PL213030B1

PL213030B1 - Wyizolowane ludzkie monoklonalne przeciwcialo anty-dwuintegrynowe i jego fragment wiazacy antygen, wyizolowane ludzkie przeciwcialo monoklonalne, kompozycja farmaceutyczna, wyizolowana czasteczka kwasu nukleinowego, komórka gospodarza, sposób wytwarzania ludzkiego monoklonalnego przeciwciala anty-dwuintegrynowego, transgeniczne zwierze niebedace czlowiekiem oraz zastosowania takiego przeciwciala lub jego fragmentu i wyrób przemyslowy

Info

Publication number: PL213030B1
Application number: PL366211A
Authority: PL
Inventors: Jill Giles-Komar; George Heavner; Linda Snyder; Mohit Trikha
Original assignee: Centocor
Priority date: 2000-08-07
Filing date: 2001-08-07
Publication date: 2012-12-31
Also published as: CN1468307B; NO20030621D0; EP2253646A1; EA200300244A1; KR100832486B1; RS51197B; CA2418962C; BR0113112A; HRP20030088B1; NZ524146A; US20030040044A1; EP1309693B1; HU229418B1; WO2002012501A2; HUP0302128A2; WO2002012501A3; ATE470714T1; ES2346041T3; NO334999B1; JP2004510414A

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest wyizolowane ludzkie monoklonalne przeciwciało anty-dwuintegrynowe specyficznie wiążące się z ludzkimi integrynami Alfa V Beta 3 i Alfa V Beta 5 i jego fragment wiążący antygen, wyizolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne, kompozycja farmaceutyczna zawierająca wyizolowane ludzkie monoklonalne przeciwciało anty-dwuintegrynowe specyficznie wiążące się z ludzkimi integrynami Alfa V Beta 3 i Alfa V Beta 5 lub jego fragment wiążący antygen, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, komórka gospodarza, sposób wytwarzania ludzkiego monoklonalnego przeciwciała anty-dwuintegrynowego, transgeniczne zwierzę niebędące człowiekiem i zastosowania takiego przeciwciała lub jego fragmentu oraz wyrób przemysłowy.

Dziedzina wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy przeciwciał, w tym specyficznych części specyficznych dla białka dwuintegrynowego alfa-v-beta3 i alfa-v-beta5, jak również kwasów nukleinowych kodujących takie przeciwciała dwuintegrynowe, wektorów, komórek gospodarza i sposobów ich wytwarzania i ich zastosowania, w tym preparatów terapeutycznych i urządzeń.

Stan techniki

Istnieją obecnie poważne dowody na to, że postępujący wzrost guza zależy od angiogenezy, tworzenia nowych naczyń krwionośnych dostarczających guzom substancje odżywcze i tlen, wyprowadzających produkty odpadowe, działających jako drogi przerzutów komórek nowotworowych w odległe miejsca (Gastl i wsp., Oncol. 54:177-184). Ostatnie badania określiły ponadto znaczenie integryn w procesie angiogenezy. Integryny są heterodimerowymi transbłonowymi białkami odgrywającymi krytyczną rolę w adhezji komórek do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), co z kolei warunkuje przeżycie, proliferację i migrację komórek dzięki sygnalizacji wewnątrzkomórkowej. Podczas angiogenezy szereg integryn ulegających ekspresji na powierzchni aktywowanych komórek śródbłonka reguluje krytyczne dla adhezji oddziaływania z różnymi białkami ECM w celu regulacji różnych stanów biologicznych takich jak migracja, proliferacja i różnicowanie komórkowe. Wykazano, że blisko spokrewnione, lecz odmienne integryny aVb3 i aVb5 wpływają na niezależne szlaki procesu angiogenezy. Przeciwciało wytworzone przeciw ανβ3 zablokowało angiogenezę wywołaną przez zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF), podczas gdy przeciwciało specyficzne dla ανβ5 hamowało angiogenezę wywołaną przez czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) (Eliceiri i wsp., J. Clin. Invest. 103:1227-1230 (1999); Friedlander i wsp., Science 27 0:1500-1502 (1995)).

Niepochodzące od człowieka przeciwciała ssacze, chimerowe, poliklonalne (np. surowica odpornościowa) i/lub przeciwciała monoklonalne (Mabs) oraz fragmenty (np. produkty trawienia proteolitycznego lub ich białka fuzyjne) są potencjalnie czynnikami terapeutycznymi, które są badane w niektórych przypadkach dla osiągnięcia leczenia pewnych chorób. Jednakże, takie przeciwciała lub fragmenty mogą wzbudzić odpowiedź immunologiczną po podaniu ludziom. Taka odpowiedź immunologiczna może skutkować zależnym od kompleksów immunologicznych usuwaniem z układu krążenia przeciwciał lub fragmentów i czynić powtórne podanie nieodpowiednim do leczenia, co za tym idzie może ograniczać terapeutyczne korzyści przynoszone pacjentowi i ograniczać ponowne podawanie przeciwciała lub jego fragmentu. Przykładowo, powtórne podanie przeciwciał lub fragmentów zawierających niepochodzące od człowieka części może prowadzić do choroby posurowiczej i/lub anafilaksji. W celu usunię cia tych i innych problemów podję to szereg prób dla ograniczenia immunogenno ś ci takich przeciwciał i ich części obejmujących otrzymywanie chimer i humanizację, co jest dobrze znane w dziedzinie. Te i inne podejś cia nadal mogą jednak skutkować wytwarzaniem przeciwciał lub fragmentów o pewnej immunogenności, niskim powinowactwie, niskiej zachłanności wiązania, lub stwarzających problemy w hodowli komórkowej, zwiększaniu skali produkcji i/lub z niską wydajnością otrzymywania. Tak więc, takie przeciwciała lub fragmenty mogą być mniej niż idealnie przystosowane do wytwarzania lub zastosowania jako białka terapeutyczne.

Zgodnie z tym istnieje potrzeba dostarczenia przeciwciał anty-dwuintegrynowych (ang. anti-dual integryn antibodies) lub fragmentów, które przezwyciężą jeden lub więcej takich problemów, jak również będą udoskonaleniem w stosunku do znanych przeciwciał lub ich fragmentów.

Podsumowanie wynalazku

Niniejszy wynalazek dostarcza wyizolowanych, ludzkich, przeciwciał anty-dwuintegrynowych i ich specyficznych części, jak również kompozycji przeciwciała anty-dwuintegrynowego, kodującego kwasu nukleinowego, wektora, komórki gospodarza, transgenicznych zwierząt niebędących człowiePL 213 030 B1 kiem, transgenicznych roślin i sposobów ich otrzymywania i zastosowania, jak to opisano i ujawniono tutaj w kombinacji z tym co znane jest w dziedzinie.

Przedmiotem wynalazku jest wyizolowane ludzkie monoklonalne przeciwciało anty-dwuintegrynowe specyficznie wiążące się z ludzkimi integrynami Alfa V Beta 3 i Alfa V Beta 5 lub jego fragment wiążący antygen, charakteryzujące się tym, że zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego i ł a ń cucha lekkiego wybrany spoś ród NR ID. SEKW.: 7 i NR ID. SEKW.: 8 oraz zawiera (i) wszystkie regiony determinujące komplementarność (CDR) łańcucha ciężkiego o sekwencjach aminokwasowych NR ID. SEKW.: 1, 2 i 3; oraz (ii) wszystkie regiony determinujące komplementarność (CDR) łańcucha lekkiego o sekwencjach aminokwasowych NR ID. SEKW.: 4, 5 i 6.

Korzystnie przeciwciało to lub jego fragment wiąże się z ludzkimi integrynami Alfa V Beta 3 albo Alfa V Beta 5 z powinowactwem co najmniej jednym wybranym spośród co najmniej 10^-9 M, co najmniej 10^-10 M, co najmniej 10^-11 M, albo co najmniej 10^-12 M.

Korzystnie przeciwciało to lub jego fragment wiąże się z ludzkimi integrynami Alfa V Beta 3 i Alfa V Beta 5 z KD wynoszącą 10^-7 M lub mniej.

Korzystnie przeciwciało to lub jego fragment wiąże się z ludzkimi integrynami Alfa V Beta 3 i Alfa V Beta 5 z KD wynoszącą KD 10^-8 M lub mniej.

Korzystnie przeciwciało to lub jego fragment wiąże się z ludzkimi integrynami Alfa V Beta 3 i Alfa V Beta 5 z KD wynoszącą KD 10^-9 M lub mniej.

Korzystnie przeciwciało to lub jego fragment zasadniczo neutralizuje co najmniej jedną aktywność ludzkich białek integryny Alfa V Beta 3 i Alfa V Beta 5 lub ich fragmentu.

Korzystnie przeciwciało to lub jego fragment całkowicie hamuje adhezję komórek M21 do witronektyny.

Korzystnie przeciwciało to lub jego fragment zawiera łańcuch ciężki ludzkiej IgG1 i łańcuch lekki ludzkiej IgG1.

Korzystnie przeciwciało to lub jego fragment zawiera łańcuch ciężki IgG1 albo IgG3.

Przedmiotem wynalazku jest także wyizolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne, charakteryzujące się tym, że wiąże się z tym samym regionem ludzkich integryn Alfa V Beta 3 i Alfa V Beta 5 jak przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jak określono powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest też kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera wyizolowane ludzkie monoklonalne przeciwciało anty-dwuintegrynowe lub jego fragment wiążący antygen jak określono powyżej i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Korzystnie kompozycja ta zawiera ponadto skuteczną ilość co najmniej jednego spośród: wykrywalnego znacznika lub reportera, antagonisty TNF, środka przeciwreumatycznego, środka zwiotczającego mięśnie, środka narkotycznego, niesterydowego leku przeciwzapalnego (NSAID), środka przeciwbólowego, środka znieczulającego, środka uspokajającego, środka miejscowo znieczulającego, blokera neuro-mięśniowego, środka przeciwdrobnoustrojowego, środka przeciwłuszczycowego, kortykosterydu, sterydu anabolicznego, erytropoetyny, środka immunizującego, immunoglobuliny, środka immunosupresyjnego, hormonu wzrostu, leku do hormonalnej terapii zastępczej, radiofarmaceutyku, środka przeciwdepresyjnego, środka przeciwpsychotycznego, środka pobudzającego, leku na astmę, beta agonisty, sterydu wziewnego, epinefryny lub jej analogu, cytokiny lub antagonisty cytokiny, środka modulującego receptor estrogenowy, cytotoksyny, środka przeciwnowotworowego, środka alkilującego, antymetabolitu albo inhibitora mitotycznego.

Przedmiotem wynalazku jest również wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, charakteryzująca się tym, że koduje ludzkie monoklonalne przeciwciało anty-dwuintegrynowe lub jego fragment wiążący antygen jak określono powyżej.

Korzystnie cząsteczka ta koduje ludzkie monoklonalne przeciwciało anty-dwuintegrynowe, lub jego region zmienny obejmujące sekwencje NR ID. SEKW.: 7 i NR ID. SEKW.: 8.

Korzystnie cząsteczka ta koduje ludzkie przeciwciało anty-dwuintegrynowe lub jego fragment wiążący antygen zawierające (i) wszystkie CDR łańcucha ciężkiego o sekwencjach aminokwasowych NR ID. SEKW.: 1, 2 i 3; oraz (ii) wszystkie CDR łańcucha lekkiego o sekwencjach aminokwasowych NR ID. SEKW.: 4, 5 i 6.

Korzystnie cząsteczka ta wprowadzona jest do wektora ekspresyjnego.

Przedmiotem wynalazku jest tez komórka gospodarza, charakteryzująca się tym, że zawiera wektor ekspresyjny jak określono powyżej.

Korzystnie komórka ta stanowi komórkę COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, komórkę szpiczaka, komórkę chłoniaka albo komórkę roślinną.

PL 213 030 B1

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania ludzkiego monoklonalnego przeciwciała anty-dwuintegrynowego lub jego fragmentu wiążącego antygen jak określono powyżej, polegający na tym, że obejmuje hodowlę komórki gospodarza jak określono powyżej w warunkach takich, że następuje ekspresja przeciwciała.

Przedmiotem wynalazku jest też transgeniczne zwierzę niebędące człowiekiem, charakteryzujące się tym, że wykazuje ekspresję ludzkiego przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen jak określono powyżej, przy czym genom tego transgenicznego zwierzęcia niebędącego człowiekiem zawiera transgen albo transchromosom ludzkiego łańcucha ciężkiego oraz transgen albo transchromosom ludzkiego łańcucha lekkiego.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie wyizolowanego przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen jak określono powyżej do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki białaczki, ostrej białaczki, ostrej białaczki Iimfoblastycznej (ALL), ALL z komórek B, ALL z komórek T albo ALL z FAB, ostrej białaczki mieloidalnej (AML), przewlekłej białaczki mielocytarnej (CML), przewlekłej białaczki Iimfocytarnej (CLL), białaczki włochatokomórkowej, zespołu mielodysplastycznego (MDS), chłoniaka, chłoniaka Hodgkin'a, chłoniaka złośliwego, chłoniaka nieziarniczego, chłoniaka Burkitt'a, szpiczaka mnogiego, mięsaka Kaposi'ego, raka jelita grubego, raka trzustki, raka jamy nosowogardłowej, histiocytozy złośliwej, zespołu paraneoplastycznego/hiperkalcemii w chorobie nowotworowej typu złośliwego, guza litego, gluczorakoraka, mięsaka, czerniaka złośliwego, naczyniaka, choroby przerzutowej, resorpcji kości związanej z nowotworem, bólu kości związanego z nowotworem, lub choroby złośliwej.

Korzystnie lek jest przeznaczony do podawania ze skuteczną ilością co najmniej jednego spośród: wykrywalnego znacznika lub reportera, antagonisty TNF, środka przeciwreumatycznego, środka zwiotczającego mięśnie, środka narkotycznego, niesterydowego leku przeciwzapalnego (NSAID), środka przeciwbólowego, środka znieczulającego, środka uspokajającego, środka miejscowo znieczulającego, blokera neuro-mięśniowego, środka przeciwdrobnoustrojowego, środka przeciwłuszczycowego, kortykosterydu, sterydu anabolicznego, erytropoetyny, środka immunizującego, immunoglobuliny, środka immunosupresyjnego, hormonu wzrostu, leku do hormonalnej terapii zastępczej, radiofarmaceutyku, środka przeciwdepresyjnego, środka przeciwpsychotycznego, środka pobudzającego, leku na astmę, beta agonisty, sterydu wziewnego, epinefryny lub jej analogu, cytokiny lub antagonisty cytokiny.

Korzystnie lek jest odpowiedni do podawania pozajelitowego, podskórnego, domięśniowego, dożylnego, dostawowego, dooskrzelowego, dobrzusznego, dotorebkowego, dochrząskowego, dojamowego, do przestrzeni jamistej, domóżdżkowego, do komór mózgu, do okrężnicy, doszyjkowego, dożołądkowego, dowątrobowego, do mięśnia sercowego, dokostnego, domiednicznego, doosierdziowego, dootrzewnowego, doopłucnowego, do prostaty, dopłucnego, doodbytniczego, donerkowego, dosiatkówkowego, dordzeniowego, domaziówkowego, dopiersiowego, domacicznego, dopęcherzowego, w jednej dużej dawce, pochwowego, odbytniczego, policzkowego, podjęzykowego, donosowego albo przezskórnego.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto wyrób przemysłowy, charakteryzujący się tym, że zawiera materiał opakowujący i pojemnik zawierający roztwór lub postać liofilizowaną co najmniej jednego wyizolowanego ludzkiego przeciwciała anty-dwuintegrynowego jak określono powyżej.

Sekwencja aminokwasowa przeciwciała może ewentualnie zawierać przynajmniej jedno specyficzne podstawienie, insercję lub delecję, jakie tu opisano lub jakie są znane w dziedzinie.

Niniejszy opis ujawnia również przynajmniej jedno, wyizolowane przeciwciało anty-dwuintegrynowe jakie tu opisano, które to przeciwciało posiada przynajmniej jedną aktywność taką jak, lecz nie ograniczoną do hamowania wiązania witronektyny, hamowania wiązania alfa-v beta-3 z przynajmniej jednym z ligandów lub receptorów alfa-v beta-3, hamowania wiązania alfa-v beta-5 z przynajmniej jednym ligandem lub receptorem alfa-v beta-5, modulowania angiogenezy, wiązania komórek wyrażających dwuintegrynę lub pojedynczą integrynę. Co za tym idzie, przeciwciało anty-dwuintegrynowe musi być wyszukane, zgodnie ze znanymi sposobami, z uwagi na odpowiednią aktywność, tak jak, lecz nie tylko z uwagi na przynajmniej jedną aktywność biologiczną względem białka dwuintegrynowego (ang. dual integrin protein).

Niniejszy opis ujawnia wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego zawierające komplementarny polinukleotyd kodujący przynajmniej jedno przeciwciało antyidiotypowe dla dwuintegryny (ang. dual integrin), zawierający przynajmniej jedną specyficzną sekwencję, domenę, część lub jej wariant, lub hybrydyzujący z nim. Niniejszy opis ujawnia ponadto rekombinowane wektory zawierające cząPL 213 030 B1 steczki kwasu nukleinowego kodującego wspomniane przeciwciało antyidiotypowe dla dwuintegryny, komórki gospodarza zawierające takie kwasy nukleinowe i/lub rekombinowane wektory, jak również sposoby wytwarzania i zastosowania takich kwasów nukleinowych dla przeciwciała antyidiotypowego, wektorów i/lub komórek gospodarza.

Niniejszy opis ujawnia również przynajmniej jeden sposób do wyrażania przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego lub przeciwciała antyidiotypowego dla dwuintegryny, w komórce gospodarza, obejmujący hodowanie komórki gospodarza jaką tu opisano w warunkach, w których wyrażane jest przynajmniej jedno przeciwciało anty-dwuintegrynowe w wykrywalnych i/lub odzyskiwalnych ilościach.

Niniejszy wynalazek dostarcza również przynajmniej jednej kompozycji zawierającej (a) wyizolowane przeciwciało jakie tu opisano; i (b) dogodny nośnik lub rozcieńczalnik. Nośnik lub rozcieńczalnik może być ewentualnie akceptowalny farmaceutycznie, zgodnie ze znanymi nośnikami lub rozcieńczalnikami. Kompozycja może ewentualnie zawierać ponadto przynajmniej jeden dodatkowy związek, białko lub kompozycję.

Niniejszy opis ujawnia ponadto przynajmniej jeden sposób lub kompozycję do podawania przeciwciała anty-dwuintegrynowego w ilości terapeutycznie skutecznej dla modulowania lub leczenia przynajmniej jednego stanu związanego z dwuintegryną występującego w komórce, tkance, organie, zwierzęciu lub u pacjenta i/lub przed, w trakcie lub w czasie związanego z nią stanu, jak wiadomo w dziedzinie i/lub tu opisano.

Niniejszy opis ujawnia również przynajmniej jedną kompozycję, urządzenie i/lub sposób do dostarczania terapeutycznie lub profilaktycznie skutecznej ilości przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego według niniejszego wynalazku.

Niniejszy opis ujawnia ponadto przynajmniej jedną kompozycję, urządzenie lub sposób do diagnozowania przynajmniej jednego stanu związanego z dwuintegryną, w komórce, tkance, organie, zwierzęciu lub u pacjenta i/lub przed, po lub w trakcie związanego z nią stanu jak wiadomo w dziedzinie i/lub jak tu opisano.

Niniejszy opis ujawnia również przynajmniej jedną kompozycję, urządzenie i/lub sposób dostarczania do diagnozowania przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego według niniejszego wynalazku.

Opis Figur

Fig. 1 przedstawia wykres podwójnych rozcieńczeń Mab anty-ave3 inkubowanych na płytkach opłaszczonych ανβ3 przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Płytki dwukrotnie płukano i sondowano wyznakowanym HRP kozim przeciwciałem anty-ludzkim specyficznym wobec łańcucha kappa IgG przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Płytki ponownie płukano, wywołano substratem OPD i mierzono OD przy 490 nm.

Fig. 2 przedstawia wykres dla wyznakowanych kalceiną komórek M21 preinkubowanych z próbkami przeciwciała przy braku lub w obecności P1F6, płynu surowiczego anty-ave5 przez 30 minut, następnie dodano na 45 minut do płytek opłaszczonych witronektyną. Niezwiązane komórki M21 usunięto dwoma płukaniami o objętości 150 μl na studzienkę HBSS z wapniem. Płytkę odczytano na fluorymetrze przy 485-538 nm.

Fig. 3 przedstawia wykres adhezji komórek, gdzie komórki MDAMB43 5L2 zebrano i wstępnie inkubowano przez 10 min. z różnymi stężeniami Gen095. Następnie komórki nowotworowe dodano do płytek Linbro opłaszczonych witronektyną, które inkubowano w 37°C przez 1 godzinę. Studzienki płukano trzykrotnie i do każdej studzienki dodano oparty na MTT barwnik Cell Titer AQ. Adhezję komórek określano na czytniku płytki do ELISA, gdzie OD przy 490 nm jest wprost proporcjonalne do adhezji komórei. Adhezja komórek do studzienek opłaszczonych BSA służyła jako kontrola negatywna (dane nie przedstawione). Każdy punkt informacyjny przedstawia wartość średnią dla trzech oznaczeń.

Fig. 4 A-D przedstawia wykresy wiązania przeciwciała z ανβ3, gdzie ligand ten był preinkubowany w dwukrotnych rozcieńczeniach począwszy od 10: g/ml z 50 mM EDTA w 1% BSA-HBSS (przy braku Ca⁺⁺) lub z 1% BSA-HBSS (z Ca⁺⁺) przez 30 min. w 37°C. Mieszaniny dodano do płytek opłaszczonych CNTO 95, C372, c7E3 lub LM609 IgG i inkubowano przez 1 godz. w 37°C. LM609 lub CNTO 95 dodano w stężeniu 20:g/ml w odpowiednim buforze (+/-Ca⁺⁺) na 30 min. w 37°C. Płytki sondowano kozim przeciwciałem przeciwko mysiemu Fe IgG, HRP lub kozim przeciwciałem przeciwko ludzkiemu Fe IgG, HRP.

Fig. 4 E-G przedstawia wykresy wiązania przeciwciała z ανβ5, gdzie ligand ten był preinkubowany w dwukrotnych rozcieńczeniach począwszy od 10: g/ml z 50 mM EDTA w 1% BSA- HBSS (przy

PL 213 030 B1 braku Ca⁺⁺) lub z 1% BSA-HBSS (z Ca⁺⁺) przez 30 min. w 37°C. Mieszaniny dodano do płytek opłaszczonych CNT095, C372, c7E3 IgG i inkubowano przez 1 godz. w 37°C. Dodano VNR139 w stężeniu 10:g/ml w odpowiednim buforze (+/- Ca⁺⁺) na 30 min. w 37°C. Płytki sondowano kozim przeciwciałem przeciwko ludzkiemu Fe IgGz HRP.

Fig. 5 A-B przedstawia wykres krzywej nasycenia wiązania Gen095 (Fig. 5A) i ReoPro (Fig. 5B) na płytkach opłaszczonych ανβ3.

Fig. 12. Immunofluorescja i cytometria przepływowa. Histogram po lewej stronie przedstawia tło fluorescencji w obecności izotypowo dopasowanego przeciwciała. Histogram po prawej pokazuje barwienie pozytywne. A, D, G, LM609 (mAb skierowane przeciwko ανβ3, 10 μg/ml); B, E, H, PIF6 (Mab skierowane przeciwko ανβ5, 10 μg/ml) i C, F, I, Gen095 (10 μg/ml).

Fig. 13. Adhezja HUVECS do płytek opłaszczonych białkiem macierzy. Oznaczenie adhezji przeprowadzono jak opisano w Metodach z Przykładu 5. Płytki odczytano fluorymetrem przy 485-538 nm. Adhezja komórek do studzienek opłaszczonych BSA służyła jako kontrola negatywna. Na Fig. 13 zasięg adhezji komórek w obecności różnych stężeń przeciwciała przedstawiono na wykresie jako procent adhezji komórek przy braku przeciwciała, którą traktowano jako 100%. Każdy punkt informacyjny oznacza wartość średnią dla trzech oznaczeń (+/-SD).

Fig. 14. Adhezja ludzkich komórek czerniaka do płytek opłaszczonych białkiem macierzy. Oznaczenia adhezji przeprowadzono jak opisano w Metodach. Jako kontrola negatywna posłużyła adhezja komórek do studzienek opłaszczonych BSA. Na Fig. 14 zasięg adhezji komórki w obecności różnych stężeń przeciwciała przedstawiono na wykresie jako procent adhezji komórek przy braku przeciwciała, którą traktowano jako 100%. Każdy punkt informacyjny przedstawia wartość średnią dla trzech oznaczeń (+/-SD).

Fig. 15. Adhezja ludzkich komórek HT29 raka jelita grubego do witronektyny. Oznaczenie adhezji przeprowadzono jak opisano w Metodach. Jako kontrola negatywna służyła adhezja komórek do studzienek opłaszczonych BSA. Dane na Fig. 15 przedstawiono na wykresie jako procent maksymalnego wiązania (brak przeciwciała) i są wartością średnią dla trzech oznaczeń (+/- SD).

Fig. 16 A-D. Migracja HUVECS w kierunku fibronektyny o stężeniu 2 μg/ml. Oznaczenie przeprowadzono jak opisano w Metodach pozwalając komórkom na migrację przez 6 godzin.

Fotomikrografie przedstawiają pola (soczewki obiektywu 10 x) migracji komórkowej na Fig. 16A, brak przeciwciała, (16B), Gen095 (5 μg/ml), (16C), Gen059 (40 μg/ml). Fig. 16D jest graficznym przedstawieniem migracji komórkowej w obecności różnych stężeń Gen095. Dane znormalizowano do procenta kontroli (brak przeciwciała), którą uznano za 100% i każdy punkt jest wartością średnią dla trzech filtrów przezstudzienkowych (+/-SD).

Fig. 17 Migracja HUVECS w kierunku 2 μg/ml fibronektyny w obecności przeciwciał ανβ3 i ανβ5. Oznaczenie migracji przeprowadzono jak opisano w Metodach i komórkom pozwolono na migrację przez 6 godzin. LM609 i P1F6 są Mab skierowanymi odpowiednio przeciwko ανβ3 i ανβ5. Dane przedstawione na Fig. 17 zostały znormalizowane do procenta kontroli (brak przeciwciała), którą traktowano jako 100% i każdy słupek jest wartością średnią dla trzech filtrów przezstudzienkowych (+/-SD). Jako kontrole negatywne służyły BSA, mysie IgG i ludzkie IgG. LM609-PIF6 stanowią kombinację obu przeciwciał. Przeciwciała i BSA stosowano w stężeniu 10 μg/ml.

Fig. 18 A-E. Migracja HUVECS w kierunku 2% FBS. Oznaczenie migracji prowadzono przez 4 godz. i dane zebrano jak opisano w Metodach. Fig. 18 (A) jest graficznym przedstawieniem migracji komórkowej w obecności LM609, P1f6, kombinacji LM609 + P1f6, dopasowanych izotypowo kontrolnych przeciwciał (ludzkich i mysich). Przeciwciała i białka stosowano w stężeniu 10 μg/ml. Fig. 18(B) jest graficznym przedstawieniem migracji komórkowej w obecności ReoPro i Gen095. Fotomikrografie przedstawiają pola (soczewki obiektywu 10 x) migracji komórkowej na Fig. 18 (C), brak przeciwciała, Fig. 18(D), Gen095 (5 μg/ml·) i Fig. 18(E), Gen095 (20 μg/ml). Dane są znormalizowane jako procent kontroli (bez przeciwciała), którą traktuje się jako 100% i każdy punkt jest wartością średnią dla trzech filtrów przezstudzienkowych (+/- SD).

Fig. 19 A-E. Migracja komórek A375S.2 w kierunku 10% FBS. Oznaczenie migracji prowadzono przez 4 godz. i dane zebrano jak opisano w Metodach. Przeciwciała stosowano w stężeniu 10 μg/ml. Fig. 19(A) jest graficznym przedstawieniem migracji komórkowej w obecności różnych stężeń Gen095. Fig. 19(B) jest graficznym przedstawieniem migracji komórkowej w obecności LM609, P1F6, kombinacji LM609 + P1F6, izotypowo dopasowanych przeciwciał kontrolnych (ludzkich i mysich). Dane są znormalizowane do procenta kontroli, którą traktuje się jako 100% i każdy punkt jest wartością średnią dla trzech filtrów przezstudzienkowych (+/-SD). Fotomikrografie przedstawiają pola (soczewki obiekPL 213 030 B1 tywu 10 x) migracji komórkowej na Fig. 19(C), brak przeciwciała, Fig. 19(D), Gen095 (5 μg/ml) i Fig. 19(E), Gen095 (20 gg/ml).

Fig. 20 A-E. Migracja HUVECS w kierunku fibronektyny w obecności bFGF. Spód filtrów komory migracji opłaszczono 2 gg/ml· witronektyny i oznaczenie przeprowadzono jak opisano w Metodach. Komórkom pozwolono migrować przez 6 godzin. Na Fig. 20 A-E każdy punkt informacyjny przedstawia dane dla wartości średniej dla trzech filtrów przezstudzienkowych (+/-SD). Fig 20(A), bFGF; Fig. 20(B) Gen095 (5 gg/ml); Fig. 20(C) Gen095 (40 gg/ml); Fig. 20(D) bez bFGF. Fig. 20(E) Hamowanie migracji komórkowej w obecności różnych przeciwciał przedstawiono graficznie.

Fig. 21 A-D. Inwazja komórek A375S-2 przez żel fibrynowy (5 mg/ml). Oznaczenie inwazji przeprowadzono przez 24 godziny i dane zbierano jak opisano w Metodach. Fotomikrografie są reprezentatywnymi polami (soczewki obiektywu 4 x) inwazji komórkowej na Fig. 21(A) przy braku przeciwciał, Fig. 21(B) Gen095 (10 ng/ml), Fig. 21(C) i (D) są graficznym przedstawieniem inwazji komórkowej w obecności Gen095, 10E5 F(ab')2, LM609, P1F6, LM-P1F6 (LM609 + P1F6), ludzkich i mysich IgG (H-IgG i M-IgG). Wykres na Fig. 21(D): stężenie wszystkich przeciwciał i białek wynosi 10 gg/ml. Dane są normalizowane do procenta kontroli (bez przeciwciała), którą traktowano jako 100% i każdy punkt informacyjny jest wartością średnią dla trzech filtrów przezstudzienkowych (+/- SD).

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dostarcza wyizolowanych, ludzkich rekombinowanych i/lub syntetycznych przeciwciał anty-dwuintegrynowych, jak również kompozycji i kodujących cząsteczek kwasu nukleinowego zawierających przynajmniej jeden polinukleotyd kodujący przynajmniej jedno przeciwciało antydwuintegrynowe według wynalazku. Ponadto, niniejszy wynalazek obejmuje, lecz bez ograniczenia, sposoby wytwarzania i zastosowania takich kwasów nukleinowych i przeciwciał na przykład w kompozycjach diagnostycznych i terapeutycznych, sposobach i urządzeniach.

W użytym tu znaczeniu „przeciwciało dwuintegrynowe anty-alfa-v-beta3, alfa-v-beta5, „przeciwciało anty-dwuintegrynowe, „część przeciwciała anty-dwuintegrynowego lub „fragment przeciwciała anty-dwuintegrynowego i/lub „wariant przeciwciała anty-dwuintegrynowego i im podobne obejmują jakiekolwiek białko lub peptyd zawierający cząsteczkę zawierającą przynajmniej część cząsteczki immunoglobuliny tak jak, lecz bez ograniczenia, przynajmniej jeden region determinujący komplementarność (CDR) łańcucha ciężkiego lub lekkiego lub jego część wiążącą ligand, region zmienny łańcucha ciężkiego lub łańcucha lekkiego, region stały łańcucha ciężkiego lub łańcucha lekkiego, region zrębu lub jakąkolwiek jego część lub przynajmniej jedną część receptora dwuintegrynowego lub białka wiążącego, które może być włączone do przeciwciała według niniejszego opisu. Takie przeciwciało ewentualnie wpływa ponadto na specyficzny ligand, taki jak, lecz bez ograniczenia, który jest modulowany przez przeciwciało, zmniejszany, zwiększany, antagonizowany, agonizowany, łagodzony, blokowany, hamowany, usuwany i/lub który będzie wpływał na przynajmniej jedną aktywność lub wiązanie dwuintegryny, lub wpływał na aktywność lub wiązanie receptora dwuintegrynowego in vitro, in situ i/lub in vivo. Jako nieograniczający przykład, użyteczne przeciwciało anty-dwuintegrynowe, specyficzna część lub wariant może wiązać się z przynajmniej jedną dwuintegryną lub jej specyficznymi częściami, wariantami lub domenami. Odpowiednie przeciwciało anty-dwunintegrynowe, specyficzna część lub wariant może również ewentualnie wpływać na przynajmniej jedną aktywność lub funkcję dwuintegryny, taką jak, lecz bez ograniczenia, synteza RNA, DNA lub białka, uwolnianie dwuintegryny, sygnalizacja przez receptor dwuintegrynowy, cięcie błonowej dwuintegryny, aktywność dwuintegryny, wytwarzanie i/lub synteza dwuintegryny. Termin „przeciwciało ma ponadto obejmować przeciwciała, fragmenty po trawieniu, ich specyficzne części i warianty w tym mimetyki przeciwciała lub części przeciwciał naśladujące strukturę i/lub funkcje przeciwciała lub specyficznego jego fragmentu lub części obejmujących przeciwciała jednołańcuchowe i ich fragmenty. Funkcjonalne fragmenty obejmują fragmenty wiążące antygen, które wiążą ssaczą dwuintegrynę. Przykładowo, fragmenty przeciwciała zdolne do związania dwuintegryny, lub jej części, obejmują, lecz bez ograniczenia Fab (np. przez trawienie papainą), Fab' (np. przez trawienie pepsyną i częściową redukcję) i F(ab')2 (np. przez trawienie pepsyną), facb (np. przez trawienie plazminą), pFc' (np. przez trawienie pepsyną lub plazminą), Fd (np. przez trawienie pepsyną, częściową redukcję i reagregowanie), Fv lub scFv (np. technikami biologii molekularnej) (patrz np. Colligan, Immunology, powyżej).

Takie fragmenty mogą być wytworzone przez cięcie enzymatyczne, sposobami syntezy lub rekombinowania znanymi w dziedzinie i/lub tu opisanymi. Przeciwciała takie mogą być także wytworzone w różnych skróconych postaciach przy pomocy genów dla przeciwciała, w których jeden lub więcej kodonów stop zostało wprowadzonych powyżej naturalnego miejsca stop. Przykładowo, kombinacja

PL 213 030 B1 genu kodującego część łańcucha ciężkiego F(ab')2 może być zaprojektowana tak, aby obejmowała sekwencje DNA kodujące domenę CH4 i/lub region zawiasowy łańcucha ciężkiego. Różne części przeciwciał mogą być połączone chemicznie tradycyjnymi sposobami lub mogą być wytwarzane jako styczne białka przy pomocy technik inżynierii genetycznej.

W użytym tu znaczeniu termin „ludzkie przeciwciało określa przeciwciało, w którym zasadniczo każda część białka (np. CDR, zrąb, domeny CL, CH (np. CH1, CH2, CH3), zawias, (VL, VH)) jest zasadniczo nieimmunogenna u ludzi przy jedynie mniejszych zmianach sekwencji lub wariantach. Podobnie, przeciwciała oznaczonych naczelnych (małpy, pawiana, szympansa itp.), gryzoni (myszy, szczura, królika, świnki morskiej, chomika i podobnych) i innych ssaków oznaczają przeciwciała specyficzne wobec takich gatunków, podgatunków, rodzajów, podrodzin, rodzin. Ponadto, chimerowe przeciwciała obejmują dowolną kombinację powyższych. Takie zmiany lub warianty ewentualnie i dogodnie zachowują lub ograniczają immunogenność u ludzi lub innych gatunków w stosunku do niezmodyfikowanych przeciwciał. Co za tym idzie ludzkie przeciwciało jest inne niż przeciwciało chimerowe lub humanizowane. Wskazuje się, że ludzkie przeciwciało może być wytworzone przez niebędące człowiekiem zwierzę albo komórkę prokariotyczną lub eukariotyczną zdolną do wyrażania genów dla funkcjonalnie przearanżowanej ludzkiej immunoglobuliny (np. łańcucha ciężkiego i/lub łańcucha lekkiego). Ponadto, gdy ludzkie przeciwciało jest przeciwciałem jednołańcuchowym może zawierać łącznik peptydowy niewystępujący w naturalnych, ludzkich przeciwciałach. Przykładowo, Fv może zawierać łącznik peptydowy taki jak dwie do około ośmiu glicyn lub innych reszt aminokwasowych łączących region zmienny łańcucha ciężkiego i region zmienny łańcucha lekkiego. Takie łączniki peptydowe uważa się za pochodzące od człowieka.

Dwuspecyficzne, heterospecyficzne, heterokoniugaty lub podobne przeciwciała mogą również być stosowane tak, jak monoklonalne, dogodnie ludzkie lub humanizowane przeciwciała wiążące się specyficznie z przynajmniej dwoma różnymi antygenami. W obecnym przypadku, jedna ze specyficzności wiązania jest dla przynajmniej jednego białka dwuintegrynowego, a druga jest dla jakiegokolwiek innego antygenu. Sposoby wytwarzania przeciwciał dwuspecyficznych są znane w dziedzinie. Tradycyjnie, wytwarzanie przez rekombinowanie dwuspecyficznych przeciwciał opiera się na współekspresji dwóch par lekki łańcuch-ciężki łańcuch immunoglobuliny, gdzie dwa łańcuchy ciężkie mają różne specyficzności (Nilstein i Cuello, Nature 305:537 (1983)). Z uwagi na losowy rozdział łańcuchów lekkich i ciężkich immunoglobulin te hybrydomy (kwadromy) wytwarzają potencjalnie mieszaninę 10 różnych cząsteczek przeciwciał, z których tylko jedno posiada prawidłową, dwuspecyficzną strukturę. Oczyszczanie prawidłowej cząsteczki, które jest zazwyczaj przeprowadzane przez etapy chromatografii powinowactwa, jest raczej problematyczne a wydajność otrzymywanych produktów niska. Podobne procedury ujawniono w np. w WO 93/08829, patentach USA nr 6210668, 6193967, 6132992, 6106833, 6060285, 6037453, 6010902, 5989530, 5959084, 5959083, 5932448, 5833985, 5821333, 5807706, 5643759, 5601819, 5582996, 5496549, 4676980, WO 91/00360, WO 92/00373, EP 03089, Traunecker i wsp., EMBO J. 10:3 655 (1991), Suresh i wsp., Methods in Enzymology 121:210 (1986).

Przeciwciała anty-dwuintegrynowe (określane również jako przeciwciała dla dwuintegryny) według niniejszego wynalazku mogą ewentualnie być scharakteryzowane przez wiązanie z wysokim powinowactwem z dwuintegryną i ewentualnie i dogodnie posiadają niską toksyczność. W szczególności użyteczne w niniejszym wynalazku jest przeciwciało, specyficzny fragment, w którym pojedyncze składniki takie jak region zmienny, region stały i zrąb, indywidualnie i/lub wspólnie, ewentualnie i dogodnie wykazują niską immunogenność. Przeciwciała, które można zastosować w wynalazku ewentualnie charakteryzują się zdolnością do leczenia pacjentów przez wydłużone okresy czasu z możliwym do zmierzenia łagodzeniem objawów i niską i/lub akceptowalną toksycznością. Niska i akceptowalna immunogenność i/lub wysokie powinowactwo, jak również inne, użyteczne właściwości, mogą wspomagać osiąganie wyników terapeutycznych. „Niska immunogenność jest zdefiniowana tu jako zwiększające się istotne odpowiedzi HAHA, HACA lub HAMA u mniej niż około 75% lub dogodnie, u mniej niż około 50% leczonych pacjentów i/lub powoduje wzbudzenie niskich mian u pacjentów leczonych (mniej niż około 300, dgodnie mniej niż około 100 zmierzonych w teście immunoenzymatycznym z podwójnym antygenem) (Elliott i wsp., Lancet 344:1125-1127 (1994)).

