RS51458B

RS51458B - Inhibitori humane fosfatidil-inozitol 3-kinaze delta

Info

Publication number: RS51458B
Application number: YUP-804/02A
Authority: RS
Inventors: Chanchal Sadhu; Ken Dick; Jennifer Treiberg; C. Gregory Sowell; Edward A. Kesicki; Amy Oliver
Original assignee: Icos Corporation
Priority date: 2000-04-25
Filing date: 2001-04-24
Publication date: 2011-04-30
Also published as: EP2223922A2; WO2001081346A2; EA200200990A1; HUP0300497A2; GEP20084317B; EA008241B1; SI3029041T1; DK1278748T3; MXPA02010618A; ES2788383T3; CA2406278A1; BRPI0110371B8; NZ522076A; PT1939203E; US6800620B2; BR0110371A; DK1939203T3; AU2001255667B2; EP3029041B1; IS6585A

Abstract

Jedinjenje koje ima strukturunaznačeno time stoje Y izabrano iz grupe koju sačinjavaju ništa i NH;R4 je izabran iz grupe koju sačinjavaju H, halogen, NO2, OH, OCH3, CH3 i CF3;R5 je izabran iz grupe koju sačinjavaju H, OCH3 i halo;ili R4 i R5 zajedno sa C-6 i C-7 hinazolinskog prstenskog sistema defmišu petočlani ili šestočlani aromatični prsten koji opciono sadrži jedan ili više O, N ili S atoma;R6 je izabran iz grupe koju sačinjavaju C1-C6alkil, fenil, halofenil, alkoksifenil, alkilfenil, bifenil, benzil, piridinil, 4-metilpiperazinil, C(=O)OC2H5, i morfolinil;Rd je nezavisno izabran iz grupe koju čine NH2, halo, C1-3alkil, S(C1-3alkil), OH, NH(C1-3alkil), N(C1-3alkil)2, NH(C1-3alkilenfenil), iq je 1 ili 2,i njegove farmaceutski prihvatljive soli i solvati,pri čemu je najmanje jedan od R4 i R5 različit od H, kada R6 predstavlja fenil ili 2-hlorofenil.Prijava sadrži još 19 patentnih zahteva.

Description

Referenca odnosne prijave

Ova prijava traži prioritet od privremene U.S. patentne prijave serijski br. 60/199,655, podnete 25. aprila 2000. godine i privremene U.S. patentne prijave serijski br. 60/238,057, podnete 25. oktobra 2000. godine.

Oblast pronalaska

Predmetni pronalazak se generalno odnosi na enzime fosfatidii-inozitol 3-kinaze (PI3K), i konkretnije na selektivne inhibitore aktivnosti PI3K i na metode upotrebe takvih materijala.

Stanje tehnike

Ćelijska signalizacija putem 3'-fosforilovanih fosfoinozitida je povezana sa većim brojem ćelijskih procesa, npr. malignom transformacijom, signalizacijom faktora rasta, zapaljenjem i imunitetom (pogledati Rameh et aLJ. Biol. Chem,274; 8347-8350 (1999) radi pregleda). Enzim odgovoran za generisanje ovih fosforilovanih signalizacionih proizvoda, fosfatidilinozitol 3-kinaza (PI 3-kinaza; PI3K), originalno je identifikovan kao aktivnost povezana sa virusnim onkoproteinima i receptorima faktora rasta, tirozin kinazama, koje fosforiluju fosfatidilinozitol (PI) i njegove fosforilovane derivate, kao i njegove fosforilovane derivate na 3'-hidroksilu inozitolskog prstena (Panayotou et aLTrends Cell Biol 2:358-60

(1992)).

Nivoi fosfatidilinozitol-3,4,5-trifosfata (PIP3), primarnog proizvoda aktivacije PI 3-kinaze, povećavaju se tretiranjem ćelija različitim agonistima. Odatle, smatra se da aktivacija PI 3-kinaze učestvuje u većem broju ćelijskih odgovora koji uključuju ćelijski rast, diferencijaciju i apoptozu (Parker et aL,Curreni Biology,5:577-99 (1995); Yao et al..Science,267: 2003-05 (1995)). Iako ciljevi na koje deluju fosforilovani lipidi generisani nakon aktivacije PI 3-kinaze nisu još uvek dobro okarakterisani, novi dokazi ukazuju na to da proteini koji sadrže pleckstrin-homologv domen i FYVE-fmger domen bivaju aktivirani prilikom vezivanja za različite fosfatidil-inozitolne lipide (Sternmark et ah,J Cei! Sci,772:4175-83 (1999); Lemmon et ah,Trends Cell Biol,7:237-42 (1997)).In vitro,pojedini izoformi protein kinaze C (PKC) bivaju direktno aktivirani od strane PIP3, a pokazano je da se protein kinaza povezana sa PKC, PKB, aktivira PI 3-kinazom (Burgering et ah.Nature,575:599-602 (1995)).

U ovom trenutku, familija enzima PI 3-kinaza podeljena je u tri klase na osnovu specifičnosti njihovih supstrata. Klasa I PI3K može da fosforiluje fosfatidilinozitol (PI), fosfatidilinozitol-4-fosfat, i fosfatidilinozitol-4,5-bifosfat (PIP2) dajući fosfatidilinozitol-3-fosfat (PIP), fosfatiđilinozitol-3,4-bifosfat i fosfatidi]inoziiol-3,4,5-trifosfat. respektivno. Klasa II PI3K fosforiluje PI i fosfatidilinozitol-4-fosfat. dok Klasa III PI3K može samo fosforilovati PI.

Početno prečišćavanje i molekularno kloniranje PI 3-kinaze pokazalo je da je u pitanju heterodimer koji se sastoji od subjedinica p85 i pllO (Otsu et ah,Cell,65:91-304 (1991); Hiles et ah,Cell,70:419-29 (1992)). Od tada su identifikovane četiri određene PI3K iz Klase I i nazvane PI3K a, p, 5 i y, pri čemu se svaka sastoji iz određene 110 kDa katalitičke subjedinice i regulatorne subjedinice. Konkretnije, tri od ovih katalitičkih podjedinica i to pllOa, pllOp i pl 105, svaka ponaosob, interaguju sa istom regulatornom subjedinicom p85; dok p!10y interaguje sa određenom regulatornom subjedinicom pl01. Kako je opisano u nastavku, načini ekspresije svakog od ovih PI3K u ljudskih ćelijama i tkivima su takođe karakteristični. Iako je u nedavnoj prošlosti velika količina informacija sakupljena na temu ćelijskih funkcija PI 3-kinaza uopšte, uloge koje igraju individualne izoforme su u velikoj meri nepoznate.

Opisano je kloniranje goveđeg pllOa. Ovaj protein je identifikovan kao srodan proteinuSuccharomyces cerevisiae:Vps34p, što je protein uključen u preradu proteina u vakuolama. Pokazano je da se rekombinantni pllOa proizvod povezuje sa p85a, čime se dobija PI3K aktivnost u COS-1 ćelijama. Videti Hiles et ah,Cell, 70,43 9-29(1992).

Kloniranje drugog humanog pl 10 izoforma, nazvanog pl 10(3, opisano je u Hu et ah,Mol Cell Biol,75:7677-88 (1993). Smatra se da se ovaj izoform povezuje sa p85 u ćelijama, i da se eksprimira na više mesta istovremeno, pošto je pl 1 Ofi mRNK pronađen u brojnim humanim i mišjim tkivima, kao i u humanim endotelnim ćelijama pupčane vene, Jurkat-humanim leukemijskim T-ćelijama, 293 humanim embrionskim bubrežnim ćelijama, mišjim 3T3 fibroblastima, HeLa ćelijama, i NBT2 ćelijama karcinoma bešike pacova. Ovako široka ekspersija sugeriše daje ovaj izoform veoma značajan u putevima signalizacije.

Identifikacija pl 108 izoforma PI 3-kinaze opisana je u Chantrv et ah,J Biol Chem,272:19236-43 (1997). Uočeno je da se humani pl 10S izoform eksprimira samo u određenim tkivima. Eksprimira se u visokim nivoima u limfocitima i limfoidnim tkivima, što sugeriše da bi protein mogao igrati ulogu u signalizacijama posredovanim Pl 3-kinazom u imunom sistemu. Detalji koji se tiču pl 105 izoforma se mogu takođe naći u US patentima br. 5,858,753; 5,822,910; i 5,985,589. Videti takođe Vanhaesebroeck et ah,Proc Natl Acad Sci USA,94:4330-5 (1997), i međunarodnu objavu WO 97/46688.

U svakom od PI3Ka, (3 i 5 podtipova, p85 subjedinica deluje tako da lokalizuje PI 3-kinazu u plazma membrani, putem interakcije njenog SH2 domena sa fosforilovanim tirozinskim ostacima (prisutnim u kontekstu odgovarajuće sekvence) u ciljnim proteinima (Rameh et ah,Cell,55:821-30 (1995)). Identifikovana su dva izoforma p85 i to p85a koji se eksprimira istovremeno na više mesta, i p85[3 koji se prevashodno nalazi u mozgu i limfoidnim tkivima (Volinia et ah,Oncogene,7:789-93 (1992)). Izgleda da je povezivanje p85 subjedinice na PI 3-kinaza pllOa, (3 ili 5 katalitičke subjedinice potrebno za katalitičku aktivnost i stabilnost ovih enzima. Dodatno, vezivanje Ras proteina takođe ima ulogu regulacije aktivnosti PI 3-kinaze.

Kloniranjem pl 10y otkrivena je još veća kompleksnost unutar PI3K familije enzima (Stovanov et ah,Science,2(5P:690-93 (1995)). Izoform pl 10y je u bliskom srodstvu sa pl 10a • i pl 10(3 (45-48% identiteta u katalitičkom domenu), ali kao što je rečeno ne koristi p85 kao ciljnu podjedinicu. Umesto toga, pll0y sadrži dodatni domen koji je nazvan »plekstrinski homologi domen« bilzu svog amino terminusa. Ovaj domen omogućava interakciju pll0y sa (3y subjedinicama heterotrimernih G proteina i smatra se da ova interakcija reguliše njegovu aktivnost.

Regulatorna subjedinica plOl za PI3Ky je originalno klonirana kod svinja, a humani ortolog je naknadno identifikovan- (Krugmann et ah,J Biol Chem,274:17152-8 (1999)). Smatra se daje interakcija između N-terminalnog regiona plOl sa N-terminalnim regionom pl 10y kritična za aktivaciju PI3Ky putem Gf}y pomenutog u ranijem tekstu.

Konstitutivno aktivni PI3K polipeptid opisan je u međunarodnoj objavi WO 96/25488. Ova objava opisuje pripremanje himeričkih fuzionih proteina u kome je fragment sa 102 ostatka p85 poznat kao inter-SH2 (iSH2) vezan preko vezujuće oblasti za N-terminus mišijeg pl 10. Izgleda daje iSH2 domen p85 sposoban da aktivira PI3K aktivnost na način porediv sa neizmenjenim p85 (Klippel et aL,Mol Cell Biol,74:2675-85 (1994)).

Odatle, PI3-kinaze mogu biti definisane svojim aminokiselinskim identitetom ili svojom aktivnošću. Dodatni članovi ove rastuće familije gena uključuju dalje srodne lipid i protein kinaze, uključujući Vps34 TORI i TOR2Saccharomyces cerevisiae(i njihove homologe kod sisara kao što su FRAP i mTOR), ataxia telangiectasia genski proizvod (ATR) i katalitičku subjedinicu DNK-zavisne protein kinaze (DNK-PK). Pogledati generalno Hunter,

Cell, £3:1-4 (1995).

Takođe, izgleda daje PI 3-kinaza uključena u veći broj aspekata aktivacije leukocita. Pokazano je da se aktivnost PI 3-kinaze povezana sa p85 fizički povezuje sa citoplazmičkim domenom CD28, koji je značajan kostimulatorni molekul za aktivaciju T-ćelija u odgovoru na antigen (Pages et ah.Nature, 369:327- 29(1994); Rudd,lmmunity\4:527-34 (1996)). Aktivacija T-ćelija putem CD28 snižava prag za aktivaciju putem antigena i povećava magnitudu i trajanje proliferativnog odgovora. Ovi efekti su povezani sa povećanjima u transkripciji većeg broja gena uključujući interleukin-2 (IL2), značajan faktor rasta T-ćelija (Fraser et aL,Science,257:313-16 (1991)). Mutacija CD28 takva da isti ne može više interagovati sa PI 3-kinazom, dovodi do nemogućnosti inicijacije proizvodnje IL2, što sugeriše postojanje kritične uloge PI 3-kinaze u aktivaciji T-ćelija.

Specifični inhibitori individualnih članova familije enzima daju neprocenjive alate za dešifrovanje funkcija svakog od ovih enzima. Dva jedinjenja, LY294002 i vvoitmannin, široko su korišćeni kao inhibitori Pl 3-kinaze. Ova jedinjenja međutim, predstavaljaju nespecifične PI3K inhibitore, pošto oni ne prave razliku između četiri člana Klase I Pl 3-kinaza. Na primer. IC50vrednosti za wortmannin u vezi sa svakom od pojedinačnih PI 3-kinaza Klase 1, nalaze se u opsegu od 1-10 nM. Slično tome, IC50vrednosti za LY294002 u vezi sa svakom od ovih Pl 3-kinaza je oko I uM (Fruman et ah,Ann Rev Biochem,(57:481-507 (1998)). Odatle, upotrebljivost ovih jedinjenja u proučavanju uloga pojedinačnih PI 3-kinaza Klase 1 je ograničena.

Na osnovu studija sa upotrebom wortmannin-a, došlo se do dokaza daje funkcija PI 3-kinaze takođe potrebna za neke aspekte leukocitne signalizacije putem G-proteinskih spregnutih receptora (Thelen et ah,Proc Natl Acad Sci USA,P .7:4960-64 (1994)). Štaviše, pokazano je da vvortmannin i LY294002 blokiraju migraciju neutrofila i oslobađanje superoksida. Međutim, iako ova jedinjenja ne prave razliku između različitih izoforma PI3K, ostaje nejasno koji su konkretni PI3K izoform ili izoformi uključeni u ove fenomene.

U svetlu prethodno navedenog razmatranja, jasno je daje postojeće znanje nedovoljno u oblasti strukturnih i funkcionalnih osobina enzima PI 3-kinaza, uključujući subcelularnu lokalizaciju, aktivaciona stanja, afinitete za supstrate i si. Štaviše, funkcije koje ovi enzimi obavljaju, kako u normalnim, tako i u obolelim tkivima ostaju da se do kraja razjasne. Konkretno, funkcija PI3K8 u leukocitima nije ranije bila karakterizovana, i znanje o njegovoj funkciji u humanoj fiziologiji ostaje ograničeno. Koekspresija u ovim tkivima drugih PI3K izoforma je do sada onemogućavala uspeh u naporima da se odvojeno prouče aktivnosti svakog od enzima. Štaviše, odvajanje aktivnosti različitih PI3K izozima može biti nemoguća bez identifikacije inhibitora koji pokazuju selektivne inhibitorne karakteristike. Zaista, podnosioci prijave u ovom trenutku nemaju saznanje da su takvi selektivni, ili još bolje specifični inhibitori PI3K izozima prikazani.

Stoga, postoji potreba u ovoj oblasti za daljom strukturnom karakterizacijom PI3K8 polipeptida. Takođe postoji potreba za funkcionalnom karakterizacijom PI3K5. Dodatno, naše shvatanje PI3K8 zahteva dodatnu elaboraciju strukturnih interakcija pl 106, kako sa njegovom regulatornom subjedinicom, tako i sa drugim proteinima u ćeliji. Takođe, ostaje potreba za selektivnim ili specifičnim inhibitorima PI3K izozima, u cilju bolje karakterizacije funkcija svakog od izozima. Konkretno, selektivni ili specifični inhibitori PI3KS poželjni su za istraživanje uloge ovog izozima i za razvoj farmaceutskih preparata za modulaciju aktivnosti izozima.

Jedan aspekt predmetnog pronalaska je obezbeđivanje jedinjenja koja mogu inhibirati biološku aktivnost humanog PI3K5. Još jedan aspekt predmetnog pronalaska je obezbeđivanje jedinjenja koja inhibiraju P13K5 selektivno, imajući pri tome relativno nizak inhibitorni potencijal prema drugim PI3K izoformima. Još jedan aspekt predmetnog pronalaska je obezbeđivanje metoda karakterizacije funkcija humanog PI3K6. Još jedan aspekt predmetnog pronalaska je obezbeđivanje postupka za selektivno modulisanje aktivnosti humanog PI3K5 i odatle razvoj medicinskog tretmana bolesti povezanih sa disfunkcijom PI3K5. Ostali aspekti i prednosti predmetnog pronalaska biće očigledni stručnjaku koji poseduje prosečno znanje.

Suština pronalaska

Upravo je otkriveno da ovi i drugi aspekti mogu biti postignuti putem predmetnog pronalaska koji, u jednom aspektu, jeste postupak za ometanje funkcije leukocita. koji uključuje kontak leukocita sa jedinjenjem koje selektivno inhibira aktivnost fosfatidilinozitol 3-kinaze delta (PI3K5) u leukocitima. Prema ovom postupku, leukočiti mogu obuhvatati ćelije izabrane iz grupa koja sadrži neutrofile, B limfocite, T limfocite i bazofile.

Na primer. u slučajevima u kojima leukociti obuhavataju neutrofile, postupak može uključivati ometanje najmanje jedne funkcije neutrofila izabrane iz grupe koja obuhvata stimulisano oslobađanje superoksida, stimulisani egzocitozu i hemotaktičku migraciju. Poželjno, postupak ne ometa u značajnoj meri bakterijsku fagocitozu ili ubijanje bakterija od strane neutrofila. U slučajevima kada leukociti obuhvataju B limfocite. postupak može sadržati ometanje proliferacije B limfocita ili proizvodnje antitela od strane B limfocita. U slučajevima kada leukociti obuhvataju T limfocite, postupak može sadržati sprečavanje proliferacije T limfocita. U slučajevima kada leukociti obuhvataju bazofile, postupak može sadržati ometanje oslobađanja histamina od strane bazofila.

U postupcima predmetnog pronalaska naznačenim time što se koristi selektivni inhibitor PI3K8, poželjno je da jedinjenje bude najmanje deset puta selektivnije za inhibiciju PI3KS u odnosu na druge izoforme Tipa I PI3K u ćelijski zasnovanom testu. Poželjnije, jedinjenje je najmanje oko dvadeset puta selektivnije za inhibiciju P13K5 u odnosu na druge izoforme Tipa I PI3K u ćelijski zasnovanom testu. Još poželjnije, jedinjenje je najmanje oko pedeset puta selektivnije za inhibiciju P13K5 u odnosu na druge izoforme Tipa I PI3K u biohemijskom testu.

Poželjna selektivna jedinjenja upotrebljiva prema postupcima uključuju jedinjenja koja imaju strukturu (I):

naznačena time što A predstavlja opciono supstituisan monociklični ili biciklični sistem prstenova koji sadrži najmanje dva atoma azota, i najmanje jedan prsten u sistemu je aromatičan;

X je izabran iz grupe koju sačinjavaju CHR, CH2CHR, i CH=C(R):

Y je izabran iz grupe koju sačinjavaju ništa. S. SO, S02. NH. 0, C(=0), 0C(=0). C(=0)0. iNHC(=0)CH2S;

R<1>i R<2>. nezavisno, izabrani su iz grupe koju sačinjavaju vodonik, C|.6alkil, aril. heteroaril, halo, NHC(=0)C|.3alkilenN(R<a>)2. N02. 0R<a.>OCF3, N(R<a>)2, CN, OC(=0)R<a>, C(=0)R<a>. C(=0)OR<a>. arilOR, Het, NR<a>C(=0)C,.3alkilenC(=0)OR<a>, arilOC^alkilenNCR<*>)-,, arilOC(=0)R<a>, CMalkilenC(=0)OR<a.>OCMa]kilenC(=0)ORa, CMalkilenOCMalkilen-C(=0)OR<a>, C(=0)NRaS02R\ C,.4alkilenN(R<a>)2, C2.6alkenilenN(R<a>)2, C(=0)NR<a>CM-alkilenOR<3>, C(=0)NR<a>CMalkilenHet, OCMalkilenN(Ra)2.. OCMalkilenCH(ORb)CH2N(Ra)2, OC,.4alkilenHeL OC2.4alkilenOR<a>, OC2.4alkilenNR<a>C(=0)OR<a>, NR<a>C,.4alkilenN(R<a>)2. NR<a>C(=0)R<a>, NR<a>C(=0)N(R<a>)2. N(S02C,.4aIkiI)2, NR<a>(S02C,.4alkil), S02N(R<a>)2. OS02CF3;C,.3alkilenaril, CMalkilenHet, C,.6alkilenOR, Ci.3alkilenN(R<a>)2, C(=0)N(R<a>)2, NHC(=0)Cr C3alkilenaril, C3.8cikloalkil, C3.8heterocikloalkil, arilOCi.3alkilenN(R<a>)2, arilOC(=0)R, NHC(=0)CN3alkilenC3.8heterocikloalkiJ, NHC(=0)C].3alki]enHet, OC,^alkilenOC,.4-alkiIenC(O)0R, C(=0)CMalkilenHet, i NHC(=0)haloC,.6alkil;

ili su R<1>i R<2>uzeti zajedno tako da formiraju tročlanu ili četvoročlanu alkilen ili alkenilen lančanu komponentu petočlanog ili šestočlanog prstena, koji opciono sadrži najmanje jedan heteroatom;

R<3>je izabran iz grupe koju sačinjavaju opciono supstituisani vodonik, C).6alkil, C3. gcikloalkil, C3.gheterocikloalkil, C].4alkilencikloalkil, C2.6alkenil, Ci^alkilenaril, arilCj.3alkil, C(=0)R<a>, aril, heteroaril, C(O)0R<a>, C(=0)N(R<a>)2, C(=S)N(R<a>)2. S02R<a>, S02N(R<a>)2, S(=0)R\ S(=0)N(R<a>)2, C(=0)NR<a>CMalkilenOR<a>, C(=0)NRaCMaIkilenHet, C(=0)CM-alkilenaril, C(=0)CMalki)enheteroaril, Ci.4alkilenaril opciono supstituisan sa jednim ili više od halo, S02N(R<a>)2, N(R<a>)2, C(=0)OR<a>, NR<a>S02CF3, CN, N02, C(=0)R<a>. OR<a>, CM-alkilenN(R<a>)2, i OCi.4alkilenN(R<a>)2, CMalkilenheteroaril, Ci.4alkilenHet, CMalkilenC(0)-Ci.4alkilenaril, C].4alkilenC(K})Ci.4a]kilenheteroaril, C]-4alkilenC(=0)Het, C|.4alkilen-C(=0)N(R<a>)2, CMalkilenOR<a>:CMalkilenNRaC(=0)Ra, CMalkilenOCi.4alki]enOR<a>, CM-alkilenN(R<a>)2, CMalkilenC(=0)OR<a>, i C,.4alkilenOC,.4alkilenC(=0)OR<a>;

R<a>je izabran iz grupe koju sačinjavaju vodonik, C)-6alkil, C3.gcikloalkil, C3.s-heterocikloalkih Ci.3alkilenN(R<a>)2, aril, arilC|.3alkil, C|.3alkilenaril, heteroaril, heteroarilCj.3-alkil, i C].3alkilenheteroaril;

ili su dve R<a>grupe uzete zajedno tako da formiraju petočlani ili šestočlani prsten, koji opciono sadrži najmanje jedan heteroatom;

Rb je izabran iz grupe koju sačinjavaju vodonik, Cj-^alkil. aril, heteroaril, arilC^alkil, heteroarilCi.3alkil, Ci-3alkilenaril, i CMalkilenheteroaril;

Het je petočlani ili šestočlani heterociklični prsten, zasićen ili delimično ili potpuno nezasićen, i koji sadrži najmanje jedan heteroatom izabran iz grupe koju sačinjavaju kiseonik. azot i sumpor, i opciono supstituisan sa C]^alkilom ili sa C(=0)OR<a>;

i njihove farmaceutski prihvatljive soli i solvati (npr. hidrati),

pri čemu jedinjenje ima najmanje oko desetostruko veću selektivnost mhibicije za PI3K5 u odnosu na druge izoforme PI3K Tipa 1 u ćelijski zasnovanom testu.

U još jednom rešenju, predmetni pronalazak predstavlja postupak za tretiranje medicinskog oboljenja posredovanog neutrofilima, pri čemu postupak sadrži davanje životinji, kojoj je takav tretman potreban, efikasne količine jedinjenja koje selektivno inhibira aktivnost fosfatidilinozitol 3-kinaze delta (PI3K5) u neutrofilima. Primeri oboljenja koja se mogu tretirati prema navedenom postupku uključuju ona stanja koja su karakterisana neželjenom funkcijom neutrofila izabranom iz grupe koja se sastoji od stimulisanog oslobađanja superoksida, stiumilisane egzocitoze i hemotaktićke migracije. Poželjno, prema postupku, fagocitna aktivnost ili ubijanje bakterija od strane neutrofila u velikoj meri ostaju neinhibirani.

U još jednom rešenju, predmetni pronalazak predstavlja postupak za ometanje funkcije osteoklasta koji uključuje dodir osteoklasta sa jedinjenjem koje selektivno inhibira aktivnost fosfatidilinozitol 3-kinaze delta (PI3K5) u osteoklastima. Prema navedenom postupku, jedinjenje može uključivati ostatak koji se preferentno vezuje za kost.

U još jednom rešenju, predmetni pronalazak predstavlja postupak za ublažavanje poremećaja koštane resorpcije kod životinje kojoj je takav tretman potreban, pri čemu tretman obuhvata davanje životinji efikasne količine jedinjenja koje inhibira aktivnost fosfatidilinozitol 3-kinaze delta (PI3K5) u osteoklastima životinje. Poželjni poremećaj koštane resorpcije, pogodan za tretiranje prema navedenom postupku je osteoporoza.

U još jednom rešenju, predmetni pronalazak predstavlja postupak za inhibiciju rasta ih proliferacije ćelija kancera hematopoetskog porekla, koji uključuje dodir ćelija kancera sa jedinjenjem koje selektivno inhibira aktivnost fosfatidilinozitol 3-kinaze delta (PI3K5) u ćelijama kancera. Postupak može imati prednosti u inhibiciji rasta ili proliferacije kancera izabranih iz grupe koja sadrži limfome, multiple mijelome i leukemije.

U još jednom rešenju, predmetni pronalazak predstavlja postupak za inhibiciju aktivnosti kinaze fosfatidilinozitol 3-kinaze delta (P13K5) polipeptida, koji uključuje dodir PI3KS polipeptida sa jedinjenjem koje ima generičku strukturu (I).

Poželjna jedinjenja, upotrebljiva prema pomenutom postupku, uključuju jedinjenja izabrana iz grupe koju čine:

naznačene time što je Y izabrano iz grupe koju sačinjavaju ništa. S i NH; R4 je izabran iz grupe koju sačinjavaju H, halogen, NO2, OH, OCH3, CH3i CF3; R5 je izabran iz grupe koju sačinjavaju H, OCH3i halo; ili R<4>i R<?>zajedno sa C-6 i C-7 hinazolinskog prstenskog sistema definišu petočlani ili šestočlani aromatični prsten koji opciono sadrži jedan ili više O. N ili S atoma: R<6>je izabran iz grupe koju sačinjavaju Ci-Cgalkih fenil, halofenih alkoksifenil, alkilfenil. bifenil, benzih piridinih 4-metilpiperazinii, C(=0)OC2H5, i morfolinil; R<d>je nezavisno izabran iz grupe koju čine NH2, halo, Ci^alkih S(Ci_3alkil), OH, NH(Ci.3alkil), N(Ci.3alkil)2>NH(C,.3alkilenfenil); i

q je 1 ili 2.

pri čemu je najmanje jedan od R4 i R^ različit od H, kada R<6>predstavlja fenil ili 2-hlorofenil.

Još poželjnije, jedinjenje je izabrano iz grupe koju čine:

naznačene time što je Y izabrano iz grupe koju čine ništa. S i NH;

R7 je izabran iz grupe koju sačinjavaju H. halo, OH, OCH3, CH3i CF3;

R8 je izabran iz grupe koju sačinjavaju H, OCH3i halogen;

ili R i R zajedno sa C-6 i C-7 hinazolinskog prstenskog sistema defmišu petočlani ili šestočlani aromatični prsten koji opciono sadrži jedan ili više O. N ili S atoma;

R9 je izabran iz grupe koju sačinjavaju Ci-Cćalkil, fenil, halofenil, alkilfenih bifenih benzih piridinil, 4-metilpiperazinil, C(=0)OC2H.si morfohnil;

R<d>je nezavisno izabran iz grupe koju čine NH2, halo, Ci^alkil, S(C].jalkil), OH. NH(Ci.3alkil), N(C].3a]kil)2, NH(C,.3aIkilenfenil); i

q je 1 ili 2,

pri čemu je najmanje jedan od R' i R<s>različit od 6-halo ih 6,7-dimetoksi grupa, a R9 je različit od 4-hlorofenil grupe.

U još jednom rešenju, predmetni pronalazak predstavlja postupak za ometanje funkcije leukocita, koji uključuje dodir leukocita sa jedinjenjem koje ima opštu strukturu (I).

U još jednom rešenju, predmetni pronalazak predstavlja klasu jedinjenja za koja je primećeno da inhibiraju aktivnost PI3K8 u biohemijskim i ćelijski baziranim testovima, i za koja se očekuje da pokažu pozitivan terapijski efekat kod oboljenja kod kojih je aktivnost PI3K5 prekomerna ili neželjena. Stoga, predmetni pronalazak obezbeđuje klasu jedinjenja koja imaju strukturu (II).

Poželjno, jedinjenja imaju opštu strukturu (IV)

naznačenu time što Y izabrano iz grupe koju sačinjavaju ništa, S i NH;

R10 je izabran iz grupe koju sačinjavaju H, halo, OH. OCH3, CH3i CF3;

R11 je izabran iz grupe koju sačinjavaju H, OCH3i halo;

ili R<10>i R11 zajedno sa C-6 i C-7 hinazolinskog prstenskog sistema definišu petočlani ili šestočlani aromatični prsten koji opciono sadrži jedan ili više O, N ili S atoma;

R12 je izabran iz grupe koju sačinjavaju Ci-C6alkil, fenil, halofenil, alkilfenih bifenih benzil, piridinil, 4-metilpiperazinil, C(=0)C2H5, i morfolinil;

R<d>je nezavisno izabran iz grupe koju čine NH2, halo, Ci.3alkil, S(Ci.3alkil), OH, NH(Ci.3alkil), N(C,.3alkil)2, NH(C).3alkilenfenil), i

qje 1 ih 2.

pri čemu je:

(a) najmanje jedan od R<10>i R1' različit od 6-halo ili 6,7-dimetoksi grupa;

(b) R12 je različit od 4-hlorofenila; i

(c) najmanje jedan od R<10>i R<n>različit H, kada R<12>predstavlja fenil ili 2-hlorofeni) i

XjeS.

Ove i druge osobine i prednosti predmetnog pronalaska biće vidljive iz detaljnog opisa i primera koji su ovde izloženi. Detaljan opis i primeri su dati kako bi se poboljšalo shvatanje pronalaska, ali nisu namenjeni ograničavanju obima zaštite predmetnog pronalaska.

Kratakopis slika

Slika 1 pokazuje efekat selektivnog PI3K5 inhibitora predmetnog pronalaska na aktivnost PI3K izoforma.

Slika 2 pokazuje efekat selektivnog PI3K5 inhibitora na generisanje superoksida od strane humanih neutrofila u prisustvu TNF ili IgG.

Slika 3 pokazuje efekat selektivnog PI3K5 inhibitora na generisanje superoksida od strane humanih neutrofila u prisustvu TNF ili fMLP.

Slika 4 pokazuje efekat selektivnog PI3K8 inhibitora na egzocitozu elastaze u prisustvu fMLP od strane humanih neutrofila.

Slika 5 pokazuje efekat selektivnog PI3K5 inhibitora na fMLP-indukovanu hemotaksiju humanih neutrofila.

Slika 6 pokazuje da selektivni PI3K5 inhibitor ne utiče na fagocitozu i ubijanjeS. aureusod strane neutrofila.

Slika 7 pokazuje efekat selektivnog PI3K8 inhibitora na proliferaciju i proizvodnju antitela od strane humanih B limfocita.

Slika 8 pokazuje efekat selektivnog PI3K8 inhibitora na proliferaciju B limfocita misije slezine stimulisanu putem anti-IgM.

Slika 9 pokazuje efekat selektivnog PI3K5 inhibitora na egzocitozu elastaze u životinjskom modelu.

Detaljan opis poželjnih rešenja

Predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenja koja selektivno inhibiraju aktivnost P13K5. Predmetni pronalazak dodatno obezbeđuje postupke za inhibiciju aktivnosti PI3K5

uključujući postupke selektivno modulacije aktivnosti PI3K5 izozima u ćelijama, posebno leukocitima, osteoklastima i ćelijama kancera. Postupci obuhvatajuin vitro, in vivoiex vivoaplikacije.

Posebno su korisni postupci selektivne modulacije aktivnosti PI3K8 u kliničkim uslovima u cilju ublažavanja oboljenja ili poremećaja posredovanih aktivnošću P13K6. Stoga, oboljenja ili poremećaji karakterisani prekomernom ili neadekvatnom aktivnošću PI3K5 mogu biti tretirani upotrebom selektivnih modulatora PI3KS prema predmetnom pronalasku.

Ostali postupci predmetnog pronalaska uključuju omogućavanje dalje karakterizacije fiziološke uloge izozima. Štaviše, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutske preparate koji sadrže selektivne inhibitore PI3K5. Takođe su opisani proizvodi koji sadrže jedinjenje koje je selektivni inhibitor PI3K5 (ili farmaceutski perparat koji sadrži takvo jedinjenje) i uputstvo za upotrebu tog jedinjenja. Detalji ovih i drugih korisnih rešenja predmetnog pronalaska biće opisani u nastavku.

Ovde opisani postupci zasnovani su na upotrebi jedinjenja koja selektivno inhibiraju, i poželjno specifično inhibiraju, aktivnost PI3K8 u ćelijama, uključujući ćelijein vitro. in vivoiliex vivo.Ćelije upotrebljive u postupcima uključuju one koje eksprimiraju endogeni PI3K5. pri čemu endogeni označava da ćelije eksprimiraju PI3K5 bez rekombinantnog unošenja u ćelije jednog ili više polinukleotida koji kodiraju PI3K5 peptid ili njegov biološki aktivni fragment. Postupci takođe obuhvataju upotrebu ćelija koje ekspirimiraju egzogeni P13KS. pri čemu su jedan ili više polinukleotida koji kodiraju PI3KS ili njegov biološki aktivni fragment, bili introdukovani u ćeliju upotrebom rekombinantnih postupaka.

Posebno je pogodno to što ćelije mogu bitiin vivo.tj. u živom subjektu, npr. životinji ili čoveku, pri čemu se PI3K6 inhibitor može koristiti kao terapeutsko sredstvo za inhibiciju aktivnosti PI3K5 kod subjekta. Alternativno, ćelije mogu biti izolovane kao diskretne ćelije ili u ovkiru tkiva, zaex vivoiliin vitropostupke.In vitropostupci, takođe obuhvaćeni obimom zaštite predmetnog pronalaska, mogu sadržati korak kontakta PI3K5 enzima ili njegovog biološki aktivnog fragmenta sa inhibitornim jedinjenjem predmetnog pronalaska. PI3K5 enzim može obuhvatati prečišćeni i izolivani enzim, pri čemu se enzim izoluje iz prirodnog izvora (npr. ćelija ili tkiva koji normalno eksprimiraju PI3K5 polipeptid bez modifikacija putem rekombinantne tehnologije) ili iz ćelija modifikovanih rekombinantnim tehnikama tako da eksprimiraju egzogeni enzim.

Termin »selektivni PI3K8 inhibitor« na način na koji se ovde upotrebljava, odnosi se na jedinjenje koje inhibira P13K5 izozim efikasnije od ostalih izozima PI3K familije. Za jedinjenje označeno kao »selektivni PI3K6 inhibitor« podrazumeva se da je selektivnije u odnosu na PI3K8 od jedinjenja koja predstavljaju konvencionalno i generički predodređene PI3K inhibitore, npr. wortmaixnin ili LY294002. Zajedno, wortmannin i LY294002 su označeni kao »neselektivni PI3K inhibitori«. Jedinjenja bilo kog tipa koja selektivno negativno regulišu ekspresiju ili aktivnost PI3KS, mogu se koristiti kao selektivni PI3K5 inhibitori u postupcima predmetnog pronalaska. Štaviše, jedinjenja bilo kog tipa koja selektivno negativno regulišu ekspresiju ili aktivnost PI3K5 i koja poseduju prihvatljive farmakološke osobine mogu se koristiti kao selektivni PI3K5 inhibitori u terapeutskim postupcima predmetnog pronalaska.

Relativna efikasnost jedinjenja kao inhibitora enzimske aktivnosti (ili neke druge biološke aktivnosti) mogu se ustanoviti određivanjem koncentracija pri kojima svako od jedinjenja inhibira aktivnost do predefinisanog nivoa, a zatim poređenjem dobijenih rezultata. Tipično, poželjna odrednica je koncentracija koja inhibira 50% aktivnosti u biohemijskom testu, odnosno, 50% inhibitorna koncentracija ili »IC50«. Određivanje IC50može se postići primenom konvencionalnih tehnika poznatih u struci. Generalno, IC50se može odrediti merenjem aktivnosti datog enzima u prisustvu različitih vrednosti (u datom opsegu) koncentracija inhibitora koji se proučava. Eksperimentalno dobijene vrednosti enzimske aktivnosti se zatim crtaju na dijagramu u funkciji koncentracija inhibitora koje su korišćene. Koncentracija inhibitora koja pokazuje 50% enzimsku aktivnost (u poređenju sa aktivnošću u odsustvu bilo kakvog inhibitora) uzima se kao vrednost IC50. Analogno, druge inhibitorne koncentracije se mogu definisati na osnovu odgovarajućih određivanja aktivnosti. Na primer. u nekim situacijama, može biti poželjno da se odredi 90% inhibitorna koncentracija, odnosno IC90 itd.

U skladu sa navedenim, »selektivni PI3K6 inhibitor« može alternativno biti shvaćen tako da se odnosi na jedinjenje koje ispoljava 50% inliibitornu koncentraciju (IC50) prema PI3K8 koja je najmanje desetostruko, poželjno najmanje dvadesetostruko, a još poželjnije najmanje tridesetostruko, niža od vrednosti IC50prema bilo kojem ili svim drugim članovima PI3K familije Klase I. Termin »specifični P13KS inhibitor« može biti shvaćen tako da se odnosi na selektivno PI3KS inhibitorno jedinjenje koje ispoljava IC50prema PI3KS koji je najmanje pedesetostruko, poželjno najmanje stostruko, još poželjnije najmanje 200-struko, a još poželjnije najmanje 500-struko. niži od vrednosti IC50prema bilo kojem ili svim drugim članovima P13K familije Klase 1.

Između ostalog, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke inhibicije leukocitne funkcije. Konkretno, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke inhibicije ili suprimiranja funkcija neutrofila i T i B limfocita. Što se tiče neutrofila, neočekivano je otkriveno da inhibicija PI3K5 aktivnosti inhibira funkciju neutrofila. Na primer, primećeno je da jedinjenja predmetnog pronalaska izazivaju inhibiciju klasičnih funkcija neutrofila, kao što su stinulisano oslobađanje superoksida, stimulisana egzocitoza i hemotaktiČka migracija. Međutim, nadalje je preimećeno da postupak prema predmetnom pronalasku omogućava supresiju određenih funkcija neutrofila, istovremeno ne utičući značajno na druge funkcije ovih ćelija. Na primer, primećeno je da fagocitoza bakterija od strane neutrofila nije u značajnoj meri inhibirana dejstvom selektivnih P13KS inhibitornih jedinjenja predmetnog pronalaska.

Stoga, predmetni pronalazak uključuje postupke inhibicije funkcija neutrofila, bez značajne inliibicije fagocitoze bakterija. Funkcije neutrofila pogodne za inhibiciju prema postupku, uključuju bilo koje funkcije koje su posredovane aktivnošću ili ekspresijom PI3K5. Takve funkcije uključuju, bez ograničenja, stimulisano oslobađanje superoksida, stimulisanu egzocitozu ili degranulaciju, hemotakičku migraciju, prijanjanje za vaskularni endotel (npr. vezivanje/kotrljanje neutrofila, okidanje neutrofilne aktivnosti, i/ili kačenje neutrofila za endotel), transmuralnu dijapedezu ili migraciju kroz endotel do perifernih tkiva. Generalno, ove funkcije se kolektivno mogu nazvati »inflamatorinim funkcijama«, pošto se tipično mogu povezati sa neutrofilnim odgovorom kod zapaljen ja. Inflamatorne funkcije neutrofila mogu se razlikovati od funkcije ubijanja bakterija koju ove ćelije takođe ispoljavaju, npr. fagocitoze i ubijanja bakterija. U skladu sa time, predmetni pronalazak nadalje uključuje postupke tretiranja oboljenskih stanja kod kojih su jedna ili više inflamatornih funkcija neutrofila abnormalne ili neželjene.

Dodatno je ustanovljeno, putem predmetnog pronalaska, da P13K5 igra ulogu u stimulisanoj proliferaciji limfocita, uključujući B ćelije i T ćelije. Štaviše, izgleda da PI3K8 igra ulogu u stimulisanom stvaranju antitela od strane B ćelija. Selektivna PI3K8 inhibitorna jedinjenja predmetnog pronalaska su korišćena u cilju ustanovljavanja da ovi fenomeni mogu biti sprečavani inhibicijom PI3K8. Odatle, predmetni pronalazak uključuje postupke inhibicije proliferacije limfocita. kao i postupke inhibicije proizvodnje antitela od strane B limfocita. Ostali postupci omogućeni predmetnim pronalaskom obuhvataju postupke tretiranja oboljenskih stanja kod kojih je jedna ili više ovih limfocitnih funkcija abnormalna ili nepoželjna.

Ustanovljeno je da se PI3KS aktivnost može inhibirati selektivno ili specifično u cilju tretmana oboljena posredovanih PI3KS prilikom čega se smanjuju ili eliminišu komplikacije koje su tipično povezane sa istovremenom inhibicijom aktivnosti drugih Pl 3-kinaza Klase 1. U cilju ilustracije ovog rešenja predmetnog pronalaska, postupci prema predmetnom pronalasku mogu se praktikovati upotrebom članova klase jedinjenja za koja je ustanovljeno da selektivno inhibiraju PI3KS u odnosu na druge PI3K izoforme.

Postupci ovog rešenja mogu se koristiti upotrebom jedinjenja koja imaju opštu strukturu (III). Poželjni postupci obuhvataju primenu jedinjenja za koja je empirijski ustanovljeno da ispoljavaju najmanje desetostruku selektivnost inhibicije PI3K6 u odnosu na druge PI3K izoforme. Na primer, postupci se mogu sprovoditi upotrebom siedećih jedinjenja: 3- (2-izopropilfenil) -5-metil-2- (9H-purin-6-il-sulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on: 5-hloro-2- (9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3-o-tolil-3H-hinazolin-4-on;

5-hloro-3-(2-fluorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on;

3- (2-fluorofenil) -5-metil -2- (9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 3-(2-metoksifenil)-5-metil-2-(9H-purin-i-ilsulfanilmetil-3H-hinazolin-4-on,

3-(2, 6-dihlorofenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-il-sulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 3-(2-hlorofenil)-6-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 5- hloro-3-(2-hlorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 3-(2-hlorofenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 3-(3-metoksifenil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil-3H-hinazolin-4~on ;

3-(2-hlorofenil)-5-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetjl)-3H-hinazolin-4-on; 3-benzil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on;

3-butil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on ;

3-(2-hlorofenil)-7-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on;

3-morfoiin-4-il-2- (9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on, acetatna so; 8-hloro-3-(2-hlorofenil)-2-(9H-purii>6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on;

3-(2-hlorofenil)-6, 7-difluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 3-(2-metoksifenil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on;

6- hloro-3-(2-hlorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 3-(3-hlorofenil)-2-(9H-purin-6-iIsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on;

2- (9H-purin-6-ilsulfanilmetil)- 3-piridin-4-il-3H-hinazolin-4-on;

3- (2-hlorofeniI)-2- (9H-purin-6-ilsulfatii]meii])-trifluorometil-3H-hinazolin-4-on; 3-benzi]-5-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmelil)-3H-hinazo]in-4-on;

3-(4-metilpiperazin-1 -il)-2-(9H-purin-6-i]sulfani)metil)-3H-hinazo]in-4-on, acetatna so; 3-(2-hlorofenil)-6-hidroksi-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on;

etil estar [5-fluoro-4-okso-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-4H-hinazolin-3-il] sirćetne kiseline;

3-(2,4-dimetoksifenil)-2-(9H-purin-6-ilsu]fanilmetil)-3H-hinazolirj-4-on; 3-bifeni]-2-il-5-hloro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin 2-(6-arninopurin-9-ilmetil)-3-(2-izopropilfenil)-5-metil-3H-hinazolin 2-(6-airiinopurin-9-ilmetil)-5-rnetil-3-o-toli]-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurm-9-ilmetil)-3-bifenil-2-il-5-hloro-3H-hinazolin-4-on; 5-hloro-3-(2-metoksifenil)-2'(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-fluorofenil)-5-irietil-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetiI)-5-hloro-3-(2-fluoro-feniI)-3H-hinazoIin-4-on; 2-(6-aiiiinopurin-9-ilmetil)-8-hloro-3-(2-hloro-fenil)-3H-hiriazoliri-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-hloro-3-(2-hloro-fenil)-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-ammopurin-9-ilmetil)-3-(2-hlorofenil)-5-XTietil-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-i]metil)-3-(2-hlorofenil)-5-fluoro-3H-hinazoliri-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-benzil-5-fluoro-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilrnetil)-3-butil-3H-hinazolin-4-on;

2-(6-aminopurir)-9-ilmetil)-3-rnorfolin-4-il-3H-hinazolin-4-on;

2- (6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-hlorofeniI)-7-fluoro-3H-hinazolin-4-on; 3- (2-hlorofenil)-2-(9H-purin-6-i}sulfaniliT)etil)-3H-hinazo]in-4-on; 3-fenil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on;

2-(6-aminopurin-9-ilmetiI)-5-h]oro-3-(2-izopropil-fenil)-3H-hinazolin-4-on; i 2- (6-aminopurin-9-ilmetil) -5-hloro-3-o-tolil-3H-hinazolin-4-on.

Nadalje je ustanovljeno da postupci predmetnog pronalaska imaju prednosti kada se koriste članovi klase jedinjenja koja pokazuju PI3K5 inhibitornu aktivnost, čime omogućavaju inhibiciju PI3K5 aktivnosti kod oboljenja koja su njime posredovana. Na primer, u ovom rešenju, postupci prema predmetnom pronalasku se mogu praktikovati upotrebom jedinjenja koja imaju opštu strukturu (1).

