RS54926B1 - Derivati sterola, metodi njihovog pripremanja, farmaceutske smeše koje ih sadrže, i njihova upotreba u lečenju multiplih glioblastoma - Google Patents

Abstract

Jedinjenje formule (I)naznačeno time, što- A je-(R1)n- grupa u kojoj je R1 aminokiselinska rezidua vezana svojim C-terminalnim krajem i n = 1 do 3, svaki R1 je identičan ili različit, gde je N-terminalni kraj pomenute amino-kiseline nesupstituisan ili supstituisan sa -C-(O)-R2 grupom u kojoj je R2 mono-ili policiklična C6-C14 arilalkil grupa; mono- ili policiklična C5-C14 heteroarilalkil grupa koja može sadržati jedan ili više heteroatoma, koji mogu biti identični ili različiti; mono- ili policiklična C6-C14 arilalkiloksi grupa ili mono- ili policiklična C5-C14 heteroarilalkiloksi grupa koja može sadržati jedan ili više heteroatoma koji mogu biti identični ili različiti,-C(O)-NH-R3 ili -C(S)-NH-R3 grupa u kojoj je R3 vodonik; C1-C12 alkil grupa, linearna ili granata. nesupstituisana ili supstituisana grupom koja se bira između OR, NRR', NHR i SR, gde su R i R', nezavisno, vodonik, linearni C1-C12 alkil ili nesupstituisani aril; aril grupa, nesupstituisana ili supstituisana grupom koja se bira između OR, NRR', NHR i SR kako je definisano gore; acil grupa; formil grupa; sulfonil grupa; sulfinil grupa, silil grupa, nesupstituisana ili supstituisana mono- ili policikličnom C6-C14 aril grupom, nesupstituisanom ili supstituisanom najmanje jednim linearnim ili granatim C1-C6 alkilom; alil grupa; šećerna rezidua; -C(O)-OR4 grupa u kojoj je R4 linearni ili granati C1-C12 alkil, nesupstituisan ili supstituisan grupom koja se bira između OR, NRR", NHR i SR, kako je definisano gore; amidna grupa; tioamidna grupa; sulfonamidna grupa.-C(O)-R5 grupa u kojoj je R5 zasićeni C5-C14 heterocikl koji uključuje 1 ili 2 heteroatoma, nesupstituisan ili supstituisan najmanje jednim linearnim ili granatim C1-C6 alkilom ili grupom koja se bira između OR, NRR', NHR i SR, kako je definisano gore, gde su R i R', nezavisno, vodonik, C1-C12 alkil ili nesupstituisani aril.- B je -C(O)-R6 grupa gde je R6 vodonik; C1-C12, poželjno C1-C6, alkil, linearni ili granati, nesupstituisan ili supstituisan grupom koja se bira između OR, NRR', NHR i SR, kako je definisano gore; aril grupa, nesupstituisana ili supstituisana grupom koja se bira između OR, NRR', NHR i SR, kako je definisano gore; ili R6 predstavlja OR7, gde je R7 linearni ili granati C1-C12, poželjno C1-C6, alkil.Prijava sadrži još 15 patentnih zahteva.

Description

Pronalazak se odnosi na nove derivate sterola, metode njihove pripreme, farmaceutske smeše koje ih sadrže, i njihovu upotrebu u lečenju bolesti vezanih za astrocitne ćelije transformisane u ćelije kancera, i posebno lečenju multiformnog glioblastoma.

Transformacija ćelija predstavlja prelazak normalne eukariotske ćelije u imortalizovanu i/ili kancersku eukariotsku ćeliju. Izrazi "transformisana ćelija" ili "kancerska ćelija" koristiće se kasnije u ovom tekstu kao sinonimi.

Multiformni glioblastom (glioblastoma multiforme, GBM), poznat i kao glioblastom IV stadijuma, moždani je tumor koji se karakteriše transformacijom astrocitnih ćelija u kancerske ćelije.

Uprkos značajnim naučnim i terapijskim dostignućima u oblasti onkologije. GBM je i dalje neizlečivi kancer. U najboljem slučaju, istraživači i lekari su zadovoljni kada prosečan život pacijenata može da se produži za nekoliko meseci, najviše petnaest meseci.

Jedan od problema u lečenju GBM je povratak bolesti prouzrokovan matičnim ćelijama. U stvari, čak i kada postojeće terapije uspešno iskorene veći deo tumora, matične ćelije često dovode do razvoja novog tumora (1, 2).

Trenutno postojeće terapije uvek sc sastoje od resekcije tumora, ako njegova lokacija to dopušta, za čime sledi radioterapija i/ili hemoterapija. kako je pogodno. U hemoterapiji, jedan od vodećih tretmana je dvojna terapija koja se sastoji od primene avastina (inhibicija vezivanja VEGF za receptore) i irinotekana (inhibitor topoizomeraze I). Trojna terapija PCV tipa, koja predstavlja kombinaciju prokarbazina (DNK-alkilirajuće sredstvo), lomustina (CCNU: nespecifično alkilirajuće sredstvo) i vinkristina (inhibicija polimerizacije mikrotubula), trenutno je veoma sporna. Temozolomid, guanin-al kili raj uće sredstvo, u kombinaciji sa radioterapijom. produžava prosečno preživljavanje, naročito u slučaju pacijenata sa hipermetilisanom DNK. U toku su klinička ispitivanja (faza III), testiranja cilengitida (inhibicija nekih integrinskih receptora) i talampanela (blokiranje glutamatnih kanala AMPA tipa).

Postoje dva tipa imunoterapijskih studija i kliničkih ispitivanja:

- adaptivna imunoterapija, u kojoj sein vi troaktivirane ćelije injektiraju u pacijenta, na primer. ćelije-ubice aktivirane limfokinima (lymphokine-activated killer cells, LAK; faza II kliničkih ispitivanja) ili citotoksični T-limfociti (cytotoxic T !yrnphocytes, CTL; faza 1 kliničkih ispitivanja) injektiraju se intrakranijalno. Danas, posmatranja pokazuju veoma retko preživljavanje od 20 meseci. - aktivna imunoterapija, koja se sastoji od upotrebe vakcina (faza 1) i dendritskih ćelija (faza II). Ovo nije pokazalo značajno produženje preživljavanja pacijenata. Izučavanja su obustavljena.

Genska terapija, koja se sastoji od upotrebe adenovirusa, retrovirusa ili virusa malih boginja kao vektora molekula sa antikancerskim potencijalom, produžava preživljavanje samo 6 do 11 meseci. Ćelijska terapija kojom se predlaže upotreba neuronskih matičnih ćelija kao transportera medicinskih proizvoda u GBM još uvek je u demonstracionoj fazi osnovnog ispitivanja.

Pristup koji je bio donekle zanemarivan poslednjih decenija, a koji se ponovo uzima u obzir, sastoji se od delovanja na nivou glikolize i oksidativne fosfori I acije. Kancerske ćelije u povećanoj meri konzumiraju glukoze jer teže da modifikuju svoj metabolizam u pravcu anaerobnog metabolizma. Čak i kada snabdevanje kiseonikom ne predstavlja ograničavajući faktor. Ovaj fenomen, koji je prvi zapazio Warburg (3), javlja se usled preterane ekspresije HIF (hypoxia induced factor, hipoksijom indukovani faktor) i Myc proonkogena. HIF povećava konverziju piruvata u laktat. anaerobno. inaktiviranjem piruvat-dehidrogenaze koja je ključni enzim aerobne respiracije. Myc stimuliše biosintezu glutamina uključenog u anaerobnu respiraciju (4).

U tom kontekstu, u toku su klinička ispitivanja kojima se delujc na energetski metabolizam, kao primeri, mogu se pomenuti (4): - metformin: inhibitor mitohondrijalnog respiratornog kompleksa I, čime se indukujc AMPK koja usporava proliferaciju ćelija; - foretin: sredstvo za smanjenje importa glukoze; - fenilacetat: sredstvo za smanjenje nivoa glutamina;

- dihloroacetat: inhibitor piruvat-dehidrogenaze.

Svi ovi molekuli, izuzev dihloroacetata. su testirani (faza II kliničkih ispitivanja), a zapažanja još uvek nisu poznata.

Sada jc nađeno da derivati sterola koji ciljaju specifičan aspekt energetskog metabolizma astrocita. tipa ćelija koji jc u osnovi porekla GBM, mogu da se koriste za lecenje multiformnog glioblastoma.

Originalni aspekt pronalaska predstavlja korišćenje posebnog energetskog metabolizma astrocitnih ćelija (glijskog porekla) čija transformacija na kraju dovodi do formiranja GBM.

U stvari, astrocitne ćelije se istovremeno snabdevaju energijom u vidu ATP. korišćenjem oksidativne fosforilacije (Krebs-ov ciklus kuplovan sa transportom elektrona u mitohondrijama) i glikolize: u ovom drugom slučaju, piruvat ne ulazi u K.rebs-ov ciklus nego se redukuje u laktat pomoću laktat-dehidrogenaznog (lactate dehvdrogenase, LDH) enzima tipa 5. Pored toga što se njome snabdevaju ATP. astrociti koriste glikolizu, preko proizvodnje laktata, za snabdevanje susednih ćelija, neurona, neurotransmiterom (glutamat).

U sledećoj tabeli, energetski metabolizam astrocita. normalnih i kancerskih, upoređenje šematski sa metabolizmom drugih ćelija:

Energetski metabolizam astrocita je poseban: u stvari, respiracija u mitohondrijama i glikoliza funkcionišu usklađeno.

Ovaj specifični metabolički dualizam normalne astrocitne ćelije, mitohondrijalna respiracija sa jedne strane i glikoliza sa druge, ono je što čini osnovu strategije za pripremanje sterolnih derivata prema pronalasku.

U stvari, pronalazači iznose radnu hipotezu prema kojoj derivati sterola prema pronalasku, mogu preusmeriti energetski metabolizam kancerskih astrocitnih ćelija sa glikolize ka mitohondrijalnoj respiraciji. sto je postupak koji bi doveo do njihove smrti.

