RS57065B1 - Derivati sterola i njihova upotreba za lečenje bolesti koje obuhvataju transformisane ćelije astrocite ili za lečenje malignih hemopatija - Google Patents

Description

Opis

Pronalazak se odnosi na nove derivate sterola za upotrebu u lečenju malignih hemopatija, naročito koje obuhvataju transformisane mijeloidne ćelije za lečenje limfoma.

Transformacija ćelija predstavlja prelazak normalne eukariotske ćelije u imortalizovanu i/ili kancersku eukariotsku ćeliju. Izrazi "transformisana ćelija" ili "kancerska ćelija" koristiće se kasnije u ovom tekstu kao sinonimi.

Multiformni glioblastom (glioblastoma multiforme, GBM), poznat i kao astrocitom IV stadijuma, moždani je tumor koji se karakteriše transformacijom astrocitnih ćelija u kancerske ćelije, naročito prolaženjem kroz gliome stadijuma I, stadijuma II i stadijuma III.

Uprkos značajnim naučnim i terapijskim dostignućima u oblasti onkologije, GBM je i dalje neizlečivi kancer. U najboljem slučaju, istraživači i lekari su zadovoljni kada prosečan život pacijenata može da se produži za nekoliko meseci, najviše petnaest meseci.

Jedan od problema u lečenju GBM je povratak bolesti prouzrokovan matičnim ćelijama. U stvari, čak i kada postojeće terapije uspešno iskorene veći deo tumora, matične ćelije često dovode do razvoja novog tumora (1, 2).

Trenutno postojeće terapije uvek se sastoje od resekcije tumora, ako njegova lokacija to dopušta, za čime sledi radioterapija i/ili hemoterapija, kako je pogodno. U hemoterapiji, jedan od vodećih tretmana je dvojna terapija koja se sastoji od primene avastina (inhibicija vezivanja VEGF za receptore) i irinotekana (inhibitor topoizomeraze I). Trojna terapija PCV tipa, koja predstavlja kombinaciju prokarbazina (DNK-alkilirajuće sredstvo), lomustina (CCNU; nespecifično alkilirajuće sredstvo) i vinkristina (inhibicija polimerizacije mikrotubula), trenutno je veoma sporna. Temozolomid, guaninalkilirajuće sredstvo, u kombinaciji sa radioterapijom, produžava prosečno preživljavanje, naročito u slučaju pacijenata sa hipermetilisanom DNK. U toku su klinička ispitivanja (faza III), testiranja cilengitida (inhibicija nekih integrinskih receptora) i talampanela (blokiranje glutamatnih kanala AMPA tipa).

Postoje dva tipa imunoterapijskih studija i kliničkih ispitivanja:

- adaptivna imunoterapija, u kojoj se in vitro aktivirane ćelije injektiraju u pacijenta, na primer, ćelije-ubice aktivirane limfokinima (lymphokine-activated killer cells, LAK; faza II kliničkih ispitivanja) ili citotoksični T-limfociti (cytotoxic T lymphocytes, CTL; faza I kliničkih ispitivanja) injektiraju se intrakranijalno. Danas, posmatranja pokazuju veoma retko preživljavanje od 20 meseci, što je veoma marginalno.

- aktivna imunoterapija, koja se sastoji od upotrebe vakcina (faza I) i dendritskih ćelija (faza II). Ovo nije pokazalo značajno produženje preživljavanja pacijenata. Izučavanja su obustavljena.

Genska terapija, koja se sastoji od upotrebe adenovirusa, retrovirusa ili virusa malih boginja kao vektora molekula sa antikancerskim potencijalom, produžava preživljavanje samo 6 do 11 meseci. Ćelijska terapija kojom se predlaže upotreba neuronskih matičnih ćelija kao transportera lekova u GBM još uvek je u demonstracionoj fazi osnovnog ispitivanja.