X je izabran iz grupe koju sačinjavaju CHR, CH2CHR, i CH=C(R);

Y je izabran iz grupe koju sačinjavaju ništa, S, SO, S02, NH, O, C(=0), OC(=0), C(=0)0,iNHC(=0)CH2S;

R' i R\ nezavisno, izabrani su iz grupe koju sačinjavaju vodonik, Ci-ćalkil, aril, heteroaril, halo, NHC(0)C,.3alki]enN(R<a>)2, N02, OR<a>, OCF3, N(R<a>)2, CN, OC(=0)R<a>, C(=0)R<a>, C(=0)OR<a>, ari]0R, Het, NR<a>C(=0)Ci.3alkilenC(=0)OR<a>, arilOC].3alkilenN(R<a>)2, arilOC(=0)R<a>, CMalkilenC(=0)OR<a>, 0CMalkilenC(=0)0R\ CMalkilenOCMalkilen-C(=0)OR<a>, C(=0)NRaS02R\ CMalkilenN(R<a>)2, C2.6alkeni]enN(R<a>)2, C(=0)NR<a>C,.4-alkilenOR<2>, C(=0)NR<a>CMalkilenHet, 0C2.4alkilenN(R<a>)2, OCMalkilenCH(OR)CH2N(R<a>)2, OCMaIkilenHet, OC2.4alkilenOR<a>, OC2^alkilenNR<a>C(=0)OR<a>, NRaCMalki]enN(Ra}2. NR<a>C(=0)R<a>, NR<a>C(-0)N(R<a>)2, N(S02CMalkil)2. NR<a>(S02C,.4alkil), S02N(R<a>)2. OS02CF3, C,.3alkilenaril, CMalkilenHet, C^alkilenOR", C,.3alkilenN(R<a>)2, C(=0)N(R<a>)2, NHC(=0)C,-C3alkilenaril, C3.8cikloa)kil, C3.8heterocikloalkil, arilOCi.3alkilenN(R<a>)2, arilOC(=0)R.NHC(=0)C,.3alkilenC3.gheterocikloalkil, NHC(=0)C1.3alkilenHet. OC,.4alkilenOCM-alkilenC(O)0Rb, C(=0)CMalkilenHet, i NHC(=0)haloC,.6alkil,

R<J>je izabran iz grupe koju sačinjavaju opciono supstituisani vodonik. Ci.6alkih C3_8cikloalkil, C3.8heterocikloalkih Ci.4alkilencikloalkil, C2-ćalkenil, C].3alkilenaril. arilCi_3alkil. C(=0)R<a>, aril, heteroaril, C(=0)OR<a>, C(=0)N(R<a>)2. C(=S)N(R<a>)2, S02R<a>, S02N(R<a>)2. S(=0)R<a>, S(=0)N(R<a>)2, C(=0)NR<a>CMalkilenOR<a>, C(=0)NR<a>CMalkilenHet, C(=0)CM-alkilenaril, C(=0)C i-4alkilenheteroaril, Ci.4alkilenaril opciono supstituisan sa jednim ili više od halo, S02N(R<a>)2, N(R<a>)2, C(O)0Ra, NR<a>S02CF3, CN, N02, C(=0)R<a>, OR<a>, CM-alkilenN(R<a>)2, i OC|.4alkilenN(R<a>)2, CMalkilenheteroaril, C,.4alkilenHet. CMalki]enC(=0)-C|.4alkilenaril, C|.4alkilenC(=0)Ci.4alkilenheieroaril. Ci.4alkilenC(=0)Het, Ci.4alkiJen-C(=0)N(R<a>)2. C,.4alkilenOR<a>, Ci^alkilenNR^C^R<2>. CMalkilenOCMalkilenORa, CM-alkilenN(R<a>)2, C,.4alkilenC(=0)OR<a>, i CMalkilen0C,.4alkilenC(=0)0R<a>;

R<a>je izabran iz grupe koju sačinjavaju vodonik, Ci.6alkil, C3.scikloalkiL C3.8-heterocikloalkil, Cj.3alkilenN(R<a>)2, aril, arilC].3alkil, Ci.3alkilenaril, heteroaril, heteroarilC).3-alkil, i Ci-3alkilenheteroaril;

Rb je izabran iz grupe koju sačinjavaju vodonik, Cj.ćalkil, aril. heteroaril, arilC].3alkil. heteroarilC).3alkil, Ci.3alkilenarih i Ci.3aIkilenheteroaril;

Het je petočlani ili šestočlani heterociklični prsten, zasićen ili delimično ili potpuno nezasićen, i koji sadrži najmanje jedan heteroatom izabran iz grupe koju sačinjavaju kiseonik, azot i sumpor, i opciono supstituisan sa Ci-^alkilom ili sa C(=0)OR<a>;

i njihove farmaceutski prihvatljive soli i solvati (npr. hidrati).

Na primer, u postupcima prema predmetnom pronalasku mogu se upotrebiti jedinjenja koja ispoljavaju PI3K5 inhibitornu aktivnost, kao što su sledeća: 3-(2-izopropilfenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-il-sulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 5-hloro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3-o-tolil-3H-hinazolin-4-on;

5-hloro-3-(2-fluorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfan-ilmetil) -3H-hinazolin-4-on; 3-(2-fluorofenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfajt-ilmetil)-3H-hinazolin-4-on: 3-(2-metoksifeni])-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsu]fanilmetil)oH-hinazolin-4-on; 3-(2.6-dihlorofenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 3-(2-hlorofenil)-6-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfani]metil)-3H-hinazohn-4-on; 5-hloro-3-(2-hlorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanihiietil)-3H-hinazolin-4-on; 3-(2-hlorofenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 3-(2-metoksifenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on;

3-(2-hlorofenil)-5-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanihr)etil)-3H-hinazolin-4-on; 3-benzil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on;

3-butil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on;

3-(2-hlorofenil)-7-lfuoro-2-(9H-purin-6-ilsulfani]irieti])-3H-hinazolin-4-on; 3-morfo]in-4-il-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetii)-3H-hinazolin-4-on, acetatna so; 8-hioro-3-(2-hlorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on: 3-(2-hlorofenil)-6.7-difluoro-2-(9H-purin-6-ilsu!fajhhTietil)-3H-hinazolin-4-on; 3-(3-metoksifenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on;

64iloro-3-(2-hlorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 3-(3-hlorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on;

2- (9H-purin-6-ilsulfanilrnetiI)-3-piridin-4-iI-3H-hinazolin-4-on;

3- (2-hlorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmeti])-tirfluorometil-3H-W 3-benzil-5-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazoliri-4-on;

3-(4-metilpipera2in-l-il)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on, acetatna so; 3-(2-hlorofenil)-6-hidroksi-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on;

etil estar [5-fluoro-4-okso-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-4H-hinazoIin-3-il] sirćetne kiseline; 3-bifenil-2-il-5-hloro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmeti])-3H-hinazolin-4-on; 5- hloro-3-(2-metoksifenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-izopropilfeniI)-5-metil-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-iTietil-3-o-to)il-3H-hinazolin-4-on;

2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-bifenil-2-il-t-hloro-3H-hinazolin-4-on;

2-(6-aminopurin-9-ilrnetil)-3-(2-fluorofenil)-5-metil-3H-hinazo]in-4-on; 2-(6-aminopuirn-9-ilmeti])-5-hloro-3-(2-fluorofenil) -3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-8-hloro-3-(2-hlorofenil) -3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopui"in-9-ilmetil)-5-hloro-3-(2-hlorofenil) -3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-hlorofenil)-5-metil-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-hIorofenil)-5-fluoro-3H-hinazo]in-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmeti])-3-benzil-5-fluoro-3H-hinazolin-4-on;

2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-butil-3H-hinazolin-4-on;

2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-morfolin-4-il-3H-hinazolin-4-on;

2- (6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-hlorofenil)-7-fluoro-3H-hinazolin-4-on; 3- (2-hlorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on;

3-fenil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on;

2- (6-aminopurin-9-ilmetil)-5-hloro-3-(2-hloro-fenil)-3H-hinazolin-4-on; 3- (4-hlorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on;

3-(2-hlorofenil)-6J-dimetoksi-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 3-(2-h]orofenil)-7-nitro-2-(9H^ 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-6-bromo-3-(2-hlorofenil)-3H-hinazolin-4-on; 2- (6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-hlorofenil)-6,7-dimetoksi-3H-hinazolin-4-on; 6- bromo-3-(2-hIorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-binazolin-4-on; 3- (2-hlorofenil)-2-(9H-purin-6-i]sulfanilmetil)-3H-benzo[g]hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-hloro-3-o-tolil-3H-hinazolin-4-on; i

2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-hloro-3-(2-nietoksi-fenil)-3H-hinazolin-4-on.

Predmetni pronalazak dodatno obezbeđuje jedinjenja koja su selektivni inhibitori aktivnosti PI3K8. Jedinjenja ispoljavaju inhibiciju PI3K8 u biohemijskim probama i selektivno ometaju funkciju PI3K8-eksprimirajućih ćelija u ćelijski zasnovanim testovima. Kao što je opisano na drugom mestu u ovoj prijavi, pokazano je da jedinjenja predmetnog pronalaska inhibiraju određene funkcije neutrofila i drugih leukocita, kao i funkcije osteoklasta.

Generalno, jedinjenja prema predmetnom pronalasku imaju opštu strukturu (I). predstavljaju njihove farmaceutski prihvatljive soli, ili njihove prekursore:

X je izabran iz grupe koju sačinjavaju CHR, CH2CHR, i CH=C(R);

Y je izabran iz grupe koju sačinjavaju ništa, S, SO, S02, NH, O, C(=0). OC(=0), C(=0)0,iNHC(=0)CH2S;

R<1>i R<2>, nezavisno, izabrani su iz grupe koju sačinjavaju vodonik. Ci.^alkil. aril, heteroaril, halo. NHC(=0)C,.3alkilenN(R<a>)2, N02, OR<a>, OCF3. N(R<a>)2, CN, OC(=0)R<a>, C(=0)R<a>, C(=0)OR<a>, arilOR, Het, NR<a>C(=0)C,.3alkilenC(=0)OR<a>, arilOC,.3alkilenN(R<a>)2, arilOC(=0)R<a>, C,.4alkilenC(=0)OR\ OCMalkilenC(=0)OR<a>, CMalkilenOC,.4alkilen-C(=0)OR<a>, C(=0)NR<a>S02R<a>, CMalkilenN(R<a>)2, C2.6alkenilenN(R<a>)2. C(=0)NR<a>CM-alkilenOR<3>. C(=0)NR<a>CMalkilenHet. OC2.4alkilenN(R<a>)2, OCi.4alkilenCH(OR)CH2N(R<a>)2, OC,.4alkilenHet. OC3.4alkilenOR\ OC2.4alkilenNR<a>C(=0)OR<a>, NR<8>CMalkilenN(R<a>)2?NR<a>C(=0)R<a>. NR<a>C(=0)N(R<a>)2. N(S02CMalki))2. NR<:i>(S02C,.4alkil), S02N(R<a>)2, OS02CF3, C,.3alkilenaril, C|.4alkilenHet, C,.6alkilenOR, C,.3alkilenN(R<a>)2, C(=0)N(R<a>)2. NHC(=0)C,-C3alkilenaril.C3.gcikloalkil, C3.gheterocikloalkil, arilOC,.3alkilenN(R<a>)2, arilOC(=0)R, NHC(=0)Ci.3alkilenC3.8heterocikloalkil, NHC(=0)d-3alkilenHet, OC,_4alkilenOCM-alkilenC(=0)OR, C(=0)CMalkilenHet, i NHC(=0)haloC,.6alkil;

R<J>je izabran iz grupe koju sačinjavaju opciono supstituisani vodonik, C|.6alkil, C3. gcikloalkil, C3.gheterocikloalkil, Ci^alkilencikloalkil, C2-6alkenil, C).3alkilenaril, arilC).3alkil, C(=0)R<a>, aril, heteroaril, C(=0)OR\ C(=0)N(R<a>)2, C(=S)N(R<a>)2, S02R<a>, S02N(R<a>)2, S(=0)R\ S(=0)N(R<a>)2, C(=0)NR<a>C,.4alkilenOR<a>, C(=0)NR<a>CMalkilenHet, C(=0)CM-alkilenaril, C(=0)CMalkilenheteroaril, Ci^alkilenaril opciono supstituisan sa jednim ili više od halo, S02N(R<a>)2, N(R<a>)2, C(=0)OR<a>, NR<a>S02CF3, CN, N02, C(=0)R<a>, OR<a>, CM-alkilenN(R<a>)2, i OCMalkilenN(R<a>)2, CMalkilenheteroaril, Ci.4alkilenHet, CMalkilenC(=0)-Ci_4alkilenaril, Ci.4alkilenC(=0)Ci.4alkilenlieteroaril, Ci.4alkilenC(=0)Het, Ci.4alki)en-C(=0)N(R<a>)2, Ci.4alkilenOR<a>, C,.4alkilenNR<a>C(=0)R<a>, C,.4alkilenOC,.4alkilenOR<a>, CM-alkilenN(R<a>)2, Ci.4alkilenC(=0)OR<a>, i CMalkilenOC,.4alkilenC(=0)OR<a>;

R<a>je izabran iz grupe koju sačinjavaju vodonik, Ci^alkil. C3.gcikloalkil. C3_s-heterocikloalkil, C].3alkilenN(R<a>)2, aril, arilC].3alkil, Ci-3alkilenaril, heteroaril, heteroarilC].3-alkil, i C|.3alkilenheteroaril;

Rb je izabran iz grupe koju sačinjavaju vodonik, Ci^alkil, aril, heteroaril, arilC].3alkil, heteroarilCi.3alkil, Ci-3alkilenaril, i Ci.3alkilenheteroaril;

Het je petočlani ili šestočlani heterociklični prsten, zasićen ili delimično ili potpuno nezasićen, i koji sadrži najmanje jedan heteroatom izabran iz grupe koju sačinjavaju kiseonik, azot i sumpor, i opciono supstituisan sa Ci^alkilom ili sa C(=0)OR<a>;

i njihove farmaceutski prihvatljive soli i solvati (npr. hidrati).

Termin »aJkil«, na način kao što se ovde upotrebljava, obuhvata ugljovodonične grupe pravog i razgranatog lanca koje sadrže naznačeni broj ugljenikovih atoma, tipično metil, etil i propil i butil grupe pravog i razgranatog lanca. Ugljovodonična grupa može sadržati do 16 ugljenikovih atoma, poželjno od jednog do osam ugljenikovih atoma. Termin »alki!« uključuje »premošćeni alk.il«. tj. C(,-C|(, bicikličnu ili policikličnu ugljovodoničnu grupu, na primer, norbornil, adamantil, biciklo[2.2.2]oktil, biciklo[2.2.1]heptil, biciklo[3.2.1 joktil. ili dekahidronaftil. Termin »cikloalkil« definisan je kao ciklična C3-C8ugljovodonična grupa, na primer, ciklopropil, ciklobutil, cikloheksil i ciklopentil.

Termin »alkenil« je definisan identično kao »alkil«, osim što sadrži ugljenik-ugljenik dvogubu vezu. »Cikloalkenil« je defeinisan slično kao cikloalkil, osim što je u prstenu prisutna ugljenik-ugljenik dvoguba veza.

Termin »alkilen« odnosi se na alkil grupu koja sadrži supstituent. Na primer, termin »Ci^alkilenaril« odnosi se na alkil grupu koja sadrži jedan do tri ugljenikova atoma i koja je supstituisana aril grupom.

Termin »halo« ili »halogen« je ovde definisan tako da uključuje fluor, brom. hlor i jod.

Termin »haloalkil« je ovde definisan kao alkil grupa supstituisana sa jednim ili više halo supstituienata, bilo fluoro, bromo, hloro i jodo ili njihovim kombinacijama. Slično tome. »halocikloalkil« je definisan kao cikloalkil grupa koja sadrži jedan ili više halo supstituenata.

Termin »aril«, sam ili u kombinaciji, definisan je ovde kao monociklična ili policiklična aromatična grupa, poželjno monociklična ili biciklična aromatična grupa. npr. fenil ili naftil. Ukoliko nije drugačije navedeno, »aril« grupa može biti nesupstituisana ili supstituisana, na primer, sa jednom ili više grupa, i konkretno jednom do tri. halo, alkil. fenil. hidroksialkil, alkoksi, alkoksialk.il, haloalkil. ni tro, amino, alkilamino. acilammo, alkiltio. alkilsulfmil i alkilsulfonil grupe. Primeri aril grupa uključuju fenil, naftil, bifenil. tetrahidronaftil, hlorofenil, fluorofenil. aminofenil, metilfenil. metoksifenil. trifluorometilfenil, ni tro fenil, karboksifenil i slične. Termini »arild^alkil« i »heteroarilCi.;,-alkil« defmisani su kao aril ili heteroaril grupa koja ima Ci^alkil supstituent.

Termin »heteroaril« je ovde definisan kao monociklični ili biciklični prstenski sistem koji sadrži jedan ili dva aromatična prestena i koji sadrži najmanje jedan atom azota, kiseonika ili sumpora u aromatičnom prstenu, i koji može biti nesupstituisan ili supstituisan, na primer, sa jednim ili više, i konkretno jednim do tri, supstituenta, kao što su halo. alkil. hidroksi, hidroksialkil. alkoksi, alkoksialkil, haloalkil, nitro, amino, alkilamino, acilamino. alkiltio, alkilsulfmil i alkilsulfonil. Primeri heteroaril grupa uključuju tienil, furil. piridih oksazolil, hinolil, izohinolil. indolil, triazolil, izotiazolil, izoksazolil, imidizolil. benzotiazolil. pirazinil. pirimidinil. tiazolil i tiadiazolil.

Termin »het« je definisan kao monociklične. biciklične i triciklične grupe koje sadrže jedan ili više heteroatoma, izabranih iz grupe koju čine kiseonik, azot i sumpor. »Het« grupa takođe može da sadrži okso grupu (=0) vezanu za prsten. Neograničavajući primeri Het grupa uključuju 1,3-dioksolan, 2-pirazolin, pirazolidin. pirolidin, piperazin, pirolin, 2H-piran, 4H-piran, morfolin, tiofolin, piperidin, 1,4-ditian i 1,4-dioksan.

Termin »hidroksi« je definisan kao -OH.

Termin »alkoksi« je definisan kao —OR, pri čemu R predstavlja alkil.

Termin »alkoksialkil« je definisan kao alkil grupa kod koje je vodonik zamenjen alkoksi grupom. Termin »(alkiltio)alkil« je definisan slično kao alkoksialkil. osim što je umesto kiseonikovog atoma prisutan atom sumpora.

Termin »hidroksialkil« je definisan kao hidroksi grupa vezana na alkil grupu.

Termin »amino« je definisan kao -NH2, a termin »alkilamino« je definisan kao -NR2, pri čemu najmanje jedan R predstavlja alkil, dok drugi R predstavlja alkil ili vodonik.

Termin »acilamino« je definisan kao RC(=0)N, pri čemu R predstavlja alkil ili aril. Termin »alkiltio« je definisan kao -SR, pri čemu R predstavlja alkil.

Termin »alkilsulfmil« je definisan kao R-SO2, pri čemu R predstavlja alkil.

Termin »amino« je definisan kao —NH2, a termin »alkilamino« je definisan kao -NR2. pri čemu najmanje jedan R predstavlja alkil, dok drugi R predstavlja alkil ili vodonik.

Termin »alkilsulfmil« je definisan kao R-SO?, pri čemu R predstavlja alkil.

Termin »alkilsulfonil« je definisan kao R-SO3, pri čemu R predstavlja alkil.

Termin »nitro« je definisan kao -N02.

Termin »trifluorometil« je definisan kao —CF;,.

Termin »trifluorometoksi« je definisan kao -OCF3.

Termin »cijano« je definisan kao -CN.

U poželjnim rešenjima predmetnog pronalaska, X je izabran iz grupe koju sačinjavaju CH2, CH2CH2, CH=CH, CH(CH3), CH2CH(CH3) i C(CH3)2. U daljim poželjnim rešenjima, Y je izabran iz grupe koju sačinjavaju ništa, S i NH.

A prsten može biti monocikličan ili bicikličan. MonocikliČni A prstenski sistemi su aromatični. Biciklični A prstenski sistemi sadrže najmanje jedan armoatičan prsten, ali i oba prstena mogu biti aromatična. Primeri A prstenskih sistema uključuju, ne ograničavajući se samo na njih, imidazolil, pirazolil, 1,2,3-triazolil. piridizinil, pirimidinil. pirazinil, 1.3.5-triazinil, purinih cinolinil, ftalazinil, hinazolinil, hinoksalinil, 1,8-naftiridinil, pteridinil. 1H-indazolil i benzimidazolil.

U poželjnoj grupi jedinjenja formule (I), A je predstavljeno opciono supstituisanim prstenskim sistemom izabranim iz grupe koju čine

A prstenski sistem može opciono biti supstituisan sa jednim do tri, poželjno jednim do dva supstituenta koji su izabrani iz grupe koja sadrži N(R<a>)2)halo, C1.3al.kil, S(C]-3alkil), OR<a>, i Specifični supstituenti uključuju, ne ograničavajući se samo na njih, NH2, NH(CH3), N(CH3)2, NHCH2C6H5, NH(C2H5), Cl, F, CH3, SCH3, OH, i

U još jednoj poželjnoj grupi jedinjenja formule (I), R, i R2nezavisno su predstavljeni sa vodonikom, OR<a>, halo, C,.6alkil, CF3, N02, N(R<a>)2, NR<a>C,.3a]kilenN(R<a>)2i OC,.r alkilenOR<3>. Specifični supstituenti uključuju, ali nisu ograničeni samo njima. H. OCH3. Cl, Br. F. CH3, CF3, N02. OH, N(CH3)2, i 0(CH2)20CH2C6H5. R<1>i R<2>takođe mogu biti uzeti zajedno tako da formiraju prsten, na primer, fenil prsten.

U poželjnom rešenju, R<J>je izabran iz grupe koju čine opciono supstituisani C).6alkil, aril, heteroaril, C3_gcikloalkil, C3.8heterocikloalkil, C(=0)OR\ Ci^»alkilenHet, CM-alkilencikloalkil, CMalkilenaril, CMalkilenC(=0)-Ci.4alkilenaril, CMalkilenC(=0)OR<a>, CM-alkilen-C(=0)N(R<a>)2, CMalkilenC(=0)Het, C,.4-alkilenN(R<a>)2i CMalkilenNRaC(=0)Ra. Specifične R<3>grupe uključuju, ne ograničavajući sa samo na njih,

R<J>grupa može biti supstituisana sa jednim do tri supstituenta, na primer. halo. OR\ C,.6alkil, aril, heteroaril, N02, N(R<a>)2, NR<a>S02CF3, NRaC(=0)R\ C(=0)OR<a>, N(R<a>)C,^-alkilen(R<a>)2, S02N(R<a>)2, CN, C(0)Ra, C,.4-alkilenN(R<a>)2, i OC,.4alkilenN(R<a>)2. Specifični supstituenti za R<J>grupu obuhvataju, bez ograničavanja samo na njih, Cl, F, CH3, CH(CH3)2, OCH3, C6H5, N02, NH2, NHC(=0)CH3, C02H i N(CH3)CH2CH2N(CH3)2.

Na način na koji se ovde upotrebljava, hinazolinska prstenska struktura, sa odgovarajućum brojnim označavanjem iste, je

Purinska prstenska struktura, sa odgovarajućum brojnim označavanjem, je

Primeri jedinjenja obezbeđenih predmetnim pronalaskom su sledeći: 3-(2-izopropilfenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 5-hloro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3-o-tolil-3H-hinazolin-4-on; 5-hloro-3-(2-fluorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on: 3-(2-fluorofenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 3-(2-metoksifenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 3-(2,6-dihlorofenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 3-(2-hlorofenil)-6-lfuoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazoIin-4--on; 5-hloro-3-(2-hlorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on. 3-(2-hlorofenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 3-(2-metoksifenil)-2-(9H-purin-6-i]sulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 3-(2-hlorofenil)-5-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsu]fanilmetil)-3H-hinazolin-4-on: 3-benzil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on;

3-butil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on;

3-(2-hlorofenil)-7-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsu]fanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 3-morfolin-4-il-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on, acetatna so; 8-hloro-3-(2-hlorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 3-(2-hlorofenil)-6,7-difluoro-2-(9H-purin-6rilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 3-(3-metoksifenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; tj-hloro-3-(2-hloroienil)-2-(^^ 3-(3-hlorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 2- (9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3-piridin-4-il-3H-hinazolin-4-on; 3- (24tlorofenil)-8-tirfluorometil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 3-benzil-5-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 3-(4-metilpiperazin-l-il)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; acetatna so; 3-(2-hlorofenil)-6-hidroksi-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on;

etil estar [5-fluoro-4-okso-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-4H-hinazolin-3-il] sirćetne kiseline; 3-(2-metoksifenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 3-bifenil-2-il-5-hloro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 5- hloro-3-(2-metoksifenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-izopropilfenil)-5-metil-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-metil-3-o-tolil-3H-hinazolin-4-on;

2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-bifenil-2-il-5-hloro-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-fluorofenil)-5-metil-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-hloro-3-(2-fiuoro-fenil)-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-8-hloro-3-(2-hloro-fenil)-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilrnetil)-5-hloro-3-(2-hloro-fenil)-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-ajTiinopurin-9-ilrnetil)-3-(2-hlorofenil)-5-metil-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-h)orofenil)-5-fluoro-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-benzil-5-fluoro-3H-hinazolin-4-on;

2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-butil-3H-hinazolin-4-on;

2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-morfolin-4-il-3H-hinazolin-4-on;

2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-hlorofenil)-7-fluoro-3H-hinazolin-4-on; 2- (6-aminopurin-9-ilmetil)-6-hloro-3- (2-hloro-fenil)-3H-hinazolin-4-on; 3- (4-hlorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on;

3-(2-hlorofenil)-6.7-dimetoksi-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 3-(2-hlorofenil)-7-nitro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-6-brorao-3-(2-hlorofenil)-3H-hinazolin-4-on; 2- (6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-h]orofenil)-6.7-dimetoksi-3H-hinazolin-4-on; 6- bromo-3-(2-hlorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 3- (2-hlorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-benzo[g]hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-hloro-3-o-tolil-3H-hinazolin-4-on; i

2- (6-aminopurin-9-ilmetil)-5-hloro-3-(2-metoksi-fenil)-3H-hinazolin-4-on.

Primeri poželjnih jedinjenja obezbedenih predmetnim pronalaskom imaju strukturu (IV) i oni su sledeći: 3- (2-izopropilfenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 5-hloro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3-o-toIil-3H-hinazolin-4-on;

5-hloro-3-(2-fluorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hina2olin-4-on: 3-(2-fluorofenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmeti])-3H-hiriazolin-4-on; 3-(2,6-dih]orofeni])-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hin^ 3-(2-hlorofenil)-6-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin 5- hloro-3-(2-hlorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 3-(2-hlorofenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfani]metil)-3H-hinazolin-4-on: 3-(2-hlorofenil)-5-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 3-benzil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on;

3-butil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmeti])-3H-hinazo]in-4-on;

3-(2-hlorofeniI)-7-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 3-morfolin-4-il-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on, acetatna so; 8-hloro-3-(2-hlorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 3-(2-hlorofenil)-6.7-difiuoro-2-(9H-puirn-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 6- hloro-3-(2-hlorofeni])-2-(9H-purin-6-ilsu]fanilmetil)-3H-hinazolin-4-on; 3-(3-hlorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on;

2- (9H-purin-6-ilsu]fanilmetil)-3-piridin-4-il-3H-hinazoIin-4-on;

3- (2-hlorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-trifluorometil-3H-hinazo]in-4-on; 3-benzil-5-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on;

3-(4-metilpiperazin-] -i])-2-(9H-purin-6-ilsu]fani]metil)-3H-hinazolin-4-on. acetatna so; 3-(2-hlorofenil)-6-hidroksi-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmeti])-3H-hinazolin-4-on;

etil estar [5-fluoro-4-okso-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-4H-hinazolin-3-il] sirćetne kiseline: 3-bifenil-2-il-5-hloro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-binazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-izopropi]fenil)-5-metil-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-metil-3-o-tolil-3H-hinazolin-4-on;

2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-bifenil-2-i]-5-hloro-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopm-in-9-ilmetil)-3-(2-fluorofenil)-5-metil-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-hloro-3-(2-fluoro-fenil)-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-8-hloro-3-(2-hloro-fenil)-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-hloro-3-(2-hloro-fenil)-3H-hinazolin-4-on: 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-hlorofenil)-5-metil-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-i]metil)0-(2-hlorofenil)-5-fluoro-3H-hinazolin-4-oii; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-benzil-5-fluoro-3H-hinazolin-4-on;

2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-butil-3H-hinazolin-4-on;

2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-morfolin-4-il-3H-hinazolin-4-on^

2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-hlorofenil)-7-fluoro-3H-hinazolin-4-on; i 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-hloro-3-o-tolil-3H-hinazolin-4-on.

Termin »prekursor« na način na koji se ovde upotrebljava, odnosi se na jedinjenja koja se brzo transformišuin vivoujedinjenje koje ima prethodno navedenu strukturnu formulu (I). na primer, putem hidrolize. Formiranje prekursora generalno je razmatrano u Hardma et ah, (Eds.),Goodman and Gilman ' s The Pharmacological Basis o/ Therapeulics, 9' b ed,pp. 11-16

(1996). Detaljno razmatranje je dato u Higuchi et ah,Prodrugs as Nove! Delivery Systems, Vol. 14,ASCD Svmposium Series, kao i u Roche (ed.),Bioreversible Carriers in Drug Design,American Pharmaceutical Association and Pergamon Press (1987). Ukratko, davanje leka je praćeno njegovom eliminacijom iz tela ili nekom biotransformacijom, čime se biološka aktivnost leka redukuje ili eliminiše. Alternativno, proces biotransformacije može voditi do metaboličkog nusproizvoda, koji je sam po sebi više ili podjednako aktivan kao lek koji je prvobitno dat. Poboljšano razumevanje ovih procesa biotransformacije omogućava osmišljavanje tzv. »prekursora« koji, nakon biotransformacije, postaju fiziološki aktivniji u svom izmenjenom stanju. Prekursori stoga obuhvataju farmakološki neaktivna jedinjenja koja se konvertuju u biološki aktivne metabolite.

U cilju ilustracije, prekursori mogu biti prevedeni u farmakološki aktivni oblik, putem hidrolize, na primer, estarske ili amidne veze, čime se uvodi ili izlaže funkcionalna grupa rezultantnog proizvoda. Prekursori mogu biti formirani tako da reaguju sa endogenim jedinjenjem čime se obrazuje hidrosolubilni konjugat koji dodatno poboljšava farmakološke osobine jedinjenja, na primer, produžavajući poluživot u krvotoku. Alternativno, prekursori mogu biti obrazovani tako da se podvrgavaju kovalentnoj modifikaciji na funkcionalnoj grupi sa, na primer, glukuronskom kiselinom, sulfatom, glutationom. amino-kiselinama ili acetatom. Dobijeni konjugat može biti inaktiviran i izlučen putem urina, ili učinjen još snažnijim u odnosu na polazno jedinjenje. Konjugati visoke molekularne težine, mogulakode biti izlučeni u žuč. izloženi enzimskom razlaganju, i oslobođeni nazad u krvotok, čime se efektivno produžava biološko vreme poluzivota prvobitno primenjenog jedinjenja.

Postupci za identifikaciju negativnih regulatora PI3K8 aktivnosti

PI3K6 protein kao i njegovi fragmenti koji ispoljavaju biološku aktivnost, mogu biti korišćeni za ispitivanje jedinjenja za koja se pretpostavlja da su negativni regulatori, bilo kojom od tehnika za ispitivanje lekova. Negativni regulator PI3K8 je jedinjenje koje slabi ili eliminiše sposobnost PI3K6 da obavlja bilo koju od njegovih bioloških funkcija. Primer takvih jedinjenja jeste agens koji smanjuje sposobnost PI3K6 polipeptida da fosforiluje fosfatidilinozitol ili da cilja odgovarajuće strukture unutar ćelije. Selektivnost jedinjenja koje negativno reguliše aktivnost PI3K6 može se oceniti poređenjem njegove aktivnosti na PI3K5 sa njegovom aktivnošću na druge proteine. Selektivni negativni regulatori uključuju, na primer, antitela i druge proteine ili peptide koji se specifično vezuju za PI3K5 polipeptid. oligonukleotide koji se specifično vezuju za P13K5 polipeptide, i druga nepeptidna jedinjenja (npr. izolovani ili sintetizovani organski molekuli) koja specifično interaguju sa PI3K5 polipeptidima. Negativni regulatori takođe uključuju perthodno opisana jedinjenja, ali takva koja interaguju sa specifičnim partnerom za vezivanje PI3KS polipeptida.

U ovom trenutku, poželjni ciljevi za razvoj selektivnih negativnih regulatora PI3K6 uključuju, na primer: (1) Citoplazmičke oblasti PI3K8 polipeptida koje dolaze u dodir sa drugim proteinima i/ili lokalizuju PI3KS unutar ćelija: (2) Oblasti PI3K5 polipeptida koje vezuju specifične partnere za vezivanje; (3) Oblasti PI3K5 polipeptida koje vezuju supstrat; (4) Alosterska regulatorna mesta PI3K5 polipeptida koja mogu ili ne mogu interagovati direktno sa aktivnim centrom po regulatornom signalu;

(5) Oblasti PI3K8 polipeptida koje posreduju u mulitmerizaciji.

Na primer, jedan cilj za razvoj modulatora je identifikovana regulatorna interakcija p85 sa pl 105, koja može biti uključena u aktivaciji i/ili subcelularnoj lokalizaciji pl 106 ostatka. Još neki od selektivnih modulatora obuhvataju one koji prepoznaju specifične regulatorne ili PI3K5-kodirajuće sekvence nukleotida. Modulaiori PI3K8 mogu biti terapeutski efikasni u tretmanu širokog spektra oboljenja i fizioloških stanja kod kojih je prisutna aberantna aktivnost PI3K8.

U skadu sa pomenutim, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke karakterizacije potencijala testiranog jedinjenja kao inhibitora P13K8 polipeptida. pri čemu navedeni postupak obuhvata korake (a) merenja aktivnosti PI3K8 polipeptida u prisustvu jedinjenja koje se ispituje; (b) poređenja aktivnosti PI3K8 polipeptida u prisustvu ispitivanog jedinjenja sa aktivnošću PI3K5 polipeptida u prisustvu ekvivalentne količine referentnog jedinjenja (npr. PI3K8 inliibitornog jedinjenja prema predmetnom pronalasku, kako je ovde opisano), pri čemu niža aktivnost PI3K8 polipeptida u prisustvu ispitivanog jedinjenja u poređenju sa aktivnošću u prisustvu referentnog jedinjenja ukazuje da je ispitivano jedinjenje snažniji inhibitor od referentnog jedinjenja, dok veća aktivnost PI3K8 polipeptida u prisustvu ispitivanog jedinjenja u poređenju sa aktivnošću u prisustvu referentnog jedinjenja ukazuje da je ispitivano jedinjenje slabiji inliibitor od referentnog jedinjenja.

Predmetni pronalazak dodatno obezbeđuje postupke karakterizacije moći ispitivanog jedinjenja kao inhibitora PI3K8 polipeptida, koji uključuju korake (a) određivanja količine kontrolnog jedinjenja (npr. PI3K8 inhibitornog jedinjenja predmetnog pronalaska kao što je ovde opisano) koje inhibira aktivnost PI3K8 polipeptida u referentnom procentu inhibicije. čime se definiše referentna inhibitorna količina kontrolnog jedinjenja; (b) određivanja količine kontrolnog jedinjenja koje inhibira aktivnost PI3K8 polipeptida u referentnom procentu inhibicije, čime se definiše referentna inhibitorna količina kontrolnog jedinjenja; (c) poređenja referentne inhibitorna količine ispitivanog jedinjenja sa referentnom inhibitornom količinom kontrolnog jedinjenja, pri čemu niža referentna inhibitorna količina jedinjenja koje se ispituje od one za kontrolno jedinjenje ukazuje daje ispitivano jedinjenje snažniji inhibitor od kontrolnog jedinjenja, dok viša referentna inhibitorna količina jedinjenja koje se ispituje od one za kontrolno jedinjenje ukazuje da je ispitivano jedinjenje slabiji inhibitor od kontrolnog jedinjenja. U jednom aspektu, postupak koristi referentnu inhibitornu količinu koja predstavlja onu količinu jedinjenja koja inhibira aktivnost PI3K8 polipeptida u procentu od 50%, 60%, 70% ili 80%. U još jednom aspektu, postupak koristi referentnu inhibitornu količinu koja predstavlja onu količinu jedinjenja koja inhibira aktivnost PI3K5 polipeptida u procentu od 90%, 95% ilr 99%. Ovi postupci obuhvataju određivanje referentne inhibitorne količine jedinjenja uin vilrobiohemijskom testu, uin vilrućelijski bazitanom testu, ili uin vivotestu.

Predmetni pronalazak nadalje obezbeđuje postupke identifikacije negativnog regulatora P13K8 aktivnosti, koji uključuju korake (i) merenja aktivnosti P13K5 polipeptida u prisustvu i odsustvu ispitivanog jedinjenja. i (ii) identifikacije kao negativnog regulatora ispitivanog jedinjenja koje smanjuje aktivnost PI3K5 i koje ulazi u kompeticiju sa jedinjenjem predmetnog pronalaska za vezivanje PI3K5. Dalje, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke identifikacije jedinjenja koja inhibiraju aktivnost PI3K6, koji uključuju korake (i) kontakta PI3K8 polipeptida sa jedinjenjem predmetnog pronalaska u prisustvu i odsustvu ispitivanog jedinjenja, i (ii) identifikacije ispitivanog jedinjenja kao negativnog regulatora aktivnosti PI3K8, pri čemu jedinjenje ulazi u kompeticiju sa jedinjenjem predmetnog pronalaska za vezivanje PI3K8. Predmetni pronalazak, stoga, obezbeđuje postupak za ispitivanje potencijalnih negativnih regulatora aktivnosti P13K8 i/ili postupak za potvrđivanje načina dejstva takvih potencijalnih negativnih regulatora. Ovakvi postupci mogu biti upotrebljeni paralelno na druge PI3K izoforme u cilju utvrđivanja komparativne aktivnosti ispitivanog jedinjenja na razne izoforme i/ili u odnosu na jedinjenje perdmetnog pronalaska.

U ovim postupcima, PI3K8 može biti fragment od pl 105 koji ispoljava aktivnost karakterističnu za kinaze, tj. fragment koji sadrži katalitički aktivni centar od p 1105. Alternativno, PI3K5 polipeptid može biti fragment iz pl 10-vezujućeg domena od p85 i obezbeđuje postupak za identifikaciju alosterskih modulatora PI3K5. Postupci mogu biti upotrebljeni kod ćelija koje eksprimiraju PI3K5 ili njegove subjedinice, bilo endogeno ili egzogeno. U skladu sa ovime, polipeptid koji je upotrebljen u ovim postupcima može biti slobodan u rastvoru, učvršćen na čvrstu podlogu, modifikovan tako da bude izložen na površini ćelije ili lociran intracelularno. Modulacija aktivnosti ili formiranja vezujućih kompleksa između PI3K5 polipeptida i agensa koji se ispituje, se može tada izmeriti.

Na humane PI3K polipeptide se mogu primeniti biohemijski ili ćelijski bazirani postupci ispitivanja velikog kapaciteta (HTS - high throughput screening) prema postupcima koji su poznati i primenjivani u struci, koji obuhvataju melanoforne probne sisteme u cilju ispitivanja interakcija receptor-ligand, probne sisteme bazirane na kvascu i sisteme za ekspresiju sa ćelijama sisara. Radi pregleda, pogledati Javavvickreme and Kost,Curr Opin Biotechnol,5:629-34 (1997). Takođe su obuhvaćena i automatizovana i minijaturizovana HTS ispitivanja koja su opisana, na primer, u Houston and Banks,Curr Opin Biotechnol,5:734-40(1997).

Ovakva HTS testiranja se koriste u ispitivanju biblioteka jedinjenja u cilju identifikacije konkretnih jedinjenja koja ispoljavaju željenu osobinu. Bilo koja biblioteka jedinjenja može biti korišćena, uključujući hemijske biblioteke, biblioteke prirodnih proizvoda i kombinatorna biblioteke koje obuhvataju slučajne ili osmišljene oligopeptide. oligonukleotide ili druga organska jedinjenja.

Hemijske biblioteke mogu sadržati poznata jedinjenja, odgovarajuće strukturne analoge poznatih jedinjenja, ili jedinjenja koja se identifikuju ispitivanjem prirodnih proizvoda.

Biblioteke prirodnih proizvoda su kolekcije materijala izolovanih iz prirodnih izvora, tipično, mikroorganizama, životinja, biljaka ili morskih organizama. Prirodni proizvodi se izoluju iz njihovih izvora, fermentacijom mikroorganizmima nakon čega sledi izolovanje i ekstrakcija iz fermentacione smeše, ili putem direktne ekstrakcije iz mikroorganizama ili tkiva (biljnih ili životinjskih). Biblioteke prirodnih proizvoda obuhvataju poliketide, neribozomske peptide, i njihove varijetete (uključujući veštački dobijene varijetete). Radi pregleda, pogledati Cane et ah,Science,252:63-68 (1998).

Kombinatorne bibloteke se sastoje od velikog broja srodnih jedinjenja, kao što su peptidi, oligonukleotidi ili druga organska jedinjenja u obliku smeše. Ovakva jedinjenja se relativno šematski dizajniraju i dobijaju tradicionalnim procedurama automatizovane sinteze. PCR, kloniranjem ili poznatim postupcima sinteze. Od posebnog interesa su kombinatorne biblioteke peptida i oligonukleotida.

Biblioteke koje su takođe od interesa obuhvataju peptidne. proteinske, peptidomimetičke, multiparalelne sintetičke kolekcije, rekombinatorne i polipeptidne. Radi pregleda kombinatorne hernije i odgovarajućih biblioteka koje su sačinjene pogledati Myers,Curr Opin Biotechnol.5:701-07 (1997).

Kada su identifikovana jedinjenja koja pokazuju aktivnost u smislu negativne regulacije funkcije PI3K5, može se preduzeti program optimizacije u cilju poboljšanja moći i/ili selektivnosti date aktivnosti. Ova analiza veza strukture i aktivnosti (SAR - structure-activitv relationships) tipično uključuje serije iterativnih selektivnih modifikacija struktura jedinjenja i njihovu korelaciju sa biohemijskim i biološkim aktivnostima. Mogu se kreirati familije srodnih jedinjenja koja sva pokazuju željenu aktivnost, pri čemu se određeni članovi familije, konkretno oni koji poseduju odgovarajuće farmakološke profile, potencijalno kvalifikuju kao kandidati za terapijska sredstva.

Terapijske primene inhibtora aktivnosti PI3KS

Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za selektivnu ili specifičnu inhibiciju aktivnosti PI3K5 u terapijske ili profilaktičke svrhe. Postupak uključuje davanje selektivnog ili specifičnog inhibitora aktivnosti PI3KS u količini koja je za to efikasna. Ovaj postupak se može primeniti u lečenju ljudi i životinja koje jesu ili mogu biti stanju čiji su simptomi ili patologija posredovani ekspresijom ili aktivnosšću PI3K5.

»Tretman«, na način na koji se ovde koristi, odnosi se na prevenciju pojave poremećaja kod životinje koja može biti predisponirana za poremećaj, ali kod koje takav poremećaj još nije đijagnostifikovan; inhibiciju poremećaja, odnosno, sprečavanje njegovog razvoja; olakšavanje poremećaja, tj. izazivanje njegovog povlačenja; ili ublažavanje poremećaja, odnosno smanjivanje izraženosti simptoma povezanih sa poremećajem. Podrazumeva se da termin »poremećaj« obuhvata medicinske poremećaje, oboljenja, stanja, sindrome i slično, bez ograničenja.

Postupci prema predmetnom pronalasku obuhvataju različite načine tretiranja životinjskog subjekta, poželjno sisara, još poželjnije primata, i još poželjnije čoveka. Među životinjama sisarima koje se mogu tretirati su, na primer. kućni ljubimci, uključujući pse i mačke; domaće životinje uključujući stoku, konje, ovce, svinje i koze; laboratorijske životinje uključujući pacove, miševe, zečeve, zamorčiće i ne-humane primate, i zoološke primerke. Životinje koje ne spadaju u sisare obuhvataju, na primer, ptice, ribe, reptile i vodozemce.

U jednom aspektu, postupak prema predmetnom pronalasku može biti upotrebljen za terapeutski ili profilaktički tretman subjekata kod kojih jeste ili može biti prisutan zapaljenski poremećaj. Jedan aspekt predmetnog pronalaska je izveden iz uključenosti PI3K5 u aspekte posredovanja zapaljenskog procesa. Bez namere za ograničavanjem bilo kakvom teorijom, teorijski se smatra da, pošto zapaljenje uključuje procese koji su tipično posredovani leukocitnom aktivacijom (npr. neutrofila, limfocita itd.) i hemotaktičkom transmigracijom. i pošto PI3K6" može posredovati u ovakvim fenomenima, mogu se koristiti antagonisti P13K5 da bi se sprečila povreda povezana sa zapaljenjem.

»Zapaljenski poremećaj« (ili »inflamatomi poremećaj«), na način na koji se ovde koristi, može se odnositi na bilo koje oboljenje, poremećaj ili sindrom kod kojeg prekomerni ili neregulisani inflamatomi odgovor dovodi do prekomernih inflamatornih simptoma, oštećenja tkiva domaćina ili gubitka funkcije tkiva. »Zapaljenski poremećaj« (ili »inflamatomi poremećaj«) se takođe odnosi na patološko stanje posredovano influksom leukocita i/ili neutrofilnom hemolaksijom.

Termin »zapaljenje« (ili »inflamacija«). kako je ovde korišćen, odnosi se na lokalizovan, odbrambeni odgovor uzrokovan povredom ili uništenjem tkiva, čija uloga je da uništi, razblaži ili izoluje (odvoji) kako agens izazivač povrede, tako i povređeno tkivo. Zapaljenje je u značajnoj meri povezano sa influksom leukocita i/ili neutrofilnom hemotaksijom. Zapaljenje može biti rezultat infekcije patogenim organizmima i virusima, ali može poticati i od neinfektivnih uzroka kao što su trauma ili reperfuzija nakon infarkta miokarda ili udara, imuni odgovor na strani antigen, i autoimuni odgovori. U skladu sa rečenim, zapaljenski poremećaji koji se mogu tretirati prema predmetnom pronalasku uključuju poremećaje povezane sa reakcijama specifičnog odbrambenog sistema kao i sa reakcijama nespecifičnog odbrambenog sistema.

Kako je ovde korišćen, termin »specifični odbrambeni sistem« odnosi se na komponentu imunog sistema koja reaguje na prisustvo specifičnih antigena. Primeri zapaljenja koje rezultuje kao posledica odgovora specifičnog odbrambenog sistema uključuju klasičan odgovor na strane antigene, autoimune bolesti, i hipersenzitivni odgovor zakasnelog tipa posredovan T-ćelijama. Hronična inflamatorna oboljenja, odbacivanje presađenih tkiva i organa, npr. bubrega ili koštane srži, kao i oboljenje presadak protiv domaćina (GVHD - graft versus host disease), takođe su primeri inflamatornih reakcija specifičnog odbrambenog sistema.

Kako je ovde korišćen, termin »nespecifični odbrambeni sistem« odnosi se na inflamatorne poremećaje koji su posredovani leukocitima koji ne poseduju imunološku memoriju (npr. granulociti i makrofagi). Primeri zapaljenja koja rezultuju, barem delom. kao posledica reakcije nespecifičnog odbrambenog sistema, uključuju zapaljenja povezana sa stanjima kao što su adultni (akutni) sindrom respiratornog distresa (ARDS) ili sindromi multiple povrede organa; reperfuzione povrede: akutni glomerulonefritis; reaktivni artritis: dermatoze sa akutnim inflamatornim komponentama; akutni gnojni meningitis ili druga inflamatorna oboljenja centralnog nervnog sistema kao što je moždani udar; termalne povrede; zapaljensku bolest creva; sindrome povezane sa transfuzijom granulocita; i citokinski-indukovani toksicitet.

Kako je ovde korišćen, termin »autoimuna bolest« odnosi se na bilo koju grupu oboljenja kod kojih je povreda tkiva povezana sa humoralnim ili ćelijski-posredovanim odgovorima na konstituente samog tela. Kako je ovde korišćen, termin »alergijsko oboljenje« odnosi se na bilo koje simptome, oštećenje tkiva, ili gubitak funkcije tkiva kao posledice alergije. Kako je ovde korišćen. termin »artritično oboljenje« odnosi se na bilo koje oboljenje koje je karakterisano inflamatornim lezijama zglobova koje se mogu pripisati različitim etiologijama. Kako je ovde korišćen, termin »dermatitis« odnosi se na bilo koje oboljenje iz velike familije oboljenja kože koja su karakterisana zapaljenjem kože koje se može pripisati različitim etiologijama. Kako je ovde korišćen. termin »odbacivanje presadka« odnosi se na bilo koju imunu reakciju usmerenu protiv presađenog tkiva, kao što su organi ili ćelije (npr. koštana srž), karakterisanu gubitkom funkcije presađenog i okolnih tkiva, bolom, otokom, leukocitozom. i trombocitopenijom.

