TWI592425B - 與ｃｘｃｒ４結合之人抗體及彼之用途 - Google Patents

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Description

與CXCR4結合之人抗體及彼之用途
本發明關於與CXCR4結合之人抗體及其用途。
趨化因子(chemokines)係包含約50個小蛋白質之家族，其可調節細胞遷移及血管新生及在腫瘤微環境中亦具有重要功能(Vicari,A.P.and Caux,C.(2002)Cytokine Growth Factor Rev.13：143-154)。根據它們的構造，趨化因子被分成C-C趨化因子(包含半胱胺酸-半胱胺酸模體(motif))或C-X-C趨化因子(包含半胱胺酸-X-半胱胺酸模體)。與該趨化因子結合之受體因此被分別歸類為CCR家族或CXCR家族之成員。CXCR家族的成員之一係CXCR4，其為大多表現在淋巴球上及活化趨化性之7次跨膜G蛋白偶聯受體。CXCR4與趨化因子CXCL12(SDF-1)結合。
CXCR4影響胚胎發生、恆定狀態及發炎。經工程化以令鼠之CXCR4或SDF-1缺損的研究顯示，CXCR4/SDF-1路徑與器官血管化及免疫和造血系統有關 (Tachibana,K.et al.(1998)Nature 393：591-594)。此外，CXCR4經顯示可作為嗜T淋巴細胞HIV-1毒株之協同受體(Feng,Y.et al.(1996)Science 272：872-877)。CXCR4亦經顯示可表現於廣泛之癌細胞類型。另外，CXCR4/SDF-1路徑經顯示與刺激許多不同腫瘤之轉移過程有關(Murphy,P.M.(2001)N.Engl.J.Med.345：833-835)。舉例來說，研究顯示CXCR4及SDF-1藉由在原發腫瘤部位及轉移部位之間產生趨化梯度以調節器官特異性轉移(Muller,A.et al.(2001)Nature 410：50-56；Murakami,T.et al.(2002)Cancer Res.62：7328-7334；Hanahan,D.et al.(2003)Cancer Res.63：3005-3008)。
發明簡述
本發明提供與人CXCR4結合及展現數種所欲特性之經分離之單株抗體，特別是人單株抗體。這些特性包括與細胞表面上所表現之天然人CXCR4結合的能力、抑制SDF-1與人CXCR4結合之能力、抑制於表現CXCR4之細胞中經SDF-1誘發鈣離子流動之能力、抑制表現CXCR4之細胞經SDF-1誘發之移動的能力、抑制由人臍靜脈內皮細胞(HuVECs)之毛細血管形成的能力、誘發表現CXCR4之細胞凋亡的能力、於活體外抑制腫瘤細胞增生之能力、於活體內抑制腫瘤細胞增生之能力、抑制CXCR4+腫瘤細胞轉移之能力及/或增加CXCR4+腫瘤患 者存活時間之能力。
在一方面，本發明與經分離之人單株抗體或其抗原結合部位有關，其中該抗體與表現在細胞表面上之天然人CXCR4結合。在一實施態樣中，該抗體亦抑制SDF-1與人CXCR4結合，較佳以50nM或更低，或30nM或更低，或15nM或更低，或10nM或更低，或5nM或更低，或3nM或更低之EC50值抑制(例如抑制之EC50值為28.60nM或更低、或12.51nM或更低、或2.256nM或更低)。在其他實施態樣中，該抗體與細胞表面上表現之天然人CXCR4結合，但是不抑制SDF-1與人CXCR4結合。在其他實施態樣中，該抗體亦抑制於表現人CXCR4之細胞中經SDF-1誘發之鈣離子流動，較佳以3nM或更低，或2nM或更低，或1nM或更低，或0.9nM或更低，或0.8nM或更低，或0.7nM或更低、或0.6nM或更低、或0.5nM或更低、或0.4nM或更低之EC50值抑制(例如0.9046nM或更低、0.5684nM或更低、或0.3219nM或更低)。在其他實施態樣中，該抗體亦抑制表現人CXCR4細胞經SDF-1誘發之移動，較佳以50nM或更低，或30nM或更低，或20nM或更低，或15nM或更低之EC50值抑制(例如18.99nM或更低、或12.44nM或更低)。在其他實施態樣中，該抗體亦抑制由HuVECs之毛細血管形成、誘導表現CXCR4之細胞的凋亡、於活體外抑制腫瘤細胞增生、於活體內抑制腫瘤細胞增生或誘發腫瘤細胞凋亡、抑制CXCR4+腫瘤 細胞轉移及/或增加CXCR4+腫瘤患者之存活時間。
較佳的是，該抗體以高親和性(諸如以1×10-7M或更低之KD值或以5×10-8M或更低之KD值)與人CXCR4結合。較佳的是，本發明之抗體係全長抗體(也就是包含變異區及固定區)。另外，本發明之抗體較佳係以抗宿主細胞上或人工膜中以其天然構型表現之全長人CXCR4製備。
在較佳之態樣中，本發明關於一種經分離之人單株抗體或其抗原結合部位，其中該抗體：(a)與表現在細胞表面上之天然人CXCR4結合；(b)抑制SDF-1與人CXCR4結合；(c)抑制於表現人CXCR4之細胞中經SDF-1誘發之鈣離子流動；(d)抑制表現人CXCR4之細胞經SDF-1誘發的移動；及(e)抑制由人臍靜脈內皮細胞之毛細血管形成。
甚至更佳的是，該抗體亦誘導表現人CXCR4之細胞的凋亡及/或抑制CXCR4+腫瘤細胞生長及/或於活體內誘發腫瘤細胞凋亡。
在其他態樣中，本發明關於經分離之人單株抗體或其抗原結合部位，其中該抗體與參考抗體交互競爭與CXCR4之結合，其中該參考抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的重鏈變異區及包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的輕鏈變異區；或 (b)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的重鏈變異區及包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列的輕鏈變異區；或(c)包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的重鏈變異區及包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的輕鏈變異區；或(d)包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的重鏈變異區及包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的輕鏈變異區。
在特定實施態樣中，本發明提供一種經分離之單株抗體或其抗原結合部位，其包含為人VH 3-48基因之產物或衍生自該人VH 3-48基因之產物的重鏈變異區，其中該抗體與人CXCR4專一性結合。在其他實施態樣中，本發明提供一種經分離之單株抗體或其抗原結合部位，其包含為人VK L15基因之產物或衍生自該人VK L15基因之產物的輕鏈變異區，其中該抗體與人CXCR4專一性結合。在其他實施態樣中，本發明提供一種經分離之單株抗體或其抗原結合部位，其包含為人VH 3-48基因之產物或衍生自該人VH 3-48基因之產物的重鏈變異區及為人VK L15基因之產物或衍生自該人VK L15基因之產物的輕鏈變異區，其中該抗體與人CXCR4專一性結合。
在其他態樣中，本發明提供一種經分離之單株抗體或其抗原結合部位，其包含：包含CDR1、CDR2及CDR3序列之重鏈變異區；及包含CDR1、CDR2及CDR3序列之輕鏈變異區，其中：(a)該重鏈變異區CDR3序列包含選自SEQ ID NO：9-12中之胺基酸序列的胺基酸序列及其保留性修飾； (b)該輕鏈變異區CDR3序列包含選自SEQ ID NO：21-24中之胺基酸序列的胺基酸序列及其保留性修飾；及(c)該抗體與細胞表面上所表現之天然人CXCR4結合。
在較佳之實施態樣中，此抗體亦具有下列一或多項特徵：抑制SDF-1與CXCR4結合、抑制於表現CXCR4之細胞中經SDF-1誘發之鈣離子流動、抑制表現CXCR4之細胞經SDF-1誘發的移動；抑制由HuVECs之毛細血管形成；誘導表現CXCR4之細胞的細胞凋亡(活體外及/或活體內)、於活體外及/或活體內抑制CXCR4+腫瘤細胞生長，及/或抑制CXCR4+腫瘤細胞轉移。
較佳的是，該重鏈變異區CDR2序列包含選自SEQ ID NO：5-8中之胺基酸序列的胺基酸序列及其保留性修飾；及該輕鏈變異區CDR2序列包含選自SEQ ID NO：17-20中之胺基酸序列的胺基酸序列及其保留性修飾。較佳的是，該重鏈變異區CDR1序列包含選自SEQ ID NO：1-4中之胺基酸序列的胺基酸序列及其保留性修飾；及該輕鏈變異區CDR1序列包含選自SEQ ID NO：13-16中之胺基酸序列的胺基酸序列及其保留性修飾。
較佳之組合包含：(a)包含SEQ ID NO：1之重鏈變異區CDR1；(b)包含SEQ ID NO：5之重鏈變異區CDR2；(c)包含SEQ ID NO：9之重鏈變異區CDR3； (d)包含SEQ ID NO：13之輕鏈變異區CDR1；(e)包含SEQ ID NO：17之輕鏈變異區CDR2；及(f)包含SEQ ID NO：21之輕鏈變異區CDR3。
其他較佳之組合包含：(a)包含SEQ ID NO：2之重鏈變異區CDR1；(b)包含SEQ ID NO：6之重鏈變異區CDR2；(c)包含SEQ ID NO：10之重鏈變異區CDR3；(d)包含SEQ ID NO：14之輕鏈變異區CDR1；(e)包含SEQ ID NO：18之輕鏈變異區CDR2；及(f)包含SEQ ID NO：22之輕鏈變異區CDR3。
其他較佳之組合包含：(a)包含SEQ ID NO：3之重鏈變異區CDR1；(b)包含SEQ ID NO：7之重鏈變異區CDR2；(c)包含SEQ ID NO：11之重鏈變異區CDR3；(d)包含SEQ ID NO：15之輕鏈變異區CDR1；(e)包含SEQ ID NO：19之輕鏈變異區CDR2；及(f)包含SEQ ID NO：23之輕鏈變異區CDR3。
其他較佳之組合包含：(a)包含SEQ ID NO：4之重鏈變異區CDR1；(b)包含SEQ ID NO：8之重鏈變異區CDR2；(c)包含SEQ ID NO：12之重鏈變異區CDR3；(d)包含SEQ ID NO：16之輕鏈變異區CDR1；(e)包含SEQ ID NO：20之輕鏈變異區CDR2；及(f)包含SEQ ID NO：24之輕鏈變異區CDR3。
本發明之其他較佳抗體或其抗原結合部位包含：(a)包含選自SEQ ID NO：25-28及41-44中之胺基酸序列的重鏈變異區；及(b)包含選自SEQ ID NO：29-32及45-48中之胺基酸序列的輕鏈變異區；其中該抗體與CXCR4專一性結合。
較佳之組合包含：(a)包含SEQ ID NO：25或41之胺基酸序列的重鏈變異區；及(b)包含SEQ ID NO：29或45之胺基酸序列的輕鏈變異區。
其他較佳之組合包含：(a)包含SEQ ID NO：26或42之胺基酸序列的重鏈變異區；及(b)包含SEQ ID NO：30或46之胺基酸序列的輕鏈變異區。
其他較佳之組合包含：(a)包含SEQ ID NO：27或43之胺基酸序列的重鏈變異區；及(b)包含SEQ ID NO：31或47之胺基酸序列的輕鏈變異區。
其他較佳之組合包含：(a)包含SEQ ID NO：28或44之胺基酸序列的重鏈變異區；及(b)包含SEQ ID NO：32或48之胺基酸序列的輕鏈變異區。
本發明之其他態樣提供與任何前述抗體競爭結合CXCR4之抗體或其抗原結合部位。
本發明之抗體舉例來說可為全長抗體，例如IgG1或IgG4同型。或者，該抗體可為抗體片段(諸如Fab、Fab’或Fab’2片段)，或單鏈抗體。
本發明亦提供一種免疫偶聯物，其包含與治療劑(諸如細胞毒素或放射性同位素)連接之本發明之抗體或其抗 原結合部位。本發明亦提供包含本發明之抗體或其抗原結合部位之雙特異性分子，其與具有異於該抗體或其抗原結合部位之結合專一性的第二官能性基團連接。
本發明亦提供包含本發明之抗體或其抗原結合部位或免疫偶聯物或雙特異性分子及藥學上可接受之載劑的組成物。
本發明亦包含編碼本發明之抗體或其抗原結合部位之核酸分子，以及包含該核酸之表現載體及包含該表現載體之宿主細胞。本發明亦提供利用包含該表現載體之宿主細胞製備抗CXCR4抗體之方法，其可能包括(i)在宿主細胞中表現該抗體及(ii)自宿主細胞分離該抗體之步驟。
本發明之其他態樣關於調節細胞中CXCR4活性之方法，其中令細胞與本發明之抗體或其抗原結合部位接觸。藉由令細胞與抗體一起培養可在活體外使細胞被接觸或藉由投服抗體至個體可在活體內使細胞被接觸。在較佳之實施態樣中，該細胞為表現CXCR4之腫瘤細胞且該方法導致抑制腫瘤細胞生長及/或抑制腫瘤細胞轉移。在其他實施態樣中，該細胞為表現CXCR4之T細胞且該方法導致抑制HIV進入細胞中。在其他實施態樣中，該細胞為發炎疾病中之淋巴球且該方法導致抑制發炎。在其他實施態樣中，該細胞與血管化有關且該方法導致調節血管新生。
在其他態樣中，本發明關於一種刺激CD34+幹細胞自個體之骨髓移動至週邊血液之方法，該方法包含投服本發明之抗體或其抗原結合部位至個體以刺激CD34+幹細 胞自骨髓移動至週邊血液。該方法可進一步包含自週邊血液收集CD34+幹細胞，諸如自體幹細胞移植之用途。
本發明之其他特性及好處將顯見於下列詳細說明及實施方式中，但不應被視為具有限制性。所有本申請書所引述之參考文獻、基因登錄號(Genbank entries)、專利及公開專利申請書的內容以參照方式明確納入此處。
發明詳細說明
本發明關於經分離之單株抗體(特別是人單株抗體)，其與細胞表面上所表現之天然人CXCR4專一性結合。在特定實施態樣中，本發明之抗體源自特定重鏈及輕鏈胚系序列及/或包含特定結構特性諸如CDR區域包含特定胺基酸序列。本發明提供經分離之抗體、製備該抗體之方法、包含該抗體之免疫偶聯物及雙特異性分子，及包含本發明之抗體、免疫偶聯物或雙特異性分子之醫藥組成物。本發明亦關於使用抗體之方法，諸如用於偵測CXCR4，或在與CXCR4表現有關或涉及CXCR4/SDF-1途徑之疾病或異常中(諸如癌症、腫瘤轉移、HIV感染、發炎及血管新生)用於調節CXCR4之活性。因此，本發明亦提供使用本發明之抗CXCR4抗體以治療癌症之方法，例如治療乳癌、卵巢癌、前列腺癌、非小細胞肺癌、胰癌、甲狀腺癌、黑色素癌、鼻咽癌、腎細胞癌、淋巴癌、神經母細胞瘤、膠質母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、大腸直腸癌、腎癌、骨肉瘤、急性淋巴細胞白血病或急性骨髓性白血病。此外， 本發明提供使用本發明之抗CXCR4抗體以抑制腫瘤轉移之方法。
為了更清楚的了解本發明，首先定義特定名詞。其它定義如詳細說明中各處所述。
「CXCR4」一詞包括變異體(variants)、同型體(isoforms)、同源物(homologs)、直系同源物(orthologs)及旁系同源物(paralogs)。舉例來說，對CXCR4具專一性之抗體在特定情況下可能與來自非人物種之CXCR4交叉反應。在其他實施態樣中，對人CXCR4具專一性之抗體可能對人CXCR4具有完全專一性及可能不展現物種或其他類型之交叉反應。「人CXCR4」一詞係指人序列CXCR4，諸如Genbank收錄號為P61073之人CXCR4的完整胺基酸序列(SEQ ID NO：51)。CXCR4在該領域中亦被稱為例如LESTR、融合素(Fusin)或CD184。人CXCR4序列可能與SEQ ID NO：51之人CXCR4不同，例如具有保留性突變或非保留區之突變及該CXCR4實質上具有與SEQ ID NO：51之人CXCR4相同的生物功能。舉例來說，人CXCR4之生物功能係在CXCR4之胞外結構域中具有與本發明之抗體專一性結合的抗原決定位，或人CXCR4之生物性功能係結合趨化因子或與腫瘤轉移過程有關。
特定人CXCR4序列之胺基酸序列通常與SEQ ID NO：51之人CXCR4具有至少90%之一致性及包含當與其他物種(例如鼠)之CXCR4胺基酸序列比較時可識別該 胺基酸序列之為人之胺基酸序列的胺基酸殘基。在特定情況下，人CXCR4之胺基酸序列可能與SEQ ID NO：51之CXCR4具有至少95%，或甚至至少96%、97%、98%或99%之一致性。在特定實施態樣中，人CXCR4序列將顯示與SEQ ID NO：51之CXCR4不超過10個胺基酸的差異。在特定實施態樣中，人CXCR4可能顯示與SEQ ID NO：51之CXCR4不超過5個，或甚至不超過4、3、2或1個胺基酸的差異。一致性百分比可依此處所述測定。
「SDF-1」一詞係指基質細胞衍生因子1，其為CXCR4之配體。「SDF-1」一詞包含SDF-1之不同同型體，諸如SDF-1α及SDF-1β。人SDF-1α之胺基酸序列的Genbank收錄號為NP_954637。人SDF-1β之胺基酸序列的Genbank收錄號為NP_000600。人SDF-1亦於美國專利第5,756,084號中描述。SDF-1亦稱為CXCL12。人SDF-1之胺基酸序列可異於NP_954637或NP_000600之SDF-1，如此處所述CXCR4之情形。
「免疫反應」一詞係指例如淋巴球、抗原表現細胞、吞噬細胞、顆粒細胞及由上述細胞或肝臟所產生之可溶性巨分子(包括抗體、細胞激素及補體)的作用，該作用導致選擇性破壞、摧毀或清除入侵人體中之病原、受病原感染之細胞或組織、癌細胞或在自體免疫或病理性發炎的狀況中之正常人細胞或組織。
「信號轉導路徑」係指具有自細胞的一部分傳遞信號至細胞其他部分之功能的各種信號轉導分子之間的生化關 係。此處所使用的「細胞表面受體」一詞包括例如可接受信號及傳遞該信號通過細胞質膜的分子及分子複合體。本發明之「細胞表面受體」的一個例子為CXCR4受體。
此處所指的「抗體」一詞包括完整抗體及任何抗原結合片段(意即「抗原結合部位」)或其單鏈。「抗體」係指包含以雙硫鍵相連之至少2條重(H)鏈及2條輕(L)鏈的糖蛋白，或其抗原結合部位。每條重鏈係由一個重鏈變異區(此處縮寫為VH)及一個重鏈固定區組成。重鏈固定區係由3個結構域(CH1、CH2及CH3)組成。每條輕鏈係由一個輕鏈變異區(此處縮寫為VL)及一個輕鏈固定區組成。輕鏈固定區係由1個結構域(CL)組成。VH及VL區可進一步細分為高變異區(稱為互補決定區(CDR))及夾雜其間較具保留性之區域(稱為構架區(FR))。每個VH及VL係由3個CDRs及4個FRs組成，以下列順序自胺基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之變異區包含與抗原交互反應之結合結構域。抗體之固定區可調節免疫球蛋白與宿主組織或因子之結合，包括免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及典型補體系統之第一成分(C1q))。
此處所使用之抗體的「抗原結合部位」(或簡稱「抗體部位」)一詞係指具有與抗原(例如CXCR4)專一性結合之能力的一或多個抗體片段。研究顯示抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段進行。抗體之「抗原結合部位」一詞所包含的結合片段例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、 CL及CH1結構域所組成之單價片段；(ii)F(ab’)2片段，包含2個以雙硫鍵連接絞鏈區之Fab片段的雙價片段；(iii)Fab’片段，其實質上為包含部分絞鏈區之Fab(見FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(Paul ed.,3.sup.rd ed.1993))；(iv)由VH及CH1結構域組成之Fd片段；(v)由抗體單臂之VL及VH結構域所組成的Fv片段；(vi)dAb片段(Ward et al.,(1989)Nature 341：544-546)，其由VH結構域組成；(vii)經分離之互補決定區(CDR)；及(viii)奈米抗體，包含單一變異結構域及2個固定結構域之重鏈變異區。另外，雖然Fv片段之2個結構域(VL及VH)係由分開之基因編碼，可利用重組方法藉由合成連接子將它們連接，以使它們可被製備為其中VL及VH區域配對以形成單價分子之單一蛋白質鏈(被稱為單鏈Fv(scFv)；見例如Bird et al.(1988)Science 242：423-426；and Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。該單鏈抗體亦意圖被包含在抗體之「抗原結合部位」一詞內。這些抗體片段係利用該領域之技術人士所知之傳統技術獲得，及該片段係經篩選以依與完整抗體相同之方式被利用。
此處所使用之「經分離之抗體」意指實質上不含其他具有不同抗原特異性之抗體的抗體(例如與CXCR4專一性結合之經分離之抗體實質上不含與非CXCR4抗原專一性結合之抗體)。然而，與CXCR4專一性結合之經分離之抗體可能具有對其他抗原(諸如來自其他物種之CXCR4 分子)之交叉反應。另外，經分離之抗體可能實質上不含其他細胞物質及/或化學物質。
此處所使用之「單株抗體」或「單株抗體組成物」係指單一分子組成物之抗體分子製劑。單株抗體組成物展現對特定抗原決定位之單一結合專一性及親和性。
此處所使用之「人抗體」一詞意圖包括具有其中構架區及CDR區均源自人胚系免疫球蛋白序列之變異區的抗體。另外，如果抗體包含固定區，該固定區亦源自人胚系免疫球蛋白序列。本發明之人抗體可包括非由人胚系免疫球蛋白序列所編碼之胺基酸殘基(例如由活體外隨機或定點突變或由活體內體突變所導入之突變)。然而，此處所使用之「人抗體」一詞並非意圖包括其中源自其他哺乳類物種(諸如鼠)胚系之CDR序列已被移殖至人構架序列之抗體。
「人單株抗體」一詞係指展現單一結合專一性之抗體，其具有其中構架區及CDR區均源自人胚系免疫球蛋白序列之變異區。在一實施態樣中，人單株抗體係由包括融合至永生化細胞之B細胞的融合瘤產生，該B細胞得自具有包含人重鏈轉殖基因及輕鏈轉殖基因之基因體的基因轉殖非人動物(例如基因轉殖鼠)。
此處所使用之「重組人抗體」一詞包括所有以重組方式製備、表現、生產或經分離之人抗體，諸如(a)自轉殖人免疫球蛋白基因或染色體之動物(例如鼠)或由其所製備之融合瘤分離的抗體(如下述)，(b)自經轉化以表現人抗 體之宿主細胞(例如自轉染瘤)分離之抗體，(c)自重組、組合之人抗體庫分離的抗體，及(d)以任何其他涉及剪接人免疫球蛋白基因序列至其他DNA序列之方法所製備、表現、生產或分離之抗體。該重組人抗體具有其中構架區及CDR區係源自人胚系免疫球蛋白序列之變異區。然而在特定實施態樣中，該重組人抗體可發生活體外突變(或使用轉殖人Ig序列之動物時之活體內體突變)，因此當該重組抗體之VH及VL區域的胺基酸序列係源自及關於人胚系VH及VL序列時，其為天然可能不存在活體內人抗體胚系庫中之序列。
此處所使用之「同型」係指由重鏈固定區基因所編碼之抗體類型(例如IgM或IgG1)。
「識別抗原之抗體」及「具抗原專一性之抗體」之用語在此處可與「與抗原專一性結合之抗體」交換使用。
「人抗體衍生物」一詞係指任何修飾形式之人抗體，例如抗體與其他劑質或抗體之偶聯物。
「人化抗體」一詞意圖指其中源自其他哺乳類動物(諸如鼠)胚系之CDR序列被移植至人構架序列之抗體。其它構架區修飾可在人構架序列中進行。
「嵌合抗體」一詞意圖指其中變異區序列源自一物種及固定區序列源自其他物種之抗體，諸如其中變異區序列源自鼠抗體及固定區序列源自人抗體之抗體。
此處所使用之「與人CXCR4專一性結合」之抗體意圖指與人CXCR4(及可能是來自一或多種非人物種之 CXCR4)結合但實質上不與非CXCR4蛋白質結合之抗體。在特定實施態樣中，本發明之抗體與SEQ ID NO：51之人CXCR4或其變異體專一性結合。較佳的是，該抗體以1×10-7M或更低(更佳以5×10-8M或更低、更佳以3×10-8M或更低、更佳以1×10-8M或更低、甚至更佳以5×10-9M或更低)之KD值與人CXCR4結合。
此處所使用之「實質上不結合」蛋白質或細胞係指不結合或不以高親和性結合蛋白質或細胞，意即以1×10-6M或更高(更佳以1×10-5M或更高、更佳以1×10-4M或更高、更佳以1×10-3M或更高、甚至更佳以1×10-2M或更高)之KD值結合蛋白質或細胞。
此處所使用之「Kassoc」或「Ka」一詞意圖指特定抗體-抗原交互作用之結合率，然而此處所使用之「Kdis」或「Kd」一詞意圖指特定抗體-抗原交互作用之解離率。此處所使用之「KD」一詞意圖指解離常數，其係自Kd與Ka之比(意即Kd/Ka)求出及係以莫耳濃度(M)表示。抗體之KD值可利用該領域已完整建立之方法測定。測定抗體KD值之較佳方法係利用表面電漿共振技術進行，以使用生物感測器系統諸如Biacore®系統為佳。
此處所使用之對IgG抗體具有「高親和性」一詞係指抗體對目標抗原具有1×10-7M或更低(更佳為5×10-8M或更低、甚至更佳為1×10-8M或更低、甚至更佳為5×10-9M或更低及甚至更佳為1×10-9M或更低)之KD值。然而，對其他抗體同型而言「高親和性」結合可有所 不同。舉例來說，與IgM同型「高親和性」結合係指抗體之KD值為10-6M或更低(更佳為10-7M或更低、甚至更佳為10-8M或更低)。
此處所使用之「個體」一詞包括任何人或非人動物。「非人動物」一詞包括所有脊椎動物，例如哺乳類及非哺乳類，諸如非人靈長類、羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲類、爬蟲類等。
本發明之不同態樣於下面更詳細地描述。
抗CXCR4抗體
本發明之抗體的特徵為具有抗體之特定功能性質或特性。舉例來說，抗體與在細胞表面上表現之天然人CXCR4結合。較佳的是，本發明之抗體以高親和性與CXCR4結合，例如10-7M或更低之KD值。本發明之抗CXCR4抗體以展現一或多項下列特徵為宜：(a)與表現在細胞表面上之天然人CXCR4結合；(b)抑制SDF-1與CXCR4結合；(c)抑制於表現CXCR4之細胞中經SDF-1誘發之鈣離子流動；(d)抑制表現CXCR4之細胞經SDF-1誘發的移動；(e)抑制由人臍靜脈內皮細胞之毛細血管形成；(f)以10-7M或更低之KD值與人CXCR4結合；(g)誘發表現CXCR4之細胞的細胞凋亡； (h)於活體內抑制腫瘤細胞增生；(i)於活體內抑制腫瘤細胞增生及/或誘發腫瘤細胞凋亡；(j)抑制CXCR4+腫瘤細胞之轉移；及/或(k)增加CXCR4+腫瘤患者之存活時間。
在特定實施態樣中，本發明之抗體與細胞表面上之天然人CXCR4結合但是不抑制SDF-1與CXCR4結合及不抑制於表現CXCR4之細胞中經SDF-1誘發之鈣離子流動及不抑制表現CXCR4之細胞經SDF-1誘發的移動。在其他實施態樣中，本發明之抗體與細胞表面上之天然人CXCR4結合及抑制SDF-1與CXCR4結合及抑制於表現CXCR4之細胞中經SDF-1誘發之鈣離子流動但不抑制表現CXCR4之細胞經SDF-1誘發的移動。在其他實施態樣中，本發明之抗體與細胞表面上之天然人CXCR4結合及抑制SDF-1與CXCR4結合及抑制於表現CXCR4之細胞中經SDF-1誘發之鈣離子流動及抑制表現CXCR4之細胞經SDF-1誘發的移動。在其他實施態樣中，本發明之抗體與細胞表面上之天然人CXCR4結合、抑制SDF-1與CXCR4結合、抑制於表現CXCR4之細胞中經SDF-1誘發之鈣離子流動、抑制表現CXCR4之細胞經SDF-1誘發的移動及抑制由HuVECs之毛細血管形成。