Wykorzystanie

Wyizolowane kwasy nukleinowe według niniejszego wynalazku mogą być zastosowane do wytwarzania przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego lub jego specyficznego wariantu, które mogą być zastosowane do pomiaru lub wywołania efektu w komórce, tkance, organie lub u zwierzęcia (włącznie ze ssakami i ludźmi) do diagnozowania, monitorowania, modulowania, leczenia, łaPL 213 030 B1 godzenia, pomocy w profilaktyce wystąpienia lub łagodzeniu objawów przynajmniej jednego stanu związanego z dwuintegryną, wybranego, ale bez ograniczenia, spośród przynajmniej jednego zaburzenia lub choroby immunologicznej, zaburzenia lub choroby układy sercowo-naczyniowego, infekcji, nowotworu złośliwego i/lub zaburzenia lub choroby neurologicznej lub innych znanych lub opisanych stanów związanych z dwuintegryną.

Taki sposób może obejmować podawanie skutecznej ilości kompozycji lub kompozycji farmaceutycznej zawierającej przynajmniej jedno przeciwciało anty-dwuintegrynowe komórce, tkance, organowi, zwierzęciu lub pacjentowi potrzebującemu takiego modulowania, leczenia, łagodzenia, profilaktyki lub ograniczania objawów, skutków lub mechanizmów. Skuteczna ilość może obejmować ilość około 0,001 do 500 mg/kg na pojedyncze (np. w jednej dużej dawce), wielokrotne lub ciągłe podawanie lub dla osiągnięcia stężenia w surowicy 0,01-5000 μg/ml stężenia w surowicy na pojedyncze, wielokrotne lub ciągłe podawanie lub dowolnego skutecznego zakresu lub wartości w nim zawartej, jak jest to wykonywane i określane przy pomocy znanych sposobów jak tu opisano lub jakie są znane w odpowiednich dziedzinach.

Cytowania

Wszystkie, cytowane tu publikacje i patenty przedstawiają stan wiedzy w chwili powstania niniejszego wynalazku i/lub dostarczają opisu i realizacji niniejszego wynalazku. Publikacje dotyczą jakiejkolwiek publikacji naukowej lub publikacji patentowej lub jakiejkolwiek innej informacji dostępnej na dowolnym środku przekazu obejmującym wszystkie nagrywane, elektroniczne i wydrukowane postaci. Poniższe cytowania są w szczególności przywoływane: Ausubel, i wsp., wyd., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey Sc Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2gie wyd., Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow i Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, i wsp., Current Protocols in Immunology, John Willey & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan i wsp., Current Protocols in Protein Science, John Willey Sc Sons, Inc., NY, NY, (1997-2001).

Przeciwciała według niniejszego wynalazku

Przynajmniej jedno przeciwciało anty-dwuintegrynowe według niniejszego wynalazku może być ewentualnie wytwarzane przez linię komórkową lub unieśmiertelnioną linię komórkową, mieszaną linię komórkową lub klonalną populację unieśmiertelnionych komórek, jak jest to dobrze znane w dziedzinie. Patrz np. Ausubel i wsp., wyd., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey Sc Sons, Inc., NY (1987-2001); Sambrook, i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2gie wyd., Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow i Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, i wsp., Current Protocols in Immunology, John Willey Sc Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan i wsp., Current Protocols in Protein Science, John Willey & Sons, Inc., NY, NY, (1997-2001).

Ludzkie przeciwciała, które są specyficzne dla ludzkich białek dwuintegrynowych lub ich fragmentów mogą być wzbudzone przeciwko odpowiedniemu antygenowi immunogennemu, takiemu jak wyizolowane i/lub białko integryny lub jego część (w tym syntetyczne cząsteczki, takie jak syntetyczne peptydy). Inne specyficzne lub ogólne ssacze przeciwciała mogą być podobnie wzbudzane. Wytwarzanie antygenów immunogennych i wytwarzanie przeciwciała monoklonalnego może być przeprowadzone przy pomocy jakiejkolwiek dogodnej techniki.

W jednym podejściu wytwarzana jest hybrydoma przez fuzję dogodnej unieśmiertelnionej linii komórkowej (np. linii komórkowej szpiczaka, takiej jak, lecz bez ograniczenia, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MA1, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A lub im podobne lub heteroszpiczaków, produktów ich fuzji lub jakichkolwiek komórek, lub komórek fuzyjnych pochodzących z nich lub jakiejkolwiek innej linii komórkowej znanej w dziedzinie. Patrz np., www.atcc.org,www.lifetech.com., i im podobne, z komórkami wytwarzającymi przeciwciało takimi jak, lecz bez ograniczenia, wyizolowane lub sklonowane komórki śledziony, krwi obwodowej, limfatyczne, migdałków lub innych komórek immunologicznych lub komórek B, lub innych komórek wyrażających łańcuch ciężki lub lekki, region stały lub zmienny lub zrąb lub sekwencje CDR, zarówno jako endogenne jak i heterologiczne kwasy nukleinowe, jako rekombinowane lub endogenne, wirusowe, bakteryjne, pochodzące z glonów, prokariotyczne, płaza, owada, gada, ryby, ssaka, gryzonia, konia, owcy, kozy, naczelnego, eukariotyczne, genomowego DNA, cDNA, rDNA, mitochondrialnego DNA lub RNA, chloroplastowego DNA lub RNA, hnRNA, mRNA, tRNA, jedno, dwu lub trójniciowego, zhybrydyzowanego i im podobne lub jakiekolwiek ich kombinacje. Patrz np., Ausubel, powyżej i Colligan, Immunology, powyżej, rozdział 2.

PL 213 030 B1

Komórki wytwarzające przeciwciało mogą być również uzyskane z krwi obwodowej lub dogodnie śledziony lub węzłów Iimfatycznych ludzi lub innych odpowiednich zwierząt, które immunizowano będącym przedmiotem zainteresowania antygenem. Jakiekolwiek inne, dogodne komórki gospodarza mogą również być użyte do ekspresji heterologicznego lub endogennego kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało, specyficzny jego fragment lub wariant według niniejszego wynalazku. Komórki fuzyjne (hybrydomy) lub rekombinowane komórki mogą być izolowane przy pomocy selektywnych warunków hodowli lub innych znanych, odpowiednich sposobów, i sklonowane przez ograniczone rozcieńczenia lub sortowanie komórek lub innymi znanymi sposobami. Komórki wytwarzające przeciwciała o pożądanej specyficzności mogą być wyselekcjonowane przy pomocy odpowiedniego oznczenia (np. ELISA).

Inne użyteczne sposoby wytwarzania lub izolacji przeciwciał o wymaganej specyficzności, które mogą być użyte obejmują, lecz bez ograniczenia, sposoby selekcjonujące rekombinowane przeciwciało z biblioteki białek lub peptydów (np. lecz bez ograniczenia bakteriofagowej, rybosomowej, oligonukleotydowej, RNA, cDNA lub im podobnych, biblioteki prezentującej np. dostępnej z Cambridge Antibody Technologies, Cambridgeshire, UK; MorphoSys, Martinsreid/Planegg, DE; Biovation, Aberdeen, Szkocja, UK; Biolnvent, Lund, Szwecja; Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Berkeley, CA; Ixsys. Patrz, np., EP 368,684, PCT/GB91/01134; PCT/GB92/01755; PCT/GB92/002240; PCT//GB92/00883; PCT/GB93/00605; USA 08/350260 (5/12/94); PCT/GB94/01422; PCT/GB94/02662; PCT/GB97/01835; (CAT/MRC); WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; PCT/US94/1234; WO92/18619; WO96/07754; (Scripps); EP 614 989 (MorphoSys); WO95/16027 (Biolnvent); WO88/06630; WO90/3809 (Dyax); USA 4,704,692 (Enzon); PCT/US91/02989; (Affymax); WO89/06283; EP 371 998; EP 550 400; (Xoma); EP 229 046; PCT/US91 / 07149 (Ixsys.) lub stochastycznie wytworzone peptydy lub białka - patenty USA 5723323, 5763192, 5814476, 5817483, 5824514, 5976862, WO86/05803, EP 590 689 (Ixsys, obecnie Applied Molecular Evolution (AME) lub zależne od immmunizacji transgenicznych zwierząt (np. myszy SCID, Nguyen i wsp., Microbiol Immunol. 41:901-907 (1997); Sandhu i wsp., Crit. Rev. Biotechnol. 16:95-118 (1996); Eren i wsp., Immunol. 93:154-161 (1998)), które są zdolne do wytwarzania repertuaru ludzkich przeciwciał jak jest to znane w dziedzinie i/lub tu opisane. Techniki takie obejmują lecz bez ograniczenia prezentowanie na rybosomie (Hanes i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 4937-4942 (maj 1997), Hanes i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14130-14135 (listopad 1998)); sposoby wytwarzania przeciwciała przez pojedynczą komórkę (np. sposób wytwarzania przeciwciała przez wybrany limfocyt „SLAM) (patent USA nr 5,627,052, Wen i wsp., J. Immunol. 17:887-892 (1987); Babcook i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:7843- 7848 (1996)); sposoby mikrokropelkowe żelu i cytometrii przepływowej (Powell i wsp., Biotechnol. 8:333-337 (1990); One Cell Systems, Cambridge, MA; Gray i wsp., J. Imm. Meth. 182:155-163 (1995); Kenny i wsp., Bio/Technol. 13:787-790 (1995)); selekcję komórek B (Steenbakkers i wsp., Molec. Biol. Reports 19:125-134 (1994); Jonak i wsp., Progress Biotech. Tom 5, In Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Borrebaeck, wyd., Elsevier Science Publishers B.V. Amsterdam, Holandia (1988)).

Sposoby do przebudowania lub humanizowania niepochodzących od człowieka lub ludzkich przeciwciał mogą być również użyte i są one dobrze znane w dziedzinie. Ogólnie, humanizowane lub przebudowane przeciwciało ma jedną lub więcej reszt aminokwasowych ze źródła niebędącego człowiekiem, np. lecz bez ograniczenia, myszy, szczura, królika, niebędącego człowiekiem naczelnego lub innego ssaka. Te pochodzące od człowieka aminokwasy są często określane jako reszty „importowane, które są typowo wzięte z „importowanych zmiennych, stałych lub innych domen znanej, ludzkiej sekwencji. Znane ludzkie sekwencje Ig są ujawnione np. w www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi;

www.atcc.org/phage/hdb.html;

www.sciquest.com/;

www.abeam.com/;

www.antibodyresource.com/onlinecom.html; www.public.iastate.edu/~pedro/research tools.html; www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/TT.html;

www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm;

www.Library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html;

www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www. path.cam.ac.uk/~mrc/mikeimages.html;

PL 213 030 B1 www.antibodyresource .com/;

mcb.harvard.edu/BioLinks/immunology.html.www.immunologylink.com/;

pathbox.wustl.edu/-hcenter/index.html;

www.biotech.ufl.edu/~hcl/;

www.pebio.com/pa/340913/3 40913.html;

www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/;

www.m.ehimeu.ac.jp/~yasuhito/Elisa.html;

www.biodesign.com/table.asp;

www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html;

www.biotech.ufI.edu/-feeI/protocol.html;

www.isacnet.org/sites geo.html;

aximtl.imt.unimarburg.de/~rek/AEPStart.html;

baserv.uci.kun.nl/-jraats/liknsI.html;

www.recab.unihd.d/immuno.bme.nwu.edu/;

www.mrs-cpe.cam.ace.uk/imtdoc/public/intro.html;

www.ibt.unam.mx/vir/V mice.html;

imgt.cnusc.fr:8104/;

www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/abs/ index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/~honegger/AHOseminar/Slide01.html;

www.cryst.bbk.ace.uk/~ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/TAHHP.html; www.ibt.umam.mx/vir/stucture/stat aim.html;

www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/~fmolina/Web-pages /Pept/spttech.html; www.jerini.d/fr products.htm;

www.patents.ibm.com/ibm.html. Kabat i wsp., Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health (1983).

Takie importowane sekwencje mogą być użyte do ograniczenia immunogenności lub ograniczenia, wzmocnienia lub modyfikowania wiązania, powinowactwa, szybkości przyłączania lub odłączania, zachłanności wiązania, specyficzności, półokresu trwania i innych odpowiednich w dziedzinie cech charakterystycznych. Ogólnie, część lub wszystkie niepochodzące od człowieka lub kozie sekwencje CDR są zachowane, podczas gdy niepochodzące od człowieka regiony zmienne i stałe są zastępowane ludzkimi lub innymi aminokwasami. Przeciwciała mogą być ewentualnie humanizowane z zachowaniem wysokiego powinowactwa do antygenu i innych, dogodnych właściwości biologicznych. Dla osiągnięcia tego celu, humanizowane przeciwciała mogą być ewentualnie wytwarzane z użyciem procesu analizy rodzicielskich sekwencji i różnych pojęciowych humanizowanych produktów, przy pomocy trójwymiarowych modeli sekwencji rodzicielskich i humanizowanych. Trójwymiarowe modele immunoglobulin są powszechnie dostępne i są znane specjalistom w dziedzinie. Dostępne są programy komputerowe ilustrujące i prezentujące prawdopodobne trójwymiarowe struktury konformacyjne wybranych kandydujących sekwencji immunoglobulinowych. Badanie tych prezentacji pozwala na analizę przypuszczalnej roli tych reszt w funkcjonowaniu kandydującej sekwencji immunoglobulinowej, tj. badanie reszt wpływających na zdolność kandydującej immunoglobuliny do wiązania antygenu. W ten sposób reszty FR mogą być wybrane i połączone z sekwencji najwyższej zgodności i sekwencji importowanej, tak że osiągnięta może być pożądana właściwość przeciwciała, taka jak zwiększone powinowactwo do docelowego antygenu(antygenów). Ogólnie, reszty CDR są bezpośrednio i najbardziej istotnie zaangażowane we wpływ na wiązanie antygenu. Humanizacja lub przebudowa przeciwciał według niniejszego wynalazku może być przeprowadzona przy pomocy jakiegokolwiek znanego sposobu, takiego jak, lecz bez ograniczenia, opisany w Winter (Jones i wsp., Nature 321:522 (1986); Riechmann i wsp., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen i wsp., Science 239:1534 (1988)), Sims i wsp., J. Immunol. 151:2296 (>1993); Chothia i Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992), Presta i wsp., J. Immunol. 151:2623 (1993), patenty USA nr: 5723323, 5976862, 5824514, 5814476, 5763192, 5723323, 5766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539, 4816567, PCT/US98/16280,

PL 213 030 B1

US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246.

Przeciwciało anty-dwuintegrynowe może również być ewentualnie wytworzone przez immunizację transgenicznego zwierzęcia (np. myszy, szczura, chomika, niebędącego człowiekiem naczelnego i im podobnego) zdolnego do wytworzenia repertuaru ludzkich przeciwciał jakie tu opisano i/lub jakie znane są w dziedzinie. Komórki wytwarzające ludzkie przeciwciało anty-dwuintegrynowe mogą być izolowane z takich zwierząt i unieśmiertelnione przy pomocy odpowiednich sposobów, takich jak opisane tu sposoby.

Transgeniczne myszy, które mogą wytworzyć repertuar ludzkich przeciwciał wiążących się z ludzkimi antygenami mog ą być wytworzone znanymi sposobami (np., lecz bez ograniczenia, z patentów USA nr: 5,770,428, 5,569,825, 5,545,806, nadanych Lonberg i wsp.; Jokobovits i wsp. WO98/50433, Jakobovits i wsp. WO98/24893, Lonberg i wsp. WO98/24884, Lonberg i wsp. WO97/13852, Lonberg i wsp. WO94/25585, Kucherlapate i wsp., WO96/34096, Kucherlapate i wsp. EP 0463 151 B1, Kucherlapate i wsp. EP 0710 719 A1, Surani i wsp., patent USA nr 5,545,807, Bruggemann i wsp., WO 90/04036, Bruggemann i wsp., EP 0438 474 B1, Lonberg i wsp., EP 0814 2 59 A2, Lonberg i wsp. GB 2 272 440 A, Lonberg i wsp. Nature 386:856-859 (1994), Taylor i wsp., Int. Immunol. 6(4) 579-591 (1994), Green i wsp., Nature Genetics 7:13-21 (1994), Mendez i wsp., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Taylor i wsp., Nucleic Acids Research 20(23): 6287-6295 (1992), Tuaillon i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(8) 3720-3724 (1993), Lonberg i wsp., Int. Rev. Immunol. 13(1):65-93 (1995) i Fishwald i wsp. Nat. Biotechnol. 14(7): 845-851 (1996)). Ogólnie, myszy te zawierają przynajmniej jeden transgen zawierający DNA z przynajmniej jednego, ludzkiego locus immunoglobuliny, które jest funkcjonalnie przebudowane lub które może podlegać funkcjonalnej przebudowie. Endogenne Ioci immunoglobuliny w takiej myszy może być rozbite lub usunięte dla wyeliminowania zdolności zwierzęcia do wytwarzania przeciwciał kodowanych przez endogenne geny.

Wyszukiwanie przeciwciał specyficznie wiążących podobne białka lub fragmenty może być dogodnie osiągnięte przy pomocy bibliotek prezentujących peptyd. Sposób ten obejmuje przeszukiwanie dużych zbiorów peptydów pod kątem pojedynczych przedstawicieli o pożądanej funkcji lub strukturze. Wyszukiwanie przeciwciała z bibliotek prezentujących peptydy jest dobrze znane w dziedzinie. Prezentowane sekwencje peptydowe mogą mieć długość od 3 do 5 tysięcy lub więcej aminokwasów, często długość od 5-100 aminokwasów i często długość od około 8 do 25 aminokwasów. Oprócz sposobów bezpośredniej syntezy chemicznej w celu wytworzenia bibliotek peptydowych opisano szereg sposobów rekombinowania DNA. Jeden rodzaj wymaga prezentowania sekwencji peptydowej na powierzchni bakteriofaga lub komórki. Każdy bakteriofag lub komórka zawiera sekwencję nukleotydową kodującą szczególną prezentowaną sekwencję peptydową. Takie sposoby są opisane w Publikacjach Patentowych PCT nr 91/17271, 91/18980, 91/19818 i 93/08278. Inne systemy wytwarzania bibliotek peptydów obejmują zagadnienia zarówno sposobów syntezy chemicznej in vitro i rekombinowania. Patrz publikacja patentowa PCT nr 92/05258, 92/14843 i 96/19256. Patrz również patent USA nr 5,658,754 i 5,643,768. Biblioteki prezentujące peptyd, wektor i zestawy do wyszukiwania są komercyjnie dostępne od takich dostawców jak Invitrogen (Carlsbad, CA) i Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, UK). Patrz np. patent USA nr 4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621, 5656730, 5763733, 5767260, 5856456, scedowane na Enzon; 5223409, 5403484, 5571698, 5837500, scedowane na Dyax, 5427908, 5580717, scedowane na Genentech, 5618920, 5595898, 5576195, 5698435, 5693493, 5698417, scedowane na Xoma, Colligan, powyżej; Ausubel, powyżej lub Sambrook, powyżej.

Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być również wytwarzane przy pomocy przynajmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało anty-dwuintegrynowe w celu dostarczenia transgenicznych zwierząt niebędących człowiekiem lub ssaków, takich jak kozy, krowy, konie, owce i im podobne, tak aby wytwarzały takie przeciwciała w swoim mleku. Zwierzęta takie mogą być dostarczone przy pomocy znanych sposobów. Patrz np., lecz nie tylko patent USA nr 5,827,690; 5,849,992; 4,873,316; 8,849,992; 4,873,316; 5,849,992; 5,994,616; 5,565,362; 5,304,489 i im podobnych.

Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą ponadto być wytwarzane przy pomocy przynajmniej jednego kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało anty-dwuintegrynowe w celu dostarczenia transgenicznych roślin i hodowanych komórek roślinnych (np., ale bez ograniczenia tytoniu i kukurydzy) wytwarzających takie przeciwciała, wyszczególnione części lub warianty w częściach rośliny lub wyhodowanych z niej komórkach. Nieograniczającymi przykładami są liście transgenicznego tytoniu wyrażające transgeniczne białka, które zostały pomyślnie użyte do dostarczenia dużych

PL 213 030 B1 ilości rekombinowanych białek np. przy pomocy ulegającego indukcji promotora patrz np. Cramer i wsp., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 240:95-118 (1999) i cytowanej tu literatury. Również transgeniczną kukurydzę użyto do ekspresji białek ssaczych na komercyjnym poziomie produkcji o równoważnych aktywnościach biologicznych jak te uzyskane w innych systemach rekombinacyjnych lub oczyszczonych z naturalnych źródeł. Patrz np. Hood i wsp., Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147 (1999) i odniesienia tam cytowane. Przeciwciała są również wytwarzane w dużych ilościach z nasion rośliny transgenicznej w tym fragmenty przeciwciała, takie jak przeciwciała jednołańcuchowe (scFv's), w tym nasiona tytoniu i bulwy ziemniaka. Patrz np. Conrad i wsp., Plant Mol. Biol. 38:101-109 (1998) i odniesienia tam cytowane. Tak więc, przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być również wytworzone przy pomocy transgenicznych roślin zgodnie ze znanymi sposobami. Patrz również np. Fischer i wsp., Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108 (październik 1999), Ma i wsp., Trends Biotechnol. 13:522-7 (1995); Ma i wsp., Plant Physiol. 109:341-6 (1995); Whitelman i wsp., Biochem Soc. Trans. 22:940-944 (1994) i cytowane tam odniesienia.

Przeciwciała według wynalazku mogą wiązać ludzką dwuintegrynę w szerokim zakresie powinowactwa (KD). W korzystnej postaci, przynajmniej jedno ludzkie mAb według niniejszego wynalazku może ewentualnie wiązać, z dużym powinowactwem, ludzką dwuintegrynę. Przykładowo ludzkie mAb może wiązać ludzką dwuintegrynę z KD równą lub mniejszą niż 10^-7 M, tak jak lecz bez ograniczenia 0,1-9,9 (lub dowolny zakres lub wartość w nim zawarta) X 10^-7, 10^-8, 10^-9, 10^-10, 10^-11, 10^-12, 10^-13 lub dowolny zakres lub wartość w nim zawarta.

Powinowactwo lub zachłanność wiązania przeciwciała do antygenu można określać doświadczalnie przy pomocy jakiegokolwiek odpowiedniego sposobu. (Patrz przykładowo, Berzowsky i wsp., „Antibody-Antigene Interactions w Fundamental Immunology, Paul, W.E. wyd., Raven Press: Nowy Jork, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman & Company: Nowy Jork, NY (1992) i opisane tam sposoby). Zmierzone powinowactwo szczególnego oddziaływania przeciwciało-antygen może różnić się jeżeli zostało zmierzone w różnych warunkach (np. stężenie soli, pH). Tak więc, pomiary powinowactwa i innych parametrów wiązania antygenu (np. KD, Ka, Kd) są dogodnie przeprowadzane w standaryzowanych roztworach przeciwciała i antygenu, i w wystandaryzowanych buforach, takich jak opisany tu bufor.

Cząsteczki kwasu nukleinowego.

Używając dostarczonej tu informacji, takiej jak sekwencje nukleotydowe kodujące przynajmniej 100% kolejnych aminokwasów z NR ID. SEKW.: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, specyficznych fragmentów, lub zdeponowany wektor zawierający przynajmniej jedną z tych sekwencji, przy pomocy opisanych tu sposobów lub sposobów znanych w dziedzinie można otrzymać cząsteczkę kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku kodującą przynajmniej jedno przeciwciało anty-dwuintegrynowe.

Cząsteczki kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku mogą być w postaci RNA, takiego jak mRNA, hnRNA, tRNA lub jakiejkolwiek innej postaci lub w postaci DNA obejmującej, lecz bez ograniczenia, cDNA i genomowy DNA, który można otrzymać przez klonowanie, lub wytworzyć syntetycznie, lub jakąkolwiek ich kombinacją. DNA może być trójniciowy, dwuniciowy lub jednoniciowy lub może być jakąkolwiek ich kombinacją. Jakakolwiek część przynajmniej jednej nici DNA lub RNA może być nicią kodującą, znaną również jako nić sensowna, lub może być nicią niekodującą, określaną również jako nić antysensowna.

Wyizolowane cząsteczki kwasu nukleinowego tu ujawnione mogą obejmować cząsteczki kwasu nukleinowego zawierające otwartą ramkę odczytu (ORF), ewentualnie z jednym lub większą liczbą intronów, np. lecz bez ograniczenia przynajmniej jedną szczególną część przynajmniej jednego CDR takiego jak CDR1, CDR2 i/lub CDR3 z przynajmniej jednego łańcucha ciężkiego (np. NR ID. SEKW.: 1-3) lub łańcucha lekkiego (np. NR ID. SEKW.: 4-6); cząsteczki kwasu nukleinowego zawierające sekwencję kodującą dla przeciwciała anty-dwuintegrynowego lub regionu zmiennego (np. NR ID. SEKW.: 7, 8) i cząsteczki kwasu nukleinowego zawierające sekwencję nukleotydową zasadniczo różną od opisanej powyżej, lecz która z powodu degeneracji kodu genetycznego nadal koduje przynajmniej jedno przeciwciało anty-dwuintegrynowe jakie tu opisano i/lub jakie znane jest w dziedzinie. Oczywiście kod genetyczny jest dobrze znany w dziedzinie. Co za tym idzie dla specjalisty będzie rutynową praktyką wytworzenie takich zdegenerowanych wariantów kwasu nukleinowego kodujących specyficzne przeciwciała anty-dwuintegrynowe według niniejszego wynalazku. Patrz np. Ausubel, i wsp.. Nieograniczające przykłady wyizolowanych cząsteczek kwasu nukleinowego obejmują NR ID. SEKW.: 10, 11, 12, 13, 14, 15, odpowiadające nieograniczającym przykładom kwasu nukleinowego

PL 213 030 B1 kodującego odpowiednio HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC, CDR1, LC CDR2, LC CDR3, region zmienny HC i region zmienny LC.

Jak tu wskazano cząsteczki kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku zawierające kwas nukleinowy kodujący przeciwciało anty-dwuintegrynowe mogą zawierać, lecz bez ograniczenia, te kodujące sekwencje aminokwasowe fragmentu przeciwciała; sekwencję kodującą dla całego przeciwciała lub jego części; sekwencję kodującą przeciwciało, fragment lub część, jak również dodatkowe sekwencje, takie jak sekwencja kodująca przynajmniej jeden peptyd sygnałowy lub peptyd fuzyjny, z lub bez wyżej wspomnianych dodatkowych sekwencji kodujących, takich jak przynajmniej jeden intron, wraz z dodatkowymi sekwencjami niekodującymi, obejmującymi lecz bez ograniczenie niekodujące sekwencje 5' i 3' takie jak transkrybowane, nieulegające translacji sekwencje odgrywające rolę w transkrypcji, obróbce mRNA, zawierające sygnały składania i poliadenylacji mRNA (przykładowo wiązanie rybosomu i stabilność mRNA); dodatkowo sekwencja kodująca, która koduje dodatkowe aminokwasy takie jak te, dostarczające dodatkowych właściwości funkcjonalnych. Co za tym idzie, sekwencja kodująca przeciwciało może być połączona z sekwencją znacznika, taką jak sekwencja kodująca peptyd umożliwiający oczyszczanie przyłączonego przeciwciała zawierającego fragment lub część przeciwciała.

Polinukleotydy selektywnie hybrydyzujące z opisanym tu polinukleotydem

Niniejszy opis ujawnia wyizolowane kwasy nukleinowe hybrydyzujące w selektywnych warunkach z ujawnionym tu polinukleotydem. Co za tym idzie polinukleotydy takie mogą być stosowane do izolowania, wykrywania i/lub ilościowej oceny kwasów nukleinowych zawierających takie polinukleotydy. Przykładowo, polinukleotydy takie mogą być stosowane do identyfikowania, izolowania lub amplifikowania części lub pełnej długości klonów ze zdeponowanej biblioteki. W pewnych postaciach polinukleotydy są sekwencjami genomowymi lub cDNA wyizolowanymi lub w inny sposób komplementarnymi do cDNA z ludzkiej lub ssaczej biblioteki kwasów nukleinowych.

Biblioteka cDNA zawiera dogodnie przynajmniej 80% sekwencji o pełnej długości, dogodnie przynajmniej 85% lub 90% sekwencji pełnej długości i w szczególności przynajmniej 95% sekwencji pełnej długości. Biblioteki cDNA mogą być znormalizowane do zwiększenia udziału rzadkich sekwencji. Hybrydyzacja w warunkach niskiej lub średniej ostrości jest typowo, lecz nie wyłącznie, stosowane w przypadku sekwencji o zmniejszonej identyczności sekwencji w porównaniu z sekwencjami komplementarnymi. Warunki o średniej i wysokiej ostrości mogą być ewentualnie stosowane w przypadku sekwencji o większej identyczności. Warunki o niskiej ostrości pozwalają na wybiórczą hybrydyzację sekwencji posiadającej około 70% identyczności sekwencji i mogą być stosowane do identyfikacji sekwencji ortologów lub paralogów.

Polinukleotydy według niniejszego wynalazku będą ewentualnie kodowały przynajmniej część przeciwciała kodowanego przez opisane tu polinukleotydy. Polinukleotydy obejmują sekwencje kwasu nukleinowego, które mogą być stosowane do selektywnej hybrydyzacji z polinukleotydem kodującym przeciwciało według niniejszego wynalazku. Patrz np. Ausubel, powyżej; Colligan, powyżej.

Konstrukcja kwasów nukleinowych

Wyizolowane kwasy nukleinowe według niniejszego wynalazku mogą być wytwarzane przy pomocy (a) sposobów rekombinowania, (b) technik syntezy, (c) technik oczyszczania, lub ich kombinacji, jak jest to dobrze znane w dziedzinie.

Kwasy nukleinowe mogą dogodnie zawierać sekwencje dodatkowe do polinukleotydu według niniejszego wynalazku. Przykładowo, miejsce wielokrotnego klonowania zawierające jedno lub wiele miejsc rozpoznawanych przez endonukleazy restrykcyjne może być włączone do kwasu nukleinowego, w celu ułatwienia izolowania polinukleotydu. Również sekwencje ulegające translacji mogą być wbudowane w celu ułatwienia izolowania ulegającego translacji polinukleotydu według wynalazku. Przykładowo, sześciohistydynowa sekwencja markerowa dostarcza dogodnego sposobu do oczyszczania białek według niniejszego wynalazku. Kwas nukleinowy według niniejszego wynalazku - z wyjątkiem sekwencji kodującej jest ewentualnie wektorem, adaptorem lub łącznikiem do klonowania i/lub ekspresji polinukleotydu według niniejszego wynalazku.

Dodatkowe sekwencje mogą być dodane do takich sekwencji do klonowania i/lub ekspresji celem optymalizacji ich funkcji w klonowaniu i/lub ekspresji, w celu ułatwienia wyizolowania polinukleotydu lub udoskonalenia wprowadzania polinukleotydu do komórki. Zastosowanie wektorów do klonowania, wektorów ekspresyjnych, adaptorów i łączników jest dobrze znane w dziedzinie (patrz np. Ausubel, powyżej i Sambrook, powyżej).

Sposoby rekombinowania dla konstrukcji kwasów nukleinowych.

PL 213 030 B1

Kompozycje wyizolowanego kwasu nukleinowego według tego wynalazku takie jak RNA, cDNA, DNA genomowy lub jakakolwiek ich kombinacja mogą być otrzymane ze źródeł biologicznych, przy pomocy jakiejkolwiek z szeregu metodologii klonowania znanych specjalistom. W pewnych postaciach, sondy oligonukleotydowe, które selektywnie hybrydyzują w ostrych warunkach z polinukleotydami według niniejszego wynalazku są stosowane do identyfikowania pożądanej sekwencji w bibliotece cDNA lub bibliotece genomowego DNA. Izolowanie RNA i konstrukcja bibliotek cDNA i genomowych są dobrze znane specjalistom o przeciętnych umiejętnościach. (Patrz np. Ausubel, powyżej lub Sambrook, powyżej).

Sposoby izolacji i przeszukiwania kwasów nukleinowych

Biblioteka cDNA lub biblioteka genomowa może być przeszukana przy pomocy sondy opartej na sekwencji polinukleotydu według niniejszego wynalazku, takie jak ta tu ujawniona. Sondy mogą być stosowane do hybrydyzacji z genomowym DNA lub sekwencjami cDNA w celu izolacji homologicznych genów w tych samych lub innych organizmach. Specjaliści powinni dostrzec, że w oznaczeniu mogą być zastosowane różne stopnie ostrości hybrydyzacji i, że zarówno podłoże do hybrydyzacji jak i płukania może stwarzać ostre warunki. Gdy warunki hybrydyzacji stają się ostrzejsze, to stopień komplementarności pomiędzy sondą i sekwencją docelową musi być większy aby wystąpiło utworzenie dwuniciowej struktury. Stopień ostrości warunków może być kontrolowany przez jeden lub więcej czynników takich jak temperatura, siła jonowa, pH i obecność częściowo denaturującego roztworu takiego jak formamid. Przykładowo, ostrość hybrydyzacji jest dogodnie zmieniana przez zmianę polarności roztworu reakcyjnego przez, przykładowo, manipulowanie stężeniem formamidu w zakresie 0% do 50%. Stopień komplementarności (identyczność sekwencji) wymagany dla wykrywalnego wiązania będzie zmieniał się zgodnie z ostrością hybrydyzacji zapewnianą przez podłoże do hybrydyzacji i/lub płukania. Stopień komplementarności będzie optymalnie wynosił 100%, lub 70-100%, lub jakikolwiek zakres lub wartość w nim zawarta. Jednakowoż należy rozumieć, że mniejsza zmienność sekwencji, sond i starterów może być skompensowana przez zmniejszenie ostrości warunków hybrydyzacji i/lub płukania.

Sposoby amplifikacji RNA lub DNA są dobrze znane w dziedzinie i mogą być stosowane według niniejszego wynalazku bez niepotrzebnego eksperymentowania w oparciu o nauki i wskazówki, które są tu prezentowane.

Znane sposoby amplifikacji DNA lub RNA obejmują, lecz bez ograniczenia, łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) i pokrewne procesy amplifikacji (patrz np. patent USA nr 4,683,195, 4,683,202, 4,800,159, 4,965,188 dla Mullis i wsp.; 4,795,699 i 4,921,794 dla Tabor i wsp.; 4,142,033 dla Innis; 5,122,464 dla Wilson i wsp.; 5,091,310 dla Innis; 5,066,584 dla Gyllensten i wsp.; 4,889,818 dla Belfand i wsp.; 4,994,370 dla Siver i wsp.; 4,766,067 dla Bisfas; 4,656,134 dla Ringold) oraz amplifikację zależną od RNA wykorzystującą antysensowny RNA względem sekwencji docelowej jako matrycę do syntezy dwuniciowego DNA (patent USA nr 5,130,238 dla Malek i wsp., ze znakiem towarowym NASBA), (patrz np. Ausubel, powyżej lub Sambrook, powyżej).

Przykładowo, technologia łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) może być zastosowana do amplifikacji sekwencji polinukleotydów według niniejszego wynalazku i pokrewnych genów bezpośrednio z bibliotek genomowego DNA lub cDNA. Użyteczna może być również PCR i inne sposoby amplifikacji in vitro, przykładowo, do klonowania sekwencji kwasu nukleinowego kodującej białka, które mają ulegać ekspresji, do wytwarzania kwasów nukleinowych do zastosowania jako sondy do wykrywania obecności pożądanego mRNA w próbkach, do sekwencjonowania kwasu nukleinowego lub innych celów. Przykłady sposobów wystarczających dla umożliwienia specjaliście amplifikacji in vitro można znaleźć w Berger, powyżej, Sambrook, powyżej i Ausubel, powyżej, jak również w Mullis i wsp., patent USA nr 4,683,202 (1987) i Innis i wsp., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, wyd., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). Komercyjnie dostępne zestawy do amplifikacji genomowego DNA przez PCR są znane w dziedzinie. Patrz np. Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech). Ponadto, np. białko genu 32 bakteriofaga T4 (Boehringer Mannheim) może być stosowane do zwiększania wydajności otrzymywania długich produktów PCR.

Sposoby syntezy do konstrukcji kwasów nukleinowych

Wyizolowane kwasy nukleinowe według niniejszego wynalazku mogą być również wytwarzane znanymi sposobami przez bezpośrednią syntezę chemiczną (patrz np. Ausubel i wsp., powyżej). Synteza chemiczna ogólnie wytwarza jednoniciowy oligonukleotyd, który może być przekształcony do dwuniciowego DNA przez hybrydyzację z komplementarną sekwencją lub przez polimeryzację polimerazą DNA z użyciem pojedynczej nici jako matrycy. Specjalista dostrzeże, że chemiczna synteza DNA

PL 213 030 B1 może być ograniczona do sekwencji około 100 lub więcej nukleotydów, zaś dłuższe sekwencje można otrzymać przez łączenie krótszych sekwencji.

Rekombinowane kasetki ekspresyjne

Niniejszy wynalazek dostarcza ponadto rekombinowanych kasetek ekspresyjnych zawierających kwas nukleinowy według niniejszego wynalazku. Sekwencja kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku, przykładowo cDNA lub sekwencja genomowa kodująca przeciwciało według niniejszego wynalazku może być stosowana do konstrukcji rekombinowanej kasetki ekspresyjnej, która może być wprowadzona do przynajmniej jednej pożądanej komórki gospodarza. Rekombinowana kasetka ekspresyjna będzie typowo zawierała polinukleotyd według niniejszego wynalazku połączony operacyjnie z sekwencjami regulującymi inicjację transkrypcji, które będą kierowały transkrypcją polinukleotydu w zamierzonej komórce gospodarza. Zarówno homologiczne jak i niehomologiczne (tj. endogenne) promotory mogą być stosowane do kierowania ekspresją kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku.

W pewnych postaciach wyizolowane kwasy nukleinowe służące jako promotor, wzmacniacz lub inne elementy mogą być wprowadzone w odpowiednie miejsce (powyżej, poniżej lub do intronu) nieheterologicznej postaci polinukleotydu według niniejszego wynalazku tak, aby pobudzać lub hamować ekspresję polinukleotydu według niniejszego wynalazku. Przykładowo, endogenne promotory mogą być zmieniane in vivo lub in vitro przez mutację, delecję i/lub podstawienie.

Wektory i komórki gospodarza

Niniejszy wynalazek dotyczy również wektorów obejmujących wyizolowane cząsteczki kwasów nukleinowych według niniejszego wynalazku, komórek gospodarza, które są genetycznie zmienione przez rekombinowane wektory oraz wytwarzania przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego technikami rekombinowania jak to jest dobrze znane w dziedzinie. Patrz np. Sambrook i wsp., powyżej; Ausubel, i wsp., powyżej.

Polinukleotydy mogą ewentualnie być łączone z wektorem zawierającym marker selekcyjny do namnażania w gospodarzu.

Ogólnie, wektor plazmidowy jest wprowadzany w postaci osadu takiego jak osad fosforanu wapnia lub w kompleksie z lipidem posiadającym ładunek. Jeśli wektor jest wirusem, to może być zapakowany in vitro przy pomocy odpowiedniej pakującej linii komórkowej i następnie wprowadzany przez transdukcję do komórek gospodarza.

Wstawka DNA powinna być połączona operacyjnie z odpowiednim promotorem. Konstrukty ekspresyjne będą ponadto zawierały miejsca dla inicjacji transkrypcji, terminacji i w ulegającym transkrypcji regionie miejsce wiązania rybosomu dla translacji. Kodująca część dojrzałych transkryptów wyrażanych przez konstrukty będzie dogodnie zawierała miejsce inicjacji translacji na początku i kodon terminacyjny (np. UAA, UGA lub UAG) odpowiednio umiejscowiony na końcu mRNA który ma ulegać translacji, dogodnie UAA i UAG w przypadku ekspresji w komórkach ssaczych lub eukariotycznych.