Terapeutski postupci predmetnog pronalaska uključuju postupke za tretman poremećaja povezanih sa inflamatornom ćelijskom aktivacijom. Termin »inflamatorna ćelijska aktivacija« odnosi se na indukovanje putem stimulusa (uključujući, ali bez ograničenja na, citokine, antigene ili auto-antitela) proliferativnog ćelijskog odgovora, proizvodnje rastvorljivih medijatora (uključujući, ali bez ograničenja na. citokine, kiseonične radikale, enzime, prostanoide, ili vazoaktivne amine). ekspresije na ćelijskoj površini novih ili povećanog broja medijatora (uključujući, ali bez ograničenja na, veće antigene histokompatibilnosti ili molekule ćelijske ađhezije) u inflamatornim ćelijama (uključujući, ali bez ograničenja na, monocite, makrofage, T limfocite. B limfocite, granulocite (odnosno polimorfonukleame leukocite kao što su neutrofili, bazofili i eozinofili), mastocite. dendritičke ćelije, Langerhansove ćelije, i ćelije endotela). Stručnjaci će primetiti da aktivacija jednog ili kombinacije ovih fenotipa u ovim ćelijama može doprineti započinjanju, održavanju ili pogoršavanju inflamatornog poremećaja.

Ustanovljeno je da jedinjenja predmetnog pronalaska inhibiraju oslobađanje superoksida od strane neutrofila. Neutrofili oslobađaju superoksid kao odgovor na neki od stimulusa, uključujući signale infekcije, što čini mehanizam za ubijanje ćelija. Na primer, poznato je da se oslobađanje superoksida indukuje faktorom tumorske nekroze alfa (TNFa), koji se oslobađa od strane makrofaga, mastocita i limfocita nakon kontakta sa komponentama bakterijskog ćelijskog zida kao što je lipopolisaharid (LPS). TNFa je izuzetno snažan i neselektivan aktivator inflamatornih procesa, uključen u aktivaciju neutrofila i raznih drugih tipova ćelija, indukovanje leukocit/endotel ćelijske ađhezije, pireksije, pojačane proizvodnje MHC klase I. i stimulaciju angiogeneze. Alternativno, oslobađanje superoksida može biti stimulisano putem formil-Met-Leu-Phe (fMLP) ili drugih peptida blokiranih na N-terminusu formilovanog metionina. Takvi peptidi se normalno ne nalaze kod eukariota, ali su fundamentalno karakteristični za bakterije i signalizuju prisustvo bakterija imunom sistemu. Leukociti koji eksprimiraju fMLP receptor, npr. neutrofili i makrofagi, stimulisani su da migriraju u pravcu rasta gradijenta ovih peptida (hemotaksija) odnosno ka žarištu infekcije. Kako je ovde pokazano, jedinjenja predmetnog pronalaska inhibiraju stimulisano oslobađanje superoksida od strane neutrofila kao odgovor bilo na TNFa ili fMLP. Pokazano je da druge funkcije neutrofila, uključujući stimulisanu egzocitozu i usmerenu hemotaktičku migraciju, takođe bivaju inhibirane dejstvom inhibitora PI3K8 predmetnog pronalaska. U skladu sa ovim, može se očekivati da jedinjenja predmetnog pronalaska budu upotrebljiva u tretiranju poremećaja, kao što su zapaljenski poremećaji, koji su posredovani bilo kojim od ih svim ovim funkcijama neutrofila.

Predmetni pronalazak obezbeđuje postupke tretiranja oboljenja kao što su artritička oboljenja kao što su reumatoidni artritis, monoartikularni artritis, osteoartritis, giht, spondilitis; Bečetova bolest; sepsa, septički šok, endotoksički šok, gram negativna sepsa, gram pozitivna sepsa, i sindrom toksičkog šoka: sindrom multiple povrede organa odakle sledi septikemija, trauma, ili hemoragija; oftalmički poremećaji kao što su alergijski konjunktivitis, prolećni konjunktivitis, uveitis, i oftalmopatija povezana sa tiroidnom žlezdom; eozinofilni granulom; pulmonarni ili respiratorni poremećaji kao što su astma, hronični bronhitis, alergijski rinitis, ARĐS, hronično puimonarno zapaljensko oboljenje (npr. hronično opstruktivno puimonarno oboljenje), silikoza, pulmonama sarkoidoza, upala plućne maramice, alveolitis, vaskulitis, emfizema, pneumonija, bronhiektaza. i pulmonama kiseonična toksičnost; reperfuziona povreda miokarda, mozga, ili ekstremiteta; fibroza kao što je cistična fibroza; formiranje keloida ili formiranje ožiljnog tkiva; ateroskleroza; autoimuna oboljenja kao što su sistemski eritemni lupus (SLE - svstemic lupus ervthematosus). autoimuni tiroiditis, multipla skleroza, pojedine forme dijabetesa, i Reynaud-ov sindrom; i poremećaji odbacivanja presadka kao što su GVHD i odbacivanje alografta; hronični glomerulonefritis; inflamatorne bolesti creva kao što su hronična inflamatorna bolest creva (CIBD - chronic inflammatory bowel disease), Kronova bolest, ulcerativni kolitis, i nekrotizujući enterokolitis; inflamatorne dermatoze kao što su kontaktni dermatitis, atopični dermatitis, psorijaza, ili urtikarija; groznica i mialgije usled infekcije; inflamatomi poremećaji centralnog ili perifernog nervnog sistema kao što su meningitis, encefalitis, i povreda mozga ili kičmene moždine usled manje traume; Sjorgen-ov sindrom; oboljenja koja uključuju leukocitnu dijapedezu; alkoholni hepatitis; bakterijska pneumonija; oboljenja posredovana antigen-antitelo kompleksima; hipovolemički šok;diabetes mellilusTipa 1; akutni ili odloženi hipersenzitivitet; oboljenska stanja uzrokovana leukocitnom diskrazijom i metastazama; termalne povrede; sindromi povezani sa granulocitnom transfuzijom; i citokinski indukovani toksicitet.

Postupak se može upotrebiti u tretmanu subjekata koji jesu ili mogu biti izloženi reperfuzionim povredama, tojest povredama koje su posledica situacija u kojima tkivo ili organ bivaju izloženi periodu ishemije iza koje sledi reperfuzija. Termin »ishemija« odnosi se na lokalizovanu tkivnu anemiju usled opstrukcije dotoka arterijske krvi. Tranzientna ishemija praćena reperfuzijom karakteristično rezultuje neutrofilnom aktivacijom i transmigracijom kroz endotel krvnih sudova u zahvaćenu oblast. Nagomilavanje aktiviranih neutrofila, nadalje, dovodi do generisanja reaktivnih kiseoničnih metabolita koji oštećuju komponente zahvaćenog tkiva ili organa. Ovaj fenomen »reperfuzione povrede« je uobičajeno povezan sa stanjima kao što su vaskularni udar (ukljulujući globalnu i fokalnu ishemiju), hemoragički šok, miokardijalna ishemija ili infarkt, transplantacija organa, i cerebralni vazospazam. Kao ilustracija, reperfuziona povreda nastaje na kraju procedure srčanog bajpasa ili tokom srčanog udara kada srce, pošto je sprečen dotok krvi u njega, počinje reperfuziju. Očekuje se da će inhibicija aktivnosti PI3K6 rezultovati smanjenjem broja reperfuzionih povreda u takvim situacijama.

U vezi sa nervnim sistemom, globalna ishemija se dešava kada se dotok krvi u čitav mozak prekine tokom određenog vremena. Globalna ishemija može biti posledica srčanog udara. Fokalna ishemija se događa kada deo mozga biva lišen normalnog snabdevanja krvlju. Fokalna ishemija može biti posledica tromboembolitičke okluzije cerebralnog krvnog suda. traumatske povrede glave, edema ili moždanog tumora. Čak i ako je tranzijentna, kako globalna, tako i fokalna ishemija mogu dovesti do obimnog oštećenja neurona. Iako se oštećenje nervnog tkiva događa satima, pa i danima nakon pojave ishemije. određena premanentna oštećenja nervnog tkiva se mogu razviti u prvim minutima nakon prestanka dotoka krvi u mozak.

Ishemija se takođe može javiti u srcu, u slučaju infarkta miokarda i drugih kardiovaskularnih poremećaja, kada dolazi do opstrukcije koronarnih arterija kao posledica ateroskleroze, tromba ili spazma. U skladu sa ovime, smatra se da pronalazak može biti upotrebljiv za tretman oštećenja srčanog tkiva, posebno oštećenja koja su posledica srčane ishemije ili su izazavana reperfuzionim povredama kod sisara.

U još jednom aspektu, selektivni inhibitori P13K5, kao što su jedinjenja predmetnog pronalaska, mogu se koristiti u postupcima tretmana koštanih oboljenja, posebno oboljenja kod kojih je funkcija osteoklasta abnormalna ili neželjena. Kao što je pokazano u Primeru 6. ispod, jedinjenja predmetnog pronalaska inhibiraju funkciju osteoklastain vitro.U skladu sa navedenim, upotreba ovakvih jedinjenja i drugih selektivnih inhibitora PI3K5 može biti korisna u tretmanu osteoporoze, Paget-ove bolesti i srodnih poremećaja koštane resorpcije.

U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obuhvata postupke upotrebe PI3K5 inhibitornih jedinjenja u cilju inhibicije rasta ili proliferacije ćelija kancera hematopoetskog porekla, poželjno ćelija kancera limfoidno porekla i još poželjnije, ćelija kancera srodnih ili izvedenih iz B limfocita ili B limfocitnih progenitora. Kanceri koji su podložni tretmanu upotrebom postupka prema predmetnom pronalasku obuhvataju, ne ograničavajući se samo na njih, limfome, npr. maligne neoplazme limfoidnih i retikuloendotelnih tkiva, kao što su Burkitt-ov limfom, Hodgkins-ov limfom, ne-Hodgkins-ovi limfomi, limfocimi limfomi i si.; multipli mijelomi; kao i leukemije, kao što su limfocitne leukemije, hronične mijeloidne (mijelogene) leukemije, i si. U poželjnom rešenju predmetnog pronalaska, PI3K5 inhibitorna jedinjenja mogu biti korišćena za inhibiciju ili kontrolu rasta ili proliferacije ćelija hronične mijeliodne (mijelogene) leukemije.

U još jednom aspektu, predmetni pronalazak uključuje postupak suprimiranja funkcije bazofila i/ih mastocita, i na taj način omogućuje tretman oboljenja ili poremećaja okarakterisanih prekomernom ih neželjenom aktivnošću bazofila i/ili mastocita. U skladu sa postupkom, jedinjenje predmetnog pronalaska može biti korišćeno da selektivno inhibira ekspresiju ili aktivnost fosfatidilinozitol 3-kinaze delta (PI3K5) u bazofilima i/ili mastocita. Poželjno, postupak koristi inhibitor PI3K8 u količini dovoljnoj za inhibiciju stimulisanog oslobađanja histamina od strane bazofila i/ili mastocita. U skladu sa navedenim, upotreba ovakvih jedinjenja i drugih PI3K5-selektivnih inhibitora može biti od koristi u tretmanu oboljena karakterisanih oslobađanjem histamina. tj. alergijskih poremećaja, uključujući poremećaje kao što su hronično opstruktuvno puimonarno oboljenje (COPD - chronic obstructive pulmonarv disease), astma, ARDS, emfizem, i srodni poremećaji.

Farmaceutski preparati inhibitora PI3K5 aktivnosti

Jedinjenje predmetnog pronalaska se može dati u obliku čiste supstance, ali se tipično preferira davanje jedinjenja u obliku farmaceutskih preparata ili formulacija. U skladu sa ovim, predmetni pronalazaklakode obezbeđuje farmaceutske preparate koji sadrže nemijski ili biološki sastojak (»agens«) koji je aktivan kao modulator aktivnosti PI3K6 i biokompatibilan farmaceutski nosilac, adjuvans ili vehikulum. Preparat može sadržati agens kao jedini aktivni ostatak ili u kombinaciji sa drugim agensima kao što su oligo- ili polinukleotidi, oligo- ili polipeptidi. lekovi ili hormoni pomešani sa ekscipijensorn/ekscipijensima ili drugim farmaceutski prihvatljivim nosiocima. Nosioci i drugi sastojci se mogu smatrati famraceutski prihvatljivim ukoliko su kompatibilni sa drugim sastojcima formulacije i nisu štetni po korisnika.

Tehnike formulacije i davanja farmaceutskih perparata se mogu naći uRemington ' s Pharmaceutical Sciences, 18<lh>Ed.,Mack Publishing Co, Easton, PA, 1990. Farmaceutski preparati predmetnog pronalaska mogu biti pripremljeni bilo kojim konvencionalnim postupkom, npr. mešanjem, rastvaranjem, granulacijom, proizvodnjom dražeja, sprašivanjem, emulzifikacijom, enkapsulacijom, vezivanjem, rotacionim topljenjem, sušenjem putem raspršivanja ili procesom liofilizacije. Međutim, optimalne farmaceutske formulacije odrediće stručnjak u zavisnosti od načina davanja i željene doze. Ovakve formulacije mogu uticati na fizičko stanje, stabilnost, brzinu oslobađanjain vivoi brzinu preuzimanja primenjenog agensain vivo.U zavisnosti od stanja koje se tretira, ovi farmaceutski perparati se mogu formulisati i primanjivati sistemski ili lokalno.

Farmaceutski preparati su formulisani tako da sadrže pogodne farmaceutski prihvatljive nosioce, i mogu opciono sadržavati ekscipijense i dodatne supstance koje olakšavaju preradu aktivnih supstanci u preparate koji se mogu farmaceutski upotrebljavati. Modalitet primene će u opštem smislu određivati prirodu nosioca. Na primer, formuSlacije za parenteralnu primenu mogu sadržati vodene rastvore aktivnih jedinjenja u hidrosolubilnom obliku. Nosioci pogodni za parenteralnu primenu mogu biti izabrani između rastvora soli. sonog pufera, dekstroze, vode i drugih fiziološki kompatibilnih rastvora. Poželjni nosioci za parenteralnu primenu su fiziološki kompatibilni puferi, kao što su Hank-ov rastvor, Ringer-ov rastvor ili fiziološki puferovan rastvor soli. Za primenu na tkiva ili ćelije, penetranti pogodni za konkretnu barijeru koja treba da ih propusti, koriste se u formulaciji. Ovakvi penetranti su generalno poznati u struci. Za preparate koji sadrže proteine, formulacija može uključivati materijale za stabilizaciju, kao što su polioli (npr. saharoza) i/ili surfaktanti (npr. nejonski surfaktanti), i si.

Alternativno, formulacije za parenteralnu primenu mogu sadržati disperzije ili suspenzije aktivnih sastojaka pripremljene u vidu pogodnih uljastih injekcionih suspenzija. Pogodni lipofilni rastvarači ili vehikulumi uključuju masne kiseline, kao što se sezamovo ulje. i sintetičke estre masnih kiselina, kao što su etil-oleat ili trigliceridi, ili lipozome. Vodene injekcione suspenzije mogu sadržati supstance koje povećavaju viskoznost suspenzije, kao što su natrij um karboksimetil-celuloza. sorbitol ili dekstran. Opciono, suspenzija takođe može da sadrži pogodne stabilizatore ili agense koji povećavaju rastvorljivost jedinjenja čime se omogućava priprema visoko koncentrovanih rasvora. Tečni polimeri koji obezbeđuju pH-osetljivu solubilzaciju i/ili kontinuirano oslobađanje aktivnog sastojka, takođe mogu biti korišćeni kao prevlake ili strukture matrice, npr. metakrilni polimeri, kao što su oni iz EUDRAGIT<®>serija koji se mogu nabaviti kod Rohm America Inc. (Piscataway, NJ). Emulzije, npr. ulje-u-vodi i voda-u-ulju disperzije, mogu se takođe koristiti opciono stabilizovane emulzifikujućim agensom ili dispergantom (površinski aktivni materijali; surfaktanti). Suspenzije mogu sadržavati agense za suspendovanje kao što su etoksilovani izostearil alkoholi, estri polioksietilen sorbitola i sorbitana, mikrokristalna celuloza, aluminijum metahidroksid, bentonit, agar-agar, tragantova guma, i njihove smeše.

Lipozomi koji sadrže aktivni sastojak mogu takođe biti upotrebljeni za parenteralnu primenu. Lipozomi se generalno izvode iz fosfolipida i drugih lipidnih supstanci. Preparati u obliku liopzoma mogu takođe sadržati druge sastojke kao što su stabilizatori, konzervansi, ekscipijensi i si. Poželjni lipidi uključuju fosfolipide i fosfatidil holine (lecitine), kako prirodne, tako i sintetičke. Postupci formiranja lipozoma su poznati u struci. Videti, npr., Prescott (Ed.),Methods in Cell Biolog}', Vol. XIV,p. 33, Academic Press, Nevv York (1976).

Farmaceutski preparati koji sadrže agens u dozama pogodnim za oralnu primenu mogu biti formulisani primenom farmaceutski prihvatljivih nosilaca dobro poznatih u struci. Preparati formulisani za oralnu primenu, mogu biti u obliku tableta, pilula, kapsula, kesica, dražeja, bombona, tečnosti, gelova, sirupa, rastvora, eliksira, suspenzija ili praškova. U cilju ilustracije, farmaceutski preparati za oralnu primenu mogu biti dobijeni kombinovanjem aktivnih sastojaka sa čvrstim ekscipijensom, opciono uz mlevenje dobijene smeše i prerade smeše granula, nakon čega se dodaju, po potrebi, odgovarajući dodaci, u cilju dobijanja jezgra tableta ili dražeja. Formulacije za oralnu primenu mogu biti sačinjene pomoću tečnih nosilaca sličnih po tipu onima koji su opisani za parenteralnu primenu, npr. puferovani vodeni rastvori, suspenzije i si.

Poželjne formulacije za oralnu primenu obuhvataju tablete, dražeje i želatinske kapsule. Ovi preparati mogu sadržati jedan ili više ekscipijensa koji obuhvataju, ne ograničavajući se samo na njih: a) razblaživače, kao što su šećeri, uključujući laktozu, dekstrozu, saharozu, manitol ili sorbitol: b) vezivna sredstva, kao što su magnezijum aluminijum silikat, škrob dobijen iz kukuruza, žita, pirinča, krompira, itd. ; c) celulozne materijale, kao što su metilceluloza. hidroksipropilmetil celuloza, natrijum karboksimetilceluloza, polivinilpirolidon, gume, kao što su gumi arabika i tragantova guma, i proteine kao što su želatin i kolagen; d) dezintegrišuća sredstva ili agense za solubilizaciju, kao što su unakrsno povezani polivinil pirolidon, škrobovi, agar, alginska kiselina ili njena so, kao što je natrijum alginat, ili efervescentne smeše; e) podmazivače, kao što su silicijum dioksid, talk, stearinska kiselina ili njena magnezijumova ili kalcijumova so, i polietilen glikol; f) korigense ukusa i zaslađivače; g) sredstva za bojenje ili pigmente, npr. radi identifikacije proizvoda ili karakterizacije kvantiteta (doze) aktivnog sastojka; i h) druge sastojke, kao što su konzervansi, stabilizatori, agensi za nadimanje, afensi za emulzifikaciju, poboljšivači rastvorljivosti, soli za regulaciju osmotskog pritiska i

puferi.

Želatinske kapsule uključuju dvodelne kapsule načinjene od želatina, kao i meke. zapečaćene kapsule načinjene od želatina i prevlake, kao što su glicerol ili sorbitol. Dvodelne kapsule mogu sadržati aktivni sastojak/aktivne sastojke pomešane sa puniocima, vezivnim sredstvima, podmazivačima i/ili stabilizatorima, itd. U mekim kapsulama, aktivni sastojci mogu biti rastvoreni ili suspendovani u pogodnim fluidima, kao što su masne kiseline, tečni parafin, ili tečni polietilen glikol, sa ili bez stabilizatora.

Jezgra dražeja mogu obložena pogodnim oblogama, kao što su koncentrovani rastvori šećera, koji takođe mogu sadržati gumi arabiku, talk, polivinil pirolidon, karbopol gel, polietilen glikol i/ili titanijum dioksid, rastvore laka, i pogodne organske rastvarače ili smeše rastvarača.

Farmaceutski preparati mogu biti pripremeljeni u vodu soli aktivnog sastojka. Soli imaju tendenciju da budu rastvorljivije u vodenom i drugim protonskim rastvaračima, u odnosu na odgovarajuće baze i kiseline. Farmaceutski prihvatljive soli su dobro poznate u struci. Jedinjenja koja sadrže kiselinske ostatke mogu obrazovati farmaceutski prihvatljive soli sa pogodnim katjonima. Pogodni farmaceutski prihvatljivi katjoni uključuju, na primer, katjone alkalnih metala (npr. natrijuma ili kalijuma) i katjone zemnoalkalnih metala (npr. kalcijuma ili magnezijuma).

Jedinjenja strukturne formule (I) koja sadrže bazne ostatke mogu formirati farmaceutski prihvatljive soli, uz dodatak pogodne kiseline. Na primer, Berge et al. detaljno opisuju farmaceutski prihvatljive soliJ Pharm Sci 66:1(1977). Soli mogu biti pripremljenein situu toku finalnog izolovanja i prečišćavanja jedinjenja predmetnog pronalaska, ili posebno, reakcijum slobodne bazne funkcionalne grupe sa odgovarajućom kiselinom.

Reprezentativne soli dobijene dodavanjem kiseline obuhvataju, bez ograničavanja samo na njih, acetate, adipate, alginate, citrate, aspartate, benzoate, benzensulfonate. bisulfate, butirate, kamforate, kamforolsulfonate, diglukonate. glicerofosfate, hemisulfate, heptanoate, heksanoate, tumarate, hidrohloride, hidrobromide, hidrojodide, 2-hidroksietansulfonate (izotionate), laktate, maleate, metansulfonate ili sulfate, nikotinate, 2-naftalensulfonate, oksalate, pamoate, pektinate, persulfate, 3-fenilpropionate, pikrate, pivalate, propionate, sukcinate, tartarate, tiocijanate. fosfate ili hidrogenfosfate, glutamate, bikarbonate, p-toluensulfonate i undekanoate. Primeri kiselina koje se mogu koristiti za dobijanje farmaceutski prihvatljivih soli uključuju, bez ograničavanja samo na njih, takve neorganske kiseline kao što su hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina i fosforna kiselina, i takve organske kiseline kao što su oksalna, maleinska, ćilibarna i limunska kiselina.

U svetlu prethodno rečenog, svako pominjanje jedinjenja predmetnog pronalaska koje se ovde pojavljuje, pojavljuje se s namerom da obuhvati jedinjenja strukturnih formula (I)-(V), kao i njihove farmaceutski prihvatljive soli i solvate, kao i prekursore.

Soli dobijene dodavanjem baza mogu biti pripremljenein situu toku finalnog izolovanja i prečišćavanja jedinjenja predmetnog pronalaska, ili odvojeno reakcijom ostatka koji sadrži karboksilnu kiselinu sa odgovarajućom bazom, kao što su hidroksid. karbonat ih bikarbonat farmaceutski prihvatljivog katjona metala, ili sa amonijakom ili organskim primarnim, sekundarnim ili tercijarnim aminom. Farmaceutski prihvatljive soli koje se dobijaju dodavanjem baze uključuju, ne ograničavajući se samo na njih, soli bazirane na katjonima alkalnih metala ili zemnoalkalnih metala, kao što su litijumove, natrijumove, kalijumove, kalcij umove, magnezijumove i aluminij umove soli i si., i netoksične kvaternerne amonijum i amin katjone, uključujući amonijum, tetrametilamonijum, tetraetilamonijum, metilamonijum, dimetilamonijum, trimetilamonijum, etilamonijum, dietilamonijum, trietilamonijum i si. Drugi reprezentativni organski amini upotrebljivi za dobijanje soli. uključuju etilendiamin, etanol-amin, dietanol-amin. piperidin. piperazin i si.

Bazne grupe koje sadrže azot mogu biti kvaternizovane sa agensima kao što su niži alkil halidi kao što su metil, etil. propil i butil kloridi, bromidi i jodiđi; dialkilsulfati, kao što su dimetil, dietil, dibutil i diamil sulfati; alkil halidi dugog lanca, kao što su decil lauril, miristil i stearil hloridi, bromidi i jodidi; aril-alikl halidi. kao što su benzil i fenetil bromidi; i drugi. Na ovaj način se dobijaju proizvodi izmenjene rastvorljivosti ili disperzibilnosti.

Preparati koji sadrže jedinjenje predmetnog pronalaska formulisani u farmaceutski prihvatljivom nosiocu mogu se pripremiti, smestiti u odgovarajući sud i označiti radi tretmana indikovanog stanja. U skladu sa ovim, takođe se razmatra proizvod kao što je sud koji sadrži doznu formu jedinjenja predmetnog pronalaska i oznaka koja sadrži uputstvo za upotrebu. Predmetnim pronalaskom su takođe obuhvaćeni i kompleti. Na primer, komplet može sadržati dozni oblik farmaceutskog preparata i umetak koji sadrži uputstvo za upotrebu preparata u tretmanu medicinskog stanja. U svakom slučaju, stanja indikovana na oznaci mogu uključivati tretman inflamatornih poremećaja, kancera, itd.

Postupci primene inhibitora aktivnosti PI3KS

Farmaceutski preparati koji sadrže inhibitor aktivnosti PI3K5 se mogu primeniti na bilo koji od uobičajenih načina, uključujući parenteralni i enteralni način primene. U parenteralne načine primene se ubrajaju oni kod kojih se preparat primenjuje putem koji ne podrazumeva primenu kroz gastrointestinalni trakt, gde spadaju npr. intravenske, intraarterijske, intraperitonealne, intramedularne. intramuskularne. intraartikularne. intratekalne i intraventrikularne injekcije. U enteralne načine primene se ubrajaju, na primer, oralna (uključujući bukalnu i sublingvalnu) i rektalna primena. U transepitelijalne načine primene se ubrajaju, na primer, primena preko sluzokože ili preko kože. U primenu preko sluzokože spada primena, na primer, preko sluzokože creva , primena preko sluzokože nosa. zatim primena inhalacijom, duboka plućna primena, vaginalna primena, kao i rektalna primena. Transdermalna primena uključuje aktivne ili pasivne načine primene kroz derm ili primenu preko kože, uključujući, na primer. flastere ili uređaje za jontoforezu, kao i topijsku primenu pasta, melema, ili masti. Parenteralna primena se takođe može sprovesti upotrebom tehnike visokog pritiska, npr. primenom POWDERJECT^ sistema.

Hirirške tehnike primene uključuju implantaciju depo preparata (rezervoara aktivne supstance), osmotskih pumpi, i slično. Poželjni način primene za lečenje zapaljenja može biti lokalna ili topijska primena za poremećaje lokalnog karaktera, kao sto je artritis, ili sistemska primena za rasprostranjene poremećaje, npr. intravenska primena kod reperfuzione povrede ili kod sistemskih stanja kao što je septikemija. Za druga oboljenja, uključujući ona koja rairistil i stearil hloridi, bromidi i jodidi; aril-alikl halidi, kao što su benzil i fenetil bromidi; i drugi. Na ovaj način se dobijaju proizvodi izmenjene rastvorljivosti ili disperzibilnosti.

Postupci primene inhibitora aktivnosti PI3K5

Farmaceutski preparati koji sadrže inhibitor aktivnosti PI3K5 se mogu pnmeniti na bilo koji od uobičajenih načina, uključujući parenteralni i enteralni način primene. U parenteralne načine primene se ubrajaju oni kod kojih se preparat primenjuje putem koji ne podrazumeva primenu kroz gastrointestinalni trakt, gde spadaju npr. intravenske, intraarterijske, intraperitonealne, intramedularne, intramuskularne, intraartikularne, intratekalne i intraventrikularne injekcije. U enteralne načine primene se ubrajaju, na primer, oralna (uključujući bukalnu i sublingvalnu) i rektalna primena. U transepitelijalne načine primene se ubrajaju, na primer, primena preko sluzokože ili preko kože. U primenu preko sluzokože spada primena, na primer, preko sluzokože creva , primena preko sluzokože nosa. zatim primena inhalacijom, duboka plućna primena, vaginalna primena, kao i rektalna primena. Transdermalna primena uključuje aktivne ili pasivne načine primene kroz derm ih primenu preko kože, uključujući, na primer. flastere ili uređaje za jontoforezu. kao i topijsku primenu pasta, melema, ili masti. Parenteralna primena se takođe može sprovesti upotrebom tehnike visokog pritiska, npr. primenom PONVDERJECT<*>sistema.

Hirirške tehnike primene uključuju implantaciju depo preparata (rezervoara aktivne supstance), osmotskih pumpi, i slično. Poželjni način primene za lečenje zapaljenja može biti lokalna ili topijska primena za poremećaje lokalnog karaktera, kao sto je artritis, ili sistemska primena za rasprostranjene poremećaje, npr. intravenska primena kod reperfuzione povrede ili kod sistemskih stanja kao što je septikemija. Za druga oboljenja, uključujući ona koja zahvataju i respiratorni trakt, kao što su npr. hronična opstruktivna bolest pluća, astma i emfizem, primena se može sprovesti inhalacijom ili dubokom plućnom primenom sprejeva, aerosola, praškova i slično.

Za lečenje neoplastičnih bolesti, posebno leukemija i drugih rasprostranjenih tumora, tipično je poželjan parenteralni način primene. Poželjne su formulacije jedinjenja koje će njihovo raspoređivanje u biološkim strukturama nakon parenteralne primene učiniti optimalnim. Jedinjenja koja inhibiraju PI3K6 se mogu primenjivati pre, tokom ili nakon primene hemoterapije, radioterapije i/ili hirurške intervencije.

Štaviše, terapijski indeks jedinjenja koja inhibiraju PI3K5 se može povećati njihovom modifikacijom ili derivacijom za ciljanu isporuku ćelijama tumora koje poseduju određeni, za njih specifičan marker. Na primer, ova jedinjenja mogu da se vežu za antitelo koje prepoznaje marker, koji je selektivan ili specifičan za ćelije tumora, tako da se pomenuta jedinjenja dopremaju u neposrednu blizinu ciljnih ćelija, kako bi ispoljila svoja dejstva lokalno, na način koji je prethodno opisan (vidi, na primer, Pietersz et ah,Immunol Rev,129:57 (1992); Trail et ah,Science,261:212 (1993); i Rowlinson-Buszy et ah,Curr Opin OncoL4:1142 (1992)). Dopremanje ovih jedinjenja koje je usmereno ka tumoru povećava njihovo terapijsko dejstvo, između ostalog, umanjivanjem potencijalnih nespecifičnih toksičnih dejstava koja nastaju nakon radijacione terapije ili hemoterapije. Sa druge strane, jedinjenja koja inhibiraju PI3K5 i radioizotopi ili hemoterapijska sredstva se mogu konjugovati sa istim anti-tumorskim antitelom.

Za lečenje poremećaja resorpcije kostiju ili poremećaja koji su posredovani osteklastima, inhibitori PI3KS se mogu primeniti na bilo koji način koji se oceni kao pogodan. Fokalna primena može biti poželjna, na primer intraartikularnom injekcijom. U nekim slučajevima, može biti poželjno da se jedinjenja prikače na molekul koji može da ih dopremi do kosti. Na primer, inhibitor P13K8 može da se veže za jedinjenje sa izraženim afinitetom za hidroksiapatit, glavni sastojak kosti. Ovo se može postići, na primer, prilagođavanjem postupka za vezivanje tetraciklina, koji je razvijen za ciljano dopremanje estrogena u kost (Orme et ah.Biuorg Med Chem Lm,4(11): 1375-80 (1994)).

Kako bi sredstva koja se koriste u postupcima predmetnog pronalaska bila terapijski efikasna u izmeni ciljnih struktura u centralnom nervnom sistemu, ona moraju lako da prolaze kroz krvno-moždanu barijeru, nakon primene na periferiji. Međutim, i sredstva koja ne mogu da prođu kroz krvno-moždanu barijeru ipak mogu biti efikasna nakon primene intravenskim putem.

Kao što je gore naznačeno, osobine samog sredstva , kao i njegova formulacija, mogu da utiču na njegovo fizičko stanje, stabilnost, brzinu oslobađanjain vivo,i njegovu brzinu uklanjanjain vivo.Pomenute farmakokinetske i farmakodinamske informacije se mogu prikupiti tokom prekliničkihin vitroiin vivoispitivanja, a kasnije mogu da se potvrde tokom kliničkih ispitivanja na ljudima. Stoga, za svako jedinjenje koje se koristi u nekom od postupaka predmetnog pronalaska, terapijski efikasna doza može inicijalno da se proceni na osnovu biohemijskih testova i/ili testova koji se zasnivaju na ispitivanju ćelijskih kultura. Nakon toga, doze se mogu odrediti na animalnim modelima, kako bi se postigao željeni opseg koncentracija supstance u cirkulaciji, koji menja ekspresiju ili aktivnost PI3K8. Sprovođenjem studija na ljudima, dobijaju se dalje informacije o odgovarajućim nivoima doza i trajanju lečenja za različite bolesti i stanja.

Toksičnost i terapijska efikasnost takvih jedinjenja može da se odredi standardnim farmaceutskim postupcima na ćelijskim kulturama ili na eksperimentalnim životinjama, npr. tako se određuju vrednosti LD50(doza koja je smrtonosna za 50% ispitivanih subjekata) i ED50(doza koja pokazuje terapijski efekat kod 50% ispitivanih subjekata). Odnos između toksične i terapijski efikasne doze naziva se »terapijski indeks«, i on se uobičajeno izražava kao odnos LD50/ED50. Poželjna su jedinjenja koja pokazuju široke terapijske indekse, tj. jedinjenja kod kojih je toksična doza značajno viša u odnosu na efektivnu dozu. Podaci koji se dobijaju na osnovu testova na ćelijskim kulturama i dodatnih studija na životinjama mogu da se iskoriste za određivanje opsega doza za upotrebu kod ljudi. Poželjno je da se doze jedinjenja nalaze u opsegu koncentracija u cirkulaciji koje uključuju vrednost ED50uz malu ih nikakvu toksičnost.

U postupcima predmetnog pronalaska, moguće je upotrebiti bilo koji način primene koji reguliše vreme i redosled doziranja. Poželjno je da doze sredstva predmetnog pronalaska uključuju farmaceutske oblike za doziranje koji obuhvataju efektivnu količinu tog sredstva. Pojam »efektivna količina«, koji se ovde navodi, odnosi se na količinu sredstva koja je dovoljna da izmeni ekspresiju PI3K6 ili njenu aktivnost i/ili da izazove merljivu promenu fizioloških parametara ispitivanog subjekta nakon primene jedne ili više farmaceutskih oblika za doziranje pomenutog sredstva.

Eksperimentalni nivoi doza za upotrebu kod ljudski se nalaze u opsegu od oko 0.001 mg aktivne supstance po kilogramu telesne mase (mg/kg), do oko 100 mg/kg. Tipično, jedinice za doziranje aktivnog sastojka sadrže od oko 0,01 mg do oko 10000 mg, poželjno od oko 0.1 mg do oko 1000 mg, što zavisi od indikacije, načina primene itd. U zavisnosti od načina primene, odgovarajuća doza se može izračunati na osnovu telesne mase, površine tela, ili veličine organa. Konačni opseg doza se određuje od strane nadležnog lekara, a na osnovu propisane medicinske prakse, uzimanjem u obzir različitih činilaca koji menjaju dejstvo leka, kao što su npr. specifična aktivnost leka, vrsta i težina bolesti, terapijski odgovor pacijenta, starostna dob, ukupno stanje organizma, telesna masa, pol, način ishrane pacijent, kao i težine neke infekcije. Drugi činioci koji mogu biti uzeti u obzir uključuju vreme i učestalost davanja leka, kombinovanje sa drugim lekovima, reakcije osetljivosti na primenjeni lek, kao i toleranciju/odgovor na primenjenu terapiju. Dalja podešavanja opsega doza tokom lečenja prilikom primene bilo koje od formulacija koje se ovde pominju, rutinski se sprovode od strane stručnjaka, bez izvođenja nepodesnih eksperimenata, posebno na osnovu uvida u informacije o dozama i testovima koje su već izložene, kao i farmakokinetskih podataka zapaženih tokom kliničkih ispitivanja na ljudima. Odgovarajuće doze mogu biti definisane korišćenjem postojećih testova za određivanje koncentracije sredstva u telesnim tečnostima ili nekom drugom uzorku, kao i podataka o dozno zavisnim odgovorima organizma.

Učestalost primene doze će zavisiti od farmakokinetskih parametara sredstva i načina njegove primene. Doziranje i način primene su podešeni tako da obezbede odgovarajuće nivoe aktivne supstance ili da održavaju željeno dejstvo. Shodno tome, farmaceutski preparati mogu da se primenjuju u pojedinačnoj dozi, u višestrukim odvojenim dozama, kontinuiranoj infuziji, u obliku depo preparata sa usporenim oslobađanjem aktivne supstance, ili u vidu kombinacija pomenutih načina doziranja, shodno zahtevu da se održi minimalni željeni nivo sredstva. Farmaceutski preparati kratkog dejstva (tj. preparati kratkog poluživota) mogu da se primenjuju jednom ili više puta dnevno (npr. dva, tri ili četiri puta na dan). Farmaceutski preparati dugog dejstva mogu da se primenjuju na svaka tri ili četiri dana, svake nedelje, ili jednom u dve nedelje. Za kontinuiranu infuziju može biti poželjna upotreba pumpi za infuziju, kao što su pumpe za subkutanu, intraperitonealnu ili subduralnu primenu sredstva.

Primeri koji slede navedeni su radi dalje pomoći u razumevanju predmetnog pronalaska, pri čemu se unapred pretpostavlja poznavanje uobičajenih postupaka, a koji su dobro poznati stručnjacima na koje se ovi primeri i odnose, npr. konstruisanje vektora i plazmida, uvođenje gena koji kodiraju polipeptide u vektore i plazmide, ili uvođenje vektora i plazmida u ćelije-domaćine. Ovi postupci su detaljno opisani u brojnim publikacijama u koje spadaju, na primer, Sambrook et ah,Molecular Cloning; A Laboratory ManuaLCold Spring Harbor Laboratorv Press (1989), Ausubel et ah, (Eds.),Curreni Proloculs in Molecular Biology,John Wiley&Sons, Inc. (1994); i Ausubel et ah, (Eds.),Shorl Protocoh in MolecularBiolog}',4th ed., John Wiley&Sons, Inc. (1999). Posebni materijali i uslovi koji su opisani u tekstu koji sledi imaju cilj da kroz primere pojasne posebne aspekte predmetnog pronalaska i ne bi trebalo da budu protumačeni kao ograničavajući po opseg predmetnog pronalaska.

Primer 1

Pobijanje i prečišćavanje rekombinaatnih PI3Ka, ft i 5

Rekombinantni PI3K heterodimerni kompleksi, koji se sastoje od pl 10 podjedinice i p85 regulatorne podjedinice, prekomerno su eksprimirani korišćenjem BAC-TO-BAC® bakulovirus sistema za ekspresiju (GIBCO/-BRL), a zatim prečišćeni radi upotrebe u biohemijskim testovima. Četiri PI3 kinaze klase I su klonirane u bakulovirusnim vektorima na sledeći način: pl 105: Za FLAG® sistem vezana verzija humanog pl 10 (SEQ ID No:l) (vidi Chantry et ah,J Biol Chem,272:19236-41 (1997)) je subklonirana korišćenjem uobičajenih tehnika rekombinantne DNK naBamW\- Xbalmestu pFastbac HTb vektora za ekspresiju u ćelijama insekata (Life Technologies, Gaithersburg, MD), tako daje klon bio u okviru čitanja His mesta za vezivanje vektora. FLAG<®>sistem je opisan u U.S. patentima br. 4,703,004; 4,782,137; 4,851,341; i 5,011,912, dok su reagensi dobavljeni od proizvođača Eastman Kodak Co. pllOa: Slično postupku koji je korišćen za pl 105, koji je gore opisan, za FLAG^ sistem vezana verzija pllOa (vidi Volinia et ah,Genomics,24 (3):427-477 (1994)) je subkloniranana BamU 1 -Hindlllmestima pFastbac HTb vektora (Life Technologies), tako da je klon bio u okviru čitanja His mesta za vezivanje vektora. pllOp: pl 10p klon (vidi Hu et ah,Mol Cell Biol,13:7677-88 (1993)) je amplifikovan iz humane MARATHON<®>Ready cDNK zbirke slezine (Clontech, Palo Alto CA), prema protokolu koji je dat od strane proizvođača, korišćenjem sleaećih inicijalnih sekvenci (prajmera): 5'inicijalna sekvenca ( prajmer) 3'inicijalna sekvenca ( prajmer)

5' inicijalna sekvenca (prajmer) je konstruisana tako da sadrži FLAG<®>sistem za vezivanje u okviru čitanja sa pl 1 Op sekvencom. Nakon amplifikacije, FLAG€-pl 10(3 sekvenca je subklonirana korišćenjem uobičajenih rekombinantnih tehnika naEcoR\- Not\mestima pFastbac HTa vektora (Life Technologies), tako daje klon bio u okviru čitanja His mesta za vezivanje vektora.

pllOy: pl 10y cDNK (vidi Stovanov et ah,Science,269:690-93 (1995)) je amplifikovana iz humane MARATHON<®>Readv cDNK zbirke slezine (Clontech), prema protokolu koji je dao proizvođač, korišćenjem sledećih inicijalnih sekvenci:

5' inicijalnasekvenca ( prajmer)

3'inicijalna sekvenca ( prajmer)

FLAG<®>sistem za vezivanje je nakon toga prikačen na 5' kraj pl 10y sekvence i podvrgnut je kloniranju naBumHl- Spelmestima pFastbac HTb vektora (Life Technologies), korišćenjem uobičajenih tehnika rekombinantne DNK, sa FLAG<*->pll0y sekvencom u okviru čitanja His mesta za vezivanje vektora.

p85a:BamUl- EcoRlfragment za FLAG<LE>prikačene p85 cDNK (vidi Skolnik et ah,Cell,65:83-89 (1991)) je subkloniran na ita/nHl-EcoRl mestima vektora pFastbac dual (Life Technologies).

Rekombinatni bakulovirusi koji sadrže gore pomenute klonove su proizvedeni korišćenjem protokola koji je predložen od strane proizvođača (Life Technologies). Bakulovirusima koji eksprimiraju za His povezane pllOa, pl 1OB, ili pl 1 OS katalitičke podjedinice i p85 podjedinicu, inficirane su Sf21 ćelije insekta. Da bi se obogatio heterodimerni enzimski kompleks, ćelije su inficirane bakulovirusima koji eksprimira p85 podjedinicu u višku, a zatim je za His povezana pl 10 katalitička podjedinica, koja je kompleksno vezana sa p85, prečišćena na koloni sa afinitetom za nikal. S obzirom da se pll0y ne vezuje sa p85, Sf21 ćelije su inficirane sa rekombinantnim bakulovirusima koji eksprimiraju samo za His povezani pllOy. Alternativno, plOl se može klonirati u bakulovirusu, kako bi omogućio koekspresiju sa pllOy, koji predstavlja poželjni supstrat za vezivanje.

Sedamdeset i dva Časa nakon što su inficirane, Sf21 ćelije (zaprmine 3 litra) su prikupljene i homogenizovane u hipotoničnom puferu (20 mM HEPES-KOH, pH 7,8, 5 mM KC1, kompletni koktel proteaznih inhibitora (Roche Biochemicals, Indianopolis. IN)). korišćenjem Dounce homogenizatora. Homogenati su centrifugirani pri ubrzanju od 1000 G tokom 15 minuta. Supernatanti su dalje centifugirani pri ubrzanju od 10 000 G tokom 20 minuta, nakon čega je sledilo ultracentrifugiranje na 100 000 G. tokom 60 minuta. Solubilna frakcija je odmah zatim postavljena HITRAP* kolonu od 10 ml sa afinitetom za nikal (Pharmacia, Piscataway, NJ), koja je ekvilibrisana sa 50 ml Pufera A (50 mM HEPES-KOH, pH 7,8, 0,5 M NaCl, 10 mM imidazola). Kolona je ekstenzivno isprana sa Puferom A, i eluirana linearnim gradijentom od 10 - 500 mM imidazola. p85 podjedinica je uklonjena iz kolone tokom koraka ispiranja, a samo je heterodimerni enzimski kompleks eluiran na 250 mM imidazola. Podjednake količine frakcija nikla su analizovane elektroforezom na 10% SDS-poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE), obojene bojom SYPRO€ Red (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), i kvantifikovane uređajem STORM<*>Phospholmager (Molecular Dynamics, Sunnyvale. CA). Aktivne frakcije su prikupljene i direktno postavljena na Hi-trap kolonu sa heparinom od 5 ml, preekvilibrisanu Puferom B, koji sadrži 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5. 50 mM NaCl i 2 mM ditiotreitola (DTT). Kolona je isprana sa 50 ml Pufera B i eluirana linearnim gradijentom 0,05-2 M NaCl. Jedinstvena frakcija koja sadrži P13K enzimski kompleks eluirana je sa 0,8 M NaCl. Analiza SDS-poliakrilamidnim gelom je pokazala da prečišćene PI3K enzimske frakcije sadrže kompleks p 110 i p85 podjedinica u stehiometrijskom odnosu 1:1.

Proteinski profil enzimskog kompleksa tokom heparinske hromatografije odgovara aktivnosti lipidne kinaze. Aktivne frakcije su izdvojene i zamrznute u tečnom azotu.

Primer 2

Ispitivanje PI3K5 na velikom broju uzoraka i test selektivnosti

Sprovedeno je ispitivanje hemijskih supstanci obuhvaćenih obimom zaštite predmetnog pronalaska kako bi se identifikovali najpodesniji inhibitori aktivnosti PI3K5. PI3K5 katalizuje transfer fosfata iz y-[<32>P]ATP na PIP2/PS lipozome na D3' poziciji P1P2lipidnom prstenu inozitola. Ova reakcija je zavisna od MgCl2i zaustavlja se u visoko molarnom puferu kalijum fosfata pH vrednosti 8.0. koji sadrži 30 mM EDTA. Tokom ispitivanja, ova reakcija je izvedena u prisustvu ili u odsustvu zaštićenih jedinjenja. Proizvodi reakcije (kao i svi neobeleženi proizvodi) su prebačeni na ploču za filtriranje sa 96 polja, koja su prethodno ovlažena sa PVDF, zatim su filtrirani i isprani kalijum fosfatom visoke molarnosti. U osušena polja je dodato sredstvo za scintilaciju, a zatim je merena inkorporisana radioaktivnost.

Najveći deo operacija tokom izvođenja testa je sproveden korišćenjem BIOMEK* 1000 robotizovanih radnih stanica (Beckman), a sve ploče su očitavane korišćenjem protokola za Wallac scintilacioni brojač tečnosti na pločama.

Napravljene su serije za testiranje sa trostrukom koncentracijom supstrata i enzima i pohranjene su u pločama sa velikim brojem polja (za robotizovane testove) ili u polipropilenskim pločama V-profila sa 96 polja (za manuelne testove). Reagensi su bili stabilni na sobnoj temperaturi tokom najmanje 3 časa.

Trostruka koncentracija supstrata za ispitivanje na velikom broju uzoraka sadrži 0.6 mM Na2ATP, 0,10 mCi/ml y-[32P]ATP (NEN, Pittsburgh, PA) i 6 uM PIP2/PS lipozoma (Avanti Polar Lipids, Inc., Atlanta, GA) u 20 mM HEPES, pH vrednosti od 7,4.

Trostruka koncentracija enzima za ispitivanje na velikom broju uzoraka sadrži 1,8 nM PI3K8, 150 u.g/ml konjskog IgG (korišćenog isključivo u vidu stabilizatora), 15 mM MgCl2i 3 mM DTT u 20 mM HEPES, pH vrednosti od 7,4.

