RS51255B - DOBIJANJE TNFR-Fc - Google Patents

DOBIJANJE TNFR-Fc

Info

Publication number
RS51255B
RS51255B RSP-2010/0190A RSP20100190A RS51255B RS 51255 B RS51255 B RS 51255B RS P20100190 A RSP20100190 A RS P20100190A RS 51255 B RS51255 B RS 51255B
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
medium
culture
glutamine
cells
conditions
Prior art date
Application number
RSP-2010/0190A
Other languages
English (en)
Inventor
Denis Drapeau
Yen-Tung Luan
James R. Mercer
Wenge Wang
Daniel R. Lasko
Original Assignee
Wyeth Research Ireland Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=35500648&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS51255(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Wyeth Research Ireland Limited filed Critical Wyeth Research Ireland Limited
Publication of RS51255B publication Critical patent/RS51255B/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C12N2500/95—Protein-free medium and culture conditions

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Postupak za proizvodnju Fc regiona fuzionog proteina imunoglobulina faktora nekroze tuniora (TNFR-Fc) u ćelijskoj kulturi na veliko, što se sastoji od koraka: dobijanja ćelijske kulture, koja sadrži:ćelije sisara, koje sadrže gen koji kodira TNFR-Fc gen koji se ekspresuje u uslovima ćelijske kulture; imedijum, koji sadrži glutamin, a ima karakteristike medijuma koje se biraju iz grupe koju čine: (i) kumulativna količina aminokiselina po jedinici zapremine veća od oko 70 mM, (ii) molski odnos kumulativnog glutamina prema kumulativnom asparaginu manji od oko 2, (iii) molski odnos kumulativnog glutamina prema kumulativnim ukupnim aminokiselinama manji od oko 0,2, (iv) molski odnos kumulativnih neorganskih jona prema kumulativnim ukupnim aminokiselinama između oko 0,4 i 1, (v) kombinovanu kumulativnu količinu glutamina i asparagina po jedinici zapremine veću od oko 16 mM, i njihove kombinacije;održavanja pomenute kulture u inicijalnoj fazi rasta, pod prvim skupom uslova kulture, tokom prvog perioda vremena, dovoljnog da se dozvoli pomenutim ćelijama da se reprodukuju do gustine vitalnih ćelija unutar opsega od oko 20%-80% od maksimalno moguće gustine vitalnih ćelija, kada se pomenuta kultura održava pod prvim skupom uslova kulture;izmene najmanje jednog uslova kulture, tako da se zatim primenjuje drugi skup uslova kulture;održavanja pomenute kulture tokom drugog perioda vremena pod ovim drugim skupom uslova, a u drugom periodu vremena se akumulira TNFR-Fc u ćelijskoj kulturi.Prijava sadrži još 49 patentnih zahteva.