Pristup koji je bio donekle zanemarivan poslednjih decenija, a koji se ponovo uzima u obzir, sastoji se od delovanja na nivou glikolize i oksidativne fosforilacije. Kancerske ćelije u povećanoj meri konzumiraju glukoze jer teže da modifikuju svoj metabolizam u pravcu anaerobnog metabolizma, čak i kada snabdevanje kiseonikom ne predstavlja ograničavajući faktor. Ovaj fenomen, koji je prvi zapazio Warburg (3), javlja se usled preterane ekspresije HIF (hypoxia induced factor, hipoksijom indukovani faktor) i Myc proonkogena. HIF povećava konverziju piruvata u laktat, anaerobno, inaktiviranjem piruvat-dehidrogenaze koja je ključni enzim aerobne respiracije. Myc stimuliše biosintezu glutamina uključenog u anaerobnu respiraciju (4).

U tom kontekstu, u toku su klinička ispitivanja kojima se deluje na energetski metabolizam. kao primeri, mogu se pomenuti (4):

- metformin: inhibitor mitohondrijalnog respiratornog kompleksa I, čime se indukuje AMPK koja usporava proliferaciju ćelija;

- foretin: sredstvo za smanjenje importa glukoze;

- fenilacetat: sredstvo za smanjenje nivoa glutamina;

- dihloroacetat: inhibitor piruvat-dehidrogenaze.

Svi ovi molekuli, izuzev dihloroacetata, su testirani (faza II kliničkih ispitivanja), a zapažanja još uvek nisu poznata.

Sada je nađeno da derivati sterola koji ciljaju specifičan aspekt energetskog metabolizma astrocita, tipa ćelija koji je u osnovi porekla GBM, mogu da se koriste za lečenje multiformnog glioblastoma.

Originalni aspekt pronalaska predstavlja korišćenje posebnog energetskog metabolizma astrocitnih ćelija (glijskog porekla) čija transformacija na kraju dovodi do formiranja GBM.

U stvari, astrocitne ćelije se istovremeno snabdevaju energijom u vidu ATP, korišćenjem oksidativne fosforilacije (Krebs-ov ciklus kuplovan sa transportom elektrona u mitohondrijama) i glikolize: u ovom drugom slučaju, piruvat ne ulazi u Krebs-ov ciklus nego se redukuje u laktat pomoću ezima laktat-dehidrogenaze (LDH) tipa 5. Pored toga što se njome snabdevaju ATP, astrociti koriste glikolizu, preko proizvodnje laktata, za snabdevanje susednih ćelija, neurona, neurotransmiterom (glutamat).

U sledećoj tabeli, energetski metabolizam astrocita, normalnih i kancerskih, upoređen je šematski sa metabolizmom drugih ćelija:

Energetski metabolizam astrocita je poseban: u stvari, respiracija u mitohondrijama i glikoliza funkcionišu usklađeno.

Ovaj specifični metabolički dualizam normalne astrocitne ćelije, mitohondrijalna respiracija sa jedne strane i glikoliza sa druge, ono je što čini osnovu strategije za pripremanje sterolnih derivata prema pronalasku.

U stvari, pronalazači iznose radnu hipotezu prema kojoj derivati sterola prema pronalasku, mogu preusmeriti energetski metabolizam kancerskih astrocitnih ćelija sa glikolize ka mitohondrijalnoj respiraciji, što je postupak koji bi doveo do njihove smrti.

7 β-hidroksiholesterol (7 β-OHCH), molekul sa visokim antikancerskim potencijalom (5,6), upadljivo je citotoksičan za imortalizovane (spontano transformisane) linije astrocita pacova (7,8) i GBM (pacovska C6 linija) "in vitro" (9). Studije pokazuju da je esterifikacija 7 β-OHCH na C3-OH unutarćelijskim masnim kiselinama (formiranje 7 β-OHCH-C3-estra) snažno uključena u toksični efekat roditeljskog molekula, 7 β-OHCH (7, 8, 10).