Uzorci (od kojih svaki sadrži skupinu od 22 jedinjenja) iz zbirke jedinjenja zaštićenih obimom zaštite predmetnog pronalaska, spremljeni za ispitivanje na velikom broju uzoraka, i pomešani sa dimetil sulfoksidom (DMSO). razblaženi su redestilovanom vodom do koncentracija od 18,75 u.M ili 37,8 uM, a zatim je po 20 u.1 ovih razblaženja postavljeno u polja polipropilenske ploče sa 96 polja radi testiranja. Negativna inhibitorna kontrola (ili pozitivna enzimska kontrola) je bio DMSO razblažen u vodi, a pozitivne inhibitorne kontrole su sadržavale LY294002 u koncentracijama koje su dovoljne da obezbede inhibiciju od 50% i od 100%.

U porcije od 20 pl razblaženja jedinjenja iz zbirke jedinjenja zaštićenih obimom zaštite predmetnog pronalaska dodato je po 20 u.1 supstrata trostruke koncentracije. Reakcija je započeta dodavanjem 20 u.1 enzima trostruke koncentracije, a smeša je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta. Ovo razblaživanje je uspostavilo konačnu koncentraciju od 200 uM ATP u reakcionoj zapremini. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 150 u.1 pufera (1,0 M kalijum fosfat, pH 8,0, 30 mM EDTA). Deo rastvora (180 pl) u kome je prekinuta reakcija je zatim prebačen na PVDF ploču za filtraciju (Millipore #MAIP NOB prethodno ovlažen sekvencijalnim ispiranjima čistim metanolom, vodom, i konačno 1.0 M kalijum fosfatnim puferom za ispiranje pH vrednosti od 8,0).

PVDF ploča za filtraciju je aspirirana pod vakuumom umerene jačine (2-5 nimHg), isprana 5 puta sa 200 u.1 pufera za ispiranje, a zatim osušena aspiracijom. Nakon toga je natopljeni filter ostavljen da se potpuno osuši na vazduhu i ubačen u VVallac kasetu za brojanje, uz prethodno dodavanje po 50 pl Esoscint koktela za scintilaciju u svako od polja. Inkorporirana radioaktivnost je izmerena, a podaci su analizovani nakon normalizovanja do enzimske pozitivne kontrole (podešene na 100%), kako bi se identifikovala tačka preseka krive pri vrednosti inhibicije od 50%, radi procenjivanja IC,ovrednosti za inhibitore.

Ukupno je 57 glavnih bazenčića izabrano za dekonvoluciju, a na osnovu kombinovanih kriterijuma u koje spadaju: (a) rezidualna aktivnost manja od 42% pri testiranim koncentracijama, kao i (b) ukupni prihvatljiv procenat uspešnosti ne veći od 0,2%. Sa po 22 jedinjenja po bazenčiću, ukupno je identifikovano 1254 jedinjenja tokom pomenute dekonvolucije, koja su zatim pojedinačno testirana pri jednostrukoj koncentraciji od 27 uM. kako bi se otkrilo koja jedinjenja pokazuju željenu aktivnost. Na osnovu ovih testova izabrano je 73 jedinjenja koja su dalje testirana da bi se dobile IC50krivulje. Nakon dobijanja rezultata sa IC50krivulja, izabrano je 34 jedinjenja za testove selektivnosti prema P13Ka i PI3KP (vidi protokol testa u Primeru 11).

Na osnovu testova selektivnosti, jedno jedinjenje. 3-(2-hlorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-kvinazolin-4-on (Jedinjenje D-000), izabrano je zbog relativne jačine dejstva i selektivnosti. Pretragom kataloga i testova selektivnosti mnogih analognih jedinjenja sa sličnom jačinom dejstva iVili selektivnošću, nađeno je samo jedno jedinjenje koje je bilo analog jedinjenju D-000 kako u pogledu aktivnosti, tako i selektivnosti. Ovo jedinjenje je nabavljeno iz kompanije Contract Service Corporation (kataloški br. 7232154), i razlikovalo se od jedinjenja D-000 po tome što je imalo supstituisanu fenil grupu umesto 2-hlorofenil grupe jedinjenja D-000.

Kao što je gore opisano, jedinjenje LY294002 (Calbiochem, La Jolla, CA), koje je inhibitor P13-kinaze, ne poseduje značajnu selektivnost prema različitim testiranim izoformama PI3-kinaze. U uslovima pod kojim se sporvodi test prema predmetnom pronalasku, LY294002 inhibira sve tri izoforme PI3-kinaza sa vrednošću IC50od 0,3 do 1 uM. Međutim, kada je jedinjenj D-000 testirano sa istim izoformama P13-kinazama, primećena je drugačija selektivnost. Specifično, kao što je prikazano na Slici L jedinjenje D-000 je inhibiralo aktivnost 5 izoforme PI3K sa IC50od oko 0,3 uM, dok pod sličnim uslovima nije inhibiralo aktivnosti a i P izoformi pri graničnoj koncentraciji od 100 uM. Ovi rezultati pokazuju da D-000 selektivno inhibira aktivnost PI3K5.

Primeri3- 7

PI3K8 je eksprimirana u značajnim nivoima samo u leukocitima, tako da je važno da se prouče dejstva PI3K5 selektivnog inhibitora na funkcije leukocita. Shodno tome. ispitivane su posledice inhibicije PI3K5 na nekoliko tipova leukocita. Ispitivani su neutrofili. kako bi se odredili efekti koje selektivna inhibicija PI3K6 može da izazove (Primer 3,.naveden u tekstu koji sledi). Iznenađujuće je da je selektivna inhibicija aktivnosti P13K8 izgleda značajno povezana sa inhibicijom nekih, ali ne svih funkcija koje su karakteristične za aktivirane neutrofile. Takođe, dodatno su testirani efekti inhibicije PI3K8 na funkcije B i T ćelija (Primeri 4 i 5, navedeni u tekstu koji sledi). S obzirom daje PI3K5 takođe eksprimirana u osteoklastima, proučneni su efekti inhibicije PI3K5 i na ove specijalizovane ćelije (Primer 6, naveden u tekstu koji sledi).

Primer 3

Određivanje uloge PI3K5 na funkcije neutrofila

Testirani su efekti PI3K8 inhibitora koji je obuhvaćen obimom zaštite predmetnog pronalaska, tj. jedinjenja D-000, na funkcije neutrofila, kao što su stvaranje superoksida, egzocitoza elastaza, hemotaksa i ubijanje bakterija.

A. Pobijanje neutrofila iz humane krvi

Jednake količine (po 8 ml) heparinizirane krvi dobijene od zdravih dobrovoljaca su položene na podlogu (»jastučiće«) za izdvajanje ćelijskih frakcija krvi koja sadrži 7,3% FICOLL® (Sigma, St. Louis, MO) i 15,4% HYPAQUE<®>(Sigma) zapremine 3 ml. i centrifugirane su pri brzini od 900 obrtaja/min, na sobnoj temperaturi, u stonoj centrifugi (Beckman). Pojas bogat neutrofilima neposredno iznad FICOLL<®->HYPAQUE<®>jastučića je sakupljen i ispran Hankovim balansiranim slanim rastvorom (Hank's balanced salt solution - HBSS), koji sadrži 0,1% želatina, zaostali eritrociti su uklonjeni hipotonim liziranjem rastvorom sa 0,2% NaCl. Nakon toga je preparat neutrofila dva puta ispran sa HBSS, koji sadrži 0,1 % želatina, i odmah iskorišćen za dalje analize.

B. Kvantifikovanje stvaranja superoksida od strane neutrofila

Stvaranje superoksida je jedna od osnovnih karakteristika aktivacije neutrofila. Brojni aktivatori pospešuju stvaranje superoksida od strane neutrofila. Meren je efekat jedinjenja D-000, kao inhibitora PI3K8, na stvaranje superoksida od neutrofila stimulisanih agonistima koji pripadaju različitim klasama neutrofilnih agonista- TNFla, IgG i fMLP. Superoksid koji se oslobađa iz aktiviranih neutrofila je kvantifikovan praćenjem promene absorbancije pri redukciji citohroma C, modifikovanim postupkom koji su opisali Green et al., (pp. 14.5.1-14.5.11 u Supp. 12,Curr Prolocols lmmunol(Eds., Colligan et al.) (1994)), kao što sledi. Svako od polja ploče sa 96 polja je obloženo sa 50 u.1 rastvora humanog fibrinogena ili rastvora humanog IgG koncentracije 2 mg/ml, pa je ploča ostavljena tokom noći na temperaturi od 4°C. Polja su zatim isprana sa PBS, a zatim su u svako od polja dodati sledeći reagensi: 50 p.1 HBSS ili superoksid-dismutaže (koncentracije 1 mg/ml), 50 p.1 HBSS ili TNFla (koncentracije 50 ng/ml), 50 pl citohroma C (koncentracije 2,7 mg/ml) i 100 ul prečišćene suspenzije humanih neutrofila (koncentracije 2 x IO<6>ćelija/ml). Ploča je centrifugirana tokom 2 časa pri brzini od 200 obrtaja/min, a absorbancija na 550 nm je praćena tokom 2 časa. Kako bi se izmerile relativne količine stvorenog superoksida, vrednosti koje su dobijene očitavanjem sa polja koja sadrže superoksid-dismutazu su oduzete od ukupne vrednosti, a zatim normalizovane do vrednosti koje su dobijene očitavanjem sa polja bez inhibitora.

kao što je prikazano na Slici 2, D-000 inhibitor PI3KS je inhibirao stvaranje superoksida od strane neutrofila, koje je bilo indukovano sa TNF, na način koji je zavisan od koncentracije. Stvaranje superoksida indukovano sa TNF je smanjeno na polovinu maksimalne vrednosti ovako indukovog stvaranja pri koncentraciji jedinjenja D-000 od oko 3 uM. Slika 2 takođe pokazuje da stvaranje superoksida indukovano sa IgG nije značajnije inhibirano jedinjenjem D-000. U stvari, čak ni kada je jedinjenje D-000 primenjeno u koncentraciji od 10 uM, ovaj inhibitor PI3K5 nije pokazao bikakav efekat na stvaranje superoksida koje je indukovano sa IgG.

Kao sledeći korak, proučavano je dejstvo jedinjenja D-000 na stvaranje superoksida koje je indukovano drugim moćnim induktorom, bakterijskim peptidom, formilom obrađenim peptidom Met-Leu-Phe (fMLP). Slično kao i kod stvaranja superoksida koje je indukovano sa TNF, stvaranje superoksida indukovano sa fMLP je takođe bilo inhibirano jedinjenjem D-000 (Slika 3). Ovi rezultati pokazuju da inhibitor PI3K5, jedinjenje D-000, može da spreči indukciju stvarnja superoksida od strane neutrofila koji su izloženi dejstvu specifičnog induktora, što ukazuje daje PI3K6 uključena u proces stvaranja superoksida.

C. Kvantifikovanje egzocitoze elastaze iz neutrofila

Kao dodatak stvaranju superoksida, aktivirani neutrofili takođe reaguju oslobađanjem nekoliko proteaza koje su odgovorne za razaranje tkiva i hrskavice tokom zapaljenske reakcije. Kao pokazatelj otpuštanja proteaza, meren je efekat jedinjenja D-000 na egzocitozu elastaze. Egzocitoza elastaze je kvantifikovana modifikovanim postupkom koji su opisali Ossanna et. al., (J.Clin Invest,77:1939-1951 (1986)), kao što sledi. Prečišćeni humani neutrofili (0,2 x IO<6>) (tretirani ili sa DMSO il serijom razblaženja jedinjenja D-000 u DMSO) su stimulisani sa fMLP u PBS, koji sadrži 0,01 mg/ml citohalazina B, 1,0 uM natrijum azida (NaN3), 5 ug/ml L-metionina, kao i 1 pM fMLP, tokom 90 minuta, na temperaturi od 37 °C. u poljima ploče od 96 polja. Nakon završetka inkubacionog perioda ploča je centrifugirana tokom 5 minuta pri brzini od 1000 obrtaja/min, a 90 ul supernatanta je prebačeno i pomešano sa rastvorom peptidnog supstrata za elastazu, MeO-suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA, u koncentraciji od 10 mM, pri čemu je MeO-suc oznaka za metoksi-sukcinil, a pNA oznaka za p-nitroanilid (Calbiochem, San Diego, CA). Praćena je absorbancija na 410 nm tokom 2 časau čitaču za ploče sa 96 polja, kako bi se odredila relativne količine elastaze koja je oslobođena egzocitozom, sve vrednosti absorbancije su normalizovane na vrednosti bez inhibitora. kao što je prikazano na Slici 4, D-000 inhibitor PI3KS značajno inhibira egzocitozu elastaze indukovanu sa fMLP, i to na dozno zavisan način. Inhibicija je dostigla polovinu maksimalne vrednosti pri koncentraciji D-000 od oko 2-3 uM.

D. Kvantifikovanje migracije humanih neutrofila stimulisane sa fMLP

Neutrofili poseduju sebi svojstvenu sposobnost da migruiraju kroz tkiva, i predstavljaju prve ćelije koje stižu na mesta na kojima je započela zapaljenska reakcija, ili na kojim je došlo do oštećenja tkiva. Kvantifikovan je efekat jedinjenja D-000 na migraciju neutrofila prema koncentracionom gradijentu fMLP. Dan pre sprovođenja testova migracije, ploče sa 6 polja su obložene rekombinantnim 1CAM-1/Fc proteinom za fuziju (Van der Vieren et ah,lmmunity,3:683-690 (1995)) (koncentracije 25 ug/ml u bikarbonatnom puferu, pH 9,3), i ostavljene su preko noći na temperaturi od 4 °C. Nakon ispiranja, u polja sa ili bez inhibitora dodat je 1% rastvor agaroze u RPM1-1640 sa 0,5% goveđeg serumskog albumina (Bovine Serum Albumine-BSA), pa su ploče ostavljene u frižideru, nakon čega su napravljene rupe u gelatinizovanoj agarozi, kako bi nastali kalupi (1 centralna rupa okružena sa 6 perifernih, i tako u svakom od polja na ploči).

Humani neutrofili, koji su dobijeni na gore opisani način, u koncentraciji od 5 x 106 ćelija/ml, resuspendovani su u RPMI medijumu sa dodatkom 0,5% BSA. Nakon mešanja jednakih zapremina suspenzije neutrofila i medijuma (bilo sa DMSO ili serijskim razblaženjem testiranog jedinjenja u DMSO), jednake količine neutrofila su postavljene u periferne rupe, dok je u centralnu rupu na svakom od polja ploče dodat fMLP (koncentracije od 5 u.M). Ploče su inkubirane na temperaturi od 37 °C u prisustvu 5% CO2tokom 4 časa, nakon čega je migracija prekinuta dodavanjem 1% rastvora glutaraldehida u D-PBS. Nakon uklanjanja agaroznog sloja, polja ploče su isprana destilovanom vodom i osušena.

Analiza migracije neutrofila je sprovedena korišćenje Nikon DIAPHOT<®>inverznog mikroskopa (lx objektiv) sa video radnom stanicom, korišćenjem NIH 1.61 programa. Korišćenjem Microsoft Excel i Table Curve 4 (SSPS Inc., Chicago, IL) programa, dobijen je indeks migracije za svaki od proučavanih stanja. Indeks migracije se definiše kao površina ispod krive, koja predstavlja broj neutrofila koji su migrirali u odnosu na net distancu migracije po ćeliji.

Kao što je prikazano na Slici 5, D-000 inhibitor PI3K5 je pokazao suštinski uticaj na migraciju neutrofila, inhibirajući ovu njihovu aktivnost na dozno zavisan način. Vrednost EC50ovog jedinjenja za inhibiciju migracije neutrofila u ovom testu je iznosila oko 1 u.M. Na osnovu vizuelne analize zabeleženih putanja ćelija u ovom testu, izgleda da ukupna dužina putanje neutrofila nije značajnije izmenjena uticajem testiranog jedinjenja. Međutim, jedinjenje je uticalo na orijentaciju neutrofila ili na njihov osećaj za pravac, tako da umesto migriranja duž ose koncentracionog gradijenta, ćelije su migrirale duž proizvoljnih pravaca ili na manje usmeren način.

E. Kvantifikovanje baktericidnog kapaciteta neutrofila

Na osnovu detaljnih gore navedenih podataka da jedinjenje D-000 inhibira PI3K5 i tako utiče na određene funkcije neutrofila, bilo je od interesa da se vidi da li jedinjenje utiče i na ubijanje bakterija koje je posredovano neutrofilima. Efekat jedinjenja D-000 na neutrofilima posredovano ubijanje bakterijaStaphylococcus aureusproučavano je prema postupku koji su opisali Clark i Nauseef (pp. 7.23.4 - 7.23.6 u Vol. 2, Supp. 6,Curr Proiucols Jmmunol(Eds., Colligan et ah,) (1994)). Prečišćeni humani neutrofili (koncentracije 5 x 106 ćelija/ml) (tretirani ili sa DMSO ili serijskim razblaženjima jedinjenja D-000 u DMSO) su pomešani sa autologim serumom. ĆelijeS. aureuskoje su izrasle preko noći su isprane, resuspendovane u HBSS, i dodate serumom opsonizovanim neutrofilima u odnosu 10:1. Dopušteno je da neutrofili internalizuju bakterije fagocitozom, za vreme inkubacije na temperaturi od 37 °C, tokom 20 minuta. Bakterije koje nisu intemalizovane su pobijene sa 10 jedinica/ml lizostafma (lisostaphin), na temperaturi od 37 °C, tokom 5 minuta, pa je ceiokupna smeša mešana na temperaturi od 37 °C. Uzorci su izvlačeni u različita vremena do ukupno proteklog vremena od 90 minuta, a neutrofili su lizirani razblaživanjem u vodi. Vijabilne bakterije su brojane zasejavanjem odgovarajućih razblaženja na triotikaza-soja-agar podlogu, pa su posle rasta preko noći brojane 5.aureuskolonije.

kao što je prikazano na Slici 6, ubijanjeS. aureusbakterija je bilo slično u uzorcima tretiranim sa DMSO (kontrola) i sa D-000. Ovi rezultati ukazuju da inhibitor aktivnosti P13K5 ne utiče značajno na sposobnost neutrofila da ubijaju bakterijeS. aureus,što sugeriše da PI3K8 nije uključena u sprovođenje ove funkcije neutrofila.

Primer 4

Karakterizacija uticaja PI3K5 na funkciju B limfocita

Takođe su proučavana dejstva inhibitora PI3-kinaze na funkcije B ćelija, uključujući klasične indikatore, kao što su proizvodnja antitela i specifičnim stimulusima indukovana proliferacija.

A. Pobijanje i stimulacija B ćelija iz periferne humane krvi

Heparinizirana krv (200 ml), uzeta od tdravih dobrovoljaca, je pomešana sa jednakom zapreminom D-PBS, i nasuta na sloj od 10 x 10 ml FICOLL-PAQUE<®>rastvora(Pharmacia), i centrifugirana je pri brzini od 1600 obrtaja/min, tokom 30 minuta, na sobnoj temperaturi. Mononuklearne ćelije iz periferne krvi (Peripheral blood mononuclear cells - PBMC) su prikupljene sa spoja seruma i FICOLL^ rastvora, a zatim su nasute preko 10 ml fetalnog goveđeg seruma (Fetal Bovine Serum - FBS), i centrifugirane pri brzini, od 800 obrtaja/min, tokom 10 minuta, kako bi se odstranili trombociti. Nakon ispiranja, ćelije su inkubirane sa DYNAL<*>Smešom antitela (B ćelijski kit) (Dynal Corp., Lake Success, NY), tokom 20 minuta, na temperaturi od 4-8 °C. Nakon uklanjanja nevezanih antitela, PBL su pomešani anti-mišijim IgG antitelima obloženim magnetnim kuglicama (Dvnal), tokom 20 minuta, na temperaturi od 4-8 °C, uz blago mućkanje, a zatim je usledila eliminacija obeleženih non-B ćelija na separatoru magnetnih kuglica. Ceo postupak je još jednom ponovljen. B ćelije su resuspendovane u RPMI-1640 sa 10% FBS, i držane su na ledu do naredne upotrebe.

B. Kvantifikovanje proizvodnje antitela od strane humanih B ćelija

Da bi se proučila proizvodnja antitela. B ćelije su postavljene u polja ploče od 96 polja u jednakim količinama od 50-75 x 10<J>ćelija/polju, sa ili bez inhibitora, a u svako od polja su dodati još IL-2 (100 jedinica/ml) i PANSORBIN<®>(Calbiochem) ćelijeStaphylococcus aureus- a(1:90000). Deo medijuma je uklonjen nakon 24-36 časova, pa je svež medijum (sa ili bez inhibitora) i sa IL-2 ponovo dodat. Kulture su ostavljene u inkubatoru sa CO2na temperaturi od 37 °C, tokom 7 dana. Uzorci za svako od stanja (u triplikatu) su potom uklonjeni, i anaiizovani na IgG i IgM, primenom ELISA testa. Ukratko, četiri IMMULON<T<f>' ploče sa 96 polja su obložene (50 ul po polju) ili sa 150ng/ml magarećeg antihumanog IgG antitela (H+L)(Jackson ImmunoResearch. West Grove, PA), ili sa 2 u.g/ml magarećih antihumanih IgG+IgM antitela (H+L)(Jackson ImmunoResearch) u bikarbonatnom puferu, i ostavljene su preko noći, na temperaturi od 4 °C. Nakon trostrukog ispiranja sa slanim rastvorom fosfatnog pufera, koji sadrži 0,1% TWEEN®-80 (PBST) (350 uJ po polju), i blokiranjem sa 3% kozijeg seruma u PBST (100 ul po polju), tokom jednog časa, na sobnoj temperaturi, dodati su uzorci (100 pl po polju) medijuma u kome su bile B ćelije, razblaženog sa PBST. Za ploče sa IgG antitelima, opseg razblaženja se kretao od 1:500 do 1:10000, a za IgM antitela od 1:50 do 1:1000. Nakon jednog časa, ploče su izložene antihumanim IgG antitelima konjugovanim sa biotinom (100 ng/ml) ili antihumanim IgM antitelima (200 ng/ml) (Jackson ImmunoResearch), tokom 30 minuta, zatim streptavidin-HRP (1:20000) tokom 30 minuta, i konačno rastvoru TMB (1:100) sa H202(1:10000) tokom 5 minuta, uz trostruko ispiranje sa PBST između svakog od navedenih koraka. Razvoj obojenja je zaustavljen rastvorom H2S04, a ploče su očitane na čitaču za ELISA test za ploče.

Kao što je prikazano na Slici 7, D-000 značajno inhibira proizvodnju antitela. Na proizvodnju IgM antitela uticaj je veći nego na proizvodnju IgG antitela: postizanje polovine maksimalne inhibicije proizvodnje IgM antitela je primećeno pri koncentraciji jedinjenja D-000 od oko 1 p.M, u odnosu na koncentraciju od oko 7 u.M D-000 koja je potrebna za postizanje polovine maksimalne inhibicije proizvodnje IgG antitela.

C.Kvantifikovanje proliferacije B ćelija nakon stimulacije IgM antitelananjihovoj

površini

U gore pomenutom eksperimentu, B ćelije su stimulisane korišćenjem PANSORBIN®-a. Takođe je meren efekat D-000 na proliferaciju B ćelija, koja je stimulisana korišćenjem anti-IgM antitela specifičnih za IgM antitela na površini ovih ćelija. U bazenčiće ploče za mikrotitraciju sa 96 bazenčića, postavljeni su ćelije mišije slezine (Balb/c), u količini od 2 x IO<5>ćelija po polju, koje su potopljene u 10% rastvor FBS/RPMI. Odgovarajuća razblaženja testiranog inhibitora u gotovom medijumu su dodata ćelijama, a ploče su inkubirane tokom 30 - 60 minuta, neposredno pre dodavanja stimulatora. Nakon preinkubacije sa testiranim inhibitorom, u polja ploče je dodat F(ab')2preparat kozijih antitela specifičnih za u-lanac mišijih IgM antitela, u konačnoj koncentraciji od 25 ug/ml. Ploče su inkubirane na temperaturi od 37 °C, tokom 3 dana, a zatim je dodat po 1 pCi [<3>H]-timidina u svako od polja, tokom završna četiri časa kultivacije. Sadržaj ploče je potom filtriran kroz vlaknaste filtere, ispran, pa je zatim određena inkorporacija radioaktivnog markera korišćenjem beta brojača (Matrix 96, Packard Instruments Co., Dovvners Grove, IL), izražena kao otkucaji u minuti (counts per minute -CPM).

Slika 8 prikazuje efekat D-000 na proliferaciju B ćelija stimulisanu anti-IgM antitelima. Predmetno jendinjenje je inhibiralo anti-IgM antitelima stimulisanu proliferaciju B ćelija na dozno zavisan način. Pri koncentraciji predmetnog jedinjenja od oko 1 uM, proliferacija je umanjena na polovinu maksimalne vrednosti.

Na osnovu činjenice da je jedinjenje D-000 inhibiralo proliferaciju B ćelija, predviđeno je da bi ovo jedinjenje, kao i drugi inhibitori PI3K8, mogli da budu iskorišćeni za supreiju nepoželjne proliferacije B ćelija u kliničkim situacijama. Na primer, kod B ćelijskih malignih bolesti, B ćelije različitih stdijuma diferenciranosti ispoljavaju neregulisanu proliferaciju. Na osnovu gore prikazanih rezultata, može se izvesti zaključak da bi selektivni inhibitori PI3K8 mogli da budu iskorišćeni da kontrolišu. ograniče, ili inhibiraju rast takvih ćelija.

Primer 5

Određivanje uticaja PI3K5 na funkciju T ćelija

Kvantifikovana je proliferacija T ćelija, nakon kostimulacije markera CD3 i CD28. Negativnom selekcijom, korišćenjem antitelima obloženih magnetnih perli, a na osnovu protokola koji je dao proizvođač (Dynal), prečišćene su T ćelije iz periferne krvi zdravih dobrovoljaca, a zatim resuspendovane u RPMI. Ćelije su tretirane bilo sa DMSO, ili serijskim razblaženjima D-000 u DMSO, a zatim su postavljene u polja ploče od 96 polja, u koncentraciji od 1 x IO<5>ćelija po polju, pri čemu su polja prethodno obložena kozijim anti-mišijim IgG antitelima. Nakon toga su u svako od polja dodata mišija monoklonska anti-CD3 i anti-CD28 antitela, u koncentracijama od 0,2 ng/ml i 0,2 u-g/ml, respektivno. Ploča je inkubirana na temperaturi od 37 °C, tokom 24 časa, a zatim je dodat [<3>H]-timidin (u količini od 1 pCi po polju). Nakon dodatnih 18 časova inkubacije, ćelije su sakupljene automatskim sakupljačem ćelija, isprane, a zatim je izmerena inkorporirana radioaktivnost.

Iako jedinjenje D-000, koje je selektivni inhibitor PI3K6, inhibira proliferaciju T ćelija stimulisanu anti-CD3 i anti-CD 28 antitelima, taj efekat nije tako snažan kao efekat koji D-000 ispoljava na B ćelije ili na neke funkcije neutrofila. Polovina maksimalne inhibicije inkorporacije timidina nije postignuta ni pri najvećim testiranim koncentracijama D-000, tj. pri koncentraciji od 10 pM.

Primer 6

Određivanje uticaja PI3KS na funkciju osteoklasta

Kako bi se analizovao efekat PI3K6 inhibitora D-000 na osteoklaste, ćelije koštane srži miša su izolovane, a zatim je stimulisana njihova diferencijacija do osteoklasta, trodnevnim tretiranjem ćelija sa faktorom stimulacije rasta kolonija makrofaga-1 (Macrophage Colony Stimulating factor-1 -mCSF-1) i Osteoprotegerin ligandom (OPGL), u medijumu koji sadrži serum (aMEM sa 10% toplotom inaktivisanim FBS; Sigma). Četvrtog dana, kada su se razvili osteoklasti. medijum je uklonjen, a ćelije su prikupljene. Osteoklasti su zatim postavljeni u polja ploče za mikrotitraciju, u koncentraciji od 10^ ćelija po polju, u kojoj je prethodno stavljen u vidu ploča sečeni dentin. u medijumu za rast ćelijskih kultura, tj. u aMEM koji sadrži 1% serum i 2% BSA sa 55 ug/ml OPGL i 10 ng/ml mCSF-1. Nakon tri časa, medijum je promenjen - stavljen je 1% serum i i 1% BSA, sa ili bez osteopontina (25 pg/ml) i PI3K inhibitori (100 nM). Medijum je menjan savakih 24 časova, uz dodavanje svežeg osteopontina i inhibitora. Nakon 72 časa, medijum je uklonjen, površine dentinskih ploča su isprane vodom, kako bi se uklonili ćelijski ostaci, a zatim su obojene kiselim hematoksilinom. Boja u višku je isprana dubina udubljenja u dentinskim pločama je merena korišćenjem konfokalne mikroskopije.

Kao što je prikazano u Tabeli 1, u dva eksperimenta, inhibitori PI3-kinaze su pokazali inhibitorni efekat na funkciju osteoklasta. Takođe, i nespecifični inhibitori PI3-kinaze, i to kako LY294002 i vvortmannin, pokazali su inhibitornu aktivnost na osteoklastima. Međutim, inhibitor PI3K5, jedinjenje D-000, je pokazalo najznačajniji efekat, što govori činjenica da je pri koncentraciji od čak 100 nM, ovo jedinjenje skoro u potpunosti inhibiralo osteoklastnu aktivnost.

Primer 7

Određivanje uticaja PI3K5 na funkciju bazofila

Procenjivanje efekta jedinjenja predmetnog pronalaska na funkciju bazofila testirano je korišćenjem konvencionalnih testova otpuštanja histamina, uopšteno u skladu sa postupkom opisanim od strane Miura et ah.J Immunol,162:4198-206 (1999). Ukratko, obogaćeni bazofili su preinkubirani sa test jedinjenjima u različitim koncentracijama, u opsegu od 0,1 nM do 1000 nM. tokom 10 minuta, pri temperaturi od 37 °C. Nakon toga je dodat poliklonski koziji antihumani IgE (0.1 pg/ml) ili fMLP, pa je inkubacija nastavljena tokom dodatnih 30 minuta. Kvantifikovan je histamin koji je otpušten u supernatant. korišćenjem tehnike automatizovane fluorometrije. Testirana su dva jedinjenja, koja su dole prikazana.

Kada su bazofili stimulisani anti-IgE antitelom, primećeno je dozno zavisno smanjenje u otpuštanju histamina nakon primene 3-(2-hlorofenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-kvinazolin-4-ona (D026). Ova supresija u otpuštanju histamina je praktično bila 100% pri koncentraciji od 1000 nM, sa EC50vredošću od oko 25 nM. Drugo jedinjenje, 3-(2-hlorofenil)-2-(lH-pirazolo[3,4-d]pirinndin-4-ilsu]fanilmetil)-3H-kvinazolin-4-on (D-999), kod koga je struktura purinskog prstena izmenjena, pokazalo je manju efikasnost u inhibiciji otpuštanja histamina. Ni jedno od pomenutih jedinjenja nije pokazalo nikakav efekat kada su bazofili stimulisani sa fMLP. Poređenja radi, LY294002, koji je neselektivni inhibitor P13K, testiranje pri koncentracijama od 0,1 nM i 10000 nM, i pokazao je skoro 100% inhibiciju otpuštanja histamina, pri najvećoj primenjenoj koncentraciji.

Ovi podaci ukazuju da inhibitori aktivnosti PI3KS mogu da budu korišćeni za supresiju otpuštanja histamina, koji je jedan od medijatora alergije. S obzirom daje aktivnost različitih PI3-kinaza potrebna za transport proteina, sekreciju i egzocitozu kod mnogih vrsta ćelija, gore navedeni podaci sugerišu da otpuštanje histamina od strane drugih ćelija, kao što su npr. mastociti, takođe može da bude narušeno primenom selektivnih inhibitora P13K6.

PRIMERI HEMIJSKE SINTEZE

Specifični primeri jedinjenja predmetnog pronalaska, koji ni na koji način nisu ograničavajući, opisani su u tekstu koji sledi. U struci je poznato da se zaštitne grupe mogu koristiti tamo gde je to potrebno, shodno opštim principima sintetičke hernije. Ove zaštitne grupe se uklanjaju u završnim koracima sinteze, u baznim, kiselim ili hidrogenolitičkim uslovima, što je opšte poznato stručnjacima. Korišćenjem odgovarajućih postupaka i zaštite bilo koje hemijske funkcionalne grupe, mogu se sintetisati jedinjenja strukturne formule (I), koja ovde nisu posebno naznačena, primenom postupaka analogno šemama koje su predstavljene u tekstu koji sledi.

Ukoliko nije drugačije navedeno, sce početne sirovine su nabavljene od komercijalnih snabdevača, bez dodatnog prečišćavanja. Sve reakcije, kao i hromatografske frakcije su analizovane hromatograftjom na tankom sloju (thin layer chromatograph) - TLC), na pločama silika gela od 250 mm, uz vizuelizaciju ultravioletnom (UV) svetlošću ili jodne (I2) boje. Proizvodi i intermedijeri su prečišćavani hromatografijom za rektifikaciju lakih frakcija ili tečnom hromatografijom visoke performanse reverzne faze.

U primerima sinteze korišćene su sledeće skraćenice: aq (vodeni), H20 (voda), CHCh, (hloroform), HC1 (hlorovodonična kiselina). MeOH (metanol), NaOH (natrijum hidroksid). NaOMe (natrijum metoksid), TFA (trifluorosirćetna kiselina), K2CO;, (kalijum karbonat). SOCI2(tionil hlorid), CH2CI2(metilen hlorid), EtOAc (etil acetat), DMF (dimetilformamid), EtOH (etanol), DMSO (dimetilsulfoksid), NaHC03 (natrijum bikarbonat), TLC (liromatografija na tankom sloju), HPLC (tečna hromatografija visoke performanse). HOBT (hidroksibenzotriazol), EDC (etil-dietil-aminopropil-karbodiimid), DIEA(di-izopropiletilamin) i HOAc (sirćetna kiselina).

I. Opšti postupci

Postupak A

Rastvoru antranilne kiseline koji se brzo meša, ili benzojevoj kiselini u benzenu, dodat je tionil hlorid, a sameša je zatim mešana na temperaturi refluktovanja tokom 5-18 časova. Reakciona smeša je koncentrovana u vakuumu, i dva puta isprana benzenom. Dobijeno ulje je rastvoreno u CHCI3, pa je u tako nastali rastvor dodata odgovarajuća količina anilina. Reakciona smeša je zagrejana do temperature refluktovanja, i mešana sve do okončanja reakcije, Što je utvrđeno primenom TLC, nakon čega je ohlađena do sobne temperature. Talog je uklonjen filtracijom, a filtrat je koncentrovan u vakuumu. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom i/ili rekristalizacijom iz MeOH. kako bi se dobili amidi la-lr.

Postupak B

U brzo mešanu suspenziju amida u glacijalnoj sirćetnoj kiselini, dodat je hloroacetil hlorid. Reakciona smeša je zagrejana do temperature od 120 °C, na kojoj je mešana do okončanja, što je utvrđeno primenom TLC. Nakon brzog hlađenja, reakciona smeša je koncentrovana u vakuumu. Sirovi ostatak je prečišćen ekstrakcijom, hromatografijom i/ili rekristalizacijom, kako bi se dobili hlorodo 2a-2r.

Postupak C

Na sobnoj temperaturi, tokom 15-72 časova, mešana je smeša hlorida, nukleofila bilo za azot ili za sumpor, npr. merkaptopurin-monohidrata ili adenina, i K2CO3u DMF. Nastala suspenzija je pomešana sa vodom, i držana na temperaturi od 4 °C tokom nekoliko časova. Sirova Čvrsta tečnost je filtrirana, isprana vodom i prečišćena hromatografijom ili rekristalizacijom, kako bi se dobili krajnji proizvodi.

Primer8

Pobijanje intermedijernih jedinjenja: amidi

2-Amino-N-(2-hlorofenil)-4,5-dimetoksibenzamid (1 a)

Dobijen prema Postupku A, korišćenjem 4,5-dimetoksiantranilne kiseline (5,0 g, 25.4 mmol) i SOCl2(5,5 ml, 76,1 mmol) u benzenu (100 ml), a nakon toga i 2-hloroanilina (6,7 ml, 63,5 mmol) i CHCI3(75 ml). Proizvod je ispran sa vodenim rastvorom NaHC03(2 x 25 ml) i HC1 (0,5 M, 75 ml), a zatim prečišćen hromatografijom u CH2C12, kako bi se dobilo 4,3 g braon pene (55%).<]>H NMR (CDCla) 5 : 8.42 (dd, J = 1.5, 8.3 Hz, IH); 8.32 (br s, IH); 7.40 (dd, J = 1.4, 8.0 Hz, IH); 7.31 (dt, J = 1.4. 7.9 Hz, IH); 7.05 (dt, J = 1.5, 7.7 Hz, IH); 7.03 (s, IH); 6.24 (s, IH); 3.88 (s, 3H); 3.87 (s, 3H). MS (ES): m/z 307.0 (M+).

2-Amino-5-bromo-N-(2-hlorofeniI)benzamid (1 b)

Dobijen prema Postupku A, korišćenjem 2-amino-5-bromobenzojeve kiseline (5,0 g. 23,1 mmol) i SOCl2(7,0 ml, 95,9 mmol) u benzenu (50 ml), a nakon toga i 2-hloroanilina (7,3 ml, 69,3 mmol) i CHCI3(50 ml). Proizvod je prečišćen dvostrukom hromatografijom u CH2C12, kako bi se dobilo 1,48 g žuto-narandžaste čvrste supstance (20%).<!>H NMR (CDC13) 6 : 8.36 (dd, J = 1.2, 8.2 Hz, IH); 8.20 (br s, IH); 7.62 (d, J = 2.1 Hz, IH); 7.42 (dd, J = 1.3. 8.0 Hz, IH); 7.34 (dd, J = 2.2, 8.8 Hz, IH); 7.28-7.33 (m, IH); 7.09 (dt, .1 = 1.4, 7.7 Hz. IH); 6.62 (d, J = 8.7 Hz, IH); 5.57 (br s, 2H).

2-Amino-N-(2-hlorofenil)-4-fluorobenzamid (lc)

Dobijen prema Postupku A. korišćenjem 2-amino-4-fJuorobenzojeve kiseline (1,15 g. 7.41 mmol) i S0C12 (1,4 ml, 18,5 mmol) u benzenu (25 ml), a nakon toga i 2-hloroanilina (1.6 ml, 14,8 mmol) i CHCI3(25 ml). Proizvod je prečišćen hromatografijom u CH2C12, a zatim sprašivanjem iz heksana, kako bi se dobilo 1,02 g sivkasto-žućkaste čvrste supstance (52%).

'H NMR (CDCI3) 6: 12.91 (br s, IH); 8.72 (dd, J = 2.7, 12 Hz, IH); 8.34 (dd, J = 6.4, 9.2 Hz, IH); 8.29 (dd, J = 5.9, 8.8 Hz, IH); 7.81 (dd, .1 = 6.2. 8.8 Hz, IH); 7.28 (dt, J = 2.4, 8.4 Hz.

IH); 7.21 (dd, J = 2.4, 9.0 Hz, IH); 6.92 (ddd, J = 2.4, 7.3, 9.1 Hz, IH); 6.54 (ddd, .1 = 2.4. 7.8, 8.8 Hz, IH); 6.45 (dd, J = 2.4, 11 Hz, IH); 5.93 (br s, 2H). MS (ES): m/z 265.0 (M+).

2-Amino-5-hIoro-N-(2-hlorofenil)benzamid (ld)

Dobijen prema Postupku A, korišćenjem 2-amino-5-hlorobenzojeve kiseline (2,0 g, 11.7 mmol) i SOCl?(2,2 ml, 29,2 mmol) u benzenu (50 ml), a nakon toga i 2-hloroanilina (2,5 ml, 23,3 mmol) i CHCI3(50 ml). Proizvod je prečišćen reksristalizacijom iz MeOH, kako bi se dobilo 1,72 g tamno žute čvrste supstance (52%). 'NMR (CDC13) 6: 8.37 (dd, J = 1.5, 8.3 Hz, IH); 8.22 (br s, IH); 7.48 (d, J = 2.3 Hz, IH); 7.42 (dd, J = 1.5, 8.1 Hz, IH); 7.31 (dt, J = 1.4, 7.8 Hz, IH); 7.22 (dd, J = 2.4, 8.8 Hz, IH); 7.09 (dt, J = 1.5, 7.7 Hz, IH): 6.67 (d, J = 8.8 Hz, IH); 5.56 (br s, 2H).

2-Amino-N-(2-hlorofenil)-6-fluorobenzamid (le)

Dobijen prema Postupku A, korišćenjem 2-amino-6-fluorobenzojeve kiseline (2,0 g. 12,9 mmol) i SOC1?(2,3 ml, 32,2 mmol) u benzenu (50 ml), a nakon toga i 2-hloroanilina (2.7 ml, 25,8 mmol) i CHCI3(50 ml). Proizvod je prečišćen hromatografijom u smeši EtOAc i heksanima, kako bi se dobilo 2,06 g bledo narandžaste čvrste supstance (60%). 'H NMR (CDCI3) 8 : 9.00 (d, J = 17 Hz. IH); 8.47 (d, J = 8.3 Hz, IH); 7.41 (d, J = 8.0 Hz, IH): 7.30 (t, .1 = 7.9 Hz, IH); 7.10-7.20 (m, IH); 7.07 (t, J = 7.7 Hz, IH); 6.49 (d, J = 8.3 Hz, IH); 6.03 (br s, 2H). MS (ES): m/z 265.0 (M+).

2-Amino-6-hloro-N-(2-hlorofenil)benzamid (11)

Dobijen prema Postupku A, korišćenjem 2-amino-6-hlorobenzojeve kiseline (2,5 g, 14.6 mmol) i SOCh (2.7 ml, 36,4 mmol) u benzenu (75 ml), a nakon toga i 2-hloroanilina (3,1 ml, 29,1 mmol) i CHC13(75 ml). Proizvod je prečišćen hromatografijom u CH2CI2, kako bi se dobilo 1,05 g žuto narandžaste čvrste supstance (26%). 'NMR (CDCI3) 5 : 8.54 (d..1 = 8.1 Hz, IH): 8.30 (br s, IH); 7.41 (dd, J = 1.5, 8.0 Hz, IH); 7.33 (t, J = 7.8 Hz, IH); 7.10 (t, .1 = 8.1 Hz, IH); 7.09 (dl, J = 1.6, 7.8 Hz, IH); 6.78 (dd, J = 0.4, 7.9 Hz. IH); 6.63 (dd, J = 0.9, 8.2 Hz, IH); 4.69 (br s, 2H). MS (ES) : m/z 303.0 (M+22), 281.0 (M+).

2-Amino-N-(2-hlorofeniI)-6-metilbenzamid (lg)

Dobijen prema Postupku A, korišćenjem 2-amino-6-metilbenzojeve kiseline (2,5 g, 16,5 mmol) i SOCkj(3,0 ml, 41,3 mmol) u benzenu (75 ml), a nakon toga i 2-hloroanilina (3,5 ml, 33,0 mmol) i CHCI3(75 ml). Proizvod je prečišćen hromatografijom u CPHCl?, kako bi se dobilo 2,19 g braon ulja (51%). 'H NMR (CDC13) 5 : 8.58 (d, J = 8.1 Hz, IH); 7.99 (br s, IH); 7.40 (dd, J= 1.4, 8.0 Hz, IH); 7.34 (t, J = 7.7 Hz, IH); 7.11 (t, J = 7.8 Hz, IH); 7.09 (dt, J = 1.5, 7.7 Hz, IH); 6.64 (d, J = 7.5 Hz, IH); 6.59 (d, J = 8.1 Hz. IH); 4.29 (br s, 2H); 2.45 (s, 3H). MS (ES): m/z 283.0 (M+22).

2-Amino-3-hloro-N-(2-hlorofenil)benzamid (lh)

Dobijen prema Postupku A, korišćenjem 2-amino-3-hlorobenzojeve kiseline (1,0 g, 5,82 mmol) i SOCb (1,1 ml, 14,6 mmol) u benzenu (25 ml), a nakon toga i 2-hloroanilina (1,2 ml, 11,7 mmol) i CHC13(25 ml). Proizvod je prečišćen reksristalizacjom iz MeOH, kako bi se dobilo 1,29 g žute čvrste supstance (78%). 'H NMR (CDCI3) 8 : 8.43 (dd, J = 1.4. 8.3 Hz, IH); 8.30 (br s, IH); 7.47 (dd, J = 1.1, 8.0 Hz, IH); 7.42 (d, J = 8.0 Hz, 2H); 7.33 (dt. J = 1.4, 7.9 Hz, IH.); 7.09 (dt, J = 1.5, 7.7 Hz, IH); 6.68 (t, J = 7.9 Hz, IH); 6.13 (br s, 2H). MS (ES): m/z 281.0 (M+).

2-Amino-N-bifenil-2-il-6-hlorobenzamid (1 i)

Dobijen prema Postupku A, korišćenjem 2-amino-6-hlorobenzojeve kiseline (2.0 g. 11,7 mmol) i SOCl2(2,1 ml, 29,3 mmol) u benzenu (60 ml), a nakon toga i 2-aminobifenilamina (4,15 ml, 24,5 mmol) i CHCI3(60 ml). Proizvod je prečišćen hromatografijom u CH2CI2, kako bi se dobilo 2.16 g penastog ostatka boje tamnog ćilibara (57%). 'H NMR"(CDCl3) 6 : 8.48 (d, J = 8.2 Hz. IH); 7.79 (br s, IH); 7.34-7.46 (m. 6H);

7.20-7.30 (m, 2H); 7.00 (t, J = 8.1 Hz, IH); 6.63 (dd, J = 0.6, 7.9 Hz, IH); 6.54 (d, J = 8.3.Hz, IH); 4.58 (br s, 2H). MS (ES): m/z 323.1 (M+).

2-Amino-6-hloro-N-o-tolilbenzamid (lj)

Dobijen prema Postupku A, korišćenjem 2-amino-6-hlorobenzojeve kiseline (1,0 g, 5,83 mmol) i SOCI2(1,1 ml, 14,6 mmol) u benzenu (30 ml), a nakon toga i o-toluidina (1.4 ml, 12,8 mmol) i CHCI3(30 ml). Proizvod je prečišćen hromatografijom u CH2CI2, kako bi se dobilo 840 mg uljaste žute čvrste supstance (55%). 'H NMR (CDC13) 6 : 7.96 (d, J = 7.9 Hz, IH); 7.60 (brs, IH); 7.23-7.30 (m, 2H); 7.14 (t, J = 7.5 Hz, IH); 7.11 (t, J = 8.3 Hz, IH); 6,78 (d, J = 7.9 Hz, IH); 6.64 (d, J = 8.2 Hz, IH); 4.73 (br s, 2H); 2.35 (s, 3H). MS (ES): m/z 261.0

(M+).

2-Amino-6-hloro-N-(2-fluorofeniI)benzamid (lk)

Dobijen prema Postupku A, korišćenjem 2-amino-6-hlorobenzojeve kiseline (2.0 g, 11,7 mmol) i SOCl2(2,1 ml. 29,1 mmol) u benzenu (60 ml), a nakon toga i 2-fluoroanihna (2,3 ml, 23,4 mmol) i CHCI3(60 ml). Proizvod je prečišćen hromatografijom u CH?C12, kako bi se dobilo 1,05 g žute čvrste supstance (34%). 'H NMR (CDCI3) 6 : 8.45 (t. J = 8.0 Hz. IH); 8.01 (br s, IH); 7.02-7.22 (m, 4H); 6.78 (dd, J = 0.5, 7.9 Hz, IH); 6.64 (dd, J = 0.8, 8.2 Hz, IH); 4.73 (br s, 2H). MS (ES) : m/z 265.0 (M+).

2-Amino-6-hloro-N-(2-metoksifenil)benzamid (11)

Dobijen prema Postupku A, korišćenjem 2-amino-6-hlorobenzojeve kiseline (2.0 g, 11,7 mmol) i SOCl2(2,1 ml, 29,1 mmol) u benzenu (60 ml), a nakon toga i o-anizidina (2.6 ml. 23,4 mmol) i CHCI3(60 ml). Proizvod je prečišćen hromatografijom u CH2CI2, kako bi se dobilo 2,61 g tamno žutog ulja (81%). 'H NMR (CDC13) 6 : 8.53 (dd. J = 1.7, 7.9 Hz, IH); 8.39 (brs, IH); 7.11 (dt, J = 1.6,7.8 Hz, IH); 7.09 (t, J = 8.1 Hz, IH); 7.02 (dt, J - 1.4. 7.8 Hz, IH); 6.92 (dd, J = 1.4. 8.0 Hz, IH); 6.62 (dd, J = 0.9, 8.2 Hz, IH); 4.66 (br s, 2H); 3.87 (s, 3H). MS (ES): m/z 277.0 (M+).