7P-hidroksiholesterol (7p-hydroxycholestcrol, 7p-OHCH), molekul sa visokim antikancerskim potencijalom (5,6), upadljivo je citotoksičan za imortalizovane (spontano transformisanc) linije astrocita pacova (7.8) i GBM {pacovska C6 linija)"/>? vitro"(9). Studije pokazuju da je esterifikacija 7J3-OHCH na C3-OH unutarćelijskim masnim kiselinama (formiranje 7<p->OHCH-C3-estra) snažno uključena u toksični efekat roditeljskog molekula, 7p-OHCH (7, 8, 10).

Međutim, mehanizam delovanja 7<p->OHCH, bilo da je esterifikovan na C3-OH ili ne, na GBM" in vitm"daleko je od toga da bude objašnjen. Nedavno, studije sprovedene na C6 linijama pokazale su da 7f3-OHCH mođuliše arhitekturu i dinamiku raftova, mikrodomena u ćelijskoj membrani, koji su mesta inicijacije određenih ćelijskih signala uključujući signale preko protein-kinaze Akt, enzima ključnog za energetski metabolizam ćelije (11). U stvari, narušavanjem arhitekture raftova. oksisterol posledično utiče na aktivnost Akt, posebno tokom transformacije normalnih ćelija u kancerske ćelije: u ovim ćelijama Akt reguliše usvajanje glukoze i glikolitičku aktivnost.

Neočekivano, nađeno je da derivati sterola prema pronalasku, koji imaju 7-beta-hidroksiholesterolsku osnovnu strukturu i nose supstituente na poziciji 3 i protektivne grupe na poziciji 7, istovremeno omogućavaju inhibiciju glikolize, esencijalnu za snabdevanje kancerskog astrocita visokog stadijuma energijom i, u isto vreme, obnavljaju respiraciju u mitohondrijama. stoje takođe "letalno" za ovu ćeliju.

U stvari, ovo dvojno delovanjc dovodi do "prekomernog zagrevanja" kancerske ćelije, dovodeći i do njene smrti.

Pored toga, moguće je pokazati da derivati sterola prema pronalasku, deluju i na matične ćelije, čime omogućavaju potpunu destrukciju ćelija glioblastoma.

Pronalazak se stoga odnosi na jedinjenja formule (I)

gdc

- A je

-(Ri)„- grupa u kojoj je R| aminokiselinska rezidua vezana svojim C-terminalnim krajem i n = 1 do 3, svaki R| je identičan ili različit, gde N-terminalni kraj pomenute amino-kiselinc može biti supstiluisan -C-{0)-R;> grupom u kojoj je Rimono-ili policiklična Cft-C 14 aralkil grupa; mono- ili policiklična C5-C14heteroaralkil grupa koja može sadržati jedan ili više heteroatoma. koji mogu biti identični ili različiti; mono- ili policiklična CVC14aralkiloksi grupa ili mono- ili policiklična CVC14hcteroaralkiloksi grupa koja može sadržati jedan ili više heteroatoma koji mogu biti identični ili različiti, -C(0)-NH-R3ili -C(S)-NH-R3grupa u kojoj je R3vodonik; CrC12alkil grupa, linearna ili granata, nesupstituisana ili supstituisana grupom koja se bira između OR. NRR<*>. NHR i SR. gde su R i R". nezavisno, vodonik. linearni alkil u C1-C12ili nesupstituisani aril; aril grupa, nesupstituisana ili supstituisana grupom koja se bira između OR. NRR", NHR i SR kako je definisano gore; acil grupa; formil grupa; sultinil grupa, silil grupa, nesupstituisana ili supstituisana mono- ili policikličnom aril grupom u Cft-C 14, nesupstituisanom ili supstituisanom najmanje jednim linearnim ili granatim C|-Cf, alkilom; alil grupa; šećerna rezidua; -C{0)-OR4grupa u kojoj je R4CrC 12 alkil, linearni ili granati, nesupstituisan ili supstituisan grupom koja se bira između OR, NRR", NHR i SR, kako je definisano gore; amidna grupa; tioamidna grupa; sulfonamiđna grupa, -C(0)-R5grupa u kojoj je R5zasićeni C?-C|4heterocikl koji uključuje 1 ili 2 heteroatoma, nesupstituisan ili supstituisan najmanje jednim linearnim ili granatim Ci-Cftalkilom ili grupom koja se bira između OR. NRR<*>. NHR i SR, kako je definisano gore, gde su R i R\ nezavisno, vodonik, alkil u C|-C|2ili nesupstituisani aril. - B je -C(0)-Rf, grupa u kojoj je R(, vodonik: C|-CtT. poželjno C|-C(„ alkil. linearni ili granati, nesupstituisan ili supstituisan grupom koja se bira između OR. NRR". NHR i SR. kako je definisano gore; aril grupa, nesupstituisana ili supstituisana grupom koja se bira između OR. NRR'. NHR i SR; ili Rfl je OR7. gde je R7 linearni ili granati, Cj-Ci?. poželjno C<1>-C0. alkil.

Alkil grupa označava linearnu ili granatu C1 -C12 grupu, npr., metil, etil. propil, izopropil, butil, izobutil, sec-butil, tert-butil. pentil, izopentil, sec-pentil, tert-pentil, neo-pentil. heksil, izoheksil, sec-heksil, tert-heksil, heptil, oktil, nonil, đecil, undecil ili dodecil grupu, s tim što su prelerentne linearne ili granate C|-C<, alkil grupe.

Aril grupa označava nezasićenu monocikličnu ili policikličnu. karbocikličnu. C6-C|4grupu, npr., fenil, naftil, indenil, antracenil grupu i posebno, fenil grupu.

Pod "heteroatomom" podrazumeva se atom kiseonika, azota ili sumpora.

Pod "šećernom reziduom" podrazumeva se. na primer, jedinica glukoznog, riboznog ili arabinoznog tipa.

Pogodne aminokiselinske reziduc su, na primer, metionil, glicinil ili alanil jedinice.

Poželjna jedinjenja formule (I) su ona u kojima je ispunjen bar jedan od sledećih uslova: - A je -{Ri)n- grupa u kojoj je R| aminokiselinska rezidua i n = 2; - A je -(Ri)n- grupa u kojoj je Riaminokiselinska rezidua, n = 2 i N-terminalni kraj pomenute amino-kiseline je supstituisan arilalkoksikarbonil grupom, posebno benziloksikarbonil grupom; - A je alanil radikal povezan sa glicinil radikalom, opciono supstituisan na N-terminalnom kraju arilalkoksikarbonil grupom, posebno benziloksikrbonil grupom; - A je metionil radikal povezan sa glicinil radikalom, opciono supstituisan na N-terminalnom kraju arilalkoksikarbonil grupom, posebno benziloksikarbonil grupom;

- A je-C(0)-R_<; grupa u kojoj je R? 2,2-dimetil-l,3-dioksolan grupa.

Pogodno, B je acil grupa u kojoj je alkil grupa C|-Cf„ posebno acetil ili alkoksikarbonil grupa u kojoj je alkil grupa C|-C(„ posebno/c/V-butoksikarbonil grupa.

Poželjna jedinjenja formule (1) su sledeća:

- 7-{(^/-?-butoksikarbonil)oksii)-l0,13-dimetil-l 7-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4.7,8, 9,10,11.12,13,14,15,16,17-tetradckahidro-1 f/-ciklopenta[a]fenantrcn-3-il 2-{2-(((benziloksi)karbonii)amino)-acctamido)propanoat (molekul l.a); - 7-acetoksi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9.10,11.12.13.14,15, 16,1 7-tetrađckahidro-1 H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2-{2-(((benziloksi)karbonil)amino) -acetamido)propanoat (molekul 1 .b); - 7-((tert-butoksikarbonil)oksi)-10.13-dimetil-17-(6-metilhep(an-2-il)-2,3,4.7,8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2.2-dimctil-1, 3-dioksolan-4-karboksilat {molekul 2.a); - 7-acetoksi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9.10.11.12,13,14,15, 16,17-tetradekahidro-1 H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2.2-dimetiI-1,3-dioksolan-4-karbo-ksilat (molekul 2.b).

Jedinjenja formule (I) mogu da se dobiju iz holesterola metodom koji uključuje sledeće korake: - protektovanje hidroksilne funkcije na poziciji 3 holesterola protektivnom grupom kao stoje, na primer. arilalkoksikarbonil grupa,

- uvođenje ketonske funkcije na poziciji 7,

- redukcija ketonske funkcije u hidroksilnu funkciju,

- uvođenje protektivne grupe na hidroksilnoj funkciji na poziciji 7, koja odgovara B grupi, kao sto je na primer. acil ili alkoksikarbonil grupa,

- deprotektovanje hidroksilne funkcije na poziciji 3.

Posle deprotektovanja hidroksilne funkcije na poziciji 3, pomenuta hidroksilna funkcija može biti supstituisana željenom A grupom.

Pronalazak se takođe odnosi na farmaceutske smeše ili medicinske proizvode koji sadrže najmanje jedno jedinjenje formule (I) i farmaceutski prihvatljivi prenosnik.

Farmaceutska smeša prema pronalasku može da se sastoji od lipozomskog preparata koji sadrži najmanje jedno jedinjenje formule (I). Lipozomi mogu da se proizvedu različitim tehnikama koje su poznate stručnjaku u oblasti. Mogu se koristiti različiti lipidi koji čine lipozoine [Medical Application of Liposomes (1986) edited by Kunio Vagi, Japan Scientific Societies Press, Tokyo, Karger].

Poželjni medicinski proizvodi pronalaska sastoje se od lipozoma koji nose najmanje jedno jedinjenje formule (I).

Poželjno, jedinjenje/jedninjenja formule (1) čini/čine jedini aktivni sastojak/sastojke farmaceutske smeše prema pronalasku, posebno kada je pomenuta farmaceutska smeša lipozom.

Alternativno, jedinjenje formule (1) može da se koristi u kombinaciji sa drugim aktivnim sastojkom, kao što je na primer antikancersko sredstvo, posebno derivati avastina, irinotekana, temozolomida ili taksola.

Farmaceutske smeše prema pronalasku opisane ranije u ovom tekstu mogu biti u bilo kojoj formi pogodnoj za oralnu primenu ili za parenteralnu primenu, posebno injekcijom, infuzijom ili inhalacijom, što je poznato stručnjaku u oblasti.

Posebno, pomenuta farmaceutska smeša može da bude farmaceutski prihvatljivi rastvor, posebno alkoholni rastvor, najmanje jednog jedinjenja formule (I), samog ili u kombinaciji sa drugim aktivnim sastojkom, koji pacijentu može da se daje transfuzijom ili infuzijom.