較佳的是，本發明之抗體以5×10-8M或更低之KD值與人CXCR4結合，以2×10-8M或更低之KD值與人CXCR4結合，以5×10-9M或更低之KD值與人CXCR4 結合，以4×10-9M或更低之KD值與人CXCR4結合，以3×10-9M或更低之KD值與人CXCR4結合，或以2×10-9M或更低之KD值與人CXCR4結合。
較佳的是，本發明之抗體以50nM或更低之抑制EC50值抑制SDF-1與人CXCR4結合，更佳為30nM或更低，或15nM或更低，或10nM或更低，或5nM或更低，或3nM或更低(例如28.60nM或更低，或12.51nM或更低，或2.256nM或更低之抑制EC50值)。
較佳的是，本發明之抗體以3nM或更低(更佳為2nM或更低，或1nM或更低，或0.9nM或更低，或0.8nM或更低，或0.7nM或更低，或0.6nM或更低，或0.5nM或更低，或0.4nM或更低)之抑制EC50值抑制於表現人CXCR4之細胞中經SDF-1誘發之鈣離子流動(例如0.9046nM或更低，0.5684nM或更低，或0.3219nM或更低)。
較佳的是，本發明之抗體以50nM或更低(更佳為30nM或更低，或20nM或更低，或15nM或更低)之抑制EC50值抑制表現人CXCR4之細胞經SDF-1誘發的移動(例如18.99nM或更低，或12.44nM或更低)。
評估抗體對表現在細胞表面上之天然人CXCR4之結合能力的標準試驗係該領域中所知，包括例如使用自然表現天然CXCR4或經轉染以表現天然CXCR4之細胞系的流式細胞分析。適當分析方法詳細描述於實施例中。表現 天然CXCR4之較佳細胞系為CEM T細胞系。實施例中亦詳細描述用於評估抑制與SDF-1結合、抑制SDF-1所誘發之鈣離子流動、抑制SDF-1所誘發之細胞移動、抑制HuVECs之毛細血管形成、於活體外及/或活體內誘導表現CXCR4之細胞的凋亡、抑制活體外及/或活體內CXCR4+腫瘤細胞之生長，及/或抑制CXCR4+腫瘤細胞轉移之適當檢測法。抗體之結合親和性亦可以標準方法測定，諸如斯科查德(Scatchard)分析法。
單株抗體F7、F9、D1及E2
本發明之較佳抗體係人單株抗體F7、F9、D1及E2，以實施例1及2中所述之方式加以分離及結構特徵化。F7、F9、D1及E2之VH胺基酸序列係分別如SEQ ID NO：25,26,27及28中所示。F7、F9、D1及E2之VL胺基酸序列係分別如SEQ ID NO：29,30,31及32中所示。此外製備替代形式之F7、F9、D1及E2(其中特定構架殘基以胚系殘基取代)，並在此處以F7GL、F9GL、D1GL及E2GL表示。F7GL、F9GL、D1GL及E2GL之VH胺基酸序列分別如SEQ ID NO：41,42,43及44中所示。F7GL、F9GL、D1GL及E2GL之VL胺基酸序列分別如SEQ ID NO：45,46,47及48中所示。
由於這些抗體中的每一個都可以和CXCR4結合，因此該VH及VL序列可被「混合及配對」以產生本發明之其他抗CXCR4結合分子。CXCR4與該「混合及配對」 抗體之結合可利用上述及實施例中所描述之結合試驗分析(例如CEM細胞之流式細胞分析)。較佳的是，當VH及VL鏈被混合及配對時，來自特定VH/VL對之VH序列係以結構類似之VH序列取代。同樣的，來自特定VH/VL對之VL序列以結構類似之VL序列取代為宜。
因此在一態樣中，本發明提供一種經分離之單株抗體或其抗原結合部位，其包含：(a)包含選自SEQ ID NO：25-28及41-44中之胺基酸序列的重鏈變異區；及(b)包含選自SEQ ID NO：29-32及45-48中之胺基酸序列的輕鏈變異區；其中該抗體與CXCR4專一性結合，特別是人CXCR4。
較佳之重鏈及輕鏈組合包括：(a)包含SEQ ID NO：25或41之胺基酸序列的重鏈變異區及包含SEQ ID NO：29或45之胺基酸序列的輕鏈變異區；或(b)包含SEQ ID NO：26或42之胺基酸序列的重鏈變異區及包含SEQ ID NO：30或46之胺基酸序列的輕鏈變異區；或(c)包含SEQ ID NO：27或43之胺基酸序列的重鏈變異區及包含SEQ ID NO：31或47之胺基酸序列的輕鏈變異區；或(d)包含SEQ ID NO：28或44之胺基酸序列的重鏈變 異區及包含SEQ ID NO：32或48之胺基酸序列的輕鏈變異區。
在其他態樣中，本發明提供包含F7、F9、D1或E2之重鏈及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3或彼等組合之抗體。F7、F9、D1及E2之VH CDR1的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：1-4中所示。F7、F9、D1及E2之VH CDR2的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：5-8中所示。F7、F9、D1及E2之VH CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：9-12中所示。F7、F9、D1及E2之VK CDR1的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：13-16中所示。F7、F9、D1及E2之VK CDR2的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：17-20中所示。F7、F9、D1及E2之VK CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：21-24中所示。該CDR區係利用Kabat系統描述(Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)。
由於這些抗體中之每一個均可與CXCR4結合且抗原結合專一性主要係由CDR1、CDR2、及CDR3區決定，該VH CDR1、CDR2、及CDR3序列及VK CDR1、CDR2、及CDR3序列可被「混合及配對」(意即來自不同抗體之CDR可被混合及配對，雖然每個抗體必需包含一個VH CDR1、CDR2、及CDR3及一個VK CDR1、CDR2、及CDR3)以產生本發明之其他抗CXCR4結合分 子。CXCR4與該「混合及配對」抗體之結合可利用上述及實施例中所描述之結合試驗分析(例如ELISA、Biacore®分析)。較佳的是，當VH CDR序列被混合及配對時，來自特定VH序列之CDR1、CDR2、及/或CDR3序列係以結構類似之CDR序列取代。同樣的，當VK CDR序列被混合及配對時，來自特定VK序列之CDR1、CDR2、及/或CDR3序列以結構類似之CDR序列取代為宜。對於該領域一般技術人士顯而易見的是，單株抗體F7、F9、D1及E2之新穎VH及VL序列可藉由以結構類似於來自此處所揭示之CDR序列的序列取代一或多個VH及/或VL CDR區序列而產生。
因此在另一態樣中，本發明提供一種經分離之單株抗體或其抗原結合部位，其包含：(a)包含選自SEQ ID NO：1-4中之胺基酸序列的重鏈變異區CDR1；(b)包含選自SEQ ID NO：5-8中之胺基酸序列的重鏈變異區CDR2；(c)包含選自SEQ ID NO：9-12中之胺基酸序列的重鏈變異區CDR3；(d)包含選自SEQ ID NO：13-16中之胺基酸序列的輕鏈變異區CDR1；(e)包含選自SEQ ID NO：17-20中之胺基酸序列的輕鏈變異區CDR2；及(f)包含選自SEQ ID NO：21-24中之胺基酸序列的輕 鏈變異區CDR3；其中該抗體與CXCR4專一性結合，特別是人CXCR4。
在較佳之實施態樣中，該抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：1之重鏈變異區CDR1；(b)包含SEQ ID NO：5之重鏈變異區CDR2；(c)包含SEQ ID NO：9之重鏈變異區CDR3；(d)包含SEQ ID NO：13之輕鏈變異區CDR1；(e)包含SEQ ID NO：17之輕鏈變異區CDR2；及(f)包含SEQ ID NO：21之輕鏈變異區CDR3。
在其他較佳之實施態樣中，該抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：2之重鏈變異區CDR1；(b)包含SEQ ID NO：6之重鏈變異區CDR2；(c)包含SEQ ID NO：10之重鏈變異區CDR3；(d)包含SEQ ID NO：14之輕鏈變異區CDR1；(e)包含SEQ ID NO：18之輕鏈變異區CDR2；及(f)包含SEQ ID NO：22之輕鏈變異區CDR3。
在其他較佳之實施態樣中，該抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：3之重鏈變異區CDR1；(b)包含SEQ ID NO：7之重鏈變異區CDR2；(c)包含SEQ ID NO：11之重鏈變異區CDR3；(d)包含SEQ ID NO：15之輕鏈變異區CDR1；(e)包含SEQ ID NO：19之輕鏈變異區CDR2；及(f)包含SEQ ID NO：23之輕鏈變異區CDR3。
在其他較佳之實施態樣中，該抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：4之重鏈變異區CDR1；(b)包含SEQ ID NO：8之重鏈變異區CDR2；(c)包含SEQ ID NO：12之重鏈變異區CDR3；(d)包含SEQ ID NO：16之輕鏈變異區CDR1；(e)包含SEQ ID NO：20之輕鏈變異區CDR2；及(f)包含SEQ ID NO：24之輕鏈變異區CDR3。
該領域所熟知的是，單獨之CDR3結構域(與CDR1及/或CDR2結構域無關)可決定抗體與偶聯抗原之結合專一性及根據共同之CDR3序列可預期地產生具有相同結合專一性之多重抗體。參見例如Klimka et al.,British J.of Cancer 83(2)：252-260(2000)(描述僅利用鼠抗CD30抗體Ki-4之重鏈變異結構域CDR3製備人化抗CD30抗體)；Beiboer et al.,J.Mol.Biol.296：833-849(2000)(描述僅利用親代鼠MOC-31抗EGP-2抗體重鏈CDR3序列之重組表皮糖蛋白2(EGP-2)抗體)；Rader et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95：8910-8915(1998)(描述利用鼠抗整合素αVβ3抗體LM609之重鏈及輕鏈變異區CDR3結構域的一組人化抗整合素αVβ3抗體，其中各組成抗體在CDR3結構域之外包含不同序列及可具親代鼠抗體之高親和性或更高親和性以與親代鼠抗體相同之抗原決定位結合)；Barbas et al.,J.Am.Chem.Soc.116：2161-2162(1994)(揭示CDR3結構域對抗原結合有最顯著之影響)；Barbas et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：2529-2533 (1995)(描述移植3個抗人胎盤DNA之Fabs(SI-1,SI-40及SI-32)的重鏈CDR3序列至抗破傷風類毒素Fab之重鏈藉此取代現存之重鏈CDR3及證實單獨CDR3結構域可提供結合專一性)；Ditzel et al.,J.Immunol.157：739-749(1996)(描述其中僅轉移親代多專一性Fab LNA3之重鏈CDR3至單專一性IgG破傷風類毒素結合Fab p313抗體之重鏈足以維持該親代Fab結合專一性之移植試驗)；Berezov et al.,BIAjournal 8：Scientific Review 8(2001)(描述根據抗HER2單株抗體之CDR3的肽擬物)；Igarashi et al.,J.Biochem(Tokyo)117：452-7(1995)(描述對應抗磷脂絲胺酸(phosphatidylserine)抗體之CDR3結構域的12個胺基酸合成多肽)；Bourgeois et al.,J.Virol 72：807-10(1998)(顯示源自抗呼吸道融合病毒(RSV)抗體重鏈CDR3結構域之單一肽可在活體外中和該病毒)；Levi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：4374-8(1993)(描述根據鼠抗HIV抗體重鏈CDR3結構域之肽)；Polymenis and Stoller,J.Immunol.152：5218-5329(1994)(描述藉由移植Z-DNA-結合抗體之重鏈CDR3區域以令scFv結合)；及Xu and Davis,Immunity 13：37-45(2000)(描述重鏈CDR3之多樣性足以令其他部分相同之IgM分子識別各種半抗原(hapten)及蛋白質抗原)。亦可參考美國專利第6,951,646；6,914,128；6,090,382；6,818,216；6,156,313；6,827,925；5,833,943；5,762,905及5,760,185號，其描述以單一CDR結構域定義之專利抗體。這些參 考資料各以參照方式整體納入此處。
因此，本發明提供包含一或多個來自源自人或非人動物抗體之重鏈及/或輕鏈CDR3結構域的單株抗體，其中該單株抗體可與CXCR4專一性結合。在特定態樣中，本發明提供包含一或多個來自非人抗體(諸如小鼠或大鼠抗體)之重鏈及/或輕鏈CDR3結構域的單株抗體，其中該單株抗體可與CXCR4專一性結合。在一些實施態樣中，該包含一或多個來自非人抗體之重鏈及/或輕鏈CDR3結構域的新穎抗體(a)可與對應之親代非人抗體競爭結合；(b)維持對應之親代非人抗體的功能特徵；(c)與對應之親代非人抗體的相同抗原決定位結合；及/或(d)具有與對應之親代非人抗體類似的結合親和性。
在其他態樣中，本發明提供包含一或多個來自人抗體(例如得自非人動物之人抗體)之重鏈及/或輕鏈CDR3結構域的單株抗體，其中該人抗體可與CXCR4專一性結合。在其他態樣中，本發明提供包含一或多個來自第一人抗體(例如得自非人動物之人抗體)之重鏈及/或輕鏈CDR3結構域的單株抗體，其中該第一人抗體可與CXCR4專一性結合及其中該來自第一人抗體之CDR3結構域取代不具CXCR4結合專一性之人抗體中的CDR3結構域以產生可與CXCR4專一性結合之第二人抗體。在一些實施態樣中，該包含一或多個來自第一人抗體之重鏈及/或輕鏈CDR3結構域的新穎抗體(a)可與對應之親代第一人抗體競爭結合；(b)維持對應之親代第一人抗體之功能特徵； (c)與對應之親代第一人抗體之相同抗原決定位結合；及/或(d)具有與對應之親代第一人抗體類似的結合親和性。
具有特定胚系序列之抗體
在特定實施態樣中，本發明之抗體包含來自特定胚系重鏈免疫球蛋白基因之重鏈變異區及/或來自特定胚系輕鏈免疫球蛋白基因之輕鏈變異區。
例如在較佳之實施態樣中，本發明提供經分離之單株抗體或其抗原結合部位，其包含為人VH 3-48基因之產物或衍生自該人VH 3-48基因之產物的重鏈變異區，其中該抗體與CXCR4專一性結合。在其他較佳實施態樣中，本發明提供一種經分離之單株抗體或其抗原結合部位，其包含為人VK L15基因之產物或衍生自該人VK L15基因之產物的輕鏈變異區，其中該抗體與CXCR4專一性結合。在其他較佳實施態樣中，本發明提供一種經分離之單株抗體或其抗原結合部位，其中該抗體包含為人VH 3-48基因之產物或衍生自該人VH 3-48基因之產物的重鏈變異區及包含為人VK L15基因之產物或衍生自該人VK L15基因之產物的輕鏈變異區，其中該抗體與CXCR4專一性結合，特別是人CXCR4。該抗體亦可具有一或多個如上詳述之功能特徵，諸如與表現在細胞表面上之天然CXCR4結合、抑制SDF-1與CXCR4結合、抑制於表現CXCR4之細胞中經SDF-1誘發之鈣離子流動、抑制表現CXCR4之細胞經SDF-1誘發的移動、抑制由HuVECs之毛細血 管形成、於活體外及/或活體內誘導表現CXCR4之細胞的細胞凋亡、於活體外及/或活體內抑制CXCR4+腫瘤細胞生長，及/或抑制CXCR4+腫瘤細胞轉移。
分別具有VH 3-48及VK L15之VH及VK的抗體實例係F7、F9、D1及E2抗體。
此處所使用之人抗體包含為特定胚系序列之「產物」或「衍生自該產物」的重鏈或輕鏈變異區，若該抗體之變異區係得自使用人胚系免疫球蛋白基因之系統。該系統包括以所欲抗原免疫帶有人免疫球蛋白基因之基因轉殖鼠或以所欲抗原篩選展現在噬菌體上之人免疫球蛋白基因庫。為人胚系免疫球蛋白序列之「產物」或「衍生自該產物」的人抗體可藉由比較人抗體之胺基酸序列與人胚系免疫球蛋白之胺基酸序列及篩選在序列上與人抗體之序列最接近(一致性%最高)之人胚系免疫球蛋白序列來加以識別。為特定人胚系免疫球蛋白序列之「產物」或「衍生自該產物」的人抗體相較於該胚系序列可能包含例如因天然發生之體突變或意圖導入之定點突變所導致之胺基酸差異。然而，經篩選之人抗體的胺基酸序列通常與由人胚系免疫球蛋白基因所編碼之胺基酸序列具有至少90%之一致性及包含當與其他物種之胚系免疫球蛋白胺基酸序列(例如鼠胚系序列)比較時可識別該人抗體之為人抗體的胺基酸殘基。在特定情況中，人抗體之胺基酸序列可能與該胚系免疫球蛋白基因所編碼之胺基酸序列具有至少95%，或甚至至少96%、97%、98%或99%的一致性。通常，源自特 定人胚系序列之人抗體將展現不超過10個相較於該人胚系免疫球蛋白基因所編碼之胺基酸序列的胺基酸差異。在特定情況中，該人抗體可展現不超過5個或甚至不超過4、3、2或1個相較於該胚系免疫球蛋白基因所編碼之胺基酸序列的胺基酸差異。
同源抗體
在其他實施態樣中，本發明之抗體包含重鏈及輕鏈變異區，其包含與此處所述之較佳抗體的胺基酸序列同源的胺基酸序列，及其中該抗體保留本發明之抗CXCR4抗體所欲之功能特性。
舉例來說，本發明提供一種經分離之單株抗體或其抗原結合部位，其包含重鏈變異區及輕鏈變異區，其中：(a)該重鏈變異區包含與選自SEQ ID NO：25-28及41-44中之胺基酸序列具有至少80%同源性之胺基酸序列；(b)該輕鏈變異區包含與選自SEQ ID NO：29-32及45-48中之胺基酸序列具有至少80%同源性之胺基酸序列；(c)該抗體與表現在細胞表面上之天然人CXCR4結合。
此外或二者擇一地，該抗體可能具有下列一或多種功能特性：(i)以1×10-7M或更低之KD值與人CXCR4結合；(ii)抑制SDF-1與CXCR4結合；(iii)抑制於表 現CXCR4之細胞中經SDF-1誘發之鈣離子流動；(iv)抑制表現CXCR4之細胞經SDF-1誘發的移動；(v)抑制由HuVECs之毛細血管形成；(vi)於活體外及/或活體內誘發表現CXCR4之細胞的細胞凋亡；(vii)於活體外及/或活體內抑制CXCR4+腫瘤細胞生長；及/或(viii)抑制CXCR4+腫瘤細胞轉移。
在不同的實施態樣中，該抗體可為例如人抗體、人化抗體或嵌合抗體。
在其他實施態樣中，該VH及/或VL胺基酸序列可與前述之序列具有85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%之同源性。具有對前述序列之VH及VL區有高度(意即80%或更高)同源性之VH及VL區的抗體可藉由令編碼SEQ ID NO：25-32或41-48之核酸分子發生突變(例如定點或PCR媒介突變)得到，之後利用此處所描述之功能試驗檢測該編碼改變抗體所保留之功能(意即前述功能)。
此處所使用之二個胺基酸序列之間的同源性百分比相當於二個序列之間的一致性百分比。二序列之間的一致性百分比隨序列之間完全相同之位置數而定(意即%同源性=相同位置數/總位置數×100)，考慮到為達二序列最佳比對所需導入之間隔數及各間隔長度。比較序列及決定二序列間之一致性百分比可利用數學演算式完成，如下於非限制性實例中所述。
二個胺基酸序列之間的一致性百分比可利用E. Meyers及W.Miller已被納入ALIGN程式(第二版)之演算法決定(Comput.Appl.Biosci.,4：11-17(1988))，其使用PAM120權重殘基表、間隔長度罰分12及間隔罰分4。此外，二個胺基酸序列之間的一致性百分比可利用已被納入GCG套裝軟體中之GAP程式(可得自http：//www.gcg.com)的尼德曼及馮斯(Needleman and Wunsch)(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))演算法決定，其使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，及間隔權重16、14、12、10、8、6或4及長度權重1、2、3、4、5或6。
此外或二者擇一地，本發明之蛋白質序列可進一步用來作為「查詢序列(query sequence)」以進行公共資料庫搜尋，以例如找出相關序列。該搜尋可利用Altschul,et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-10之XBLAST程式(第二版)進行。BLAST蛋白質搜尋可利用XBLAST程式、得分=50、文字長度(wordlength)=3進行以得到與本發明之抗體分子具同源性之胺基酸序列。要得到比較目的之間隔比對，可利用如Altschul et al.,(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中所描述之Gapped BLAST進行。當使用BLAST及Gapped BLAST程式時，可利用個別程式(例如XBLAST及NBLAST)之內建參數。參見www.ncbi.nlm.nih.gov。
具保留性修飾之抗體
在特定實施態樣中，本發明之抗體包含重鏈變異區(其包含CDR1、CDR2及CDR3序列)及輕鏈變異區(其包含CDR1、CDR2及CDR3序列)，其中一或多個這些CDR序列包含以此處所描述之較佳抗體(例如F7、F9、D1或E2)為基礎之特定胺基酸序列或其保留性修飾，且其中該抗體保留本發明之抗CXCR4抗體之所欲功能特性。在該領域所了解的是，可進行特定保留性序列修飾而不影響抗原結合性。參見例如Brummell et al.(1993)Biochem 32：1180-8(描述對沙門氏菌(Salmonella)具專一性之抗體的CDR3重鏈結構域突變分析)；de Wildt et al.(1997)Prot.Eng.10：835-41(描述抗UA1抗體之突變研究)；Komissarov et al.(1997)J.Biol.Chem.272：26864-26870(顯示在HCDR3中間之突變導致親和性消失或降低)；Hall et al.(1992)J.Immunol.149：1605-12(描述CDR3區域中單一胺基酸改變使結合活性消失)；Kelley and O’Connell(1993)Biochem.32：6862-35(描述Tyr殘基對抗原結合性之影響)；Adib-Conquy et al.(1998)Int.Immunol.10：341-6(描述疏水性對結合之影響)及Beers et al.(2000)Clin.Can.Res.6：2835-43(描述HCDR3胺基酸突變)。因此，本發明提供一種包含重鏈變異區(其包含CDR1、CDR2及CDR3序列)及輕鏈變異區(其包含CDR1、CDR2及CDR3序列)之經分離之單株抗體或其抗原結合部位，其中：(a)該重鏈變異區CDR3序列包含選自SEQ ID NO：9-12中之胺基酸序列的胺基酸序列及其保留性修飾；(b)該輕鏈變異區CDR3序列包含選自SEQ ID NO：21-24中之胺基酸序列的胺基酸序列及其保留性修飾；及(c)該抗體與表現在細胞表面上之天然人CXCR4結合。
此外或二者擇一地，該抗體可能具有下列一或多項功能特性：(i)以1×10-7M或更低之KD值與人CXCR4結合；(ii)抑制SDF-1與CXCR4結合；(iii)抑制於表現CXCR4之細胞中經SDF-1誘發之鈣離子流動；(iv)抑制表現CXCR4之細胞經SDF-1誘發的移動；(v)抑制由HuVECs之毛細血管形成；(vi)於活體外及/或活體內誘發表現CXCR4之細胞的細胞凋亡；(vii)於活體外及/或活體內抑制CXCR4+腫瘤細胞生長；及/或(viii)抑制CXCR4+腫瘤細胞轉移。
在較佳之實施態樣中，重鏈變異區CDR2序列包含選自SEQ ID NO：5-8中之胺基酸序列的胺基酸序列及其保留性修飾；及輕鏈變異區CDR2序列包含選自SEQ ID NO：17-20中之胺基酸序列的胺基酸序列及其保留性修飾。在其他較佳之實施態樣中，重鏈變異區CDR1序列包含選自SEQ ID NO：1-4中之胺基酸序列的胺基酸序列及其保留性修飾；及輕鏈變異區CDR1序列包含選自SEQ ID NO：13-16中之胺基酸序列的胺基酸序列及其保留性修飾。
在不同的實施態樣中，該抗體可為例如人抗體、人化抗體或嵌合抗體。
此處所使用之「保留性序列修飾」一詞意圖指不顯著影響或改變包含該胺基酸序列之抗體的結合特徵之胺基酸修飾。該保留性修飾包括胺基酸取代、加入及刪除。修飾可藉該領域已知之標準技術導入本發明之抗體中，諸如定點突變及PCR-媒介性突變。保留性胺基酸取代係指其中胺基酸殘基被具有類似側鏈之胺基酸殘基取代的胺基酸取代。具類似側鏈之胺基酸殘基家族在該領域中已被定義。這些家族包括具有鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、β分枝側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳香側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)之胺基酸。因此，本發明之抗體CDR區中一或多個胺基酸殘基可由來自相同側鏈家族之其他胺基酸殘基取代及該改變抗體可利用此處所描述之功能試驗檢測其所保留之功能(即前述功能)。
與抗CXCR4抗體之相同抗原決定位結合的抗體
在其他實施態樣中，本發明提供如本發明之任一抗CXCR4單株抗體與人CXCR4上之相同抗原決定位結合 之抗體(也就是具有與本發明之任一單株抗體交叉競爭與CXCR4結合之能力的抗體)。在較佳之實施態樣中，用於交叉競爭試驗中之參考抗體可為單株抗體F7(具有分別如SEQ ID NO：25及29中所示之VH及VL序列)，或單株抗體F9(具有分別如SEQ ID NO：26及30中所示之VH及VL序列)，或單株抗體D1(具有分別如SEQ ID NO：27及31中所示之VH及VL序列)，或單株抗體E2(具有分別如SEQ ID NO：28及32中所示之VH及VL序列)。
