RS54424B1 - Humana antitela koja se vezuju za cxcr4 i njihove upotrebe - Google Patents

Humana antitela koja se vezuju za cxcr4 i njihove upotrebe

Info

Publication number
RS54424B1
RS54424B1 RS20150771A RSP20150771A RS54424B1 RS 54424 B1 RS54424 B1 RS 54424B1 RS 20150771 A RS20150771 A RS 20150771A RS P20150771 A RSP20150771 A RS P20150771A RS 54424 B1 RS54424 B1 RS 54424B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
cxcr4
human
seq
antibodies
Prior art date
Application number
RS20150771A
Other languages
English (en)
Inventor
Michelle Kuhne
Peter Brams
Dawn M. Tanamachi
Alan Korman
Josephine M. Cardarelli
Original Assignee
E. R. Squibb & Sons, L.L.C.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39402166&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS54424(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by E. R. Squibb & Sons, L.L.C. filed Critical E. R. Squibb & Sons, L.L.C.
Publication of RS54424B1 publication Critical patent/RS54424B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)

Abstract

Humano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, naznačeno time, što se specifično vezuje za nativni humani CXCR4 eksprimiran na površini ćelije i sadrži:CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca koji uključuje amino-kiseline sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 1;CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca koji uključuje amino-kiseline sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 5;CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca koji uključuje amino-kiseline sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 9;CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca koji uključuje amino-kiseline sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 13;CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca koji uključuje amino-kiseline sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 17; iCDR3 varijabilnog regiona lakog lanca koji uključuje amino-kiseline sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 21.Prijava sadrži još 16 patentnih zahteva.