Jedinjenja formule (I), za upotrebu u lečenju bolesti u koje su uključene transformisane astrocitne ćelije, posebno u lečenju multiformnog glioblastoma (GBM). takođe su predmet pronalaska. Posebno, jedinjenja formule (1) mogu da se injektiraju direktno u cerebralni korteks, na mesto tretmana.

Pronalazak se takođe odnosi na lečenje bolesti u koje su uključene transformisane astrocitne ćelije, posebno lečenje multiformnog glioblastoma (GBM), primenom efikasne količine bar jednog jedinjenja formule (I).

Alternativno, pomenuti tretman je sekvencijalni tretman koji uključuje najmanje jedan korak primene prvog jedinjenja formule (I) i najmanje jedan korak primene drugog jedinjenja formule (I), različitog od prvog.

Sledeći primeri ilustruju pronalazak, ali ga ne ograničavaju.

Odeljak I razmatra hemijsku sintezu.

Primeri 1 i 2 razmatraju pripremu intermedijara sinteze, koji se koriste za pripremanje jedinjenja formule (I). Primeri 3 do 6 razmatraju pripremu jedinjenja formule (I).

Odeljak II razmatra biološku aktivnost jedinjenja formule (I).

1/Hemijska sinteza

Primer 1: Pripremanje 7- beta- acetilholcsterola ( jedinjenje 1. 4)

Dijagram reakcije prikazanje na Slici 1.

1) Pripremanje jedinjenja 1.1

Korišćeni su sledeći reagensi:

Holesteril-benzoat. mešavina dioksan/voda. natrijum-hlorit i N-hidroksiftalimid stave se tim redom u 1-litarski trogrli flakon opremljen kondenzorom. Mešavina se zagreva na 50°C, 6 h. Tok reakcije prati se TLC na silicijumskoj ploči (TLC silika gel 60 F254, Merck) u heksanu/EbO 8/2.

Kada stopa formiranja dostigne prihvatljivu vrednost. sirova rcakciona mešavina se ulije u 10% rastvor natrijum-sulfita (500 ml), a zatim ekstrahuje etrom. Dobijena organska faza se ispere zasićenim rastvorom natrijum-hidrogenkarbonata, zatim vodom i na kraju zasićenim slanim rastvorom. Ova organska faza se onda suši preko natrijum-sulfata. filtrira i potom evaporiše pod sniženim pritiskom.

Dobijena obojena uljasta rezidua se zatim prečisti rekristalizacijom u etanolu. Kako dobijena bela čvrsta supstanca nije zadovoljavajuće čistoće, ponovo se prečišćava hromatografijom na silika gelu {silika SDS 60A, 35-70[ im).Čvrsti talog se dobija preuzimanjem ovog ulja u dihlorometan. Prečišćavanje se obavlja protokom eluenta heksan/etil-acetata od 98/2 do 90/10. Proizvod se dobija u vidu bele čvrste supstance.

Prinos:23%

Analize:Analiza pomoću 'li NMR u CDCI3. BRUKER 400 MHz. HPLC kolona norma!no-fazna CHIRALCEL O-DH (ODH0CE-CE026 kolona), eluent 9/1 hcksan/iProH, 20 min, talasna dužina 190 nm.

Vreme retencije 6.682 min, HPLC čistoća 99.2%.

'H NMR (CDCI,, 400.13 MHz):6 0.71 (s, 3H, CH3), 0.89 (dd, 6H, 2CH3), 0.94 (d, 3H, CH3), 1.02-2.78 (m, 26H), 1.27 (s. 3H, CH3), 4.99 {m, IH, CH), 5.76 (d. IH, CH), 7.44-8.05 (m, 5H, CHAr).

2) Pripremanje jedinjenja 1.2

Korišćeni su sledeći reagensi:

Ketoholesteril-benzoat, mešavina rastvarača THF/MeOH i hidratisani cerijum-hlorid stave se u 500 ml-ski flakon. Sirova reakciona mešavina se zatim ohladi na 0°C u ledenom kupatilu, pre nego što joj se polako doda natrijum-borohidrid. Zapaža se emitovanje gasa, ledeno kupatilo se održava 1 h, zatim se vrši mešanje na temperaturi okoline, 18 h. Tok reakcije se prati pomoću TLC (TLC silika gel 60 F254, Merck) u eluentu 80/20 hcksan/EtOAc. Ako je stopa formiranja nedovoljna, doda se 0.5 ekv. natrij um-borohidrida.

Sirovoj reakcionoj mešavint doda se 50 ml vode i 200 ml dihlorometana. Posle prebacivanja u separacioni levak, izdvoji se organska faza. Vodena faza se ponovo ekstrahuje sa DCM. Organske faze se kombinuju, isperu 1 N rastvorom hlorovodonične kiseline i zatim zasićenim rastvorom NaCl.

Organska faza se zatim suši preko natrijuma-sulfata. filtrira i cvaporiše pod sniženim pritiskom, dajući blago obojeno ulje. koje spontano podleže kristalizaciji.

Čvrsti talog se dobija preuzimanjem rezidue u DCM. Ovaj sirovi proizvod se prečisti na koloni od silika gela (silika SDS 60A. 35-70 um) u eluentu 9/1 heksan/EtOAc. Proizvod se dobija u vidu bele čvrste supstance.

Prinos:89%

Analiza:Analiza pomoću 'H NMR u CDClj, BRUKER 400 MHz. HPLC kolona normalno-fazna CHIRALCEL O-DH (ODH0CE-CE026 kolona), eluent 9/1 heksan/iProH, 20 min, talasna dužina 190 nm.

Vreme retencije 7.076 min, HPLC čistoća 98.8%.

'H NMR (CDC13, 400.13 MHz):6 0.63 (s. 3H, CH3), 0.79 (dd, 6H, 2CH3), 0.85 (d, 3H, CH3), 0.89-2.43 (m, 27H), 1.04 (s. 3H. CH3), 3.81 (d, IH, CH). 4.81 (m, IH, CH), 5.29 (d, IH, CH), 7.34-7.99 (m, 5H, CHAr).

3) Pripremanje jedinjenja 1.3

Korišćeni su sledeći reagensi:

7-P-hidroksiholesteril-benzoat, piridin, i zatim sirćctni anhidrid stave se u 100 ml-ski flakon. Mešavina se meša na temperaturi okoline,16 h. Tok reakcije se prati pomoću TLC (TLC silika gel 60 F254, Merck) u eluentu 9/1 heksan/EtOAc.

Sirova reakciona mešavina evaporiše pod sniženim pritiskom. Obave se dve koevaporacije sa etiLacetatom. Dobijena rezidua se preuzme u etil-acetat. Tako dobijena organska faza se ispere 1 N hlorovodoničnom kiselinom, suši preko natrijum-sulfata i zatim evaporiše pod sniženim pritiskom.

Dobijena bela čvrsta supstanca uvodi se u sledeći korak direktno, bez dodatnog prečišćavanja.

Prinos: 100%

Analiza: Analiza pomoću 'H NMR u CDC13, BRUKER 400 MHz. HPLC kolona normalno-fazna CHIRALCEL O-DH (ODH0CE-CE026 kolona), eluent 9/1 hcksan/iProH, 20 min. talasna dužina 190 nm.

Vrcme retencije 4.972 min, HPLC čistoća 99.6%.

'HNMR (CDCb, 400.13 MHz): 6 0.63 (s, 3H, CH3), 0.79 (dd, 6H, 2CH3), 0.84 (d, 3H, CH3), 0.91-2.41 (m, 26H), 1.06 (s. 3H, CH3), 1.95 (s, 3H, CH3acetil), 4.78 (m, IH, CH), 4.99 (d, IH, CH), 5.21 (s, IH, CH), 7.33-7.98 (m, 5H, CHAr).

4) Pripremanje jedinjenja 1.4

Korišćeni su sledeći reagensi:

7-p-acetilholesteril-benzoat i 1% rastvor natrijuma u metanolu stave se u 100 i flakon. Mešavina se meša na temperaturi okoline do potpunog rastvaranja. Tok ije se prati pomoću TLC (TLC silika gel 60 F254. Merck) u eluentu 7/3 n/EtOAc.

Da bi se reakcija okončala, sirova mešavina može da se zagreje na 40°C. u tom iu praćenje pomoću TLC vrši se svakih 20 minuta.

Doda se 200 ml etil-acetata i 50 ml vode. što je praćeno prenošenjem u acioni levak i separacijom faza. Vodena faza se još jednom ekstrahuje etil-om. Organske faze se kombinuju. suše preko natrijum-sulfata, filtriraju i zatim irisu pod sniženim pritiskom dajući uljastu reziduu.

Rezidua se preuzme u etil-acetat da bi se pripremio čvrsti talog. Prečišćavanje se ja na koloni od silika gela (silika SDS 60A, 35-70 um) u eluentu heksan/EtOAc, irotiče od 9/1 to 7/3. Očekivani proizvod se dobija u vidu bezbojnog ulja koje se lizuje spontano, dajući belu čvrstu supstancu. Kolona se spira 100% etil-acetatom se izdvojio formirani 7-|3-hidroksiholesterol.

Prinos:38%

Analiza:Analiza pomoću 'H NMR u CDCL, BRUKER 400 MHz. HPLC a normalno-fazna CHIRALCEL O-DH (ODH0CE-CE026 kolona), eluent 9/1 n/iProH, 20 min. talasna dužina 190nm.

Vremc retencijc 6.186 min, HPLC čistoća 91.7%.

'HNMR (CDCI3, 400.13 MHz):60.62 (s, 3H. CH.-,), 0.78 (dd, 6H, 2CH3), 0.85 (d, 3H, CH3), 0.86-2.28 (m, 27H). 1.03 (s. 3H. CH?). 1.96 (s. 3H, CH?acetil), 3.47 (m, IH, CH),4.94(td, IH, CH), 5.13 (t, 1H,CH).

Primer 2: Pripremanje 7- beta- tert- butiloksikarbonilholesterola ( jedinjenje 1. 6)

Dijagram reakcije prikazanje na Slici 2.

Jedinjenje 1.6 priprema se od jedinjenja 1.2 iz Primera 1.