該交叉競爭抗體可根據它們在標準CXCR4結合試驗中與F7、F9、D1或E2交叉競爭之能力來識別。舉例來說，可利用CEM細胞流式細胞法來顯示與本發明之抗體的交叉競爭，其中該參考抗體係經FITC標示及評估測試抗體抑制FITC標示參考抗體與CEM細胞結合之能力。測試抗體抑制例如F7、F9、D1或E2與人CXCR4結合之能力證實該受測抗體可與F7、F9、D1或E2競爭與人CXCR4之結合及因此如F7、F9、D1或E2般地與人CXCR4上之相同抗原決定位結合。在較佳之實施態樣中，與CXCR4上F7、F9、D1或E2之相同抗原決定位結合的抗體係人單株抗體。該人單株抗體可如實施例中所述之製備及分離。
工程化及經修飾之抗體
本發明之抗體另外可利用具有一或多個此處所揭示之VH及/或VL序列的抗體作為起始物質以建構經修飾之抗 體以製備，該經修飾之抗體可能具有與起始抗體不同之性質。抗體可藉由修飾一或二個變異區(即VH及/或VL)中之一或多個殘基以建構，例如在一或多個CDR區中及/或在一或多個構架區中。此外或二者擇一地，抗體可藉由修飾固定區中之殘基以建構，例如改變抗體之效應功能。
在特定實施態樣中，CDR移植可被用來建構抗體之變異區。抗體主要透過位於6個重鏈及輕鏈互補決定區(CDRs)中之胺基酸殘基與目標抗原交互作用。因為這個因素，個別抗體在CDRs之間的胺基酸序列相較於CDRs以外的序列更為多樣化。因為CDR序列負責大部分之抗體-抗原交互反應，藉由建構表現載體以表現模擬特定天然發生抗體性質之重組抗體是可能的，該表現載體包括來自特定天然發生抗體而被植入具有不同特性之不同抗體的構架區序列中的CDR序列(參見例如Riechmann,L.et al.(1998)Nature 332：323-327；Jones,P.et al.(1986)Nature 321：522-525；Queen,C.et al.(1989)Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86：10029-10033；Winter之美國專利5,225,539號及Queen等人之美國專利5,530,101；5,585,089；5,693,762；及6,180,370號。
因此，本發明之其他實施態樣關於一種經分離之單株抗體或其抗原結合部位，其包含包含CDR1、CDR2及CDR3序列之重鏈變異區(該CDR1、CDR2及CDR3序列包含分別選自SEQ ID NO：1-4,SEQ ID NO：5-8，及SEQ ID NO：9-12中之胺基酸序列)，及包含CDR1、CDR2 及CDR3序列之輕鏈變異區(該CDR1、CDR2及CDR3序列包含分別選自SEQ ID NO：13-16,SEQ ID NO：17-20，及SEQ ID NO：21-24中之胺基酸序列)。因此，該抗體包含單株抗體F7、F9、D1或E2之VH及VL CDR序列，然而可能包含與這些抗體不同的構架序列。
該構架序列可得自包括胚系抗體基因序列之公共DNA資料庫或公開資料。舉例來說，人重鏈及輕鏈變異區基因之胚系DNA序列可見於「VBase」人胚系序列資料庫(可得自網路www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)以及Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242；Tomlinson,I.M.,et al.(1992)“The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops”J.Mol.Biol.227：776-798；and Cox,J.P.L.et al.(1994)“A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage”Eur.J.Immunol.24：827-836；各文獻之內容以參照方式明示納入此處。在其他實施例中，人重鏈及輕鏈變異區基因之胚系DNA序列可見於Genbank資料庫。例如，下列見於HCo7 HuMAb鼠中之重鏈胚系序列可得自隨附之Genbank收錄號：1-69(NG_0010109,NT_024637及BC070333)、3-33(NG_0010109及NT_024637)及3-7(NG_0010109及 NT_024637)。在其他實施例中，下列見於HCo12 HuMAb鼠中之重鏈胚系序列可得自隨附之Genbank收錄號：1-69(NG_0010109,NT_024637及BC070333)、5-51(NG_0010109及NT_024637)、4-34(NG_0010109及NT_024637)、3-30.3(CAJ556644)及3-23(AJ406678)。另外人重鏈及輕鏈胚系序列之其他來源係可得自IMGT(http：//imgt.cines.fr)之人免疫球蛋白基因之資料庫。
抗體蛋白質序列利用一種稱為Gapped BLAST(Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Research 25：3389-3402)之序列相似性搜尋方法與匯總蛋白質序列資料庫比較，該法為熟習該項技術之人士所熟知。BLAST係一種啟發式演算法，其中抗體序列與資料庫序列之間具統計顯著性之比對可能包含高比值片段對(HSP)之比對字。其得分無法藉由延長或剪短而提高之片段對係稱為擊中序列(hit)。簡單地說，VBASE來源(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php)之核苷酸序列被轉譯及介於與包含FR1至FR3構架區之區域被保留。該資料庫序列之平均長度為98個殘基。與全長蛋白質完全配對之重複序列被移除。利用預設、標準參數(除低複雜性過濾被關閉外)之blastp程式及BLOSUM62取代矩陣進行蛋白質BLAST搜尋，過濾出5個最佳序列比對結果。該核苷酸序列的所有6個讀框被轉譯及在資料庫序列之配對片段中無終止密碼子之讀框被認為是可能的擊中序列。此接著利用BLAST程式tblastx得到證實，其轉譯所有6個讀 框中之抗體序列及比較該些翻譯與在所有6個讀框動態轉譯之VBASE核苷酸序列。其它人胚系序列資料庫(諸如可得自IMGT者(http：//imgt.cines.fr))可如上述對VBASE進行類似檢索。
一致性為全長抗體序列與蛋白質資料庫之間完全一致的胺基酸配對。陽性(一致性+取代配對)非指完全一致但由BLOSUM62取代矩陣所引導之胺基酸取代。如果抗體序列以相同之一致性符合二個資料庫序列，具有最多陽性之擊中序列將被決定為匹配擊中序列。
用於本發明之抗體的較佳構架序列為該些結構類似本發明之篩選抗體所使用的構架序列，例如類似本發明之較佳單株抗體所使用的VH 3-48構架序列(SEQ ID NO：49)及/或VK L15構架序列(SEQ ID NO：50)。該VH CDR1、CDR2及CDR3序列及VK CDR1、CDR2及CDR3序列可被移植至與構架序列所源自之胚系免疫球蛋白基因具有相同序列之構架區，或該CDR序列可被移植至相較於胚系序列包含一或多個突變之構架區。例如，已經發現在特定實例中，使構架區中的殘基發生突變以維持或提高抗體之抗原結合能力係有益的(參見例如Queen et al.之美國專利5,530,101；5,585,089；5,693,762及6,180,370號。
其他類型之變異區修飾係使VH及/或VK CDR1、CDR2及/或CDR3區域中之胺基酸殘基突變以藉此改善所欲抗體之一或多項結合特性(例如親和性)。可進行定點突變或PCR媒介突變以導入突變，及可依此處所描述及 實施例中所提供之活體外或活體內試驗來評估對抗體結合或其他所欲功能特性之影響。較佳的是導入保留性修飾(如上討論)。突變可為胺基酸取代、加入或刪除，但是較佳的是取代。另外，通常在一個CDR區域中改變不超過1、2、3、4或5個殘基。
因此在其他實施態樣中，本發明提供包含重鏈變異區之經分離之抗CXCR4單株抗體或其抗原結合部位，該重鏈變異區包含(a)包含選自SEQ ID NO：1-4中之胺基酸序列或相較於SEQ ID NO：1-4具有1、2、3、4或5個胺基酸取代、刪除或插入之胺基酸序列的VH CDR1區；(b)包含選自SEQ ID NO：5-8中之胺基酸序列或相較於SEQ ID NO：5-8具有1、2、3、4或5個胺基酸取代、刪除或插入之胺基酸序列的VH CDR2區；(c)包含選自SEQ ID NO：9-12中之胺基酸序列或相較於SEQ ID NO：9-12具有1、2、3、4或5個胺基酸取代、刪除或插入之胺基酸序列的VH CDR3區；(d)包含選自SEQ ID NO：13-16中之胺基酸序列或相較於SEQ ID NO：13-16具有1、2、3、4或5個胺基酸取代、刪除或插入之胺基酸序列的VK CDR1區；(e)包含選自SEQ ID NO：17-20中之胺基酸序列或相較於SEQ ID NO：17-20具有1、2、3、4或5個胺基酸取代、刪除或插入之胺基酸序列的VK CDR2區；及(f)包含選自SEQ ID NO：21-24中之胺基酸序列或相較於SEQ ID NO：21-24具有1、2、3、4或5個胺基酸取代、刪除或插入之胺基酸序列的VK CDR3 區。
本發明之工程化抗體包括該些其中VH及/或VK中之構架殘基已經過修飾以例如改善該抗體之性質者。通常該構架修飾係用來降低該抗體之免疫原性。例如，一種方式為「反突變」一或多個構架殘基成為該對應之胚系序列。更具體地說，經過體突變之抗體可能包含異於該抗體所源自之胚系序列的構架殘基。該殘基可藉由比較抗體構架序列與該抗體所源自之胚系序列以識別。
舉例來說，在F7之VH區中，下列構架區胺基酸位置(使用Kabat計算系統)與胚系不同：1、6及25。一、二或所有三個這些位置藉由進行一、二或所有三個下列取代可反突變為胚系序列：Q1E、Q6E及A25S。較佳修飾形式之F7 VH區係F7GL VH(其胺基酸序列係顯示於圖5A及SEQ ID NO：41中)，其具有下列構架取代：Q1E及Q6E。
另外，在F7之VK區中，下列構架區胺基酸位置(使用Kabat計算系統)與胚系不同：1、3及84。一、二或所有三個這些位置藉由進行一、二或所有三個下列取代可反突變為胚系序列：A1D、R3Q及V84A。較佳修飾形式之F7 VK區係F7GL VK(其胺基酸序列係顯示於圖5B及SEQ ID NO：45中)，其具有下列構架取代：A1D及R3Q。
另外，在F9之VH區中，下列構架區胺基酸位置(使用Kabat計算系統)與胚系不同：1、6及25。一、二 或所有三個這些位置藉由進行一、二或所有三個下列取代可反突變為胚系序列：Q1E、Q6E及A25S。較佳修飾形式之F9 VH區係F9GL VH(其胺基酸序列係顯示於圖6A及SEQ ID NO：42中)，其具有下列構架取代：Q1E及Q6E。
另外，在F9之VK區中，下列構架區胺基酸位置(使用Kabat計算系統)與胚系不同：1、3、4及60。一、二、三或所有四個這些位置藉由進行一、二、三或所有四個下列取代可反突變為胚系序列：E1D、V3Q、L4M及P60S。較佳修飾形式之F9 VK區係F9GL VK(其胺基酸序列係顯示於圖6B及SEQ ID NO：46中)，其具有下列構架取代：E1D、V3Q及L4M。
另外，在D1之VH區中，下列構架區胺基酸位置(使用Kabat計算系統)與胚系不同：6、25及76。一、二或所有三個這些位置藉由進行一、二或所有三個下列取代可反突變為胚系序列：Q6E、A25S及R76K。較佳修飾形式之D1 VH區係D1GL VH(其胺基酸序列係顯示於圖7A及SEQ ID NO：43中)，其具有下列構架取代：Q6E。
另外，在D1之VK區中，下列構架區胺基酸位置(使用Kabat計算系統)與胚系不同：1、3、4、45及46。一、二、三、四或所有五個這些位置藉由進行一、二、三、四或所有五個下列取代可反突變為胚系序列：V1D、W3Q、V4M、E45K及L46S。較佳修飾形式之D1 VK區係D1GL VK(其胺基酸序列係顯示於圖7B及SEQ ID NO：47中)，其具有下列構架取代：V1D、W3Q及V4M。
另外，在E2之VH區中，下列構架區胺基酸位置(使用Kabat計算系統)與胚系不同：6及25。一或二個這些位置藉由進行一或二個下列取代可反突變為胚系序列：Q6E及A25S。較佳修飾形式之E2 VH區係E2GL VH(其胺基酸序列係顯示於圖8A及SEQ ID NO：44中)，其具有下列構架取代：Q6E。
另外，在E2之VK區中，下列構架區胺基酸位置(使用Kabat計算系統)與胚系不同：1、3及4。一、二或所有三個這些位置藉由進行一、二或所有三個下列取代可反突變為胚系序列：E1D、V3Q及L4M。較佳修飾形式之E2 VK區係E2GL VK(其胺基酸序列係顯示於圖8B及SEQ ID NO：48中)，其具有下列構架取代：E1D、V3Q及L4M。
其他種類之構架修飾與構架區或甚至一或多個CDR區中之一或多個殘基突變有關，以移除T細胞抗原決定位以藉此降低該抗體之潛在免疫原性。此方法亦稱為「去免疫化」及進一步詳細描述於Carr等人之美國專利公開號20030153043中。
除了在構架區或CDR區中進行的修飾之外或作為構架區或CDR區中所進行之修飾的替代方案，本發明之抗體可被建構以包括Fc區中之修飾，通常可改變該抗體之一或多個功能特性，諸如血清半衰期、補體固定、Fc受體結合、及/或抗原依賴性細胞性細胞毒性。另外，本發 明之抗體可經化學修飾(例如該抗體可與一或多個化學基團連接)或經修飾以改變其糖基化，同樣可改變該抗體之一或多個功能特性。這些實施態樣各在下面進一步詳細描述。Fc區中之殘基計算係Kabat之EU指數計算法。
在一實施態樣中，CH1之絞鏈區係經修飾以使該絞鏈區中之半胱胺酸殘基數目改變，例如增加或減少。此方法進一步描述於Bodmer等人之美國專利第5,677,425號。CH1絞鏈區中之半胱胺酸殘基數目被改變以例如促進輕鏈與重鏈之組合或增加或降低該抗體之穩定性。
在另一實施態樣中，抗體之Fc絞鏈區係經突變以降低該抗體之生物半衰期。更具體地說，一或多個胺基酸突變被導入Fc絞鏈片段之CH2-CH3結構域介面區中，以使該抗體相較於天然Fc絞鏈結構域之葡萄球菌蛋白A(SpA)結合具有受損之SpA結合。此方法進一步詳細描述於Ward等人之美國專利第6,165,745號。
在其他實施態樣中，該抗體係經修飾以增加其生物半衰期。各種方式均為可能。例如，可導入下列一或多個突變：T252L、T254S、T256F(如Ward之美國專利第6,277,375號中所述)。另一種增加生物半衰期之方式係改變該抗體之CH1或CL區以包含取自IgG Fc區之二個CH2環狀結構域的救援受體結合抗原決定位(如Presta等人之美國專利第5,869,046及6,121,022號中所述)。
在其他實施態樣中，該Fc區之改變係由不同之胺基酸殘基取代至少一個胺基酸以改變該抗體之效應功能。例 如，一或多個選自胺基酸殘基234、235、236、237、297、318、320及322中之胺基酸可被不同之胺基酸殘基取代，以使該抗體具有對效應配體改變之親和性但仍保留親代抗體之抗原結合能力。對其親和性被改變之效應配體可為例如Fc受體或補體之C1成分。此方法進一步詳細描述於Winter等人之美國專利第5,624,821及5,648,260號。
在另一實施例中，一或多個選自胺基酸殘基329、331及322中之胺基酸可以不同之胺基酸殘基取代，以使該抗體具有改變之C1q結合及/或降低或消失之補體依賴性細胞毒性(CDC)。此方法進一步詳細描述於Idusogie等人之美國專利第6,194,551號。
在其他實施例中，在胺基酸位置231及239中之一或多個胺基酸殘基被改變以藉此改變該抗體固定補體之能力。此方法進一步描述於Bodmer等人之PCT公開號WO 94/29351中。
在其他實施例中，該Fc區藉由修飾下列位置之一或多個胺基酸以為修飾，以增加該抗體媒介抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)之能力及/或增加該抗體對Fcγ受體之親和性：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、 338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。此方法進一步描述於Presta等人之PCT公開號WO 00/42072中。另外，人IgG1上之FcγR1、FcγRII、FcγRIII及FcRn結合位置已經定位及具有改善結合力之變異體已被描述(參見Shields,R.L.et al.(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604)。在位置256、290、298、333、334及339之特定突變經顯示可改善與FcγRIII之結合。此外，下列組合突變經顯示可改善FcγRIII結合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A及S298A/K333A/K334A。
在另一實施態樣中，抗體之糖基化係經修飾。例如，可製備糖基化抗體(意即該抗體缺乏糖基化)。糖基化可被改變以例如增加抗體對抗原之親和性。該碳水化合物修飾藉由例如改變抗體序列中一或多個糖基化位置而達成。舉例來說，可進行導致清除一或多個變異區構架糖基化位置之一或多個胺基酸取代，以藉此清除該位置之糖基化。該去糖基化可增加抗體對抗原之親和性。該方法進一步詳細描述於Co等人之美國專利第5,714,350及6,350,861號。
此外或二者擇一地，可製備具有改變類型之糖基化抗體，諸如具有降低量之岩藻糖殘基的低岩藻糖基化抗體或具有增加之平分型GlcNac結構的抗體。該改變之糖基化模式經證實可增加抗體之ADCC能力。該碳水化合物修飾可藉由例如在具有改變糖基化機制之宿主細胞中表現抗體以完成。具有改變糖基化機制之細胞在該領域中已被描述 且可被用來作為在其中表現本發明之重組抗體的宿主細胞以藉此產生具有改變糖基化之抗體。舉例來說，細胞系Ms704、Ms705及Ms709缺乏岩藻糖轉移酶基因FUT8(α(1,6)岩藻糖轉移酶)，因此在Ms704、Ms705及Ms709細胞系中所表現的抗體在它們的碳水化合物上缺乏岩藻糖。該Ms704、Ms705及Ms709 FUT8-/-細胞系係藉由在使用二個取代載體之CHO/DG44細胞中定向敲除FUT8基因而產生(參見Yamane等人及Yamane-Ohnuki等人(2004)Biotechnol Bioeng 87：614-22之美國專利公開號20040110704)。在其他實施例中，Hanai等人之EP 1,176,195描述具有功能缺陷之FUT8基因(其編碼岩藻糖轉移酶)的細胞系，因此在該細胞系中所表現的抗體藉由減少或清除該α 1,6鍵相關酵素展現低岩藻糖基化。Hanai等人亦描述用於添加岩藻糖至與抗體Fc區域結合之N-乙醯葡萄糖胺上之酵素活性低或不具酵素活性之細胞系，例如鼠骨髓瘤細胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。Presta之PCT公開號WO 03/035835描述變異之CHO細胞系Lec13細胞(其連接岩藻糖至Asn(297)連接碳水化合物之能力降低)亦導致該宿主細胞中所表現之抗體的低岩藻糖基化(亦參見Shields,R.L.et al.(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。具有修飾糖基化特性之抗體亦可在雞蛋中產生，如美國專利申請號PCT/US06/05853中所述。或者，具有修飾糖基化特性之抗體可在植物細胞中產生，諸如浮萍(Lemna)。在植物系統中生產抗體之方法係揭露於對應 Alston &Bird LLP代理人案號040989/314911(2006年8月11日提交)之美國專利申請書中。Umana等人之PCT公開號WO 99/54342描述表現糖蛋白修飾之糖基轉移酶(例如β(1,4)-N-乙醯葡萄糖胺轉移酶III(GnTIII))的工程化細胞系，以使該工程化細胞系中所表現之抗體展現導致抗體ADCC活性提高之平分型GlcNac結構增加(亦參見Umana et al.(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。或者，抗體之岩藻糖殘基可利用岩藻糖苷酶(fucosidase)酵素切割。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶自抗體移除岩藻糖醯殘基(Tarentino,A.L.et al.(1975)Biochem.14：5516-23)。
本發明所考慮之抗體的另一種修飾係聚乙二醇化(pegylation)。抗體可被聚乙二醇化以例如增加該抗體之生物(例如血清)半衰期。要聚乙二醇化抗體，該抗體或其片斷通常在其中一或多個PEG基團與該抗體或抗體片段連接的條件下與聚乙二醇(PEG)反應，諸如PEG之活性酯或乙醛衍生物。較佳的是，聚乙二醇化係透過活性PEG分子(或類似之活性水溶性聚合物)之醯基化反應或烷基化反應進行。此處所使用之「聚乙二醇」一詞意圖包含曾被用來衍生化其他蛋白質之任何形式的PEG，諸如單(C1-C10)烷氧基或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。在特定實施態樣中，經聚乙二醇化之抗體係非糖基化抗體。用於聚乙二醇化蛋白質之方法係該領域所熟知且可應用於本發明之抗體。參見例如Nishimura等人之EP 0 154 316及Ishikawa等人之EP 0 401 384。
抗體片段及抗體擬似物
本發明並不限於傳統抗體，其實施可透過使用抗體片段及抗體擬似物。如下面之詳細說明，目前已發展出廣泛種類之抗體片段及抗體擬似物技術，且為該領域所熟知。雖然一些技術(諸如結構域抗體、奈米抗體(Nanobodies)及單抗體(UniBodies))使用傳統抗體結構之片段或其他修飾，亦有替代性技術採用雖然是模擬傳統抗體結合但透過不同機制產生及作用之結合結構，諸如親和抗體(Affibodies)、DARPins、抗運載蛋白(Anticalins)、高親合性多聚體(Avimers)及多樣抗體(Versabodies)。
結構域抗體(dAbs)為抗體之最小功能性結合單位，其對應人抗體之重鏈(VH)或輕鏈(VL)的變異區。結構域抗體之分子量約為13kDa。Domantis已發展出一系列大型及高度功能性之全長人VH及VL dAbs資料庫(各資料庫中有超過1百億個不同序列)，及使用這些資料庫篩選對治療目標具有專一性之dAbs。與許多傳統抗體相比，結構域抗體在細菌、酵母菌及哺乳類細胞系統中表現良好。有關結構域抗體之進一步細節及其生產方法可參照美國專利6,291,158；6,582,915；6,593,081；6,172,197；6,696,245；美國序號2004/0110941；歐州專利申請案號1433846及歐洲專利0368684 & 0616640；WO05/035572、WO04/101790、WO04/081026、WO04/058821、WO04/003019及WO03/002609，這些各以參照方式整體納 入此處。
奈米抗體(nanobodies)係抗體源性治療蛋白質，其包含天然發生之重鏈抗體的獨特構造及功能特性。這些重鏈抗體包含一個變異結構域(VHH)及二個固定結構域(CH2及CH3)。重要的是，該經選殖及分離之VHH結構域係完全穩定之多肽，其具有原始重鏈抗體之完整抗原結合能力。奈米抗體與人抗體之VH結構域具有高度同源性，可進一步加以人化而不喪失任何活性。重要的是，奈米抗體之免疫原性低，這已經在使用奈米抗體先導化合物之靈長動物試驗中得到證實。
奈米抗體結合傳統抗體之優勢與小分子藥物之重要特性。就像傳統抗體，奈米抗體顯示高度目標專一性、對它們的目標具有高度親和性及低度內源毒性。然而，就像小分子藥物，它們可以抑制酵素及快速進入受體間隙。另外，奈米抗體極度穩定、可以注射以外之方式投服(參見例如WO 04/041867，其以參照方式整體納入本文)及容易製造。奈米抗體之其他優點包括因為其分子小而可辨識不常見或隱藏之抗原決定位、由於其獨特的三維、藥物形式彈性而以高親和性及選擇性與蛋白質目標之空腔或活性位置結合、調整半衰期及易於快速藥物回收。
奈米抗體係由單一基因編碼及在幾乎所有原核及真核宿主中均可有效生產，例如大腸桿菌(參見例如US 6,765,087，其以參照方式整體納入此處)、黴菌(例如麴菌或木黴菌)及酵母菌(例如酵母菌屬(Saccharomyces)、克魯 維酵母菌屬(Kluyveromyces)、漢遜酵母菌屬(Hansenula)或畢赤酵母菌屬(Pichia))(參見例如US 6,838,254，其以參照方式整體納入此處)。生產過程係可擴充的，可生產數公斤產量之奈米抗體。由於奈米抗體相較於傳統抗體具有較佳之穩定性，它們可被調製成為長貨架壽命、立即可用之溶液。
奈米選殖(Nanoclone)法(參見例如WO 06/079372，其以參照方式整體納入此處)係用於生產抗所欲目標之奈米抗體的一種專利方法，其根據自動高通量B細胞篩選及可被用於本發明中。
單抗體(UniBodies)係另一種抗體片段技術，然而此技術係根據移除IgG4抗體之絞鏈區。刪除絞鏈區導致其大小實質上為傳統IgG4抗體一半之分子及具有單價結合區而非IgG4抗體之雙價結合區。亦為眾所周知的是IgG4抗體係不活潑的，因此並不與免疫系統交互反應，其可能有益於治療其中免疫反應並非所欲之疾病，而單抗體具備此項優點。例如，單抗體之功能可能為抑制或安靜化但不殺滅它們所結合之細胞。此外，與癌細胞結合之單抗體不會刺激癌細胞增生。另外，由於單抗體之大小約為傳統IgG4抗體的一半，它們在較大實質腫瘤中可能顯示較佳分布及可能有益之療效。單抗體自體內清除之速率類似IgG4全抗體，及可以類似完整抗體之親和性與它們的抗原結合。有關單抗體之其他細節可參照專利WO2007/059782，其以參照方式整體納入此處。
親和抗體(Affibody)分子代表一種以58個胺基酸殘基蛋白質結構域為基礎之新型親和性蛋白質，其係源自葡萄球菌蛋白質A之一個IgG結合結構域。此三螺旋束結構域曾被用來作為構建組合式噬菌體庫之支架，以所欲分子為目標之親和抗體變異體可利用噬菌體展示技術自其中篩選(Nord K,Gunneriusson E,Ringdahl J,Stahl S,Uhlen M,Nygren PA,Binding proteins selected from combinatorial libraries of an α-helical bacterial receptor domain,Nat Biotechnol 1997；15：772-7.Ronmark J,Gronlund H,Uhlen M,Nygren PA,Human immunoglobulin A(IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A,Eur J Biochem 2002；269：2647-55)。親和抗體簡單而強健的結構加上它們的低分子量(6kDa)，使它們適用於廣泛種類之應用，例如作為偵測試劑(Ronmark J,Hansson M,Nguyen T,et al,Construction and characterization of affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli,J Immunol Methods 2002；261：199-211)及抑制受體交互作用(Sandstorm K,Xu Z,Forsberg G,Nygren PA,Inhibition of the CD28-CD80 co-stimulation signal by a CD28-binding Affibody ligand developed by combinatorial protein engineering,Protein Eng 2003；16：691-7)。其他有關親和抗體之細節及其生產方法可參照美國專利5831012號，其以參照方式整體納入此處。