Description

STANJE TEHNIKE
Proteini i polipeptidi su postali terapeutski agensi sa rastućim značajem. U većini slučajeva, terapeutski proteini i polipeptidi se dobijaju iz ćelijske kulture, ćelija koje su obrađenje inženjeringom i/ili selekcionisane tako da proizvode neuobičajeno visoke sadržaje posmatranog proteina ili polipeptida za kojim postoji interesovanje. Kontrola i optimizacija uslova ćelijske kulture od kritičnog je značaja za uspešnu komercijalnu proizvodnju proteina i polipeptida.
Mnogi proteini i polipeptidi, koji se dobijaju iz ćelijskih kultura, prave se u šaržnom procesu ili šaržnom procesu sa napajanjem, u kome se ćelije kultivišu tokom nekog perioda vremena, a zatim se prekida kultivisanje, pa se izoluje dobijeni protein ili polipeptid. Na krajnju količinu i kvalitet dobijenog proteina ili polipeptida mogu dramatično da utiču uslovi ćelijske kulture. Na primer, tradicionalni procesi šaržne ili šaržne kulture sa napajanjem često dovode do stvaranja metaboličkih otpadnih proizvoda, koji imaju štetne efekte na rast ćelija, vitalnost i proizvodnju ili stabilnost posmatranog proteina ili poplipeptida. lako se čine napori za poboljšanje proizvodnje proteina i polipeptida u šaržnim procesima kulture i šaržnim procesima sa napajanjem kulture, postoji potreba za dodatnim poboljšanjima.
Pored toga, značajni napori se ulažu u razvoj definisanih medijuma (tj. medijuma sačinjenih od pojedinačno poznatih komponenata bez seruma, ili drugih životinjskih sporednih proizvoda) za upotrebu u kultivisanju ćelija, naročito ćelija sisara. Karakteristike rasta ćelija u definisanim medijumima mogu biti vrlo različite, nasuprot medijumima koji se izvode iz seruma. Postoji posebna potreba za razvojem poboljšanih sistema za dobijanje proteina i polipeptida iz kulture ćelija u definisanim medijumima.
IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA
Ovaj pronalazak se odnosi na poboljšani sistem za proizvodnju proteina i/ili polipeptida na veliko. Na primer, ovaj pronalazak daje postupke za kultivisanje na komercijalnoj skali (npr. 500 L, ili više), koji koriste medijum koga karakteriše jedno ili više od sledećih svojstava: i) kumulativna količina aminokiseline na jedinicu zapremine, veća od oko 70 mM; ii) molski odnos kumulativnog glutamina prema kumulativnom asparaginu manji od oko 2; iii) molski odnos kumulativnog glutamina prema kumulativnim ukupnim aminokiselinama manji od oko 0,2; iv) molski odnos kumulativnih neorganskih jona prema kumulativnim aminokiselinama između oko 0,4 i 1; ili v) kombinovana koncentracija kumulativne količine glutamina i asparagina u jedinici zapremine veća od oko 16 mM. Onaj ko je uobičajeno verziran u stanju tehnike zna da se reč "kumulativno", kako se ovde koristi, odnosi na ukupnu količinu posmatranog jedinjenja ili komponenata koji se dodaju tokom kultivisanja ćelije, uključujući komponente koje su dodate na početku kultivisanja i komponente naknadno dodate. U nekim poželjnim realizacijama ovog pronalaska, poželjno je da se na minimum svedu "napajanja" kulture tokom vremena, tako da je poželjno da budu maksimalne prvobitno prisutne količine. Naravno, komponente medijuma se metabolišu tokom kultivisanja, tako da će kulture sa istim kumulativnim količinama datih komponenata imati različite absolutne sadržaje, ako se te komponente dodaju u različitim vremenima (npr. sve su bili prisutne na početku, u odnosu na neke od njih koje su dodavane napajanjem).
U skladu sa ovim pronalaskom, upotreba takvog medijuma dozvoljava visoke nivoe proizvodnje proteina i smanjenje akumulacije nekih neželjenih faktora, kao što su amonijum i/ili laktat.
Onaj ko je uobičajeno verziran u stanju tehnike zna da formulacije medijuma iz ovog pronalaska obuhvataju i definisane i nedefinisane medijume. U nekim poželjnim realizacijama ovog pronalaska, kulturu medijuma predstavlja definisani medijum, pri čemu je kompozicija medijuma poznata i kontrolisana.
U nekim realizacijama ovog pronalaska, postupke kultivisanja čini promena kulture, od prvog skupa uslova kulture do nekog drugog skupa uslova kulture, tako da se postiže metabolički pomak kod ćelija. U nekim realizacijama, ova promena se ostvaruje kada kultura dostigne 20-80% maksimalne gustine ćelija. U nekim realizacijama, promenu čini izmena temperature (ili opsega temperature) na kojoj se drži kultura. Alternativno, ili dodatno, ovaj pronalazak daje postupke koji su tako podešeni da se posle dostizanja pika, sadržaji laktata i/ili amonijuma u kulturi smanjuju sa vremenom. U drugim realizacijama, pomak obuhvata menjanje pH, osmolariteta ili sadržaja hemijskih induktanata, kao što su alkanoinske kiseline ili njihove soli.
Ćelijskim kulturama iz ovog pronalaska mogu opciono da se dodaju nutritijenti i/ili druge komponente medijuma, uključujući hormone i/ili druge faktore rasta, a naročito jone (kao što su natrijumov, hloridni, kalcijumov, magnezijumov i fosfatni), pufere, vitamine, nukleozide ili nukleotide, mikroelemente (neorganska jedinjenja obično prisutna u vrlo niskim konačnim koncentracijama), aminokiseline, lipide ili glukozu, ili drugi izvor energije. U nekim realizacijama ovog pronalaska, može biti korisno da suplement medijumu budu hemijski induktanti, kao što su heksametilen-bis(acetamid) ("HMBA") i natrijum-butirat ("NaB"). Ovi opcioni suplementi se mogu dodati na početku kultivisanja, ili se mogu dodati kasnije, da se nadoknade nutrijenti osiromašeni iz nekog drugog razloga. Obično, poželjno je da se u skladu sa ovim pronalaskom početna kompozicija medijuma odabere tako da se na minimum svodi dodavanje suplemenata.
U skladu sa ovim pronalaskom, mogu se pratiti različiti uslovi kultivisanja, uključujući pH, gustinu ćelija, vitalnost ćelija, sadržaje laktata, sadržaje amonijuma, osmolarnost, ili titar ekspresovanoh polipeptida ili proteina.
KRATAK OPIS SLIKA NACRTA
Slika 1 pokazuje poređenje Medijuma 1 i Medijuma 2, u balonima za mućkanje, uz upotrebu ćelija anti-GDF-8.
Slika 2 pokazuje rast i vitalnost ćelija anti-GDF-8 u Medijumu 1.
Slika 3 pokazuje kulture za rast ćelija anti-GDF-8 pod uslovima kultivisanja, kontrolnim i bez napajanja glutamina.
Slika 4 pokazuje vitalnost ćelija anti-GDF-8 pod uslovima kultivisanja, kontrolnim i bez napajanja glutamina.
Slika 5 pokazuje sadržaje amonijuma u kulturama ćelija anti-GDF-8, pod uslovima kultivisanja, kontrolnim i bez napajanja glutamina.
Slika 6 pokazuje sadržaje laktata u kulturama ćelija anti-GDF-8, pod uslovima kultivisanja, kontrolnim i bez napajanja glutamina.
Slika 7 pokazuje titar anti-GDF-8 ćelija, pod uslovima kultivisanja, kontrolnim i bez napajanja glutamina.
Slika 8 pokazuje gustinu ćelija u kulturama ćelija anti-GDF-8, pod uslovima kultivisanja, kontrolnim i napajanja sa osiromašenim glutaminom.
Slika 8 pokazuje vitalnost ćelija u kulturama ćelija anti-GDF-8, pod uslovima kultivisanja, kontrolnim i napajanja sa osiromašenim glutaminom.
Slika 10 pokazuje sadržaje amonijuma u kulturama ćelija anti-GDF-8, pod uslovima kultivisanja, kontrolnim i napajanja sa osiromašenim glutaminom.
Slika 11 pokazuje sadržaje laktata u kulturama ćelija anti-GDF-8, pod uslovima kultivisanja, kontrolnim i napajanja sa osiromašenim glutaminom.
Slika 12 pokazuje titar anti-GDF-8, pod uslovima kultivisanja, kontrolnim i napajanja sa osiromašenim glutaminom.
Slika 13 pokazuje odgovor ćelija anti-GDF-8 na doziranje gvožđa, u Medijumu 1 i u Medijumu 2.
Slika 14 pokazuje gustinu ćelija u kulturama napajanim sa Glutamatom i Glutaminom.
Slika 15 pokazuje vitalnost ćelija u kulturama napajanim sa Glutamatom i Glutaminom.
Slika 16 pokazuje anti-Lewis Y titar u kulturama napajanim sa Glutamatom i Glutaminom.
Slika 17 pokazuje saržaje laktata u kulturama napajanim sa Glutamatom i Glutaminom.
Slika 18 pokazuje sadržaje amonijuma u kulturama napajanim sa Glutamatom i Glutaminom.
Slika 19 pokazuje osmolarnost u kulturama napajanim sa Glutamatom i Glutaminom.
Slika 20 pokazuje gustinu ćelija u ćelijama anti-l_ewis Y. Svaki grafik je prošek iz dva balona za mućkanje, uz korišćenje istih uslova.
Slika 21 pokazuje vitalnost ćelija u ćelijama anti-Lewis Y. Svaki grafik je prošek iz dva balona za mućkanje, uz korišćenje istih uslova.
Slika 22 pokazuje prosečan titar u kulturi anti-Levvis Y. Svaki grafik je prošek iz dva balona za mućkanje, uz korišćenje istih uslova.
Slika 23 pokazuje sadržaj amonijuma u ćelijama anti-Levvis Y. Svaki grafik je prošek iz dva balona za mućkanje, uz korišćenje istih uslova.
Slika 24 pokazuje pogonski pomak u kulturama sa napajanom šaržom.
Slika 25 pokazuje rast ćelija anti-GDF-8 pod raznim eksperimentalnim uslovima.
Slika 26 pokazuje vitalnost ćelija anti-GDF-8 pod raznim eksperimentalnim uslovima.
Slika 27 pokazuje titar anti-GDF-8 pod raznim eksperimentalnim uslovima.
Slika 28 pokazuje sadržaje laktata u kulturama anti-GDF-8 pod raznim eksperimentalnim uslovima.
Slika 29 pokazuje sadržaje amonijuma u kulturama anti-GDF-8 pod raznim eksperimentalnim uslovima.
Slika 30 pokazuje rast ćelija za ćelije anti-GDF-8 pod raznim eksperimentalnim uslovima.
Slika 31 pokazuje titar anti-GDF-8 pod raznim eksperimentalnim uslovima.
Slika 32 pokazuje sadržaje laktata u kulturama anti-GDF-8 pod raznim eksperimentalnim uslovima.
Slika 33 pokazuje sadržaje amonijuma u kulturama anti-GDF-8 pod raznim eksperimentalnim uslovima.
Slika 34 pokazuje rast ćelija, za ćelije anti-GDF-8 u modifikovanom Medijumu 9, sa različitim sadržajima glutamina i asparagina.
Slika 35 pokazuje vitalnost ćelija anti-GDF-8 u modifikovanom Medijumu 9, sa različitim sadržajima glutamina i asparagina.
Slika 36 pokazuje sadržaje laktata u kulturama anti-GDF-8 u modifikovanom Medijumu 9, sa različitim sadržajima glutamina i asparagina.
Slika 37 pokazuje sadržaje amonijuma u kulturama anti-GDF-8 u modifikovanom Medijumu 9, sa različitim sadržajima glutamina i asparagina.
Slika 38 pokazuje sadržaje glutamina u kulturama anti-GDF-8 u modifikovanom Medijumu 9, sa različitim sadržajima glutamina i asparagina.
Slika 39 pokazuje titar anti-GDF-8 u modifikovanom Medijumu 9, sa različitim sadržajima glutamina i asparagina.
Slika 40 pokazuje osmolarnost u kulturama anti-GDF-8 u modifikovanom Medijumu 9, sa različitim sadržajima glutamina i asparagina.
Slika 41 pokazuje rast ćelija, za ćelije anti-GDF-8 u medijumima sa različitim sadržajima asparagina i cisteina.
Slika 42 pokazuje sadržaje laktata u kulturama anti-GDF-8, u medijumima sa različitim sadržajima asparagina i cisteina.
Slika 43 pokazuje sadržaje amonijuma u kulturama anti-GDF-8, u medijumima sa različitim sadržajima asparagina i cisteina.
Slika 44 pokazuje sadržaje glutamina u kulturama anti-GDF-8, u medijumima sa različitim sadržajima asparagina i cisteina.
Slika 45 pokazuje sadržaje glutamata u kulturama anti-GDF-8, u medijumima sa različitim sadržajima asparagina i cisteina.
Slika 46 pokazuje titar anti-GDF-8, u medijumima sa različitim sadržajima asparagina i cisteina.
Slika 47 pokazuje osmolarnost u kulturama anti-GDF-8, u medijumima sa različitim sadržajima asparagina i cisteina.
Slika 48 pokazuje rast ćelija, za ćelije anti-GDF-8, u medijumima sa različitim sadržajima aminokiselina i vitamina.
Slika 49 pokazuje sadržaje laktata u kulturama anti-GDF-8, u medijumima sa različitim sadržajima aminokiselina i vitamina.
Slika 50 pokazuje sadržaje amonijuma u kulturama anti-GDF-8, u medijumima sa različitim sadržajima aminokiselina i vitamina.
Slika 51 pokazuje sadržaje glutamina u kulturama anti-GDF-8, u medijumima sa različitim sadržajima aminokiselina i vitamina.
Slika 52 pokazuje titar anti-GDF-8, u medijumima sa različitim sadržajima aminokiselina i vitamina.
Slika 53 pokazuje rast ćelija, za ćelije anti-GDF-8, u medijumima sa različitim sadržajima vitamina, mikroelemenata E i gvožđa.
Slika 54 pokazuje sadržaje laktata u kulturama anti-GDF-8, u medijumima sa različitim sadržajima vitamina, mikroelemenata E i gvožđa.
Slika 55 pokazuje sadržaje amonijuma u kulturama anti-GDF-8, u medijumima sa različitim sadržajima vitamina, mikroelemenata E i gvožđa.
Slika 56 pokazuje titar anti-GDF-8, u medijumima sa različitim sadržajima vitamina, mikroelemenata E i gvožđa.
Slika 57 pokazuje rast ćelija, za ćelije anti-GDF-8, u Medijumima 1, 3 i 9.
Slika 58 pokazuje titar anti-GDF-8, u Medijumima 1, 3 i 9.
Slika 59 pokazuje ekstrapolisane titre anti-GDF-8 za razne sadržaje samo glutamina i ukupne kombinovane sadržaje glutamina i asparagina.
Slika 60 pokazuje rast ćelija za ćelije anti-ABeta, pod raznim uslovima testiranja medijuma.
Slika 61 pokazuje vitalnost ćelija za ćelije anti-ABeta, pod raznim uslovima testiranja medijuma.
Slika 62 pokazuje sadržaje laktata u kulturama anti-ABeta, pod raznim uslovima testiranja medijuma.
Slika 63 pokazuje sadržaje amonijuma u kulturama anti-ABeta, pod raznim uslovima testiranja medijuma.
Slika 64 pokazuje titar anti-ABeta, pod raznim uslovima testiranja medijuma.
Slika 65 pokazuje osmolarnost u kulturama anti-ABeta, pod raznim uslovima testiranja medijuma.
Slika 66 pokazuje rast ćelija, za ćelije koje ekspresuju TNFR-lg, pod raznim eksperimentalnim uslovima.
Slika 67 pokazuje vitalnost ćelija koje ekspresuju TNFR-lg pod raznim eksperimentalnim uslovima.
Slika 68 pokazuje zaostalu glukozu u kulturama ćelija koje ekspresuju TNFR-lg pod raznim eksperimentalnim uslovima.
Slika 69 pokazuje sadržaje glutamina u kulturama ćelija koje ekspresuju TNFR-lg pod raznim eksperimentalnim uslovima.
Slika 70 pokazuje koncentraciju laktata u kulturama ćelija koje ekspresuju TNFR-lg pod raznim eksperimentalnim uslovima.
Slika 71 pokazuje sadržaje amonijuma u kulturama ćelija koje ekspresuju TNFR-lg pod raznim eksperimentalnim uslovima.
Slika 72 pokazuje relativni titar TNFR-lg pod raznim eksperimentalnim uslovima.
Slika 73 pokazuje gustinu ćelija, za ćelije anti-GDF-8, koje su rasle u bioreaktorima od 6000 L i od 1 L
Slika 74 pokazuje titre ćelija anti-GDF-8, koje su rasle u bioreaktorima od 6000 L i od 1
L.
Slika 75 pokazuje sadržaje laktata za ćelije anti-GDF-8, koje su rasle u bioreaktorima od 6000 L i od 1 L.
Slika 76 pokazuje sadržaje amonijuma za ćelije anti-GDF-8, koje su rasle u bioreaktorima od 6000 L i od 1 L.
DEFINICIJE
"Oko", "približno": kako se ovde koriste, termini "oko" i "približno", kada se primenjuju na jedan ili više uslova posmatrane kulture ćelije, odnose se na opseg vrednosti koji je sličan navedenoj referentnoj vrednosti za to stanje ili stanja kulture. U nekim realizacijama, termmin "oko" se odnosi na opseg vrednosti koji pada unutar 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 procenat ili manje, od navedene referentne vrednosti za uslov ili uslove kulture.
"Aminokiselina": kako se ovde koristi, termin "aminokiselina" se odnosi na dvadest amino kiselina koje se nalaze u prirodi, i koje se normalno koriste za formiranje polipeptida, ili analoge i derivate tih aminokiselina. Aminokiseline iz ovog pronalaska se dodaju medijumima ćelijskih kultura. Aminokiseline, koje se dodaju u medijumu, mogu biti u obliku soli ili hidrata.
"Antitelo": kako se ovde koristi, termin "antitelo" se odnosi na molekul imunoglobulina ili neki aktivni deo imunoglobulina u molekulu imunoglobulina, kao što su fagmenti fab ili F(ab')2, koji sadrže jedno ili više mesta za vezivanje antigena, sa specifičnim
vezivanjem antigena (imunoreaguje sa njim). Termini "monoklonalna antitela" i "kompozicija monoklonalnog antitela", kako se ovde koriste, odnose se na klonalnu populaciju molekula antitela, koja sadrži samo jednu vrstu mesta za vezivanje antigena, koje je u stanju da imunoreaguje sa posmatranim epitopom antigena, pri čemu se termini "poliklonalna antitela" i "kompozicija poliklonalnog antitela", odnose na populaciju molekula antitela koji sadrže mesta za vezivanje više vrsta antigena, koja su u stanju da ostvare interakciju sa posmatranim antigenom. Definicija monoklonalnog antitela obuhvata i klonalne molekule izvedene tradicionalnim tehnologijama, kao i molekule definisane sekvencije, izvedene manipulacijom ili mutacijom specifičnih ostataka, na primer, humanizovanih antitela.
"Šaržna kultura": kako se ovde koristi, termin "šaržna kultura" se odnosi na postupak kultivisanja ćelija u kome se sve komponente, koje će se na kraju iskoristiti pri kultivisanju ćelija, uključujući i medijum (definicija "medijuma"biće data niže), kao i same ćelije, obezbeđuju na početku procesa kultivisanja. Šaržna kultura se tipično zaustavlja u nekom vremenu, pa se sakupljaju ćelije i/ili komponente medijuma i opciono prečišćavaju.
"Bioreaktor": kao se ovde koristi, termin "bioreaktor" se odnosi na bilo kakav sud koji se koristi za gajenje kulture nekih ćelija sisara. Bioreaktor može biti bilo kojih dimenzija, sve dok je dok se može korisiti za kultivisanje ćelija sisara. Tipično, bioraktor ima najmanje 1 L, a može biti od 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10.000, 12.000 L ili više, ili bilo koja zapremina između ovih. Interni uslovi u bioreaktoru, uključujući, ali bez ograničavanja, pH i temperaturu, tipično se kontrolišu tokom vremena kultivisanja. Bioreaktor može biti napravljen od bilo kog materijala koji je pogodan za držanje kultura ćelija sisara, suspendovanih u medijumu, pod uslovima kulture iz ovog pronalaska, uključujući staklo, plastiku ili metal. Termin "proizvodni biorekator" se ovde odnosi na konačni bioreaktor koji se koristi za proizvodnju posmatranog polipeptida ili proteina. Zapremina bioreaktora za proizvodnju ćelijske kulture u velikim razmerama, tipično je najmanje 500 L, a može biti 1000, 2500, 5000, 8000, 10.000, 12.000 L ili više, ili bilo
koja zapremina između ovih. Onaj ko je uobičajeno verziran u stanje tehnike u stanju je da odabere pogodne bioreaktore za upotrebu u praktikovanju ovog pronalaska.
"Gustina ćelija": kako se ovde koristi termin "gustina ćelija" se odnosi na broj ćelija prisutnih u datoj zapremini medijuma.
"Vitalnost ćelija": kako se ovde koristi, termin "vitalnost ćelija" se odnosi na sposobnost ćelija u kulturi da prežive pod datim skupom uslova kultivisanja, ili njihovih eksperimentalnih varijacija. Kako se ovde koristi, ovaj termin se odnosi na deo ćelija koje su žive u posmatranom vremenu, u odnosu na ukupan broj ćelija u kulturi, u tom vremenu, živih i mrtvih.
"Kultura", "Ćelijska kultura" i "Kultura ćelija sisara": kako se vode koriste ovi termini se odnose na neku populaciju ćelija sisara koja je suspendovana u medijumu (videti definiciju "medijuma", niže), pod uslovima koji su pogodni za preživljavanje i/ili rast te populacije ćelija. Kao što je jasno onima koji su uobičajeno verzirani u stanju tehnike, ovi termini, kako se ovde koriste, mogu se odnositi na kombinaciju koja se sastoji od populacije ćelija sisara i medijuma, u kome je ta populacija suspendovana.
"Napajana šarža kulture": kako se ovde koristi, termin "napajana šarža kulture" se odnosi na postupak kultivisanja ćelija u kome se komponente dodatno obezbeđuju kulturi u nekom vremenu, posle početka procesa kultivisanja. Ove obezbeđivane komponente tipično sadrže nutricione suplemente za ćelije, sa kojima su osiromašile tokom procesa kultivisanja. Napajana šarža kulture se tipično zaustavlja u nekom vremenu, pa se ćelije i/ili komponente medijuma sakupljaju i opciono prečišćavaju.
"Fragment": kako se ovde koristi, termin "fragment" se odnosi na polipeptide, a definiše se kao bilo koji diskretan deo datog polipeptida koji je jedinstven ili karakterističan za taj polipeptid. Ovaj termin se ovde koristi i tako da se odnosi takođe na diskretni deo datog polipeptida koji zadržava najmanje jedan udeo aktivnosti celokupne dužine polipeptida.
Poželjno je da se ovaj udeo aktivnosti zadrži na najmanje 10% aktivnosti polipeptida celokupne dužine. Poželjnije je da se ovaj udeo aktivnosti zadrži na najmanje 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% aktivnosti polipeptida celokupne dužine. Još je poželjnije da se ovaj udeo aktivnosti zadrži na najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% aktivnosti polipeptida celokupne dužine. Najpoželjnije je da se ova frakciona aktivnost zadrži na 100% aktivnosti polipeptida celokupne dužine. Ovaj termin se takođe odnosi i na bilo koji deo datog polipeptida, koji obuhvata najmanje jedan utvrđeni element sekvencije koja se nalazi u polipeptidu celokupne dužine. Poželjno je da ovaj element sekvencije uzima 4-5, poželjnije najmanje oko 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ili više aminokiselina iz peptida celokupne dužine.
"Gen": kako se ovde koristi, termin "gen" se odnosi na bilo koju sekvenciju nukleotida, DNK ili RNK, čiji bar deo kodira diskretni konačni proizvod, tipično, ali bez ograničavanja, polipeptid, koji funkcioniše u nekom aspektu ćelijskog metabolizma ili razvoja. Ne podrazumeva se da se ovaj termin odnosi na sekvenciju za kodiranje koja kodira polipeptid ili drugi konačni proizvod, nego može takođe da obuhvati regione koji prethode ili koji slede sekvenciju za kodiranje, koja moduliše bazalni sadržaj ekspresije (videti definiciju "genetski kontrolni element", niže), kao i sekvencije za intervenciju ("introni") između pojedinačnih segmenata za kodiranje ("eksoni").
"Genetski kontrolni element": kako se ovde koristi, termin "genetski kontrolni elelement" se odnosi na bilo koji element sekvencije koji moduliše ekspresiju gena sa kojim je operabilno povezan. Elementi genetske kontrole mogu funkcionisati preko ili povišavanja ili snižavanja sadržaja ekspresije, a mogu biti locirani pre, unutar ili posle sekvencije za kodiranje. Elementi genetske kontrole mogu delovati u bilo kom stupnju ekspresije gena, preko regulisanja, na primer, iniciranjem, produžavanjem ili terminacijom transkripcije, cepanjem mRNK, editovanjem mRNK, stabilnošću mRNK, lokalizacijom mRNK unutar ćelije, iniciranjem, produžavanjem ili terminacijom translacije, ili u bilo kom drugom koraku ekspresije gena. Elementi genetske kontrole mogu funkcionisati pojedinačno ili u kombinacijama jednog sa drugim.
"Hibridoma": kako se ovde koristi, termin "hibridoma" se odnosi na neku ćeliju stvorenu fuzijom besmrtnih ćelija, izvedenih iz nekog imunološkog izvora, i neke ćelije koja proizvodi antitelo. Dobijena hibridoma je besmrtna ćelija koja proizvodi antitela. Pojedinačne ćelije koje se koriste za stvaranje hibrodome, mogu biti iz bilo kog sisarskog izvora, uključujući ali bez ograničavanja, pacove, svinje, zečeve, ovce, svinje, koze i humana bića. Ovaj termin obuhvata takođe i sojeve ćelija trioma, koje predstavljaju rezultat, kada se progeni heterohibridni mijelomi fuzionišu, a koji su proizvod fuzije humanih ćelija i soja mišjih ćelija mijeloma, posle toga fuzionišu sa ćelijama plazme. Pored toga, podrazumeva se da ovaj termin obuhvata soj bilo kojih besmrtni hibridnih ćelija koji stavara antitela, kao što su na primer, kvadrome (videti, npr. Milstein et al.,Nature,537, 3053 (1983)).
"Integralna gustina vitalnih ćelija": kako se ovde koristi, termin "integralna gustina vitalnih ćelija" se odnosi na prosečnu gustinu vitalnih ćelija u čitavoj kulturi, pomnoženu sa iznosom vremena do koga je kultivisanje teklo. Predpostavljajući da je količina dobijenog polipeptida i/ili proteina proporcionalna broju vitalnih ćelija prisutnih tokom trajanja kultivisanja, integralna gustina vitalnih ćelija je korisno oruđe za procenu količine polipeptida i/ili proteina proizvedenih tokom trajanja kultivisanja.
"Medijum", "Medijum ćelijske kulture", "Medijum kulture": kako se ovde koriste, ovi termini se odnose na neki rastvor koji sadrži nutrijente, kojima se hrane rastuće ćelije nekog sisara. Tipično, ovi rastvori obezbeđuju esencijalne i ne-esencijalne aminokiseline, vitamine, izvore energije, lipide i mikroelemente koje zahtevaju ćelije za minimalan rast i/ili preživljavanje. Ovaj rastvor može sadržati komponente koje poboljšavaju rast i/ili preživljavanje iznad minimalne brzine, uključujući hormone i faktore rasta. Poželjno je da se ovaj rastvor formuliše pri nekom pH i koncentraciji soli, koji su optimalni za preživljavanje i proliferaciju ćelija. Ovaj medijum može takođe biti "definisani medijum" - medijum bez seruma, koji sadrži proteine, hidrolizate ili
komponente nepoznatog sastava. Definisani medijumi su bez komponeneta izvedenih iz životinja, a sve komponente imaju poznatu hemijsku strukturu.
"Metabolički otpadni proizvod": kako se ovde koristi, termin "metabolički otpadni proizvod" se odnosi na jedinjenja proizvedena u kulturi ćelija, koja su rezultat normalnih ili ne-normalnih metaboličkih procesa, koja su na neki način štetna za kulturu ćelije, a posebno u odnosu na ekspresiju ili aktivnost željenog rekombinantnog polipetida ili proteina. Na primer, metabolički otpadni proizvodi mogu biti štetni po rast i vitalnost kulture ćelija, mogu smanjivati količinu proizvedenog rekombinantnog polipeptida ili proteina, mogu menjati faltanje, stabilnost, glikozilovanje ili drugu post-translacionu modifikaciju ekspresovanog polipeptida ili proteina, ili mogu biti štetni po ćelije i/ili aktivnost ekspresije rekombinantnog polipeptida ili proteina na bilo koji drugi način. Egzemplarni metabolički otpadni proizvodi su laktat, koji se proizvodi kao rezultat metabolizma glukoze, i amonijum, koji se stvara kao rezultat metabolizma glutamina. Jedan cilj ovog pronalaska je da se uspori stvaranje, smanje, ili čak eliminišu metabolički otpadni proizvodi u kulturama ćelija sisara.
"Osmolarnost" i "Osmolalitet": "Osmolalitet" je mera osmotskog pritiska čestica rastvorenih supstanci u nekom vodenom rastvoru. Rastvorene čestice obuhvataju i jone i nejonizovane molekule. Osmolalnost se iskazuje koncentracijom osmotski aktivnih čestica (tj. osmola) rastvorenih u 1 kg rastvora (1 mOsm/kg H20, na 38°C je ekvivalentan osmotskom pritisku od 25 mbar). Nasuprot, "Osmolarnost" se odnosi na broj čestica rastvorenih u 1 L rastvora. Kako se ovde koristi, skraćenica "mOsm" označava "miliosmol/kg rastvora).
"Perfuziona kultura": kako se ovde koristi, termin "perfuziona kultura" se odnosi na postupak za kultivisanje ćelija u kome se dodatne komponente kulturi obezbeđuju kontinualno ili polu-kontinualno, posle početka procesa kultivisanja. Ove komponente koje se obezbeđuju tipično su nutricioni suplementi za ćelije, sa kojima su ćelije
osiromašile tokom procesa kultivisanja. Deo ćelija i/ili komponenta iz medijuma tipično se sakuplja na kontinualan ili polu-kontinualana način, pa se opciono prečišćava.
