 2001-04-27 2012-11-27 Kyowa Kirin Co., Ltd. Anti-cd40 monoclonal antibody
US7829087B2 (en) * 2001-07-09 2010-11-09 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating cognitive impairment
EP1414491A4 (en) * 2001-07-09 2005-07-06 Elan Pharm Inc METHOD OF INHIBITING THE TOXICITY OF AMYLOID
NZ535425A (en) 2002-03-13 2008-05-30 Biogen Idec Inc Anti-alphavbeta6 antibodies
CL2003002461A1 (es) * 2002-11-27 2005-01-07 Dow Chemical Company Agroscien Inmunoglobulina que comprende al menos un glicano afucosilado, composicion que la contiene, secuencia nucleotidica y vector que la comprende, procedimiento para producir dicha inmunoglobulina en plantas.
DK2236154T3 (en) 2003-02-10 2018-06-25 Biogen Ma Inc IMMUNOGLOBULIN INFORMATION AND METHOD OF PREPARING IT
EP1599502A1 (en) * 2003-02-27 2005-11-30 TheraVision GmbH A molecule which binds cd80 and cd86
MXPA05010555A (es) 2003-04-04 2006-03-09 Genentech Inc Formulaciones de proteina y anticuerpo de alta concentracion.
US9708410B2 (en) 2003-05-30 2017-07-18 Janssen Biotech, Inc. Anti-tissue factor antibodies and compositions
US7365154B2 (en) 2003-06-23 2008-04-29 Centocor, Inc. Peptides antagonistic to an anti-angiogenic antibody and uses therefor
WO2005068504A1 (ja) * 2004-01-19 2005-07-28 Medical And Biological Laboratories Co., Ltd. 炎症性サイトカイン抑制剤
AU2012216372B2 (en) * 2004-04-02 2015-01-22 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for treating and preventing disease associated with alphaVbeta5 integrin
AU2005229015C1 (en) * 2004-04-02 2013-01-17 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for treating and preventing disease associated with alphaVbeta5 integrin
US20060008415A1 (en) * 2004-06-25 2006-01-12 Protein Design Labs, Inc. Stable liquid and lyophilized formulation of proteins
US20060035239A1 (en) * 2004-08-06 2006-02-16 Applera Corporation Method and compositions for treating diseases targeting CD51
US8603483B2 (en) 2004-12-09 2013-12-10 Janssen Biotech, Inc. Anti-integrin immunoconjugates, methods and uses
CN104072614B (zh) 2005-07-08 2017-04-26 生物基因Ma公司 抗-αvβ6 抗体及其用途
CN101563105B (zh) 2006-07-10 2013-01-23 拜奥根Idec马萨诸塞公司 用于抑制smad4-缺陷癌症的组合物和方法
AU2007294731B2 (en) 2006-09-13 2014-04-17 Abbvie Inc. Cell culture improvements
US8911964B2 (en) 2006-09-13 2014-12-16 Abbvie Inc. Fed-batch method of making human anti-TNF-alpha antibody
US20090196913A1 (en) * 2007-05-11 2009-08-06 Ken Shi Kun Huang Anti-Alpha-V Immunoliposome Composition, Methods, and Uses
WO2008141278A1 (en) * 2007-05-11 2008-11-20 Centocor, Inc. Method for preparing antibody conjugates
US20090175784A1 (en) 2007-05-11 2009-07-09 Joshua Goldstein Anti-Alpha V Immunoliposome Composition, Methods, and Uses
ES2526355T3 (es) 2007-10-01 2015-01-09 Bristol-Myers Squibb Company Anticuerpos humanos que se adhieren a mesotelina, y usos de los mismos
BRPI0907046A2 (pt) 2008-01-18 2015-07-28 Medimmune Llc Anticorpo de cisteína engenheirada, ácido nucleico isolado, vetor, célula hospedeira, conjugado de anticorpo, composição farmacêutica, métodos de detecção de câncer, doenças ou distúrbios autoimunes, inflamatórios ou infecciosos em um indivíduo e de inibição de proliferação de uma célula alvo
WO2009154995A2 (en) * 2008-05-27 2009-12-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Interleukin 10 receptor (il-10r) antibodies and methods of use
WO2010068722A1 (en) 2008-12-12 2010-06-17 Medimmune, Llc Crystals and structure of a human igg fc variant with enhanced fcrn binding
AU2010221156A1 (en) * 2009-03-06 2011-09-22 Genentech, Inc. Antibody formulation
US20100291160A1 (en) * 2009-05-13 2010-11-18 Carver David R Pharmaceutical system for trans-membrane delivery
EP2711018A1 (en) 2009-06-22 2014-03-26 MedImmune, LLC Engineered Fc regions for site-specific conjugation
EP2456460A4 (en) 2009-07-24 2013-02-20 Univ California METHOD AND COMPOSITIONS FOR TREATING AND PREVENTING DISEASES ASSOCIATED WITH AVB5 INTEGRIN