Description

Osnova pronalaska
[0001]Hemokini su familija od oko 50 malih proteina koji modulišu ćelijske migracije i angiogenezu i imaju značajnu ulogu u tumorskom mikrookruženju (Vicari, A.P. and Caux, C. (2002) Cylokine Growth Factor Rev. 13:143-154). U zavisnosti od strukture, hemokini se klasifikuju kao C-C hemokini (sadrže cistein-cistein motiv) ili C-X-C hemokini (sadrže cistein-X-cistein motiv). Receptori koji se vezuju za te hemokine se, prema tome, svrstavaju u članove CCR familije odnosno CXCR familije. Jedan član CXCR familije je CXCR4, transmembranski receptor povezan sa G-proteinom, koji sedam puta prolazi kroz ćelijsku membranu, prevashodno se eksprimira na limfocitima i aktivira hemotaksiju. CXCR4 se vezuje za hemokin CXCL12 (SDF-1).
[0002]CXCR4 ima ulogu u embriogenezi, homeostazi i zapaljenjima. Studije sa miševima inženjerisanim da budu deficijentni za CXCR4 ili SDF-1 ukazuju na to daje CXCR4/SDF-1 put uključen u vaskularizaciju organa, kao i u imunski i hematopoetski sistem (Tachibana, K. et al. (1998) Nature 393:591-594). Pored toga, pokazano je da CXCR4 funkcioniše kao koreceptor za T-limfotrofhe HIV-1 izolate (Feng, Y. et al.
(1996) Science 272:872-877). Pokazano je takođe da se CXCR4 eksprimira na velikom broju različitih tipova kancerskih ćelija. Pored toga, pokazano je da je CXCR4/SDF-1 put uključen u stimulaciju metastatskog procesa u mnogim različitim neoplazijama (Murphv, P.M. (2001) N. Engl. J. Med. 345:833-835). Na primer, pokazano je da CXCR4 i SDF-1 posreduju u organ-specifičnom metastaziranju, stvaranjem hemotaksičnog gradijenta između mesta primarnog tumora i mesta metastaze (Muller, A. et al. (2001) Nature 410:50-56; Murakami, T. et al. (2002) Cancer Res. 62:7328-7334; Hanahan, D. et al. (2003) Cancer Res. 63:3005-3008). |0003]Vaday G.G. et al, (2004) Clinical Cancer Research, vol. 10, p.5630-5639 objavljuju da dva anti-CXCR4 antitela, Abl24 i Abl25, imaju sledeće osobine: vezuju se za ćelije kancera prostate; inhibiraju vezivanje DF1 za CXCR4 na ćelijama kancera prostate; dovode do značajne redukcije fluksa kalcijuma; inhibiraju hemotaksiju ćelija kancera prostate; i inhibiraju invaziju ćelija kancera prostate.
Sažetak
[0004]Predmetna objava obezbeđuje izolovana monoklonska antitela, preciznije, humana monoklonska antitela koja se vezuju za humani CXCR4 i koja ispoljavaju brojne željene osobine. Ove osobine uključuju sposobnost vezivanja za nativni humani CXCR4 eksprimiran na površini ćelije, sposobnost inhibiranja vezivanja SDF-1 za humani CXCR4, sposobnost inhibiranja SDF-1-indukovanog fluksa kalcijuma u ćelije koje eksprimiraju CXCR4, sposobnost inhibiranja SDF-1 -indukovane migracije ćelija koje eksprimiraju CXCR4, sposobnost inhibiranja endotelskih ćelija humane umbilikalne vene (human umbilical vein endothelial cells, HuVEC) da formiraju kapilarne tube, sposobnost indukovanja apoptoze u ćelijama koje eksprimiraju CXCR4, sposobnost inhibiranja proliferacije tumorskih ćelijain vitro,sposobnost inhibiranja proliferacije tumorskih ćelijain vivo,sposobnost inhibiranja metastaza CXCR4<+>tumorskih ćelija i/ili sposobnost produžavanja vremena preživljavanja subjekta koji nosi CXCR4<+>tumor. 10005]U jednom aspektu, sadašnja objava odnosi se na izolovano humano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, gde se antitelo vezuje za nativni humani CXCR4 eksprimiran na površini ćelije. U jednoj formi, antitelo takođe inhibira vezivanje SDF-1 za humani CXCR4, poželjno sa inhibitornom EC50od 50 nM ili manjom, ili 30 nM ili manjom, ili 15 nM ili manjom, ili 10 nM ili manjom, ili 5 nM ili manjom, ili 3 nM ili manjom (npr., inhibitornom EC50od 28.60 nM ili manjom, ili 12.51 nM ili manjom, ili 2.256 nM ili manjom). U drugoj formi, antitelo se vezuje za nativni humani CXCR4 eksprimiran na površini ćelije, ali ne inhibira vezivanje SDF-1 za humani CXCR4. U drugim formama, antitelo takođe inhibira SDF-1-indukovani fluks kalcijuma u ćelije koje eksprimiraju humani CXCR4, poželjno sa inhibitornom EC50od 3 nM ili manjom, ili 2 nM ili manjom, ili 1 nM ili manjom, ili 0.9 nM ili manjom, ili 0.8 nM ili manjom, ili 0.7 nM ili manjom, ili 0.6 nM ili manjom, ili 0.5 nM ili manjom, ili 0.4 nM ili manjom (npr., 0.9046 nM ili manjom, 0.5684 ili manjom, ili 0.3219 nM ili manjom). U drugim formama, antitelo takođe inhibira SDF-1-indukovanu migraciju ćelija koje eksprimiraju humani CXCR4, poželjno sa inhibitornom EC50od 50 nM ili manjom, ili 30 nM ili manjom, ili 20 nM ili manjom, ili 15 nM ili manjom (npr., 18.99 nM ili manjom, ili 12.44 ili manjom). U drugim formama, antitelo takođe inhibira HuVEC da formiraju kapilarne tube, indukuje apoptozu ćelija koje eksprimiraju CXCR4, inhibira proliferaciju tumorskih ćelijain vitro,inhibira proliferaciju tumorskih ćelija ili indukuje apoptozu tumorskih ćelijain vivo,inhibira metastaze CXCR4<+>tumorskih ćelija i/ili produžava vreme preživljavanja subjekta koji nosi CXCR4<+>tumor.
[0006]Poželjno, antitelo se vezuje za humani CXCR4 sa visokim afinitetom, na primer sa Kdod 1 x 10" M ili manjom, ili sa Kdod 5 x 10" M ili manjom. Poželjno, antitela ove objave su antitela pune dužine (tj., sadrže varijabilne i konstantne regione). Pored toga, antitela ove objave su, poželjno, formirana na humani CXCR-4 pune dužine, eksprimiran u nativnoj konformaciji na ćeliji-domaćinu ili na vcštačkoj membrani.
[0007]U poželjnom aspektu, ova objava odnosi se na izolovano humano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, gde antitelo: (a) vezuje se za nativni humani CXCR4 eksprimiran na površini ćelije; (b) inhibira vezivanje SDF-1 za humani CXCR4; (c) inhibira SDF-1-indukovani fluks kalcijuma u ćelije koje eksprimiraju humani CXCR4; (d) inhibira SDF-1-indukovanu migraciju ćelija koje eksprimiraju humani CXCR4; i (e) inhibira endotelske ćelije humane umbilikalne vene ds formiraju kapilarne tube.
[0008]Još poželjnije, antitelo takođe indukuje apoptozu ćelija koje eksprimiraju humani CXCR4 i/ili inhibira rast CXCR4 tumorskih ćelija i/ili indukuje apoptozu tumorskih ćelijain vivo.
[0009]U drugom aspektu, ova objava odnosi se na izolovano humano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, gde antitelo unakrsno kompetira sa referentnim antitelom za vezivanje za CXCR4, pri čemu referentno antitelo sadrži: (a) varijabilni region teškog lanca, koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25 i varijabilni region lakog lanca, koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29; ili (b) varijabilni region teškog lanca, koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26 i varijabilni region lakog lanca, koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 30; ili (c) varijabilni region teškog lanca, koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27 i varijabilni region lakog lanca, koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31; ili (d) varijabilni region teškog lanca, koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28 i varijabilni region lakog lanca, koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32.
[0010] U određenim formama, ova objava obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, koji sadrže varijabilni region teškog lanca, koji je proizvod ili je izveden iz humanog Vh3-48 gena, pri čemu se antitelo specifično vezuje za humani CXCR4. U drugim formama, ova objava obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, koji sadrže varijabilni region lakog lanca koji je proizvod ili je izveden iz humanog V«. LI5 gena, pri čemu se antitelo specifično vezuje za humani CXCR4. U drugim formama, ova objava obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, koji sadrže varijabilni region teškog lanca, koji je proizvod ili je izveden iz humanog VH3-48 gena i varijabilni region lakog lanca, koji je proizvod ili je izveden iz humanog VKLI 5 gena, pri čemu se antitelo specifično vezuje za humani CXCR4.
10011] U drugom aspektu, ova objava obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, koji sadrže:
varijabilni region teškog lanca, koji uključuje CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence; i varijabilni region lakog lanca, koji uključuje CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence, pri čemu: (a) CDR3 sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca uključuje aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 9-12 i njihovih konzervativnih modifikacija; (b) CDR3 sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca uključuje aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 21-24 i njihovih konzervativnih modifikacija; i (c) antitelo se vezuje za nativni humani CXCR4 eksprimiran na površini ćelije.
U poželjnim formama, ovo antitelo takođe ima jednu ili više od sledećih karakteristika: inhibira vezivanje SDF-1 za CXCR4, inhibira SDF-1-indukovani fluks kalcijuma u ćelije koje eksprimiraju CXCR4, inhibira SDF-1-indukovanu migraciju ćelija koje eksprimiraju CXCR-4; inhibira HuVEC da formiraju kapilarne tube, indukuje apoptozu ćelija koje eksprimiraju CXCR4( in vitroi/iliin vivo),inhibira rast CXCR4<*>tumorskih ćelijain vitroi/iliin vivoi/ili inhibira metastaze CXCP.4+ tumorskih ćelija.
[0012] Poželjno, CDR2 sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca uključuje aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 5-8, i njihovih konzervativnih modifikacija; i CDR2 sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca uključuje aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 17-20, i njihovih konzervativnih modifikacija. Poželjno, CDR1 sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca uključuje aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 1-4, i njihovih konzervativnih modifikacija; i CDR1 sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca uključuje aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 13-16, i njihovih konzervativnih modifikacija.
[0013]Poželjna kombinacija sadrži: (a) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 1; (b) CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 5; (c) CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 9; (d) CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 13; (e) CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 17; i (f) CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 21.
[0014] Sledeća poželjna kombinacija sadrži: (a) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 2; (b) CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 6; (c) CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 10; (d) CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 14; (e) CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 18; i (f) CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 22.
[0015] Sledeća poželjna kombinacija sadrži: (a) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 3; (b) CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 7; (c) CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 11: (d) CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 15; (e) CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 19; i (f) CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 23.
[0016] Sledeća poželjna kombinacija sadrži: (a) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 4; (b) CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 8; (c) CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 12; (d) CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 16; (e) CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 20; i (f) CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 24.
[0017]Druga poželjna antitela ove objave, ili njihovi antigen-vezujući delovi, sadrže: (a) varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 25-28 i 41-44; i (b) varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 29-32 i 45-48; pri čemu se antitelo specifično vezuje za CXCR4.
[0018] Poželjna kombinacija sadrži: (a) varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25 ili 41; i (b) varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29 ili 45.
[0019] Druga poželjna kombinacija sadrži: (a) varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26 ili 42; i (b) varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 30 ili 46.
[0020] Druga poželjna kombinacija sadrži: (a) varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27 ili 43; i (b) varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31 ili 47. [0021[ Druga poželjna kombinacija sadrži: (a) varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28 ili 44; i (b) varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32 ili 48.
[0022] U drugom aspektu ove objave, obezbeđena su antitela ili njihovi antigen-vezujući delovi koji sa bilo kojim od gore pomenutih antitela kompetiraju za vezivanje za CXCR4.
[0023] Antitela ove objave mogu biti, na primer, antitela pune dužine, na primer, IgGl ili IgG4 izotipa. Alternativno, antitela mogu da budu fragmenti antitela, kao što su Fab, Fab' ili Fab'2 fragmenti, ili jednolančana antitela. [0024J Ova objava takođe obezbeđuje imunokonjugat koji sadrži antitelo ove objave, ili njegov antigen-vezujući deo, povezane sa terapijskim sredstvom npr. citotoksinom ili radioaktivnim izotopom. Ova objava takođe obezbeđuje bispecifični molekul koji sadrži antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, ove objave povezane sa drugom funkcionalnom komponentom koja ima različitu vezujuću specifičnost od pomenutog antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg dela. [0025J Obezbeđene su i smeše koje sadrže antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, ili imunokonjugat, ili bispecifični molekul ove objave i farmaceutski prihvatljivi nosač.
[0026]Molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju antitela, ili njihove antigen-vezujuće delove ove objave takođe su obuhvaćeni ovom objavom, kao i ekspresioni vektori koji sadrže takve nukleinske kiseline i ćelije-domaćini koje sadrže takve ekspresione vektore. Metodi pripremanja anti-CXCR4 antitela korišćenjem ćelija-domaćina koje sadrže takve ekspresione vektore, takođe su obezbeđeni i mogu da uključuju korake (i) eksprimiranja antitela u ćeliji-domaćinu i (ii) izolovanje antitela iz ćelije-domaćina.
[0027]Drugi aspekt ove objave odnosi se na metode modulisanja aktivnosti CXCR4 u ćeliji, pri čemu ćelije dolaze u kontakt sa antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim delom ove objave. Ćelije mogu da kontaktirajuin vitrokultivisanjem ćelija sa antitelom ili ćelije mogu da kontaktirajuin vivotako što se antitelo primenjuje na subjektu. U poželjnoj formi, ćelije su tumorske ćelije koje eksprimiraju CXCR4, a metod za rezulatat ima inhibiciju rasta tumorskih ćelija i/ili inhibiciju metastaza tumorskih ćelija. U drugoj formi, ćelije su T-ćelije koje eksprimiraju CXCR4, a metod za rezulatat ima inhibiciju ulaska HIV u ćelije. U još jednoj formi, ćelije su limfociti u zapaljenskom poremećaju, a metodi za rezultat imaju inhibiciju zapaljenja. U još jednoj formi, ćelije su uključene u vaskularizaciju, a metod za rezulatat ima modulaciju angiogeneze.
[0028]U drugom aspektu, ova objava se odnosi na metod stimulisanja mobilizacije CD34<+>matičnih ćelija iz kostne srži u perifernu kn/, kod subjekta, metod uključuje davanje subjektu antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg dela, ove objave, tako da se stimuliše mobilizacija CD34<+>matičnih ćelija iz kostne srži u perifernu krv. Metod uključuje i sakupljanje CD34<+>matičnih ćelija iz periferne krvi, na pr. za upotrebu u autologoj transplantaciji matičnih ćelija.
[0029]Druge osobine i prednosti sadašnje objave biće vidljive iz detaljnog opisa i primera koji slede, što ne bi trebalo shvatati kao ograničavajuće.
Kratak opis crteža
[0030]
Slika 1A pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 33) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 25) varijabilnog regiona teškog lanca humanog monoklonskog antitela
F7. CDR1 (SEQ ID NO: 1), CDR2 (SEQ ID NO: 5) i CDR3 (SEQ ID NO: 9) regioni su naznačeni i navedeno je poreklo V, D i J iz germinativne linije.
Slika 1B pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 37) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 29) varijabilnog regiona lakog lanca humanog monoklonskog antitela F7. CDR1 (SEQ ID NO: 13), CDR2 (SEQ ID NO: 17) i CDR3 (SEQ ID NO: 21) regioni su naznačeni i navedeno je poreklo V i J iz germinativne linije.
Slika 2A pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 34) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 26) varijabilnog regiona teškog lanca humanog monoklonskog antitela F9. CDR1 (SEQ ID NO: 2), CDR2 (SEQ ID NO: 6) i CDR3 (SEQ ID NO: 10) regioni su naznačeni i navedeno je poreklo V, D i J iz germinativne linije.
Slika 2B pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 38) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 30) varijabilnog regiona lakog lanca humanog monoklonskog antitela F9. CDR1 (SEQ ID NO: 14), CDR2 (SEQ ID NO: 18) i CDR3 (SEQ ID NO: 22) regioni su naznačeni i navedeno je poreklo V i J iz germinativne linije.
Slika 3A pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 35) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 27) varijabilnog regiona teškog lanca humanog monoklonskog antitela Dl. CDR1 (SEQ ID NO: 3), CDR2 (SEQ ID NO: 7) i CDR3 (SEQ ID NO: 11) regioni su naznačeni i navedeno je poreklo V, D i J iz germinativne linije.
Slika 3B pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 39) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 31) varijabilnog regiona lakog lanca humanog monoklonskog antitela Dl. CDR1 (SEQ ID NO: 15), CDR2 (SEQ ID NO: 19) i CDR3 (SEQ ID NO: 23) regioni su naznačeni i navedeno je poreklo V i J iz germinativne linije.
Slika 4A pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 36) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 28) varijabilnog regiona teškog lanca humanog monoklonskog antitela E2. CDR1 (SEQ ID NO: 4), CDR2 (SEQ ID NO: 8) i CDR3 (SEQ ID NO: 12) regioni su naznačeni i navedeno je poreklo V, D i J iz germinativne linije.
Slika 4B pokazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 40) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 32) varijabilnog regiona lakog lanca humanog monoklonskog antitela E2. CDR1 (SEQ ID NO: 16), CDR2 (SEQ ID NO: 20) i CDR3 (SEQ ID NO: 24) regioni su naznačeni i navedeno je poreklo V i J iz germinativne linije.
Slika 5A pokazuje poravnavanje aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona teških lanaca F7 (SEQ ID NO: 25) i F7GL (SEQ ID NO: 41) sa humanom aminokiselinskom sekvencom VH3-48 germinativne linije (SEQ ID NO: 49) (JH6b germinativne linije objavljena kao SEQ ID NO: 52).
Slika 5B pokazuje poravnavanje aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca F7 (SEQ ID NO: 29) i F7GL (SEQ ID NO: 45) sa humanom aminokiselinskom sekvencom VkLI 5 germinativne linije (SEQ ID NO: 50) (JK1 germinativne linije objavljena kao SEQ ID NO: 53).
Slika 6A pokazuje poravnavanje aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona teških lanaca F9 (SEQ ID NO: 26) i F9GL (SEQ ID NO: 42) sa humanom aminokiselinskom sekvencom VH3-48 germinativne linije (SEQ ID NO: 49) (JH6b germinativne linije objavljena kao SEQ ID NO: 52).
Slika 6B pokazuje poravnavanje aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca F9 (SEQ ID NO: 30) i F9GL (SEQ ID NO: 46) sa humanom aminokiselinskom sekvencom VkLI 5 germinativne linije (SEQ ID NO:50) (JK1 germinativne linije objavljena kao SEQ ID NO: 53).
Slika 7A pokazuje poravnavanje aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona teških lanaca Dl (SEQ ID NO: 27) i D1GL (SEQ ID NO: 43) sa humanom aminokiselinskom sekvencom VH3-48 germinativne linije (SEQ ID NO: 49) (JH6b germinativne linije objavljena kao SEQ ID NO: 52).
Slika 7B pokazuje poravnavanje aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca Dl (SEQ ID NO: 31) i D1GL (SEQ ID NO: 47) sa humanom aminokiselinskom sekvencom VkLI 5 germinativne linije (SEQ ID NO:50) (JK1 germinativne linije objavljena kao SEQ ID NO: 53).
Slika 8A pokazuje poravnavanje aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona teških lanaca E2 (SEQ ID NO: 28) i E2GL (SEQ ID NO: 44) sa humanom aminokiselinskom sekvencom VH3-48 germinativne linije (SEQ ID NO: 49) (JH6b germinativne linije objavljena kao SEQ ID NO: 52).
Slika 8B pokazuje poravnavanje aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca E2 (SEQ ID NO: 32) i E2GL (SEQ ID NO: 48) sa humanom aminokiselinskom sekvencom VkLI5 germinativne linije (SEQ ID NO:50) (JK1 germinativne linije objavljena kao SEQ ID NO: 53).
Slika 9 je grafikon koji prikazuje vezivanje anti-CXCR4 humanih antitela F7, F9, Dl i E2 za CEM ćelije koje na svojoj površini eksprimiraju nativni humani CXCR4.
Slika 10 je grafikon koji prikazuje kompetitivno vezivanje antitela za CEM ćelije između FITC-obeleženog anti-CXCR4 antitela F9 i panela neobeleženih anti-CXCR4 humanih antitela.
Slika 11 je grafikon koji prikazuje inhibiciju vezivanja "I-obeleženog SDF-1 za CEM ćelije anti-CXCR4 humanim antitelima F7, F9 i Dl.
Slika 12 je grafikon koji prikazuje inhibiciju SDF-1-indukovanog fluksa kalcijuma u CEM ćelije anti-CXCR4 humanim antitelima F7, F9 i Dl.
Slika 13 je grafikon koji prikazuje inhibiciju SDF-1-indukovane migracije CEM ćelija anti-CXCR4 humanima antitelima F7 i F9.
Slika 14 je grafikon koji prikazuje inhibiciju proliferacije ćelija Ramos-ovog tumorain vitroanti-CXCR4 humanim antitelima F7, F9 i E2.
Slike 15A-C su grafikoni koji prikazuju inhibiciju proliferacije ćelija Ramos-ovog tumorain vivou modelu subkutanog tumora, anti-CXCR4 humanim antitelima F7 i F9. Slika 15A prikazuje krivu rasta srednje zapremine tumora; Slika 15B prikazuje krivu rasta medijane zapremine tumora; Slika 15C prikazuje medijane % promene telesne težine.
Slika 16 je grafikon koji prikazuje % preživljavanja miševa tretiranih anti-CXCR4 humanim antitelom F9 u Ramos-ovom modelu sistemskih tumorskih ćelija.
Detaljan opis ove objave
[0031]Predmetna objava odnosi se na izolovana monoklonska antitela, posebno humana monoklonska antitela koja se specifično vezuju za nativni humani CXCR4 eksprimiran na površini ćelije. U određenim formama, antitela ove objave izvode se iz određenih teško- i lakolančanih sekvenci germinativne linije i/ili sadrže posebne strukturne osobenosti kao što su CDR regioni koji uključuju posebne aminokiselinske sekvence. Ova objava obezbeđuje izolovana antitela, metode pravljenja takvih antitela, imunokonjugate i bispecifične molekule koji uključuju takva antitela i farmaceutske smeše koje sadrže antitela, imunokonjugate ili bispecifične molekule ove objave. Ova objava se takođe odnosi na metode upotrebe antitela, npr. za detekciju CXCR4, kao i za modulaciju aktivnosti CXCR4 u bolestima ili poremećajima udruženim sa ekspresijom CXCR4 ili koji uključuju CXCR4/SDF-1 put, kao što su kanceri, tumorske metastaze, HIV infekcija, zapaljenje i angiogeneza. Prema tome. ova objava obezbeđuje i metode upotrebe anti-CXCR4 antitela ove objave za lečenje kancera kao što su kancer dojke, ovarijuma, prostate, nemalih ćelija pluća, pankreasa, tiroidne žlezde, melanom, nazofaringealni kaner, kancer renalnih ćelija, limfom, neuroblastom, glioblastom, rabdomiosarkom, kolorektalni kancer, kancer bubrega, osteosarkom, akutna limfoblastna leukemija ili akutna mijeloidna leukemija. Pored toga, ova objava obezbeđuje metode upotrebe anti-CXCR4 antitela ove objave za inhibiciju tumorskih metastaza.
[0032]Da bi se predmetna objava lakše razumela, najpre će se definisati neki izrazi. Dodatne definicije biće navedene u okviru detaljnog opisa.
[0033]Izraz "CXCR4" uključuje vaijante, izoforme, homologe, ortologe i paraloge. Na primer, antitela specifična za CXCR4 mogu, u nekim slučajevima, unakrsno reagovati sa CXCR4 iz vrsta koje nisu čovek. U drugim formama, antitela specifična za humani CXCR4 mogu da budu kompletno specifična za humani CXCR4 i mogu da ne pokazuju vrsnu ili druge tipove unakrsne reaktivnosti. Izraz "humani CXCR4" odnosi se na humanu sekvencu CXCR4, kao što je kompletna aminokiselinska sekvenca humanog CXCR4 sa Genbank pristupnim brojem P61073 (SEQ ID NO.:51). CXCR4 je takođe poznat u struci kao, na primer, LESTR, fuzin ili CD 184. Humana CXCR4 sekvenca može da se razlikuje od humane CXCR4 SEQ ID NO.:51 po tome što ima, na primer, konzervirane mutacije ili mutacije u nekonzerviranim regionima i CXCR4 ima suštinski istu biološku funkciju kao humani CXCR4 SEQ ID NO.:51. Na primer, biološka funkcija humanog CXCR4 je posedovanje epitopa na vanćelijskom domenu CXCR4, koji se specifično vezuje sa antitelom sadašnje objave ili, biološka funkcija humanog CXCR4 je vezivanje hemokina ili uključenost u metastatski proces.
[0034]Posebna humana CXCR4 sekvenca će obično biti najmanje 90% identična po aminokiselinskoj sekvenci sa humanom CXCR4 SEQ ID NO.: 51 i sadrži aminokiselinske rezidue koje određuju aminokiselinsku sekvencu kao humanu kada se upoređuje sa CXCR4 aminokiselinskim sekvencama drugih vrsta (npr., miša). U nekim slučajevima, humani CXCR4 može da bude najmanje 95%, ili čak najmanje 96%, 97%, 98%, ili 99% identičan po aminokiselinskoj sekvenci sa CXCR4 SEQ ID NO.: 51. U nekim formama, humana CXCR4 sekvenca pokazaće razliku u ne više od 10 amino-kiselina u odnosu na CXCR4 SEQ ID NO.: 51. U nekim formama, humani CXCR4 može da pokaže razliku u ne više od 5, ili čak od 4, 3, 2 ili 1 amino-kiseline u odnosu na CXCR4 SEQ ID NO.: 51. Procenat identičnosti može da se odredi na način opisan u ovom tekstu.
[0035]Izraz "SDF-1" odnosi se na faktor 1 poreklom iz ćelija strome, koji je ligand za CXCR4. Izraz "SDF-1" obuhvata različite izoforme SDF-1, kao što su SDF-1 a i SDF-ip. Aminokiselinska sekvenca humanog SDF-1 a ima Genbank pristupni broj NP_954637. Aminokiselinska sekvenca humanog SDF-1 p ima Genbank pristupni broj NP 000600. Humani SDF-1 je takođe opisan u U.S. Patent No. 5,756,084. SDF-1 je poznat i kao CXCL12. Aminokiselinska sekvenca humanog SDF-1 može da se razlikuje od SDF-1 NP 954637 ili NP 000600, kako je opisano u ovom tekstu za CXCR4.
[0036]Izraz "imunski odgovor" odnosi se na delovanje, na primer, limfocita, antigen-prezentujućih ćelija, fagocitnih ćelija, granulocita i solubilnih makromolekula koje proizvode navedene ćelije ili jetra (uključujući antitela, citokine i komplement), koje za rezultat ima selektivno oštećenje, uništenje ili eliminaciju iz čovekovog tela invazivnih patogena, ćelija ili tkiva inficiranih patogenima, kanceroznih ćelija ili, u slučaju autoimunosti ili patološkog zapaljenja, normalnih čovekovih ćelija ili tkiva. [0037["Put prenosa signala" odnosi se na biohemijsku relaciju između različitih molekula za prenos signala, koji imaju ulogu u prenesu signala iz jednog dela ćelije u drugi deo ćelije. Kako se koristi u ovom tekstu, fraza "receptor na površini ćelije" uključuje, na primer, molekule i komplekse molekula sposobne da prime signal i da prenesu takav signal kroz ćelijsku membranu. Primer "receptora na površini ćelije" ove objave je CXCR4 receptor.
[0038]Izraz "antitelo", kada se koristi u ovom tekstu, uključuje cela antitela i svaki antigen-vezujući fragment (tj., "antigen-vezujući deo") ili njihove pojedinačne lance. "Antitelo" odnosi se na glikoprotein koji sadrži najmanje dva teška (heavy, H) lanca i dva laka (light, L) lanca, međusobno povezana disulfidnim vezama, ili njihov antigen-vezujući deo. Svaki teški lanac sastoji se od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skraćeno VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca sastoji se od tri domena, ChI, Ch2 i Ch3. Svaki laki lanac sastoji se od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skraćeno VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca sastoji se od jednog domena, Cl- Regioni VHi Vi. mogu da se dalje podele u podregione hipervarijabilnosti, označene kao regioni koji određuju komplementarnost
(complementaritv determining regions, CDR), ispresecane regionima koji su više konzervisani, označene kao regioni okvira (framework regions, FR). Svaki VHi VLsastavljen je od tri CDR i četiri FR, postavljena od amino-terminusa do karboksi-terminusa sledećim redom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže vezujući domen koji interaguje sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu da posreduju u vezivanju imunoglobulina za tkiva domaćina ili faktore, uključujući različite ćelije imunog sistema (npr., efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa.
[0039] Izraz "antigen-vezujući deo" antitela (ili jednostavno "deo antitela"), kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vežu za antigen (npr., CXCR4). Pokazano je da antigen-vezujuću funkciju antitela mogu da obave fragmenti antitela pune dužine. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćeni izrazom "antigen-vezujući deo" uključuju (i) Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CLi ChI domena; (ii) F(ab')2fragment, bivalentni fragment koji uključuje dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u regionu zgloba; (iii) Fab<*>fragment, koji je suštinski Fab sa delom zglobnog regiona (vidi, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993); (iv) Fd fragment koji se sastoji od VHi ChI domena; (v) Fv fragment koji se sastoji od VLi VHdomena jedne ručice antitela, (vi) dAb fragment (VVard et al., (1989) Nature 341:544-546), koji se sastoji od VHdomena; (vii) izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR); i (viii) nanoantitelo, varijabilni region teškog lanca koji sadrži jedan varijabilni domen i dva konstantna domena. Pored toga, iako su dva domena Fv fragmenta, VLi VH, kodirana različitim genima, oni mogu da se spoje, korišćenjem rekombinantnih metoda, sintetskim linkerom koji omogućava da budu napravljeni u vidu jednog proteinskog lanca u kojem se VLi Vhregion sparuju da bi formirali monovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (single ehain Fv, scFv); vidi, npr., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; i Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Takva jednolančana antitela takođe su obuhvaćena izrazom "antigen-vezujući deo" antitela. Ovi fragmenti antitela dobijaju se korišćenjem konvencionalnih tehnika poznatih stručnjacima u oblasti i fragmenti se pretražuju u pogledu upotrebljivosti na isti način kao i intaktna antitela.
[0040]"Izolovano antitelo", kako se koristi u ovom tekstu, treba da se odnosi na antitelo koje suštinski ne sadrži druga antitela sa različitom antigenskom specifičnošću (npr., izolovano antitelo koje se specifično vezuje za CXCR4 suštinski ne sadrži antitela koja se specifično vezuju za antigene različite od CXCR4). Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za CXCR4 može, međutim, da bude unakrsno reaktivno sa drugim antigenima kao što su CXCR4 molekuli iz drugih vrsta. Pored toga, izolovano antitelo može da suštinski ne sadrži drugi ćelijski materijal i/ili hemijske materije.
[0041]Izrazi "monoklonsko antitelo " ili "smeša monoklonskog antitela", kako se koriste u ovom tekstu, odnose se na preparat molekula antitela ili jednomolekulsku smešu. Smeša monoklonskog antitela pokazuje jednu vezujuću specifičnost i afinitet za određeni epitop.
[0042] Izraz "humano antitelo", kako se koristi u ovom tekstu, treba da uključi antitela koja imaju varijabilne regione u kojima su regioni okvira i CDR regioni izvedeni iz humanih imunoglobulinskih sekvenci germinativne linije. Pored toga, ako antitelo sadrži konstantni region, konstantni region je takođe izveden iz humanih imunoglobulinskih sekvenci germinativne linije. Humana antitela ove objave mogu uključivati aminokiselinske rezidue koje nisu kodirane humanim imunoglobulinskim sekvencama germinativne linije (npr., mutacije uvedene nasumičnom mutagenezom ili za mesto specifičnom mutagenezomin vitro,ili somatskom mutacijomin vivo).Međutim, izraz "humano antitelo", kada se koristi u ovom tekstu, ne treba da uključuje antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz germinativne linije druge sisarske vrste, npr. miša, graftovane u humane sekvence okvira.
[0043] Izraz "humano monoklonsko antitelo", odnosi se na antitela koja pokazuju jednu vezujuću specifičnost, koja imaju varijabilne regione u kojima su regioni okvira i CDR regioni izvedeni iz humanih imunoglobulinskih sekvenci germinativne linije. U jednoj formi, humana monoklonska antitela proizvode se u hibridomu koji uključuje B-ćelije dobijene iz transgene nehumane životinje, npr., transgenog miša, čiji genom sadrži transgen humanog teškog lanca i transgen humanog lakog lanca, fuzionisane sa imortalisanom ćelijom.
[0044] Izraz "rekombinantno humano antitelo", kako se koristi u ovom tekstu, uključuje sva humana antitela koja se pripremaju, eksprimiraju, kreiraju ili izoluju rekombinantnim načinima, kao što su (a) antitela izolovana iz životinje (npr., miša) koja je transgena ili transhromozomska za humane imunoglobulmske gene ili hibridoma pripremljenog od toga (detaljnije opisano dole), (b) antitela izolovana iz ćelije-domaćina transformisane da eksprimira humano antitelo, npr., iz transfektoma, (c) antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke humanih antitela, i (d) antitela pripremljena, eksprimirana, kreirana ili izolovana bilo kojim drugim načinom koji uključuje splajsovanje humanih imunoglobulinskih genskih sekvenci sa drugim DNK sekvencama. Takva humana rekombinantna antitela imaju varijabilne regione u kojima su regioni okvira i CDR izvedeni iz humanih imunoglobulinskih sekvenci germinativne linije. U određenim formama, međutim, takva rekombinantna humana antitela mogu da se izlože mutageneziin vitro(ili, kada se koristi životinja koja je transgena za humane Ig sekvence,in vivosomatskoj mutagenezi) i tako amninokiselinske sekvence VHi VLregiona rekombinantnih antitela su sekvence koje, iako izvedene i povezane sa humanim Vh i VLsekvencama germinativne linije, ne moraju prirodno postojati u humanom repertoaru antitela germinativne linijein vivo.
[0045] Kako se koristi u ovom tekstu, "izotip" se odnosi na klasu antitela (npr., IgM ili IgGl) koja je kodirana genima konstantnog regiona teškog lanca.
[0046] Izrazi "antitelo koje prepoznaje antigen" i "antitelo specifično za antigen" koriste se naizmenično u ovom tekstu sa izrazom "antitelo koje se specifično vezuje za antigen".
[0047] Izraz "derivati humanog antitela" odnosi se na svaku modifikovanu formu humanog antitela, npr., konjugat antitela i drugog sredstva ili antitela.
[0048] Izraz "humanizovano antitelo" treba da se odnosi na antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz germinativne linije druge sisarske vrste, npr. miša, graftovane u sekvence humanog okvira. Dodatne modifikacije regiona okvira mogu da se naprave unutar sekvenci humanog regiona okvira.
[0049] Izraz "himerno antitelo" treba da se odnosi na antitela u kojima su sekvence varijabilnog regiona izvedene iz jedne vrste i sekvence konstantnog regiona izvedene iz druge vrste, npr. antitela u kojima su sekvence varijabilnog regiona izvedene iz antitela miša i sekvence konstantnog regiona izvedene iz antitela čoveka.
[0050] Kako se koristi u ovom tekstu, antitelo koje se "specifično vezuje za humani CXCR4" treba da se odnosi na antitelo koje se vezuje za humani CXCR4 (i, moguće, CXCR4 iz jedne ili više nehumanih vrsta), ali se suštinski ne vezuje za ne-CXCR4 proteine. U nekim formama, antitelo sadašnje objave specifično se vezuje za humani CXCR4, SEQ ID NO.: 51 ili varijantu istog. Poželjno, antitelo se vezuje za humani CXCR4 sa KDod 1 x 10" 7 M ili manjom, poželjni• j• e 5x10" 8 M ili manj•om, poželjnije 3 x IO"<8>M ili manjom, poželjnije 1 x IO"<8>M ili manjom, još poželjnije 5 x IO"9 M ili manjom.
[0051]Izraz "suštinski se ne vezuje" za protein ili ćelije, kako se koristi u ovom tekstu, znači da se ne vezuje ili se ne vezuje sa visokim afinitetom za protein ili ćelije, tj. vezuje se za protein ili ćelije sa Kdod 1 x 10"<6>M ili većom, poželjnije 1 x 10"<5>M ili većom, poželjnije 1 x IO"4 M ili većom, poželjnije 1 x IO"3 M ili većom, još poželjnije 1 x 10" M ili većom.
[0052]Izraz "Kassoc" ili "Ka", kada se koristi u ovom tekstu, treba da se odnosi na stopu asocijacije određene interakcije antitelo-antigen, dok izraz "KdiS" ili "Kj", kako se koristi u ovom tekstu, treba da se odnosi na stopu disocijacije određene interakcije antitelo-antigen. Izraz "Kd", kako se koristi u ovom tekstu, treba da se odnosi na konstantnu disocijacije koja se dobija iz odnosa K<jprema Ka(tj,. KVKa) i izražava se kao molarna koncentracija (M). Knvrednosti za antitela mogu mogu da se odrede korišćenjem metoda dobro utvrđenih u struci. Poželjan metod određivanja KDantitela je korišćenjem rezonance površinskog plazmona, poželjno korišćenjem biosenzornog sistema kao stoje Biacore<®>sistem. |0053]Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "visoki afinitet" za IgG antitelo odnosi se na antitelo koje ima KDod 1 x 10" 7 M ili manju, poželjnije 5x10" 8 M ili manju, poželjnije lxl0"<8>M ili manju, još poželjnije 5 x IO"<9>M ili manju i još poželjnije 1 x IO"<9>M ili manju, za ciljni antigen. Međutim, vezivanje sa "visokim afinitetom" može da varira za druge izotipove antitela. Na primer, vezivanje sa "visokim afinitetom" za IgM izotip odnosi se na antitelo koje ima Kdod IO"<6>M ili manju, poželjnije IO"<7>M ili manju, još poželjnije IO"<8>M ili manju.
[0054]Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "subjekt" uključuje svaku humanu ili nehumanu životinju. Izraz "nehumana životinja" uključuje sve vertebrate, npr., sisarske i nesisarske vrste, kao što su nehumani primati, ovce, psi. mačke, konji, krave, pilići, vodozemci, gmizavci, itd.
[0055]Različiti aspekti ove objave opisani su detaljnije u odeljcima koji slede.
Anti- CXCR4 antitela
(0056] Antitela ove objave karakterišu se posebnim funkcionalnim osobinama ili svojstvima. Na primer, antitela se vezuju za nativni humani CXCR4 eksprimiran na površini ćelije. Poželjno, antitelo ove objave vezuje se za CXCR4 sa visokim afinitetom, na primer sa K.Dod 1 x IO"<7>M ili manjom. Anti-CXCR4 antitela ove objave poželjno pokazuju jednu ili više od sledećih karakteristika:
(a) vezivanje za nativni humani CXCR4 eksprimiran na površini ćelije; (b) inhibiciju vezivanja SDF-1 za CXCR4; (c) inhibiciju SDF-l-indukovanog fluksa kalcijuma u ćelije koje eksprimiraju CXCR4; (d) inhibiciju SDF-l-indukovane migracije ćelija koje eksprimiraju CXCR4; (e) inhibiciju humanih endotelskih ćelija umbilikalne vene da formiraju kapilarne tube; (f) vezivanje za humani CXCR4saKDod lxlO"<7>M ili manjom; (g) indukovanje apoptoze u ćelijama koje eksprimiraju CXCR4; (h) inhibiranje proliferacije tumorskih ćelijain vitro;(i) inhibiranje proliferacije tumorskih ćelija i/ili indukovanje apoptoze tumorskih ćelijain vivo;
(j) inhibiranje metastaza CXCR4<+>tumorskih ćelija; i/ili
(k) porast vremena preživljavanja CXCR4<+>subjekata koji nose tumor.
(0057] U nekim formama, antitelo ove objave vezuje se za nativni humani CXCR4 na površini ćelije, ali ne inhibira vezivanje SDF-1 za CXCR4 i ne inhibira SDF-1 - indukovani fluks kalcijuma u ćelije koje eksprimiraju CXCR4 i ne inhibira SDF-1-indukovanu migraciju ćelija koje eksprimiraju CXCR4. U drugim formama, antitelo ove objave vezuje se za nativni humani CXCR4 na površini ćelije i inhibira vezivanje SDF-1 za CXCR4 i inhibira SDF-l-indukovani fluks kalcijuma u ćelije koje eksprimiraju CXCR4, ali ne inhibira SDF-1-indukovanu migraciju ćelija koje eksprimiraju CXCR4. U drugim formama, antitelo ove objave vezuje se za nativni humani CXCR4 na površini ćelije i inhibira vezivanje SDF-1 za CXCR4 i inhibira SDF-l-indukovani fluks
kalcijuma u ćelije koje eksprimiraju CXCR4 i inhibira SDF-1-indukovanu migraciju ćelija koje eksprimiraju CXCR4. U drugim formama, antitelo ove objave vezuje se za nativni humani CXCR4 na površini ćelije, inhibira vezivanje SDF-1 za CXCR4, inhibira SDF-l-indukovani fluks kalcijuma u ćelije koje eksprimiraju CXCR4, inhibira SDF-1-indukovanu migraciju ćelija koje eksprimiraju CXCR4 i inhibira HuVEC da formiraju kapilarne tube.
[0058]Poželjno, antitelo ove objave vezuje se za humani CXCR4 sa KDod 5 x 10 8 M ili manjom, vezuje se za humani CXCR4 sa KDod 2 x 10"° M ili manjom, vezuje se za humani CXCR4 sa KDod 5 x IO"<9>M ili manjom, vezuje se za humani CXCR4 sa KDod 4x IO"<9>Mili manjom, vezuje se za humani CXCR4 sa KDod 3 x IO"<9>M ili manjom, ili vezuje se za humani CXCR4 sa KDod 2 x 10"' M ili manjom.
[0059]Poželjno, antitelo inhibira vezivanje SDF-1 za humani CXCR4 sa inhibitornom EC50od 50 nM ili manjom, poželjnije 30 nM ili manjom, ili 15 nM ili manjom, ili 10 nM ili manjom, ili 5 nM ili manjom, ili 3 nM ili manjom (npr., inhibitorna EC50od 28.60 nM ili manja, ili 12.51 nM ili manja, ili 2.256 nM ili manja)
[0060]Poželjno, antitelo ove objave inhibira SDF-l-indukovani fluks kalcijuma u ćelije koje eksprimiraju humani CXCR4 sa inhibitornom EC50od 3 nM ili manjom, poželjnije 2 nM ili manjom, ili 1 nM ili manjom, ili 0.9 nM ili manjom, ili 0.8 nM ili manjom, ili 0.7 nM ili manjom, ili 0.6 nM ili manjom, ili 0.5 nM ili manjom, ili 0.4 nM ili manjom (npr., 0.9046 nM ili manjom, 0.5684 ili manjom, ili 0.3219 nM ili manjom). ]0061]Poželjno, antitelo ove objave inhibira SDF-1-indukovanu migraciju ćelija koje eksprimiraju humani CXCR4 sa inhibitornom EC50od 50 nM ili manjom, poželjnije 30 nM ili manjom, ili 20 nM ili manjom, ili 15 nM ili manjom (npr., 18.99 nM ili manjom, ili 12.44 ili manjom).
[0062]Standardni testovi za evaluaciju sposobnosti vezivanja antitela za nativnom hmanom CXCR4 eksprimiranom na površini ćelije poznati su u struci, uključujući, na primer, analizu protočnom citometrijom uz korišćenje ćelijske linije koja prirodno eksprimira nativni CXCR4 ili koja je bila transfektovana da eksprimira nativni CXCR4. Pogodni testovi opisani su detaljno u Primerima. Poželjna ćelijska linija koja eksprimira nativni CXCR4 je linija CEM T-ćelija. Pogodni testovi za evaluaciju inhibicije vezivanja SDF-1, inhibiciju SDF-1 indukovanog fluksa kalcijuma, inhibiciju SDF-1 indukovane migracije ćelija, inhibiciju HuVEC da formiraju kapilarne tube, indukciju apoptoze u ćelijama koje eksprimiraju CXCR4in vitroi/iliin vivo,inhibiciju rasta CXCR4<+>tumorskih ćelijain vitroi/iliin vivo,i/ili inhibiciju metastaza CXCR4<+>tumorskih ćelija, takođe su opisani detaljno u Primerima. Afinitet vezivanja antitela takođe može da se odredi standardnim metodima kao sto je Scatchard-ova analiza.
Monoklonska antitela F7, F9, Dl i E2
[0063]Poželjna antitela ove objave su humana monoklonska antitela F7, F9, Dl i E2, izolovana i strukturno karakterisana kako je opisano u Primerima 1 i 2. VHaminokiselinske sekvence F7, F9, Dl i E2 pokazane su u SEQ ID NO: 25, 26, 27 i 28, respektivno. VLaminokiselinske sekvence F7, F9, Dl i E2 pokazane su u SEQ ID NO: 29, 30, 31 i 32, respektivno. Pored toga, alternativni oblici F7, F9, Dl i E2, u kojima su neke rezidue okvira supstituisane reziduama germinativne linije, kreirane su i označene u ovom tekstu kao F7GL, F9GL, D1GL i E2GL. VHaminokiselinske sekvence F7GL, F9GL, D1GL i E2GL pokazane su u SEQ ID NO: 41, 42, 43 i 44, respektivno. VLaminokiselinske sekvence F7GL, F9GL, D1GL i E2GL pokazane su u SEQ ID NO: 45, 46, 47 i 48, respektivno.
[0064]S obzirom na to da svako od ovih antitela može da se vezuje za CXCR4, VHi VLsekvence mogu da se "pomešaju i poklope" da bi kreirale druge anti-CXCR4 vezujuće molekule ove objave. Vezivanje ovakvih "pomešanih i poklopljena" antitela za CXCR4 može da se testira korišćenjem testova vezivanja opisanih gore u Primerima (npr., protočna citometrija sa CEM ćelijama). Poželjno, kada se VHi VLlanci pomešaju i poklope, VHsekvenca određenog VH/VLpara zamenjuje se strukturno sličnom VHsekvencom. Slično tome, poželjna VLsekvenca iz određenog Vh/Vlpara zamenjuje se strukturno sličnom VLsekvencom.
[0065]Prema tome, u jednom aspektu, objava obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, koji uključuju: (a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 25-28 i 41-44; i (b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 29-32 i 45-48;
pri čemu se antitelo specifično vezuje za CXCR4, poželjno humani CXCR4.
Poželjna kombinacija teškog i lakog lanca uključuje:
(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25 ili 41 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 29 ili 45; ili (b) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26 ili 42 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 30 ili 46; ili (c) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27 ili 43 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31 ili 47; ili (d) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28 ili 44 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32 ili 48.
[0066]U drugom aspektu, ova objava obezbeđuje antitela koja sadrže CDR1, CDR2 i CDR3 teških i lakih lanaca F7, F9, Dl ili E2, ili kombinacije istih. Aminokiselinske sekvence CDR1 VHF7, F9, Dl i E2 pokazane su u SEQ ID NO: 1-4, respektivno. Aminokiselinske sekvence CDR2 VHF7, F9, Dl i E2 pokazane su u SEQ ID NO: 5-8, respektivno. Aminokiselinske sekvence CDR3VHF7, F9, Dl i E2 pokazane su u SEQ ID NO: 9-12, respektivno. Aminokiselinske sekvence CDRlVkF7, F9, Dl i E2 pokazane su u SEQ ID NO: 13-16, respektivno. Aminokiselinske sekvence CDR2 VkF7, F9, Dl i E2 pokazane su u SEQ ID NO: 17-20, respektivno. Aminokiselinske sekvence CDR3 VkF7, F9, Dl i E2 pokazane su u SEQ ID NO: 21-24, respektivno. CDR regioni su naznačeni korišćenjem Kabat-ovog sistema (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242).
[0067]S obzirom na to da svako od ovih antitela može da se vezuje za CXCR4 i da je antigen-vezujuća specifičnost obezbeđena prvenstveno preko CDR1, CDR2 i CDR3 regiona, CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence VHi CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence Vkmogu da se "pomešaju i poklope" (tj., CDR iz različitih antitela mogu da se pomešaju i poklope, iako svako antitelo mora da sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 VHi CDR1, CDR2, i CDR3Vk) da bi se kreirao drugi anti-CXCR4 vezujući molekul ove objave. Vezivanje ovakvih "pomešanih i poklopljenih" antitela za CXCR4 može da se testira korišćenjem testova vezivanja opisanih gore i u Primerima (npr., ELISA, Biacore* analiza). Poželjno, kada se CDR sekvence VHpomešaju i poklope, CDR1, CDR2 i/ili CDR3 sekvence iz određene VHsekvence se zamene strukturno sličnom CDR sekvencom (sekvencama). Slično tome, kada se CDR sekvence Vkpomešaju i poklope, CDR1, CDR2 i/ili CDR3 sekvence iz određene Vksekvence se poželjno zamene strukturno sličnom CDR sekvencom (sekvencama). Stručnjak u oblasti će lako zapaziti da nove VHi VLsekvence mogu da se kreiraju supstitucijom jednog ili više CDR regiona VH i/ili VLstrukturno sličnim sekvencama iz CDR sekvenci objavljenih u ovom tekstu za monoklonska antitela F7, F9, Dl i E2.
[0068]Prema tome, u drugom aspektu, ova objava obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, koji sadrže: (a) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca, koji uključuje aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-4; (b) CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca, koji uključuje aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 5-8; (c) CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca, koji uključuje aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 9-12; (d) CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca, koji uključuje aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 13-16; (e) CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca, koji uključuje aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 17-20; i (f) CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca, koji uključuje aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 21-24;