"Polipeptid": kako se ovde koristi, termin "polipeptid" se odnosi na neku sekvenciju lanca aminokiselina zajedno povezanih peptidnim vezama. Ovaj termin se koristi da označi lanac aminokiselina bilo koje dužine, ali onaj ko je uobičajeno verziran u stanje tehnike zna da se ovim terminom ne ograničava dužina lanca i da se može odnositi i na minimalni lanac, koji sadrži dve aminoksieline povezane peptidnom vezom.
"Protein", kako se ovde koristi, termin "protein" se odnosi na jedan ili više polipeptida koji funkcionušu kao zasebne celine. Ukoliko jedan polipeptid predstavlja zasebnu celinu koja funkcioniše i zahteva stalnu fizičku povezanost sa drugim polipeptidima, sa ciljem formiranja celine za zasebno funkcionisanje, termini "polipetid" i "protein" se ovde koriste naizmenično. Ukoliko zasebna funkcionalna celina sadrži više od jednog polipeptida koji su fizički povezani jedan sa drugim, termin "protein", kako se ovde koristi, odnosi se na više polipeptida koji su fizički kuplovani i zajedno funkcionišu kao zasebna celina.
"Rekombinantno ekspresovani polipeptid" i "Rekombinanti polipeptid": kako se ovde koriste, ovi termini se odnose na polipeptid ekspresovan iz neke ćelije sisara kao domaćina, koja je obrađena genetičkim inženjeringom tako da ekspresuje taj polipeptid. Rekombinantno ekspresovani polipeptid može biti identičan ili sličan polipeptidima koji se normalno ekspresuju u ćelijama sisara kao domaćina. Rekombinantno ekspresovani polipeptid može biti takođe i stran za ćeliju domaćina, tj. heterologan za peptide koji se nirmalno ekspresuju u ćeliji sisara domaćina. Alternativno, rekombinantno ekspresovani polipeptid može biti himeran, tako što ima delove polipeptida koji sadrže identične ili slične sekvencije aminokiselina sa polipeptidima koji su normalno ekspresovani u ćelijama sisara domaćina, dok su ostali delovi strani, u odnosu na ćeliju domaćina.
"Zasejavanje": kako se ovde koristi, termin "zasejavanje" se odnosi na proces obezbeđivanja ćelija kulturi u bioreaktoru ili nekom drugom sudu. Ove ćelije mogu prethodno biti podvrgnute propagaciji, u nekom drugom bioreaktoru ili sudu. Alternativno, ove ćelije mogu biti smrznuze, pa otkravljene neposredno pre nego što se stavljaju u boreaktor ili sud. Ovaj termin se odnosi na bilo koji broj ćelija, uključujući i jednu ćeliju.
"Titar": kako se ovde koristi, termin "titar" se odnosi na ukupan broj rekombinantno ekspresovanog polipeptida ili proteina, proizveden u kulturi ćelija sisara, podeljen sa zapreminom datog medijuma. Tipično, titar se iskazuje u jedinicama miligram polipeptida ili proteina po mililitru medijuma.
DETALJAN OPIS NEKIH POŽELJNIH REALIZACIJA
Ovaj pronalazak daje poboljšan sistem za proizvodnju proteina i/ili polipeptida pomoću kulture ćelija. Posebno, ovaj pronalazak daje sisteme koji svode na minimum proizvodnju jednog ili više proizvoda koji su štetni za rast ćelija, vitalnost i/ili kvalitet proizvodnje proteina. U poželjnoj realizaciji ovog pronalaska, ćelijska kultura je šaržna ili šaržna kultura sa napajanjem. Neke druge poželjne realizacije ovog pronalaska se diskutuju detaljnije u nastavku. Međutim, oni koji su uobičajeno verzirani u stanju tehnike znaju da su modifikacije ovih poželjnih realizacija unutar obima priključenih patentnih zahteva. Obim ovog pronalaska definišu patenti zahtevi i njihovi ekvivalenti, koji nisu i ne treba da budu ograničeni ovim opisom nekih poželjnih realizacija.
Polipeptidi
Bilo koji TNFR-Fc polipeptid, koji se može ekspresovati u ćelijama domaćina, može se dobiti u skladu sa ovim pronalaskom. Ovaj polipeptid se može eskpesovati iz nekog gena koji je endogen u ćelijama domaćina, ili iz nekog gena koji je uveden u ćelije domaćina genetskim inženjeringom. Ovaj polipeptid može biti jedan od onih koji se nalaze u prirodi, ili alternativno, može imati sekvenciju koja je inženjerisana ili selektovana od strane čoveka. Inženjerisani polipeptid se može sklopiti iz segmenata drugih polipeptida koji se pojedinačno nalaze u prirodi, ili mogu sadržati jedan ili više segmenata koji se ne nalaze u prirodi.
U sledećoj realizaciji, antitelo predstavlja jedno od humanih anti-GDF-8 antitela, pod nazivima Myo29, Myo28 i Myo22, i antitela i fragmenti koji vezju antigen, koji su iz njih izvedeni. Ova antitela su u stanju da sa visokim afinitetom vezuju zreo GDF-8, da inhibiraju aktivnost GDF-8in vitroiin vivo,kao što je pokazano, na primer, u testovima inhibicije vezivanja ActRIIB i reporetr gena, i da inhibiraju aktivnost GDF-8 povezanu sa negativnom regulacijom mase skeletnih mišića i gustinom kosti. Videti npr. Veldman et al., U.S. Patent Application No. 20040142382.
Receptori
Sledeću klasu polipeptida, za koje je pokazano da su efikasni kao farmaceutski i/ili komercijalni agensi, čine receptori. Tipično, receptori su transmembranski glikoproteini koji funkcionišu tako što prepoznaju van-ćelijski ligand za signalizaciju. Tipično, receptori imaju domen protein kinaze, pored domena za prepoznavanje liganda, koji inicira put signalizacije fosforilizovanjem targetiranih intraćelijskih molekula, posle vezivanja liganda, što dodvodi do razvojnih ili metaboličkih promena unutar ćelije. U jednoj realizaciji, posmatrani receptori su modifikovani tako da se uklone transmembranski i/ili intraćelijski domen ili domeni, na mestu gde opciono može biti pripojen Ig-domen.
U naročito poželjnoj realizaciji, inhibitori faktora nekroze tumora, u obliku alfa i beta receptora faktora nekroze tumora, (TNFR-1; EP 417,563, publikovan 20. marta 1991; i RNFR-2, P 417,014, publikovan 20. marta 1991) su ekspresovani u skladu sa ovim pronalaskom (za pregled, videti Naismith i Sprang,J. Inflamm.47(1-2), 1-7 (1995-96)). U skladu sa jednom realizacijom, inhibitor faktora nekroze tumora sadrži rastvorni receptor TNF i poželjno TNFR-lg. U jednoj realizaciji, poželjni inhibitori TNF iz ovog pronalaska su rastvorni oblici TNFRI i TNFRII, kao i rastvorni proteini koji vezuju TNF, u drugoj realizaciji, TNFR-lg fuzioni protein je TNFR:Fc, termin koji se ovde koristi da označi "etanercept", koji je dimer dva molekula vanćelijskog dela receptora p75 TNF-alfa, a svaki molekul se sastoji od 235 aminokiselina Fc dela humanog lgG-sub.1.
Obično, korisnici ovog pronalaska će odabrati peptid za koji su zaineteresovani i poznavaće precizno njegovu sekvenciju aminokiselina. Tehnike iz ovog pronalaska su uspešno primenjivane za proizvodnju raznih polipeptida, uključujući na primer, humano monoklonalno antitelo koje se usmerava na rast i deferencijaciju faktora 8 (Primeri 1, 3, 4, 7-14), humanizovano anti-Levvis Y antitelo (Primeri 5 i 6), anti-ABeta (Primer 15) i dimerni fuzioni protein receptora faktora nekroze tumora (Primer 16), što pokazuje da je ovaj pronalazak koristan za ekspresiju mnoštva raznih polipeptida i proteina. Bilo koji dati protein, koji treba da se ekspresuje u skladu sa ovim pronalaskom, imaće njegove vlastite idiosinkretske karakteristike i može uticati na gustinu ćelija ili vitalnost kultivisanih ćelija, a može se u nižim sadržajima ekspresovati kao neki drugi polipeptid ili protein, koji raste pod indentičnim uslovima kultivisanja. Onaj ko je uobičajeno verziran u stanju tehnike, u stanju je da na odgovarajući način modifikuje ove korake i kompozicije iz ovog pronalaska, sa ciljem optimizacije rasta ćelija i/ili dobijanja bilo koga datog ekspresovanog polipeptida ili proteina.
Elementi genetske kontrole
Onima koji su uobičajeno verzirani u stanju tehnike je jasno da se genetska kontrola elemenata može primeniti zbog regulacije ekspresije polipeptida ili proteina. Ti elementi genetske kontrole treba da se izaberu tako da su aktivni u ćeliji relevantnog domaćina. Elementi kontrole mogu biti konstituitivno aktivni ili mogu da se indukuju pod definisanim okolnostima. Kontrolni elementi koji se mogu indukovati su naročito korisni kada je ekspresija proteina toksična ili ima neke druge štetne efekte na rast i/ili vitalnost ćelija U tim slučajevima, regulisanje ekspresije polipeptida ili proteina preko elemenata kontrole koji se mogu indukovati može da poboljša vitalnost ćelija, gustinu ćelija i/ili ukupni prinos ekspresovanog polipeptida ili proteina. U stanju tehnike poznat je i dostupan veliki broj korisnih kontrolnih elemenata za realizaciju ovog pronalaska. Reprezentativni konstitutivni sisarski promoteri, koji se mogu koristiti u skladu sa ovim pronalaskom, su ali bez ograničavanja, promoter hipoksantin fosforibozil transferaze (HPTR), promoter adenozin deaminaze, promoter piruvat kinaze, promoer beta-aktina, kao i drugi konstitutivni promoteri, poznati onima koji su uobičajeno verzirani u stanju tehnike. Pored toga, pokazano je da virusni promoteri izazivaju konstitutivnu ekspresiju kodiranih sekvencija u eukariotskim sekvencijama, na primer, promoteri simian virusa, promoteri virusa herpes simpleks, promoteri virusa papilome, promoteri adenovirusa, promoteri virusa humane imunodeficitarnosti (HIV), promoteri virusa Rous-ovog sarkoma, promoteri citomegalovirusa (CMV), ponavljanja dugog terminala (LTR) Molonev virusa mišje leukemije i drugi retrovirusi, promoter timidin kinaze virusa herpes simpleks, kao i drugi promoteri virusa, poznati onima koji su uobičajeno verzirani u stanju tehnike.
Promoteri koji se mogu indukovati izazivaju ekspresiju operabilno povezanih sekvencija za kodiranje, u prisustvu nekog agensa za indukovanje, pa se takođe mogu koristiti u skladu sa ovim pronalaskom. Na primer, u ćelijama sisara promoter metalotionen indukuje transkripciju u silaznom smeru duž sekvencije kodiranja, u prisustvu nekih jona metala. Poznati su i drugi promoteri koji se mogu indukovati i/ili su poznati onima koji su verzirani u stanju tehnike.
Obično, ekspresija sekvencije gena će obuhvatiti takođe i 5' non-transkripcione i 5' non-translacione sekvencije, uključene u iniciranje transkripcije i translacije, respektivno, kao što je TATA boks, pokrivna sekvencija, CAAT sekvencija, i slično. Opciono, mogu se koristiti elementi za poboljšanje i za povećanje sadržaja ekspresije polipeptida ili proteina koji treba da se ekspresuju. Primeri ovih elemenata za pojačavanje, za koje je bilo pokazano da deluju u ćelijama sisara, su pojačavač ranog SV40 gena, kao što su opisali Dijkema et al.,EMBO J.,4, 761 (1985), i pojačavač/promoter izveden iz ponavljanja dugog terminala (LTR) virusa Raus-ovog sarkoma (RSV), kao što su opisali Gorman et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA79, 6777 (1982b) i humanog citomegalovirusa, kao što su opisali Boshartet al.,Ce//41,521 (1985).
Sistemi za povezivanje kontrolnih elemenata sa sekvencijama za kodiranje, kao što je dobro poznato u stanju tehnike (opšte tehnike molekularne biologije i rekombinantne DNK, opisane u Sambrook, Fritsch i Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratorv Manual", Second edition, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Komercijalni vektori, poželjni za kodiranje sekvencije ekspresije u raznim ćelijama sisara, pod raznim uslovima rasta i indukovanja, takođe su dobro poznati u stanju tehnike.
Ubacivanje sekvencije za kodiranje i srodnih kontrolnih elemenata u ćelije domaćina
Postupci za pogodni za ubacivanje nukleinskih kiselina u ćelije sisara domaćina, koji su dovoljni da se postigne ekspresija posmatranih polipeptida ili proteina, takođe su dobro poznati u stanju tehnike. Videti, na primer, Gething et al.,Nature,293, 620-625 (1981); Mantei et al.,Nature,28J., 40-46 (1979); Levinson et al.; EP 117,060; i EP 117,058, svi priključni ovde kroz citate.
Za ćelije sisara, poželjni postupci transformacije su postupak taloženja kalcijum-fosfata, koji su dali Graham i van der Erb,Virology,52, 456-457 (1978), ili lipofectamine"".
(Gibco BRL) Method of Hawley-Nelson,Focus,15, 73 (1193). Opšti aspekti transformacija sistema ćelija sisara kao domaćina, opisani su u Axel, U.S. Patent No. 4,339,216, priznat 16. avgusta 1983. Za razne tehnike transformisanja ćelija sisara, videti Keovvn et al.,Methods in Enzymology,(1989), Keovvn et al.,Methods in Enzymology,185, 527.537 (1990) i Mansour et al.,Nature,336, 348-352 (1988). Reprezentativni primeri, ali bez ograničavanja, pogodnih vektora za ekspresiju polipeptida ili proteina u ćelijama sisara, su pCDNAl; pCD, videti Okayama et al.,Mol. CellBiol. 5,1136-1142 (1985); pMCIneo Poly-A, videti Thomas et al.,Cell,51, 503-512
(1987) i vektor bakulovirusa, kao što je pAC 373 ili pAC 610.
U poželjnim realizacijama polipeptid ili protein se stabilno transficira u ćelije domaćina. Međutim, onaj ko je uobičajeno verziran u stanje tehnike će znati da se ovaj pronalazak može koristiti ili sa prolazno ili sa stabilno transficiranim ćelijama sisara.
Ćelije
Bilo koja ćelija sisara, ili vrsta ćelije osetljiva na ćelijsku kulturu i na ekspresiju polipeptida, može se koristiti u skladu sa ovim pronalaskom. Primeri, ali bez ograničavanja, ćelija sisara koje se mogu koristiti u skladu sa ovim pronalaskom, su soj mijeloma BALV/c miševa (NSO/I, ECACC No: 85110503); humani retinoblasti (PER.C6 (CruCell, Leiden, Holandija)); Soj CV1 iz bubrega majmuna, transformisan sa SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); soj bubrega humanog embriona (293 ili ćelije 293 sub-klonirane za rast u suspenzionoj kulturi, Graham et al.,J. Gen. Virol.,36, 59 (1977)); ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK, ATCC CCL 10); ćelije jajnika kineskog hrčka ±-DHFR (CHO, Urlaub i Chasin,Proc, Natl. Acad. Sci. USA,77, 4216 (1980)); mišje sertoli ćelije (TM4, Mather,Biol. Reprod.23, 243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CV1, ATCC CCL 70); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1 587); ćelije humanog cervikalnog karcinoma (HeLA, ATCC CCL 2); ćelije bubrega psa (MDCK; ATCC CCI 34); ćelije jetre bufalo pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ćelije humanih pluća (W138, ATCC CCL 75); ćelije humane jetre (Hep G2, HB 8965); tumor mišje dojke (MMT 060562, ATCC CCL 51); ćelije TRI (Mather et al.,Annals N. Y. Acad. Sci.383, 44-68 (1982)); ćelije MRC 5; ćelije FS4; i soj humanog hepatoma (Hep G2). U naročito poželjnoj realizaciji, ovaj pronalazak se koristi za kultivisanje i ekspresiju polipeptida i proteina iz soja ćelija CHO.
Pored toga, bilo koji broj komercijalno i ne-komercijalno dostupnih sojeva ćelija hibrodome, koji ekspresuje polipeptide i proteine, može da se upotrebi u skladu sa ovim pronalaskom. Onaj ko je verziran u stanju tehnike zna da soj ćelija hibrodome može imati različite nutricione zahteve i/ili da može zahtevati različite uslove kulture za optimalan rast i ekspresiju polipeptida i proteina, i u stanju je da modifikuje ove uslove prema potrebi.
Kao što je gore pomenuto, u mnogim primerima ćelije će se birati ili inženjerizovati tako da se dobijaju visoki sadržaji proteina ili polipeptida. Često se ćelije genetski inženjerizuju da se proizvedu visoki sadržaji proteina, na primer, uvođenjem gena koji kodira posmatrani protein ili polipeptid i/ili uvođenjem elemenata kontrole koji regulišu ekspresiju gena (bilo endogenih ili uvedenih), kodiranjem posmatranog polipeptida.
Neki polipeptidi mogu imati štetne elemente na rast ćelija, vitalnost ćelija ili neke druge karakteristike ćelija koje na kraju na neki način ograničavaju dobijanje posmatranog polipeptida ili proteina. Čak i unutar populacije ćelija jedne posmatrane vrste, inženjerizovane tako da se ekspresuje specifični polipeptid, postoji varijabilnost unutar ćelijske populacije, tako da neke pojedine ćelije rastu bolje i/ili proizvode više posmatranog polipeptida. U nekim poželjnim realizacijama ovog pronalaska, za robustni rast pod posmatranim uslovima odabranim za kultivisanje ćelija, soj ćelija izabire stručnjak empirijski. U naročito poželjnim realizacijama, pojedinačne ćelije koje su inženjerizovane tako da ekspresuju određeni polipeptid, u proizvodnji na veliko, izabiru se na osnovu rasta ćelija, konačne gustine ćelija, procenta vitalnosti ćelija, titra ekspresovanog polipeptida ili bilo koje kombinacije ovih, ili nekih drugih uslova, koje stručnjak procenjuje da su važni.
Faza kulture ćelija
Tipične procedure za dobijanje nekog polipeptida su u šaržnim kulturama i u kulturama sa napajanjem šarži. Procesi šaržne kulture tradicionalno sadrže inokulaciju kulture za proizvodnju na veliko, zasejavanjem kulture sa određenom gustinom ćelija, i gajenje ćelija pod uslovima koji vode rastu i vitalnosti ćelija, sakupljanje kulture kada ćelije dostignu naznačenu gustinu ćelija, i prečišćavanje ekspresovanog polipeptida. Procedure sa napajanjem šarži imaju i dodatni korak ili korake, dodavanja suplemenata kulturi šarže, sa nutrijentima i drugim komponentama koje se troše tokom rasta ćelija. Stalni i nerešeni problem u tradicionalnim kulturama šarže i šaržama sa napajanjem, je stvaranje metaboličkih otpadnih proizvoda, koji imaju štetne efekte na rast ćelija, vitalnost i dobijanje ekspresovanog polipeptida. Dva metabolička otpadna proizvoda, koji imaju naročito štetne efekte, su laktat i amonijum, koji se stvaraju kao rezultat metabolizma glukoze i glutamina, respektivno. Pored enzimatskog stvaranja amonijuma, kao reziltat metabolizma glutamina, amonijum se može takođe akumulirati u kulturama ćelija, i kao rezultat ne-metaboličke razgradnje tokom vremena. Ovaj pronalazak daje poboljšan postupak za proizvodnju polipeptida na veliko, koji svodi na minimum ove štetne efekte amonijuma i laktata i koji čak pokazuje reversne efekte, prilikom akumulacije ovih otpadnih proizvoda u kulturama ćelija. Onaj ko je uobičajeno verziran u stanju tehnike će shvatiti da se ovaj pronalazak može primeniti u bilo kom sistemu u kome se kultivišu ćelije, uključujući, ali bez ograničavanja, šaržne, šaržne sa napajanjem i perfuzione sisteme. U nekim poželjnim realizacijama ovog pronalaska, ćelije rastu u šaržnim sistemima ili šaržnim sistemima sa napajanjem.
Medijumi
Tradicionalne formulacije medijuma, uključujući komercijalno dostupne medijume, kao što su Ham-ov F10 (Sigma), Minimalni esencijalni medijum ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) i Dulbeco's Modified Eagle's Medium ([DMEM], Sigma), sadrže relativno visoke nivoe glukoze i glutamina, u poređenju sa drugim aminokiselinama. Smatralo se da ove komponente treba da budu obilato zastupljene, zato što su to primarni metabolički izvori energije u ćelijama. Međutim, brza potrošnja ovih nutrienata vodi u akumulaciju laktata i amonijuma, kao što je opisano gore. Pored toga, visoki početni sadržaji glukoze i glutamina i naknadna akumulacija laktata i amonijuma, vodi u visoki osmolaritet, stanje koje je po sebi često štetno za rast ćelija, vitalnost ćelija i dobijanje polipeptida.
Ovaj pronalazak daje razne formulacije medijuma koje, kada se koriste u skladu sa drugim koracima kultivisanja, opisanim ovde, svode na minimum, pa čak akumulaciju laktata i amonijuma preokreću u reversni smer. Formulacije medijuma iz ovog pronalaska, za koje je pokazano da imaju blagotvorne efekte na rast ćelija i/ili vitalnost ćelija, ili na ekspresiju polipeptida ili proteina, sadrže jedan ili više od: (i) kumulativnu količinu aminokiseline po jedinici zapremine koja je veća od oko 70 mM, ii) molski odnos kumulativnog glutamina prema kumulativnom asparaginu manji od oko 2, iii) molski odnos kumulativnog glutamina prema kumulativnim ukupnim aminokiselinama manji od oko 0,2, iv) molski odnos kumulativnog neorganskog jona prema kumulativnim ukupnim aminokiselinama između oko 0,4 i 1, i v) kombinovnu kumulativnu količinu glutamina i asparagina po jedinici zapremine veću od oko 16 mM. Onaj ko je uobičajeno verziran u stanju tehnike će shvatiti da se termin "kumulativan", kako se ovde koristi, odnosi na ukupnu količinu posmatrane komponente ili komponenata dodatih tokom kultivisanja ćelija, uključujući i komponente koje su dodate na početku kultivisanja i komponente naknadno dodate. Onaj ko je uobičajeno verziran u stanju tehnike shvata da formulacije medjuma iz ovog pronalaska obuhvataju i definisane i ne-definisane medijume.
Tradicionalne formulacije medijuma počinju sa relativno niskim sadržajem ukupnih aminokiselina, u poređenju sa formulacijama medijuma iz ovog pronalaska. Na primer, tradicionalni medijum kulture ćelija, poznat kao DME-F12 (smeša 50:50 Dulbecco's Modified Eagle's Medium-a i Ham-ovog F12 mediuma) ima ukupni sadržaj aminokiselina 7,29 mM, a tradicionalni medijum kulture ćelija, poznat kao RPMI-1640, ima ukupni sadržaj aminokiselina od 6,44 mM (videti npr. H.J.Morton,In Vitro6, 89-108
(1970), R.G. Ham,Proc. Natl. Acad. Sci USA53, 288-293 (1965), G.E. Moore et al.,J. Am. Medical Assn.,199, 519-24 (1967)). U nekim realizacijama ovog pronalaska, koncentracija aminokiselina u medijumu kulture poželjno je da bude veća od oko 70 mM. Još poželjnije je da formulacije medijuma iz ovog pronalaska sadrže u polaznom medijumu koncentraciju aminokiselina veću od oko 70 mM. Pokazano je, kada su koncentracije aminokiselina u polaznom medijumu u ovom opsegu, da su gustina ćelija i titar u porastu tokom perioda rasta kulture (videti Primer 13).
Pored toga, u nekim realizacijama ovog pronalaska, molski odnos glutamina prema asparaginu u medijumu kulture je smanjen, u poređenju sa drugim komercijalnim i ne-komercijalnim medijumima koji su dostupni. Poželjno je da odnos glutamina prema asparaginu u medijumu kulture bude manji od oko dva.
Pored toga, u nekim realizacijama ovog pronalaska, molski odnos glutamina prema ukupnim aminokiselinama u medijumu kulture je smanjen, u poređenju sa drugim komercijalnim i ne-komearcijalnim medijumima koji su dostupni. Poželjan molski odnos glutamina prema ukupnim aminokiselinama u medijumu kulture je manji od oko 0,2.
Interesantan i neočekivan rezultat sniženja molskog odnosa glutamina prema asparaginu ili prema ukupnoj koncentraciji aminokiselina u polaznom medijumu, u skladu sa ovim pronalaskom, bio je da je pored opaženog smanjenja u akumulaciji amonijuma, opaženo isto tako i smanjenje akumulacije laktata. U nekim realizacijama, nivoi akumulacije amonijuma i laktata, ne samo da su niži, nego u kontrolnim kulturama, nego je činjenica da se stvarno smanjuju posle početne akumulacije (na primer, videti Primere 3 i 7).
Boraston (U.S. Patent No. 5,871,999) je opisao medijum kulture u kome je molski odnos ukupnih neorganskih soli prema ukupnim aminokiselinama bio između 1 i 10. Boraston je pokazao da kada se pripremi medijum kulture u kome je molski odnos neorganskih jona prema ukupnim aminokiselinama unutar ovog opsega, da se smanjuje agregacija CHO ćelija koje rastu u medijumu. U drugoj poželjnoj realizaciji ovog pronalaska, molski odnos ukupnih neorganskih jona prema ukupnim aminokiselinama u medijumu kulture, je još smanjen, na između 0,4 i 1. Kao što je pokazano u Primeru 13, smanjivanje ovog odnosa od 1,75 na približno 0,7, ima za rezultat porast gustine ćelija i proizvodnje ekspresovanog polipeptida ili proteina, tokom čitavog perioda rasta kulture.
U sledećoj poželjnoj realizaciji ovog pronalaska, medijum kulture sadrži kombinovanu koncentraciju glutamina i asparagina između oko 16 i 36 mM. Kao što je pokazano u Primeru 14, Tabela 22, medijumi koji sadrže kombinovanu koncentraciju glutamina i asparagina unutar ovog opsega, pokazuju više titre ekspresovanog polipeptida, nego medijumi koji sadrže kombinovani ukupni glutamin i asparagin izvan ovog opsega. Onaj ko je uobičajeno verziran u stanju tehnike u stanju je da odabere tačnu kombinaciju koncentracije glutamina i asparagina unutar ovog opsega, kako bi optimizovao rast ćelija i/ili vitalnost ćelija i učinio maksimalnom proizvodnju ekspresovanog polipeptida. Pored toga, onaj ko je uobičajeno verziran u stanju tehnike će shvatiti da bilo koji od uslova koji su gore navedeni, može da se iskoristi pojedinačno ili u raznim kombinacijama jednog sa drugim. Korišćenjem formulacija medijuma koje pokazuju samo jednu, neke ili sve od gornjih karakteristika, onaj ko je uobičajeno verziran u stanju tehnike biće u stanju da optimizuje rast i/ili vitalnost ćelija i dovede do maksimuma proizvodnju ekspresovanog polipeptida.
Bilo koja od ovih formulacija medijuma opisanih u ovom pronalasku može opciono, po potrebi da dobije kao suplemente hormone i/ili druge faktore rasta, a naročito jone (kao što su natrijumovi, hloridni, kalcijumovi, magnezijumovi i fosfatni), pufere, vitamine, nukleozide ili nukleotide, mikroelemente (neorganska jedinjenja koja su obično prisutna u vrlo niskim koncentracijama), aminokiseline, lipide, hidrolizate proteina ili glukoze i druge energetske izvore. U nekim realizacijama ovog pronalaska može biti korisno da suplementi medijumima budu hemijski induktanti, kao što su heksametilen-bis(acetamid) ("HMBA") i natrijum-butirat ("NaB"). Opcioni suplementi se mogu dodavati na početku kultivisanja, ili se mogu dodavati u nekom kasnijem trenutku, da bi se nadoknadili potrošeni nutrijenti, ili iz nekog drugog razloga. Onaj ko je uobičajeno verziran u stanju tehnike svestan je da se bilo koji poželjni ili potrebni suplementi mogu uključiti u formulacije medijuma.
Pripremanje kulture ćelija sisara
U stanju tehnike dobro su poznati razni postupci pripremanja ćelija sisara za proizvodnju proteina ili polipeptida u šaržnoj kulturi ili šaržnoj kulturi sa napajanjem. Kao što je opisano gore, neka nukleinska kiselina, dovoljna da se postigne ekspresija (tipično, vektor koji sadrži gen koji kodira posmatrani polipeptid ili protein, a može biti operabilno povezan sa elementima genetske kontrole), može se uvesti u soj ćelija domaćina bilo kojom od brojnih, dobro poznatih tehnika. Tipično, ćelije se testiraju da se odredi koje od ćelija domaćina su stvarno preuzele vektor i ekspresuju posmatrani polipeptid ili protein. Tradicionalni postupci za detekciju određenog polipeptida ili proteina, koji ekspresuju ćelije sisara, su ali bez ograničavanja, imunohistohemija, imunotaloženje, protočna citometrija, mikroskopija imunofluorescencije, SDS-PAGE, bojenje sa VVestern blot-om, enzimski povezan test na imunosorbentu (ELISA), tehnike tečne hromatografije visoke performanse (HPLC), testovi biološke aktivnosti i afinitetna hromatografija. Onaj ko je uobičajeno verziran u stanju tehnike zna i za druge odgovarajuće tehnike za detekciju ekspresovanih polipeptida ili proteina. Ako višestruke ćelije domaćina ekspresuju posmatrani polipeptid ili protein, može se koristiti neka ili sve od navedenih tehnika za određivanje koja od ćelija ekspresuje taj polipeptid ili protein u najvećem sadržaju.