2-Amino-N-(2-hlorofenil)-3-trifluorometilbenzamid (1 m)

Dobijen prema Postupku A, korišćenjem 3-fluorometilantranilne kiseline (2,0 g, 9.75 mmol) i SOCb (1,8 ml, 24.4 mmol) u benzenu (50 ml), a nakon toga i 2-hloroanilina (2,1 ml. 19,5 mmol) i CHCI3(50 ml). Proizvod je prečišćen rekristalizacijom iz MeOH, kako bi se dobilo 2,38 g žutih kristala (78%).<]>H NMR (CDC13) 5 : 8.40 (dd, J = 1.4, 8.3 Hz, IH); 8.25 (br s, IH); 7.71 (d, J = 7.8 Hz, IH); 7.60 (d, J = 7.8 Hz, IH); 7.43 (dd, J = 1.4. 8.0 Hz, IH); 7.34 (dt, .1 = 1.3, 7.9 Hz, IH); 7.11 (dt, J = 1.5, 7.7 Hz, IH); 6.77 (t, J = 7.8 Hz, IH); 6.24 (br s, 2H). MS (ES): m/z 315.0 (M+).

(2-HlorofeniI)amid 3-aminonaftalen-2-karboksilne kiseline (ln)

Dobijen prema Postupku A, korišćenjem 3-amino-2-naftalin karboksilne kiseline (2,0 g, 10,7 mmol) i SOCI2(1,9 ml, 26,7 mmol) u benzenu (50 ml), a nakon toga i 2-hloroanilina (2,3 ml, 21,4 mmol) i CHCI3(50 ml). Proizvod je prečišćen rekristalizacijom iz MeOH, kako bi se dobilo 1,71 g braon čvrste supstance (54%). 'H NMR (CDC13) 5 : 10.88 (br s. IH): 9.21 (s, IH); 8.91 (s, IH); 8.70 (dd, J = 1.0, 8.3 Hz, IH); 7.95-8.01 (m, IH); 7.87-7.94 (m, IH); 7.60-7.68 (m, 2H), 7.41 (dd, J = 1.3, 8.0 Hz, IH); 7.34 (dt, J = 1.2, 7.8 Hz, IH); 7.07 (dt, J =1.4, 7.7 Hz, IH). MS (ES): m/z 297.1 (M+).

2-Amino-N-(2-hlorofenil)-4-nitrobenzamid (10)

Dobijen prema Postupku A. korišćenjem 4-nitroantranilne kiseline (5,0 g, 27,5 mmol) i SOCb (5,0 ml, 68,6 mmol) u benzenu (150 ml), a nakon toga i 2-hloroanilina (5,8 ml, 55.0 mmol) i CHCI3(150 ml). Proizvod je prečišćen hromatografijom u CH2CI2, a zatim i rekristalizovan iz MeOH, kako bi se dobilo 2,20 g braon-žute čvrste supstance (31%). 'H NMR (CDCI3) 6 : 8.41 (dd. J = 1.3. 8.3 Hz, IH); 8.31 (br s, IH); 7.67 (d..1 = 8.6 Hz, IH);

7.57. (d, J = 2.1 Hz, IH); 7.52 (dd, J = 2.2, 8.5 Hz, IH); 7.44 (dd, J = 1.3, 8.1 Hz, IH); 7.35 (dt, J = 1.3, 7.9 Hz, IH); 7.13 (dt, J = 1.4, 7.8 Hz, IH); 5.88 (br s, 2H). MS (ES): m/z 292.0

(M+).

2-Amino-N-(2-hlorofenil)-5-hidroksibenzamid (lp)

Dobijen prema Postupku A, korišćenjem 2-amino-5-hidroksibenzojeve kiseline (5,0 g, 32,7 mmol) i SOCb (6,0 ml, 81,6 mmol) u benzenu (150 ml), a nakon toga i 2-hloroanilina (6,9 ml, 65,4 mmol) i CHCI3(150 ml). Proizvod je prečišćen dva puta ponovljenom hromatografijom u smeši MeOH i CH2CI2, kako bi se dobilo 990 mg braon čvrste supstance (12%). 'H NMR (MeOH-d4) 6 : 7.92 (dd, J = 1.6, 8.1 Hz, IH); 7.48 (dd, J = 1.5, 7.7 Hz, IH); 7.34 (dt, J= 1.5, 7.7 Hz, IH); 7.20 (dt, J = 1.7, 7.7 Hz, IH); 7.16 (d, J = 2.7 Hz, IH); 6.83 (dd, J = 2.7, 8.7 Hz, IH); 6.76 (d, J = 8.7 Hz, IH); (6.24 (br s, 2H)). MS (ES): m/z 263.0 (M+).

2-Amino-N-(2-hlorofeniI)-4,5-difluorobenzamid (lq)

Dobijen prema Postupku A, korišćenjem 4,5-difiuoroantranilne kiseline (2,0 g, 11.6 mmol) i SOCl2 (2,1 ml, 28,9 mmol) u benzenu (60 ml), a nakon toga i 2-hloroanilina (2.4 ml. 23,2 mmol) i CHCI3(60 ml). Proizvod je prečišćen korišćenjem dve hromatografije, u CH2CI2 i smeši EtOAc i heksana, kako bi se dobilo 769 mg žućkaste čvrste supstance (23%). 'H NMR (CDCI3) 8 : 8.69-8.82 (m, IH); 8.00 (dd, J = 8.4, 9.0 Hz, IH); 7.90 (dd, J = 8.9, 12 Hz, IH); 7.39 (dd, J = 6.8, 10 Hz, IH); 6.53 (dd, J = 6.6, 12 Hz, IH); 6.41 (br s, 2H); 5.79 (br s, IH). MS (ES): m/z 283.1 (M+).

2-Amino-N-(2-hlorofeniI)-5-fluorobenzamid (1 r)

Dobijen prema Postupku A, korišćenjem 2-amino-5-fluorobenzojeve kiseline (1.0 g. 6,45 mmol) i SOC1?(1.2 ml, 16,1 mmol) u benzenu (30 ml), a nakon toga i 2-hloroanilina (1.4 ml, 12.9 mmol) i CHCI3(30 ml). Proizvod je sprašen iz CH2CI2, kako bi se dobilo 985 mg kao senf žute čvrste supstance (58%). 'H NMR (CDC13) 8 : 7.66 (dd. J = 2.9. 8.7 Hz, IH); 7.52-7.55 (m, IH); 7.32-7.37 (m, 3H); 7.09 (dt, J - 3.0, 8.5 Hz, IH); 6.71 (dd, J = 4.3, 8.7 Hz, IH). MS (ES): m/z 305.0 (M+40).

Primer 9

Pobijanje intermedijernih jedinjenja: hloridi

2-Hlorometil-3-(2-hlorofenil)-6,7-dimetok5i-3H-hinazolin-4-on (2a)

Dobijen prema Postupku B, korišćenjem jedinjenja la (2,95 g, 9,63 mmol) i hloroacetil hlorida (2,3 ml, 28,9 mmol) u sirćetnoj kiselini (30 ml). Prečišćen ekstrakcijom iz vodenog rastvora K2CO3i rekristalizacijom iz izopropanola, kako bi se dobilo 1,61 g braon kristalne čvrste supstance (46%). 'H NMR (CDCI3) 6 : 7.59-7.66 (m, 2H); 7.45-7.56 (m, 3H); 7.20 (s, IH); 4.37 (d, J = 12 Hz, IH), 4.08 (d, J = 12 Hz, IH); 4.04 (s, 3H); 4.00 (s, 3H). MS (ES): m/z 365.0 (M+).

6-Bromo-2-hlorometil-3-(2-hlorofeniI)-3H-hinazolin-4-on (2b)

Dobijen prema Postupku B, korišćenjem jedinjenja lb (500 mg, 1,54 mmol) i hloroacetil hlorida (0,37 ml, 4,61 mmol) u sirćetnoj kiselini (3 0 ml). Prečišćen rekristalizacijom iz izopropanola, kako bi se dobilo 490 mg žućkasto-sivkaste čvrste supstance (83%). 'H NMR (CDCI3) § : 8.43 (d, J = 2.3 Hz, IH); 7.91 (dd, J = 2.3, 8.7 Hz, IH); 7.67 (d, J = 8.7 Hz, IH); 7.60-7.65 (m, IH); 7.47-7.56 (m, 2H); 7.52 (t, J = 5.3 Hz, IH); 7.47-7.56 (m, IH); 4.37 (d, J = 12 Hz, IH), 4.06 (d, J = 12 Hz, IH). MS (ES): m/z 385.0

(M+).

2-HIorometil-3-(2-hlorofenil)-7-nuoro-3H-hinazolin-4-on (2c)

Dobijen prema Postupku B, korišćenjem jedinjenja lc (500 mg, 1,89 mmol) i hloroacetil hlorida (0,45 ml, 5,67 mmol) u sirćetnoj kiselini (10 ml). Prečišćen ekstrakcijom iz vodenog rastvora K2CO3, a zatim rekristalizacijom iz izopropanola, kako bi se dobilo 501 mg žute kristalne čvrste supstance (82%). 'H NMR (CDC13) 5 : 8.32 (dd, J = 6.0, 8.9 Hz, IH); 7.59-7.66 (m, IH); 7.50-7.55 (m, 3H); 7.44 (dd, J = 2.4, 9.4 Hz, IH); 7.27 (dt, J = 2.5, 8.5 Hz, IH); 4.37 (d, J = 12 Hz, IH), 4.07 (d, J = 12 Hz, IH). MS (ES): m/z 323.0 (M+).

6-Hloro-2-hlorometil-3-(2-hlorofeniI)-3H-hinazolin-4-on (2d)

Dobijen prema Postupku B, korišćenjem jedinjenja ld (500 mg, 1,78 mmol) i hloroacetil hlorida (0,42 ml, 5,33 mmol) u sirćetnoj kiselini (10 ml). Prečišćen rekristalizacijom iz izopropanola, kako bi se dobilo 555 mg žute kristalne čvrste supstance (92%). 'H NMR (CDCI3) 8 : 8.27 (d, J = 1.9 Hz, IH); 7.74-7.78 (m, 2H); 7.60-7.66 (m, IH); 7.48-7.57 (m, 3H); 4.37 (d, J = 12 Hz, IH), 4.07 (d, J = 12 Hz, IH). MS (ES): m/z 339.0

(M+).

2-HIorometil-3-(2-hlorofenil)-5-fluoro-3H-hinazolin-4-on (2e)

Dobijen prema Postupku B, korišćenjem jedinjenja le (500 mg. 1,89 mmol) i hloroacetil hlorida (0,45 ml, 5,67 mmol) u sirćetnoj kiselini (10 ml). Prečišćen ekstrakcijom iz vodenog rastvora K2CO3, a zatim rekristalizacijom iz izopropanola, kako bi se dobilo 430 mg žućkasto-sivkaste kristalne čvrste supstance (70%).<]>H NMR (CDC13) 5 : 7.76 (dt, J = 5.3. 8.2 Hz, IH); 7.56-7.65 (m, 2H); 7.47-7.56 (m, 3H); 7.16-7.25 (m, IH); 4.35 (d, J = 12 Hz, IH), 4.07 (d, J = 12 Hz, IH). MS (ES) : m/z 323.0 (M+).

5-Hloro-2-hlorometil-3-(2-hlorol'enil)-3H-hinazoIin-4-on (21)

Dobijen prema Postupku B, korišćenjem jedinjenja lf (1,0 g, 3,56 mmol) i hloroacetil hlorida (0,85 ml, 10,7 mmol) u sirćetnoj kiselini (15 ml). Prečišćen rekristalizacijom iz izopropanola, kako bi se dobilo 791 mg žućkasto-sivkaste kristalne čvrste supstance (65%).

'H NMR (CDCI3) 6: 7.70 (s, IH); 7.68 (d. J = 3.8 Hz, IH); 7.61-7.65 (m, IH); 7.55 (dd. J = 2.7. 6.4 Hz, IH); 7.51 (d, J = 3.1 Hz, IH); 7.50 (s, 2H); 4.35 (d, .1 = 12 Hz. IH), 4.05 (d. J = 12 Hz. IH). MS (ES): m/z 339.0 (M+).

2-HIorometiI-3-(2-hlorofenil)-5-metil-3H-hinazolin-4-on (2g)

Dobijen prema Postupku B, korišćenjem jedinjenja lg (2,18 g, 8,36 mmol) i hloroacetil hlorida (2,0 ml, 25,1 mmol) u sirćetnoj kiselini (40 ml). Prečišćen korišćenjem dve hromatografije u CH2CI2i smeši EtOAc i heksana, a potom i rekristalizacijom iz izopropanola, kako bi se dobilo 638 mg žućkasto-sivkaste kristalne čvrste supstance (24%).

'H NMR (DMSO-d6) 6: 7.73-7.80 (m, 3H); 7.58-7.64 (m, 3H); 7.41 (d, J = 7.4 Hz, IH); 4.40 (d, J = 12 Hz, IH), 4.26 (d, J = 12 Hz, IH); 2.74 (s, 3H). MS (ES): m/z 319.0 (M+).

8-Hloro-2-hlorometil-3-(2-hlorofenil)-3H-hinazolin-4-on(2h)

Dobijen prema Postupku B, korišćenjem jedinjenja lh (500 mg. 1.78 mmol) i hloroacetil hlorida (0,49 ml, 6,13 mmol) u sirćetnoj kiselini (10 ml). Prečišćen ekstrakcijom iz vodenog rastvora K2CO3, a zatim rekristalizacijom iz izopropanola, kako bi se dobilo 448 mg žute čvrste supstance (74%).<!>H NMR (CDCI3) 6: 8.23 (dd, .1=1.4, 8.0 Hz, IH); 7.90 (dd. J=1.4, 7.8 Hz, IH); 7.61-7.66 (m, IH); 7.51-7.55 (m, 3H); 7.47 (t, J=8.0 Hz, IH); 4.48 (d, J=12 Hz, IH), 4.12 (d, J=12 Hz, IH). MS (ES): m/z 339.0 (M+).

3-Bifenil-2-il-5-hIoro-2-hiorometil-3H-hinazolin-4-on (2i)

Dobijen prema Postupku B, korišćenjem jedinjenja li (2,0 g, 6.20 mmol) i hloroacetil hlorida (1,5 ml, 18,6 mmol) u sirćetnoj kiselini (30 ml). Prečišćen korišćenjem hromatografije u CH2CI2, a potom i rekristalizacijom iz izopropanola, kako bi se dobilo 1,44 g žućkasto-sivkaste čvrste supstance (61%). 'H H NMR (CDC13) 6: 7.61-7.64 (m, IH); 7.58-7.59 (m, IH); 7.54-7.57 (m, 2H); 7.52-7.53 (m, IH); 7.45-7.52 (m, 2H); 7.24 (s, 5H); 3.92-4.03 (m, 2H). MS (ES): m/z 381.0 (M+).

5-Hloro-2-hlorometiI-3-o-toIil-3H-hinazoIin-4-on(2j)

Dobijen prema Postupku B, korišćenjem jedinjenja lj (750 mg. 2,88 mmol) i hloroacetil hlorida (0,69 ml, 8,63 mmol) u sirćetnoj kiselini (15 ml). Prečišćen korišćenjem hromatografije u CH2CI2, a potom i rekristalizacijom iz izopropanola, kako bi se dobilo 340 mg bele čvrste supstance (37%). 'H NMR (CDCI3) 6: 7.69 (d, J = 2.1 Hz, IH); 7.68 (q, J = 7.4 Hz, IH); 7.54 (dd, J = 2.2, 7.0 Hz, IH); 7.35-7.47 (m, 3H); 7.21-7.25 (m, IH); 4.27 (d, J = 12 Hz, IH); 4.11 (d,J= 12 Hz, IH); 2.18 (s, 3H). MS (ES): m/z 319.0 (M+).

5-Hloro-2-hlorometil-3-(2-fluorofeniI)-3H-hinazolin-4-on (2k)

Dobijen prema Postupku B, korišćenjem jedinjenja lk (1,0 g, 3,78 mmol) i hloroacetil hlorida (0,90 ml, 11,3 mmol) u sirćetnoj kiselini (20 ml). Prečišćen korišćenjem hromatografije u CH2CI2, kako bi se dobilo 484 mg bledo ružičaste čvrste supstance (40%>).

'H NMR (CDCI3) 6: 7.69 (s, IH): 7.68 (d, J = 3.2 Hz, IH); 7.56 (d, J = 3.0 Hz, IH); 7.54 (d..1 = 3.0 Hz, IH); 7.40-7.47 (m, IH); 7.35-7.38 (m, IH); 7.27-7.32 (m. IH); 4.35 (d, J - J2.Hz. IH); 4.18 (d, J= 12 Hz, IH). MS (ES): m/z 323.0 (M+).

5-Hloro-2-hlorometil-3-(2-metoksifenil)-3H-hinazoIin-4-on (21)

Dobijen prema Postupku B, korišćenjem jedinjenja 11 (2,6 g, 9,41 mmol) i hloroacetil hlorida (2,2 ml, 28,2 mmol) u sirćetnoj kiselini (40 ml). Prečišćen korišćenjem hromatografije u CH2C12, a potom i rekristalizacijom iz izopropanola, kako bi se dobilo 874 mg bledo žute čvrste supstance (28%).<!>H NMR (CDC13) 8: 7.55-7.74 (m, 2H); 7.47-7.54 (m, 2H); 7.34 (dd, J = 1.7, 7.8 Hz, IH); 7.13 (dt, J = 1.2, 7.7 Hz, IH); 7.08 (dd, J = 1.0, 8.4 Hz, IH); 4.29 (d, J = 12 Hz, IH); 4.11 (d, J = 12 Hz, IH); 3.80 (s, 3H). MS (ES): m/z 335.0 (M+).

2-Hlorometil-3-(2-hlorofeniI)-8-trifluorometiI-3H-hinazolin-4-on(2m)

Dobijen prema Postupku B. korišćenjem jedinjenja lm (500 mg, 1,59 mmol) i hloroacetil hlorida (0,38 ml, 4,77 mmol) u sirćetnoj kiselini (10 ml). Prečišćen rekristalizacijom iz izopropanola, kako bi se dobilo 359 mg bele kristalne čvrste supstance (61%). !H NMR (CDC13) 6: 8.51 (dd, .1 = 1.0, 8.0 Hz, IH); 8.14 (d, J = 7.3 Hz, IH); 7.65 (dd, J = 2.5, 5.6 Hz, IH); 7.62 (d, J = 3.9 Hz, IH); 7.48-7.60 (m, 3H); 4.44 (d, J = 12 Hz, IH), 4.12 (d, J = 12 Hz, IH). MS (ES): m/z 373.0 (M+).

2-Hlorometil-3-(2-hlorofenil)-3H-benzo[g]hinazolin-4-on (2n)

Dobijen prema Postupku B, korišćenjem jedinjenja ln (500 mg, 1,68 mmol) i hloroacetil hlorida (0,40 ml, 5,05 mmol) u sirćetnoj kiselini (3 0 ml). Prečišćen korišćenjem hromatografije u CH2CI2, a potom i rekristalizacijom iz izopropanola. kako bi se dobilo 232 mg svetio braon čvrste supstance (39%). 'H NMR (CDC13) 5: 8.92 (s, IH); 8.29 (s, IH); 8.81 (d, J = 8.3, IH); 8.32 (d, J = 8.3 Hz, IH); 7.51-7.69 (m, 4H); 7.55 (d, J = 5.2 Hz, IH); 7.53 (d. J = 3.8 Hz, IH); 4.43 (d, J = 12 Hz, IH), 4.12 (d. J = 12 Hz, IH). MS (ES): m/z 355.0

(M+).

2-Hlorometil-3-(2-hlorofeniI)-7-nitro-3H-hinazoIin-4-on (2o)

Dobijen prema Postupku B, korišćenjem jedinjenja lo (500 mg, 3,71 mmol) i hloroacetil hlorida (0,41 ml, 5,14 mmol) u sirćetnoj kiselini (10 ml). Prečišćen ekstrakcijom iz vodenog rastvora K2C03, a zatim korišćenjem dve hromatografije u CH2CI2, kako bi se dobilo 338 mg žutog ulja (56%). 'H NMR (CDC13) 8: 8.64 (d, J = 2.2 Hz, IH); 8.48 (d, J = 8.8Hz, IH): 8.32 (dd, J - 2.2, 8.7 Hz, IH); 7.66 (dd, J = 2.5, 6.0 Hz, IH); 7.52-7.59 (m, 3H); 4.41 (d, J = 12 Hz, IH), 4.10 (d, J = 12 Hz, IH). MS (ES): m/z 350.0 (M+).

2-Hlorometi]-3-(2-hlorofenil)-4-oliso-3,4-dihidro-hinazolin-6-ilestar sirćetne kiseline

(2p)

Dobijen prema Postupku B, korišćenjem jedinjenja lp (670 mg, 2,55 mmol) i hloroacetil hlorida (0,61 ml, 7,65 mmol) u sirćetnoj kiselini (10 ml). Prečišćen korišćenjem hromatografije u smeši MeOH i CH2CI2pri koncentraciji od 0-3%, a zatim i rekristalizacije iz izopropanola, kako bi se dobilo 523 mg acetata u vidu bledih kristala boje breskve (57%>). 'H NMR (CDCI3) 6: 8.00 (d, J = 2.7 Hz, IH); 7.82 (d, J = 8.8 Hz, IH); 7.60-7.66 (m, IH); 7.56 (dd, J = 2.7, 8.8 Hz, IH); 7.51 (t, J = 4.7 Hz, 2H); 7.50 (s, IH); 4.38 (d, J = 12 Hz, IH), 4.08 (d, J = 12 Hz, IH); 2.36 (s, 3H),MS (ES): m/z 363.0 (M+).

2-HIorometiI-3-(2-hlorofeniI)-6,7-đifluoro-3H-hinazolin-4-on (2q)

Dobijen prema Postupku B, korišćenjem jedinjenja lq (700 mg, 2,48 mmol) i hloroacetil hlorida (0,60 ml, 7,43 mmol) u sirćetnoj kiselini (12 ml). Prečišćen hromatografijom u CH2G2, a zatim i rekristalizacijom iz izopropanola kako bi se dobilo 219 mg žute kristalne čvrste supstance (26%).<J>H NMR (CDC13) 5: 8.07 (dd, J = 8.5. 9.7 Hz. IH); 7.64 (dd, J = 2.5, 5.6 Hz, IH); 7.60 (dd, J = 3.5. 11 Hz, IH); 7.55 (q, J = 2.9 Hz, 3H); 7.52 (d, J = 1.9 Hz, IH); 7.49-7.51 (m, IH); 4.36 (d, J = 12 Hz. IH), 4.06 (d..1 - 12 Hz. IH). MS (ES): m/z 341.0 (M+).

2-Hlorometil-3-(2-hlorofenil)-6-fluoro-3H-hinazolin-4-on (2r)

Dobijen prema Postupku B, korišćenjem jedinjenja lr (850 mg, 3,21 mmol) i hloroacetil hlorida (0,77 ml, 9,63 mmol) u sirćetnoj kiselini (15 ml). Prečišćen ekstrakcijom iz vodenog rastvora K2CO3, a zatim korišćenjem hromatografije u smeši EtOAc i heksana. Nakon druge hromatografije u smeši acetona i heksana, dobijeno je 125 mg bele čvrste supstance (12%). 'H NMR (CDCI3) 5: 7.95 (dd. J = 2.9. 8.2 Hz. IH): 7.81 (dd, J = 4.8, 9.0 Hz. IH); 7.61-7.66 (m. IH); 7.57 (dd, J = 2.7. 8.6 Hz. IH); 7.57 (dd, J = 2.7, 8.6 Hz. IH):7.52 (dd, J = 3.2, 6.9 Hz, IH); 7.52 (br s, 2H); 4.38 (d, .1 = 12 Hz, IH), 4.08 (d, J = 12 Hz, IH). MS (ES): m/z 323.0 (M+).

Primer 10

Pobijanje inhibitora PI3KS

Jedinjenje P-001

2-(6-Aminopurin-9-ilmetiI)-3-(2-hlorofenil)-6,7-dimetoksi-3H-hinazolin-4-on

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem Intermedijera 2a (200 mg, 0,546 mmol), adenina (81 mg, 0,601 mmol), K2C03(83 mg, 0,601 mmol) i DMF (4 ml). Sirovi proizvod je rekristalizovan iz etanola (EtOH), kako bi se dobilo 164 mg čvrste supstance bež boje (65%), t.t. 281,5 - 282,7 °C (razlaganje). 'H NMR (DMSO-d6) 6: 8.06 (s, IH); 8.04 (s, IH); 7.76-7.81 (m, IH); 7.70-7.76 (m, IH); 7.60-7.67 (m, 2H); 7.45 (s, IH); 7.22 (s, 2H); 6.90 (s, IH); 5.08 (d, J = 17 Hz, IH); 4.91 (d, J = 17 Hz, IH); 3.87 (s, 3H); 3.87 (s, 3H).,<3>C NMR (DMSO-dć) ppm: 159.9, 156.2, 155.4, 152.9, 150.0, 149.7, 149.4, 143.0, 141.9, 133.7, 132.1, 131.9, 131.2, 130.8, 129.3, 118.4, 113.6, 108.4, 105.8. 56.5, 56.1, 44.7. MS (ES): m/z 464.1 (M+). Analiza računala za C22H18CrN703 • 0.1 C2H60 • 05KC1: C, 56.47; H. 3.97; Cl, 7.88; N. 20.76. Otkriveno: C, 56.54; H, 4.05; Cl. 7.77; N. 20.55.

Jedinjenje P-002

2-(6-Aminopurin-o-ilmetil)-6-bromo-3-(2-hlorofenil)-3H-hinazolin-4-on

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem Intermedijera 2b (100 mg, 0.260 mmol), adenina (39 mg, 0.286 mmol), K2C03(40 mg, 0,286 mmol) i DMF (2 ml). Sirovi proizvod je rekristalizovan iz EtOH, kako bi se dobilo 52 mg sivo-žućkaste čvrste supstance (41%), t.t. 284,2 - 284,7 °C (razlaganje). 'H NMR (DMS0-d6) 8: 8.24 (d, J = 2.0 Hz, IH); 8.05 (s, IH); 8.03 (s, IH); 7.98 (dd, J = 1.9. 8.6 Hz. IH); 7.74-7.83 (m, 2H); 7.59-7.68 (m, 2H); 7.46 (d, J = 8.7 Hz, IH); 7.22-(s, 2H); 5.12 (d, .1 = 17 Hz, IH); 4.94 (d, J = 17 Hz, IH).<I3>C NMR (DMSO-d6)ppm: 159.5, 156.2, 152.9, 152.0, 150.1, 145.8, 141.8, 138.4, 133.1, 132.2, 131.9, 131.1, 130.9, 130.1, 129.4, 128.9, 122.4, 120.4, 118.4. 45.0. MS (ES): m/z 482.0 (M+). Analiza računata za C2oHi3ClBrN70»0.1KCl: C, 49.01; H, 2.67; Cl, 7.96; N, 20.00. Pronađeno: C, 48.82; H, 2.82: Cl, 8.00; N, 19.79.

JedinjenjeD-003

2-(6-Aminopurin-o-ilmetil)-3-(2-hlorofenil)-7-fluoro-3H-hinazolin-4-on

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem Intermedijera 2c (100 mg, 0,310 mmol), adenina (46 mg, 0,340 mmol), K2CO3(47 mg, 0,340 mmol) i DMF (1 ml). Sirovi proizvod je rekristalizovan iz EtOH, kako bi se dobilo 57 mg čvrste supstance bež boje (44%). t.t. 216,8 - 217,2 °C. 'H NMR (DMSO-d6) 8: 8.22 (dd, J = 6.3, 8.7 Hz, IH); 8.05 (s, IH); 8.03 (s, IH); 7.78-7.80 (m, 2H); 7.61-7.64 (m, 2H); 7.46 (dt, J = 2.1, 8.6 Hz, IH); 7.32 (d, J = 9.8 Hz, IH); 7.22 (s, 2H); 5.13 (d, J = 17 Hz, IH); 4.95 (d, J = 17 Hz, IH).<I3>C NMR (DMSO-d6) ppm: 166.1 (d, J = 253 Hz), 159.6, 155.8, 152.5, 149.7. 148.6 (d, J = 14 Hz), 141.4, 132.8, 131.8, 131.6, 130.8, 130.5, 129.8 (d, J = 11 Hz), 129.0, 118.1, 117.4, 116.2 (d, J = 24 Hz), 112.7 (d, J = 22 Hz), 44.6. MS (ES): m/z 422,0 (M+). Analiza računata za C2oH13ClFN70'0.1H20 (0.15KC1: C, 55.25; H, 3.06; Cl, 9.38; N, 22.55. Pronađeno: C, 55.13; H, 2.92; Cl, 9.12; N, 22.30.

Jedinjenje D-004

2-(6-Aminopurin-9-iimetil)-6-hloro-3-(2-hlorofenil)-3H-hinazolin-4-on

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem Intermedijera 2d (100 mg, 0,294 mmol), adenina (44 mg, 0,323 mmol), K2C03(44 mg, 0,323 mmol) i DMF (3 ml). Sirovi proizvod je rekristalizovan iz EtOH, kako bi se dobilo 50 mg žute čvrste supstance (39%), t.t. 294,5 - 294,8 °C (razlaganje). 'H NMR (DMSO-d6) 8: 8.10 (d, J = 2.2 Hz, IH); 8.05 (s, IH); 8.03 (s, IH); 7.86 (dd, J = 2.4, 8.8 Hz, IH); 7.75-7.82 (m, 2H); 7.59-7.67 (m, 2H); 7.53 (d, J = 8.7 Hz. IH); 7.22 (br s, 2H); 5.13 (d, J = 17 Hz, IH); 4.95 (d, J = 17 Hz, IH). 13C NMR (DMSO-d6) ppm: 359.7, 156.2, 152.9, 151.9, 150.1, 145.5, 141.8, 135.7, 133.1, 132.3, 132.2, 331.9, 131.1, 130.9, 130.0, 129.4, 125.9, 122.0, 118.4, 44.9. MS (ES): m/z 438.0 (M+). Analiza računata za C20H13CI2N7O: C, 54.81; H, 2.99; N, 22.37. Pronađeno: C, 54.72; H, 2.87; N, 22.18.

Jedinjenje D-005

2-(6-Aminopurin-9-ilmetiI)-3-(2-hlorofenil)-5-fluoro-3H-hinazolin-4-on

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem Intermedijera 2e (200 mg, 0.619 mmol). adenina (92 mg, 0,681 mmol), K2CO3(94 mg, 0,680 mmol) i DMF (4 ml). Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom u smeši MeOH i CH2CI2, kako bi se dobilo 168 mg sivo-žućkaste čvrste supstance (64%), t.t. 159 - 172 °C (postepeno razlaganje). 'H NMR (DMSO-d6) 5: 8.10 (s, IH); 8.08 (s, IH); 7.73-7.89 (m, 3H); 7.57-7.71 (m, 2H); 7.37-7.48 (m, 2H); 7.34 (d, J = 11 Hz, IH); 7.30 (d, J = 8.3 Hz, IH); 5.14 (d, J = 17 Hz, IH); 4.94 (d, J = 17.Hz, IH). i3CNMR (DMSO-d6) ppm: 160.8 (d, .1 = 264 Hz), 157.5 (d, J = 4.2 Hz), 155.8, 152.4, 152.4, 150.0, 148.7, 142.1, 136.4 (d, J = 11 Hz), 133.0, 132.2, 132.1, 131.2, 130.9, 129.4, 123.8 (d, J = 3.6 Hz), 118.4, 114.5 (d, J = 20 Hz), 110.2 (d, J = 6.0 Hz), 44.9. MS (ES): m/z 422.0 (M+). Analiza računata za C20Hi3ClFN7O : C, 56.95; H, 3.11; Cl, 8.40; N, 23.24. Pronađeno: C, 54.62; H, 3.32; Cl, 9.40; N, 21.29.

Jedinjenje D-006

2-(6-Aminopurin-o-ilmetil)-5-hloro-3-(2-hlorofeniI)-3H-hinazolin-4-on

Dobijen prema Postupku C. korišćenjem Intermedijera 2f (300 mg, 0.883 mmol), adenina (131 mg, 0,972 mmol), K2C03(134 mg, 0,972 mmol) i DMF (4 ml). Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom u smeši MeOH i CH2CI2, a zatim rekristalizovan iz EtOH, kako bi se dobilo 188 mg bledo narandžaste čvrste kristalne supstance (49%), t.t. 245,7 - 246,0 °C (počinje da oslobađa vlagu na temperaturi 220 °C). 'H NMR (DMSO-d6) 8: 8.06 (s, IH); 8.04 (s, IH); 7.76-7.81 (m, 2H); 7.72 (d, J = 8.0 Hz, IH); 7.59-7.66 (m, 3H); 7.41 (d, J = 8.1 Hz, IH); 7.26 (br s, 2H); 5.11 (d, J = 17 Hz, IH); 4.93 (d, J = 17 Hz, IH).<I3>C NMR (DMSO-d6) ppm: 158.5, 156.2, 152.9. 152.2, 150.1. 149.2. 141.8, 135.4, 133.3, 133.2, 132.1, 132.0, 131.2, 130.9, 130.4, 129.4, 127.3, 118.4, 117.7, 44.9. MS (ES): m/z 438.0 (M+). Analiza računata za C2oH,3Cl2N70-0.1C2HćO'0.05H20: C, 54.67; H, 3.11; Cl, 15.98; N, 22.09. Pronađeno: C, 54.35; H, 3.00; Cl, 15.82; N, 22.31.

Jedinjenje D-007

2-(6-Arainopurin-9-ilmetiI)-3-(2-hlorofeniI)-5-metil-3H-hinazolin-4-on

Dobijen prema Postupku C. korišćenjem Intermedijera 2g (250 mg, 0,783 mmol), adenina (116 mg, 0,862 mmol), K2C03(119 mg, 0,862 mmol) i DMF (4 ml). Sirovi proizvod je rekristalizovan iz EtOH, kako bi se dobilo 93 mg bledo žute čvrste supstance (28%), t.t. 190,7 - 190,9 °C. 'HNMR (DMSO-d6) 5: 8.05 (s, IH); 8.03 (s, IH); 7.76-7.79 (m, IH); 7.71-7.74 (m, IH); 7.59-7.67 (m, IH); 7.34 (d, J = 7.4 Hz, IH); 7.28 (d, J = 8.2 Hz, IH); 7.24 (br s, 2H); 5.07 (d, J = 17 Hz, IH); 4.92 (d, J = 17 Hz, IH); 2.73 (s, 3H).<13>C NMR (DMSO-d6) ppm: 161.1, 156.2, 152.8, 150.9, 150.1, 148.3, 141.9, 141.0, 134.6, 133.6, 132.2, 131.9, 131.3, 130.8, 130.3, 129.3, 125.9, 119.1, 118.4, 44.8, 22.8. MS (ES): m/z 418.3 (M+). Analiza računata za C2]H,6C1N70-H20: C, 57.87; H, 4.16; Cl, 8.13; N, 22.49. Pronađeno: C, 57.78; H, 3,99; Cl, 8.38; N, 22.32.

Jedinjenje D-008

2-(6-Aminopurin-9-iImetil)-8-hIoro-3-(2-hlorofeniI)-3H-hinazolin-4-on

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem Intermedijera 2h (3 00 mg. 0,294 mmol). adenina (44 mg, 0,324 mmol), K2CO3(45 mg, 0,324 mmol) i DMF (1 ml). Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom u smeši MeOH i CH2C12, kako bi se dobilo 50 mg bledo žute čvrste supstance (39%), t.t. 273,3 - 273,5 °C (obezbojavanje).<!>H NMR (DMSO-d6) S: 8.13 (dd, J = 1.3, 8.0 Hz, IH); 8.08 (s, IH); 8.05 (s, IH); 8.00 (dd, J = 1.3, 7.8 Hz, IH); 7.79-7.83 (m, 2H); 7.63-7.66 (m, 2H); 7.56 (t, J = 7.9Hz, IH); 7.21 (br s, 2H); 5.17 (d..1=17 Hz, IH); 4.97 (d. J = 17 Hz, IH).<13>C NMR (DMSO-d6) ppm: 160.2, 156.1, 152.8, 152.2, 150.2, 143.3, 142.0, 135.6, 133.1, 132.3, 131.9, 131.1,131.0, 130.9, 129.4, 128.4, 126.0, 122.5, 118.4,45.0. MS (ES) : m/z 438.0 (M+). Analiza računata za C20H13Cl2N7O»0.1CH4O-0.6 H20 (0.15KC1 : C. 52.09; H, 3.18; N, 21.15. Pronađeno: C. 51.85; H. 2.93; N. 21.01.

JedinjenjeD-009

2-(6-Aminopurin-9-ilmetil)-3-bifeniI-2-il-5-hIoro-3H-hinazolin-4-on

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem Intermedijera 2i (400 mg, 1.05 mmol), adenina (155 mg, 1.15 mmol), K2C03(159 mg, 1,15 mmol) i DMF (5 ml). Sirovi proizvod je rekristalizovan iz EtOH, kako bi se dobilo 344 mg bele čvrste supstance (68%), t.t. 299,9 - 300,1 °C (obezbojavanje). 'H NMR (DMSO-d6) 5: 8.08 (s, IH); 7.89 (s, IH); 7.58-7.73 (m, 5H); 7.51 (d, J = 7.9 Hz, IH); 7.46 (d, J = 7.5 Hz, 2H); 7.27-7.41 (m, 3H); 7.14-7.27 (m, 3H); 5.14 (d, J = 17 Hz, IH); 4.82 (d, J - 17 Hz, IH).<13>C NMR (DMSO-d6) ppm: 159.6, 156.2, 152.8, 152.5, 150.0, 149.0, 141.7, 140.2, 137.7, 135.0, 133.3, 133.2, 131.8, 130.7, 130.1, 129.8, 129.5, 128.8. 128.6, 128.4, 127.1, 118.4. 117.6, 45.3. MS (ES): m/z 480.1 (M+). Analiza računata za C26Hi8ClN70: C, 65.07; H, 3.78; Cl, 7.39; N, 20.43. Pronađeno: C, 64.77; H, 3.75; Cl, 7.43; R 20.35.

Jedinjenje D-010

5-Hloro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3-o-tolil-3H-hinazoIin-4-on

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem Intermedijera 2j (200 mg, 0,626 mmol). 6-merkaptopurin monohidrata (93 mg, 0,546 mmol), K2C03(95 mg, 0,689 mmol) i DMF (4 ml). Sirovi proizvod je rekristalizovan iz EtOH, kako bi se dobilo 125 mg sivo-žućkaste čvrste supstance (46%), t.t. 213,9 °C. 'H NMR (DMSO-d6) 6: 13.53 (br s. IH); 8.49 (s, IH); 8.44 (s, IH); 7.78 (t, J = 7.9 Hz, IH); 7.63 (d. J = 8.2 Hz, IH); 7.59 (d, J = 7.7 Hz, IH); 7.49 (d, J = 6.9 Hz, IH); 7.24-7.41 (m, 3H); 4.32-4.45 (m, 2H); 2.14 (s, 3H).<13>C NMR (DMSO-d6) ppm: 158.9, 157.2, 154.2, 153.5, 149.7, 149.6. 143.5, 136.1, 135.9, 135.1, 133.2, 131.3. 130.3, 130.0, 129.9, 129.1, 127.6, 127.1, 117.8,32.4, 17.5. MS (ES): m/z 438.0 (M+). Analiza računata za C2,Hi5ClN6OS: C, 58.00; H, 3.48; Cl. 8.15; N, 19.32; S, 7.37. Pronađeno: C, 58.05; H, 3.38; Cl, 8.89; N, 18.38; S, 7.00.

JedinjenjeD-011

5-Hloro-3-(2-fluorofenil)-2-(9H-purin-6-il-sulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem Intermedijera 2k (210 mg. 0.650 mmol). 6-merkaptopurin monohidrata (122 mg, 0,715 mmol), K2CO3(99 mg, 0,715 mmol) i DMF (4 ml). Sirovi proizvod je rekristalizovan iz EtOH, kako bi se dobilo 240 mg sivo-žućkaste čvrste supstance (84%), t.t. 244,0 °C. 'H NMR (DMSO-d6) 6: 13.56 (br s, IH); 8.50 (s, IH); 8.45 (s, IH); 7.81 (t, J = 8.0 Hz, IH); 7.74 (t, J = 7.7 Hz, IH); 7.67 (d, J = 8.1 Hz, IH); 7.62 (d, J = 7.7 Hz, IH); 7.46-7.55 (m, IH); 7.29-7.42 (m, 2H); 4.47-4.59 (m, 2H).<13>C NMR (DMSO-d6) ppm: 158.4, 157.3 (d, J - 249 Hz), 156.4, 153.8, 151.0, 149.1, 143.2, 135.0, 132.9, 131.8 (d, J = 8.0Hz), 130.8, 129.9, 126.7, 125.3 (d, J = 3.5 Hz), 123.6 (d, J = 13 Hz). 117.0, 116.2 (d, J = 19 Hz), 31.7. MS (ES): m/z 439.0 (M+). Analiza računata za C2oHi2ClFN6OS : C, 54.74; H, 2.76; Cl, 8.08; N, 19.15; S, 7.31. Pronađeno: C, 54.42; H, 2.88; Cl, 8.08; N, 18.87; S, 7.08.

Jedinjenje D-012

2-(6-Aminopurin-9-ilmetil)-5-hloro-3-(2-fluorofeniI)-3H-hinazolin-4-on

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem Intermedijera 2k (210 mg, 0,650 mmol). adenina (97 mg, 0.715 mmol), K2CO3(99 mg, 0,715 mmol) i DMF (4 ml). Sirovi proizvod je rekristalizovan iz EtOH, kako bi se dobilo 137 mg mrke čvrste supstance (50%o), t.t. 295,6-295,8 °C (razlaganje). 'H NMR (DMSO-d6) 5: 8.05 (s, IH); 8.04 (s, IH); 7.75 (t, J=7.6 Hz, IH); 7.74 (t, J=7.9 Hz, IH); 7.62-7.69 (m, IH); 7.61 (d, J=7.6 Hz, IH); 7.47-7.55 (m, IH); 7.48 (d, J=7.8 Hz, IH); 7.41 (d, J=8.0 Hz. IH); 7.24 (br s, 2H); 5.19 (d. J=17 Hz, IH); 5.03 (d, J=17 Hz, IH).<I3>C NMR (DMSO-d6) .ppm: 158.7, 157.6 (d, J=250 Hz), 156.2, 152.8, 152.4, 150.0, 149.2, 141.8, 135.4. 133.3, 132.5 (d, J=8.0 Hz), 131.0, 130.4, 127.3, 126.2 (d, J=3.5Hz), 123.1 (d, .1=14 Hz). 118.4, 117.6, 117.2 (d, .1=19 Hz), 45.1. MS (ES): m/z 422.0 (M+). Analiza računata za C20H13ClFN7O'0.05 C2H60: C. 56.92; H. 3.16; Cl, 8.36; N, 23.12. Pronađeno: C, 56.79; H, 3.20; Cl, 8.46; N, 22.79.

JedinjenjeD-013

3-Bifenil-2-il-5-hloro-2-(9H-purin-6-ilsulfanil-metiI)-3H-hinazoIin-4-on

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem Intermedijera 2i (400 mg, 1,05 mmol), 6-merkaptopurin monohidrata (196 mg, 1,15 mmol), K2CO3(159 mg, 1.15 mmol) i DMF (5 ml). Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom u smeši MeOH i CH2CI2, a zatim rekristalizovan iz EtOH, kako bi se dobilo 439 mg bledo žute kristalne čvrste supstance (84%), t.t. 222,0-222,5 °C (razlaganje).<]>H NMR (DMSO-d6) 5: 13.56 (br s, IH); 8.55 (s, IH); 8.45 (s, IH); 7.73 (t, J=8.0 Hz, IH); 7.64 (d, .1=7.7 Hz, IH); 7.50-7.59 (m, 4H); 7.41-7.48 (m, IH); 7.25-7.38 (m, 5H); 4.41 (d, J=16 Hz, IH); 4.16 (d, J=16 Hz, IH). 13C NMR (DMSO-d6) ppm: 160.2, 157.0, 153.7, 151.5, 149.7, 149.3, 143.5, 139.9, 137.8, 135.1, 134.1, 133.3. 131.5, 130.5, 130.3, 130.1, 129.1, 128.9, 128.4, 128.4, 126.9, 117.5, 32.3. MS (ES): m/z 497.0 (M+). Analiza računata za C26H,7C1N60S: C, 62.84; H, 3.45; Cl, 7.13; N, 16.91; S. 6.45. Pronađeno: C, 62.60; H, 3.47; Cl, 7.15; N, 16.65; S. 6.41.

Jedinjenje D-014

5-Hloro-3-(2-metoksifeniI)-2-(9H-purin-6-il-sulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem Intermedijera 21 (250 mg, 0,746 mmol). 6-merkaptopurin monohidrata (140 mg, 0,821 mmol), K2CO3(113 mg, 0,821 mmol) i DMF (4 ml). Sirovi proizvod je rekristalizovan iz EtOH, kako bi se dobilo 254 mg sivo-žućkaste čvrste supstance (76%), t.t. 237,0 °C (razlaganje; obezbojavanje na 154,6 °C).<]>H NMR (DMSO-d6) 6: 13.53 (br s, IH); 8.52 (s, IH); 8.45 (s, IH); 7.78 (t, J=7.9Hz, IH); 7.64 (d. .1=8.0Hz, IH); 7.59 (d, J=7.7 Hz, IH); 7.48 (d, J=7.3 Hz, IH); 7.42 (t, J=7.7 Hz, IH); 7.35 (d, J=8.2 Hz, IH); 7.03 (t, J=7.5 Hz, IH); 4.45 (s, 2H); 3.76 (s, 3H).<13>C NMR (DMSO-d6) ppm: 158.9, 157.1, 154.8, 154.7, 151.5. 149.6, 143.6. 135.1, 133.2, 131.3, 130.4, 130.0, 127.0, 124.8, 121.2, 117.8, 112.7, 56.1, 32.0. MS (ES): m/z 451.0 (M+). Analiza računata za C2iHi5ClN602S» 0.15C2H6O0.05 KC1 : C, 55.43; H, 3.47; Cl, 8.07; N, 18.21; S, 6.95. Pronađeno: C, 55.49; H, 3.68: Cl, 7.95; N, 17.82; S, 6.82.

JedinjenjeD-015

3-(2-Hlorofenil)-5-fluoro-2-(9H-purin-6-il-sulfanilmetil)-3H-hinazoIin-4-on

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem Intermedijera 2e (200 mg, 0,619 mmol). 6-merkaptopurin monohidrata (116 mg, 0,681 mmol), K2CO3(94 mg, 0,681 mmol) i DMF (5 ml). Sirovi proizvod je rekristalizovan iz EtOH, kako bi se dobilo 152 mg bele čvrste supstance (56%), t.t. 222,7-223,8 °C (obezbojavanje). 'H NMR (DMSO-d6) 6: 13.56 (br s, IH); 8.48 (s, IH); 8.44 (s, IH) ; 7.89 (dt, J=5.6, 8.1 Hz, IH); 7.76 (dd, J=1.6, 7.3 Hz, IH); 7.67 (d, J=7.4 Hz, IH); 7.56 (d, J=8.1 Hz, IH); 7.47 (t, J=7.1 Hz, IH), 7.41-7.53 (m, 2H); 7.37 (dd, J=8.7, 11 Hz, IH); 4.38-4.52 (m, 2H).,<3>C NMR (DMSO-d6) ppm: 160.9 (d, J=264 Hz), 157.6, 156.8, 154.1, 151.5, 149.6, 149.0, 143.6, 136.4 (d, J=ll Hz), 133.9, 132.2, 131.7, 131.6, 130.5, 130.2, 128.8, 123.6, 114.4 (d, J=20 Hz), 110.2, 32.0. MS (ES): m/z 439.0 (M+). Analiza računata za C2oHi2ClFN6OS'0.5C2H60: C, 54.61; H, 3.27; Cl, 7.68; N, 18.19; S, 6.94. Pronađeno: C, 54.37; H, 3.26; Cl, 7.89; N, 18.26; S, 6.55.