pri čemu se antitelo specifično vezuje za CXCR4, poželjno humani CXCR4.
[0069]U poželjnoj formi, antitelo sadrži: (a) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 1; (b) CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 5; (c) CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 9; (d) CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 13; (e) CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 17; i (f) CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 21.
|0070] U drugoj poželjnoj formi, antitelo sadrži:
(a) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 2; (b) CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 6; (c) CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 10; (d) CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 14; (e) CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 18; i (f) CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 22.
[0071] U drugoj poželjnoj formi, antitelo sadrži: (a) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 3; (b) CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 7; (c) CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 11; (d) CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 15; (e) CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 19; i (f) CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 23.
J0072] U drugoj poželjnoj formi, antitelo sadrži:
(a) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 4; (b) CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 8; (c) CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 12; (d) CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 16; (e) CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 20; i (f) CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca, koji uključuje SEQ ID NO: 24.
[0073]U struci je dobro poznato da CDR3 domen sam, nezavisno od CDR1 i/ili CDR2 domena, može da određuje specifičnost vezivanja antitela za poznati antigen i da više antitela može predvidljivo da se generi[e tako da imaju istu specifičnost vezivanja na osnovu zajedničke CDR3 sekvence. Vidi, na primer, Klimka et al., British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000) (opisuje proizvodnju humanizovanog anti-CD30 antitela uz korišćenje samo CDR3 varijabilnog domena teškog lanca mišjeg anti-CD30 antitela Ki-4); Beiboer et al., J. Mol. Biol. 296:833-849 (2000) (opisuje rekombinantna antitela na epitelni glikoprotein-2 (epitelial glycoprotein-2, EGP-2) uz korišćenje samo CDR3 sekvence teškog lanca roditeljskog mišjeg MOC-31 anti-EGP-2 antitela); Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:8910-8915 (1998) (opisuje panel humanizovanih anti-integrinskih avP3antitela korišćenjem CDR3 varijabilnog domena teškog i lakog lanca mišjeg anti-integrinskog avp3antitela LM609, gde svaki član antitela sadrži različitu sekvencu izvan CDR3 domena i može da se vezuje za isti epitop kao roditeljsko mišje antitelo, sa afinitetom kao roditeljsko mišje antitelo ili višim); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994) (opisuje da CDR3 domen najznačajnije doprinosi vezivanju sa antitgenom); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:2529-2533
(1995) (opisuje graftovanje teškolančanih CDR3 sekvenci tri Fab (SI-1, Sl-40 i SI-32) protiv humane placentalne DNK na teški lanac anti-tetanusni toksoid-Fab, čime se zamenjuje postojeći teškolančani CDR3 i pokazuje da CDR3 domen sam daje vezujuću specifičnost); Ditzel el al., J. Immunol. 157:739-749 (1996) (opisuje studije graftovanja u kojima je transfer samo teškolančanog CDR3 roditeljskog po li specifičnog Fab LNA3 na teški lanac monospecifičnog IgG tetanus toksoid-vezujućeg Fab p313 antitela dovoljan za zadržavanje specifičnosti vezivanja roditeljskog Fab); Berezov et al., BIAjournal 8:Scientific Review 8 (2001) (opisuje peptidne mimetike na bazi CDR3 anti-HER2 monoklonskog antitela; Igarashi et al., J. Biochem (Tokyo) 117:452-7
(1995) (opisuje sintetski polipeptid od 12 amino-kiselina koji odgovara CDR3 domenu anti-fosfatidilserinskog antitela); Bourgeois et al., J. Virol 72:807-10 (1998) (pokazuje da je jedan peptid izveden iz teškolančanog CDR3 domena anti-respiratorni sincicijalni virus (respiratorv syncytial virus, RSV)-antitela u stanju da neutrališe virusin vitro) ;Levi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:4374-8 (1993) (opisuje peptid na bazi teškolančanog CDR3 domena mišjeg anti-HIV antitela); Polvmenis and Stoller, J. Immunol. 152:5218-5329 (1994) (opisuje omogućavanje vezivanja scFv graftovanjem teškolančanog CDR3 regiona Z-DNA-vezujućeg antitela) i Xu i Daviš, Immunitv 13:37-45 (2000) (opisuje daje raznovrsnost teškolančanog CDR3 dovoljna da omogući da inače identični IgM molekuli razlikuju raznovrne haptenske i proteinske antigene). Vidi takođe, US Patents No. 6,951,646; 6,914,128; 6,090,382; 6,818,216; 6,156,313; 6,827,925; 5,833,943; 5,762,905 i 5,760,185, opisuju patentirana antitela definisana jednim CDR domenom.
[0074]Prema tome, predmetna objava obezbeđuje monoklonska antitela koja sadrže jedan ili više teškolančanih i/ili lakolančanih CDR3 domena iz antitela izvedenog iz humane ili nehumane životinje, pri čemu su monoklonska antitela sposobna da se specifično vezuju za CXCR4. U određenim aspektima, predmetna objava obezbeđuje monoklonska antitela koja sadrže jedan ili više teško- i/ili lakolančanih CDR3 domena iz nehumanog antitela, kao što je antitelo miša ili pacova, pri čemu je monoklonsko antitelo sposobno da se specifično veže za CXCR4. U nekim formama, takva antitela koja sadrže jedan ili više teško- i/ili lakolančanih CDR3 domena iz nehumanog antitela (a) sposobna su da pri vezivanju kompetiraju sa; (b) zadržavaju funkcionalne karakteristike; (c) vezuju se za isti epitop; i/ili (d) imaju sličan afinitet vezivanja kao odgovarajuće roditeljsko nehumano antitelo.
[0075]U drugim aspektima, predmetna objava obezbeđuje monoklonska antitela koja sadrže jedan ili više teško- i/ili lakolančanih CDR3 domena iz humanog antitela, kao što je, na primer, humano antitelo dobijeno iz nehumane životinje, pri čemu je humano antitelo sposobno da se specifično vezuje za CXCR4. U drugim aspektima, predmetna objava obezbeđuje monoklonska antitela koja sadrže jedan ili više teško- i/ili lakolančanih CDR3 domena iz prvog humanog antitela, kao što je na primer, humano antitelo dobijeno iz nehumane životinje, pri čemu je prvo humano antitelo sposobno da se specifično vezuje za CXCR4 i pri čemu CDR3 domen iz prvog humanog antitela zamenjuje CDR3 domen u humanom antitelu kojem nedostaje specifičnost vezivanja za CXCR4 da bi se stvorilo drugo humano antitelo koje je sposobno da se specifično vezuje za CXCR4. U nekim formama, takva antitela koja sadrže jedan ili više teško- i/ili lakolančanih CDR3 domena iz prvog humanog antitela (a) sposobna su da pri vezivanju kompetiraju sa; (b) zadržavaju funkcionalne karakteristike; (c) vezuju se za isti epitop; i/ili (d) imaju sličan afinitet vezivanja kao odgovarajuće roditeljsko prvo humano antitelo.
Antitela koja imaju određene sekvence germinativne linije
[0076] U nekim formama, antitelo ove objave sadrži varijabilni region teškog lanca iz određenog teškolančanog imunoglobulinskog gena germinativne linije i/ili varijabilni region lakog lanca iz određenog lakolančanog imunoglobulinskog gena germinativne linije.
[0077] Na primer, u poželjnoj formi, ova objava obezbeđuje izolovano mnoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, koji sadrže varijabilni region teškog lanca koji je proizvod ili je izveden iz humanog Vh 3-48 gena, pri čemu se antitelo specifično vezuje za CXCR4. U drugoj poželjnoj formi, ova objava obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, koji sadrže varijabilni region lakog lanca koji je proizvod ili je izveden iz humanog Vk LI 5 gena, pri čemu se antitelo specifično vezuje za CXCR4. U još jednoj poželjnoj formi, ova objava obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji je proizvod ili je izveden iz humanog VH3-48 gena i sadrži varijabilni region lakog lanca koji je proizvod ili je izveden iz humanog VKLI 5 gena, pri čemu se antitelo specifično vezuje za CXCR4, poželjno humani CXCR4. Takva antitela mogu posedovati jednu ili više funkcionalnih karakteristika opisanih detaljno gore, kao što su vezivanje za nativni CXCR4 eksprimiran na površini ćelije, inhibicija vezivanja SDF-1 za CXCR4, inhibicija SDF-1-indukovanog fluksa kalcijuma u ćelije koje eksprimiraju CXCR4, inhibicija HuVEC da formiraju kapilarne tube, indukcija apoptoze u ćelijama koje eksprimiraju CXCR4in vitroi/iliin vivo,inhibicija rasta CXCR4<+>tumorskih ćelijain vitroi/iliin vivo,i/ili inhibicija metastaza CXCR4<+>tumorskih ćelija.
[0078] Primeri antitela koja imaju VHi VKiz VH3-48 odnosno VKLI5 su F7, F9, Dl i E2 antitela.
[0079[ Kako se koristi u ovom tekstu, humano antitelo sadrži teškolančane ili lakolančane varijabilne regione koji su "proizvod" ili "izvedeni iz" određene sekvence germinativne linije ako su varijabilni regioni antitela dobijeni od sistema koji koristi
humane imunoglobulinske gene germinativne linije. Takvi sistemi uključuju imunizovanje transgenog miša koji nosi humane imunoglobulinske gene antigenom od interesa ili skrining biblioteke humanih imunoglobulinskih gena ispoljenih na fagima, antigenom od interesa. Humano antitelo koje je "proizvod" ili "izvedeno iz" humane imunoglobulinske sekvence germinativne linije može da se odredi kao takvo upoređivanjem aminokiselinske sekvence humanog antitela sa aminokiselinskim sekvencama humanih imunoglobulina germinativne linije i selektovanjem humane imunoglobulinske sekvence germinativne linije koja je po sekvenci najbliža (tj., ima najveći % identičnosti) sa sekvencom humanog antitela. Humano antitelo koje je "proizvod" ili "izvedeno iz" određene humane imunoglobulinske sekvence germinativne linije može sadržati razlike u amino-kiselinama u poređenju sa sekvencom germinativne linije zbog, na primer, somatskih mutacija koje se prirodno dešavaju ili namernog uvođenja usmerene mutacije. Međutim, selektovano humano antitelo je tipično najmanje 90% identično po aminokiselinskoj sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom koju kodira humani imunoglobulinski gen germinativne linije i sadrži aminokiselinske rezidue koje humano antitelo određuju kao humano kada se uporedi sa imunoglobulinskim amino-kiselinskim sekvencama germinativne linije drugih vrsta (npr., mišje sekvence germinativne linije). U određenim slučajevima, humano antitelo može da bude najmanje 95%, ili čak najmanje 96%, 97%, 98%. ili 99% identično po aminokiselinskoj sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom koju kodira imunoglobulinski gen germinativne linije. Tipično, humano antitelo izvedeno iz određene humane sekvence germinativne linije pokazivače ne više od 10 aminokiselinskih razlika u odnosu na aminokiselinsku sekvencu koju kodira humani imunoglobulinski gen germinativne linije. U određenim slučajevima, humano antitelo može da pokazuje ne više od 5, ili čak ne više od 4, 3, 2, ili 1 aminokiselinske razlike u odnosu na aminokiselinsku sekvencu koju kodira imunoglobulinski gen germinativne linije.
Homologa antitela
[0080] U još jednoj formi, antitelo ove objave sadrži teško- i lakolančane varijabilne regione koji uključuju aminokiselinske sekvence homologe sa aminokiselinskim sekvencama poželjnih antitela opisanih u ovom tekstu, i pri čemu antitela zadržavaju željene funkcionalne osobine anti-CXCR4 antitela ove objave.
[0081]Na primer, ova objava obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, koji sadrže varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, pri čemu: (a) varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% homologa sa aminokiselinskom sekvencom odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 25-28 i 41-44; (b) varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% homologa sa aminokiselinskom sekvencom odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 29-32 i 45-48; (c) antitelo se vezuje za nativni humani CXCR4 eksprimiran na površini ćelije.
[0082]Dodatno ili alternativno, antitelo može imati jednu ili više od sledećih osobina: (i) vezivanje za humani CXCR4 sa KDod 1 x 10"<7>M ili manjom; (ii) inhibiranje vezivanja SDF-1 za CXCR4; (iii) inhibiranje SDF-1 -indukovanog fluksa kalcijuma u ćelije koje eksprimiraju CXCR4; (iv) inhibiranje SDF-1-indukovane migracije ćelija koje eksprimiraju CXCR4; (v) inhibiranje HuVEC da formiraju kapilarne tube; (vi) indukovanje apoptoze u ćelijama koje eksprimiraju CXCR4in vitroi/iliin vivo;(vii) inhibiranje rasta CXCR4<+>tumorskih ćelijain vitroi/iliin vivo;i/ili (viii) inhibiranje metastaza CXCR4<+>tumorskih ćelija.
[0083]U različitim formama, antitelo može da bude, na primer, humano antitelo, humanizovano antitelo ili himerno antitelo.
[0084]U drugim formama, Vh i/ili VLaminokiselinske sekvence mogu biti 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% homologe sa sekvencama navedenim gore. Antitelo koje ima VHi Vlregione visoko (tj., 80% ili više) homologe sa Vhi VLregionima sekvenci navedenim gore, može da se dobije mutagenezom (npr., usmerenom ili PCR-posredovanom mutagenezom) molekula nukleinske kiseline koji kodiraju SEQ ID NO: 25-32 ili 41-48, posle čega sledi testiranje kodiranog izmenjenog antitela u pogledu zadržavanja funkcije (tj., gore navedenih funkcija) korišćenjem funkcionalnih testova opisanih u ovom tekstu. |0085]Kako se koristi u ovom tekstu, procenat homologije dveju aminokiselinskih sekvenci ekvivalentan je procentu identičnosti između dveju sekveenci. Procenat identičnosti između dveju sekvenci je funkcija broja pozicija identičnih u obe sekvence (tj., % homologije = # identičnih pozicija/ukupan # pozicija x 100), uzimajući u obzir broj prekida i dužinu svakog prekida, što treba da se uvede za optimalno poravnavanje dveju sekvenci. Upoređivanje sekvenci i određivanje procenta identičnosti dveju sekvenci može da se obavi korišćenjem matematičkog algoritma, kako je opisano u neograničavajućim primerima, dole.
|0086]Procenat identičnosti dveju aminokiselinskih sekvenci može da se odredi korišćenjem algoritma E. Mevers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17
(1988)) inkorporisanog u ALIGN program (verzija 2.0), korišćenjem PAM120 tabele težine rezidua, kazne za dužinu procepa od 12 i kazne za procep od 4. Pored toga, procenat identičnosti dveju aminokiselinskih sekvenci može da se odredi korišćenjem Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) algoritma inkorporisanog u GAP program, u GCG softverskom paketu (dostupno na http://www.gcg.com), uz korišćenje Blossum 62 matriksa ili PAM250 matriksa, i težine procepa od 16, 14, 12, 10, 8, 6, ili 4 i dužinske težine od 1,2, 3, 4, 5, ili 6.
[0087]Dodatno ili alternativno, proteinske sekvence predmetne objave mogu da se koriste i kao "sekvence upita" za obavljanje pretraživanja javnih baza podataka za, na primer, identifikovanje srodnih sekvenci. Takve pretrage mogu da se obave korišćenjem XBLAST programa (verzija 2.0), Altschul, et al. (1990) J Mol. Biol. 215:403-10. BLAST proteinske pretrage mogu da se obave XBLAST programom, skor = 50, dužina reči = 3, da bi se dobile aminokiselinske sekvence homologe sa molekulima antitela ove objave. Da bi se dobila poravnavanja sa prekidima za potrebe upoređivanja, može da se koristi Gapped BLAST, kako je opisano u Altschui et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Kada se koriste programi BLAST i Gapped BLAST korisni su zadati parametri respektivnih programa (npr., XBLAST i NBLAST). Vidi www.ncbi.nlm.nih.gov.
Antitela sa konzervativnim modifikacijama
10088]U nekim formama, antitelo ove objave sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence, pri čemu jedna ili više ovih CDR sekvenci uključuju specifikovane aminokiselinske sekvence, bazirano na poželjnim antitelima opisanim u ovom tekstu ( npr., F7, F9, Dl ili E2), ili njihove konzervativne modifikacije, i gde antitela zadržavaju željene funkcionalne osobine anti-CXCR4 antitela ove objave. U struci se razume daje moguće napraviti određene konzervativne modifikacije sekvence koje neće ukinuti sposobnost vezivanja za antigen. Vidi, na primer, Brummell et al.
(1993) Biochem 32:1180-8 (opisuje mutacionu analizu u CDR3 domenu teškog lanca antitela specifičnog zaSalmonella) ;de Wildt et al. (1997) Prot. Eng. 10:835-41 (opisuje mutacione studije u anti-UAl antitelima); Komissarov et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:26864-26870 (pokazuje da mutacije u sredini HCDR3 dovode do gubitka ili smanjenja afiniteta); Hali el al. (1992) J. Immunol. 149:1605-12 (opisuje da jedna aminokiselinska zamena u CDR3 regionu dovodi do gubitka vezujuće aktivnosti); Kellev and O'Connell (1993) Biochem. 32:6862-35 (opisuje doprinos Tyr rezidua u vezivanju za antigen); Adib-Conquy et al. (1998) Int. Immunol. 10:341-6 (opisuje efekat hidrofobnosti u vezivanju) i Beers et al. (2000) Clin. Can. Res. 6:2835-43 (opisuje HCDR3 aminokiselinske mutante). Prema tome, ova objava obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, koji sadrže varijabilni region teškog lanca, koji uključuje CDR1, CDR2 i CDR3 sekvencu i varijabilni region lakog lanca, koji uključuje CDR1, CDR2 i CDR3 sekvencu pri čemu: (a) CDR3 sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 9-12, i njihovih konzervativnih modifikacija; (b) CDR3 sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 21-44, i njihovih konzervativnih modifikacija; i (c) antitelo se vezuje za nativni humani CXCR4 eksprimiran na površini ćelije.
[0089]Dodatno ili alternativno, antitelo može posedovati jednu ili više sledećih funkcionalnih osobina: (i) vezivanje za humani CXCR4 sa a KDod 1x10" *7 M ili manjom; (ii) inhibiranje vezivanja SDF-1 za CXCR4; (iii) inhibiranje SDF-1 - indukovanog fluksa kalcijuma u ćelije koje eksprimiraju CXCR4; (iv) inhibiranje SDF-1-indukovane migracije ćelija koje eksprimiraju CXCR4; (v) inhibiranje HuVEC da formiraju kapilarne tube; (vi) indukovanje apoptoze u ćelijama koje eksprimiraju CXCR4in vitroi/iliin vivo;(vii) inhibiranje rasta CXCR4<+>tumorskih ćelijain vitroi/iliin vivo;i/ili (viii) inhibiranje metastaza CXCR4<+>tumorskih ćelija.
[0090]U poželjnoj formi, CDR2 sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 5-8, i njihovih konzervativnih modifikacija; i CDR2 sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 17-20, i njihovih konzervativnih modifikacija. U drugoj poželjnoj formi, CDR1 sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 1-4, i njihovih konzervativnih modifikacija; i CDR1 sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 13-16, i njihovih konzervativnih modifikacija.
[0091]U različitim formama, antitelo može da bude. na primer, humano antitelo, humanizovano antitelo ili himerno antitelo.
[0092]Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "konzervativne modifikacije sekvenci" treba da označi aminokiselinske modifikacije koje bitno ne utiču ili ne menjaju vezujuće karakteristike antitela koje sadrži aminokiselinsku sekvencu. Takve konzervativne modifikacije uključuju aminokiselinske supstitucije, adicije i delecije. Modifikacije mogu da se uvedu u antitelo ove objave standardnim tehnikama poznatim u struci, kao što su usmerena mutageneza i PCR-posredovana mutageneza. Konzervativne aminokiselinske susptitucije su one u kojima se aminokiselinska rezidua zamenjuje aminokiselinskom reziduom sa sličnim bočnim lancem. Familije aminokiselinskih rezidua sa sličnim lancima definisane su u struci. Ove familije uključuju amino-kiseline sa baznim bočnim lancima (npr., lizin, arginin, histidin), kiselim bočnim lancima (npr., asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisanim polarnim bočnim lancima (npr., glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein, triptofan), nepolarnim bočnim lancima (npr., alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin), beta-granatim bočnim lancima (npr., treonin, valin, izoleucin) i aromatičnim bočnim lancima (npr., tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Prema tome, jedna ili više aminokiselinskih rezidua u CDR regionima antitela ove objave mogu da se zamene drugim aminokiselinskim reziduama iz iste familije bočnih lanaca i izmenjeno antitelo može da se testira u pogledu zadržavanja funkcije (tj., gore navedenih funkcija) korišćenjem funkcionalnih testova opisanih u ovom tekstu.
Antitela koja se vezuju za isti epitop kao anti- CXCR4 antitela
[0093] U drugoj formi, ova objava obezbeđuje antitela koja se vezuju za isti epitop na humanom CXCR4 kao svako od anti-CXCR4 monoklonskih antitela ove objave (tj., antitela koja imaju sposobnost da unakrsno kompetiraju za vezivanje za CXCR4 sa svakim od monoklonskih antitela ove objave). U poželjnim formama, referentno antitelo za studije unakrsne kompeticije može da bude monoklonsko antitelo F7 (koje ima sekvence VHi Vlkako je pokazano u SEQ ID NO: 25 i 29, respektivno), ili monoklonsko antitelo F9 (koje ima sekvence VHi VLkako je pokazano u SEQ ID NO: 26 i 30, respektivno) ili monoklonsko antitelo Dl (koje ima sekvence VHi Vlkako je pokazano u SEQ ID NO: 27 i 31, respektivno) ili monoklonsko antitelo E2 (koje ima sekvence VHi VLkako je pokazano u SEQ ID NO: 28 i 32, respektivno).
[0094] Ovakva unakrsno kompetirajuća antitela mogu da se identifikuju na osnovu sposobnosti da, u standardnim testovima vezivanja za CXCR4, unakrsno kompetiraju sa F7, F9, Dl ili E2. Na primer, protočna citometrija sa CEM ćelijama može da se koristi za prikazivanje unakrsne kompeticije sa antitelima ove objave, pri čemu se referentno antitelo obeleži pomoću FITC i procenjuje se sposobnost testnog antitela da inhibira vezivanje FITC-obeleženog referentnog antitela za CEM ćelije. Sposobnost testnog antitela da inhibira vezivanje, na primer, F7, F9, Dl ili E2, za humani CXCR4 pokazuje da testno antitelo može da kompetira sa F7, F9, Dl ili E2 u vezivanju za humani CXCR4 i prrema tome, vezuje se za isti epitop na humanom CXCR4 kao F7, F9, Dl ili E2. U poželjnoj formi, antitelo koje se vezuje za isti epitop na CXCR4 kao F7, F9, Dl ili E2 je humano monoklonsko antitelo. Takva humana monoklonska antitela mogu da se pripreme i izoluju kako je opisano u Primerima.
Inženjerisana i modifikovana antitela
[0095]Antitelo ove objave može da se pripremi i korišćenjem antitela koje ima jednu ili više VHi/ili VLsekvenci objavljenih u ovom tekstu kao polaznog materijala za inženjerisanje modifikovanog antitela, a modifikovano antitelo može imati izmenjene osobine u odnosu na polazno antitelo. Antitelo može da se inženjeriše modifikovanjem jedne ili više rezidua u jednom ili oba varijabilna regiona (tj., VHi/ili Vl), na primer u jednom ili više CDR regiona i/ili u jednom ili više regiona okvira. Dodatno ili alternativno, antitelo može da bude inženjerisano modifikovanjem rezidua u konstantnom regionu/regionima, na primer da se izmeni efektorska funkcija/funkcije antitela.
[0096]U nekim formama, graftovanje CDR može da se upotrebi za inženjerisanje varijabilnih regiona antitela. Antitela interaguju sa ciljnim antigenima prevashodno preko aminokiselinskih rezidua koje su locirane u šest teško- i lakolančanih regiona koji određuju komplementarnost (CDR). Zbog toga među pojedinačnim antitelima postoji veća razlika u aminokiselinskim sekvencama CDR nego u sekvencama izvan CDR. Zbog toga što su CDR sekvence odgovorne za većinu interakcija antitelo-antigen, moguće je eksprimirati rekombinantna antitela koja imitiraju osobine specifičnih prirodnih antitela, konstruisanjem ekspresionih vektora koji uključuju CDR sekvence iz specifičnih prirodnih antitela graftovane u sekvence okvirnih regiona iz različitih antitela, sa različitim osobinama (vidi, npr., Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; U.S. Patent No. 5,225,539, Winter, i U.S.
Patent No. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 i 6,180,370, Queen et al.)
|0097]Prema tome, druga forma ove objave odnosi se na izolovano monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, koji sadrže varijabilni region teškog lanca koji uključuje CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence koje sadrže aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-4, SEQ ID NO: 5-8, i SEQ ID NO: 9-12, respektivno, i varijabilni region lakog lanca koji uključuje CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence koje sadrže aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 13-16, SEQ ID NO: 17-20, i SEQ ID NO: 21 - 24, respektivo. Prema
tome, takva antitela sadrže CDR sekvence Vhi Vlmonoklonskih antitela F7, F9, Dl ili E2, mada mogu sadržati sekvence okvira različite od sekvenci okvira ovih antitela.
[0098]Takve sekvence okvira mogu da se dobiju iz javnih DNK baza podataka ili publikovanih referenci koje uključuju genske sekvence antitela germinativne linije. Na primer, DNK sekvence gena germinativne linije za varijabilne regione humanog teškog i lakog lanca mogu da se nađu u "VBase" bazi podataka sekvenci humane germinativne linije (dostupno na internetu, na www.mrccpe. cam.ac.uk/vbase), kao i u Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fiffh Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hvpervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; i Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836.
[0099]Kao sledeći primer, DNK sekvence gena germinativne linije za varijabilne regione humanog teškog i lakog lanca mogu da se nađu u Genbank bazi podataka. Na primer, sledeće sekvence teškog lanca germinativne linije nađene u HCo7 HuMAb miša dostupne su sa pridruženim Genbank pristupnim brojevima: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 i BC070333), 3-33 (NG_0010109 i NT_024637) i 3-7 (NG_0010109 i NT_024637). Kao još jedan primer, sledeće sekvence teškog lanca germinativne linije nađene u HCol2 HuMAb miša dostupne su, sa pridruženim Genbank pristupnim brojevima: 1-69 (NG_0010109, NT 024637 i BC070333), 5-51 (NG 0010109 i NT_024637), 4-34 (NG_0010109 i NT_024637), 3-30.3 (CAJ556644) i 3-23 (AJ406678). Još jedan izvor humanih sekvenci teških i lakih lanaca germinativne linije je baza podataka humanih imunoglobulinskih gena dostupna na IMGT (http://imgt.cines.fr).
[0100]Proteinske sekvence antitela upoređuju se sa kompilovanim bazama podataka proteinskih sekvenci korišćenjem jednog od metoda pretraživanja sličnosti sekvenci nazvanim Gapped BLAST (Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402), koji je dobro poznat stručnjacima u oblasti. BLAST je heuristički algoritam u tome što je verovatno da statistički značajno poravnanje između sekvence antitela i sekvence baze podataka sadrži segmentne parove sa visokim skorom (high-scoring segment pairs, HSP) poravnatih reči. Segmentni parovi čiji skorovi ne mogu da se poboljšaju ekstenzijom ili skraćivanjem naziva se pogodak( hit).Ukratko, nukleotidne sekvence VBASE-porekla( http:// vbase. mrc~ cpe. cam. ac. uk/ vbaseJ/ list2. php)su prevedene i zadržan je region okvira između i uključujući FR1 do FR3. Sekvence baze podataka imaju prosečnu dužinu od 98 rezidua. Duplicirane sekvence koje se precizno poklapaju duž čitave dužine proteina se uklone. BLAST-pretraživanje proteina uz korišćenje programa blastp sa zadatim, standardnim parametrima izuzev filtera niske kompleksnosti, koji se isključi, i supstitucionog matriksa BLOSUM62, filtrira prvih 5 pogodaka koji daju sekvenciona poklapanja. Nukleotidne sekvence se translatuju u svih šest okvira i okvir bez stop kodona u poklopljenom segmentu sekvence baze podataka se smatra kao potencijalni pogodak. Ovo se zatim potvrđuje korišćenjemBLAST programa tblastx, koji translatuje sekvencu antitela u svih šest okvira i upoređuje ove translacije sa VBASE-nukleotidnim sekvencama dinamički translatovanim u svih šest okvira. Druge baze podataka humanih sekvenci germinativne linije, kao što su one dostpne sa IMGT (http://imgt.cines.fr), mogu da se pretražuju na sličan način kao VBASE, kako je opisano gore.
[0101] Identičnosti su tačna poklapanja amino-kiselina sekvence antitela i baze podataka proteina, čitavom dužinom sekvence. Pozitivi (identičnosti + supstituciono poklapanje) nisu identični, nego su aminokiselinske supstitucije vođene BLOSUM62 supstitucionim matriksom. A.ko se sekvenca antitela poklapa sa dve sekvence baze podataka sa istom identičnošću, biće odlučeno da je pogodak sa najviše pozitiva pogodak poklapanja sekvence.
[0102] Poželjne sekvence okvira za upotrebu u antitelima ove objave su one koje su strukturno slične sekvencama okvira koje koriste odabrana antitela ove objave, npr., slične sa VH3-48 sekvencama okvira (SEQ ID NO: 49) i/ili VKLI 5 sekvencama okvira (SEQ ID NO: 50) koje koriste poželjna monoklonska antitela ove objave. VH CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence i VKCDR1, CDR2, i CDR3 sekvence, mogu da se graftuju u regione okvira koji imaju identičnu sekvencu sa nađenom u imunoglobulinskom genu germinativne linije iz kojeg je okvirna sekvenca izvedena, ili CDR sekvenca može da bude graftovana u regione okvira koji sadrže jednu ili više mutacija u odnosu na sekvence germinativne linije. Na primer, nađeno je da je u nekim slučajevima korisno mutirati rezidue u regionima okvira da bi se zadržala ili pojačala sposobnost vezivanja antitela sa antigenom (vidi npr., U.S. Patent No. 5,530, 101; 5,585,089; 5,693,762 i 6,180,370, Queen et al.).
[0103]Drugi tip modifikacije varijabilnog regiona je mutiranje aminokiselinske rezidue u VH i/ili VKCDR.1, CDR2 i/ili CDR3 regionu da bi se time poboljšale jedna ili više osobina vezivanja (npr., afinitet) antitela od interesa. Usmerena mutageneza ili PCR-posredovana mutageneza mogu da se izvrše da bi se uvela mutacija/mutacije, a efekat na vezivanje antitela ili drugu funkcionalnu osobinu od interesa može da se evaluirain vitroiliin vivotestovima, kako je opisano u ovom tekstu i dato u Primerima. Poželjno, uvedene su konzervativne modifikacije (kako je rečeno gore). Mutacije mogu da budu aminokiselinske supstitucije, adicije ili delecije, ali su poželjne supstitucije. Pored toga, u CDR regionu izmenjeno je, tipično, ne više od jedne, dve, tri, četiri ili pet rezidua.
[0104]Prema tome, u drugoj formi, ova objava obezbeđuje izolovana anti-CXCR4 monoklonska antitela ili njihove antigen-vezujuće delove, koji sadrže varijabilni region teškog lanca koji uključuje: (a) CDR1 region VH, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-4, ili aminokiselinsku sekvencu koja ima jednu, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija, u poređenju sa SEQ ID NO: 1-4; (b) CDR2 region VH, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 5-8, ili aminokiselinsku sekvencu koja ima jednu, dve, tri, Četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija, u poređenju sa SEQ ID NO: 5-8; (c) CDR3 region Vh, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 9-12, ili aminokiselinsku sekvencu koja ima jednu, dve. tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija, u poređenju sa SEQ ID NO: 9-12; (d) CDR1 region V«, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 13-16, ili aminokiselinsku sekvencu koja ima jednu, dve. tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija, u poređenju sa SEQ ID NO: 13-16; (e) CDR2 region VK, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 17-20, ili aminokiselinsku sekvencu koja ima jednu, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija, u poređenju sa SEQ ID NO: 17-20; i (f) CDR3 region VK, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 21-24, ili aminokiselinsku sekvencu koja ima jednu, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija, u poređenju sa SEQ ID NO: 21-24.
[0105]Inženjerisana antitela ove objave uključuju ona u kojima su napravljene modifikacije u reziduama okvira unutar VH i/ili VK, npr. da bi se poboljšale osobine antitela. Tipično, takve modifikacije regiona okvira naprave se da bi se smanjila imunogenost antitela. Na primer, jedan pristup je "povratna mutacija" jedne ili više rezidua okvirnog regiona u odgovarajuću sekvencu germinativne linije. Preciznije, antitelo koje je podleglo somatskoj mutaciji može sadržati rezidue okvira koje se razlikuju od sekvence germinativne linije od koje je antitelo izvedeno. Takve rezidue mogu da se identifikuju upoređivanjem sekvenci regiona okvira antitela sa sekvencama germinativne linije iz kojih je antitelo izvedeno
[0106]Na primer, za Vhregion F7, sledeće aminokiselinske pozicije regiona okvira (uz korišćenje Kabat-ovog sistema numerisanja) razlikuju se od germinativne linije: 1, 6 i 25. Jedna, dve ili sve tri ove pozicije mogu da se povratno mutiraju u sekvence germinativne linije pravljenjem jedne, dve ili sve tri od sledećih supstitucija: Q 1E, Q6E i A25S. Poželjni modifikovani oblik VH regiona F7 je F7GL VH(aminokiselinska sekvenca koja je pokazana na Slici 5A i u SEQ ID NO: 41), koja ima sledeće supstitucije okvira: Ql E i Q6E.
[0107]Pored toga, za Vkregion F7, sledeće aminokiselinske pozicije regiona okvira (uz korišćenje Kabat-ovog sistema numerisanja) razlikuju se od germinativne linije: 1, 3 i 84. Jedna, dve ili sve tri ove pozicije mogu da se povratno mutiraju u sekvence germinativne linije pravljenjem jedne, dve ili sve tri od sledećih supstitucija: AID, R3Q i V84A. Poželjni modifikovani oblik Vkregiona F7 je F7GL Vk(aminokiselinska sekvenca koja je pokazana na Slici 5B i u SEQ ID NO: 45), koja ima sledeće supstitucije okvira: AID i R3Q.
[0108]Pored toga, za VH region F9, sledeće aminokiselinske pozicije regiona okvira (uz korišćenje Kabat-ovog sistema numerisanja) razlikuju se od germinativne linije: 1, 6 i 25. Jedna, dve ili sve tri ove pozicije mogu da se povratno mutiraju u sekvence germinativne linije pravljenjem jedne, dve ili sve tri od sledećih supstitucija: Q1E, Q6E i A25S. Poželjni modifikovani oblik VHregiona F9 je F9GL VH(aminokiselinska sekvenca koja je pokazana na Slici 6A i u SEQ ID NO: 42), koja ima sledeće supstitucije okvira: Q1E i Q6E.
[0109]Pored toga, za Vkregion F9, sledeće aminokiselinske pozicije okvirnog regiona (uz korišćenje Kabat-ovog sistema numerisanja) razlikuju se od germinativne linije: 1, 3, 4 i 60. Jedna, dve, tri ili sve četiri ove pozicije mogu da se povratno mutiraju u germline sekvence pravljenjem jedne, dve, tri ili sve četiri od sledećih supstitucija: E1D, V3Q, L4M i P60S. Poželjni modifikovani oblik Vkregiona F9 je F9GL Vk (aminokiselinska sekvenca koja je pokazana na Slici 6B i u SEQ ID NO: 46), koja ima sledeće supstitucije okvira: E1D, V3Q i L4M.
[0110]Pored toga, za VHregion Dl, sledeće aminokiselinske pozicije okvirnog regiona (uz korišćenje Kabat-ovog sistema numerisanja) razlikuju se od germinativne linije: 6, 25 i 76. Jedna, dve ili sve tri ove pozicije mogu da se povratno mutiraju u sekvence germinativne linije pravljenjem jedne, dve ili sve tri od sledećih supstitucija: Q6E, A25S i R76K. Poželjni modifikovani oblik Vh regiona Dl je D1GL VH(aminokiselinska sekvenca koja je pokazana na Slici 7A i u SEQ ID NO: 43), koja ima sledeću supstituciju okvira: Q6E.
[0111]Pored toga, za Vkregion Dl, sledeće aminokiselinske pozicije okvirnog regiona (uz korišćenje Kabat-ovog sistema numerisanja) razlikuju se od germinativne linije: 1, 3, 4, 45 i 46. Jedna, dve, tri, četiri ili svih pet ovih pozicija mogu da se povratno mutiraju u sekvence germinativne linije pravljenjem jedne, dve, tri, četiri ili svih pet od sledećih supstitucija: VID, W3Q, V4M, E45K i L46S. Poželjni modifikovani oblik Vkregiona Dl je DIGL Vk(aminokiselinska sekvenca koja je pokazana na Slici 7B i u SEQ NO: 47), koja ima sledeće supstitucije okvira: VID, W3Q i V4M.
[0112]Pored toga, za VHregion E2, sledeće aminokiselinske pozicije okvirnog regiona (uz korišćenje Kabat-ovog sistema numerisanja) razlikuju se od germinativne linije: 6 i 25. Jedna ili obe ove pozicije mogu da se povratno mutiraju u sekvence germinativne linije pravljenjem jedne ili obe od sledećih supstitucija: Q6E i A25S. Poželjni modifikovani oblik VHregiona E2 je E2GL Vh(aminokiselinska sekvenca koja je pokazana na Slici 8A i u SEQ ID NO: 44), koja ima sledeću supstituciju okvira: Q6E.
[0113]Pored toga, za Vkregion E2, sledeće aminokiselinske pozicije okvirnog regiona (uz korišćenje Kabat-ovog sistema numerisanja) razlikuju se od germinativne linije: 1, 3 i 4. Jedna, dve ili sve tri ove pozicije mogu da se povratno mutiraju u sekvence germinativne linije pravljenjem jedne, dve ili sve tri od sledećih supstitucija: E1D, V3Q i L4M. Poželjni modifikovani oblik Vkregiona E2 je E2GL Vk(aminokiselinska sekvenca koja je pokazana na Slici 8B i u SEQ ID NO: 48), koja ima sledeće supstitucije okvira: E1D, V3Q i L4M.
[0114]Drugi tip modifikacije okvira obuhvata mutacije jedne ili više rezidua u okvirnom regionu, ili čak u jednom ili više CDR regiona, da bi se uklonili epitopi za T-ćelije i time redukovala potencijalna imunogenost antitela. Ovaj pristup se označava i kao "deimunizacija" i opisan je detaljnije u U.S. Patent Publication No. 20030153043, Carr et al. [0115Dodatno ili alternativno, modifikacijama napravljenim u regionima okvira ili CDR regionima, antitela ove objave mogu da se inženjerišu tako da uključuju modifikacije unutar Fc regiona, tipično da bi se izmenile jedna ili više funkcionalnih osobina antitela kao što su poluživot u serumu, fiksacija komplementa, vezivanje za Fc-receptor, i/ili antigen-zavisna ćelijska citotoksičnost. Pored toga, antitelo ove objave može da se hemijski modifikuje (npr., za antitelo mogu da se zakače jedna ili više hemijskih komponenti) ili da se modifikuje tako da se izmeni njegova glikozilacija, opet da bi se promenile jedna ili više funkcionalnih osobina antitela. Svaka od ovih formi opisana je detaljnije dole. Numerisanje rezidua u Fc regionu je prema Kabat-ovom EU indeksu.
[0116]U jednoj formi, zglobni region CHI modifikovan je tako da broj cisteinskih rezidu u zglobnom regionu bude izmenjen, npr., povećan ili smanjen. Ovaj pristup opisan je detaljnije u U.S. Patent No. 5,677,425, Bodmer et al. Broj cisteinskih rezidua u zglobnom regionu CHI izmenjen je da bi se, na primer, olakšalo sklapanje teških i lakih lanaca ili da bi se povećala ili smanjila stabilnost antitela.
[0117]U drugoj formi, Fc-zglobni region antitela mutiran je tako da se smanji biološki poluživot antitela. Preciznije, jedna ili više aminokiselinskih mutacija uvedene su u interfejs region CH2-CH3 domena Fc-zglobnog fragmenta tako da antitelo ima ometeno vezivanje za Staphylococcyl protein A (SpA) u poređenju sa SpA vezivanjem nativnog Fc-zglobnog domena. Ovaj pristup opisan je detaljnije u U.S. Patent No. 6,165,745, Ward et al. (0118]U drugoj formi, antitelo se modifikuje tako da mu se produži biološki poluživot. Mogući su različiti pristupi. Na primer, moguće je uvesti jednu ili više sledećih mutacija: T252L, T254S, T256F, kako je opisano u U.S. Patent No. 6,277,375, Ward. Alternativno, da bi se produžio biološki poluživot, antitelo može da bude izmenjeno u CHI ili CL regionu tako da sadrži vezujući epitop receptora spasa uzet iz dve petlje CH2 domena Fc regiona IgG, kako je opisano u U.S. Patent No. 5,869,046 i 6,121,022, Presta et al.
[0119]U drugim formama, Fc region je izmenjen tako što je zamenjena najmanje jedna aminokiselinska rezidua različitom aminokiselinskom reziduom, da bi se promenila efektorska funkcija/funkcije antitela. Na primer, jedna ili više amino-kiselina odabranih između aminokiselinskih rezidua 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 i 322 mogu da se zamene različitom aminokiselinskom reziduom tako da antitelo ima promenjeni afinitet za efektorni ligand, ali zadržava antigen-vezujuću sposobnost roditeljskog antitela. Efektorni ligand za koji je afinitet promenjen, može da bude, na primer, Fc receptor ili Cl komponenta komplementa. Ovaj pristup oposan je detaljnije u U.S. Patent No. 5,624,821 i 5,648,260, VVinter et al., oba.
[0120]U drugom primeru, jedna ili više amino-kiselina odabranih između aminokiselinskih rezidua 329, 331 i 322 mogu da se zamene različitom aminokiselinskom reziduom tako da antitelo ima promenjeno vezivanje za Clq i/ili smanjenu ili ukinutu komplement-zavisnu citotoksičnost (complement dependent cytotoxicity, CDC). Ovaj pristup opisan je detaljnije u U.S. Patent No. 6,194,551, Idusogie et al. [01211U drugom primeru, jedna ili više aminokiselinskih rezidua unutar aminokiselinskih pozicija 231 i 239 izmenjene su tako da menjaju sposobnost antitela da fiksira komplement. Ovaj pristup oposan je detaljnije u PCT Publication WO 94/29351, Bodmeret al.
[0122]U još jednom primeru, Fc region je modifikovan tako da poveća sposobnost antitela da posreduje u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC) i/ili da poveća afinitet antitela za Fcy receptor, modifikovanjem jedne ili više amino-kiselina na sledećim poziicjama: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278. 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ili 439. Ovaj pristup opisan je detaljnije u PCT Publication WO 00/42072, Presta. Pored toga, mapirana su vezujuća mesta na humanom IgG za FcyRl, FcyRII, FC7RIII i FcRn i opisane su varijante sa poboljšanim vezivanjem (vidi Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Pokazano je da specifične mutacije na pozicijama 256, 290, 298, 333, 334 i 339 poboljšavaju vezivanje za FcyRlII. Dodatno, pokazano je da sledeći kombinacioni mutanti poboljšavaju FcyRIII vezivanje: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A i S298A/E333A/K334A.
[0123]U još jednoj formi, modifikovana je glikozilacija antitela. Na primer, može da se napravi aglikozilovano antitelo (tj., antitelo koje nema glikozilaciju). Glikozilacija može da bude izmenjena tako da, na primer, poveća afinitet antitela za antigen. Takve ugljenohidratne modifikacije mogu da se obave, na primer, menjanjem jednog ili više mesta glikozilacije u sekvenci antitela. Na primer, mogu se napraviti jedna ili više aminokiselinskih supstitucija koje za rezultat imaju eliminaciju glikozilacionih mesta okvira varijabilnog regiona, da bi se time eliminisala glikozilacija na tom mestu. Takva glikozilacija može povećati afinitet antitela za antigen. Ovaj pristup opisan je detaljnije u U.S. Patent No. 5,714,350 i 6,350,861, Co et al. [0124[Dodatno ili alternativno, antitelo može da se napravi tako da ima izmenjen tip glikozilacije, kao što je hipofukozilovano antitelo sa smanjenim količinama fukozil rezidua ili antitelo sa povećanim presecajućim GlcNac strukturama. Pokazano je da tako izmenjeni obrasci glikozilacije povećavaju ADCC sposobnost antitela. Takve ugljenohidratne modifikacije mogu da se obave, na primer, eksprimiranjem antitela u ćeliji-domaćinu sa izmenjenom glikozilacionom mašinerijom. Ćelije sa izmenjenom glikozilacionom mašinerijom opisane su u struci i mogu da se koriste kao ćelije-domaćini u kojima se eksprimiraju rekombinantna antitela ove objave da bi se time proizvelo antitelo sa izmenjenom glikozilacijom. Na primer, ćelijske linije Ms704, Ms705, i Ms709 nemaju fukoziltransferazni gen, FUT8 (alfa (1,6) fukoziltransferaza), tako da antitela koja se eksprimirjau u Ms704, Ms705, i Ms709 ćelijskim linijama nemaju fukozu u svojim ugljenim hidratima. Ms704, Ms705, i Ms709 FUT8" " ćelijske linije kreirane su ciljanim oštećenjem FUT8 gena u CHO/DG44 ćelijama, koiršćenjem dva zamenska vektora (vidi U.S. Patent Publication No. 20040110704, Yamane et al. i Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22). Kao drugi primer, EP 1,176,195, Hanai et al. opisuju ćelijsku liniju sa funkcionalnim oštećenjem FUT8 gena koji kodira fukozil-transferazu, tako da ta antitela eksprimirana u toj ćelijskoj liniji pokazuju hipofukozilaciju smanjenjem ili eliminisanjem enzima vezanog za alfa 1,6-vezu. Hanaiet al.takođe opisuju ćelijske linije koje imaju nisku enzimsku aktivnost za dodavanje fukoze na N-acetilglukozamin koji se vezuje za Fc region antitela, ili nemaju enzimsku aktivnost, na primer ćelijska linija mijeloma pacova YB2/0 (ATCC CRL 1662). PCT Publication WO 03/035835, Presta, opisuje varijantu CHO ćelijske linije, Leci3 ćelije, sa smanjenom sposobnošću prikačinjanja fukoze za Asn(297)-vezane ugljenohidrate, što takođe za rezultat ima hipofukozilaciju antitela koja se eksprimiraju u toj ćeliji-domaćinu (vidi i Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). Antitela sa modifikovanim profilom glikozilacije mogu da se proizvedu i u kokošjim jajima, kako je opisano u PCT publication No. WO2006/089231 Alternativno, antitela sa modifikovanim profilom glikozilacije mogu da se proizvedu u biljnim ćelijama kao što jeLemna.Metodi proizvodnje antitela u biljnom sistemu objavljeni su u U.S. Patent application koja odgovara Alston & Bird LLP broju delovodnika pravnog zastupnika. 040989/314911, podnetom 11. avgusta 2006. PCT Publication WO 99/54342, Umana et al. opisuje ćelijske linije inženjerisane da eksprimiraju glikoprotein-modifikujuće glikozil-transferaze (npr., beta(l,4)-N-acetilglukozaminil-transferaza III (GnTIII)), tako da antitela eksprimirana u inženjerisnim ćelijskim linijama pokazuju povećane presecajuće GlcNac strukture, što za rezultat ima povećanu ADCC aktivnost antitela (vidi i Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17-176-180). Alternativno, fukozne rezidue antitela mogu da se odseku korišćenjem fukozidaznog enzima. Na primer, fukozidaza alfa-L-fukozidaza uklanja fukozil rezidue sa antitela (Tarentino, A.L. et al. (1975) Biochem. 14:5516-23).
[0125]Druga modifikacija antitela ovog teksta, koju razmatra ova objava je pegilacija. Antitelo može da se pegiliše da bi se, na primer, povećao biološki (npr., serumski) poluživot antitela. Da bi se antitelo pegilisalo, antitelo ili njegov fragment, tipično reaguju sa politeilen-glikolom (polyethylene glycol, PEG), npr. reaktivnim estrom ili aldehidnim derivatom PEG-a, pod uslovima pod kojima se jedna ili više PEG grupa prikače za antitelo ili fragment antitela. Poželjno, pegilacija se dešava reakcijom acilacije ili reakcijom alkilacije sa reaktivnim PEG molekulom (ili analognim reaktivnim vodorastvornim polimerom). Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "polietilen-glikol" treba da obuhvati sve oblike PEG koji su korišćeni za derivatizovanje drugih proteina, kao što su mono (Cl-CIO) alkoksi ili ariloksi-polietilen-glikol ili polietilen-glikol-maleimid. U nekim formama, antitelo koje se pegiliše je aglikozilovano antitelo. Metodi pegilacije proteina poznati su u struci i mogu se primeniti na antitela ove objave. Vidi na primer, EP 0 154 3 16, Nishimura et al. i EP 0 401 384, Ishikawa et al.
Fragmenti antitela i mimetici antitela
[0126]Ovaj pronalazak nije ograničen na tradicionalna antitela i u praksi može da se primenjuje preko upotrebe fragmenata antitela. Kako je detaljnije opisano dole, danas postoji razvijen veliki broj tehnologija vezanih za fragmente antitela i mimetike antitela i one su široko poznate u struci, lako mnoge od ovih tehnologija, npr. domenska antitela, nanotela i unitela, koriste fragmente ili druge modifikacije strukture tradicionalnih antitela, postoje i alternativne tehnologije kao što su afitela, DARPini, antikalini, avimeri i verzatela, koje koriste vezujuće strukture koje se, iako imitiraju tradicionalno vezivanje, stvaraju i funkcionišu drugačijim mehanizmima.