1) Pripremanje jedinjenja 1.5

Korišćeni su sledeći reagensi:

7-|3-hidroksiholesteriI-benzoat. rastvarač, 2,6-dimetilaminopiridin i zatim tert-butiloksikarbonilni anhidrid stave se u lOOml-ski jednogrli flakon. Mešavina se meša na tempeaturi okoline do potpunog rastvaranja. Tok reakcije prati se pomoću TLC u eluentu 8/2 heksan/EtOAc.

Doda se 50 ml EtOAc i 10 ml vode. Tako dobijena organska faza suši se preko natrij um-sulfata, filtrira i zatim evaporiše pod sniženim pritiskom dajući uljastu reziduu.

Rezidua se preuzme u EtOAc da hi se pripremio čvrsti talog. Prečišćavanje se obavlja na koloni od silika gela u eluentu 95/5 heksan/EtOAc.

Analiza: Analiza pomoću 'H NMR u CDC13.

'HNMR (CDClj, 400.13 MHz): 6 0.59 {s. 3H, CH?), 0.77 (dd, 6H, 2CH3), 0.84 (d, 3H, CH3), 0.86-1.98 (m. 24H). 1.09 (s, 3H, CH3), 1.41 (s, 9H, 3CH3, t-Boc), 2.42 (m. 2H, CH2),4.80(m, IH, CH), 4.91 (d. IH, CH). 5.18 (s, IH, CH), 7.34-7.97 (m, 5H. CHAr).

2) Pripremanje jedinjenja 1.6

Korišćeni su sledeći reagensi:

7-<p->t-butiloksikarbonilholesteril-benzoat i 1% rastvor natrijuma u metanolu stave se u 50 ml-ski jednogrli flakon. Ova mešavina se meša na temperaturi okoline do potpunog rastvaranja. Tok reakcije se prati pomoću TLC u eluentu 7/3 heksan/EtOAc. Da bi se kompletirala reakcija, sirova mešavina se zagreva do 40°C.

Doda se 100 EtOAc i 20 ml vode. Vodena faza se ponovo ekstrahuje pomoću EtOAc. Organske faze se kombinuju. suše preko natrijum-sulfata, filtriraju i zatim evaporišu pod sniženim pritiskom dajući uljastu reziduu.

Rezidua se preuzme u EtOAc da bi se pripremio čvrsti talog. Prečišćavanje se odvija na koloni od silika gela u eluentu heksan/EtOAc koji protiče od 9/1 do 7/3. Kolona se ispira sa 100% EtOAc da bi se izdvojio formirani 7-fi-hidroksiholesterol.

Analiza: Analiza pomoću 'H NMR u CDCl.i.

'HNMR (CDCb, 400.13 MHz): 8 0.60 {s, 3H. CH,). 0.78 (dd. 6H, 2CHj), 0.84 (d, 3H, CH3), 0.91-2.29 (m, 27H), 0.97 (s. 3H. CH3), 1.41 {s, 9H, 3CH3, t-Boc), 3.47 (m, 1H, CHB), 4.77 (td, 1H, CHC), 5.17 (t, 1H, CHA).

Primer 3: Pripremanje 7-(( ftT/- butoksikarbonil) oksil)- 10. 13- dimetil- l 7-( 6-

metillieptan- 2- in- 2. 3. 4, 7, 8, 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17- tetradekahidro- 1 //- ciklopentalal

fcnantren- 3- il 2-( 2-((( benziloksi) karbonil) amino) acetamido) propanoata ( molekul l. a)

Pojednostavljeno ime: 3-benziloksikarbonil-glicinil-alanil-7-[3-0-tert-butiloksi-karbonil-holesterol

Molekul l.a priprema se od intermeđijarnog jedinjenja 1.6. Koriste se sledeći reagensi: 80 mg (0.16mmol) 7-(3-t-butiloksikarbonilholesterola, 68 mg (0.24 mmol, 1.5 ekv.) dipcptida. 6 ml mešavine rastvarača (THF/DCE 1:1), 50 mg (0.24 mmol. 1.5 ekv.) DCC i 30 mg (0.24 mmol. 1.5 ekv.) DMAP stave se u 10 ml-sku Wheaton-ovu bocu. Sirova rcakciona mešavina mesa se 24 h na temperaturi okoline. Tok reakcije se prati pomoću TLC u eluentu 7/3 heksan/etil-acetat.

U sirovi proizvod reakcije doda se 30 ml etil-acetata i 10 ml vode. Organska faza se izdvoji, suši preko natrijum-sulfata. filtrira i zatim evaporiše pod sniženim pritiskom. Dobijena uljasta rezidua preuzme se u ctil-acetat da bi se pripremio čvrsti talog.

Prečišćavanje se obavlja na koloni od silika gela u eluentu 7/3, zatim 6/4, heksan/etil-acetat.

Analiza:Analiza pomoću 'H NMR u CDC13.

'H NMR (CDCI3, 400.13 MHz):5 0.60 (s, 3H. CH3). 0.79 (dd, 6H, 2CH3), 0.83

<d, 3H, CH3), 0.94-1.88 (m, 24H), 0.98 (s. 3H. CH3), 1.19 (s, 3H, CH3 Aia). 1.40 (s, 9H. 3CH3, t-Boc), 2.27 (m, 2H, CH2), 3.83 (m, 2H, CH2), 4.47 (td, IH, CH Ala). 4.47 (m, 1 H, CH), 4.78 (td, 1H, CH), 5.07 (s, 2H, CH2GIy), 5.22 (t, 1H, CH), 5.23 (m, 1H, NH), 6.41 (si, IH, NH), 7.29 (m, 5H, CHAr).

Primer 4: Pripremanje 7- acetoksi- 10, l 3- dimetil- l 7-( 6- metilhcptan- 2- il)-2, 3. 4, 7, 8. 9. 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17- tetradekahidro- 1 //- ciklonentar« lfcnantren- 3- il 2-( 2-((( benzi1oksi) karbonil) amino)- acetamido) propanoata ( molekul Lb)

Pojednostavljeno ime: 3-benziloksikarbonil-glicinil-alanil-7-|3-0-acetil-holesterol

Molekul I .b priprema se od intermedijamo<g>jedinjenja 1.4.

Koriste se sledeći reagensi: 60 mg (0.13 mmol) 7-P-acetilholesterola, 70 mg (0.19 mmol, 1.5 ekv.) dipeptida, 6 ml mešavine rastvarača (THF/DCE 1:1), 42 mg (0.19 mmol, 1.5 ekv.) DCC i 25 mg (0.19 mmol, 1.5 ekv.) DMAP stave se u 10 ml-sku Wheaton-ovu bocu. Sirova reakciona mešavina meša se 24 h na temperaturi okoline.

Tok reakcije sc prati pomoću TLC u eluentu 7/3 heksan/etil-acetat.

U sirovi proizvod reakcije doda se 30 ml etil-acetata i 10 ml vode. Organska faza se izdvoji, suši preko natrijum-sulfata. filtrira i zatim evaporiše pod sniženim pritiskom. Dobijena uljasta rezidua preuzme se u etil-acetat da bi se pripremio čvrsti talog.

Prečišćavanje se obavlja na koloni od silika gela u eluentu 7/3, zatim 6/4, heksan/cti 1 -acctat.

Analiza: Analiza pomoću 'H NMR u CDCh.

'HNMR (CDC13, 400.13 MHz): 6 0.62 (s. 3H, CH3), 0.78 (dd, 6H, 2CH3), 0.84 (d, 3H,CH3), 0.91-1.83 (m, 25H), 1.01 (s, 3H, CH3), 1.17 (s. 3H. CH3 Ala), 1.94 (s,3H, CH3acetil), 2.27 (m, 2H, CH2). 3.82 (m, IH, CH), 4.47 (td, IH, CH Ala), 4.56 (m, IH, CH), 4.95 (td, IH, CH), 5.06 (s, 2H,CH- >Gly), 5.17 (si, IH, CH), 5.37 (t, IH, CH), 6.49 (dl, IH, NH), 7.24 (m, 5H, CHAr).

Primer 5: Pripremanje 7-((/ f/- r- butoksikarbonil) oksi)- 10, 13- dimetii- l 7-( 6-

metilheptan- 2- il)- 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17- tetradekahidro- l//- ciklopentakl

fenantren- 3- il 2, 2- dimetil- l, 3- dioksolan- 4- karboksilata ( molekul 2. a)

Pojednostavljeno ime: 3-(5r)-2,2-dimetil-l ,3-dioksolan-4-karboksil-7-p-0-tert-butiloksikarbonil-holesterol

1) Pripremanje dimctil -1.3-dioksolan-4-karboksilatne grupe

Koriste se sledeći reagensi:

Acetal, metanol i zatim litijum-hidroksid stave se u 50 ml-ski flakon. Ova mešavina se mesa na temperaturi okoline 16 h.

Sirova reakciona mešavina evaporiše na sniženom pritisku. Dobijena rezidua se preuzme u 75 ml vode. Ova faza se zatim acidifikuje na 0°C do pH 1, 1 N hlorovodoničnom kiselinom, zatim ekstrahuje sa 2 x 100 ml etil-acetata. Organske faze se kombinuju. suše preko natrijum-sulfata. filtriraju i zatim cvaporišu pod sniženim pritiskom, dajući blago obojenu uljastu reziduu.

Rezidua se direktno koristi u koraku kuplovanja. bez dodatnog prečišćavanja. Analiza: Analiza pomoću 'H NMR u DMSO, BRUKER 400 MHz.

'H NMR (CDC13, 400.13 MHz):61.32 (d, 3H, CH3), 1.42 (s, 3H, CH3), 4.14 (AB, 2H, CH2), 4.55 (dd, 1H, CH), 10.30 (si, 1 H, OH), 7.24 (m, 5H, CHAr).

Prinos: 94%

2) Pripremanje molekula 2.a

Molekul 2.a priprema se od intermedijamog jedinjenja 1.4. Koriste se sledeći reagensi: 50 mg (9.9 mmol) 7-p-t-butiloksikarbonilholesterola, 6 ml mešavine rastvarača (THF/DCE 1:1) i 16 mg (11.9 mmol, 1.2 ekv.) 3-{5)-2,2-dimetil-l,3-dioksolan-4-karboksilne kiseline stavi se u 10 ml-sku Wheaton-ovu bocu.