Wektory ekspresyjne będą dogodnie, lecz ewentualnie, zawierały przynajmniej jeden marker selekcyjny. Markery takie obejmują, np. lecz bez ograniczenia, metotreksat (MTX), reduktazę dihydrofolianową (DHFR), patenty USA nr 4,399,216; 4,634,665; 4,656,134; 4,956,288; 5,149,636; 5,179,017, ampicyliny, neomycyny (G418), kwasu mykofenolowego lub syntetazy glutaminy (GS, patent USA nr 5,122,464; 5,77 0,3 59; 5,827,739) w przypadku hodowli komórek eukariotycznych i genów oporności na tetracyklinę lub ampicylinę w przypadku hodowli E. coli i innych bakterii lub prokariontów. Odpowiednie pożywki hodowlane i warunki hodowli dla wyżej opisanych komórek gospodarza są dobrze znane w dziedzinie. Dogodne wektory będą łatwo dostępne dla specjalisty.

Wprowadzenie konstruktu wektorowego do komórki gospodarza może być osiągnięte przez transfekcję fosforanem wapnia, transfekcję zależną od DEAE - dekstranu, transfekcję przy pomocy kationowego lipidu, elektroporację, transdukcję, infekcję lub przy pomocy innych znanych sposobów. Sposoby takie są opisane np. w Sambrook, powyżej, rozdziały 1-4 i 16-18; Ausubel, powyżej, rozdziały 1, 9, 13, 15, 16.

Przynajmniej jedno przeciwciało według niniejszego wynalazku może być wyrażone w zmodyfikowanej postaci, takiej jak białko fuzyjne, i może zawierać nie tylko sygnały dla wydzielania, lecz również dodatkowe, heterologiczne regiony funkcjonalne. Przykładowo, region dodatkowych aminokwasów, szczególnie aminokwasów z ładunkiem, może być dodany do N-końca przeciwciała w celu zwiększenia stabilności i utrzymywania się w komórce gospodarza, podczas oczyszczania i podczas dalszego przechowywania i magazynowania. W celu ułatwienia oczyszczania do przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być również dodawane ugrupowania peptydowe. Takie regiony mogą

PL 213 030 B1 być usunięte przed ostatecznym oczyszczeniem przeciwciała lub przynajmniej jednego jego fragmentu. Takie sposoby są opisane w wielu typowych podręcznikach laboratoryjnych, takich jak Sambrook, powyżej, rozdziały 17.29-17.42 i 18.1-18.74; Ausubel, powyżej, rozdziały 16, 17 i 18.

Specjaliści o przeciętnych umiejętnościach znają liczne systemy ekspresyjne dostępne do ekspresji kwasu nukleinowego kodującego białko według niniejszego wynalazku.

Alternatywnie, kwasy nukleinowe według niniejszego wynalazku mogą być wyrażane w komórce gospodarza przez włączenie (przez manipulowanie) w komórce gospodarza zawierającej endogenny DNA kodujący przeciwciało według niniejszego wynalazku. Takie sposoby są dobrze znane w dziedzinie, np. jak opisano w patentach USA nr 5,580,734, 5,641,670, 5,733,746 i 5,733,761.

Przykładem obrazującym hodowle komórkowe użyteczne do wytwarzania przeciwciał, specyficznych ich części lub wariantów są komórki ssacze. Systemy komórek ssaczych często będą w postaci pojedynczej warstwy komórek, choć mogą być także stosowane zawiesiny komórek ssaczych lub bioreaktory. W dziedzinie opracowano szereg użytecznych linii komórkowych gospodarza zdolnych do ekspresji niezmienionych glikozylowanych białek i obejmują one linie komórkowe COS-1 (np. ATCC CRL 1650), COS-7 (np. ATCC CRL-1651), HEK 293, BHK21 (np. ATCC CRL-10), CHO (np. ATCC CRL 1610) i BSC-1 (np. ATCC CRL-26), komórki Cos-7, komórki CHO, komórki hep G2, komórki P3X63Ag8;1653, SP2/0Ag14, komórki 293, komórki HeLa i im podobne, i które są łatwo dostępne przykładowo z American Type Culture Colection, Manassas Va (www.atcc.org). Dogodnie komórki gospodarza obejmują komórki pochodzenia limfoidalnnego takie jak komórki szpiczaka i chłoniaka. Szczególnie preferowanymi komórkami gospodarza są P3x63Ag8.653 (numer dostępu ATCC CRL-1580) i komórki SP2/0Ag14 (numer dostępu ATCC CRL-1851). W szczególnie zalecanej postaci rekombinowaną komórką jest komórka P3x63Ab8.653 lub komórka SP2/0Ag14.

Wektory ekspresyjne dla tych komórek obejmują jedną lub więcej poniższych sekwencji kontrolujących ekspresję, takich jak lecz bez ograniczenia miejsca inicjacji replikacji; promotora (np. późne lub wczesne promotory SV40, promotor CMV (patenty USA nr 5,168,062; 5,385,839) i promotor tk HSV, promotor pgk (kinazy fosfoglicerynowej), promotor EF-1 alfa (patent USA 5,266,491), przynajmniej jeden promotor ludzkiej immunoglobuliny, wzmacniacz i/lub miejsca informacyjne dla obróbki, takie jak miejsca wiązania rybosomu, miejsca składania RNA, miejsca poliadenylacji (np. miejsca dodawania poliA dla dużego antygenu T SV40) i sekwencje terminacji transkrypcji. Patrz np. Ausubel i wsp., powyżej; Sambrook i wsp., powyżej. Inne komórki użyteczne do wytwarzania kwasów nukleinowych lub białek według niniejszego wynalazku są znane i/lub dostępne przykładowo z American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas (www.atcc.org) lub z innego znanego lub komercyjnego źródła.

Gdy zastosowane są komórki eukariotyczne sekwencje dla poliadenylacji lub terminacji transkrypcji są typowo włączone do wektora. Przykładem sekwencji terminatora jest sekwencja poliadenylacji z genu bydlęcego hormonu wzrostu. Uwzględnione mogą być również sekwencje dla dokładnego składania transkryptu. Przykładem sekwencji składania jest intron VP1 z SV40 (Sprague, i wsp., J. Virol. 45:773-781 (1983)). Ponadto, jak jest to znane w dziedzinie do wektora mogą być włączone sekwencje genu kontrolujące replikację w komórce gospodarza.

Oczyszczanie przeciwciała

Przeciwciało anty-dwuintegrynowe może być odzyskane i oczyszczone z hodowli rekombinowanych komórek dobrze znanymi sposobami obejmującymi, lecz bez ograniczenia, oczyszczanie na białku A, wytrącanie siarczanem amonu lub etanolem, kwaśna ekstrakcja, kationo- lub anionowymienna chromatografia, chromatografia na fosfocelulozie, chromatografia oddziaływań hydrofobowych, chromatografia powinowactwa, chromatografia na hydroksyapatycie i chromatografia na lektynie. Do oczyszczania może być również zastosowana wysokosprawna chromatografia cieczowa („HPLC). Patrz np. Colligan, Current Protocols in Immunology lub Current Protocols in Protein Science, John Willey & Sons, NY (1997-2001), np. rozdziały 1, 4, 6, 8, 9, 10.

Przeciwciała według niniejszego wynalazku obejmują naturalnie oczyszczone produkty, produkty syntezy chemicznej i produkty otrzymane technikami rekombinacji z eukariotycznej komórki gospodarza w tym przykładowo drożdży, rośliny wyższej, owada i komórki ssaczej. Zależnie od gospodarza użytego w procedurze rekombinacyjnej produkcji przeciwciało według niniejszego wynalazku może być glikozylowane lub może być nieglikozylowane, zaś zalecane jest przeciwciało glikozylowane. Takie sposoby są opisane w wielu typowych podręcznikach laboratoryjnych takich jak Sambrook, powyżej, Rozdziały 17.37-17.42; Ausubel, powyżej, Rozdziały 10, 12, 13, 16, 18 i 20, Colligan, Protein Science, powyżej, Rozdziały 12-14.

PL 213 030 B1

Przeciwciała anty-dwuintegrynowe

Wyizolowane przeciwciała według niniejszego wynalazku zdefiniowano w zastrzeżeniach i zawierają one ujawnione tu sekwencje aminokwasowe przeciwciała kodowane przez dowolny odpowiedni polinukleotyd. Ludzkie przeciwciało lub fragment wiążący antygen dogodnie wiąże ludzką dwuintegrynę i co za tym idzie częściowo lub zasadniczo zobojętnia przynajmniej jedną aktywność biologiczną tego białka. Przeciwciało lub jego specyficzna część lub wariant, które częściowo lub korzystnie zasadniczo zobojętnia przynajmniej jedną aktywność biologiczną przynajmniej jednego białka dwuintegrynowego lub fragmentu może wiązać białko lub fragment i w ten sposób hamować aktywności zależne od wiązania dwuintegryny z receptorem dwuintegrynowym lub przez inne mechanizmy zależne od dwuintegryny lub w których uczestniczy dwuintegryną. W użytym tu znaczeniu termin „zobojętniające przeciwciało określa przeciwciało hamujące aktywność zależną od dwuintegryny w około 20-120%, zwłaszcza w przynajmniej około 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% lub więcej zależnie od oznaczenia. Zdolność przeciwciała antydwuintegrynowego do hamowania aktywności zależnej od dwuintegryny jest dogodnei oceniana przy użyciu oznaczenia przynajmniej jednego białka lub receptora dwuintegrynowego, jak tu opisano i/lub jak jest to znane w dziedzinie. Ludzkie przeciwciało według wynalazku może być dowolnej klasy (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, itp.) lub izotypu i może zawierać łańcuch lekki kappa lub lambda. W pewnej postaci ludzkie przeciwciało zawiera łańcuch ciężki IgG lub określony fragment, przykładowo przynajmniej jeden z izotypów, IgG1, IgG2, IgG3 lub IgG4. Przeciwciała tego typu mogą być wytwarzane przy użyciu transgenicznej myszy lub innego niebędącego człowiekiem transgenicznego ssaka zawierającego przynajmniej jeden ludzki transgen łańcucha lekkiego (np. IgG, IgA i IgM (np. γ1, γ2, γ3, γ4) jak tu opisano i/lub jak znane jest w dziedzinie. W innej postaci ludzkie przeciwciało przeciwko ludzkiej dwuintegrynie zawiera łańcuch ciężki IgG1 i łańcuch lekki IgG1.

Przynajmniej jedno przeciwciało według wynalazku wiąże przynajmniej jeden podany epitop specyficzny dla przynajmniej jednego białka dwuintegrynowego, fragmentu, podjednostki, części lub dowolnej ich kombinacji. Przynajmniej jeden epitop może zawierać przynajmniej jeden region wiążący przeciwciało, który zawiera przynajmniej jedną część wspomnianego białka, który to epitop jest dogodnie zawarty w przynajmniej jednej zewnątrzkomórkowej, rozpuszczalnej, hydrofilowej, zewnętrznej lub cytoplazmatycznej części wspomnianego białka. Przynajmniej jeden podany epitop może zawierać dowolna kombinację przynajmniej jednaj sekwencji aminokwasowej o przynajmniej 1-3 aminokwasach do całej podanej części przyległych aminokwasów sekwencji NR ID. SEKW.: 9, 16 lub 17.

Przeciwciało lub fragment wiążący antygen według niniejszego wynalazku zdefiniowano w zastrzeżeniach. Przeciwciała według wynalazku mogą być wytwarzane przez chemiczne łączenie ze sobą różnych części (np. CDRów, zrębu) przeciwciała przy pomocy tradycyjnych sposobów, przez wytwarzanie i ekspresję cząsteczki kwasu nukleinowego (tj. jednej lub więcej) kodującej przeciwciało przy pomocy tradycyjnych technik technologii rekombinacji DNA lub przy pomocy jakiegokolwiek innego sposobu.

Przeciwciało anty-dwuintegrynowe według wynalazku zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego mający sekwencję aminokwasową NR ID. SEKW.: 7 i region zmienny łańcucha lekkiego mający sekwencję aminokwasową NR ID. SEKW.: 8. Przeciwciała wiążące się z ludzką dwuintegryną i posiadające region zmienny łańcucha ciężkiego lub lekkiego mogą być wytwarzane odpowiednimi sposobami, takimi jak prezentacja na fagach (Katsube, Y., i wsp., Int. J. Mol. Med., 1(5):863-868 (1998)) lub sposobami wykorzystującymi transgeniczne zwierzęta jakie są znane w dziedzinie i/lub jakie tu opisano. Przykładowo, transgeniczna mysz zawierająca funkcjonalnie przebudowany transgen ludzkiego łańcucha ciężkiego immunoglobuliny i transgen zawierający DNA z locus łańcucha lekkiego ludzkiej immunoglobuliny, który może podlegać funkcjonalnej przebudowie może być immunizowana ludzką dwuintegryną lub jej fragmentem w celu wzbudzenia wytwarzania przeciwciał. Jeśli jest to pożądane komórki wytwarzające przeciwciało mogą być wyizolowane i mogą być wytwarzane hybrydomy lub inne unieśmiertelnione komórki wytwarzające przeciwciała jak tu opisano i/lub jak jest to znane w dziedzinie. Alternatywnie, przeciwciało, specyficzna część lub wariant mogą być wyrażane z zastosowaniem kodującego kwasu nukleinowego lub jego części w dogodnej komórce gospodarza.

Konserwatywne podstawienie aminokwasowe odnosi się do zastąpienia pierwszego aminokwasu przez drugi aminokwas o właściwościach chemicznych i/lub fizycznych (np. ładunek, struktura, polarność, hydrofobowość/hydrofilowość), które są podobne do właściwości pierwszego aminokwasu. Konserwatywne podstawienia obejmują zastąpienie jednego aminokwasu drugim w obrębie poniższych grup: lizyna (K), arginina (R) i histydyna (H); asparaginian (D) i glutaminian (E); asparagina (N),

PL 213 030 B1 glutamina (Q), seryna (S), treonina (T), tyrozyna (Y), K, R, H, D i E; alanina (A), walina (V), leucyna (L), izoleucyna (I), prolina (P), fenyloalanina (F), tryptofan (W), metionina (M), cysteina (C) i glicyna (G); F, W i Y; C, S i T.

Kod aminokwasowy

Aminokwasy tworzące przeciwciała anty-dwuintegrynowe według niniejszego wynalazku są często podawane skrótami. Oznaczenia aminokwasów mogą być podane przez oznaczenie aminokwasu kodem jednoliterowym, jego kodem trzyliterowym, nazwą lub trójnukleotydowym kodonem(kodonami), co jest dobrze znane w dziedzinie (patrz Alberts, B., i wsp., Molecular Biology of the Cell, trzecie wyd., Garland Publishing Inc. Nowy Jork, 1994):

Kod jednoliterowy	Kod trzy literowy	Nazwa	Kodon(y) trójnukleotydowy
A	Ala	Alanina	GCA, GCC, GCG, GCU
C	Cys	Cysteina	UGC, UGU
D	Asp	Kwas asparaginowy	GAC, GAU
E	Glu	Kwas glutaminowy	GAA, GAG
F	Phe	Fenyloalanina	UUC, UUU
G	Gly	Glicyna	GGA, GGC, GGG, GGU
H	His	Histydyna	CAC, CAU
I	Ile	Izoleucyna	AUA, AUC, AUU
K	Lys	Lizyna	AAA, AAG
L	Leu	Leucyna	UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU
M	Met	Metionina	AUG
N	Asn	Asparagina	AAC, AAU
P	Pro	Prolina	CCA, CCC, CCG, CCU
Q	Gln	Glutamina	CAA, CAG
R	Arg	Arginina	AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU
S	Ser	Seryna	AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU
T	Thr	Treonina	ACA, ACC, ACG, ACU
V	Val	Walina	GUA, GUC, GUG, GUU
W	Trp	T ryptofan	UGG
Y	Tyr	Tyrozyna	UAC, UAU

Przeciwciało anty-dwuintegrynowe według niniejszego wynalazku może obejmować jedno lub więcej podstawień aminokwasowych, delecji lub insercji zarówno będących wynikiem naturalnych mutacji lub dokonanych przez człowieka zabiegów, jak tu podano.

Oczywiście specjalista może wykonać szereg podstawień aminokwasowych zależnie od licznych czynników, w tym tych opisanych powyżej. Ogólnie, liczba podstawień aminokwasowych, insercji lub delecji w danym przeciwciele anty-dwuintegrynowym nie będzie większa niż 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, tak jak 1-30 lub jakikolwiek zakres lub wartość w nim zawarta, jak tu określono.

Aminokwasy w przeciwciele anty-dwuintegrynowym według niniejszego wynalazku, które są kluczowe dla funkcji mogą być zidentyfikowane sposobami znanymi w dziedzinie, takimi jak miejscowo specyficzna mutageneza lub mutageneza wyszukująca alaninę (np. Ausubel, powyżej, Rozdziały 8, 15; Cunnigham i Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). Ta ostatnia procedura (wprowadza pojedyncze mutacje alaniny w każdej reszcie w cząsteczce. Otrzymane zmutowane cząsteczki są następnie badane z uwagi na ich aktywność biologiczną, taką jak, lecz bez ograniczenia, zdolność do neutralizacji przynajmniej jednej aktywności dwuintegryny. Miejsca krytyczne dla wiązania przeciwciała mogą być również zidentyfikowane przez badanie struktury takie jak krystalizacja, jądrowy rezonans magne20

PL 213 030 B1 tyczny lub znakowanie przez fotopowinowactwo (Smith, i wsp., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) i DeVos, i wsp., Science 255:306-312 (1992)).

Specjaliści powinni docenić, że niniejszy wynalazek obejmuje przynajmniej jedno biologicznie aktywne przeciwciało według niniejszego wynalazku. Biologicznie aktywne przeciwciała posiadają aktywność specyficzną przynajmniej 20%, 30% lub 40% i dogodnie przynajmniej 50%, 60% lub 70% i w szczególno ś ci przynajmniej 80%, 90% lub 95% - 1000% aktywnoś ci naturalnego (nie syntetycznego), endogennego lub pokrewnego i znanego przeciwciała. Sposoby oznaczania i pomiaru ilościowego aktywności enzymatycznej i specyficzności substratowej są dobrze znane naukowcom.

W kolejnej postaci wynalazek dotyczy ludzkich przeciwciał i fragmentów wiążących antygen, jakie tu opisano, które są zmodyfikowane przez przyłączenie kowalencyjne ugrupowania organicznego. Taka modyfikacja może wytworzyć przeciwciało lub fragment wiążący antygen o ulepszonych właściwościach farmakokinetycznych (np. zwiększonym okresie półtrwania surowicy in vivo). Ugrupowanie organiczne może być liniową lub rozgałęzioną hydrofilową grupą polimerową, grupą kwasu tłuszczowego lub grupą estru kwasu tłuszczowego. W szczególnych postaciach hydrofilową grupa polimerowa może posiadać masę cząsteczkową pomiędzy około 800 a około 120 tys. daltonów i może być glikolem polialkanowym (np. glikol polietylenowy (PEG), glikol polipropylenowy (PPG)), polimerem węglowodanowym, polimerem aminokwasowym lub poliwinylopirolidonem i kwas tłuszczowy lub grupa estru kwasu tłuszczowego może zawierać od około 8 do około 40 atomów węgla.

Zmodyfikowane przeciwciała i fragmenty wiążące antygen według wynalazku mogą zawierać jedną lub więcej cząsteczek organicznych, które są przyłączone kowalencyjnie, bezpośrednio lub pośrednio do przeciwciała. Każda cząsteczka organiczna związana z przeciwciałem lub jego fragmentem wiążącym antygen według wynalazku może być niezależnie polimerową grupą hydrofilową, grupą kwasu tłuszczowego lub grupą estru kwasu tłuszczowego. W użytym tu znaczeniu termin „kwas tłuszczowy obejmuje kwasy monokarboksylowe i kwasy dikarboksylowe. „Hydrofilowa grupa polimerowa w użytym tu znaczeniu określa polimer organiczny, który jest bardziej rozpuszczalny w wodzie niż w octanie. Co za tym idzie, przeciwciał o zmodyfikowane przez kowalencyjne przyłączenie polilizyny jest objęte wynalazkiem. Hydrofilowe polimery użyteczne do modyfikowania przeciwciał według wynalazku mogą być liniowe lub rozgałęzione i mogą obejmować przykładowo, glikole polialkanowe (np. PEG, glikol monometoksypolietylenowy (mPEG), PPG i im podobne), węglowodany (np. dekstran, celulozę, oligosacharydy, polisacharydy i im podobne), polimery hydrofilowych kwasów aminowych (np. polilizyna, poliarginina, poliasparagina i im podobne), tlenki polialkanów (np. tlenek polietylenu, tlenek polipropylenu i im podobne) i poliwinylopirolidon. Hydrofilowy polimer modyfikujący przeciwciało według wynalazku dogodnie ma masę cząsteczkową około 800 do około 150 tys. daltonów jako niezależna cząsteczka. Przykładowo, może być użyty PEG5000 i PEG20000 gdzie w indeksie dolnym podana jest średnia masa cząsteczkowa polimeru wyrażona w daltonach. Hydrofilowe grupy polimeru mogą być podstawione jedną do około sześcioma grupami alkilowymi kwasu tłuszczowego lub estru kwasu tłuszczowego. Hydrofilowe polimery podstawione kwasem tłuszczowym lub grupą estrową kwasu tłuszczowego mogą być wytwarzane z użyciem odpowiednich sposobów. Przykładowo, polimer zawierający grupę aminową może być przyłączony do karboksylowanego kwasu tłuszczowego lub estru kwasu tłuszczowego i aktywowanego karboksylanu (np. aktywowanego N,N-karbonylodiimidazolem) lub kwas tłuszczowy lub ester kwasu tłuszczowego może być przyłączony do grupy hydroksylowej na polimerze.

Kwasy tłuszczowe i estry kwasów tłuszczowych użyteczne Il do modyfikowania przeciwciał według wynalazku mogą być nasycone lub mogą zawierać jedną lub więcej nienasyconych jednostek. Kwasy tłuszczowe, które są użyteczne do modyfikowania przeciwciał według wynalazku obejmują przykładowo kwas N-dodekanowy (C12, IauryIowy), N-tetradekanowy (C14, mirystylowy), N-oktadekanowy (C18, stearynowy), N-eikozanowy (C20, arachidowy), N-dokazanowy (C22, behenowy), N-triakontanowy (C₃₀), N-tetrakontanowy (C₄₀), cis^9-oktadekanowy (C₁₈, oleinowy), wszystkie οϊβ-Δ5,8,11,14-eikozatetraenowy (C20, arachidonowy), kwas oktanodiowy, kwas tetradekanodiowy, kwas oktadekanodiowy, kwas dokozanodiowy i im podobne. Użyteczne estry kwasu tłuszczowego obejmują monoestry kwasów dikarboksylowych, które zawierają liniową lub rozgałęzioną niższą grupę alkilową. Niższa grupa alkilowa może zawierać od jednego do około 12, dogodnie 1 do około 6 atomów węgla.

Zmodyfikowane ludzkie przeciwciała i fragmenty wiążące antygen mogą być wytwarzane przy pomocy odpowiednich sposobów takich jak przez reakcję z jednym lub większą liczbą zmodyfikowanych czynników. Użyty tu termin „zmodyfikowany czynnik odnosi się do odpowiedniej grupy organicznej (np. hydrofilowego polimeru, kwasu tłuszczowego, estru kwasu tłuszczowego) zawierającego akPL 213 030 B1 tywowaną grupę. „Aktywowana grupa jest ugrupowaniem chemicznym lub grupą funkcyjną, która może w odpowiednich warunkach reagować z drugą grupą chemiczną, co za tym idzie tworzyć wiązanie kowalencyjne pomiędzy zmodyfikowanym czynnikiem i drugą grupą chemiczną. Przykładowo, aminoreaktywne aktywowane grupy obejmują elektrofilowe grupy takie jak tosylowa, mesylanowa, fluorowcowa (chlorkowa, bromkowa, fluorowa, jodowa), estry N-hydroksysukcynyloimidylowe (NHS) i im podobne. Aktywowane grupy, które mogą reagować z tiolowymi obejmują, przykładowo maleimidową, jodoacetylową, akryloilową, dwusiarczki pirydylowe, tiol kwasu 5-tiolo-2-nitrobenzoesowego (TNB-tiol), i im podobne. Funkcyjna grupa aldehydowa może być przyłączona do cząsteczek zawierających aminę lub hydrazynę i grupa azydowa może reagować z trójwartościową grupą fosforową tworząc wiązania fosforamidowe lub fosforoimidowe. Użyteczne sposoby wprowadzania aktywowanych grup do cząsteczek są znane w dziedzinie (patrz przykładowo, Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)). Aktywowane grupy mogą być przyłączane bezpośrednio do grupy organicznej (np. hydrofilowego polimeru, kwasu tłuszczowego, estru kwasu tłuszczowego) lub za pośrednictwem cząsteczki łącznikowej przykładowo dwuwartościowej grupy C1-C12 gdzie jeden lub więcej atomów może być zastąpionych przez heteroatomy takie jak tlen, azot, lub siarka. Użyteczne cząsteczki łącznikowe obejmują przykładowo glikol tetraetylenowy, -(CH2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-NH- i -CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-. Modyfikowane czynniki zawierające ugrupowanie łącznikowe mogą być wytworzone, przykładowo, przez reakcję mono-Boc-alkilodiaminy (np. mono- Boc-etylenodiaminy, mono-Boc-diaminoheksanu) z kwasem tłuszczowym w obecności 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo) karbodiiminy (EDC) tworząc wiązanie amidowe pomiędzy wolną aminą i karboksylowanym kwasem tłuszczowym. Grupa chroniąca Boc może być usunięta z produktu przez działanie kwasem trifluorooctowym (TFA) w celu prezentacji pierwszorzędowej aminy, która jak to opisano może być przyłączona do kolejnej karboksylowanej cząsteczki lub może reagować z bezwodnikiem maleinowym i uzyskany produkt poddano cyklizacji z wytworzeniem aktywowanych pochodnych maleimidowych kwasu tłuszczowego (patrz, przykładowo, Thompson i wsp., WO 92/16221).

Zmodyfikowane przeciwciała według wynalazku mogą być wytworzone przez reakcję ludzkiego przeciwciała lub fragmentu wiążącego antygen z czynnikiem modyfikującym. Przykładowo, cząsteczki organiczne mogą być związane z przeciwciałem w niespecyficzny sposób przez zastosowanie aminoreaktywnego czynnika modyfikującego, przykładowo estru NHS PEG. Zmodyfikowane ludzkie przeciwciała lub fragmenty wiążące antygen mogą być również wytwarzane przez redukcję wiązań dwusiarczkowych (np. wiązań dwusiarczkowych wewnątrz łańcucha) przeciwciała lub fragmentu wiążącego antygen. Zredukowane przeciwciało lub fragment wiążący antygen może następnie reagować z reaktywnym względem grupy tiolowej czynnikiem modyfikującym z wytworzeniem zmodyfikowanego przeciwciała według wynalazku. Zmodyfikowane ludzkie przeciwciała i fragmenty wiążące antygen zawierające ugrupowanie organiczne związane ze specyficznymi miejscami przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być wytwarzane przy pomocy odpowiednich sposobów, takich jak odwrotna proteoliza (Fisch i wsp., Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992); Werlen i wsp., Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994); Kumaran i ws., Protein Sci., 6(10):2233-2241 (1997); Itoh i wsp., Bioorg. Chem., 24(1):59-68 (1996); Capellas i wsp., Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463 (1997)) i sposoby opisane w Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996).

Kompozycje przeciwciała anty-dwuintegrynowego

Niniejszy wynalazek dostarcza również kompozycji przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego zawierającej przynajmniej jedno, przynajmniej dwa, przynajmniej trzy, przynajmniej cztery, przynajmniej pięć, przynajmniej sześć lub więcej przeciwciał anty-dwuintegrynowych jakie tu opisano i/lub jakie znane są w dziedzinie, dostarczonych w niewystępującej naturalnie kompozycji, mieszaninie lub postaci.

Kompozycje przeciwciała anty-dwuintegrynowego według niniejszego wynalazku mogą ponadto zawierać przynajmniej jedną z jakiejkolwiek odpowiedniej lub skutecznej ilości przynajmniej jednego antagonisty TNF (np. lecz bez ograniczenia przeciwciała dla TNF lub jego fragmentu, rozpuszczalnego receptora TNF lub jego fragmentu, jego białek fuzyjnych lub niskocząsteczkowego antagonisty TNF), środka przeciwreumatycznego (np. metotreksat, auranofina, aurotioglukoza, azatiopryna, etanercept, sodowy tiomaleinian złota, siarczan hydroksychlorochiny, leflunomid, sulafasalazyna), czynnika rozluźniającego mięśnie, narkotyku, niesteroidowego leku przeciwzapalnego (NSAID), leku przeciwbólowego, środka znieczulającego, środka uspokajającego, środka do znieczulania miejscowego, blokera neuro-mięśniowego, środka przeciw mikroorganizmom (np. aminoglikozyd, przeciw grzybom,

PL 213 030 B1 przeciw pasożytom, przeciw wirusom, karbapanem, cefalosporyna, fluorochinolon, makrolid, penicylina, sulfonamid, tetracyklina, inne związki przeciw mikroorganizmom), środka przeciwłuszczycowego, kortykosterydu, sterydu anabolicznego, czynników związanych z cukrzycą, środka mineralnego, substancji odżywczej, czynnika tarczycowego, witaminy, hormonu związanego z wapniem, substancji przeciwbiegunkowej, przeciwkaszlowej, przeciwwymiotnej, przeciwwrzodowej, przeczyszczającego, przeciw krzepnięciu, erytropoetyny (np. epoetyna alfa), filgrastimu (np. G-CSF, Neupogen), sargramostimu (GM-CSF, Leukina), środka do immunizacji, immunoglobuliny, środka hamującego odpowiedź immunologiczną (np. bazyliksymab, cyklosporyna, deklizumab), hormonu wzrostu, leku do hormonalnej terapii zastępczej, modulatora receptora estrogenowego, środka rozszerzającego źrenice, środka porażającego akomodację, czynnika alkilującego, antymetabolitu, inhibitora mitozy, środka radioleczniczego, antydepresyjnego, czynnika przeciw maniom, antypsychotycznego, przeciwlękowego, hipnotycznego, sympatykomimetycznego, pobudzającego, donepenzylu, takryny, leku na astmę, beta agonisty, sterydu wziewnego, inhibitora leukotrienowego, metyloksantyny, kromolinu, epinefryny lub jej analogu, dornazy alfa (pulmozym), cytokiny lub antagonisty cytokiny, lub przeciwciała. Nieograniczające przykłady takich cytokin obejmują, bez ograniczenia, dowolną z cytokin od IL-1 do IL-23, IL-6, przeciwciała przeciwnowotworowego, czynniki chemoterapeutyczne lub leczenie przez napromieniowanie. W dziedzinie dobrze znane są odpowiednie dawkowania. Patrz np. Wells i wsp., wyd., Pharmacotherapy Handbook, 2gie wyd., Appleton i Lange, Stanford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, wydanie Deluxe, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000).

Takie środki przeciwnowotworowe lub przeciwzakaźne mogą również zawierać cząsteczki toksyny, które towarzysza, są związane, współpreparowane lub współpodawane z przynajmniej jednym przeciwciałem według niniejszego wynalazku. Toksyna może ewentualnie działać selektywnie zabijając zmienioną chorobowo komórkę lub tkankę. Zmienioną chorobowo komórką może być komórka nowotworowa lub inna. Takie toksyny mogą być, bez ograniczeń, oczyszczoną lub rekombinowaną toksyną lub fragmentem toksyny zawierającą przynajmniej jedną funkcjonalną, cytotoksyczną domenę toksyny, np. wybraną spośród przynajmniej jednej rycyny, toksyny błonniczej, toksyny jadu lub toksyny bakteryjnej. Termin toksyna obejmuje również zarówno endotoksyny i egzotoksyny wytwarzane przez jakąkolwiek, występującą naturalnie, zmienioną w wyniku mutacji lub rekombinacji bakterię lub wirusa, który może powodować u człowieka i innych ssaków jakiekolwiek stany patologiczne, włącznie z wywołanym toksyną wstrząsem, który może prowadzić do śmierci. Takie toksyny mogą obejmować, lecz bez ograniczeń, enterotoksynogenną wrażliwą na temperaturę enterotoksynę E. coli (LT), termostabilną enterotoksynę (ST), cytotoksynę Shigella, enterotoksynę Aeromonas, toksynę 1 zespołu wstrząsu toksycznego (TSST-1), enterotoksynę A ze Staphylococcus (SEA), B (SEB) lub C (SEC), enterotoksynę z paciorkowca i im podobne. Takie bakterie obejmują, lecz bez ograniczenia, szczepy enterotoksynogenne gatunków E. coli (ETEC), wywołujące biegunkę szczepy E. coli (np. szczepy o serotypie 0157H7), gatunki Staphylococcus (np. Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes), gatunków Shigella (np. Shigella dysenterie, Shigelle flexneri, Shigella boydii i Shigella sonnei), gatunki Salmonella (np. Salmonella typhi, Salmonella cholerae-swis, Salmonella enteritidis), gatunki Clostridium (np. Clostridium perfringens, Clostridium dificile, Clostridium botulinum), gatunki Camphlobacter (np. Camphlobacter jejuni, Camphlobacter fetus), gatunki Heliobaeter (np. Heliobacter pylori), gatunki Aeromonas (np. Aeromonas sobria, Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae), Pleisomonas shigelloides, Yersina enterocolitica, gatunki Vibrio (np. Vibrio cholerae, Vibrios parahemolyticus), gatunki Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa i Streptococcus. Patrz np. Stein, wyd., Internal Medicine, 3cie wyd., str. 1-13, Little Brown i Co., Boston (1990); Evans i wsp., wyd., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control, 2gie wyd., str. 239-254, Plenum Medical Book Co., Nowy Jork (1991); Mandell i wsp., Principles and Practice of Infectious Diseases, 3cie wyd., Churchill Livingstone, Nowy Jork (1990); Berkow i wsp., wyd., The Merck Manual, 16te wyd., Merck i Co., Rahway, NJ., 1992; Wood i wsp., FEMS Microbiology Immunology, 76:121-134 (1990); Marrack i wsp., Science, 248:705-711 (1990).

Związki przeciwciała anty-dwuintegrynowego według niniejszego wynalazku, kompozycje lub kombinacje tu opisane mogą ponadto zawierać przynajmniej jeden z odpowiednich użytecznych dodatków, takich jak, lecz bez ograniczenia, rozcieńczalnik, substancja wiążąca, stabilizująca, bufory, sole, rozcieńczalniki lipofilowe, konserwant, adiuwant lub im podobne. Preferowane są farmaceutycznie dopuszczalne dodatki. Nieograniczające przykłady takich sposobów wytwarzania jałowych roztworów są dobrze znane w dziedzinie tak jak, lecz nie tylko, z Gennaro, wyd., Remington's Pharmaceutical Sciences 18te wyd., Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990. Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki mogą być dobrane rutynowo tak, aby były odpowiednie do sposobu podawania, rozpuszczalnoPL 213 030 B1 ści i/lub stabilności przeciwciała anty-dwuintegrynowego, fragmentu lub kompozycji, jak jest dobrze znane w dziedzinie lub tu opisane.

Farmaceutyczne zaróbki i dodatki użyteczne w niniejszej kompozycji obejmują, lecz bez ograniczenia, białka, peptydy, aminokwasy, lipidy i węglowodany (np. cukry, włącznie z monosacharydami, di-, tri-, tetra- i oligosacharydami; pochodnymi cukrów takimi jak algitole, kwasy aldonikowe, zestryfikowane cukry i im podobne i polisacharydami lub polimerami cukrowymi), które mogą występować pojedynczo lub w kombinacji obejmującej same lub w kombinacji 1-99,99% masy lub objętości. Przykładowo, zaróbki białkowe obejmują albuminę z surowicy taką jak albumina surowicy ludzkiej (HSA), rekombinowana ludzka albumina (rHA), żelatyna, kazeina i im podobne. Reprezentatywne składniki aminokwas/przeciwciało, które mogą również działać na pojemność buforującą, obejmują alaninę, glicynę, argininę betainę, histydynę, kwas glutaminowy, kwas asparaginowy, cysteinę, lizynę, leucynę, izoleucynę, walinę, metioninę, fenyloalaninę, aspartam i im podobne. Preferowanym aminokwasem jest glicyna.

Zaróbki węglowodanowe odpowiednie do zastosowania w wynalazku obejmują, przykładowo, monosacharydy takie jak fruktoza, maltoza, galaktoza, glukoza, D-mannoza, sorboza i podobne; disacharydy takie jak laktoza, sacharoza, trechaloza, cellobioza i podobne; polisacharydy takie jak rafinoza, melezytoza, maltodekstryny, dekstrany, skrobie i podobne oraz alditole takie jak mannitol, ksylitol, maltitol, laktitol, ksylitol, sorbitol (glucytol), mioinozytol i podobne. Preferowanymi zaróbkami węglowodanowymi do zastosowania w niniejszym wynalazku są mannitol, trechaloza i rafinoza.

Kompozycje przeciwciała anty-dwuintegrynowego mogą również zawierać bufor lub czynnik ustalający pH; typowo, buforem jest sól otrzymana z kwasu organicznego lub zasady. Reprezentatywne bufory obejmują sole kwasu organicznego, takie jak sole kwasu cytrynowego, kwasu askorbinowego, kwasu glukonowego, kwasu węglowego, kwasu winowego, kwasu bursztynowego, kwasu octowego lub kwasu ftalowego; Tris, chlorowodorek trometaminy lub bufory fosforanowe. Preferowanymi buforami do zastosowania w niniejszych kompozycjach są sole kwasów organicznych takie jak cytrynian.

Dodatkowo, kompozycje przeciwciała anty-dwuintegrynowego według wynalazku mogą zawierać polimerowe zaróbki/dodatki takie jak poliwinylopirolidony, fikole (polimeryczny cukier), dekstrany (np. cyklodekstryny takie jak 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstryna), glikole polietylenowe, czynniki smakowe, czynniki przeciw mikroorganizmom, słodziki, antyutleniacze, czynniki antystatyczne, substancje powierzchniowo czynne (np. polisorbaty takie jak „TWEEN 20 i „TWEEN 80), lipidy (np. fosfolipidy, kwasy tłuszczowe), steroidy (np. cholesterol) i czynniki chelatujące (np. EDTA).

Te i inne znane zaróbki farmaceutyczne i/lub dodatki odpowiednie do zastosowania w kompozycjach z przeciwciałem anty-dwuintegrynowym lub jego częścią według wynalazku są znane w dziedzinie np. jak wymieniono w „Remington: The Science and Practice of Pharmacy wyd. 19te, Williams i Williams (1995) i w „Physician's Desk Reference wyd. 52., Medical Economics, Montvale, NJ (1998). Preferowanym nośnikiem lub zaróbką są węglowodany (np. sacharydy i alditole) i bufory (np. cytrynianowy) lub czynniki polimeryczne.

Preparaty

Jak określono powyżej opisano tu stabilne preparaty, które są dogodnie buforem fosforanowym z fizjologicznym roztworem soli lub wybraną solą, jak również konserwowane roztwory i preparaty zawierające konserwanty, jak również konserwowane preparaty o różnorodnym zastosowaniu użyteczne do zastosowania farmaceutycznego lub weterynaryjnego, obejmujące przynajmniej jedno przeciwciało anty-dwuintegrynowe w farmaceutycznie akceptowalnym preparacie. Konserwowane preparaty zawierają przynajmniej jeden znany konserwant lub ewentualnie wybrany z grupy składającej się z przynajmniej jednego: fenolu, M-krezolu, P-krezolu, O-krezolu, chlorokrezolu, alkoholu benzylowego, azotynu fenylortęciowego, fenoksyetanolu, formaldehydu, chlorobutanolu, chlorku magnezu (np. heksahydrat), parabenu alkilowego (metylowego, etylowego, propylowego, butylowego i tym podobnwego), chórku benzalkonium, chlorku benzetonium, dehydrooctanu sodowego i timerosalu lub ich mieszanin w rozcieńczalnikach wodnych. Jakiekolwiek odpowiednie stężenie mieszaniny może być użyte, co jest znane w dziedzinie, takie jak 0,001-5% lub jakikolwiek zakres lub wartość w nim zawarta, taka jak, lecz bez ograniczeń, 0,001, 0,003, 0,005, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 17, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9 lub jakimkolwiek zakresie lub wartości w nim zawartej. Nieograniczające przykłady obejmują brak konserwanta, 0,1-2% M-krezolu (np. 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,1-3% alkoholu benzylowego (np. 0,5, 0,9, 1,1, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5%), 001-0,5% timerosalu (np. 0,005, 0,01), 0,001-2,0% fenolu (np. 0,05,

PL 213 030 B1

0,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,0005-1,0% parabenu(parabenów) alkilowych (np. 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005, 0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9, 1,0%) i podobne.