Kada se neka ćelija koja ekspresuje posmatrani polipeptid ili protein identifikuje, ta ćelija se nekim od brojnih postupaka podvrgne propagaciji u kulturi, inače dobro poznatim onome ko je uobičajeno verziran u stanju tehnike. Ćelija koja ekspresuje posmatrani polipeptid ili protein, tipično je da se propagira rastom na temperaturi i u medijumu koji dovodi do preživljavanja, rasta i vitalnosti ćelija. Polazna zapremina kulture može biti bilo koje veličine, ali često je manja nego zapremina kulture koja se koristi za proizvodnju u bioreaktoru, pri konačnoj proizvodnji posmatranog polipeptida ili proteina, a često ćelije prođu kroz nekoliko bioreaktora rastućih zapremina, pre nego što se zaseju u proizvodni bioreaktor. Kultura ćelije se može mešati ili mućkati, da se poveća oksigenacija medijuma i disperzija nutrijenata prema ćelijama. Alternativno, ili pored toga, posebni uređaji za produvavanje, koji su dobro poznati u stanju tehnike, mogu se koristiti za povećanje i kontrolu oksigenacije kulture. U skladu sa ovim pronalaskom, onaj ko je uobičajeno verziran u stanje tehnike zna da od koristi može biti kontrolisanje ili regulisanje nekih internih stanja bioreaktora, uključujući ali bez ograničavanja, pH, temperaturu, oksigenaciju, itd.
Polaznu gustinu ćelija u proizvodnom bioreaktoru može da bira onaj ko je uobičajeno verziran u stanju tehnike. U skladu sa ovim pronalaskom, polazna gustina ćelija u proizvodnom bioreaktoru može biti i toliko niska, kao što je jedna ćelija po zapremini kulture. U poželjnim realizacijama ovog pronalaska, polazne gustine ćelija u proizvodnom bioreaktoru mogu bitiu opsegu od oko 2x1 o2 vitalnih ćelija po mL, do oko2x103, 2x104, 2x105, 2x106, 5x106 ili 10x10<6>vitalnih ćelija po mL, ili više.
Polazne i intermedijarne kulture ćelija mogu da rastu do bilo koje željene gustine, pre nego što se zasejava sledeći, intermedijarni ili konačno, proizvodni bioreaktor. Poželjno je da većina ćelija ostane u životu pre zasejavanja, mada se ne zahteva potpuna ili skoro potpuna vitalnost. U jednoj realizaciji ovog pronalaska, ćelije se mogu ukloniti iz supernatanta, na primer, centrifugiranjem sa malom brzinom. Takođe, može biti poželjno da se uklonjene ćelije operu sa medijumom pre zasejavanja sledećeg bioreaktora, da se uklone neželjeni bioreaktivni metabolički otpadni proizvodi ili komponente medijuma. Taj medijum može biti medijum u kome su ćelije prethodno rasle, ili to može biti neki različit medijum, ili rastvor za ispiranje, koji bira lice koje obavlja ovaj pronalazak.
Ćelije se zatim mogu razblažiti na odgovarajuću gustinu zasejavanja proizvodnog bioreaktora. U poželjnoj realizaciji ovog pronalaska, ćelije se razblažuju u istom medijumu koji se koristi u proizvodnom bioreaktoru. Alternativno, ćelije se mogu razblažiti u nekom drugom medijumu ili rastvoru, zavisno od potreba ili želja lica koje obavlja ovaj pronalazak, ili da se prilagode posebnim zahtevima samih ćelija, na primer, ako treba da se čuvaju tokom kratkog perioda vremena, pre zasejavanja u proizvodni bioreaktor.
Inicijalna faza rasta
Kada se proizvodni bioreaktor zaseje, kao što je opisano gore, kultura ćelija se održava u inicijalnoj fazi rasta pod uslovima koji vode preživljavanju, rastu i vitalnosti ćelijske kulture. Precizni uslovi će varirati zavisno od vrste ćelija, od organizma iz koga su ćelije izvedene i prirode i karaktera ekspresovanog polipeptida ili proteina.
U skladu sa ovim pronalaskom, proizvodni reaktor može imati bilo koju zapreminu, koja odgovara proizvodnji na veliko polipeptida ili proteina. U poželjnoj realizaciji, zapremina proizvodnog reaktora je 1000, 2500, 5000, 8000, 10.000, 12.000 L ili više, ili bilo koja zapremina između. Onaj ko je uobičajeno verziran u stanje tehnike, će znati i biti u stanju da odabere pogodan bioreaktor za upotebu u realizaciji ovog pronalaska. Proizvodni bioreaktor se može konstruisati od bilo kog materijala koji dovodi do rasta i vitalnosti ćelija i ne interferira sa ekspresijom ili stabilnošću proizvedenog polipeptida ili proteina.
Temperatura ćelijske kulture u inicijalnoj fazi rasta bira se prvenstveno na osnovu opsega temperature u kome ćelije u kulturi ostaju vitalne. Na primer, tokom inicijalne faze rasta ćelije CHO dobro rastu na 37°C. Obično većina ćelija sisara dobro raste u opsegu od oko 25°C do 42°C. Poželjno je da ćelije sisara rastu unutar opsega od oko 35°C do 40°C. Oni koji su uobičajeno verzirani u stanju tehnike biće u stanju da odaberu odgovarajuću temperaturu ili temperature na kojima rastu ćelije, zavisno od potreba ćelija i proizvodnih zahteva onoga ko vodi proces.
U jednoj realizaciji ovog pronalaska, temperatura se u inicijalnoj fazi rasta drži na jednoj, konstantnoj temperaturi. U drugoj realizaciji, temperatura u inicijalnoj fazi rasta se održava unutar nekog opsega temperature, na primer, temperatura može lagano da se povećava ili smanjuje tokom inicijalne faze rasta. Alternativno, temperatura može da se povećava ili smanjuje za diskretne iznose u raznim vremenima tokom inicijalne faze rasta. Onaj ko je uobičajeno verziran u stanju tehnike u stanju je da odredi da li treba da se koristi jedna ili više temperatura, ili da li temperatura treba da se podešava lagano i kontinualno, ili u diskretnim iznosima.
Tokom inicijalne faze rasta ćelije mogu da rastu dužiili kraći period vremena, zavisno od potreba stručnjaka koji vodi proces i zahteva u vezi sa samim ćelijama. U jednoj realizaciji, ćelije rastu tokom vremena dovoljnog da se postigne gustina vitalnih ćelija koja se daje kao neki procenat od maksimalne gustine vitalnih ćelija koji bi ćelije konačno dostigle, ako bi se ostavile da nesmetano rastu. Na primer, ćelije mogu rasti tokom perioda vremena dovoljnog da se dostigne željena gustina vitalnih ćelija od 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ili 99 procenata od maksimalne gustine vitalnih ćelija.
U sledećoj realizaciji, ćelijama se dozvoljava da rastu tokom definisanog perioda vremena. Na primer, zavisno od polazne koncentracije u ćelijskoj kulturi, temperature na kojoj rastu ćelije, i svojstvene brzine rasta ćelija, ćelije mogu da rastu 0,1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više dana. U nekim slučajevima ćelijama se može dozvoliti da rastu mesec dana ili više. Ćelije bi rasle 0 dana u proizvodnom bioreaktoru, ukoliko bi njihov rast u reaktoru za zasejavanje, na temperaturi inicijalne faze rasta, bio dovoljan da gustina vitalnih ćelija u proizvodnom reaktoru u vreme njihove inokulacije bude na željenom procentu od maksimalne gustine vitalnih ćelija. Stručnjak iz ovog pronalaska je u stanju da odabere trajanje faze inicijalnog rasta, zavisno od zahteva za proizvodnju polipeptida ili proteina i potreba samih ćelija.
Kultura ćelija se može mešati ili mućkati za vreme inicijalne faze rasta, da bi se povećala oksigenacija i disperzija nutrijenata ka ćelijama. U skladu sa ovim pronalaskom, onaj ko je uobičajeno verziran u stanju tehnike će znati da može biti korisno da se tokom inicijalne faze rasta kontrolišu ili regulišu neka interna stanja u biorektoru, uključujući, ali bez ograničavanja, pH, temperaturu, oksigenaciju, itd. Na primer, pH se može kontrolisati dodavanjem odgovarajuće količine kiseline ili baze, a oksigenacija se može kontrolisati pomoću uređaja za produvavanje, koji su dobro poznati u stanju tehnike.
Promena uslova kultivisanja
U skladu sa saznanjima iz ovog pronalaska, na kraju inicijalne faze rasta, najmanje jedan od uslova u kulturi može da se promeni, tako da se primenjuje drugi skup uslova, a u kulturi dođe do metaboličkog pomaka. Akumulacija inhibitornih metabolita, najčešće laktata i amonijuma, inhibira rast. Metabolički pomak, koji se ostvaruje na primer sa promenom temperature, pH, osmolaliteta, ili sadržaja hemijskog induktanta u ćelijskoj kulturi, može biti karakterisan smanjenjem brzine specifične proizvodnje laktata prema specifičnoj brzini potrošnje glukoze. U jednoj realizaciji, ali bez ograničavanja, uslovi kultivisanja se menjaju promenom temperature kulture. Međutim, kao što je poznato u stanju tehnike, promena temperature nije jedini mehanizam preko koga se može postići metabolička promena. Na primer metabolička promena se može takođe postići menjanjem drugih uslova kultivisanja, uključujući ali bez ograničavanja, pH, osmolalitet i sadržaje natrijum-butirata. Kao što je diskutovano gore, vreme promene kultivisanja će odrediti stručnjak koji vodi proces iz ovog pronalaska, na osnovu zahteva za proizvodnju polipeptida ili proteina ili potreba samih ćelija.
Kada se menja temperatura kulture, ova promena temperature može biti relativno postepena. Na primer, može trajati nekoliko sati ili dana dok se temperatura kompletno promeni. Alternativno, promena temperature može biti relativno nagla. Na primer, kompletna izmena temperature može biti za manje od nekoliko sati. Za date zahteve proizvodnje i kontrole, kao što su standardi u komercijalnoj proizvodnji polipeptida ili proteina na veliko, potpuna izmena temperature se može obaviti čak i za manje od jedan sat.
Temperatura ćelijske kulture u narednoj fazi rasta će se birati prvenstveno na osnovu opsega temperature unutar koga ćelije u kulturi ostaju vitalne i ekspresuju rekombinantne polipeptide ili proteine na komercijalno prihvatljivom nivou. Obično, većina ćelija sisara ostaje vitalna i ekspresuje rekombinantne polipeptide ili proteine na komercijalno prihvatljivom nivou unutar opsega temperature od oko 25°C do 42°C. Poželjno je da ćelije sisara ostanu vitalne i da ekspresuju rekombinantne polipeptide ili proteine na komercijalno prihvatljivom nivou unutar opsega temperature od oko 25°C do 35°C. Oni koji su uobičajeno verzirani u stanju tehnike u stanju su da odaberu odgovarajuću temperaturu ili temperature na kojima će ćelije rasti, zavisno od potreba ćelija i proizvodnih zahteva postavljenih stručnjaku.
U jednoj realizaciji ovog pronalaska, temperatura u narednoj fazi rasta se održava na jednoj, konstantnoj temperaturi. U drugoj realizaciji, temperatura u narednoj fazi rasta se održava unutar nekog opsega temperature. Na primer, tokom naredne faze rasta temperatura može polako da se povećava ili da se smanjuje. Alternativno, temperatura može da se povećava ili da se smanjuje u diskretnim iznosima u raznim vremenima tokom ove naredne faze rasta. Onaj ko je uobičajeno verziran u stanju tehnike shvata da su i višestruke diskretne promene temperature obuhvaćene ovim pronalaskom. Na primer, temperatura se može promeniti odjednom, pa ćelije držati na toj temperaturi, ili unutar opsegs temperature tokom nekog perioda vremena, a zatim se temperatura ponovo promeni, ili na više ili na niže. Temperatura kulture, posle svakog diskretnog pomaka, može biti konstantna ili se može održavati unutar nekog opsega temperature.
U Primeru 16, prikazani su podaci koji pokazuju efikasnost primene dve sukcesivne promene temperature, mada će oni koji su verzirani u stanje tehnike shvatiti, da se u skladu sa ovim pronalaskom, mogu koristiti tri ili više sukcesivnih promena temperature da bi se povećala vitalnost ili gustina ćelija i/ili povećala ekspresija rekombinantnih polipeptida ili proteina. Temperatura ili opsezi temperature kulture ćelija, nakon svakog sukcesivnog pomaka temperature, mogu biti viši ili niži od prethodne temperature ili opsega temperature, pre nego što je došlo do pomaka. U poželjnoj realizaciji ovog pronalaska, svaka sukcesivna temperatura ili opseg temperature je niža nego prethodna temperatura ili opseg temperature.
Naredna faza proizvodnje
U skladu sa ovim pronalaskom, kada se uslovi kultivisanja ćelija promene, kao što je diskutovano gore, kultivisanje ćelija se održava u narednoj fazi proizvodnje pod nekim drugim skupom uslova kulture, koji vodi preživljavanju i vitalnosti ćelija u kulturi i odgovarajućoj ekspresiji željenog polipeptida ili proteina na komercijalno odgovarajućem nivou.
Kao što je gore diskutovano, pomak u kulturi može promeniti izmenom jednog ili više od brojnih uslova kulture, uključujući ali bez ograničavanja, temperaturu, pH, osmolalitet i sadržaje natrijum-butirata. U jednoj realizaciji, promeni se temperatura kulture. U skladu sa ovom realizacijom, u narednoj prizvodnoj fazi, kultura se drži na temperaturi, ili unutar opsega temperature, koji su niži od temperature ili opsega temperature u inicijalnoj fazi rasta. Na primer, tokom naredne proizvodne faze, ćelije CHO ekspresuju rekombinantne polipeptide i proteine uglavnom unuar opsega od 25°C do 35°C. Kao što je diskutovano gore, može se primeniti više diskretnih promena temperature, da bi se povećala gustina ili vitalnost ćelija, ili da bi se povećala ekspresija rekombinantnog polipeptida ili proteina.
U skladu sa ovim pronalaskom, u narednoj, proizvodnoj fazi ćelije se mogu držati sve dok se ne dostigne željena gustina ćelija ili proizvodni titar. U jednoj realizaciji, ćelije se drže u narednoj, proizvodnoj fazi sve dok titar rekombinantnog polipeptida ili proteina ne dostigne maksimum. U drugim realizacijama, kultura se može sakupiti i pre toga, zavisno od proizvodnih zahteva datih stručnjaku, ili potreba samih ćelija. Na primer, ćelije se mogu držati tokom vremena koje je dovoljno dugo da se postigne gustina vitalnih ćelija od 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75. 80, 85, 90, 95 ili 99 procenata od maksimalne gustine vitalnih ćelija. U nekim slučajevima može biti poželjno da se dopusti da gustina vitalnih ćelija dostigne maksimum, pa da se zatim dozvoli da gustina vitalnih ćelija opadne do nekog nivoa, pre nego što se kultura sakupi. U ekstremnom primeru, može biti oželjno da se dozvoli da gustina vitalnih ćelija dođe do nule, pre nego što se kultura sakupi.
U sledećoj realizaciji ovog pronalaska, u narednoj proizvodnoj fazi ćelijama se dozvoljava da rastu tokom definisanog perioda vremena. Na primer, zavisno od koncentracije ćelijske kulture na početku naredne faze rasta, zatim temperature na kojoj ćelije rastu i svojstvene brzine rasta ćelija, ćelije mogu rasti 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više dana. U nekim slučajevima ćelijama se može dozvoliti da rastu mesec dana ili više. Stručnjak koji vodi ovaj pronalazak je u stanju da odabere trajanje naredne proizvodne faze, zavisno od zahteva za proizvodnju polipeptida ili proteina i potreba samih ćelija.
U nekim slučajevima, može biti korisno ili potrebno da se u toku naredne, proizvodne faze u ćelijsku kulturu dodaju suplementi, u vidu nutrijenata ili drugih komponenti medijuma, koje su osiromašile ili su ih ćelije metabolisale. Na primer, može biti pogodno da se ćelijskoj kulturi dodaju nutrijenti ili druge komponente medijuma za koje je, prilikom praćenja ćelijske kulture opaženo da su osromašili (videti odeljak "Praćenje uslova kultivisanja", niže). Alternativno, ili pored toga, može biti korisno ili neophodno da se ćelijskoj kulturi dodaju suplementi i pre naredne, proizvodne faze. Kao primer, ali bez ograničavanja, može biti korisno ili neophodno, da se ćelijskoj kulturi dodaju hormoni i/ili drugi faktori rasta, određeni joni (kao što su natrijumov, hloridni, kalcijumov, magnezijumov i fosfatni), puferi, vitamini, nukleozidi ili nukleotidi, mikroelementi (neorganska jedinjenja, obično prisutna u vrlo niskim konačnim koncentracijama), aminokiseline, lipidi ili glukoza, ili neki drugi izvor energije.
Ovi suplementi se mogu dodavati ćelijskoj kulturi u jednom trenutku, ili se mogu dodavati ćelijskoj kulturi kroz niz dodavanja. U jednoj realizaciji ovog pronalaska, suplementi se dodaju ćelijskoj kulturi u više vremena, u proporcionalnim količinama. U sledećoj realizaciji, može biti poželjno da se samo neki od suplemenata obezbede inicijalno, a da se ostale komponete dodaju kasnije. U još jednoj realizaciji ovog pronalaska, ćelijska kultura se kontinualno napaja sa ovim suplementima.
U skladu sa ovim pronalaskom, optimalno je da se ukupna zapremina koja se dodaje ćelijskoj kulturi drži na minimumu. Na primer, ukupna zapremina medijuma ili rastvora koji sadrži suplemente, koja se dodaje ćelijskoj kulturi, može biti 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50% od zapremine ćelijske kulture pre dodavanja suplemenata.
Ćelijska kultura se može mešati ili mućkati tokom naredne, proizvodne faze, da bi se povećala oksigenacija i dispergovanje nutrijenata ćelijama. U skladu sa ovim pronalaskom, onaj ko je uobičajeno verziran u stanju tehnike zna da može biti korisno da se kontrolišu ili regulišu neki interni uslovi u bioreaktoru, za vreme naredne proizvodne faze, kao što su, ali bez ograničavanja, pH, temperatura, oksigenacija, itd. Na primer, pH se može kontrolisati dodavanjem odgovarajuće količine kiseline ili baze, a oksigenacija se može kontrolisati pomoću uređaja za produvavavnje, koji su dobro poznati u stanju tehnike.
Praćenje uslova kultivisanja
U nekim realizacijama ovog pronalaska, vodeći stručnjak može naći da je korisno ili neophodno da se periodično prate određeni uslovi rasta ćelijske kulture. Praćenje uslova ćelijske kulture dozvoljava vodećem stručnjaku da odredi da li ćelijska kultura proizvodi rekombinantni polipeptid ili protein na suboptimalnom nivou, ili da li je kultura pred ulaskom u suboptimalnu proizvodnu fazu. Da bi se pratili neki uslovi u ćelijskoj kulturi, potrebno je uzeti male alikvote kulture za analizu. Onaj ko je uobičajeno verziran u stanju tehnike zna da se ovim uzimanjem potencijalno mogu uneti kontaminacije u ćelijsku kulturu, pa će stoga peduzeti odgovarajuće mere da se na minimum svede rizik od takve kontaminacije.
Kao primer, ali bez ograničavanja, može biti korisno ili neophodno da se prati temperatura, pH, gustina ćelija, vitalnost ćelija, integralna gustina vitalnih ćelija, sadržaj laktata, sadržaj amonijuma, osmolaritet ili titar ekspresovanog polipeptida ili proteina. U stanju tehnike su poznate brojne tehnike koje dozvoljavaju onom ko je uobičajeno verziran u stanju tehnike, da meri ove uslove. Na primer, gustina ćelija se može meriti upotrebom hematocitometra, Coultier-ovog brojača, ili ispitivanjem gustine ćelija (CEDEX). Gustina vitalnih ćelija se može odrediti bojenjem uzorka kulture sa bojom Tripan plavo. Pošto samo mrtve ćelije apsorbuju Tripan plavo, gustina vitalnih ćelija se može odrediti brojanjem ukupnog broja ćelija, pa deljenjem broja ćelija koje su apsorbovale boju sa ukupnim brojem ćelija, pa uzimanjem recipročne vrednosti dobijenog rezultata. Može se koristiti HPLC za određivanje sadržaja laktata, amonijuma ili ekspresovanog polipeptida ili proteina. Alternativno, sadržaj ekspresovanog polipeptida ili proteina se može odrediti standardnim tehnikama molekularne biologije, kao što je bojenje sa Coomassie-m gelova SDS-APGE, zatim bojenje sa VVestern blot, Bradford-ovim testovima, Lowry-evim testovima, Biuret-ovim testovima i preko absorbancije UV. Takođe, može biti korisno ili neophodno da se prate post-translacione modifikacije ekspresovanog polipeptida ili proteina, uključujući fosforilovanje i glikozilovanje.
Izolovanje ekspresovanog polipeptida
Obično, tipično je poželjno da se izoluju i/ili prečiste proteini ili polipeptidi ekspresovani u skladu sa ovim pronalaskom. U poželjnoj realizaciji, ekspresovani polipeptid ili protein se nalazi u medijumu, pa se stoga ćelije i druge čvrste supstance moraju ukloniti, na primer centrifugiranjem ili filtriranjem, u prvom koraku procesa prečišćavanja. Ova realizacija je naročito korisna kada se koristi u skladu sa ovim pronalaskom, zato što postupci i kompozicije koji su ovde opisani, za rezultat imaju povećanu vitalnost ćelija. Kao rezultat toga, tokom procesa kultivisanja manje ćelija umire, pa se u medijumu oslobodi i manje proteolitičkih enzima, koji potencijalno mogu da smanje prinos ekspresovanog polipeptida ili proteina.
Alternativno, ekspresovani polipeptid ili protein je vezan za površinu ćelija domaćina. U ovoj realizaciji, ukloni se medijum, a ćelije domaćina, koje ekspresuju polipeptid ili protein, se lizuju, što predstavlja prvi korak u procesu pečišćavanja. Liza sisarskih ćelija domaćina se može postići bilo kojim od brojnih načina, poznatih onima koji su uobičajeno verzirani u stanju tehnike, uključujući fizičko raskidanje pomoću staklenih perli i izlaganje uslovima visokog pH.
Polipeptid ili protein se može izolovati i prečistiti standardnim postupcima, uključujući, ali bez ograničavnja, hromatografiju (npr. hromatografijfa sa jonskom izmenom, afinitetna, sa odvajanjem po veličini, i na hidroksiapatitu), gel-filtriranje, centrifugiranje, ili diferencijalnu rastvorljivost, taloženje etanolom ili neku drugu dostupnu tehniku za prečišćavanje proteina (videti npr., Scopes, "Protein Purification Principles and Practice", 2nd edition, Springer-Verlag, New York, 1987; Higgins, S.J. i Hames, B.D., (eds), "Protein Expression: A practical Approach", Oxford Univ. Press, 1999; i Deutscher, M.P., Simon, M.I., Abelson, J.N. (eds), "Guide to Proteein Purification: Methods in Enzymology" (Methods in Enzimology Series, Vol. 182), Academic Press 1997). Posebno, u imunoafinitetnoj hromatografiji, protein se može lizovati njegovim vezivanjem za kolonu sa afinitetom, koja sadrži antitela koja su uzgajena protiv tog proteina, a vezana su za stacionarni nosač. Alternativno, za protein se mogu zakačiti i afinitetni privesci, kao što je sekvencija za oblaganje gripa, poli-histidin ili glutation-S-transferaza, korišćenjem standardnih rekombinantnih tehnika, da bi se omogućilo lako prečišćavanje, propuštanjem kroz odgovarajuću afinitetnu kolonu. Inhibitori proteaze, kao što su fenilmetilsulfonil fluorid (PMSF), leupeptin, pepstatin ili aprotinin, mogu biti dodavani u bilo kom ili u svim koracima, kako bi se smanjila ili eliminisala degradacija polipeptida ili proteina tokom procesa prečišćavanja. Inhibitori proteaze su naročito poželjni kada se ćelije moraju lizovati, da bi se izolovao ili prečistio ekspresovani polipeptid ili protein. Onaj ko je uobičajeno verziran u stanju tehnike zna da će tačna tehnika prečišćavanja varirati, zavisno od karaktera polipetida ili proteina koji treba da se prečisti, karaktera ćelija iz kojih je polipeptid ili protein ekspresovan i kompozicije medijuma u kome su ćelije rasle.
Farmaceutske formulacije
U nekim poželjnim realizacijama ovog pronalaska, dobijeni polipeptidi ili proteini će imati farmakološku aktivnost, pa će biti korisni za dobijanje farmaceutskih preparata. Pronađene kompozicije, kao što je opisano gore, mogu se ordinirati nekom subjektu, ili prvo treba da se formulišu za oslobađanje bilo kojim dostupnim putem, uključujući ali bez ograničavanja, parenteralni (npr. intravenozni), intradermalni, subkutani, oralni, nazalni, bronhijalni, oftalmalni, transdermalni (površinski), transmukozalni, rektalni i vaginalni put. Pronađene farmaceutske kompozicije tipično sadrže prečišćeni polipeptid ili protein, ekspresovan iz nekog soja ćelija sisara, agens za oslobađanje (tj. neki katjonski polimer, peptidni molekulski transporter, surfaktant, itd., kao što je opisano gore) u kombinaciji sa nekim farmaceutski prihvatljivim nosačem. Kako se ovde koristi, fraza "farmaceutski prihvatljiv nosač" obuhvata rastvarače, disperzione medijume, obloge, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične agense, agense za odlaganje absorpcije, i slično, koji su kompatibilni sa farmaceutskim ordiniranjem. U ove kompozicije takođe mogu biti uključena i jedinjenja aktivna kao suplementi.
Farmaceutska kompozicija se formuliše tako da bude kompatibilna na namenjenim putem ordiniranja. Rastvori i suspenzije, koji se koriste za parenteralnu, intradermalnu ili subkutanu primenu, mogu sadržati sledeće komponente: neki sterilni razblaživač, kao što je voda za injekcije, slani rastvor, stabilizovana ulja, polietilenglikoli, glicerin, propilenglikol ili drugi sintetski rastvarači; antibakterijske agense, kao što su benzil alkohol ili metil parabeni; antioksidante, kao što je askorbinska kiselina ili natrijum-bisulfit; agense za helatiranje, kao što je etilendiamintetrasirćetna kiselina; pufere, kao što su acetati, citrati ili fosfati i agense za podešavanje izotoničnosti, kao što su natrijum-hlorid ili dekstroza. Podešavanje pH može biti sa kiselinama ili bazama, kao što su hlorovodonična kiselina ili natrijum-hidroksid. Parenteralni preparati se mogu pakovati u ampule, špriceve za jednu upotrebu, ili fiole za više doza, napravljene od stakla ili plastike.
Farmaceutske kompozicije pogodne za injektiranje tipično sadrže sterilne vodene rastvore (ako su rastvorni u vodi) ili disperzije i sterilne prahove za ekstemporane preparate sterilnih injektibilnih rastvora ili disperzija. Za intravenozno ordiniranje, pogodni nosači su fiziološki slani rastvor, bakteriostatska voda, Cremophor EL™ (BASF, Parsippanv, NJ) ili fosfatni slani pufer (PBS). U svim slučajevima kompozicija treba da je sterilna i da bude fluidna do one mere da se može lako davati iz šprica. Poželjne farmaceutske formulacije su stabilne pod uslovima proizvodnje i skladištenja, i moraju biti zaštićene od kontaminiranja mikroorganizmima, kao što su bakterije i gljivice. Obično, relevantni nosač može biti neki rastvarač ili disperzioni medijum, koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerin, propilenglikol, i tečni polietilenglikol, i slično) i njihove pogodne smeše. Ispravan fluiditet se može održavati, na primer, upotrebom neke obloge, kao što je lecitin, u slučaju disperzija održavanjem zahtevane veličine čestica, i upotrebom surfaktanata. Sprečavanje delovanja mikroorganizama se može postići raznim antibakterijskim i antifungalnim agensima, na primer, parabenima, hlorbutabnolom, fenolom, askorbinskom kiselinom, timerosalom, i slično. U mnogim slučajevima poželjno je da se u kompoziciju uključe izotonični agensi, na primer, šećeri, polialkoholi, kao što su manitol, sorbitol, ili natrijum-hlorid. Produžena absorpcija injektibilnih kompozicija se može ostvariti uključivanjem u kompoziciju nekog agensa koji odlaže absorpciju, na primer, aluminijum-monostearata i želatina.