Mešanju sirove reakcione mešavine, 24 h na sobnoj temperaturi, prethodi dodavanje 24.5 mg (11.9 mmol, 1.2 ekv.) DCC i 14.5 mg (11.9 mmol, 1.2 ekv.) DMAP. Tok reakcije prati se pomoću TLC u eluentu 8/2 heksan/etil-acetat. Da bi se okončala reakcija, vrši se zagrevanje na 50°C, 2 h.

U sirovi proizvod reakcije doda se 30 ml etil-acetata i 10 ml vode. Organska faza se izdvoji, suši preko natrijum-sulfata. filtrira i zatim evaporiše pod sniženim pritiskom. Dobijena uljasta rezidua preuzme se u etil-acetat da bi se pripremio čvrsti talog.

Prečišćavanje se obavlja na koloni od silika gela u eluentu 95/5, zatim 9/1 heksan/etil-acetat.

Analiza:Analiza pomoću 'H NMR u CDC13.

'H NMR(CDCI?,400.13 MHz):8 0.60 (s. 3H. CH3), 0.79 (dd. 6H. 2CH.0. 0.83 (d, 3H, CH3), 0.74-1.97 (m, 25H), 0.98 (s, 3H, CH3), 1.33 (s. 3H, CH3 acctal), 1.40 (s. 9H, 3CH3. t-Boc), 1.42 (s, 3H, CH3 acctal), 2.29 (m, 2H. CH2). 4.08 (AB. 2H. CH2acetal), 4.48 (ddd, IH, CH acetal), 4.63 (m, IH. CH), 4.78 {td, IH, CH), 5.22 (d, IH,

CH).

Primer 6: Pripremanje 7- acetoksi- 10, 13- dimetil- 17-( 6- metilheptan- 2- il)-2. 3. 4, 7, 8. 9. 10. 11. 12, 13, 14, 15, 16, 17- tetradekahidro- 1 //- ciklopentaf alfenantrcn- 3- il 2, 2-

dimetil- l, 3- dioksolan- 4 karboksilata ( molekul 2. b)

Pojednostavljeno ime: 3-(5r)-2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-karboksil-7-[3-0-acetil-holesterol

Molekul 2.b priprema se od intemncdijarnog jedinjenja 1.4. Koriste se sledeći reagensi:

Holesterol, mešavina rastvarača i kiselina stave se u 100 ml-ski flakon. Mešanju sirovog reakcionog proizvoda 24 h na temperaturi okoline prethodi dodavanje DCC i DMAP. Tok reakcije se prati pomoću TLC {TLC silika gel 60 F254, Merck) u eluentu 8/2 heksan/EtOAc.

U sirovu reakcionu mešavinu doda sc 100 ml etil-acetata i 50 ml vode. Organska faza se izdvoji, suši preko natrijum-sulfata. filtrira i zatim evaporiše pod sniženim pritiskom.

Dobijena uljasta rezidua preuzme se u ctil-acetat da bi se pripremio čvrsti talog. Silika gel kolona (silica SDS 60A, 35-70um) u eluentu 95/5, zatim 9/1 heksan/EtOAc.

Prinos: 68%

Analiza: Analiza pomoću ]H i<l3>C NMR u CDC13BRUKER 400 MHz. HPLC kolona normalno-fazna CH1RALCEL O-DH (ODH0CE-CE026 kolona), eluent 9/1 heksan/iProH, 20 min. talasna dužina 190 nm.

Vreme retencije 5.291 min. HPLC čistoća 98.7%.

'HNMR (CDC13, 400.13 MHz): 8 0.62 (s, 3H, CH3), 0.79 (dd, 6H. 2CH3), 0.84 (d, 3H, CH3), 0.91-2.30 (m, 27H), 1.01 (s, 3H, CH3), 1.33 {s, 3H, CH3acetal). 1.42 {s, 3H, CH3acetal), 1.93 {s, 3H, CH3acetil), 4.09 (AB, 2H. CH2acetal), 4.48 {dd, IH, CH acetal). 4.62 (m, 1H, CH), 4.96 (td, IH, CH), 5.18 (d, IH, CH).

11/ Biološka aktivnost

A/ Protokoli

Za sve eksperimente koriste se sledeći protokoli:

1) Kulture ćelija

Koriste se plastične ploče za kulturu ćelija sa 96 bunarčića sa ravnim dnom (NUNC, USA) tretirane za ćelijsku kulturu (Sigma-Aldrich, ref. 114754); 1500 ćelija po bunarčiću zaseje se u 200 ul medijuma za kulturu. U vreme tretmana, 100 ul čistog kultivacionog medijuma, 100 ul kultivacionog medijuma koji sadrži etanol. ili lipozome, ili 100 ul kultivacionog medijuma koji sadrži aktivne sastojke doda sc u bunarčiće; finalna zapremina kultivacionog medijuma. posle tretmana, prema tome iznosi 300 ul za svaki bunarčić.

Kulture se inkubiraju u Sanyo inkubatoru (Japan, model MCO-19AIC-UV) na 37°C i u atmosferi sa 5% CO?i uz zasićenost vlagom. Ćelije se posmatraju invertnim mikroskopom (Nikon Eclipse TSIOO, Japan) i fotografišu kamerom (DIGITAL kamera sa c-mount; LABOVER, France). Komora za kulturu je mikrobiološki bezbedna komora MSC (thermo SCIENT1FIC, model HERA SAFE KS 12. France).

Vreme udvostručavanja ćelija izračunava se po formuli:

Iog2(a) = 1ogl0(a)x3.32

log2(b) = log(b)x3.32

Vreme udvostručavanja = log2(b) - log2(a)

gde (a) i (b) predstavljaju broj ćelija u vreme a i b (b>a) (12).

Tranzicija se obavlja disocijacijom tripsinom (goveđi pankreas, tip 3. Sigma, France). Disocijacija ćelija obavlja se na temperaturi okoline, 30 minuta, uz korišćenje 0.04% (w/v) Tyrode-ovog KC1 rastvora koji sadrži 0.05% (w/v) tripsin.

Posle disocijacije, ćelije sc suspenduju u medijumu za kulturu pogodnom za ćelije, i broje se korišćenjem THOMA komore za brojanje ćelija i razblažuju u istom medijumu da bi se dobilo 1500 ćelija po bunarčiću.

a) Ćelijske linije

Koriste se sledeće ćelije glioblastoma:

• C6 linije.

Ćelijska linija tipa C6 dobijena je od Benda et al. (13) iz moždanih tumora pacova, indukovanih N-mctilnitrozoureom. Ovaj tip ćelija koristi se kao" in vi tro"i" in vivo"model za procenu anti-GBM potencijala. Linije su poreklom iz ranijeg Strasbourg Neurochemistry Centre (U44 INSERM and UPR 416 CNRS).

Kultivacioni medijum napravljen je od 70% minimalnog esencijalnog medijuma (Minimum Essential Medium, MEM; Fischer Scientifique, ref. 61100) i 30% Hank-ovog rastvora (SIGMA, ref. H 9269). U kultivacioni medijum dodaju se sledeći sastojci: fetalni teleći serum (fetal calf serum, FCS; Fischer Scientifique, ref. 10108165) u finalnoj koncentraciji od 5% (v/v), rastvor antibiotika ciprofloksacin-hidrohlorida 5 ug/mL (EUROMEDEX, ref. UC5074) i rastvor fungizona 2.5 u g/ml (INVITROGEN. ref. 15290-026). Vreme udvostručavanja za ovaj tip ćelija iznosi 1 7 h.

• GBM linije humanog porekla

Linije humanog glioblastoma (GBM, line U-87 MG) i njihov kultivacioni medijum (Eagle-ov minimalni esencijalni medijum, Eagle's Minimum Essential Medium ili EMEM) dobijeni su od ATCC (USA, ref. ATCC- HTB-14). Kultura ovih ćelija uspostavljena jc i održavana prema preporukama ATCC. Ove linije se obično koriste "mvitro"i" in rivo"za testiranje anti-GBM potencijala. Vreme udvostručavanja za ove linije iznosi 16 h.

Korišćene su i sledeće primarne kulture humanih ćelija:

• Astrocitne ćelije

Astrocitne ćelije humanog porekla nabavljene su od ScienCell. USA (ref. 1800) kao i njihov kultivacioni medijum, napravljen od osnovnog medijuma koji sadrži 2%

(v/v) FCS serum (ref. 0010), astrocitne proteine rasta (astrocvte grovvth proteins, AGS, ref. 1852) i rastvor penicilina/streptomicina (ref. 0503). Vreme udvostručavanja za ove humane astrocite iznosi 96 h.

• Ćelije jetre

Humanog porekla, dobijene su od ScienCell, USA (ref. 50200) kao i kultivacioni medijum (ref. 5201) koji sadrži 10% (v/v) FCS. Vreme udvostručavanja za ove ćelije iznosi 24 h.

• Ćelije bubrega

Ove ćelije, humanog porekla, dobijene su od ScienCell, USA (ref. 4120) kao i kultivacioni medijum (ref. 4101), koji sadrži 10% (v/v) FCS. Vreme udvostručavanja iznosi 96 h.

• Srčane ćelije

Ove ćelije, humanog porekla, dobijene su od ScienCell, USA (ref. 6300) kao i kultivacioni medijum, koji sadrži 10% (v/v) FCS. Vreme udvostručavanja je 72 h.

• Skeletne mišićne ćelije

Humanog porekla, dobijene su od ScienCell, USA {ref. 3500) kao i kultivacioni medijum (ref. 3501). koji sadrži 10% (v/v) FCS. Vreme udvostručavanja za ove ćelije iznosi 72 h.

Korišćene su i sledeće kulture kancerskih ćelija humanog porekla:

• Kancerske ćelije jetre

Dobijene su od ATCC (ref. ATCC-HB-8065). Kultivacioni medijum se sastoji od MEM (Gibco. USA; ref. 51200) i 10% (v/v) FCS. Vreme udvostručavanja je 60 h.

• Ćelije kancera prostate

Dobijene su od ATCC (ref. ATCC-HTB-81). Kultivacioni medijum je isti kao i onaj koji se koristi za linije kancera jetre. Vreme udvostručavanja je 60 h.

• Ćelije kancera dojke

Dobijene su od ATCC (ref. ATCC-HTB-19). Kultivacioni medijum je isti kao i onaj koji sc koristi za linije kancera jetre. Vreme udvostručavanja je 20 h.