Međutim, mehanizam delovanja 7 β-OHCH, bilo da je esterifikovan na C3-OH ili ne, na GBM "in vitro" daleko je od toga da bude objašnjen. Nedavno, studije sprovedene na C6 linijama pokazale su da 7 β-OHCH moduliše arhitekturu i dinamiku raftova, mikrodomena u ćelijskoj membrani, koji su mesta inicijacije određenih ćelijskih mesindžera uključujući one od protein-kinaze Akt, enzima ključnog za energetski metabolizam ćelije (11). Ustvari, narušavanjem arhitekture raftova, oksisterol posledično utiče na aktivnost Akt, posebno tokom transformacije normalnih ćelija u kancerske ćelije: u ovim ćelijama Akt reguliše usvajanje glukoze i glikolitičku aktivnost.

Neočekivano, nađeno je da derivati sterola prema pronalasku, koji imaju 7-betahidroksiholesterolsku osnovnu strukturu i nose supstituente na poziciji 3 i protektivne grupe na poziciji 7, istovremeno omogućavaju inhibiciju glikolize, esencijalnu za snabdevanje kancerskog astrocita visokog stadijuma energijom i, u isto vreme, obnavljaju respiraciju u mitohondrijama, što je takođe "letalno" za ovu ćeliju.

U stvari, ovo dvojno delovanje dovodi do "prekomernog zagrevanja" kancerske ćelije, dovodeći i do njene smrti.

Pored toga, pokazano je da derivati sterola prema pronalasku, deluju i na matične ćelije, čime omogućavaju potpunu destrukciju ćelija glioblastoma.

Aktivnost derivata sterola prema pronalasku u vezi sa glioblastomom takođe označava da njihova upotreba može biti predviđena u lečenju malignih hemopatija mijeloidnog tipa, zahvaljujući sličnosti ćelijskog metabolizma mijeloidne ćelije sa onim kod astrocite; u lečenju neuroblastoma, neorona koji imaju isto embrionalno i ćelijsko poreklo kao astrocita; i u lečenju melanoma, s obzirom na to da melanocite imaju isto embrionalno poreklo kao astrocite, kao što će biti objašnjeno kasnije.

Pored toga, činjenica da mijeloidna linija i limfoidna linija imaju zajednično poreklo, naime pluripotentna hematopoetska matična ćelija, označava da je takođe moguće predvideti upotrebu derivata sterola prema pronalasku za lečenje limfoma.

Pronalazak se prema tome odnosi na jedinjenja formule (I)

izabrana od sledećih jedinjenja:

- 7-((terc-butoksikarbonil)oksi)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2-(2-(((benziloksi)karbonil)amino)-acetamido)propanoat (molekul 1.a);

- 7-acetoksi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2-(2-(((benziloksi)karbonil)amino)-acetamido)propanoat (molekul 1.b);

- 7-((terc-butoksikarbonil)oksi)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-karboksilat (molekul 2.a);

- 7-acetoksi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-karboksilat (molekul 2.b),

za upotrebu u lečenju malignih hemopatija.

Jedinjenja formule (I) mogu da se dobiju iz holesterola metodom koji uključuje sledeće korake:

- protektovanje hidroksilne funkcije na poziciji 3 holesterola protektivnom grupom kao što je, na primer, aciloksi R9-C(O)- grupa u kojoj je R9grupa supstituisani ili nesupstituisani C1-C6alkil ili supstituisana ili nesupstituisana aril grupa, naročito arilalkoksikarbonil grupa,

- uvođenje ketonske funkcije na poziciji 7,

- redukcija ketonske funkcije u hidroksilnu funkciju,

- uvođenje protektivne grupe na hidroksilnoj funkciji na poziciji 7, koja odgovara B grupi, kao što je na primer acil, aril ili alkoksikarbonil grupa, ili aciloksi R10-C(O) grupa u kojoj R10je supstituisan ili nesupstituisan C1-C6alkil, aril, nesupstituisan ili supstituisan sa najmanje jednim linearnim ili granatim C1-C6alkilom, ili C5-C14heteroarilom, nesupstituisan ili supstituisan sa najmanje jednim linearnim ili granatim C1-C6alkilom ili najmanje jedna grupa izabrana od OR, NHR i SR, kao što je ovde definisano,

- deprotektovanje hidroksilne funkcije na poziciji 3.