CA2790866C (en) 2010-02-23 2019-02-12 Sanofi Anti-alpha2 integrin antibodies and their uses
US8993844B1 (en) 2010-05-27 2015-03-31 University Of Wyoming Production of spider silk protein in corn
ES2757857T3 (es) 2010-09-27 2020-04-30 Janssen Biotech Inc Anticuerpos de unión a colágeno II humano
US8906649B2 (en) 2010-09-27 2014-12-09 Janssen Biotech, Inc. Antibodies binding human collagen II
BR112013027119A8 (pt) 2011-04-21 2018-03-06 Seattle Genetics Inc novos conjugados ligante-droga (adcs) e uso dos mesmos
US9062106B2 (en) 2011-04-27 2015-06-23 Abbvie Inc. Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
ES2936387T3 (es) 2011-10-31 2023-03-16 Hoffmann La Roche Formulaciones de anticuerpos anti-il13
WO2013158273A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Methods to modulate c-terminal lysine variant distribution
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
WO2013158279A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Protein purification methods to reduce acidic species
WO2013176754A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 Abbvie Inc. Novel purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography
JP2015529199A (ja) * 2012-08-21 2015-10-05 オルソ−クリニカル ダイアグノスティクス，インコーポレイティド パリペリドンハプテンに対する抗体及びその使用
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
HK1211981A1 (en) 2012-09-02 2016-06-03 Abbvie Inc. Methods to control protein heterogeneity
HK1207960A1 (en) 2013-03-12 2016-02-19 Abbvie Inc. Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same
US9499614B2 (en) 2013-03-14 2016-11-22 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosaccharides
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
WO2014159579A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Abbvie Inc. MUTATED ANTI-TNFα ANTIBODIES AND METHODS OF THEIR USE
WO2014143739A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Biogen Idec Ma Inc. Anti-alpha v beta 6 antibodies and uses thereof
JP2016515120A (ja) * 2013-03-15 2016-05-26 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． 抗アルファｖベータ５抗体を用いた急性腎損傷の治療及び予防
WO2014144466A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Biogen Idec Ma Inc. Anti-alpha v beta 6 antibodies and uses thereof
US9598667B2 (en) 2013-10-04 2017-03-21 Abbvie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US8946395B1 (en) 2013-10-18 2015-02-03 Abbvie Inc. Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
US20150139988A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
RU2698697C2 (ru) 2013-12-23 2019-08-29 Байер Фарма Акциенгезельшафт Конъюгаты связующего (ADC) с ингибиторами KSP
EP3191519A1 (en) * 2014-09-12 2017-07-19 Biogen MA Inc. Humanized anti-alpha v beta 5 antibodies and uses thereof
EP3194972B1 (en) * 2014-09-17 2021-04-14 Merck Patent GmbH A method of treating bone metastasis diseases, medicaments therefore, and a method of predicting the clinical outcome of treating bone metastasis diseases
WO2016041614A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Merck Patent Gmbh A method of treating solid cancers and/or metastases thereof, medicaments therefore, and a method of predicting the clinical outcome of treating solid cancers and/or metastases thereof
JP6971858B2 (ja) 2015-06-22 2021-11-24 バイエル ファーマ アクチエンゲゼルシャフト 酵素開裂性基を有する抗体薬物複合体（ａｄｃ）および抗体プロドラッグ複合体（ａｐｄｃ）
CN106517702B (zh) * 2015-07-26 2021-03-12 通化鑫鸿新材料有限公司 一种去除含镉污水污染物的方法
WO2017060322A2 (en) 2015-10-10 2017-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Ptefb-inhibitor-adc
PE20181326A1 (es) 2015-11-03 2018-08-20 Janssen Biotech Inc Anticuerpos que se unen especificamente a pd-1 y sus usos
US11045547B2 (en) 2015-12-16 2021-06-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-LAG3 antibodies and antigen-binding fragments
EP3207937A1 (en) * 2016-02-17 2017-08-23 Royal College of Surgeons in Ireland A method of treating or preventing sepsis
JP7251981B2 (ja) 2016-03-24 2023-04-04 バイエル ファーマ アクチエンゲゼルシャフト 酵素開裂基を有する細胞毒性活性剤のプロドラッグ