Za sve ove kulture važi da je uspostavljanje i održavanje kultura obavljeno je prema preporukama dobavljača.

b ) Tretiranje kultura

Aktivni sastojci su rastvoreni u apsolutnom etanolu (AnalaR, NIORMAPUR, VWR, France) ili su u obliku Hpozomskog rastvora, na primer 10 ul stok-rastvora razblaži se u u 990 ul i zatim doda u bunarčiće za kulturu (200 ul kultivacionog medijuma) dajući koncentracije od 30.0, 15.0, 7.5 i 3.3 uM (finalna zapremina kultivacionog medijuma po bunarčiću BI-GBM: 300 ul).

Kada su aktivni sastojci rastvoreni u etanolu, kultivacioni medijum sadrži 3.3% etanola (v/v).

2) Pripremanje lipozoma

Osnovna metodologija opisana jc u VVerthle et al. (10).

Ukratko, jedinjenja koja će se testirati, naime, jedinjenja u skladu sa pronalaskom (aktivni sastojci) ili 7p-OHCH-C3-estar (derivat 7-beta-hidroksisterola esterifikovan na poziciji 3 oleatnom grupom, čija je sinteza opisana u Rakotoarivelo et al. (14) i služi kao kontrola), sojin fosfhatidilholin (Sigma) kao i holesteril-3-sulfat (Sigma) uzmu se iz stok rastvora pripremljenih od dihloroetana u slučaju aktivnih sastojaka i 7-f}-OHCH-C3-estra, mešavine hloroform:metanol (9:1, v/v) u slučaju fosfatidilholina i hloroforma u slučaju holesteril-3-sulfata. Molarni odnosi su 1 M/0.1 M/0.25 M za fosfatidilholin, holestcril-3-sulfat i 7fi-OHCH-C3-estar i aktivne sastojke, respektivno.

Posle evaporacije, suvom jedinjenju se doda rastvor PBS, bez Ca~ i Mg" , pH 7.2 (BioRad). Zapremina pufera i masa proizvoda podešavaju se tako da se 20 ili 10 u) lipozoma dodatih u 90 ul kultivacionog medijuma daju željene finalne koncentracije. Lipozomi se formiraju ekstruzijom sa Liposofast (Sodexim, SA Muizon, France). Rastvor se propusti kroz polikarbonatne filtracione membrane (100 nm) 41 put. Lipozomi se sterilišu Hltracijom na 22 um Milliporc membranama.

3) Merenje aktivnosti i toksičnosti

Isti metodi koriste se u oba slučaja. Za aktivnost, koristi se anti-GBM potencijal testnih jedinjenja, a za toksičnost, isti test se koristi na normalnim ćelijama humanog porekla održavanim" in vitro".

Koriste se sledeći metodi merenja:

a)Brojanje ćelija

Koristi se metod brojanja ćelija na fotografijama.

Na primer. u slučajevima kultura na pločama sa 96 bunarčića i zavisno od uveličanja mikroskopa koje se koristi (x 100 ili x 200). dobijene fotografije predstavljaju vidno polje dijametra koji je jednak 1/5 dijametra bunarčića. Prema tome, ukupan broj ćelija u bunarčiću jednak je broju ćelija po fotografiji pomnoženom sa 5. Ova tehnika je upoređena sa standardnom tehnikom (tripsinizacija ćelijskog sloja, centrifugiranje ćelija, suspendovanjc ćelija u fiziološkom slanom rastvoru i brojanje uz korišćenje THOMA komore za brojanje ćelija) u slučaju C6 ćelija. Rezultati dobijeni ovim metodima su identični.

b ) Proteinski test

Kultivacioni medijum sc izvuče iz svakog bunarčića i 50 u 1 Laemmli pufera {0.1 ml Tris, 0.8 ml glicerola, 1.6 mL 10% SDS, 8 mlq. s.ultračistc vode) se doda u svaki bunarčić.

U kontrolne bunarčiće, doda se 10 ul rastvora goveđe« serum albumina, u različitom opsegu {kristalizovani BSA, Sigma): opseg se kreće od 0 do 20 ug po bunarčiću. Bunarčići se zatim dopune sa 40 ul Laemmli pufera. Na kraju, doda se 200 ul rastvora BCA reagensa (Pierce. USA; BCA Protein Assay Kit; Thermo Scientific, France).

Ploče za kulturu se inkubiraju 30 min na 37°C u komori za zagrevanje. Optička gustina za svaki bunarčić očitava se i kvantifikuje pomoću čitača ploča (BioRad, USA, iMark Microplate reader 12222) na 570 nm.

c ) Vijabiinost ćelija ( MTT test )

Ovaj test omogućava detektovanje ćelijske respiracije. posebno respiracije u mitohondrijama. Stok rastvor tetrazolijumove soli MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolijum bromid, Sigma-Aldrich, USA, ref. M5655) pripremi se od 10 mg MTT/ml PBS pufera {fosfatom puferisani slani rastvor, SIGMA, ref. D 1408). Ovaj rastvor se dodaje direktno u kultivacioni medijum u svaki bunarčić; finalna koncentracijaMTT je 25fig/ml. Ploča se zatim inkubira na 37°C najmanje 1 h.

Posle pojave plavih zrnaca formazana, proizvedenih uglavnom transportom elektrona u mitohondrijama, napravljene su fotografije da bi se izbrojalc ćelije sa visokom gustinom granula formazana: ova tehnika koristi se u slučaju U87-MG linija. Zatim, za ovu liniju i za druge kulture, medijumi se uklone i doda se 100 ul dimetilsulfoksida (DMSO, SDS CARLO ERBA, Italy) da se rastvore depoziti formazana.

Optička gustina se očitava i kvantifikuje korišćenjem čitača ploča (BioRad, iMark Microplate reader) na 490 nm.

Vijabiinost se ponekad testira tehnikom izuzimanja od bojenja, uz korišcenje tripan-plavog.

4) lmunoobeležavanjc ćelija i dobijanje slika

Anti-CD133 (poly, Abnova), anti-GFAP (poly, Sigma). anti-NFL (mono. Santa Cruz) i anti-fibroblastna (ERTR7, Santa Cruz) primarna antitela razblaže se do 1/100 u slučaju prva tri antitela i 1/50 u slučaju poslednjeg.

Sekundarna antitela. odgovarajuća za prepoznavanje primarnih antitela su antizečja antitela kuplovana sa peroksidazom (kozja, Sigma), antimišja kuplovana sa Dylight 488 (ovčja, Sigma), antimišja kuplovana sa Dylight 488 (ovčja, Sigma) i antipacovska kuplovana sa FITC (zečja. Sigma). Razblaženja su 1/4000. 1/1000, 1/4000 i 1 /400 respektivno.

Ćelije se permeabilišu 5 min pomoću 0.1% Triton X-100 (Sigma) u PBS (Fisher Scientific). Nespecifična mesta se blokiraju sa 2% BSA (Sigma) u PBS. Inkubacije traju respektivno 1 h na temperaturi okoline, 48 h na 4°C, 24 h na 4°C i 1 h na temperaturi okoline za anti-CD133, anti-GFAP, anti-NFL i antifibroblastna antitela. Inkubacija sa sekundarnim antitelima obavlja se 1 h na temperaturi okoline. CD 133-pozitivne ćelije detektuju se pomoću DAB/H2O2sistema (Sigma) i posmatraju pod optičkim mikroskopom. Fluorescencija se detektuje i slike dobijaju korišćenjem epifluorescentnog mikroskopa (Axiovert, Zeiss, Germany).

5) Ekstrakcija lipida i identifikacija oksisterola

Ćelije se isperu sa 0.9%o NaCI. sakupe mehanički, suspenduju u Tris-HCl puferu (10 mM; pH 7.4) i homogenizuju sa Potter (1000 r.p.m. i 13 reciprokacija). Homogenizacija se obavlja u ledu. Ekstrakcija sc obavlja na 4°C posle dodavanja 19 zapremina hloroformaimetanola (2:1, v/v) za 1 zapreminu ćelijske suspenzije prema Folch et al. (13). Organska faza i vodena faza se razdvoje dodavanjem 0.2 zapremine 0.74% KC1 (w/v).

Posle evaporisanja organske faze u rotacionom evaporatoru (Buchi, R-215, Switzerland), lipidna rezidua se preuzme u hloroform. TLC slojevi se prethodno operu rastvorom hloroform:metanol (1:1, v/v) i aktiviraju na 100°C 1 h. Lipidi se eluiraju sledećim sistemom: petroleumdar (tačka ključanja: 60-70°C): etansirćetna kiselina (80:20:1.3, v/v/v). Nataloženi standardi su holesterol. 7-keto-holesterol, 7-beta-OHCH, 7-beta-OHCH-C3-estar i molekul 2.b. Lipidi i standardi se detektuju pomoću Maccala reagensa. Rf vrednosti su respektivno 0.21, 0.09, 0.08, 0.27 i 0.23 za holesterol, 7-keto-holesterol, 7-beta-OHCH, 7-beta-OHCH-C3-estar i molekul 2.b. Kalibracioni opsezi od 0.5 do 2 ug za svaki standard urađeni su zasebno. Intenziteti tačaka od interesa izračunati su u odnosu na standarde posle skeniranja tankih silika-slojeva koji su se razvili.

Čistoća korišćenih rastvarača je AnalAR ili HPLC stepena.

B/Anti- GBM aktivnost" in vitro "

B.l. Životinjski model

Kulture C6 ćelija (paeov) korišćene su pod radnim uslovima pomenutim ranije u ovom tesktu (odeljak II, A).

Primer 7: Anti- GBM aktivnost" in vitro "na kulturama C6 ćeiija ( paeov)

Dobijeni rezultati zbirno su prikazani u Tabeli 1, dole, kao i na Slici 3.

Slika 3 (uveličanje x 200) pokazuje izgled kultura C6 ćelija pod radnim uslovima pomenutim ranije u ovom tekstu (odeljak II, A) u prisustvu molekula l.a (Pr. 3) ili posle sekvencijalnog tretmana molekulom l.a i molekulom 2.a (Pr. 5), posle 19 dana i 35 dana.