[0127]Domenska antitela (domain antibodies, dAbs) predstavljaju najmanje funkcionalno vezujuće jedinice antitela koje odgovaraju varijabilnim regionima teških (VH) ili lakih (VL) lanaca humanih antitela. Domenska antitela imaju molekulsku težinu od približno 13 kDa. Domantis je razvio niz velikih i visoko funkcionalnih biblioteka potpuno humanih VH i VL dAbs (više od deset milijardi različitih sekvenci u svakoj biblioteci), i koristi ove biblioteke za selektovanje dAbs koja su specifična za terapijske ciljeve. Nasuprot mnogim konvencionalnim antitelima, domenska antitela se dobro eksprimiraju u bakterijskim, kvaščevim i sisarskim ćelijskim sistemima. Drugi detalji o domenskim antitelima i metodima njihove proizvodnje mogu se dobiti upućivanjem na US Patent 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; 6,696,245; US Serial No. 2004/0110941; European patent application No. 1433846 i European Patents 0368684 & 0616640; VVO05/035572, WO04/101790, WO04/081026, WO04/058821, WO04/003019 i WO03/002609.
[0128]Nanotela su terapijski proteini izvedeni iz antitela, koji sadrže jedinstvene strukturne i funkcionalne osobine prirodnih teškolančanih antitela. Ova teškolančana antitela sadrže jedan varijabilni domen (VHH) i dva konstantna domena (CH2 i CH3). Što je važno, klonirani i izolovani VHH domen je savršeno stabilan protein koji ima puni antitgen-vezujući kapacitet originalnog teškolančanog antitela. Nanotela imaju visoku homologiju sa VH domenima humanih antitela i mogu dodatno da se humanizuju bez bilo kakvog gubitka aktivnosti. Od važnosti je da nanotela imaju nizak imunogeni potencijal, što je potvrđeno u studijama na primatima, sa vodećim jedinjenjima nanotela.
[0129]Nanotela kombinuju prednosti konvencionalnih antitela sa važnim osobinama lekova malih molekula. Kao i konvencionalna antitela, nanotela pokazuju visoku specifičnost za cilj, visok afinitet za svoj cilj i nisku inherentnu toksičnost. Međutim, kao i lekovi malih molekula, mogu da inhibiraju enzime i da lako pristupe žlebovima receptora. Pored toga, nanotela su izuzetno stabilna, mogu da se primene putevima različitim od injekcije (vidi npr. WO 04/041 867) i lako se izrađuju. Druge prednosti nanotela uključuju prepoznavanje neuobičajenih ili skrivenih epitopa, što je rezultat njihove male veličine, vezivanje u udubljenjima ili aktivnim mestima proteinskim ciljeva sa visokim afinitetom i selektivnošću, zbog toga što imaju jedinstvenu trodimenzionalnu strukturu, fleksibilnost formata leka, podešavanje poluživota i lakoća i brzina otkrivanja leka.
[0130]Nanotela kodiraju pojedinačni geni i ona se efikasno proizvode u gotovo svim prokariotskim i eukariotskim ćelijama-domaćinima, npr.E. coli(vidi npr. US 6,756,087), plesnima (na primerAspergillusiliTrichoderma)i kvascima (na primerSaccharomyces, Kluyveromyces, HansenulailiPichia)(vidi npr. US 6,838,254). Obim procesa proizvodnje je podesiv i proizvodi se količina nanotela reda veličine više kilograma. Zbog toga što nanotela pokazuju superiornu stabilnost u poređenju sa konvencionalnim antitelima, ona mogu da se formulišu kao dugotrajni rastvori spremni za upotrebu.
[0131]Metod nanoklona (vidi npr. WO 06/079372) zaštićeni je metod stvaranja antitela na željeni cilj, baziran na automatizovanoj visokopropusnoj selekciji B-ćelija i može da se koristi u kontekstu ovog pronalaska.
[0132]Unitela predstavljaju još jednu tehnologiju fragmenata antitela, međutim ova je zasnovana na uklanjanju zglobnog regiona IgG4 antitela. Delecija zglobnog regiona za rezultat ima molekul koji je suštinski polovina veličine tradicionalnih IgG4 antitela i ima univalentni vezujući region umesto dvovalentnog vezujućeg regiona IgG4 antitela. Dobro je poznato i to da su IgG4 antitela inertna i tako ne interaguju sa imunskim sistemom, što može biti prednost u lečenju oboljenja u kojima imunski odgovor nije poželjan i ova prednost se prenosi na unitela. Na primer, unitela mogu funkcionisati tako da inhibiraju ili utišaju, ali ne i da ubiju ćelije za koje su vezana. Pored toga, vezivanje unitela za kancerske ćelije ne stimuliše ih na prolifraciju. Pored toga, zbog toga što su unitela veličine oko polovine tradicionalnih lgG4 antitela, ona mogu pokazivati bolju distribuciju u većim solidnim tumorima, uz potencijalno bolju efikasnost. Unitela se odstranjuju iz tela sličnomm stopom kao cela IgG4 antitela i sposobna su da se za svoje antigene vezuju sa sličnim afinitetom kao cela antitela. Drugi detalji o unitelima mogu se dobiti upućivanjem na patent WO2007/059782.
[0133]Molekuli afitela predstavljaju novu klasu afinitetnih proteina koja se zasniva na proteinskom domenu od 58 aminokiselinskih rezidua, izvedenom iz jednog od IgG-vezujućih domena stafilokoknog proteina A. Ovaj domen od tri usnopljena heliksa koristi se kao osnova za konstruisanje kombinatornih fagemidskih biblioteka iz kojih se varijante afitela, koje ciljaju željene molekule, mogu selektovati uz korišćenje tehnologije ispoljavanja na fagima (Nord K, Gunneriusson E, Ringdahl J, Stahl S, Uhlen M, Nvgren PA, Binding proteins selected from combinatorial libraries of an a-helical bacterial receptor domain, Nat Biotechnol 1997;15:772-7. Ronmark J, Gronlund H, Uhlen M, Nvgren PA, Human immunoglobulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, Eur J Biochem 2002;269:2647-55.). Jednostavna, robusna struktura molekula afitela u kombinaciji sa njihovom malom molekulskom težinom (6 kDa), čini ih pogodnim za veliki broj različitih primena, na primer kao detekcioni reagensi (Ronmark J, Hansson M, Nguven T, et al, Construction and characterization of affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli, J Immunol Methods 2002;261:199-211) i za inhibiranje receptorskih interakcija (Sandstorm K, Xu Z, Forsberg G, Nvgren PA, Inhibition of the CD28-CD80 co-stimulation signal by a CD28- binding Affibody ligand developed by combinatorial protein engineering, Protein Eng 2003;16:691-7). Drugi detalji o afitelima mogu se dobiti upućivanjem na US Patent No 5831012.
[0134]Obeležena afitela mogu biti korisna i kada se primenjuju za dobijanje slike, za određivanje zastupljenosti izoformi.
[0135]DARPini (designed ankvrin repeat proteins, dizajnirani ankirin-ponavljajući proteini, DARPins) jedan su primer tehnologije mimetika antitela DRP (designed repeat protein, dizajnirani ponavljajući protein), razvijene da bi sc iskoristile vezujuće sposobnosti polipeptida koji nisu antitela. Ponavljajući proteini kao što su proteini bogati ankirinskim ili leucinskim ponovcima, široko su rasprostranjeni vezujući molekuli koji se, za razliku od antitela, sreću i u ćeliji i van nje. Njihova jedinstvena modularna arhitektura odlikuje se ponavljajućim strukturnim jedinicama (ponovcima), napakovanim zajedno da formiraju duge ponavljajuće domene koji pokazuju varijabilne i modularne površine koje se vezuju za cilj. Na osnovu ove modularnosti, mogu da se stvore kombinatorne biblioteke polipeptida sa visokom raznovrsnošću vezujućih specifičnosti. Ova strategija uključuje konsenzusni dizajn samokompatibilnih ponovaka koji pokazuju različite površinske rezidue i njihovo nasumično uklapanje u ponavljajuće domene.
[0136]DARPini mogu da se proizvedu u bakterijskim ekspresionim sistemima sa vrlo visokim prinosima i pripadaju najstabilnijim poznatim proteinima. Odabrani su visokospecifični, visokoafinitetni DARPini za širok opseg ciljnih proteina, uključujući humane receptore, citokine, kinaze, humane proteaze, viruse i membranske proteine. Moguće je dobiti DARPine koji imaju afinitete u jednocifrenom nanomolarnom do pikomolarnom opsegu.
[0137]DARPini se koriste u širokom opsegu aplikacija, uključujući ELISA, sendvič ELISA, analizu protočnom citomtrijom (flow cvtometric analvsis, FACS), imunohistohemiju (immunohistochemistrv, IHC), primene čipova, afmitetno prečišćavanje ili Western blot. Potvrdilo se i da su DARPini visoko aktivni u unutarćelijskom kompartmentu, na primer kao unutarćelijski marker-proteini fuzionisani sa zelenim fluorescentnim proteinom (green fluorescent protein, GFP). DARPini se koriste i za inhibiranje ulaska virusa, sa IC50u pM opsegu. DARPini nisu idealni samo za blokiranje interakcija protein-protein, nego i za inhibiranje enzima. Proteaze, kinaze i transporteri uspešno se inhibiraju, najčešće u alostcričnom inhibicionom modalitetu. Veoma brzo i specifično koncentrisanje u tumoru i veoma povoljni odnosi tumor-krv, čine DARPine pogodnim zain vivodijagnostičke i terapijske pristupe.
[0138]Dodatne informacije u vezi sa DARPinima i drugim DRP tehnologijama mogu se naći u US Patent Application Publication No. 2004/0132028 i International Patent Application Publication No. VVO 02/20565.
[0139]Antikalini predstavljaju još jednu tehnologiju mimetika antitela, međutim u ovom slučaju, vezujuća specifičnost je izvedena iz lipokalina, familije proteina male molekulske težine, koji se prirodno i u velikoj meri eksprimiraju u humanim tkivima i telesnim tečnostima. Lipokalini su razvijeni za obavljanje mnogih funkcijain vivoudruženih sa fiziološkim transportom i skladištenjem hemijski senzitivnih ili nerastvorljivih jedinjenja. Lipokalini imaju robusnu unutrašnju strukturu koja sadrži visoko konzervirano(3-burence koje podržava četiri petlje najednom terminusu proteina. Ove petlje formiraju ulaz u vezujući džep i konformacione razlike u ovom delu molekula odgovorne su za varijacije u vezujućoj specifičnosti između pojedinačnih lipokalina. JOHO] Dok je čitava struktura hipervarijabilnih petlji, podržana konzerviranim P-ploča okvirom, reminiscencija imunoglobulina, lipokalini se značajno razlikuju od antitela u pogledu veličine, sačinjeni su od jednog polipeptidnog lanca od 160-180 amino-kiselina, koji je nešto veći od jednog imunoglobulinskog domena.
[0141] Lipokalini su klonirani i njihove petlje su podvrgnute inženjerisanju da bi se stvorili antikalini. Stvorene su biblioteke strukturno raznovrsnih antikalina i ispoljavanje antikalina omogućilo je selekciju i skrining vezujuće funkcije, praćeno ekspresijom i proizvodnjom solubilnog proteina za dalju analizu, u prokariotskim ili eukariotskim sistemima. Studije su uspešno pokazale da se mogu razviti antikalini specifični za praktično sve humane ciljne proteine, oni se mogu izolovati i mogu se dobiti njihovi vezujući afiniteti u nanomolarnom ili višem opsegu.
[0142] Antikalini mogu da se formatiraju i kao dvojni ciljni proteini, takozvani duokalini.
[0143] Duokalin vezuje dva zasebna terapijska cilja za jedan monomerni protein koji se lako proizvodi, korišćenjem standardnih procesa izrade, uz zadržavanje ciljne specifičnosti i afiniteta bez obzira na strukturnu orijentaciju njegova dva vezujuća domena.
[0144] Modulacija više ciljeva preko jednog molekula posebna je prednost u bolestima za koje se zna da uključuju više od jednog uzročnog faktora. Pored toga, bi- ili multivalentni vezujući formati kao što su duokalini imaju značajan potencijal u ciljanju molekula na površini ćelije u bolestima, posredujući u agonističkim efektima na puteve prenosa signala ili indukujući pojačane efekte internalizacije putem vezivanja i stvaranja klastera ćelijskih površinskih receptora. Pored toga, visoka unutrašnja stabilnost duokalina uporediva je sa monomernim antikalinima. što duokalinima daje fleksibilni formulacioni i dostavni potencijal. [0145)Dodatne informacije u vezi sa antikalinima mogu se naći u US Patent No. 7,250,297 i International Patent Application Publication No. WO 99/16873.
[0146]Druga tehnologija mimetika antitela korisna u kontekstu ove objave su avimeri. Avimeri su razvijeni iz velike familije domena humanih vanćelijskih receptora, putemin vitromešanja egzona i ispoljavanja na fagima, pri čemu su stvoreni multidomenski proteini sa vezujućim i inhibitornim osobinama. Pokazano je da povezivanje više nezavisnih vezujućih domena stvara aviditet i rezultuje poboljšanjem afiniteta i specifičnosti u poređenju sa konvencionalnim proteinima koji se vezuju za jedan epitop. Druge potencijalne prednosti uključuju jednostavnu i efikasnu proizvodnju multiciljno-specifičnih molekula uEscherichia coli,poboljšanu termostabilnost i otpornost prema proteazama. Dobijeni su avimeri za različite ciljeve, sa subnanomolarnim afinitetima.
[0147]Dodatne informacije u vezi sa avimerima mogu se naći u US Patent Application Publication No. 2006/0286603, 2006/0234299, 2006/0223114, 2006/0177831, 2006/0008844, 2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0089932, 2005/0053973, 2005/0048512, 2004/0175756.
[0148]Verzatela predstavljaju još jednu tehnologiju mimetika antitela koja mogu da se koriste u kontekstu sadašnje objave. Verzatela su mali proteini od 3-5 kDa sa >15% cisteina koji formira potku visoke gustine zamenjujući hidrofobnu srž koju imaju tipični proteini. Zamena velikog broja hidrofobnih aminokiselina koje obuhvataju hidrofobnu srž, malim brojem disulfida za rezultat ima protein koji je manji, hidrofilniji (manje agregiranja i nespecifičnog vezivanja), rezistentniji na proteaze i toplotu, i ima manju gustinu epitopa za T-ćelije, jer su rezidue koje u najvećoj meri doprinose MHC prezentaciji hidrofobne. Dobro je poznato da sve ove četiri osobine utiču na imunogenost i očekuje se da zajedno dovode do velikog smanjenja imunogenosti.
[0149]Inspiracija za verzatela došla je od prirodnih injektabilnih biofarmaceutika koje proizvode pijavice, zmije, pauci, škorpije, puževi i anemone (sase) za koje se zna da pokazuju neočekivano nisku imunogenost. Polazeći od odabranih familija prirodnih proteina, dizajniranjem i skriningom veličine, hidrofobnost, proteolitička obrada antigena i gustina epitopa su smanjeni na nivoe daleko ispod prosečnih za prirodne injektabilne proteine.
[0150]S obzirom na strukturu verzatela, ovi mimetici antitela nude višestrani format koji uključuje multivalencu, multispecifičnost, raznovrsnost mehanizama poluživota, module ciljanja tkiva i odsustvo Fc regiona antitela. Pored toga, verzatela se izrađuju uE. colisa visokim prinosima, a zbog svoje hidrfilnosti i male veličine verzatela su visokosolubilna i mogu da se formulišu u visokim koncentracijama. Verzatela su izuzetno termostabilna (mogu da ključaju) i imaju produženi vek trajanja.
[0151]Dodatne informacije u vezi sa verzatelima mog se naći u US Patent Application Publication No. 2007/0191272.
[0152]Detaljan opis tehnologija fragmenata antitela i mimetika antitela dat gore, ne predstavlja sveobuhvatnu listu svih tehnologija koje mogu da se koriste u kontekstu sadašnje specifikacije. Na primer, a u isto vreme ne kao ograničenje, različite dodatne tehnologije, uključujući alternativne tehnologije bazirane na polipeptidima kao što su fuzije regiona koji određuju komplementarnost kako je navedeno u Qui et al., Nature Biotechnologv, 25(8) 921-929 (2007), kao i tehnologije zasnovane na nukleinskim kiselinama, kao RNK aptamer tehnologije, opisane u US Patent No. 5,789,157, 5,864,026, 5,712,375, 5,763,566, 6,013,443, 6,376,474, 6,613,526, 6,114,120, 6,261,774 i 6,387,620, mogu se koristiti u kontekstu sadašnje objave.
Fizičke osobine antitela
[0153]Antitela predmetne objave mogu da se karakterišu i po različitim fizičkim osobinama anti-CXCR4 antitela. Različiti testovi mogu da se koriste za detektovanje i/ili diferenciranje klasa antitela na osnovu ovih fizičkih osobina.
[0154]U nekim formama, antitela predmetne objave mogu da sadrže jedno ili više mesta glikozilacije u varijabilnom regionu lakog ili teškog lanca. Prisustvo jednog ili više mesta glikozilacije u varijabilnom regionu može za rezultat imati povišenu imunogenost antitela ili promenu pK antitela, zbog izmenjenog vezivanja za antigen (Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala FA and Morrison SL
(2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro RG (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7: Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706). Poznato je da se glikozilacija dešava na motivima koji sadrže N-X-S/T sekvencu. Glikozilacija varijabilnog regiona može se testirati korišćenjem Glvcoblot testa koji seče anttielo da se dobije Fab, i zatim ispituje glikozilaciju korišćenjem testa koji meri oksidaciju perjodata i formiranje Schiff-ove baze. Alternativno, glikozilacija varijabilnog regiona može da se testira korišćenjem Dionex brze hromatografije (Dionex light chromatographv, Dionex-LC), koja seče saharide sa Fab u monosaharide i analizira sadržaj pojedinih monosaharida. U nekim slučajevima, poželjno je imati anti-CXCR4 antitelo koje ne sadrži glikozilaciju varijabilnog regiona. Ovo može da se postigne selektovanjem antitela koja ne sadrže glikozilacioni motiv u varijabilno regionu ili mutiranjem rezidua unutar glikozilacionog motiva, korišćenjem standardnih tehnika dobro poznatih u struci.
[0155]U poželjnoj formi, antitela predmetne objave ne sadrže mesta asparaginskog izomerizma. Deamidacija ili efekat izoasparaginske kiseline može da se desi na N-G ili D-G sekvencama, respektivno. Efekat deamidacije ili izoasparaginske kiseline rezultuje kreiranjem izoasparaginske kiseline koja smanjuje stabilnost antitela stvaranjem zalomljene strukture sa karboksi-terminusom bočnog lanca, a ne glavnog lanca. Stvaranje izoasparaginske kiseline može da se meri upotrebom izo-kvant testa koji za testiranje izoasparaginske kiseline koristi reverzno-faznu HPLC .
[0156]Svako antitelo imaće jedinstvenu izoelcktričnu tačku (pl), ali obično će antitela biti u opsegu pH između 6 i 9.5. pl za IgGl antitelo obično će biti u opsegu pH 7-9.5, a pl za IgG4 antitelo tipično će biti u opsegu pH 6-8. Antitela mogu imati pl koja je izvan ovog opsega. Iako su efekti generalno nepoznati, postoje spekulacije da antitela sa pl izvan normalnog opsega mogu imati neka ispravljanja i nestabilnost u uslovimain vivo.Izoelektrična tačka može da se testira korišćenjem testa kapilarnog izoelektričnog fokusiranja, koji stvara pH gradijent i može da koristi lasersko fokusirnaje za povećanje pouzdanosti (Janini et al (2002) Electrophoresis 23:1605-11; Ma et al. (2001) Chromatographia 53:S75-89; Hunt et al (1998) J Chromatogr A 800:355-67). U nekim slučajevima, poželjno je imati anti-CXCR4 antitelo koje ima pl vrednost izvan normalnog opsega. Ovo može da se postigne selekcijom antitela sa pl u normalnom opsegu ili mutiranjem naelektrisanja površinskih rezidua korišćenjem standardnih tehnika dobro poznatih u struci.
[0157]Svako antitelo imaće temperaturu topljenja koja je indikacija termičke stabilnosti (Krishnamurthv R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). Veća termička stabilnost ukazuje na veću ukupnu stabilnost antitelain vivo.Tačka topljenja antitela može da se meri korišćenjem tehnika kao što je diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52). TM1 označava temperaturu početnog ispravljanja antitela. TM2 označava temperaturu kompletnog ispravljanja antitela. Generalno, poželjno je da TM1 antitela predmetne objave bude veća od 60°C, poželjno veća od 65°C, još poželjnije veća od 70°C. Alternativno, termička stabilnost antitela može da se meri korišćenjem cirkularnog dihroizma (Murrav et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9).
]0158]U poželjnoj formi, selektuju se antitela koja se ne razgrađuju brzo. Fragmentacija anti-CXCR4 antitela može da se meri korišćenjem kapilarne elektroforeze (capillarv electrophoresis, CE) i MALDI-MS, kako se dobro zna u struci (Alexander AJ and Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32).
[0159]U drugoj poželjnoj formi, selektuju se antitela koja imaju minimalne agregacione efekte. Agregacija može da dovede do pokretanja neželjenog imunog odgovora i/ili izmenjenih ili neželjenih farrnakokinetičkih osobina. Obično, prihvatljiva su antitela sa agregacijom od 25% ili manjom, poželjno 20% ili manjom, još poželjnije 15% ili manjom, još poželjnije 10% ili manjom i još poželjnije 5% ili manjom. Agregacija može da se meri pomoću nekoliko tehnika dobro poznatih u struci, uključujući tečnu hromatografiju visokih performansi (high performance liquid chromatographv, HPLC) na ekskluzionoj koloni (size-exclusion column, SEC), i rasipanje svetlosti, za identifikovanje monomera, dimera, trimera ili multimera.
Metodi inženjerisanja antitela
[0160]K.ako je gore rečeno, anti-CXCR4 antitela koja imaju VHi V«sekvence objavljene u ovom tekstu, mogu da se koriste za stvaranje novih anti-CXCR4 antitela modifikovanjem VHi/ili Vk. sekvenci, ili konstantnog/konstantnih regiona prikačenih za njih. Prema tome, u drugom aspektu ove objave strukturne osobine anti-CXCR4 antitela ove objave, npr. F7, F9, Dl ili E2, koriste se za stvaranje strukturno srodnih anti-CXCR4 antitela koja zadržavaju najmanje jednu funkcionalnu osobinu antitela ove objave, kao stoje vezivanje za humani CXCR4. Na primer, jedan ili više CDR regiona F7, F9, Dl ili E2, ili njihovih mutacija, mogu da se rekombinantno kombinuju sa poznatim regionima okvira i/ili drugim CDR da bi se stvorila dodatna, rekombinantno inženjerisana anti-CXCR4 antitela ove objave, kako je bilo reci gore. Drugi tipovi modifikacija uključuju one opisane u prethodnom odeljku. Polazni materijal za metod inženjerisanja je jedna ili više VHi/ili VKsekvenci datih u ovom tekstu, ili jedan ili više njihovih CDR regiona. Da bi se stvorilo inženjerisano antitelo, nije neophodno da se pripremi (tj., eksprimira kao protein) antitelo koje ima jednu ili više Vhi/ili VKsekvenci datih u ovom tekstu, ili jedan ili više njihovih CDR regiona. Umesto toga, informacija sadržana u sekvenci/sekvencama koristi se kao polazni materijal za kreiranje "druge generacije" sekvence/sekvenci poreklom od originalne sekvence/sekvenci i zatim se "druga generacija" sekvence/sekvenci priprema i eksprimira kao protein.
[0161]Prema tome, u drugoj formi, ova objava obezbeđuje metod pripremanja anti-CXCR4 antitela koji uključuje: (a) obezbeđivanje: (i) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca antitela, koja sadrži CDR1 sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-4, CDR2 sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 5-8, i/ili CDR3 sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 9-12; i/ili (ii) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca antitela, koja sadrži CDR1 sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 13-16, CDR2 sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 17-20, i/ili CDR3 sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 21-24; (b) zamenu najmanje jedne aminokiselinske rezidue u sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca antitela i/ili sekvenci varijabilnog regiona lakog lanca antitela da bi se stvorila najmanje jedna izmenjena sekvenca antitela;i (c) eksprimiranje izmenjene sekvence antitela u vidu proteina.
[0162]Standardne tehnike molekularne biologije mogu da se koriste za pripremanje i ekspresiju izmenjene sekvence antitela.
[0163]Poželjno, antitelo kodirano izmenjenom sekvencom/sekvencama antitela je ono koje zadržava jednu, neke ili sve funkcionalne osobine anti-CXCR4 antitela opisanih u ovom tekstu, koje, funkcionalne osobine, uključuju, ali se ne ograničavaju na: (i) vezivanje za nativni humani CXCR4 eksprimiran na površini ćelije; (ii) inhibiranje vezivanja SDF-1 za CXCR4; (iii) inhibiranje SDF-1-indukovanog fluksa kalcijuma u ćelije koje eksprimiraju CXCR4; (iv) inhibiranje SDF-1-indukovane migracije ćelija koje eksprimiraju CXCR4; (v) inhibiranje HuVEC da formiraju kapilarne tube; (vi) vezivanje za humani CXCR4 sa Ku od lx IO"7 M ili manjom; (vii) indukovanje apoptoze u ćelijama koje eksprimiraju CXCR4; (viii) inhibiranje proliferacije tumorskih ćelijain vitro;
(ix) inhibiranje proliferacije tumorskih ćelija i/ili indukovanje apoptoze tumorskih ćelijain vivo;
(x) inhibiranje metastaza CXCR4<4>tumorskih ćelija; i/ili
(xi) produžavanje vremena preživljavanja subjekata koji nose CXCR4<+>tumor.
[0164]Funkcionalne osobine izmenjenih antitela mogu da se procene korišćenjem standardnih testova dostupnih u struci i/ili opisanih u ovom tekstu, kao što su oni navedeni u Primerima (npr., protočna citometrija, testovi vezivanja, funkcionalni testovi).
[0165]U nekim formama metoda inženjerisanja antitla ove objave, mutacije mogu da se uvedu nasumično ili selektivno duž celog ili dela sekvence koja koidra anti-CXCR4 antitelo i dobijena modifikovana anti-CXCR4 antitela mogu da se pretražuju u pogledu vezujuće aktivnosti i/ili drugih funkcionalnih osobina, kako je opisano u ovom tekstu. Mutacioni metodi opisani su u struci. Na primer, PCT Publication VVO 02/092780, Short, opisuje metode stvaranja i skrininga mutacija antitela korišćenjem saturacione mutageneze, sklapanja sintetskom ligacijom, ili njihovom kombinacijom. Alternativno, PCT Publication WO 03/074679, Lazar et al., opisuje korišćenje metoda kompjuterskog skrininga za optimizovanje fizičko-hemijskih osobina antitela.
Molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju antitela ove objave
[0166]Drugi aspekt ove objave odnosi se na molekule nukelinskih kiselina koji kodiraju antitela ove objave. Nukelinske kiseline mogu biti prisutne u celim ćelijama, ćelijskom lizatu, ili u delimično prečišćenoj ili suštinski čistoj formi. Nukleinska kiselina je "izolovana" ili "data suštinski čista" kada je prečišćena od drugih ćelijskih komponenti ili drugih kontaminanata, npr., drugih ćelijskih nukleinskih kiselina ili proteina, standardnim tehnikama, uključujući baza/SDS tretman, centrifugiranje na gradijentu CsCl, hromatografiju na koloni, elektroforezu na agaroznom gelu i druge tehnike dobro poznate u struci. Vidi, F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biologv, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Nukelinska kiselina ove objave može da bude, na primer, DNK ili RNK i može, ali ne mora sadržati intronske sekvence. U poželjnoj formi, nukelinska kiselina je molekul cDNK.
[0167]Nukleinske kiseline ove objave mogu da se dobiju korišćenjem standardnih tehnika molelekularne biologije. Za antitela koja se eksprimiraju u hibridomima (npr., hibridomi pripremljeni iz transgenih miševa koji nose humane imunoglobulinske gene, kako je detaljnije opisano dole), cDNK koje kodiraju lake i teške lance antitela napravljene u hibridomima mogu da se dobiju standardnom PCR-amplifikacijom ili tehnikama kloniranja cDNK. Za antitela dobijena iz biblioteke imunoglobulinskih gena (npr., korišćenjem tehnika ispoljavanja na fagima), nukelinska kiselina koja kodira ta antitela može da se izoluje iz biblioteke gena.
[0168]Poželjni molekuli nukelinskih kiselina ove objave su oni koji kodiraju VHi VLsekvence F7, F9, Dl i E2 monoklonskih antitela. DNK sekvence koje kodiraju VHsekvence F7, F9, Dl i E2 pokazane su u SEQ ID NO: 33-36, respektivno. DNK sekvence koje kodiraju Vlsekvence F7, F9, Dl i E2 pokazane su u SEQ ID NO: 37-40, respektivno.
[0169]Kada se dobiju fragmenti DNK koji kodiraju VHi VLsegmente, ovi DNK fragmenti mogu dalje da se obrađuju standardnim tehnikama rekombinantne DNK, na primer da se geni varijabilnog regiona konvertuju u gene lanaca antitela pune dužine, u gene Fab fragmenata ili u scFv gene. U ovim manipulacijama, Vl- ili Vn-kodirajući fragment DNK operativno je povezan sa drugim DNK fragmentom koji kodira drugi protein, kao što je konstantni region antitela ili fleksibilni linker. Izraz "operativno povezan", kada se koristi u ovom kontekstu, znači da su dva DNK fragmenta spojena tako da aminokiselinske sekvence koje kodiraju dva DNK fragmenta ostaju unutar okvira.
[0170]Izolovana DNK koja kodira VHregion može da se konvertuje u gen teškog lanca pune dužine operativnim povezivanjem VH-kodirajuće DNK za drugi DNK molekul koji kodira konstantne regione teškog lanca (CHI, CH2 i CH3). Sekvence gena humanih teškolančanih konstantnih regiona poznate su u struci (vidi npr., Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) i DNK fragmenti koji obuhvataju ove regione mogu da se dobiju standardnom PCR-amplifikacijom. Konstantni region teškog lanca može da bude konstantni region IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ili IgD, ali je najpoželjnije konstantni region IgGl ili IgG4. Za gen teškog lanca Fab fragmenta, VH-kodirajuća DNK može da bude operativno povezana sa drugim DNK molekulom koji kodira samo CHI konstantni region teškog lanca.
[0171]Izolovana DNK koja kodira Vi. region može da se konvertuje u gen lakog lanca pune dužine (kao i gen lakog lanca Fab) operativnim povezivanjem VL-kodirajuće DNK za drugi DNK molekul koji kodira konstantni region lakog lanca, Cl- Sekvence gena konstantnog regiona humanog lakog lanca poznate su u struci (vidi npr., Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) i DNK fragmenti koji obuhvataju ove regione mogu da se dobiju standardnom PCR-amplifikacijom. U poželjnim formama, konstantni region lakog lanca može da bude kapa ili lambda konstantni region.
[0172]Da bi se stvorio scFv gen, Vh- i Vi_-kodirajući DNK fragmenti operativno se povežu sa drugim fragmentom koji kodira fleksibilni linker, npr., koji kodira aminokiselinsku sekvencu (Gly4-Ser)3, tako da VH i VL sekvence mogu da se eksprimiraju u vidu kontinuiranog jednolančanog proteina, sa VLi VHregionima spojenim fleksibilnim linkerom (vidi npr., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al.,
(1990) Nature 348:552-554).
Proizvodnja monoklonskih antitela ove objave
[0173]Monoklonska antitela (monoclonal antibodies, mAb) predmetne objave mogu da se proizvedu različitim tehnikama uključujući konvencionalnu metodologiju monoklonskih antitela npr., standardnu tehniku hibridizacije somatskih ćelija, Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495. Iako su postupci hibridizacije somatskih ćelija poželjni, u principu, mogu da se koriste druge tehnike proizvodnje monoklonakih antitela npr., virusna ili onkogena transformacija B-limfocita.
[0174]Poželjan animalni sistem za pripremanje hibridoma je mišji sistem. Proizvodnja hibridoma u mišu veoma je dobro utvrđen postupak. Protokoli imunizacije i tehnike izolacije imunizovanih splenocita za fuziju, poznati su u struci. Fuzioni partneri (npr., ćelije mišjeg mijeloma) i postupci fuzije, takođe su poznati.
[0175]Himerna ili humanizovana antitela predmetne objave mogu da se pripreme na osnovu sekvence nehumanog monoklonskog antitela pripremljenog kako je opisano gore. DNK koja kodira teško- i lakolančane imunoglobuline može da se dobije iz nehumanog hibridoma od interesa i inženjeriše da sadrži nemišje (npr., humane) imunoglobulinske sekvence, korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije. Na primer, da bi se stvorilo himerno antitelo, mišji varijabilni regioni mogu da se povežu sa humanim konstantnim regionima korišćenjem metoda poznatih u struci (vidi npr., U.S. Patent No. 4,816,567, Cabillv et al.). Da bi se stvorilo humanizovano antitelo, mišji CDR regioni mogu da se insertuju u humani okvir korišćenjem metoda poznatih u struci (vidi npr., U.S. Patent No. 5,225,539, Winter, i U.S. Patent No. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 i 6,180,370, Queen et al.).
[0176]U poželjnoj formi, antitela ove objave su humana monoklonska antitela. Takva humana monoklonska antitela usmerena protiv CXCR4 mogu da se stvore korišćenjem transgenih ili transhromozomskih miševa koji nose delove humanog imunskog sistema, a ne mišjeg sistema. Ovi transgeni ili transhromozomski miševi uključuju miševe označene u ovom tekstu kao HuMAb Mouse® i KM Mouse®, respektivno, i zajedničkim imenom su označeni kao "human-Ig miševi."
[0177]HuMAb Mouse® (Medarex®, Inc.) sadrži minilokuse humanog imunoglobulinskog gena, koji kodiraju nerearanžirane humane teško- (u i y) iklakolančane imunoglobulinske sekvence, zajedno sa ciljanim mutacijama koje inaktiviraju endogene lokuse u iklanca (vidi npr., Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859). Prema tome, miševi pokazuju smanjenu ekspresiju mišjeg IgM ilik, i u odgovoru na imunizaciju, uvedeni humani teško- i lakolančani transgeni podležu klasičnom prekopčavanju i somatskoj mutaciji da bi se stvorila visokoafinitetna humana IgGKmonoklonska antitela (Lonberg, N.et al.(1994), gore; pregled dat u Lonberg, N.
(1994) Handbook of Experimental Pharmacologv 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, i Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546). Pripremanje i upotreba HuMAb Mouse®, i genomske modifikacije koje takvi miševi nose, detaljnije su opisani u Tavlor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunologv 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Pro. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al.
(1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Tavlor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; i Fishvvild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851.
[0178]Vidi još i U.S. Patent No. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; i 5,770,429; sve Lonberg and Kay; U.S. Patent No. 5,545,807, Surani et al.; PCT Publication No. WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 i WO 99/45962, sve Lonberg and Kay; i PCT Publication No. WO 01/14424, Korman et al.
[0179]U drugoj formi, humana antitela ove objave mogu da se naprave koiršćenjem miša koji nosi humane imunoglobulinske sekvence na transgenima i transhromozomima, kao što je miš koji nosi humani teškolančani transgen i humani lakolančani transhromozom. Ovaj miš se označava u ovom tekstu kao "KM mouse®," i opisan je detaljno u PCT Publication WO 02/43478, Ishida et al.
[0180]Pored toga, alternativni transgeni animalni sistemi koji eksprimiraju gene za humane imunoglobuline dostupni su u struci i mogu da se koriste za stvaranje anti-CXCR4 antitela ove objave. Na primer, može da se koristi alternativni transgeni sistem označen kao Xenomouse (Abgenix, Inc.); takvi miševi opisani su na primer, u U.S.
Patent No. 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 i 6,162,963, Kucherlapati et al.
[0181]Pored toga, u struci su dostupni alternativni transhromozomski animalni sistemi koji eksprimiraju gene za humane imunoglobuline i mogu da se koriste za stvaranje anti-CXCR4 antitela ove objave. Na primer, mogu da se koriste miševi koji nose humani teškolančani transhromozom i humani lakolančani transhromozom. označeni kao "TC miševi"; ovakvi miševi opisani su u Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Pored toga, krave koje nose humane teško- i lakolančane transhromozome opisane su u struci (npr., Kuroivva et al. (2002) Nature Biotechnologv 20:889-894 i PCT application No. WO 2002/092812) i mogu da se koriste za stvaranje anti-CXCR4 antitela ove objave.
[0182]Humana monoklonska antitela ove objave mogu da se pripreme i korišćenjem metoda ispoljavanja na fagima, za skrining biblioteka humanih imunoglobulinskih gena. Ovi metodi ispoljavanja na fagima za izolovanje humanih antitela uspostavljeni su u struci. Vidi na primer: U.S. Patent No. 5,223,409; 5,403,484; i 5,571,698, Ladner et al.; U.S. Patent No. 5,427,908 i 5,580,717, Dovver et al.; U.S. Patent No. 5,969,108 i 6,172,197, McCafferfv et al.; i U.S. Patent No. 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 i 6,593,081, Griffiths et al.
[0183]Humana monoklonska antitela ove objave mogu da se pripreme i korišćenjem SCID miševa u koje se rekonstituišu humane imunske ćelije tako da može da se generiše odgovor humanim antitelima posle imunizacije Takvi miševi opisani su na primer u U.S. Patent No. 5,476,996 i 5,698,767, Wilson et al.
[0184]U posebno poželjnoj formi, humana anti-CXCR4 antitela pripremaju se korišćenjem kombinacije human-Ig miš i tehnika ispoljavanja na fagima, kako je opisano u U.S. Patent No. 6,794,132, Buechler et al. Preciznije, metod uključuje najpre stvaranje anti-CXCR4 odgovora antitelima u human-Ig mišu (kao što su HuMab miš ili KM miš, kako je gore opisano) imunizovanjem miša CXCR4 antigenom, praćeno izolovanjem nukelinskih kiselina koje kodiraju lance huamnih antitela iz limfnih ćelija miša i uvođenje ovih nukleinskih kiselina u vektor za ispoljavanje (npr., fag), da bi se obezbedila biblioteka ispoljavajućih paketa. Tako, svaki član biblioteke podrazumeva nukleinsku kiselinu koja kodira lanac humanog antitela i svaki lanac antitela se ispoljava iz ispoljavajućeg paketa. Biblioteka se zatim pregleda CXCR4 antigenom da se izoluju članovi biblioteke koji se specifično vezuju za CXCR4. Inserti nukleinske kiseline odabranih članova biblioteke se zatim izoluju i sekvencionišu standardnim metodima da bi se odredile lako- i teškolančane varijabilne sekvence odabranih vezivača za CXCR4. Varijabilni regioni mogu da se konvertuju u lance antitela pune dužine standardnim tehnikama rekombinantne DNK, kao što je kloniranje varijabilnih regiona u ekspresioni vektor koji nosi humane teško- i lakolančane konstantne regione tako da je VHregion operativno povezan sa Chregionom i VLregion je operativno povezan sa CLregionom. Za dalji opis pripremanja humanih anti-CXCR4 antitela korišćenjem ovog kombinovanog sistema ispoljavanja transgeni miš/fag, vidi Primer 1.
Imunizacija human- Ig miševa
[0185]Kada se human-Ig miševi koriste za stvaranje humanih antitela ove objave, takvi miševi mogu da se imunizuju prečišćenim ili obogaćenim prparatom CXCR4 antigena i/ili rekombinantnim CXCR4, ili ćelijama koje eksprimiraju CXCR4, ili CXCR4 fuzionim proteinom, kako su opisali Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishvvild, D. et al. (1996) Nature Biolechnology 14: 845-851; i PCT Publication WO 98/24884 i WO 01/14424. Poželjno, miševi će pri prvoj infuziji biti stari 6-16 nedelja. Na primer, prečišćeni ili rekombinantni preparat (5-50 ug) CXCR4 antigena može da se koristi za imunizovanje human-Ig miševa intraperitonealno. Najpoželjnije, imunogen upotrebljen za stvaranje antitela ove objave sadrži humani CXCR4 u nativnoj konformaciji unutar membrane, neograničavajući primeri čega uključuju ćelije transfektovane da eksprimiraju CXCR4 na svojoj površini, ćelije koje nativno eksprimiraju CXCR4 (npr., CEM ćelije), i veštačke membrane (npr., lipozomi) u koje je CXCR4 inkorporisan, kao što su magnetni proteolipozomi (magnetic proteoliposomes, MPL) koji inkorporišu CXCR4 (detaljnije opisano u Primeru 1).
[0186]Detaljni postupci generisanja potpuno humanih monoklonskih antitela na CXCR4 opisani su u Primeru 1, dole. Kumulativno iskustvo sa različitim antigenima pokazalo je da transgeni miševi odgovaraju kada se početno imunizuju intraperitonealno (IP) antigenom u kompletnom Freund-ovom adjuvansu, praćeno IP imunizacijama svake druge nedelje (do ukupno 6), antigenom u nekompletnom Freund-ovom adjuvansu. Međutim, nađeno je da su efikasni i adjuvansi različiti od Freund-ovog. Pored toga, nađeno je da su cele ćelije u odsustvu adjuvansa visoko imunogene. Imunski odgovor može da se prati tokom trajanja protokola imunizacije preko uzoraka plazme dobijene uzimanjem krvi retroorbitalno. Plazma može da se pregleda pomoću ELISA (kako je dole opisano), i miševi sa dovoljnim titrima anti-CXCR4 humanih imunoglobulina mogu da se koriste za fuzije. Miševima može da se izvrši pojačavanje intravenski antigenom 3 dana pre žrtvovanja i uklanjanja slezine. Očekuje se da može biti potrebno obaviti 2-3 fuzije za svaku imunizaciju. Između 6 i 24 miša tipično se imunizuje za svaki antigen. Obično se koriste i HCo7 i HCol2 sojevi. Pored toga, HCo7 i HCol2 transgen mogu da se uzgajaju u jednom mišu koji ima dva različita humana teškolančana transgena (HCo7/HCol2). Alternativno ili dodatno, može da se koristi KM Mouse® soj, kako je opisano u Primeru 1.
Generisanje hibridoma koji proizvode humana monoklonska antitela ove objave
[0187]Da bi se generisali hibridomi koji proizvode humana monoklonska antitela ove objave, splenociti i/ili ćelije limfnih čvorova imunizovanih miševa mogu da se izoluju i fuzionišu sa odgovarajućom imortalizovanom ćelijskom linijom kao što je ćelijska linija mišjeg mijeloma. Dobijeni hibridomi mogu da se pretraže u pogledu produkcije antigen-specifičnih antitela. Na primer, pojedinačno-ćelijske suspenzije slezinskih limfocita iz imunizovanih miševa mogu da se fuzionišu sa jednom šestinom broja P3X63-Ag8.653 ćelija nesekretujućeg mišjeg mijeloma (ATCC, CRL 1580) sa 50% PEG. Alternativno, pojedinačno-ćelijska suspenzija slezinskih limfocita iz imunizovanih miševa može da se fuzionišc, korišćenjem metoda elektrofuzije baziranog na električnom polju, korišćenjem CvtoPulse elektroporatora za ćelijsku fuziju sa velikom komorom (CvtoPulse Sciences, Inc., Glen Burnie Marvland). Ćelije se zaseju pri gustini od 2 x IO<5>na mikrotitarske ploče sa ravnim dnom, inkubiraju dve nedelje u selektivnom medijumu koji sadrži 20% fetalni klonski serum, 18% "653" kondicionirani medijum, 5% origen (IGEN), 4 mM L-glutamin, 1 mM natrijum-piruvat, 5mM HEPES, 0.055 mM 2-merkaptoetanol, 50 jedinica/ml penicilina, 50 mg/ml streptomicina, 50 mg/ml gentamicina i IX HAT (Sigma; the HAT se dodaje 24 sata posle fuzije). Posle oko dve nedelje, ćelije mogu da se kultivišu u medijumu u kojem je HAT zamenjen sa HT. Pojedinačni bunarčići mogu zatim da se pretraže pomoću ELISA u pogledu humanih monoklonskih IgM i IgG antitela. Kada dođe do ekstenzivnog rasta hibridoma, medijum može da se posmatra, obično posle 10-14 dana. Hibridomi koji sekretuju antitelo mogu ponovo da se zaseju, ponovo pregledaju i ako su još uvek pozitivni na humani IgG, monoklonska antitela mogu da se subkloniraju najmanje dva puta metodom graničnog razblaženja. Stabilni subklonovi mogu da se kultivišuin vitroda bi nastale male količine antitela u medijumu za kulturu tkiva, za karakterizaciju.
[0188]Da bi se prečistila humana monoklonska antitela, odabrani hibridomi mogu da rastu u dvolitarskim flakonima sa mehaničkom mešalicom za prečišćavanje monoklonksih antitela. Supernatanti mogu da se filtriraju i koncentuju pre afinitetne hromatografije na protein A-sefarozi (Pharmacia, Piscataway, N.J.). Eluirani IgG mogu da se provere elektroforezom na gelu i tečnom hromatografijom visokih performansi da bi se osigurala čistoća. Puferski rastvor može da se razmeni u PBS, i koncentracija može da se odredi pomoću OD280 korišćenjem koeficijenta ekstinkcije 1.43. Monoklonska antitela mogu da se alikvotiraju i uskladište na -80° C.
Generisanje transfektoma koji proizvode monoklonska antitela ove objave
[0189]Antitela ove objave mogu da se proizvedu i u transfektoma ćelijama-domaćinima uz korišćenje, na primer, kombinacije tehnika rekombinantne DNK i metoda transfekcije gena, kako je dobro poznato u struci (npr, Morrison, S. (1985) Science 229:1202).
[0190]Na primer, da bi se eksprimirala antitela ili njihovi fragmenti, DNK koje kodiraju delove ili cele lake i teške lance mogu da se dobiju standardnim tehnikama molekularne biologije (npr., PCR-amplifikacija ili kloniranje cDNA korišćenjem hibridoma koji eksprimira antitelo od interesa) i DNK mogu da se insertuju u ekspresione vektore tako da geni budu operativno povezani sa sekvencama koje kontrolišu transkripciju i translaciju. U ovom kontekstu, izraz "operativno povezan" treba da označi daje gen za antitelo povezan u vektoru tako da sekvence koje kontrolišu transkripciju i translaciju u vektoru obavljaju svoju funkciju regulacije transkripcije i translacije gena za antitelo. Ekspresioni vektor i ekspresione kontrolne sekvence, odabrani su tako da budu kompatibilni sa ćelijom-domaćinom koja se koristi. Gen lakog lanca antitela i gen teškog lanca antitela mogu da se insertuju u zasebni vektor ili, tipičnije, oba gena se insertuju u isti ekspresioni vekotr. Geni antitela insertuju se u ekspresioni vektor standardnim metodima (npr., ligacijom komplementarnih restrikcionih mesta na genskom fragmentu antitela i vektoru, ili povezivanjem ravnih dvolančanih krajeva, ako nisu prisutna restrikciona mesta). Varijabilni regioni lakog i teškog lanca antitela opisani u ovom tekstu mogu da se upotrebe za kreiranje gena antitela pune dužine svakog izotipa antitela, insertovanjem u ekspresione vektore koji već kodiraju konstantne regione lakih i teških lanaca željenog izotipa tako da je VHsegment operativno povezan sa CHsegmentom/segmentima unutar vektora i Vksegment je operativno povezan sa Clsegmentom unutar vektora. Dodatno ili alternativno, rekombinantni ekspresioni vekotor može da kodira signalni peptid koji olakšava sekreciju lanca antitela iz ćelije-domaćina. Gen za lanac antitela može da se klonira u vektor tako da signalni peptid bude povezan unutar okvira sa amino-terminusom gena za lanac antitela. Signalni peptid može da bude imunoglobulinski signalni peptid ili heterologi signalni peptid (tj., signalni peptid iz neimunoglobulinskog proteina).
[0191]Pored gena za lance antitela, rekombinantni ekspresioni vektori ove objave nose regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju gena za lance antitela u ćeliji-domaćinu. Izraz "regulatorna sekvenca" treba da uključi promotore, enhensere, kontrolne elemente (npr., poliadenilacione signale) koji kontrolišu transkripciju ili translaciju gena za lance antitela. Takve regulatorne sekvence opisane su, na primer, u Goeddel (Gene Expression Technologv. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA
(1990)). Stručnjak u oblasti će razumeti da dizajn ekspresionog vektora, uključujući izbor regulatornih sekvenci, može zavisiti od faktora kao što su izbor ćelije-domaćina koja će biti transformisana, nivoa ekspresije željenog proteina, itd. Poželjne regulatorne sekvence za ekspresiju u sisarskim ćelijama-domaćinima uključuju virusne elemente koji dovode do visokih nivoa ekspresije proteina u sisarskim ćelijama, kao što su promotori i/ili enhenseri izvedeni iz citomegalovirusa (CMV), Simijan virusa 40 (SV40), adenovirusa, (npr., adenovirusni glavni kasni promotor (adenovirus major late promoter, AdMLP) i polioma. Alternativno, mogu da se koriste nevirusne regulatorne sekvence, npr. ubikvitinski promotor ili (3-globinski promotor. Dodatno, mogu da se koriste regulatorni elementi sastavljeni od sekvenci iz različitih izvora, npr. SRa promotorski sistem koji sadrži sekvence iz SV40 ranog promotora i dugi terminalni ponovak virusa leukemije humanih T-ćelija tipl (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472).
[0192]Pored gena za lance antitela i regulatornih sekvenci, rekombinantni ekspresioni vektori ove objave mogu da nose dodatne sekvence kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćelijama-domaćinima (npr., početak replikacije) i selektabilne markerske gene. Selektabilni markerski geni olakšavaju selektovanje ćelija-domaćina u koje je vektor uveden (vidi, npr. U.S. Pat. No. 4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017, Axel et al., svi). Na primer, tipični selektabilni markerski gen daje ćeliji-domaćinu u koju je vektor uveden rezistenciju na lekove kao što su G418, higromicin ili metotreksat. Poželjni selektabilni markerski geni uključuju gen za dihidrofolat-reduktazu (dihvdrofolate reductase, DHFR) (za korišćenje u dhfr-ćelijama-domaćinima uz metotreksat selekciju/amplifikaciju) i neogen (za G418 selekciju). Za ekspresiju lakih i teških lanaca, ekspresioni vektor/vektori koji kodiraju teške i lake lance transfektuju se u ćeliju-domaćina standardnim tehnikama. Različiti oblici izraza "transfekcija" treba da obuhvate veliku raznovrsnost tehnika koje se obično koriste za uvođenje egzogene DNK u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju-domaćina, npr., elektroporacija, kalcijum-fosfat precipitacija, DEAE-dekstran transfekcija i slično. Iako je teorijski moguće da se antitela ove objave eksprimiraju u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama-domaćinima. ekspresija antitela u eukariotskim ćelijama, i najpoželjnije sisarskim ćelijama-domaćinima, najpoželjnija je jer eukariotske ćelije i, posebno, ćelije sisara verovatnije nego prokariotske ćelije sklapaju i sekretuju ispravno savijeno i imunološki aktivno antitelo. Saopšteno je da je prokariotska ekspresija gena za antitelo neefikasna za proizvodnju aktivnih antitela u visokom prinosu (Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunologv Today 6:12-13).