經標示之親和抗體亦可用於供決定同型之量的造影用 途。
DARPins(經設計的錨蛋白重複蛋白)係抗體擬似物DRP(經設計的重複蛋白)技術的一個例子，此技術係被發展以探討非抗體多肽之結合能力。重複蛋白如錨蛋白或富含白胺酸之重複蛋白係無所不在的結合分子，不像抗體其發生在細胞內及細胞外。它們獨特的模組結構以重複構造單位(重複)為特色，其堆疊在一起以形成具有變異及模組目標結合表面之延長重複結構域。根據此模組化性質，可產生具有高度多樣化結合專一性之組合式多肽庫。此策略包括展現變異表面殘基之自容性重複的一致設計及它們與重複結構域之隨機組合。
DARPins可在細菌表現系統中以非常高的產量生產，它們屬於已知最穩定的蛋白質。已經篩選出對廣泛種類之目標蛋白質(包括人受體、細胞激素、激酶、人蛋白酶、病毒及膜蛋白)具高度特異性、高度親和性之DARPins。可獲得具有個位數奈莫耳至皮莫耳範圍之親和性的DARPins。
DARPins已被用於廣泛應用中，包括ELISA、三明治式ELISA、流式細胞計數分析(FACS)、免疫組織化學(IHC)、晶片應用、親和性純化或西方印漬法。DARPins亦經證實在細胞內隔室中具高度活性，例如作為與綠色螢光蛋白(GFP)融合之細胞內標記蛋白。DARPins另外被用於以pM範圍之IC50抑制病毒進入。DARPins不僅理想地阻斷蛋白-蛋白間的交互作用，同時也可以抑制酵素。 蛋白酶、激酶及轉運子已經被成功抑制，最常見的是別構(allosteric)抑制模式。在腫瘤中非常快速及特異性地增加及非常有利的腫瘤與血之比，使得DARPins非常適用於活體內診斷劑或治療法。
有關DARPins及其他DRP技術之其他資訊可見於美國專利申請公開號2004/0132028及國際專利申請公開號WO 02/20565，二者以參照方式整體納入此處。
抗運載蛋白(Anticalins)是另一種抗體擬似物技術，然而在此技術中該結合專一性係源自脂質運載蛋白(lipocalins)，此為在人組織及體液中天然及大量表現之低分子量蛋白質家族。脂質運載蛋白已發展為進行一系列與化學敏感性或不可溶性化合物之生理運輸及儲存有關的活體內功能。脂質運載蛋白具有強健的內部結構，其包含支持在蛋白質一端之四個環的高度保留性β-筒體。這些環形成結合口袋的入口，在分子這個部分的結構差異與個別脂質運載蛋白之間的結合專一性差異有關。
雖然由保留性β-片層構架所支持之超變異環的整體結構令人聯想到免疫球蛋白，但是脂質運載蛋白在大小方面與抗體有顯著不同，其係由160-180個胺基酸的多肽單鏈組成，僅稍大於一個免疫球蛋白結構域。
選殖脂質運載蛋白及構建它們的環以產生抗運載蛋白。結構多樣之抗運載蛋白庫已產生及利用抗運載蛋白顯示可篩選結合功能，隨後表現及生產可溶性蛋白質以在原核或真核系統中進一步分析。研究成功證實可發展出對幾 乎任何可被分離之人目標蛋白質具專一性之抗運載蛋白及可獲得奈莫耳或更高範圍之結合親和性。
抗運載蛋白亦可被調製成雙目標蛋白質，稱為雙運載蛋白(Duocalins)。雙運載蛋白與二個不同的治療目標結合於一個單體蛋白質，其利用標準製程簡單生產然而不論其二個結合結構域之結構來源為何仍可維持目標專一性及親和性。
透過單一分子調節多重目標在已知涉及一種致病因子以上之疾病中特別有利。另外，雙或多價結合形式諸如雙運載蛋白在以疾病中之細胞表面分子為標靶、調節信號轉導途徑中之協同作用或透過結合及聚集細胞表面受體以誘導提高之內化作用上具有顯著潛力。另外，雙運載蛋白之高度內部穩定性與單體抗運載蛋白類似，使雙運載蛋白具有彈性配方及運送潛力之特性。
有關抗運載蛋白之其他資訊可見於美國專利7,250,297及國際專利申請公開號WO 99/16873，二者均以參照方式整體納入此處。
其他可用於本發明中之抗體擬似物技術係高親合性多聚體(Avimers)。高親合性多聚體係源自人胞外受體結構域之大型家族，其藉由活體外外子(exon)拼湊及噬菌體展示產生具有結合及抑制性質之多結構域蛋白質。連接多個獨立之結合結構域已經顯示可產生親合力(avidity)及導致相較於傳統單抗原決定位結合蛋白質改善之親和性及專一性。其它可能的好處包括在大腸桿菌中簡單而有效的生產 多目標專一性分子、改善之熱穩定性及對蛋白酶之抗性。對各種目標具亞奈莫耳親和性之高親合性多聚體已經獲得。
有關高親合性多聚體之其他資訊可見於美國專利申請公開號2006/0286603、2006/0234299、2006/0223114、2006/0177831、2006/0008844、2005/0221384、2005/0164301、2005/0089932、2005/0053973、2005/0048512、2004/0175756，所有皆以參照方式整體納入此處。
多樣抗體(Versabodies)係另一種可用於本發明中之抗體擬似物技術。多樣抗體係含有超過15%半胱胺酸之3-5kDa小型蛋白質，其形成高二硫化物密度支架，取代典型蛋白質所含之疏水性核。以少數二硫化物取代多數疏水性胺基酸(包含疏水性核)導致較小、親水性較高(較少聚集及非特異性結合)、對蛋白酶及熱更具抗性及具有較低密度之T細胞抗原決定位之蛋白質，因為與MHC表現最有關之殘基具疏水性。所有這四種特性已知會影響免疫原性，可預期的是它們一起導致免疫原性大幅降低。
多樣抗體之靈感係來自由水蛭、蛇、蜘蛛、蠍子、蝸牛、及銀蓮花所產生之天然注射性生物醫藥品，已知它們呈現非預期之低免疫原性。從經選擇之天然蛋白質家族開始，藉由設計及篩選大小，使疏水性、溶蛋白抗原處理及抗原決定位密度最小化至遠低於天然注射性蛋白質平均值之程度。
由於多樣抗體的構造，這些抗體擬似物提供包括多價、多專一性、多種半衰期機制、組織目標模組及缺乏抗體Fc區之多種形式。另外，多樣抗體以高產量在大腸桿菌中製造，由於它們的親水性及小體積，多樣抗體具有高度可溶性及可備調配成高濃度。多樣抗體係極度熱穩定(它們可被煮沸)及具有延長之貨架壽命。
有關多樣抗體之其他資訊可見於美國專利申請公開號2007/0191272，其以參照方式整體納入此處。
以上有關抗體片段及抗體擬似物技術之詳細說明並非意圖作為可用於本發明中之所有技術的完整清單。舉例來說(亦非作為限制之用)，多種其他技術包括替代性以多肽為基礎之技術諸如Qui et al.,Nature Biotechnology,25(8)921-929(2007)(其以參照方式整體納入此處)所述之融合互補決定區以及以核酸為基礎之技術諸如美國專利5,789,157、5,864,026、5,712,375、5,763,566、6,013,443、6,376,474、6,613,526、6,114,120、6,261,774及6,387,620(所有皆以參照方式納入此處)中所述之RNA適體(aptamer)技術可用於本發明中。
抗體物理性質
本發明之抗體可進一步以抗CXCR4抗體之各種物理特性為特徵。根據這些物理特性可利用各種試驗來偵測及/或區別不同類型之抗體。
在一些實施態樣中，本發明之抗體在輕鏈或重鏈變異 區中可包含一或多個糖基化位置。在變異區中存在一或多個糖基化位置可能因為抗原結合改變而導致抗體免疫原性增加或抗體之pK值改變(Marshall et al(1972)Annu Rev Biochem 41：673-702；Gala FA and Morrison SL(2004)J Immunol 172：5489-94；Wallick et al(1988)J Exp Med 168：1099-109；Spiro RG(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh et al(1985)Nature 316：452-7；Mimura et al.(2000)Mol Immunol 37：697-706)。已知糖基化發生在包含N-X-S/T序列之模體中。變異區糖基化可利用Glycoblot試驗測試，其切割抗體以產生Fab，接著利用測量過碘酸氧化及席夫鹼形成之試驗測試糖基化。或者，變異區糖基化可利用戴安(Dionex)公司光學色譜層析儀(Dionex-LC)檢測，其自Fab切割糖類成單糖及分析個別糖類含量。在一些案例中，較佳的是具有不包含變異區糖基化之抗CXCR4抗體。此可藉由選擇變異區不包含糖基化模體之抗體或藉由利用該領域所熟知之標準技術令糖基化模體中之殘基突變達成。
在較佳之實施態樣中，本發明之抗體不包含天冬醯胺酸異構位置。去醯胺基或異天冬胺酸作用可能分別發生在N-G或D-G序列。該去醯胺基或異天冬胺酸作用導致產生異天冬胺酸，其藉由在側鏈羧基端而非主鏈上產生結節構造而降低抗體之穩定性。異天冬胺酸之產生可利用等量試驗測量，其使用逆相HPLC檢測異天冬胺酸。
每個抗體將有獨特的等電點(pI)，但是抗體通常落在 pH 6至9.5之範圍內。IgG1抗體之pI通常落在7-9.5之pH範圍，及IgG4抗體之pI通常落在6-8之pH範圍。抗體可能具有此範圍外之pI值。雖然其作用大致上未知，猜測具有正常範圍以外之pI的抗體可能在活體內狀況下呈現一些展開及不穩定性。等電點可利用毛細管等電聚焦試驗測試，其產生pH梯度及可利用雷射聚焦以增加正確性(Janini et al(2002)Electrophoresis 23：1605-11；Ma et al.(2001)Chromatographia 53：S75-89；Hunt et al(1998)J Chromatogr A 800：355-67)。在一些案例中，較佳的是具有包含落在正常範圍之pI值的抗CXCR4抗體。這可藉由選擇具有正常範圍之pI的抗體或藉由利用該領域所熟知之標準技術令帶電表面殘基突變達成。
每個抗體將具有顯示熱穩定性之變性溫度(Krishnamurthy R and Manning MC(2002)Curr Pharm Biotechnol 3：361-71)。較高之熱穩定性表示活體內整體抗體穩定性較佳。抗體之變性溫度可利用諸如示差掃描熱量技術測量(Chen et al(2003)Pharm Res 20：1952-60；Ghirlando et al(1999)Immunol Lett 68：47-52)。TM1表示抗體之最初展開溫度。TM2表示抗體之完全展開溫度。通常較佳的是，本發明之抗體的TM1大於60℃，較佳大於65℃，甚至更加大於70℃。或者，抗體之熱穩定性可利用圓二色譜測量(Murray et al.(2002)J.Chromatogr Sci 40：343-9)。
在較佳之實施態樣中，選擇不會快速分解之抗體。抗 CXCR4抗體之片段可利用毛細管電泳(CE)及MALDI-MS測量，以該領域中所熟知之方式進行(Alexander AJ and Hughes DE(1995)Anal Chem 67：3626-32)。
在另一較佳之實施態樣中，選擇具有最小聚集效果之抗體。聚集作用可能導致刺激非所欲之免疫反應及/或改變或不利之藥動性質。一般來說，聚集作用25%或更低，較佳20%或更低，甚至更佳15%或更低，甚至更佳10%或更低及甚至更佳5%或更低之抗體係可接受的。聚集可利用該領域所熟知之數種技術測量，包括體積排阻管柱(SEC)高效液體色層分析(HPLC)及識別單體、雙體、三體或多體之光散射法。
構建抗體之方法
如上述討論，此處所揭示之具有VH及VK序列的抗CXCR4抗體可藉由修飾該VH及/或VK序列或與其連接之固定區以產生新的抗CXCR4抗體。因此，在本發明之其他態樣中，本發明之抗CXCR4抗體(例如F7、F9、D1或E2)的結構特性可被用來產生結構相關之抗CXCR4抗體，其保留至少一項本發明之抗體的功能特性，諸如與人CXCR4結合。舉例來說，F7、F9、D1或E2之一或多個CDR區或其突變可與已知之構架區及/或其他CDRs重組結合以產生如上述之其他重組構建之本發明之抗CXCR4抗體。其它種類之修飾包括該些在先前所描述者。用於構建方法之起始物質係一或多個此處所提供之VH及/或VK 序列或其一或多個CDR區。要產生該工程化抗體，不需要真的製備(即表現蛋白質)具有一或多個此處所提供之VH及/或VK序列或其一或多個CDR區之抗體。而是利用該序列中所包含之資訊作為起始物質以產生源自原始序列之「第二代」序列，接著該「第二代」序列被製備及表現成為蛋白質。
因此，在其他實施態樣中，本發明提供一種用於製備抗CXCR4抗體之方法，其包含：(a)提供(i)包含選自SEQ ID NO：1-4中之CDR1序列、選自SEQ ID NO：5-8中之CDR2序列及/或選自SEQ ID NO：9-12中之CDR3序列的重鏈變異區抗體序列；及/或(ii)包含選自SEQ ID NO：13-16中之CDR1序列、選自SEQ ID NO：17-20中之CDR2序列及/或選自SEQ ID NO：21-24中之CDR3序列的輕鏈變異區抗體序列；(b)改變重鏈變異區抗體序列及/或輕鏈變異區抗體序列中至少一個胺基酸殘基以產生至少一個經改變之抗體序列；及(c)表現該經改變之抗體序列為蛋白質。
可使用標準分子生物學技術以製備及表現該經改變之抗體序列。
較佳的是，由經改變之抗體序列編碼之抗體係保留一項、一些或所有此處所述之抗CXCR4抗體之功能特性的抗體，其功能特性包括但不限於：(i)與表現在細胞表面上之天然人CXCR4結合； (ii)抑制SDF-1與CXCR4結合；(iii)抑制於表現CXCR4之細胞中經SDF-1誘發之鈣離子流動；(iv)抑制表現CXCR4之細胞經SDF-1誘發的移動；(v)抑制由HuVECs之毛細血管形成；(vi)以1×10-7M或更低之KD值與人CXCR4結合；(vii)誘導表現CXCR4之細胞的細胞凋亡；(viii)於活體外抑制腫瘤細胞增生；(ix)於活體內抑制腫瘤細胞增生及/或誘導腫瘤細胞之細胞凋亡；(x)抑制CXCR4+腫瘤細胞轉移；及/或(xi)增加罹患CXCR4+腫瘤個體之存活時間。
經改變之抗體的功能特性可利用該領域中可用及/或此處所描述之標準試驗檢測，諸如該些在實施例中所述者(例如流式細胞計數、結合分析、功能試驗)。
在本發明之工程化抗體方法之特定實施態樣中，突變可被隨機或選擇性導入所有或部分抗CXCR4抗體編碼序列之中及可篩選該導致之經修飾的抗CXCR4抗體之結合活性及/或其他此處所述之功能特性。突變方法已在該領域中描述。例如，Short之PCT公開號WO 02/092780描述利用飽合突變、合成性連接組合或彼等之組合以產生及篩選抗體突變之方法。或者，Lazar等人之PCT公開號 WO 03/074679描述使用電腦篩選方法以最佳化抗體之生理化學特性之方法。
編碼本發明之抗體的核酸分子
本發明之其他態樣關於編碼本發明之抗體的核酸分子。該核酸可存在於完整細胞、細胞溶解物中或以部分純化或實質上純化之形式存在。當核酸以標準技術包括鹼/SDS處理、CsCl條帶分離法、管柱色層分析法、洋菜膠電泳及其他該領域所熟知之方法自其他細胞成分或其他污染物(例如其他細胞核酸或蛋白質)中被純化出來時係「經分離」或「成為實質上純化」。參見F.Ausubel,et al.,ed.(1987)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。本發明之核酸可為例如DNA或RNA及可包含或不包含內含子序列。在較佳之實施態樣中，該核酸係cDNA分子。
本發明之核酸可利用標準分子生物學技術獲得。對於由融合瘤(例如自下詳述之帶有人免疫球蛋白基因之基因轉殖鼠製備的融合瘤)所表現之抗體來說，編碼融合瘤所製造之抗體的輕鏈及重鏈cDNAs可由標準PCR放大或cDNA選殖技術得到。對於得自免疫球蛋白基因庫(例如使用噬菌體展示技術)之抗體而言，編碼該抗體之核酸可自基因庫中取得。
本發明較佳之核酸分子係該些編碼F7、F9、D1及E2單株抗體之VH及VL序列者。編碼F7、F9、D1及 E2之VH序列的DNA序列分別顯示於SEQ ID NO：33-36。編碼F7、F9、D1及E2之VL序列的DNA序列分別顯示於SEQ ID NO：37-40。
一旦獲得編碼VH及VL部分之DNA片段，可利用標準重組DNA技術進一步調控這些DNA片段，例如將變異區基因轉變為全長抗體鏈基因、成為Fab片段基因或成為scFv基因。在這些調控中，由VL或VH編碼之DNA片段係與其他編碼其他蛋白質之DNA片段操作性連接，諸如抗體固定區或彈性連接子。此處所使用之「操作性連接」一詞意圖指連接二個DNA片段以使由該二個DNA片段所編碼之胺基酸序列維持讀框順序(in-frame)。
該編碼VH區之經分離之DNA可藉由令VH編碼DNA與編碼重鏈固定區(CH1、CH2及CH3)之其他DNA分子操作性連接以轉換為全長重鏈基因。人重鏈固定區基因之序列為該領域中所知(參見Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)及包含這些區域之DNA片段可藉標準PCR放大技術獲得。重鏈固定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD固定區，但最佳者係IgG1或IgG4固定區。對於Fab片段重鏈基因來說，該VH編碼DNA可與其他僅編碼重鏈CH1固定區之DNA分子操作性連接。
該編碼VL區之經分離之DNA可藉由操作性連接VL 編碼DNA與編碼輕鏈固定區(CL)之其他DNA分子以轉換為全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人輕鏈固定區基因之序列為該領域中所知(參見Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)及包含這些區域之DNA片段可藉標準PCR放大技術獲得。在較佳之實施態樣中，輕鏈固定區可為κ或λ固定區。
要產生scFv基因，該VH及VL編碼DNA片段係與編碼彈性連接子(例如編碼胺基酸序列(Gly4-Ser)3)之其他片段操作性連接，以使該VH及VL序列可被表現為其VL及VH區係由該彈性連接子所連接之連續單鏈蛋白質(參見例如Bird et al.(1988)Science 242：423-426；Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty et al.,(1990)Nature 348：552-554)。
生產本發明之單株抗體
本發明之單株抗體(mAbs)可藉由各種技術生產，包括傳統單株抗體方法例如Kohler and Milstein(1975)Nature 256：495之標準體細胞雜交技術。雖然體細胞雜交法原則上較佳，但可以使用其他用於生產單株抗體之技術例如B淋巴球經病毒或腫瘤基因轉形。
用於製備雜交瘤之較佳動物系統係鼠系統。鼠之雜交瘤生產係一建立非常良好之程序。用於分離供融合之免疫 化脾細胞的免疫程序及技術為該領域所知。融合伴侶(例如鼠骨髓瘤細胞)及融合程序亦廣為所知。
本發明之嵌合或人化抗體可根據如上述製備之非人單株抗體之序列製備。編碼重鏈及輕鏈免疫球蛋白之DNA可利用標準分子生物學技術得自所欲之非人雜交瘤及構建以包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。舉例來說，要產生嵌合抗體，可利用該領域已知之方法將鼠變異區與人固定區連接(參見例如Cabilly等人之美國專利4,816,567)。要產生人化抗體，可利用該領域已知之方法將鼠CDR區插入人構架中(參見例如Winter之美國專利5,225,539，及Queen等人之美國專利5,530,101；5,585,089；5,693,762及6,180,370)。
在較佳之實施態樣中，本發明之抗體係人單株抗體。該與CXCR4結合之人單株抗體可利用帶有部分人免疫系統而非鼠系統之基因轉殖或染色體轉殖鼠產生。這些基因轉殖及染色體轉殖鼠分別包括此處所述之HuMAb Mouse®及KM Mouse®鼠，及在此處總稱為「人Ig鼠」。
HuMAb Mouse®(Medarex®公司)包含編碼未重新排列之人重鏈(μ及γ)及κ輕鏈免疫球蛋白序列之人免疫球蛋白基因微基因座，以及不活化該內源性μ及κ鏈基因座之目標突變(參見例如Lonberg,et al.(1994)Nature 368(6474)：856-859)。因此，該鼠展現減少表現鼠IgM或κ，及對免疫之反應為該導入之人重鏈及輕鏈轉殖基因經過類型轉換及體突變以產生高親合性人IgGκ單株抗體 (Lonberg,N.et al.(1994),supra；reviewed in Lonberg,N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101；Lonberg,N.and Huszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13：65-93,and Harding,F.and Lonberg,N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546)。HuMAb Mouse®之製備及用途，及該鼠所攜帶之基因修飾係進一步描述於Taylor,L.et al.(1992)Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen,J.et al.(1993)International Immunology 5：647-656；Tuaillon et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：3720-3724；Choi et al.(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chen,J.et al.(1993)EMBO J.12：821-830；Tuaillon et al.(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Taylor,L.et al.(1994)International Immunology 6：579-591；及Fishwild,D.et al.(1996)Nature Biotechnology 14：845-851，所有這些內容以參照方式整體納入此處。另外參考皆為Lonberg and Kay所有之美國專利5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；及5,770,429；Surani等人之美國專利5,545,807；皆為Lonberg and Kay所有之PCT公開號WO 92/03918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97/13852、WO 98/24884及WO 99/45962；及Korman等人之PCT公開號WO 01/14424。
在另一實施態樣中，本發明之人抗體可利用在轉殖基 因及轉殖染色體上帶有人免疫球蛋白序列之鼠培養，諸如帶有人重鏈轉殖基因及人輕鏈轉殖染色體之鼠。此鼠在此處被稱為「KM mouse®」，及詳細說明於Ishida等人之PCT公開號WO 02/43478。
另外，表現人免疫球蛋白基因之替代性轉殖基因動物系統可得自該領域中及可被用來培養本發明之抗CXCR4抗體。舉例來說，可使用被稱為Xenomouse(Abgenix,Inc)之替代性轉殖基因系統；該鼠被描述於例如Kucherlapati等人之美國專利5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584及6,162,963中。
另外，表現人免疫球蛋白基因之替代性轉殖染色體動物系統可得自該領域中及可被用來培養本發明之抗CXCR4抗體。舉例來說，可使用被稱為「TC mice」之帶有人重鏈轉殖染色體及人輕鏈轉殖染色體之鼠；該鼠被描述於Tomizuka et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727中。另外，帶有人重鏈及輕鏈轉殖染色體之牛已在該領域中描述(例如Kuroiwa et al.(2002)Nature Biotechnology 20：889-894及PCT公開號WO 2002/092812)及可被用來培養本發明之抗CXCR4抗體。
本發明之人單株抗體亦可利用供篩選人免疫球蛋白基因庫之噬菌體展示法製備。該用於分離人抗體之噬菌體展示法係該領域中已經建立者。參考例如Ladner等人之美國專利5,223,409；5,403,484及5,571,698；Dower等人之美國專利5,427,908及5,580,717；McCafferty等人之美國 專利5,969,108及6,172,197；及Griffiths等人之美國專利5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915及6,593,081。
本發明之人單株抗體亦可利用其中經人免疫細胞重建以使免疫時可產生人抗體反應之SCID鼠製備。該鼠係描述於例如Wilson等人之美國專利5,476,996及5,698,767。
在特別較佳之實施態樣中，人抗CXCR4抗體係利用人Ig鼠及噬菌體展示技術之組合製備，如Buechler等人之美國專利6,794,132中所述。更具體地說，該方法首先關於藉由以CXCR4抗原免疫鼠以在人Ig鼠(如前述之HuMab鼠或KM鼠)中獲得抗CXCR4抗體反應，接著自鼠之淋巴細胞分離編碼人抗體鏈之核酸及將這些核酸導入展示載體(例如噬菌體)以提供展示包之文庫。因此，各文庫之成員包含編碼人抗體鏈之核酸及各抗體鏈係由該展示包展示。接著以CXCR4抗原篩選該文庫以分離與CXCR4專一性結合之文庫成員。然後以標準方法分離及定序被選擇之文庫成員的核酸插入物，以決定該被選擇之CXCR4結合物的輕鏈及重鏈變異序列。該變異區可藉標準重組DNA技術轉換為全長抗體鏈，諸如選殖變異區至帶有人重鏈及輕鏈固定區之表現載體以使該VH區與CH區操作性連接及該VL區與CL區操作性連接。有關利用此組合之轉殖基因鼠/噬菌體展示系統製備人抗CXCR4抗體之進一步描述請參考實施例1。
免疫人Ig鼠