Sterilni injektibilni rastvori se mogu dobiti dodavanjem prečišćenog polipeptida ili proteina u potrebnu količinu odgovarajućeg rastvarača, sa jednim ili kombinacijom sastojaka nabrojanih gore, prema potrebi, posle čega sledi sterilizacija filtriranjem. Obično, disperzije se dobijaju uključivanjem prečišćenog polipeptida ili proteina, ekspresovanog iz nekog soja ćelija sisara, u sterilni tečni nosač, koji sadrži osnovni disperzioni medijum i druge potrebne sastojke, između onih koji su nabrojani gore. U slučaju sterilnih prahova, za dobijanje sterilnih injektibilnih rastvora, poželjni postupci dobijanja su sušenje pod vakuumom i sušenje smrzavanejm, koji daju prah aktivnog sastojka i bilo koji dodatni poželjni sastojak, iz prethodnog njegovog sterilno filtriranog rastvora.
Oralne kompozicije obično sadrže neki inertni razblaživač ili jestivi nosač. Za potrebe oralnog terapeutskog ordiniranja, prečišćni polipeptid ili protein se može pomešati sa ekscipijentima, pa koristiti u obliku tableta, traheja ili kapsula, npr. želatinskih kapsula. Oralne kompozicije mogu takođe da se dobiju korišćenjem nekog fluidnog nosača, kada se koriste kao vodice za usta. Kao deo kompozicije, mogu se dodati farmaceutski kompatibilni agensi za vezivanje i/ili adjuvantni materijali. Tablete, pilule, kapsule, troheje i slično, mogu sadržati bilo koji od sledećih sastojaka, ili jedinjenja slične prirode: vezivo, kao što je mikrokristalna celuloza, guma tragakant ili želatin; neki ekscipijent, kao što su škrob ili laktoza, dezintegracioni agens, kao što je alginska kiselina, Primogel ili kukuruzni škrob; lubrikant, kao što je magnezijum-stearat ili Sterotes; neki glidant, kao što je koloidni silicijum-dioksid; zaslađivač, kao što je saharoza ili saharin; ili agens za aromatizovanje, kao što je pepermint, metilsalicilat ili aroma pomorandže. Formulacije za oralno oslobađanje pogodno je da sadrže agense koji poboljšavaju stabilnost unutar gastrointestinalnog trakta i/ili pomažu absorpciju.
Za ordiniranje inhalacijom, kompozicije iz ovog pronalaska sadrže prečišćeni polipeptid ili protein, ekspresovan iz nekog soja ćelija sisara, i agens za oslobađanje, a poželjno je da se oslobađaju u formi raspršavanja aerosola iz nekog kontejera pod pritiskom, ili iz dozera, koji sadrži pogodan propelant, npr. gas, kao što je ugljen-dioksid, ili iz nebulizatora. Ovaj pronalazak posebno podrazumeva oslobađanje ovih kompozicija korišćenjem nazalnog spreja, inhalatora ili drugog direktnog oslobađanja u gornje i/ili donje vazdušne puteve. Intranazalno ordiniranje DNK vakcina protiv virusa gripa, pokazano je da indukuje odgovore CD8 T ćelija, što ukazuje da bar neke od ćelija u respiratornom traktu mogu absorbovati DNK, kada se oslobađaju ovim putem, a agensi za oslobađanje iz ovog pronalaska će pojačati ćelijsku absorpciju. U skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, kada se ordiniraju kao aerosol, kompozicije koje sadrže prečišćeni polipetid, ekspresovan iz nekog soja ćelija sisara, i agens za oslobađanje, formulišu se kao velike porozne čestice.
Sistemsko ordiniranje se može takođe postići transmukozalnim ili transdermalnim načinima. Za transmukozalno ili transdermalno ordiniranje, u formulacijama se koriste penetranti, prema odgovarajućoj barijeri koja treba da se savlada. Ovi penetranti su obično poznati u stanju tehnike, a to su na primer, za transmukozalno ordiniranje deterdženti, soli žučne kiseline i derivati fusidične kiseline. Transmukozalno ordiniranje se može obaviti primenom nazalnih sprejova ili supozitorija. Za transdermalno ordiniranje, prečišćeni polipeptid ili protein i agens za oslobađanje se mogu formulisati u masti, meleme, gelove ili kreme, kao što je obično poznato u stanju tehnike.
Ove kompozicije se mogu takođe dobiti u obliku supozitorija (npr. sa konvencionalnim osnovama za supozitorije, kao što su kakaobuter i drugi gliceridi) ili retencionih klistira, za rektalno oslobađanje.
U jednoj realizaciji, kompozicije se dobijaju sa nosačima koji će zaštititi polipeptid ili protein od brze eliminacije iz tela, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implantate i sisteme za oslobađanje iz mikrokapsula. Mogu se koristiti biodegradabilni, biokompatibilni polimeri, kao što su etilenvinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poli-ortoestri i poliaktička kiselina. Postupci za dobijanje ovih formulacija su jasni onom ko je verziran u stanju tehnike. Ovi materijali se mogu takođe dobiti komercijalnim putem, iz Alza Corporation i iz Nova Pharmaceuticals, Inc. Suspenzije lipozoma (uključujući lipozome targetirane na inficirane ćelije sa monoklonalnim antitelima na virusnim antigenima), mogu takođe da se upotebe kao farmaceutski prihvatljivi nosači. Ovi se mogu dobiti u skladu sa postupcima koji su poznati onima koji su verzirani u stanju tehnike, na primer, kao što je opisano u U.S.
Patent No. 4,522,811.
Pogodno je da se oralne ili parenteralne kompozicije formulišu u oblik jedinične doze, radi lakšeg ordiniranja i uniformnosti doziranja. Oblik jedinične doze, kako se ovde koristi, odnosi se na fizički odvojene entitete, podešene za pojedinačno doziranje subjektu koji treba da se tretira; svaki ovaj entitet sadrži unapred određenu koičinu aktivnog polipeptida ili proteina, izačunatu tako da izazove željeni terapeutski efekat, zajedno sa potrebnim farmaceutskim nosačem.
Polipeptid ili protein, ekspresovan u skladu sa ovim pronalaskom, može se ordinirati u raznim intervalima i u raznim periodima vremena, prema potrebi, npr. jedanput nedeljno između oko 1 do 10 nedelja, između 2 do 8 nedelja, između 3 do 7 nedelja, oko 4, 5, 6, nedelja, itd. Stručno lice zna da izvesni faktori mogu da utiču na doziranje i vremenski režim koji su potrebni za efikasno tretiranje subjekta, uključujući, ali bez ograničavanja, ozbiljnost bolesti ili poremećaja, prethodne tretmane, opšte stanje zdravlja i/ili starost subjekta, i prisustvo drugih bolesti. Obično, tretman nekog subjekta sa polipeptidom ili proteinom, koji su opisani ovde, može predstavljati jedan tretman, ili u mnogim slučajevima to može biti serija tretmana. Pored toga, podrazumeva se da će odgovarajuća doza zavisiti od snage polipeptida ili proteina, a može se isplanirati tako da, na primer, posmatrani primalac prima rastuće doze dok se ne dostigne prethodno izabrani željeni odgovor. Podrazumeva se da nivo specifične doze za bilo kog posmatranog animalnog subjekta može zavisiti od raznih faktora, uključujući aktivnost specifičnog polipeptida ili proteina koji se koristi, starosti, telesne mase, opšteg zdravstvenog stanja, pola, ishrane subjekta, vremena ordiniranja, puta ordiniranja, brzine izlučivanja, i kombinacije lekova, kao i stepena izlaganja ili aktivnosti, i da se može modulisati.
Ovaj pronalazak obuhvata upotrebu kompozicija iz ovog pronalaska i za tretman ne-humanih animalnih bića. U skladu sa tim, doze i postupci ordiniranja se odabiru u saglasnosti sa poznatim principima veterinarske farmakologije i medicine. Uputstva se mogu naći, na primer, u Adams, R. (ed), "Veterinarv Pharmacologv and Therapeutics", 8<th>edition, lowa State University Press, ISBN: 081381439; 2001.
Inventivne farmaceutske kompozicije se mogu staviti u neki kontejner, pakovanje ili dozer, zajedno sa uputstvom za ordiniranje.
Prethodni opis treba da se shvati samo reprezentativnim, a ne ograničavajućim. Alternativni postupci i materijali implementirani u ovaj pronalazak, a takođe i dodatne primene, će biti jasne onom ko je verziran u stanju tehnike, i obuihvaćeni su priključenim patentnim zahtevima.
PRIMERI
Primer 1: Poboljšani medijum 1 za anti- GDF- 8 šaržni proces sa napajanjem
Tradicionalni šaržni proces sa napajanjem za kultivisanje sojeva ćelija ima nekoliko nedostataka, uključujući vreme i napore potrebne za upravljanje napajanjima, i potrebu za posebnom opremom u bioreaktorima za rad na veliko. Zadatak je bio razviti šaržne medijume za proizvodnju na veliko određenih proteina u biorekatorima, koji će zahtevati minimalna napajanja.
Materijali i postupci
Sojevi i medijumi:Ćelije jajnika kineskog hrčka ("CHO", od engl. chinese hamster ovary) se inženjerizuju tako da ekspresuju monoklonalno antitelo protiv rasta i diferencijalcije faktora 8 ("ćelije anti-GDF-8", od engl. growth and differentiation factor) (videti, Veldman et al., "Neutralizing Antibodies Against GDF-8 and Uses Thereof u U.S. 2004/0142382 A1). Ćelije anti-GDF-8 su upotrebljene za testiranje novih šaržnih medijuma. Porede se Medijum 1 i Medijum 2 u pogledu njihovih sposobnosti da podrže visoku gustinu i vitalnost ćelija. Kompozicije ovih medijuma, kao i Medijuma 3, date su u Tabeli 1. Medijumi se prave dodavanjem svih komponenata osim FeS04-7H20. Ovim medijumima se zatim podesi pH na 7,25, registruje osmolarnost, pa zatim doda FeS04-7H20.
Uslovi kultivisanja:U eksperimentima obavljanim u balonu, ćelije anti-GDF-8 rastu u balonima sa mućkanjem, sa tri pasaže. U eksperimentima u bioreaktoru, ćelije anti-GDF-8 rastu 12 dana u medijumima, uz svakodnevno napajanje, ili sa 2 vol% 20X šaržnog medijuma Medijuma 4 (Tabela 3), ili posle 5. dana sa 3 vol% 16X Medijuma 4 (Tabela 4). Tokom prva 4 dana ćelije rastu na 37°C. Petog dana ćelije se prebace na 31°C.
Analiza uzoraka:Uzorci iz kultura se uzimaju svakodnevno, pa analiziraju na sadržaj aminokiselina, vitamina, gvožđa, fosfata, glukoze i glutamina.
Rezultati i zaključak
Slika 1 pokazuje da je u eksperimentima u balonu brzina rasta ćelija anti-GDF-8 bila slična i u Medijumu 1 i u Medijumu 2.
Slika 2 pokazuje da je u bioreaktoru Medijum 1 pokazao značajan porast konačne gustine ćelija i vitalnosti, u odnosu na Medijum 3. Konačni titar je takođe značajno povećan, od 555 mg/L za proces na platou, na 976 mg/L za Medijum 1 (podaci nisu prikazani). Petog dana temperatura je pomerena sa 37°C na 31 °C. Usled neočekivano visokog rasta ćelija, posle 5. dana kulture su svakodnevno napajanje ili sa 2 vol% 20X Medijuma 4, ili sa 3 vol% 16X Medijuma 4. Dakle, to nije bio pravi šaržni eksperiment, kao što je bila prvobitna namera. U medijum za napajanje, počevši od 10. dana, dodavani su asparagin i tiamin.
Pri razvijanju koncentrisanih šaržnih medijuma, potrebno je voditi računa o nekoliko bitnih stvari. Prvo, koncentrovani nutrienti se mogu pokazati toksičnim za ćelije. U medijumima koji su razvijeni u ovom Primeru, svi nutrijenti i komponente određeni su tako da budu ispod granica toksičnosti (podaci nisu prikazani).
Drugo, koncentrovani šaržni medijumi neophodno imaju viši osmolaritet, nego ne-koncentrovani medijumi, za koji je pokazano da ima štetne efekte na rast i vitalnost ćelija. Ovaj problem se može izbeći snižavanjem količine NaCI u polaznim medijumima. Pored toga, koncentrovani šaržni medijumi sadrže nedovoljno glukoze da podrže rast tokom čitavog kultivisanja. Stoga, kulturama se svakodnevno, posle 5. dana, dodaje napajanjem glukoza.
Treće, insulin i glutamin su osetljivi na degradaciju tokom 12-todnevnog perioda kultivisanja. Stoga, kulturi se, pored glukoze, dodaju i ovi suplementi.
Konačno, gvožđe će se taložiti iz rastvora koji sadrže visoke koncentracije fosfata i visoko pH. Ovaj problem se može izbeći dodavanjem gvožđa na kraju procesa pripremanja medijuma, nakon što se pH podesi na odgovarajući nivo.
Primer 2: Razvoj koncentrisanog medijuma za napajanje ( Medijum 5) za šaržni proces
sa napajanjem ćelija anti- GDF- 8
U Primeru 1 razvijen je šaržni proces za kultivisanje ćelija anti-GDF-8 uz upotrebu Medijuma 1. Zbog visoke gustine ćelija koja je posledica procesa, nađeno je da je pogodno dodavanje nutrijenata, pored glukoze i glutamina. Međutim, dodavanje suplemenata u šaržu, napajanjem medijuma sa 8X Medijumom 4, vodilo bi povećanom razblaživanju kulture. Da bi se prevazišao ovaj problem, razvijeni su koncentrovaniji medijumi.
Materijali, postupci i rezultati
U Tabeli 2 su date kompozicije Medijuma 4A-1, Medijuma 4B, Mikro B i Mikro D, korišćene u formulacijama u Tabelama 3-7.
20X Medijum 4
Prvi razvijeni koncentrovani medijum bio je 20X Medijum 4. Formulacija 20X Medijuma 4 je data u Tabeli 3.
Formulacija ovog medijuma se sastoji iz tri dela: I, II i III. Deo I je koncentrovana verzija 8X Medijuma 4, sa pojedinim komponentama Medijuma 4B, izuzimajući folnu kiselinu, zbog problema sa rastvorljivošću ovog vitamina. Deo II, je polazni rastvor gvožđa, Mikroelemenata D i kiselog cisteina, kako bi se izbeglo moguće taloženje gvožđa, ukoliko bi se dodao u Deo I. Deo III je polazni rastvor folne kiseline. Deo I se dodaje u iznosu 2 vol%, svakodnedno posle 5. dana, a Delovi II i III se dodaju jedanput 5. dana, zajedno sa Delom I.
Konačno pH napojnog medijuma se podesi na pH 7,0, a osmolarnost je oko 1064 mOsm. Jedno 2% napajanje kulture dovodi do porasta glukoze za 2 g/L, glutamina 2 mM i osmolarnosti za 0,14 mOsm.
2.16X Medijum 4
Da bi se smanjio porast osmolariteta, napojni medijum je promenjen od 20X Medijuma 4 (svakodnevno 2 vol%) na 16X Medijum 4 (svakodnevno 3 vol%). Formulacija medijuma 16X Medijum 4 data je u Tabeli 4.
U ovom modifikovanom 16X Medijumu 4 izostavljena je glukoza, da se još smanji osmolaritet i dozvoli izvesna fleksibilnost u napajanju glukozom. Ukupni osmolaritet ovog napojnog medijuma je sada 295 mOsm.
3. 16X Medijum 4
U formulaciji 16X Medijuma 4 napravljene su izmene. Polazni rastvor gvožđa je dodat napajanju, što pri svakom napajanju predstavlja dodatak od 0,45 pM. Pored toga, vraćena je glukoza, što predstavlja dodatak od 1,5 g/L pri svakom napajanju. Formulacija medijuma za ovaj modifikovani 16X Medijum 4 data je u Tabeli 5.
4. 16X Medijum 4
Ovde je medijum za napajanje (16X Medijum 4) napravjen kao kombinovani medijum, umesto kao tri razdvojena napajanja, u nekoliko poslednjih šarži. Obavljeni su testovi da se proveri da li se folna kiselina može rastvoriti u zahtevanoj koncentraciji i da li se gvožđe i folna kiselina ne talože iz rastvora posle skladištenja 6 dana na 4°C, ili na sobnoj temperaturi. Formulacija medijuma za ovaj kombinovani 16X Medijum 4 data je u Tabeli 6.
Konačni osmolaritet medijuma je 724 mOsm, a svakodnevni dodatak glukoze je 2 g/L, a dodatak glutamina je 1,5 mM.
5. 12X Medijum 4
Ovde je napravljeno nekoliko izmena u medijumu za napajanje. Prah medijuma 4B se koristi umesto dodavanja svakog individualnog sastojka Medijuma 4B. Prah medijuma 4B se pomeša sa glukozom i odvojeno rastvori pod baznim uslovima, titrišući rastvor do pH 10,25. Doda se još asparagina i tiamina, ako rezultati analize aminokiselina i vitamina pokažu da su ove dve komponente iscrpljene pod kraj šaržnog procesa sa napajanjem. Upotreba 12X Medijuma 4 još smanjuje porast osmolariteta pri napajanju kulture. Formulacija medijuma 12X Medijum 4 data je u Tabeli 7.
Konačni osmolaritet je 566 mOsm. Svakodnevno napajanje sa 4 vol% daje približno povećanje osmolariteta od 8,6, povećanje glukoze za 2 g/L i povećanje glutamina od 1,5 mM. Formulacija ovog 12X Medijum 4 medijuma poznata je i kao Medijum 5. Medijum 5 se lako pravi, u poređenju sa 20X Medijumom 4 ili 16X Medijumom 4, a stabilan je 10 dana ili na sobnoj temperaturi ili na 4°C (podaci nisu prikazani).
Primer 3: Šaržni proces sa napajanjem za kultivisanje ćelija anti- GDF- 8 sa
osiromašenim glutaminom
Ćelije CHO, da bi mogle da prežive, zahtevaju glutamin u polaznom medijumu. Tradicionalno, polazni sadržaji glutamina su visoki, pa se glutamin posle 5. dana svakodnevno napaja, sve do kraja tog šaržnog procesa sa napajanjem. Normalno,
tradicionalni šaržni procesi sa napajanjem u kulturama ćelija daju visoke sadržaje laktata i amonijuma, za koje se zna da imaju inhibitorne efekte na rast ćelija, gustinu ćelija i ekspresiju rekombinantnog proteina. Šaržni procesi sa napajanjem u kojima se kulturi glukoza polako dodaje, pokazano je da snižavaju proizvodnju laktata i poboljšavaju rast ćelija, gustinu ćelija i ekspresiju rekombinantnog proteina. Međutim, postupci sa manipulacijom dodavanja glukoze iz stanja tehnike nisu praktični u proizvodnji na veliko. Ovde je pokazano da, korišćenjem medijuma kulture sa nižim polaznim sadržajima glutamina i eliminisanjem glutamina iz napajanja, dolazi do nižih sadržaja proizvedenog amonijuma i laktata, što dovodi do porasta vitalnosti ćelija. Pored toga, u kulturama sa osiromašenim glutaminom, raste ekspresija rekombinantnog proteina, a konačni osmolaritet se smanjuje.
Materijali i postupci
Sojevi i medijumi:Ćelije anti-GDF-8 se kultivišu pomoću šarže sa napajanjem u Medijumu 1, u bioreaktoru od 1 L.
Uslovi kultivisanja:Ćelije rastu 12 dana u bioreaktorima od 1 L. Temperatura se pomera sa 37°C na 31 °C ili posle 4. ili posle 5. dana, zavisno od rasta ćelija. Ovi šaržni procesi sa napajanjem se testiraju kao što sledi: normalni (kontrolni) proces, proces bez napajanja glutamina i proces sa osiromašenim glutaminom. Detalji ovih procesa su navedeni u Tabeli 8 i Tabeli 9.
Analiza uzoraka:Uzorci kultura se uzimaju svakodnevno, pa analiziraju na gustinu ćelija, vitalnost ćelija, i sadržaje laktata, glutamina i amonijuma. Takođe, svakodnevno se meri titar ekspresovanog anti-GDF-8 antitela.
Rezultati i zaključci
Slika 3 prikazuje gustinu ćelija u kulturama koje su rasle ili bez napajanja glutaminom, ili pod kontrolnim uslovima šarže sa napajanjem. U oba slučaja, tokom čitavog eksperimenta gustina ćelija je bila slična.
Slika 4 prikazuje procenat vitalnosti ćelija u kulturama, koje su rasle ili bez napajanja glutaminom, ili pod kontrolnim uslovima šarže sa napajanjem. Kultura bez napajanja glutaminom je pokazala primetno veću vitalnost ćelija na kraju eksperimenta, počevši od 6. dana.
Slika 5 prikazuje sadržaje amonijuma u kulturama raslim ili bez napajanja glutaminom, ili pod uslovima kontrolne šarže sa napajanjem. Kultura bez napajanja glutaminom je pokazala primetno sniženje sadržaja amonijuma pod kraj eksperimenta, počevši od 4. dana.
Slika 6 prikazuje sadržaje laktata koji su rasli u kulturama bez napajanja glutaminom, ili pod uslovima kontrolne šarže sa napajanjem. Sadržaji laktata tokom čitavog eksperimenta su malo niži u kulturama bez napajanja glutaminom.
Slika 7 prikazuje titar anti-GDF-8 antitela u kulturama bez napajanja glutaminom, ili pod uslovima kontrolne šarže sa napajanjem. Konačni titar anti-GDF-8 antitela bio je viši u kulturama bez napajanja glutaminom.
Slika 8 prikazuje gustinu ćelija u kulturama koje su rasle sa osiromašenim glutaminom ili pod uslovima kontrolne šarže sa napajanjem. U oba sluačaja gustina ćelija je bila slična čitavim tokom eksperimenta.
Slika 9 prikazuje vitalnost ćelija u kulturama koje su rasle sa osiromašenim glutaminom ili pod uslovima kontrolne šarže sa napajanjem. U oba sluačaja vitalnost ćelija je bila slična čitavim tokom eksperimenta.
Slika 10 prikazuje sadržaje amonijuma u kulturama koje su rasle sa osiromašenim glutaminom ili pod uslovima kontrolne šarže sa napajanjem. Kulture sa osiromašenim glutaminom su pokazale primetno smanjenje sadržaja amonijuma čitavim tokom eksperimenta.
Slika 11 prikazuje sadržaj laktata u kulturama koje su rasle sa osiromašenim glutaminom ili pod uslovima kontrolne šarže sa napajanjem. Kulture sa osiromašenim glutaminom su pokazale primetno smanjenje sadržaja laktata čitavim tokom pred kraj eksperimenta, počevši od 4. dana.
Slika 12 prikazuje titar anti-GDF-8 antitela u kulturama koje su rasle sa osiromašenim glutaminom ili pod uslovima kontrolne šarže sa napajanjem. Konačni titar anti-GDF-8 antitela bio je viši u kulturama sa osiromašenim glutaminom.
Kolektivno, ovi rezultati pokazuju da su smanjeni sadržaji glutamina korisni za ćelijske kulture, jer smanjuju proizvodnju količine amonijuma, povećavaju vitalnost ćelija i povećavaju titar ekspresije anti-GDF-8 antitela. Pored toga, u kulturama osiromašenim sa glutaminom, opaženi su niži sadržaji laktata, moguće usled smanjene brzine potrošnje glukoze. Sniženi sadržaji amonijuma i laktata nemaju efekat na smanjenje ukupnog osmolariteta. Poznato je takođe da povišenje osmolariteta ima inhibitorne efekte na rast i vitalnost ćelija. Niži polazni sadržaji glutamina, zajedno sa eliminisanjem napajanja glutaminom, imaju takođe pozitivan efekat na smanjenje amonijuma proizvedenog kao rezultat ne-enzimatske degradacije glutamina pri stajanju medijuma. Eliminisanje glutamina iz napajanja takođe pojednostavljuje proces kultivisanja anti-GDF-8 ćelija.
Primer 4: Odgovor ćelija anti- GDF- 8 na dozu gvožđa u Medijumu 1 i Medijumu 2
Medijum 1 je koncentrovaniji sa nutrijentima nego Medijum 2. Određeni su optimalni sadržaji gvožđa u Medijumu 1, kako bi se izbegli problemi sa nedostatkom gvožđa tokom kultivisanja ćelija.
Materijali i postupci
Ćelije anti-GDF-8 su kultivisane u petrijevim šoljama sa jednim pasažom, ili u Medijumu 1 ili u Medijumu 2. Koncentracije gvožđa u ovim medijumima mogu se manipulisati dodavanjem različitih količina polaznog rastvora gvožđa. Konačne gustine ćelija su merene pomoću CEDEX.
Rezultati i zaključak
Slika 13 prikazuje odgovor ćelija anti-GDF-8 na dozu Fe u Medijumu 1 i u Medijumu 2, koji sadrže različite koncentracije gvožđa. U Medijumu 2, gustina ćelija bila je relativno konstantna za koncentracije gvžđa koje su se kretale od 3 uM do 15 uM. U Medijumu 1, gustina ćelija je rasla sa povećanjem koncentracije gvožđa, ali je dostigla maksimum posle približno 5 uM. Ova razlika može biti usled visokog sadržaja nutrijenata u Medijumu 1, koji bi mogli da snize dostupnost gvožđa ćelijama, kao posledica helatiranja gvožđa u medijumu. Ovi rezultati pokazuju da sadržaji gvožđa treba da se drže oko 5 uM, da bi se izbegli problemi sa nedostatkom gvožđa u Medijumu 1.
Primer 5: Zamena glutamata sa glutaminom u procesu u bioreaktoru
Obavljena su tri eksperimenta da se testiraju efekti zamene glutamata sa glutaminom u procesu kultivisanja ćelija anti-Levvis Y.
Materijali i postupci
Eksperimenti su obavljeni u bioreaktorima od 10 L, na pH 7,1, sa 30% rastvorenog kiseonika, na polaznoj temperaturi od 37°C, koja je 5. dana pomerena na 31 "C. Gasovi koji su produvavani i prevođeni iznad kulture, bili su 88% smeše 93% vazduh/7%002i 12% kiseonik. Polazni medijum u svim eksperimentima bio je Medijum 1, koji sadrži glutamin. Napojni medijum u shemi napajanja je sadržao dodatnu glukozu i glutamin, kao što je pokazano u Tabeli 10. Kolone naslovljene "Glutamat" su napajane sa modifikovanim Medijumom 5, koji nije sadržao glutamat, nego je sadržao molarnu koncentraciju glutamata, jednaku molarnoj koncentraciji glutamina u standardnom Medijumu 5. Kolone naslovljene sa "Glutamin" napajane su sa standardnim Medijumom 5.
Rezultati i zaključci
U svakom od eksperimenata gustina ćelija je slična, kao što pokazuje Slika 14. Gustine ćelija su niske u eksperimentima sa Glutaminom 2 i Glutamatom 2, usled odstupanja pH na oko 6,7 3. dana procesa. Pad gustine između 6. i 7. dana u eksperimentima sa Glutaminom 3 i Glutamatom 3, je usled toga što je 6. dana napajan 29% medijum.
Slika 15 prikazuje vitalnost ćelija u kulturama napajanim sa glutamatom i glutaminom. Više vitalnosti su bile tokom druge polovine procesa u bioreaktorima u kojima su kulture napajane glutamatom.
U Eksperimentu 1, titar anti-Levvis Y je sličan među kulturama napajanim glutamatom i glutaminom. Slika 16 prikazuje da su u Eksperimentima 2 i 3 titri anti-Levvis Y bili niži u reaktorima napajanim glutaminom. Niži titar anti-Levvis Y, opažen u ovim reaktorima, može biti usled suviše visokih sadržaja proizvedenog laktata, kao što pokazuje Slika 17.
Bioreaktori koji su vođeni sa glutamatom u medijumu za napajanje imali su nižu koncentraciju amonijuma (Slika 18) i niži osmolaritet (Slika 19).
Korišćen je vezujući ELISA test da se testira aktivnost uzoraka u eksperimentima Glutamin 1 i Glutamat 1. Aktivnosti su bile slične: 110% od referentnog za uzorak Glutamina 1, i 122% od referentnog za uzorak Glutamata 1 (podaci nisu prikazani).
Zamena glutamata glutaminom u ovim eksperimentima nije imala značajan efekat na gustinu ćelija. Međutim, vitalnost ćelija je niža u bioreaktorima sa glutaminom. Amonijum, laktati i osmolarnost su bili niži u bioreaktorima sa glutamatom, u poređenju sa onima koji su napajani glutaminom. U prošeku, titar anti-Levvis Y je viši u bioreaktorima napajanim sa glutamatom, a aktivnost je u biti ista pod oba uslova.
Primer 6: Zamena glukoze i glutamina u procesu kultivisanja ćelija anti- Levvis Y
Svrha ovog eksperimenta je da se testiraju efekti zamene glukoze i glutamina sa medijumom za napajanje iz Tabele 11 niže, u kultivisanju ćelija anti-Levvis Y (videti Bogheart et al., "Antibodv-targeted chemotherapv vvith the calcicheamicin conjugate hu3S193-N-acetyl gamma calcicheamicin dimethyl hydrazide targets Lewisy and eliminates Lewisy-positive human carcinoma cells and xenografs" uClin. Can. Res. 10,4538-49 (2004)). Mereni su gustina ćelija, vitalnost ćelija, titar anti-Levvis Y i sadržaji amonijuma.
Materijali i postupci
Eksperiment je obavljen u balonima za mućkanje od 250 mL, sa polaznom zapreminom 75 mL. Svi baloni za mućkanje su zasejani sa 0,25x10<6>ćelija/mL u Medijumu 2. Ovi balonii su inkubirani 14 dana, na 37°C, u inkubatoru sa 7% C02. Trećeg i 4. dana baloni su napajani sa 5 vol% Medijuma 6 za napajanje. Kompozicija Medijuma 6 je navedena u Tabeli 11. U dane 5-13 baloni su napajani sa 5 vol% jednog od rastvora za napajanje, navedenih u Tabeli 12. Svaki uslov je ponovljen u duplikatu. Uzroci su uzimani svakodnevno za određivanje broja ćelija pomoću CEDEX i testiranje amonijuma, glukoze i laktata.
Rezultati i zaključci
Najveća gustina ćelija je opažena kada su u medijumu za napajanje glutamat ili glicilglutamin zamenili glutamin, u prisustvu ili glukoze ili galaktoze. Gustina ćelija je obično niža u kulturama napajanim sa glukozom/glutaminom, galaktozom/glutaminom ili sa samom glukozom (Slika 20). Konačna vitalnost je bila najviša u kulturama napajanim samo sa glukozom, a zatim u kulturama napajanim sa glukozom/glutamatom. Najniža vitalnost je opažena u kulturama napajanim sa glutaminom ili asparaginom kombinovanim ili sa glukozom ili galaktozom (Slika 21).
Titar je bio najviši 14. dana u kulturama napajanim sa oko 700 pg/mL glukoze/glicilglutamina i glukoze/glutamata. Titar je bio najniži u kulturama napajanim sa oko 500 ug/mL galaktoze/glicilglutamina i galaktoze/asparagina. Titar u kontroli glukoza/glutamin bio je oko 570 ug/mL (Slika 22).