[0193]Poželjne sisarske ćelije-domaćini za ekspresiju rekombinantnih antitela ove objave uključuju ćelije ovarijuma kineskog hrčka (chinese hamster ovary, CHO ćelije)
(uključujući dhfr-CHO ćelije opisane u Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, upotrebljene sa DHFR selektabilnim markerom, npr., kako je opisano u R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621), NSO mijeloma ćelije, COS ćelije i SP2 ćelije. Posebno, za upotrebu sa NSO mijeloma ćelijama, drugi poželjni ekspresioni sistem je GS genski ekspresioni sistem objavljen u WO 87/04462 (Wilson), VVO 89/01036 (Bebbmgton) i EP 338,841 (Bebbington). Kada se rekombinantni ekspresioni vektori koji kodiraju gene antitela uvedu u sisarske ćelije-domaćine, antitela se proizvode kultivisanjem ćelija-domaćina onoliko vremena koliko je dovoljno da se omogući ekspresija antitela u ćelijama-domaćinima ili. poželjnije, sekrecija antitela u kultivacioni medijum u kojem ćelije-domaćini rastu. Antitela mogu
da se izoluju iz kultivacionog medijuma korišćenjem standardnih metoda prečišćavanja proteina.
Karakterizacija vezivanja antitela za antigen
[0194]Antitela ove objave mogu da se testiraju u pogledu vezivanja za CXCR4, na primer, standardnim metodima protočne citometrije. Pošto antitela ove objave poželjno prepoznaju CXCR4 u njegovoj nativnoj konformaciji unutar membrane, testiranje na vezivanje za CXCR4 poželjno se vrši testom (npr., protočna citometrija) koji koristi reagens koji eksprimira nativnu konformaciju CXCR4. Neograničavajući primeri reagenasa koji eksprimiraju nativnu konformaciju CXCR4 koji mogu da se koriste u testovima vezivanja uključuju ćelije koje prirodno eksprimiraju CXCR4 (npr., CEM ćelije), ćelije koje su transfektovane da eksprimiraju CXCR4 (npr., R1610 ćelije transfektovane CXCR4 ekspresionim vektorom) i lipozome u kojie je inkorporisan CXCR4 (npr., magnetni proteolipozomi u koje je inkorporisan CXCR4), od kojih je svaki opisan detaljnije u Primerima. Ukratko, za test protočnom citometrijom, ćelije koje eksprimiraju CXCR4 inkubiraju se sa testnim antitelom, isperu, inkubiraju sa obeleženim sekundarnim reagensom sposobnim za vezivanje sa testnim antitelom. ponovo isperu, i podvrgnu analizi za detektovanje vezivanja sekundarnog reagensa za ćelije (npr., korišćenjem FACS mašine). Poželjno, miševi koji razvijaju najviše titre, što se utvrđuje protočnom citometrijom, koristiće se za fuzije ili dalju selekciju antitela (npr., pretraživanjem biblioteka antitela napravljenih od B-ćelija miša, pomoću ispoljavanja na fagima).
[0195]Gore opisani test protočnom citometrijom može da se koristi i za traženje hibridoma koji pokazuju pozitivnu reaktivnost sa CXCR4 imunogenom. Hibridomi koji eksprimiraju antitela koja se vezuju sa visokim aviditetom za CXCR4, subkloniraju se i dalje karakterišu. Jedan klon iz svakog hibridoma, koji zadržava reaktivnost roditeljskih ćelija (prema protočnoj citometriji), može da se odabere za pravljenje ćelijske banke u 5-10 fiola uskladištenih na -140°C, i za prečišćavanje antitela.
[0196]Da bi se prečistila anti-CXCR4 antitelal, selektovani hibridomi mogu da rastu u dvolitarskim flakonima sa mehaničkom mešalicom za prečišćavanje monoklonskih antitela. Supernatanti mogu da se filtriraju i koncentruju pre afinitetne hromatografije na protein A-sefarozi (Pharmacia, Piscataway, NJ). Eluirani IgG mogu da se provere elektroforezom na gelu i tečnom hromatografijom visokih performansi, da bi se obezbedila čistoća. Puferski rastvor može da se promeni u PBS, i koncentracija može da se odredi pomoću OD280, korišćenjem koeficijenta ekstinkcije 1.43. Monoklonska antitela mogu da se alikvotiraju i uskladište na -80° C.
[0197]Da bi se odredilo da li se selektovana anti-CXCR4 monoklonska antitela vezuju za jedinstvene epitope, svako antitelo može da se biotinizuje korišćenjem komercijalno raspoloživih reagenasa (Pierce, Rockford, IL). Kompeticione studije u kojima se koriste neobeležena monoklonska antitela i biotinizovana monoklonska antitela mogu da se izvode korišćenjem ELISA testa za cele ćelije u kojem se ELISA ploče oblože ćelijama koje eksprimiraju CXCR4, i ispituje se sposobnost neobeleženog antitela da kompetira sa biotinizovanim antitelom u vezivanju sa ćelijama koje eksprimiraju CXCR4. Vezivanje biotinizovanog mAb može da se detektuje probom streptavidin-alkalna fosfataza. [01981Da bi se odredio izotip prečišćenih antitela, mogu da se obave izotipski ELISA testovi, korišćenjem reagenasa specifičnih za antitela određenog izotipa. Na primer, da bi se odredio izotip humanog monoklonskog antitela, bunarčići mikrotitarskih ploča mogu da se oblože 1 ug/ml anti-humanog imunoglobulina, preko noći, na 4°C. Posle blokiranja sa 1% BSA, ploče reaguju sa 1 ug/ml ili manje testnog monoklonskog antitela ili prečišćene izotipske kontrole, na temperaturi okoline, jedan do dva sata. Bunarčići zatim reaguju sa humanim IgGl ili humani-IgM-specifičnim, sa alkalnom fosfatazom konjugovanim probama. Ploče se razviju i analiziraju kako je opisano gore.
[0199]Anti-CXCR4 humani IgG mogu dalje da se testiraju u pogledu reaktivnosti sa CXCR4 antigenom pomoću Western blotting-a. Ukratko, CXCR4 može da se pripremi i podvrgne elektroforezi na natrijum-dodecilsulfat-poliakrilamidnom gelu. Posle elektroforeze, razdvojeni antigeni se prenesu na nitrocelulozne membrane, blokiraju 10% fetalnim telećim serumom, i ispituju monoklonskim antitelima koja će se testirati. Vezivanje humanog IgG može da se detektuje korišćenjem anti-humano IgG-alkalna fosfataza-antitela i razvije supstratnim tabletama BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.).
[0200]Specifičnost vezivanja antitela ove objave može da se odredi i praćenjem vezivanja antitela za ćelije koje eksprimiraju CXCR4, na primer protočnom citometrijom. Tipično, ćelijska linija, npr CHO ćelijska linija, može da se transfektuje ekspresionim vektorom koji kodira transmembransku formu CXCR4. Transfektovani protein može da sadrži obeleživač (tag) kao što je myc-tag, poželjno na N-terminusu, za detektovanje korišćenjem antitela na obeleživač. Vezivanje antitela ove objave za CXCR4 može da se odredi inkubiranjem transfektovanih ćelija sa antitelom i detektovanjem vezanog antitela. Vezivanje antitela za obeleživač na fransfektovanom proteinu može da se koristi kao pozitivna kontrola.
Imunokonjugati
[0201] U drugom aspektu, predmetna objava uvodi anti-CXCR4 antitelo, ili njegov fragment, konjugovane za terapijsku komponentu kao što je citotoksin, lek (npr., imunosupresant) ili radiotoksin. Takvi konjugati označeni su u ovom tekstu kao "imunokonjugati". Imunokonjugati koji uključuju jedan ili više citotoksina označeni su kao "imunotoksini." Citotoksin ili citotoksično sredstvo uključuje svako sredstvo koje je štetno za ćelije(npr., ubija ih). Primeri uključuju taksol, citohalazin B, gramicidin D, etidijum-bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi-antracin-dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol, i puromicin i njihove analoge ili homologe. Terapijska sredstva uključuju i, na primer, antimetabolite (npr., metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, 5-fluorouracil-dekarbazin), alkilirajuća sredstva (npr., mehloretamin, tioepa hlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU) i lomustin (CCNU), ciklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C, i cis-dihlorodiamin-platinu (II) (cis-dichlorodiamine platinum, DDP) cisplatin), anthracikline (npr., daunorubicin (ranije daunomicin) i doksorubicin), antibiotike (npr., daktinomicin (ranije aktinomicin), bleomicin, mitramicin, i antramicin (AMC)), : antimitotička sredstva (npr., vinkristin i vinblastin). [0202J Drugi poželjni primeri terapijskih citotoksina koji mogu da se konjuguju sa antitelima ove objave uključuju duokarmicine, kalihemicine, majtanzine i auristatine, i njihove derivate. Primer konjugata kalihemicin-antitelo je komercijalno dostupan (Mvlotarg<*>; American Home Products). |0203]Citotoksini mogu da se konjuguju sa antitelima ove objave korišćenjem tehnologije linkera, raspoložive u struci. Primeri tipova linkera koji se koriste za konjugovanje citotoksina sa antitelom uključuju, ali se ne ograničavaju na hidrazone, tioetre, estre, disulfide i linkere koji sadrže peptid. Linker može da se odabere tako da. na primer, bude osetljiv na sečenje niskim pH u lizozomskom kompartmentu ili osetljiv na sečenje proteazama, kao što su proteaze koje se preferencijalno eksprimiraju u tumorskom tkivu, kao što su katepsini (npr., katepsini B, C, D).
[0204]Za dalje razmatranje tipova citotoksina, linkera i metoda konjugovanja terapijskih sredstava sa antitelima, vidi i Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.
[0205]Antitela predmetne objave takođe mogu da se konjuguju sa radioaktivnim izotopom da bi se generisali citotoksični radiofarmaceutici, označeni i kao radioimunokonjugati. Primeri radioaktivnih izotopa koji mogu da budu konjugovani sa antitelima, za dijagnsotičku ili terapijsku upotrebu, uključuju, ali se ne ograničavaju na jod<131>, indijum"<1>, itrijum<90>i lutecijum<1>77.Metod pripremanja radioimunokonjugata utvrđen je u sstruci. Primeri radioimunokonjugata komercijalno su dostupni, uključujjući Zevalin<*>(IDEC Pharmaceuticals) i Bexxar® (Corixa Pharmaceuticals), i slični metodi mogu da se koriste za pripremanje radioimunokonjugata korišćenjem antitela ove objave.
[0206]Konjugati antitela ove objave mogu da se koriste za modifikovanje određenog biološkog odgovora, i ne treba shvatiti da je lekovita komponenta ograničena na klasična hemijska terapijska sredstva. Na primer, lekovita komponenta može da bude protein ili polipeptid koji ima željenu biološku aktivnost. Takvi proteini mogu uključivati, na primer, enzimski aktivan toksin ili njegov aktivni fragment, npr. abrin, ricin A, egzotoksin pseudomonasa ili toksin difterije; protein kao što je faktor nekroze tumora ili interferon-y; ili, modifikatore biološkog odgovora kao što su, na primer, limfokini, interleukin- 1 ("IL-1"), interleukin-2 ("IL-2"), interleukin-6 ("IL-6"), faktor stimulacije kolonija granulocita-makrofaga (granulocvte macrophage colonv stimulating factor, "GM-CSF"), faktor stimulacije kolonija granulocita (granulocvte colonv stimulating factor, "G-CSF"), ili drugi faktori rasta.
[0207]Tehnike konjugovanja takvih terapijskih komponenti sa antitelima dobro su poznate, vidi npr., Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapv", u Monoclonal Antibodies And Cancer Therapv, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Deliverv", u Controlled Drug Deliverv (2<nd>Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibodv Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapv: A Revievv", u Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985) "Analvsis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibodv In Cancer Therapv", u Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapv, Baldvvin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), i Thorpe et al., Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).
Bispecifični molekuli
[0208]U drugom aspektu, predmetna objava uvodi bispecifične molekule koji uključuju anti-CXCR4 antitelo, ili njegov fragment, ove objave. Antitelo ove objave, ili njegovi antigen-vezujući delovi, mogu da budu derivatizovani ili povezani sa drugim funkcionalnim molekulom, npr, drugim peptidom ili proteinom ( npr., drugo antitelo ili ligand za receptor), da bi se generisao bispecifični molekul koji se vezuje za najmanje dva različita vezna mesta ciljnih molekula. Antitelo ove objave može u stvari da bude derivatizovano ili povezano sa više nego jednim drugim funkcionalnim molekulom, da bi se generisali multispecifični molekuli koji se vezujvi za više od dva različita vezujuća mesta i/ili ciljna molekula; takvi multispecifični molekuli takođe su obuhvaćeni izrazom "bispecifični molekuli", kako se koristi u ovom tekstu. Da bi se stvorio bispecifični molekul ove objave, antitelo ove objave može da se funkcionalno poveže (npr, hemijskim kuplovanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnom asocijacijom ili na drugi način) sa jednim ili više drugih vezujućih molekula kao što su drugo antitelo, fragment antitela, peptid ili vezujući mimetik, tako da se dobije bispecifični molekul.
[0209]Prema tome, predmetna objava uključuje bispecifične molekule koji sadrže najmanje jednu prvu vezujuću specifičnost za CXCR4 i drugu vezujuću specifičnost za drugi ciljni epitop. U posebnoj formi ove objave, drugi ciljni epitop je Fc receptor, npr., humani FcyRI (CD64) ili humani Fca receptor (CD89). Prema tome, ova objava uključuje bispecifične molekule sposobne da se vezuju i za efektorske ćelije koje eksprimiraju FcyR ili FcaR (npr., monocite, makrofage ili polimorfonuklearne ćelije (polvmorphonuclear cells, PMN), i za ciljne ćelije koje eksprimiraju CXCR4. Ovi bispecifični molekuli kao cilj efektorskim ćelijama postavljaju ćelije koje eksprimiraju CXCR4 i pokreću Fc receptorom posredovane aktivnosti efektorskih ćelija, kao što su fagocitoza ćelija koje eksprimiraju CXCR4, ćelijama posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (antibodv dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC), oslobađanje citokina ili generisanje superoksid-anjona.
[0210]U formi ove objave u kojoj je bispecifični molekul multispecifičan, pored anti-Fc vezujuće specifičnosti i anti-CXCR4 vezujuće specifičnosti molekul može da uključuje još i treću vezujuću specifičnost. U jednoj formi, treća vezujuća specifičnost je antipojačavajući faktor-deo (anti-enhancement factor, EF), npr., molekul koji se vezuje za površinski protein uključen u citotoksičnu aktivnost pojačavajući time imunski odgovor protiv ciljne ćelije. "Antipojačavajući faktor-deo" može da bude antitelo, funkcionalni fragment antitela ili ligand koji se vezuje za dati molekul, npr., antigen ili receptor, i time rezultuje pojačavanjem efekta vezujućih determinanti za Fc receptor ili antigen ciljne ćelije. "Antipojačavajući faktor-deo" može da se veže za Fc receptor ili antigen ciljne ćelije. Alternativno, antipojačavajući faktor-deo može da se veže za entitet koji je različit od entiteta za koji se vezuju prva i druga specifičnost. Na primer, antipojačavajući faktor-deo može da se veže za citotoksičnu T-ćeliju (npr. preko CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 ili druge imunske ćelije, što za rezultat ima povećani imunski odgovor protiv ciljne ćelije).
[0211]U jednoj formi, bispecifični molekuli ove objave sadrže kao vezujuću specifičnost najmanje jedno antitelo, ili fragment istog, uključujući, npr., Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, dAb ili jednolančani Fv. Antitelo može da bude i lakolančani ili teškolančani dimer, ili bilo koji njihov minimalni fragment, npr Fv ili jednolančani konstrukt, kako je opisano u U.S. Patent No. 4,946,778, Ladner et al. 102121U jednoj formi, vezujuća specifičnost za Fcy receptor obezbeđena je monoklonskim antitelom čije vezivanje nije blokirano humanim imunoglobulinom G (IgG). Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "IgG receptor" odnosi se na bilo koji od osam gena za v-lanac, lociranih na hromozomu 1. Ovi geni kodiraju ukupno dvanaest transembranskih ili solubilnih receptorskih izoforrni koje su grupisane u tri Fcy receptorske klase: FcyRI (CD64), FcyRlI(CD32), i FcyRIII (CD16). U jednoj poželjnoj formi, Fcy receptor je humani visokoafinitetni FcyRI. Humani FcyRI je molekul od 72 kDa, koji pokazuje visok afinitet za monomerni IgG (IO<8>- IO<9>M"<1>).
[0213]Proizvodnja i karakterizacija određenih poželjnih anti-Fcy monoklonskih antitela opisane su u PCT Publication WO 88/00052 i u U.S. Patent No. 4,954,617, Fanger et al.
[0214]Ova antitla vezuju se za epitop na FcyRI, FcyRII ili FcyRIII, na mestu koje je različito od Fcy-vezujućeg mesta receptora tako da se njihovo vezivanje suštinski ne blokira fiziološkim nivoima IgG. Specifična anti-FcyRI antitela korisna u ovoj objavi su mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 i mAb 197. Hibridoma koji proizvodi mAb 32 je dostupan od American Type Culture Collection, ATCC Accession No. HB9469. U drugim formama, anti-Fcy receptorsko antitelo je humanizovana forma monoklonskog antitela 22 (H22). Proizvodnja i karakterizacija H22 antitela opisane su u Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 i PCT Publication WO 94/10332, Tempest et al.. Ćelijske linije koje proizvode H22 antitelo deponovane su u American Type Culture Collection pod oznakom HA022CL1 i imaju pristuni br. CRL 11177.
[0215]U drugim poželjnim formama, vezujuća specifičnost za Fc receptor obezbeđena je antitelom koje se vezuje za humani IgA receptor, npr., Fc-alfa receptor (FcaRI (CD89)), čije vezivanje se poželjno ne blokira humanim imunoglobulinom A (IgA). Izraz "IgA receptor" treba da uključi genski proizvod jednog a-gena (FcaRI) lociranog na hromozomu 19. Poznato je da ovaj gen kodira nekoliko alternativno splajsovanih transmembranskih izoforrni od 55 do 110 kDa. FcaRI (CD89) se konstitutivno eksprimira na monocitima/makrofagima, eozinofllnim i neutrofilnim granulocitima, ali ne na neefektorskim ćelijskim populacijama. FcaRI ima srednji afinitet (= 5 x 107 M~') za IgAl i IgA2, koji se povećava posle izlaganja citokinima kao što su G-CSF ili GM-CSF (Morton, H.C. et al. (1996) Critical Revievvs in Immunology 16:423-440). Opisana su četiri FcaRI-specifična monoklonska antitela identifikovana kao A3, A59, A62 i A77, koja se vezuju za FcaRI izvan IgA ligand-vezujućeg domena (Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol. 148:1764).
[0216]FcaRI i FcyRI su poželjni receptori-okidači za upotrebu u bispecifičnim molekulima ove objave zato što se (1) eksprimiraju primarno na imunskim efektorskim ćelijama, npr., monocitima, PMN, makrofagima i dendritskim ćelijama; (2) eksprimiraju se u visokim nivoima (npr., 5 000-100 000 po ćeliji); (3) medijatori su citotoksičnih aktivnosti (npr., ADCC, fagocitoza); i (4) posreduju u pojačanoj antigen-prezentaciji antigena, uključujući sopstvene antigene, koji su im ciljevi.
[0217]Iako su humana monoklonska antitela poželjna, druga antitela koja mogu da se koriste u bispecifičnim molekulima ove objave su mišja, himerna i humanizovana monoklonska antitela. [0218JBispecifični molekuli predmetne objave mogu da se pripreme konjugovanjem konstituentnih vezujućih specifičnosti, npr., anti-FcR i anti-CXCR4 vezujućih specifičnosti, korišćenjem metoda poznatih u struci. Na primer, svaka vezujuća specifičnost bispecifičnog molekula može da se generiše zasebno i zatim da se konjuguju jedna sa drugom. Kada su vezujuće specifičnosti proteini ili peptidi, za kovalentnu konjugaciju mogu da se koriste različita kuplujuća ili unakrsno povezujuća sredstva. Primeri unakrsno povezujućih sredstava uključuju protein A, karbodiimid, N-sukcinimidil-S-acetiltioacetat (SATA), 5,5<T->ditiobis(2-nitrobenzoevu kiselinu) (DTNB), o-fenilendimaleimid (oPDM), N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat (SPDP), i sulfosukcinimidil 4-(N-maleimidometil) ciklohaksan-1-karboksilat (sulfo-SMCC) (vidi npr., Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Drugi metodi uključuju one koji su opisani u Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83, i Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Poželjna konjugujuća sredstva su SATA i sulfo-SMCC, oba se mogu nabaviti od Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
[0219]Kada su vezujuće specifičnosti antitela, ona mogu da se konjuguju sulfhidrilnim povezivanjem zglobnih regiona C-terminusa dva teška lanca. U posebno poželjnoj formi, zglobni region se modifikuje tako da sadrži neparan broj sulfhidrilnih rezidua, poželjno jednu, pre konjugacije.
[0220]Alternativno, obe vezujuće specifičnosti mogu da budu kodirane u istom vektoru i da se eksprimiraju i sklapaju u istoj ćeliji-domaćinu. Ovaj metod je posebno koristan kada je bispecifični molekul mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab")2ili ligand x Fab fuzioni protein. Bispecifični molekul ove objave može da bude jednolančani molekul koji sadrži jednolančano antitelo i vezujuću determinantu, ili jednolančani bispecifični molekul koji sadrži dve vezujuće determinante. Bispecifični molekuli mogu da sadrže najmanje dva jednolančana molekula. Metodi pripremanja bispecifičnih molekula opisani su na primer u U.S. Patent Number 5,260,203; 5,455,030; 4,881,175; 5,132,405; 5,091,513; 5,476,786; 5,013,653; 5,258,498; i 5,482,858.
[0221]Vezivanje bispecifičnih molekula za specifične ciljeve može da se potvrdi na primer, enzimskim imunotestom (enzvme-linked immunosorbent assay, ELISA), radioimunotestom (RIA), FACS analizom, bioesejima (npr., inhibicija rasta), ili Western blot testom. Svaki od ovih testova uopšteno detektuje prisustvo kompleksa protein-antitelo od posebnog interesa, korišćenjem obeleženog reagensa (npr, antitelo) specifičnog za kompleks od interesa. Na primer, kompleksi FcR-antitelo mogu da se detektuju korišćenjem npr., za enzim vezanog antitela ili fragmenta antitela koji prepoznaje i specifično se vezuje za komplekse antitelo-FcR. Alternativno, kompleksi mogu da se detektuju korišćenjem nekog od drugih različitih imunotestova. Na primer, antitelo može da se radioaktivno obeleži i da se koristi u radioimunoeseju (RIA) (vidi, na primer, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassavs, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986).
[0222]Radioaktivni izotop može da se detektuje može da se detektuje načinom kao što je korišćenje y-brojača ili scincilacionog brojača ili autoradiografijom.
Farmaceutske smeše
[0223]U drugom aspektu, predmetna objava obezbeđuje smešu, npr., farmaceutsku smešu koja sadrži jedno ili kombinaciju monoklonskih antitela, ili antigen-vezujući deo/delove istih, predmetne objave, formulisane zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Takve smeše mogu uključivati jedno ili kombinaciju (npr., dva ili više različitih) antitela, ili imunokonjugate ili bispecifične molekule ove objave. Na primer, farmaceutska smeša ove objave može da sadrži kombinaciju antitela (ili imunokonjugata ili bispecifičnih molekula) koja se vezuju za različite epitope na ciljnom antigenu ili imaju komplementarne aktivnosti.
[0224]Farmaceutske smeše ove objave mogu da se primenjuju i u kombinacionoj terapiji, tj., u kombinaciji sa drugim sredstvima. Na primer, kombinaciona terapija može da uključuje anti-CXCR4 antitelo predmetne objave kombinovano sa najmanje jednim drugim antizapaljenskim ili imunosupresivnim sredstvom. Primeri terapijskih sredstava koja mogu da se koriste u kombinacionoj terapiji opisani su detaljnije dole u odeljku o upotrebama antitela ove objave.
[0225] Kako se koristi u ovom tekstu, "farmaceutski prihvatljivi nosač" uključuje svaki i sve rastvarače, disperzione medijume, sredstva za oblaganje, antibakterijska i antigljivična sredstva, izotonična sredstva i odlažuća sredstva i slično, koja su fiziološki kompatibilna. Poželjno, nosač je pogodan za intravensku, intramuskularnu, subkutanu. parenteralnu, spinalnu ili epidermalnu primenu (npr., injekcijom ili infuzijom). Zavisno od puta primene, aktivno jedinjenje, tj., antitelo, imunokonjugat ili bispecifični molekul, mogu da se ogrnu u materijal da bi se jedinjenje zaštitilo od delovanja kiselina i drugih prirodnih uslova koji mogu da inaktiviraju jedinjenje.
[0226] Farmaceutska jedinjenja mogu uključivati jednu ili više farmaceutski prihvatljivih soli. "Farmaceutski prihvatljiva so" odnosi se na so koja zadržava željenu biološku aktivnost roditeljskog jedinjenja i ne daje bilo kakve neželjene toksikološke efekte (vidi npr., Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Primeri takvih soli uključuju kisele adicione soli i bazne adicione soli. Kisele adicione soli uključuju one koje su izvedene iz netoksičnih neorganskih kiselina kao što su hlorovodonična, azotna, fosforna, sumporna, bromovodonična. jodovodonična, fosforasta i slično, kao i iz netoksičnih organskih kiselina kao što su alifatične mono- i dikarboksilne kiseline, fenil-supstituisane alkanske kiseline, hidroksi-alkanske kiseline, aromatične kiseline, alifatične i aromatične sulfonske kiseline i slično. Bazne adicione soli uključuju one koje su izvedene iz zemno-alkalnih metala kao što su natrijum, kalijum, magnezijum, kalcijum i slično, kao i iz netoksičnih organskih amina kao što su N,N'-dibenziletilendiamin, N-metilglukamin, hloroprokain, holin, dietanolamin, etilendiamin, prokain i slično. |0227] Farmaceutska smeša ove objave može uključivati i farmaceutski prihvatljivi antioksidant. Primeri farmaceutski prihvatljivih antioksidanata uključuju: (1) antioksidante rastvorljive u vodi, kao što su askorbinska kiselina, cistein-hidrhlorid, natrijum-bisulfat, natrijum-metabisulfit, natrijum-sulfit i slično; (2) antioksidante rastvorive u ulju, kao što su askorbil-palmitat, butilisani hidroksianizol (BHA), butilisani hidroksitoluen (BHT), lecitin, propil-galat, alfa-tokoferol, i slično; i (3) metal-helirajuća sredstva kao što su limunska kiselina, etilendiamin-tetrasirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, vinska kiselina, fosforna kiselina i slično.
[0228]Primeri pogodnih vodenih i nevodenih nosača koji mogu da se koriste u farmaceutskim smešama ove objave uključuju vodu, etanol, poliole (kao glicerol, propilen-glikol, polietilen-glikol, i slično) i njihove pogodne mešavine, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje i injektabilne organske estre, npr. etil oleat. Dobra fluidnost može da se održi, na primer, upotrebom materijala za oblaganje kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija i upotrebom surfaktanata.
[0229J Ove smeše mogu da sadrže i adjuvanse kao što su prezervansi, vlažeća sredstva, emulgujuća sredstva i dispergujuća sredstva. Prevencija prisustva mikroorganizama može da se osigura postupcima sterilizacije, gore, i inkluzijom različitih antibakterijskih i antigljivičnih sredstava, na primer, parabena, hlorobutanola, fenol-sorbinske kiseline i slično. Može biti takođe poželjno da se u kompozicije uključe izotonična sredstva, kao što su šećeri, natrijum-hlorid i slično. Pored toga produžena apsorpcija injektabilnog farmaceutskog oblika može da se ostvari uključivanjem sredstava koja odlažu apsorpciju kao što su aluminijum-monostearat i želatin.
[0230J Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za pripremanje sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija neposredno pre primene. Upotreba takvih medijuma i sredstava za farmaceutski aktivne supstance poznata je u struci. Osim ukoliko se zna da su neki konvencionalni medijum ili sredstvo inkompatibilni sa aktivnim jedinjenjem, razmatra se njihova upotreba u farmaceutskim smešama ove objave. Suplementarna aktivna jedinjenja takođe mogu da se inkorporišu u smeše.
[0231] Terapijske smeše tipično moraju da budu sterilne i stabilne pod uslovima izrade i skladištenja. Smeša može da sc formuliše kao rastvor, mikroemulzija, lipozom ili druga uređena struktura pogodna za visoko koncentrisanje leka. Nosač može da bude rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer. vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen-glikol i tečni polietilen-glikol i slično) i njihove pogodne mešavine. Dobra fluidnost može da se održi, na primer, upotrebom materijala za oblaganje kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija i upotrebom surfaktanata. U mnogim slučajevima, biće poželjno uključivanje izotoničnih sredstava, na primer šećera, polialkohola kao što su manitol, sorbitol, ili natrijum-hlorida u smešu. Produžena apsorpcija injektabilnih smeša može da se postigne uključivanjem u smešu sredstva koje odlaže apsorpciju, na primer monostearatnih soli i želatina.
[0232]Sterilni injektabilni rastvori mogu da se pripreme inkorporisanjem aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom sastojaka nabrojanih gore, po potrebi, praćeno sterilizacionom mikrofiltracijom. Obično, disperzije se pripremaju inkorporisanjem aktivnog jedinjenja u sterilni prenosnik koji sadrži bazični disperzioni medijum i potrebne druge sastojke od gore nabrojanih. U slučaju sterilnih praškova za pripremanje sterilnih injektabilnih rastvora, poželjni metodi pripremanja su sušenje pod vakuumom i sušenje zamrzavanjem (liofilizacija), koji daju prah aktivnih sastojaka i svaki željeni dodatni sastojak iz prethodnog sterilno filtriranog rastvora istog.
[0233] Količina aktivnog sastojka koja može da se kombinuje sa nosačkim materijalom da bi se proizvela jedna dozna forma, variraće u zavisnosti od subjekta koji se leči, i posebnog modaliteta primene. Količina aktivnog sastojka koja može da se kombinuje sa nosačkim materijalom da bi se proizvela jdna dozna forma obično će biti ona količina smeše koja proizvodi terapijski efekat. Obično, od sto procenata, ova količina će biti u opsegu od oko 0.01 procenta do oko devedeset devet procenata aktivnog sastojka, poželjno od oko 0.1 procenta do oko 70 procenata, najpoželjnije od oko 1 procenta do oko 30 procenata aktivnog sastojka u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljvim prenosnikom.
[0234] Dozni režimi podešavaju se tako da obezbede optimalni željeni odgovor (npr., terapijski odgovor). Na primer, jedan bolus može da se primeni, nekoliko podeljenih doza mogu da se primene tokom vremena, ili doza može srazmerno da se smanjuje ili povećava kako zahteva hitnost terapijske situacije. Posebna je prednost formulisati parenteralne smeše u jediničnoj doznoj formi za laku primenu i uniformnost doziranja. Jedinična dozna forma, kako se koristi u ovom tekstu, označava fizički zasebne jedinice pogodne za jedno doziranje subjekta koji se leči; svaka jedinica sadrži prethodno određenu količinu aktivnog jedinjenja za koju je izračunato da proizvodi željeni terapijski efekat, zajedno sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifikacija za jedinične dozne forme ove objave određena je i direktno zavisi od (a) jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i posebnog terapijskog efekta koji treba da se postigne i (b) ograničenja inherentnih struci spravljanja jedinjenja kao što je aktivno jedinjenje za lečenje senzitivnosti kod osoba.
[0235]Za primenu antitela, dozni opsezi su od oko 0.0001 do 100 mg/kg, i uobičajenije 0.01 do 5 mg/kg, telesne težine domaćina. Na primer, doze mogu da budu 0.3 mg/kg telesne težine, 1 mg/kg telesne težine, 3 mg/kg telesne težine, 5 mg/kg telesne težine ili 10 mg/kg telesne težine ili u opsegu od 1-10 mg/kg. Primer režima lečenja podrazumeva primenu jednom nedeljno, jednom svake dve nedelje, jednom svake tri nedelje, jednom svake četiri nedelje, jednom mesečno, jednom svaka 3 meseca ili jednom svakih 3 do 6 meseci. Poželjni dozni režimi za anti-CXCR4 antitelo ove ove objave uključuju 1 mg/kg telesne težine ili 3 mg/kg telesne težine, intravenskom primenom, s tim da se antitelo daje korišćenjem jednog od sledećih rasporeda doziranja: (i) svake četiri nedelje za šest doza, zatim svaka tri meseca; (ii) svake tri nedelje; (iii) 3 mg/kg telesne težine zatim 1 mg/kg telesne težine svake tri nedelje.
[0236]U nekim metodima, dva ili više monoklonskih antitela sa različitim vezujućim specifičnostima primenjuju se simultano, u kom slučaju je doziranje svakog antitela u navedenim opsezima. Antitelo se obično primenjuje u više navrata. Intervali između pojedinačnih doza mogu da budu, na primer, nedeljno, mesečno, svaka tri meseca ili godišnje. Intervali mogu da budu i neregularni, što se određuje merenjem u krvi nivoa antitela za ciljni antigen kod pacijenta. U nekim metodima, doza se podešava tako da se postigne koncentracija antitela u plazmi od oko 1-1000 p.g/ml a u nekim metodima oko 25-300 ng /ml.
[0237]Alternativno, antitelo može da se primeni kao formulacija sa produženim oslobađanjem, u kom slučaju je potrebna manje česta primena. Doza i frekvencija variraće u zavisnosti od poluživota antitela u pacijentu. Uglavnom, humana antitela pokazuju najduži poluživot, zatim slede humanizovana antitela, himerna antitela i nehumana antitela. Doza i frekvencija primene variraće u zavisnosti od toga da li je tretman profilaktički ili terapijski. U profilaktičkim primenama, relativno niska doza primenjuje se u relativno retkim intervalima, tokom dugog vremenskog perioda. Neki pacijenti nastavljaju da primaju tretman doživotno. U terapijskim primenama, ponekad je potrebna relativno visoka doza u relativno kratkim intervalima, dok se ne smanji ili zaustavi napredovanje bolesti i poželjno dok pacijent ne pokaže delimično ili potpuno ublažavanje simptoma bolesti. Posle toga pacijent može da prima profilaktički režim.
[0238]Aktuelni dozni nivoi aktivnih sastojaka u farmaceutskim smešama predmetne objave mogu varirati tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je efikasna za dostizanje željenog terapijskog odgovora za posebnog pacijenta, smešu i način primene, bez toksičnosti po pacijenta. Odabrani dozni nivo zavisiće od različitih farmakokinetičkih faktora, uključujući aktivnost određenih smeša predmetne objave koje se koriste, ili njihovih estara, soli ili amida, puta primene, vremena primene, stope ekskrecije određenog jedinjenja koje je upotrebljeno. dužine tretmana, drugih lekova, starosti, pola, težine, stanja, opšteg zdravstvenog stanja i prethodne medicinske istorije pacijenta koji se leči, i sličnih faktora poznatih u medicinskoj struci.
[0239] "Terapijski efikasna doza" anti-CXCR4 antitela ove objave poželjno rezultuje smanjenjem jačine simptoma bolesti, povećanjem frekvencije i dužine perioda u kojima nema simptoma bolesti, ili sprečavanjem ometenosti ili onesposobljenosti usled napada bolesti. Na primer, za lečenje CXCR4<+>tumora, "terapijski efikasna doza" poželjno inhibira rast ćelija ili rast tumora za najmanje oko 20%, poželjnije za najmanje oko 40%, još poželjnije za najmanje oko 60% i još poželjnije za najmanje oko 80% u odnosu na nelečene subjekte. Sposobnost jedinjenja da inhibira rast tumora može da se evaluira u animalnim model-sistemima što je prediktivno za efikasnost u tumorima kod ljudi. Alternativno, ova osobina smeše može da se evaluira ispitivanjem sposobnosti jedinjenja da inhibira rast ćelija, takva inhibicija može da se meriin vitrotestovima poznatim obučenom praktičaru. Terapijski efikasna količina terapijskog jedinjenja može da smanji veličinu tumora ili da na drugi način ublaži simptome kod subjekta. Uobičajeno obučeni stručnjak u oblasti trebalo bi da bude u stanju da odredi takve količine na osnovu faktora kao što su veličina subjekta, jačina simptoma kod subjekta i odabrana smeša ili put primene.
[0240] Smeša predmetne objave može da se primeni preko jednog ili više puteva primene korišćenjem jednog ili više različitih metoda poznatih u struci. Kako će razumeti obučeni stručnjak, put i/ili način primene variraće u zavisnosti od željenih rezultata. Poželjni putevi primene antitela ove objave uključuju intravenski, intramuskularni, intradermalni, intraperitonealni, subkutani, spinalni ili druge parenteralne puteve primene, na primer, injekcijom ili infuzijom. Izraz "parenteralna primena", kada se koristi u ovom tekstu, označava puteve primene različite od encteralne i površinske primene, obično putem injekcije, i uključuje, bez ograničenja intravensku, intramuskularnu, intraarterjsku, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, epiduralnu i intrasternalnu injekciju i infuziju. [02411Alternativno, antitelo ove objave može da se primeni neparenteralnim putem, na primer, površinskim, epidermalnim ili mukoznim putem primene, na primer, intranazalno, oralno, vaginalno, rektalno, sublingvalno ili površinski.
[0242]Aktivna jedinjenja mogu da se pripreme sa nosačima koji će jedinjenje zaštiti od brzog oslobađanja, npr. formulacije sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante, transdermalne flastere i mikroinkapsulirane dostavne sisteme. Mogu da se koriste biodegradabilni, biokompatibilni polimeri, kao što su etilen-vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polilaktična kiselina. Mnogi metodi pripremanja takvih formulacija patentirani su ili su opšte poznati stručnjacima u oblasti. Vidi npr., Sustained and Controlled Release Drug Deliverv Svstems, j.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
[0243]Terapijske smeše mogu da se primene uz medicinske uređaje poznate u struci. Na primer, u poželjnoj formi, terapijska smeša ove objave može da se primeni pomoću uređaja za hipodermalno injektiranje bez. igle. kao što su uređaji objavljeni u U.S. Patent No. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; ili 4,596,556. Primeri dobro poznatih implanata i modula korisnih u predmetnoj objavi uključuju: U.S. Patent No. 4,487,603, koji objavljuje implantabilnu mikroinfuzionu pumpu za dispendovanje leka uz kontrolisanu stopu; U.S. Patent No. 4,486,194, koji objavljuje terapijski uređaj za primenu lekova kroz kožu; U.S. Patent No. 4,447,233, koji objavljuje imfuzionu pumpu za lekove, za dostavljanje leka sa preciznom stopom infuzije; U.S. Patent No. 4,447,224, koji objavljuje implantabilni infuzioni aparat sa promenljivim protokom, za kontinuiranu dostavu leka; U.S. Patent No. 4,439,196, koji objavljuje osmotski sistem za dostavu leka sa više kompartmenata; i U.S. Patent No. 4,475,196, koji objavljuje osmotski sistem za dostavu leka. Mnogi drugi takvi implanti, dostavni sistemi i moduli poznati su stručnjacima u oblasti. |0244]U nekim formama, humana monoklonska antitela ove objave mogu da se formulišu tako da se osigura dobra distribucijain vivo.Na primer, krvno-moždana barijera (blood-brain barrier, BBB) isključuje mnoga visoko hidrofilna jedinjenja. Da bi se osiguralo da teapijska jedinjenja ove objave pređu BBB (po želji), ona mogu da se formulišu, na primer, u lipozome. O metodima izrade lipozoma vidi, npr., U.S. Patents
4,522,811; 5,374,548; i 5,399,331. Lipozomi mogu da sadrže jednu ili više komponenti koje se selektivno transportuju u specifične ćelije ili organe, čime se pojačava ciljana dostava leka (vidi npr., V.V. Ranade (1989) J. Clin. Phannacol. 29:685). Primeri ciljajućih komponenti uključuju folat ili biotin (vidi npr., U.S. Patent 5,416,016, Lovv et al.); manozide (Umezavva et al., (1988) Biochem. Biophvs. Res. Commun. 153:1038); antitela (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Ovvais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); surfaktantni protein A receptor (Briscoe et al.
(1995) Am. J. Phvsiol. 1233:134); pl20 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); vidi i K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.
Upotrebe i metodi
[0245]Antitela, posebno humana antitela, smeše antitela i metodi predmetne objave imaju brojnein vitroiin vivodijagnostičke i terapijske upotrebe koje uključuju dijagnozu i lečenje poremećaja posredovanih CXCR4. Na primer, ovi molekuli mogu da se primene na ćelijama u kulturi,in vitroiliex vivo,ili na humanim subjektima, npr.,in vivo,za lečenje, prevenciju i dijagnostikovanje različitih poremećaja. Kako se koristi u ovo tekstu, izraz "subjekt" treba da uključi čoveka i nehumane životinje. Nehumane životinje uključuju sve vertebrate, npr., sisare i nesisare, kao što su nehumani primati, ovce, psi, mačke, krave, konji, kokoške, vodozemci i gmizavci. Poželjni subjekti uključuju humane pacijente koji imaju poremećaje posredovane ili modulisane aktivnošću CXCR4 ili u koje je uključen CXCR4/SDF-1 put. Kada se antitela na CXCR4 primene zajedno sa drugim sredstvom, ova dva se mogu primeniti bilo kojim redom ili istovremeno.
[0246]S obzirom na specifično vezivanje antitela ove objave za CXCR4, antitela ove objave mogu da se koriste za specifično detektovanje ekspresije CXCR4 na površini ćelija i, pored toga, za prečišćavanje CXCR4 imunoafinitetnim prečišćavanjem.
[0247]Pogodni putevi primenjivanja smeša antitela (npr., humana monoklonska antitela, multispecifični i bispecifični molekuli i imunokonjugati) ove objavein vivoiin vitrodobro su poznati u struci i može ih odabrati prosečno obučeni stručnjak. Na primer, smeše antitela mogu da se primene injekcijom (npr., intravenskom ili subkutanom). Pogodne upotrebljene doze molekula zavisiće od starosti i težine subjekta i koncentracije i/ili formulacije smeše antitela.
[0248] Kao što je ranije opisano, humana anti-CXCR4 antitela ove objave mogu da se primenjuju uporedo sa jednim ili više drugih terapijskih sredstava, npr., citotoksičnim sredstvom, radiotoksičnim sredstvom ili imunosupresivnim sredstvom. Antitelo može da bude povezano sa sredstvom (kao imunokompleks) ili može da se daje odvojeno od sredstva. U drugom slučaju, (odvojena primena), antitelo može da se daje pre, posle ili istovremeno sa sredstvom ili može da se daje uporedo sa drugim poznatim terapijam, npr., antikancerskom terapijom, npr., zračenjem. Takva terapijska sredstva uključuju, između ostalih, antineoplastična sredstva kao što su doksorubicin (adriamicin), cisplatin, bleomicin-sulfat, karmustin, hlorambucil i ciklofosfamid-hidroksirea, koji su, kad se daju sami, efikasni jedino u nivoima koji su toksični ili subtoksični za pacijenta. Cisplatin se intravenski primenjuje u dozi od 100 mg/kg jednom svake četiri nedelje, a adriamicin se intravenski primenjuje u dozi od 60-75 mg/ml jednom na 21 dan. Uporedo davanje humanih anti-CXCR4 antitela, ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata, predmetne objave sa hemoterapijskim sredstvima obezbeđuje dva antikancerska sredstva koja deluju različitim mehanizmima, čime se ostvaruje citotoksičan efekat na humanim tumorskim ćelijama. Takva uporeda primena može da reši probleme razvoja rezistencije na lekove ili promene antigenosti tumorskih ćelija koje bi ih učinile nereaktivnim na antitela.
[0249] Za cilj specifične efektorske ćelije, npr., efektorske ćelije povezane sa smešama (npr., humanim antitelima, multispecifičnim i bispecifičnim molekulima) ove objave takođe mogu da se koriste kao terapijska sredstva. Efektorske ćelije za ciljanje mogu da budu humani leukociti kao što su makrofagi, neutrofili ili monociti. Druge ćelije uključuju eozinofile, ćelije prirodne ubice i druge ćelije koje nose receptore za IgG ili IgA. Po želji, efektorske ćelije mogu da se dobiju od subjekta koji će se lečiti. Za cilj specifične efektorske ćelije mogu da se primene u vidu suspenzije ćelija u fiziološki prihvatljivom rastvoru. Broj primenjenih ćelija može da bude reda veličine 10<8->10<9>, ali će varirati u zavisnosti od terapijske svrhe. Uopšteno. količina će biti dovoljna za postizanje lokalizacije na ciljnoj ćeliji, npr., tumorskoj ćeliji koja eksprimira CXCR4, i dovešće do ubijanja ćelije, npr., fagocitozom. Putevi primene takođe mogu da variraju.
[0250]Lečenje sa efektorskim ćelijama specifičnim za cilj može da se izvede zajedno sa drugim tehnikama uklanjanja ciljanih ćelija. Na primer, antitumorska terapija uz korišćenje smeša (npr., humanih antitela, multispecifičnih i bispecifičnih molekula) ove objave i/ili efektorskih ćelija "naoružanih" ovim smešama može da se koristi zajedno sa hemoterapijom. Dodatno, kombinovana imunoterapija može da se koristi za usmeravanje dve različite citotoksične efektorske populacije prema odbacivanju tumorske ćelije. Na primer, anti-CXCR4 antitela povezana sa anti-Fc-gama Rl ili anti-CD3 mogu da se koriste zajedno sa IgG- ili IgA-receptor specifičnim vezujućim sredstvima.
[0251]Bispecifični i multispecifični molekuli ove objave mogu da se koriste i za modulisanje FcyR ili nivoa FcyR na efektorskim ćelijama, na primer kaptiranjem i eliminisanjem receptora na površini ćelije. Mešavine anti-Fc receptora takođe mogu da se koriste u ovu svrhu.
[0252]Smeše (npr., humana, humanizovana ili himerna antitela, multispecifični i bispecifični molekuli i imunokonjugati) ove objave, koji imaju mesta za vezivanje komplementa, kao što su delovi IgGl, -2, ili -3 ili IgM koji vezuju komplement, mogu da se koriste i u prisustvu komplementa. U jednoj formi,ex vivotretiranje populacije ćelija koje uključuju ciljne ćelije, vezujućim sredstvom ove objave i odgovarajućim efektorskim ćelijama može da se dopuni dodavanjem komplementa ili seruma koji sadrži komplement. Fagocitoza ciljnih ćelija obloženih vezujućim sredstvom ove objave može da se poboljša vezivanjem proteina komplementa. U drugoj formi, ciljne ćelije obložene smešama (npr., humanim antitelima, multispecifičnim i bispecifičnim molekulima) ove objave mogu i da se liziraju komplementom. U još jednoj formi, smeše ove objave ne aktiviraju komplement.
[0253] Smeše (npr., humana, humanizovana ili himerna antitela, multispecifični i bispecifični molekuli i imunokonjugati) ove objave mogu da se primene zajedno sa komplementom. Prema tome, ova objava obuhvata smeše koje sadrže humana antitela, multispecifične ili bispecifične molekule i serum ili komplement. Ove smeše su pogodne zbog toga što je komplement lociran blizu humanih antitela, multispecifičnih ili bispecifičnih molekula ove objave i komplement ili serum mogu da se primene zasebno.
[0254]Antitela ove objave mogu da se koriste u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapijskih antitela ili drugih vezujućih sredstava, kao što su Ig fuzioni proteini. Neograničavajući primeri drugih antitela ili vezujućih sredstava sa kojima anti-CXCR4 antitelo ove objave može da se primeni u kombinaciji uključuju antitela ili vezujuća sredstva za CTLA-4, PSMA, CD30, IP-10, IFN-y, CD70, PD-1, PD-L1, TNF, TNF-R, VEGF, VEGF-R, CCR5, IL-1, IL-18, IL-18R, CD19, Campath-1, EGFR, CD33, CD20, Her-2, CD25, gpIIb/IIIa, IgE, CD1 la, a4 integrin, IFNa i IFNAR1.
[0255]U okviru predmetne objave su i kitovi koji sadrže smeše antitela ove objave (npr., humana antitela, bispecifične ili multispecifične molekule ili imunokonjugate) i uputstva za upotrebu. Kit može da sadrži i jedan ili više dodtnih reagenasa, na primer imunosupresivni reagens, citotoksično sredstvo ili radiotoksično sredstvo, ili jedno ili više dodatnih humanih antitela ove objave (npr., humano antitelo koje ima komplementarnu aktivnost koje se vezuje za epitop na CXCR4 antigenu različit od prvog humanog antitela). [0256JPrema tome. pacijenti koji se leče smešama antitela ove objave mogu dodatno da primaju (pre, istovremeno ili posle primanja antitela ove objave) drugo terapijsko sredstvo kao što je citotoksično ili radiotoksično sredstvo, koje pojačava ili povećava terapijski efekat humanih antitela.