Rezultati ( Tabela 1) pokazuju da je molekul l.a. u etanolskoj formi citotoksičan. i to posle 19 dana tretmana. Pri 15 pM l.a i posle 14 dana tretmana, broj ćelija, nivo proteina i MTT test redukuju se za 30% tako da se dostiže redukcija od 97%. najmanje, posle 19 dana. Posle 19 dana tretmana, zapažena je i dozna zavisnost za 7.5 i 3.3 uM l.a, a pri 15 uM zapaža se 20% porasta odnosa MTT/ćeliji u odnosu na kontrolne kulture.

Da bi se eliminisale rezidualne ćelije, koristi se sekveneijalni tretman. Ćelije se prvo tretiraju sa 15 uM molekula l.a. a zatim se 19. dana tretmana doda molekul 2.a u koncentraciji od 7.5 uM.

Nisu zapažene vijabilne ćelije; samo ćelijski "kadaveri" adheriraju za čvrsti supstrat ćelijske kulture (dno bunarčića), kako je pokazano na Slici 3.

Zbirno, sekveneijalni tretman molekulom 1 .a. i molekulom 2.a, pokazuje potpunu efikasnost protiv ovog tipa ćelija. Zapažanja ukazuju na porast ukupne respiracije ćelija pre njihove destrukcije.

B.2. Humani model: anti- GBM aktivnost" in vitro "na kulturama humanih ćelija

( linija U- 87GBM)

B.2.1 Definicija" in vitro "modela i iskazivanje rezultata

a) Karakterizacija različitih tipova ćelija

U-87GM ćelije kultivišu se pod radnim uslovima opisanim ranije u ovom tekstu

(odeljak II, A).

Kulture su napravljene od dve ćelijske komponente: ćelijski sloj sačinjen od ćelija koje sc ponašaju kao nomalne (nekancerske) ćelije i ćelijski agregati sastavljeni od GBM tipa ćelija.

Slika 4 pokazuje fotoničnu sliku (x 100) koja je karakteristična za kulturu. Može se videti ćelijski sloj (cell layer, CL), na kojem su fiksirani agregati ćelija (cell aggregates. CA) oblika polulopte. Slika 5 (x 200) pokazuje imunoobeležavanjem da se CD133' ćelije (matične ćelije), opisane u humanim GBM. nalaze u ćelijskim agregatima, a ne nalaze se u CL. Imunofluorescentno obeležavanje pokazuje prisustvo GFAP, markera normalnih astrocita (Slike 6 i 7; x 200) (16) u CL i CA (Slike 6 i 7; x 200) i neurofilamenata u CL i CA. Međutim, specifično obeležavanje tlbroblasta, ćelija sa visokim potencijalom za umnožavanje nađeno je jedino u slučaju CA. Fotonićna zapažanja jasno pokazuju da se ćelije CA dele veoma brzo (96 h vreme udvostručavanja, najmanje), dok ćelije koje čine CA imaju vreme udvostručavanja 16 h.

Ova zapažanja opravdavaju metod brojanja ćelija (ćelije obeležene ili neobeležene zrncima formazana), koji je razvijen; u stvari, brojanje posle tripsinizacije ne može da napravi razliku između ćelija CL i CA. Slike takođe pokazuju da samo CA imaju GBM karakter (kratko vreme udvostručavanja. prisustvo matičnih ćelija i fibroblasta). Dobijeni rezultati dakle pokazuju etekat testiranih molekula na CA.

b) Iskazivanje rezultata

Rezultati se iskazuju prema sledećim parametrima:

(i) Efikasnost molekula prema pronalasku

- Kvantifikacija rezidualnih ćelija, posebno matičnih ćelija.

- Efikasnost molekula prema pronalasku tokom vremena

Kultivacioni medijum koji sadrži molekule prema pronalasku zameni se svežim medijumom i ispituje se"de novo"multiplikacija ćelija: odsustvo" de novo"multiplikacije označava potpunu destrukciju GBM ćelija, uključujući matične ćelije.

(ii) Efekat molekula na ukupnu respiraciju GBM ćelija.

(iii) Upoređivanje rezultata dobijenih sa molekulima prema pronalasku i onih dobijenih sa 7J3-OHCH-C3-estrom (kontrola).

B.2.2 Rezultati

Kulture U87-MG (humanih) ćelija koriste se pod radnim uslovima pomenutim ranije u ovom tekstu (odeljak II, A).

7-beta-OHCH-C3-estar koristi sc kao kontrola.

Primer 8: izučavanje" in vitro "anti- GBM aktivnosti molekula 2. a ( Pr. 5) u

lipozomskoj formi

Dobijeni rezultati prikazani su u Tabeli 2, dole.

Ovi rezultati predstavljaju srednju vrednost tri nezavisna eksperimenta sprovedena u triplikatu. Rezultati su iskazani kao procenat u odnosu na kontrolu.

Zapažanja pokazuju da 15 uM molekula 2.a. u iipozomskoj formi, smanjuje prisustvo GBM ćelija (CA) na nulu posle 15 dana tretmana.

Preostaju samo ćelije koje se sporo dele (CL). Efckat nije dozno-zavisan. 7fi-OHCH-C3-estar u etanolskoj formi ne deluje na GBM (CA) (vidi i Primer 9). deluje samo u Iipozomskoj formi, i to pri 80 uM. Njegova efikasnost nije bolja, ili čak opada posle povećavanja doze 7p-OHCH-C3-estra u Iipozomskoj formi.

Međutim, ako se 13. dana tretmana kultivacioni medijum koji sadrži 7P-OHCH-C3-cstar ukloni i zameni svežim kultivacionim medijumom koji ne sadrži ovaj lek. zapaža se multiplikacija ćelija, paralelno sa porastom vrednosti u MTT testu posle dva dana; ovaj porast iznosi 40%. Ovo nije slučaj sa molekulom 2.a: u odsustvu ovo molekula, ne zapaža se multiplikacija ćelija.

Tabela 2 pokazuje i veliki porast u MTT/ćeliji (140% u odnosu na kontrole) u vreme kada većina ćelija nestaje (8 dana tretmana). Ovo nije slučaj kod lipozomskog 7p-OHCH-C3-estra: čak i pri 80 uM, odnos MTT/ćeliji ne varira.

Ovo zapažanje pokazuje različito dejstvo dva molekula: ukupna ćelijska respiracija se povećava pre masivne smrti ćelija. Ovo nije slučaj sa 7P-OHCH-C3-estrom.

Primer 9: Izučavanje"/ ;;vitro "anti- GBM aktivnosti molekula 2. b ( Pr. 6) u

etanolskoj formi

Dobijeni rezultati prikazani su u Tabeli 3 dole.

Ovi rezultati predstavljaju srednju vrednost tri nezavisna eksperimenta od kojih je svaki sproveden u triplikatu. Rezultati su iskazani kao procenat u odnosu na kontrolu. Pri više od 30 uM. 7<p->OHCH-C3-estar se više ne rastvara u etanolu.

Zapažanja pokazuju daje molekul 2.b potpuno efikasan pri 30 pM u etanolskoj formi: nema preostalih GBM ćelija, čak ni posle uklanjanja aktivnog sastojka. Kao i za molekul 2.a. u Iipozomskoj formi, ćelijska respiracija se povećava pre ćelijske smrti. Ovo nije slučaj sa etanolskim 7[3-OHCH-C3-estrom za koji nije zapažena antitumorska aktivnost.

Pored toga. zamena kultivacionog medijuma svežim medij umom koji ne sadrži jedinjenje 2.b 22. dana ne dovodi do umnožavanja ćelija.

Primer 10: imunoobeležavanje CD133" matičnih ćelija A/ B peroksidaznim

sistemom

Imunoobeležavanje se obavlja kako je opisano ranije u ovom tekstu (odeljak U.

A).

Dobijeni rezultati prikazani su u Tabeli 4 dole.

Ovi rezultati predstavljaju srednju vrcdnost dva nezavisna eksperimenta od kojih je svaki sproveden u triplikatu. Rezultati su iskazani kao procenat CD133-pozitivnih ćelija u odnosu na kontrole. Ovi eksperimenti su nezavisni od onih opisanih u Primerima 8 i 9.

Kao u zapažanjima opisanim u Tabelama 2 i 3. 7p<1->OHCH-C3-estar u Iipozomskoj formi i molekul 2.b u etanolskoj formi redukuju nivo proteina za 85% i 100% u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.

Rezultati pokazuju da su matične ćelije potpuno uništene molekulom 2.b. Ovo nije slučaj sa 7P-OHCH-C3-estrom, čak ni kada se primeni u Iipozomskoj formi.

Slika 9 (imunoobeležavanje CD133" ćelija) jasno pokazuje njihov nestanak posle 22 dana tretmana. Ovo nije slučaj sa 7|3-OHCH-C3-estrom u Iipozomskoj formi (Slika 10, imunoobeležavanje CD133" ćelija); u ovom slučaju, 50% CD133<4>ćelija još uvek je prisutno među rezidualnim ćelijama. Zamena kultivacionog medijuma svežim medijumom koji ne sadrži jedinjenje 2.b posle 22 dana ne dovodi do pojave CD 133 matičnih ćelija.

Primer 1 1: Izučavanje" in vitro "sudbine molekula 2. b ( Pr. 6) u etanolskoj formi

u GBM humanog porekla

Ekstrakcija i analiza lipida iz GBM tretiranih sa 30 uM molekula 2.b u etanolskoj formi ne pokazuje prisustvo 7-beta-OHCH-C3-estra posle 24 h ili 10 dana tretmana, ovo drugo vreme je vreme pokretanja ćelijske smrti. Međutim, zapaža sc da se 0.12% i 0.18% molekula 2.b transformisalo u 7-beta-OHCH posle 1 dana i 10 dana tretmana, respektivno. Kontrolni eksperimenti pokazuju da ovi vrlo niski nivoi 7-beta-OHCH ne indukuju smrt GBM.

Primer 12: Izučavanje toksičnosti

Toksičnost je ispitivana" in vitro"na različitim tipovima normalnih ćelija humanog porekla.

a)Na astrocitima

Upotrebijene ćelije su ćelije humanog porekla {ScienCell, USA, ref. 1800), pomenute ranije u ovom tekstu {odeljak II, A).

Aslrocitni tip jc potvrđen prisustvom GFAP. standardnog markera normalnih astrocita (Slika 11: uveličanje x 200).