Posle deprotektovanja hidroksilne funkcije na poziciji 3, pomenuta hidroksilna funkcija može biti supstituisana željenom A grupom.

Uvođenje funkcionalne grupe ketona na položaj 7 može se izvesti uobičajenim postupcima oksidacije.

Redukcija funkcionalne grupe ketona do hidroksil funkcionalne grupe, selektivno na položaju β, može se izvesti na primer pomoću Luche-ovog postupka upotrebom NaBH4u prisustvu cerijum hlorid heptahidrata (12).

Farmaceutske smeše ili lekovi koji sadrže najmanje jedno jedinjenje formule (I) i farmaceutski prihvatljiv nosač mogu da se sastoje od lipozomalnog preparata koji sadrži najmanje jedno jedinjenje formule (I). Lipozomi mogu da se proizvedu različitim tehnikama koje su poznate stručnjaku u oblasti. Mogu se koristiti različiti lipidi koji čine lipozome [Medical Application of Liposomes (1986) edited by Kunio Yagi, Japan Scientific Societies Press, Tokyo, Karger].

Alternativno, navedeni lipozom može da se sastoji od takozvanog "poboljšanog" lipozoma koji ima raspodelu veličine pretežno između 40 i 80 nm i sa kompozicijom koja je stabilna u vremenu ili takozvanog "koncentrovanog" lipozoma koji ima istu raspodelu veličina, ali koji sadrži višu koncentraciju aktivnog molekula, naročito 50% višu od one od "poboljšanog" lipozoma.

"Poboljšani" lipozom se može dobiti pomoću postupka pripreme koji sadrži sledeće korake:

- dovođenje u kontakt aktivnog molekula koji će biti uključen u lipozom i fosfolipida u organskom rastvaraču,

- isparavanje rastvarača pod strujom azota tako da se dobije lipidni film,

- rastvaranje lipidnog filma u organskom rastvaraču,

- isparavanje navedenog rastvarača pod strujom azota i apsorbovanje lipidnog filma u vodeni pufer

- ultrazvučna obrada u ultrazvučnom kupatilu,

- dobijanje vezikula ekstruzijom.

Poželjno, ultrazvučna obrada je izvedena tokom 10 pulseva jedne min na temperaturi od oko 20°C. Ekstruzija može biti izvedena na PVDF-tipu membrane koja ima veličinu pora od 200 nm.

"Koncentrovani" lipozomi mogu biti dobijeni pomoću postupka pripreme koji sadrži korake:

- dovođenja u kontakt aktivnog molekula koji se uključuje u lipozom i količine fosfolipida koja je viša od one korišćene u uobičajenim tehnikama, naročito dva puta uobičajena količina, u organskom rastvaraču,

- isparavanja rastvarača pod sniženim pritiskom tako da se dobije lipidni film,

- rastvaranja lipidnog filma u organskom rastvaraču,

- isparavanja navedenog rastvarača pod sniženim pritiskom i apsorbovanja lipidnog filma u vodenom puferu,

- ultrazvučne obrade u ultrazvučnom kupatilu,

- dobijanja vezikula ekstruzijom.

Poželjno, ultrazvučna obrada je izvedea tokom 20 pulseva od jedne min na temperaturi od oko 20°C. Ekstruzija može biti izvedena na PVDF-titu membrane koja ima veličinu pora od 200 nm.