EP3919518A1 (en) 2016-06-15 2021-12-08 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody-drug-conjugates (adcs) with ksp inhibitors and anti-cd123-antibodies
CN106265480A (zh) * 2016-09-03 2017-01-04 山西纳安生物科技有限公司 纳米抗体阴道给药系统及制备方法和应用
CN110072556B (zh) 2016-12-21 2023-05-02 拜耳制药股份公司 具有ksp抑制剂的特异性抗体药物缀合物(adc)
US12059472B2 (en) 2016-12-21 2024-08-13 Bayer Aktiengesellschaft Prodrugs of cytotoxic active agents having enzymatically cleavable groups
CN110312534B (zh) 2016-12-21 2023-04-04 拜耳制药股份公司 具有酶促可裂解基团的抗体-药物-缀合物(adc)
US12398209B2 (en) 2018-01-22 2025-08-26 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating cancers with antagonistic anti-PD-1 antibodies
JP7638989B2 (ja) 2019-11-21 2025-03-04 ユニティ バイオテクノロジー インコーポレイテッド Ｔｉｅ－２に対する抗体および使用方法

Family Cites Families (184)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4309989A (en) 1976-02-09 1982-01-12 The Curators Of The University Of Missouri Topical application of medication by ultrasound with coupling agent
FR2374910A1 (fr) 1976-10-23 1978-07-21 Choay Sa Preparation a base d'heparine, comprenant des liposomes, procede pour l'obtenir et medicaments contenant de telles preparations
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4656134A (en) 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
US5149636A (en) 1982-03-15 1992-09-22 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for introducing cloned, amplifiable genes into eucaryotic cells and for producing proteinaceous products
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB8426467D0 (en) 1984-10-19 1984-11-28 Technology Licence Co Ltd Monoclonal antibodies
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US6492107B1 (en) 1986-11-20 2002-12-10 Stuart Kauffman Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
DE229046T1 (de) 1985-03-30 1987-12-17 Marc Genf/Geneve Ballivet Verfahren zum erhalten von dns, rns, peptiden, polypeptiden oder proteinen durch dns-rekombinant-verfahren.
SE448277B (sv) 1985-04-12 1987-02-09 Draco Ab Indikeringsanordning vid en doseringsanordning for lekemedel
US4766067A (en) 1985-05-31 1988-08-23 President And Fellows Of Harvard College Gene amplification
US4870163A (en) 1985-08-29 1989-09-26 New York Blood Center, Inc. Preparation of pure human tumor necrosis factor and hybridomas producing monoclonal antibodies to human tumor necrosis factor
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5576195A (en) 1985-11-01 1996-11-19 Xoma Corporation Vectors with pectate lyase signal sequence
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
DE3600905A1 (de) 1986-01-15 1987-07-16 Ant Nachrichtentech Verfahren zum dekodieren von binaersignalen sowie viterbi-dekoder und anwendungen
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
SE453566B (sv) 1986-03-07 1988-02-15 Draco Ab Anordning vid pulverinhalatorer
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4767402A (en) 1986-07-08 1988-08-30 Massachusetts Institute Of Technology Ultrasound enhancement of transdermal drug delivery
AU610083B2 (en) 1986-08-18 1991-05-16 Clinical Technologies Associates, Inc. Delivery systems for pharmacological agents
US4889818A (en) 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US4704692A (en) 1986-09-02 1987-11-03 Ladner Robert C Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
DE3631229A1 (de) 1986-09-13 1988-03-24 Basf Ag Monoklonale antikoerper gegen humanen tumornekrosefaktor (tnf) und deren verwendung
IL83419A0 (en) 1986-09-15 1988-01-31 Westinghouse Electric Corp Antibodies reactive with chlorinated phenols,their preparation and their use
US4921794A (en) 1987-01-14 1990-05-01 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
US4795699A (en) 1987-01-14 1989-01-03 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
EP0832981A1 (en) 1987-02-17 1998-04-01 Pharming B.V. DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
ATE114723T1 (de) 1987-03-02 1994-12-15 Enzon Lab Inc Organismus als träger für ''single chain antibody domain (scad)''.