Molekuli 2.a (lipozomska forma) i 2.b (etanolska forma) nisu toksični za primarne kulture normalnih (nekancerskih) humanih astrocita pri 30 uM, posle 30 dana tretmana.

b)Na drugim ćelijama

Upotrebijene ćelije su ćelije jetre (ScienCell. USA, ref. 50200), ćelije bubrega

(ScienCell, USA, ref. 4120), skeletne mišićne ćelije (ScienCell, USA, ref. 3500) i srčane ćelije (ScienCell, USA, ref. 6300), humanog porekla, pomenute ranije u ovom tekstu (odeljak II, A).

Molekuli 2.a (lipozomska forma) i 2.b (etanolska forma) nisu toksični pri 30 uM i posle najmanje 30 dana tretmana, za primarne kulture ćelija jetre, ćelija bubrega, skeletne mišićne ćelije i srčane ćelije humanog porekla.

Primer 13: Izučavanje" m vitro "aktivnosti molekula 2, b ( Pr. 6) prema drugim

kancerima

Korišćene su kancerske ćelije iz jetre (ref. ATCC-HB-8065). prostate (ref. ATCC-HTB-81), dojke (ref. ATCC-HTB-19). humanog porekla, pomenute ranije u ovom tesktu.

Pri 30 uM i u etanolskoj formi, molekul 2.b ne pokazuje efekat na ćelijsku deobu i respiraciju kancerskih ćelija jetre, prostate ili dojke, humanog porekla.

Claims (16)

1. I. Jedinjenje formule (1)

   naznačeno time.Što - A je -(Ri)n- grupa u kojoj je R| aminokiselinska rezidua vezana svojim C-terminalnim krajem i n = 1 do 3, svaki Rije identičan ili raziičit. gde je N-terminalni kraj pomenute amino-kiseline nesupstituisan ili supstituisan sa -C-(0)-R2grupom u kojoj je R2mono-ili policiklična C(,-Ci4arilalkil grupa; mono- ili policiklična CVC14 hetcroarilalkil grupa koja može sadržati jedan ili više heteroatoma. koji mogu biti identični ili različiti:

   mono- ili policiklična CVC|4arilalkiloksi grupa ili mono- ili policiklična C5-C14heteroarilalkiloksi grupa koja može sadržati jedan ili više heteroatoma koji mogu biti identični ili različiti. -C(0)-NH-R3ili -C(S)-NH-R3grupa u kojoj jc R3vodonik; Cj-Ci2alkil grupa, linearna ili granata, nesupstituisana ili supstituisana grupom koja se bira između OR. NRR".

   NHR i SR, gde su R i R". nezavisno, vodonik. linearni C|-C!2alkil ili nesupstituisani aril: aril grupa, nesupstituisana ili supstituisana grupom koja sc bira između OR. NRR". NHR i SR kako je definisano gore; acil grupa; formil grupa; sulfonil grupa; su!fini! grupa, silil grupa, nesupstituisana ili supstituisana mono- ili policikličnom C(,-C|4aril grupom, nesupstituisanom ili supstituisanom najmanje jednim linearnim ili granatim CVCbalkilom: alil grupa: šećerna rezidua; -C(0)-OR4grupa u kojoj je R4linearni ili granati Cj-C|2alkil, nesupstituisan ili supstituisan grupom koja se bira između OR. NRR". NHR i SR, kako je definisano gore; amidna grupa; tioamidna grupa; sulfonamidna grupa, -C{0)-R5grupa u kojoj je R5zasićeni CVCu heterocikl koji uključuje 1 ili 2 heteroatoma, nesupstituisan ili supstituisan najmanje jednim linearnim ili granatim C|-C(1alkilom ili grupom koja se bira između OR. NRR". NHR i SR. kako je definisano gore, gde su R i R\ nezavisno, vodonik, Cj-Ci?alkil ili nesupstituisani aril. - B je -C(0)-R(, grupa gde je R6 vodonik; C1-C12, poželjno C|-C6, alkil, linearni ili granati, nesupstituisan ili supstituisan grupom koja se bira između OR, NRR', NHR i SR, kako je definisano gore; aril grupa, nesupstituisana ili supstituisana grupom koja se bira između OR, NRR', NHR i SR, kako je definisano gore; ili Rf>predstavlja OR7, gde je R7linearni ili granati C|-C|2, poželjno C|-C7„ alkil.
2. 2. Jedinjenje formule (I) prema zahtevu 1, naznačeno time. što je ispunjen najmanje jedan od sledećih uslova: - A je -(Ri)n- grupa, gde je R| aminokiselinska rezidua i n - 2; - A je -(Ri)„- grupa, gde je Riaminokiselinska rezidua, n = 2 i N-terminalni kraj pomenute amino-kiseline je supstituisan arilalkoksikarbonil grupom, posebno benziloksikarbonil grupom; - A je alanil radikal povezan sa glicinil radikalom. opciono supstituisan na N-terminalnom kraju arilalkoksikarbonil grupom, posebno benziloksikarbonil grupom; - A je metionil radikal povezan sa glicinil radikalom, opciono supstituisan na N-terminalnom kraju arilalkoksikarbonil grupom, posebno benziloksikarbonil grupom;
3. 3. Jedinjenje formule (I) prema zahtevu 1, naznačeno time. što je A -C(O)-R5grupa u kojoj je R52,2-dimetil-l,3-dioksolanska grupa.
4. 4. Jedinjenje formule (I) prema jednom od zahteva 1 do 3, naznačeno time. što je B acil grupa u kojoj je alkil grupa C|-Cf„ posebno acetil, ili alkoksikarbonil grupa u kojoj je alkil grupa C|-C<„ posebno/e/-/-butoksikarbonil grupa.
5. 5. Jedinjenje formule (I) prema zahtevu 1. naznačeno time, što se bira između sledećih jedinjenja:

   7-((/tr/-butoksikarbonil)oksi])-10.13-dimetil-17-(6-mefilheptan-2-il)-2.3,4.7.8.9.10. 11,12,13.14,15,16.17-tetradekahidro-1 //-ciklopenta[ć/]fcnantren-3-il 2-(2-(((benzil-oksi) karbonil)amino)-acctamido)propanoat (molekul l.a); - 7-acetoksi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2.3.4,7,8.9,10.11,12,13,14,15,16,17-tetrađekahidro-l//-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2-{2-(((benziloksi)karbonil)amino)-acetamido)propanoat (molekul 1 .b); - 7-((tert-butoksikarbonil)oksi)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3.4.7,8, 9.10.11, 12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1 //-eiklopenta[a]tenantren-3-il 2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-karboksilat (molekul 2.a); - 7-acetoksi-10,13-dimetil-i 7-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12.13.14,1 5.16,1 7-tetradekahidro-l//-ciklopenta[a]fenantrcn-3-il 2.2-dimetil-l ,3-dioksolan-4-karboksilat (molekul 2.b).
6. 6. Metod pripremanja jedinjenja formule (I) prema bilo kojem od zahteva 1 do 5, naznačen time. Što uključuje sledeće korake: - protektovanjc hidroksilne funkcije na poziciji 3 holesterola protcktivnom grupom, - uvođenje ketonske funkcije na poziciji 7, - redukcija ketonske funkcije u hidroksilnu funkciju, - uvođenje protektivne grupe na hidroksilnoj funkciji na poziciji 7. koja odgovara B grupi, i - deprotektovanje hidroksilne funkcije na poziciji 3.
7. 7. Metod prema zahtevu 6, naznačen time. što posle deprotektovanja, hidroksilna funkcija na poziciji 3 može biti supstituisana željenom A grupom.
8. 8. Farmaceutska smeša, naznačena time. što sadrži najmanje jedno jedinjenje formule (I) prema bilo kojem od zahteva 1 do 5 i farmaceutski prihvatljivi prenosnik.
9. 9. Farmaceutska smeša prema zahtevu 8. naznačena time. što se pomenuto jedinjenje formule (1) koristi kao jedini aktivni sastojak, ili u kombinaciji sa antikancerskim sredstvom.
10. 10. Farmaceutska smeša prema bilo kojem od zahteva 8 ili 9.naznačena time.što se sastoji od lipozomskog ili alkoholnog rastvora najmanje jednog jedinjenja formule (I), samog ili u mešavini sa još jednim aktivnim sastojkom.
11. 11.Jedinjenje formule (I) prema bilo kojem od zahteva 1 do 5,naznačeno time.što se koristi u lečenju bolesti u koje su uključene transformisane astrocitne ćelije.
12. 12. Jedinjenje formule (I) prema bilo kojem od zahteva 1 do 5,naznačeno time.što se koristi u lečenju multiformnog glioblastoma.
13. 13. Jedinjenje formule (I) prema bilo kojem od zahteva 1 do 5.naznačeno time.što se koristi u lečenju bolesti u koje su uključene transformisane astrocitne ćelije, pomenuto lečenje je sekvencijalno lečenje koje uključuje najmanje jedan korak primene prvog jedinjenja formule (I) i najmanje jedan korak primene drugog jedinjenja formule (I). različitog od prvog.
14. 14. Jedinjenje formule (I) prema bilo kojem od zahteva 1 do 5, naznačenotime.što se koristi u lečenju multiformnog glioblastoma. pomenuto lečenje je sekvencijalno lečenje koje uključuje najmanje jedan korak primene prvog jedinjenja formule (I) i najmanje jedan korak primene drugog jedinjenja formule (I). različitog od prvog.
15. 15. Farmaceutska smeša prema bilo kojem od zahteva 8 do 10.naznačena time.što je pomenuto jedinjenje formule (I) 7-acetoksi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-17/-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2,2-dimetil-l ,3-dioksolan-4-karboksilat (molekul 2.b).
16. 16. Jedinjenje formule (I) prema zahtevu 5, za upotrebu prema zahtevu 14,naznačeno time.što je prvo jedinjenje formule (I) 7-((/£'/Y-butoksikarbonil)oksil)-10,13-dimetil-1 7-{6-metilheptan-2-il)-2,3.4,7,8.9,10,11,12.13,14,15,16,17-tetradekahidro-l//-ciklopcnta[«]fenantrcn-3-il 2-(2-(((benzil-oksi) karbonil)amino)-acetamido) propanoat (molekul l.a) i drugo jedinjenje formule (I) je 7-((tert-butoksikarbonil)oksi)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7.8.

    9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1 //-ciklopenta[a]fcnantren-3-il 2.2-dimetil-1,3-dioksolan-4-karboksilat (molekul 2.a).