當人Ig鼠被用來培養本發明之人抗體時，該鼠可利用純化或富集之CXCR4抗原及/或重組CXCR4製劑、或表現CXCR4之細胞、或CXCR4融合蛋白質免疫，如Lonberg,N.et al.(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild,D.et al.(1996)Nature Biotechnology 14：845-851；及PCT公開號WO 98/24884及WO 01/14424所述。較佳的是，該鼠在第一次注射時為6-16週齡。舉例來說，經純化或重組之CXCR4抗原製劑(5-50微克)可用來經腹腔免疫人Ig鼠。最佳的是，該用來培養本發明之抗體的免疫原包含在膜中以其天然構型存在之人CXCR4，其非限制性實施例包括經轉染以在它們的細胞表面表現CXCR4之細胞、天然表現CXCR4之細胞(例如CEM細胞)及其中已融入CXCR4之人造膜(例如脂質體)，諸如融入CXCR4之磁性脂蛋白體(MPLs)(進一步描述於實施例1中)。
產生抗CXCR4之全長人單株抗體的詳細程序係描述於下面實施例1。使用各種抗原之累積經驗顯示轉殖基因鼠對於初期以完全弗氏佐劑中之抗原腹腔(IP)免疫，接著以不完全弗氏佐劑中之抗原隔週IP免疫(最多共6次)有所反應。然而，除弗氏以外之佐劑亦被發現有效。此外，不含佐劑之完整細胞被發現具高度免疫原性。免疫反應可利用在免疫計畫之過程中自後眼窩採血所獲得之血漿檢體監 測。該血漿可以ELISA(如下述)檢測，及具有足夠力價之抗CXCR4人免疫球蛋白之鼠可被用於輸注。鼠可在犧牲及切除脾臟前3天以抗原經靜脈加強免疫。預期每次免疫可能需要進行2-3次輸注。每種抗原通常免疫介於6至24隻鼠。通常同時使用HCo7及HCo12品系。此外，HCo7及HCo12二種轉殖基因可被一起培育至具有二個不同人重鏈轉殖基因(HCo7/HCo12)之單一鼠中。或者或此外，可如實施例1中所述使用KM Mouse®品系。
製備生產本發明之人單株抗體的雜交瘤
要製備生產本發明之人單株抗體的雜交瘤，來自免疫鼠之脾細胞及/或淋巴結細胞可被分離及融合至適當之永久化細胞系中，諸如鼠骨髓瘤細胞系。所產生之雜交瘤可經篩選以用於生產抗原專一性抗體。舉例來說，來自免疫鼠之脾淋巴球單細胞懸浮液可融合至含50% PEG之1/6數量的P3X63-Ag8.653zo非分泌性鼠骨髓瘤細胞(ATCC,CRL 1580)。或者，該來自免疫鼠之脾淋巴球單細胞懸浮液可利用電場電融合法融合，其使用CytoPulse大型腔室細胞融合電穿孔儀(CytoPulse Sciences,Inc.,Glen Burnie Maryland)。細胞以約2×105被接種至平底微量盤上，隨後2週培養於包含20%胎克隆血清、18%“653”條件培養基、5%奧利基因(origen)(IGEN)、4mM L-麩醯胺酸、1mM丙酮酸鈉(sodium pyruvate)、5mM HEPES、0.055mM 2-巰基乙醇、50單位/毫升青黴素、50毫克/毫升鏈黴素、50 毫克/毫升健大黴素及1倍HAT(Sigma；HAT於融合24小時後添加)之選擇性培養基中。經過大約2週後，細胞可被培養於其中HAT以HT取代之培養基中。然後每個孔槽可以ELISA篩選人單株IgM及IgG抗體。一旦雜交瘤開始大量生長，通常可在10-14天後觀察培養基。該抗體分泌性雜交瘤可被重新接種及篩選，如果仍然呈現人IgG陽性，該單株抗體可以極限稀釋法進行至少二次之次選殖。該穩定之次選殖物接著可於活體外培養以於組織培養基中產生少量抗體以用於特徵化。
要純化人單株抗體，經選擇之雜交瘤可生長於供單株抗體純化之2公升旋轉培養瓶中。上清液在以A蛋白-瓊脂糖管柱(Pharmacia,Piscataway,N.J.)進行親合色層分析之前可經過濾及濃縮。經洗提出之IgG可藉膠體電泳及高效液相層析法檢查以確保純度。該緩衝溶液可被換成PBS，及使用1.43之消光係數以OD280決定濃度。該單株抗體可被分裝及儲存於-80℃下。
製備生產本發明之單株抗體的轉染瘤
本發明之抗體亦可利用如該領域所熟知之重組DNA技術及基因轉染方法之組合於宿主細胞轉染瘤中生產(例如Morrison,S.(1985)Science 229：1202)。
舉例來說，要表現抗體或其抗體片段，編碼部分或全長輕鏈及重鏈之DNAs可利用標準分子生物學技術獲得(例如利用表現所欲抗體之雜交瘤進行PCR放大或cDNA 選殖)及該DNAs可被插入表現載體以使該基因與轉錄及轉譯控制序列操作性連接。在此背景之下，「操作性連接」一詞意圖指抗體基因被連接到載體中以使載體中之轉錄及轉譯控制序列發揮它們在調節抗體基因之轉錄及轉譯上的意圖功能。該表現載體及表現控制序列係經選擇以與所使用之表現宿主細胞相容。抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因可被插入分開之載體中或更典型者為二個基因均被插入相同的表現載體中。抗體基因係以標準方法插入表現載體中(例如連接抗體基因片段及載體上之互補限制位置或如果限制位置不存在以鈍端連接)。此處所描述之抗體的輕鏈及重鏈變異區可被用來產生任何抗體同型之全長抗體基因，藉由將它們插入已經編碼該所欲同型之重鏈固定區及輕鏈固定區的表現載體中，以使VH片段與CH片段在載體中操作性連接及VK片段與CL片段在載體中操作性連接。此外或二者擇一地，該重組表現載體可編碼促進抗體鏈自宿主細胞分泌之信號肽。該抗體鏈基因可被選殖至載體中以使信號肽與抗體鏈基因之胺基端依讀框順序連接。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源性信號肽(意即來自非免疫球蛋白之蛋白質的信號肽)。
除了抗體鏈基因之外，本發明之重組表現載體攜帶控制抗體鏈基因於宿主細胞中表現之調節序列。「調節序列」一詞意圖包括啟動子、增強子及其他控制抗體鏈基因之轉錄或轉譯的表現控制元件(例如聚腺苷酸化信號)。該調節序列係描述於例如Goeddel中(Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990))。該領域之技術人士將了解表現載體之設計(包括調節序列之選擇)視例如所選擇之欲轉形的宿主細胞、所欲蛋白質之表現量等因素而定。用於哺乳類宿主細胞表現之較佳調節序列包括在哺乳類細胞中引導大量蛋白質表現之病毒元件，諸如源自巨細胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))及多瘤病毒之啟動子及/或增強子。或者，可使用非病毒性調節序列，諸如泛素啟動子或β-球蛋白啟動子。另外，由不同來源之序列所組成的調節元件(諸如SRα啟動子系統)，其包含來自SV40早期啟動子及第1型人T細胞白血病病毒長端重複之序列(Takebe,Y.et al.(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。
除了抗體鏈基因及調節序列之外，本發明之重組表現載體可攜帶其他序列，諸如調節宿主細胞中之載體複製的序列(例如複製來源)及可選擇之標記基因。該可選擇之標記基因有助於其中被導入載體之宿主細胞的篩選(參見例如Axel等人之美國專利4,399,216、4,634,665及5,179,017)。舉例來說，通常該可選擇之標記基因令其中導入該載體之宿主細胞具有對藥物之抗性，諸如G418、潮黴素(hygromycin)或甲胺喋呤(methotrexate)。較佳之可選擇標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用於甲胺喋呤選擇/放大之dhfr-宿主細胞)及neo基因(用於G418篩選)。
要表現輕鏈及重鏈，該編碼重鏈及輕鏈之表現載體以標準技術被轉染至宿主細胞。各種形式之「轉染」用詞係意圖包含經常用於將外源性DNA導入至原核或真核宿主細胞之廣泛技術，例如電穿孔法、鈣-磷酸鹽沉澱法、DEAE葡聚糖轉染及該類似法。雖然理論上有可能在原核或真核宿主細胞中表現本發明之抗體，於真核細胞及最好是哺乳類宿主細胞中表現抗體係最為適宜，因為該真核細胞及特別是哺乳類細胞比起原核細胞較有可能組合及分泌經過適當摺疊及具免疫活性之抗體。利用原核細胞表現抗體基因曾被報告無法有效地大量生產活性抗體(Boss,M.A.and Wood,C.R.(1985)Immunology Today 6：12-13)。
較佳之用於表現本發明之重組抗體的哺乳類宿主細胞包括中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)(包括與DHFR可選擇性標記一起使用之dhfr- CHO細胞(描述於Urlaub and Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220)，例如描述於R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159：601-621)、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。特別是當與NSO骨髓瘤細胞一起使用時，其他較佳之表現系統係揭示於WO 87/04462(所有人Wilson)、WO 89/01036(所有人Bebbington)及EP 338,841(所有人Bebbington)之GS基因表現系統。當編碼抗體基因之重組表現載體被導入哺乳類宿主細胞中時，抗體係藉由在一段足以允許抗體於宿主細胞中表現或更佳為抗體分泌至其中宿主細胞生長之培養基中的時間內培養該 宿主細胞以產生。可利用標準蛋白質純化方法自培養基收集抗體。
與抗原結合之抗體的特徵
本發明之抗體可利用例如標準流式細胞儀測試與CXCR4之結合。由於本發明之抗體較佳地辨識以天然構型存在膜內之CXCR4，與CXCR4結合之測試係適宜地以利用表現天然構型CXCR4之試劑的試驗(例如流式細胞儀)進行。可用於結合試驗之表現天然構型CXCR4試劑的非限制性實例包括天然表現CXCR4之細胞(例如CEM細胞)、經轉染以表現CXCR4之細胞(例如以CXCR4表現載體轉染之R1610細胞)及其中已融入CXCR4之脂質體(例如融入CXCR4之磁性脂蛋白體)，以上各進一步詳細描述於實施例中。簡單地說，在流式細胞儀試驗中，表現CXCR4之細胞係與測試抗體一起培養，經過清洗，與可結合測試抗體之經標示的二次試劑一起培養，再次清洗，及進行分析以偵測二次試劑與細胞之結合(例如使用FACS儀)。較佳的是，以流式細胞儀分析具有最高力價之鼠將被用於融合或用於進一步篩選抗體(例如以噬菌體展示篩選由鼠之B細胞構成之抗體庫)。
如上所述之流式細胞術亦可被用來篩選與CXCR4免疫原呈現陽性反應之雜交瘤。表現以高親合性與CXCR4結合之抗體的雜交瘤被次選殖及進一步特徵化。每個雜交瘤(其保留親代細胞之反應性(藉流式細胞術))可選擇一個 克隆以製備儲存於-140℃下5-10槽之細胞庫及用於抗體純化。
要純化抗CXCR4抗體，經選擇之雜交瘤可生長於供單株抗體純化之2公升旋轉培養瓶。上清液在以A蛋白-瓊脂糖管柱(Pharmacia,Piscataway,N.J.)進行親合色層分析之前可經過濾及濃縮。經洗提出之IgG可藉膠體電泳及高效液相層析法檢查以確保純度。該緩衝溶液可被換成PBS，及使用1.43之消光係數以OD280決定濃度。該單株抗體可被分裝及儲存於-80℃下。
要決定該選擇之抗CXCR4單株抗體是否與特定抗原決定位結合，每個抗體可利用商業可購得之試劑(Pierce,Rockford,IL)加以生物素化。使用未經標示之單株抗體及生物素化單株抗體的競爭試驗可利用其中ELISA盤係覆有表現CXCR4之細胞的全細胞ELISA試驗進行，及測定未經標示抗體與生物素化抗體競爭結合CXCR4表現細胞之能力。生物素化mAb結合可利用鏈親合素-鹼磷酸酶探針偵測。
要決定純化抗體之同型，可利用對特定同型之抗體具專一性之試劑進行同型ELISAs。舉例來說，要決定人單株抗體之同型，以1微克/毫升之抗人免疫球蛋白在4℃下隔夜覆蓋微量滴定盤之孔槽。在以1% BSA阻斷後，該盤在室溫下與1微克/毫升或更少之測試單株抗體或純化同型對照組反應1至2小時。接著孔槽可與人IgG1或人IgM專一性鹼磷酸酶偶聯探針反應。試盤依上述方式培養 及分析。
抗CXCR4人IgGs可進一步利用西方印漬法測試與CXCR4抗原之反應。簡單地說，CXCR4可被製備及進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯胺膠體電泳。在電泳後，該經分離之抗原被轉移到硝酸纖維素膜，以10%胎牛血清封閉，及利用欲測試之單株抗體探針與之雜交。人IgG結合可利用抗人IgG鹼性磷酸酶偵測及BCIP/NBT受質錠(Sigma Chem.Co.,St.Louis,Mo.)呈色。
本發明之抗體的結合專一性亦可藉由監測抗體與表現CXCR4之細胞結合來決定，例如藉由流式細胞術。一般來說，細胞系(諸如CHO細胞系)可以編碼跨膜形式之CXCR4的表現載體轉染。該轉染蛋白質可包含較佳係在N端之標籤，諸如myc-標籤，其利用針對標籤之抗體以用於偵測。本發明之抗體與CXCR4結合可利用培養該轉染細胞與抗體及偵測經結合之抗體以決定。抗體與該轉染蛋白質上之標籤結合可被當作陽性對照。
免疫偶聯物
在另一方面，本發明包含與治療基團(諸如細胞毒素、藥物(例如免疫抑制劑)或放射毒素)偶聯之抗CXCR4抗體或其片段。該偶聯物在此處係指「免疫偶聯物」。包含一或多種細胞毒素之免疫偶聯物被稱為「免疫毒素」。細胞毒素或細胞毒性劑包括任何對細胞有害(例如殺死細胞)之劑質。實例包括紫杉醇(taxol)、細胞鬆弛素B (cytochalasin B)、短桿菌肽D(gramicidin D)、溴化乙錠(ethidium bromide)、依米丁(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、維克斯丁(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、柔紅比星(daunorubicin)、二羥基蒽二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光輝黴素(mithramycin))、放線菌素D(actinomycin D)、去氫睪酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮質激素(glucocorticoids)、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)，及嘌呤黴素(puromycin)及彼等之類似物或相同物。治療劑亦包括例如抗代謝劑(例如甲胺喋呤(methotrexate)、6-巰嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine)、賽他命(cytarabine)、5-氟尿嘧啶達卡巴嗪(5-fluorouracil decarbazine))、烷化劑(例如雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、塞替派(thioepa)、氯氨布西(chlorambucil)、美法崙(Melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)、及洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、環磷醯胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈脲佐菌素(streptozotocin)、絲裂黴素C(mitomycin C)及順-二氯二氨合鉑II(cis-dichlorodiamine platinum II)(DDP)、順鉑(cisplatin))、蒽環類(anthracyclines)(例如柔紅比星(daunorubicin)(舊稱柔 紅黴素(daunomycin))及多柔比星(doxorubicin))、抗生素(例如更生黴素(dactinomycin)(舊稱放線菌素(actinomycin))、博來黴素(bleomycin)、光輝黴素(mithramycin)及安曲黴素(anthramycin)(AMC))、及抗有絲分裂劑(長春新鹼(vincristine)及長春鹼(vinblastine))。
其他可與本發明之抗體偶聯之治療性細胞毒素的較佳實例包括杜卡黴素(duocarmycins)、刺孢黴素(calicheamicins)、美登素(maytansines)及奧瑞他丁(auristatins)及彼等之衍生物。刺孢黴素抗體偶聯物之實例可自商業購得(Mylotarg®；American Home Products)。
細胞毒素可利用該領域可得之連接子技術與本發明之抗體偶聯。曾被用於偶聯細胞毒素與抗體之聯接子類型實例包括但不限於腙類(hydrazones)、硫醚類、酯類、二硫化物及含肽連接子。可選擇在溶酶體室內易受低pH值之切割或易受蛋白酶之切割的連接子，諸如較佳為表現在腫瘤組織中之蛋白酶如組織蛋白酶(cathepsins)(例如組織蛋白酶B、C、D)。
關於細胞毒素之類型、連接子及供偶聯治療劑與抗體之方法的進一步討論亦可參考Saito,G.et al.(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail,P.A.et al.(2003)Cancer Immunol.Immunother.52：328-337；Payne,G.(2003)Cancer Cell 3：207-212；Allen,T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2：750-763；Pastan,I.and Kreitman,R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3：1089-1091；Senter, P.D.and Springer,C.J.(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53：247-264。
本發明之抗體亦可與放射活性同位素偶聯以產生細胞毒性放射性醫藥物，亦被稱為放射免疫偶聯物。可與抗體偶聯以供診斷或治療之用的放射活性同位素實例包括但不限於131碘、111銦、90釔及177鎦。用於製備放射性免疫偶聯物之方法係建立於該領域中。放射性免疫偶聯物之實例係商業可購得，包括Zevalin®(IDEC Pharmaceuticals)及Bexxar®(Corixa Pharmaceuticals)，及可使用類似方法以製備使用本發明之抗體的放射性免疫偶聯物。
本發明之抗體偶聯物可被用來修飾特定生物反應，及該藥物基團不應被視為限於典型化學治療劑。舉例來說，該藥物基團可為具有所欲生物活性之蛋白質或多肽。該蛋白質可包括例如酵素活性毒素或其活性片段，諸如相思豆毒蛋白(abrin)、蓖麻毒蛋白A(ricin A)、綠膿桿菌外毒素或白喉毒素；蛋白質諸如腫瘤壞死因子或干擾素-γ；或生物反應修飾劑諸如淋巴激素、介白素-1(IL-1)、介白素-2(IL-2)、介白素-6(IL-6)、顆粒球巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、顆粒球集落刺激因子(G-CSF)、或其他生長因子。
用於偶聯該治療基團與抗體之技術係廣為所知，參見例如Arnon et al.,“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”,in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld et al. (eds.),pp.243-56(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstrom et al.,“Antibodies For Drug Delivery”,in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.),Robinson et al.(eds.),pp.623-53(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”,in Monoclonal Antibodies ’84：Biological And Clinical Applications,Pinchera et al.(eds.),pp.475-506(1985)；“Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”,in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin et al.(eds.),pp.303-16(Academic Press 1985),and Thorpe et al.,Immunol.Rev.,62：119-58(1982)。
雙專一性分子
在另一方面，本發明包含包含本發明之抗CXCR4抗體或其片段之雙專一性分子。本發明之抗體或其抗原結合部位可衍生或連接至其他功能性分子，例如其他肽或蛋白質(例如其他抗體或受體之配體)以產生與至少二個不同結合部位或目標分子結合之雙專一性分子。本發明之抗體事實上可被衍生或連接至一個以上之其他功能性分子，以產生與二個以上不同結合部位及/或目標分子結合之多專一性分子；該多專一性分子亦意圖被包含於此處所使用之「雙專一性分子」一詞中。要產生本發明之雙專一性分 子，本發明之抗體可功能性連接(例如藉由化學偶合、基因融合、非共價連接或其他方式)至一或多個其他結合分子，諸如其他抗體、抗體片段、肽或結合擬似物，以導致雙專一性分子。
因此，本發明包括包含對CXCR4具有至少一個第一結合專一性及對第二目標抗原決定位具有第二結合專一性的雙專一性分子。在本發明之特定實施態樣中，該第二目標抗原決定位係Fc受體，例如人FcγRI(CD64)或人Fcα受體(CD89)。因此，本發明包括可與FcγR或FcαR表現效應細胞(例如單核球、巨噬細胞或多型核細胞(PMNs))及表現CXCR4之目標細胞結合的雙專一性分子。這些雙專一性分子令CXCR4表現細胞成為效應細胞之目標及刺激Fc受體媒介性效應細胞活性，諸如吞噬CXCR4表現細胞、抗體依賴性細胞媒介細胞毒性(ADCC)、細胞激素釋放或產生超氧陰離子。
在其中雙專一性分子係多專一性之本發明的實施態樣中，該分子除抗Fc結合專一性及抗CXCR4結合專一性之外可進一步包含第三結合專一性。在一實施態樣中，該第三結合專一性係抗增強因子(EF)部分，例如與細胞毒性活性有關之表面蛋白質結合的分子，其藉此增加針對目標細胞之免疫反應。「抗增強因子部分」可為與特定分子(例如抗原或受體)結合之抗體、功能性抗體片段或配體，以導致增強對Fc受體或目標細胞抗原之結合決定位的效應。該「抗增強因子部分」可與Fc受體或目標細胞抗原 結合。或者，該抗增強因子部分可結合不同於第一及第二結合專一性所結合之實體的實體。舉例來說，該抗增強因子部分可結合細胞毒性T細胞(例如透過CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或其他導致增強對抗目標細胞之免疫反應的免疫細胞)。
在一實施態樣中，本發明之雙專一性分子包含至少一個抗體或其抗體片段為結合專一性，包括例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fd、dAb或單鏈Fv。該抗體亦可為輕鏈或重鏈二聚體或其任何最小片段諸如Fv或如Ladner等人之美國專利4,946,778中所述之單鏈建構物，其內容以參照方式明示納入。
在一實施態樣中，對Fcγ受體之結合專一性係由單株抗體提供，其結合不被人免疫球蛋白G(IgG)阻斷。此處所使用之「IgG受體」一詞係指位於染色體1上之8個γ鏈基因之任何一個。這些基因共編碼12個跨膜或可溶性受體同型，它們被分成三個Fcγ受體類型：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及FcγRIII(CD16)。在一較佳之實施態樣中，該Fcγ受體係人高親和性FcγRI。該人FcγRI係72kDa之分子，其對單體IgG具有高親和性(108-109M-1)。
有關特定較佳之抗Fcγ單株抗體的生產及特徵係描述於Fanger等人之PCT公開號WO 88/00052及美國專利4,954,617號中，其揭示以參照方式完全納入此處。這些抗體與FcγRI、FcγRII或FcγRIII之抗原決定位結合的位 置異於該受體之Fcγ結合位置，因此它們的結合實質上不會受到生理濃度之IgG阻斷。可用於本發明之特定抗FcγRI抗體係mAb 22、mAb 32、mAb 44、mAb 62及mAb 197。該雜交瘤產生之mAb 32可得自ATCC登錄號HB9469。在其他實施態樣中，該抗Fcγ受體抗體係人化形式之單株抗體22(H22)。H22抗體之生產及特徵係描述於Graziano,R.F.et al.(1995)J.Immunol 155(10)：4996-5002及Tempest等人之PCT公開號WO 94/10332中。該H22抗體生產細胞系係保存於美國菌種保存中心編號HA022CL1及其登錄號為CRL 11177。
在其他較佳之實施態樣中，對Fc受體之結合專一性係由與人IgA受體(例如Fc-α受體(FcαRI(CD89))結合之抗體提供，其結合較佳不會被人免疫球蛋白A(IgA)阻斷。「IgA受體」一詞意圖包括位於染色體19上之一個α基因(FcαRI)的基因產物。此基因已知可編碼數個55至110kDa之非傳統切割跨膜同型。FcαRI(CD89)係基礎表現於單核球/巨噬細胞、嗜酸性及嗜中性顆粒球上，但不表現在非效應細胞族群上。FcαRI對IgA1及IgA2二者具有中度親和性(約5x107M-1)，當暴露於細胞激素諸如G-CSF或GM-CSF時增加(Morton,H.C.et al.(1996)Critical Reviews in Immunology 16：423-440)。四種與IgA配體結合結構域以外之FcαRI結合的FcαRI專一性單株抗體(被稱為A3、A59、A62及A77)已被描述(Monteiro,R.C.et al.(1992)J.Immunol.148：1764)。
FcαRI及FcγRI係本發明之雙專一性分子所使用之較佳刺激受體，因為它們(1)主要表現於免疫效應細胞上，例如單核球、PMNs、巨噬細胞及樹突細胞；(2)以高濃度表現(例如5,000-100,000/細胞)；(3)係細胞毒性活性之媒介物(例如ADCC、吞噬作用)；及(4)調節針對它們之抗原(包括自我抗原)的增強抗原表現。
雖然人單株抗體係較佳，其他可作為本發明之雙專一性分子之抗體係鼠、嵌合及人化單株抗體。