[0257]U drugim formama, subjekt može dodatno da se tretira sredstvom koje moduliše, npr., pojačava ili inhibira ekpsresiju ili aktivnost Fcy ili Fcy receptora, na primer tretiranjem subjekta citokinom. Poželjni citokini za primenu tokom lečenja multispecifičnim molekulom uključuju faktor stimulacije kolonija granulocita (granulocvte colonv-stimulating factor, G-CSF), faktor stimulacije kolonija granulocita-makrofaga (granulocvte-macrophage colonv-stimulating factor, GM-CSF), interferon-y (IFN-y), i faktor nekroze tumora (TNF).
[0258]Smeše (npr., humana antitela, multispecifični i bispecifični molekuli) ove objave mogu da se koriste za ciljanje ćelija koje eksprimiraju CXCR4, na primer, za obeležavanje takvih ćelija. Za tu upotrebu, vezujuće sredstvo može da se poveže sa molekulom koji treba da se detektuje. Tako, ova objava obezbeđuje metode lokalizovanjaex vivoiliin vitroćelija koje eksprimiraju CXCR4. Detektabilni obeleživač može da bude, npr., radioizotop, fluorescentno jedinjenje, enzim, ili enzimski kofaktor.
[0259]U posebnoj formi, ova objava obezbeđuje metode detektovanja prisustva CXCR4 antigena u uzorku, ili merenje količine CXCR4 antigena, što podrazumeva dovođenje u kontakt uzorka i kontrolnog uzorka sa humanim monoklonskim antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim delom, koji se specifično vezuju za CXCR4, pod uslovima koji dopuštaju formiranje kompleksa između antitela ili njegovog dela i CXCR4. Formiranje kompleksa se zatim detektuje, pri čemu razlika u formiranju kompleksa između uzorka i kontrolnog uzorka ukazuje na prisustvo CXCR4 antigena u uzorku.
[0260]U još jednoj formi, imunokonjugati ove objave mogu da se koriste za usmeravanje jedinjenja (npr., terapijskih sredstava, obeleživača, citotoksina, radiotoksina, imnosupresanata, itd.) ka ćelijama koje imaju CXCR4 ćelijske površinske receptore, povezivanjem takvih jedinjenja sa antitelom. Prema tome, ova objava obezbeđuje i metode lokalizovanjaex vivoiliin vivoćelija koje eksprimiraju CXCR4 (npr., detektabilnim obeleživačem, kao što je radioizotop, fluorescentno jedinjenje, enzim ili enzimski kofaktor). Alternativno, imunokonjugati mogu da se koriste za ubijanje ćelija koje imaju CXCR4 ćelijske površinske receptore, upućivanjem citotoksina ili radiotoksina ka CXCR4.
[0261]Poznato je da se CXCR4 eksprimira na velikom broju različitih tipova tumorkih ćelija, a takođe se zna da je uključen u metastaze tumora. Pored toga, poznato je da je, kao koreceptor za ulazak HIV u T-ćelije, CXCR4 uključen u HIV infekciju. Pored toga, pokazano je daje CXCR4/SDF-1 put uključen u zapaljenska stanja. Pokazano je takođe da je CXCR4/SDF-1 put povezan sa angiogenezom ili neovaskularizacijom. Prema tome, anti-CXCR4 antitela (i imunokonjugati i bispecifični molelkuli) ove objave mogu da se koriste za modulisanje CXCR4 aktivnosti u svakoj od ovih kliničkih situacija, kako sledi:
A. Kancer
[0262]Pokazano je da se CXCR4 eksprimira u različitim tipovima kancera i u nekim situacijama uspostavljena je inverzna korelacija između ekspresije CXCR4 i prognoze ili preživljavanja pacijenta. Neograničavajući primeri tipova kancera koji su udruženi sa ekspresijom CXCR4 uključuju: kancer dojke (Muller, A. et al. (2001) Nature 410:50-56); kancer ovarijuma (Scotton, C. et al. (2001) Br. J. Cancer 85:891-897; kancer prostate (Taichman, R.S. et al. (2002) Cancer Res. 62:1832-1837; nesitnoćelijski kancer pluća (Spano J.P. et al. (2004) Ann. Oncol. 15:613-617); kancer pankreasa (Koshiba, T. et al. (2000) Clin. Cancer Res. 6:3530-3535); kancer tiroidne žlezde (Hvvang, J.H. et al.
(2003) J. Clin. Endocrinol. Melab. 88:408-416); nazofaringealni karcinom (Wang, N. et al. (2005) J. Transi. Med. 3:26-33); melanom (Scala, S. et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11:1835-1841); karcinom ćelija bubrega (Staller, P. et al. (2003) Nature 425:307-311); limfom (Bertolini, F. et al. (2002) Cancer Res. 62:3530-3535): neuroblastom (Geminder, H. et al. (2001) J. Immunol. 167:4747-4757); glioblastom (Rempel, S.A. et al. (2000) Clin. Cancer Res. 6:102-111); rabdomiosarkom (Libura, J. et al. (2002) Blood 100:2597-2606); kolorektalni kancer (Zeelenberg, I.S. et al. (2003) Cancer Res. 63:3833-3839); kancer bubrega (Schrader, A.J. et al. (2002) Br..J. Cancer 86:1250-1256); osteosarkom (Laverdiere, C. et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11:2561-2567); akutnu limfoblastnu leukemiju (Crazzolara, R. et al. (2001) Br. J. Haematol. 115:545 - 553); i akutnu mijeloidnu leukemiju (Rombouts, E.J.C. et al. (2004) Blood 104:550-557). |0263]U svetlu navedenog, anti-CXCR4 antitela ove objave mogu da se koriste u lečenju kancera uključujući, ali ne ograničavajući se na kancer odabran iz grupe koja se sastoji od kancera dojke, ovarijuma, prostate, nesitnoćelijskog kancera pluća, kancera pankreasa, tiroidne žlezde, nazofaringealnog karcinoma, melanoma, karcinoma bubrežnih ćelija, limfoma, neuroblastom a, glioblastoma, rabdomiosarkoma, kolorektalnog kancera, kancera bubrega, osteosarkoma, akutne limfoblastne leukemije i akutne mijeloidne leukemije. Antitelo može da se koristi samo ili u kombinaciji sa drugim načinima iečenja kancera kao što su operativni i/ili zračenje i/ili sa drugim antineoplastičnim sredstvima kao što su antineoplastična sredstva o kojima je bilo reči i koja su navedena gore, uključujući hemoterapijske lekove i antitela na tumorske antigene kao što su ona koja se vezuju za CD20, Her2, PSMA, Campath-1, EGFR i slično.
B. Virusne infekcije ( uključujući HIV infekciju)
[0264]Pokazano je da je CXCR4 koreceptor za ulazak HIV u T-ćelije i pored toga, pokazano je da su neka mišja anti-CXCR4 antitela sposobna da inhibiraju ulaz HIV izolata u T-ćelije (vidi Hou, T. et al. (1998) J. Immunol. 160:180-188; Carnec, X. et al.
(2005) J. Virol. 79:1930-1938). Prema tome, CXCR4 može da se koristi kao receptor za ulazak virusa u ćelije i antitela na CXCR4 mogu da služe za inhibiranje ulaska u ćeliju virusa koji koriste CXCR4 kao receptor. Prema tome, humana anti-CXCR4 antitela ove objave mogu da se koriste za inhibiranje ulaska virusa u ćeliju, pri čemu virus koristi CXCR4 kao receptor za ulazak u ćeliju, tako da se virusna infekcija inhibira. U poželjnoj formi, antitela se koriste za inhibiciju ulaska HIV u T-ćelije, npr., u lečenju ili prevenciji HIV/AIDS. Antitelo može da se koristi samo ili u kombinaciji sa drugim antivirusnim sredsrvima, kao što su anti-retrovirusni lekovi, npr. AZT ili inhibitori proteaza.
C. Zapalienska stanja
[0265]Pokazano je da CXCR4/SDF-1 put ima ulogu u različitim zapaljenskim stanjima, uključujući ali se neograničavajući na zapaljensko oboljenje jetre (Terada, R. et al. (2003) Lab. Invest. 83:665-672); autoimuno zapaljenje zglobova (Matthvs, P. et al. (2001) J. Immunol. 167:4686-4692); alergijsko oboljenje disajnih puteva (Gonzalo, J.A. et al. (2000) J. Immunol. 165:499-508); i periodontnu bolest (Hosokavva, Y. et al.
(2005) Clin. Exp. Immunol. 141:467-474).
[0266]Prema tome, humana anti-CXCR4 antitela ove objave koja inhibiraju vezivanje SDF-1 za CXCR4 mogu da se koriste za inhibiranje zapaljenja u zapaljenskim poremećajima uključujući poremećaje odabrane iz grupe koja se sastoji od zapaljenske bolesti jetre, autoimunog zapaljenja zglobova, alergijskog oboljenja disajnih puteva, periodontne bolesti, reumatoidnog artritisa, zapaljenske bolesti creva, sistemskog eritemskog lupusa. dijabetesa tipa I, kožnih zapaljenskih poremećaja (npr., psorijaza.lichen planus),autoimunog oboljenja tiroidne žlezde, Sjogren-ovog sindroma, zapaljenja pluća (npr., hronična opstruktivna bolest pluća, sarkoidoza pluća, limfocitni alveolitis) i zapaljenske bolesti bubrega (npr., IgA nefropatija, glomerulonefritis). Antitelo može da se koristi samo ili u kombinaciji sa drugim antizapaljenskim sredstvima kao što su nesteroidni antizapaljenski lekovi (non-steroidal anti-inflammatorv drugs, NSA1D), kortikosteroidi (npr., prednizon, hidrokortizon), metotreksat, inhibitori COX-2, antagonisti TNF (npr., etanercept, infliksimab, adalimumab) i imunosupresanti (kao 6-merkaptopurin, azatioprin i ciklosporin A).
D. Angiogeneza
[0267]Pokazano je da SDF-1 indukuje neovaskularizaciju regrutovanjem CXCR4-eksprimirajućih hemangiocita (Jin, D.K. et al. (2006) Nal. Med. 12:557-567). Štaviše, blokiranje SDF-1/CXCR4 puta može da umanjiin vivorast tumora, inhibiranjem angiogeneze na VEGF-nezavisan način (Guleng, B. et al. (2005) Cancer Res. 65:5864-58-71). Pored toga, kako je pokaazano u Primeru 2, antitela ove objave sposobna su da inhibiraju formiranje kapilarnih tubain vitro.Prema tome, anti-CXCR4 antitela ove objave, koja inhibiraju vezivanje SDF-1 za CXCR4 mogu da se koriste za inhibiranje angiogeneze interferiranjem sa SDF-1/CXCR4 putem. Inhibicija angiogeneze može da se koristi, na primer, za inhibiranje rasta tumora ili tumorskih metastaza (bez obzira na to da lije tumor CXCR4<+>). Antitelo može da se koristi samo ili u kombinaciji sa drugim antiangiogenim sredstvima kao što su anti-VEGF antitela.
E. Autologa transplantacija matičnih ćelija
[0268]Matične ćelije periferne krvi poželjan su izvor matičnih ćelija za korišćenje u autologoj transplantaciji matičnih ćelija, na primer, u lečenju nekih hematoloških maligniteta. Prikupljanje matičnih ćelija iz periferne krvi zahteva mobilisanje CD34<+>matičnih ćelija iz koštane srži u perifernu krv. Različiti citokini, hemokini i adhezioni molekuli uključeni su u regulaciju ovog procesa (pregled dat u Gazitt, Y. (2001) J. Hematother. Stem Cell Res. 10:229-236), uključujući interakciju CXCR4 i SDF-1. Pored toga, pokazano je da mali molekulski antagonist CXCR4 stimuliše brzu mobilizaciju CD34<+>matičnih ćelija iz koštane srži na periferiju (vidi npr., Devine, S.M. et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22:1095-1102; Broxmeyer, H.E. et al. (2005) J. Rxp. Med.201:1307-1318; Flomenberg, N. et al. (2005) Blood 106:1867-1874). Prema tome, anti-CXCR4 antitela ove objave koja inhibiraju CXCR4 aktivnost (tj., antagonistička antitela) mogu da se koriste za stimulisanje mobilisanje CD34<+>matičnih ćelija iz koštane srži u perifernu krv, da bi se omogućilo korišćenje tih matičnih ćelija u transplantaciji (npr., autologa transplantacija), na primer u lečenju hematoloških poremećaja kao što su multipli nijelom i neHodgkin-ov limfom. Antitelo može da se koristi samo ili u kombinaciji sa drugim sredstvima koja se koriste za stimulisanje mobilisanja matičnih ćelija kao što su G-CSF i/ili GM-CSF. Tako, u drugoj formi, objava obezbeđuje metod stimulacije mobilisanja CD34<+>matičnih ćelija iz koštane srži u perifernu krv u subjktu, metod uključuje primenu, kod subjekta, anti-CXCR4 antitela pronalaska tako da mobilisanje CD34<+>matičnih ćelija iz koštane srži u perifernu krv bude stimulisano. Metod može da sadrži i sakupljanje CD34<+>matičnih ćelija iz periferne krvi, na primer za korišćenje u autologoj transplantaciji matičnih ćelija.
[0269]Predmetna objava je ilustrovana detaljnije primerima koji slede, a koje ne treba shvatiti kao ograničavajuće.
PRIMERI
Primer 1;Generisanje humanih monoklonskih antitela na CXCR4
[0270]Anti-CXCR4 humana monoklonska antitela generisana su korišćenjem kombinovanog pristupa u kojem se, prvo, miševi koji eksprimiraju gene za humana antitela imunizuju da bi se u njima stvorio repertoar humanih imunoglobulina specifičnih za humani CXCR4 i zatim, drugo, pripremi se biblioteka humanih antitela od ćelija slezine miševa i ispoljavaju se na fagima tako da se fagi pretražuju u pogledu ekspresije antitela sa specifičnošću za CXCR4. Ovaj kombinovani prostup uopšteno je opisan u U.S. Application No. 20030091995, Buechler et al.
Antigen
[0271]R1610 ćelije (linija ćelija pluća kineskog hrčka, originalno opisana u Thirion, J.P. et al. (1976) Genetics 83:137-147) transfektuje se ekspresionim vektorom koji kodira humani CXCR4 protein pune dužine, tako da se protein eksprimira na površini ćelija. Kodon-optimizovana forma CXCR4 cDNK koristi se u ekspresionom vektoru koji se priprema kako je opisano u Mirzabekov, T. el al. (1999) J. Biol. Chem.
274:28745-28750. Da bi se pojačala imunogenost ćelija, ćelije se oblože trinitrofenolom (TNP), inkubacijom sa vodenim rastvorom trinitrobenzenesulfonske kiseline (TNBS), koja se komercijalno nabavlja kao 5% rastvor (Sigma, Cat. #P2297). Preci* znije, 1x10<8>ćelija opere se jedanput sterilnim PBS, inkubira sa 50 pl komercijalnog 5% rastvora TNBS, jedan sat u mraku, na sobnoj temperaturi i zatim ispere tri puta sa PBS. Dobijene TNP-obložene CXCR-4-eksprimirajuće R1610 ćelije koriste se kao antigen za imunizaciju. Finalni imunogen je mešavina 100 pl TNP-obloženih, ispranih ćelija (1 x 10 ćelija) plus 100 ul Ribi adjuvansa. Miševi primaju šest doza imunogena tokom vremena.
Transgeni transhromozomski soj KM Mouse
[0272] Potpuno humana monoklonska antitela na CXCR4 pripreme se inicijalnim imunizovanjem KM soja transgenih transhromozomskih miševa koji eksprimiraju gene za humana antitela. U ovom soju miševa, endogeni mišji gen za kapa laki lanac homozigotno je prekinut, kako je opisano u Chen et al. (1993) EMBO J. 12:81 1-820 i endogeni mišji gen za teški lanac homozigotno je prekinut, kako je opisano u Primeru 1 PCT Publication WO 01/09187. Pored toga, soj miševa nosi transgen za humani kapa laki lanac, KCo5 (kako je opisano u Fishvvild et al. (1996) Nature Biotechnologv 14:845-851) i sadrži i SC20 transhromozom koji nosi humani Ig teškolančani lokus, kako je opisano u PCT Publication WO 02/43478. KM miševi opisani su detaljno i u U.S. Application No. 20020199213.
KM imunizacija
[0273] Da bi se stvorila potpuno humana monoklonska antitela na CXCR4, miševi soja KM Mouse® imunizuju se R1610 ćelijama koje su transfektovane da eksprimiraju CXCR4 i obložene sa TNP (kako je opisano gore za antigen). Opšta šema imunizacije za stvaranje humanih antitela u mišjim sojevima koji nose gene za humana antitela opisana je u Lonberg, N. et al (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishvvild, D. et al.
(1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 i PCT Publication WO 98/24884. Pre prve infuzije antigena, miševi su bili stari 6-16 nedelja.
[0274]KM miševi su imunizovani antigenom u Ribi adjuvansu, intraperitonealno (IP), subkutano (Se) ili preko gazne površine stopala (footpad, FP), posle čega sledi od 3-21 dana IP, Sc ili FP reimunizacija (ukupno 6 imunizacija) antigenom u Ribi adjuvansu. Imuni odgovor se prati retroorbitalnim uzimanjem krvi. Plazma se pretražuje pomoću FACS bojenja CXCR4-eksprimirajućih R1610 ćelija (u poređenju sa netransfektovanim roditeljskim R1610 ćelijama). Miševi sa dovoljnim titrima anti-CXCR4 humanih imunogolobulina koriste se za izolovanje slezine.
Pripremanje biblioteke za ispoljavanje na fagima i pretraživanje na anti- CXCR4 antitela
[0275]Slezine uzete iz gore opisanih imunizovanih miševa koriste se za pravljenje biblioteke za ispoljavanje na fagima, koja eksprimira humane teške i lake lance antitela. Preciznije, iz slezina je izolovana ukupna RNK, cDNK je pripremljena od RNK i cDNK varijabilnog regiona humanog antitela specifično je amplifikovana pomoću PCR, suštinski kako je opisano u U.S. Patent Application 20030091995, Buechler et al. Biblioteka varijabilnih regiona humanih antitela klonirana je u fagne ekspresione vektore, opet kako je suštinski opisano u U.S. Patent Application 20030091995, Buechler et al. Biblioteka za ispoljavanje na fagima pregledana je na članove biblioteke koji imaju afinitet za CXCR4 ispiranjem sa humanim CXCR4 inkorporisanim u magnetne proteolipozome (CXCR4-MPL). MPL koji eksprimiraju CX.CR4, ili druge receptore koji 7 puta prolaze kroz membranu (seven transmembrane, 7TM) (npr., CCR5), tako da je nativna konformacija 7TM receptora očuvana, opisana je ranije (vidi npr., Mirzabekov, T. et al. (2000) Nat. Biodechnol. 18:649-654; Babcock, G.J. et al.
(2001) J. Biol. Chem. 276:38433-38440; PCT Publication WO 01/49265; U.S. Patent Application 20010034432). Ukratko, rekombinantni humani CXCR4 koji sadrži epitopski obeleživač solubilizuje se iz transfektovane CXCR4-eksprimirajuće ćelijske linije korišćenjem deterdženta CHAPSO i protein se zadrži na magnetnim perlicama, preko epitopskog obeleživača. Lipidna membrana se rekonstruiše tokom uklanjanja deterdženta, tako da se očuva nativna membranska konformacija CXCR4, da bi se stvorili CXCR4-MPL. Tri kruga ispiranja biblioteke ispoljene na fagima pomoću CXCR4-MPL dovode do 30-strukog obogaćivanja CXCR4-vezivača u poređenju sa pozadinom. Fragmenti varijabilnog regiona od interesa rekloniraju se u Fab ekspresioni vektor i Fab se ponovo testira na vezivanje sa antigenom, u poređenju sa transfektovanim CXCR4-eksprimirajućim ćelijama. Cela antitela se zatim generišu od Fab korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije.
|0276] Fab klonovi F7, F9, Dl i E2 odabrani su za dalju analizu.
Primer 2: Strukturna karakterizacija humanih anti-CXCR4 monoklonskih antitela F7, F9, Dl i E2
[0277] cDNK sekvence kodirajuće za varijabilne regione teških i lakih lanaca F7, F9, Dl i E2 Fab klonova, dobijene pretraživanjem biblioteka ispoljenih na fagima, kako je opisano u Primeru 1, sekvencionišu se korišćenjem standardnih tehnika sekvencioniranja DNK.
[0278] Nukleotidna i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca F7 prikazane su na Slici 1A i u SEQ ID NO: 33 i 25, respektivno.
[0279] Nukleotidna i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca F7 prikazane su na Slici 1B i u SEQ ID NO: 37 i 29, respektivno.
[0280] Upoređivanje sekvence teškog lanca F7 imunoglobulina sa poznatim humanim sekvencama teškog lanca imunoglobulina germinativne linije, pokazalo je da teški lanac F7 koristi VHsegment iz humanog VH3-48 germinativne linije, D segment iz humanog 4-23 germinativne linije, i JH segment iz humanog JH 6B germinativne linije. Dodatna analiza F7 Vhsekvence, korišćenjem Kabat-ovog sistema determinisanja CDR, dovela je do slike teškolančanih CDR1, CDR2 i CD3 regiona kako je pokazano na Slici 1A i u SEQ ID NO: 1, 5 i 9, respektivno.
[0281] Upoređivanje sekvence lakog lanca F7 imunoglobulina sa poznatim humanim sekvencama lakog lanca imunoglobulina germinativne linije pokazalo je da laki lanac F7 koristi VLsegment iz humanog VKLI 5 germinativne linije i JK segment iz humanog JK 1 germinativne linije. Dodatna analiza F7 VLsekvence, korišćenjem Kabat-ovog sistema determinisanja CDR, dovela je do slike lakolančanih CDR1, CDR2 i CD3 regiona kako je pokazano na Slici 1B i u SEQ ID NO: 13, 17 i 21, respektivno. [0282J Nukleotidna i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca F9 prikazane su na Slici 2A i u SEQ ID NO: 34 i 26, respektivno.
[0283]Nukleotidna i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca F9 prikazane su na Slici 2B i u SEQ ID NO: 38 i 30, respektivno.
[0284[ Upoređivanje sekvence teškog lanca F9 imunoglobulina sa poznatim humanim imunoglobulinskim sekvencama teškog lanca germinativne linije pokazalo je da teški lanac F9 koristi VHsegment iz humanog VH 3-48 germinativne linije, D segment iz humanog 4-23 germinativne linije, i JH segment iz humanog JH 6B germinativne linije. Dodatna analiza F9 Vhsekvence, korišćenjem Kabat-ovog sistema determinisanja CDR, dovela je do slike teškolančanih CDR1, CDR2 i CD3 regiona kako je pokazano na Slici 2A i u SEQ ID NO: 2, 6 i 10, respektivno.
[0285] Upoređivanje sekvence lakog lanca F9 imunoglobulina sa poznatim humanim imunoglobulinskim sekvencama lakog lanca germinativne linije pokazalo je da laki lanac F9 koristi Vlsegment iz humanog VkLI5 germinativne linije i JK segment iz humanog JK 1 germinativne linije. Dodatna analiza F9 Vl sekvence, korišćenjem Kabat-ovog sistema determinisanja CDR, dovela je do slike lakolančanih CDR1, CDR2 i CD3 regiona kako je pokazano na Slici 2B i u SEQ ID NO: 14, 18 i 22, respektivno.
[0286] Nukleotidna i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca Dl prikazane su na Slici 3A i u SEQ ID NO: 35 i 27, respektivno.
[0287] Nukleotidna i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca Dl prikazane su na Slici 3B i u SEQ ID NO: 39 i 31, respektivno.
[0288J Upoređivanje sekvence teškog lanca Dl imunoglobulina sa poznatim humanim imunoglobulinskim sekvencama teškog lanca germinativne linije pokazalo je da teški lanac Dl koristi Vh segment iz humanog VH3-48 germinativne linije, D segment iz humanog 4-23 germinativne linije, i JH segment iz humanog JH 6B germinativne linije. Dodatna analiza Dl Vh sekvence, korišćenjem Kabat-ovog sistema determinisanja CDR, dovela je do slike teškolančanih CDR1, CDR2 i CD3 regiona kako je pokazano na Slici 3A i u SEQ ID NO: 3, 7 i 11, respektivno.
[0289] Upoređivanje sekvence lakog lanca Dl imunoglobulina sa poznatim humanim imunoglobulinskim sekvencama lakog lanca germinativne linije pokazalo je da laki lanac Dlkoristi VLsegment iz humanog VkLI5 germinativne linije i JK segment iz humanog JK 1 germinativne linije. Dodatna analiza Dl Vl sekvence, korišćenjem Kabat-ovog sistema determinisanja CDR, dovela je do slike lakolančanih CDR1, CDR2 i CD3 regiona kako je pokazano na Slici 3B i u SEQ ID NO: 15, 19 i 23, respektivno.
[0290]Nukleotidna i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca E2 prikazane su na Slici 4A i u SEQ ID NO: 36 i 28, respektivno.
[0291]Nukleotidna i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca E2 prikazane su na Slici 4B i u SEQ ID NO: 40 i 32, respektivno.
|0292]Upoređivanje sekvence teškog lanca E2 imunoglobulina sa poznatim humanim imunoglobulinskim sekvencama teškog lanca germinativne linije pokazalo je da teški lanac E2 koristi Vh segment iz humanog VH 3-48 germinativne linije, D segment iz humanog 4-23 germinativne linije, i JH segment iz humanog JH 6B germinativne linije. Dodatna analiza E2 VHsekvence, korišćenjem Kabat-ovog sistema determinisanja CDR, dovela je do slike teškolančanih CDR1, CDR2 i CD3 regiona kako je pokazano na Slici 4A i u SEQ ID NO: 4, 8 i 12, respektivno.
[0293JUpoređivanje sekvence lakog lanca E2 imunoglobulina sa poznatim humanim imunoglobulinskim sekvencama lakog lanca germinativne linije pokazalo je da laki lanac E2 koristi VLsegment iz humanog VkLI 5 germinativne linije i JK segment iz humanog JK 1 germinativne linije. Dodatna analiza E2 VLsekvence, korišćenjem Kabat-ovog sistema determinisanja CDR, dovela je do slike lakolančanih CDR1, CDR2 i CD3 regiona kako je pokazano na Slici 4B i u SEQ ID NO: 16, 20 i 24, respektivno.
[0294]Analiza sekvenci okvira VHi VLregiona F7, F9, Dl i E2, u poređenju sa sekvencama germinativne linije iz kojih su izvedene, identifikovala je različite aminokiselinske rezidue okvira koje se razlikuju od germinativne linije. Neke rezidue okvira u N-terminalnim regionima VHi VLsegmenata odabrane su za "povratne mutacije" da bi se obnovile rezidue okvira kakve su u sekvenci germinativne linije, zato što su ove rezidue u N-terminalnom delu različite od rezidua germinativne linije, bile kodirane prajmerima upotrebljenim za kreiranje biblioteka za ispoljavanje na fagima opisanih u Primeru 1. Preciznije, sledeće modifikovane forme Vhi Vlsegmenata F7, F9, Dl E2 (označene kao "GL" forme, za germline, germinativna linija) bile su kreirane korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije, da bi se supstituisale aminokiselinske rezidue germinativne linije na naznačenim pozicijama u okviru:
F7GL VH: Q1E, Q6E
F7GL Vk: AID, R3Q
F9GL VH: Q1E, Q6E
F9GL Vk: E1D, V3Q, L4M
D1GL VH: Q6E
D1GL Vk: VID, W3Q, V4M
E2GL VH: Q6E
E2GL Vk: E1D, V3Q, L4M
[0295]Slika 5A pokazuje poravnavanje F7 (SEQ ID NO: 25) i F7GL (SEQ ID NO: 41) teškolančanih varijabilnih aminokiselinskih sekvenci sa VH3-48 kodiranom aminokiselinskom sekvencom germinativne linije (SEQ ID NO: 49). CDR1, CDR2 i CDR3 regioni su naznačeni.
[0296]Slika 5B pokazuje poravnavanje F7 (SEQ ID NO: 29) i F7GL (SEQ ID NO: 45) lakolančanih varijabilnih aminokiselinskih sekvenci sa VKLI 5 kodiranom aminokiselinskom sekvencom germinativne linije (SEQ ID NO: 50). CDR1, CDR2 i CDR3 regioni su naznačeni.
[0297]Slika 6A pokazuje poravnavanje F9 (SEQ ID NO: 26) i F9GL (SEQ ID NO: 42) teškolančanih varijabilnih aminokiselinskih sekvenci sa VH3-48 kodiranom aminokiselinskom sekvencom germinativne linije (SEQ ID NO: 49). CDR1, CDR2 i CDR3 regioni su naznačeni. [0298JSlika 6B pokazuje poravnavanje F9 (SEQ ID NO: 30) i F9GL (SEQ ID NO: 46) lakolančanih varijabilnih aminokiselinskih sekvenci sa VKLI 5 kodiranom aminokiselinskom sekvencom germinativne linije (SEQ ID NO: 50). CDR1, CDR2 i CDR3 regioni su naznačeni.
[0299]Slika 7A pokazuje poravnavanje Dl (SEQ ID NO: 27) i D1GL (SEQ ID NO: 43) teškolančanih varijabilnih aminokiselinskih sekvenci sa VH3-48 kodiranom aminokiselinskom sekvencom germinativne linije (SEQ ID NO: 49). CDR1, CDR2 i CDR3 regioni su naznačeni.
[0300]Slika 7B pokazuje poravnavanje Dl (SEQ ID NO: 31) i D1GL (SEQ ID NO: 47) lakolančanih varijabilnih aminokiselinskih sekvenci sa VKLI 5 kodiranom aminokiselinskom sekvencom germinativne linije (SEQ ID NO: 50). CDR1, CDR2 i CDR3 regioni su naznačeni.
[0301] Slika 8A pokazuje poravnavanje E2 (SEQ ID NO: 28) i E2GL (SEQ ID NO: 44) teškolančanih varijabilnih aminokiselinskih sekvenci sa VH 3-48 kodiranom aminokiselinskom sekvencom germinativne linije (SEQ ID NO: 49). CDR1, CDR2 i CDR3 regioni su naznačeni.
[0302] Slika 8B pokazuje poravnavanje E2 (SEQ ID NO: 32) i E2GL (SEQ ID NO: 48) lakolančanih varijabilnih aminokiselinskih sekvenci sa VkLI 5 kodiranom aminokiselinskom sekvencom germinativne linije (SEQ ID NO: 50). CDR1, CDR2 i CDR3 regioni su naznačeni.
[0303] F7, F9, Dl i E2 Fab fragmenti konvertovani su u antitela pune dužine korišćenjem standardnih tehnika rekombinantne DNK. Na primer, DNK koja kodira VHi Vkregione jednog od Fab fragmenata može da se klonira u ekspresioni vektor koji nosi konstantne regione lakog i teškog lanca tako da varijabilni regioni budu operativno povezani sa konstantnim regionima. Alternativno, zasebni vektori mogu da se koriste za ekspresiju teškog lanca pune dužine i lakog lanca pune dužine. Neograničavajući primeri ekspresionih vektora pogodnih za korišćenje pri kreiranju antitela pune dužine uključuju pIE vektore opisane u U.S. Patent Application No. 20050153394, Black.
Primer 3: Vezujuće karakteristike anti-CXCR4 humanih monoklonskih antitela
[0304J U ovom primeru, vezujuće karakteristike anti-CXCR4 antitela ispitivane su protočnom citometrijom.
[0305] CEM linija humanih T-ćelija koje eksprimiraju nativni humani CXCR4 na svojoj površini, korišćena je da se ispita sposobnost F7, F9, Dl i E2 antitela da se vezuju za nativni CXCR4 na površini ćelije. F7, F9, Dl i E2 pune dužine titrovana su u nizu serijskih razblaženja 1:3, što je rezultovalo koncentracionim opsegom od 300 nM do 5 pM. Antitela su zatim pomešana sa CEM ćelijama i ostavljena da se vežu pre nego što se pristupilo detektovanju sa FITC-konjugovanim anti-humanim IgG sekundarnim antitelom. Ćelije su zatim analizirane fluorescentnom citometrijom. Dobijeni srednji intenziteti fluorescencije prikazani su na grafikonu Slike 9, koji pokazuje da se sva četiri anti-CXCR4 antitela vezuju za CEM ćelije. EC50za vezivanje F7, F9, Dl i E2 bile su 21 nM, 14 nM, 80 nM i 290 nM, respektivno. (03061Da bi se odredila sposobnost panela anti-CXCR4 antitela da kompetiraju za vezivanje za CXCR4, obavljene su studije kompeticije. Korišćena su četiri humana anti-CXCR4 antitela F9, F7, E2 i Dl, zajedno sa četiri komercijalno dostupna mišja monoklonska anti-CXCR4 antitela (12G5, 708, 716 i 717; R&D Svstems kataloški brojevi: MAB170, MAB 171, MAB172 i MAB173, respektivno). Anti-CXCR4 antitela titrovana su u nizu serijskih razblaženja 1:3, što je rezultovalo koncentracionim opsegom od 300 nM do 5 pM u prisustvu konstantne koncentracije FITC-obeleženog anti-CXCR4 antitela F9. Zatim se mešavina antitela doda CEM ćelijama i omogući se vezivanje. Sposobnost svakog antitela da kompetira sa F9 za vezivanje sa CEM ćelijama procenjuje se protočnom citometrijom i detekcijom FITC. Dobijeni srednji intenziteti fluorescencije prikazani su na grafikonu Slike 10, koji pokazuje daje svih sedam ispitivanih antitela (F7, E2, Dl, 12G5, 708, 716 i 717) bilo sposobno da kompetira sa F9 za vezivanje sa CEM ćelijama, iako je E2 antitelo pokazalo samo delimičnu inhibiciju pri visokim koncentracijama u poređenju sa drugim antitelima.
(0307]U drugom setu eksperimenata, sposobnost F7 mAb da se vezuje za veći broj različitih ćelijskih linija ispitivana je protočnom citometrijom, sprovođenjem FACS titracije. Rastuće količine mAb (od manje od 0.001 ug/ml do više od 100 ug/ml) inkubirane su sa 100 000 ćelija i vezivanje je procenjivano protočnom citometrijom. Bmaxvrednost takođe je određivana, što je približno ukazivalo na to koliko je CXCR4 molekula prisutno na svakoj ćeliji. Na osnovu krivih vezivanja, određena je EC50za vezivanje antitela, rezultati su zbirno prikazani u Tabeli 1:
Rezultati pokazuju da je F7 mAb sposobno da se efikasno veže za svaku od šest testiranih ćelijskih linija, sa najnižim EC50zapaženim sa Ramos i Raji ćelijskim liinijama. Ovi podaci pokazuju da je ekspresija CXCR4 receptora najviša za Ramos i Namalvva ćelije i najniža za MDA-MB-231 ćelije i DMS79 ćelije.
[0308]U drugom eksperimentu vezivanja, ispitivana je sposobnost F7 mAb da se veže za različite subsetove mononuklearnih ćelija periferne krvi (peripheral blood mononuclear cells, PBMC). Humane PBMC su izolovane standardnim metodima i različiti subsetovi ćelija su izolovani putem FACS. Preciznije, sledeći subsetovi ćelija se izoluju: (i) CD3<+>, (ii) CD20<+>; (iii) CDllb<+>i (iv) CD14<+>. Eksperimenti sa protočnom citometrijom sprovedeni sa F7 mAb (pri 33 pg/ml) pokazali su da je the F7 mAb sposobno da se efikasno vezuje za svaki od četiri subsetova, u poređenju sa izotipski poklapajućim kontrolnim antitelom.
Primer 4:Inhibicija vezivanja SDF-1 za CXCR4 pomoću anti-CXCR4 antitela
[03091Da bi se odredila sposobnost humanih anti-CXCR4 antitela da inhibiraju vezivanje SDF-1 za CXCR4, obavljena je studija kompeticije korišćenjem<l25>I-obeleženog SDF-1 i CEM ćelija, koje prirodno eksprimiraju CXCR4. Upoređivanje anti-CXCR4 antitela u pogledu blokiranja SDF-1 vezivanja za CEM ćelije obavljeno je standardnim testom vezivanja radioobeleženog liganda. Anti-CXCR4 antitela su serijski razblažena 1:3 da se dobije opseg koncentracija od 300 nM do 137 pM. Antitela se dodaju u 750 000 CEM ćelija u 100 pl, u prisustvu 100pM<125>1-SDF-1 sa specifičnom
aktivnošću od 2000 Ci/mmole (Amersham, catalog #IM314-25UCI). Irelevantno antitelo istog izotipa koristi se kao negativna kontrola. Ukupan mogući vezani radioobeleženi ligand određuje se dopuštanjem<l25>I-SDF-l da se veže za CEM ćelije u odsustvu antitela, za 2 sata, na 4°C. Nespecifično vezivanje radioobeleženog liganda određuje se dopuštanjem da se<l25>I-SDF-l veže u prisustvu 1 mM neobeleženog SDF-1 (Peprotech, kataloški br. 300-28A). Količina l25I-SDF-l udruženog sa ćelijama određuje se standardnim metodima. Rezultati su pokazani na Slici 11 koja pokazuje da antitelo F7 obezbeđuje najefikasniju blokadu SDF-1 vezivanja za CXCR4 eksprimiran na CEM ćelijama. F9 i Dl antitela takođe blokiraju SDF-1 vezivanje iako umerenije nego F7. E2 antitelo, iako se ne vezje za CXCR4 na CEM ćelijama (kako je pokazano u Primeru 3), ne blokira efikasno SDF-1 vezivanje za CXCR4 na CEM ćelijama. EC50za SDF-1 blokiranje pomoću F7, F9 i Dl bile su 2.3 nM, 12.5 nM i 28.6 nM, respektivno.
Primer5:Inhibicija SDF-l-indukovanog fluksa kalcijuma pomoću anti-CXCR4
antitela
[0310]Da bi se odredila sposobnost anti-CXCR4 humanih antitela da inhibiraju fluks kalcijuma u CEM ćelije indukovan SDF-1, CEM ćelije se prvo obeleže fluorescentnom bojom Calcium 3 (Molecular Devices). Anti-CXCR4 antitela titruju se u nizu serijskih razblaženja 1:3 što za rezultat ima opseg koncentracija od 100 nM do 1 pM i pusti se da se vezuju za 200 000 CEM ćelija u 200 p. i inkubiraju 10 minuta na sobnoj temperaturi pre nego što se nanesu na Flexstation mašinu (Molecular Devices). Kao negativna kontrola, koristi se irelevantno antitelo istog izotipa. Ćelije se zatim stimulišu rekombinantnim humanim SDF-1 u finalnoj koncentraciji od 50 nM (Peprotech), dodatim kao 500 nM u zapremini od 22 pl, do finalne zapremine od 222 pl. Dobijeni fluks kalcijuma meri se po bunarčiću tokom 200 sekundi. Kao pozitivna kontrola, ćelije u odsustvu antitela stimulišu se sa SDF-1 a (napravljenim u Hank-ovom puferisanom slanom rastvoru (HBS) sa 0.1 % BSA ili HBS) da se dobije maksimalan mogući signal fluksa kalcijuma. Da bi se odredila bazalna vrednost, ćelije se stimulišu sa HBS sa 0.1 % BSA. SDF-1 a-stimulisano oslobađanje kalcijuma meri se razvijanjem kalcijum-zavisne fluorescencije tokom vremena. Oblast ispod krive dobijenog fluorescentnog traga saopštena je kao indikacija fluksa kalcijuma. Dobijena inhibicija fluksa kalcijuma anti-CXCR4 antitelima prikazana je na Slici 12. Podaci su uneti i EC50izračunate korišćenjem GraphPad Prism softvera i nelinearnim podešavanjem krive, formula sigmoidnog doznog odgovora. Antitela F7, F9 i Dl inhibiraju SDF-1 a-indukovani fluks kalcijuma. Antitelo E2, iako se ne vezuje za CXCR4 (kako je pokazano u Primeru 3), ne inhibira značajno SDF-1 a-indukovani fluks kalcijuma. EC5oza inhibiciju SDF-1 - indukovanog fluksa kalcijuma F7, F9 i Dl bile su 0.90 nM, 0.32 nM i 0.57 nM, respektivno.
Primer 6: Inhibicija SDF-l~indukovane migracije CEM ćelija pomoću anti-CXCR4 antitela
[0311] Da bi se odredila sposobnost anti-CXCR4 humanih antitela da inhibiraju migraciju CEM ćelija indukovanu SDF-1, CEM ćelije se prvo obeleže BATDA reagensom (Perkin Elmer). Anti-CXCR4 antitela se titruju u nizu serijskih razblaženja 1:3 što za rezultat ima opseg koncentracija od 100 nM do 1 pM i dopusti se da dođe do vezivanja za obeležene CEM ćelije pri gustini od 10 miliona ćelija po ml. Kao negativna kontrola, koristi se irelevantno antitlo istog izotipa. Rekombinantni humani SDF-1 a (Peprotech) doda se pri 5 nM u količini od 30 pl po bunarčiću u donju komoru Neuroprobe migracione ploče sa 96 bunarčića sa filterima dijametra 5.7 mm po bunarčiću. Svaki bunarčić sadrži 5 mM pore. Obeležene CEM ćelije sa i bez antitela nanesu se na filtere u koncentraciji od 0.5 miliona ćelija po bunarčiću u zapremini od 50 ul. Migraciona ploča se inkubira na 37°C, 2.5 sata. Ćelije koje migriraju bivaju zarobljene u donjoj komori ploče, liziraju se i detektuju detekcionim rastvorom sa europijumom (Perkin Elmer). Hemi-luminescentni signal se snima na Fusion instrumentu. Dobijena inhibicija SDF-la-indukovane migracije pomoću anti-CXCR4 antitela pokazana je na Slici 13. Rezultati pokazuju da antitela F7 i F9 inhibiraju migraciju efikasno, dok antitela Dl i E2 ne inhibiraju značajno migraciju. EC50za inhibiciju SDF-1-indukovane CEM migracije ćelija pomoću F7 i F9 bile su 12.44 nM i 18.99 nM, respektivno.
Primer 7: Inhibicija formiranja kapilarnih tuba HuVEC pomoću anti-CXCR4 antitela
[0312]U ovom primeru, ispitivana je sposobnost anti-CXCR4 humanih antitela da inhibiraju humane endotelske ćelije umbilikalne vene da formiraju kapilarne tube (HuVEC). Matrigel je razblažen 1:1 sa RPM1 i nanet na bunarčiće ploče sa 96 bunarčića i dopuštena je polimerizacija 30 minuta na 37°C. HuVEC (Cambrex, kataloški br. CC-2519) pri konfluenciji od 80% su tripsinizovane i resuspendovane pri 1 x IO<6>ćelija po ml u RPMI sa 0.5% FBS. Antitela su dobro promešana sa HuVEC pri finalnoj koncentraciji od 3 (ig/ml i ostavljena da se inkubiraju na sobnoj temperaturi 30 minuta. Irelevantno antitelo istog izotipa ili medijum sam uzeti su kao negativna kontrola. Kao pozitivna kontrola inhibicije formiranja tuba, korišćeno je mišje anti-humano avp3 (CD51/CD61) antitelo (R&D Svstems, kataloški broj MAB3050). HuVEC sa ili bez antitela nanete su na bunarčiće obložene matrigelom i inkubirane na 37°C, 18 sati.
[0313]HuVEC inkubirane sa medijumom samim ili sa izotipski poklapajućim kontrolnim antitelom formirale su kapilarne tube, što je za rezultat imalo pojavu povezanih ćelija na ploči sa 3-5 tačaka kontakta ili grananja po ćeliji. HuVEC inkubirane sa anti-CXCR4 humanim antitelima ili anti-avp3 antitelom nisu formirale kapilarne tube. Ćelije su izgledale izolovane i sa nekoliko ili bez tačaka grananja. Anti-CXCR4 antitela koja su najefikasnija u blokiranju SDF-1 vezivanja, SDF-1 - indukovanog fluksa kalcijuma i SDF-1-indukovane migracije, F7 i F9, bila su i najefikasnija u inhibiranju formiranja kapilarnih tuba. Anti-CXCR4 antitelo E2, koje se vezuje za CXCR4, ali ne blokira SDF-1 vezivanje ili SDF-1-indukovane efekte, nije inhibiralo formiranje kapilarnih tuba.
Primer 8:Inhibicija proliferacije tumorskih ćelijain vitroanti-CXCR4 antitelima
[0314]U ovom primeru, ispitivana je sposobnost anti-CXCR4 humanih antitela da inhibiraju proliferaciju Ramos tumorskih ćelija (ćelijska linija humanog Burkitt-ovog limfoma)in vitro.U testu, 1 x IO<4>ćelija/bunarčiću inkubira se sa rastućim dozama (10 3 do 300 nM) F7 IgG4 antitela, F9 IgGl antitela, E2 IgGl antitela, F9 Fab' antitela ili izotipskim kontrolama. Ćelije se inkubiraju sa antitelom 72 sata, uz dodavanje<3>H-timidina za poslednja 24 sata inkubacije, da se dopusti praćenje proliferacije ćelija. Posle inkubacije, inkorporisanje<3>H-timidina u ćelije mereno je standardnim tehnikama. Rezultati su prikazani na grafikonu Slike 14. Rezultati pokazuju da je svako od F7 IgG4, F9 IgGl i E2 IgGl antitela sposobno da inhibira proliferaciju Ramos ćelija, što se vidi smanjenjem inkorporisanja<3>H-timidina kada se inkubira sa ovim antitelima, dok F9 Fab' fragment nije inhibirao proliferaciju ćelija. Ovi rezultati pokazuju da anti-CXCR4 humana antitela imaju direktan antiproliferativni efekat na tumorske ćelijein vitroi tako ne zahtevaju sekundarno unakrsno povezivanje da bi postigli antiproliferativni efekat.
Primer9:Inhibicija proliferacije ćelija solidnog tumora invivoanti-CXCR4
antitelima
|0315]U ovom primeru, ispitivana je sposobnost anti-CXCR4 humanih antitela da inhibiraju proliferaciju uspostavljenog solidnog tumorain vivo,korišćenjem modela Ramos-ovih subkutanih tumorskih ćelija. U ovom testu, 10 x IO<6>Ramos-ovih ćelija/mišu implantira se u region boka svakog miša i ostave se da rastu do prosečne veličine od 40 mm , izračunato kao dužina x širina x visina/2 tumora. Miševi zatim prime intraperitonealnu (i.p.) injekciju prve doze antitela (označeno kao dan 0 tretmana) i prime drugu i.p. dozu antitela na dan 7. Miševi tretirani Fab' fragmentom antitela takođe primaju i.p. doze antitela na dan 3 i dan 10. Grupe miševa (n=8) tretirane su jednim od sledećeg: (i) prenosnik; (ii) izotipska kontrola (15 mg/kg) ; (iii) F7 IgG4 (15 mg/kg); (iv) F9 IgGl (15 mg/kg); (v) F9 Fab" (10 mg/kg); ili (vi) anti-CD20 pozitivna kontrola (15 mg/kg). Zapremina tumora i telesna težina miša mere se u regularnim intervalima (približno 2-3 puta nedeljno) između dana 0 i dana 30 posle doziranja. Rezultati eksperimenta prikazani su na Slikama 15A, 15B i 15C, koje pokazuju srednju zapreminu tumora (Slika 15A), medijanu zapremine tumora (Slika 15B) i medijanu % promene telesne težine (Slika 15C). Rezultati pokazuju da, kao i pozitivna kontrola, F7 IgG4 i F9 IgGl antitela značajno inhibiraju rast tumorskih ćelija, mereno preko povećanja zapremine tumora, dok F9 Fab' fragment ne inhibira rast tumorskih ćelija u poređenju sa izotipskom kontrolom. Svi tretmani se dobro tolerišu na šta je ukazao izostanak značajne promene telesne težine. Razlike u telesnoj težini između tretmana najverovatnije su nastale zbog težine tumora. Rezultati ukazuju na to da su anti-CXCR4 humana antitela sposobna da inhibiraju rast uspostavljenog solidnog tumorain vivo.
Primer 10:Produženo vreme preživljavanja u modelu sistemskih tumorskih ćelija
kod miša lečenjem anti-CXCR4 antitelom
[0316]U ovom primeru, ispitivana je sposobnost anti-CXCR4 humanih antitela da produže vreme preživljavanja miševa korišćenjem modela Ramos-ovih sistemskih tumorskih ćelija. Uovom testu, 1 x IO6 Ramos-ovih ćelija/mišu injektira se intravenski (i.v.) u svakog miša na dan 0. Miševi zatim prime intrapeirtonealnu (i.p.) injekciju prve doze antitela na dan 1 (tj., jedan dan posle i.v. primene tumorskih ćelija) i primaju još četiri i.p. doze antitela na dane 5, 8, 15 i 22 (miševi tretirani pozitivnim kontrolnim antitelima tretiraju se samo na dan 1). Grupe miševa (n=8) tretiraju se jednim od sledećeg; (i) prenosnik; (ii) izotipska kontrola (15 mg/kg); (iii) F9 IgGl (15 mg/kg); ili (iv) anti-CD19 pozitivna kontrola (15 mg/kg). Procenat preživljavanja meri se u regualrnim intervalima između dana 0 i dana 50 posle doziranja (paraliza zadnje noge koristi se kao završna tačka eksperimenta). Rezultati eksperimenta prikazani su na Slici 16, koja pokazuje procenat preživljavanja tokom vremena. Medijana broja dana preživljavanja miševa tretiranih prenosnikom ili izotipskom kontrolom bile su 23 odnsono 25.5 dana, dok je medijana broja dana preživljavanja miševa tretiranih jednom dozom anti-CD 19 pozitivnom kontrolom bila 39 dana. Značajno, 100% miševa u grupi tretiranoj sa pet doza F9 IgGl antitela preživelo je do kraja eksperimenta. Ovi rezultati pokazuju daje anti-CXCR4 humano antitelo sposobno da produži vreme preživljavanja miševa u modelu sistemskih tumorskih ćelija.
Primer 11:Indukcija apoptoze anti-CXCR4 monoklonskim antitelom F7
[0317]U ovom primeru, ispitivana je sposobnost anti-CXCR4 mAb F7 da indukuju apoptozu u različitim ćelijama. U testu apoptoze, F7 mAb pri 10 ug/ml inkubira se sa Ramos-ovim ćelijama (500 000 ćelija), Namalwa ćelijama (500 000 ćelija) ili R1610 ćelijama transfektovanim da eksprimiraju CXCR4 (100 000 ćelija) Netransfektovane R1610 ćelije korišćene su kao negativna kontrola. Anti-CXCR4 mAb F7 ili izotipsko kontrolno antitelo inkubiraju se sa ćelijama na 37°C i uzorci od 250 pl uzimaju se posle 24, 48 i 72 sata. Za procenu apoptoze, ćelije iz različitih vremenskih tačaka inkubiraju se sa Annexin V-FITC-FL1 i Propidium Iodide-FL3, posle čega sledi protočna citometrija. Kombinovani procenti ćelija sakupljenih u FL1, FL3 i FL1-FL3 dvostruko pozitivnim kvadrantima razmatraju se kao apoptoza. Da se ukloni pozadinski efekat, procenti izotipskim antitelom indukovanih apoptotskih ćelija oduzmu se od procenta ćelija kod kojih je apoptoza indukovana F7 mAb.
[0318]Rezultati su zbirno prikazani dole u Tabeli 2:
Rezultati pokazuju da je F7 mAb sposobno da indukuje apoptozu u Ramos, Namalvva R1610-CXCR4 ćelijama, dok F7 nije imao efekta na indukciju apoptoze roditeljskih R1610 ćelija što ukazuje na to daje odgovor bio CXCR4-specifičan.
Primer 12:Dodatne studije koje pokazuju inhibiciju proliferacije ćelija solidnog
tumora invivoanti-CXCR4 antitelima
[0319]U ovom primeru, ispitivana je sposobnost anti-CXCR4 humanih antitela da inhibiraju proliferaciju ili indukuju apoptozu uspostavljenih solidnih tumorain vivo,korišćenjem dodatnih tumorskih ćelijskih modela sličnih Ramos-ovom modelu opisanom gore u Primeru 9. Ispitivane su različite tumorske ćelijske linije. Reprezentativni eksperimenti i rezultati su sledeći.
[0320]U jednom eksperimentu, 7.5 x IO<6>MDA-MB231 ćelija humanog kancera dojke/mišu implantira se u bočni region svakog miša i ostave se da rastu do srednje veličine od 100 mm<3>, izačunato kao dužina x širina x visina/2 tumora, što je bilo na dan 7 posle implantacije. Miševi su nasumično raspoređeni u različite grupe tretmana i primali su intraperitonealnu (i.p.) injekciju prve doze antitela na dan 7 posle implantacije, drugu i.p. doz antitela na dan 14 posle implantacije i zatim treću dozu na dan 46 posle implantacije. Grupe miševa (n=9) tretirane su jednim od sledećeg: (i) prenosnik (PBS); (ii) IgGl izotipska kontrola (15 mg/kg) ; (iii) IgG4 izotipska kontrola (15 mg/kg); (iv) F7 IgGl (15 mg/kg); ili (v) F7 IgG4 (15 mg/kg). Zapremine tumora merene su u regularnim intervalima i prosečna zapremina tumora i medijana zapremine tumora određivane su za svaku grupu tretmana, za svaki interval. Rezultati ovog eksperimenta zbirno su prikazani dole u Tabeli 3 koja pokazuje prosečnu zapreminu tumora (u mm ) i % inhibicije rasta tumora (tumor grovvth inhibition, TG1) na dan 52, i medijanu zapremine tumora (u mm<3>) i % TGI na dan 59 posle implantacije:
do srednje veličine od 160 mm<3>, izačunato kao dužina x širina x visina/2 tumora, što je bilo na dan 7 posle implantacije. Miševi su nasumično raspoređeni u različite grupe tretmana i primali su intraperitonealne (i.p.) injekcije antitela po rasporedu doziranja Q3Dx5 (svaka tri dana, pet puta). Grupe miševa (n=10) tretirane su jednim od sledećeg: (i) prenosnik (PBS); (ii) IgG4 izotipska kontrola (10 mg/kg); ili (iii) F7 IgG4 (10 mg/kg). Zapremine tumora merene su u regularnim intervalima i prosečna zapremina tumora i medijana zapremine tumora određivane su za svaku grupu tretmana, za svaki interval. Rezultati ovog eksperimenta zbirno su prikazani dole u Tabeli 4, koja pokazuje prosečnu zapreminu tumora (u mm<3>) i % inhibicije rasta tumora (TG1) na dan 34posle implantacije:
Rezultati pokazuju da je F7 mAb sposobno da inhibira rast DMS79 ćelija humanog sitnoćelijskog karcinoma plućain vivo.
[0322]Dodatni modeli subkutanih tumorskih ksenografta testirani su u pogledu sposobnosti anti-CXCR4 antitela da inhibiraju rast tumora, u eksperimentima sličnim gore opisanim i opisanim u Primeru 9. U eksperimentu uz korišćenje ćelija SU-DHL-6 limfoma B-ćelija, rezultati su pokazali da tretman sa F7 IgG4 mAb u dozi od 15 mg/kg za rezultat ima približno 60% inhibicije ratsa tumora. Slično, u eksperimentu u kojem su korišćene ćelije Namalvva Burkitt-ovog limfoma, rezultati su pokazali da tretman sa F7 IgG4 mAb u dozi 3 mg/kg za rezultat ima približno 70% inhibicije rasta tumora. Nasuprot tome, izostanak inhibicije rasta tumora putem F7 mAb zapažen je u eksperimentima sa korišćenjem NIH-H226 ćelija karcinoma pluća ili HPAC ćelija humanog adenokarcinoma pankreasa. Međutim, bojenje ovih ćelija pomoću F7 mAb u eksperimentima protočne citometrije pokazalo je minimalnuin vitroekspresiju, lako su se tumorske ćelijein vivobojile imunohistohemijski sa mAb, nije jasno u kom stadijumu njihovog tumorskog rasta CXCR4 počinje da se eksprimira. Ovo sugeriše da je ekspresija CXCR4 u ovim ćelijskim linijama nedovoljna da omogući inhibiciju rasta tumora ili indukciju apoptozein vivotretmanom sa anti-CXCR4.
Primer13:Inhibicija plućnih metastazain vivoanti-CXCR4 antitelima
[0323]U ovom primeru, ispitivana je sposobnost F7 anti-CXCR4 mAb da inhibira plućne metastaze, korišćenjem C57 sistemskog tumorskog modela kod miša. Preciznije, 0.4 x IO<6>B16-CXCR4 ćelija (BI6 ćelije transfektovane da eksprimiraju humani CXCR4) injektirane su intravenski u svakog od 30 miševa soja C57. Miševi su nasumično raspoređeni u tri grupe od po deset miševa u svakoj, i zatim tretirani jednim od sledećeg: (i) prenosnik (PBS); (ii) IgG4 izotipska kontrola (5 mg/kg); ili (Hi) F7 IgG4 (5 mg/kg). Antitelo ili prenosnik injektirani su intraperitonealno 30 minuta posle intravenskog injektiranja B16-CXCR4 ćelija. Pluća su izolovana na dan 14 i kvantifikovan je broj plućnih metastatskih nodula. Rezultati su zbirno prikazani dole u Tabeli 5, koja pokazuje prosečan broj i medijanu broja plućnih metastaza u svakoj grupi:
Rezultati pokazuju da je tretman sa F7 mAb doveo do redukcije prosečnog broja plućnih metastatskih čvorića od 56%, dok je redukcija iznosila samo 15% sa izotipskim kontrolnim antitelom, što pokazuje daje F7 mAb sposobno da inhibira plućne metastaze u modelu sistemskog tumora.
POPIS SEKVENCI