Jak opisano powyżej wynalazek dostarcza wytworu przemysłowego obejmującego opakowanie i przynajmniej jedną fiolkę zawierającą roztwór przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego z zaleconymi buforami i/lub konserwantami, ewentualnie w rozcieńczalniku wodnym, przy czym wspomniane opakowanie zawiera etykietę wskazującą, że taki roztwór może być przechowywany przez okres 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 50, 60, 66, 72 godzin lub dłużej. Ponadto, wynalazek obejmuje wytwór przemysłowy obejmujący opakowanie, pierwszą fiolkę zawierającą zliofilizowane przynajmniej jedno przeciwciało anty-dwuintegrynowe i drugą fiolkę zawierającą wodny rozcieńczalnik wyznaczonego buforu lub konserwanta, przy czym wspomniane opakowanie zawiera etykietę instruującą pacjenta o rekonstytucji przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego w wodnym rozcieńczalniku do postaci roztworu, który może być przechowywany przez 24 godziny lub dłużej.

Przynajmniej jedno przeciwciało anty-dwuintegrynowe stosowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem może być wytworzone przy użyciu technik rekombinacji, włącznie z otrzymywaniem z komórki ssaczej lub preparatów transgenicznych lub może być oczyszczone z innych źródeł biologicznych, jak tu opisano, lub jak jest znane w dziedzinie.

Zakres przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego w produkcie według niniejszego wynalazku obejmuje ilości uzyskiwane po rekonstytucji, jeśli użyty jest system mokry/suchy, stężeń od około 1,0 μg/ml do około 1000 mg/ml, choć niższe i wyższe stężenia są funkcjonalne i zależą od zamierzonego dostarczającego nośnika, np. postaci roztworu będą różniły się od plastra do podawania przezskórnego, podania do płuc, przezśluzówkowego lub przy pomocy pompki osmotycznej lub mikropompki.

Rozcieńczalnik ewentualnie dodatkowo dogodnie zawiera farmaceutycznie akceptowalny konserwant. Zalecane konserwanty obejmują konserwanty wybrane z grupy składającej się z fenolu, M-krezolu, P-krezolu, O-krezolu, chlorokrezolu, alkoholu benzylowego, parabenu alkilowego (metyloego, etyloego, propyloego, butyloego i tym podobnego), chlorku benzalkonium, chlorku benzetonium, dehydrooctanu sodowego i timerosalu lub ich mieszanin. Stężenie konserwantów stosowanych w preparacie jest stężeniem dostatecznym do osiągnięcia działania przeciw mikroorganizmom. Takie stężenia zależą od wybranego konserwanta i są łatwo określane przez biegłego specjalistę.

Inne zaróbki, np. czynniki izotonizujące, bufory, antyutleniacze, związki wzmacniające działanie konserwanta mogą być ewentualnie i dogodnie dodawane do rozcieńczalnika. Czynnik izotonizujący taki jak gliceryna jest powszechnie używany w znanych stężeniach. Fizjologicznie tolerowany bufor jest dogodnie dodawany w celu zapewnienia lepszej kontroli pH. Preparaty mogą mieć szeroki zakres pH, taki jak od około pH 4 do około pH 10 a zalecane zakresy od około pH 5 do około pH 9 i w szczególności zakres od około 6,0 do około 8,0. Korzystne preparaty według niniejszego wynalazku mają pH pomiędzy około 6,8 i około 7,8. Zalecane bufory obejmują bufory fosforanowe, w szczególności fosforan sodowy, szczególnie zbuforowany fosforanem fizjologiczny roztwór soli (PBS).

Inne dodatki, takie jak farmaceutycznie akceptowalne substancje rozpuszczające jak Tween 20 (monolaurynian sorbitanu polioksyetylenu(20)), Tween 40 (monopalmitynian sorbitanu polioksyetylenu(20)), Tween 80 (monooleinian sorbitanu polioksyetylenu(20)), Pluronic F68 (blokowe kopolimery polioksyetylenowo-polioksypropylenowe) i PEG (glikol polietylenowy) lub niejonowe substancje powierzchniowo czynne takie jak polisorbat 20 lub 80 lub poloksamer 184 lub 188, Pluronic® polil, inne blokowe kopolimery i związki chelatujące jak EDTA i EGTA mogą ewentualnie być dodawane do preparatów lub kompozycji w celu ograniczenia agregowania. Te dodatki są szczególnie użyteczne jeśli dla podawania preparatu stosowana jest pompka lub plastikowy zbiornik. Obecność farmaceutycznie akceptowalnej substancji powierzchniowo czynnej ogranicza skłonność białka do agregowania.

Preparaty tu opisane mogą być wytwarzane sposobem obejmującym mieszanie przynajmniej jednego przeciwciała anty- dwuintegrynowego i konserwanta wybranego z grupy składającej się z fenolu, M-krezolu, P-krezolu, O-krezolu, chlorokrezolu, alkoholu benzylowego, parabenu alkilowego, (metylowego, etylowego, propylowego, butylowego i tym podobnego), chlorku banzalkonium, chlorku benzatonium, dehydrooctanu sodowego i timerosalu lub ich mieszanin w wodnym rozcieńczalniku. Mieszanie przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego i konserwanta z wodnym rozcieńczalnikiem jest przeprowadzane przy pomocy tradycyjnych sposobów rozpuszczania i mieszania. Do przygotowania odpowiedniego preparatu, przykładowo, zmierzona ilość przynajmniej jednego

PL 213 030 B1 przeciwciała anty-dwuintegrynowego w zbuforowanym roztworze jest połączona z pożądanym konserwantem w zbuforowanym roztworze w ilościach wystarczających do dostarczenia białka i konserwanta w pożądanych stężeniach. Warianty tego procesu będą dostrzeżone przez specjalistę o przeciętnych umiejętnościach. Przykładowo, kolejność dodawania składników, gdy użyte są dodatkowe dodatki, temperatura i pH, w których preparat jest przygotowany, wszystkie są czynnikami, które mogą być optymalizowane z uwagi na stężenie i sposób podawania.

Opisane tu preparaty mogą być dostarczone pacjentom jako klarowne roztwory lub jako dwie fiolki obejmujące fiolkę ze zliofilizowanym przynajmniej jednym przeciwciałem anty-dwuintegrynowym, które jest rekonstytuowane w drugiej fiolce zawierającej wodny rozcieńczalnik. Zarówno jedna fiolka z roztworem lub dwie fiolki wymagające rekonstytucji mogą być używane wielokrotnie i mogą wystarczać dla jednego lub wielu cykli leczenia pacjenta i co za tym idzie dostarczają dogodniejszego reżimu leczenia niż obecnie dostępny.

Niniejsze zastrzegane wytwory przemysłowe są użyteczne do podawania natychmiastowego lub przez okres 24 godzin lub dłużej. Zgodnie z tym, niniejsze zastrzegane wytwory przemysłowe oferują pacjentowi znaczące korzyści. Preparaty tu opisane mogą ewentualnie być bezpiecznie przechowywane w temperaturach od około 2 do około 40°C i zachowywać aktywność biologiczną białka przez dłuższe okresy czasu, a zatem pozwalają na oznaczenie opakowania wskazujące, że roztwór może być przechowywany i/lub stosowany przez okres 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 lub 96 godzin lub dłużej. Jeżeli stosowany jest rozcieńczalnik z konserwantem, oznaczenie takie może wskazywać zastosowanie przez czas do 1-12 miesięcy, pół roku, rok, półtora roku i/lub dwa lata.

Roztwory przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego według wynalazku mogą być wytwarzane sposobem obejmującym mieszanie przynajmniej jednego przeciwciała w wodnym rozcieńczalniku.

Mieszanie jest przeprowadzone przy pomocy tradycyjnych procedur rozpuszczania i mieszania. W celu przygotowania odpowiedniego rozcieńczalnika, przykładowo, zmierzona ilość przynajmniej jednego przeciwciała w wodzie lub buforze jest łączona w ilościach dostatecznych do dostarczenia białka i ewentualnie konserwanta lub buforu w pożądanych stężeniach. Warianty tego sposobu będą dostrzeżone przez specjalistę o przeciętnych umiejętnościach. Przykładowo, kolejność dodawania składników, czy użyte są dodatkowe dodatki, temperatura i pH, w których przygotowywany jest preparat, wszystkie są czynnikami, które mogą być optymalizowane w celu uzyskania właściwego stężenia i podawania.

Zastrzegane produkty mogą być dostarczone pacjentom jako klarowne roztwory lub jako dwie fiolki obejmujące fiolkę ze zliofilizowanym przynajmniej jednym przeciwciałem anty-dwuintegrynowym, które jest rekonstytuowane w drugiej fiolce zawierającej wodny rozcieńczalnik. Zarówno jedna fiolka z roztworem lub dwie fiolki wymagające rekonstytucji mogą być używane wielokrotnie i mogą wystarczać dla jednego lub wielu cykli leczenia pacjenta i co za tym idzie dostarczają dogodniejszego reżimu leczenia niż obecnie dostępny.

Zastrzegane produkty mogą być dostarczone pacjentom pośrednio przez dostarczenie do aptek, klinik lub innych takich instytucji i ośrodków, przy czym zawierają klarowne roztwory lub podwójne fiolki zawierające fiolkę ze zliofilizowanym, przynajmniej jednym przeciwciałem anty-dwuintegrynowym, które jest rekonstytuowane w drugiej fiolce zawierającej wodny rozcieńczalnik. Klarowny roztwór, w tym przypadku może stanowić do 1 litra lub nawet więcej objętości, zapewniając duży zbiornik, z którego mogą być pobierane raz lub wielokrotnie mniejsze części roztworu przynajmniej jednego przeciwciała w celu przeniesienia do mniejszych zbiorników i dostarczenia przez apteki lub kliniki ich klientom i/lub pacjentom.

Znane urządzenia z systemami z pojedynczą fiolką obejmują iniektory ołówkowe do dostarczania roztworu takie jak BD Pens, BD Autojector®, Humaject®, NovoPen®, B-D®Pen, AutoPen® i OptiPen®, GenotropinPen®, Genotronorm Pen®, Humatro Pen®, Reco-Pen®, Roferon Pen®, Biojector®, iject®, J- tip Needle-Free Injector®, Intraject®, Medi-Ject®, np. jakie wykonano lub opracowano przez Becton Dickensen (Franklin Lakes, NJ, www.bectondickenson.com), Disetronic (Burgdorf, Szwajcaria, www.disetronic.com; Bioject, Portland, Oregon (www.bioject. com);_National Medicla Products, Weston Medical (Peterborough, UK, www.weston-medical.com), Medi-Ject Corp. (Minneapolis, MN, www.mediject.com). Znane urządzenia z systemami dwufiolkowymi obejmują systemy dwufiolkowych iniektorów ołówkowych do rekonstytucji liofilizowanego leku w nabojach do dostarczenia zrekonstytuowanego roztworu, takich jak HumatroPen®.

PL 213 030 B1

Obecnie zastrzegane produkty obejmują opakowania. Opakowanie dostarcza, oprócz informacji wymaganej przez organy nadzoru, warunki w których produkt może być stosowany. Opakowania tu opisane dostarczają pacjentowi instrukcji do rekonstytucji przynajmniej jednego przeciwciała antydwuintegrynowego w rozcieńczalniku wodnym do postaci roztworu i zastosowania roztworu przez okres 2-24 godzin lub dłużej w przypadku dwóch fiolek, mokry/suchy produktu. W przypadku pojedynczej fiolki z produktem w postaci roztworu etykieta wskazuje, że taki roztwór może być użyty przez okres 2-24 godzin. Obecnie zastrzegane produkty są użyteczne do zastosowania farmaceutycznego u ludzi.

Preparaty tu opisane mogą być wytwarzane przy pomocy sposobu obejmującego mieszanie przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego i wybranego buforu, dogodnie buforu fosforanowego zawierającego fizjologiczny roztwór soli lub wybraną sól. Mieszanie przynajmniej jednego przeciwciała i buforu w wodnym rozcieńczalniku jest przeprowadzane przy pomocy dogodnych procedur rozpuszczania i mieszania. W celu przygotowania odpowiedniego preparatu, przykładowo, zmierzona objętość przynajmniej jednego przeciwciała w wodzie lub buforze jest łączona z pożądanym czynnikiem buforującym w wodzie w ilości wystarczającej do dostarczenia białka i buforu w pożądanych stężeniach. Warianty tego procesu będą dostrzeżone przez specjalistę o przeciętnych umiejętnościach. Przykładowo, kolejność dodawania składników, gdzie użyte są dodatkowe dodatki, temperatura i pH, w których przygotowywany jest preparat, wszystkie są czynnikami, które mogą być optymalizowane w celu uzyskania właściwego stężenia i podawania.

Stabilne lub konserwowane preparaty mogą być dostarczane pacjentom jako klarowne roztwory lub jako dwie fiolki zawierające fiolkę z liofilizatem przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego, które jest rekonstytuowane w drugiej fiolce zawierającej konserwant lub bufor i zaróbki w wodnym rozcieńczalniku. Jedna fiolka z roztworem lub dwie fiolki wymagające rekonstytucji mogą być stosowane wielokrotnie i mogą wystarczać dla jednego lub wielu cykli leczenia pacjenta i co za tym idzie dostarczają dogodniejszego reżymu leczenia niż obecnie dostępny.

Przynajmniej jedno przeciwciało anty-dwuintegrynowe albo w stabilnych albo konserwowanych preparatach lub roztworach tu opisanych mogą być podawane pacjentowi zgodnie z niniejszym wynalazkiem przy pomocy różnych sposobów podawania obejmujących zastrzyki SC lub IM; podawanie przezskórne, dopłucne, dośluzówkowe, implanty, pompkę osmotyczną, nabój, mikropompkę lub inne sposoby znane biegłym specjalistom, jak również znane w dziedzinie.

Zastosowania terapeutyczne

Przeciwciało lub kompozycja według wynalazku mogą być przeznaczone do modulowania lub leczenia przynajmniej jednej choroby związanej z dwuintegryną, w komórce, tkance, organie, zwierzęciu lub u pacjenta, jak jest to znane w dziedzinie lub jak tu opisano.

Choroba związana z dwuintegryną może być przynajmniej jedną spośród: otyłości, choroby związanej z układem immunologicznym, choroby sercowo-naczyniowej, choroby zakaźnej, choroby nowotworowej o złośliwym charakterze lub choroby neurologicznej.

Przeciwciało lub kompozycja według wynalazku mogą być przeznaczone do modulowania lub leczenia przynajmniej jednej choroby związanej z układem immunologicznym w komórce, tkance, organie, zwierzęciu lub u pacjenta w tym, lecz bez ograniczenia, przynajmniej jednej spośród: reumatoidalnego zapalenia stawów, młodzieńczego reumatoidalnego zapalenia stawów, uogólnionego zespołu młodzieńczego reumatoidalnego zapalenia stawów, łuszczycowego zapalenia stawów, zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa, wrzodów żołądka, seronegatywnego zwyrodnienia stawów, zapalenia stawów i kości, choroby zapalnej jelit, owrzodzenia jelit, tocznia rumieniowategoukładowego, zespołu antyfosfolipidowego, zapalenia tęczówki i ciała rzęskowego/zapalenia błony naczyniowej oka/zapalenia nerwu wzrokowego, idiopatycznego zwłóknienia płuc, uogólnionego zapalenia naczyń, ziarniniakowatości Wegenera, sarkoidozy, zapalenia jąder/zabiegów odwracalnej wazektomii, choroby alergicznej/atopowej, astmy, algergicznego zapalenia błony śluzowej nosa, egzemy, alergicznego kontaktowego zapalenia skóry, algergicznego zapalenia rogówki, zapalenia płuc z nadwrażliwości, przeszczepów, odrzutu przeszczepu organu, choroby przeszczepu przeciwko gospodarzowi, zespołu ogólnionej odpowiedzi zapalnej, zespołu septycznego, posocznicy wywołanej bakteriami Gram dodatnimi, posocznicy wywołanej bakteriami Gram ujemnymi, posocznicy z ujemnym posiewem, posocznicy wywołanej grzybem, gorączki neutropenicznej, posocznicy moczopochodnej, posocznicy meningokokowej, urazu/krwotoku, oparzenia, ekspozycji na promieniowanie jonizujące, ostrego zapalenia trzustki, zespołu ostrego wyczerpania oddechowego dorosłych, reumatoidalnego zapalenia stawów, wywołanego alkoholem zapalenia wątroby, przewlekłej patologii ze stanem zapalnym, sarkoidoPL 213 030 B1 zy, choroby Crohn'a, anemii sierpowatej, cukrzycy, zapalenia nerek, chorób atopowych, reakcji nadwrażliwości, alergicznego zapalenia błony śluzowej nosa, gorączki siennej, zapalenia błony śluzowej nosa wywołanego przez byliny, zapalenia spojówek, endometriozy, astmy, pokrzywki, uogólnionej anafilaksji, zapalenia skóry, anemii złośliwej, choroby hemolitycznej, trombocytopenii, odrzutu przeszczepu jakiegokolwiek organu lub tkanki, odrzutu przeszczepu nerki, odrzutu przeszczepu serca, odrzutu przeszczepu wątroby, odrzutu przeszczepu trzustki, odrzutu przeszczepu płuc, odrzutu przeszczepu szpiku (BMT), odrzutu allograficznego przeszczepu skóry, odrzutu przeszczepu chrząstki, odrzutu przeszczepu kości, odrzutu przeszczepu jelita cienkiego, odrzutu przeszczepu grasicy, odrzutu przeszczepu przytarczyc, ksenograficznego odrzutu jakiegokolwiek organu lub tkanki, odrzutu allograficznego, reakcji nadwrażliwości przeciw receptorowi, choroby Gravesa, choroby Raynoud'a, cukrzycy typu B niewrażliwej na insulinę, astmy, miastemii, cytotoksyczności zależnej od przeciwciała, reakcji nadwrażliwości typu III, tocznia rumieniowatego układowego, zespołu POEMS (polineuropatii, organomegalii, endokrynopatii, gammopatii monoklonalnej i zespół zmian skóry), polineuropatii, organomegalii, endokrynopatii, gammopatii monoklonalnej i zespołu zmian skóry, zespołu antyfosfolipidowego, pęcherzycy, twardziny skóry, mieszanej choroby tkanki łącznej, idiopatycznej choroby Addison'a, cukrzycy, przewlekłego aktywnego zapalenia wątroby, pierwotnej żółciowej marskości wątroby, bielactwa nabytego, zapalenia naczyń, zespołu otwarcia serca po zawale MI, nadwrażliwości typu IV, kontaktowego zapalenia skóry, zapalenia płuc wywołanego nadwrażliwością, odrzutu allogenicznego, ziarnicy wywołanej organizmami wewnątrzkomórkowymi, wrażliwości na lek, metabolicznej//idiopatycznej choroby Wilsona, hematochromatozy, niedoboru alfa-1-antytrypsyny, retinopatii cukrzycowej, zapalenia tarczycy typu Hashimoto, osteoporozy, oceny osi podwzgórzowo-przysadkowonadnerczowej, pierwotnej żółciowej marskości wątroby, zapalenia tarczycy, zapalenia mózgu i rdzenia, kacheksji, mukowiscydozy, około urodzeniowej przewlekłej choroby płuc, przewlekłej niedrożnościowej choroby płuc (COPD), rodzinnej hematofagocytozy, Iimfohistiocytozy, stanów dermatologicznych, łuszczycy, łysienia, zespołu nefrotycznego, zapalenia nerki, zapalenia kłębuszków nerkowych, ostrej niewydolności nerki, hemodializy, moczówki, toksyczności, stanu przedrzucawkowego, leczenia okt3, leczenia anty-cd3, leczenia cytokiną, chemoterapii, radioterapii, np. w tym lecz bez ograniczenia astenii, anemii, kacheksji i podobnych), przewlekłego zatrucia salicylanem, i podobne. Patrz np. Merck Manual, 12te-17te wydania, Merck and Company, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells i wsp., wyd., 2gie wydanie, Appleton i Lange, Stanford, Conn. (1998, 2000).

Przeciwciało lub kompozycja według wynalazku mogą być również przeznaczone do modulowania lub leczenia przynajmniej jednej choroby sercowo-naczyniowej w komórce, tkance, organie, zwierzęciu lub u pacjenta w tym, lecz bez ograniczenia, przynajmniej jeden spośród następujących: zespół niewydolności serca, zawał mięśnia sercowego, zastoinowa niewydolność serca, udar, udar niedokrwienny, krwawienie, arterioskleroza, miażdżyca tętnic, zwężenie naczynia, cukrzycowa choroba miażdżycowa, nadciśnienie, nadciśnienie tętnicze, nadciśnienie nerkowo-naczyniowe, omdlenie, wstrząs, kiła układu sercowo-naczyniowego, atak serca, serce płucne, pierwotne nadciśnienie płucne, arytmia serca, dodatkowe skurcze przedsionka, migotanie przedsionka, zwłóknienie przedsionka (trwałe lub czasowe), zespół po perfuzji, zapalna odpowiedź na bypas sercowo-płucny, chaotyczny lub wieloogniskowy częstoskurcz przedsionkowy, regularny częstoskurcz o wąskim QRS, specyficzne arytmie, zwłóknienie komorowe, arytmie zależne od pęczków His, blok przedsionkowo-komorowy, blok rozgałęzienia pęczka, choroby niedokrwienne mięśnia sercowego, choroba tętnicy wieńcowej, angina pectoris, zawał mięśnia sercowego, choroba mięśnia sercowego, kardiomiopatia rozstrzeniowa i zastoinowa, kardiomiopatia restrykcyjna, choroby zastawek serca, zapalenie wsierdzia, choroby osierdzia, nowotwory serca, aneuryzmy aorty i obwodowe, rozwarstwienie aorty, zapalenie aorty, wypadanie tylnej części aorty i jej gałęzi, choroby naczyń obwodowych, choroby ze zwężeniami tętnic, choroba ze zwężeniem tętnicy obwodowej, zakrzepowo-zarostowe zapalenie naczynia, funkcjonalne choroby naczyń obwodowych, zjawisko i choroba Raynaud'a, sinica kończyn, czerwienica bolesna kończyn, choroby żył, tromboza żył, żylakowatość żył, przetoka tętniczo-żylna, limfoderma, bolesny obrzęk tkanki tłuszczowej, niestabilna dusznica, uszkodzenie poperfuzyjne, zespół po użyciu pompy, uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne i im podobne. Takie sposoby mogą optymalnie obejmować podawanie skutecznej ilości kompozycji lub farmaceutycznej kompozycji zawierającej przynajmniej jedno przeciwciało anty-dwuintegrynowe komórce, tkance, organowi, zwierzęciu lub pacjentowi potrzebującemu takiego modulowania, postępowania lub leczenia. Opisano tu również sposób do modulowania lub leczenia przynajmniej jednej choroby zakaźnej w komórce, tkance, organie, u zwierzęcia lub pa28

PL 213 030 B1 cjenta w tym lecz bez ograniczenia przynajmniej jednego ostrego lub przewlekłego zakażenia bakteryjnego, ostrego lub przewlekłego procesu pasożytniczego lub zakaźnego, obejmującego zakażenie bakterią, wirusem i grzybem, zakażenie HIV/neuropatię HIV, zapalenie opon, żółtaczki (A, B lub C lub podobne), septyczne zapalenie stawów, zapalenie otrzewnej, zapalenie płuc, zapalenie nagłośni, E.coli 0157:h7, zespół moczówki hemolitycznej/czerwonki trombolitycznej trombocytopenicznej, malarii, gorączki krwotocznej Dengue, leiszmaniozy, trądu, zespołu wstrząsu toksycznego, paciorkowcowego zapalenia mięśni, zgorzeli gazowej, gruźlicy mykobakteryjnej, wewnątrzkomórkowego zakażenia ptasią mykobakterią, zapalenia płuc wywołanego Pneumocystis carinii, choroby zapalnej miednicy, zapalenia jąder/zapalenie najądrzy, Legionella, choroby z Lyme, grypy α, wirusa Epsteina-Barr, zespołu hemafagocytowego, zapalenia mózgu, aseptycznego zapalenia opon i im podobnych.

Przeciwciało lub kompozycja według wynalazku mogą być również przeznaczone do modulowania lub leczenia przynajmniej jednej choroby nowotworowej o charakterze złośliwym w komórce, tkance, organie, zwierzęciu lub u pacjenta w tym, lecz bez ograniczenia, przynajmniej jednej spośród: białaczki, ostrej białaczki, ostrej białaczki Iimfoblastycznej (ALL), ALL z komórek B, komórek T lub FAB, ostrej białaczki szpikowej (AML), przewlekłej białaczki szpikowej (CML), przewlekłej białaczki Iimfocytarnej (CLL), białaczki włochatokomórkowej, zespołu dysplastycznego (MDS), chłoniaka, ziarnicy złośliwej, chłoniaka złośliwego, chłoniaka nieziarniczego, białaczki Burkitt'a, szpiczaka mnogiego, mięsaka Kaposi'ego, raka okrężnicy i odbytnicy, raka trzustki, raka nosogardzieli, złośliwej histocytozy, zespołu paraneoplastycznego/złośliwej hiperkalcemii, nowotworów litych, gruczolakoraka, mięsaków, czerniaka złośliwego, naczyniaka krwionośnego, choroby przerzutującej, wywołanej nowotworem resorpcji kości, wywołanej nowotworem bolesności kości.

Przeciwciało lub kompozycja według wynalazku mogą być również przeznaczone do modulowania lub leczenia przynajmniej jednej choroby neurologicznej w komórce, tkance, organie, u zwierzęcia lub pacjenta w tym, lecz bez ograniczenia, jednej z: chorób neurodegeneracyjnych, stwardnienia rozsianego, migrenowego bólu głowy, AIDS, demencji złożonej, choroby z demielinizacją takiej jak stwardnienie rozsiane i ostre zapalenie rdzenia poprzeczne; zaburzeń pozapiramidowych i móżdżkowych takich jak uszkodzenia systemu korowo-rdzeniowego; choroby węzłów podstawowych; zaburzeń z ruchem hiperkinetycznym takich jak pląsawica Huntingtona i pląsawica starcza; zaburzeń motorycznych wywołanych lekiem takich jak te wywołane lekami blokującymi w OUN receptory dopaminy; zaburzeń z ruchem hipokinetycznym takiej jak choroba Parkinsona; postępującego porażenia nadjądrowego, ubytków strukturalnych móżdżku; degeneracji rdzeniowo-móżdżkowych, takich jak ataksja rdzeniowa, ataksja Friedreicha, degeneracji móżdżkowo-korowych, degeneracji wielosystemowych (Mencela, Dejerine-Thomasa, Shi-Dragera i Machado-Josepha); zaburzeń układowych (choroba Revsum'a, abetalipoprotemia, ataksja, telangiektazja i mitochondrialna choroba wielosystemowa); zaburzeń z demielinizacją kory, takich jak stwardnienie rozsiane, ostre zapalenie rdzenia poprzeczne i zaburzeń jednostki ruchowej takich jak neurogeniczne atrofie mięśniowe (degeneracja komórek rogu przedniego, taka jak amniotropowe stwardnienie boczne, młodociana rdzeniowa atrofia mięśni i młodzieńcza rdzeniowa atrofia mięśni); choroby Alzheimera; zespołu Down'a, zespołu Down'a w wieku średnim, choroby rozlanych ciałek Lewy'ego; demencji starczej typu ciałek Lewy'ego; zespołu Wernicke-Korsakoffa; chronicznego alkoholizmu; choroby Creutzfeldta-Jacoba; podostrego ogólnego zapalenia mózgu ze stwardnieniem, choroby Hallerrorden-Spatza i demencji i im podobnych. Sposoby takie mogą ewentualnie obejmować podanie skutecznej ilości kompozycji lub kompozycji farmaceutycznej zawierającej przynajmniej jedno przeciwciało TNF lub określoną część lub wariant do komórki, tkanki, organu, zwierzęcia lub pacjenta potrzebującego takiego modulowania, postępowania lub leczenia. Patrz np. Merck Manual, wyd. 16te, Merck & Company, Rahway, NJ (19 92).

Jakikolwiek taki sposób może obejmować podawanie skutecznej ilości kompozycji lub kompozycji farmaceutycznej zawierającej przynajmniej jedno przeciwciało anty-dwuintegrynowe komórce, tkance, organowi, zwierzęciu lub pacjentowi potrzebującemu takiej modulacji, postępowania lub leczenia. Taki sposób może ewentualnie obejmować ponadto współpodawanie lub terapię skojarzoną do leczenia chorób immunologicznych, gdzie podawanie wspomnianego przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego, specyficznej jego części lub wariantu, obejmuje ponadto podawanie przed, równocześnie i/lub po przynajmniej jednego wybranego z przynajmniej jednego antagonisty TNF (np. lecz bez ograniczenia przeciwciała dla TNF lub fragmentu, rozpuszczalnego receptora TNF lub fragmentu, białek fuzyjnych, lub małej cząsteczki antagonisty TNF), środka antyreumatycznego (np. metotreksat, auranofina, aurotioglukoza, azatiopryna, etanercept, sodowy tiomaleinian złota, siarczan hydroksychlorochinonu, leflunomid, sulfasalazyna), środka rozluźniającego mięśnie, narkotyku,

PL 213 030 B1 niesteroidowego leku przeciwzapalnego (NSAID), leku przeciwbólowego, środka znieczulającego, środka uspokajającego, środka do znieczulenia miejscowego, blokera neuro-mięśniowego, środka bakteriobójczego (np. aminoglikozyd, środka przeciw grzybom, przeciw pasożytom, przeciw wirusom, karbapenem, cefalosporyna, fluorochinolon, makrolit, penicylina, sulfonamid, tetracyklina, inny środek przeciw mikroorganizmom), przeciwłuszczycowego kortykosteroidu, sterydu anabolicznego, czynnika związanego z cukrzycą, minerału, substancji odżywczej, czynnika tarczycowego, witaminy, hormonu związanego z wapniem, środka przeciw biegunce, przeciwkaszlowego, antyemetycznego, przeciwwrzodowego, przeczyszczającego, antykoagulacyjnego, erytropoetyny (np. erytropoetyna alfa), filgrastimu (np. G-CSF, Neupogen), sargramostimu (GM-CSF, Leukina), środka do immunizacji, immunoglobuliny, środka immunosupresyjnego (np. basiliksimab, cyklosporyna, deklizumab), hormonu wzrostu, leku do hormonalnej terapii zastępczej, modulatora receptora estrogenowego, środka rozszerzającego źrenicę, środka porażającego akomodację, czynnika alkilującego, antymetabolitu, inhibitora mitotycznego, środka radioleczniczego, środka antydepresyjnego, czynnika przeciw maniom, antypsychotycznego, anksiolitycznego, hipnotycznego, sympatomimetycznego, pobudzającego, domepezilu, takryny, leku na astmę, beta agonisty, sterydu wziewnego, inhibitora leukotrienu, metyloksantyny, kromolinu i epinefryny lub analogu dornazy alfa (Pulmozym), cytokiny lub antagonisty cytokiny. Użyteczne dawki są dobrze znane w dziedzinie. Patrz, np. Wells i wsp., wyd. Pharmacotherapy Handbook, drugie wyd., Appleton i Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, wydanie Delux, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000).

Antagoniści TNF odpowiedni w niniejszym wynalazku obejmują, lecz bez ograniczenia, przeciwciała anty-TNF, ich fragmenty wiążące antygen i cząsteczki receptora, które wiążą się specyficznie z TNF; związki zapobiegające i/lub hamujące syntezę TNF, uwalnianie TNF lub działanie na docelowe komórki, takie jak talidomid, tenidap, inhibitory fosfodiesterazy (np. pentoksyfylinę i rolipram), agoniści receptora adenozynowego A2b oraz związki pobudzające receptor adenozynowy A2b; związki zapobiegające i/lub hamujące sygnalizacje przez receptor TNF takie jak inhibitory kinazy białkowej aktywowanej przez mitogen (MAP); związki blokujące i/lub hamujące cięcie błonowego TNF, takie jak inhibitory metaloproteinazy; związki blokujące i/lub hamujące aktywność TNF, takie jak inhibitory enzymu przekształcającego angiotensynę (ACE) (np. kaptopril) i związki, które blokują i/lub hamują wytwarzanie TNF i/lub syntezę takie jak inhibitory MAP kinazy.

W użytym tu znaczeniu „przeciwciało czynnika martwicy nowotworu, „przeciwciało dla TNF, „przeciwciało dla TNFa lub fragment i podobne zmniejsza, blokuje, hamuje, łagodzi lub wpływa na aktywność TNFa in vitro, in situ i/lub dogodnie in vivo. Przykładowo, użyteczne ludzkie przeciwciało dla TNF tu opisane może wiązać TNFa i obejmować przeciwciała anty-TNF, ich fragmenty wiążące antygen i określone, zmienione w wyniku mutacji postaci lub jego domeny wiążące się specyficznie z TNFa. Użyteczne przeciwciało TNF lub fragment mogą również zmniejszać blokowanie, znosić, wpływać, zapobiegać i/lub hamować syntezę RNA, DNA lub białka dla TNF, uwalnianie TNF, sygnalizację przez receptor TNF, cięcie błonowego TNF, aktywność TNF, wytwarzanie TNF i/lub syntezę.

Chimerowe przeciwciało cA2 zawiera region zmienny wiążący antygen o wysokim powinowactwie neutralizujący mysie przeciwciało IgG1 przeciw ludzkiemu TNFa, oznaczone A2 i regiony stałe ludzkiej immunoglobuliny kappa IgG1. Region Fe ludzkiej IgGl udoskonala efektorową funkcję allogenicznego przeciwciała, zwiększa okres półtrwania w krążącej surowicy i zmniejsza immunogenność przeciwciała. Zachłanność wiązania i specyficzność epitopowa chimerowego przeciwciała cA2 pochodzi z regionu zmiennego mysiego przeciwciała A2. W szczególnej postaci preferowane źródło kwasów nukleinowych kodujących region zmienny mysiego przeciwciała A2 to linia komórkowa hybrydomy A2.

Chimerowe A2 (cA2) neutralizuje cytotoksyczny efekt zarówno naturalnego jak i rekombinowanego ludzkiego TNFa w sposób zależny od dawki. Z oznaczeń wiązania chimerowego przeciwciała cA2 i rekombinowanego ludzkiego TNFa obliczono stałą powinowactwa chimerowego przeciwciała cA2 wynoszącą 1,04 x 10¹⁰ M^-1. Zalecane sposoby określania specyficzności monoklonalnego przeciwciała i powinowactwa przez hamowanie kompetycyjne można znaleźć w Harlow i wsp., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nowy Jork, 1988; Colligan i wsp., wyd., Current Protocols in Immunology, Green Publishing Assoc, and Willey Interscience, Nowy Jork, (1992-200); Kozbor i wsp., Immunol. Today, 4:72-79 (1983); Ausubel i wsp., wyd. Current Protocols in Molecular Biology, Willey Interscience, Nowy d Jork (1987-200) i Muller, Meth. Enzymol., 92,-589-601 (1983).

PL 213 030 B1

W szczególnej postaci mysie przeciwciało monoklonalne A2 jest wytworzone przez linię komórkową oznaczoną c134A. Przeciwciało chimerowe cA2 produkowane jest przez linię komórkową oznaczoną jako c168A.

Dodatkowymi przykładami monoklonalnych przeciwciał anty-TNF, które mogą być użyte w niniejszym wynalazku są przeciwciała opisane w pracach naukowych (patrz np. patent USA nr 5,231,024; Molier, A. i wsp., Cytokine 2(3):162-169 (1990); zgłoszenie USA nr 07/394,852 (złożone 11 września 1992); Rathjen i wsp., Publikacja Międzynarodowa No WO 91,02078 (opublikowana 21 lutego 1991); Rubin i wsp., EPO Publikacja Patentowa Nr 0 218 868 (opublikowana 22 kwietnia 1987); Yone i wsp., Publikacja Patentowa EPO Nr 0 288 088 (26 październik, 1988); Liang i wsp., Biochem. Biophys. Res. Comm. 137:847-854 (1986); Meager i wsp., Hybridoma 6:305-311 (1987); Fendly i wsp., Hybridoma 6:359-369 (1987); Bringman, i wsp., Hybridoma 6:489-507 (1987) i Hirai i wsp., J. Immunol. Meth. 96:57-62 (1987).

Cząsteczki receptora TNF

Zalecane cząsteczki receptora TNF użyteczne w niniejszym wynalazku to takie, które wiążą TNFa z wysokim powinowactwem (patrz np. Feldmann i wsp., Międzynarodowa Publikacja Nr WO 92/07076 (opublikowana 30 kwietnia 1992); Schall i wsp., Cell 61:361-370 (1990) i Loetscher i wsp., Cell 61:351-359 (1990) i ewentualnie posiadają niską immunogenność. W szczególności powierzchniowe receptory komórkowe TNF 55 kDa (p55 TNF-R) i 75 kDa (p75 TNF-R) są użyteczne w niniejszym wynalazku. Skrócone postaci tych receptorów zawierające zewnątrzkomórkowe domeny receptorów (ECD) lub ich funkcjonalne części (patrz np. Corcoran i wsp., Eur. J. Biochem. 223:831-840 (1994)) są również użyteczne w niniejszym wynalazku. Skrócone postaci receptorów TNF zawierające EDC zostały wykryte w moczu i w surowicy jako inhibitorowe białka wiążące TNFa o masie 30 kDa i 40 kDa (Engelman, H. i wsp., J. Biol. Chem. 265:1531-1536 (1990)). Multimeryczne cząsteczki receptora TNF i cząsteczki fuzyjne immunoreceptora TNF oraz pochodne i fragmenty lub ich części są dodatkowymi przykładami cząsteczek receptora TNF użytecznych w niniejszym wynalazku. Cząsteczki receptora TNF, które mogą być użyte w wynalazku charakteryzują się zdolnością do leczenia pacjentów przez wydłużony okres czasu z dobrym do doskonałego łagodzeniem objawów i niską toksycznością. Niska immunogenność i/lub wysokie powinowactwo, jak również inne nieokreślone właściwości mogą przyczyniać się do osiąganych wyników terapeutycznych.

Multimeryczne cząsteczki receptora TNF użyteczne w niniejszym wynalazku obejmują całą lub funkcjonalną część ECD dwóch lub większej liczby receptorów TNF połączonych jednym lub większą liczbą łączników polipeptydowych lub innych nie-peptydowych łączników takich jak glikol polietylenowy (PEG). Multimeryczne cząsteczki mogą ponadto zawierać peptyd sygnałowy wydzielanego białka aby kierowywał ekspresję multimerycznej cząsteczki. Te multimeryczne cząsteczki i sposoby ich wytwarzania zostały opisane w zgłoszeniu USA Nr 08/437,533 (złożonym 9 maja 1995).

Cząsteczki fuzyjne immunoreceptora TNF użyteczne w niniejszym wynalazku obejmują przynajmniej jedną część lub więcej cząsteczek immunoglobulin i cały lub funkcjonalną część jednego lub większej liczby receptorów TNF. Te cząsteczki fuzyjne immunoreceptora mogą być złożone jako monomery lub hetero- lub homomultimery. Cząsteczki fuzyjne immunoreceptora mogą być również jednowartościowe lub wielowartościowe. Przykładem takiej cząsteczki fuzyjnej immunoreceptora TNF jest receptor TNF/białko fuzyjne IgG. Cząsteczki fuzyjne immunoreceptora TNF i sposoby ich wytwarzania zostały opisane w literaturze naukowej (Lesslauer i wsp., Eur. J. Immunol. 21:2883-2886 (1991); Ashkenazi i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539 91994); Butler i wsp., Cytokine 6(6):616-623 (1994); Baker i wsp., Eur. J. Immunol. 24:2040-2048 (1994); Beutler i wsp., patent U.S. Nr 5,447,851; i Zgłoszenie Patentowe U.S. Nr 08/442,133 (złożone 16 maja 1995)). Sposoby wytwarzania cząsteczek fuzyjnych immunoreceptora można również znaleźć w Capon i wsp., Patent U.S. Nr 5,116,964; Capon i wsp., Patent U.S. Nr 5,225,538; i Capon i wsp., Nature 337:525-531 (1989).