本發明之雙專一性分子可利用該領域已知之方法偶聯基礎結合專一性製備，例如抗FcR及抗CXCR4之結合專一性。舉例來說，該雙專一性分子之各結合專一性可分別產生然後互相偶聯。當結合專一性係蛋白質或肽，各種偶合或交聯劑可被用於共價偶聯。交聯劑之實例包括A蛋白、carbodiimide、N-succinimidyl-S-acetyl-thioacetate(SATA)、5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)(DTNB)、o-phenylenedimaleimide(oPDM)、N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate(SPDP)及sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohaxane-1-carboxylate(sulfo-SMCC)(參見例如Karpovsky et al.(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu,MA et al.(1975)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括該些於Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78,118-132；Brennan et al.(1985)Science 229：81-83及Glennie et al.(1987)J.Immunol.139：2367-2375中所描述者。較佳之偶聯劑係SATA及sulfo- SMCC，二者皆可得自皮爾斯化學公司(Rockford,IL)。
當結合專一性係抗體，它們可透過二個重鏈之C端鉸鏈區的sulfhydryl結合偶聯。在特別較佳之實施態樣中，該鉸鏈區在偶聯之前經修飾以包含奇數之sulfhydryl殘基，較佳為一個。
或者，二個結合專一性可在相同之載體中編碼及於相同的宿主細胞中表現及組合。此方法特別適用於該雙專一性分子係mAb x mAb、mAb x Fab、Fab x F(ab’)2或配體x Fab融合蛋白。本發明之雙專一性分子可為包含一個單鏈抗體及一個結合決定位之單鏈分子，或包含二個結合決定位之單鏈雙專一性分子。雙專一性分子可包含至少二個單鏈分子。用於製備雙專一性分子之方法係描述於例如美國專利號碼5,260,203；5,455,030；4,881,175；5,132,405；5,091,513；5,476,786；5,013,653；5,258,498；及5,482,858中，所有皆以參照方式明示納入此處。
雙專一性分子與其特定目標之結合可經由例如酵素連接免疫吸附法(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)、FACS分析、生物分析(例如生長抑制)或西方印漬法確認。每種這些試驗通常使用對所欲之複合物具專一性之經標記試劑(例如抗體)來偵測所欲之蛋白質-抗體複合物之存在。舉例來說，FcR-抗體複合物可利用例如辨識及與該抗體-FcR複合物專一性結合之酵素連接抗體或抗體片段偵測。或者，該複合物可利用任何各種其他免疫分析法偵測。舉例來說，該抗體可經放射活性標記及使用於放射免疫分析法 (RIA)(參見例如Weintraub,B.,Principles of Radioimmunoassays,Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques,The Endocrine Society,March,1986，其以參照方式納入此處)。該放射活性同位素可利用諸如γ計數器或閃爍計數器或自動放射線照相術(autoradiography)之方法偵測。
醫藥組成物
在另一態樣中，本發明提供一種組成物，例如醫藥組成物，其包含與藥學上可接受之載劑一起調合之本發明的一種單株抗體或單株抗體組合物或其抗原結合部位。該組成物可包含本發明之一種或組合(例如二或多種不同)之抗體，或免疫偶聯物或雙專一性分子。舉例來說，本發明之醫藥組成物可包含與目標抗原上之不同抗原決定位結合或具有互補活性之抗體(或免疫偶聯物或雙專一性分子)的組合物。
本發明之醫藥組成物亦可於組合療法中(意即與其它劑質組合)投服。例如，該組合療法可包括本發明之抗CXCR4抗體與至少一種其他抗發炎或免疫抑制劑之組合物。可用於組合療法中之治療劑實例係詳細描述於下面本發明之抗體之用途一節中。
此處所使用之「藥學上可接受之載劑」包括任何及所有生理上相容之溶劑、分散介質、塗層、抗細菌及抗真菌劑、等張及吸收延遲劑、及該類似物。較佳的是，該載劑 係適用於靜脈內、肌肉內、皮下、非經腸、脊椎或表皮投服(例如注射或輸注)。依所選擇之投服途徑而定，該活性化合物(意即抗體、免疫偶聯物或雙專一性分子)可被包覆於保護化合物不受酸作用及其他可不活化該化合物之天然條件的材質中。
本發明之醫藥組成物可包括一或多種藥學上可接受之鹽。「藥學上可接受之鹽」係指保留母化合物之所欲生物活性及不造成任何非所欲毒理作用之鹽(參見例如Berge,S.M.,et al.(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。該鹽之實例包括酸添加鹽及鹼添加鹽。酸添加鹽包括該些衍生自無毒之無機酸者(諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸及該類似物)及衍生自無毒之有機酸者(諸如脂肪族單及雙羧酸、經苯基取代之烷酸、羥基烷酸、芳香酸、脂肪族及芳香族磺酸及該類似物)。鹼添加鹽包括該些衍生自鹼土金屬者(諸如鈉、鉀、鎂、鈣及該類似物)及衍生自無毒之有機胺者(諸如N,N’-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因及該類似物)。
本發明之醫藥組成物亦可包括藥學上可接受之抗氧化劑。藥學上可接受之抗氧化劑實例包括(1)可溶於水之抗氧化劑，諸如維生素C、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、重亞硫酸鈉、亞硫酸鈉及該類似物；(2)可溶於油之抗氧化劑，諸如維生素C棕櫚酸酯、丁基羥基甲氧苯(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、天然維生 素E(alpha-tocopherol)及該類似物；及(3)金屬螯合劑，諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸及該類似物。
可應用於本發明之醫藥組成物中之適當水性及非水性載劑實例包括水、乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇、及該類似物)及彼等之適當混合物、植物油(諸如橄欖油)及可注射之有機酯(諸如油酸乙酯)。適當流動性可藉由例如使用包覆材質(諸如卵磷脂)、維持以分散劑為例中之所需顆粒大小及使用介面活性劑以維持。
這些組成物亦可包含佐劑諸如保存劑、潤濕劑、乳化劑及分散劑。防止微生物出現可藉由上述之滅菌程序及包含各種抗細菌及抗真菌劑(例如乙酯、氯丁醇、山梨酸酚及該類似物)以確保。在組成物中包括等張劑(諸如糖、氯化鈉及該類似物)亦為所欲。此外，延長注射型醫藥形式之吸收可藉由包含延緩吸收之劑質(諸如單硬脂酸鋁及明膠)以達成。
藥學上可接受之載劑包括無菌之水性溶液或分散劑及用於立即製備無菌注射溶液或分散劑之無菌粉末。使用該用於醫藥活性物質之介質及劑質係該領域中所知。除了任何與活性化合物不相容之傳統介質或劑質之外，可考慮其於本發明之醫藥組成物中之用途。補充之活性化合物亦可被納入該組成物中。
治療組成物通常在製造及儲存的條件下必須為無菌及穩定。該組成物可被調配為溶液、微乳化物、脂質體、或 其他適用於藥物高濃度中之有序結構。該載劑可為包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、及液體聚乙二醇及該類似物)及彼等之適當混合物的溶劑或分散介質。適當流動性可藉由例如使用塗層(諸如卵磷脂)、維持以分散劑為例中之所需顆粒大小及使用介面活性劑以維持。在許多案例中，較佳的是在該組成物中包括等張劑，例如糖、多元醇諸如甘露醇、山梨醇或氯化鈉。延長注射型組成物之吸收可藉由在組成物中包含延長吸收之劑質例如單硬脂酸鹽及明膠以達成。
無菌之注射型溶液的製備可藉由將所需量之活性化合物及視需要之一或多種上述成分納入適當溶劑，接著經過無菌微過濾。一般來說，分散劑係藉由將活性化合物納入包含基礎分散介質及所需之來自上述其他成分的無菌載劑以製備。在供製備無菌注射型溶液之無菌粉末的案例中，較佳之製備方法係真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，以產生含活性成分之粉末以及任何其他來自其先前經無菌過濾之溶液中的所欲成分。
可與載劑物質結合以產生單一劑型之活性成分的量，將視接受治療之個體及特定投服模式而有所不同。可與載劑物質結合以產生單一劑型之活性成分的量通常將是可產生治療效果之組成物的量。以百分率而言，此量通常介於約0.01%至約99%之活性成分，較佳介於約0.1%至約70%，最佳介於1%至約30%之活性成分與藥學上可接受之載劑組合。
給藥方案經調整以提供最佳之所欲反應(例如治療反應)。舉例來說，可給予單次注射、在一段時間內給予數次分開投藥或可視治療情況之危急性而按比例減少或增加投藥。特別有利的是將非經腸投服之組成物調合成易於投服及劑量一致之劑量單位形式。此處所使用之劑量單位形式係指適用於供欲治療之個體單次投服之物理分離單位；每個單位包含經計算以產生所欲治療效果之預先決定量的活性化合物與所欲之藥學載劑之組合物。本發明之劑量單位形式的規格將由(a)該活性化合物之獨特特徵及所欲達成之特定治療效果，及(b)合成該治療個體之敏感性之活性化合物的固有技藝限制描述及直接視二者而定。
在投服抗體時，該劑量介於約0.0001至100毫克/公斤，及更常為0.01至5毫克/公斤之宿主體重。舉例來說，劑量可為0.3毫克/公斤體重、1毫克/公斤體重、3毫克/公斤體重、5毫克/公斤體重或10毫克/公斤體重或介於1-10毫克/公斤之範圍內。示範性治療方式需要每週投服一次、每二週一次、每三週一次、每四週一次、每月一次、每三月一次或每三至六月一次。本發明之抗CXCR4抗體的較佳投服計畫包括經靜脈投服1毫克/公斤體重或3毫克/公斤體重，抗體之給予係利用下列投藥計畫之一：(i)每四週給予六次，然後每三月；(ii)每三週；(iii)3毫克/公斤體重一次接著每三週1毫克/公斤體重。
在一些方法中，二或多株具不同結合專一性之單株抗體係同時給予，其中每種抗體投服之劑量落在所顯示之範 圍。抗體通常在多重場合投服。在單次劑量之間的間隔可為例如每週、每月、每三月或每年。間隔亦可如測量抗病患體內目標抗原之抗體的血中濃度所示而不規則。在一些方法中，劑量經過調整以達到約1-1000微克/毫升之血漿抗體濃度及在一些方法中約25-300微克/毫升。
或者，抗體可被投與為持續釋放調合物，在此情況下需要較少投與次數。劑量及頻率視抗體在病患體內之半衰期而有所不同。一般來說，人抗體顯示最長之半衰期，之後為人化抗體、嵌合抗體、及非人抗體。投與之劑量及頻率可視該治療係預防或治療而不同。在預防應用中，相當低的劑量在一段長期的時間以相對不頻繁之間隔投服。在治療應用中，相對高劑量以相對短間隔有時候需要直到疾病進展減少或終結，及較佳的是病患顯示疾病之症狀部分或完全惡化。之後，病患可投服預防療法。
在本發明之藥學組成物中之活性成分的實際劑量濃度可有所差異以獲得活性成分之量，其有效達成對特定病患所欲治療反應，組成物及投服模式而對病患無毒性。該選擇之劑量濃度將視各種藥動因子而定，包括所使用之本發明之特定組成物的活性，或其酯、鹽或胺、投服途徑、投服時間、所使用之特定化合物之排泄速率、治療期間、與所使用之特定組成物所使用之其他藥物、化合物及/或物質、接受治療之病患的年齡、性別、體重、狀況、一般健康及先前醫學歷史，及在醫學技藝中所熟知之類似因子。
本發明之抗CXCR4抗體的「治療有效劑量」較佳導 致疾病症狀之嚴重度減少、無疾病症狀時期之頻率及期間增加、或預防因疾病折磨所致之障礙或失能。舉例來說，在治療CXCR4+腫瘤方面，「治療有效劑量」相對於未治療個體較佳地抑制至少約20%之細胞生長或腫瘤生長、更佳至少約40%、甚至更佳至少約60%、及更佳至少約80%。化合物抑制腫瘤生長之能力可於動物模型系統中評估人腫瘤之療效。或者，此組成物之性質可藉由檢查該化合物抑制細胞生長之能力評估，該抑制可於活體外藉由技術人士熟知之試驗測量。治療有效量之治療化合物可減少腫瘤大小，或以其他方式減輕個體之症狀。具該領域一般技藝之人士將可根據諸如個體大小、個體症狀之嚴重性及該所選擇之特定組成物或投服途徑等因素來決定該量。
本發明之組成物可使用一或多種該領域已知之多種方法經一或多種投服途徑投服。如該領域技術人士所知道的，投服之途徑及/或模式將視所欲之結果而定。本發明之抗體的較佳投服途徑包括靜脈內、肌肉內、皮內、腹腔內、皮下、脊椎或其他非經腸投服途徑例如注射或輸注。此處所使用之「非經腸投服」一詞係指除經腸及局部投服以外之投服模式，通常經注射，及包括但不限於靜脈內、肌肉內、動脈內、囊內、關節內、眶內、心內、皮內、腹腔內、經氣管、皮下、角質下、關節內、包膜下、蛛網膜下腔、脊椎內、硬膜外及胸骨內注射及輸注。
或者，本發明之抗體可經非經腸途徑投服，諸如局部、表皮或黏膜投服途徑，例如鼻內、口腔、陰道、直 腸、舌下或局部。
活性化合物可與防止化合物快速釋放之載劑一起製備，諸如控制釋放調合物，包括植入物、經皮貼布、及微膠囊釋放系統。可使用生物可分解、生物相容性之聚合物，諸如乙烯醋酸乙烯共聚物、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯、及聚乳酸。許多用於製備該調合物之方法具有專利或廣為該領域之技術人士所知。參見例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
治療組成物可以該領域所熟知之醫學設備投服。舉例來說，在較佳之實施態樣中，本發明之治療組成物可以無針之皮下注射設備投服，諸如在美國專利號5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中所揭示之設備。可用於本發明之眾所周知的植入物及模組實例包括：美國專利第4,487,603號，其揭露一種用於以控制速率給予藥物之植入式微輸注幫浦；美國專利第4,486,194號，其揭露一種用於經皮膚投服藥物之治療設備；美國專利第4,447,233號，其揭露一種用於以精準輸注速率輸送藥物之藥物輸注幫浦；美國專利第4,447,224號，其揭露一種用於連續輸送藥物之可變流速植入式輸注設備；美國專利第4,439,196號，其揭露一種具有多腔隔室之滲透性藥物輸送系統；及美國專利第4,475,196號，其揭露一種滲透性藥物輸送系統。這些專利以參照方式納入此處。許多其他該些植入物、輸送系統 及模組為該領域之技術人士所熟知。
在特定實施態樣中，本發明之人單株抗體可被調合以確保在活體內適當分佈。舉例來說，血腦障礙(BBB)排除許多高親水性化合物。要確保本發明之治療化合物穿越血腦障礙(若為所欲)，它們可被調合為例如脂質體。有關製造脂質體之方法，參見例如美國專利第4,522,811；5,374,548；及5,399,331號。該脂質體可包含一或多個被選擇性輸送至特定細胞或器官中之基團，藉此促進標靶藥物輸送(參見例如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。示範性標靶基團包括葉酸或生物素(參見例如Low等人之美國專利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa et al.,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗體(P.G.Bloeman et al.(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais et al.(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；介面活性劑A蛋白受體(Briscoe et al.(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier et al.(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；亦參見K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。
用途及方法
本發明之抗體(特別是人抗體)、抗體組成物及方法具有多種關於診斷及治療CXCR4媒介疾病之活體外及活體內診斷及治療用途。舉例來說，這些分子可被投服至培養 細胞(試管內或活體外)或人類個體(例如活體內)，以治療、預防及診斷各種疾病。此處所使用之「個體」一詞意圖包括人及非人動物。非人動物包括所有脊椎動物，例如哺乳類及非哺乳類，諸如非人靈長類、羊、狗、貓、牛、馬、雞、兩棲類及爬蟲類。較佳個體包括具有由CXCR4活性所媒介或調節或關於CXCR4/SDF-1途徑之疾病的人病患。當抗CXCR4之抗體與其他藥劑一起投服時，該二者可以任何順序或同時投服。
由於本發明之抗體與CXCR4具有專一結合性，本發明之抗體可用來專一性偵測CXCR4在細胞表面上之表達，及另外可透過免疫親和性用來純化CXCR4。
本發明之抗體組成物(例如人單株抗體、多專一性及雙專一性分子及免疫偶聯物)的活體內及活體外適當投服途徑為該領域中所熟知且可由該些具一般技藝之人士選擇。舉例來說，該抗體組成物可經注射投服(例如靜脈或皮下)。所使用之分子的適當劑量將視個體之年齡及體重及該抗體組成物之濃度及/或調合物而定。
如前所述，本發明之人抗CXCR4抗體可與一或其他多種治療劑一起投服，例如細胞毒性劑、放射毒性劑或免疫抑制劑。該抗體可與藥劑連接(成為免疫複合體)或可與藥劑分開投服。在後者情況中(分開投服)，該抗體可在該藥劑之前、之後或同時投服或可與其他已知療法一起投服，例如抗癌療法，例如放射線療法。該治療劑包括由其是抗腫瘤劑諸如多柔比星(doxorubicin)(阿黴素 (adriamycin))、順鉑硫酸博來黴素(cisplatin bleomycin sulfate)、卡莫司汀(carmustine)、氯氨布西(chlorambucil)及環磷醯胺羥基脲(cyclophosphamide hydroxyurea)，其自身僅在對病患有毒性或次毒性之濃度下才有效。順鉑(cisplatin)係以100毫克/公斤每四週一次之劑量經靜脈投服及阿黴素(adriamycin)係以60-75毫克/毫升每21天一次之劑量經靜脈投服。一起投服本發明之人抗CXCR4抗體或其抗原結合片段與化學治療劑提供二種透過不同機制作用以產生對人腫瘤細胞之細胞毒性作用的抗癌劑。這種一起投藥可解決因發生對藥物之抗性或腫瘤細胞之抗原性改變而使它們對抗體無反應的問題。
目標專一性效應細胞例如與本發明之組成物(例如人抗體、多專一性及雙專一性分子)連接之效應細胞亦可被用來作為治療劑。用來瞄準之效應細胞可為人白血球諸如巨噬細胞、嗜中性球或單核球。其他細胞包括嗜酸性球、天然殺手細胞及其他IgG或IgA受體攜帶細胞。若為所欲，效應細胞可獲取自欲接受治療之個體。目標專一性效應細胞可以在生理可接受之溶液中之細胞懸浮液投服。投服之細胞數量可在108-109但將視治療目的而有所不同。一般來說，該量將足以獲得目標細胞例如表現CXCR4之腫瘤細胞之定位及藉由例如吞噬作用啟動細胞殺滅。投服途徑亦可不同。
目標專一性效應細胞之療法可與其他用於移除目標細胞之技術一起進行。舉例來說，使用本發明之組成物(例 如人抗體、多專一性及雙專一性分子)及/或帶有這些組成物之效應細胞的抗癌療法可與化學療法一起使用。此外，組合免疫療法可被用來引導引起腫瘤細胞排斥之二種不同細胞毒性效應族群。例如，與抗Fc-gamma RI或抗CD3連接之抗CXCR4抗體可與IgG或IgA受體專一性結合劑一起使用。
本發明之雙專一性及多專一性分子亦可被用來調節效應細胞上之FcγR或FcγR濃度，諸如藉由阻斷(capping)及清除細胞表面上之受體。抗Fc受體之混合物亦可被用於本目的。
具有補體結合位置(諸如與補體結合之來自IgG1、-2或-3或IgM之部位)之本發明之組成物(例如人、人化、或嵌合抗體、多專一性及雙專一性分子及免疫偶聯物)亦可在補體存在下使用。在一實施態樣中，以本發明之結合劑活體外處理一群包含目標細胞之細胞及適當之效應細胞可藉由添加補體或血清包含補體加以補充。藉由與補體蛋白結合可促進吞噬包被本發明之結合劑的目標細胞。在另一實施態樣中，包被本發明之組成物(例如人抗體、多專一性及雙專一性分子)的目標細胞亦可被補體溶解。在另一實施態樣中，本發明之組成物不活化補體。
本發明之組成物(例如人、人化、或嵌合抗體、多專一性及雙專一性分子及免疫偶聯物)亦可與補體一起投服。因此，在本發明之範圍內係包含人抗體、多專一性或雙專一性分子及血清或補體之組成物。這些組成物的好處 在於補體與人抗體、多專一性或雙專一性分子的位置接近。或者，本發明之人抗體、多專一性或雙專一性分子及該補體或血清可分開投服。
本發明之抗體亦可與一或多種其他治療抗體或其他結合劑(諸如Ig融合蛋白)一起使用。可與本發明之抗CXCR4抗體一起投服之其他抗體或結合劑之非限制性實例包括抗CTLA-4、PSMA、CD30、IP-10、IFN-γ、CD70、PD-1、PD-L1、TNF、TNF-R、VEGF、VEGF-R、CCR5、IL-1、IL-18、IL-18R、CD19、Campath-1、EGFR、CD33、CD20、Her-2、CD25、gpIIb/IIIa、IgE、CD11a、α4整合素、IFNα及IFNAR1之抗體或結合劑。
亦屬於本發明之範圍內的是包含本發明之抗體組成物(例如人抗體、雙專一性或多專一性分子或免疫偶聯物)及使用說明之套組。該套組可進一步包含一或多種其他試劑，諸如免疫抑制劑、細胞毒性劑或放射毒性劑、或一或多種其他本發明之人抗體(例如具有補體活性之人抗體，其與CXCR4抗原上異於第一人抗體之抗原決定位結合)。
因此，以本發明之抗體組成物治療之病患可額外投服(在投服本發明之人抗體之前、同時或之後)其他治療劑，諸如細胞毒性或放射毒性劑，其可促進或增強該人抗體之治療效果。
在其他實施態樣中，該個體可額外接受調節(例如增強或抑制)Fcγ或Fcγ受體之表現或活性之劑質的治療， 藉由例如以細胞激素治療個體。在以多專一性分子治療期間用於投服之較佳細胞激素包括顆粒球集落刺激因子(G-CSF)、顆粒球-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-γ(IFN-γ)及腫瘤壞死因子(TNF)。
本發明之組成物(例如人抗體、多專一性及雙專一性分子)亦可被用於瞄準表現CXCR4之細胞，例如用於標示該細胞。在該用途中，該結合劑可連接至可被偵測到之分子。因此，本發明提供在活體外或試管內用於定位表現CXCR4之細胞的方法。該可偵測之標記可為例如放射性同位素、螢光化合物、酵素或酵素輔助因子。
在特定實施態樣中，本發明提供用於偵測檢體中CXCR4抗原之存在，或測量CXCR4抗原之量的方法，其包含令該檢體(及對照檢體)與人單株抗體或其抗原結合部位(其與CXCR4專一性結合)在抗體或其部位與CXCR4之間可形成複合體之條件下接觸。接著偵測複合體之形成，其中檢體與對照檢體之間形成不同複合體表示該檢體中存在CXCR4抗原。
在另一實施態樣中，本發明之免疫偶聯物可被用於瞄準化合物(例如治療劑、標籤、細胞毒素、放射性毒素、免疫抑制劑等)至具有CXCR4細胞表面受體之細胞，藉由連接該化合物至抗體。因此，本發明亦提供用於定位活體外或活體內表現CXCR4之細胞(例如以可偵測之標籤，諸如放射性同位素、螢光化合物、酵素、或酵素輔助因子)的方法。或者，該免疫偶聯物可被用來藉由瞄準細 胞毒素或放射性毒素至CXCR4以殺滅具有CXCR4細胞表面受體之細胞。
已知CXCR4可被表現在廣泛種類之腫瘤細胞類型上及亦與腫瘤轉移有關。另外，作為HIV進入T細胞之輔助受體，已知CXCR4與HIV感染有關。此外，CXCR4/SDR-1路徑已被顯示與發炎狀態有關。另外，該CXCR4/SDF-1路徑已被顯示與血管新生或新血管生成有關。因此，本發明之抗CXCR4抗體(及免疫偶聯物及雙專一性分子)可被用於下列各種臨床狀況中以調節CXCR4活性：
A.癌症
已顯示CXCR4由多種癌症類型表現及在特定狀況下已建立CXCR4表現與病患預後或存活之間的逆相關。與CXCR4表現有關之非限制性癌症種類實例包括：乳癌(Muller,A.et al.(2001)Nature 410：50-56)；卵巢癌(Scotton,C.et al.(2001)Br.J.Cancer 85：891-897)；攝護腺癌(Taichman,R.S.et al.(2002)Cancer Res.62：1832-1837)；非小細胞肺癌(Spano J.P.et al.(2004)Ann.Oncol.15：613-617)；胰癌(Koshiba,T.et al.(2000)Clin.Cancer Res.6：3530-3535)；甲狀腺癌(Hwang,J.H.et al.(2003)J.Clin.Endocrinol.Metab.88：408-416)；鼻咽癌(Wang,N.et al.(2005)J.Transl.Med.3：26-33)；黑色素瘤(Scala,S.et al.(2005)Clin.Cancer Res.11：1835- 1841)；腎細胞癌(Staller,P.et al.(2003)Nature 425：307-311)；淋巴癌(Bertolini,F.et al.(2002)Cancer Res.62：3530-3535)；神經母細胞瘤(Geminder,H.et al.(2001)J.Immunol.167：4747-4757)；膠質母細胞瘤(Rempel,S.A.et al.(2000)Clin.Cancer Res.6：102-111)；橫紋肌肉瘤(Libura,J.et al.(2002)Blood 100：2597-2606)；結直腸癌(Zeelenberg,I.S.et al.(2003)Cancer Res.63：3833-3839)；腎癌(Schrader,A.J.et al.(2002)Br.J.Cancer 86：1250-1256)；骨肉瘤(Laverdiere,C.et al.(2005)Clin.Cancer Res.11：2561-2567)；急性淋巴細胞白血病(Crazzolara,R.et al.(2001)Br.J.Haematol.115：545-553)；及急性骨髓細胞白血病(Rombouts,E.J.C.et al.(2004)Blood 104：550-557)。
考慮到前述，本發明之抗CXCR4抗體可被用於治療癌症，包括但不限於選自乳癌、卵巢癌、攝護腺癌、非小細胞肺癌、胰癌、甲狀腺癌、鼻咽癌、黑色素瘤、腎細胞癌、淋巴癌、神經母細胞瘤、膠質母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、結直腸癌、腎癌、骨肉瘤、急性淋巴細胞白血病、及急性骨髓細胞白血病中之癌症。該抗體可被單獨使用或與其他癌症治療組合使用，諸如手術及/或放射線治療，及/或與其它抗腫瘤劑組合使用，諸如上述討論及列出之抗腫瘤劑，包括化學治療劑及其他抗腫瘤抗原抗體，諸如該些與CD20、Her2、PSMA、Campath-1、EGFR及該類似物結合者。