Najniži sadržaji amonijuma opaženi su u balonima napajanim sa glukozom/glutamatom i samo sa glukozom. Baloni koji su napajani sa galaktozom/glutamatom, glukozom/glutaminom, glukozom/glicilglutaminom i glukozom/asparaginom, pokazivali su srednje sadržaje amonijuma. Baloni napajani sa galaktozom/asparaginom, galaktozom/glicilglutaminom i galaktozom/glutaminom su imali najviše sadržaje amonijuma (Slika 23).
Sadržaji glukoze su ostajali iznad 1 g/L u svim balonima napajanim sa galaktozom, sve do 11. dana. Od 11. do 14. dana, glukoza u ovim balonima nikada nije bila potpuno potrošena, nego je ostajala između 0,6 i 1 g/L, bez signifikantnih razlika između različitih kultura.
Sadržaji glukoze su rasli u svim balonima napajanim glukozom ili glukozom kombinovanom sa nekim drugim substratom, sve do 10. dana. Od 10. do 14. dana, u ovim kulturama sadržaji glukoze su ostajali zadovoljavajuće konstantni i slični jedan drugom. Najzad, 14. dana, oko 8,4 g/L glukoze je ostalo u kulturama napajanim sa glukozom/glutamatom, a oko 10,8 g/L je ostalo u kulturama napajanim samo sa glukozom.
Sadržaji laktata su dostigli oko 2,4 g/L 5. dana, kada su uslovi bili isti za sve ćelije, a u svim kulturama pali su suštinski na nulu posle 14. dana. Sadržaji laktata bili su najviši od 10. do 14. dana u kontroli glukoza/glutamin, ali su bili ispod 1 g/L tokom ovog vremena (podaci nisu prikazani).
Svi testirani uslovi u ovim eksperimentima su doveli do veće gustine ćelija nego u kontrolnom stanju glukoza/glutamin. Svi testirani uslovi, izuzimajući kombinaciju galaktoza/asparagin, doveli su do veće konačne vitalnosti ćelija, nego kontrola glukoza/glutamin, ili pod uslovom napajanja sa galaktoza/glutaminom. Titar u kontroli glukoza/glutamin bio je oko 570 pg/mL, u poređenju sa visokih oko 700 pg/mL za uslov napajanja glukuoza/glicilglutaminom i uslov napajanja glukoza/glutamatom.
Primer 7: Ocena šaržnog procesa sa osiromašenim glutaminom za proizvodnju anti-GDF- 8.
Tipični postupci šaržne proizvodnje sa napajanjem zahtevaju višestruko napajanje tokom perioda kultivisanja. Ova napajanja su planirana da zamene nutrijente u medijumu koje su ćelije potrošile, ili su mogli da se razgrade tokom šaržiranja. Ova napajanja izazivaju komplikacije kada se proces unapređuje ka većoj proizvodnji, i treba da se koristi u većim reaktorima, kao što je potreba zapomakom u povećanju pogona (videti Sliku 24). Pored toga, napajanja razblažuju količinu anti-GDF-8, koji je već izlučen u kulturu, pa stoga utiču na titar žetve. Upotreba šaržnog procesa zahteva inokulaciju čitave zapremine bioreaktora, umesto dela zapremina, pa time i raspoređivanje napajanja, čime bi prestala potreba za pomakom u povećanju pogona i umnogome se smanjio efekat razblaživanja na produktovnost.
Glutamin je jedan od najznačajnijih razloga zašto se koristi pristup šarže sa napajanjem, zato što on nije stabilan na 37°C, pa je smatrano da on treba da se potroši tokom šaržnog kultivisanja. Međutim, rezultati Eksperimenata 2, 5 i 6, u kojima je testirana strategija osiromašavanja glutamina, su pokazali signifikantan porast u produktivnosti, u poređenju sa kontrolnim reaktorom koji je napajan glutaminom. Ovaj rezultat je kombinovan sa šaržnim procesom da bi se kreirao šaržni proces sa osiromašenjem glutamina, koji je testiran u ovom Primeru.
Materijali i postupci
Ćelije anti-GDF-8 su rasle 12 dana u bioreaktorima od 1 L, u skladu sa sledeća četiri uslova za rast. Parametri bioreaktora za sve ove uslove održavani su istim. Rastvoreni kiseonik je držan na ne manje od 23%, zasićavanjem sa vazduhom, produvavanjem vazduha, a pH je održavano na 7,00 dodavanjem rastvora koji je sadržao 0,58 M natrijum-bikarbonat i 0,71 M natrijum-karbonat. Temperatura šarže u svim kulturama je prvih 4 dana održavana na 37°C. Četvrtog dana temperatura šarži u svim bioreaktorima je snižena na 31 °C i na tom nivou održavana tokom trajanja procesa. Kontrola i šaržne kulture sa napajanjem su napajanje respektivnim medijumima za napajanje sa 8%, 12% i 8% od ukupne zapemine reaktora, u dane 5, 7 i 10, respektivno.
1. Kontrola.
- Inokulacioni medijum je Medijum 7 (videti Tabelu 13).
- Napajanje medijumom je sa Medijumom 8, u dane 5, 7 i 10 (videti Tabelu 13).
- Napajanje sa 5 mM glutaminom 4. dana.
- Sniženje temperature na 31 °C 4. dana.
2. Šarža napajana sa osiromašenim glutaminom
- Inokulacioni medijum je Medijum 7, sa samo 4 mM glutaminom (v. Tabelu 13)
- Napajanje medijumom je sa Medijumom 8, bez glutamina, u dane 5, 7 i 10 (v. Tabelu 13)
- Nema napajanja glutaminom 4. dana
- Sniženje temperature na 31 °C 4. dana.
3. Šarža sa osiromašenim glutaminom
- Inokulacioni medijum je novi medijum šarže sa samo 4 mM glutamina (v. Tabelu 13)
- Nema napajanja medijumom
- Nema napajanja glutaminom
- Sniženje temperature na 31 °C 4. dana.
- Dodavanje 5 g/L glukoze 8. dana.
4. Šarža sa osiromašenim glutaminom uz dodatke 8. dana
- Inokulacioni medijum je novi medijum šarže sa samo 4 mM glutamina (v. Tabelu 13)
- Nema napajanja medijumom
- Nema napajanja glutaminom
- Sniženje temperature na 31 °C 4. dana.
- Dodavanje 8. dana: 4 g/L glukoze, 375 mg Asparagina, 3 mL 1 mM polaznog rastvora FeS04, 3,33 mL polaznog rastvora sa 5 g/L Nucellin-a™, 2,57 mL polaznog rastvora od 36 mg/L Hidrokortizona i 1,0 g/L Putrescine-a, 0,3 mL polaznog rastvora od 50 mg/L natrijum-selenita i 13,1 mg tiamina.
Rezultati i zaključci
Rast ćelija tokom prva 4 dana bio je sličan u kontrolnom i šaržnim pocesima, dok je šaržni proces napajan sa osiromašenim glutaminom imao nešto nižu gustinu ćelija, koja je ostala nešto niža u ostatku šarže. Oba šaržna procesa su zadržala visoke gustine ćelija tokom trajanja procesa, verovatno usled nedostatka nekog značajnijeg razblaživanja (videti Sliku 25). Vitalnosti kultura su bile iste sve do 8. dana. Međutim, interesantno je primetiti da je 11. dana vitalnost šaržnog procesa bez dodataka bila niža, nego u druga tri bioreaktora i završila je sa značajano nižom poslednjeg dana. Ovo ukazuje da se šaržni medijum još uvek može optimizovati, zato što je šaržni proces sa dodacima imao vitalnost koja je bila ista kao u bioreaktorima šarži sa napajanjem, (videti Sliku 26).
Ćelije koje su kultivisane ili u šaržnom procesu sa osiromašenim glutaminom, ili u šaržnim procesima napajanim sa osiromašenim glutaminom, nadvisile su u produktivnosti iste ćelije koje su kultivisane u kontrolnom šaržnom procesu sa napajanjem. Kontrolni šaržni proces sa napajanjem ima titar na dan žetve od 685 ug/mL, kao što je i očekivano, dok šaržni proces napajan sa osiromašenim glutaminom ima titar na dan žetve od 1080 pg/mL, što je oko 58% više od kontrole. Ovo je slično ranije viđenim rezultatima. Šarža sa osiromašenim glutaminom bez dodavanja imala je titar na dan žetve od 960 ug/mL, slično šaržnom procesu napajanom sa osiromašenim glutaminom,dok je šaržni proces sa sa dodavanjem osiromašenog glutamina imao najviši titar od 1296 pg/mL. Ovo je povećanje za 89% u odnosu na kontrolu (videti Sliku 27).
Kada se analiziraju sadržaji inhibitora za ova četiri uslova, rezultati pokazuju da su sadržaji laktata i amonijuma u sva tri procesa sa osiromašenim glutaminom značajno niži nego u kontroli. Ustvari, posle 4. dana, pod ova tri uslova je ili prestalo stvaranje ili počelo trošenje laktata, dok je kontrola nastavila da stvara laktat, tokom čitavog šaržnog procesa (videti Sliku 28). Kao što se očekuje, sadržaji amonijuma su bili mnogo niži u procesima sa osiromašenim glutaminom i opadali su posle 4. dana, dok je kontrola nastavila da stvara amonijum (videti Sliku 29).
U ovom Primeru, kombinovanjem šaržnog procesa sa strategijom osiromašenog glutamina, dobilo se poboljšanje produktivnosti za 40%, u odnosu na kontrolni šaržni proces sa napajanjem, za anti-GDF-8 ćelije. Ovi podaci ukazuju takođe da se uz izvesnu optimizaciju medijuma šarže, može postići skoro 2-struko poboljšanje produktivnosti. Ovo poboljšanje produktivnosti se može pripisati dvama faktorima. Prvo, osiromašenje glutamina povećava produktivnost, ili direktno ili držanjem sadržaja amonijuma i laktata vrlo niskim. Drugo, zbog odsustva napajanja tokom šaržnog procesa, titar se ne razređuje. Povećana produktivnost, zajedno sa lakoćom operacije, koji su svojstvo šaržnog procesa, čini ovo privlačnom opcijom proizvodnje rekombinantnih polipeptida.
Primer 8. Efekti koncentracija glutamina i asparagina u medijumu šarže za proces
kultivisanja ćelija anti- GDF- 8
U Primerima 2, 5 i 6, pokazano je da osiromašenje glutamina predstavlja korist u kulturama šaržiranja sa napajanjem, za dva soja ćelija, uključujući povećanje rasta ćelija, vitalnosti ćelija i titra, kao i smanjenje stvaranja laktata i amonijuma. Izgleda da i asparagin igra neku ulogu u medijumu za šaržiranje.
Materijali i postupci
Ćelije anti-GDF-8 se kultivišu 12 dana u bioreaktorima od 1 L, u modifikovanom Medijumu 9, sa različitim koncentracijama glutamina i asparagina. Osnovna kompozicija Medijuma 9 je navedena u Tabeli 14. Eksperimentalne varijacije ove osnovne kompozicije navedene su u Tabeli 15. Kulture se prvih 5 dana inkubiraju na 37°C, sa izuzetkom Reaktora 4, čija temperatura je prva dva dana bila 30°C, usled problema sa kontrolisanjem temperature. Kulture su 6. dana prebačene na 31 °C. Kulture se 7. dana napajaju jedanput sa 5 vol% Medijumom 5 kome nedostaje glutamin. Kulturama se svakodnevno mere gustina ćelija, titar anti-GDF-8, sadržaji laktata i amonijuma.
Rezultati i zaključci
Slike 30, 31, 32 i 33 pokazuju rast ćelija anti-GDF-8, titar anti-GDF-8, sadržaje laktata i amonijuma, respektivno, tokom čitavog eksperimenta, pod raznim eksperimentalnim uslovima.
Pod svim eksperimentalnim uslovima, 4 mM glutamin je bolji od 1 mM glutamina, pri svim testiranim sadržajima asparagina. Pri uporednim sadržajima glutamina, bolji su uslovi sa 12 mM i 20 mM asparaginom, nego uslovi sa 8 mM asparaginom. Opaženo je smanjenje sadržaja laktata i NH4pri kraju perioda kultivisanja pod svim testiranim uslovima.
Primer 9. Efekti koncentracija glutamina i asparagina za proces kultivisanja ćelija anti-GDF- 8 u šaržnom medijumu
U Primeru 8 je pokazano da su performanse bolje u Medijumu 9, koji sadrži početnu koncentraciju glutamina od 4 mM, nego u medijumu koji sadrži 1 mM glutamin, bez obzira na sadržaje asparagina. Ovaj primer pokazuje efekte medijuma koji sadrži 13 mM glutamin i razne sadržaje asparagina.
Materijali i postupci
Ćelije anti-GDF-8 se kultivišu 12 dana u bioreaktorima od 1 L, u modifikovanom Medijumu 9, sa različitim koncentracijama glutamina i asparagina, kao što je dato u Tabeli 16. Kulture se 3 dana inkubiraju na 37°C. Zatim, 4. dana kulture se prebace na 31 °C. Kulture se 7. dana jedanput napajaju sa 5 vol% Medijuma 5 kome nedostaje glutamin. Kulturama se periodično mere gustina ćelija, vitalnost ćelija, sadržaji laktata, amonijuma i glutamina, titar anti-GDF-8 i osmolarnost.
Rezultati i zaključci
Slike 34, 35, 36, 37, 38, 39 i 40 pokazuju rast ćelija anti-GDF-8, procenat vitalnosti ćelija anti-GDF-8, sadržaje laktata, sadržaje amonijuma, sadržaje glutamina, titar anti-GDF-8 i osmolaritet, respektivno, tokom čitavog trajanja eksperimenta, pod raznim eksperimentalnim uslovima.
Između svih testiranih uslova, samo je Medijum 9, koji je sadržao 13 mM glutamin i 20 mM asparagin pokazao značajne negaitivne efekte na rast ćelija i titar. Glutamin je iscrpljen u svim kulturama približno u isto vreme, bez obzira da li kultivisanje počinje sa 4 mM ili 13 mM glutaminom. Najveći titar anti-GDF-8 je dobijen u kulturama koje su sadržale 13 mM gljutamin i 12 mM asparagin. Svi uslovi kultivisanja su pokazali smanjene sadržaje laktata i amonijuma pred kraj kultivisanja. Sadržaji amonijuma bili su najviši u kulturi koja je imala 13 mM glutamin i 20 mM asparagin.
Primer 10. Efekat sadržaja asparagina i cisteina na opaženo smanjenje laktata i
amonijuma u kulturama ćelija anti- GDF- 8 u Medijumu 9
U Primerima 2, 5 i 6 je nađeno da kulture u kojima ćelije rastu pod uslovima osiromašenog glutamina pokazuju smanjenje sadržaja laktata i amonijuma pri kraju procesa kultivisanja. Međutim, kulture koje rastu u Medijumu 9, pod uslovima kada nema osiromašenja glutamina, ipak pokazuju smanjene sadržaje laktata i amonijuma pred kraj procesa kultivisanja. Ovaj efekat nije opažen u drugim medijumima, kao što je Medijum 1, gde se osiromašenje glutamina pokazalo neophodnim za smanjene sadržaje laktata i amonijuma. Medijum 9 i Medijum 1 se razlikuju u sadržajima asparagina (20 mM u Medijumu 9, a 11 mM u Medijumu 1, plus napajanje) i kiselog čistina (1,5 mM u Medijumu 9, a 0,95 mM u Medijumu 1). U ovom primeru se testira da li su ove dve komponente odgovorne za opaženo smanjenje sadržaja laktata i amonijuma pred kraj kultivisanja.
Materijali i postupci
Ćelije anti-GDF-8 su kultivisane 12 dana u biorekatorima od 1 L. Kultivisanje sa 8-10
*10<6>ćelija/mL počinje na 37°C, a 5. ili 6. dana se prebaci na 31 °C. U Tabeli 17 su dati razni testirani eksperimentalni uslovi. Uzorci su uzimani svakodnevno i čuvani za analizu titra pomoću Protein A HPLC.
Rezultati i zaključci
Ćelije anti-GDF-8 koje su rasle u Medijumu 9 pokazale su smanjene sadržaje laktata i amonijuma pred kraj procesa kultivisanja, bez obzira da li su kulture počinjale sa 4 mM ili 13 mM glutaminom (videti Slike 42 i 43). Nasuprot, u Medijumu 1 smanjeni sadržaji laktata i amonijuma pred kraj procesa kultivisanja su se pokazali samo ako su kulture na početku sadržale 4 mM glutamin (videti Slike 42 i 43). Posebni dodatak asparagina i cisteina u Medijum 1, koji je sadržao 13 mM glutamin, nije za rezultat dao smanjenje sadržaja laktata i amonijuma pred kraj procesa kultivisanja (videti Slike 42 i 43).
Kulture koje su pokazale smanjene sadržaje laktata i amonijuma pred kraj procesa kultivisanja (Medijum 1 sa 4 mM glutaminom, Medijum 9 sa 4 mM glutaminom i Medijum 9 sa 13 mM glutaminom), opaženo je takođe da imaju niži ukupni osmolaritet pri kraju procesa kultivisanja (videti Sliku 47).
Medijum 9 sa 4 mM glutaminom je pokazao najveći titar anti-GDF-8 ćelija, a zatim Medijum 9 sa 13 mM glutaminom, napajan 4. dana (videti Sliku 46). Uzimajući u obzir efekat razblaživanja pri napajanju, Medijum 9 koji sadrži 4 mM glutamin je imao ekvivalentan anti-GDF-8 titar kao i Medijum 9, koji sadrži 13 mM glutamin.
Primer 11. Efekat sadržaja aminokiseline i vitamina na opaženo smanjenje sadržaja
laktata i amonijuma pri kultivisanju ćelija anti- GDF- 8 u Medijumu 9
U Primeru 10 je testirano da li je razlika u sadržajima asparagina i cisteina, između Medijuma 1 i Medijuma 9, odgovorna na opaženo smanjenje sadržaja laktata i amonijuma pred kraj procesa kultivisanja u Medijumu 9 koji nije osiromašen glutaminom. Utvrđeno je da ovi faktori nisu odgovorni za opaženo smanjenje. Medijum 1 i Medijum 9 se razlikuju takođe i u konentracijama aminokiselina i vitamina. Ovaj primer testira da lije razlika u koncentracijama aminokiselina i vitamina između ova dva medijuma odgovorna za opaženo smanjenje.
Materijali i postupci
Ćelije anti-GDF-8 su kultivisane 12 dana u biorekatorima od 1 L. Kultivisanje sa 8-10
*10<6>ćelija/mL počinje na 37°C, a 4. dana se prebaci na 31 °C. U Tabeli 18 su dati razni testirani eksperimentalni uslovi. Dodaju se aminokiseline, vitamini, hidrokortizon i putrescine, mikroelementi E (kompozicije su navedene u Tabeli 19) i gvožđe, pod raznim eksperimentalnim uslovima u Medijum 1, tako da su sadržaji ovih komponenata bili jednaki onima u Medijumu 9. Svakodnevno su uzimani uzorci i čuvani za analizu titra pomoću Protein A HPLC.
Rezultati i zaključci
Svi testirani uslovi su pokazali smanjene sadržaje laktata i amonijuma pred kraj procesa kultivisanja, izuzev za Medijum 1, kada je sadržao dodate aminokiseline, što ukazuje da povećani sadržaji aminokiselina u Medijumu 9, u poređenju sa Medijumom 1, verovatno nisu odgovorni za smanjenje sadržaja laktata i amonijuma (videti Slike 49 i 50). Međutim, Medijum 1 koji je sadržao dodate vitamine, hidrokortizon i putrescine, mikroelemente E i gvožđe, pokazao je niže sadržaje laktata i amonijuma na kraju procesa kultivisanja, u poređenju sa Medijumom 1, koji je sadržao samo dodate aminokiseline (videti Slike 49 i 50). Ovo ukazuje da te komponente mogu biti odgovorne za opaženo sniženje u Medijumu 9.
Kulture koje su rasle u Medijumu 1, koji je sadržao dodate vitamine, hidrokortizon i putrescine, mikroelemente E i gvožđe, pokazao je najniže sadržaje amonijuma u čitavom eksperimentu, usled nižih količina asparagina i glutamina u polaznom medijumu (videti Sliku 50).
Primer 12. Efekat sadržaja vitamina, mikroelemenata E i gvožđa na opaženo smanjenje
sadržaja laktata i amonijuma pri kultivisanju ćelija anti- GDF- 8 u Medijumu 9
U Primeru 11 je utvrđeno da povećanje sadržaja vitamina, hidrokortizona i putrescine-a, mikroelemenata E i gvožđa u Medijumu 9, relativno prema Medijumu 1, može biti odgovorno za smanjenje sadržaja laktata i amonijuma, opaženo pred kraj procesa kultivisanja. Ovde su ove komponente testirane pojedinačno i u kombinaciji, da se odredi koja je, ako je ikoja, odgovorna za opaženo smanjenje.
Materijali i postupci
Ćelije anti-GDF-8 su kultivisane 12 dana u biorekatorima od 1 L. Kultivisanje sa 8-10
*10<6>ćelija/mL počinje na 37°C, a 4. dana se prebaci na 31 °C, sa izuzetkom Medijuma 1 koji je sadržao mikroelemente E, koji je kultivisan sa 6><10<8>ćelija/mL, a prebačen je takođe 4. dana. U Tabeli 20 su dati razni testirani eksperimentalni uslovi. Pod svim uslovima se dodaju hidrokortizon i putrescine u Medijum 1, tako da su sadržaji ovih komponenata bili jednaki sadržajima u Medijumu 9. Vitamini, mikroelementi E (kompozicija je data u Tabeli 19) i gvožđe su dodavani Medijumu 1 pod raznim eksperimentalnim uslovima, ali tako da su sadržaji ovih komponenata bili jednaki njihovim sadžajima u Medijumu 9. Svakodnevno su uzimani uzorci i čuvani za analizu titra pomću Protein A HPLC.
Rezultati i zaključci
Od svih testiranih uslova, samo su Medijum 9, koji sadrži 13 mM glutamin, i Medijum 1, koji sadrži mikroelemente E, pokazali smanjenje sadržaja laktata i amonijuma pred kraj procesa kultivisanja (videti Slike 54 i 55). Treba napomenuti da bi smanjenje sadržaja opaženo u Medijumu 1 koji je sadržao mikroelemente E, moglo biti usled činjenice da je u ovoj kulturi temperatura promenjena kada su ćelije bile na oko 6x10<6>ćelija/mL.
Medijum 9, koji sadrži 13 mM glutamin, je pokazao veći titar anti-GDF-8 nego bilo koja od formulacija Medijuma 1.
Primer 13. Poređenie rasta ćelija i titra anti GDF- 8 u Medijumima 1, 3 i 9
Ovaj eksperiment je urađen da se izmeri razlika u rastu ćelija i titru anti-GDF-8 pri korišćenju Medijuma 1, 3 i 9.
Materijali i postupci
Ćelije anti-GDF-8 su kultivisane u raznim medijumima pod uslovima napajanja navedenim u Tabeli 21. Odgovarajuće informacije o medijumima su date u Tabeli 22. Ćelije su rasle 12 dana u bioreaktorima od 1 L, a prebačene su sa 37° na 31 °C 4. dana.
Rezultati i zaključci
Ćelije anti-GDF-8, koje su kultivisane u Medijumu 9, pokazale su najveću gustinu ćelija i titar anti-GDF-8, dok su ćelije anti-GDF-8, kultivisane u Medijumu 3, pokazale najnižu gustinu ćelija i titar anti-GDF-8 (videti slike 57 i 58). Činjenica da Medijum 9 daje superiornije rezultate nego Medijum 1, pokazuje daje bolje obezbediti komponente medijuma u polaznom medijumu, nego ih nadoknađivati kroz višestruka napajanja. Pored toga, činjenica da i Medijum 1 i Medijum 9 funkcioišu bolje nego Madijum 3, pokazuje da obezbeđivanje koncentracija aminokiselina većih od 70 mM, daje superiornije rezultate, nego obezbeđivanje koncentracija aminokiselina manjih od oko 70 mM. Konačno, obezbeđivanje koncentracija aminokiselina većih od oko 70 mM u polaznom medijumu ima za rezultat najveće gustine ćelija i titre (uporediti Medijum 9 i Medijum 1).
Primer 14. Statistička analiza optimalnih sadržaja glutamina i asparagina u Medijumu 9
pri kultivisanju ćelija anti- GDF- 8 u bioreaktorima
Materijali i postupci
Ćelije anti-GDF-8 rastu u bioreaktorima od 1 L, a dana naznačenog u Tabeli 23 se prebacuju sa 37°C na 31 °C. Konačni titri su podvrgnuti T-testu, kako bi se odredio optimalni sadržaj samog glutamina i optimalni sadržaj ukupne kombinacije glutamina i asparagina. U tabeli 23 su sumirani neki relevantni eksperimentalni uslovi i krajnji rezultati za rast ćelija anti-GDF-8 u Medijumu 9.
Rezultati i zaključci
Slika 59 prikazuje ektrapolisane titre anti-GDF-8 za razne sadržaje samog glutamina i ukupne kombinacije glutamina i asparagina. Tabela 24 prikazuje rezultate T-testa za poređenje normalizovanog titra sadržaja glutamina između 2 mM i 15 mM i sadržaja glutamina izvan ovog opsega. Tabela 25 prikazuje rezultate T-testa za poređenje normalizovanog titra kombinovanih sadržaja glutamina i asparagina između 16 i 36 mM, i kombinovane sadržaje glutamina i asparagina izvan ovog opsega.
Oba T-testa pokazuju signifikantne razlike u titrima anti-GDF-8 između dveju grupa koje su poređene. Kulture koje su rasle u Medijumu 9, koje sadrže između 2 i 15 mM glutamina i između 16 i 36 mM kombinovanih glutamina i asparagina, pokazale su više titre anti-GDF-8, nego kulture koje su rasle u medijumima sa sadržajem glutamina i kombinovanim sadržajima glutamina i asparagina, koji padaju izvan ovih opsega. U svim eksperimentima sadržaji asparagina su bili veći od 9 mM.
Primer 15. Efekti medijuma na ćeliisku kulturu
U ovom primeru se ispituju performanse tri varijacije medijuma za ćelijske kulture, na srednjoj skali, uz korišćenje visoke gustine zasejavanja kultura. Očekivalo se da svi ovi testirani medijumi pokažu poboljšanje u odnosu na medijum Faze 1. (Medijum 10 napajan sa Medijumom 11 kao napojnim medijumom), na osnovu podataka iz malih bioreaktora.
Materijali i postupci
Ćelije CHO koje ekspresuju anti-Abeta peptid lgG1 humanizovanog monoklonalnog antitela ("anti-ABeta ćelije") su tesitrane u raznim medijumima, kao što pokazuje Tabela 26 (videti, Basi et al., "Humanized Antibodies that Recognize Beta Amvloid Peptide" u WO 02/46237). Krajnja tačka, sa niskim pH od 7,0, je kontrolisana sa 0.95M Na2CO3+0,05M K2CO3, izuzimajući Fazu 1, koja je kontrolisana sa rastvorom koji sadrži 0,58 M natrijum-bikarbonat i 0,71 M natrijum-karbonat. Rastvoreni kiseonik je kontrolisan na 30%, produvavanjem vazduha prema potrebi, mešanje je bilo sa 60 o/min, a napojni medijum je bio Medijum 5 (sa ili bez glutamina, kako je naznačeno). Sve kulture su rasle u zapremini od 130 L, izuzev 03P49B501, koji je rastao u zapremini od 500 L. Ukratko, Medijum 1 je obogaćen svim nutrijentima, bez razmatranja relativnih brzina absorpcije, dok je Medijum 12 bio uravnotežen uklanjanjem očigledno nepotrebnih nutrijenata iz bezrazložno obogaćene verzije. Kompozicije Medijuma 10, 11 i 12 su navedene u Tabeli 27.
Rezultati i zaključci
Kroz ove eksperimente izmene medijuma su dovele do stalnih poboljšanja. U vezi sa rastom ćelija, vitalnošću, smanjenim sadržajima laktata, smanjenim sadržajima amonijuma i titrom, smanjeni sadržaji glutamina su se pokazali boljim, nego povećani (Slike 60-64), a uravnoteženi (šaržni) medijum bolji, nego bogati medijum (Medijum 1, videti Slike 60-64). Kulture, koje su startovale sa inokulumima visoke gustine pokazale su veći krajnji titar, nego kulture koje su startovale sa inokulumima manje gustine (Slika 64).
Različito od onog što se opaža u bioreaktorima za rad na malo, prvi medijum (Medijum 1, sa visokim Gln) dao je niže titre, nego originalni proces (videti sliku 64). Takođe nije bilo pomaka u utrošnji laktata posle promene temperature (videti Sliku 62). Ovo ukazuje da kod ovog medijuma možda postoji izvesna osetljivost na veličinu bioreaktora. Ovaj zaključak potvrđuju eksperimenti na malo (2 L), koji su urađeni zajedno sa ovim eksperimentima na srednjoj skali veličine bioreaktora (podaci nisu prikazani). Ove poslednje formulacije medijuma, koje sadrže manje glutamina, nisu bile osetljive na veličinu reaktora, bar ne u ovim eksperimentima (videti Slike 60-65). Duplirani procesi (Šarže 2 i 3 i Šarže 5 i 6) su pokazali veoma dobru reproduktibilnost od jednog do drugog eksperimenta (videti Slike 60-65), što povećava poverenje u sve podatke sakupljene u ovoj kampanji.
Primer 16. Pobijanje TNFR- lg upotrebom Medijuma 9
Materijali i postupci
Ćelije CHO, koje ekspresuju dimerni fuzioni protein koji se sastoji od vanćelijskog dela za vezivanje liganda humanog receptora faktora nekroze tumora (TNFR) od 75 kilodaltona (p75), povezanog sa Fc delom lgG1 ("TNFR-lg ćelije"), zaseju se sa velikom gustinom iz perfuzionog bioreaktora, pa razblaže na 3*10<6>vitalnih ćelija/mL, u Medijumu 9, za proizvodni korak u bioreaktoru.
Rezultati i zaključci
Slike 66, 67, 68, 69, 70, 71 i 72 pokazuju rast ćelija, vitalnost ćelija, zaostalu glukozu, sadržaje glutamina, koncentraciju laktata, koncentraciju amonijuma i relativni titar proizvoda, respektivno. U okviru manjih modifikacija procesa, svi uslovi su dali dobar rast ćelija, visoku ćelijsku vitalnost i visok ukupni konačni titar.
Za sve uslove ovog eksperimenta, laktat, kao metabolički inhibitorni proizvod, bio je ili potrošen, ili mu je koncentracija bila na platou, što ukazuje da je stvaranje laktata zaustavljeno. Slično, je za inhibitorni metabolit amonijum, čiji su sadržali inicijalno rasli, ali u nekom vremenu posle pomaka temperature, ćelije su počele da troše amonijum. U ovom Primeru, kulture TNFR-lg ćelija su bile podvrgnute hemijskim induktantima natrijum-butiratu i HMBA.
Primer 17. Poređenje uslova kultivisanja na veliko i na malo
Materijali i postupci
Da bi se odredilo da li veličina kulture utiče na relevantne karakteristike kultivisanja, anti-GDF-8 ćelije su rasle ili na malo, u bioreaktorima od 1 L, ili na veliko, u bioreaktorima od 6000 L. Ćelije su rasle na 37°C, a 4. dana su prešle na 31 °C.
Rezultati i zaključci
Kao što se može videti sa Slika 73, 74, 75 i 76 (koje pokazuju gustinu ćelija, titar, sadržaje laktoze i sadržaje amonijuma, respektivno), ne postoje relevantne razlike u ovim karakteristikama između proizvodnje na veliko, u 6000 L i na malo, u 1 L. Sadržaji i laktata i amonijuma su počeli da opadaju posle pomeranja temperature 4. dana. Ovaj primer demonstrira da veličina kulture ne utiče na gustinu ćelija, vitalnost ćelija, sadržaje laktata i sadržaje amonijuma, kada se te kulture podvrgnu istim uslovima rasta.