Funkcjonalny równoważnik, pochodna, fragment lub region cząsteczki receptora TNF dotyczy części cząsteczki receptora TNF lub części sekwencji cząsteczki kodującej cząsteczkę receptora TNF, która jest dostatecznie duża i posiada sekwencję funkcjonalnie przypominającą cząsteczki receptora TNF, które mogą być użyte w niniejszym wynalazku (np. wiążą TNFa z wyższym powinowactwem i posiadają niższą immunogenność). Funkcjonalny równoważnik cząsteczki receptora TNF obejmuje również zmodyfikowane cząsteczki receptora TNF, które funkcjonalnie przypominają cząsteczki receptora TNF, które mogą być użyte w niniejszym wynalazku (np. wiążą TNFa z wysokim powinowactwem i posiadają niską immunogenność). Przykładowo funkcjonalny równoważnik cząsteczki receptora TNF może posiadać „milczący kodon lub jedną lub więcej podstawień aminokwasowych, delecji lub inserPL 213 030 B1 cji (np. jeden aminokwas zastąpiony innym aminokwasem, lub podstawienie jednego kodonu kodującym ten sam lub inny hydrofobowy aminokwas innym kodonem kodującym hydrofobowy aminokwas). Patrz Ausubel i wsp., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc, and WileyInterscience, Nowy Jork (1987-2000).

Cytokiny obejmują jakiekolwiek znane cytokiny. Patrz np. CopewithCytokines.com. Antagoniści cytokiny obejmują lecz bez ograniczenia jakiekolwiek przeciwciało, fragment lub mimetyk, jakikolwiek rozpuszczalny receptor, fragment lub mimetyk, jakiegokolwiek antagonistę niskocząsteczkowego lub jakąkolwiek ich kombinację.

Postępowania terapeutyczne

Przeciwciało lub kompozycja według wynalazku mogą być stosowane w sposobie leczenia choroby zależnej od dwuintegryny obejmującym podawanie skutecznej ilości przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego lub kompozycji komórce, tkance, organowi, zwierzęciu lub pacjentowi tego potrzebującemu. Taki sposób może ewentualnie ponadto obejmować współpodanie lub terapię skojarzoną do leczenia takich chorób immunologicznych, w których podawanie wspomnianego przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego, lub specyficznej jego części lub kompozycji obejmuje ponadto podawanie przed, równocześnie i/lub później przynajmniej jednego spośród: antagonisty TNF (np. lecz bez ograniczenia przeciwciała dla TNF lub fragmentu, rozpuszczalnego receptora TNF lub fragmentu, ich białek fuzyjnych lub antagonisty niskocząsteczkowego TNF), czynnika antyreumatycznego (np. metotreksat, auranofina, aurotioglukoza, azatiopryna, etanercept, sodowy tiomaleinian złota, siarczan hydroksychlorochinonu, leflunomid, sufasalazyna), czynnika rozluźniającego mięśnie, narkotyku, niesterydowego leku przeciwzapalnego (NSAID), leku przeciwbólowego, środka znieczulającego, środka uspokajającego, środka znieczulającego miejscowo, blokera mięśniowo nerwowego, środka przeciwbakteryjnego (np. amino glikozyd, środek przeciw grzybom, przeciw pasożytom, przeciw wirusom, karbapanem, cefalosporyna, fluorochinolon, makrolid, penicylina, sulfonamid, tetracyklina, inny środek przeciwbakteryjny), przeciwłuszczycowego kortykosteroidu, sterydu anabolicznego, czynnika związanego z cukrzycą, minerału, środka odżywczego, czynnika tarczycowego, witaminy, hormonu zależnego od wapnia, preparatu przeciwbiegunkowego, przeciwkaszlowego, środka przeciwwymiotnego, przeciwwrzodowego, środka przeczyszczającego, antykoagulacyjnego, erytropoetyny (np. epoetyna alfa), filgrastimu (np. G-CSF, Neupogen), sargramostimu (GM-CSF, Leukina), preparatu do immunizacji, immunoglobuliny, środka immunosupresyjnego (np. basiliksimab, cyklosporyna, deklizumab), hormonu wzrostu, leku do hormonalnej terapii zastępczej, modulatora receptora estrogenowego, środka rozszerzającego źrenice, środka porażającego akomodację, czynnika alkilującego, antymetabolicznego, inhibitora mitozy, środka radioleczniczego, antydepresyjnego, czynnika przeciw maniom, antypsychotycznego, przedwiekowego, hipnotycznego, symaptomimetycznego, pobudzającego, donepezilu, takrynu, leku na astmę, beta agonisty, sterydu wziewnego, inhibitora leukotrienowego, metylksantyny, kromolinu, epinefryny lub jej analogu, dornazy alfa (pulmozyn), cytokiny lub antagonisty cytokiny.

Typowo leczenie stanów patologicznych przeprowadzane jest przez podawanie skutecznej ilości lub dawki kompozycji przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego, które łącznie, przeciętnie w zakresie od przynajmniej około 0,01 do 500 mg przynajmniej jednego przeciwciała antydwuintegrynowego na kg masy ciała pacjenta na dawkę i dogodnie od przynajmniej około 0,1 do 100 mg przeciwciała/kg pacjenta na pojedyncze lub wielokrotne podanie zależnie od specyficznej aktywności zawartej w kompozycji. Alternatywnie, skuteczne stężenie w surowicy może obejmować 0,1 - 5 000 gg/ml surowicy na jedno lub wiele podań. Użyteczne dawkowania są znane praktykującym lekarzom i będą oczywiście zależały od szczególnego stanu chorobowego, specyficznej aktywności podawanej kompozycji i szczególnego sposobu leczenia pacjenta. W pewnych sytuacjach w celu osiągnięcia pożądanej terapeutycznej ilości może być niezbędne dostarczenie wielu powtarzanych podań, np. powtarzających się pojedynczych podań w szczególnie monitorowanych lub odmierzonych dawkach, gdzie pojedyncze podania są powtarzane aż do osiągnięcia pożądanej dziennej dawki lub skutku.

Szczególne dawki mogą ewentualnie obejmować 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 i/lub 100-500 mg/kg/podanie lub jakikolwiek zakres, wartość lub jej frakcja lub do osiągnięcia stężenia w surowicy 0,1, 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5, 2,9, 3,0, 3,5, 3,9, 4,0, 4,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5,

PL 213 030 B1

9,9, 10,0, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 20, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14,0, 14,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0,

6.5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10,0, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 20, 12,5, 12,9, 13,0,

13.5, 13,9, 14,0, 14,5, 15, 15,5, 15,9, 16, 16.5, 16,9, 17, 17,5, 17,9, 18, 18,5, 18,9, 19, 19,5, 19,9, 20,

20.5, 20,9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 i/lub 5000 gg/ml stężenia w surowicy na jedną lub wiele podań lub w jakimkolwiek zakresie, wartości lub jego frakcji.

Alternatywnie, podawane dawkowanie może różnić się zależnie od znanych czynników, takich jak charakterystyka farmakodynamiczna szczególnego czynnika oraz jego sposób i droga podawania; wiek, zdrowie i masa biorcy; charakter i zasięg objawów, rodzaj równoczesnego leczenia, częstotliwości leczenia i pożądanego skutku. Zazwyczaj dawka aktywnego składnika może wynosić około 0,1 do 100 miligramów na kilogram masy ciała. Zwykle 0,1 do 50 i dogodnie 0,1 do 100 miligramów na kilogram masy ciała. Dla uzyskania pożądanych wyników jest zwykle skuteczne 0,1 do 50 i dogodnie 0,1 do 10 miligramów na kilogram na podanie lub w postaci podtrzymującej uwalnianie.

Jako nieograniczający przykład, leczenie ludzi i zwierząt może być przeprowadzone z zastosowaniem jednokrotnej lub okresowej dawki przynajmniej jednego przeciwciała według niniejszego wynalazku wynoszącej 0,1 do 100 mg/kg. Tak jak 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 lub 100 mg/kg na dzień przynajmniej w dniu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, lub alternatywnie lub dodatkowo w tygodniu 1-52, lub alternatywnie, albo dodatkowo przynajmniej w jednym z lat 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 lub 20 lub jakiejkolwiek ich kombinacji przy pomocy pojedynczego wlewu lub powtórzonych dawek.

Postać dawkowania (kompozycja) użyteczna do podawania wewnętrznego ogólnie zawiera od około 0,1 mg do około 500 mg aktywnego składnika na jednostkę lub pojemnik. W tych kompozycjach farmaceutycznych aktywny składnik będzie zazwyczaj występował w ilości około 0,5-99,999% na podstawie masy całkowitej kompozycji.

W przypadku podawania pozajelitowego przeciwciało może być preparowane jako roztwór, zawiesina, emulsja lub liofilizowany proszek, w połączeniu lub niezależnie, z farmaceutycznie akceptowalnym nośnikiem do podania pozajelitowego. Przykładami takich nośników są woda, fizjologiczny roztwór soli, roztwór Ringera, roztwór dekstrozy i 1-10% albumina surowicy ludzkiej. Użyte mogą być również liposomy i nie-wodne nośniki takie jak utrwalone oleje. Nośnik lub zliofilizowany proszek może zawierać dodatki zapewniające izotoniczność (np. chlorek sodu, mannitol) i stabilność chemiczną (bufory i konserwanty). Preparat sterylizuje się przy pomocy znanej lub dogodnej techniki.

Dogodne nośniki farmaceutyczne są opisane w najnowszym wydaniu Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, typowy tekst referencyjny z tej dziedziny.

Alternatywne podawanie

Wiele znanych i opracowanych sposobów może być użytecznych w niniejszym wynalazku do podawania farmaceutycznie skutecznej ilości przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego według niniejszego wynalazku. Gdy w poniższym opisie stosowane jest podawanie dopłucne, inne sposoby podawania mogą być użyte w niniejszym wynalazku z odpowiednimi wynikami.

Przeciwciała anty-dwuintegrynowe według niniejszego wynalazku mogą być dostarczone w nośniku jako roztwór, emulsja, koloid lub zawiesina, lub jako suchy proszek, przy pomocy jakiegokolwiek z różnorodnych urządzeń i sposobami dogodnymi do podawania przez inhalację lub innymi opisanymi tu sposobami lub znanymi w dziedzinie.

Preparaty pozajelitowe i podawanie

Preparaty do podawania pozajelitowego mogą zawierać jako zwykłe zaróbki jałową wodę lub fizjologiczny roztwór soli, glikole polialkilenowe, takie jak glikol polietylenowy, oleje pochodzenia roślinnego, uwodornione naftaleny i im podobne. Wodne lub olejowe zawiesiny do wstrzyknięć mogą być wytwarzane przy pomocy odpowiedniego emulgatora lub nawilżacza i czynnika zawieszającego zgodnie ze znanymi sposobami. Czynniki do wstrzyknięć mogą być nietoksycznymi, nieprzeznaczonymi do podawania doustnego czynnikami rozpuszczającymi, takimi jak roztwór wodny lub jałowy roztwór do wstrzyknięć lub zawiesina w rozcieńczalniku. Jako użyteczne nośniki lub rozcieńczalniki dopuszczalne są woda, roztwór Ringera, izotoniczny fizjologiczny roztwór soli itp.; jako zwykły rozcieńczalnik lub rozcieńczalnik zawieszający użyty może być jałowy, nielotny olej. Do tego celu może być użyty jakikolwiek rodzaj nielotnego oleju i kwasu tłuszczowego, w tym naturalny lub syntetyczny lub semisyntetyczne oleje tłuszczowe lub kwasy tłuszczowe; naturalne lub syntetyczne lub semi-syntetyczne

PL 213 030 B1 mono- lub di- lub tri-glicerydy. Pozajelitowe podawanie jest znane w dziedzinie i obejmuje, lecz bez ograniczenia, tradycyjne środki wstrzyknięć, urządzenie do wstrzyknięć ciśnieniowych bez igły, jak opisano w patencie USA Nr 5,851,198 i przy pomocy urządzenie laserowe jak opisano w patencie USA Nr 5,839,446.

Alternatywne dostarczanie

Wynalazek ponadto dotyczy podawania przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego drogą podania pozajelitowego, podskórnego, domięśniowego, dożylnego, dostawowego, dooskrzelowego, do wnętrza brzucha, dotorebkowego, dochrząstkowego, do jamy ciała, dotrzewnowego, do mięśnia sercowego, do kości, domiednicznego, doosierdziowego, dootrzewnowego, do opłucnej, do stercza, dopłucnego, doodbytniczego, donerkowego, dosiatkówkowego, dordzeniowego, domaziówkowego, do klatki piersiowej, domacicznego, dopęcherzowego, w dużej dawce, dopochwego, odbytowego, policzkowego, podjęzykowego, donosowego lub przezskórnego. Przynajmniej jedna kompozycja przeciwciała anty-dwuintegrynowego może być przygotowana do zastosowania pozajelitowego (podskórnego, domięśniowego lub dożylnego) lub jakiegokolwiek innego podawania, szczególnie w postaci ciekłych roztworów lub zawiesin do podawania dopochwowego lub doodbytniczego szczególnie w semi-stałych postaciach takich jak, lecz bez ograniczenia, kremy i czopki do podawania dopoliczkowego lub podjęzykowego, takich jak, lecz bez ograniczenia, postaci tabletek lub kapsułek lub donosowego takich jak, lecz bez ograniczenia, postaci proszków, kropli do nosa lub aerozoli lub określonych czynników lub podawania podskórnego, takiego jak, lecz bez ograniczenia, żele, maści, płyny, zawiesiny lub system dostarczania przez plaster z chemicznymi substancjami wspomagajacymi takimi jak dimetylosulfotlenek, aby zarówno modyfikować strukturę skóry lub zwiększać stężenie leku przy podawaniu przez skórę przy pomocy plastra (Junginger, i wsp., w „Drug Permeation Enhancement wyd. Hsieh, D.S., str. 59-90 (Marcel Dekker, Inc. Nowy Jork 1994) lub czynniki utleniające umożliwiające podanie postaci zawierających białka i peptydy na skórę (WO 98/53847) lub zastosowania pola elektrycznego do stworzenia przejściowych szlaków transportu tak jak elektroporacja lub do zwiększenia ruchliwości posiadających ładunek leków, przez skórę, tak jak jonoforeza lub ultradźwięków, tak jak sonoforeza (Patent U.S. Nr 4,309,989 i 4,767,402).

Podanie dopłucne/donosowe

W przypadku podawania dopłucnego dogodnie dostarczona jest przynajmniej jedna kompozycja przeciwciała anty-dwuintegrynowego o wielkości cząsteczek skutecznej do osiągnięcia dolnych dróg oddechowych, płuc lub zatok. Zgodnie z wynalazkiem przynajmniej jedno przeciwciało anty-dwuintegrynowe może być dostarczone przy pomocy jakiejkolwiek z różnorodnych inhalacji lub urządzeń do podawania do nosa znanych w dziedzinie do podawania czynnika leczniczego przez inhalację. Urządzenia zdolne do odkładania rozpylonych postaci w jamie zatok lub pęcherzykach płucnych pacjenta obejmują inhalatory odmierzające dawki, nebulizery, wytwornice suchego proszku, spray'e i im podobne. Inne urządzenia użyteczne do podawania przeciwciała do nosa lub płuc są również znane w dziedzinie. Wszystkie takie urządzenia mogą wykorzystywać preparaty odpowiednie do podania w postaci zawieszonej przeciwciała w aerozolu. Takie aerozole mogą być zawarte zarówno w roztworach (zarówno wodnych i nie wodnych) lub jako cząsteczki stałe. Inhalatory odmierzające dawkę, takie jak odmierzający dawkę inhalator Ventolin®, typowo wykorzystują jako propelent gaz i wymagają uruchomienia podczas wdechu (patrz np. WO 94/16970, WO 98/35888). Pojemniki z suchym proszkiem jak Turbuhalter™ (Astra), Rotahalter®, Diskus® (Glaxo), Spiros™ (Dura), urządzenia sprzedawane przez Inhale Therapeutic oraz Spinhaler® będący pojemnikiem z proszkiem (Fisons) wykorzystują uruchamianie mieszaniny proszku oddechem (USA 4668218 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, USA 5458135 Inhale, WO 94/06498 Fisons. Nebulizery jak AERx™ Aradigm, nebulizer Ultravent® (Mallinckrodt) i nebulizer Acorm II (Marquest Medical Products) (USA 5404871 Aradigm, WO 97/22376), wytwarzają aerozole z roztworów, podczas gdy inhalatory odmierzające dawkę, inhalatory suchego proszku, itp. wytwarzają małe cząsteczki aerozoli. Te specyficzne przykłady komercyjnie dostępnych urządzeń dla inhalacji zostały przedstawione w celu reprezentacji specyficznych urządzeń użytecznych do realizacji tego wynalazku i nie mają na celu ograniczania zakresu wynalazku. Dogodnie kompozycja zawierająca przynajmniej jedno przeciwciało anty-dwuintegrynowe dostarczana jest przez inhalator z suchym proszkiem lub spray. Istnieje szereg pożądanych właściwości urządzenia dla inhalacji do podawania przynajmniej jednego przeciwciała według niniejszego wynalazku. Przykładowo, dostarczenie przy pomocy urządzenia do inhalacji jest preferowane z uwagi na powtarzalność i dokładność. Urządzenie do inhalacji może ewentualnie do34

PL 213 030 B1 starczać małe, suche cząsteczki np. mniejsze niż około 10 μm, dogodnie około 1-5 μm, w celu dobrego pobierania przez wdychanie.

Podawanie kompozycji przeciwciała anty-dwuintegrynowego jako spray

Spray zawierający kompozycję przeciwciała anty-dwuintegrynowego może być wytworzony przez wyrzucenie zawiesiny lub roztworu przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego, pod ciśnieniem, przez dyszę. Wielkość i kształt dyszy, podawane ciśnienie i szybkość podawania roztworu może być dobrana w celu uzyskania pożądanego wyrzutu i wielkości cząsteczek. Elektrospray może być wytworzony przykładowo polem elektrycznym w połączeniu z kapilarą lub dyszą. Dogodnie, cząsteczki kompozycji białkowej przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego dostarczone jako spray mają wielkość cząsteczek mniejszą niż około 10 μm, dogodnie są w zakresie około 1 μm do 5 (im i w szczególności około 2 μm do około 3 μm.

Preparaty kompozycji białkowej przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego użyteczne do zastosowania jako spray typowo obejmują białkową kompozycję przeciwciała w roztworze wodnym w stężeniu około 0,1 mg do około 100 mg kompozycji białkowej przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego na ml roztworu lub mg/g lub jakimkolwiek zakresie lub tej wartości np. lecz bez ograniczenia 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 lub 100 mg/ml lub mg/g. Preparat może zawierać czynniki takie jak zaróbka, bufor, czynnik izotoniczny, konserwant, substancję powierzchniowo czynną i dogodnie cynk. Preparat może zawierać również zaróbkę lub czynnik stabilizujący białkową kompozycję przeciwciała, takie jak bufor, czynnik redukujący, białko wypełniające lub węglowodan. Białko wypełniające użyteczne do przygotowywania białkowych kompozycji przeciwciała obejmuje albuminę, protaminę lub tym podobne. Typowo węglowodany użyteczne do przygotowywania białkowych kompozycji przeciwciała obejmują sacharozę, mannitol, laktozę, trechalozę, glukozę i im podobne. Preparat białkowej kompozycji przeciwciała może również zawierać substancję powierzchniowo czynną, która może redukować lub zapobiegać powierzchniowo-indukowanej agregacji białkowej kompozycji przeciwciała powodowanej przez rozpylenie roztworu tworzącego aerozol. Zastosowane mogą być różne tradycyjne substancje powierzchniowo czynne takie jak estry polioksyetylenowe kwasu tłuszczowego i alkohole oraz estry polioksyetylenowe sorbitolu i kwasu tłuszczowego. Ilości będą zazwyczaj mieściły się w zakresie pomiędzy 0,001 i 14% masy preparatu. Szczególnie dogodne substancje powierzchniowo czynne dla celów tego wynalazku stanowią monooleinian sorbitanu polioksyetylenu, polisorbat 80, polisorbat 20 lub podobne. Dodatkowe czynniki znane w dziedzinie do preparowania białek takich jak przeciwciała anty-dwuintegrynowe lub specyficzne części lub warianty mogą również być uwzględnione w preparacie.

Podanie kompozycji przeciwciała anty-dwuintegrynowego nebulizerem

Białkowa kompozycja przeciwciała może być podawana przy pomocy nebulizera, takiego jak nebulizer odrzutowy lub nebulizer ultradźwiękowy. Typowo, w nebulizerze odrzutowym źródło sprężonego powietrza jest stosowane do wytworzenia o odrzutu z dużą prędkością powietrza przez wylot. Gdy gaz wydostaje się przez dyszę powstaje strefa obniżonego ciśnienia wyciągająca roztwór białkowej kompozycji przeciwciała przez kapilarną rurkę połączoną z pojemnikiem z cieczą. Strumień cieczy z kapilary jest rozdzielany na niestabilne ciągi i kropelki podczas wydostawania się z rurki z wytworzeniem aerozolu. W celu osiągnięcia pożądanej charakterystyki danego nebulizera można zastosować odpowiedni zakres konfiguracji, tempo przepływu i rodzaj hamowania. W nebulizerze ultradźwiękowym energia elektryczna o wysokiej częstotliwości jest wykorzystywana do wytworzenia wibracji, energii mechanicznej, typowo wykorzystując transduktor piezoelektryczny. Energia ta jest przenoszona do preparatu białkowej kompozycji przeciwciała zarówno bezpośrednio lub przez fluid sprzęgający z wytworzeniem aerozolu zawierającego białkową kompozycję przeciwciała. Dogodnie, cząsteczki białkowej kompozycji przeciwciała wytwarzane przez nebulizer mają wielkość cząsteczek mniejszą niż około 10 nm, dogodnie w zakresie około 1 nm do około 5 nm i w szczególności około 2 nm do około 3 nm.

Preparaty przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego użyteczne do zastosowania z nebulizerem, zarówno odrzutowym jak i ultradźwiękowym, typowo zawierają przynajmniej jedno białko przeciwciała anty-dwuintegrynowego w stężeniu około 0,1 mg do około 100 mg na ml roztworu. Preparat może zawierać czynniki takie jak zaróbka, bufor, czynnik izotoniczny, konserwant, substancja powierzchniowo czynna i dogodnie cynk. Preparat może również zawierać zaróbkę lub czynnik do stabilizowania kompozycji białkowej przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego taki jak bufor, czynnik redukujący, białko wypełniające lub węglowodan. Białka wypełniające użyteczne w preparatach białkowych kompozycji przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego

PL 213 030 B1 obejmują albuminę, protaminę lub im podobne. Typowo węglowodany użyteczne w preparacie przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego obejmują sacharozę, mannitol, laktozę, trechalozę, glukozę lub im podobne. Preparat przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego może również zawierać substancję powierzchniowo czynną, która może redukować lub zapobiegać powierzchniowej indukcji agregowania przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego powodowanej przez atomizowanie roztworu tworzącego aerozol. Zastosowane mogą być różne tradycyjne substancje powierzchniowo czynne takie jak estry polioksyetylenowe kwasu tłuszczowego i alkohole oraz estry sorbitanu polioksyetylenowego kwasu tłuszczowego. Ilości będą ogólnie mieściły się w zakresie pomiędzy 0,001 i 4% masy preparatu. Szczególnie zalecanymi substancjami dla celów tego wynalazku są monooleinian sorbitanu polioksyetylenu, polisorbat 80, polisorbat 20 lub im podobne. Dodatkowe czynniki znane w dziedzinie do preparowania białka takiego jak białko przeciwciała mogą również być zawarte w preparacie.

Podawanie kompozycji przeciwciała anty-dwuintegrynowego przy pomocy inhalatora odmierzającego dawki

W inhalatorze odmierzającym dawkę (MDI) propelent, przynajmniej jedno przeciwciało anty-dwuintegrynowe i jakiekolwiek zaróbki lub inne dodatki zawarte są w pojemniku jako mieszanina zawierająca upłynniony sprężony gaz. Uruchomienie zaworu odmierzającego uwalnia mieszaninę jako aerozol dogodnie zawierający cząsteczki o wielkości mniejszej niż około 10 μm, dogodnie około 1 μm do 5 nm i w szczególności około 2 μm do 3 nm. Cząsteczki aerozolu o pożądanej wielkości mogą być otrzymane przez zastosowanie preparatu białkowej kompozycji przeciwciała wytworzonego różnymi sposobami znanymi specjalistom obejmującymi przemiał odrzutowy, suszenie rozpyłowe, kondensację w krytycznym punkcie lub inne tego typu. Dogodnie, inhalatory odmierzające dawkę obejmują inhalatory wytwarzane przez 3M lub Glaxo i wykorzystujące propelent hydrofluorowęglowy.

Preparaty przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego do zastosowania w inhalatorze odmierzającym dawkę będą ogólnie zawierały dokładnie rozdrobniony proszek zawierający przynajmniej jedno przeciwciało anty-dwuintegrynowe jako zawiesinę w nie-wodnym ośrodku, przykładowo zawieszone w propelencie z pomocą substancji powierzchniowo czynnej. Propelent może być jakimkolwiek dogodnym materiałem wykorzystywanym dla tego celu, tak jak chlorofluorowęglan, hydrochlorofluorowęglan, hydrofluorowęglan lub hydrowęglan łącznie z trichlorofluorometanem, dichlorodifluorometanem, dichlorotetrafluorometanolem i 1,1,1,2-tetrafluorometanem, HFA-134a(hydrofluoroalkanem-134a), HFA-227 (hydrofluoroalkanem-227) lub podobnym. Dogodnie propelent jest hydrofluorowęglanem. Substancja powierzchniowo czynna może być dobrana tak, aby stabilizowała przynajmniej jedno przeciwciało anty-dwuintegrynowe jako zawiesinę w propelencie w celu ochrony aktywnego czynnika przed degradacja chemiczną i tym podobne. Użyteczne substancje powierzchniowo czynne obejmują trioleinian sorbitanu, lecytynę sojową, kwas oleinowy lub podobne. W pewnych przypadkach dogodne są roztwory aerozoli wytwarzane przy pomocy rozcieńczalników takich jak metanol. Dodatkowo czynniki znane w dziedzinie do przygotowywania białka takiego jak białko mogą być uwzględnione w prepracie.

Specjalista o przeciętnych umiejętnościach dostrzeże, że sposoby tu opisane mogą być przeprowadzone przez podawanie do płuc przynajmniej jednej z kompozycji przeciwciała anty-dwuintegrynowego przy pomocy nieopisanych tu urządzeń.

Preparaty i podanie doustne

Preparaty do podawania doustnego zależą od współpodawanych adiuwantów (np. rezorcynoli i niejonowych substancji powierzchniowo czynnych takich jak eter oleilowy polioksyetylenu i eter N-heksadecylopolietylenowy) do sztucznego zwiększania przepuszczalności ścian jelita jak również współpodawania inhibitorów enzymów (np. inhibitory trypsyny trzustkowej, fosforan diizopropylofluorowy (DFF) i trazylol) do zahamowania degradacji enzymatycznej. Składniki aktywne postaci dawkowania typu stałego do podawania doustnego mogą być zmieszane z przynajmniej jednym dodatkiem obejmującym sacharozę, laktozę, celulozę, mannitol, trechalozę, rafinozę, maltitol, dekstran, skrobię, agar, arginiany, chityny, chitosany, pektyny, guma z tragakantu, guma arabska, żelatyna, kolagen, kazeina, albumina, syntetyczny lub semi syntetyczny polimer i gliceryd. Te postaci dawkowania mogą również zawierać inny rodzaj(e) dodatków np. nieaktywny czynnik rozcieńczający, zwilżający taki jak stearynian magnezu, paraben, czynnik konserwujący taki jak kwas sorbowy, kwas askorbinowy, alfatokoferol, antyutleniacz taki jak cysteina, środek rozpraszający, lepiszcze, zagęszczacz, czynnik buforujący, słodzik, czynnik smakowy, czynnik nadający zapach itp.

PL 213 030 B1

Tabletki i pigułki mogą być dalej przekształcane w preparaty powlekane do podawania dojelitowego. Preparaty ciekłe do podawania doustnego obejmują emulsję, syrop, eliksir, zawiesinę i preparaty w roztworze pozwalające na zastosowanie medyczne. Preparaty te mogą zawierać nieaktywne środki rozcieńczające powszechnie stosowane w dziedzinie, np. wodę. Jako systemy dostarczania leku dla insuliny i heparyny opisano również liposomy (patent USA Nr 4,239,754). Bardziej współcześnie mikrosfery sztucznych polimerów mieszanych aminokwasów (proteinoidy) wykorzystano do dostarczania farmaceutyków (patent USA Nr 4,92 5,673). Ponadto, do doustnego dostarczania biologicznie aktywnych czynników nośniki używane są związki opisane w patencie USA Nr 5,879,681 i patencie USA Nr 5,5,871-753.

Preparaty do podawania przezśluzówkowego i ich podawanie

Do absorpcji przez powierzchnię śluzówki kompozycje i sposoby podawania przynajmniej jednego przeciwciała anty-dwuintegrynowego obejmują emulsję z licznymi submikronowymi cząsteczkami, makrocząsteczkę o powinowactwie do śluzówki, bioreaktywny peptyd i ciągłą fazę wodną, która sprzyja absorpcję przez powierzchnię śluzówki nadając cząsteczkom emulsji powinowactwo do śluzówki (patent USA Nr 5,514,670). Powierzchnie śluzówek użyteczne do podawania emulsji tu opisanej mogą obejmować jako drogę podawania rogówkę, spojówkę, śluzówkę policzka, śluzówkę pod językiem, śluzówkę nosa, pochwy, płuc, żołądka, jelita i odbytu. Preparaty do podawania dopochwowego lub doodbytniczego np. czopki mogą zawierać jako zaróbki przykładowo, glikole polialkilenowe, wazelinę, masło kokosowe i tym podobne Preparaty do podawania donosowego mogą być stałe i mogą zawierać zaróbki, przykładowo laktozę lub mogą być roztworami wodnymi lub olejowymi kropli donosowych. Do podawania dopoliczkowego zaróbki obejmują cukry, stearynian wapnia, stearynian magnezu, wstępnie żelowane skrobie i tym podobne (patent USA Nr 5,849,695).

Preparaty do podawania przezskórnego i ich podawanie

Do podawania przezskórnego przynajmniej jedno przeciwciało anty-dwuintegrynowe jest zamknięte w urządzeniu dla dostarczania takim jak liposom lub nanocząsteczki polimeryczne, mikrocząsteczki, mikrokapsułki lub mikrosfery (określane łącznie jako mikrocząsteczki, chyba, że będzie to określone inaczej). Znanych jest szereg użytecznych urządzeń obejmujących mikrocząsteczki wytworzone z syntetycznych polimerów takich jak kwasy polihydroksylowe takie jak kwas polimlekowy, kwas poliglikolikowy i ich kopolimery, poliortoestry, polibezwodniki i polifosfazeny i naturalne polimery takie jak kolagen, poliaminokwasy, albumina i inne białka, alginiany i inne polisacharydy i ich kombinacje (patent USA Nr 5,814,599).

Przedłużone podawanie i preparaty do przedłużonego podawania

Czasem może być pożądane dostarczanie związków tu opisanych podmiotowi przez wydłużone okresy czasu, przykładowo przez czas jednego tygodnia do jednego roku począwszy od jednego podania. Wykorzystane mogą być różne postaci dawkowania do powolnego uwalniania, typu depot lub implantów. Przykładowo, postać dawki może zawierać farmaceutycznie akceptowalną nietoksyczną sól związków o niskim stopniu rozpuszczalności w płynach ustrojowych, przykładowo (a) kwasową sól addycyjną z wielowartościowym kwasem takim jak kwas fosforowy, kwas siarkowy, kwas cytrynowy, kwas winowy, kwas taninowy, kwas pamoinowy, kwas alginowy, kwas poliglutaminowy, kwasy nafatleno mono- lub disulfonowe, kwas poligalakturonowy i tym podobne; (b) sól z poliwalentnym kationem metalu, takim jak cynk, wapń, bizmut, bar, magnez, glin, miedź, kobalt, nikiel, kadm i im podobne lub z kationem organicznym utworzonym z np. N,N'-dibenzyloetylenodiamina lub etylenodiamina; lub (c) kombinacji (a) i (b) np. taninowa sól cynku. Dodatkowo, związki tu opisane lub dogodnie względnie nierozpuszczalna sól taka jak ta, którą właśnie opisano mogą być preparowane w żel, przykładowo w żel z monostearynianem glinu z np. olejem sezamowym, odpowiednim do wstrzyknięć. Szczególnie zalecane sole to sole cynku, taninowe sole cynku, sole pamoinowe i tym podobne. Inny rodzaj preparatu o wolnym uwalnianiu typu depot do wstrzyknięć będzie zawierał związek lub sól rozproszoną do kapsułkowania w ulegającym powolnej degradacji, nietoksycznym, nieantygenicznym polimerze takim jak polimer kwas polimlekowy/kwas poliglikolowy przykładowo jak opisano w patencie USA Nr 3,773,919. Związki, lub dogodnie względnie nierozpuszczalne sole, takie jak te opisane powyżej, mogą być również preparowane w pigułki silastikowe z rdzeniem cholesterolowym, szczególnie do zastosowania u zwierząt. Dodatkowe preparaty wolnouwalniające, typu depot lub implanty, np. gazowe lub płynne liposomy są znane w literaturze (patent USA Nr 5,770,222 i „Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson wyd., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978).

Po ogólnym opisie wynalazku będzie on łatwiej zrozumiały przez odniesienie do poniższych przykładów dostarczonych celem zilustrowania i nie ograniczenia.

PL 213 030 B1

P r z y k ł a d 1: Klonowanie i ekspresja przeciwciała dwuintegryny w komórkach ssaczych

Typowy ekspresyjny wektor ssaczy zawiera przynajmniej element promotora, który pośredniczy w inicjacji transkrypcji mRNA, sekwencję kodującą przeciwciało i sygnały wymagane do terminacji transkrypcji i poliadenylacji transkryptu. Dodatkowe elementy obejmują wzmacniacze, sekwencje Kozak i wtrącone sekwencje otoczone przez miejsca donorowe i akceptorowe składania RNA. Wysokowydajna transkrypcja może być osiągnięta przy pomocy wczesnych i późnych promotorów z SV40, długich końcowych powtórzeń (LTRS) z retrowirusów np. RSV, HTLVI, HIVI i wczesnego promotora cytomegalowirusa (CMV). Jednakowoż mogą być również użyte elementy komórkowe (np. promotor ludzkiego genu dla aktyny). Użyteczne wektory ekspresyjne dla zastosowania w realizacji niniejszego wynalazku obejmują przykładowo wektory takie jak pIRES1neo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN lub pLNCX (Clonetech Labs, Palo Alto, CA), pcDNA3.1 (+/-), pcDNA/Zeo (+/-) lub pcDNA3.1/Hygro (+/-) (Invitrogen), PSVL i PMSG (Pharmacia, Uppsala, Szwecja), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) i pBC12MI (ATCC 67109). Użyte mogą być komórki ssacze w tym ludzkie HeLa 293, H9 i Jurkat, mysie komórki NIH, 3T3 i C127, COS 1, COS 7 i CV 1, komórki przepiórki QC1-3, komórki mysie L i komórki jajnika chomika chińskiego (CHO).

Alternatywnie, gen może być wyrażony w stabilnych liniach komórkowych zawierających gen wbudowany do chromosomu. Współtransfekcja markerem selekcyjnym takim jak dhfr, gpt, neomycyna lub higromycyna pozwala na identyfikację i izolację stransfekowanych komórek.

Stransfekowany gen może być również zamplifikowany w celu ekspresji dużych ilości kodowanego przeciwciała. Marker DHFR (reduktaza dihydrofolianowa) jest użyteczny do otrzymania linii komórkowych zawierających kilkaset lub nawet kilka tysięcy kopii genu będącego przedmiotem zainteresowania. Innym użytecznym markerem selekcyjnym jest syntaza glutaminy (GS) (Murphy, i wsp., Biochem. J. 227:227- 279 (1991); Bebbington i wsp., Bio/Technology 10:169-175 (1992)). Przy pomocy tych markerów komórki ssacze są hodowane w pożywce selekcyjnej i selekcjonowane są komórki o najwyższej oporności. Te linie komórkowe zawierają zamplifikowany gen(geny) wbudowane do chromosomów. Komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) i komórki NSO są często używane do wytwarzania przeciwciał.

Wektory ekspresyjne pC1 i pC4 zawierają silny promotor (LTR) z wirusa mięsaka Rous'a (Cullen i wsp., Molec. Cell. Biol. 5:438-447 (1985)) plus fragment wzmacniacza CMV (Boshart i wsp., Cell 41:521-530 (1985)). Miejsca wielokrotnego klonowania np. z miejscem dla cięcia enzymu restrykcyjnego BamHI, XbaI i Asp718 umożliwiają klonowanie genu będącego przedmiotem zainteresowania. Wektory zawierają dodatkowo 3' intron, sygnał poliadenylacji i terminacji ze szczurzego genu preproinsuliny.

Klonowanie i ekspresja w komórkach CHO

Wektora pC4 użyto do ekspresji przeciwciała anty-dwuintegrynowego. Plazmid pC4 jest pochodną plazmidu pSV2-dhfr (numer dostępu ATCC Nr 37146). Plazmid zawiera mysi gen dhfr pod kontrolą wczesnego promotora SV40. Komórki jajnika chomika chińskiego lub inne komórki pozbawione aktywności reduktazy dihydrofolianowej stransfekowane tymi plazmidami mogą być selekcjonowane z uwagi na wzrost komórek w podłożu selekcyjnym (np. alfa minus MEM, Life Technologies, Gaithersburg, MD) uzupełnionym czynnikiem chemioterapeutycznym jakim jest metotreksat. Amplifikacja genów dhfr w komórkach opornych na metotreksat (MTX) została dobrze udokumentowana (patrz np. F.W. Alt, i wsp., J. Biol. Chem. 253:1357-1370 (1978); J.L. Hamlin i C. Ma, Biochem. et Biophys. Acta 1097:107-143 (1990) i M.J. Page i M. A. Sydenham, Biotechnology 9:64-68 (1991)). Komórki hodowane przy rosnących stężeniach MTX wytwarzały oporność na lek przez nadprodukcję docelowego enzymu, DHFR, będącą wynikiem amplifikacji genu dhfr. Jeśli drugi gen jest przyłączony do genu dhfr to jest on zazwyczaj współamplifikowany i ulega nadekspresji. Jest znane w dziedzinie, że to podejście może być stosowane do opracowania linii komórkowych niosących więcej niż 1000 kopii zamplifikowanego genu(genów). Następnie, po usunięciu metotreksatu otrzymuje się linie komórkowe zawierające zamplifikowane geny wbudowane do jednego lub większej liczby chromosomu(chromosomów) komórki gospodarza.