B.病毒感染，包括HIV感染
CXCR4已被顯示為HIV進入T細胞之輔助受體，及此外特定鼠抗CXCR4抗體已經證實可抑制HIV分離株進入T細胞(參見Hou,T.et al.(1998)J.Immunol.160：180-188；Carnec,X.et al.(2005)J.Virol.79：1930-1938)。因此，CXCR4可被用來作為病毒進入細胞之受體及抗CXCR4之抗體可被用來抑制該使用CXCR4作為受體之病毒進入細胞。因此，本發明之人抗CXCR4抗體可被用來抑制病毒進入細胞，其中該病毒利用CXCR4作為進入細胞之受體，以使病毒感染被抑制。在較佳之實施態樣中，該抗體在例如HIV/AIDS之治療或預防中被用來抑制HIV進入T細胞。該抗體可被單獨使用或與其他抗病毒劑一起使用，諸如抗反轉錄病毒藥物諸如AZT或蛋白酶抑制劑。
C.發炎狀況
已顯示CXCR4/SDF-1路徑與多種發炎狀況有關，包括但不限於發炎性肝疾病(Terada,R.et al.(2003)Lab.Invest.83：665-672)；自體免疫性關節發炎(Matthys,P.et al.(2001)J.Immunol.167：4686-4692)；過敏性呼吸道疾病(Gonzalo,J.A.et al.(2000)J.Immunol.165：499-508)；及牙周病(Hosokawa,Y.et al.(2005)Clin.Exp.Immunol.141：467-474)。
因此，本發明之抑制SDF-1與CXCR4結合之人抗CXCR4抗體可被用來抑制發炎性疾病中之發炎，包括選自發炎性肝病、自體免疫性關節發炎、過敏性呼吸道疾病、牙周病、類風濕性關節炎、發炎性腸疾病、系統性紅斑性狼瘡、第一型糖尿病、發炎性皮膚疾病(例如乾癬、扁平苔蘚)、自體免疫性甲狀腺疾病、薛格連氏症候群、肺炎(例如慢性阻塞性肺病、肺結節病、淋巴細胞性肺泡炎)及發炎性腎疾病(例如IgA腎病變、腎小球腎炎)中之疾病。該抗體可被單獨使用或與其他抗發炎劑一起使用，諸如非固醇類抗發炎藥(NSAIDs)、皮質類固醇(例如潑尼松(prednisone)、氫化可地松(hydrocortisone)、甲胺喋呤(methotrexate)、COX-2抑制劑、TNF拮抗劑(例如依那西普(etanercept)、英利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab))及免疫抑制劑(諸如6-巰嘌呤(6-mercaptopurine)、硫唑嘌呤(azathioprine)及環孢靈A(cyclosporine A)。
D.血管新生
已經證實SDF-1透過吸引CXCR4表現之血管細胞(hemangiocytes)以誘導新血管形成(Jin,D.K.et al.(2006)Nat.Med.12：557-567)。另外，阻斷SDF-1/CXCR4路徑可藉由VEGF非依賴性方式抑制血管新生以減輕活體內腫瘤生長(Guleng,B.et al.(2005)Cancer Res.65：5864-58-71)。另外，如實施例2中所示，本發明之抗體可抑制試 管內之毛細血管形成。因此，本發明之抑制SDF-1與CXCR4結合之抗CXCR4抗體可被用來藉由干擾SDF-1/CXCR4途徑以抑制血管新生。抑制血管新生可被用來例如抑制腫瘤生長或腫瘤轉移(無論該腫瘤是否為CXCR4+)。該抗體可單獨使用或與其他抗血管新生劑一起使用，諸如抗VEGF抗體。
E.自體幹細胞移植
週邊血液幹細胞係用於自體幹細胞移植(例如用於治療特定血液惡性疾病)之幹細胞的較佳來源。自週邊血液收集幹細胞需要令CD34+幹細胞自骨髓移動至週邊血液。各種細胞激素、趨化因子及黏附分子曾被應用於調節此過程(於Gazitt,Y.(2001)J.Hematother.Stem Cell Res.10：229-236中回顧)，包括CXCR4及SDF-1之交互作用。另外，已證實小分子CXCR4拮抗劑可刺激CD34+幹細胞自骨髓快速移動至週邊(參見例如Devine,S.M.et al.(2004)J.Clin.Oncol.22：1095-1102；Broxmeyer,H.E.et al.(2005)J.Exp.Med.201：1307-1318；Flomenberg,N.et al.(2005)Blood 106：1867-1874)。因此，本發明之抑制CXCR4活性之抗CXCR4抗體(意即拮抗抗體)可被用來刺激CD34+幹細胞自骨髓移動至週邊血液以利該幹細胞於移植之用途(例如自體移植)，例如用於治療血液疾病，諸如多發性骨髓瘤及非何杰金氏淋巴瘤。該抗體可被單獨使用或與其它用於刺激幹細胞移動之劑質一起使用，諸如G- CSF及/或GM-CSF。因此，在另一實施態樣中，本發明提供一種刺激CD34+幹細胞自個體骨髓移動至週邊血液之方法，該方法包含投服本發明之抗CXCR4抗體予個體以刺激CD34+幹細胞自骨髓移動至週邊血液。該方法可進一步包含自週邊血液收集CD34+幹細胞，諸如用於自體幹細胞移植。
圖1A顯示F7人單株抗體之重鏈變異區的核苷酸序列(SEQ ID NO：33)及胺基酸序列(SEQ ID NO：25)。描述CDR1(SEQ ID NO：1)、CDR2(SEQ ID NO：5)及CDR3(SEQ ID NO：9)區，及指出V、D及J胚系來源。
圖1B顯示F7人單株抗體之輕鏈變異區的核苷酸序列(SEQ ID NO：37)及胺基酸序列(SEQ ID NO：29)。描述CDR1(SEQ ID NO：13)、CDR2(SEQ ID NO：17)及CDR3(SEQ ID NO：21)區，及指出V及J胚系來源。
圖2A顯示F9人單株抗體之重鏈變異區的核苷酸序列(SEQ ID NO：34)及胺基酸序列(SEQ ID NO：26)。描述CDR1(SEQ ID NO：2)、CDR2(SEQ ID NO：6)及CDR3(SEQ ID NO：10)區，及指出V、D及J胚系來源。
圖2B顯示F9人單株抗體之輕鏈變異區的核苷酸序列(SEQ ID NO：38)及胺基酸序列(SEQ ID NO：30)。描述CDR1(SEQ ID NO：14)、CDR2(SEQ ID NO：18)及CDR3(SEQ ID NO：22)區，及指出V及J胚系來源。
圖3A顯示D1人單株抗體之重鏈變異區的核苷酸序列(SEQ ID NO：35)及胺基酸序列(SEQ ID NO：27)。描述CDR1(SEQ ID NO：3)、CDR2(SEQ ID NO：7)及CDR3(SEQ ID NO：11)區，及指出V、D及J胚系來源。
圖3B顯示D1人單株抗體之輕鏈變異區的核苷酸序列(SEQ ID NO：39)及胺基酸序列(SEQ ID NO：31)。描述CDR1(SEQ ID NO：15)、CDR2(SEQ ID NO：19)及CDR3(SEQ ID NO：23)區，及指出V及J胚系來源。
圖4A顯示E2人單株抗體之重鏈變異區的核苷酸序列(SEQ ID NO：36)及胺基酸序列(SEQ ID NO：28)。描述CDR1(SEQ ID NO：4)、CDR2(SEQ ID NO：8)及CDR3(SEQ ID NO：12)區，及指出V、D及J胚系來源。
圖4B顯示E2人單株抗體之輕鏈變異區的核苷酸序列(SEQ ID NO：40)及胺基酸序列(SEQ ID NO：32)。描述CDR1(SEQ ID NO：16)、CDR2(SEQ ID NO：20)及CDR3(SEQ ID NO：24)區，及指出V及J胚系來源。
圖5A顯示F7(SEQ ID NO：25)及F7GL(SEQ ID NO：41)之重鏈變異區的胺基酸序列與人胚系VH 3-48胺基酸序列(SEQ ID NO：49)之比對(JH6b胚系揭示為SEQ ID NO：52)。
圖5B顯示F7(SEQ ID NO：29)及F7GL(SEQ ID NO：45)之輕鏈變異區的胺基酸序列與人胚系VK L15胺基酸序列(SEQ ID NO：50)之比對(JK1胚系揭示為SEQ ID NO：53)。
圖6A顯示F9(SEQ ID NO：26)及F9GL(SEQ ID NO：42)之重鏈變異區的胺基酸序列與人胚系VH 3-48胺基酸序列(SEQ ID NO：49)之比對(JH6b胚系揭示為SEQ ID NO：52)。
圖6B顯示F9(SEQ ID NO：30)及F9GL(SEQ ID NO：46)之輕鏈變異區的胺基酸序列與人胚系VK L15胺基酸序列(SEQ ID NO：50)之比對(JK1胚系揭示為SEQ ID NO：53)。
圖7A顯示D1(SEQ ID NO：27)及D1GL(SEQ ID NO：43)之重鏈變異區的胺基酸序列與人胚系VH 3-48胺基酸序列(SEQ ID NO：49)之比對(JH6b胚系揭示為SEQ ID NO：52)。
圖7B顯示D1(SEQ ID NO：31)及D1GL(SEQ ID NO：47)之輕鏈變異區的胺基酸序列與人胚系VK L15胺基酸序列(SEQ ID NO：50)之比對(JK1胚系揭示為SEQ ID NO：53)。
圖8A顯示E2(SEQ ID NO：28)及E2GL(SEQ ID NO：44)之重鏈變異區的胺基酸序列與人胚系VH 3-48胺基酸序列(SEQ ID NO：49)之比對(JH6b胚系揭示為SEQ ID NO：52)。
圖8B顯示E2(SEQ ID NO：32)及E2GL(SEQ ID NO：48)之輕鏈變異區的胺基酸序列與人胚系VK L15胺基酸序列(SEQ ID NO：50)之比對(JK1胚系揭示為SEQ ID NO：53)。
圖9顯示抗CXCR4人抗體F7、F9、D1及E2與在細胞表面上表現天然人CXCR4之CEM細胞結合。
圖10顯示FITC標示之抗CXCR4抗體F9及未標示之抗CXCR4人抗體組之間與CEM細胞結合的抗體競爭。
圖11顯示抗CXCR4人抗體F7、F9及D1抑制125I標示之SDF-1與CEM細胞結合。
圖12顯示抗CXCR4人抗體F7、F9及D1抑制SDF-1於CEM細胞中所誘發之鈣離子流動。
圖13顯示抗CXCR4人抗體F7及F9抑制SDF-1所誘發之CEM細胞移動。
圖14顯示抗CXCR4人抗體F7、F9及E2抑制雷蒙氏(Ramos)腫瘤細胞於活體外之增生。
圖15A-C顯示抗CXCR4人抗體F7及F9於皮下腫瘤模式中抑制雷蒙氏(Ramos)腫瘤細胞於活體內之增生。圖15A顯示平均腫瘤體積生長曲線；圖15B顯示中位腫瘤體積生長曲線；圖15C顯示中位%體重變化。
圖16顯示在雷蒙氏全身性腫瘤細胞模式中以抗CXCR4人抗體F9治療之鼠的存活%。
本發明進一步以下列實施例說明，其不應被視為額外限制。所有圖表及本申請案所引述之所有參考文獻、專利及公開專利申請書之內容以參照方式明白納入此處。
實施例1：生產抗CXCR4之人單株抗體
抗CXCR4人單株抗體係利用組合方式生產，其中首先免疫表現人抗體基因之鼠以在鼠體內建立對人CXCR4具專一性之人免疫球蛋白庫，其次自該鼠之脾臟細胞製備人抗體庫並於噬菌體上展示，以便之後篩選表現具CXCR4專一性之抗體的噬菌體。此組合方式大致描述於Buechler等人之美國專利申請案20030091995號中。
抗原
R1610細胞(中國倉鼠肺細胞系，原始描述於Thirion,J.P.et al.(1976)Genetics 83：137-147)經編碼全長人CXCR4蛋白質之表現載體轉染，以使該蛋白質於該細胞表面上表現。密碼子最佳化形式之CXCR4 cDNA被使用於該表現載體中，其係如Mirzabekov,T.et al.(1999)J.Biol.Chem.274：28745-28750中所述製備。為提高細胞之免疫原性，該細胞藉由與三硝基苯磺酸(TNBS)之水溶液(商業可購得之5%溶液(Sigma,Cat.#P2297))培養以包覆三硝基苯酚(TNP)。更具體地說，1×108細胞以無菌PBS清洗一次，於室溫暗室中與50微升商用5% TNBS溶液培養1小時及之後以PBS清洗三次。該所形成之TNP-包覆之CXCR4表現R1610細胞被當作免疫之抗原使用。最終免疫原係100微升經TNP-包覆、清洗之細胞(1×107細胞)加上100微升Ribi佐劑之混合物。鼠在一段時間內接 受6次免疫原免疫。
轉基因轉染色體之KM Mouse®品系
抗CXCR4之全長人單株抗體係由初步免疫KM品系之轉基因轉染色體鼠以製備，該鼠表現人抗體基因。在此鼠品系中，該內源性鼠kappa輕鏈基因已如Chen et al.(1993)EMBO J.12：811-820中所述經同源性中斷及該內源性鼠重鏈基因已如PCT公開號WO 01/09187之實施例1中所述經同源性中斷。此外，此鼠品系帶有人kappa輕鏈轉基因KCo5(如Fishwild et al.(1996)Nature Biotechnology 14：845-851中所述)及亦包含攜帶人Ig重鏈基因座(如PCT公開號WO 02/43478中所述)之SC20轉染色體。在美國專利申請案號20020199213中亦詳細描述KM鼠。
KM免疫
為了培養抗CXCR4之全長人單株抗體，KM Mouse®品系之鼠以經轉染以表現CXCR4及包覆TNP(如上抗原部分所述)之R1610細胞免疫。在攜帶人抗體基因之鼠品系中培養人抗體的總體免疫計畫係描述於Lonberg,N.et al(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild,D.et al.(1996)Nature Biotechnology 14：845-851及PCT公開號WO 98/24884中。該鼠在第一次注射抗原時為6-16週齡。
KM鼠以含Ribi佐劑之抗原經腹腔(IP)、皮下(Sc)或經足墊(FP)免疫，之後以含Ribi佐劑之抗原每3-21天經IP、Sc或FP再次免疫(共免疫6次)。免疫反應係藉眼後採血監測。血漿係由CXCR4表現R1610細胞之FACS染色篩選(與未經轉染之親代R1610細胞比較)。具有足夠力價之抗CXCR4人免疫球蛋白之鼠被用來收集脾臟。
製備噬菌體展示庫及篩選抗CXCR4抗體
自如上述之免疫鼠收集的脾臟被用來製作表現人抗體重鏈及輕鏈之噬菌體展示庫。具體地說，自脾臟分離總RNA、自該RNA製備cDNA及人抗體變異區cDNA係利用PCR特異性擴增，實際上如Buechler等人之美國專利申請號20030091995中所述。該人抗體變異區庫經轉殖至噬菌體表現載體中，實際上同樣如Buechler等人之美國專利申請號20030091995中所述。該噬菌體展示庫藉由與融入磁性蛋白脂質體之人CXCR4(CXCR4-MPL)反應以篩選具CXCR4親和性之噬菌體庫成員。表現CXCR4或其他7次跨膜(7TM)受體(例如CCR5)以維持7TM受體天然構型之MPLs已於先前被描述(參見例如Mirzabekov,T.et al.(2000)Nat.Biotechnol.18：649-654；Babcock,G.J.et al.(2001)J.Biol.Chem.276：38433-38440；PCT公開號WO 01/49265；美國專利申請號20010034432)。簡單地說，使用清潔劑CHAPSO自經轉染之CXCR4表現細胞系中溶解包含抗原決定位標籤之重組人CXCR4及該蛋白質 係經該抗原決定位標籤被捕捉到磁珠上。在移除清潔劑時重組脂質膜，以使CXCR4之天然膜構型得以維持，以產生CXCR4-MPLs。令噬菌體展示庫以CXCR4-MPLs篩選三次導致CXCR4-結合劑相較於背景增加30倍。所欲之變異區片段經選殖至Fab表現載體及重新測試該Fab對經轉染之CXCR4表現細胞之抗原結合性。接著使用標準分子生物學技術自該Fabs生產全長抗體。
選擇Fab克隆F7、F9、D1及E2以供進一步分析。
實施例2：人抗CXCR4單株抗體F7、F9、D1及E2之結構特徵
使用標準DNA定序技術以定序編碼F7、F9、D1及E2 Fab克隆(得自如實施例1中所述之噬菌體展示庫篩選)之重鏈及輕鏈變異區的cDNA序列。
F7之重鏈變異區的核苷酸及胺基酸序列顯示於圖1A及分別於SEQ ID NO：33及25中。
F7之輕鏈變異區的核苷酸及胺基酸序列顯示於圖1B及分別於SEQ ID NO：37及29中。
比較F7重鏈免疫球蛋白序列與已知之人胚系免疫球蛋白重鏈序列證實F7重鏈使用來自人胚系VH 3-48之VH片段、來自人胚系4-23之D片段、及來自人胚系JH 6B之JH片段。利用Kabat系統之CDR區分析進一步分析F7 VH序列得知重鏈CDR1、CDR2及CDR3區之描述係如圖1A及分別如SEQ ID NO：1、5及9中所示。
比較F7輕鏈免疫球蛋白序列與已知之人胚系免疫球蛋白輕鏈序列證實F7輕鏈使用來自人胚系VK L15之VL片段及來自人胚系JK 1之JK片段。利用Kabat系統之CDR區分析進一步分析F7 VL序列得知輕鏈CDR1、CDR2及CDR3區之描述係如圖1B及分別如SEQ ID NO：13、17及21中所示。
F9之重鏈變異區的核苷酸及胺基酸序列顯示於圖2A及分別於SEQ ID NO：34及26中。
F9之輕鏈變異區的核苷酸及胺基酸序列顯示於圖2B及分別於SEQ ID NO：38及30中。
比較F9重鏈免疫球蛋白序列與已知之人胚系免疫球蛋白重鏈序列證實F9重鏈使用來自人胚系VH 3-48之VH片段、來自人胚系4-23之D片段、及來自人胚系JH 6B之JH片段。利用Kabat系統之CDR區分析進一步分析F9 VH序列得知重鏈CDR1、CDR2及CDR3區之描述係如圖2A及分別如SEQ ID NO：2、6及10中所示。
比較F9輕鏈免疫球蛋白序列與已知之人胚系免疫球蛋白輕鏈序列證實F9輕鏈使用來自人胚系VK L15之VL片段及來自人胚系JK 1之JK片段。利用Kabat系統之CDR區分析進一步分析F9 VL序列得知輕鏈CDR1、CDR2及CDR3區之描述係如圖2B及分別如SEQ ID NO：14、18及22中所示。
D1之重鏈變異區的核苷酸及胺基酸序列顯示於圖3A及分別於SEQ ID NO：35及27中。
D1之輕鏈變異區的核苷酸及胺基酸序列顯示於圖3B及分別於SEQ ID NO：39及31中。
比較D1重鏈免疫球蛋白序列與已知之人胚系免疫球蛋白重鏈序列證實D1重鏈使用來自人胚系VH 3-48之VH片段、來自人胚系4-23之D片段、及來自人胚系JH 6B之JH片段。利用Kabat系統之CDR區分析進一步分析D1 VH序列得知重鏈CDR1、CDR2及CDR3區之描述係如圖3A及分別如SEQ ID NO：3、7及11中所示。
比較D1輕鏈免疫球蛋白序列與已知之人胚系免疫球蛋白輕鏈序列證實D1輕鏈使用來自人胚系VK L15之VL片段及來自人胚系JK 1之JK片段。利用Kabat系統之CDR區分析進一步分析D1 VL序列得知輕鏈CDR1、CDR2及CDR3區之描述係如圖3B及分別如SEQ ID NO：15、19及23中所示。
E2之重鏈變異區的核苷酸及胺基酸序列顯示於圖4A及分別於SEQ ID NO：36及28中。
E2之輕鏈變異區的核苷酸及胺基酸序列顯示於圖4B及分別於SEQ ID NO：40及32中。
比較E2重鏈免疫球蛋白序列與已知之人胚系免疫球蛋白重鏈序列證實E2重鏈使用來自人胚系VH 3-48之VH片段、來自人胚系4-23之D片段、及來自人胚系JH 6B之JH片段。利用Kabat系統之CDR區分析進一步分析E2 VH序列得知重鏈CDR1、CDR2及CDR3區之描述係如圖4A及分別如SEQ ID NO：4、8及12中所示。
比較E2輕鏈免疫球蛋白序列與已知之人胚系免疫球蛋白輕鏈序列證實E2輕鏈使用來自人胚系VK L15之VL片段及來自人胚系JK 1之JK片段。利用Kabat系統之CDR區分析進一步分析E2 VL序列得知輕鏈CDR1、CDR2及CDR3區之描述係如圖4B及分別如SEQ ID NO：16、20及24中所示。
令F7、F9、D1及E2之VH及VL區的骨架序列分析與它們所衍生自之胚系序列比較，找出各種異於胚系之骨架胺基酸殘基。在VH及VL片段之N端區域中的特定骨架殘基被選擇用於「反突變」以恢復骨架殘基成為胚系序列，因為這些N端部分之非胚系殘基係由用來產生實施例1中所描述之噬菌體展示庫的引子所編碼。具體來說，下列F7、F9、D1及E2之VH及VL片段的修飾形式(稱為「GL」形式，指胚系)係利用標準分子生物技術產生以取代所示之骨架位置的胚系胺基酸殘基：F7GL VH：Q1E,Q6E
F7GL VK：A1D,R3Q
F9GL VH：Q1E,Q6E
F9GL VK：E1D,V3Q,L4M
D1GL VH：Q6E
D1GL VK：V1D,W3Q,V4M
E2GL VH：Q6E
E2GL VK：E1D,V3Q,L4M
圖5A顯示F7(SEQ ID NO：25)及F7GL(SEQ ID NO： 41)重鏈可變異胺基酸序列與胚系VH 3-48編碼胺基酸序列(SEQ ID NO：49)之比對。該CDR1、CDR2及CDR3區係經描述。
圖5B顯示F7(SEQ ID NO：29)及F7GL(SEQ ID NO：45)輕鏈可變異胺基酸序列與胚系VK L15編碼胺基酸序列(SEQ ID NO：50)之比對。該CDR1、CDR2及CDR3區係經描述。
圖6A顯示F9(SEQ ID NO：26)及F9GL(SEQ D NO：42)重鏈可變異胺基酸序列與胚系VH 3-48編碼胺基酸序列(SEQ ID NO：49)之比對。該CDR1、CDR2及CDR3區係經描述。
圖6B顯示F9(SEQ ID NO：30)及F9GL(SEQ ID NO：46)輕鏈可變異胺基酸序列與胚系VK L15編碼胺基酸序列(SEQ ID NO：50)之比對。該CDR1、CDR2及CDR3區係經描述。
圖7A顯示D1(SEQ ID NO：27)及D1GL(SEQ ID NO：43)重鏈可變異胺基酸序列與胚系VH 3-48編碼胺基酸序列(SEQ ID NO：49)之比對。該CDR1、CDR2及CDR3區係經描述。
圖7B顯示D1(SEQ ID NO：31)及D1GL(SEQ ID NO：47)輕鏈可變異胺基酸序列與胚系VK L15編碼胺基酸序列(SEQ ID NO：50)之比對。該CDR1、CDR2及CDR3區係經描述。
圖8A顯示E2(SEQ ID NO：28)及E2GL(SEQ ID NO：44)重鏈可變異胺基酸序列與胚系VH 3-48編碼胺基酸序列(SEQ ID NO：49)之比對。該CDR1、CDR2及CDR3區係經描述。
圖8B顯示E2(SEQ ID NO：32)及E2GL(SEQ ID NO：48)輕鏈可變異胺基酸序列與胚系VK L15編碼胺基酸序列(SEQ ID NO：50)之比對。該CDR1、CDR2及CDR3區係經描述。
F7、F9、D1及E2之Fab片段係利用標準重組DNA技術轉換成全長抗體。舉例來說，編碼Fab片段之一的VH及VK區之DNA可被選殖至帶有重鏈及輕鏈固定區之表現載體以使該變異區與固定區操作性連接。或者，不同之載體可被用於表現全長重鏈及全長輕鏈。適用於產生全長抗體之表現載體的非限制性實例包括Black之美國專利申請號20050153394中所描述之pIE載體。
實施例3：抗CXCR4人單株抗體之結合特徵
在此實施例中，抗CXCR4抗體之結合特徵係以流式細胞術檢查。
在其細胞表面上表現天然人CXCR4之人T細胞系CEM被用來檢測F7、F9、D1及E2抗體與天然、細胞表面CXCR4結合之能力。全長F7、F9、D1及E2係以1：3連續稀釋倍數稀釋，導致自300nM至5pM之濃度。該抗體接著與CEM細胞混合及使之在以FITC偶聯之抗人IgG二次抗體偵測之前得以結合。該細胞接著利 用螢光細胞術分析。所導致之平均螢光強度係於圖9中之圖所示，其證實所有4種抗CXCR4抗體均與CEM細胞結合。與F7、F9、D1及E2結合之EC50值分別為21nM、14nM、80nM及290nM。
為了決定抗CXCR4抗體群競爭與CXCR4結合之能力，進行競爭試驗。使用4種人抗CXCR4抗體F9、F7、E2及D1與4種商業可得之鼠單株抗CXCR4抗體(12G5、708、716及717；R&D Systems目錄標號分別為MAB170、MAB171、MAB172及MAB173)。該抗CXCR4抗體係以1：3連續稀釋倍數稀釋，導致在含有固定濃度之FITC標記抗CXCR4抗體F9的情況下自300nM至5pM之濃度。該抗體混合物接著被加入CEM細胞中及使之得以結合。各抗體與F9競爭與CEM細胞結合之能力係由螢光細胞術及FITC偵測分析。所導致之平均螢光強度係於圖10中之圖所示，其證實所有7種受測抗體(F7、E2、D1、12G5、708、716及717)均可與F9競爭與CEM細胞之結合，雖然E2抗體相較於其他抗體僅於高濃度下顯示部分抑制。
在另一組試驗中，F7單株抗體與多種不同細胞系結合之能力係由進行FACS稀釋之流式細胞術檢測。增量之單株抗體(自低於0.001微克/毫升至高於100微克/毫升)係與100,000個細胞培養及以流式細胞術測定結合。亦決定Bmax值，其顯示大約有多少CXCR4分子存在於每個細胞上。根據該結合曲線決定抗體結合之EC50值， 其結果摘列於下表1： Bmax=最高結合力(GMFI單位)
結果顯示F7單株抗體可與6種受測之各種細胞系有效結合，所觀察到之最低EC50值出現在Ramos與Raji細胞系。這些資料同時顯示Ramos與Namalwa細胞之CXCR4受體表現最高及MDA-MB-231細胞與DMS79細胞最低。
在其他結合試驗中，F7單株抗體與不同亞群之人周邊血液單核細胞(PBMCs)結合之能力受到檢測。人PBMCs係以標準方法分離及不同的細胞亞群係以FACS分離。具體地說，下列細胞亞群被分離：(i)CD3+，(ii)CD20+；(iii)CD11b+及(iv)CD14+。以F7單株抗體(33微克/毫升)進行之流式細胞試驗顯示F7單株抗體相較於同型符合對照抗體可與4種亞群中之各種有效結合。
實施例4：抗CXCR4抗體抑制SDF-1與CXCR4結 合
為了決定抗CXCR4人抗體抑制SDF-1與CXCR4結合之能力，使用以碘125-標記之SDF-1與天然表現CXCR4之CEM細胞進行競爭試驗。抗CXCR4抗體對於阻斷SDF-1與CEM細胞結合之比較係利用標準放射線標記配體結合試驗進行。該抗CXCR4抗體係以1：3連續稀釋以產生自300nM至137pM之濃度範圍。該抗體在含有具2000Ci/mmole特定活性之100pM碘125-SDF-1的情況下(Amersham，目錄編號IM314-25UCI)被加入100微升之750,000個CEM細胞中。屬於相同同型之不相關抗體被用來作為陰性對照。可能結合之放射線標記配體總量係藉由允許碘125-SDF-1在不含抗體之情況下於4℃下與CEM細胞結合2小時以決定。放射線標記配體之非專一性結合係由允許碘125-SDF-1在含有1μM未經標記之SDF-1(Peprotech，目錄編號300-28A)之情況下結合以決定。細胞相關之碘125-SDF-1之量係由標準方法決定。該結果顯示於圖11，其證實F7抗體提供最有效地阻斷SDF-1與表現在CEM細胞上之CXCR4結合。F9及D1抗體亦阻斷SDF-1結合，雖然相較於F7較為溫和。E2抗體雖然確實與CEM細胞上之CXCR4結合(如實施例3中所示)，其無法有效地阻斷SDF-1與CEM細胞上之CXCR4結合。F7、F9及D1抑制SDF-1之EC50值分別為2.3nM、12.5nM及28.6nM。