Claims (50)

1. Postupak za proizvodnju Fc regiona fuzionog proteina imunoglobulina faktora nekroze tumora (TNFR-Fc) u ćelijskoj kulturi na veliko, što se sastoji od koraka: dobijanja ćelijske kulture, koja sadrži: ćelije sisara, koje sadrže gen koji kodira TNFR-Fc gen koji se ekspresuje u uslovima ćelijske kulture; i medijum, koji sadrži glutamin, a ima karakteristike medijuma koje se biraju iz grupe koju čine: (i) kumulativna količina aminokiselina po jedinici zapremine veća od oko 70 mM, (ii) molski odnos kumulativnog glutamina prema kumulativnom asparaginu manji od oko 2, (iii) molski odnos kumulativnog glutamina prema kumulativnim ukupnim aminokiselinama manji od oko 0,2, (iv) molski odnos kumulativnih neorganskih jona prema kumulativnim ukupnim aminokiselinama između oko 0,4 i 1, (v) kombinovanu kumulativnu količinu glutamina i asparagina po jedinici zapremine veću od oko 16 mM, i njihove kombinacije; održavanja pomenute kulture u inicijalnoj fazi rasta, pod prvim skupom uslova kulture, tokom prvog perioda vremena, dovoljnog da se dozvoli pomenutim ćelijama da se reprodukuju do gustine vitalnih ćelija unutar opsega od oko 20%-80% od maksimalno moguće gustine vitalnih ćelija, kada se pomenuta kultura održava pod prvim skupom uslova kulture; izmene najmanje jednog uslova kulture, tako da se zatim primenjuje drugi skup uslova kulture; održavanja pomenute kulture tokom drugog perioda vremena pod ovim drugim skupom uslova, a u drugom periodu vremena se akumulira TNFR-Fc u ćelijskoj kulturi.
2. Postupak prema Zahtevu 1, gde pomenuti medijum sadrži molski odnos kumulativnog glutamina prema kumulativnom asparaginu koji je manji od oko 2; a pomenuti medijum ima dve karakteristike medijuma, koje se biraju iz grupe koju čine: (i) medijum sadrži količinu kumulativnih aminokiselina po jedinici zapremine veću od oko 70 mM, (iii) molski odnos kumulativnog glutamina prema kumulativnim ukupnim aminokiselinama manji od oko 0,2, (iv) molski odnos kumulativnih neorganskih jona prema kumulativnim ukupnim aminokiselinama između oko 0,4 i 1, (v) kombinovanu kumulativnu količinu glutamina i asparagina po jedinici zapremine veću od oko 16 mM, i njihove kombinacije.
3. Postupak prema Zahtevu 1, gde se pomenuti uslov ćelijske kulture, u pomenutom koraku promene najmanje jednog uslova kulture, bira iz grupe koju čine: (i) temperatura, (ii) pH, (iii) osmolalitet, (iv) sadržaj hemijskog induktanta, i njihove kombinacije.
4. Postupak prema Zahtevu 1, gde je inicijalna koncentracija glutamina u pomenutom medijumu manja od ili jednaka 10 mM.
5. Postupak prema Zahtevu 1, gde je inicijalna koncentracija glutamina u pomenutom medijumu manja od ili jednaka 4 mM.
6. Postupak prema Zahtevu 1, gde je ukupna kumulativna količina glutamina po jedinici zapremine u pomenutom medijumu manja ili jednaka 10 mM.
7. Postupak prema Zahtevu 1, gde je ukupna kumulativna količina glutamina po jedinici zapremine u pomenutom medijumu manja ili jednaka 4 mM.
8. Postupak prema Zahtevu 1, gde se glutamin obezbeđuje samo u inicijalnom medijumu, u polaznoj ćelijskoj kulturi.
9. Postupak prema Zahtevu 1, gde je inicijalna gustina pomenutih ćelija sisara najmanje 2x10<5>ćelija/mL.
10. Postupak prema Zahtevu 1, gde je inicijalna gustina pomenutih ćelija sisara najmanje 2*10<6>ćelija</>mL.
11. Postupak prema Zahtevu 1, gde korak obezbeđivanja sadrži obezbeđivanje najmanje oko 1000 L kulture.
12. Postupak prema Zahtevu 1, gde korak obezbeđivanja sadrži obezbeđivanje najmanje oko 10.000 L kulture.
13. Postupak prema Zahtevu 1, gde pomenuti prvi skup uslova sadrži prvi opseg temperature, koji je približno od 30°C do 42°C.
14. Postupak prema Zahtevu 1, gde pomenuti prvi skup uslova sadrži prvi opseg temperature koji je približno 37°C.
15. Postupak prema Zahtevu 1, gde pomenuti prvi skup uslova sadrži drugi opseg temperature, koji je približno od 25°C do 41 °C.
16. Postupak prema Zahtevu 1, gde pomenuti prvi skup uslova sadrži drugi opseg temperature, koji je približno od 29°C do 35°C.
17. Postupak prema Zahtevu 1, gde pomenuti prvi skup uslova sadrži drugi opseg temperature, koji je približno 31 °C.
18. Postupak prema Zahtevu 1, što sadrži još i drugi korak izmene, posle pomenute prve izmene najmanje jednog od uslova kulture, a koji se sastoji od izmene najmanje jednog od uslova kulture, tako da se u kulturi primenjuje treći skup uslova.
19. Postupak prema Zahtevu 18, gde drugi korak izmene sadrži izmenu najmanje jednog od uslova kulture, koji se bira iz grupe koju čine: (i) temperatura, (ii) pH, (iii) osmolalitet, (iv) sadržaj hemijskog induktanta, i njihove kombinacije.
20. Postupak prema Zahtevu 18, gde pomenuti treći skup uslova sadrži treći opseg temperature, koji je približno od 27 do 37°C.
21. Postupak prema Zahtevu 1, gde pomenuti prvi period vremena traje između 1 i 7 dana.
22. Postupak prema Zahtevu 1, gde pomenuti prvi period vremena traje približno 4 dana.
23. Postupak prema Zahtevu 1, gde pomenuti prvi period vremena i pomenuti drugi period vremena traju najmanje 5 dana.
24. Postupak prema Zahtevu 1, gde u koraku održavanja pomenute kulture u drugom periodu vremena, sadržaj laktata opada, posle dostizanja maksimalnog sadržaja laktata u kulturi.
25. Postupak prema Zahtevu 1, gde u koraku održavanja pomenute kulture u drugom periodu vremena, sadržaj amonijuma opada, posle dostizanja maksimalnog sadržaja amonijuma u kulturi.
26. Postupak prema Zahtevu 1, gde je pomenuta količina dobijenog TNFR-Fc najmanje 1,5-put veća nego količina dobijenog TNFR-Fc pod inače identičnim uslovima, u inače identičnom medijumu, kome nedostaju pomenute karakteristike medijuma.
27. Postupak prema Zahtevu 1, gde je pomenuta ukupna količina dobijenog TNFR-Fc najmanje 2-puta veća nego količina dobijenog TNFR-Fc pod inače identičnim uslovima, u inače identičnom medijumu, kome nedostaju pomenute karakteristike medijuma.
28. Postupak prema Zahtevu 1, gde se pomenuta ćelijska kultura obezbeđuje još i sa komponentama suplemenata.
29. Postupak prema Zahtevu 28, gde se pomenute komponente suplemenata obezbeđuju u više intervala.
30. Postupak prema Zahtevu 28, gde se pomenute komponente suplemenata biraju iz grupe koju čine hormoni i/ili drugi faktori rasta, određeni joni (kao što su natrijumov, hloridni, kalcijumov, magnezijumom i fosfatni), puferi, vitamini, nukleozidi ili nukleotidi, mikroelementi (neorganska jedinjenja obično prisutna u vrlo niskim konačnim koncentracijma), aminokiseline, lipidi, ili glukoza ili neki drugi izvor energije.
31. Postupak prema Zahtevu 1, što se pomenutoj kulturi ne dodaju komponente suplemenata tokom trajanja proizvodnje pomenutog TNFR-Fc.
32. Postupak prema Zahtevu 1, što se u pomenutoj kulturi glutamin zamenjuje sa glicilglutaminom.
33. Postupak prema Zahtevu 1, što je pomenuta kumulativna ukupna količina histidina, izoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofana, tirozina i prolina po jedinici zapremine u pomenutom medijumu veća od približno 25 mM.
34. Postupak prema Zahtevu 1, što je pomenuta kumulativna ukupna količina histidina, izoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofana, tirozina i prolina po jedinici zapremine u pomenutom medijumu veća od približno 35 mM.
35. Postupak prema Zahtevu 1, gde pomenuti medijum ima karakteristike medijuma koje se biraju iz grupe koju čine: (i) kumulativna ukupna količina histidina po jedinici zapremine veća od približno 1,7 mM; (ii) kumulativna ukupna količina izoleucina po jedinici zapremine veća od približno 3,5 mM; (iii) kumulativna ukupna količina leucina po jedinici zapremine veća od približno 5,5 mM; (iv) kumulativna ukupna količina metionina po jedinici zapremine veća od približno 2,0 mM; (v) kumulativna ukupna količina fenilalanina po jedinici zapremine veća od približno 2,5 mM; (vi) kumulativna ukupna količina prolina po jedinici zapremine veća od približno 2,5 mM; (vii) kumulativna ukupna količina triptofana po jedinici zapremine veća od približno 1,0 mM; (viii) kumulativna ukupna količina tirozina po jedinici zapremine veća od približno 2,0 mM.
36. Postupak prema Zahtevu 1, što je kumulativna ukupna količina serina po jedinici zapremine u pomenutom medijumu veća od približno 10 mM.
37. Postupak prema Zahtevu 1, što je kumulativna ukupna količina asparagina po jedinici zapremine u pomenutom medijumu veća od približno 8 mM.
38. Postupak prema Zahtevu 1, što je kumulativna ukupna količina asparagina po jedinici zapremine u pomenutom medijumu veća od približno 12 mM.
39. Postupak prema Zahtevu 1, što je kumulativna ukupna količina fosfora po jedinici zapremine u pomenutom medijumu veća od približno 5 mM.
40. Postupak prema Zahtevu 1, što je kumulativna ukupna količina glutamata po jedinici zapremine u pomenutom medijumu manja od približno 1 mM.
41. Postupak prema Zahtevu 1, što je kumulativna ukupna količina kalcijum pantotenata po jedinici zapremine u pomenutom medijumu veća od približno 20 mg/L.
42. Postupak prema Zahtevu 1, što je kumulativna ukupna količina nikotinamida po jedinici zapremine u pomenutom medijumu veća od približno 25 mg/L.
43. Postupak prema Zahtevu 1, što je kumulativna ukupna količina piridoksina i piridoksala po jedinici zapremine u pomenutom medijumu veća od približno 35 mg/L.
44. Postupak prema Zahtevu 1, što je kumulativna ukupna količina riboflavina po jedinici zapremine u pomenutom medijumu veća od približno 2,0 mg/L.
45. Postupak prema Zahtevu 1, što je kumulativna ukupna količina tiamin hidrohlorida po jedinici zapremine u pomenutom medijumu veća od približno 35 mg/L.
46. Postupak prema Zahtevu 1, što se pomenuti medijum sastoji od medijuma koji sadrži glutamin i ima karakteristike medijuma koje se biraju iz grupe koju čine: (i) polazna koncentracija aminokiselina veća od oko 70 mM, (ii) molski odnos polaznog glutamina prema polaznom asparaginu manji od oko 2, (iii) molski odnos polaznog glutamina prema polaznim ukupnim aminokiselinama manji od oko 0,2, (iv) molski odnos polaznih neorganskih jona prema polaznim ukupnim aminokiselinama između oko 0,4 i 1, (v) polazna konacetracija kombinovanih glutamina i asparagina veća od oko 16 mM, i njihove kombinacije:
47. Postupak za proizvodnju TNFR-Fc na velikoj skali proizvodnje ćelija iz kulture, što sadrži korake: dobijanja ćelijske kulture, koja sadrži: ćelije sisara, koje sadrže gen koji kodira TNFR-Fc, gen koji se ekspresuje u uslovima ćelijske kulture; i definisani medijum, koji sadrži glutamin, a ima najmanje dve karakteristike medijuma koje se biraju iz grupe koju čine: (i) polazna koncentracija aminokiselina veća od oko 70 mM, (ii) molski odnos glutamina prema asparaginu manji od oko 2, (iii) molski odnos glutamina prema ukupnim aminokiselinama manji od oko 0,2, (iv) molski odnos neorganskih jona prema ukupnim aminokiselinama između oko 0,4 i 1, (v) kombinovanu koncentraciju glutamina i asparagina veću od oko 16 mM; održavanja pomenute kulture u inicijalnoj fazi rasta pod prvim skupom uslova kulture, tokom prvog perioda vremena, dovoljno da se dozvoli pomenutim ćelijama da se reprodukuju unutar opsega od oko 20%-80% od maksimalno moguće gustine vitalnih ćelija, ako se pomenuta kultura održava pod prvim skupom uslova kulture; izmene najmanje jednog uslova kulture, tako da se primenjuje drugi skup uslova kulture; održavanja pomenute kulture tokom drugog perioda vremena pod ovim drugim skupom uslova, a u ovom drugom periodu vremena u ćelijskoj kulturi se akumulira TNFR-Fc.
48. Postupak prema Zahtevu 47, što pomenuti medijum ima karakteristike medijuma: i) polaznu koncentraciju aminokiselina veću od oko 70 mM, ii) molski odnos glutamina prema asparaginu manji od oko 2, iii) molski odnos glutamina prema ukupnim aminokiselinama manji od oko 0,2, iv) molski odnos neorganskih jona prema ukupnim aminokiselinama između oko 0,4 i 1, i v) kombinovanu koncentraciju glutamina i asparagina veću od oko 16 mM.
49. Postupak prema bilo kom od Zahteva 1-2, ili 46-48, što je: sadržaji laktata niži od sadržaja koji su opaženi pod inače identičnim uslovima u inače identičnom medijumu, kome nedostaju pomenute karakteristike; sadržaji amonijuma niži od sadržaja koji su opaženi pod inače identičnim uslovima u inače identičnom medijumu, kome nedostaju pomenute karakteristike; i ukupna količina proizvedenog TNFR-Fc je bar toliko velika kao što se opaža pod inače identičnim uslovima u inače identičnom medijumu, kome nedostaju pomenute karakteristike.
50. Postupak prema Zahtevima 1 do 47, što se proizvedeni TNFR-Fc izoluje i/ili prečišćava za upotrebu ili za dobijanje farmaceutskih proizvoda.
RSP-2010/0190A 2004-08-27 2005-08-26 DOBIJANJE TNFR-Fc RS51255B (sr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US60537904P 2004-08-27 2004-08-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS51255B true RS51255B (sr) 2010-12-31