JP2647427B2 (ja) 1987-04-24 1997-08-27 帝人株式会社 被検者の病態の判定のための検出方法、モノクロ−ナル抗体および検出キット
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
CA1341235C (en) 1987-07-24 2001-05-22 Randy R. Robinson Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US4939666A (en) 1987-09-02 1990-07-03 Genex Corporation Incremental macromolecule construction methods
EP0396612B1 (en) 1988-01-11 1996-07-24 Xoma Corporation Novel plasmid vector with pectate lyase signal sequence
US6010902A (en) 1988-04-04 2000-01-04 Bristol-Meyers Squibb Company Antibody heteroconjugates and bispecific antibodies for use in regulation of lymphocyte activity
US4956288A (en) 1988-04-22 1990-09-11 Biogen, Inc. Method for producing cells containing stably integrated foreign DNA at a high copy number, the cells produced by this method, and the use of these cells to produce the polypeptides coded for by the foreign DNA
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5091310A (en) 1988-09-23 1992-02-25 Cetus Corporation Structure-independent dna amplification by the polymerase chain reaction
US5142033A (en) 1988-09-23 1992-08-25 Hoffmann-La Roche Inc. Structure-independent DNA amplification by the polymerase chain reaction
US5066584A (en) 1988-09-23 1991-11-19 Cetus Corporation Methods for generating single stranded dna by the polymerase chain reaction
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US4994370A (en) 1989-01-03 1991-02-19 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services DNA amplification technique
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5266491A (en) 1989-03-14 1993-11-30 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. DNA fragment and expression plasmid containing the DNA fragment
DE3909708A1 (de) 1989-03-23 1990-09-27 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur herstellung bispezifischer antikoerper
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
CA2016841C (en) 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
AU652539B2 (en) 1989-05-16 1994-09-01 Medical Research Council Co-expression of heteromeric receptors
ES2096590T3 (es) 1989-06-29 1997-03-16 Medarex Inc Reactivos biespecificos para la terapia del sida.
JP3443119B2 (ja) 1989-08-07 2003-09-02 ペプテック リミテッド 腫瘍壊死因子結合リガンド
AU638762B2 (en) 1989-10-05 1993-07-08 Optein Inc Cell-free synthesis and isolation of novel genes and polypeptides
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5580575A (en) 1989-12-22 1996-12-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Therapeutic drug delivery systems
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
WO1996033735A1 (en) * 1995-04-27 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
TW212184B (sr) 1990-04-02 1993-09-01 Takeda Pharm Industry Co Ltd
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
DK0600866T3 (da) 1990-06-01 1998-03-09 Chiron Corp Præparater og fremgangsmåder til identifikation af biologisk aktive molekyler
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
WO1992000373A1 (en) 1990-06-29 1992-01-09 Biosource Genetics Corporation Melanin production by transformed microorganisms
US5580734A (en) 1990-07-13 1996-12-03 Transkaryotic Therapies, Inc. Method of producing a physical map contigous DNA sequences
CA2090126C (en) 1990-08-02 2002-10-22 John W. Schrader Methods for the production of proteins with a desired function
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) * 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1992005258A1 (en) 1990-09-20 1992-04-02 La Trobe University Gene encoding barley enzyme
GB9022648D0 (en) 1990-10-18 1990-11-28 Charing Cross Sunley Research Polypeptide and its use
WO1992008802A1 (en) 1990-10-29 1992-05-29 Cetus Oncology Corporation Bispecific antibodies, method of production, and uses thereof
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5582996A (en) 1990-12-04 1996-12-10 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Bifunctional antibodies and method of preparing same
JPH06508022A (ja) 1991-02-21 1994-09-14 ギリアド　サイエンシズ，インコーポレイテッド 生体分子に特異的なアプタマーおよび生産方法
US5404871A (en) 1991-03-05 1995-04-11 Aradigm Delivery of aerosol medications for inspiration
ATE240740T1 (de) 1991-03-15 2003-06-15 Amgen Inc Pegylation von polypeptiden
ATE414768T1 (de) 1991-04-10 2008-12-15 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
DE4118120A1 (de) 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
DE69230613T2 (de) 1991-07-02 2000-12-28 Inhale Inc Verfahren und vorrichtung zum abgeben von medikamenten in aerosolform
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5733761A (en) 1991-11-05 1998-03-31 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5641670A (en) 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