Poželjno, isparavanje je izvedeno na pritisku ispod oko 3kPa (30 mbar) i na temperaturi kupatila od 25°C. Rotacioni isparivač je poželjno korišćen.

Količina aktivnog molekula u odnosu na fosfolipid može biti, na primer, približno 15%, izražena u tež.%.

Poželjni lek se sastoji od lipozoma napunjenog sa najmaje jednim jedinjenjem formule (I).

Poželjno, jedinjenje (jedinjenja) formule (I) kao što je definisan u prethodnom tekstu čini/čine samo aktivni sastojak (sastojci) sadržan(i) u farmaceutskoj smeši prema pronalasku, naročito kada je navedena farmaceutska smeša lipozom. Navedeni lipozom koji sadrži najmanje jedno jedinjenje formule (I) kao što je definisano u prethodnom tekstu može biti primenjivano, na primer, oralnim putem ili parenteralnim putem.

Alternativno, jedinjenje formule (I) kao što je definisano u prethodnom tekstu može da se koristi u kombinaciji sa drugim aktivnim sastojkom, kao što je na primer antikancersko sredstvo, posebno derivati avastina, irinotekana, temozolomida ili taksola. Farmaceutske smeše mogu biti u bilo kojoj formi pogodnoj za oralnu primenu ili za parenteralnu primenu, posebno injekcijom, infuzijom ili inhalacijom, što je poznato stručnjaku u oblasti.

Posebno, pomenuta farmaceutska smeša može da bude farmaceutski prihvatljivi rastvor, posebno alkoholni rastvor, najmanje jednog jedinjenja formule (I) kao što je definisano u prethodnom tekstu, samog ili u kombinaciji sa drugim aktivnim sastojkom, koji pacijentu može da se daje transfuzijom ili infuzijom.

Navedena farmaceutska kompozicija može, naročito, biti pogodna za primenu oralnim ili sublingvalnim putem. Pored uobičajenih farmaceutskih oblika, na primer tableta, kapsula, praškova, granula, rastvora, emulzija, oralnih suspenzija, kapi, sirupa, itd., oralne farmaceutske smeše prema pronalasku mogu da sadrže komplekse jedinjenja formule (I) kao što su definisani u prethodnom tekstu sa žučnim solima, ili, na primer, kombinacije jedinjenja formule (I) kao što su definisani u prethodnom tekstu sa fosfolipidima, kao što je fosfatidilholin, u lipozomalnom ili nelipozomalnom obliku.

Jedinjenja formule (I), mogu biti korišćena u lečenju bolesti u koje su uključene transformisane astrocitne ćelije, posebno u lečenju multiformnog glioblastoma ili astrocitoma stadijuma IV (GBM). Posebno, jedinjenja formule (I) mogu da se injektiraju direktno u cerebralni korteks, na mesto tretmana.

Pronalazak se odnosi na lečenje drugih kancera, naime malignih hemopatija mijeloidnog tipa i limfoma, neuroblastomaa i melanoma.

Jedinjenja formule (I) kao što su definisani u prethodnom tekstu, za upotrebu u lečenju malignih hemopatija mijeloidnog tipa, su predmet pronalaska.

Pronalazak se odnosi na lečenje malignih hemopatija mijeloidnog tipa, primenom efikasne količine najmanje jednog jedinjenja formule (I) kao što je definisano u prethodnom tekstu.

Maligne patologije mijeloidnog tipa razvijaju se od normalne mijeloidne ćelije. Sada, ovaj ćelijski tip, u normalnom stanju, ima energetski metabolizam prilično sličan onom od astrocite: on proizvodi svoju energiju iz mitohondrijalne respiracije i iz glikolize (laktatni put; LDH) (13). U slučaju kancera mijeloidnog porekla, ćelije kancera proizvode svoju energiju iz glikolize. Kao za GBM, anti-kancerska aktivnost jedinjenja formule (I) bila bi posledica inhibicije LDH (glikoliza) i, posledično, pregrevanje ćelije uzrokovano visokom eksplozijom mitohondrijalne respiracije.