Claims (17)

1. Humano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, naznačeno time, što se specifično vezuje za nativni humani CXCR4 eksprimiran na površini ćelije i sadrži: CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca koji uključuje amino-kiseline sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 1; CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca koji uključuje amino-kiseline sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 5; CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca koji uključuje amino-kiseline sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 9; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca koji uključuje amino-kiseline sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 13; CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca koji uključuje amino-kiseline sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 17; i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca koji uključuje amino-kiseline sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 21.
2. Monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, iz zahteva 1, naznačeno time, što sadrži: varijabilni region teškog lanca koji uključuje amino-kiseline sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 25 i varijabilni region lakog lanca koji uključuje amino-kiseline sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 29.
3. Monoklonsko antitelo iz zahteva 1 ili zahteva 2, naznačeno time, što je pomenuto antitelo - antitelo pune dužine.
4. Monoklonsko antitelo iz zahteva 3, naznačeno time. što je pomenuto monoklonsko antitelo IgG 1 ili lgG4 izotipa.
5. Antigen-vezujući deo monoklonskog antitela iz zahteva 1 ili zahteva 2, naznačen time, što je pomenuti antigen-vezujući deo Fab fragment, F(ab")2fragment, Fab' fragment, Fd fragment, Fv fragment, ili scFv.
6. Antigen-vezujući deo monoklonskog antitela iz zahteva 5, naznačen time, što je pomenuti antigen-vezujući deo F(ab')2fragment.
7. Imunokonjugat, naznačen time, što sadrži monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, iz bilo kojeg od zahteva 1 do 6, povezano sa terapijskim sredstvom; opciono gde je terapijsko sredstvo citotoksin ili radioaktivni izotop.
8. Bispecifični molekul, naznačen time, što sadrži monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, iz bilo kojeg od zahteva 1 do 6. povezano sa drugom funkcionalnom komponentom koja ima drugačiju vezujuću specifičnost nego monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući deo.
9. Smeša, naznačena time, što sadrži farmaceutski prihvatljivi nosač i jedno od sledećeg: (a) monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, iz bilo kojeg od zahteva 1 do 6; (b) imunokonjugat iz zahteva 7; ili (c) bispecifični molekul iz zahteva 8.
10. Izolovana nukleinska kiselina, naznačena time, što kodira monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo iz bilo kojeg od zahteva 1 do 6.
11. Ekspresioni vektor, naznačen time, što sadrži nukleinsku kiselinu iz zahteva 10.
12. Celija-domaćin, naznačena time, što sadrži ekspresioni vektor iz zahteva 11.
13.Metod pripremanja anti-CXCR4 antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg dela,naznačen time,što uključuje eksprimiranje antitela. ili njegovog antigen-vezujućeg dela u ćeliji-domaćinu iz zahteva 12 i izolovanje antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela iz ćelije-domaćina.
14. In- vitrometod modulisanja aktivnosti CXCR4 u ćeliji,naznačen time,što uključuje dovođenje u kontakt ćelije sa monoklonskim antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim delom, iz bilo kojeg od zahteva 1 do 6 tako da se aktivnost CXCR4 u ćeliji u ćeliji modulliše; opciono gde: (a) ćelija je tumorska ćelija koja eksprimira CXCR4 i metod za rezultat ima inhibiciju rasta tumorske ćelije ili inhibiciju metastaza tumorske ćelije; (b) ćelija je T-ćelija koja eksprimira CXCR4 i metod za rezultat ima inhibiciju ulaska HIV u ćeliju; (c) ćelija je limfocit u zapaljenskom poremećaju i metod za rezultat ima inhibiciju zapaljenja; ili (d) ćelija je uključena u vaskularizaciju i metod za rezultat ima modulaciju angiogeneze.
15. Monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, iz bilo kojeg od zahteva zahteva 1 do 6,naznačeno time,što se upotrebljava u metodu modulisanja aktivnosti CXCR4 u ćeliji subjekta, pri čemu: (a) ćelija je tumorska ćelija koja eksprimira CXCR4 i metod za rezultat ima inhibiciju rasta tumorske ćelije ili inhibiciju metastaza tumorske ćelije kod subjekta; (b) ćelija je T-ćelija koja eksprimira CXCR4 i metod za rezultat ima inhibiciju ulaska HIV u ćeliju subjekta; (c) ćelija je limfocit u zapaljenskom poremećaju i metod za rezultat ima inhibiciju zapaljenja kod subjekta; ili (d) ćelija je uključena u vaskularizaciju i metod za rezultat ima modulaciju angiogeneze kod subjekta.
16. Monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo za upotrebu prema zahtevu 15,naznačeno time,što se tumorska ćelija bira između ćelije kancera dojke, kancera ovarijuma, kancera prostate, nesitnoćelijskog kancera pluća, kancera pankreasa, kancera tiroidne žlezde, nazofaringealnog karcinoma, melanoma, karcinoma bubrežnih ćelija, limfoma, neuroblastoma, glioblastoma, rabdomiosarkoma, kolorektalnog kancera, kancera bubrega, osteosarkoma, akutne limfoblastne leukemije, akutne mijeloidne leukemije, sitnoćelijskog karcinoma pluća i metastatskog kancera pluća.
17. Monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, iz bilo kojeg od zahteva 1 do 6,naznačeno time,što se upotrebljava u metodu transplantacije, koji uključuje stimulisanje mobilisanje CD34<+>matičnih ćelija iz koštane srži u perifernu krv; opciono gde metod uključuje još i sakupljanje CD34<+>matičnih ćelija iz periferne krvi.
RS20150771A 2006-10-02 2007-10-01 Humana antitela koja se vezuju za cxcr4 i njihove upotrebe RS54424B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US82785106P 2006-10-02 2006-10-02
PCT/US2007/021152 WO2008060367A2 (en) 2006-10-02 2007-10-01 Human antibodies that bind cxcr4 and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS54424B1 true RS54424B1 (sr) 2016-04-28