Jedinjenje D-016

3-(2-HIorofeniI)-6,7-dimetoksi-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem Intermedijera 2a (200 mg, 0,546 mmol), 6-merkaptopurin monohidrata (102 mg, 0,601 mmol), K2CO3(83 mg, 0,601 mmol) i DMF (5 mi). Sirovi proizvod je rekristalizovan iz EtOH, kako bi se dobilo 172 mg sivo-žućkaste čvrste supstance (65%), t.t. 160-180 °C (postepeno razlaganje). 'H NMR (DMSO-d6) o : 13.55 (br s, IH); 8.49 (s, IH); 8.44 (s, IH); 7.72 (d, J=6.9 Hz, IH); 7.66 (d, J=6.9 Hz, IH) 7.38-7.54 (m, 3H); 7.22 (s, IH); 4.36-4.52 (m. 2H); 3.94 (s, 3H); 3.89 (s, 3H).<13>C NMR (DMSO-d6) ppm: 160.1, 155.4, 151.5, 151.1, 149.4, 143.2, 134.6, 132.3, 131.6, 131.5, 130.4. 128.7, 1 13.6, 108.4, 105.8, 56.5, 56.1, 32.0. MS (ES) : m/z 481.1 (M+). Analiza računata za C22H,7ClN6O3S-0.5C2H6O-0.05KCl : C, 54,41; H, 3.97; Cl, 7.33; N, 16.55; S, 6.32. Pronađeno: C, 54.43; H. 3.94; Cl, 7.69; N. 16.69; S. 6.52.

Jedinjenje D-017

6-Bromo-3-(2-hlorofenil)-2-(9H-purin-6-il-sulfanilmetiI)-3H-hinazoIin-4-on

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem Intermedijera 2b (200 mg. 0,519 mmol). 6-merkaptopurin monohidrata (97 mg, 0,570 mmol), K2CO3(79 mg, 0,572 mmol) i DMF (5 ml). Sirovi proizvod je rekristalizovan iz EtOH, kako bi se dobilo 123 mg sivo-žućkaste čvrste supstance (47%), t.t. 212-242 °C (postepeno razlaganje). 'H NMR (DMSO-d6) 6 : 13.07 (br s, IH); 8.48 (s, IH); 8.44 (s, IH); 8.24 (d, J=2.3 Hz, IH); 8.06 (dd, .1=2.3, 8.7 Hz, IH); 7.76 (dd, J=1.9, 7.4 Hz, IH); 7.70 (d, J=8.7 Hz, IH); 7.66 (d, J=8.1 Hz, IH); 7.51 (dd, J=2.1, 7.9 Hz, IH); 7.46 (dd, J=1.9, 7.9 Hz, IH); 4.47 (s, 2H).<13>C NMR (DMSO-d6) ppm: 159.7, 156.8, 153.6, 151.5, 146.1, 143.6, 138.5, 134.0, 132.1, 131.8, 131.5, 130.5, 130.2, 129.9, 128.9, 128.8, 122.2, 120.3, 32.0. MS (ES) : m/z 499.0 (M+). Analiza računata za C20Hi2ClBrN6OS'0.2C2l-l6O-0.05KCl : C, 47.79; H, 2.59; N, 16.39: S, 6.25. Pronađeno: C, 47.56; H, 2.54; N, 16.25; S. 6.58.

Jedinjenje D-018

3-(2-HIorofeniI)-(9H-purin-6-iIsulfanilmetil)-trifluorometil-3H-hinazolin-4-on

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem Intermedijera 2m (200 mg, 0,536 mmol), 6-merkaptopurin monohidrata (100 mg, 0,588 mmol), K2C03(82 mg, 0,593 mmol) i DMF (4 ml). Sirovi proizvod je rekristalizovan iz EtOH, kako bi se dobilo 148 mg bele čvrste supstance (56%), t.t. 218,5-219,4 °C. 'H NMR (DMSO-d6) 5 : 13.52 (br s, IH): 8.48 (s, IH); 8.44 (s, IH); 8.43 (d, J=6.0 Hz, IH); 8.26 (d, J=7.5 Hz, IH); 7.84 (dd, J=2.5. 6.7 Hz. IH); 7.70-7.75 (m, 2H); 7.51-7.59 (m, 2H); 4.40-4.55 (m, 2H).<13>C NMR (DMSO-d6) ppm: 160.0, 157.2, 154.2, 151.4, 149.6, 144.4, 143.4, 133.8, 133.0 (q, J=5.1 Hz), 132.0, 131.9, 131.6, 131.4, 130.6, 129.0, 127.3, 125.2 (q, J=30 Hz), 123.6 (q, J=273 Hz), 121.8, 32.6. MS (ES) : m/z 489.0 (M+). Analiza računata za C2iH12ClF3N6OS : C, 51.59; H, 2.47; CL 7.25; N, 17.19; S. 6.56. Pronađeno: C, 51.51; H. 2.55; Cl, 7.37; N, 17.05; S, 6.38.

Jedinjenje D-019

3-(2-HlorofeniI)-2-(9H-purin-6-ilsuIfanilmetil)-3H-benzo[g]hinazolin-4-on

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem Intermedijera 2n (200 mg, 0,563 mmol), 6-merkaptopurin monohidrata (105 mg, 0,619 mmol), K2CO3(86 mg, 0,619 mmol) i DMF (4 ml). Sirovi proizvod je rekristalizovan iz EtOH, kako bi se dobilo 128 mg tamno žute čvrste supstance (48%), t.t. 247,8-254,4 °C (razlaganje). 'H NMR (DMSO-d6) 6 : 13.56 (br s, IH); 8.90 (s, IH); 8.50 (s, IH); 8.46 (s, IH); 8.34 (s, IH); 8.27 (d, J=8.2 Hz, IH); 8.16 (d, J=8.2 Hz, IH); 7.81 (dd, J=1.6, 7.3 Hz, IH); 7.70 (t, J=7.5 Hz, IH); 7.61-7.74 (m, 2H); 7.49 (t, .1=7.5 Hz, IH); 7.44-7.53 (m, IH); 4.44-4.56 (m, 2H).<I3>C NMR (DMSO-d6) ppm: 161.3, 151.6, 151.5, 143.9, 142.2, 136.7, 134.4, 132.5, 131.8, 131.6, 130.5, 129.7, 129.3, 128.8. 128.6, 128.3, 128.3, 127.1, 125.2, 119.5, 32.4. MS (ES) : m/z 471.0 (M+). Analiza računata za C24H15ClN6OS-0.2C2H6O'0.05KCl : C, 60.57; H, 3.37; Cl, 7.69; N, 17.37; S, 6.63. Pronađeno: C, 60.24; H, 3.46; Cl, 7.50; N, 17.34; S, 6.69.

Jedinjenje D-020

6-Hloro-3-(2-hlorofenil)-2-(9H-purin-6-il-sulfanilmetiI)-3H-hinazolin-4-on

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem Intermedijera 2d (200 mg, 0,587 mmol), 6-merkaptopurin monohidrata (110 mg, 0,646 mmol), K2CO3(90 mg, 0,651 mmol) i DMF (5 ml). Sirovi proizvod je rekristalizovan iz EtOH, kako bi se dobilo 113 mg žute kristalne čvrste supstance (42%), t.t. 237,1-238,2 °C (razlaganje). 'H NMR (DMSO-d6) 5 : 13.55 (br s, IH); 8.48 (s, IH); 8.44 (s, IH); 8.11 (s, IH); 7.94 (d, J=8.3 Hz, IH); 7.78 (d, .1=8.1 Hz, 2H); 7.66 (d, .1=6.7 Hz, IH); 7.48-7.56 (m, 2H); 4.48 (s, 2H).<I3>C NMR (DMSO-d6) ppm: 159.8, 156.8, 153.5, 151.5, 149.6, 145.8, 143.6, 135.7, 134.0, 132.2, 132.1, 131.7, 131.5, 130.5, 130.2, 129.8, 128.8, 125.8, 121.9, 32.0. MS (ES) : m/z 455.0 (M+). Analiza računata za C2oHi2Cl2N60S«0.1C2H60-0.6H20 (0.15KC1 : C, 50.34; H, 2.89; Cl, 15.82; N, 17.44; S, 6.65. Pronađeno: C, 50.02; H, 2.63;.C1, 15.51; N, 17.39; S. 6.81.

JedinjenjeD-021

8-HIoro-3-(2-hlorofeniI)-2-(9H-purin-6-iI-sulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem Intermedijera 2h (200 mg, 0,589 mmol), 6-merkaptopurin monohidrata (124 mg, 0,726 mmol), K2C03(100 mg, 0,726 mmol) i DMF (4 ml). Sirovi proizvod je rekristalizovan iz EtOH, kako bi se dobilo 202 mg bele čvrste supstance (75%), t.t. 211,9-212,7 °C (razlaganje). 'H NMR (DMSO-d6) 8 : 13.54 (br s, IH); 8.47 (s, IH); 8.44 (s, IH); 8.12 (d, J=7.9 Hz, IH); 8.07 (d, J=7.6 Hz, IH); 7.78 (d, J=7.5 Hz, IH); 7.67 (d, J=7.1 Hz, IH); 7.58 (t, J=7.9 Hz, IH); 7.42-7.54 (m, 2H); 4.52 (s, 2H).<!3>C NMR (DMSO-d6) ppm: 160.3, 156.9, 153.9, 151.5, 149.7, 143.5, 135.7, 134.0, 132.1, 131.8, 131.4, 131.1, 130.5, 130.3, 128.9, 128.3, 126.1, 122.4, 32.5. MS (ES) : m/z 455.0 (M+). Analiza računata za C20H12CI2N6OS : C, 52.76; H, 2.66; Cl, 15.57; N, 18.46; S, 7.04. Pronađeno: C, 52.65; H, 2.79; Cl, 15.32; N, 18.47; S, 7.18.

Jedinjenje D-022

3-(2-Hlorofenil)-7-fluoro-2-(9H-purin-6-il-sulfanilmetiI)-3H-hinazolin-4-on

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem Intermedijera 2c (200 mg. 0,619 mmol), 6-merkaptopurin monohidrata (116 mg, 0,681 mmol), K2CO3(95 mg, 0.687 mmol) i DMF (4 ml). Sirovi proizvod je rekristalizovan iz EtOH, kako bi se dobilo 143 mg bele kristalne čvrste supstance (53%), t.t. 151,4-154,2 °C (obezbojavanje). 'H NMR (DMSO-d6) 6 : 13.55 (br s, IH); 8.48 (s, IH); 8.44 (s, IH); 8.23 (dd, J=6.3, 8.7 Hz, IH); 7.77 (dd, J=1.7, 7.4 Hz, IH); 7.64 (d, J=7.4 Hz, IH); 7.57 (d, J=9.8 Hz, IH); 7.45-7.52 (m, 3H); 4.48 (s, 2H).<13>C NMR (DMSO-d6) ppm: 169.0 (d, J=253 Hz), 162.6, 159.3, 157.0, 154.0, 152.2, 151.7 (d, J=13 Hz), 146.1, 136.5, 134.7, 134.2, 134.0, 133.0, 132.6 (d, .1=11 Hz), 131.3, 120.2, 118.9 (d, .1=24 Hz), 115.3 (d, J=22 Hz), 34.6. MS (ES) : m/z 439.0 (M+). Analiza računata za C2oH]2ClFN6OS-0.4-C2H60'0.4H20 (0.15KC1 : C, 52.52; H, 3.22; Cl, 8.57; N, 17.67. Pronađeno: C, 52.25; H, 3.11; Cl, 8.20; N, 17.69.

Jedinjenje D-023

3-(2-HIorofeniI)-7-nitro-2-(9H-purin-6-il-sulfanilmetil)-3H-hinazoiin-4-on

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem Intermedijera 2o (216 mg, 0,617 mmol), 6-merkaptopurin monohidrata (116 mg, 0,681 mmol), K2C03(94 mg, 0,680 mmol) i DMF (4 ml). Sirovi proizvod je rekristalizovan iz EtOH, kako bi se dobilo 212 mg žute kristalne čvrste supstance (74%), t.t. 218,0-218,3 °C (razlaganje). 'H NMR (DMSO-d6) 6 : 13.56 (br s, IH); 8.49 (s, IH); 8.42 (s, IH); 8.38-8.45 (m, 2H); 8.31 (d, J=8.4 Hz, IH); 7.81 (d, J=6.5 Hz, IH); 7.68 (d, J=6.7 Hz, IH); 7.43-7.58 (m, 2H); 4.53 (s, 2H).<I3>C NMR (DMSO-d6) ppm: 157.7, 154.4, 153.3, 149.8, 149.3, 147.6, 145.2, 141.4, 131.5, 129.8, 129.7, 129.2, 128.4, 127.1, 126.7, 122.7, 120.3, 119.4, 29.9. MS (ES) : m/z 466.0 (M+). Analiza računata za C2oH,2ClN703S'0.4C2H60»0.05KCl : C, 51.19; H, 2.97; Cl, 7.63; N, 20.09; S, 6.57. Pronađeno: C, 51.27; H, 2.88; Cl, 7.40; N, 20.04; S, 6.52.

Jedinjenje D-024

3-(2-Hlorofenil)-6-hidroksi-2-(9H-purin-6-il-sulfanilmetiI)-3H-hinazolin-4-on

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem Intermedijera 2p (200 mg, 0,552 mmol), 6-merkaptopurin monohidrata (117 mg, 0,685 mmol). K2C03(95 mg, 0,687 mmol) i DMF (4 ml). Sirovi proizvod je rekristalizovan iz EtOH, kako bi se dobilo 182 mg bele čvrste supstance, koja je smeša željenog proizvoda i acetilnog derivata. Deo ovog materijala (120 mg) je suspendovan u smeši MeOH (2 ml) i vodenog rastvora NaHC03(zasićeni rastvor, 1 ml), i mešan velikom brzinom tokom 4 časa. Smeša je koncentrovana u vakuumu, suspendovana u H20 (10 ml), i ostavljena na temperaturi od 4 °C tokom noći. Belča čvrsta supstanca je prikulpljena i osušena, kako bi se dobilo 103 mg željene supstance (66%), t.t. 186-214 °C (postepeno razlaganje). 'H NMR (DMSO-d6) 6 : 8.48 (s, IH); 8.45 (s, IH); 7.71 (d, J=6.8 Hz, IH); 7.62-7.64 (m, 2H); 7.43-7.51 (m, 2H); 7.40-7.43 (m, IH); 7.35 (d, J=8.8 Hz, IH); 4.39-4.52 (m, 2H).<13>C NMR (DMSO-d6) ppm: 160.6, 157.1, 156.2, 151.4, 150.8, 149.3. 144.1, 140.2, 134.5, 132.2, 131.6, 131.4. 130.4, 129.3, 128.7. 124.8, 121.7, 109.8, 32.0. MS (ES) : m/z 437.0 (M+). Analiza računata za (2 C20H13ClN6O2S'0.1 C2H60'6H20 : C, 49.68; H, 3.88; Cl, 7.26; N, 17.21; S, 6.57. Pronađeno: C. 49.43; H, 3.62; Cl, 7.32; N, 17.07; S,6.58.

JedinjenjeD-025

5-Hloro-3-(2-hlorofenil)-2-(9H-purin-6-il-sulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem Intermedijera 2f (300 mg. 0,883 mmol), 6-merkaptopurin monohidrata (165 mg, 0,972 mmol), K2C03(134 mg, 0,972 mmol) i DMF (4 ml). Sirovi proizvod je rekristalizovan iz EtOH, kako bi se dobilo 314 mg bledo narandžaste kristalne čvrste supstance (85%), t.t. 233,7-234,4 °C (razlaganje). 'H NMR (DMSO-d6) 5 : 13.58 (br s, IH); 8.50 (s, IH); 8.47 (s, IH); 7.77-7.85 (m, 2H); 7.68 (d, J=8.1 Hz, 2H); 7.65 (d, J=7.7 Hz, IH); 7.41-7.56 (m, 2H); 4.45 (d, J=1.2 Hz, 2H).<13>C NMR (DMSO-d6) ppm: 158.7, 156.8, 153.8, 151.5, 149.6, 149.5, 143.5, 135.4, 134.1, 133.3, 132.2, 131.6, 131.6, 130.5, 130.2, 128.8, 127.1, 117.6, 32.0. MS (ES) : m/z 455.0 (M+). Analiza računata za C2oHi2Cl2N6-OS'C2H60'0.3H2 : C, 52.14; H, 3.70; Cl, 13.99; N, 16.58; S, 6.33. Pronađeno: C, 52.07; H, 3.37; Cl, 13.40; N, 16.65; S, 6.42.

Jedinjenje D-026

3-(2-HlorofeniI)-5-metil-2-(9H-purin-6-il-sulfanilmetiI)-3H-hinazolin-4-on

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem Intermedijera 2g (300 mg, 0,940 mmol), 6-merkaptopurin monohidrata (176 mg. 1,03 mmol), K2CO3(142 mg, 1,03 mmol) i DMF (5 ml). Sirovi proizvod je rekristalizovan iz EtOH, kako bi se dobilo 324 mg bele kristalne čvrste supstance (79%), t.t. 227,8-230,1 °C (razlaganje). 'H NMR (DMSO-d6) 6 : 13.57 (br s, IH); 8.49 (s, IH); 8.47 (s, IH); 7.69-7.78 (m, 2H); 7.66 (d, J=7.3 Hz, IH); 7.55 (d, J=7.9 Hz, IH); 7.39-7.52 (m, 2H); 7.36 (d, J=6.9 Hz, IH); 4.38-4.50 (m, 2H); 2.74 (s, 3H).<13>C NMR (DMSO-de) ppm: 161.2, 156.3, 152.4, 151.5, 148.6, 143.9, 141.0, 134.6, 134.5, 132.3, 131.7, 131.4, 130.4, 130.2, 128.7, 125.7. 119.0, 32.0, 22.8. MS (ES) : m/z 435.0 (M+). Analiza računata za C2iHi5ClN6OS«0.65C2H6O-0.1H2O : C, 57.40; H, 4.13; Cl. 7.60; N, 18.01; S, 6.87. Pronađeno: C, 57.11; H, 3.96; Cl, 7.45; N, 17.79; S, 6.90.

Jedinjenje D-027

3-(2-HlorofeniI)-6,7-difluoro-2-(9H-purin-6-iI-sulfanilmetiI)-3H-hinazolin-4-on

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem Intermedijera 2q (200 mg, 0,586 mmol), 6-merkaptopurin monohidrata (110 mg, 0,645 mmol), K2C03(89 mg, 0,645 mmol) i DMF (4 ml). Sirovi proizvod je rekristalizovan iz EtOH, kako bi se dobilo 143 mg bledo žute kristalne čvrste supstance (53%), t.t. 207,8 (obezbojavanje; oslobađa vlagu na 136 °C). 'H NMR (DMSO-d6) 5 : 13.57 (br s, IH); 8.49 (s, IH); 8.46 (s, IH); 8.11 (t, J=9.4 Hz, IH); 7.88 (dd, J=7.3, 11 Hz, IH); 7.77 (dd, J=1.7, 7.3 Hz, IH); 7.67 (d, J=7.4 Hz, IH); 7.42-7.55 (m, 2H); 4.48 (s, 2H).<13>C NMR (DMSO-d6) ppm: 159.5 (d, J=2.5 Hz), 154.6 (dd, J=14, 255 Hz), 154.0 (d, J=1.5 Hz), 151.5, 149.3 (dd, J=14, 250 Hz), 145.1 (d, J=12 Hz), 143.9, 133.9, 132.1, 131.8, 131.4, 130.5, 128.9, 118.0 (d, J=4.9 Hz), 115.8 (d, J=18 Hz), 114.6 (d, J=20 Hz), 32.0. MS (ES) : m/z 457.0 (M+). Analiza računata za C20HiiClF2N6OS : C, 52.58; H, 2.43; Cl, 7.76; N, 18.40; S, 7.02. Pronađeno: C, 51.81; H, 2.37; Cl, 7,49; N, 18.04; S, 7.55.

Jedinjenje D-028

3-(2-Hlorofenil)-6-fluoro-2-(9H-purin-6-il-sulfanilmetiI)-3H-hinazolin-4-on

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem Intermedijera 2r (118 mg, 0,365 mmol). 6-merkaptopurin monohidrata (68 mg, 0,402 mmol), K2C03(56 mg, 0,402 mmol) i DMF (2 ml). Sirovi proizvod je rekristalizovan iz EtOH, kako bi se dobilo 103 mg sivo-žučkaste kristalne čvrste supstance (64%), t.t. 232,8-233,0 °C (obezbojavanje).<]>H NMR (DMSO-d6) 5 : 13.56 (br s, IH); 8.48 (s, IH); 8.44 (s, IH); 7.81-7.86 (m, 3H); 7.76 (d, J=7.5 Hz, IH): 7.67 (d, J=7.5 Hz, IH); 7.40-7.54 (m, 2H); 4.48 (br s, 2H).<13>C NMR (DMSO-d6) ppm: 160.8 (d, ,K247 Hz), 160.2 (d, J=3.3 Hz), 156.9, 152.3 (d, J=1.9Hz), 151.5, 149.7, 144.0, 143.6, 134.1, 132.1, 131.7, 131.5, 130.5, 130.4, 130.2, 128.8, 124.0 (d, .1=24 Hz), 122.0 (d, J=8.7 Hz), 111.7 (d, J=24 Hz), 32.0. MS (ES) : m/z 439.0 (M+). Analiza računata za C2oH)2ClFN60S-0.2C2H600.1H20 : C, 54.46; H, 3.00; Cl, 7.88; N, 18.68. Pronađeno: C, 54.09; H, 2.73; Cl, 7.80; N, 18.77.

JedinjenjeD-029

2-(6-Aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-izopropilfenil)-5-metiI-3H-hinazolin-4-on

Tionil hlorid (2,2ml, 30 mmol) je dodat u rastvor 2-amino-6-metilbenzojeve kiseline (1,51 g, 10 mmol) u benzenu (50 ml), uz mešanje, a smeša je potom zagrevana na temperaturi refluktovanja, tokom 18 časova. Nakon hlađenja, rastvarač je uklonjen u vakuumu, a ostatak je dva puta ispran benzenom (25 ml). Ostatak je rastvoren u CHCb (50 ml) i tretiran sa 2-izopropilanilinom (2,83 ml, 20 mmol). Sluzava smeša je potom zagrevana na temperaturi refluktovanja tokom 3 časa. Tada je TLC (50% smeša EtOAc i heksana) indikovala da je reakcija okončana. Nakon hlađenja do sobne temperature, reakciona smeša je postavljena na kolonu silika gela od 4 cm i eluirana 20% smešom EtOAc i heksana. Frakcionisani proizvod je pomešan i koncentrovan u vakuumu. Ostatak je rastvoren u HOAc (50 ml) i tretiran hloroacetil hloridom (1,6 ml, 20 mmol), pa je smeša zagravana na temperaturi refluktovanja tokom 18 časova. Reakciona smeša je potom ohlađena i koncentrovana u vakuumu. Preostali HOAc je uklonjen trostrukim azeotropiranjem toluenom (25 ml). Ostatak je rastvoren u toluenu (10 ml) i propušten kroz kolonu silika gela od 4 cm, eluiran sa 20% smešom EtOAc i heksana. Frakcionisani proizvod je identifikovan korišćenjem LCMS (MS (ES): m/z 327 (M+)), i koncentrovan u vakuumu, kako bi se dobilo 975 mg (30%) proizvoda u vidu bele pene. Hlorid u vidu bele pene (450 mg, 1,36 mmol) je rastvoren u DMF (10 ml) i tretiran adeninom (275 mg, 2,04 mmol) i K2CO3(281 mg, 2,04 mmol), a smeša je mešana tokom noći na sobnoj temperaturi. Suspenzija je zatim usuta u 200 ml vode, mešana tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim ohlađena u frižideru tokom 30 minuta. Nastala čvrsta supstanca je prikupljena vakuum filtracijom i rekristalizovana iz EtOH, kako bi se dobilo 285 mg (49%) sivo-žućkaste čvrste supstance, t.t. 258,0-258.2 °C. 'HNMR (DMSO-d6) 5 : 8.19 (s, IH), 8.09 (s, IH), 7.60 (m, 3H), 7.45 (m, 2H), 7.23 (m, 3H), 5.11 (d, J=17.5 Hz, IH), 4.71 (d, J=17.5 Hz, IH), 2.68 (s, 3H), 2.73 (q, J=6.9 Hz, IH), 1.34 (d, J=6.8 Hz, 3H), 1.13 (d, J=6.8 Hz, 3H). 13C NMR (DMSO-d6) ppm: 161.9, 156.2, 152.8, 151.6, 150.1, 148.4, 146.1, 142.2, 140.8, 134.3, 133.7, 130.6, 130.0, 129.0, 127.7, 127.6, 125.8, 119.2, 118.4, 44.8, 28.3, 24.4. 23.3, 22.9. MS (ES) : m/z 426.4 (M+). Analiza računata za C24H23N7O : C, 67.75; H, 5.45; N, 23.04. Pronađeno: C, 67.60; H, 5.45; N, 22.82.

JedinjenjeD-030

2-(6-Aminopurin-9-ilmetiI)-5-metil-3-o-toIil-3H-hinazolin-4-on

Tionil hlorid (2,2ml, 30 mmol) je dodat u rastvor 2-amino-6-metilbenzojeve kiseline (1,51 g, 10 mmol) u benzenu (50 ml), uz mešanje, a smeša je potom zagrevana na temperaturi refluktovanja, tokom 18 časova. Nakon hlađenja, rastvarač je uklonjen u vakuumu, a ostatak je dva puta ispran benzenom (25 ml). Ostatak je rastvoren u CHCI3(50 ml) i tretiran sa0-toluidinom (2,13 ml, 20 mmol). Sluzava smeša je potom zagrevana na temperaturi refluktovanja tokom 3 časa. Tada je TLC (50% smeša EtOAc i heksana) indikovala da je reakcija okončana. Nakon hlađenja do sobne temperature, reakciona smeša je postavljena na kolonu silika gela od 4 cm i eluirana 20% smešom EtOAc i heksana. Frakcionisani proizvod je pomešan i koncentrovan u vakuumu. Ostatak je rastvoren u HOAc (50 ml) i tretiran hloroacetil hloridom (1,6 ml, 20 mmol), pa je smeša zagravana na temperaturi refluktovanja tokom 18 časova. Reakciona smeša je potom ohlađena i koncentrovana u vakuumu. Preostali HOAc je uklonjen trostrukim azeotropiranjem toluenom (25 ml). Ostatak je rastvoren u toluenu (10 ml) i propušten kroz kolonu silika gela od 4 cm, eluiran sa 20% smešom EtOAc i heksana. Frakcionisani proizvod je identifikovan korišćenjem LCMS (MS (ES): m/z 299 (M+)), i koncentrovan u vakuumu, kako bi se dobilo 476 mg (16%) proizvoda u vidu bele pene. Hlorid u vidu bele pene (470 mg, 1,57 mmol) je rastvoren u DMF (10 ml) i tretiran adeninom (423 mg, 3,14 mmol) i K2CO3(433 mg, 3,14 mmol), a smeša je mešana tokom noći na sobnoj temperaturi. Suspenzija je zatim usuta u 200 ml vode, mešana tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim ohlađena u frižideru tokom 30 minuta. Nastala čvrsta supstanca je prikupljena vakuum filtracijom i rekristalizovana iz EtOH, kako bi se dobilo 123 mg (20%) sivo-žućkaste čvrste supstance, t.t. 281,5-282,7 °C. 'H NMR (DMSO-d6) 6 : 8.07 (s, IH); 8.05 (s, IH); 7.61 (t, J=7.8 Hz, IH), 7.48 (m, 4H), 7.25 (m, 3H), 5.09 (d, .1=17.4 Hz, IH), 4.76 (d, J=l7.4 Hz, IH), 2.73 (s, 3H), 2.18 (s, 3H). 13C NMR (DMSO-d6) ppm: 161.3,156.2, 152.8, 151.4, 150.0, 148.5, 142.2, 140.9, 136.1, 135.4, 134.3, 131.7, 130.1, 130.0, 129.0, 128.0, 125.8, 119.2, 118.5, 44.8, 22.9, 17.4. MS (ES) : m/z 398.2 (M+). Analiza računata za C22H19N7O : C, 66.49; H, 4.82; N, 24.67. Pronađeno: C, 66.29; H, 4.78; N. 24.72.

JedinjenjeD-031

3-(2-FluorofeniI)-5-metil-2-(9H-purin-6-il-suIfanilmetil)-3H-hinazoIin-4-on

Tionil hlorid (2,2ml, 30 mmol) je dodat u rastvor 2-amino-6-metilbenzojeve kiseline (1,51 g, 10 mmol) u benzenu (50 ml), uz mešanje, a smeša je potom zagrevana na temperaturi refluktovanja, tokom 18 časova. Nakon hlađenja, rastvarač je uklonjen u vakuumu, a ostatak je dva puta ispran benzenom (25 ml). Ostatak je rastvoren u CHCI3(50 ml) i tretiran sa 2-fluoroanilinom (1,93 ml, 20 mmol). Sluzava smeša je potom zagrevana na temperaturi refluktovanja tokom 3 časa. Tada je TLC (50% smeša EtOAc i heksana) indikovala da je reakcija okončana. Nakon hlađenja do sobne temperature, reakciona smeša je postavljena na kolonu silika gela od 4 cm i eluirana 20% smešom EtOAc i heksana. Frakcionisani proizvod je pomešan i koncentrovan u vakuumu. Ostatak je rastvoren u HOAc (50 ml) i tretiran hloroacetil hloridom (1,6 ml, 20 mmol), pa je smeša zagravana na temperaturi refluktovanja tokom 18 čsaova. Reakciona smeša je potom ohlađena i koncentrovana u vakuumu. Preostali HOAc je uklonjen trostrukim azeotropiranjem toluenom (25 ml). Ostatak je rastvoren u toluenu (10 ml) i propušten kroz kolonu silika gela od 4 cm, eluiran sa 20% smešom EtOAc i heksana. Frakcionisani proizvod je identifikovan korišćenjem LCMS (MS (ES): m/z 303 (M+)), i koncentrovan u vakuumu, kako bi se dobilo 1,21 g (37%) proizvoda u vidu bele pene. Hlorid u vidu bele pene (455 mg, 1,50 mmol) je rastvoren u DMF (10 ml) i tretiran 6-merkaptopurin monohidratom (510 mg, 3,0 mmol) i K2CO3(414 mg, 3,0 mmol), a smeša je mešana tokom noći na sobnoj temperaturi. Suspenzija je zatim usuta u 200 ml vode, mešana tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim ohlađena u frižideru tokom 30 minuta. Nastala čvrsta supstanca je prikupljena vakuum filtracijom i rekristalizovana iz EtOH, kako bi se dobilo 487 mg (77%) sivo-žućkaste čvrste supstance, t.t. 151,9-152,2 °C. 'H NMR (DMSO-d6) 5 : 8.48 (s, IH), 8.44 (s, IH), 7.70 (m, 2H), 7.48 (m, 2H), 7.33 (m, 3H), 4.55 (d, J=l5.1 Hz, IH), 4.48 (d, J=15.1 Hz, IH), 2.73 (s, 3H).<13>C NMR (DMSO-d6) ppm: 161.3, 157.8 (d, J=249.1 Hz),'156.9, 152.8, 151.5, 149.6, 148.6, 143.6, 140.9, 134.7, 131.9 (d, J=8.0Hz), 131.4, 130.2, 125.6 (d, J=3.6 Hz), 125.5, 124.4 (d, J=13.5 Hz), 118.8, 116.6 (d, .1=3 9.6 Hz), 56.4, 22.9. MS (ES) : m/z 419.5 (M+). Analiza računata za C2]H]5FN6OS'0.15 C2HćO : C, 60.14; H, 3.77; F, 4.47; N, 19.76; S, 7.54. Pronađeno: C, 59.89; H, 3.88; F, 4.42; N, 19.42; S, 7.23.

Jedinjenje D-032

2-(6-Aminopurin-9-ilmetil)-5-hloro-3-o-tolil-3H-hinazoIin-4-on

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem jedinjenja 2j (200 mg, 0,626 mmol), adenina (93 mg, 0,689 mmol), K2C03(95 mg, 0,689 mmol) i DMF (3 ml). Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom u smeši MeOH i CH2CI2, kako bi se dobilo 101 mg sivo-žučkaste čvrste supstance (39%), t.t. 262,0-266,5 °C. 'H NMR (DMSO-d6) 8 : 8.08 (s, IH); 8.07 (s, IH); 7.70 (t, J=8.0 Hz, IH); 7.58 (dd, J=0.6, 7.9 Hz, IH); 7.43-7.57 (m, 4H); 7.36 (dd, J=0.7, 8.0 Hz, IH); 7.26 (br s, 2H); 5.12 (d, J=l8 Hz, IH); 4.78 (d, J=18 Hz, IH); 2.20 (s, 3H).<13>C NMR-(DMSO-d6) ppm: 158.7, 156.2, 152.9, 152.7, 150.0, 149.4, 142.1, 136.1, 135.1, 135.0, 133.2, 131.8, 130.3, 130.1, 128.9, 128.1, 127.2, 118.5, 117.9, 44.9, 17.4. MS (ES) : m/z 418.1 (M+). Analiza računata za C2|H,6ClN7O-0.1H2O-0.05KCl : C, 59.57; H, 3.86; Cl, 8.79; N, 23.16. Pronađeno: C, 59.65; H, 3.80; Cl, 8.70; N, 22.80.

Jedinjenje D-033

2-(6-Aminopurin-9-ilmetil)-5-hloro-3-(2-metoksi-fenil)-3H-hinazolin-4-on

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem jedinjenja 21 (250 mg, 0,746 mmol), adenina (111 mg, 0,821 mmol), K2C03(113 mg, 0,821 mmol) i DMF (4 ml). Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom u smeši MeOH i CH2C12, i rekristalizovan iz EtOH, kako bi se dobilo 124 mg braon čvrste supstance (38%), t.t. 257,0-257,1 °C.<!>H NMR (DMSO-d6) 5 : 8.06 (s, IH); 8.01 (s, IH); 7.71 (t, J=8.0 Hz, IH); 7.57 (dd, J=0.9, 7.9 Hz, IH); 7.52-7.59 (m, IH); 7.50 (dd, J=1.6, 7.8 Hz, IH); 7.38 (dd, J=l.l, 8.2 Hz, IH); 7.27 (dd, J=0.6, 8.3 Hz, IH); 7.24 (br s, 2H); 7.17 (dt, J=0.9, 7.6 Hz, IH); 5.07 (d, J=17 Hz, IH); 4.97 (d, J=17 Hz, IH); 3.79 (s, 3H).<I3>C NMR (DMSO-dć) ppm: 158.8, 156.2, 154.7, 153.2, 152.8, 150.1, 149.3, 142.0, 135.1, 133.2, 131.8, 130.1, 130.1, 127.2, 123,8, 121.6, 118.4, 117.9, 113.1, 56.2,44.8. MS (ES) : m/z 434.0 (M+). Analiza računata za C2|H,6ClN7Or0.5H2O'0.04KCl : C, 56.57; H, 3.84; Cl, 8.27; N, 21.99. Pronađeno: C, 56.29; H, 3.75; Cl, 8.21; N, 23.61.

Sledeća jedinjenja su sintetisana, generalno uzevši prema gore opisanim postupcima, i služe kako bi dalje ilustrovala specifična rešenja predmetnog pronalaska: 3K2,6-dihlorofenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hin (D-034) . 3-(2-izopropilfenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-o (D-035) 3-(2-metoksifenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hin (D-036) 3-benzil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on (D-037)

3-butil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilrnetil)-3H-hinazolin-4-on (D-038)

3-morfolin-4-il-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on, acetatna so (D-039) 3-(3-metoksifenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on (D-040) 3-(3-hlorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on (D-041) 2- (9H-purin-6-ilsulfanilmetil)- 3-piridin-4-il-3H-hinazolin-4-on (D-042) 3- benzil-5-fluoro-2-(9H-purin-6-ilsulfanilrnetil)-3H-hinazolin-4-on (D-04-3) 3-(4-metilpiperazin-l-il)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on, acetatna so (D-044)

etil estar [5-fluoro-4-okso-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-4H-hinazolin-3-il] sirćetne kiseline

(D-045)

3-(2-metoksifenil)-2-(9H-purii>6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on (D-046) 3-(2-metoksifenil)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil) -3H-hinazolin-4-on (D-047) 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-fluorofenil)-5-metil-3H-hinazolin-4-on (D-048) 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-benzil-5-fluoro-3H-hinazolin-4-on (D-049) 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-butil-3H-hinazolin-4-on (D-050)

2- (6-ajninopurin-9-ilrnetil)-3-morfolin-4-il-3H-hinazolin-4-on, acetatna so (D-051)

3- (4-hlorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on (D-052).

Dodatna jedinjenja predmetnog pronalaska su dobijena sledećim sintetičkim postupcima.

Sledeći intermedijeri su dobijeni gore opisanim Postupkom A.

3 a R=ciklopropil

3 b R=ciklopropilmetil

3 c R=fenetil

3d R=ciklopentil

3e R=3-(2-hloro)piridil

3f R=4-(2-metil)benzojeva kiselina

3g R=4-nitrobenzil

3h R=cikloheksil

3i R=E-(2-fenil)ciklopropil

Sledeća jedinjenja predmetnog pronalaska (D-053 do D-070), sa sledećom osnovnom strukturom, opisana su u eksperimentalnom delu koji sledi. Sva ova jedinjenja su dobijena prema Postupku C.

Osnovna struktura:

2-(2-Amino-9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3-cikJopropil-5-metil-3H-hinazoIin-4-on

(D-053)

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem jedinjenja 3a (100 mg, 0,4 mmol), 2-amino-6-merkaptopurina (80 mg, 0,48 mmol) i K2CO3(77 mg, 0,56 mmol). Sirovi proizvod je prečišćen sprašivanjem iz H20. 'H NMR (DMSO-d6) 5 : 7.89 (d, J=0.9 Hz, IH); 7.54 (t, J=7.4 Hz, IH); 7.34 (d, J=8.1 Hz, IH); 7.19 (d, J=7.2 Hz, IH); 6.28 (s, 2H); 4.94 (s, 2H); 2.70 (s, 3H); 1.24 (d, J=6.5 Hz, 2H); 0.91 (s, 2H). MS (ES): m/z 380 (M+H), 190.

3 -Ciklopropilmetil-5-metiI-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on (D-054)

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem jedinjenja 3b (300 mg, 1,14 mmol), 6-merkaptopurin monohidrata (214 mg, 1,26 mmol) i K2CO3(189 mg, 1,37 mmol). Sirovi proizvod je prečišćen sprašivanjem iz H20, a zatim rekristalizacijom iz MeOH.<!>H NMR (DMSO-d6) 5 : 13.60 (br s, IH); 8.72 (s, IH); 8.48 (s, IH); 7.63 (t, J=7.8 Hz, IH); 7.42 (d, J=8.0 Hz, IH); 7.28 (d, J=7.3 Hz, IH); 5.01 (s, 2H);4.11 (d, J=6.8 Hz, 2H); 2.78 (s, 3H); 1.35 (kvint, J=6.2 Hz, IH); 0.44-0.59 (m, 4H). MS (ES) : m/z 379 (M+H), 325.

2- (6-Aminopurin-9-ilmetil)-3-ciklopropilmetil-5-metil-H-hinazolin-4-on (D-055)

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem jedinjenja 3b (300 mg, 1,14 mmol), adenina (170 mg, 1,26 mmol) i K2C03(189 mg, 1,37 mmol). Sirovi proizvod je prečišćen sprašivanjem iz H20, a zatim rekristalizacijom iz MeOH. 'H NMR (DMSO-d6) 5 : 8.21 (s, IH); 8.10 (s, IH); 7.52 (t, J=7.7 Hz, IH); 7.18-7.31 (m, 3H); 7.06 (d, J=8.1 Hz, IH); 5.68 (s, 2H);4.14 (d, J=6.8 Hz, 2H); 2.77 (s, 3H); 1.34 (kvint, JM6.4 Hz, IH); 0.45-0.60 (m, 4H). MS (ES): m/z 362 (M+H), 308.

2-(2-Amino-9H-purin-6-ilsulfanilmeM^

(D-056)

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem jedinjenja 3b (280 mg, 1,1 mmol), 2-amino-6-merkaptopurina (200 mg, 1,2 mmol) i K2CO3(180 mg, 1,3 mmol). Sirovi proizvod je prečišćen sprašivanjem iz MeOH. 'H NMR (DMSO-d6) 8 : 12.70 (br s, IH); 7.95 (s, IH); 7.64 (t, J=7.8 Hz, IH); 7.44 (d, J=7.9 Hz, IH); 7.28 (d, J=7.4 Hz, IH); 6.41 (s, 2H); 4.91 (s, 2H); 4.05 (d, J=6.8 Hz, 2H); 2.78 (s, 3H); 1.26-1.43 (m, IH); 0.36-0.56 (m, 4H). MS (ES) : m/z 394 (M+H), 340.

5- Metil-3-fenetil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on (D-057)

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem jedinjenja 3c (750 mg, 2,4 mmol), 6-merkaptopurin monohidrata (442 mg, 2,6 mmol) i K2CO3(398 mg, 2,9 mmol). Proizvod je prečišćen sprašivanjem iz H20. 'H NMR (DMSO-d6) 8 : 13.61 (s, IH); 8.71 (s, IH); 8.48 (s, IH); 7.65 (t, J=7.7 Hz, IH); 7.44 (d, J=7.9 Hz. IH); 7.16-7.35 (m, 6H); 4.89 (s, 2H); 4.29 (br t, J=7.9 Hz, 2H); 3.08 (br t, J=7.8 Hz, 2H); 2.81 (s, 3H). MS (ES) : m/z 429 (M+H). 105.

2- (2-Amino-9H-purin-6-ilsulfanilmetiI)-5-metil-3-fenetiI-3H-hinazolin-4-on (D-058)

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem jedinjenja 3c (750 mg, 2,4 mmol), 2-amino-6- merkaptopurina (435 mg, 2,6 mmol) i K2C03(398 mg, 2,9 mmol). Proizvod je prečišćen sprašivanjem iz H20. 'H NMR (DMSO-d6) 8 : 12.61 (s, IH); 7.95 (s, IH); 7.65 (t, J=7.7 Hz, IH); 7.45 (d, J=7.9 Hz, IH); 7.14-7.32 (m, 6H); 6.44 (s, 2H); 4.81 (s, 2H); 4.24 (br t, 3=1. 9 Hz, 2H); 3.04 (br t, J=7.8 Hz, 2H); 2.81 (s, 3H). MS (ES): m/z 444 (M+H), 340.

3- Ciklopentil-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on (D-059)

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem jedinjenja 3d (100 mg, 0,36 mmol), 6-merkaptopurin monohidrata (73 mg, 0,43 mmol) i K?C03(100 mg, 0,72 mmol). Proizvod je prečišćen reksristalizacijom iz MeOH. 'HNMR (DMSO-d6) 6 : 13.62 (br s, IH); 8.77 (s, IH); 8.48 (s, IH); 7.62 (t, J=7.7 Hz, IH); 7.42 (d, J=7.8 Hz, 2H); 7.26 (d, J=7.4 Hz, IH); 5.03 (s, 2H); 4.80 (quint, J=8.0 Hz, IH); 2.76 (s, 3H); 2.12-2.31 (m, 2H); 1.79-2.04 (m, 4H); 1.44-1.58 (m, 2H). MS (ES): m/z 393 (M+H), 325.

2- (6-Aminopurin-9-iImetil) -3-ciklopentil-5-metil-3H-hinazoIin-4-on (D-060)

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem jedinjenja 3d (100 mg, 0,36 mmol), adenina (58 mg, 0,43 mmol) i K2CO3(100 mg, 0,72 mmol). Proizvod je prečišćen rekristalizacijom iz MeOH. 'HNMR (DMSO-d6) 5 : 8.15 (s, IH); 8.11 (s, IH); 7.52 (t, J=7.7 Hz, IH); 7.16-7.31 (m, 3H); 7.10 (d, J=8.0 Hz, 2H); 5.68 (s, 2H); 4.78 (kvint, J=8.3 Hz, IH); 2.74 (s, 3H); 2.09-2.32 (m, 2H); 1.86-2.04 (m, 2H); 1.68-1.86 (m, 2H); 1.43-1.67 (m, 2H). MS (ES) : m/z 376 (M+H), 308, 154.

3- (2-Hloro-piridin-3-iI)-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsuIfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on (D-061)

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem jedinjenja 3e (500 mg. 1,6 mmol), 6-merkaptopurin monohidrata (289 mg, 1,7 mmol) i K2CO3(262 mg, 1,9 mmol). Proizvod je prečišćen sprašivanjem iz H20. MS (ES): m/z 436 (M+H), 200.

2-(6-Aminopurin-9-ilmetil)-3- (2-hloro-piridin-3-il) -5-metil-3H-hinazolin-4-on (D-062)

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem jedinjenja 3e (500 mg, 1,6 mmol), adenina (230 mg, 1,7 mmol) i K2CO3(262 mg, 1,9 mmol). Proizvod je prečišćen sprašivanjem iz H20.

'H NMR (DMSO-d6) 5 : 8.59 (dd, J=1.7, 4.8 Hz, IH); 8.22 (dd, J=1.7, 7.8 Hz, IH); 8.025 (s, IH); 8.017 (s, IH); 7.60-7.72 (m, 2H); 7.35 (t, J=8.2 Hz, 2H); 7.22 (s, 2H); 5.12 (d, J=17.0 Hz, IH); 5.02 (d, J=17.0 Hz, IH); 2.72 (s, 3H). MS (ES): m/z 419 (M+H).

3-Metil-4-[5-metil-4-okso-2-(9H-purin-6-ilsulfaniImetil)-4H-hinazolin-3-iI]-benzoje

kiselina (D-063)

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem jedinjenja 3f (400 mg, 1,17 mmol), 6-merkaptopurin monohidrata (219 mg, 1,29 mmol) i K2CO3(226 mg, 1,64 mmol). Proizvod je prečišćen rekristalizacijom iz MeOH. 'H NMR (DMSO-d6) 5 : 13.54 .(br s, IH); 8.44 (s, IH); 8.42 (s, IH); 7.80 (s, 2H); 7.71 (t, J=7.7Hz, IH); 7.59 (d, J=8.6 Hz, IH); 7.52 (d, J=7.9 Hz, IH); 7.34 (d, J=7.4 Hz, IH); 4.46 (d, J=15.4 Hz, IH); 4.34 (d, J=15.7 Hz, IH); 3.17 (d, J=4.4 Hz, IH); 2.73 (s, 3H); 2.17 (s, 3H). MS (ES):m/z459 (M+H).

3-Ciklopropil-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on (D-064)

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem jedinjenja 3a (100 mg, 0,40 mmol), 6-merkaptopurin monohidrata (90 mg, 0,53 mmol) i K2CO3(97 mg, 0,7 mmol). Proizvod je prečišćen sprašivanjem iz H20. 'H NMR (DMSO-d6) 6 : 8.69 (d, J=0.8 Hz, IH); 8.47 (s. IH); 7.57 (d, J=7.9 Hz, IH); 7.37 (d, J=8.1Hz, IH); 7.23 (d. J=7.3 Hz, IH); 5.08 (s, 2H); 3.06-3.18 (m, IH); 2.74 (s, 3H); 1.14-1.36 (m, 2H); 0.92-1.06 (m, 2H).

2-(6-Aminopurin-9-ilmetiI)-3-ciklopropil-5-metil-3H-hinazolin-4-on (D-065)

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem jedinjenja 3a (100 mg, 0,40 mmol), adenina (94 mg, 0,7 mmol) i K2C03(121 mg, 0,88 mmol). Proizvod je prečišćen sprašivanjem iz H20.