Do ekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania plazmid pC4 posiada silny promotor z długiego końcowego powtórzenia (LTR) wirusa mięsaka Rous'a (Cullen i wsp., Molec. Cell. Biol. 5:438-447 (1985)) plus fragment wyizolowany ze wzmacniacza bezpośredniego wczesnego genu ludzkiego cytomegalowirusa (CMV) (Boshart i wsp., Cell 41:521-530 (1985)). Poniżej promotora są miejsca cięcia dla enzymów restrykcyjnych BamHI, XbaI i Asp718 pozwalające na integrację genów. Za tymi miejscami klonowania plazmid posiada 3' sekwencję intronu i miejsce poliadenylacji z genu

PL 213 030 B1 szczurzej preproinsuliny. Do ekspresji mogą również być użyte inne wysokowydajne promotory np. promotor ludzkiej b-aktyny, wczesne lub późne promotory SV40 lub długie końcowe powtórzenia z innych retrowirusów np. HIV lub HTLVI. Do ekspresji dwuintegryny w komórkach ssaczych w regulowany sposób mogą być użyte systemy ekspresji genów Tet-Off i Tet-On z Clontech oraz podobne systemy (M. Gossen i H. Bujard, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 (1992)). Do poliadenylacji mRNA użyte mogą być również inne sygnały np. z ludzkich genów dla hormonu wzrostu lub globiny. Stabilne linie komórkowe niosące gen będący przedmiotem zainteresowania wbudowany do chromosomów mogą być również wyselekcjonowane przez kotransfekcję markerem selekcyjnym takim jak gpt, G418 lub higromycyna. Zalecane jest zastosowanie na początku więcej niż jednego markera selekcyjnego, np. G418 plus metotreksat.

Plazmid pC4 jest trawiony enzymami restrykcyjnymi i defosforylowany przy pomocy cielęcej fosfatazy jelitowej procedurami znanymi w dziedzinie. Następnie wektor jest izolowany z 1% żelu agarozowego.

Stosowana jest sekwencja DNA kodująca całe przeciwciało dla dwuintegryny, odpowiadająca regionom zmiennym HC i LC przeciwciała dwuintegryny według niniejszego wynalazku zgodnie ze znanymi sposobami postępowania. Stosowany jest tu również wyizolowany kwas nukleinowy kodujący użyteczny ludzki region stały (tj. regiony HC i LC).

DNA kodujący wyizolowane zmienne i stałe regiony i zdefosforylowany wektor są następnie łączone przy pomocy ligazy DNA z bakteriofaga T4. Następnie, transformowane są komórki E.coli HB101 lub XL-1 Blue i identyfikowane są bakterie zawierające fragment wbudowany do plazmidu pC4 przy pomocy, przykładowo analizy enzymem restrykcyjnym.

Do transfekcji stosuje się komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) pozbawione aktywności

DHFR. 5 μg plazmidu ekspresyjnego pC4 kotransfekuje się z 0,5 μg plazmidu pSV2-neo przy pomocy lipofektyny. Plazmid pSV2neo zawiera domenę markera selekcyjnego, gen neo z Tn5 kodujący enzym ustalający oporność na grupę antybiotyków obejmujących G418. Komórki są wyszczepione na pożywkę alfa minus MEM uzupełnioną G418 do stężenia 1 μg/ml. Po dwóch dniach komórki poddaje się działaniu trypsyny i wyszczepieniu na płytki do hodowli hybrydomy (Greiner, Niemcy) w pożywce alfa minus MEM uzupełnionej 10, 25 lub 50 ng/ml metotreksatu plus 1 μg/ml G418. Po około 10-14 dniach pojedyncze klony są odtrawiane trypsyną i następnie wyszczepiane na sześciostudzienkowe płytki Petriego lub do 10 ml kolbek stosując różne stężenia metotreksatu (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Klony rosnące przy najwyższych stężeniach metotreksatu są następnie przenoszone do nowej sześciostudzienkowej szalki zawierającej nawet wyższe stężenia metotreksatu (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM). Ta sama procedura jest powtarzana aż do otrzymania klonów, które rosną przy stężeniu 100-200 mM. Ekspresja pożądanego produktu genu jest analizowana przykładowo przez analizę SDS-PAGE lub przez HPLC na odwróconej fazie.

P r z y k ł a d 2: Sposób otrzymywania i charakteryzowania nieograniczającego przykładu w pełni ludzkiego przeciwciała anty-dwuintegrynowego

Streszczenie. Hybrydowe myszy F2 (CBA/J x C57/BL6/J) (Taylor i wsp., International Immunology 6:579-591 (1993); Lonberg i wsp., Nature 368:856-859 (1994); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); Fishwild i wsp., Nature Biotechnology 14:845-851 (1996)) zawierająca transgeny ludzkiego regionu zmiennego i stałego przeciwciała zarówno łańcuchów ciężkich jak i lekkich były immunizowane ludzką łożyskową ανβ3. Jedna fuzja dała w pełni ludzkie monoklonalne przeciwciała IgG1K reaktywne względem ludzkiej ανβ3, nazwane GenO.95 i GenO.101. Całkowicie ludzkie przeciwciała przeciwko ανβ3 były następnie charakteryzowane i w przypadku obu stwierdzono, że są reaktywne względem heterodimerów ανβ3 i ανβ5, co sugeruje specyficzność dla wspólnego łańcucha alfa występującego w obu cząsteczkach. Jedno Mab, GenO.95, znane również jako CNTO 95, hamuje wiązanie zarówno ανβ3 jak i ανβ5 z fibronektyną w oznaczeniach opartych na komórkach.

Skróty: BSA - albumina surowicy bydlęcej, CO2 dwutlenek węgla, DMSO - dimetylosulfotlenek, EIA - enzymatyczne oznaczenie immunologiczne, FBS - płodowa surowica bydlęca, H2O2 - nadtlenek wodoru, HC - łańcuch ciężki, HRP - peroksydaza chrzanowa, Ig - immunoglobulina, IP - dootrzewnowo, IV - dożylnie, Mab - przeciwciało monoklonalne, OD - gęstość optyczna, OPD - dihydrochlorek O-fenylenodiaminy, PEG - glikol polietylenowy, PSA - penicylina, streptomycyna, amfoterycyna, RT temperatura pokojowa, SQ - podskórnie, TBS - zbuforowany Tris fizjologiczny roztwór soli, v/v - objętość/objętość, w/v - masa/objętość.

Wprowadzenie: do wytworzenia całkowicie ludzkich przeciwciał monoklonalnych, które są specyficzne dla integryn aV wykorzystano transgeniczną mysz posiadającą geny dla ludzkiego łańcucha

PL 213 030 B1 ciężkiego i lekkiego immunoglobuliny. Te nowe przeciwciała mogą być zastosowane terapeutycznie do hamowania procesu angiogenezy przez blokowanie wiązania integryn aV z odpowiednimi dla nich ligandami ECM i dostarczają dodatkowych narzędzi w leczeniu różnych raków.

Materiały i metody

Zwierzęta

Transgeniczne myszy otrzymane zostały przez GenPharm International, i wyrażają one ludzkie immunoglobuliny, lecz nie mysie IgM lub IgK. Te myszy posiadają sekwencje ludzkich transgenów podlegające łączeniu V(D)J, przełączaniu klas łańcucha ciężkiego i mutacji somatycznej z wytworzeniem repertuaru ludzkich sekwencji immunoglobulin (Taylori wsp., International Immunology 6:579-591 (1993)). Transgen łańcucha lekkiego pochodzi częściowo z klonu sztucznego chromosomu drożdżowego zawierającego niemal połowę ludzkiego regionu Vk linii zarodkowej. Oprócz szeregu genów VH transgen koduje łańcuch ciężki (HC) zarówno ludzki μ jak i ludzki γ1 (Lonberg i wsp., Nature 368:856-859 (1994)) i/lub regiony stałe γ3. W celu wytworzenia tych przeciwciał monoklonalnych w procesie immunizacji i fuzji wykorzystano mysz pochodzącą z linii genotypowej HC012.

Oczyszczanie ludzkiego ανβ3

Ludzkie łożysko (rozdrobnione przy pomocy młynka do mięsa) lub ludzkie komórki czerniaka M21 wyrażające integrynę ανβ3 wyekstrahowano fizjologicznym roztworem soli zawierającym 20 mM Tris pH 7,5, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, 100 mM oktylotioglukozyd (OTG z Pierce), 0,05% azydek sodu i 1 mM fluorek fluorometylosulfonylu (Sigma). Mieszaninę rozdrabniano przez 1 godz. w temperaturze pokojowej i klarowano przez wirowanie przy 10 tys. x g. Nadsącz z ekstraktów łożyska naniesiono na kolumnę powinowactwa zawierającą Mab 10E5 związane z Sefarozą (Pharmacia) w celu usunięcia GPIIb/IIIa, a niewiążącą się z kolumną frakcje naniesiono na kolumnę powinowactwa zawierającą Mab c7E3 Fab związane z Sepharozą (Pharmacia) w celu związania ανβ3. Kolumnę c7E3 wypłukano PBS zawierającym 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2 i 0,1% OTG, a następnie 0,1 M octan sodu pH 4,5, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2 i 0,1% OTG pH 3,0. Kolumnę wymywano 0,1 M glicyną 2% kwasem octowym, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2 i 0,1% OTG. Eluat zawierający oczyszczoną ανβ3 zobojętniono przy pomocy 2 M Tris pH 8,5. Czystość preparatów scharakteryzowano przez analizę SDS-PAGE i ELISA w celu odrzucenia zanieczyszczenia GPIIb/IIIa (Wayner i wsp., J. Cell. Biol. 113:919-929 (1991)).

Immunizacje

Chirurgicznie wykastrowane samce myszy w wieku 15 do 17 tygodni otrzymane z GenPharm immunizowano IP (200 μθ oraz w dwa miejsca SQ (100 μl w miejsce) łącznie 20 μg łożyskowego ανβ3 (preparat frakcji V, JG21197) emulgowanych z równą objętością kompletnego adiuwanta Freund'a (dzień 0). Myszy immunizowano dwa tygodnie później w ten sam sposób ανβ3 zemulgowaną z równą objętością niepełnego adiuwanta Freund'a. Następnie w dniach 28, 42 i 56 wstrzyknięto IP 10 μg/10 μg SQ z niekompletnym adiuwantem Freund'a. Następnie w dniach 42 i 56 myszy skrawiono przez punkcję w żyłę zaoczodołową bez antykoagulanta. Krwi pozwolono skrzepnąć w RT przez 1 godz. i surowicę zebrano i oznaczono miano przy pomocy oznaczenia EIA ανβ3 na fazie stałej. Fuzję, nazwaną GenO, przeprowadzono gdy powtórne wstrzyknięcia nie spowodowały wzrostu miana. W tym czasie myszy o specyficznym mianie ludzkiej IgG 1:1280 przeciwko ανβ3 podano końcowe IV przypominające szczepienie 10 μg ανβ3 rozcieńczonej w 100 μl fizjologicznego roztworu soli. Trzy dni później myszy uśmiercono przez przerwanie rdzenia kręgowego i aseptycznie usunięto śledzionę i zanurzono ją w 10 ml zimnego zbuforowanego fosforanem fizjologicznego roztworu soli (PBS) zawierającego 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 0,25 μg/ml amfoterycyny B (PSA). Zebrano splenocyty przez jałowe przepłukiwanie śledziony PSA-PBS. Komórki jednokrotnie płukano w zimnym PSA-PBS, zliczono stosując wykluczanie z użyciem barwnikiem błękitu trypanu i ponownie zawieszono w pożywce RPMI 1640 zawierającej 25 mM Hepes.

Linie komórkowe

Niewydzielający mysi szpiczak będący partnerem fuzji, SP2/0 otrzymano 9-1-93 z grupy Cell Biology Services (CBS). Linię komórkową namnożono w aMEM (zmodyfikowanej) (JRH Biosciences) uzupełnionej 10% (v/v) FBS (Cell Culture Labs), 1 mM pirogronianem sodu, 0,1 mM NEAA, 2 mM L-glutaminy (wszystkie z JRH Biosciences) i przechowywano zamrożone w 95% FBS i 5% DMSO (Sigma) i następnie przechowywano w oparach ciekłego azotu w CBS. Bank komórek był jałowy (Quality Control Centocor, Malvern) i wolny od mykoplazmy (Bionique Laboratories). Do momentu fuzji komórki utrzymywano w hodowli w fazie logarytmicznej. Przed fuzją były one płukane w PBS, zliczane i określano ich żywotność (więcej niż 95%) przez barwienie błękitem trypanu.

PL 213 030 B1

Linię komórkową M21 ludzkiego czerniaka wyrażającego integryny ανβ3 i ανβ5 namnożono i przechowywano kriogenicznie. Bank komórek w dziesięciu naczyniach otrzymano z Cell Biology Services i przechowywano w ciekłym azocie. Bank komórek był jałowy i wolny od mykoplazmy (Bionique Laboratories). Linia komórkowa MDAMB435L2 ludzkiego raka piersi otrzymana od dr Janet Price (MD Anderson, Huston TX) wyraża integrynę ανβ3. Linię komórkową przechowywano kriogenicznie w Cell Biology Services. Bank komórek był jałowy i wolny od mykoplazmy (Bionique Laboratories). Komórki M21 i MDAMB435L2 rozmnożono, namnożono w odpowiednim podłożu i utrzymywano w fazie logarytmicznej przez szereg dni przed użyciem w oznaczeniach biologicznych lub pozwalano osiągnąć konfluencję w przypadku użycia w oczyszczaniu białka ανβ3 (komórki M21).

Fuzja komórek

Fuzje przeprowadzono w proporcji 1:1 mysich komórek szpiczaka (SP2/0) do żywotnych komórek śledziony. W skrócie, komórki śledziony i komórki szpiczaka osadzono razem. Osad wolno ponownie zawieszano przez 30 sekund w 1 ml 50% (w/v) roztworu PEG/PBS (masa cząsteczkowa PEG 3000, Sigma) w 37°C. Fuzje zatrzymano przez wolne dodanie 1 ml Dulbecco PBS (JRH) (37°C) przez 1 minutę. Dodatkowe 19 ml PBS dodano przez następne 90 sekund. Połączone komórki wirowano przez 5 min. przy 750 obr/min. Następnie komórki ponownie zawieszono w pożywce HAT (pożywka aMEM zawierająca 20% płodową surowicę bydlęcą (JRH), 1 mM pirogronian sodu, 2 mM L-glutamina, 0,1 mM nie podstawowe aminokwasy, 10 (g/ml gentamycyny, 2,5% hodowlanego uzupełnienia Origen (Fisher), 50 (Μ 2-merkaptoetanolu, 100 (Μ hipoksantyny, 0,4 (Μ aminopteryny i 16 (Μ tymidyny) i następnie wyszczepiono po 200 (l na studzienkę na 13 96-studzienkowych płaskodennych płytek do hodowli tkankowej. Następnie płytki umieszczano w wilgotnej atmosferze w 37°C w inkubatorze zawierającym 5% CO2 i 95% powietrza na 7-10 dni.

Wykrywanie ludzkich przeciwciał IgG anty ανβ3 w surowicy myszy

EIA na fazie stałej użyto do przeszukiwania mysich surowic pod kątem występowania ludzkich przeciwciał IgG specyficznych dla ludzkiej ανβ3. Krótko, płytki opłaszczono ανβ3 w stężeniu 1 (g/ml w PBS przez noc. Po płukaniu w 0,15 M fizjologicznym roztworze soli zawierającym 0,02% (v/v) Tween 20 studzienki blokowano 1% (w/v) BSA w HBSS z Ca⁺⁺ i Mg⁺⁺, 200 (l/studzienka przez 1 godz. w RT. Płytki użyto niezwłocznie lub zamrożono w -20°C do późniejszego użycia. Mysie surowice inkubowano jako dwukrotne rozcieńczenia na płytkach opłaszczonych ανβ3 przy 50 (l/studzienka w RT przez 1 godz. Płytki płukano i następnie sondowano 50 (l/studzienkę wyznakowanego HRP koziego przeciwciała przeciw ludzkiej IgG, specyficznego dla Fe (Accurate) rozcieńczonego 1:30 000 w 1% BSA-PBS przez 1 godz. w RT. Następnie płytki płukano i dodano na 15 min. w RT 100 (l/studzienkę cytrynianowo-fosforanowego roztworu substratu (0,1 M kwas cytrynowy i 0,2 M fosforan sodu, 0,01% H2O2 i 1 mg/ml OPD). Roztwór zatrzymujący (4 N kwas siarkowy dodano w ilości 25 (l/studzienkę i odczytano OD przy 490 nm przy pomocy zautomatyzowanego spektrofotometru do płytek.

Wykrywanie całkowicie ludzkich immunoglobulin w nadsączach hybrydom

Ponieważ mysz GenPharm zdolna jest do wytworzenia zarówno mysich jak i ludzkich łańcuchów immunoglobulin, wzrost hybrydom wydzielających całkowicie ludzkie immunoglobuliny wykrywano przy pomocy dwóch niezależnych systemów EIA. Płytki opłaszczono jak opisano powyżej i nierozcieńczone nadsącza inkubowano na płytkach przez 1 godz. w 37°C. Płytki płukano i sondowano zarówno wyznakowanymi HRP kozimi przeciwciałami przeciw ludzkiemu łańcuchowi kappa (Southern Biotech) rozcieńczonymi 1:10000 w 1% BSA-HBSS lub wyznakowanym HRP kozim przeciwciałem przeciw ludzkiej IgG, specyficznym dla Fe rozcieńczonym 1:30000 w 1% BSA-HBSS przez 1 godz. w 37°C. Następnie płytki inkubowano jak opisano powyżej w roztworze substratu.

Izotypowanie

Określenie izotypu przeciwciał osiągnięto przy pomocy EIA w sposób podobny do zastosowanego przy przeszukiwaniu mysich surowic odpornościowych dla specyficznych mian. 96-studzienkowe płytki opłaszczono ανβ3 jak to opisano powyżej i oczyszczone przeciwciało w stężeniu 2 (g/ml inkubowano na płytce przez 1 godz. w RT. Płytkę płukano i sondowano wyznakowanym HRP kozim przeciwciałem przeciwko ludzkiej IgG1 (miejsce wiązania) lub wyznakowanym HRP kozim przeciwciałem przeciwko ludzkiej IgG3 rozcieńczonym 1:4000 (Zymed) w 1% BSA-HBSS przez 1 godz. w RT. Płytkę ponownie płukano i inkubowano z roztworem substratu jak to opisano powyżej.

Charakterystyka wiązania ludzkich przeciwciał monoklonalnych przez EIA

Charakterystyki wiązania przeciwciał oceniono przez EIA wychwytującą ανβ3. Płytki Linbro opłaszczono ανβ3 w stężeniu 1 (g/ml w TBS z 2 mM wapniem przez noc w 4°C. Płytki wypłukano i zablokowano w TBS/1% BSA/wapń przez przynajmniej 1 godz. w temperaturze pokojowej. OczyszPL 213 030 B1 czone przeciwciała inkubowano w dwukrotnych rozcieńczeniach począwszy od stężenia 2 μg/ml. Płytki wypłukano i skoniugowane przeciwciała (wyznakowane HRP kozie przeciwciało przeciwko Fe ludzkiej IgG w rozcieńczeniu 1:30000) dodano i inkubowano na płytkach przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Płytki wypłukano i do studzienek dodano substrat OPD. Płytki odczytano przy pomocy zautomatyzowanego spektrofotometru do płytek.

Kompetycja wiązania Gen095 do komórek M21 przez różne komercyjne Mab anty-integrynowe.

Komórki M21 wytrawiono trypsyną z kolb hodowlanych, wypłukano i zawieszono w HBSS/wapń do stężenia 2 x 10⁶ komórek na ml. Gen095 wstępnie znakowano FITC-kozim przeciciałem przeciwko ludzkiemu Fe (Jackson) przez 30 min. w RT. 10X stężone Gen095 w stężeniu 200 μg/ml lub 20 μg/ml inkubowano z FITC-kozimi przeciwko ludzkiej IgG w stężeniu 250 μg/ml. 100 μl porcje komórek M21 (2 x 10⁵) inkubowano z 12 μl 10Χ Gen095 przy wysokich (końcowe 20 μg/ml) i niskich (końcowe 2 μg/ml) stężeniach ± 12 μl następujących mysich przeciwciał: m7E3 IgG, anty-ave3 (klon LM609, Chemicon), anty-ave5 (klon P1F6, Gibco), anty-e3 (Chemicon, AMAC) lub anty-αν (klon VNR139, Gibco) (w stężeniu 20 μg/ml) przez 45 minut w 37°C. Porcje usunięto z każdej probówki (do analizy dwubarwnej) a pozostałość utrwalono 1% paraformaldehydem i zbadano w cytometrze przepływowym. Do analizy dwubarwnej (50 μθ inkubowano z PE - kozim przeciwciałem przeciwko mysiej IgG przez 30 min. w RT w celu wyznakowania mysich przeciwciał anty-ave3, anty-aVe3, anty-aVe3 lub anty-aV do analizy dwubarwnej. Wszystkie próbki utrwalono 1% paraformaldehydem.

Hamowanie zależnej od aVe3 lub aVe5 adhezji komórek M21 lub komórek MDAMB435L2 do płytek opłaszczonych witronektyną przez Mab specyficzne dla aVe3/aVe5

Płytki Linbro opłaszczono przez 1 godz. w temperaturze pokojowej 50 μl/studzienka witronektyny (Collaborative, Becton Dickinson) w stężeniu 5 μg/ml w TBS z 2 mM wapniem. Płytki płukano HBSS/wapń i zablokowano TBS zawierającym 2 mM wapń i 1% BSA, przez 30 min. w RT. Komórki M21 strawiono trypsyną, płukano jednokrotnie pożywką zawierającą FCS i zawieszono w 3 ml HBSS bez wapnia. Wszystkie płukania wykonano z 10 minutowymi wirowaniami przy 10 tys. obr/min w mikrowirówce Sorvall. W celu wyznakowania fluorescencyjnego komórek dodano kalceinę (Molecular Probes) (5 mg/ml w DMSO) do końcowego stężenia 100 μg/ml w 50 ml probówce stożkowej (zawiniętej w folię). Komórki inkubowano 10 do 15 minut w 37°C. Komórki wyznakowane kalceiną płukano jednokrotnie HBSS i zawieszano w HBSS uzupełnionej 0,1% BSA i 1 mM MgCl2. Przeciwciała zmiareczkowano (14-krotne seryjne rozcieńczenia) w HBSS/0,1%BSA/2 mM wapń w 10X stężeniu końcowym. Komórki (300 μl o stężeniu 7,5 x 10⁶/ml) preinkubowano z mianowanym przeciwciałem (37 μl 10X roztworu) ± płyn wysiękowy anty-ave5 (P1F6) (Chemicon) (37 μl rozcieńczonego 1:600 (10X)) przez 15 minut w 37°C. Do płytek opłaszczonych fibronektyną dodano mieszaninę komórkaprzeciwciało w ilości 100 μl/studzienkę w trzech powtórzeniach (około 6 x 10⁵ komórek/studzienkę). Płytki inkubowano przez 45 minut w 37°C. Niezwiązane komórki usunięto dwoma płukaniami HBSS/wapń (150 μl/studzienkę). Do każdej studzienki dodano 100 μl HBSS/wapń i płytki odczytano przy pomocy Fluoroskan przy 485-538 nm.

W niezależnym oznaczeniu zebrano komórki ludzkiego raka piersi MDAMB435L2 z użyciem wersenianu i zawieszono w pożywce niezawierającej surowicy w stężeniu 500 tys. komórek/ml, i inkubowano z różnymi stężeniami GenO95. Po 10 minutach inkubacji zawiesinę komórek guza (100 μθ dodano do płytek Linbro opłaszczonych witronektyną (100 μg/ml) i inkubowano w 37°C. Po 1 godzinie studzienki trzykrotnie płukano pożywką wolną od surowicy (200 μl/płukanie) i do każdej studzienki dodano oparty na MTT barwnik Cell Titer AQ (Promega). Zakres adhezji komórek określono z użyciem czytnika płytek ELISA, gdzie OD 490 nm jest wprost proporcjonalne do adhezji komórek. Jako negatywna kontrola służyła adhezja komórek do studzienek opłaszczonych BSA.

Określenie zależności od Ca⁺⁺ wiązania Mab przeciwko ludzkiej α wyznakowanego HRP koziego przeciwciała przeciw ludzkiej IgG, specyficznego dla Fe ανβ3/ανβ5 do jej ligandów

Dla określenia określonej zależności wiązania CNTO 95 i C372 do ανβ3 lub ανβ5 użyto EJA w fazie ciekłe. Płytki EJA (Corning) opłaszczono CNTO 95, C372, c7E3 lub LM609 Mab IgG w stężeniu 10 g/ml w węglanowym buforze do opłaszczania przez noc w 4°C. Płytki zablokowano w 1% BSA rozcieńczonym w HBSS w obecności lub przy braku 2 mM Ca⁺⁺ przez co najmniej 1 godz. w 37°C. Podwójne rozcieńczenia ανβ3 (log Ig 52599) lub ανβ5 (Chemicon) począwszy od 10 :g/ml preinkubowano z 50 mM EDTA (Sigma) w 1% BSA/HBSS bez Ca⁺⁺ lub z 1% BSA/HBSS z Ca⁺⁺ przez 30 min. w 37°C. Następnie mieszaniny dodano do płytek i inkubowano przez 30 min. w 37°C. Następnie płytki płukano i dodano niekompetytywne Mab jak następuje: do płytek opłaszczonych CNTO 95, C372, c7E3 w celu wykrycia wiązania ανβ3 dodano Mab LM609 w stężeniu 20 :g/ml w 1% BSA/HBSS α

PL 213 030 B1

Ca⁺⁺, do płytki opłaszczonej LM609 w celu wykrycia wiązania ανβ3 dodano Mab CNTO 95 w stężeniu 20 :g/ml w 1% BSA/HBSS α Ca⁺⁺; do płytek opłaszczonych CNTO 95, C372, c7E3 w celu wykrycia wiązania ανβ5 dodano Mab VNTR139 (Gibco) w stężeniu 10 :g/ml w 1% BSA/HBSS α Ca⁺⁺ i inkubowano przez 30 min. w 37°C. Płytki ponownie płukano i sondowano zarówno wyznakowanym HPR kozim przeciwciałem przeciwko mysiemu Fe IgG lub wyznakowanym HPR kozim przeciwciałem przeciwko ludzkiemu Fe IgG w odpowiednim buforze i inkubowano przez 30 min. w 37°C. Płytki płukano, dodawano substrat OPD i mierzono OD 490 jak to wcześniej opisano.

Wyniki i dyskusja

Wytworzenie całkowicie ludzkich monoklonalnych przeciwciał przeciw ludzkiej integrynie ανβ3. Jedną fuzje, nazwaną GenO, przeprowadzono z myszy GenPharm immunizowanych białkiem ανβ3. Z fuzji tej wybrano 129 pozytywnych pod względem wzrostu hybryd. Zidentyfikowano dwie linie komórkowe hybrydom, które wydzielały ludzkie przeciwciała IgG reaktywne z ludzkią ανβ3. Te dwie linie komórkowe GenO.95.9.12 i GenO.101.17.22, każdą wydzielającą immunoglobuliny ludzkiego izotypu IgG1K, dwukrotnie subklonowano przez ograniczone rozcieńczenia aby otrzymać stabilne linie komórkowe (więcej niż 90% homogenności). GenO.95.9.12 oznaczono kodem C #CNTO 95 a GenO.101.17.22 oznaczono kodem C #C372A. Każdą z linii komórkowych zamrożono w 12 naczyniowych bankach komórek przechowywanych w LN2.

Charakterystyka wiązania ludzkich przeciwciał monoklonalnych przy użyciu EIA

Analiza ELISA potwierdziła, że przeciwciało oczyszczone z dwóch hybrydom CNTO 95 i C3 72A wiąże ανβ3 w sposób zależny od stężenia. Fig. 1 przedstawia wyniki względnej wydajności wiązania przeciwciał. Pięćdziesiąt procent wiązania jest uzyskano przy 0,07 i 0,7 gg/ml odpowiednio dla C372A i CNTO 95. W tym samym oznaczeniu c7E3 IgG wykazywało pięćdziesiąt procent maksymalnego wiązania przy 0,07 gg/ml.

Kompetycyjne wiązanie Mab GenO95 z M21 przez komercyjnie dostępne Mab anty-integrynowe W jednobarwnym oznaczeniu żadne z mysich przeciwciał anty-a_Ve₃, anty-a_Ve₅, anty-e₃, anty-a_V, nie konkurowało z CNTO 95 o wiązanie z komórkami M21 (Tabela 1). Doświadczenie to pokazało również, że CNTO wiążę komórki M21 w sposób zależny od dawki. W dwubarwnej analizie pokazano, że mysie przeciwciała anty-a_Ve₃, anty-a_Ve₅, anty-e₃, anty-a_V, były zdolne do wiązania komórek M21 (dane nieprezentowane).

T a b e l a 1: Kompetycja wiązania GenO95 z mysimi komórkami M21, przez mysie Mab anty-integrynowe

Przeciwciało kompetycyjne	Kozie GenO95	przeciwciało-FITC	anty-ludzkie Fc
MCF	2 gg/ml % pozytywn.	MCF	20 gg/ml % pozytywn.
Kontrola negatywna (bez GenO95)	2,69		2,69
Kontrola pozytywna (fizjologiczny roztwór soli)	4,33	100%	14,83	100%
M7E3 IgG	5,73	132%	14,72	103%
LM609 (anty-avP₃)	4,78	110%	13,34	93%
Anty-p₃ (Chemicon)	5,42	125%	13,10	91%
Anty-p₃ (AMAC)	4,61	106%	13,10	91%
P1F6 (anty-avP₃)	4,87	112%	14,46	101%
VNR139 (anty-ay)	4,61	106%	14,86	104%

MCF = Median Channel Fluorescence

Zależne od ανβ3 lub ανβ5 hamowanie adhezji komórek M21 lub komórek MDAMB435L2 do szalek opłaszczonych witronektyną przez przeciwciała specyficzne dla ανβ3/ανβ5

Komórki M21 przylegają do płytek opłaszczonych witronektyną w sposób zależny od ανβ3 jak i ανβ5. Co za tym idzie blokowanie zarówno ανβ3 i ανβ5 jest wymagane do pełnego hamowania przylegania komórki M21 do płytek opłaszczonych witronektyną. C372A nie hamuje adhezji komórek M21 w obecności lub przy braku P1F6, płynów wysiękowych anty-ave5 (Fig. 2). GenO95(CNTO 95) całkowicie hamuje adhezję komórek M21 do płytek opłaszczonych witronektyną zarówno z jak i bez płynów

PL 213 030 B1 wysiękowych anty-ae5 (P1F6), wskazując że przeciwciało blokuje zarówno ανβ3 jak i ανβ5. Jako kontrolę dla parametrów oznaczenia uwzględniono ReoPro (c7E3 Fab), które blokują ανβ3 (dodatkowo do GPIIb/IIIa). Samo ReoPro jedynie częściowo blokuje adhezję komórek M21, ReoPro w obecności płynu wysiękowego anty-ave5 (P1F6) całkowicie hamuje adhezję co pokazuje, że komórki M21 wiążą się z witronektyną zarówno przez integrynę ανβ3 jak i integrynę ανβ5. Dane znormalizowano do procenta maksymalnego wiązania komórek M21 przy braku antagonisty +/- płynów wysiękowych anty-aVe5 (P1F6). Do miareczkowania antagonisty bez P1F6 dane znormalizowano do maksymalnego wiązania komórek M21 przy braku antagonisty lub P1F6. Do miareczkowania antagonisty w obecności P1F6 dane znormalizowano do maksymalnego wiązania przy braku antagonisty lecz w obecności P1F6. Dane przedstawiono jako wykres procenta maksymalnego wiązania (brak przeciwciała) i nieliniowej regresji przeprowadzonej przy pomocy GraphPad Prism.

Mab GenO95 wykazują zdolność do pełnego hamowania adhezji komórek MDAMB43 5L2 do witronektyny w minimalnym stężeniu 1,5 μg/ml (Fig. 3). Dane te w połączeniu z danymi wykazującymi hamowanie adhezji komórek M21 potwierdzają zdolność GenO95 do funkcjonalnego hamowania oddziaływania receptora ανβ3 i/lub ανβ5 z witronektyną.

Określenie zależności od Ca++ dla wiązania Mab przeciwko ludzkiej ανβ3/ανβ5 z jego ligandami

Wiadomo, że obecność kationów wapnia jest niezbędna dla Mab c7E3 do związania ανβ3 i nie jest wymagane do związania Mab EM6 09 z ανβ3, co pokazano odpowiednio na Fig. 4c i 4d. Doświadczenie to przeprowadzono po to, aby ocenić czy zależność od wapnia dotyczy również charakterystyki wiązania CNTO 95 lub C372 do integryn ανβ3 lub ανβ5. Nadmierne stężenie EDTA wprowadzono do postaci oznaczenia do chelatowania obecnego Ca w kieszeni wiążącej heterodimerów integryn i co za tym idzie wiązanie oceniano przy braku kationu. Stwierdzono, że wiązanie CNTO 95 i C372 z ανβ3 jest niezależne od obecności Ca (Fig. 4a i 4b). To samo jest prawdą dla wiązania CNTO 95 z ανβ5, jednak nie dla wiązania C372 z ανβ5 (Fig. 4e, 4f), bowiem wiązanie to wydaje się być zwiększone w obecności Ca.

Wnioski

Fuzja GenO została przeprowadzona przy pomocy splenocytów z hybrydowej myszy zawierającej transgeny ludzkiego zmiennego i stałego regionu przeciwciała, którą immunizowano ludzką ανβ3. Wytworzono dwa całkowicie ludzkie przeciwciała monoklonalne IgG z izotypu IgG1K reaktywne z ανβ3. Te Mab charakteryzowano dalej i stwierdzono, że oba wiążą się z integrynami ανβ3 i ανβ5. Stwierdzono, że wiązanie dwóch Mab z ανβ3 jest niezależne od wapnia i zależne od wapnia z ανβ5 jedynie dla wiązania C372. Ponadto, jedno Mab, GenO95 (CNTO 95), jest zdolne do całkowitego hamowania wiązania ανβ3 i ανβ5 z ligandem witronektyny w oznaczeniach komórkowych. Te Mab mogą potwierdzić swoją użyteczność w zastosowaniach związanych z hamowaniem angiogenezy i innych zastosowań związanych z rakiem.

Literatura:

1. Taylor i wsp., International Immunology 6:579-591 (1993).

2. Lonberg i wsp., Nature 368:856-859 (1994).

3. Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996).

4. Fishwild i wsp., Nature Biotechnology 14:845-851 (1996).

5. Gastl i wsp., Oncology 54:177-184 (1997).

6. Eliceiri, i wsp., J. Clin. Invest. 103:1227-1230 (1999).

7. Friedlander i wsp., Science 270:1500-1502 (1995).

8. Wayner i wsp., J. Cell Biol. 113:919-929 (1991).

P r z y k ł a d 3: Powinowactwa wiązania dla przeciwciała dwuintegryny

Wstęp

GenO.95, znane również jako CNTO 95, jest ludzkim przeciwciałem monoklonalnym wytworzonym przez immunizację hybrydowych myszy F2 (CBA/J x C57/BL6/J, GenPharm International) integryna ανβ3 oczyszczoną z ludzkiego łożyska. Przeciwciało to jest zbudowane z ludzkich regionów zmiennych i stałych IgG1 kappa i stwierdzono, że jest reaktywne zarówno względem ανβ3 jak i ανβ5 co sugeruje specyficzność dla łańcucha alfa wspólnego dla obu cząsteczek integryny.

Cel

Celem tych badań jest scharakteryzowanie powinowactwa wiązania GenO.05 do oczyszczonych integryn ανβ3 i ανβ5 oraz do linii komórkowych wyrażających beta integrynę. Do dalszego charakteryzowania, wartości wiązania będą porównywane pomiędzy GenO.95 a ReoPro.

PL 213 030 B1

Skróty

Kd, stała równowagi dysocjacji wyrażona w M

Bmax = maksymalna liczba miejsc wiązania

Materiały i metody

Linie komórkowe

Komórki A375S2, linii komórkowej ludzkiego czerniaka wyrażającej integryny ανβ3 i ανβ5, hodowano w pożywce minimalnej Dulbecco (DMEM) zawierającej 10% płodową surowicę bydlęcą (FBS, Cell Culture Labs), 1 mM pirogronian sodu, 0,1 mM endogenne aminokwasy i 2 mM L-glutaminę (wszystkie z JRH Biosciences).

Komórki HT29 ludzkiego nowotworu jelita grubego wyrażające ανβ5 i minimalnie ανβ3 (NB4546, p207) hodowano w pożywce DMEM zawierającej 10% FBS, 1 mM pirogronian sodu, 0,1 mM endogenne aminokwasy i 2 mM L-glutaminę.

Komórki M21 ludzkiego szpiczaka wyrażające integryny ανβ3 i ανβ5 otrzymane od dr J. Jakubowski (Eli Lilly, Inc.), hodowano w pożywce RPMI (JRH Biosciences) zawierającej 10% FBS, 1 mM pirogronian sodu, 0,1 mM endogenne aminokwasy i 2 mM L-glutaminę.

Integryny ανβ3, partia JG22499 oczyszczono w Centocor z ludzkiego łożyska. Inną partię integryny ανβ3 (postać oktylowa, partia 19100991) otrzymano z Chemicon. ανβ5 (preparat z Tritonem, partia 20030055, partia 1910990 i preparat oktylowy, partia 19060747) otrzymano z Chemicon.

Przeciwciała

GenO.95 oczyszczono z nadsączu komórek przez chromatografię na białku A. ReoPro wytworzono w Centocor, Inc. LM609, mysie przeciwciało przeciwko ludzkiej ανβ3, (1976ZK, partia 20020559 partia 1910329) i P1F6, mysie przeciwciał o przeciwko ludzkiej α νβ5 (1961 P-K, partia 17110560) otrzymano z Chemicon.

Znakowanie radioaktywne

Przeciwciała wyznakowano radioaktywnie 125-1 Na (Amersham, IL) stosując ziarna jodowe (Pierce Chemicals, IL) do specyficznej aktywności 1-2 ąCi/ąg. Stężenie przeciwciała (mg/ml) określono dzieląc adsorbcję (OD/ml) w 280 nm przez 1,4. Aktywność specyficzną wyznakowanego jodem przeciwciała określono przez rozcieńczenie przeciwciała i zliczenie próbki w liczniku gamma lub Top Counter (Packard).

, 1 . _ - X ____ rr __, [ „„„ _ cpm/obiętość (ml) x współczynnik, rozcieńczenia

Aktywność specyficzna (cpm/gg)-—----¹stężenie (gg/ml określone przez odczyt ÓD ) 280

Oznaczenie wiązania z płytką opłaszczoną integryną.

Integryna ανβ3 lub ανβ5 rozcieńczono do stężenia 1 ąg/ml w fizjologicznym roztworze soli zbuforowanej Tris (TBS, 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,5) zawierającym 2 mM chlorek wapnia (TBS/Ca++) i opłaszczano 50 ąl na studzienkę na 96-studzienkowych polistyrenowych płytkach Linbro (Flow/ICN) przez noc w 4°C. Płytki płukano TBS/Ca⁺⁺ i blokowano 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w TBS/Ca⁺⁺ przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Pięćdziesiąt mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała dodano w trzech powtórzeniach do opłaszczonych studzienek i inkubowano przez godz. w 37°C. Po trzech płukaniach buforem TBS-Tween (TBS plus 0,1% Tween 20) dodano sprzężone z peroksydazą kozie przeciwciało przeciwko ludzkiemu F(ab')2 IgG (H+L, Jackson partia 16869) w rozcieńczeniu 1:40000 w 1% BSA-TBS i inkubowano przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Płytki płukano trzykrotnie i wywołano roztworem substratu dihydrochlorku o-fenylenodiaminy (OPD, Sigma) zawierającym 0,1 M kwas cytrynowy, 0,2 M fosforan sodu, 0,01% H2O2 i 1 mg/ml OPD. Wywoływanie barwy zatrzymano po 15 min. w temperaturze pokojowej przy pomocy 0,3 M H2SO4 i płytki odczytano przy OD490 nm w czytniku płytki Molecular Dynamics.

Krzywe wiązania wytworzono przy pomocy GraphPad PRISM (wersja 3 Graph Pad Software). Wyniki wyrażono jako procent maksymalnego wiązania wartości nasycenia. KD, stałą równowagi dysocjacji wiązania (wyrażona jako M) określono z dopasowania nieliniowej regresji danych przy pomocy PRISM.