EP0571613B1 (en) 1991-12-13 2003-09-17 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
US5667988A (en) 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
DE4207475A1 (de) 1992-03-10 1993-09-16 Goldwell Ag Mittel zum blondieren von menschlichen haaren und verfahren zu dessen herstellung
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
WO1993020229A1 (en) 1992-04-03 1993-10-14 Genentech, Inc. ANTIBODIES TO ALPHAvBETA3 INTEGRIN
AU4829593A (en) 1992-09-23 1994-04-12 Fisons Plc Inhalation device
WO1994008038A1 (en) 1992-10-02 1994-04-14 Trustees Of Dartmouth College Bispecific reagents for redirected targeting of low density lipoprotein
SK51695A3 (en) 1992-10-19 1995-11-08 Dura Pharma Inc Dry powder medicament inhaler
US5643252A (en) 1992-10-28 1997-07-01 Venisect, Inc. Laser perforator
WO1994012520A1 (en) 1992-11-20 1994-06-09 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
JPH08504194A (ja) 1992-12-01 1996-05-07 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド フィブリノーゲンレセプターアンタゴニスト
US5849695A (en) 1993-01-13 1998-12-15 The Regents Of The University Of California Parathyroid hormone analogues useful for treatment of osteoporosis and disorders of calcium meatabolism in mammals
WO1994016970A1 (en) 1993-01-19 1994-08-04 Glaxo Group Limited Device
EP0804561B1 (en) 1993-02-12 2009-12-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Regulated transcription of targeted genes and other biological events
EP0614989A1 (en) 1993-02-17 1994-09-14 MorphoSys AG A method for in vivo selection of ligand-binding proteins
US5770428A (en) 1993-02-17 1998-06-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Chimeric retrovial expression vectors and particles containing a simple retroviral long terminal repeat, BLV or HIV coding regions and cis-acting regulatory sequences, and an RNA translational enhancer with internal ribsome entry site
JPH08509612A (ja) 1993-04-26 1996-10-15 ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US5514670A (en) 1993-08-13 1996-05-07 Pharmos Corporation Submicron emulsions for delivery of peptides
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
DE4337197C1 (de) 1993-10-30 1994-08-25 Biotest Pharma Gmbh Verfahren zur selektiven Herstellung von Hybridomazellinien, die monoklonale Antikörper mit hoher Zytotoxizität gegen humanes CD16-Antigen produzieren, sowie Herstellung bispezifischer monoklonaler Antikörper unter Verwendung derartiger monoklonaler Antikörper und des CD30-HRS-3-Antikörpers zur Therapie menschlicher Tumore
US5814599A (en) 1995-08-04 1998-09-29 Massachusetts Insitiute Of Technology Transdermal delivery of encapsulated drugs
SE9304060D0 (sv) 1993-12-06 1993-12-06 Bioinvent Int Ab Sätt att selektera specifika bakteriofager
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
AU692239B2 (en) 1994-03-07 1998-06-04 Medarex, Inc. Bispecific molecules having clinical utilities
US5753230A (en) * 1994-03-18 1998-05-19 The Scripps Research Institute Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis
US5763733A (en) 1994-10-13 1998-06-09 Enzon, Inc. Antigen-binding fusion proteins
EP0719859B1 (en) 1994-12-20 2003-07-02 MERCK PATENT GmbH Anti-alpha V-integrin monoclonal antibody
US5549551A (en) 1994-12-22 1996-08-27 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Adjustable length balloon catheter
US5674483A (en) * 1995-01-31 1997-10-07 National Jewish Medical And Research Center Treatment for diseases involving inflammation
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6037453A (en) 1995-03-15 2000-03-14 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants
US5656730A (en) 1995-04-07 1997-08-12 Enzon, Inc. Stabilized monomeric protein compositions
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
ATE308981T1 (de) 1995-08-14 2005-11-15 Scripps Research Inst Verfahren und mittel zur hemmung der durch alpha v beta 5 vermittelten angiogenese
US20030009404A2 (en) * 1995-10-12 2003-01-09 Mopex, Inc. Open end mutual fund securitization process
GB9526100D0 (en) 1995-12-20 1996-02-21 Intersurgical Ltd Nebulizer
EP0938907B1 (en) 1996-01-03 2001-12-05 Glaxo Group Limited Inhalation device
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
DE69710319T2 (de) 1996-03-29 2002-08-14 G.D. SEARLE &amp; CO., CHICAGO Para-substituierte phenylpropansäure derivate als integrin-antagonisten
DE19624387C2 (de) 1996-06-19 1999-08-19 Hatz Motoren Kaltstartvorrichtung
DK0826695T3 (da) 1996-09-03 2002-04-15 Gsf Forschungszentrum Umwelt Tilintetgørelse af kontaminerende tumorceller i stamcelletransplantater med bispecifikke antistoffer
JP4044648B2 (ja) 1996-10-04 2008-02-06 日本エンバイロケミカルズ株式会社 洗剤またはその分解物の免疫学的分析用モノクローナル抗体およびその用途
CA2722378C (en) 1996-12-03 2015-02-03 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that bind tnf.alpha.