'H NMR (DMSO-d6) 5 : 8.19 (d, J=0.9 Hz, IH); 8.09 (d, J=1.0 Hz, IH); 7.48 (t, J=7.8 Hz, IH); 7.13-7.29 (m, 3H); 7.04.(d, J=8.1 Hz, IH); 5.74 (s, 2H); 3.00-3.13 (m, IH); 2.73 (s, 3H); 1.18-1.38 (m, 2H); 0.94-1.09 (m, 2H).

5-Metil-3-(4-nitro-benziI)-2-(9H-purin-6-ilsu)fanilmetil)-3H-hinazolin-4-on (D-066)

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem jedinjenja 3g (200 mg, 0,58 mmol), 6-merkaptopurin monohidrata (148 mg, 0,87 mmol) i K2CO3(160 mg, 1,16 mmol). Proizvod je5-Metil-3-(E-2-fenil-cikJopropil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetiI)-3H-hinazolin-4-on

(D-070)

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem jedinjenja 3i i 6-merkaptopurin monohidrata. Proizvod je prečišćen korišćenjem HPLC reverzne faze (kolona Cl 8 Luna. 4,6 x 250 mm, 4,7 ml/min, 10-75% smeša acetonitrila i vode tokom 15 minuta, 100% acetonitrila tokom 18 minuta, detektor na 220). MS (ES): m/z 441.

Slede dodatna jedinjenja predmetnog pronalaska, zajedno sa opisima sinteze jedinjenja D-071 do D-118.

prečišćen sprašivanjem iz MeOH. 'H NMR (DMSO-d6) 6 : 13.44 (br s, IH); 8.50 (s, IH); 8.31 (s, IH); 8.03 (d, J=8.6 Hz, 2H); 7.58 (t, J=7.9 Hz, IH); 7.37 (d, J=8.3 Hz, 3H); 7.22 (d, J=7.5Hz, IH); 5.44 (s, 2H); 4.70 (s, 2H); 2.66 (s, 3H). MS (ES) : m/z 460 (M+H).

3-Cikloheksil-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazoIin-4-on (D-067)

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem jedinjenja 3h (150 mg, 0,52 mmol), 6-merkaptopurin monohidrata (97 mg, 0,57 mmol) i K2CO3(86 mg, 0,62 mmol). Proizvod je prečišćen sprašivanjem iz MeOH. 'H NMR (DMSO-d6) 5 : 13.66 (br s, IH); 8.82 (s, IH); 8.50 (s, IH); 7.62 (t, J=7.7 Hz, IH); 7.42 (d, J=8.0 Hz, IH); 7.26 (d, J=7.3 Hz, IH); 5.01 (s. 2H); 4.11 (br s, IH); 2.75 (s, 3H); 2.38-2.65 (m, 2H); 1.58-1.90 (m, 4H); 1.37-1.57 (m, IH); 0.71-1.26 (m, 3H). MS (ES) : m/z 407 (M+H), 325.

2-(6-Aminopurin-9-ilmetil)-3-cikloheksil-5-metil-3H-hinazolin-4-on (D-068)

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem jedinjenja 3h (150 mg, 0,52 mmol), adenina (77 mg, 0,57 mmol) i K2CO3(86 mg, 0,62 mmol). Proizvod je prečišćen sprašivanjem iz MeOH. 'H NMR (DMSO-d6) 5 : 8.15 (s, 2H); 7.54 (t, J=7.9 Hz, IH); 7.06-7.35 (m, 4H); 5.65 (s, 2H); 4.09 (br s, IH); 2.73 (s, 3H); 1.41-1.90 (m, 6H); 0.99-1.34 (m, 4H). MS (ES) : m/z 390 (M+H), 308.

2-(2-Amino-9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3-cikloheksil-5-metil-3H-hinazolin-4-on (D-069)

Dobijen prema Postupku C, korišćenjem jedinjenja 3h (150 mg, 0,52 mmol), 2-amino-6-merkaptopurina (95 mg, 0,57 mmol) i K2CO3(86 mg, 0,62 mmol). Proizvod je prečišćen korišćenjem HPLC reverzne faze (kolona Cl 8 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 ml/min, 10-75% smeša acetonitrila i vode tokom 15 minuta, 100% acetonitrila tokom 18 minuta, detektor na 220). MS (ES): m/z 422 (M+H), 340, 170.

PostupakD: Smeša amida 4a ili 4b, FMOC-glicil hlorid i glacijalne sirćetne kiseline, mešana je na temperaturi od 120 °C, tokom 1 do 4 časova. Nastala reakciona smeša je koncentrovana u vakuumu i prečišćena hromatografijom za rektifikaciju lakih frakcija, kako bi nastao ciklizovani. zaštićeni amin. Ovaj materijal je kombinovan sa 10 ekvivalenata oktanetiola i katalitičkom količinom DBU u THF, a zatim mešan na sobnoj temperaturi, dok utrošak početnih supstanci nije indikovan od strane LCMS. Reakciona smeša je direktno postavljena na kolonu za hromatogranju za rektifikaciju lakih frakcija (ekvilibrisanu u CH2CI2) i eluiran 0-5% smešom MeOH i CH2CI2,, kako bi se dobio slobodni amin 5a ili 5 b. Jedinjenje 5c je dobijeno na analogan način, korišćenjem (±) FMOC-alanil hlorida umesto FMOC-glicil hlorida.

Postupak E: Ekvimolarne količine jedinjenja 5a ili 5 b, zajedno sa odgovarajućom količinom 6-hloropurina i DIEA, kombinovane su u malom reakcionom sudu i zagrevane do temperature od 80 °C. Reakciona smeša je redovno kontrolisana upotreboma LCMS i prečišćena na već opisan način.

Postupak F: Smeša amida 4b, acetoksiacetil hlorida i glacijalne sirćetne kiseline, zagrevana je na temperaturi od 120 °C i mešana tokom 2 časa. Ohlađena reakciona smeša je filtrirana, čvrsti ostatak je ispran sa CH2CI2. kako bi se dobio ciklizovani acetat u vidu bele čvrste supstance. Ovaj materijal je pomešan sa K7CO3u vodenom rastvoru metanola i mešan tokom jednog časa, a zatim koncentrovan u vakuumu. Nastale čvrste supstance su sprašene iz H2O, kako bi nastalo jedinjenje 6a, u vidu bele čvrste supstance.

3-(2-Hlorofenil)-5-fluoro-2-[(9H-purin-6-ilamino)-metil]-3H-hinazolin-4-on (D-072)

Dobijen prema Postupku E, korišćenjem jedinjenja 5b (50 mg, 0,165 mmol) i 6-hloropurina (26 mg, 0,165 mmol) u 1 ml EtOH. Nakon 5 dana, reakciona smeša je prečišćena korišćenjem HPLC (kolona C18 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 ml/min, 10-75% smeša acetonitrila i vode tokom 15 minuta, 100% acetonitrila tokom 18 minuta, detektor na 220X).<]>H NMR (DMSO-d6) 6 : 12.99 (br s, IH); 8.14 (br s, IH); 8.12 (s, IH); 7.85 (dt, J=5.7, 8.1 Hz, IH); 7.68-7.79 (m, 3H); 7.57 (t, J=6.2 Hz, IH); 7.57 (d, J=7.7 Hz, IH); 7.50 (d, J=8.1 Hz, IH); 7.35 (dd, J=8.4, 10.7 Hz, IH); 4.15-4.55 (m, 2H). MS (ES) : m/z 422 (M+H), 211.

2-[(2-Amino-9H-purin-6-ilamino)metil]-3-(2-hlorofenil)-5-fluoro-3H-hinazoIin-4-on

(D-074)

Dobijen prema Postupku E, korišćenjem jedinjenja 5b (50 mg, 0,165 mmol) i 2-amino-6-hloropurina (28 mg, 0,165 mmol) u 1 ml EtOH. Nakon 5 dana, reakciona smeša je prečišćena korišćenjem HPLC (kolona Cl8 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 ml/min, 10-75% smeša acetonitrila i vode tokom 15 minuta, 100% acetonitrila tokom 18 minuta, detektor na 2201).

'H NMR (DMSO-d6) 5 : 12.13 (br s, IH); 7.86 (dt, J=5.6, 8.2 Hz, IH); 7.76-7.83 (m, 2H): 7.68 (br s, IH); 7.61 (t, J=5.7 Hz, IH); 7.61 (d, .1=7.2 Hz, IH); 7.53 (d, J=8.2 Hz, IH); 7.35 (dd, J=8.2, 10.9 Hz, IH); 5.66 (br s, 2 H); 4.16-4.50 (m, IH); 4.09 (q, J=5.3 Hz, 2H). MS (ES):m/z 437 (M+H), 219.

5-MetiI-2-[(9H-purin-6-ilamino)metil]-3-o-tolil-3H-hinazoIin-4-on (D-071)

Dobijen prema Postupku E, korišćenjem jedinjenja 5a (20 mg, 0,072 mmol) i 6-hloropurina (11 mg, 0,072 mmol). Nakon 5 dana, reakcija je prekinuta dodavanjem vode, a nastala suspenzija je filtrirana. Čvrste supstance su prečišćene korišćenjem HPLC (kolona Cl8 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 ml/min, 10-75% smeša acetonitrila i vode tokom 15 minuta, 100% acetonitrila tokom 18 minuta, detektor na 220 X). 'H NMR (DMSO-d6) 5 : 12.98 (br s, IH); 8.14 (br s, IH); 8.10 (s, IH); 7.58-7.79 (m; 2H); 7.37-7.48 (m, 4H); 7.26-7.36 (m, 2H); 3.93-4.39 (m, 2H); 2.75 (s, 3H); 2.18 (s, 3H). MS (ES): m/z 398 (M+H), 199.

2-[(2-Amino-9H-purin-6-iIamino)metiI]-5-metiI-3-o-toIil-3H-hinazoIin-4-on(D-073)

Dobijen prema Postupku E, korišćenjem jedinjenja 5a (189 mg, 0,677 mmol) i 2-amino-6-hloropurina (115 mg, 0,677 mmol) u 3 ml EtOH. Nakon 3 dana, reakciona smeša je filtrirana, kako bi se uklonio purin u višku, a filtrat je prečišćen korišćenjem HPLC (kolona Cl 8 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 ml/min, 10-75% smeša acetonitrila i vode tokom 15 minuta, 100% acetonitrila tokom 18 minuta, detektor na 220X),kako bi se dobilo 7 mg proizvoda u vidu TFA soli. 'H NMR (DMSO-d6) 5 : 8.88 (br s, IH); 8.21 (s, IH); 7.71 (t, J=7.7 Hz, IH); 7.45-7.56 (m, 2H): 7.38-7.44 (m. 3H); 7.35 (d, J=7.5 Hz, IH); 7.30 (br s, IH); 4.40 (dd, J=4.5, 17.5 Hz, IH); 4.27 (dd, J=5.3, 17.4 Hz, IH); 2.75 (s, 3H); 2.09 (s, 3H). MS (ES) : m/z 413 (M+H), 207, 163.

2-((2-Fluoro-9H-purin-6-ilaarino)metil]-5-metil-3-o-toIil-3H-hinazolin-4-on (D-076)

Dobijen prema Postupku E, korišćenjem jedinjenja 5a (20 mg, 0,072 mmol) i 2-fluoro-6-hloropurina (16 mg, 0,094 mmol) u 1 ml EtOH. Nakon 18 časova, reakciona smeša je prečišćena korišćenjem HPLC (kolona Cl8 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 ml/min, 10-75% smeša acetonitrila i vode tokom 15 minuta, 100% acetonitrila tokom 18 minuta, detektor na 220X),a zatim i rekristalizovana iz EtOH, kako bi se dobilo 14 mg proizvoda u vidu žute čvrste supstance. 'H NMR (DMSO-d6) 6 : 13.12 (br s, IH); 8.40 (br s, IH); 8.15 (s, IH); 7.66 (t, J=7.7 Hz, IH); 7.35-7.49 (ra, 4H); 7.31 (d, J=7.2 Hz, IH); 4.O0-4.22 (m, 2H); 3.17 (s, IH); 2.74 (s, 3H); 2.18 (s, 3H). MS (ES) : m/z 416 (M+H), 208.

(2-Hlorofenil)-dimetilamino-(9H-purin-641sulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on (D-075)

Jedinjenje D-015 (100 mg. 0,228 mmol) je pomešano sa amonijum hidroksidom (28-30%, 1 ml) u DMF (2 ml) i zagrevano do temperature od 80 °C. Nakon 2 dana, reakciona smeša je prečišćena korišćenjem HPLC (kolona Cl8 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 ml/min, 10-. 75% smeša acetonitrila i vode tokom 15 minuta, 100% acetonitrila tokom 18 minuta, detektor na 220X),kako bi se dobilo približno 2 mg proizvoda u vidu čvrste žute supstance. 'H NMR

(DMSO-d6} 8 : 13.52 (br s, IH); 8.46 (s, IH); 8.42 (s, IH); 7.69 (dd, J=2.1, 7.3 Hz, IH); 7.62 (dd, J=1.6, 7.6 Hz, IH); 7.61 (t, J=8.0 Hz, IH); 7.37-7.48 (m, 2H); 7.05 (d, J=7.9 Hz, IH); 6.96 (d, J=7.8 Hz, IH); 4.32-4.45 (m, 2H); 2.80 (s, 6H). MS (ES): m/z 464 (M+H), 232.

5-(2-Benziloksietoksi)-3-(2-hlorofenil)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on

(D-078)

U ratvor 2-benziloksietanola (0,3 ml) u DMF (1.0 ml), dodat je NaH (50 mg, 2,08 mmol). Nakon mešanja tokom 5 minuta, 0,5 ml reakcione smeše je dodato u rastvor jedinjenja 1C-871853 (50 mg, 0,114 mmol) u anhidrovanom DMF (0,75 ml). Reakciona smeša je zagrejana do temperature od 50 °C, a potom mešana tokom 3 dana. Prečišćavanjem putem HPLC (kolona Cl 8 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 ml/min, 10-75% smeša acetonitrila i vode tokom 15 minuta, 100% acetonitrila tokom 18 minuta, detektor na 220X).dobijeno je 150 u.g proizvoda u vidu heterogene čvrste supstance. MS (ES): m/z 571 (M+H), 481.

3-(2-Hlorofenil)-5-fluoro-4-okso-3,4-dihidro-hinazolin-2-ilmetilestar 6-aminopurin-9-karboksilne kiseline (D-079)

U rastvor jedinjenja 3b (20 mg, 0,066 mmol) u CH2C12(500 u.1) na temperaturi od 0 °C, dodat je fozgen (2M u toluenu, 36 u.1, 0,072 mmol), a nakon toga i adenin (10 mg, 0,072 mmol), kao i DIEA (25 ul 0,145 mmol). Smeša je ostavjena da se zagreje do ambijentalne temperature, a potom je mešana tokom 8 dana. Prečišćavanjem putem HPLC (kolona Cl 8 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 ml/min, 10-75% smeša acetonitrila i vode tokom 15 minuta, 100% acetonitrila tokom 18 minuta, detektor na 220X),dobijeno je proizvod u vidu smeše.<f>H NMR (DMSO-d6) 8 : 11.04 (br s, IH); 8.61 (s, IH); 8.40 (s, IH); 7.85-7.95 (m, IH); 7.76 (dd,J=5.4, 9.6 Hz, IH); 7.70-7.78 (m, IH); 7.52-7.63 (m, 3H); 7.38 (dt, .1=8.3, 10.6 Hz, IH); 4.76-4.89 (m, 2H). MS (ES): m/z 466 (M+H), 331, 305.

N-[3-(2-Hlorofenil)-5-fluoro-4-okso-3,4-dihidro-hinazolin-2-ilmetil]-2-(9H-purin-6-

ilsulfanil)-acetamid (D-077)

U reakcionom sudu oblika flaše, pomešani su (9H-purin-6-ilsulfanil)-sirćetna kiselina (63 mg, 0,296 mmol), jedinjenje 5b (108 mg, 0,355 mmol), EDC (68 mg, 0,355 mmol), HOBT (48 mg, 0,355 mmol), DIEA (62 u.1, 0,355 mmol) i DMF (1 ml), a potom mešani na sobnoj temperaturi tokom jednog časa. Reakciona smeša je razblažena sa EtOAc (20 ml) i isprana sa slanim rastvorom za ispiranje (2x13 ml). Organska faza je koncentrovana u vakuumu i hromatografisana u smeši MeOH i CH2C12, kako bi se dobilo 91 mg proizvoda, u vidu viskozne pene boje breskve. 'H NMR (DMSO-d6) 8 : 12.88 (br s, IH); 8.72 (s, IH); 8.62 (t, J=5.0 Hz, IH); 8.49 (s, IH); 7.88 (dt, J=5.6, 8.2 Hz, IH); 7.73-7.78 (m, IH); 7.67-7.72 (m, IH); 7.57-7.65 (m, 2H); 7.38 (d, J=8.1 Hz, IH); 7.36 (dd, J=8.3, 11.1 Hz, IH); 4.11-4.24 (m, 2H); 3.96 (dd, 3=5. 0', 17.4 Hz, IH); 3.78 (dd, J=5.2,T7.4 Hz, IH). MS (ES) : m/z 496 (M+H), 248.

2-[l-(2-Fluoro-9H-purin-6-ilamino)etiI]-5-metil-3-o-tolil-3H-hinazoIin-4-on (D-080)

Dobijen prema Postupku E, korišćenjem jedinjenja 5c (50 mg, 0,17 mmol) i 2-fluoro-6-hloropurina (35 mg, 0,204 mmol) u 1,2 ml EtOH. Prečišćavanjem pomoću HPLC (kolona Cl8 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 ml/min, 10-75% smeša acetonitrila i vode tokom 15 minuta. 100% acetonitrila tokom 18 minuta, detektor na 220X),dobijena su dva atropizomera u vidu belih čvrstih supstanci. Podaci za jedno od ovih jedinjenja slede: 'H NMR (DMSO-dć) 5 : 8.48 (br d, J=6.4 Hz, IH); 8.17 (s, IH); 7.69 (t, J=7.8 Hz, IH); 7.53 (d, J=7.8 Hz, IH); 7.44 (d, J=7.8 Hz. 2H); 7.33 (d, J=7.2 Hz, 2H); 7.07 (br t, .1=7.2 Hz, IH); 4.80 (br t, J=6.8 Hz. IH): 2.74 (s, 3H); 2.09 (s, 3H); 1.38 (d, J=6.7 Hz, 3H). MS (ES) : m/z 430 (M+H), 215.

5-Metil-2-[l-(9H-purin-6-ilamino)etil]-3-o-tolil-3H-hinazoIin-4-on (D-081)

Dobijen prema Postupku E, korišćenjem jedinjenja 5c (50 mg, 0,17 mmol) i 6-hloropurina (32 mg, 0,204 mmol) u 1,2 ml EtOH. Prečišćavanjem pomoću HPLC (kolona Cl8 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 ml/min, 10-75% smeša acetonitrila i vode tokom 15 minuta, 100% acetonitrila tokom 18 minuta, detektor na 220X),dobijena su dva atropizomera u vidu žutih čvrstih supstanci. Podaci za jedno od ovih jedinjenja slede: 'H NMR (DMSO-dć) 8 : 8.39 (brs, IH); 8.34 (s, IH); 8.18 (s, IH); 7.71 (t, J=7.7 Hz, IH); 7.56 (d, J=7.9 Hz. IH); 7.49 (d, J=6.9 Hz, IH); 7.28-7.43 (m, 3H); 7.20 (br s, IH); 5.06 (br s, IH): 2.73 (s, 3H); 2.04 (s, 3H); 1.51 (d, J=6.6 Hz, 3H). MS (ES) : m/z 412 (M+H), 206.

Sledeća jedinjenja predmetnog pronalaska (D-082 do D-109) su dobijena kao što je navedeno u opisu Postupka C, korišćenjem 2-hlorometil-5-metil-3-o-tolil-3H-kvinazolin-4-ona (10 mg), odgovarajućeg nukleofila XH (20 mg, u višku) i kalijum karbonata (10 mg) u DMF (0,25 ml), reakciona smeša je mešana tokom 16 časova na sobnoj temperaturi, a zatim je reakcija prekinuta dodavanjem vode, a sirovi proizvod u čvrstom stanju je prikupljen filtracijom i osušen na vazduhu. Sirovi materijal je rastvoren u 0,5 ml DMSO i prečišćen korišćenjem HPLC reverzne faze (kolona Cl 8 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 ml/min, 10-75% smeša acetonitrila i vode tokom 15 minuta, 100% acetonitrila tokom 18 minuta, detektor na 220X).Odgovarajuće frakcije su koncentrovane u vakuumu, kako bi se dobio konačni proizvodi.

2-(6-Dimetilaminopurin-9-iImetil)-5-metil-3-o-tolil-3H-hinazolin-4-on (D-082)

Prinos: 8,1 mg.

'H NMR (300 MHz, d6-DMSO) 8 : 8.13 (s, IH), 8.11 (s, IH), 7.60 (t, J=7.8 Hz, IH), 7.54-7.38 (m, 4H), 7.30 (d, J=7.4 Hz, IH), 7.20 (d,J=8.1 Hz, IH), 5.11 (d,J=17.4 Hz, IH), 4.76 (d, J=17.4 Hz, IH), 3.33 (s, 6H), 2.73 (s, 3H), 2.20 (s, 3H). LRMS (ES pozitiv.) m/z = 426 (M+l).

5-Metil-2-(2-metil-6-ok5o-l,6-dihidro-purin-7-ilmetil)-3-o-tolil-3H-hinazoIin-4-on

(D-083)

Prinos: 3,3 mg.

'H NMR (300 MHz, d6-DMSO) 5 : 12.06 (s, IH), 8.12 (s, IH), 7.60 (t, J=7.8 Hz, IH), 7.55-7.38 (m,4H), 7.30 (d, J=7.4 Hz, IH), 7.15 (d, J=7.9 Hz, IH), 5.26 (d, J=17.4 Hz, IH), 4.94 (d,3=17AHz, IH), 2.73 (s, 3H), 2.32 (s, 3H), 2.24 (s, 3H). Alkilacija na N7atomu purina je arbitražno pripisana prema pomaku nadole metilenskih protona zbog prisustva karbonilne grupe.

5-Metil-2-(2-metil-6-okso-l,6-dihidro-purin-9-iImetiI)-3-o-tolil-3H-hinazolin-4-on

(D-084)

Prečišćeno iz iste reakcione smeše kao i jedinjenje D-083. Prinos: 3,6 mg.

'H NMR (300 MHz, d6-DMSO) 8 : 12.17 (s, IH), 7.96 (s, IH), 7.63 (t, .1=7.8 Hz, IH), 7.57-7.39 (m,4H), 7.32 (d, 3=1 A Hz, IH), 7.26 (d, .1=8.1 Hz, IH), 5.08 (d, .1=17.2 Hz, IH), 4.70 (d,

.1=17.2 Hz, IH), 2.73 (5, 3H), 2.27 (s, 3H), 2.17 (s, 3H). LRMS (ES pozitiv.) m/z = 413 (M+l). 2-(Amino-đimetilaminopurin-9-ilmetil)-5-rnetil-3-o-toliI-3H-hinazolin-4-on (D-085)

Prinos: 6,7 mg.

<]>H NMR (300 MHz, d6-DMSO) 6 : 7.66 (s, IH), 7.61 (d, J=7.8 Hz, IH), 7.55-7.40 (m, 4H), 7.32-7.26 (m, 2H), 6.74 (s, 2H), 4.94 (d, J=17.2 Hz, IH), 4.63 (d, J=17.2 Hz, IH), 4.63 (d, J=17.2 Hz, IH), 2.97 (s, 6H), 2.73 (s, 3H), 2.17 (s, 3H), 2.08 (s, 3H). LRMS (ES pozitiv.) m/z = 441 (M+l).

2-(2-Amino-9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-5-metil-3-o-toliI-3H-hinazoIin-4-on (D-086)

Prinos: 9,5 mg.

'H NMR (300 MHz, d6-DMSO) 6 : 12.54 (s, IH), 7.89 (s, IH), 7.69 (t, J=7.8 Hz, IH). 7.51 (d, J=8.0 Hz, IH), 7.51 (d, J=8.0 Hz, IH), 7.43 (t, J=3.9 Hz, IH), 7.34 - 7.26 (m, 4H), 6.16 (s, 2H), 4.32 (AB quartet, JAB=14.8 Hz, An=23.7), 2.74 (s, 3H), 2.09 (s, 3H). LRMS (ES pozitiv.) m/z = 430 (M+l).

2-(4-Amino-l, 3, 5-triazin-2-ilsulfanilmetil)-5-metil-3-o-toIil-3H-hinazolin-4-on(D-087)

Prinos: 5,8 mg.

<!>H NMR (300MHz, d6-DMSO) 8 : 8.10 (s, IH), 7.70 (t, J=7.8 Hz, IH), 7.58 (s, IH), 7.52 (d, J=8.0 Hz, IH), 7.48-7.26 (m, 6H), 4.08 (s, 2H), 2.73 (s, 3H), 2.09 (s, 3H). LRMS (ES pozitiv.) m/z = 391 (M+l).

5-MetiI-2-(7-metil-7H-purin-6-ilsulfanilmetiI)-3-o-tolil-3H-hinazolin-4-on (D-088)

Prinos: 3,1 mg.

'H NMR (300 MHz, d6-DMSO) 8 : 8.52 (s, IH), 8.49 (s, IH), 7.70 (t, J=7.8 Hz, IH), 7.50 (d, J=7.8 Hz, IH), 7.45 (d, J=7.1 Hz, IH), 7.35-7.20 (m, 4H), 4.41 (AB kvartet, JAB=15.3 Hz, Av=19.2 Hz), 4.08 (s, 3H), 2.73 (s, 3H), 2.12 (s, 3H). LRMS (ES pozitiv.) m/z = 406 (M+l).

5-Metil-2-(2-okso-l,2-dihidro-pirimidin-4-ilsulfanilmetil)-3-o-toIiI-3H-hinazolin-4-on

(D-089)

Prinos: 2,4 mg.

'H NMR (300 MHz, d6-DMSO) 8 : 11.49 (s, IH), 7.70 (t, J=7.8 Hz, IH), 7.60 (brt, J=6.0 Hz, IH), 7.53-7.48 (m, 2H), 7.46-7.28 (m, 4H), 6.31 (d, J=6.7Hz, IH), 4.05 (s, 2H), 2.73 (s, 3H), 2.12 (s, 3H). LRMS (ES poz.) m/z = 391 (M+l).

5-Metil-2-purin-7-ilmetil-3-o-tolil-3H-hinazoIin-4-on (D-090)

'HNMR (300MHz, d6-DMSO) 5 : 9.04 (s, IH), 8.97 (s, IH), 8.48 (s, IH), 7.65-7.54 (m, 2H), 7.53-7.39 (m, 3H), 7.31 (d, J=7.4 Hz, IH), 7.13 (d, .1=8.0 Hz, IH), 5.31 (d, .1=17.6 Hz, IH), 5.16 (d, J=17.6 Hz, IH), 2.73 (s, 3H), 2.09 (s, 3H). Alkilacija na N7atomu purina je utvrđena NOE pojačanjem između protona na poziciji 6 purina i protona metilena na linkeru između purina i kvinazolinona. LRMS (ES poz.) m/z = 383 (M+l).

5 -Metil-2-purin-9-ilmetil -3-o-tolil- 3H-hinazolin-4-on (D-091)

Dobijeno u istoj reakciji kojom je dobij eno jedinjenje D-090.

'H NMR (300MHz, d6-DMSO) 5 : 9.17 (s, IH), 8.86 (s, IH), 8.55 (s, IH), 7.59 (t, J=7.8 Hz, IH), 7.55-7.42 (m, 4H), 7.30 (d, J=7.4 Hz, IH), 7.13 (d, .1=8.0 Hz, IH), 5.26 (d, J=17.5 Hz, IH), 4.92 (d, J=17.5 Hz, IH), 2.73 (s, 3H), 2.19 (s, 3H). Alkilacija na N9atomu purina je sugerisana nedostatkom NOE pojačanja između protona na poziciji 6 purina i protona metilena na linkeru. LRMS (ES poz.) m/z = 383 (M+l).

5-Metil-2-(9-metil-9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3-o-tolil-3H-hinazolin-4-on (D-092)

'H NMR (300MHz, dć-DMSO) 8 : 8.52 (s, IH), 8.42 (s, IH), 7.69 (t, J=7.7 Hz, IH), 7.50 (d, J=8.0Hz, IH), 7.44 (d, J=7.6 Hz, IH), 7.36-7.27 (m, 4H), 4.38 (AB kvartet, JAB=15.5 Hz, Av=21.0 Hz), 3.80 (s, 3H), 2.73 (s, 3H), 2.12 (s, 3H). LRMS (ES poz.) m/z = 429 (M+l). 2-(2,6-Diamino-pirimidin-4-ilsulfanilmetil)-5-metil-3-o-toIil-3H-hinazolin-4-on (D-093)

<J>H NMR (300 MHz, d6-DMSO) 8 : 7.70 (t, J=7.7 Hz, IH), 7.54 (d, J=8.0 Hz, IH), 7.45-7.27 (m, 5H), 6.22 (br s, IH), 5.80 (br s, IH), 3.99 (AB kvartet, JAB=14.6 Hz, Av=26.9 Hz, 2H), 2.73 (s, 3H), 2.08 (s, 3H). LRMS (ES poz.) m/z = 405 (M+l).

5-Metil-2-(5-metil-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirimidin-7-ilsulfaniImetil)-3-o-tolil-3H-hinazolin-4-on (D-094)

'H NMR (300 MHz, d6-DMSO) 8 : 8.57 (s, IH), 7.73 (t, J=7.8 Hz, IH), 7,55-7.35 (m, 4H), 7.18 (s, IH), 4.27 (s, 2H), 2.74 (s, 3H), 2.55 (s, 3H), 2.08 (s, 3H). LRMS (ES poz.) m/z = 429 (M+l). 5-Metil-2<2-metilsuIfanil-9H-purin-6-iIsulfanilmetiI)-3-o-toIiI-3H-hinazoIin (D-095) 'H NMR (300MHz, d6-DMSO) 8 : 13.30 (s, IH), 8.29 (s, IH), 7.72 (t, J=7.8 Hz, IH), 7.54 (d, J=7.8 Hz, IH), 7.47 (d, J=6.3 Hz, IH), 7.38-7.26 (m, 4H), 4.34 (AB kvartet, JAB=16.1 Hz, Av=23.6 Hz, 2H), 2.74 (s, 3H), 2.32 (s, 3H), 2.10 (s, 3H). LRMS (ES poz.) m/z = 461 (M+l). 2-(2-Hidroksi-9H-purin-6-ilsulfanilmetiI)-5-metiI-3-o-tolil-3H-hinazolin-4-on (D-096) 'H NMR (300 MHz, d6-DMSO) 8 : 8.08 (s, IH). 7.69 (t, .1=7.8 Hz, IH), 7.50 (brd. J=t.S Hz, 2H), 7.33-7.50 (m, 4H), 4.28 (AB kvartet. JAB=15.5 Hz, Av=21.3 Hz, 2H), 2.74 (s, 3H), 2.12 (s, 3H). LRMS (ES poz.) m/z = 431 (M+l). 5-MetiI-2-(l-metil-lH-imidazol-2-ilsulfanil-metil)-3-o-tolil-3H-hinazolin-4-on (D-097) 'H NMR (300 MHz, d6-DMS0) 6 : 7.69 (t, J=7.8 Hz, IH), 7.46-7.37 (m, 5H), 7.32 (d, J=7.3 Hz, IH), 7.20 (d, J=1.0 Hz, IH), 6.48 (d, .1=1.0 Hz), 3.83 (AB kvartet, JAB=15.0 Hz, Av=18.8 Hz, IH), 3.55 (s, 3H), 2.73 (s, 3H), 2.09 (s, 3H). LRMS (ES poz.) m/z = 364 (M+l). 5-Metil-3-o-toIil-2-(lH-[l,2,4]triazol-3-ilsulfanilmetiI)-3H-hinazolin-4-on (D-098) 'H NMR (300 MHz, d6-DMSO) 6 : 13.98 (s, IH), 8.47 (s, IH), 7.70 (t, J=7.8 Hz, IH), 7.49 (d, J=7.9 Hz, IH), 7.44-7.31 (m, 5H), 4.04 (AB kvartet, JAB=15.5 Hz, Av=19.1 Hz, IH), 2.74 (s, 3H), 2.10 (s, 3H). LRMS (ES poz.) m/z = 364 (M+l).2-(2-Amino-6-hloro-purin-9-ilmetil)- 5-metil-3-o-tolil-3H-hinazoIin-4-on(D-099)

LRMS (ES poz.) 432 (M+l).

2-(6-Aminopurin-7-ilmetil)-5-metil-3-o-tolil-3H-hinazolin-4-on (D-100)

'H NMR (300 MHz, d6-DMSO) 5 : 8.19 (s, 3H), 7.66 (t, J=7.8 Hz, IH), 7.59-7.43 (m, 5H), 7.34 (d, J=7.4 Hz, IH), 7.23 (d, J=8.0 Hz, IH), 6.90 (s, 2H), 5.21 (AB kvartet, JAB=17.4 Hz, Av=22.1 Hz, 2H), 2.72 (s, 3H), 1.93 (s, 3H).

Alkilacija na N7atomu purina je potvrđena NOE pojačanjima između sledećih protona: 1) protona egzocikličnog amina i metilena; 2) protona egzocikličnog amina i toluil metil protona.

LRMS (ES poz.) m/z = 398 (M+l).

2-(7-Amino-l,23-triazoIo[4,5-đ]pirimidin-341-metiI)-5-metil-3-o-toIil-3H-hinazolin-4-(D-101)

'HNMR (300 MHz, d6-DMSO) 6 : 8.43 (brs, IH), 8.19 (s, IH), 8.10 (brs, IH), 7.62 (t, J=7.8 Hz, IH), 7.49-7.28 (m, 5H), 7.22 (d, .1=8.1 Hz, IH), 5.49 (d, .1=17.0 Hz, IH), 5.19 (d. J=17.0 Hz, IH), 2.73 (s, 3H), 2.11 (s, 3H). Alkilacija purina na N7atomu je određena po sličnosti sa NMR spektrom jedinjenja D-030.

LRMS (ES poz.) m/z = 399 (M+l).

2-(7-Amino-l,2,3-triazolo[4,5-d]pirimidin-l-il-rnetil)-5-metil-3-o-toliI-3H-hinazoIin-4-on

Jedinjenje dobijeno iz iste reakcione smeše kao i jedinjenje D-101.

'H NMR (300 MHz, d6-DMSO) 6 : 8.27 (s, IH), 8.20 (br s, IH), 8.05 (br s, IH), 7.70 (t, J=7.8 Hz, IH), 7.47-7.26 (m, 6H), 5.61 (AB kvartet, JAB=16.0 Hz, Av=20.7 Hz, 2H), 2.75 (s, 3H), 1.98 (s, 3H) ). Alkilacija purina na N?atomu je određena po sličnosti sa NMR spektrom jedinjenja D-100.

LRMS (ES poz.) m/z = 399 (M+l).

2-(6-Amino-9H-purin-2-ilsulfanilmetiI)-5-metil-3-o-tolil-3H-hinazoIin-4-on (D-103)

<]>H NMR (300 MHz, dć-DMSO) 5 : 12.62 (s, IH), 7.93 (s, IH), 7.69 (t, J=7.7 Hz, IH), 7.51 (d, J=8.1 Hz, IH), 7.42 (dd, J=7.6, 1.7 Hz, IH), 7.35-7.15 (m, 6H), 4.12 (AB kvartet. JAB=14.5 Hz, Av=18.2 Hz, 2H), 2.73 (s, 3H), 2.10 (s, 3H).

LRMS (ES poz.) m/z = 430 (M+l).

2-(2-Amino-6-etilamino-pirimidin-4-ilsulfanil-metil)-5-metil-3-o-tolil-3H-hinazoliri-4-on

(D-104)

'H NMR (300 MHz, d6-DMSO) 5 : 7.70 (T, J=7.8 Hz, IH), 7.53 (d, J=8.0Hz, IH), 7.44-7.31 (m, 5H), 6.69 (br s, IH), 5.83, (br s, 2H), 5.61 (s, IH), 4.03 (d, .1=14.6 Hz, IH), 3.95 (d, J=14.6 Hz, IH), 3.22-3.11 (m, 2H), 2.73 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 1.06 (t, J=7.I Hz, 3H).

LRMS (ES poz.) m/z = 433 (M+l).

2-(3-Amino-5-metilsulfanil-l,2,4-triazoI-l-il-metiI)-5-metil-3-o-toliI-3H-hin

CD- 105)

Prinos: 5,0 mg.

<l>HNMR (300 MHz, d4-MeOH) 6 : 7.67 (t, J=7.8 Hz, IH), 7.55-7.37 (m, 4H), 7.35-7.27 (m, 2H), 4.77 (d, J=17.1Hz, IH), 4.60 (d, J=17.1 Hz, IH), 2.80 (s, 3H), 2.43 (s, 3H), 2.14 (s, 3H). LRMS (ES poz.) m/z = 393 (M+l).

2-(5-Amino-3-metilsulfanil-l,2,4-triazol-l-ilmetil)-5-metiI-3-o-tolil-3H-hinazolin-4-on

(D-106)

Prinos: 0,6 mg.

Dobijeno prečišćavanjem iz iste reakcione smeše kao i jedinjenje D-l 05.

'H NMR (300 MHz, đVMeOH) 5 : 7.67 (t, .1=7.8 Hz, IH), 7.50-7.24 (m, 6H), 4.83 (d, J=16.5Hz, IH), 4.70 (d, J=16.5 Hz, IH), 2.79 (s, 3H), 2.47 (s, 3H), 2.14 (s, 3H).

LRMS (ES poz.) m/z = 393 (M+l).

5-Metil-2-(6-metilaminopurin-9-ilmetil)-3-o-toIil-3H-hinazoIin-4-on (D-107)

Prinos: 5.0 mg.

'HNMR(300 MHz, d4-MeOH) 6 : 8.17 (s, IH), 8.03 (s, IH), 7.54-7.43 (m 4H), 7.31-7.23 (m, 2H), 5.14 (d, J=17.5 Hz, IH), 4.90 (d, J=17.5 Hz, IH), 3.14 (br s, 3H), 2.79 (s, 3H), 2.22 (s, 3H). LRMS (ES poz.) m/z = 412 (M+l).

2-(6-Benzilaminopurin-9-ilmetiI)-5-metil-3-o-tolil-3H-hinazolin-4-on (D-108)

Prinos: 6,7 mg.

'H NMR (300 MHz, d4-MeOH) S : 8.13 (s, IH), 8.04 (s, IH), 7.58 (t, J=7.8 Hz, IH), 7.51-7.21 (m, 1 IH), 5.15 (d, J=17.5 Hz, IH), 4.91 (d, J=17.5 Hz, IH), 4.83 (s, 2H, ispod pika H20), 2.79 (s, 3H), 2.22 (s, 3H).

LRMS (ES poz.) m/z = 488 (M+l).

2-(2,6-Diaminopurin-9-ilmetil)-5-metil-3-o-tolil-3H-hinazolin-4-on (D-109)

Duplirane su količine svih reaktanata. Prinos: 14 mg.

'H NMR (300 MHz, d6-DMSO) 5 : 8.53 (br s, 2H). 8.01 (s, IH), 7.64 (t, .1=7.8 Hz, IH). 7.53-7.40 (m,4H), 7.33 (d, J=7.4 Hz, IH), 7.27 (d, J=7.9 Hz, IH), 4.96 (d, J=17.5Hz, IH), 4.64 (d, .1=17.5 Hz, IH), 2.74 (s, 3H), 2.17 (s, 3H).

LRMS (ES poz.) m/z = 413 (M+l).

Jedinjenja od D-110 do D-115, sa sledćom opštom strukturom, dobijena su iz Intermedijera od E-l do E-3.

Intermedijer E-l 5-Metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetiI)-3,l-benzoksazin-4-on

Korak1. U zapečanjenom reakcionom sudu, tokom 30 minuta, na temperaturi od 115 °C, mešana je suspenzija 6-metilantranilne kiseline (2,0 g, 13,2 mmol) u hloroacetil hloridu (12 ml, u izrazitom višku). Nakon hlađenja tokom noći na temperaturi od 4 °C, nastali mrki precipitat je sakupljen filtracijom, ispran etrom, i osušen u vakuumu, kako bi se dobio hloro intermedijer (1,39 g, 50%).

'H NMR (300 MHz, CDC13) 6 : 7.67 (t, J=7.8 Hz, IH), 7.46 (d, J=7.9 Hz, IH), 7.35 (d, .1=7.6 Hz, IH), 4.39 (s, 2H), 2.81 (s, 3H). LRMS (ES poz.) m/z = 210, (M+l).

Korak2. Smeša hloro intermedijera (50 mg, 0,25 mmol), 6-merkaptopurin monohidrata (43 mg, 0,25 mmol) i kalijum karbonata (25 mg, 0,25 mmol) u suvom DMF (0,5 ml9, mešana je na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Smeša je zatim usuta u etil acetat (20 ml), a sve nerastvorne materije su filtrirane i odbačene. Filtrat je koncentrovan u vakuumu, kako bi se uklonio sav etil acetat, a ostatak je tretiran etrom, čime je dobije svetio narandžasti precipitat. Precipitat je prikupljen filtracijom, ispran etrom, i osušen u vakuumu, kako bi se dobio Intermedijer E-l (41 mg, 51%).

<]>H NMR (300 MHz, d6-DMSO) 5: 8.64 (s, IH), 8.39 (s, IH), 7.73 (t, J=7.8 Hz, IH), 7.44-7.37 (m, 2H), 4.69 (s, 2H), 2.69 (s, 3H). LRMS (ES poz.) m/z = 326 (M+l).

IntermedijerE-2

Rastvor 2-nitroacetanilida (1,0 g, 5,6 mmol) u EtOH je ispran azotom, tretiran sa Pd(OH)2(20%o (masenih), na ugljeniku, 200 mg, katalizator), i mešan tokom 2 časa u atmosferi H2(20 psi). Katalizator je uklonjen filtracijom kroz membranu acetat-celuloze sa porama od 0,22 um (Comig), a filtrat je koncentrovan u vakuumu, kako bi se dobio proizvod u vidu bele čvrste supstance (800 mg, 96%).

'H NMR (300 MHz, d6-DMSO) 5 : 9.12 (s, IH), 7.14 (dd, J=7.8, 1.3 Hz, IH), 6.88 (dt, J=7.6, 1.5 Hz, IH), 6.70 (dd, J=8.0, 1.3 Hz, IH), 6.52 (dt, J=7.5, 1.4 Hz, IH), 4.85 (br s, 2H), 2.03 (s, 3H). LRMS (ES poz.) m/z =151 (M+l).

IntermedijerE-3

Smeša 2-fluoro-nitrobenzena (1,41 g, 10 mmol) i NaHC03u EtOH (20 ml), tretirana je sa (N,N,N'-trimetil)-l,2-diaminoetanom (1,1 g, 11 mmol), i mešana tokom 16 časova na temperaturi od 80 °C. Rastvarač je uklonjen u vakuumu, a ostatak tretiran sa 0,1 M NaOH (120 ml), a zatim je smeša ekstrahovana etil acetatom (2 x 50 ml). Organski slojevi su kombinovani i isprani sa 20 ml vode (lx) i slanim rastvorom (2x), osušeni natrijum sulfatom i koncentrovani u vakuumu, dok nije dobijena narandžasta tečnost (2,2 g, 100%; EMS: m/z=224, M+l).

Navedeni intermedijer je rastvoren u EtOH, a rastvor je ispran azotom, tretiran sa Pd(OH)2(20%o (masenih) na ugljeniku, 180 mg, katalizator), a zatim mešan tokom 2 časa u atmosferi H2 (50 psi). Katalizator je uklonjen filtracijom kroz membranu acetat-celuloze sa porama od 0,22 um (Cornig), a filtrat je koncentrovan u vakuumu, kako bi se dobio Intermedijer E-3 (1,8 g, 95%), u vidu crvene tečnosti.

'H NMR (300 MHz, CDC13) 5 : 8.64 (s, IH), 7.03 (dd, J=8.3, 1.4 Hz, IH), 6.91 (ddd. J=7.6, 7.2, 1.4 Hz, IH), 6.73-6.67 (m, 2H), 4.20 (br s, 2H), 2.95 (t, J=6.7 Hz, 2H), 2.68 (s, 3H), 2.41 (t, J=6.7Hz, IH), 2.26 (s, 6H).

LRMS (ES poz.) m/z = 194 (M+l).

Jedinjenja od D-l 10 do D-l 15 su dobijena na sledeći način:

5-Metil-2-(9H-purin-6-ilsuIfanilmetiI)-3-o-tolil-3H-hinazo!in-4-on (D-l 10)

Smeša Intermedijera E-l (40 mg) i o-toluidina (0,3 ml, u velikom višku), zagrevana je na temperaturi od 100 °C u zapečaćenom reakcionom sudu, tokom 16 časova. Reakciona smeša je ohlađena, tretirana sa IN HC1 (2 ml) i etrom (2 ml), a nastali sivi precipitat je prikupljen filtracijom, ispran etrom i osušen na vazduhu (dobijeno je 19 mg sirove supstance). Sirova čvrsta supstanca je rastvorena u 0,5 ml DMSO i prečišćena korišćenjem HPLC (kolona Cl8 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 ml/min, 10-75% smeša acetonitrila i vode tokom 15 minuta, 100% acetonitrila tokom 18 minuta, detektor na 220X).Odgovarajuće frakcije su koncentrovane u vakuumu, kako bi se dobio konačni proizvod, u vidu bele čvrste supstance (4 mg)-'H NMR (300 MHz, d6-DMSO) 5 : 13.52 (s, IH), 8.47 (s, IH), 8.43 (s, IH), 7.69 (t, J=7.8 Hz, IH), 7.50 (d, J=7.9 Hz, IH), 7.46-7.43 (m, IH), 7.37-7.25 (m, 4H), 4.37 (AB kvartet, JAB=15.4 Hz, Av=22.4 Hz, 2H), 2.74 (5, 3H), 2.12 (5, 3H). LRMS (ES poz.) m/z = 415 (M+l).

3-Izobutil-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilrnetil)-3H-hinazoIin-4-on (D-l 11)

Smeša Intermedijera E-l (40 mg) i izobutilamina (0,4 ml, u velikom višku), zagrevana je na temperaturi od 120 °C u zapečaćenom reakcionom sudu, tokom 16 časova. Reakciona smeša je ostavljena kako bi višak izobutilamina ispario, a ostatak je rastvoren u 1 ml DMSO i prečišćena iz dva dela korišćenjem HPLC (kolona Cl8 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 ml/min, 10-75% smeša acetonitrila i vode tokom 15 minuta, 100% acetonitrila tokom 18 minuta, detektor na 220X).Odgovarajuće frakcije su koncentrovane u vakuumu, kako bi se dobio konačni proizvod, u vidu bele čvrste supstance (4 mg).

'H NMR (300 MHz, d6-DMSO) 5 : 13.75 (br s. IH), 8.73 (s, IH), 8.50 (s, IH), 7.63 (t, J=7.7Hz, IH), 7.42 (d, J=8.0 Hz, IH), 7.28 (d, .1=7.3 Hz, IH), 4.96 (s, 2H). 4.00 (d, .1=7.5 Hz. 2H), 2.77 (s, 3H), 2.30-2.15 (m, IH), 0.98 (d, J=6.7 Hz, IH). LRMS (ES poz.) m/z = 381 (M+l).

N-{2-[5-Metil-4-okso-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetiI)-4H-hinazolin-3-il]-fenil}-acetamid

(D-112)

Smeša Intermedijera E-l (80 mg, 0,25 mmol) i Intermedijera E-2 (75 mg, 0,5 mmol, 2 eq), zagrevana je do topljenja u zapečaćenom reakcionom sudu, korišćenjem fena. Reakciona smeša je sprašena etrom, a čvrste supstance su prikupljene filtracijom. Sirovi materijal je rastvoren u 1 ml DMSO i prečišćena iz dva dela korišćenjem HPLC (kolona Cl 8 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 ml/min, 10-75% smeša acetonitrila i vode tokom 15 minuta, 100% acetonitrila tokom 18 minuta, detektor na 220X).Odgovarajuće frakcije su koncentrovane u vakuumu, kako bi se dobio konačni proizvod, u vidu bele čvrste supstance.