Oznaczenie wiązania komórki ąl rozcieńczonego wyznakowanego przeciwciała w 2% pożywce RPMI zawierającej 2% albuminę surowicy zwierzęcej (JRH Biosciences) dodano w trzech powtórzeniach do komórek konfluentnych hodowanych na 96-studzienkowych płytkach do hodowli tkankowych (Packard). Komórki inkubowano przez 1,5 godz. w 37°C; delikatnie trzykrotnie płukano zbuforowanym fizjologicznym rozPL 213 030 B1 tworem soli Hank'a zawierającym wapń i magnez (HBSS⁺⁺, JRH Biosciences) i następnie odessano. Do każdej studzienki dodano sto mikrolitrów Mycosinct 20 (Packard) i związaną z komórką radioaktywność oznaczono ilościowo w Top Counter (Packard).

Do określenia niespecyficznego wiązania przeprowadzono doświadczenia z podobnym zestawem rozcieńczeń w obecności stukrotnego nadmiaru niewyznakowanego przeciwciała.

Do określenia liczby komórek wyszczepionych w każdej studzience, komórki z szeregu studzienek usunięto trypsyną, zebrano i zliczono pod mikroskopem. Liczbę receptorów na komórkę obliczono jak następuje:

Liczba receptorów/komórkę = specyficznie związane cpin x 6,023 x 10e23 cząsteczek/mol aktywność specyficzna (cpm/g)xmasa mol. (g/mol)xliczba komórek

Bmax, maksymalną liczbę miejsc wiązania na komórce, i Kd określono z dopasowania nieliniowej regresji danych przy pomocy PRISM.

Wyniki i dyskusja

Określenie wartości powinowactwa wiązania przeprowadzono przez pomiar wiązania dla różnych stężeń GenO95 (i ReoPro) do oczyszczonych integryn ανβ3 i ανβ5 i do receptorów powierzchniowych w równowadze. Krzywe nasycenia wiązania były prostokątnymi hiperbolami sugerując jedno miejsce wiązania do receptora dla GenO95 i ReoPro (Fig. 5-6; Motulsky H., 1999). Analizę tych danych nasycenia wiązania (czasem nazywanych doświadczeniami Scatcharda) przeprowadzono przy pomocy miejscowego dopasowania hiperboli przez nieliniową regresję przy pomocy PRISM w celu uzyskania powinowactwa Kd, i liczby receptorów, Bmax (Motulsky H., 1999).

W celu zapewnienia dokładnego określenia wartości powinowactwa wiązania użyto szeregu partii GenO.95, ReoPro i oczyszczonych integryn. Krzywa nasycenia wiązania GenO.95 do płytki opłaszczonej ανβ3 (Fig. 5A) i krzywa wiązania ReoPro do płytki opłaszczonej ανβ3 (Fig. 5B) przedstawia wartość średnia i odchylenie standardowe z sześciu niezależnych doświadczeń. Wyniki otrzymane dla tritonowego preparatu ανβ3 były bardziej powtarzalne niż otrzymane dla preparatu oktylowego. Na szalkach opłaszczonych ανβ wartość średnia Kd dla GenO.95 wynosiła 2,1 ± 1,33 x 10^-10 M; a wartość średnia Kd dla ReoPro wynosiła 2,5 ± 1,46 x 10^-10 M.

Krzywą nasycenia wiązania GenO.95 do płytki opłaszczonej aves (Fig. 6A) i krzywą wiązania ReoPro do płytki opłaszczonej ανβ5 (Fig. 6B) przedstawiono jako wartości średnie oraz odchylenie standardowe z sześciu niezależnych doświadczeń. Wyniki otrzymane dla preparatu oktylowego były bardziej spójne niż otrzymane dla preparatu tritonowego. Wartość średnia Kd dla GenO.95 na ανβ5 wynosiła 2,5 ± 1,04 x 10^-10 M. ReoPro nie wykazywało ani wiązania ani zależnej od dawki odpowiedzi na płytkach opłaszczonych ανβ5. Wartości powinowactwa wiązania otrzymane dla oczyszczonych integryn porównano z wiązaniem do receptorów wyrażonych na różnych liniach komórkowych. Fig. 7A-c przedstawia wiązanie 125-1 GenO.95 z komórkami A375S2, które wyrażają ανβ3 i ανβ3 (Fig. 7A). Wartości średnie powinowactwa do komórek A375S2 wynosiły: Kd=5,2 ± 2,04 x 10^-9 M i 120 tysięcy ± 37 tysięcy receptorów/komórkę. Komórki HT-29 wyrażają ανβ5. Wartości powinowactwa wiązania 125-1 GenO.95 z komórkami HT-29 wynosiły: Kd = 1,3 ± 3,76 x 10^-10 M i 81 tys . ± 24 tys. receptorów/komórkę (Fig. 7B). Komórki M21 wyrażają integryny ανβ3 i ανβ5. Wiązanie 125-1 GenO.95 do komórek M21 wynosiło: Kd = 8,5 ± 3,03 x 10^-9 M i 200 tys. ± 80 tys. receptorów/komórkę (Fig. 7C).

Podobne badania wiązania przez komórkę przeprowadzono z 125-1 ReoPro na różnych liniach komórkowych. Fig. 8 A-C przedstawia wiązanie 125-1 ReoPro z komórkami A375S2, a otrzymane wartości średnie wynosiły: Kd = 22 ± 3,7 x 10^-9 M i 370 tys. ± 190 tys. receptorów/komórkę (Fig. 8A). Na komórkach HT-29 125-1 ReoPro wykazuje minimalne wiązanie (Fig. 8B). Wiązanie ReoPro z komórkami M21 wynosiło: Kd = 10 ± 2,00 x 10^-9 M i 660 tys. ± 120 tys. receptorów /komórkę (Fig. 8C). Wartości wiązania 125-1 ReoPro na komórkach M21 są zgodne z wcześniej opublikowanymi wartościami (Tam i wsp., 1998).

Podsumowanie wyników wiązania przedstawiono w Tabelach 2-3

T a b e l a 2 Podsumowanie powinowactw GenO.95 i ReoPro do oczyszczonych integryn

	Płytka opłaszczona ανβ3 (n=6)	Płytka opłaszczona ανβ5 (n=6)
Kd (M)	Kd (M)
GenO.95	2,1 ±1,33 x 10^-10	2,5 ± 1,04 x 10^-11
ReoPro	2,5 ± 1,46 x 10^-10	Do pominięcia

PL 213 030 B1

T a b e l a 3 Podsumowanie powinowactwa GenO.95 ReoPro do komórek

	Komórki A375S2	Komórki A375S2	Komórki HT-29	Komórki HT-29	Komórki M21	Komórki M21
	Kd(M)	Receptorów na komórkę	Kd(M)	Receptorów na komórkę	Kd(M)	Receptorów na komórkę
GenO.95	5,2±2,04x10^-9	120000±37000	1,3±0,38x10^-9	81000±24000	8,5±3,03x10^-9	200000±80000
	(n=5)	(n=7)	(n=5)	(n=7)	(n=4)	(n=8)
ReoPro	22±3,7x10^-9	370000±190000 (n=6)	Do pominięcia (n=4)	Do pominięcia (n=4)	10±2,00x10^-9 (n=3)	660000±120000 (n=7)

Hodowle w trójwymiarowej macierzy fibrynowej stosowano do wykazania, że przeciwciało to może mieć potencjalne właściwości anty-angiogenne.

Istnieją nowe, rozważane dowody, że postępujący wzrost guza zależy od angiogenezy, tworzenia nowych naczyń krwionośnych. Te nowe naczynia dostarczają guzom substancji odżywczych i tlenu, wyprowadzają produkty wtórne metabolizmu i działają jako szlaki dla przerzutów komórek nowotworowych w odległe miejsca (I). Współczesne badania dodatkowo określiły różne role integryn w procesach angiogenezy. Integryny są heterodimerowymi, transbłonowymi białkami odgrywającymi ważną rolę w adhezji, migracji, przeżywaniu i proliferacji komórek (2). Ekspresja integryny ανβ3 jest minimalna w spoczynkowych lub normalnych naczyniach krwionośnych, lecz znacząco wzrasta w komórkach naczyń podczas angiogenezy (1-3). Blisko spokrewniona, lecz odmienna, integryna ανβ5 również uczestniczy w procesie angiogenezy. Przeciwciało wytworzone przeciw ανβ3 blokowało angiogenezę indukowaną zasadowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF), podczas gdy przeciwciało specyficzne do ανβ5 hamowało angiogenezę indukowaną czynnikiem wzrostu komórek śródbłonka naczyniowego (VEGF) (1-5).

Angiogeneza może być naśladowana in vitro przy użyciu oznaczenia rozwoju śródbłonka naczyń. System ten wymaga migracji i proliferacji komórek śródbłonka naczyń. GenO95 jest ludzkim przeciwciałem monoklonalnym rozpoznającym integryny ανβ3 i ανβ5 a integryny te regulują migrację i proliferację komórek śródbłonka naczyń. Co za tym idzie określono, że GenO95 może hamować rozwój komórek śródbłonka naczyń. Przykład ten opisuje doświadczenia pokazujące, że Gen095 hamuje wzrost komórki śródbłonka naczyń na macierzy fibrynowej.

Materia ły

Ludzki zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) i ludzki czynnik wzrostu środbłonka naczyń 165 (VEGF165) otrzymano z R&D Systems (Minneapolis, MN). MAB 1967Z (LM609), przeciwciało monoklonalne przeciwko integrynie ανβ3 i MAB 1961 (P1F6), przeciwciało monoklonalne przeciwko ανβ5 otrzymano z Chemicon (Temacula, CA). ReoPro i GenO95 otrzymano z Centocor's Clinical Pharmacology and Antibody Technology Department. Ludzki fibrynogen (wolny od plazminogenu, >95% krzepliwego białka) i żelatynę ze skóry bydlęcej otrzymano z Sigma (Saint Louis, M1).

Linie komórkowe.

Huvecs, ludzkie komórki śródbłonka naczyń z żyły pępowinowej otrzymano z Clonetics (Walkersville, MA). Huvecs hodowano w podstawowym zestawie pożywek dla komórek śródbłonka naczyń (EBM) (Clonetics) zawierającym 10% FBS, długi insulinopodobny czynnik wzrostu 1, kwas askorbinowy, hydrokortyzon, ludzki czynnik wzrostu naskórka, ludzki czynnik wzrostu śródbłonka naczyń, hFGF-b, siarczan gentamycyny i amfoterycynę B. Komórki inkubowano w 37°C i 5% CO2 i pożywkę zmieniano co 2 do 3 dni. Do wszystkich doświadczeniach użyto tylko pasaży od 3 do 8.

Oparte na mikronośniku fibrynowym oznaczenie rozwoju

Dla pomiaru tworzenia naczyń włosowatych w trójwymiarowej macierzy opartej na fibrynie użyto zmodyfikowanych sposobów Nehlsa i Drenckhahna (6). Opłaszczone żelatyną mikronośniki cytodex-3 (MCs, Sigma) użyto zgodnie z zaleceniami dostawcy. Świeżo wyjałowione przez autoklawowanie MCs zawieszono w EBM-2 plus 20% FBS i komórki śródbłonka naczyń dodano do końcowego stężenia 40 komórek/MC. Komórkom pozwolono osadzić się na MCs w czasie czterogodzinnej inkubacji w 37°C. Następnie MCs zawieszono w dużej objętości pożywki i hodowano przez 2 do 4 dni w 37°C w 5% atmosferze CO2. MCs czasami wytrząsano aby zapobiec agregacji opłaszczonych komórkami ziaren. MCs zatopiono w żelu fibrynowym, który przygotowano jak następuje: ludzki fibrynogen (2 mg/ml) zawieszono w pełnej pożywce EBM-2 zawierającej bFGF lub surowicę. Roztwór ten zawierał również

PL 213 030 B1 różne przeciwciała. Aby zapobiec nadmiernej fibrynolizie przez komórki zatopione w fibrynie dodano do roztworu fibrynogenu i pożywki hodowlanej aprotyninę w stężeniu 200 U/ml. Opłaszczone komórkami mikronośniki dodano do roztworu fibrynogenu przy gęstości 100 do 200 MCs/ml (50-100 ziaren na studzienkę -48 studzienkowej płytki) i krzepnięcie indukowano dodając trombinę (0,5 U/ml). Po zakończeniu krzepnięcia, 0,5 ml roztworu (zawierającego wszystkie opisane powyżej składniki z wyjątkiem fibrynogenu i trombiny) dodano do macierzy fibrynowych. Płytki inkubowano w 37°C i 5% CO2 przez 1 do 3 dni. Po 1-3 dniach żele utrwalono 3% paraformaldehydem rozpuszczonym w PBS i określono ilość kiełkujących naczyń włosowatych o długości przekraczającej wymiar ziarna MC (150 μm).

Wyniki i dyskusja

Huvecs mogą tworzyć kiełki typu naczynia włosowatego gdy hodowane są w żelu fibrynowym (Fig. 9). Komórki śródbłonka naczyń wędrują na zewnątrz ziaren opłaszczonych żelatyną i wydłużają się w długie filipodia. Długie kiełki utworzone są z szeregu komórek tworzących naczynie ze światłem. Proces ten przypomina tworzenie naczyń włosowatych in vivo, ponieważ wymaga inwazji, migracji i proliferacji komórek śródbłonka naczyń. Ocena ilościowa tworzenia kiełków ujawniła, że GenO95 hamuje tworzenie kiełków przez komórki śródbłonka naczyniowego w pożywce bFGF lub w pożywce pełnej (Fig. 10). Kombinacja LM609 i P1F6 zwykle wydajniej hamowała tworzenie kiełków niż GenO95 (Fig. 11).

Wniosek

Tworzenie nowych naczyń krwionośnych z istniejących naczyń krwionośnych jest cechą angiogenezy. Proces ten może być naśladowany in vitro przez oznaczenie kiełkowanie śródbłonka. To kiełkowanie odpowiada mikrokapilarom tworzącym się w odpowiedzi na pobudzenie angiogenne takie jak bFGF lub różne bodźce występujące w surowicy. GenO95 zależnie od dawki hamował stymulowanie przez bFGF i pełną pożywkę kiełkowanie komórek śródbłonka naczyń, co sugeruje, że przeciwciało to może skutecznie hamować funkcję ανβ3 i ανβ5. Nie jest wiadomym dlaczego GenO95 nie było tak skuteczne jak kombinacja LM609 i P1F6, lecz jest możliwym, że GenO95 rozpoznaje ανβ3 i ανβ5 z niższym powinowactwem niż odpowiednio LM609 i P1F6. Łącznie, dane te pokazują, że GenO95 może hamować złożony proces tworzenia mikronaczyń in vitro.

Literatura

1. Gastl G, Hermann T, Steurer M, Zmija J, Gunsilius E, Unger C, i Kraft A. 1997. Angiogenesis as a Target for Tumor Treatment. Oncology 54:177-184.

2. Eliceiri BP, i Cheresh DA. 1999. The role of aV integrins during angiogenesis: insights into potential mechanisms of action and clinical development. The Journal of Clinical Investigation 103:1227-1230.

3. Brooks PC, Montgomery AM, Rosenfeld M, Reisfeld RA, 1994. Integrin ανβ3 antagonists promote tumor regression by inducing apoptosis of angiogenic blood vessels. Cell 79:1157-1164.

4. Enenstein J, Walweh NS, i Kramer RH. 1992. Basic FGF and TGF-β differentially modulate integrin expression of human microvascular endothelial cells. Exp. Cell Res. 203:499-503.

5. Friedlander M, Brooks PC, Shafer RW, Kincaid CM, Varner JA, i Cheresh DA. 1995. Definition of two angiogenic pathways by distinct aV integrins. Science 27 0:1500-1502.

6. Nehls, V i Drenckhahn, D. 1995. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvascular Res. 50:311-322.

P r z y k ł a d 5: Wpływ przeciwciała anty-dwuintegrynowego na adhezję, migrację i inwazję komórek guza i śródbłonka naczyń

Streszczenie

Hybrydowe myszy F2 (CBA/J x C57/BL6/J) (1-4) zawierające transgeny regionu zmiennego i stałego zarówno łańcucha ciężkiego jak i lekkiego immunizowano ludzką łożyskową ανβ3. Jedna fuzja dała całkowicie ludzkie przeciwciało monoklonalne IgG1K reaktywne względem ανβ3 nazwane GenO95. Stwierdzono, że całkowicie ludzkie przeciwciało jest reaktywne względem integryn ανβ3 i ανβ5 (5). Te integryny uczestniczą w adhezji, migracji i inwazji komórek guza i śródbłonka naczyń. Co za tym idzie scharakteryzowano efekt GenO95 na zależną od integryny ruchliwość komórek. GenO95 hamuje wiązanie z fibronektyną, zdenaturowanym kolagenem, fibrynogenem i fibryną śródbłonka naczyń żyły pępowinowej (HUVEC) oraz ludzkich komórek czerniaka, lecz nie blokuje adhezji komórek do fibronektyny i kolagenu typu I. GenO95 hamuje również migrację komórek śródbłonka naczyń, która jest pobudzana zasadowym czynnikiem wzrostu fibroblastów i niską dawką surowicy. GenO95 hamuje inwazję komórek nowotworowych przez żel fibrynowy. Podsumowując, GenO95 blokuje ανβ3 i ανβ5 w różnych oznaczeniach komórkowych in vitro.

PL 213 030 B1

Skróty

BSA, albumina surowicy bydlęcej, CO2 - dwutlenek węgla, DMSO - dimetylosulfotlenek, FBS płodowa surowica bydlęca, Ig - immunoglobulina, Mab - przeciwciało monoklonalne, OD - gęstość optyczna, RT - temperatura pokojowa, HUVECS - ludzkie komórki śródbłonka naczyń żyły pępowinowej, bFGF - bydlęcy zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów.

Wstęp

Istnieją obecnie nowe poważne dowody, że postępujący wzrost guza zależy od angiogenezy. Tworzenie nowych naczyń krwionośnych dostarcza guzowi substancji odżywczych i tlenu, wyprowadza produkty odpadowe i działa jako droga dla rozprzestrzeniania komórek guza do odległych miejsc. Szereg badań określiło rolę integryn w procesie angiogenezy.

Integryny są heterodimerowymi transbłonowymi białkami odgrywającymi kluczową rolę w adhezji komórek do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i uczestniczącymi w przeżyciu, proliferacji i migracji komórek (6). Podczas angiogenezy ανβ3 i ανβ5 są wytwarzane w większej ilości na powierzchni aktywowanych komórek śródbłonka naczyń, co z kolei pomaga tym komórkom w migracji i proliferacji (6). Przeciwciało wytworzone przeciw ανβ3 blokuje angiogeneze indukowaną zasadowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF), podczas gdy przeciwciało specyficzne dla ανβ5 hamuje angiogenezę indukowaną czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) (6, 7). Oprócz regulowania angiogenezy, ανβ3 i ανβ5 regulują adhezję, migrację i inwazję komórek guza, procesy wymagane do przerzutowania komórek guza. Wcześniejsze badania wykazały, że Gen095 wiąże się z oczyszczonymi integrynami ανβ3 i ανβ5, co za tym idzie określono, że przeciwciała te mogą funkcjonalnie blokować zależną od ανβ3 i ανβ5 adhezję, migrację i inwazję komórek guza.

Materiały i metody

Materia ły

Bydlęcy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) i ludzki czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego 165 (VEGF165) otrzymano z R&D Systems (Minneapolis, MN). MAB1976Z (LM609), przeciwciało monoklonalne przeciw integrynie ανβ3 i MAB1961 (P1F6), przeciwciało monoklonalne przeciw integrynie ανβ5 otrzymano z Chemicon (Temecula, CA). ReoPro (partia:94A04ZE) i Gen095 (partia:JG100899) otrzymano z Centocor. Biocoat, dla hodowli komórkowej (wielkość porów: 8 um) otrzymano z Becton Dickinson (Bedfrod, MA). Zestaw do oznaczenia adhezji komórek Vybrand TM (V-13181) otrzymano z Molecular Probes (Eugene, OR). Ludzki fibrynogen wolny od plazminogenu (VWF/Fn zubożony) otrzymano z Enzyme Research Labs (South Bend, IN). Żelatynę ze skóry bydlęcej otrzymano z Sigma (Saint Louis, MO). Ludzką witronektynę otrzymano z Promega (Madison, WI) i kolagen typu I otrzymano z Gibco BRL (Giathersburg, MD).

Linie komórkowe

Komórki ludzkiego śródbłonka naczyniowego żyły pępowinowej (HUVECS) otrzymano z Clonetics (Walkersville, MA) i hodowano je w zestawie pożywek EBM (Clonetics) zawierającym 10% FBS, długi R insulinopodobny czynnik wzrostu 1, kwas askorbinowy, hydrokortyzon, ludzki czynnik wzrostu naskórka, ludzki czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego, siarczan gentamycyny i amfoterycynę B. Komórki hodowano w 37°C i 5% CO2, zmieniając pożywkę co 2 do 3 dni. Komórki pasażowano gdy osiągnęły 80% konfluencji. We wszystkich doświadczeniach użyto komórek z pasaży od 3 do 8.

Linię komórek ludzkiego czerniaka A375S.2 eksprymującą integryny ανβ3 i ανβ5 otrzymano z Centocor Cell Bank, która to linia była określona jako wolna od zanieczyszczeń mykoplazmą i bakteriami. Komórki hodowano w pożywce DMEM uzupełnionej 10% FBS, 2 mM L-glutaminą, 1 mM pirogronianem sodu i 0,1 mM endogennymi aminokwasami.

Ludzkie komórki raka jelita grubego i odbytu HT29 otrzymano z Centocor Cell Biology Service Department, gdzie linia komórkowa była określona jako wolna od zanieczyszczeń mykoplazmą i bakteriami. Komórki hodowano na pożywce α-MEM uzupełnionej 10% FBS, 2 mM L-glutaminą, 1 mM pirogronianem sodu i 0,1 mM endogennymi aminokwasami.

Cytometria przepływowa.

W celu wykrycia integryn powierzchniowych komórki zebrano, wypłukano, zawieszono w pożywce RPMI bez suplementów i kolejno inkubowano przez 60 min. na lodzie z mAb anty-integrynowym (10 ug/ml) i wyznakowanym FITC kozim przeciwciałem anty-mysim (1:100) lub wyznakowanym FITC przeciwciałem anty-integrynowym (10 ug/ml). Brak pierwszorzędowego przeciwciała lub podstawienie pierwszorzędowego przeciwciała przeciwciałem dopasowanym izotypowo służyły jako kontrole negatywne. Komórki niezwłocznie analizowano przez cytometrię przepływową FACS Scan II (Becton Dickinson, Mountain View, CA).

PL 213 030 B1

Oznaczenie adhezji

Płytki do mikromiareczkowania (Linbro-Titertek, ICN Biomedicals Inc.) opłaszczono przez noc w 4°C witronektyną (1 μg/ml), żelatyną (0,1%), fibrynogenem (100 μg/ml), kolagenem typu 1 (10 μg/ml) lub fibronektyną (10 μg/ml). Bezpośrednio przed użyciem płytki płukano PBS i blokowano przez 1 godz. w 1% BSA/PBS (pH 7,4). Opłaszczone fibryną studzienki płytki do mikromiareczkowania utworzono działając trombiną (1 U/ml) na fibrynogen. Przylegające komórki (HUVECS, HT2 9 i A375S.2) wyznakowano fluorescencyjnym barwnikiem Calcein AM (Molecular Probes, Eugene, OR) zgodnie z zaleceniami producenta, zebrano, dwukrotnie płukano i zawieszono w pożywce DMEM z 0,1% BSA. Po ustaleniu gęstości komórek na 5 x 10⁵/ml komórki inkubowano z różnymi stężeniami przeciwciał przez 15 min. w 37°C. Mieszaninę komórka-przeciwciało dodano do studzienek (100 μl na studzienkę) i inkubowano przez 1 godz. w 37°C. Płytki płukano dwukrotnie PBS w celu usunięcia niezwiązanych komórek i adhezję mierzono we fluorescencyjnym czytniku do płytki (Fluoroscan) przy 485-538 nm. Adhezja komórek do studzienek opłaszczonych BSA służyła jako kontrola negatywna. Izotypowo dopasowane przeciwciała służyły jako kontrola negatywna.

Oznaczenie migracji z chemotaksją

Oznaczenia migracji komórek przeprowadzono w komorach z 24 połączonymi studzienkami z błoną polistyrenową (6,5 mm średnicy, 10 Lim grubości i 8 μm wielkości porów) . Zbierano komórki z 24 godzinnej hodowli przed osiągnięciem konfluencji (HUVECS lub A375S.2) działając trypsynąEDTA, płukano dwukrotnie i zawieszano w odpowiedniej dla nich pożywce bez surowicy zawierającej 0,1% BSA. Do górnej komory dodano komórki (100 000/500 L l) w obecności lub przy braku przeciwciał. Dla podtrzymania migracji komórek spowodowanej chemotaksją, do dolnej komory dodano 750 L l pożywki zawierającej 0,1% BSA i witronektynę (2 L g/ml) lub surowicę (2% dla HUVECS i 10% dla komórek A375S2) i płytkę umieszczono w inkubatorze do hodowli tkankowej. Migrację zakończono po 4 do 8 godzinach przez usunięcie komórek na górze przy pomocy bawełnianego wacika i następnie filtry utrwalono 3% paraformaldehydem i wybarwiono fioletem krystalicznym. Zasięg migracji komórkowej określono przy pomocy mikroskopu świetlnego i obrazy zbadano przy pomocy oprogramowania do analizy obrazu Phase 3 (Glen Mills, PA). Analizy komputerowe całkowitego regionu zajętego przez zabarwione komórki po dolnej stronie filtra wykazały ich bezpośrednią proporcjonalność do zasięgu migracji komórkowej.

Oznaczenie hepatotaktycznej migracji

Oznaczenia migracji komórkowej przeprowadzono przy pomocy komór o połączonych studzienkach, jak opisano powyżej, z nieznacznymi modyfikacjami. W skrócie, dolną stronę błony opłaszczano witronektyną (2 L g/ml) przez 60 minut w temperaturze pokojowej i następnie blokowano roztworem 1% BSA/PBS w temperaturze pokojowej przez 60 minut. Następnie błony płukano w PBS i suszono na powietrzu. Do dolnych komór dodawano pożywkę wolną od surowicy (750 L l) zawierającą 0,1% BSA i bFGF (20 ng/ml). Hodowle 24 godz. przed osiągnięciem konfluencji zebrano przy użyciu trypsyny-EDTA, płukano dwukrotnie i ponownie zawieszano w pożywce wolnej od surowicy. Komórki (100000/500 L l) dodawano do górnej komory wraz z przeciwciałami lub bez nich. Komory umieszczano w inkubatorze do hodowli tkankowej i pozwolono na zachodzenie migracji przez 6 godz. Zasięg migracji komórkowej określono jak opisano powyżej.

Oznaczenie inwazji

Fibrynogen (wolny od plazminogenu, 100 L l, 10 mg/ml) i 100 L l trombiny 1 U/ml zmieszano i niezwłocznie dodano do górnej komory 24 studzienkowych płytek o połączonych studzienkach (średnica 6,5 mm, 10 L m grubości i 8,0 L m wielkości porów, Costar). Płytki inkubowano przez 30 min. w 37°C w celu utworzenia żelu fibrynowego. Konfluentne komórki guza (A37 5S.2) trawiono trypsyną, wirowano, zawieszano w podstawowej pożywce uzupełnionej 0,1% BSA i 10 L g/ml plazminogenu (Enzyme Research Labs, South Bend, IN) z różnymi stężeniami przeciwciał i inkubowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Komórki (100000/500 L l) dodawano do górnej komory w obecności lub przy braku przeciwciał. Dolny pojemnik komory do inwazji wypełniono 0,75 ml 10% FBSDMEM, które służyły jako chemoatraktant i płytkę przeniesiono do inkubatora do hodowli tkankowej. Po 24 godzinach zakończono inwazję przez usunięcie komórek po górnej stronie przy pomocy bawełnianego wacika i filtr utrwalono 3% paraformaldehydem i wybarwiono fioletem krystalicznym. Zasięg migracji komórkowej zbadano przy pomocy oprogramowania Phase 3 jak to opisano powyżej.

Wyniki i dyskusja

Gen095 hamuje zależną od ανβ3 i ανβ5 adhezję komórkową.

PL 213 030 B1

Ponieważ GenO95 wiąże się z integrynami ανβ3 i ανβ5 sprawdzono czy komórki guza (A375S.2 i HT29) i komórki śródbłonka naczyń wyrażają te integryny. Cytometria przepływowa wykazała, że komórki A375S.2 i HUVEC wyrażają obie integryny ανβ3 i ανβ5 zaś komórki HT29 wyrażają ανβ5, lecz nie wyrażają integryny ανβ3 (Fig. 12 A-I).

Komórki HT29 (12 A, B i C) wyrażają na swojej powierzchni ανβ5, lecz nie wyrażają integryny ανβ3. HUVEC (12 D, E i F) i komórki A375S.2 (12 G, H i I) wyrażają na swojej powierzchni integryny ανβ5 i ανβ3. Komórki guza i komórki śródbłonka naczyń wybarwiono immunofluorescencyjnie i zbadano przez cytometrię przepływową. Histogram po lewej stronie przedstawia tło fluorescencji w obecności izotypowo dopasowanego przeciwciała. Histogram po prawej pokazuje barwienie pozytywne. A, D, G, LM609 (mAb przeciw ανβ3, 10 (g/ml); B, E, H, P1F6 (mAb przeciw ανβ5, 10 (g/ml); i C, F, I, GenO95 (10 (g/ml).

Wpływ Gen095 na adhezję komórek HUVEC, A375S.2 i HT29 do różnych białek macierzy oznaczono szczegółowo. GenO95 całkowicie hamował adhezję komórek HUVEC i A375S.2 do witronektyny i częściowo do fibronektyny, żelatyny i fibryny opłaszczających płytki, co wskazuje, że przeciwciało może blokować ανβ3 i ανβ5 (Fig. 2 i 3, Tabela 1 i 2).

T a b e l a 5 Adhezja komórek A375S.2 do witronektyny, żelatyny, fibrynogenu, fibryny, fibronektyny i kolagenu typuI. Zasięg adhezji komórek w obecności przeciwciała w różnych stężeniach przestawiono na wykresie jako procent adhezji komórek przy braku przeciwciała, którą uznano za 100%. Każdy punkt informacyjny jest wartością średnią z trzech powtórzeń (+/-SD). Stężenie użytych przeciwciał wynosiło 10 (g/ml.

Adhezja (%) +/- SD %

	Witronektyna	Żelatyna	Fibrynogen	Fibryna	Fibronektyna	Kolagen typu I
Ludzka IgG	104,0±5,3	94,6±12,4	102,5±5,9	99,5±4,0	100,0±5,5	99,1±3,3
LM609	42,1 ±6,1	25,2±7,1	14,0±1,8	50,0±1,9	104,0±8,1	100,0±1,5
PIF6	28,5±3,8	87,4±7,8	99,4±3,6	92,9±4,7	101,0±5,7	101,0±7,3
LM609-PIF6	0,9±0,3	1,1±1,5	10,3±2,6	47,6±3,2	109,0±4,1	102,0±4,6
Gen095	1,4±0,4	23,2±7,2	11,4±2,8	43,3±3,5	103,0±4,5	104,0±5,9
ReoPro	38,1±0,7	6,0±1,0	6,5±2,1	12,9±3,8	104,0±5,6	93,1 ±3,1

Adhezja komórek HT29 ludzkiego raka jelita grubego. Oznaczenie adhezji przeprowadzono jak opisano w Metodach. Adhezja komórek do studzienek opłaszczonych BSA służyła jako kontrola negatywna. Dane na Fig. 15 są przedstawione na wykresie jako procent maksymalnego wiązania (brak przeciwciała) i są wartością średnią z trzech oznaczeń (+/-SD). GenO95 blokuje migrację ludzkich komórek czerniaka i śródbłonka.

Integryny ανβ3 i ανβ5 uczestniczą w migracji komórkowej, tak więc pokazano czy Gen095 mógłby blokować pobudzaną witronektyną migrację komórek. Pobudzana witronektyną migracja komórek wymaga ανβ3 i ανβ5. GenO95 w sposób zależny od dawki hamował migrację komóeki śródbłonka naczyń, gdy jako chemoatraktant użyta była witronektyną (Fig. 5 i 6). Interesującym jest, że GenO95 hamuje również migrację do surowicy zarówno komóreki HUVECS jak i A375S.2 (Fig. 7-8). Odkrycie to może być potencjalnie istotne w leczeniu angiogennym i leczeniu chorób nowotworowych, ponieważ sugeruje, że cele dla GenO95, ανβ3 i ανβ5 są kluczowymi receptorami aktywowanymi przez różne występujące w surowicy czynniki migracji.

Migracja HUVECS w kierunku 2 (g/ml witronektyny. Oznaczenie przeprowadzono jak opisano w Metodach i komórkom pozwolono migrować przez 6 godzin. Fotomikrografie obejmują reprezentatywne pola (obiektyw 10x) migracji komórkowej na Fig. 16A, braku przeciwciała, (16B), Gen095 (5 (g/ml), (16 C), GenO95 (40 (g/ml). Fig. 16D jest przedstawieniem graficznym migracji komórkowej w obecności różnych stężeń GenO95. Dane znormalizowane w stosunku do procenta kontroli (bez przeciwciała) traktowanej jako 100% i każdy punkt informacyjny jest wartością średnią dla trzech filtrów międzystudzienkowych (+/-SD).

Migracja HUVECS w kierunku 2 (g/ml witronektyny w obecności przeciwciał dla ανβ3 i ανβ5. Oznaczenie migracji przeprowadzono jak opisano w Metodach i komórkom pozwolono migrować przez 6 godzin. LM609 i P1F6 są mAb skierowanymi odpowiednio przeciw ανβ3 i ανβ5. Dane przedstawione na Fig. 17 znormalizowano do procenta kontroli (bez przeciwciała), którą przyjęto za 100% przy czym każdy słupek jest wartością średnią dla trzech filtrów międzystudzienkowych (+/- SD). BSA,

PL 213 030 B1 mysie IgG i ludzkie IgG służyły jako kontrole negatywne. LM609-P1F6 oznaczają kombinacje obu przeciwciał. Przeciwciała i BSA użyto w stężeniach 10 μg/ml.

Migracja HUVECS w kierunku 2% FBS. Oznaczenie migracji prowadzono przez 4 godz. i dane zbierano jak opisano w Metodach. Fig. 18A jest graficznym przedstawieniem migracji komórkowej w obecności LM609, P1F6, kombinacji LM609 plus P1F6, izotypowo dopasowanych przeciwciał kontrolnych (ludzkich i mysich). Przeciwciała i białka użyto w stężeniu 10 μg/ml. Fig. 18(B) jest graficznym przedstawieniem migracji komórkowej w obecności ReoPro i GenO95. Fotomikrografie obejmują reprezentatywne pola (obiektyw 10x) migracji komórkowej na Fig. 18(C), brak przeciwciała, Fig. 18(D), GenO95 (5 μg/ml), i Fig. 18(E), GenO95 (20 μg/ml). Dane znormalizowano w stosunku do procenta kontroli (bez przeciwciała) traktowanej jako 100% a każdy punkt jest wartością średnią dla trzech filtrów międzystudzienkowych (+/-SD).

Migracja komórek A375S.2 w kierunku 10% FBS. Oznaczenie migracji prowadzono przez 4 godz. i dane zbierano jak opisano w Metodach. Przeciwciała użyto w stężeniu 10 μg/ml. Fig. 19A jest graficznym przedstawieniem migracji komórkowej w obecności różnych stężeń GenO95. Fig. 19 (B) jest graficznym przedstawieniem migracji komórkowej w obecności LM609, P1F6, kombinacji LM609 plus P1F6, dopasowanych izotypowo przeciwciał kontrolnych (ludzkich i mysich). Dane znormalizowano w stosunku do procenta kontroli (bez przeciwciała) traktowanej jako 100% przy czym każdy punkt jest wartością średnią dla trzech filtrów międzystudzienkowych (+/-SD). Fotomikrografie obejmują reprezentatywne pola (obiektyw 10x) migracji komórkowej na Fig. 19 (C), brak przeciwciała, Fig. 19(D), GenO95 (5 pg/ml), i Fig.19(E), GenO95 (20 pg/ml).

Opisane wyżej wyniki wykazują, że Gen095 blokuje migrację nowotworową i śródbłonka naczyń do witronektyny i surowicy. Następnie określono czy przeciwciało to mogłoby hamować migrację komórek stymulowaną bFGF. Jak pokazano na Fig. 9, bFGF stymulował migrację komórek HUVEC w kierunku witronektyny a GenO95 znacząco blokował tę stymulowaną migrację komórkową.

Migracja HUVECS w kierunku witronektyny w obecności bFGF. Dolna strona filtrów w komorze migracyjnej była opłaszczona 2 pg/ml witronektyny i oznaczenie przeprowadzono jak opisano w Metodach. Komórkom pozwolono migrować przez 6 godzin. Na Fig. 20 A-E każdy punkt informacyjny jest wartością średnią dla trzech międzystudzienkowych filtrów (+/-SD). Fig. 20(A), bFGF, Fig. 20(B), Gen095 (5 pg/ml); Fig. 20(C), Gen095 (40 μg/ml); Fig. 20(D), bez bFGF. Fig. 20(E), Hamowanie migracji komórkowej w obecności różnych przeciwciał przedstawiono graficznie. GenO95 blokuje inwazję ludzkich komórek czerniaka.

Opisane powyżej wyniki wskazują, że GenO95 może hamować adhezję i migrację komórkową. Dlatego zastanawiano się czy to przeciwciało mogłoby blokować inwazję komórek guza, wieloetapowy proces wymagający adhezji komórek, degradacji macierzy i migracji komórek przez zdegradowaną macierz. Wybrano fibrynę jako macierz dla komórek guza, ponieważ GenO95 było zdolne do blokowania adhezji komórek guza do fibryny (Fig. 3). Jak pokazano na Fig. 10 inwazja komórek A375S.2 może być zahamowana przez LM609, co sugeruje że uczestniczy w tym procesie przynajmniej ανβ. GenO95 w sposób zależny od dawki hamowało inwazję komórek guza przez fibrynę. Jako kontrola negatywna służyły niezwiązane IgG i mAb skierowane przeciw płytkom GPIIb/IIIa (10E5). Wspólnie dane te sugerują, że Gen095 może skutecznie blokować inwazję ludzkich komórek czerniaka.

Inwazja komórek A375S.2 przez żel fibrynowy (5 mg/ml). Oznaczenie inwazji prowadzono przez 24 godziny i dane zebrano jak opisano w Materiałach i Metodach. Fotomikrografie obejmują reprezentatywne pola (obiektyw 4x) inwazji komórek na Fig. 21(A), brak przeciwciała, Fig. 21(B) Gen095 (10 pg/ml), Fig.21(C) i (D) są graficznym przedstawieniem inwazji komórek w obecności Gen095, 10E5 F(ab')2, LM609, P1F6, LM-P1F6 (LM609 plusP1F6), ludzkie i mysie IgG (H-IgG i M-IgG). Wykres Fig. 21(D): stężenie wszystkich przeciwciał i białek wynosi 10 pg/ml. Dane znormalizowano w stosunku do procenta kontroli (bez przeciwciała) traktowanej jako 100% i każdy punkt jest wartością średnią dla trzech filtrów międzystudzienkowych (+/-SD).

Wniosek

Adhezja, migracja i inwazja komórkowa wymaga integryn takich jak ανβ3 i ανβ5. Gen095 jest zdolne do funkcjonalnego blokowania integryn ανβ3 i ανβ5, które są wyrażane przez komórki guza i śródbłonka naczyń. Gen095 było zdolne do blokowania migracji i inwazji komórek, które były stymulowane bFGF lub surowicą. Wyniki te sugerują, że Gen095 jest silnym inhibitorem komórek guza i śródbłonka naczyń wyrażających integryny ανβ3 i ανβ5.