Family

ID=39402166

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20150771A RS54424B1 (sr) 2006-10-02 2007-10-01 Humana antitela koja se vezuju za cxcr4 i njihove upotrebe
RS20170519A RS55740B1 (sr) 2006-10-02 2007-10-01 Humana antitela koja se vezuju za cxcr4 i njihove upotrebe

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20170519A RS55740B1 (sr) 2006-10-02 2007-10-01 Humana antitela koja se vezuju za cxcr4 i njihove upotrebe

Country Status (29)

Country Link
US (3) US8450464B2 (sr)
EP (2) EP2066351B1 (sr)
JP (4) JP5417175B2 (sr)
KR (3) KR101722261B1 (sr)
CN (2) CN103897058B (sr)
AR (2) AR063086A1 (sr)
AU (1) AU2007320024B2 (sr)
BR (1) BRPI0718197A2 (sr)
CA (1) CA2665239A1 (sr)
CL (1) CL2007002835A1 (sr)
CY (2) CY1117036T1 (sr)
DK (2) DK2486941T3 (sr)
EA (1) EA018836B1 (sr)
ES (2) ES2553553T3 (sr)
HU (2) HUE033630T2 (sr)
IL (1) IL197831A (sr)
LT (1) LT2486941T (sr)
ME (1) ME02269B (sr)
MX (1) MX2009003306A (sr)
NO (1) NO345287B1 (sr)
NZ (1) NZ575924A (sr)
PL (2) PL2066351T3 (sr)
PT (2) PT2486941T (sr)
RS (2) RS54424B1 (sr)
SG (2) SG10201608268RA (sr)
SI (2) SI2066351T1 (sr)
TW (2) TWI592425B (sr)
WO (1) WO2008060367A2 (sr)
ZA (1) ZA200902256B (sr)

Families Citing this family (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101466931B1 (ko) 2006-07-18 2014-12-02 녹손 파르마 아게 Sdf-1 결합형 b형 핵산분자
MX2009003306A (es) * 2006-10-02 2009-04-23 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen a cxcr4 y sus usos.
FR2915102B1 (fr) * 2007-04-23 2014-05-16 Pf Medicament Utilisation d'un anticorps anti-cxcr4 pour le traitement du cancer
US8772257B2 (en) * 2007-08-06 2014-07-08 Noxxon Pharma Ag SDF-1 binding nucleic acids and the use thereof
CN102027015A (zh) * 2008-05-14 2011-04-20 伊莱利利公司 抗cxcr4抗体
US7892546B2 (en) 2008-05-14 2011-02-22 Eli Lilly And Company Anti-CXCR4 antibodies
WO2010141801A2 (en) 2009-06-05 2010-12-09 Cellular Dynamics International, Inc. Reprogramming t cells and hematophietic cells
WO2011042398A1 (en) * 2009-10-09 2011-04-14 Ablynx Nv Immunoglobulin single variable domain directed against human cxcr4 and other cell associated proteins and methods to generate them
DK3305813T3 (da) * 2009-11-11 2020-04-20 Astellas Pharma Inc Antistoffer, der er specifikke for claudin 6 (cldn6)
WO2011083140A1 (en) * 2010-01-08 2011-07-14 Ablynx Nv Immunoglobulin single variable domain directed against human cxcr4
GB201002238D0 (en) 2010-02-10 2010-03-31 Affitech As Antibodies
EP2371863A1 (en) * 2010-03-30 2011-10-05 Pierre Fabre Médicament Humanized anti CXCR4 antibodies for the treatment of cancer
WO2011161266A1 (en) * 2010-06-25 2011-12-29 Ablynx Nv Improved immunoglobulin single variable domains and constructs thereof directed against cxcr4
US20140120555A1 (en) * 2011-06-20 2014-05-01 Pierre Fabre Medicament Anti-cxcr4 antibody with effector functions and its use for the treatment of cancer
EP2723380B1 (en) 2011-06-24 2019-08-21 Stephen D. Gillies Light chain immunoglobulin fusion proteins and methods of use thereof
ES2624981T3 (es) 2011-07-01 2017-07-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Descubrimiento de una mutación somática en el gen MYD88 en linfoma linfoplasmocitario
EP2734234A4 (en) * 2011-07-20 2015-01-28 Medimmune Ltd ANTI-CXCR4 ANTIBODIES AND METHOD OF USE THEREOF
AR087363A1 (es) * 2011-07-29 2014-03-19 Pf Medicament Uso del anticuerpo i-3859 para la deteccion y diagnostico de los canceres
AR087364A1 (es) 2011-07-29 2014-03-19 Pf Medicament Anticuerpo anti-cxcr4 y su uso para la deteccion y dianostico de canceres
CN104039320B (zh) * 2011-11-09 2019-10-15 百时美施贵宝公司 血液恶性肿瘤用抗-cxcr4抗体的治疗
LT2961771T (lt) * 2013-02-26 2020-03-10 Roche Glycart Ag Bispecifinės t ląstelę aktyvinančios antigeną surišančios molekulės, specifinės cd3 ir cea antigenams
MY191368A (en) 2013-06-28 2022-06-20 X Body Inc Target antigen discovery, phenotypic screens and use thereof for identification of target cell specific target epitopes
CA2919790C (en) * 2013-08-02 2018-06-19 Pfizer Inc. Anti-cxcr4 antibodies and antibody-drug conjugates
CA2920377A1 (en) * 2013-08-05 2015-02-12 Cambridge Enterprise Limited Inhibition of cxcr4 signaling in cancer immunotherapy
AU2014318614B2 (en) * 2013-09-12 2021-01-07 Dana-Farber Cancer Institute Inc. Methods for evaluating and treating Waldenstrom's macroglobulinemia
EP3779440A1 (en) * 2013-09-23 2021-02-17 X-Body, Inc. Methods and compositions for generation of binding agents against cell surface antigens
CN105899536A (zh) * 2013-11-06 2016-08-24 百时美施贵宝公司 用抗cxcr4抗体治疗c1013g/cxcr4相关的华氏巨球蛋白血症
AU2014360426B2 (en) 2013-12-06 2020-05-07 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods to distinguish Waldenstrom's Macroglobulinemia from IgM monoclonal gammopathy of undetermined significance
EP3079683A4 (en) 2013-12-13 2017-12-20 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods to treat lymphoplasmacytic lymphoma
ES2795727T3 (es) 2014-01-15 2020-11-24 Medimmune Llc Anticuerpos específicos del vrs y partes funcionales de los mismos
EP3188800A4 (en) * 2014-09-02 2018-05-09 Cedars-Sinai Medical Center Compositions and methods for treating fibrosing disorders and cancer
US9982057B2 (en) 2014-11-17 2018-05-29 Pelican Therapeutics, Inc. Human TNFRSF25 antibody
ES2924394T3 (es) * 2015-01-09 2022-10-06 Adalta Ltd Moléculas de unión a CXCR4
BR112017014937A2 (pt) 2015-01-14 2018-03-13 Bristol-Myers Squibb Company dímeros de benzodiazepina ligados em ponte a heteroarileno, conjugados dos mesmos, e métodos de preparação e uso
BR112017022845A2 (pt) 2015-04-23 2018-07-17 Nantomics, Llc neoepítopos de câncer
JP2018516969A (ja) 2015-06-12 2018-06-28 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｐｄ−１およびｃｘｃｒ４シグナル伝達経路の組合せ遮断による癌の処置
CA3008678A1 (en) 2015-12-21 2017-06-29 Bristol-Myers Squibb Company Variant antibodies for site-specific conjugation
JP2019518006A (ja) 2016-04-29 2019-06-27 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド Ｍｙｄ８８変異型疾患における治療標的としてのｈｃｋ
CN109069665A (zh) 2016-05-10 2018-12-21 百时美施贵宝公司 具有增强的稳定性的微管溶素类似物的抗体-药物缀合物
CN109219620B (zh) 2016-06-09 2023-01-31 派立卡恩治疗公司 抗-tnfrsf25抗体
RU2769282C2 (ru) 2016-06-20 2022-03-30 Кимаб Лимитед Анти-PD-L1 и IL-2 цитокины
CN109641911B (zh) 2016-08-19 2023-02-21 百时美施贵宝公司 seco-环丙吡咯并吲哚化合物和其抗体-药物缀合物以及制备和使用方法
US10398783B2 (en) 2016-10-20 2019-09-03 Bristol-Myers Squibb Company Antiproliferative compounds and conjugates made therefrom
US20190389958A1 (en) * 2017-01-31 2019-12-26 Msm Protein Technologies, Inc. Anti-cxcr4 antibodies
US10494370B2 (en) 2017-08-16 2019-12-03 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a pyridine or pyrazine moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10508115B2 (en) 2017-08-16 2019-12-17 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having heteroatom-linked aromatic moieties, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10472361B2 (en) 2017-08-16 2019-11-12 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a benzotriazole moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10487084B2 (en) 2017-08-16 2019-11-26 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a heterobiaryl moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10457681B2 (en) 2017-08-16 2019-10-29 Bristol_Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a tricyclic moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
ES2973728T3 (es) * 2018-03-13 2024-06-24 Fundacion Para La Investigacion Biomedica Del Hospital Univ La Paz Anticuerpo anti-CXCR4 combinado con linfocitos citolíticos naturales activados y expandidos para inmunoterapia contra el cáncer
WO2019209811A1 (en) 2018-04-24 2019-10-31 Bristol-Myers Squibb Company Macrocyclic toll-like receptor 7 (tlr7) agonists
MX2020012674A (es) 2018-05-29 2021-02-09 Bristol Myers Squibb Co Porciones autoinmolantes modificadas para usarse en profarmacos y conjugados y metodos de uso y fabricacion.
AU2019302603A1 (en) 2018-07-13 2021-01-14 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Co-receptor systems for treating infectious diseases
US11554120B2 (en) 2018-08-03 2023-01-17 Bristol-Myers Squibb Company 1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidine compounds as toll-like receptor 7 (TLR7) agonists and methods and uses therefor
KR102861586B1 (ko) 2018-11-30 2025-09-17 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 글루타민-함유 경쇄 c-말단 연장부를 포함하는 항체, 그의 접합체, 및 방법 및 용도
US12478686B2 (en) 2018-12-12 2025-11-25 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies modified for transglutaminase conjugation, conjugates thereof, and methods and uses
JP7489407B2 (ja) 2019-05-21 2024-05-23 ノバルティス アーゲー Ｃｄ１９結合分子及びその使用
WO2021055306A1 (en) 2019-09-16 2021-03-25 Bristol-Myers Squibb Company Dual capture method for analysis of antibody-drug conjugates
KR20220098732A (ko) 2019-10-08 2022-07-12 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. 요법, 특히 myd88 돌연변이된 질환에 사용하기 위한 hck 억제제로서의 피라졸로피리미딘 유도체
EP4051298A1 (en) 2019-11-01 2022-09-07 Magenta Therapeutics, Inc. Dosing regimens for the mobilization of hematopoietic stem and progentor cells
JP2023509760A (ja) 2020-01-08 2023-03-09 シンシス セラピューティクス，インコーポレイテッド Ａｌｋ５阻害剤複合体およびその使用
WO2021216832A1 (en) * 2020-04-23 2021-10-28 Remd Biotherapeutics, Inc. Chemokine receptor 4 (cxcr4) antagonist antibodies
CA3176979A1 (en) 2020-04-27 2021-11-04 Anthony Boitano Methods and compositions for transducing hematopoietic stem and progenitor cells in vivo
CN112521500B (zh) * 2020-12-25 2022-06-24 暨南大学 与cxcr4结合的亲和力成熟结合蛋白及应用
CN112661845B (zh) * 2020-12-25 2022-06-21 暨南大学 与cxcr4结合的亲和力成熟结合蛋白及其应用
WO2022197776A1 (en) 2021-03-16 2022-09-22 Magenta Therapeutics, Inc. Dosing regimens for hematopoietic stem cell mobilization for stem cell transplants in multiple myeloma patients
CN117003876B (zh) * 2023-08-31 2024-06-18 恺佧生物科技(上海)有限公司 一种Anti-CXCR4膜蛋白抗体及其制备方法和应用
WO2025188694A1 (en) 2024-03-05 2025-09-12 Bristol-Myers Squibb Company Tricyclic tlr7 agonists and uses thereof
WO2025188693A1 (en) 2024-03-05 2025-09-12 Bristol-Myers Squibb Company Bicyclic tlr7 agonists and uses thereof

Family Cites Families (153)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4954617A (en) 1986-07-07 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
ATE243754T1 (de) 1987-05-21 2003-07-15 Micromet Ag Multifunktionelle proteine mit vorbestimmter zielsetzung
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
WO1990006952A1 (fr) 1988-12-22 1990-06-28 Kirin-Amgen, Inc. Facteur de stimulation de colonies de granulocytes modifies chimiquement
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US6261774B1 (en) 1990-06-11 2001-07-17 Gilead Sciences, Inc. Truncation selex method
US5789157A (en) 1990-06-11 1998-08-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US5712375A (en) 1990-06-11 1998-01-27 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US5864026A (en) 1990-06-11 1999-01-26 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US5763566A (en) 1990-06-11 1998-06-09 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue SELEX
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
GB9021679D0 (en) * 1990-10-05 1990-11-21 Gorman Scott David Antibody preparation
GB9108652D0 (en) 1991-04-23 1991-06-12 Antisoma Ltd Immunoreactive compounds
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
DE69233408T2 (de) 1991-12-02 2005-09-22 Cambridge Antibody Technology Ltd., Melbourn Herstellung von Antikörpern auf Phagenoberflächen ausgehend von Antikörpersegmentbibliotheken.
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
CA2118508A1 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Elizabeth S. Ward Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US6765087B1 (en) 1992-08-21 2004-07-20 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
DE69332643T2 (de) 1992-09-16 2003-11-27 The Scripps Research Institute, La Jolla Menschliche, neutralisierende, monoklonale antikörper gegen das respiratorische synzytialvirus
GB9223377D0 (en) 1992-11-04 1992-12-23 Medarex Inc Humanized antibodies to fc receptors for immunoglobulin on human mononuclear phagocytes
JP3919830B2 (ja) 1992-11-28 2007-05-30 財団法人化学及血清療法研究所 抗ネコヘルペスウイルス−１組換え抗体および該抗体をコードする遺伝子断片
JPH08509612A (ja) 1993-04-26 1996-10-15 ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
ES2162863T3 (es) 1993-04-29 2002-01-16 Unilever Nv Produccion de anticuerpos o fragmentos (funcionalizados) de los mismos derivados de inmunoglobulinas de cadena pesada de camelidae.
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
CA2117953C (en) 1993-10-14 2001-12-11 Tasuku Honjo Human stromal derived factor 1 alpha and 1 beta and dnas encoding the same
WO1995018634A1 (en) 1994-01-04 1995-07-13 The Scripps Research Institute Human monoclonal antibodies to herpes simplex virus and methods therefor
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6013443A (en) 1995-05-03 2000-01-11 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue SELEX
CA2219807C (en) 1995-05-03 2008-12-30 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US6090382A (en) 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
EP0983303B1 (en) 1997-05-21 2006-03-08 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
US5840598A (en) 1997-08-14 1998-11-24 Micron Technology, Inc. LOC semiconductor assembled with room temperature adhesive
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DK1071700T3 (da) 1998-04-20 2010-06-07 Glycart Biotechnology Ag Glykosylerings-modifikation af antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellulær cytotoksicitet
GB9814383D0 (en) 1998-07-02 1998-09-02 Cambridge Antibody Tech Improvements relating to antibodies
JP4593783B2 (ja) 1998-07-21 2010-12-08 ゲンマブ・アクティーゼルスカブ 抗ｃ型肝炎ウイルス抗体およびその使用
PL209392B1 (pl) 1999-01-15 2011-08-31 Genentech Inc Przeciwciało, komórka gospodarza, sposób wytwarzania przeciwciała oraz zastosowanie przeciwciała
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
CA2704600C (en) 1999-04-09 2016-10-25 Kyowa Kirin Co., Ltd. A method for producing antibodies with increased adcc activity
US6387620B1 (en) 1999-07-28 2002-05-14 Gilead Sciences, Inc. Transcription-free selex
MXPA02000962A (es) 1999-07-29 2002-07-02 Medarex Inc Anticuerpos monoclonales humanos para her2/neu.
EP1212422B1 (en) 1999-08-24 2007-02-21 Medarex, Inc. Human ctla-4 antibodies and their uses
US7605238B2 (en) 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
US6794132B2 (en) 1999-10-02 2004-09-21 Biosite, Inc. Human antibodies
EP1246607B1 (en) 1999-12-30 2007-06-27 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Proteoliposomes containing an integral membrane protein having one or more transmembrane domains
EP1332209B1 (en) 2000-09-08 2009-11-11 Universität Zürich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
US7138496B2 (en) * 2002-02-08 2006-11-21 Genetastix Corporation Human monoclonal antibodies against human CXCR4
US6818216B2 (en) 2000-11-28 2004-11-16 Medimmune, Inc. Anti-RSV antibodies
CA2430013C (en) 2000-11-30 2011-11-22 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
US20040001822A1 (en) 2000-12-29 2004-01-01 Avigdor Levanon Y1-isolated molecules comprising epitopes containing sulfated moieties, antibodies to such epitopes, and uses thereof
US20030157561A1 (en) 2001-11-19 2003-08-21 Kolkman Joost A. Combinatorial libraries of monomer domains
US20030082630A1 (en) 2001-04-26 2003-05-01 Maxygen, Inc. Combinatorial libraries of monomer domains
US20050089932A1 (en) 2001-04-26 2005-04-28 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20050048512A1 (en) 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
US20040175756A1 (en) 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
US20050053973A1 (en) 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
CN1789416B (zh) 2001-05-11 2011-11-16 协和发酵麒麟株式会社 含人抗体λ轻链基因的人类人工染色体
WO2002092780A2 (en) 2001-05-17 2002-11-21 Diversa Corporation Novel antigen binding molecules for therapeutic, diagnostic, prophylactic, enzymatic, industrial, and agricultural applications, and methods for generating and screening thereof
DK1399484T3 (da) 2001-06-28 2010-11-08 Domantis Ltd Dobbelt-specifik ligand og anvendelse af denne
CA2463879C (en) 2001-10-25 2012-12-04 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US7442512B2 (en) * 2001-11-30 2008-10-28 Chemocentryx, Inc. Compositions and methods for detecting and treating diseases and conditions related to chemokine receptors
AU2003217912A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Xencor Antibody optimization
BR0309145A (pt) 2002-04-09 2005-02-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk Células das quais o genoma é modificado
WO2003105898A1 (en) 2002-06-14 2003-12-24 Centocor, Inc. Modified "s" antibodies
AU2003244817B2 (en) 2002-06-28 2010-08-26 Domantis Limited Antigen-binding immunoglobulin single variable domains and dual-specific constructs
AU2003281200A1 (en) 2002-07-03 2004-01-23 Tasuku Honjo Immunopotentiating compositions
BRPI0315295C1 (pt) * 2002-10-17 2021-05-25 Genmab As anticorpo monoclonal humano isolado, célula hospedeira procariótica, composição farmacêutica, molécula biespecífica, usos de um anticorpo, métodos in vitro de detectar a presença de antígeno de cd20 ou uma célula que expressa cd20 em uma amostra, kit, e, vetor de expressão
EP1558645B1 (en) 2002-11-08 2011-07-27 Ablynx N.V. Stabilized single domain antibodies in pharmaceutical composition adapted for inhalation
AU2003299581A1 (en) 2002-12-02 2004-06-23 Abgenix, Inc. Antibodies against drugs of abuse
US20050002939A1 (en) * 2002-12-23 2005-01-06 Albert Zlotnik Tumor killing/tumor regression using CXCR4 antagonists
EP1578801A2 (en) 2002-12-27 2005-09-28 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
US9259459B2 (en) 2003-01-31 2016-02-16 Celldex Therapeutics Inc. Antibody vaccine conjugates and uses therefor
US20090005257A1 (en) 2003-05-14 2009-01-01 Jespers Laurent S Process for Recovering Polypeptides that Unfold Reversibly from a Polypeptide Repertoire
EP1633785B1 (en) 2003-05-21 2012-11-28 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies against bacillusanthracis protective antigen
DE602004017726D1 (de) 2003-06-30 2008-12-24 Domantis Ltd Pegylierte Single-domain-antikörper (dAb)
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
JP4751326B2 (ja) 2003-09-04 2011-08-17 メダレックス インコーポレイテッド 発現ベクター
US20050164301A1 (en) 2003-10-24 2005-07-28 Avidia Research Institute LDL receptor class A and EGF domain monomers and multimers
EP1697520A2 (en) * 2003-12-22 2006-09-06 Xencor, Inc. Fc polypeptides with novel fc ligand binding sites
US20060008844A1 (en) 2004-06-17 2006-01-12 Avidia Research Institute c-Met kinase binding proteins
US20060234299A1 (en) 2004-11-16 2006-10-19 Avidia Research Institute Protein scaffolds and uses thereof
MY157915A (en) * 2004-12-21 2016-08-15 Centocor Inc Anti-il-12 antibodies, epitopes, compositions, methods and uses.
AU2005325801A1 (en) 2005-01-31 2006-08-03 Ablynx N.V. Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies
CN101160324B (zh) 2005-02-18 2013-04-24 米德列斯公司 缺乏岩藻糖残基的抗前列腺特异性膜抗原(psma)单克隆抗体
WO2006089141A2 (en) * 2005-02-18 2006-08-24 Dana-Farber Cancer Institute Antibodies against cxcr4 and methods of use thereof
ES2569409T3 (es) 2005-03-08 2016-05-10 Pfizer Products Inc. Composiciones de anticuerpo anti-CTLA-4
JP2009509535A (ja) 2005-09-27 2009-03-12 アムニクス， インコーポレイテッド タンパク様薬剤およびその使用
CA2631184A1 (en) 2005-11-28 2007-05-31 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
MX2009003306A (es) * 2006-10-02 2009-04-23 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen a cxcr4 y sus usos.
CN104039320B (zh) * 2011-11-09 2019-10-15 百时美施贵宝公司 血液恶性肿瘤用抗-cxcr4抗体的治疗
CN105899536A (zh) * 2013-11-06 2016-08-24 百时美施贵宝公司 用抗cxcr4抗体治疗c1013g/cxcr4相关的华氏巨球蛋白血症

Also Published As

Publication number Publication date
CA2665239A1 (en) 2008-05-22
CY1117036T1 (el) 2017-04-05
TWI592425B (zh) 2017-07-21
EP2486941B1 (en) 2017-03-15
KR101722261B1 (ko) 2017-04-03
TW200831535A (en) 2008-08-01
TWI522366B (zh) 2016-02-21
PT2486941T (pt) 2017-05-30
LT2486941T (lt) 2017-06-12
HUE027165T2 (en) 2016-08-29
WO2008060367A3 (en) 2008-11-06
BRPI0718197A2 (pt) 2014-09-30
TW201604208A (zh) 2016-02-01
HUE033630T2 (en) 2017-12-28
JP6496673B2 (ja) 2019-04-03
US20100104508A1 (en) 2010-04-29
AU2007320024B2 (en) 2012-11-08
NO345287B1 (no) 2020-11-30
US8450464B2 (en) 2013-05-28
US11312777B2 (en) 2022-04-26
PL2486941T3 (pl) 2017-08-31
US20190031763A1 (en) 2019-01-31
ME02269B (me) 2016-04-28
JP2019054798A (ja) 2019-04-11
JP2013227339A (ja) 2013-11-07
CN103897058B (zh) 2018-06-15
DK2486941T3 (en) 2017-06-26
KR20150065959A (ko) 2015-06-15
AR063086A1 (es) 2008-12-23
SG10201608268RA (en) 2016-11-29
PT2066351E (pt) 2015-11-30
EP2486941A1 (en) 2012-08-15
JP5417175B2 (ja) 2014-02-12
NZ575924A (en) 2012-05-25
DK2066351T3 (en) 2015-12-14
ES2553553T3 (es) 2015-12-10
KR20090064589A (ko) 2009-06-19
IL197831A0 (en) 2011-08-01
HK1131904A1 (en) 2010-02-12
EP2066351B1 (en) 2015-09-09
IL197831A (en) 2017-01-31
JP2010505830A (ja) 2010-02-25
EP2066351A2 (en) 2009-06-10
EA018836B1 (ru) 2013-11-29
PL2066351T3 (pl) 2016-02-29
SI2486941T1 (sl) 2017-08-31
CL2007002835A1 (es) 2008-05-30
CY1118949T1 (el) 2018-01-10
JP2016105719A (ja) 2016-06-16
CN103897058A (zh) 2014-07-02
MX2009003306A (es) 2009-04-23
WO2008060367A9 (en) 2008-07-10
NO20091283L (no) 2009-04-24
SG178712A1 (en) 2012-03-29
RS55740B1 (sr) 2017-07-31
JP6097650B2 (ja) 2017-03-15
ZA200902256B (en) 2019-02-27
WO2008060367A2 (en) 2008-05-22
CN101528259B (zh) 2014-04-09
CN101528259A (zh) 2009-09-09
US10106615B2 (en) 2018-10-23
AR113225A2 (es) 2020-02-19
US20130251729A1 (en) 2013-09-26
AU2007320024A1 (en) 2008-05-22
SI2066351T1 (sl) 2016-02-29
EA200900424A1 (ru) 2009-08-28
KR20170123712A (ko) 2017-11-08
ES2625798T3 (es) 2017-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11312777B2 (en) Human monoclonal antibodies that bind CXCR4 and uses thereof
ME02345B (me) MONOKLONSKA ANTlTELA PROTIV GLIPIKANA-3
CN101370830A (zh) 抗cd70的人单克隆抗体
HK1174828A (en) Human antibodies that bind cxcr4 and uses thereof
HK1174828B (en) Human antibodies that bind cxcr4 and uses thereof
HK1131904B (en) Human antibodies that bind cxcr4 and uses thereof