'H NMR (300 MHz, d6-DMSO) 6 : 13.52 (s, IH), 9.52 (s, IH), 8.48 (s, 3H), 8.42 (s, 3H), 8.02 (d, J=8.0 Hz, IH), 7.69 (t, J=7.8 Hz, IH), 7.51 (d, J=7.9 Hz, IH), 7.45-7.37 (m, 2H), 7.31 (d, J=7.3 Hz, IH), 7.19 (t, J=7.5 Hz, IH), 4.38 (s, 2H), 2.74 (s, 3H), 1.93 (s, 3H). LRMS (ES poz.) m/z = 458 (M+l).

5-Metil-3-(E-2-metil-cik]oheksiI)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on

(D-l13)

Smeša Intermedijera E-l (80 mg, 0,25 mmol) i trans-2-metil-l-aminocikloheksana (0,25 ml, u velikom višku), zagrevana je na temperaturi od 100 °C u zapečaćenom reakcionom sudu, tokom 16 časova. Reakciona smeša je sprašena etrom, a čvrste supstance su prikupljene filtracijom. Sirovi materijal je rastvoren u 0,5 ml DMSO i prečišćena korišćenjem HPLC (kolona Cl8 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 ml/min, 10-75% smeša acetonitrila i vode tokom 15 minuta, 100% acetonitrila tokom 18 minuta, detektor na 220X).Odgovarajuće frakcije su koncentrovane u vakuumu, kako bi se dobio konačni proizvod, u vidu bele čvrste supstance (1,5 mg).

'H NMR (300 MHz, d5-DMSO) S : 13.5 (br s, IH), 8.82 (s, IH), 8.51 (s, IH), 7.63 (t, J=7.7Hz, IH), 7.43 (d, J=7.9 Hz, IH), 7.27 (d, J=7.4 Hz, IH), 5.11 (d, J=14.5 Hz, IH), 3.78-3.69 (m, IH), 2.73 (s, 3H), 2.55-2.40 (m, 3H), 1.88-1.46 (m, 4H), 1.31-1.11 (m, IH), 0.90-0.65 (m, IH), 0.74 (d, J=6.7 Hz, 3H).

LRMS (ES poz.) m/z = 421 (M+1).

2-[5-Metil-4-okso-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetiI)-4H-hinazoIin-3-iI]-benzojeva kiselina

(D-l14)

Smeša Intermedijera E-l (80 mg, 0,25 mmol) i metil antranilata (0,25 ml, u velikom višku), zagrevana je na temperaturi od 100 °C u zapečaćenom reakcionom sudu, tokom 16 časova. Reakciona smeša je sprašena etrom, a čvrste supstance su prikupljene filtracijom. Sirovi materijal je rastvoren u 0,5 ml DMSO i prečišćena korišćenjem HPLC (kolona Cl 8 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 ml/min, 10-75% smeša acetonitrila i vode tokom 15 minuta, 100% acetonitrila tokom 18 minuta, detektor na 220X).Odgovarajuće frakcije su koncentrovane u vakuumu, kako bi se dobio konačni proizvod, u vidu bele čvrste supstance (8 mg).

'HNMR (300 MHz, d6-DMSO) S : 13.51 (s, IH), 8.51 (s, IH), 8.42 (s, IH), 8.11 (dd, J=7.4, 1.1 Hz, IH), 7.88 (dt, J=7.7, 1.4 Hz, IH), 7.70 (d, J=8.0 Hz, IH), 7.57 (t, J=7.2 Hz, IH), 7.49-7.35 (m, 3H), 4.58 (d, J=15.5 Hz, IH), 4.35 (d, J=15.5 Hz, IH), 2.44 (s, 3H).

LRMS (ES poz.) m/z = 445 (M+l).

3-{2-[(2-Dimetilamino-etiI)-metil-amino]-fenil}-5-metil-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil)-3H-hinazolin-4-on (D-l 15)

Smeša Intermedijera E-l (40 mg, 0,25 mmol) i Intermedijera E-3 (0,2 ml, u velikom višku), zagrevana je na temperaturi od 100 °C u zapečaćenom reakcionom sudu, tokom 16 časova. Reakciona smeša je sprašena etrom, a čvrste supstance su prikupljene filtracijom. Sirovi materijal je rastvoren u 1 ml DMSO i prečišćena iz dva dela korišćenjem HPLC (kolona Cl8 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 ml/min, 10-75% smeša acetonitrila i vode tokom 15 minuta, 100% acetonitrila tokom 18 minuta, detektor na 220X).Odgovarajuće frakcije su koncentrovane u vakuumu, kako bi se dobio konačni proizvod, u vidu TFA soli (11 mg).

<]>H NMR (300 MHz, d6-DMSO) 8 : 13.4 (br s, IH), 9.27 (s, IH), 8.52 (s, IH), 8.44 (s, IH), 7.72 (t, J=7.8 Hz, IH), 7.53 (d, J=7.9 Hz, IH), 7.40-7.33 (m, 4H), 7.10-7.04 (m, IH), 4.42 (s, 3H), 3.5 (m, 2H), 3.23-3.03 (m, 3H), 2.75 (s, 3H). 2.68-2.56 (m, 8H).

LRMS (ES poz.) m/z = 501 (M+l).

Jedinjenja od D-l 16 do D-l 18 su pripremljena na sledeći način:

3-(2-HlorofeniI)-5-metoksi-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetiI)-3H-hinazolin-4-on (D-l 16)

(R=Me, X=0)

Smeša jedinjenja D-l 15 (25 mg) u 0,5 M NaOMe (2 ml u MeOH; veliki višak), mešana je u zašečaćenom reakcionom sudu, tokom 16 časova, na temperaturi od 50 °C. Reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature, tretirana vodom (5 ml), a nastali precipitat je prikupljen filtracijom, ispran vodom i osušen na vazduhu. Sirovi materijal je rastvoren u 0,5 ml DMSO i prečišćen korišćenjem HPLC (kolona Cl8 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 ml/min, 10-75% smeša acetonitrila i vode tokom 15 minuta, 100% acetonitrila tokom 18 minuta, detektor na 220X).Odgovarajuće frakcije su koncentrovane u vakuumu, kako bi se dobio konačni proizvod, u vidu bele čvrste supstance (5,3 mg).

'H NMR (300 MHz, d6-DMSO) 6 : 13.52 (s, IH), 8.48 (s, IH), 8.44 (br s, IH), 7.77 (t, J=8.2 Hz, IH), 7.71-7.60 (m, 2H), 7.51-7.34 (m, 2H), 7.23 (d, J=8.2Hz, IH), 7.10 (d, J=8.4 Hz, IH), 4.39 (AB kvartet, JAB=5.2 Hz, Av=23.2 Hz, 2H), 3.85 (s, 3H).

LRMS (ES pozitiv.) m/z = 451 (M+l).

3-(2-HIorofeniI)-5-(2-morfolin-4-il-etiIamino)-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetil) hinazolin-4-on (D-l 17)

Smeša jedinjenja D-l 15 (25 mg) i 4-(aminoet-2-il)-morfolina (650 mg, u velikom višku), mešana je tokom 16 časova, na temperaturi od 50 °C. Sirova reakciona smeša prečišćena korišćenjem HPLC (kolona Cl8 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 ml/min, 10-75% smeša acetonitrila i vode tokom 15 minuta, 100% acetonitrila tokom 18 minuta, detektor na 220X).Odgovarajuće frakcije su koncentrovane u vakuumu, kako bi se dobio konačni proizvod.

'H NMR (300 MHz, d6-aceton) 5 : 8.57 (br s, IH), 8.47 (s, IH), 8.37 (s, IH). 7.72 (dd, J=7.7, 1.6 Hz, IH). 7.65 (dd, J=8.0, 1.2 Hz, IH), 7.57 (t, .1=8.1 Hz, IH), 7.49 (dt, .1=7.7, 1.6 Hz, IH), 7.40 (dt, J=7.7, 1.5 Hz, IH), 6.86 (d, J=7.4 Hz, IH), 6.82 (d, J=8.3 Hz. IH), 4.55 (d, J=15.0 Hz, IH), 4.42 (d, J=15.1 Hz, IH), 4.05-3.90 (m, 4H). 3.90 (t, J=6.9 Hz, 2H), 3.75-3.4 (m, 4H), 3.54 (t, J=6.9Hz, 2H).

LRMS (ES pozitiv.) m/z = 549 (M+l).

3-Benzil-5-metoksi-2-(9H-purin-6-ilsulfanilmetiI)-3H-hinazoIin-4-on (D-l 18)

Smeša jedinjenja D-043 (25 mg) u 0,5 M NaOMe (2 ml u MeOH; u velikom višku), mešana je u zapečaćenom reakcionom sudu, tokom 16 časova, na temperaturi o;': 50 °C. Reakciona smeša je tretirana sa 1 N HC1 (1 ml), a jednaki delovi ovog rastvora (po 0,5 ml svaki deo) su prečišćeni korišćenjem HPLC (kolona Cl8 Luna, 4,6 x 250 mm, 4,7 ml/min, 10-75% smeša acetonitrila i vode tokom 15 minuta, 100% acetonitrila tokom 18 minuta, detektor na 220X).Odgovarajuće frakcije su koncentrovane u vakuumu, kako bi se dobio konačni proizvod u vidu bele čvrste supstance (6,6 mg).

'H NMR (300MHz, d6-DMSO) 6 : 13.57 (s, IH), 8.60 (s, IH), 8.45 (s, IH), 7.72 (t, J=8.1 Hz, IH), 7.42-7.30 (m, 2H), 7.30-7.19 (m, 3H), 7.15 (d, J=8.0 Hz, IH), 7.06 (d, J=8.3 Hz, IH), 5.43 (s, 2H), 4.80 (s, 2H), 3.87 (s, 3H).

LRMS (ES pozitiv) m/z = 431 (M+l).

Jedinjenje D-999 (komparativno)

3-(2-HlorofeniI)-2-(lH-pirazolo[3, 4-d]pirimidin-4-ilsulfanilmetil)-3H-hinazoIin-4-on

Analogno jedinjenje, 3-(2-hlorofenil)-2-(l H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ilsulfanil-metil)-3H-kvinazolin-4-on, takođe je sintetisano, uopšteno u skladu sa gore opisanim postupcima, s tim da je 4-merkapto-lH-pirazolo[3,4-d]pirimidin supstituisan merkapto-purinom u završnom koraku sinteze.

Primer 11

Biohemijski testovi potentnosti i selektivnosti PI3K

A. Biohemijski test sa korišćenjem 20 uM ATP

Korišćenjem postupka koji je opisa u gore navedenom Primeru 2, testirani su potentnost i selektivnost inhibitorne aktivnosti jedinjenja predmetnog pronalaska prema P13K8, kao i selektivnost pomenutih jedinjenja prema PI3K8 u odnosu na Klasu 1 PI3K izoenzima. U Tabeli 2, date su IC50vrednosti PI3Ka (»Alfa«), PI3Kp (»Beta«), PI3K?

(»Gama«) i PI3K8 (»Delta«), kako bi se ilustrolvala selektivnost jedinjenja predmetnog pronalaska, dati su odnosi IC50vrednosti jedinjenja predmetnog pronalaska za PI3Ka, PI3KP i PI3Ky prema IC50vrednosti jedinjenja prema PI3K8, i to kao »Alfa/Delta odnos«, »Beta/Delta odnos« i »Gama/Delta odnos«, respektivno.

testovi inicijalne selektivnosti su sprovedeni na identičan način protokolu testa selektivnosti opisanom u Primeru 2, s tim što je korišćeno 100 u.1 Ecoscint za detekciju radio-obeleživača. Naknadni testovi selektivnosti su sprovedeni korišćenjem istih trostrukih količina supstanci, s tim što su one sadržale 0,05 mCi/ml y[<32>P]ATP i 3 mMPIP2. Naknadni testovi selektivnosti su sprovedeni korišćenjem istih trostrukih količina enzima, s tim što su one sadržale 3 nM neke od izoformi PI3K.

Za sve testove selektivnosti, testirana jedinjenja su odmeravana i rastvorena u 10-50 mM porcijama u 100% DMSO (u zavisnosti od vrednosti njihovih rastvorljivosti, respektivno), i pohranjena na temperaturi od -20 °C. Jedinjenja su zatim odmrzavana (zagrevana do sobne temperature ili do temperature od 37 °C), razblažena do 300 pM u vodi, pri čemu su od ovih razblaženja napravljena serije trostrukih razblaženja u vodi. Od ovih razblaženja, po 20 ul je dodavano u polja za testiranje, uporedo sa praznim mestima, koja se koriste za enzimsku (pozitivnu) kontrolu i kontrolu bez enzima (negativnu kontrolu). Ostatak testa je praktično sproveden prema protokolu testa selektivnosti, koji je opisan u Primeru 2.

U onim slučajevima u kojima ni najveća upotrebljena koncentracija koja je korišćena u testu, tj. koncentrcija od 100 p.M, nije inhibirala aktivnost enzima za barem 50%>, u tabeli je naveden postotak aktivnosti enzima koja se zadržala pri toj koncentraciji (tj. koncentraciji od 100 pM). U ovim slučajevima, pravi odnos aktivnosti za testirana jedinjenja ne može da se izračuna, jer jedna od potrebnih IC50vrednosti nedostaje. Međutim, kako bi se obezbedio nekakav uvid u karakteristike ovih jednjenja, računat je hipotetički odnos aktivnosti korišćenjem aktivnosti pri koncentraciji od 3 00 p.M umesto nedostajuće vrednosti. U tim slučajevima, odnos selektivnosti mora, u stvari, da bude veći od hipotetičke vrednosti, što je indikovano upotrebom simbola za veće (>).

B. Biohemi jski test sa korišćen jem 200uMATP

U odeljku A, koji je gore naveden, jedinjenja predmetnog pronalaska su testirana kako bi se odredile bilo njihove IC50vrednosti pri inhibiciji alfa, beta, delta ili gama izoformi PI3K korišćenjem 20 uM ATP. Sprovedeno je dalje ispitivanje kako bi se odredile IC50vrednosti pri inhibiciji četiri izoforme PI3K pri konačnoj, deset puta većoj koncentraciji od 200 uM ATP, koje su značajnije bliže normalnim fiziološkim koncentracijama ATP u ćelijama. Protokol ovog testa selektivnosti je identičan onome koji je gore opisan, s tim što je trostruka količina ATP bila 600 uM. Podaci iz ovog testa su ukratko prikazani u Tabeli 3, koja sledi. Uočena senzitivnost prema koncentraciji ATP sugeriše da ova jedinjenja koja su inhibitori PI3K8 deluju kao kompetitori sa ATP.

Primer 12

Podaci o inhibitorima aktivnosti PI3K5 na ćelijskim kulturama

Korišćenjem postupaka koji su opisani u Primerima 3-5, testirana je inhibitorna aktivnost i potentnost jedinjenja predmetnog pronalaska primenom testova stimulisane proliferacije B i T ćelija, migracije neutrofila (polimorfonuklearna-PMN), i otpuštanja elastaze iz neutrofila (PMN). Podaci iz ovih ispitivanja su prikazani u Tabeli 4, koja sledi. U pomenutoj tabeli, prikazane vrednosti su efektivne koncentracije jedinjenja (EC50; izraženo u pM). Ukoliko nije navedena vrednost, odgovarajući test nije izvršen.

Primer 13

Testovi inhibicije aktivnosti PI3K5 u kancerskim ćelijama

Efekat jedinjenja predmetnog pronalaska na proliferaciju kancerskih ćelija je procenjivana testiranjem jednog od jedinjenja na ploči sa ćelijskim linijama hronične mijeloidne leukemije (CML), uključujući linije KU812, RWLeu4, K562 i MEG-01.

Inhibitorna aktivnost jedinjenja (D-000, rastvorenog u DMSO), određena je na sledeći način. Serije koncentracija testiranog jedinjenja (od 0,001 uM do 20 uM) dodavane su u polja ploče za mikrotitraciju od 96 polja, koja sadrže ćelije (1000 do 5000 ćelija po polju). Ploče su inkubirane tokom 5 dana na temperaturi od 37 °C, pri čemu su ćelijske kulture koje su bile kontrola mogle da prođu barem dva ciklusa ćelijske deobe. ćelijski rast je procenjen inkorporiranjem [ H]-timidina tokom 18 časova, koji je dodavan tokom trećeg, četvrtog i petog dana ispitivanja. Ćelije su zatim prebačene na filter, isprane a radioaktivnost je merena korišćenjem Matrix 96 beta brojača (Packard). Procenti ćelijskog rasta su izmereni na sledeći način:

Prosečna EC50vrednost u ovim eksperimentima je određena na osnovu koncentracije testiranog jedinjenja, čija je primena kao posledicu imala za 50% manju radioaktivnost od one koja je izmerena korišćenjem kontrole bez inhibitora. jedinjenje D-000 je pokazalo inhibitornu aktivnost sa EC50vrednostima od približno 2 pM za ćelijske linije KU812 i RWLeu4. Pomenuto jedinjenje nije pokazalo dejstvo na ćelijske linije K562 i MEG-01. Pokazano je da inhibitori aktivnosti PI3K5 predmetnog pronalaska inhibiraju rast ćelija hronične mijeloidne leukemije, i stoga mogu biti od koristi u lečenju benignih ili malignih tumora. Za sada je aktivnost PI3K8 pokazana samo u ćelijama hematopoetskog porekla. Međutim, ovaj enzim može da bude eksprimiran u širem spektru ćelija koje proliferišu. Stoga, jedinjenja predmetnog pronalaska mogu da budu upotrebljena za indukciju regresije tumora i u sprečavanju nastanka metastaza tumora, kako kod leukemija, tako i kod solidnih tumora, a mogu da budu upotrebljena i za inhibiciju proliferacije netumorskog porekla. Nadalje, jedinjenj predmetnog pronalaska mogu da budu upotrebljena kako sama, tako i u kombinaciji sa drugim farmakološki aktivnim jedinjenjima, ili u kombinaciji sa zračnom terapijom, kao sredstva za senzitizaciju.

Primer 14

Kvantifikovanje egzocitoze elastaze kod miševa ispiranjem vazdušne kese

Testirano je dejstvo jedinjenja D-030 na influks leukocita i na egzocitozu elastaze iz neutrofila na animalnim modelima. Model šestodnevne vazdušne kese jein vivomodel inflamatorne reakcije, koji histološki liči na sinoviju zglobova. Razvija se obloga od organizovanih mononuklearnih ćelija i fibroblasta, koja veoma liči na šupljinu sinovijalnih zglobova. Model predstavlja »akutni« model hronične bolesti (npr. reumatoidnog artritisa). Ovaj model dozvoljavain vivoprocenu dejstva sgenasa koji blokiraju ćelijski influks u vazdušnu vreću, pod uticajem inflamatornog stimulusa.

Test je sproveden na sledeći način: nultog dana, grupe pacova su obrijane i svakom od njih je ubrizgano po 10 ml vazduha subkutano u predeo leđa, čime je formirana vazdušna vreća. Trećeg dana eksperimenta, ponovo je ubrizgano po 10 ml vazduha. Šestog dana, šest časova pre primene TNF, jedna grupa pacova (n=6) je oralno primila jedinjenje D-030 (lOOmg/kg u PEG 400 vehikulumu), a druga grupa (n=12) je oralno primila samo vehikulum. Nakon šest časova od primene doze, u vazdušnu vreću svakog pacova je ubrizgano 2,5 ng TNF. Dvanaest časova nakon primene doze, vazdušne vreće su isprane slanim rastvorom, a ispiranjem dobijna tečnost je analizovana u smislu određivanja broja leukocita i aktivnosti elastaze neutrofila. Dodatno, pacovima je uzeta krv, kao bi se odredila koncentracija jedinjenja D-030 u krvi. Dobijeni su sledeći rezultati: pacovi koji su dobili jedinjenje D-030 nakon 12 časova su imali prosečno 8,7 p.M jedinjenja u krvi i pokazali su redukciju u ukupnom brojuleukocita u ispiranjem dobijenoj tečnosti od 82%, u odnosu na grupu koja je primila vehikulum kao kontrolu. Dobijene su sledeće vrednosti redukcija po tipovima ćelija u leukocitarnoj formuli: neutrofili 90%, eozinofili 66% i limfociti 70%. Određivanje nivoa neutrofilne elastaze je pokazalo da pacovi koji su tretirani sa D-030 imaju nivoe elastaze koji su donekle smanjeni (15%) u odnosu na kontrolnu grupu.

U drugom testu, područje leđa miša je obrijano korišćenjem mašine za šišanje, a zatim je formirana vazdušna vreća ubrizgavanjem 3 ml vazduha potkožno u obrijanu regiju. Trećeg dana ponovljeno je ubrizgavanje vazduha. Šestog dana, životinje su primile bilo D-030 (32 mg/kg u LABRAFIL®) ili samo LABRAFIL®, i to jedan čas pre i dva časa nakon primene TNF-a (0,5 ng u 1 ml PBS), ili samo PBS. PBS je fosfatom puferovani slani rastvor. Četiri časa nakon primene TNF, životinje su stavljene u anesteziju, a vazdušne vreće su isprane sa 2 ml 0,9% slanog rastvora, pomešanog sa 2 mM EDTA. Tečnost dobijena ispiranjem je centrifugirana pri brzini rotacije od 14000 obrtaja/min u mikrocentrifugi. Korišćeno je 50 ul supernatanta, kako bi se na gore opisani način kvantifikovala egzocitoza elastaze iz neutrofila.

Kao što je prikazano na Slici 9, primena TNF je indukovala izraženu egzocitozu elastaze u odnosu na onu primećenu kod životinja koje su primile samo PBS. Međutim, kada su životinje kojima je dat TNF primile jedinjenje D-030, primećen je značajan pad aktivnosti elastaze u lavatima vazdušnih vreća.

Sve publikacije i svi patentni spisi koji su navedeni u ovom patentnom zahtevu, ovde su uključeni po referenci sa celokupnim obimima zaštite.

Mada je predmetni pronalazak opisan uz specifično referenciranje na određena poželjna rešenja, a u svrhu pojašnjavanja i razumevanja, stručnjaku je jasno da su moguće izmene i modifikacije u praksi, a koje su obuhvaćene obimom zaštite predmetnog pronalaska, koji je definisan u patentnim zahtevima, koji su dole navedeni. Shodno tome, ne treba postavljati ograničenja na obim zaštite predmetnog pronalaska, koja su drugačija od onih koja su specifično navedena u patentnim zahtevima.

Claims

1. Jedinjenje koje ima strukturu naznačeno timešto je Y izabrano iz grupe koju sačinjavaju ništa i NH; R4 je izabran iz grupe koju sačinjavaju H, halogen, NO2, OH, OCH3, CH3i CF3; R5 je izabran iz grupe koju sačinjavaju H, OCH3i halo; ili R<4>i R<5>zajedno sa C-6 i C-7 hinazolinskog prstenskog sistema definišu petočlani ili šestočlani aromatični prsten koji opciono sadrži jedan ili više O, N ili S atoma; R<6>je izabran iz grupe koju sačinjavaju Ci-Cgalkil, fenil, halofenil, alkoksifenil, alkilfenil, bifenil, benzil, piridinil, 4-metilpiperazinil, C(=0)OC2Hs, i morfolinil; R<d>je nezavisno izabran iz grupe koju čine NH2, halo, Ci.3alkil, S(Ci.3alkil), OH, NH(Ci.3alkil), N(Ci.3alkil)2, NH(Ci.3alkilenfenil), i qje 1 ili 2, i njegove farmaceutski prihvatljive soli i solvati, pri čemu je najmanje jedan od R<4>i R<5>različit od H, kada R<6>predstavlja fenil ili 2-hlorofenil.

2. Jedinjenje prema zahtevu 1,naznačeno timešto je izabrano iz grupe koju sačinjavaju: 2<6-aminourin-9-ilmetil)-3-(2-izopropilfenil)-5-metil-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-metil-3-o-tolil-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aniinopurin-9-ilmetil)-3-bifenil-2-il-5-hloro-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-fluorofenil)-5-metil-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-hloro-3-(2-fluorofenil)-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-941metil)-8-hloro^ 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-Woro-3-(2-hlorofenil)-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-anu^opurin-9-ilmetil)-3-(2-hlorofenil)-5-metil-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-h]orofenil)-5-fluoro-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-benzil-5-fluoro-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-butil-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-morfolin-4-il-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-hlorofenil)-7-fluoro-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-ammopurin-9-ilmetil)-6-Woro-3-(2-hlorofenil)-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-6-bromo-3-(2-hJorofenil)-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurm-9-ilmetil)-3-(2-Worofenil)-6J-dimetoksi-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-hloro-3-o-tolil-3H-hinazolin-4-on; i 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-Uoro-3-(2-metoksi-femU)-3H-hinazolin-4-on.

3. Jedinjenje prema zahtevu 1,naznačeno timešto je R<4>izabrano iz grupe koju čine H, halo, OH, OCH3, CH3i CF3; R6 je izabran iz grupe koju čine Ci-Cćalkil, fenil, halofenil, alkilfenil, bifenil, benzil, piridinil, 4-metilpiperazinil, C(=0)OC2Hsi morfolinil; pri čemu (a) R<4>i R<s>su, nezavisno, različiti od 6-halo ili 6,7-dimetoksi grupa; (b) R6 je različit od 4-hlorofenil grupe.

4. Jedinjenje prema zahtevu 1,naznačeno timešto je izabrano iz grupe koju sačinjavaju: 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-(2-izopropilfenil)-5-metil-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-metil-3-o-tolil-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-arninopurin-9-ilmetil)-3-bifenil-2-il-5-hloro-3H-hinazolin-4-on; 2-(6-ammopiirin-9-ilmetil)-3-(2-fluorofem 2-(6-aminopurin-9-ilm^ 2-(6-aminopurin-941metil)-8-Woro-3-(2-Worofenil)-3H-W 2-(6-anunopurin-9-ilmetil)-5-hloroO-@^ 2-(6-aminop;iirn-9-ilmetil)-3-(2-hlorofeml)-5-metil-3H-hi 2-(6-aminopurin-941metil)-3-@^ 2-(6-aminopvu4n-9-ilmetil)-3-benzil-5-fluoro-3H-hinazolm^ 2-(6-aimnopuirn-9-ilmetil)-3-butil-3H-mnazolin-4-on 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-3-morfolin-4-il-3H-hinazolin^ 2-(6-ammopiuiri-9-ilmetil)0-(2-hlorofenil)-7-fluoro-3H-W^ i 2-(6-aminopurin-9-ilmetil)-5-hloro-3-o-tolil-3H-hinazolin-4-on.

5. Jedinjenje koje ima opštu strukturnu formulu naznačeno timešto je A , koji je bilo nesupstituisan, bilo supstituisan jednim do tri supstituenta izabrana iz grupe koja se sastoji od N(R<a>)2, halo, C1.3alkil, S(Ci.3alkil), OR<a>, halo i X je izabran iz grupe koju sačinjavaju CHR, CH2CHR, i CH=C(R); Y je izabran iz grupe koju sačinjavaju ništa, NH, O, C(=0), OC(=0), C(=0)0, i NHC(=0)CH2S; R i R, nezavisno, izabrani su iz grupe koju sačinjavaju vodonik, Ci^alkil, aril, heteroaril, halo, NHC(=0)Ci.3alkilenN(R<a>)2, N02, OR<a>, OCF3, N(R<a>)2, CN, OC(=0)R<a>, C(=0)R<a>, C(=0)OR<a>, arilOR, Het, NR<a>C(=0)C,.3alkilenC(=0)OR<a>, arilOCi.3alkilenN(R<a>)2, arilOC(=0)R<a>, C^alkilenC(=0)OR<a>, OCMalkilenC(=0)OR<a>, C^alkilenOCMalkilen-C(=0)OR<a>, C(=0)NR<a>S02R<a>, CMalkilenN(R<a>)2, C2.6alkenilenN(R<a>)2, C(=0)NR<a>CM-alkilenOR", C(=0)NR<a>CMalkilenHet, OC2^alkilenN(R<a>)2, OCMalkilenCH(OR)CH2N(R<a>)2, OCMalkilenHet, OC2^alkilenOR<a>, OCMalkilenNRaC(=0)ORa, NR<a>CMalkilenN(R<a>)2, NR<a>C(=0)R<a>, NR<a>C(=0)N(R<a>)2, N(S02CMalkil)2, NR<a>(S02CMalkil), S02N(R<a>)2, OS02CF3, Ci.3alkilenaril, CMalkilenHet, Ci.6alkilenOR, Ci.3alkilenN(R<a>)2, C(=0)N(R<a>)2, NHC(=0)Ci-C3alkilenaril, C3.8cikloalkil, C3.8heterocikloalkil, arilOCi.3alkilenN(R<a>)2, arilOC(=0)R, NHC(=0)Ci.3alkilenC3.8heterocikloalkil, NHC(=0)Ci.3alkilenHet, OCMalkilenOCM-alkilenC(=0)OR, C(=0)CMalkilenHet, i NHC(=0)haloCi-6alkil; ili su R<1>i R<2>uzeti zajedno tako da formiraju tročlanu ili četvoročlanu alkilen ili alkenilen lančanu komponentu petočlanog ili šestočlanog prstena, koji opciono sadrži najmanje jedan heteroatom; R je izabran iz grupe koju sačinjavaju opciono supstituisani vodonik, Ci^alkil, C3.8-cikloalkil, C3.gheterocikloalkil, CMalkilencikloalkil, C2-6alkenil, Ci.3alkilenaril, arilCi.3alkil, C(=0)R<a>, aril, heteroaril, C(=0)OR<a>, C(=0)N(R<a>)2, C(=S)N(R<a>)2, S02R<a>, S02N(R<a>)2, S(=0)R<a>, S(=0)N(R<a>)2, C(=0)NR<a>CMalkilenOR<a>, C(=0)NRaCMalkilenHet, C(=0)CM-alkilenaril, C(=0)CMalkilenheteroaril, CMalkilenaril opciono supstituisan sa jednim ili više od halo, S02N(R<a>)2, N(R<a>)2, C(=0)OR<a>, NR<a>S02CF3, CN, N02, C(=0)R<a>, OR<a>, CM-alkilenN(R<a>)2, i OCMalkilenN(R<a>)2, Ci4alkilenheteroaril, CMalkilenHet, CMalkilenC(=0)-CMalkilenaril, CMalkilenC(=0)CMalkilenheteroaril, CMalkilenC(=0)Het, CMalkilen-C(=0)N(Ra)2, Ci-4alkilenORa, CMalkilenNR<a>C(=0)R<a>, CMalkilenOCi_4alkilenOR<a>, CM-alkilenN(R<a>)2, CMalkilenC(=0)OR<a>, i CMalkilenOCMalkilenC(=0)OR<a>; od kojih je svaki opciono supstituisan; gde je R<3>opciono supstituisan supstituentom izabranim iz grupe koja se sastoji od halo, OR<a>, Cwalkil, aril, heteroaril, N02, N(R<a>)2, NR<a>S02CF3, NR<a>C(=0)R<a>, C(=0)OR<a>, S02N(R<a>)2, CN, C(=0)R<a>, CMalkilenN(R<a>)2, OCMalkilenN(R<a>)2i N(R<a>)CMalkilenN(R<a>)2; R<a>je izabran iz grupe koju sačinjavaju vodonik, Ci.6alkil, C3-8cikloalkil, C3.s-heterocikloalkil, Ci.3alkilenN(R<a>)2, aril, arilCi.3alkil, Ci^alkilenaril, heteroaril, heteroarilCi.3-alkil, i Ci.3alkilenheteroaril; ili su dve R<a>grupe uzete zajedno tako da formiraju petočlani ili šestočlani prsten, koji opciono sadrži najmanje jedan heteroatom; Rb je izabran iz grupe koju sačinjavaju vodonik, Ci^alkil, aril, heteroaril, arilCi-3alkil, heteroarilCi.3alkil, Ci.3alkilenaril, i Ci.3alkilenheteroaril; Het je petočlani ili šestočlani heterociklični prsten, zasićen ili delimično ili potpuno nezasićen, i koji sadrži najmanje jedan heteroatom izabran iz grupe koju sačinjavaju kiseonik, azot i sumpor, i opciono supstituisan sa Ci^alkilom ili sa C(=0)OR<a>; i njegove farmaceutski prihvatljive soli i solvati, gde je "aril" definisana kao monociklična ili biciklična aromatična grupa; koja može da bude bilo nesupstituisana bilo supstituisana jednim, ili većom brojem, halo, alkil, fenil, hidroksialkil, alkoksi, alkoksialkil, haloalkil, nitro, amino, alkilamino, acilamino, alkiltio, alkilsulfmil i alkilsulfonil grupa, i gde je "heteroaril" definisan kao monociklični ili biciklični sistem prstenova koji sadrži jedan ili dva aromatična prstena i koji sadži najmanje jedan atom azota, kiseonika ili sumpora u aromatičnom prstenu, te koji može da bude bilo nesupstituisan bilo supstituisan jednim ili većim brojem halo, alkil, hidroksi, hidroksialkil, alkoksi, alkoksialkil, haloalkil, nitro, amino, alkilamino, acilamino, alkiltio, alkilsulfmil i alkilsulfonil grupa.

6. Jedinjenje prema zahtevu 5,naznačeno timešto je X izabrano iz grupe koju sačinjavaju CH2, CH2CH2, CH=CH, CH(CH3), CH2CH(CH3), i C(CH3)2.

7. Jedinjenje prema zahtevu 5,naznačeno timešto je Y izabrano iz grupe koju sačinjavaju ništa i NH.

8. Jedinjenje prema zahtevu 5,naznačeno timešto je A prstenski sistem supstituisan sa jednim do tri supstituenta izabrana iz grupe koju sačinjavaju NH2, NH(CH3), N(CH3)2, NHCH2C.6H5, NH(C2H5), Cl, F, CH3, SCH3, OH, i

9. Jedinjenje prema zahtevu 5,naznačeno timešto su Rii R2nezavisno izabrani iz grupe koju sačinjavaju vodonik, OR<a>, halo, Ci^alkil, N02, N(R<a>)2, NR<a>CMalkilenN(R<a>)2i OC2.4-alkilenOR<8>.

10. Jedinjenje prema zahtevu 8,naznačeno timešto su Rii R2nezavisno izabrani od H, OCH3, Cl, Br, F, CH3, N02, OH, N(CH3)2,

11. Jedinjenje prema zahtevu 5,naznačeno timešto su Rii R2uzeti zajedno tako da formiraju petočlani ili šestočlani prsten.

12. Jedinjenje prema zahtevu 5,naznačeno timešto je R izabrano iz grupe koju čine Ci-6-alkil, aril, heteroaril, C3.gcikloalkil, C3.gheterocikloalkil, C(=0)OR<a>, CMalkilenHet, Cm-alkilencikloalkil, CMalkilenaril, CMalkilenC(=0)-CMalkilenaril, CMalkilenC(=0)OR<a>, CM-alkilen-C(=0)N(R<a>)2, Ci4alkilenC(=0)Het, CM-alkilenN(R<a>)2i CMalkilenNR<a>C(=0)R<a>.

13. Jedinjenje prema zahtevu 5,naznačeno timešto je R<3>izabrano iz grupe koju čine OR<a>, Ci.6alkil, aril, heteroaril, N02, N(R<a>)2, C(=0)OC2H5, CH2CH(CH3)2,

14. Jedinjenje prema zahtevu 5,naznačeno timešto je R<3>supstituisano supstituentom izabranim iz grupe koju čine halo, OR<a>, Ci.6alkil, aril, heteroaril, NO2, N(R<a>)2, NR<a>S02CF3, NR<a>C(=0)R<a>, C(=0)OR<a>, S02N(R<a>)2, CN, C(=0)R<a>, CM-alkilenN(R<a>)2, OCMalkilenN(R<a>)2i N(R<a>)CMalkilenN(R<a>)2.

15. Jedinjenje prema zahtevu 5,naznačeno timešto je R supstituisano supstituentom izabranim iz grupe koju čine Cl, F, CH3, CH(CH3)2, OCH3, C6H5, N02, NH2, NHC(=0)CH3, C02H i N(CH3)CH2CH2N(CH3)2.

16. Farmaceutska kompozicijanaznačena timešto sadrži jedinjenje iz bilo kog od zahteva od 1 do 15 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

17. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva od 1 do 15 ili kompozicija prema zahtevu 16 za upotrebu u terapiji.

18. Jedinj enj e koj e ima strukturu naznačeno timešto je R7 je izabran iz grupe koju sačinjavaju H, halogen, OH, OCH3, CH3 i CF3; R8 je izabran iz grupe koju sačinjavaju H, OCH3i halogen; ili R<7>i R<8>zajedno sa C-6 i C-7 hinazolinskog prstenskog sistema definišu petočlani ili šestočlani aromatični prsten koji opciono sadrži jedan ili više O, N ili S atoma; R<9>je izabran iz grupe koju sačinjavaju Ci-C6alkil, fenil, halofenil, alkilfenil, bifenil, benzil, piridinil, 4-metilpiperazinil, sirćetna kiselina, etil estar i morfolinil; XjeNHiliS;i njegove farmaceutski prihvatljive soli i solvati, pod uslovom da je najmanje jedan od R<7>i R<8>različit od 6-halo ili 6,7-dimetoksi grupe i dalje pod uslovom daje R<9>različit od 4-hlorfenil grupe; koji selektivno inhibira aktivnost fosfatidilinozitol-3 kinaze delta u ćelijama kancera u odnosu na druge izoforme PI3K tipa I u testu na bazi ćelija, za inhibiciju rasta ili proliferacije ćelija hronične mijelogene leukemije.

19. Jedinjenje koje ima strukturu formule (III) naznačeno timešto je Y izabrano iz grupe koju sačinjavaju ništa, S i NH; R7 je izabran iz grupe koju sačinjavaju H, halo, OH, OCH3, CH3 i CF3; R8 je izabran iz grupe koju sačinjavaju H, OCH3i halogen; ili R<7>i R<8>zajedno sa C-6 i C-7 hinazolinskog prstenskog sistema definišu petočlani ili šestočlani aromatični prsten koji opciono sadrži jedan ili više O, N ili S atoma; R9 je izabran iz grupe koju sačinjavaju Ci-Cćalkil, fenil, halofenil, alkilfenil, bifenil, benzil, piridinil, 4-metilpiperazinil, C(=0)OC2Hs, i morfolinil; R<d>je nezavisno izabran iz grupe koju čine NH2, halo, Ci.3alkil, S(Ci-3alkil), OH, NH(Ci.3alkil), N(C1.3alkil)2, NH(Ci.3alkilenfenil); qje 1 ili 2, i njegove farmaceutski prihvatljive soli i solvati, pod uslovom da je najmanje jedan od R<7>i R<8>različit od 6-halo ili 6,7-dimetoksi grupe i daje R<9>različit od 4-hlorfenil grupe; za lečenje bolesti izabrane iz grupe koja se sastoji od: i) ishemije, poželjno je da to bude posledica zaustavljanja srčanog rada, infarkta miokarda, opstrukcije koronarnih arterija, tromboembolitičke okluzije krvnog suda mozga, traumatske povrede glave, edema ili tumora mozga, ii) reperfuzione povrede, poželjno je da to bude ona koja se dovodi u vezu sa vashuarnim Slogom, hemoragičnim šokom, miokardijalnom ishemijom ili infarktom, transplantacijom organa i cerebralnim vazospazmom, iii) bolesti kostiju, poželjno je da to budu bolesti odabrane iz grupe koja se sastoji od osteoporoze, Padžetove bolesti i srodnih poremećaja resorpcije kostiju, iv) hematopojetskih kancera, poželjno je da to budu a) limfomi, poželjno je da to budu oni odabrani iz grupe koja se sastoji od Burkitovog limfoma, Hodžkinsovog limfoma, ne-Hodžkinsovog limfoma, limfocitičnih limfoma; b) višestruki mijelomi c) leukemije, poželjno je da to budu leukemije odabrane iz grupe koja se sastoji od limfocitičnih leukemija, hroničnih mijeloidnih (mijelogenih) leukemija v) bolesti koje se dovode u vezu sa oslobađanjem histamina, poželjno je da to budu bolesti odabrane iz grupe koja se sastoji od hronične opstruktivne bolesti pluća (COPD), astme, ARDS (sindroma akutnog respiratornogdistresa, prim. prev.)i emfizema vi) bolesti artritisa, poželjno je da to budu one odabrane iz grupe koja se sastoji od reumatoidnog artritisa, monoartikularnog artritisa, osteoartritisa, giht artritisa, spondilitisa vii) Behetove bolesti, viii) sepse, septičnog šoka, endotoksičnog šoka, gram-negativne sepse, gram-pozitivne sepse i sindroma toksičnog šoka ix) sindroma povrede više organa kao sekundarne posledice septičnosti, traume ili krvarenja, x) oftalmoloških poremećaja, poželjno je da to budu oni odabrani iz grupe koja se sastoji od alergijskog konjuktivitisa, vernalnog konjuktivitisa, uveitisa i oftalmopatije koja se dovodi u vezu sa funkcijom tiroidne žlezde xi) eozinofilnog granuloma, xii) plućnih ili respiratornih poremećaja, poželjno je da to budu oni izabrani iz grupe koja se sastoji od astme, hroničnog bronhitisa, alergijskog rinitisa, ARDS, hronične zapaljenske bolesti pluća, hronične opstruktivne bolesti pluća, silikoze, plućne sarkoidoze, pleuritisa, alveolitisa, vaskulitisa, emfizema, zapaljenja pluća, bronhiektaze i plućne toksičnosti kiseonika xiii) fibroze, poželjno je da to bude cistična fibroza xiv) nastanka keloida ili ožiljačnog tkiva xv) ateroskleroze xvi) autoimunih bolesti, poželjno je onih koje su odabrane iz grupe koja se sastoji od sistemskog lupusa eritematozusa (SLE), autoimunog tiroiditisa, multiple skleroze, nekih oblika dijabetesa i Rejnodovog sindroma xvii) poremećaja odbacivanja transplantata, poželjno je da to budu oni odabrani iz grupe koja se sastoji od GVHD ("graft vs. host disease",bolest transplantata protiv domaćina, prim. prev.)i odbacivanja alografta, xviii) hroničnog glomerulonefritisa xix) zapaljenskih bolesti creva, poželjno je da to budu one odabrane iz grupe koja se sastoji od hronične zapaljenske bolesti creva (CIBD), Kronove bolesti, ulcerativnog kolitisa i nekrotizujućeg enterokolitisa xx) zapaljenskih dermatoza, poželjno je da to budu one odabrane iz grupe koja se sastoji od kontaktnog dermatitisa, atopijskog dermatitisa, psorijaze i urtikarije xxi) groznice i mijalgija usled infekcije, xxii) zapaljenskih poremećaja centralnog ili perifernog nervnog sistema, poželjno je da to budu oni odabrani iz grupe koja se sastoji od meningitisa, encefalitisa i povreda mozga i kičmene moždine usled manjih trauma xxiii) Sjogrenove bolesti xxiv) bolesti kod kojih dolazi do dijapedeze leukocita xxv) alkoholičnog hepatitisa xxvi) bakterijske upale pluća xxvii) bolesti u kojima posreduju kompleksi antigen-antitelo xxviii) hipovolemijskog šoka xxix) dijabetesa melitusa tipa I xxx) akutne i odložene preosetljivosti, xxxi) bolesti i stanja usled diskrazije leukocita i metastaza, xxxii) termičkih povreda, xxxiii) sindroma koji se dovode u vezu sa transfuzijom granulocita i xxxiv) toksičnosti izazvane citokinima.

20. Jedinjenje ili kompozicija prema zahtevu 17,naznačeni timešto je terapija tretman lečenja bolesti izabranih iz grupe koja se sastoji od: i) ishemije, poželjno je da to bude posledica zaustavljanja srčanog rada, infarkta miokarda, opstrukcije koronarnih arterija, tromboembolitičke okluzije krvnog suda mozga, traumatske povrede glave, edema ili tumora mozga, ii) reperfuzione povrede, poželjno je da to bude ona koja se dovodi u vezu sa vaskularnim slogom, hemoragičnim šokom, miokardijalnom ishemijom ili infarktom, transplantacijom organa i cerebralnim vazospazmom, iii) bolesti kostiju, poželjno je da to budu bolesti odabrane iz grupe koja se sastoji od osteoporoze, Padžetove bolesti i srodnih poremećaja resorpcije kostiju, iv) hematopojetskih kancera, poželjno je da to budu a) limfomi, poželjno je da to budu oni odabrani iz grupe koja se sastoji od Burkitovog limfoma, Hodžkinsovog limfoma, ne-Hodžkinsovog limfoma, limfocitičnih limfoma; b) višestruki mijelomi c) leukemije, poželjno je da to budu leukemije odabrane iz grupe koja se sastoji od limfocitičnih leukemija, hroničnih mijeloidnih (mijelogenih) leukemija v) bolesti koje se dovode u vezu sa oslobađanjem histamina, poželjno je da to budu bolesti odabrane iz grupe koja se sastoji od hronične opstruktivne bolesti pluća (COPD), astme, ARDS (sindroma akutnog respiratornogdistresa, prim. prev.)i emfizema vi) bolesti artritisa, poželjno je da to budu one odabrane iz grupe koja se sastoji od reumatoidnog artritisa, monoartikularnog artritisa, osteoartritisa, giht artritisa, spondilitisa vii) Behetove bolesti, viii) sepse, septičnog šoka, endotoksičnog šoka, gram-negativne sepse, gram-pozitivne sepse i sindroma toksičnog šoka ix) sindroma povrede više organa kao sekundarne posledice septičnosti, traume ili krvarenja, x) oftalmoloških poremećaja, poželjno je da to budu oni odabrani iz grupe koja se sastoji od alergijskog konjuktivitisa, vernalnog konjuktivitisa, uveitisa i oftalmopauje koja se dovodi u vezu sa funkcijom tiroidne žlezde xi) eozinofilnog granuloma, xii) plućnih ili respiratornih poremećaja, poželjno je da to budu oni izabrani iz grupe koja se sastoji od astme, hroničnog bronhitisa, alergijskog rinitisa, ARDS, hronične zapaljenske bolesti pluća, hronične opstruktivne bolesti pluća, silikoze, plućne sarkoidoze, pleuritisa, alveolitisa, vaskulitisa, emfizema, zapaljenja pluća, bronhiektaze i plućne toksičnosti kiseonika xiii) fibroze, poželjno je da to bude cistična fibroza xiv) nastanka keloida ili ožiljačnog tkiva xv) ateroskleroze xvi) autoimunih bolesti, poželjno je onih koje su odabrane iz grupe koja se sastoji od sistemskog lupusa eritematozusa (SLE), autoimunog tiroiditisa, multiple skleroze, nekih oblika dijabetesa i Rejnodovog sindroma xvii) poremećaja odbacivanja transplantata, poželjno je da to budu oni odabrani iz grupe koja se sastoji od GVHD ("graft vs. host disease",bolest transplantata protiv domaćina, prim. prev.)i odbacivanja alografta, xviii) hroničnog glomerulonefritisa xix) zapaljenskih bolesti creva, poželjno je da to budu one odabrane iz grupe koja se sastoji od hronične zapaljenske bolesti creva (CIBD), Kronove bolesti, ulcerativnog kolitisa i nekrotizujućeg enterokolitisa xx) zapaljenskih dermatoza, poželjno je da to budu one odabrane iz grupe koja se sastoji od kontaktnog dermatitisa, atopijskog dermatitisa, psorijaze i urtikarije xxi) groznice i mijalgija usled infekcije, xxii) zapaljenskih poremećaja centralnog ili perifernog nervnog sistema, poželjno je da to budu oni odabrani iz grupe koja se sastoji od meningitisa, encefalitisa i povreda mozga i kičmene moždine usled manjih trauma xxiii) Sjogrenove bolesti xxiv) bolesti kod kojih dolazi do dijapedeze leukocita xxv) alkoholičnog hepatitisa xxvi) bakterijske upale pluća xxvii) bolesti u kojima posreduju kompleksi antigen-antitelo xxviii) hipovolemijskog šoka xxix) dijabetesa melitusa tipa I xxx) akutne i odložene preosetljivosti, xxxi) bolesti i stanja usled diskrazije leukocita i metastaza, xxxii) termičkih povreda, xxxiii) sindroma koji se dovode u vezu sa transfuzijom granulocita i xxxiv) toksičnosti izazvane citokinima.