PL 213 030 B1

Literatura

1. Taylor, L.D., C.E. Carmack, D. Huszar, K.M. Higgins, R. Mashayekh, G. Sequar, S.R. Schramm, C-C. Kuo, S . L.O'Donnell, R.M. Kay, C.S. Woodhouse, i N. Lonberg. 1993. Human immunoglobulin transgenes undergo rearrangement, somatic mutation and class switching in mice that lack endogenousIgM. International Immunology 6:579-591.

2. Lonberg, N., L.D. Taylor, F.A. Harding, M. Trounstine, K. M. Higgins, S.R. Schramm, C-C. Kuo, R. Mashayekh, K. Wymore, J.G. Mccabe, D. Munoz-O'Regan, S.L. O'Donnell, E.S.G. Lapachet, T. Bengoechea, D. M. Fishwild, C.E. Carmack, R.M. Kay, i D. Huszar. 1994. Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature 368:856-859.

3. Neuberger, M. 1996. Generating high-activity human Mabs in mice. Nature Biotechnology 14:826.

4. Fishwild, D.M., S.L. O'Donnell, T. Bengoechea, D.V. Hudson, F. Harding, S.L. Bernhard, D. Jones, R.M. Kay, K. M. Higgins, S.R. Schramm, i N. Lonberg. 1996. High-activity human IgG monoclonal antibodies from a novel strain of minilocus transgenic mice. Nature Biotechnology 14:845-851.

5. Gastl G, Hermann T, Steurer M, Zmija J, Gunsilius E, Unger C, i Kraft A. 1997. Angiogenesis as a Target for Tumor Treatment. Oncology 54:177-184.

6. Eliceiri BP, i Cheresh DA. 1999. The role of aV integrins during angiogenesis: insights into potential mechanisms of action and clinical development. The Journal of Clinical Investigation 103:1227-1230.

7. Friedlander M, Brooks PC, Shafer RW, Kincaid CM, Varner JA, i Cheresh DA. 1995. Definition of two angiogenic pathways by distinct aV integrins. Science 27 0:1500-1502.

Powinno być oczywiste, że wynalazek może być stosowany inaczej niż to w szczególny sposób opisano w przedstawionym opisie i przykładach.

PL 213 030 B1

LISTA SEKWENCJI <110> Giles-Komar, Jill; Heavrter, George; Snyder, Linda; Trikha, Mohit

Wyizolowane ludzkie monoklonalne przeciwciało ant y-dwu mt eg rymowe i jego fragment wiążący antygen, wyizolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne, kompozycja farmaceutyczna, wyizolowana cząsteczka kwasu (J X nuit 1 e i nowego, komórka gnspndarra, spneóh wytwarzania ludzkie jo πιο noki ona 1 r.ego przeciwciała antyćwuir.tegryncwegc, transgemczne zwierzę msbędące człowiekiem oraz zastosowania takiego przeciwciała lub j fragmentu i wyrób przemysłowy <13O> CEN 249 <16O> I?

<170> Patentln wersja 2.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Arg Tyr Thr Met His 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 ,

Val Ile Ser Phe Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Glu Ala Arg Gly Ser Tyr Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> δ <212> PRT <213> Romo sapiens <400> 5

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr l 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6

PL 213 030 B1

Gin. Gin Arg Ser Asn Trp Pro Pro 1 5 <210> 7 <211» 119 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 7

Gin 1

Val

Gin

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly

' Gly

Gly Val 10

Val

Gin

Pro

Gly Arg 15

ser

Arg

Leu 20

Ser

Cys

Ala

Ser 25

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser 30

Arg

Tyr

Thr

Met

His 35

Trp

Val

Arg

Gin

Ala 40

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Val

Ala

Val 50

Ile

Ser

Phe

Asp

Gly 55

Ser

Asn

Lys

Tyr

Tyr 60

Val

Asp

Ser

Val

Lys 65

Gly Arg

Phe

Thr

Ile 70

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser 75

Glu

Asn

Thr

Leu

Tyr 80

Leu

Gin

Val

Asn

Ile 85

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Glu

Ala 100

Arg

Gly

Ser

Tyr

Ala 105

Phe

Asp

Ile

Trp

Gly 110

Gin

Gly

Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210» S <211» 108 <212» PRT <213» Homo sapiens

<400» 8

Glu 1

Ile

Val

Leu

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ala

Thr 10

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 15

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr 20

Leu

Ser

Cys

Arg

Ala 25

Ser

Gin

Ser

Val

Ser 30

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp 35

Tyr

Gin

Lys

Pro 40

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg 45

Leu

Ile

Tyr

Asp 50

Ala

Ser

Asn

Arg

Ala 55

Thr

Gly

Ile

Pro

Ala 60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser 65

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp 70

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile 75

ser

Leu

Glu

Pro 80

Glu

Asp

Phe

Ala

Val ss

Tyr

Cys

Gin

Gin 90

Arg

Ser

Asn

Trp

Pro 95

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Lys

Val

Asp

Ile

Lys

PL 213 030 B1

100 105

<210>	9
<211>	1048
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	9

Met 1

Ala

Phe

Pro

Pro 5

Arg

Leu

Arg 10

Leu

Gly

Pro Arg

Gly 15

Leu

Pro

Leu

Leu 20

Ser

Gly

Leu

Leu 25

Pro

Leu

Cys

Arg

Ala 30

Phe

Asn

Leu

Asp

Val 35

Asp

Ser

Pro

Ala

Glu 40

Tyr

Ser

Gly

Pro

Glu 45

Gly

Ser

Tyr

Phe

Gly 5Q

Phe

Ala

Val

Asp

Phe 55

Phe

Val

Pro

Ser

Ala 60

Ser

Arg

Met

Phe

Leu

Val

Gly

Ala

Pro

Lys

Ala

Asn

Thr

Gin

Pro

Gly

Ile

S5 70 75 80

Val Glu Gly Gly Gin Val Leu Lys Cys Asp Trp Ser Ser Thr Arg Arg 85 90 95

Cys

Gin

Pro

Ile 100

Glu

Phe

Asp

Ala

Thr 105

Gly

Asn

Arg

Asp

Tyr 110

Ala

Lys

Asp

Pro 115

Leu

Glu

Phe

Lys

Ser 120

His

Gin

Trp

Phe

Gly 125

Ala

Ser

Val

Arg

Ser 130

Lys

Gin

Asp

Lys

Ile 135

Leu

Ala

Cys

Ala

Pro 140

Leu

Tyr

His

Trp

Arg

Thr

Glu

Met

Lys

Gin

Glu

Arg

Glu

Pro

Val

Gly

Thr

Cys

Phe

Leu

145 150 155 ISO

Gin Asp Gly Thr Lys Thr Val Glu Tyr Ala Pro Cys Arg Ser Gin Asp 165 170 175

Ile

Asp

Ala

Asp 130

Gly

Gin

Gly

Phe

Cys 185

Gin

Gly

Phe

Ser 190

Ile

Asp

Phe

Thr

Lys 195

Ala

Asp

Arg

Val

Leu 200

Leu

Gly

Pro

Gly 205

Ser

Phe

Tyr

Trp

Gin 210

Gly

Gin

Leu

Ile

Ser 215

Asp

Gin

Val

Ala

Glu 220

Ile

Val

Ser

Lys

Tyr

Asp

Pro

Asn

Val

Tyr

Ser

Ile

Lys

Tyr

Asn

Gin

Leu

Ala

Thr

225 230 235 240

Arg Thr Ala Gin Ala Ile Phe Asp Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Val 245 250 255

Ala Val Gly Asp Phe Asn Gly Asp Gly Ile Asp Asp Phe Val Ser Gly 260 265 270

PL 213 030 B1

Val Pro Arg Ala Ai_a Arg Thr Leu Gly Met Val Tyr Ile Tyr Asp Gly 275 280 235

Lys Asn Met Ser Ser Leu Tyr Asn Phe Thr Gly Glu Gin Met Ala Ala 290 295 300

Tyr 305

Phe

Gly

Phe

Ser

Val 310

Ala

Thr

Asp

Ile 315

Asn

Gly

Asp

Tyr 320

Ala

Asp

Val

Phe

Ile 325

Gly

Ala

Pro

Leu

Phe 330

Met

Asp

Arg

Gly

Ser 335

Asp

Gly

Lys

Leu

Gin 340

Glu

Val

Gly

Gin

Val 345

Ser

Val

Ser

Leu

Gin 350

Arg

Ala

Ser

Gly

Asp 355

Phe

Gin

Thr

Lys 3 50

Leu

Asn

Gly

Phe

Glu 355

Val

Phe

Ala

Arg

Phe 370

Gly

Ser

Ala

Ile

Ala 375

Pro

Leu

Gly

Asp

Leu 380

Asp

Gin

Asp

Gly

Phe 385

Asn

Asp

Ile

Ala

Ile 390

Ala

Pro

Tyr

Gly Gly 395

Glu

Asp

Lys

Lys 400

Gly

Ile

Val

Tyr

Ile

Phe

Asn

Gly Arg

Ser

Thr

Gly

Leu

Asn

Ala

Val

405 410 415

Pro Ser Gin Ile Leu Glu Gly Gin Trp Ala Ala Arg Ser Met Pro Pro 420 425 430

Ser

Phe

Gly Tyr 435

Ser

Met

Lys

Gly 440

Ala

Thr

Asp

Ile

Asp 445

Lys

Asn

Gly

Tyr

Pro 450

Asp Leu

Ile

Val

Gly 455

Ala

Phe

Gly

Val

Asp 460

Arg

Ala

Ile

Leu

Tyr 455

Arg

Ala Arg

Pro

Val 470

Ile

Thr

Val

Asn

Ala 475

Gly

Leu

Glu

Val

Tyr 4S0

Pro

Ser

Ile Leu

Asn 485

□ln

Asp

Asn

Lys

Thr 490

Cys

Ser

Leu

Pro

Gly 495

Thr

Ala

Leu

Lys Val

Ser

Cys

Phe

Asn

Val

Arg

Phe

Cys

Leu

Lys

Ala

Asp

500 505 510

Gly

Lys

Gly 515

Val

Leu

Pro

Arg Lys 520

Leu

Asn

Phe

Gin

Val 525

Glu

Leu

Asp 530

Lys

Leu

Lys

Gin

Lys 535

Gly

Ala

Ile

Arg Arg 540

Ala

Leu

Phe

Leu

Tyr 545

Ser

Arg

Ser

Pro

Ser 550

His

Ser

Lys

Asn

Met 555

Thr

Ile

Ser

Arg

Gly 560

Gly

Leu

Met

Gin

Cys 565

Glu

Leu

Ile

Ala 570

Tyr

Leu

Arg Asp

Glu 575

Ser

Glu

Phe

Arg

Asp

Lys

Leu

Thr

Pro

Ile

Thr

Ile

Phe

Met

Glu

Tyr

Arg

PL 213 030 B1

560

5S5

590

Łeu

Asp

Tyr 595

Arg

Thr

Ala

Asp 600

Thr

Sly Leu

Gin 605

Pro

Ile

Leu

Asn

Gin 610

Phe

Thr

Pro

Ala

Asn 615

Ile

Ser

Arg

Gin

Ala 620

His

Ile

Leu

Asp 625

cys

Gly

Glu

Asp

Asn 630

Val

Cys

Lys

Pro

Lys 635

Leu

Glu

Val

Ser

Val 640

ASp

Ser

Asp

Gin

Lys 645

Lys

Ile

Tyr

Ile

Gly 650

Asp

Asn

Pro

Leu 655

Thr

Leu

Ile

Val

Lys 650

Ala

Gin

Asn

Gin

Gly 665

Glu

Gly

Ala

Tyr

Glu 670

Ala

Glu

Leu

Ile

Val 675

Ser

Ile

Pro

Leu

Gin 6S0

Ala

ASp

Phe

Ile

Gly 685

Val

Arg

Asn

Glu

Ala

Leu

Ala

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Phe

Lys

Thr

Glu

Asn

690 «95 700

Gin Thr Arg Gin Val Val Cys Asp Leu Gly Asn Pro Met Lys Ala Gly
705	710	715	720
Thr Gin Leu Leu	Ala Gly Leu	Arg Phe Ser Val His	Gin Gin Ser Glu

725 730 735

Met

Asp

Thr

Ser 740

• Val

Lys

Phe

Asp

Leu 745

Gin

, Ile

Gin

Ser

Ser 750

Asn

Leu

Phe

ASp

Lys 755

Val

Ser

Pro

Val

Val 760

Ser

His

Lys

Val

Asp 765

Leu

Ala

Val

Leu

Ala 770

Ala

Val

Glu

Ile

Arg 775

Gly

Val

Ser

Pro 780

Asp

His

Ile

Phe

Leu 735

Pro

Ile

Pro

Asn

Trp 790

Glu

His

Lys

Glu

Asn 795

Pro

Glu

Thr

Glu

Glu 800

Asp

Val

Gly

Pro

Val 805

Val

Gin

His

Ile

Tyr 310

Glu

Leu

Arg

Asn

Asn 815

Gly

Pro

Ser

Phe 320

Ser

lys

Ala

Met

Leu 825

His

Leu

Gin

Trp

Pro 830

'Jy-j*

Lys

Tyr

Asn

Α3Π 835

Asn

Thr

Leu

Tyr 840

Ile

Leu

His

Tyr

Asp 845

Ile

Asp

Gly

Pro

Met 850

Asn

Cys

Thr

Ser

Asp 855

Met

Glu

Ile

Asn

Pro 850

Łeu

Arg

Ile

Lys

Ile 365

Ser

Leu

Gin

Thr 870

Thr

Glu

Lys

Asn

Asp 875

Thr

Val

Ala

Gly

Gin 880

Gly

Glu

Arg

Asp

His

Leu

Ile

Thr

Lys

Arg

Asp

Leu

Ala

Leu

Ser

Glu

335 890 895

PL 213 030 B1

Gly Asp Ile His 900	Thr Leu	Gly Cys Gly 905	Val Ala Gln Cys	Leu Lys 910	Ile
Val Cys Gln Val 915	Gly Arg	Leu Asp Arg 920	Gly Lys Ser Ala 925	Ile Leu	Tyr
Val Lys Ser Leu 930	Leu Trp	Thr Glu Thr 935	Phe Met Asn Lys 940	Glu Asn	Gin
Asn His Ser Tyr 94 5	Ser Leu 950	Lys Ser Ser	Ala Ser Phe Asn 955	Val Ile	Glu 960
Phe Pro Tyr Lys	Asn Leu 965	Pro Ile Glu	Asp Ile Thr Asn 970	Ser Thr 975	Leu
Val Thr Thr Asn 980	Val Thr	Trp Gly Ile 985	Gln Pro Ala Pro.	Met Pro 990	Val
Pro Val Trp Val 995	Ile Ile	Leu Ala Val 1000	Leu Ala Gly Leu 1005	Leu Leu	Leu
Ala Val Leu Val	Phe Val	Met Tyr Arg ;	Met Gly Phe Phe Lys Arg	val

1010 1015 1020

Arg Pro Pro Gln Glu Glu Gln Glu Arg Glu Gln Leu Gln Pro His Glu 1025 1030 1035 1040

Asn Gly Glu Gly Asn. Ser Glu Thr 1045 <210» 10 <211» 15 <212» DNA <213» Homo sapiens <400» 10 agatatacta tgcac ¹⁵ <210» 11 <211» 51 <212» DNA <213» Homo sapiens <400» 11 gttatafcoat ttgatggaag caataaatac tacgtagact ccgtgaaggg c 51 <210» 12 <211» 30 <212» DNA <213» Homo sapiens <400» 12 gaggcccggg gatcgtatgc ttttgatatc 30 <210» 13 <211» 33 <212» DNA <213» Homo sapiens <400» 13 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctaottag co 33 <210» 14

PL 213 030 B1 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 gatgcatcca acagggcc <210> 1S <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 cagcagcgta gcaactggcc t <210> 15 <211> 789 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16

Met Arg Ala Arg Pro Arg Pro Arg Pro Leu Trp Ala Thr Val Łeu Ala 15 10 15

Leu Gly Ala Leu Ala Gly Val Gly Val Gly Gly Pro Asn Ile Cys Thr 20 25 30

Thr Arg Gly Val Ser Ser Cys Gin Gin Cys Leu Ala Val Ser Pro Met 35 40 45

Cys

Ala 50

Trp

Cys

Ser

Asp

Glu 55

Ala

Leu

Pro

Leu

Gly £0

ser

Pro

Arg

Cys

Asp 55

Leu

Lys

Glu

Asn

Leu 70

Leu

Lys

Asp

Asn

Cys 75

Ala

Pro

Glu

Ser

Ile 30

Glu

Phe

Pro

Val

Ser 85

Glu

Ala

Arg

Val

Leu 90

Glu

Asp

Arg

Pro

Leu 95

ser

Asp

Lys

Gly

Ser 100

Gly

Asp

Ser

Gin 105

Val

Thr

Gin

Val

Ser 110

Pro

Gin

Arg

Ile

Ala 115

Łeu

Arg

Leu

Arg

Pro 120

Asp

Ser

Lys

Asn 125

Phe

Ser

Ile

Gin

val 130

Arg

Gin

val

Glu

Asp 135

Tyr

Pro

Val

Asp

Ile 140

Tyr

Leu

Met

Asp 145

Leu

Ser

Tyr

Ser

Met 150

Lys

Asp

Leu

Trp 155

Ser

Ile

Gin

Asn

Leu 160

Gly

Thr

Lys

Leu

Ala 165

Thr

Gin

Met

Arg

Lys 17 0

Leu

Thr

Ser

Asn

Leu 175

Arg

Ile

Gly

Phe

Gly 1B0

Ala

Phe

Val

Asp

Lys 185

Pro

Val

Ser

Pro

Tyr 150

Met

Tyr

Ile

Ser

Pro

Glu

Ala

Leu

Glu

Asn

pro

Cys

Tyr Asp

Met

Lys

Thr

195 200 205

PL 213 030 B1

Thr

Cys 210

Leu

Pro

Met

Phe

Gly 215

Tyr

Lys

His

Val

Leu 220

Thr

Leu

Thr

Asp

Gln 225

val

Thr

Arg

Phe

Asn 230

Glu

Val

Lys

Lys 235

Gln

Ser

Val

Ser

Arg 240

Asn

Arg

Asp

Ala

Pro 245

Glu

Gly

Phe

Asp 250

Ala

Ile

Met

Gln

Ala 255

Thr

Val

Cys

Asp

Glu 260

Lys

Ile

Gly

Trp

Arg 265

Asn

Asp

Ala

Ser

His 270

Leu

Val

Phe

Thr 275

Thr

Asp

Ala

Lys

Thr 280

His

Ile

Ala

Leu

Asp 285

Gly

Arg

Leu

Ala

Gly 290

Ile

Val

Gln

Pro

Asn 295

Asp

Gly

Gln

Cys

His 300

Val

Gly

Ser

Asp

Asn

His

Tyr

Ser

Ala

Ser

Thr

Met

Asp

Tyr

Pro

Ser

Leu

Gly

Leu

305

310

315

320

Met

Thr

Glu

Lys

Leu

Ser

Gln

Lys

Asn

Ile

Asn

Leu

Ile

Phe

Ala

Val

325

330

335

Thr

Glu

Asn

Val

Asn

Leu

Tyr

Gln

Asn

Tyr

Ser

Glu

Leu

Ile

Pro

340 345 350

Gly Thr Thr Val Gly Val Leu Ser Met Asp Ser Ser Asn Val Leu Gln 355 360 365

Leu

Ile 370

Val Asp Ala

Tyr Gly 375

Lys

Ile Arg

Ser Lys Val 380

Glu

Leu

Glu

Val

Arg

Asp

Leu

Pro

Glu

Leu

Ser

Leu

Ser

Phe

Asn

Ala

Thr

Cys

385

390

3 95

400

Leu

Asn

Glu

Val

Ile

Pro

Gly

Leu

Lys

Ser

Cys

Met

Gly

Leu

Lys

405 410 415

Ile Gly Asp Thr Val Ser Phe Ser Ile Glu Ala Lys Val Arg Gly Cys 420 425 430

Pro Gln Glu Lys Glu

Lys

Ser Phe Thr Ile Lys Pro Val Gly Phe

Lys

435

440

445

Asp

Ser

Leu

Ile

Val

Gln

Val

Thr

Phe

Asp

Cys

Asp

Cys

Ala

Cys

Gln

450

455

460

Ala

Gln

Ala

Glu

Pro

Asn

Ser

His

Arg

Cys

Asn

Gly

Asn

Gly

Thr

455 470 475 480

Phe Glu Cys Gly Val Cys Arg Cys Gly Pro Gly Trp Leu Gly Ser Gln 485 490 495

Cys

Glu

Cys

Ser 500

Glu

Asp

Tyr

Arg 505

Pro

Ser

Ola

Gln

Asp 510

Glu

Cys

Ser

Pro

Arg 515

Glu

Gly

Gln

Pro

Val 520

Cys

Ser

Gln

Arg

Gly 525

Glu

Cys

Leu

PL 213 030 B1

Cys	Gly 530	Gin	Cys	val	Cys His Ser Ser Asp S35	phe	Gly Lys Ile 540	Thr	Gly
Lys 545	Tyr	Cys	Glu	Cys	Asp Asp Phe Ser Cys 550	Val 555	Arg Tyr Lys	Gly	Glu 560
Met	Cys	Ser	Gly	His 555	Gly Gin Cys Ser Cys 570	Gly	Asp Cys Leu	Cys 575	Asp
Ser	Asp	Trp	Thr 580	Gly	Tyr Tyr Cys Asn Cys 585	Thr	Thr Arg Thr 590	Asp	Thr
Cys	Met	Ser 595	Ser	Asn	Gly Leu Leu Cys Ser 600	Gly	Arg Gly Lys 605	Cys	Glu
Cys	Gly 610	Ser	Cys	Val	Cys Ile Gin Pro Gly 615	Ser	Tyr Gly Asp 620	Thr	Cys
Glu	Lys	Cys	Pro	Thr	Cys Pro Asp Ala Cys	Thr	Phe Lys Lys	Glu	Cys

625 630 635 540

Val

Glu

Cys

Lys

Lys 645

Phe

Asp Arg

Glu

Pro 650

Tyr

Met

Thr

Glu

Asn 655

Thr

Cys

Asn

Arg

Tyr 660

Cys

Arg

Asp Glu

Ile 665

GlU

Ser

Val

Lys

Glu 570

Leu

Lys

Asp

Thr

Gly 675

Lys

Asp

Ala

Val Asn 580

Cys

Thr

Tyr

Lys

Asn 685

Glu

Asp

Cys

Val 690

Val

Arg

Phe

Gin

Tyr Tyr 695

Glu

Asp

Ser

Ser 700

Gly

Lys

Ser

Ile

Leu

Tyr

Val

Glu

Pro Glu

Cys

Pro

Lys

Gly

Pro

Asp

ile

Leu

705 710 715 720

Val Val Leu Leu Ser Val Met Gly Ala Ile Leu Leu Ile Gly Leu Ala 725 730 735

Ala

Leu

Ile 740

Trp

Lys

Leu

Ile 745

Thr

Ile

His

Asp

Arg 750

Lys

Glu

Phe

Ala

Lys 755

Phe

Glu

Arg 760

Ala

Arg

Ala

Lys

Trp 765

Asp

Thr

Ala

Asn

Pro

Leu

Tyr

Lys

Głu

Ala

Thr

Ser

Thr

Phe

Thr

Asn

Ile

Thr

770 775 780

Tyr Arg Gly Thr

785 <210> 17 <211> 799 <212> PRT <213> Kamo sapiens <400> 17

Met Pro Arg Ala Pro Ala Pro Leu Tyr Ala Cys Łeu Łeu Gly Leu Cys

PL 213 030 B1

1

5

10

15

Ala

Leu

Pro

Arg

Leu

Ala

Gly

Leu

Asn

Ile

Cys

Thr

Ser

Gly

Ser

20

25

30

Ala

Thr

Ser

Cys

Glu

Cys

Leu

Ile

His

Pro

Lys

Cys

Ala

Trp

35

40

45

cys

Ser

Lys

Glu

Asp

Phe

Gly

Ser

Pro

Arg

Ser

Ile

Thr

Ser

Arg

Cys

50

55

60

Asp

Leu

Arg

Ala

Asn

Leu

Val

Lys

Asn

Gly

Cys

Gly

Glu

Ile

GlU

70 75 80

Ser

Pro

Ala

Ser

Ser 85

Phe

His

Val

Łeu

Arg 90

Ser

Leu

Pro

Leu

Ser 95

Ser

Lys

Gly

Ser

Gly 100

Ser

Ala

Gly

Trp

Asp 105

Val

Ile

Gin

Met

Thr 110

Pro

Gin

Glu

Ile

Ala 115

Val

Asn

Leu

Arg

Pro 120

Gly

Asp

Lys

Thr

Thr 125

Phe

Gin

Leu

Gin

Val 13 0

Arg

Gin

Val

Glu

Asp 135

Tyr

Pro

Val

Asp

Leu 140

Tyr

Leu

Met

Asp 145

Leu

Ser

Leu

Ser

Met 150

Lys

Asp

Leu

Asp 155

Asn

Ile

Arg

Ser

Leu 160

Gly

Thr

Lys

Leu

Ala 165

Glu

Met

Arg

Lys 170

Leu

Thr

Ser

Asn

Phe 175

Arg

Leu

Gly

Phe

Gly 180

Ser

Phe

Val

Asp

Lys 185

Asp

Ile

Ser

Pro

Phe 190

Ser

Tyr

Thr

Ala

Pro

Arg

Tyr

Gin

Thr

Asn

Pro

Cys

Ile

Gly

Tyr

Lys

Leu

Phe

195 200 205

Pro Αβη Cys Val Pro Ser Phe Gly Phe Arg His Leu Leu Pro Leu Thr

	210	215	220
Asp 225	Arg Val Asp Ser	Phe Asn 230	Glu Glu Val Arg Lys Gin Arg Val Ser 235 240
Arg	Asn Arg Asp Ala 245	Pro Glu	Gly Gly Phe Asp Ala val Leu Gin Ala 250 255
Ala	Val Cys Lys Glu 260	Lys Ile	Gly Trp Arg Lys Asp Ala Leu His Leu 265 270
Leu	Val Phe Thr Thr 275	Asp Asp	Val Pro His Ile Ala Leu Asp Gly Lys 280 285
Leu	Gly Gly Leu Val 290	Gin Pro 295	His Asp Gly Gin Cys His Leu Asn Glu 300
Ala 305	Asn Glu Tyr Thr	Ala Ser 310	Asn Gin Met Asp Tyr Pro Ser Leu Ala 315 320

PL 213 030 B1

Leu

Gly

Glu

Lys 325

Leu

Ala

Glu

Asn

Asn Ile 330

Asn

Leu

Ile

Phe 335

Ala

Val

Thr

Lys

Asn 340

His

Tyr

Met

Leu

Tyr 345

Lys Asn

Phe

Thr

Ala 350

Leu

Ile

Pro

Gły

Thr 355

Thr

Pal

Glu

Ile

Leu 360

Asp

Gly Asp

Ser

Lys 365

Asn

Ile

Gin

Leu 370

Ile

Asn

Ala

Tyr 375

Asn

Ser

Ile Arg

Ser 380

Lys

Val

Glu

Leu

Ser

Val

Trp

Asp

Gin

Pro

Glu

Asp

Leu

Asn Leu

Phe

Thr

Ala

Thr

385 390 335 400

Cys

Gin

Asp

Gly

Val 405

Ser

Tyr

Pro

Gły

Gin 410

Arg

Lys

Cys

Glu

Gly 415

Leu

Lys

Ile

Gly Asp 420

Thr

Ala

Ser

Phe

Glu 425

Val

Ser

Leu

Glu

Ala 430

Arg

Ser

Cys

Pro

Ser 435

Arg

His

Thr

Glu

His 440

Val

Phe

Ala

Leu

Arg 445

Pro

Val

Gly

Phe

Arg

Asp

Ser

Leu

Glu

Val

Gly

Val

Thr

Tyr

Asn

Cys

Thr

cys

Gly

450 455 460

Cys 465

Ser

Val

Gly

Leu

Glu 470

Pro

Asn

Ser

Ala

Arg 475

Cys Asn

Gly

Ser

Gly 480

Thr

Tyr

Val

Cys

Gly 485

Leu

Cys

Glu

Cys

Ser 490

Pro

Gly Tyr

Leu

Gly 495

Thr

Arg

cys

Glu

Cys 500

Gin

Asp

Gly

Glu

Asn 505

Gin

Ser

Val Tyr

Gin 510

Asn

Leu

Cys

Arg

Glu 515

Ala

Glu

Gly

Lys

Pro 520

Leu

Cys

Ser

Gly Arg 525

Gly Asp

Cys

Ser

Cys

Asn

Gin

Cys

Ser

Cys

Phe

Glu

Ser

Glu

Phe Gly

Lys

Ile

Tyr

530 535 540

Gly Pro Phe Cys Glu Cys Asp Asn Phe Ser Cya Ala Arg Asn Lys Gly 545 550 555 560

Val Leu Cys Ser Gly His Gly Glu Cys His Cys Gly Glu Cys Lys Cys
	565	570	575
His Ala	Gly Tyr Ile Gly 580	Asp Asn Cys Asn 585	Cys Ser Thr Asp Ile Ser 590
Thr Cys	Arg Gly Arg Asp	Gly Gin Ile Cys	Ser Glu Arg Gly His Cys

595 600 505

Leu Cys Gly Gin Cys Gin Cys Thr Glu Pro Gly Ala Phe Gly Glu Ket 610 615 620

Cys Glu Lys Cys Pro Thr Cys Pro Asp Ala Cys Ser Thr Lys Arg Asp 525 630 535 640

PL 213 030 B1

Cya

Val

Glu

Cys

Pro 64 5

Leu

His

Ser

Gly 650

Lys

Pro

Asp Asn

Gin 555

Thr

Cys

His

Ser

Leu 660

Cys

Arg

Asp

Glu

Val 665

Ile

Thr

Trp

Val

Asp 570

Thr

Ile

Val

Lys

Asp 575

Asp

Gin

Glu

Ala

Val 690

Leu

Cys

Phe

Tyr

Lys 635

Thr

Ala

Lys

Asp

Cys 690

Val

Met

Phe

Thr 695

Tyr

Val

Glu

Leu

Pro 700

Ser

Gly

Lys

Ser

Asn 705

Leu

Thr

Val

Leu

Arg 710

Glu

Cys

Gly 715

Asn

Thr

Pro

Asn

Ala 720

Met

Thr

Ile

Leu

Leu 725

Ala

Val

Gly

Ser 730

Ile

Leu

Val

Gly 73S

Leu

Ala

Leu

Ala

Ile

Trp

Lys

Leu

Val

Thr

Ile

His

Asp

Arg

740 745 750

Glu Phe Ala Lys Phe Gin Ser Glu Arg Ser Arg Ala Arg Tyr Glu Ket 755 750 765

Ala Ser Asn Pro Leu Tyr Arg Lys Pro Ile Ser Thr His Thr Val Asp 770 775 780

Phe Thr Phe Asn Lys Phe Asn Lys Ser Tyr Asn Gly Thr Val Asp 735 790 795

Claims

1. Wyizolowane ludzkie monoklonalne przeciwciało anty-dwuintegrynowe specyficznie wiążące się z ludzkimi integrynami Alfa V Beta 3 i Alfa V Beta 5 lub jego fragment wiążący antygen, znamienne tym, że zawiera region zmienny łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego wybrany spośród NR ID. SEKW.: 7 i NR ID. SEKW.: 8 oraz zawiera (i) wszystkie regiony determinujące komplementarność (CDR) łańcucha ciężkiego o sekwencjach aminokwasowych NR ID. SEKW.: 1, 2 i 3; oraz (ii) wszystkie regiony determinujące komplementarność (CDR) łańcucha lekkiego o sekwencjach aminokwasowych NR ID. SEKW.: 4, 5 i 6.

2. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że wiąże się z ludzkimi integrynami Alfa V Beta 3 albo Alfa V Beta 5 z powinowactwem co najmniej jednym wybranym spośród co najmniej 10^-9 M, co najmniej 10^-10 M, co najmniej 10^-11 M, albo co najmniej 10^-12 M.

3. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że wiąże się z ludzkimi integrynami Alfa V Beta 3 i Alfa V Beta 5 z KD wynoszącą 10^-7 M lub mniej.

4. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że wiąże się z ludzkimi integrynami Alfa V Beta 3 i Alfa V Beta 5 z KD wynoszącą KD 10^-8 M lub mniej.

5. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że wiąże się z ludzkimi integrynami Alfa V Beta 3 i Alfa V Beta 5 z KD wynoszącą KD 10^-9 M lub mniej.

6. Przeciwciało według jednego z zastrz. 1 do 5, znamienne tym, że zasadniczo neutralizuje co najmniej jedną aktywność ludzkich białek integryny Alfa V Beta 3 i Alfa V Beta 5 lub ich fragmentu.

PL 213 030 B1

7. Przeciwciało według jednego z zastrz. 1 do 6, znamienne tym, że całkowicie hamuje adhezję komórek M21 do witronektyny.

8. Przeciwciało według jednego z zastrz. 1 do 7, znamienne tym, że zawiera łańcuch ciężki ludzkiej IgG1 i łańcuch lekki ludzkiej IgG1.

9. Przeciwciało według jednego z zastrz. 1 do 8, znamienne tym, że zawiera łańcuch ciężki IgG1 albo IgG3.

10. Wyizolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne, znamienne tym, że wiąże się z tym samym regionem ludzkich integryn Alfa V Beta 3 i Alfa V Beta 5 jak przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jak określono w jednym z zastrz. 1 do 9.

11. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera wyizolowane ludzkie monoklonalne przeciwciało anty-dwuintegrynowe lub jego fragment wiążący antygen jak określono w jednym z zastrz. 1 do 9 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

12. Kompozycja według zastrz. 11, znamienna tym, że zawiera ponadto skuteczną ilość co najmniej jednego spośród: wykrywalnego znacznika lub reportera, antagonisty TNF, środka przeciwreumatycznego, środka zwiotczającego mięśnie, środka narkotycznego, niesterydowego leku przeciwzapalnego (NSAID), środka przeciwbólowego, środka znieczulającego, środka uspokajającego, środka miejscowo znieczulającego, blokera neuro-mięśniowego, środka przeciwdrobnoustrojowego, środka przeciwłuszczycowego, kortykosterydu, sterydu anabolicznego, erytropoetyny, środka immunizującego, immunoglobuliny, środka immunosupresyjnego, hormonu wzrostu, leku do hormonalnej terapii zastępczej, radiofarmaceutyku, środka przeciwdepresyjnego, środka przeciwpsychotycznego, środka pobudzającego, leku na astmę, beta agonisty, sterydu wziewnego, epinefryny lub jej analogu, cytokiny lub antagonisty cytokiny, środka modulującego receptor estrogenowy, cytotoksyny, środka przeciwnowotworowego, środka alkilującego, antymetabolitu albo inhibitora mitotycznego.

13. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, że koduje ludzkie monoklonalne przeciwciało anty-dwuintegrynowe lub jego fragment wiążący antygen jak określono w jednym z zastrz. 1 do 9.

14. Cząsteczka według zastrz. 13, znamienna tym, że koduje ludzkie monoklonalne przeciwciało anty-dwuintegrynowe, lub jego region zmienny obejmujące sekwencje NR ID. SEKW.: 7 i NR ID. SEKW.: 8.

15. Cząsteczka według zastrz. 13, znamienna tym, że koduje ludzkie przeciwciało antydwuintegrynowe lub jego fragment wiążący antygen zawierające (i) wszystkie CDR łańcucha ciężkiego o sekwencjach aminokwasowych NR ID. SEKW.: 1, 2 i 3; oraz (ii) wszystkie CDR łańcucha lekkiego o sekwencjach aminokwasowych NR ID. SEKW.: 4, 5 i 6.

16. Cząsteczka według zastrz. 13, albo 14, albo 15, znamienna tym, że wprowadzona jest do wektora ekspresyjnego.

17. Komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera wektor ekspresyjny jak określono w zastrz. 16.

18. Komórka według zastrz. 17, znamienna tym, że stanowi komórkę COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-If Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, komórkę szpiczaka, komórkę chłoniaka albo komórkę roślinną.

19. Sposób wytwarzania ludzkiego monoklonalnego przeciwciała anty-dwuintegrynowego lub jego fragmentu wiążącego antygen jak określono w jednym z zastrz. 1 do 9, znamienny tym, że obejmuje hodowlę komórki gospodarza jak określono w zastrz. 17 lub 18 w warunkach takich, że następuje ekspresja przeciwciała.

20. Transgeniczne zwierzę niebędące człowiekiem, znamienne tym, że wykazuje ekspresję ludzkiego przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen jak określono w jednym z zastrz. 1 do 9, przy czym genom tego transgenicznego zwierzęcia nie będącego człowiekiem zawiera transgen albo transchromosom ludzkiego łańcucha ciężkiego oraz transgen albo transchromosom ludzkiego łańcucha lekkiego.

21. Zastosowanie wyizolowanego przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen jak określono w jednym z zastrz. 1 do 9 do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki białaczki, ostrej białaczki, ostrej białaczki Iimfoblastycznej (ALL), ALL z komórek B, ALL z komórek T albo ALL z FAB, ostrej białaczki mieloidalnej (AML), przewlekłej białaczki mielocytarnej (CML), przewlekłej białaczki Iimfocytarnej (CLL), białaczki włochatokomórkowej, zespołu mielodysplastycznego (MDS), chłoniaka, chłoniaka Hodgkin'a, chłoniaka złośliwego, chłoniaka nieziarniczego, chłoniaka Burkitt'a, szpiczaka mnogiego, mięsaka Kaposi'ego, raka jelita grubego, raka trzustki, raka jamy nosowo-gardłowej, histio66

PL 213 030 B1 cytozy złośliwej, zespołu paraneoplastycznego/hiperkalcemii w chorobie nowotworowej typu złośliwego, guza litego, gluczorakoraka, mięsaka, czerniaka złośliwego, naczyniaka, choroby przerzutowej, resorpcji kości związanej z nowotworem, bólu kości związanego z nowotworem, lub choroby złośliwej.

22. Zastosowanie według zastrz. 21, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do podawania ze skuteczną ilością co najmniej jednego spośród: wykrywalnego znacznika lub reportera, antagonisty TNF, środka przeciwreumatycznego, środka zwiotczającego mięśnie, środka narkotycznego, niesterydowego leku przeciwzapalnego (NSAID), środka przeciwbólowego, środka znieczulającego, środka uspokajającego, środka miejscowo znieczulającego, blokera neuro-mięśniowego, środka przeciwdrobnoustrojowego, środka przeciwłuszczycowego, kortykosterydu, sterydu anabolicznego, erytropoetyny, środka immunizującego, immunoglobuliny, środka immunosupresyjnego, hormonu wzrostu, leku do hormonalnej terapii zastępczej, radiofarmaceutyku, środka przeciwdepresyjnego, środka przeciwpsychotycznego, środka pobudzającego, leku na astmę, beta agonisty, sterydu wziewnego, epinefryny lub jej analogu, cytokiny lub antagonisty cytokiny.

23. Zastosowanie według zastrz. 21 albo 22, znamienne tym, że lek jest odpowiedni do podawania pozajelitowego, podskórnego, domięśniowego, dożylnego, dostawowego, dooskrzelowego, dobrzusznego, dotorebkowego, dochrząskowego, dojamowego, do przestrzeni jamistej, domóżdżkowego, do komór mózgu, do okrężnicy, doszyjkowego, dożołądkowego, dowątrobowego, do mięśnia sercowego, dokostnego, domiednicznego, doosierdziowego, dootrzewnowego, doopłucnowego, do prostaty, dopłucnego, doodbytniczego, donerkowego, dosiatkówkowego, dordzeniowego, domaziówkowego, dopiersiowego, domacicznego, dopęcherzowego, w jednej dużej dawce, pochwowego, odbytniczego, policzkowego, podjęzykowego, donosowego albo przezskórnego.

24. Wyrób przemysłowy, znamienny tym, że zawiera materiał opakowujący i pojemnik zawierający roztwór lub postać liofilizowaną co najmniej jednego wyizolowanego ludzkiego przeciwciała antydwuintegrynowego jak określono w jednym z zastrz. 1 do 9.