Family

ID=35500648

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RSP-2010/0190A RS51255B (sr) 2004-08-27 2005-08-26 DOBIJANJE TNFR-Fc
RSP-2009/0575A RS51072B (sr) 2004-08-27 2005-08-26 Dobijanje fuzionog proteina tnfr-ig

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RSP-2009/0575A RS51072B (sr) 2004-08-27 2005-08-26 Dobijanje fuzionog proteina tnfr-ig

Country Status (37)

Country Link
US (1) US7300773B2 (sr)
EP (2) EP1781802B1 (sr)
JP (3) JP2008511330A (sr)
KR (1) KR100988451B1 (sr)
CN (2) CN101061231B (sr)
AR (2) AR050537A1 (sr)
AT (2) ATE461285T1 (sr)
AU (1) AU2005280036B2 (sr)
BR (1) BRPI0514694B8 (sr)
CA (1) CA2578138C (sr)
CL (1) CL2017000577A1 (sr)
CR (2) CR8998A (sr)
CY (2) CY1109721T1 (sr)
DE (2) DE602005017285D1 (sr)
DK (2) DK1781802T3 (sr)
EC (1) ECSP077354A (sr)
EG (1) EG26922A (sr)
ES (2) ES2341390T3 (sr)
GT (2) GT200500234A (sr)
HN (1) HN2005000485A (sr)
HR (2) HRP20100011T1 (sr)
IL (1) IL181588A (sr)
MX (1) MX2007002381A (sr)
MY (1) MY137803A (sr)
NO (1) NO344785B1 (sr)
NZ (1) NZ579208A (sr)
PE (2) PE20060815A1 (sr)
PL (2) PL1781802T3 (sr)
PT (2) PT1992697E (sr)
RS (2) RS51255B (sr)
RU (1) RU2458988C2 (sr)
SI (2) SI1992697T1 (sr)
SV (1) SV2006002211A (sr)
TW (1) TWI364458B (sr)
UA (1) UA89383C2 (sr)
WO (1) WO2006026447A2 (sr)
ZA (1) ZA200701672B (sr)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI374935B (en) 2004-08-27 2012-10-21 Pfizer Ireland Pharmaceuticals Production of α-abeta
TWI384069B (zh) 2004-08-27 2013-02-01 Pfizer Ireland Pharmaceuticals 多胜肽之製法
ES2776657T3 (es) 2005-06-14 2020-07-31 Amgen Inc Formulaciones de proteínas autotamponantes
AR058140A1 (es) * 2005-10-24 2008-01-23 Wyeth Corp Metodo de produccion proteica utilizando compuestos anti-senescencia
US20070231895A1 (en) * 2005-11-02 2007-10-04 Lee Gene W Methods for adapting mammalian cells
DK3255141T3 (da) * 2006-07-13 2022-01-31 Wyeth Llc Fremstilling af antistoffer med forbedret glycosyleringsmønster
EP2395077A1 (en) * 2006-11-03 2011-12-14 Wyeth LLC Glycolysis-inhibiting substances in cell culture
RU2520810C2 (ru) * 2006-11-08 2014-06-27 Вайет Рационально разработанные среды для культивирования клеток
JP5586235B2 (ja) * 2007-03-02 2014-09-10 ワイス・エルエルシー ポリペプチドの産生のための細胞培養における銅およびグルタミン酸塩の使用
TW200902708A (en) * 2007-04-23 2009-01-16 Wyeth Corp Methods of protein production using anti-senescence compounds
DK2154244T3 (en) 2007-04-26 2017-06-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd CELL CULTIVATION PROCEDURE WHEN AN ACID-ENRICHED MEDIUM IS USED
ES2543061T3 (es) 2008-04-17 2015-08-14 Wyeth Llc Procedimientos de producción mejorada de proteínas morfogenéticas del hueso
JP2011516086A (ja) * 2008-04-18 2011-05-26 上海中信国健薬業股▲ふん▼有限公司 濃縮培養液及びその使用方法
WO2010016943A2 (en) 2008-08-08 2010-02-11 Biogen Idec Ma Inc. Nutrient monitoring and feedback control for increased bioproduct production
BR112012002974B1 (pt) 2009-08-11 2022-06-07 Genentech, Inc Processo para produzir um anticorpo em uma célula hospedeira de célula ovário de hamster chinês (cho) expressando o referido polipeptídeo
US8722615B2 (en) * 2009-12-02 2014-05-13 Acceleron Pharma, Inc. Compositions and methods for increasing serum half-life
AU2011246504B2 (en) 2010-04-26 2013-09-26 Novartis Ag Improved cell culture medium
RU2577972C2 (ru) 2010-04-26 2016-03-20 Новартис Аг Способ получения рекомбинантного полипептида
WO2012023085A1 (en) 2010-08-20 2012-02-23 Wyeth Llc Cell culture of growth factor-free adapted cells
WO2012068134A1 (en) 2010-11-15 2012-05-24 Biogen Idec Inc. Enrichment and concentration of select product isoforms by overloaded bind and elute chromatography
ES2560470T3 (es) 2011-04-29 2016-02-19 Biocon Research Limited Un método para reducir la heterogeneidad de anticuerpos y un proceso de producción de dichos anticuerpos
US8883982B2 (en) 2011-06-08 2014-11-11 Acceleron Pharma, Inc. Compositions and methods for increasing serum half-life
CN104011073B (zh) 2011-10-18 2017-08-25 科荣生生物科学公司 使用氨基酸稳定的依那西普制剂
US10493151B2 (en) 2011-10-18 2019-12-03 Coherus Biosciences, Inc. Etanercept formulations stabilized with sodium chloride
KR20140077977A (ko) * 2011-10-21 2014-06-24 화이자 인코포레이티드 철을 첨가하여 세포 배양을 개선하는 방법
US9731007B2 (en) * 2012-02-22 2017-08-15 Nexvet Australia Pty Ltd Tumour necrosis factor receptor fusion proteins and methods of using the same
EP2869816A4 (en) 2012-07-09 2016-04-20 Coherus Biosciences Inc ETANERCEPT FORMULATIONS WITH CLEAR REDUCTION OF SUBVISIBLE PARTICLES
RS57013B1 (sr) 2012-09-11 2018-05-31 Coherus Biosciences Inc Korektno savijeni etanercept sa visokom čistoćom i odličnim prinosom
US9217168B2 (en) 2013-03-14 2015-12-22 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of cell culture
MX362922B (es) 2013-03-26 2019-02-25 Coherus Biosciences Inc Método de producción de proteínas.
KR101439195B1 (ko) 2013-04-18 2014-09-12 동아대학교 산학협력단 에셰리키아 콜리 a-53 균주를 이용하여 섬유소 분해효소의 생산성을 향상시키는 공정
US11390663B2 (en) 2013-10-11 2022-07-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Metabolically optimized cell culture
KR102358807B1 (ko) * 2013-10-11 2022-02-08 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 대사적으로 최적화된 세포 배양
EP3099324B1 (en) 2014-01-30 2020-04-01 Coherus Biosciences, Inc. Perfusion media
KR102382402B1 (ko) 2014-02-04 2022-04-01 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 번역 후 변형을 강화시키기 위한 통류 방식 양이온 교환 크로마토그래피의 용도
SI3227454T1 (sl) 2014-12-01 2020-06-30 Amgen Inc. Postopek za manipuliranje ravni vsebnosti glikana glikoproteina
KR102007930B1 (ko) 2014-12-31 2019-08-06 주식회사 엘지화학 재조합 당단백질의 글리코실화 조절 방법
CN105777897A (zh) * 2015-03-20 2016-07-20 广东东阳光药业有限公司 一种cho细胞收获液的前处理方法
US11505784B2 (en) * 2015-04-01 2022-11-22 Boehringer Ingelheim International Gmbh Cell culture medium
KR101936049B1 (ko) * 2015-10-15 2019-01-08 (주)알테오젠 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산방법
EP3528787B1 (en) 2016-10-21 2026-01-07 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations and methods of making the same
GB201708655D0 (en) 2017-05-31 2017-07-12 Ucb Biopharma Sprl Cell culture methods
CN110484487A (zh) * 2019-08-21 2019-11-22 安徽欣乐生物技术有限公司 一种适用于cho细胞培养用无蛋白培养基及其培养方法
MX2023006998A (es) 2020-12-22 2023-06-26 Amgen Inc Metodo de cultivo celular.
CN115073607A (zh) * 2021-03-12 2022-09-20 上海康岱生物医药技术股份有限公司 Tnfr2与baff受体的融合蛋白
CN114480492B (zh) * 2022-01-28 2023-04-21 景泽生物医药(合肥)股份有限公司 一种重组人抗体融合蛋白的制备方法
CN119510778A (zh) * 2024-12-31 2025-02-25 北京同立海源生物科技有限公司 一种高稳定性的pdgf-bb活性检测方法

Family Cites Families (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) * 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4522811A (en) * 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
AU2353384A (en) 1983-01-19 1984-07-26 Genentech Inc. Amplification in eukaryotic host cells
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
GB8308235D0 (en) * 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US5672502A (en) * 1985-06-28 1997-09-30 Celltech Therapeutics Limited Animal cell culture
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US6048728A (en) * 1988-09-23 2000-04-11 Chiron Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression
DE68925971T2 (de) * 1988-09-23 1996-09-05 Cetus Oncology Corp Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte
US6291159B1 (en) * 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for producing polymers having a preselected activity
US5395760A (en) * 1989-09-05 1995-03-07 Immunex Corporation DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors
NZ235148A (en) * 1989-09-05 1991-12-23 Immunex Corp Tumour necrosis factor receptor protein and dna sequences
US5605690A (en) * 1989-09-05 1997-02-25 Immunex Corporation Methods of lowering active TNF-α levels in mammals using tumor necrosis factor receptor
JPH0396383A (ja) 1989-09-08 1991-04-22 Riso Kagaku Corp 画像形成装置
DE10399023I2 (de) 1989-09-12 2006-11-23 Ahp Mfg B V TFN-bindende Proteine
DK0494955T3 (da) * 1989-10-05 1998-10-26 Optein Inc Cellefri syntese og isolering af hidtil ukendte gener og polypeptider
US6657103B1 (en) * 1990-01-12 2003-12-02 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5538983A (en) * 1990-05-16 1996-07-23 The Rockefeller University Method of treating amyloidosis by modulation of calcium
US5156964A (en) * 1990-08-16 1992-10-20 Cetus Corporation Methods for adapting cells for increased product production through exposure to ammonia
US5122469A (en) * 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
GB9021679D0 (en) 1990-10-05 1990-11-21 Gorman Scott David Antibody preparation
GB9022545D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Culture medium
GB2251249B (en) 1990-12-28 1995-06-21 Mogam Biotech Res Inst High-density medium for animal cell culture
GB9118664D0 (en) 1991-08-30 1991-10-16 Celltech Ltd Cell culture
US5447851B1 (en) * 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
JP3504963B2 (ja) 1993-10-22 2004-03-08 智靖 羅 抗ヒト高親和性ＩｇＥ受容体モノクローナル抗体に係るアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片
US6310185B1 (en) * 1994-03-08 2001-10-30 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Recombinant human anti-Lewis Y antibodies
US5856179A (en) * 1994-03-10 1999-01-05 Genentech, Inc. Polypeptide production in animal cell culture
US5589154A (en) * 1994-11-22 1996-12-31 Rutgers, The State University Of New Jersey Methods for the prevention or treatment of vascular hemorrhaging and Alzheimer's disease
IL117175A (en) * 1995-02-20 2005-11-20 Sankyo Co Osteoclastogenesis inhibitory factor protein
US5705364A (en) * 1995-06-06 1998-01-06 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process
US6656466B1 (en) * 1995-06-06 2003-12-02 Genetech, Inc. Human tumor necrosis factor—immunoglobulin(TNFR1-IgG1) chimera composition
US5721121A (en) * 1995-06-06 1998-02-24 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process for producing a tumor necrosis factor receptor immunoglobulin chimeric protein
JP4306813B2 (ja) * 1995-09-19 2009-08-05 アスビオファーマ株式会社 動物細胞の新規培養方法
US20020012991A1 (en) 1997-04-07 2002-01-31 Florence Chua Nee Ho Kit Fong Cell culture media for enhanced protein production
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
WO2000023082A1 (en) 1998-10-19 2000-04-27 Yeda Research And Development Co. Ltd. Treatment of systemic lupus erythematosus by down-regulating the autoimmune response to autoantigens
PE20020574A1 (es) 2000-12-06 2002-07-02 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloideo beta
TWI329129B (en) 2001-02-08 2010-08-21 Wyeth Corp Modified and stabilized gdf propeptides and uses thereof
EP2165714B1 (en) 2001-04-30 2013-10-23 Eli Lilly And Company Humanized antibodies recognizing the beta-amyloid peptide
EP1385544B1 (en) 2001-04-30 2008-09-24 Eli Lilly And Company Humanized antibodies
JP2004532642A (ja) 2001-06-13 2004-10-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド 動物細胞の培養方法と動物細胞でのポリペプチド産生
US7320789B2 (en) 2001-09-26 2008-01-22 Wyeth Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof
PL374966A1 (en) 2002-02-21 2005-11-14 Wyeth Follistatin domain containing proteins
PL375045A1 (en) 2002-02-21 2005-11-14 Wyeth Gasp1: a follistatin domain containing protein
MY139983A (en) 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
DK1507556T3 (en) 2002-05-02 2016-09-12 Wyeth Holdings Llc Calicheamicin derivative-carrier conjugates
AR047392A1 (es) 2002-10-22 2006-01-18 Wyeth Corp Neutralizacion de anticuerpos contra gdf 8 y su uso para tales fines
US20040223966A1 (en) 2002-10-25 2004-11-11 Wolfman Neil M. ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor
TWI374935B (en) 2004-08-27 2012-10-21 Pfizer Ireland Pharmaceuticals Production of α-abeta
TWI384069B (zh) 2004-08-27 2013-02-01 Pfizer Ireland Pharmaceuticals 多胜肽之製法

Also Published As

Publication number Publication date
AU2005280036B2 (en) 2011-11-03
JP2012095672A (ja) 2012-05-24
IL181588A0 (en) 2007-07-04
BRPI0514694A (pt) 2008-06-17
SI1781802T1 (sl) 2010-01-29
SI1992697T1 (sl) 2010-07-30
KR20070069140A (ko) 2007-07-02
RS51072B (sr) 2010-10-31
MY137803A (en) 2009-03-31
TWI364458B (en) 2012-05-21
WO2006026447A9 (en) 2006-06-01
CN101061231A (zh) 2007-10-24
CN101061231B (zh) 2012-09-26
AU2005280036A1 (en) 2006-03-09
CY1109721T1 (el) 2014-08-13
MX2007002381A (es) 2007-06-15
CL2017000577A1 (es) 2017-12-01
CR20120560A (es) 2012-12-04
PE20060815A1 (es) 2006-09-14
RU2007108717A (ru) 2008-10-10
HK1099941A1 (en) 2007-08-31
ZA200701672B (en) 2012-04-24
ES2341390T3 (es) 2010-06-18
UA89383C2 (ru) 2010-01-25
EG26922A (en) 2014-12-25
ATE461285T1 (de) 2010-04-15
CR8998A (es) 2007-11-23
DE602005017285D1 (sr) 2009-12-03
PT1992697E (pt) 2010-04-21
EP1781802A2 (en) 2007-05-09
DK1992697T3 (da) 2010-05-17
AR088824A2 (es) 2014-07-10
NO344785B1 (no) 2020-04-27
PT1781802E (pt) 2010-01-04
CY1110092T1 (el) 2015-01-14
HRP20100271T1 (hr) 2010-06-30
SV2006002211A (es) 2006-10-04
GT200500233A (es) 2006-03-09
BRPI0514694B1 (pt) 2019-04-24
WO2006026447A3 (en) 2006-04-20
AR050537A1 (es) 2006-11-01
EP1992697B1 (en) 2010-03-17
EP1992697A1 (en) 2008-11-19
PE20100448A1 (es) 2010-06-22
EP1781802B1 (en) 2009-10-21
WO2006026447A2 (en) 2006-03-09
HN2005000485A (es) 2009-06-09
BRPI0514694B8 (pt) 2021-05-25
GT200500234A (es) 2006-10-10
US20060121569A1 (en) 2006-06-08
KR100988451B1 (ko) 2010-10-18
US7300773B2 (en) 2007-11-27
HRP20100011T1 (hr) 2010-02-28
ECSP077354A (es) 2007-05-30
PL1992697T3 (pl) 2010-08-31
RU2458988C2 (ru) 2012-08-20
PL1781802T3 (pl) 2010-03-31
TW200619388A (en) 2006-06-16
JP5921910B2 (ja) 2016-05-24
ATE446376T1 (de) 2009-11-15
NZ579208A (en) 2012-01-12
HK1121497A1 (en) 2009-04-24
CA2578138A1 (en) 2006-03-09
JP2016056214A (ja) 2016-04-21
DK1781802T3 (da) 2010-01-25
CA2578138C (en) 2010-10-05
NO20071570L (no) 2007-05-23
JP2008511330A (ja) 2008-04-17
CN102876761A (zh) 2013-01-16
DE602005020076D1 (de) 2010-04-29
ES2335518T3 (es) 2010-03-29
IL181588A (en) 2010-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS51255B (sr) DOBIJANJE TNFR-Fc
EP1789571B1 (en) Production of TNFR-Ig in a large-scale production cell culture
CN101048512B (zh) 抗淀粉样β肽抗体的生产
AU2012200353B2 (en) PRODUCTION OF a-ABeta
HK1180013B (en) Production of polypeptides
HK1181073A (en) Production of tnfr-ig fusion protein
HK1121497B (en) Production of tnfr-fc
HK1180013A (en) Production of polypeptides
HK1099941B (en) Production of a tnfr-ig fusion protein
HK1100008B (en) Production of anti-amyloid beta antibodies