US20010011125A1 (en) * 1997-01-30 2001-08-02 William D. Huse Anti-alpha v beta 3 recombinant human antibodies, nucleic acids encoding same and methods of use
US5879681A (en) 1997-02-07 1999-03-09 Emisphere Technolgies Inc. Compounds and compositions for delivering active agents
US5921447A (en) 1997-02-13 1999-07-13 Glaxo Wellcome Inc. Flow-through metered aerosol dispensing apparatus and method of use thereof
EP0973550B1 (en) * 1997-04-11 2002-10-09 G.D. SEARLE &amp; CO. Antagonistic anti-avb3 integrin antibodies
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
IL120943A (en) 1997-05-29 2004-03-28 Univ Ben Gurion A system for administering drugs through the skin
US6160099A (en) 1998-11-24 2000-12-12 Jonak; Zdenka Ludmila Anti-human αv β3 and αv β5 antibodies
US6521593B1 (en) 1999-02-01 2003-02-18 Childrens Hospital Los Angeles Methods for inhibiting brain tumor growth
US6342219B1 (en) * 1999-04-28 2002-01-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody compositions for selectively inhibiting VEGF
US6175824B1 (en) * 1999-07-14 2001-01-16 Chi Research, Inc. Method and apparatus for choosing a stock portfolio, based on patent indicators
US7184981B2 (en) * 1999-12-06 2007-02-27 X/Net Associates, Inc. Method and system for the creation of a class of loan securities
US6484152B1 (en) * 1999-12-29 2002-11-19 Optimumportfolio.Com, Llc Automated portfolio selection system
US6604113B1 (en) * 2000-04-14 2003-08-05 Qwest Communications International, Inc. Method and apparatus for providing account information
US20020059126A1 (en) * 2000-06-27 2002-05-16 John Ricciardi System and method for a selecting an investment item
US20030093353A1 (en) * 2000-07-05 2003-05-15 Marketocracy System and method for creating and maintaining investment portfolios
US7584132B2 (en) * 2001-02-06 2009-09-01 Strategic Capital Network, Llc System for facilitating selection of investments
WO2002089033A1 (en) * 2001-04-30 2002-11-07 Philip Tan Meng Ngee A multi-dimensional method and system of simulating and managing an alliance investment portfolio
US20030036945A1 (en) * 2001-05-22 2003-02-20 Del Vecchio Joseph Nicholas System, method and computer program product for assessing the value of intellectual property
US20020178099A1 (en) * 2001-05-25 2002-11-28 Shayne Young Methods and systems for managing a portfolio of securities
US7509278B2 (en) * 2001-07-16 2009-03-24 Jones W Richard Long-term investing
US7512555B2 (en) * 2001-11-13 2009-03-31 Gregory M Finn Investment management tool
US20030143603A1 (en) * 2001-11-30 2003-07-31 Jill Giles-Komar Anti-TNF antibodies, compositions, methods and uses
US7433839B2 (en) * 2002-03-20 2008-10-07 Bodurtha Stephen G Total return asset contracts and associated processing systems
US20040002892A1 (en) * 2002-03-20 2004-01-01 Martin Gluck Portal for global portfolio management system method & apparatus
CA2381689A1 (en) * 2002-04-12 2003-10-12 Algorithmics International Corp. System, method and framework for generating scenarios
US20040024673A1 (en) * 2002-07-31 2004-02-05 International Business Machines Corporation Method for optimizing the allocation of resources based on market and technology considerations