實施例5：抗CXCR4抗體抑制經SDF-1誘發之鈣離子流動
為了決定抗CXCR4人抗體於CEM細胞中抑制經SDF-1誘發之鈣離子流動的能力，CEM細胞首先以螢光染料Calcium 3(Molecular Devices)標記。該抗CXCR4抗體係以1：3連續稀釋倍數稀釋導致自100nM至1pM之濃度範圍，及允許其與200微升中之200,000個CEM細胞結合，及在被加入Flexstation機器(Molecular Devices)之前於室溫下培養10分鐘。使用相同同型之不相關抗體作為陰性對照。細胞接著以終濃度50nM之重組人SDF-1α(Peprotech)刺激，加入500nM體積22微升以使終體積為222微升。測量每個孔槽中所導致之鈣離子流動200秒。作為陽性對照時，細胞在無抗體存在時係以SDF-1α(配製於含0.1% BSA或HBS之漢克氏緩衝鹽水(HBS)中)刺激以達到最大可能之鈣離子流動信號。為了決定基礎值，細胞以含0.1% BSA之HBS刺激。經SDF-1α刺激之鈣離子釋放係由一段時間內鈣依賴性螢光呈色測量。所形成之螢光曲線的曲線下面積被稱為鈣離子流動之指標。由抗CXCR4抗體所導致之抑制鈣離子流動顯示於圖12。資料作成圖表，及利用GraphPad Prism軟體及非線性曲線擬合、S型劑量反應方程計算EC50值。抗體F7、F9及D1抑制經SDF-1α誘發之鈣離子流動。抗體E2雖然確實與CXCR4結合(如實施例3中所示)，其無法顯著抑制經SDF-1α誘發之鈣離子流動。F7、F9及D1抑制經SDF-1 誘發之鈣離子流動的EC50值分別為0.90nM、0.32nM及0.57nM。
實施例6：抗CXCR4抗體抑制CEM細胞經SDF-1誘發之移動
為了決定抗CXCR4人抗體抑制CEM細胞經SDF-1誘發之移動的能力，CEM細胞首先以BATDA試劑(Perkin Elmer)標記。該抗CXCR4抗體係以1：3連續稀釋倍數稀釋導致自100nM至1pM之濃度範圍，及允許其與密度為每毫升1千萬個細胞之經標記之CEM細胞結合。使用相同同型之不相關抗體作為陰性對照。在96槽Neuroprobe移動盤之下層腔室加入每個孔槽30微升之5nM重組人SDF-1α(Peprotech)，每個孔槽具有5.7毫米直徑之過濾膜。每個孔槽包含5μM之孔洞。含抗體及不含抗體之標記CEM細胞以50微升之體積被加在濾膜上，其濃度為每個孔槽50萬個細胞。該移動盤於37℃下培養2.5小時。移動之細胞被捕捉於該盤下層腔室中，經溶解及以Europium偵測溶液(Perkin Elmer)偵測。化學冷光信號於融合儀上紀錄。由抗CXCR4抗體所導致之抑制經SDF-1α誘發之移動係顯示於圖13。該結果證實抗體F7及F9有效地抑制移動，然而抗體D1及E2無法顯著地抑制移動。由F7及F9抑制CEM細胞經SDF-1誘發之移動的EC50值分別為12.44nM及18.99nM。
實施例7：抗CXCR4抗體抑制HuVEC之毛細血管形成
在此實施例中，抗CXCR4人抗體抑制人臍靜脈內皮細胞(HuVEC)之毛細血管形成的能力係經檢測。Matrigel膠經RPMI 1：1稀釋及注入96孔盤之孔槽中，讓其於37℃下聚合30分鐘。長滿80%之HuVEC(來自Cambrex,目錄編號CC-2519)經胰酶消化及以每毫升1×106細胞重懸浮於含0.5% FBS之RPMI中。抗體與HuVEC均勻混合至終濃度3微克/毫升及使其於室溫下培養30分鐘。使用相同同型之不相關抗體或單獨使用培養基作為陰性對照。至於抑制血管形成之陽性對照，則使用鼠抗人αvβ3(CD51/CD61)抗體(R&D Systems，目錄編號MAB3050)。含或不含抗體之HuVEC被加入覆有matrigel之孔槽中及於37℃下培養18小時。
與培養基單獨培養或與同型相符之對照抗體一起培養之HuVEC形成毛細血管，導致盤中分布以每個細胞3-5個連接或分支點之相連細胞外觀。與抗CXCR4人抗體或抗αvβ3抗體一起培養之HuVEC不形成毛細血管。該細胞顯得分離及不含分支點。最有效地阻斷SDF-1結合、經SDF-1誘發之鈣離子流動及經SDF-1誘發之移動的抗CXCR4抗體(也就是F7及F9)也可最有效地抑制毛細血管形成。與CXCR4結合但不阻斷SDF-1結合或經SDF-1誘發效應之抗CXCR4抗體E2不抑制毛細血管形成。
實施例8：抗CXCR4抗體抑制活體外腫瘤細胞增生
在此實施例中，抗CXCR4人抗體於活體外抑制Ramos腫瘤細胞(人伯基特氏(Burkitt’s)淋巴瘤細胞系)增生之能力係經檢測。在此試驗中，1×104細胞/槽與增加劑量(10-3至300nM)之F7 IgG4抗體、F9 IgG1抗體、E2 IgG1抗體、F9 Fab’抗體或同型對照一起培養。這些細胞與抗體一起培養72小時，並在培養的最後24小時加入3H-胸腺嘧啶以監測細胞增生。經培養後，由細胞攝入之3H-胸腺嘧啶係以標準技術測量。結果顯示於圖14之圖表中。該結果顯示F7 IgG4、F9 IgG1及E2 IgG1各個抗體均可抑制Ramos細胞增生，由當與這些抗體一起培養時3H-胸腺嘧啶攝入下降可見，然而F9 Fab’片段不抑制細胞增生。這些結果顯示抗CXCR4人抗體具有活體外直接抗腫瘤細胞增生之效果，因此不需要二次交叉連接以達到抗增生效果。
實施例9：抗CXCR4抗體抑制活體內實體腫瘤細胞增生
在此實施例中，抗CXCR4人抗體於活體內抑制已建立之實體腫瘤增生之能力係使用Ramos皮下腫瘤細胞模型檢測。在此試驗中，10×106 Ramos細胞/鼠被植入各鼠之腹脅區域及允許生長至40mm3之平均大小(以腫瘤之長×寬×高/2計算)。該鼠接著接受腹腔(i.p.)注射第一劑抗體(選定為治療的第0天)及於第7天接受第二劑i.p.抗體。 接受Fab’片段抗體治療之鼠亦於第3及10天接受i.p.抗體注射。鼠之組別(n=8)係以(i)載劑；(ii)同型對照(15毫克/公斤)；(iii)F7 IgG4(15毫克/公斤)；(iv)F9 IgG1(15毫克/公斤)；(v)F9 Fab’(10毫克/公斤)；或(vi)抗CD20陽性對照(15毫克/公斤)治療。在第0天及第30天之間於投藥後之規律間隔(約2-3次/週)測量腫瘤體積及鼠體重。試驗結果顯示於圖15A、15B及15C中，其顯示平均腫瘤體積(圖15A)、中位腫瘤體積(圖15B)及體重變化中位%(圖15C)。該結果顯示如同陽性對照組，F7 IgG4及F9 IgG1抗體顯著抑制以腫瘤體積增加測量之腫瘤細胞生長，然而F9 Fab’片段相較於同型對照組不抑制腫瘤細胞生長。所有治療均耐受良好，如無顯著體重改變所示。治療組間之體重差異最有可能是因為腫瘤重量所致。該結果顯示抗CXCR4人抗體可抑制活體內已建立之實體腫瘤生長。
實施例10：抗CXCR4抗體治療於鼠全身性腫瘤細胞模型中延長存活時間
在此實施例中，抗CXCR4人抗體增加鼠存活時間之能力係利用Ramos全身性腫瘤細胞模型檢測。在此試驗中，1×106 Ramos細胞/鼠於第0天經靜脈(i.v.)注射至各鼠體內。該鼠接著於第1天(也就是靜脈投予腫瘤細胞之後一天)接受腹腔(i.p.)注射第一劑抗體及於第5、8、15及22天接受另外四劑i.p.抗體(以陽性對照抗體治療之鼠僅 於第一天接受治療)。鼠之組別(n=8)係以(i)載劑；(ii)同型對照(15毫克/公斤)；(iii)F9 IgG1(15毫克/公斤)；或(iv)抗CD19陽性對照(15毫克/公斤)治療。存活百分率係於第0天至第50天之間於投藥後以規律間隔(約2-3次/週)測量(後腿麻痹被用來當作該試驗之終點)。試驗結果顯示於圖16中，其顯示一段時間內之存活百分率。以載劑或同型對照治療之鼠的中位存活天數分別為23及25.5天，然而以單一劑之抗CD19陽性對照治療之鼠的中位存活天數為39天。具顯著意義的是，以5劑F9 IgG1抗體治療之組別中100%的鼠存活至試驗終點。這些結果顯示抗CXCR4人抗體可於全身性腫瘤細胞模型中增加鼠之存活時間。
實施例11：抗CXCR4單株抗體F7所誘發之細胞凋亡
在此實施例中，抗CXCR4單株抗體F7誘發不同細胞之細胞凋亡的能力係經檢測。在此細胞凋亡試驗中，10微克/毫升之F7單株抗體係與Ramos細胞(500,000細胞)、Namalwa細胞(500,000細胞)或經轉染以表現CXCR4之R1610細胞(100,000細胞)一起培養。未經轉染之R1610細胞被用來做為陰性對照。抗CXCR4單株抗體F7或同型對照抗體於37℃下與細胞一起培養及在24、48及72小時取出250微升之檢體。要檢測細胞凋亡，來自不同時間點之細胞與經螢光標記之膜聯蛋白V (Annexin V-FITC)(第一螢光(FL1))及碘化丙啶(Propidium Iodide)(第三螢光(FL3))一起培養，然後進行流式細胞分析。在FL1、FL3及FL1-FL3雙陽性象限所收集到之細胞的組合百分比被認為是細胞凋亡。要除去背景，自F7單株抗體所誘發之細胞凋亡細胞百分比減去同型抗體所誘發之細胞凋亡細胞百分比。
結果摘列於下表2：
細胞凋亡總百分比值經同型對照抗體所誘發之基底變化校正。
結果證實F7單株抗體可於Ramos、Namalwa及R1610-CXCR4細胞中誘發細胞凋亡，但F7不具誘發親代R1610細胞細胞凋亡之作用表示該反應為CXCR4專一性。
實施例12：顯示抑制實體腫瘤細胞增生之其他試驗 活體內之抗CXCR4細胞
在此實施例中，抗CXCR4人抗體於活體內抑制已建立之實體腫瘤增生或誘發細胞凋亡之能力係利用類似實施例9中所描述之Ramos模型的其他腫瘤細胞模型檢測。檢測多種腫瘤細胞系。代表性之試驗及結果如下。
在一試驗中，7.5×106個MDA-MB231人乳癌細胞/鼠被植入每隻鼠的腹脅區域及允許生長至100mm3之平均大小(以腫瘤之長×寬×高/2計算)，其為植入後第7天。鼠被隨機分配至不同治療組及於植入後第7天接受腹腔(i.p.)注射第一劑抗體、於植入後第14天接受第二劑i.p.抗體及接著於植入後第46天接受第三劑。鼠之組別(n=9)係以(i)載劑(PBS)；(ii)IgG1同型對照(15毫克/公斤)；(iii)IgG4同型對照(15毫克/公斤)；(iv)F7 IgG1(15毫克/公斤)；或(v)F7 IgG4(15毫克/公斤)治療。在規律間隔測量腫瘤體積及每次間隔測量各治療組之平均及中位腫瘤體積。此試驗之結果摘列於下表3，其顯示植入後第52天之平均腫瘤體積(mm3)及腫瘤生長抑制%(TGI)，及第59天之中位腫瘤體積(mm3)及% TGI：
此外，F7 IgG4治療組中的一隻鼠在第59天無腫瘤。結果證實F7單株抗體可抑制MDA-MB231乳癌細胞於活體內之生長。
在第二個試驗中，5×106個DMS79人小細胞肺癌細胞/鼠被植入每隻鼠的腹脅區域及允許生長至160mm3之平均大小(以腫瘤之長×寬×高/2計算)，其為植入後第7天。鼠被隨機分配至不同治療組及接受Q3Dx5(每三天5次)之投藥計畫的腹腔(i.p.)注射抗體。鼠之組別(n=10)係以(i)載劑(PBS)；(ii)IgG4同型對照(10毫克/公斤)；或(iii)F7 IgG4(10毫克/公斤)治療。在規律間隔測量腫瘤體積及每次間隔測量各治療組之平均及中位腫瘤體積。此試驗之結果摘列於下表4，其顯示植入後第34天之平均及中位腫瘤體積(mm3)及腫瘤生長抑制%(TGI)：
結果證實F7單株抗體可抑制DMS79人小細胞肺癌細胞於活體內之生長。
在類似上述及實施例9中所描述之試驗中，利用其他皮下異種移植腫瘤模型檢測抗CXCR4抗體抑制腫瘤生長之能力。在使用SU-DHL-6 B細胞淋巴瘤之試驗中，結果顯示15毫克/公斤F7 IgG4單株抗體之治療導致約60%腫瘤生長抑制。同樣的，在使用Namalwa伯基特氏淋巴瘤細胞之試驗中，結果顯示3毫克/公斤F7 IgG4單株抗體之治療導致約70%腫瘤生長抑制。相反的，在使用NIH-H226肺癌細胞或HPAC人胰腺癌細胞之試驗中未觀察到F7單株抗體之腫瘤生長抑制。然而，在流式細胞計數試驗中以F7單株抗體染色這些細胞顯示最小化之活體外表現。雖然活體內之腫瘤細胞可利用免疫組織化學以單株抗體染色，並不清楚CXCR4是在腫瘤生長的哪一個階段開始表現。這顯示由這二個細胞系表現CXCR4並不足以允許抗CXCR4治療之活體內腫瘤生長抑制或誘發細胞凋亡。
實施例13：抗CXCR4抗體抑制活體內肺轉移
在此實施例中，F7抗CXCR4單株抗體抑制肺轉移之能力係利用C57鼠全身性腫瘤模型檢測。更具體地說，0.4×106個B16-CXCR4細胞(經轉染以表現人CXCR4之B16細胞)經靜脈注射至30隻C57品系之各鼠體內。鼠經隨機分配至三組各10隻鼠之組別中，接著接受(i)載劑(PBS)；(ii)IgG4同型對照(5毫克/公斤)；或(iii)F7 IgG4(5毫克/公斤)之治療。抗體或載劑係於靜脈注射B16-CXCR4細胞後30分鐘經腹腔注射。在第14天採集肺臟及計算肺轉移結節之數量。結果摘列於下表5，其顯示各組中肺轉移之平均及中位數：
結果顯示F7單株抗體治療導致肺轉移結節平均數下降56%，然而同型對照抗體僅下降15%，表示F7單株抗體可於全身性腫瘤模型中抑制肺轉移。
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Claims (54)

  1. 一種單株抗體，該單株抗體與表現於細胞表面上之人CXCR4專一性結合且包含重鏈變異區和輕鏈變異區，該重鏈變異區包含胺基酸序列，該胺基酸序列與由人VH 3-48種系免疫球蛋白基因編碼之序列SEQ ID NO：49具有至少90%同源性，且該輕鏈變異區包含胺基酸序列，該胺基酸序列與由人Vκ L15種系免疫球蛋白基因編碼之序列SEQ ID NO：50具有至少90%同源性，且該單株抗體進一步包含重鏈變異區CDR3，該重鏈變異區CDR3具有SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列DYGGQPPYYYYYGMDV，其中該單株抗體誘發表現人CXCR4之細胞的細胞凋亡且於活體內抑制CXCR4+腫瘤細胞之生長及/或誘發CXCR4+腫瘤細胞之細胞凋亡。
  2. 如申請專利範圍第1項之單株抗體，其包含：(a)重鏈變異區CDR1，其包含SEQ ID NO：1所示序列之胺基酸或彼之1個保留性胺基酸取代；重鏈變異區CDR2，其包含SEQ ID NO：5所示序列之胺基酸或彼之1個保留性胺基酸取代；重鏈變異區CDR3，其包含SEQ ID NO：9所示序列之胺基酸；輕鏈變異區CDR1，其包含SEQ ID NO：13所示序列之胺基酸或彼之1個保留性胺基酸取代；輕鏈變異區CDR2，其包含SEQ ID NO：17所示序列之胺基酸或彼之1個保留性胺基酸取代；及，輕鏈變異區CDR3，其包含SEQ ID NO：21所示序列之胺基酸或彼之1個保留性胺基酸取代； (b)重鏈變異區CDR1，其包含SEQ ID NO：2所示序列之胺基酸或彼之1個保留性胺基酸取代；重鏈變異區CDR2，其包含SEQ ID NO：6所示序列之胺基酸或彼之1個保留性胺基酸取代；重鏈變異區CDR3，其包含SEQ ID NO：10所示序列之胺基酸；輕鏈變異區CDR1，其包含SEQ ID NO：14所示序列之胺基酸或彼之1個保留性胺基酸取代；輕鏈變異區CDR2，其包含SEQ ID NO：18所示序列之胺基酸或彼之1個保留性胺基酸取代；及，輕鏈變異區CDR3，其包含SEQ ID NO：22所示序列之胺基酸或彼之1個保留性胺基酸取代；或(c)重鏈變異區CDR1，其包含SEQ ID NO：3所示序列之胺基酸或彼之1個保留性胺基酸取代；重鏈變異區CDR2，其包含SEQ ID NO：7所示序列之胺基酸或彼之1個保留性胺基酸取代；重鏈變異區CDR3，其包含SEQ ID NO：11所示序列之胺基酸；輕鏈變異區CDR1，其包含SEQ ID NO：15所示序列之胺基酸或彼之1個保留性胺基酸取代；輕鏈變異區CDR2，其包含SEQ ID NO：19所示序列之胺基酸或彼之1個保留性胺基酸取代；及，輕鏈變異區CDR3，其包含SEQ ID NO：23所示序列之胺基酸或彼之1個保留性胺基酸取代；其中該單株抗體包含至少1個CDR，該至少1個CDR包含1個保留性胺基酸取代，且該單株抗體保留未經修飾之抗體的與抗原決定位結合和功能性質。
  3. 如申請專利範圍第2項之單株抗體，其包含：重 鏈變異區CDR1，其包含SEQ ID NO：1所示序列之胺基酸或彼之1個保留性胺基酸取代；重鏈變異區CDR2，其包含SEQ ID NO：5所示序列之胺基酸或彼之1個保留性胺基酸取代；重鏈變異區CDR3，其包含SEQ ID NO：9所示序列之胺基酸；輕鏈變異區CDR1，其包含SEQ ID NO：13所示序列之胺基酸或彼之1個保留性胺基酸取代；輕鏈變異區CDR2，其包含SEQ ID NO：17所示序列之胺基酸或彼之1個保留性胺基酸取代；及，輕鏈變異區CDR3，其包含SEQ ID NO：21所示序列之胺基酸或彼之1個保留性胺基酸取代。
  4. 如申請專利範圍第2項之單株抗體，其包含：(a)重鏈變異區和輕鏈變異區，該重鏈變異區包含SEQ ID NO：25或41所示序列或與彼具有至少90%同源性的序列之胺基酸，且該輕鏈變異區包含SEQ ID NO：29或45所示序列或與彼具有至少90%同源性的序列之胺基酸；(b)重鏈變異區和輕鏈變異區，該重鏈變異區包含SEQ ID NO：26或42所示序列或與彼具有至少90%同源性的序列之胺基酸，且該輕鏈變異區包含SEQ ID NO：30或46所示序列或與彼具有至少90%同源性的序列之胺基酸；或(c)重鏈變異區和輕鏈變異區，該重鏈變異區包含SEQ ID NO：27或43所示序列或與彼具有至少90%同源性的序列之胺基酸，且該輕鏈變異區包含SEQ ID NO：31或 47所示序列或與彼具有至少90%同源性的序列之胺基酸。
  5. 如申請專利範圍第4項之單株抗體，其包含重鏈變異區和輕鏈變異區，該重鏈變異區包含SEQ ID NO：25所示序列或與彼具有至少90%同源性的序列之胺基酸，且該輕鏈變異區包含SEQ ID NO：29所示序列或與彼具有至少90%同源性的序列之胺基酸。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之單株抗體，其係IgG1或IgG4同型。
  7. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之單株抗體，其抑制SDF-1與人CXCR4結合。
  8. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之單株抗體，其抑制於表現人CXCR4之細胞中經SDF-1誘發之鈣離子流動。
  9. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之單株抗體，其抑制表現人CXCR4之細胞之經SDF-1誘發的移動。
  10. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之單株抗體，其抑制由人臍靜脈內皮細胞之毛細血管形成。
  11. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之單株抗體，其抑制CXCR4+腫瘤細胞轉移。
  12. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之單株抗體，其延長帶有CXCR4+腫瘤之個體的存活時間。
  13. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之單株抗 體，其以50nM或更低之EC50值抑制SDF-1與人CXCR4結合。
  14. 如申請專利範圍第13項之單株抗體，其以3nM或更低之EC50值抑制於表現人CXCR4之細胞中經SDF-1誘發之鈣離子流動。
  15. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之單株抗體，其以50nM或更低之EC50值抑制表現人CXCR4之細胞之經SDF-1誘發的移動。
  16. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之單株抗體，其(a)抑制SDF-1與人CXCR4結合；(b)抑制於表現人CXCR4之細胞中經SDF-1誘發之鈣離子流動；(c)抑制表現人CXCR4之細胞之經SDF-1誘發的移動；及(d)抑制由人臍靜脈內皮細胞之毛細血管形成。
  17. 如申請專利範圍第16項之單株抗體，其以50nM或更低之EC50值抑制SDF-1與人CXCR4結合。
  18. 如申請專利範圍第16項之單株抗體，其以3nM或更低之EC50值抑制於表現人CXCR4之細胞中經SDF-1誘發之鈣離子流動。
  19. 如申請專利範圍第16項之單株抗體，其以50nM或更低之EC50值抑制表現人CXCR4之細胞之經SDF-1誘發的移動。
  20. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之單株抗體，其係嵌合抗體、人化抗體或人抗體。
  21. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之單株抗體，其係全長抗體。
  22. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之單株抗體，其係二價F(ab’)2片段。
  23. 一種組成物，其包含如申請專利範圍第1至22項中任一項之單株抗體及藥學上可接受之載劑。
  24. 一種免疫偶聯物，其包含與治療劑連接之如申請專利範圍第1至22項中任一項之單株抗體。
  25. 如申請專利範圍第24項之免疫偶聯物，其中該治療劑係細胞毒素或放射性同位素。
  26. 一種組成物，其包含如申請專利範圍第24或25項之免疫偶聯物及藥學上可接受之載劑。
  27. 一種雙專一性分子，其包含與第二功能性部分連接之如申請專利範圍第1至22項中任一項之單株抗體，該第二功能性部分具有與該單株抗體不同之結合專一性。
  28. 一種組成物，其包含如申請專利範圍第27項之雙專一性分子及藥學上可接受之載劑。
  29. 一種經分離之核酸，其編碼如申請專利範圍第1至22項中任一項之單株抗體。
  30. 一種表現載體，其包含如申請專利範圍第29項之核酸。
  31. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第30項 之表現載體。
  32. 一種用於製備抗CXCR4抗體之方法，其包含於如申請專利範圍第31項之宿主細胞中表現該抗體及自該宿主細胞分離該抗體。
  33. 一種活體外調節表現CXCR4受體之細胞中CXCR4活性之方法，其包含令該細胞與如申請專利範圍第1至22項中任一項之單株抗體接觸，藉以調節該細胞中CXCR4之活性。
  34. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該細胞係表現CXCR4之腫瘤細胞且該方法導致抑制該腫瘤細胞生長或抑制該腫瘤細胞轉移。
  35. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該細胞係表現CXCR4之T細胞且該方法導致抑制HIV進入該細胞。
  36. 一種如申請專利範圍第1至22項中任一項之單株抗體於製備醫藥組成物之用途，該醫藥組成物係用於調節個體之細胞中CXCR4之活性。
  37. 一種用於調節個體之細胞中CXCR4的活性之醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至22項中任一項之單株抗體。
  38. 如申請專利範圍第37項之醫藥組成物，其係用於刺激CD34+幹細胞自個體之骨髓移動至週邊血液。
  39. 一種如申請專利範圍第1至22項中任一項之單株抗體於製備醫藥組成物之用途，該醫藥組成物係用於抑 制個體之腫瘤細胞的生長或轉移。
  40. 如申請專利範圍第39項之用途，其中該腫瘤細胞選自B細胞白血病、淋巴癌、急性淋巴母細胞白血病、急性骨髓性白血病、小細胞肺腫瘤、非小細胞肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、胰癌、甲狀腺癌、鼻咽癌、黑色素癌、腎細胞癌、神經母細胞瘤、膠質母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、大腸直腸癌、腎癌、骨肉瘤或轉移性肺癌之細胞。
  41. 一種如申請專利範圍第1至22項中任一項之單株抗體於製備醫藥組成物之用途，該醫藥組成物係用於抑制HIV進入個體之T細胞，其中該HIV使用CXCR4作為進入該T細胞之共受體。
  42. 一種如申請專利範圍第1至22項中任一項之單株抗體於製備醫藥組成物之用途，該醫藥組成物係用於抑制罹患發炎性疾病之個體的發炎。
  43. 一種如申請專利範圍第1至22項中任一項之單株抗體於製備醫藥組成物之用途，該醫藥組成物係用於抑制個體之血管新生。
  44. 一種如申請專利範圍第1至22項中任一項之單株抗體於製備醫藥組成物之用途，該醫藥組成物係用於刺激CD34+幹細胞自個體之骨髓移動至週邊血液。
  45. 如申請專利範圍第39或40項之用途，其另包含使用另一治療劑。
  46. 如申請專利範圍第45項之用途，其中該單株抗體包含：重鏈變異區CDR1，其包含SEQ ID NO：1所示序 列之胺基酸；重鏈變異區CDR2，其包含SEQ ID NO：5所示序列之胺基酸；重鏈變異區CDR3，其包含SEQ ID NO：9所示序列之胺基酸；輕鏈變異區CDR1，其包含SEQ ID NO：13所示序列之胺基酸；輕鏈變異區CDR2，其包含SEQ ID NO：17所示序列之胺基酸；及，輕鏈變異區CDR3，其包含SEQ ID NO：21所示序列之胺基酸。
  47. 如申請專利範圍第46項之用途，其中該單株抗體包含重鏈變異區和輕鏈變異區，該重鏈變異區包含SEQ ID NO：25所示序列之胺基酸，且該輕鏈變異區包含SEQ ID NO：29所示序列之胺基酸。
  48. 如申請專利範圍第45項之用途，其中該另一治療劑係與CTLA-4、PD-1或PD-L1結合之抗體。
  49. 如申請專利範圍第45項之用途，其中該癌係胰癌或小細胞肺腫瘤。
  50. 如申請專利範圍第45項之用途，其中該單株抗體與該另一治療劑一起經調製成單一醫藥組成物以供同時施予。
  51. 如申請專利範圍第45項之用途，其中該單株抗體與該另一治療劑係各別經調製，且其中該單株抗體係於該另一治療劑之前施予。
  52. 如申請專利範圍第45項之用途，其中該單株抗體與該另一治療劑係各別經調製，且其中該單株抗體係於該另一治療劑之後施予。
  53. 如申請專利範圍第45項之用途，其中該單株抗 體與該另一治療劑係各別經調製，且其中該單株抗體與該另一治療劑係同時施予。
  54. 如申請專利範圍第39或40項之用途，其另包含使用與PD-1結合之抗體，其中該腫瘤細胞係胰癌細胞。
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