US7606756B2 (en) * 2002-08-02 2009-10-20 Jpmorgan Chase Bank, N.A. Synthetic funds having structured notes
US20040111350A1 (en) * 2002-08-14 2004-06-10 Water Street Advisers, Inc. Process to create market-sector investment portfolio performance indices
US7340425B2 (en) * 2002-10-29 2008-03-04 First Trust Portfolios, L.P. Method for generating a portfolio of stocks
US8121889B2 (en) * 2003-05-16 2012-02-21 International Business Machines Corporation Information technology portfolio management
US20050267835A1 (en) * 2003-12-31 2005-12-01 Scott Condron System and method for evaluating exposure across a group of investment portfolios by category
US20050251465A1 (en) * 2004-05-02 2005-11-10 Brown Daniel P System and method for structuring and operating an investment vehicle
US7739183B2 (en) * 2004-06-03 2010-06-15 Voudrie Jeffrey D Real-time client portfolio management system
US8442889B2 (en) * 2004-07-12 2013-05-14 Darrin B. Farrow Asset allocation based system for individual investor portfolio selection
US20060031149A1 (en) * 2004-08-04 2006-02-09 Lyons Timothy J Investment vehicle and methods and systems for implementing investment strategy
TWI503850B (zh) 2013-03-22 2015-10-11 Polytronics Technology Corp 過電流保護元件

Also Published As

Publication number Publication date
CN1468307B (zh) 2010-04-28
NO20030621D0 (no) 2003-02-07
EP2253646A1 (en) 2010-11-24
EA200300244A1 (ru) 2004-02-26
KR100832486B1 (ko) 2008-05-26
CA2418962C (en) 2012-02-21
BR0113112A (pt) 2004-04-20
HRP20030088B1 (hr) 2012-12-31
NZ524146A (en) 2005-11-25
US20030040044A1 (en) 2003-02-27
EP1309693B1 (en) 2010-06-09
HU229418B1 (hu) 2013-12-30
WO2002012501A2 (en) 2002-02-14
HUP0302128A2 (hu) 2003-09-29
WO2002012501A3 (en) 2003-01-03
ATE470714T1 (de) 2010-06-15
ES2346041T3 (es) 2010-10-08
NO334999B1 (no) 2014-08-18
JP2004510414A (ja) 2004-04-08
CN1468307A (zh) 2004-01-14
US7288390B2 (en) 2007-10-30
MXPA03001230A (es) 2004-01-29
JP5014557B2 (ja) 2012-08-29
PL366211A1 (en) 2005-01-24
DE60142342D1 (de) 2010-07-22
EP1309693A2 (en) 2003-05-14
AU2001283167A9 (en) 2002-02-18
PL213030B1 (pl) 2012-12-31
PT1309693E (pt) 2010-08-09
YU9403A (sh) 2006-05-25
IL154326A0 (en) 2003-09-17
HRP20030088A2 (en) 2007-04-30
EA007617B1 (ru) 2006-12-29
KR20030022369A (ko) 2003-03-15
CA2418962A1 (en) 2002-02-14
HUP0302128A3 (en) 2005-11-28
AU8316701A (en) 2002-02-18
NO20030621L (no) 2003-04-01
DK1309693T3 (da) 2010-09-27
AU2001283167A2 (en) 2002-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1309693B1 (en) Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
DK2305817T3 (en) ANTI-IL-12 ANTIBODIES, COMPOSITIONS, PROCEDURES AND APPLICATIONS
AU2001283167B2 (en) Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
AU2007202670B2 (en) Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
HK1151042A (en) Anti-dual integrin antibody and compositions and conjugates comprising said antibody
AU2001283167A1 (en) Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
ZA200301864B (en) Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses.
HK1159159B (en) Anti-il-12 antibodies, compositions, methods and uses
ZA200301867B (en) Anti-IL-12 antibodies, compositions, methods and uses.
HK1159159A (en) Anti-il-12 antibodies, compositions, methods and uses