[0050] Jedinjenja formule (I) izabrana od sledećih jedinjenja:

- 7-((terc-butoksikarbonil)oksi)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2-(2-(((benziloksi)karbonil)amino)-acetamido)propanoat (molekul 1.a);

- 7-acetoksi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2-(2-(((benziloksi)karbonil)amino)-acetamido)propanoat (molekul 1.b);

- 7-((terc-butoksikarbonil)oksi)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-karboksilat (molekul 2.a);

- 7-acetoksi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-karboksilat (molekul 2.b), za upotrebu u lečenju limfoma, takođe su predmet pronalaska.

1

Pronalazak se takođe odnosi na lečenje limfoma, primenom efikasne količine najmanje jednog jedinjenja formule (I) kao što je definisano u prethodnom tekstu.

Ustvari, kako mijeloidna linija i limfoidna linija imaju zajedničko poreklo, koje je pluripotentna hematopoetska matična ćelija, aktivnost jedinjenja formule (I) kao što su definisana u prethodnom tekstu na maligne hemopatije mijeloidnog tipa označava da njihova upotreba takođe može biti predviđena za lečenje limfoma.

Jedinjenja formule (I) izabrana od sledećih jedinjenja:

- 7-((terc-butoksikarbonil)oksi)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2-(2-(((benziloksi)karbonil)amino)-acetamido)propanoat (molekul 1.a);

- 7-acetoksi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2-(2-(((benziloksi)karbonil)amino)-acetamido)propanoat (molekul 1.b);

- 7-((terc-butoksikarbonil)oksi)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-karboksilat (molekul 2.a);

- 7-acetoksi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-karboksilat (molekul 2.b), za upotrebu u lečenju neuroblastoma, takođe su predmet pronalaska.

Pronalazak se takođe odnosi na lečenje neuroblastoma, primenom efikasne količine najmanje jednog jedinjenja formule (I) kao što je definisano u prethodnom tekstu.

U vezi sa neuroblastomima, koji uglavnom utiču na ekstrakranijalni simpatički nervni sistem, jedinjenja formule (I) ispoljavaju anti-tumorsku aktivnost zbog toga što, kao sa astrocitom, neuron ima isto embrionalno poreklo, sa jedne strane, naime ektoderm, i ćelijsko poreklo, sa druge strane, naime neuroepitelijalne ćelije (14). Ukratko, astrocita i neuron su obe nervne ćelije i jednako su podložne jedinjenjima formule (I).

Jedinjenja formule (I) izabrana od sledećih jedinjenja:

- 7-((terc-butoksikarbonil)oksi)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2-(2-(((benziloksi)karbonil)amino)-acetamido)propanoat (molekul 1.a);

- 7-acetoksi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2-(2-(((benziloksi)karbonil)amino)-acetamido)propanoat (molekul 1.b);

- 7-((terc-butoksikarbonil)oksi)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-karboksilat (molekul 2.a);

- 7-acetoksi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-karboksilat (molekul 2.b), za upotrebu u lečenju melanoma, takođe su predmet pronalaska.

Pronalazak se takođe odnosi na lečenje melanoma, primenom efikasne količine najmanje jednog jedinjenja formule (I) kao što je definisano u prethodnom tekstu.

Ustvari, melanociti, koji su poreklom od melanoma, izvedeni su iz nervnog grebena, koji je sam izveden iz ektoderma (14). S obzirom na to da su astrociti i neuroni takođe izvedeni iz ektoderma, i jedinjenja formule (I) ispoljavaju anti-GBM i antineuroblastoma aktivnost, ova jedinjenja takođe će verovatno imati anti-kancerske osobine u vezi sa melanomima.

Alternativno, pomenuti tretman je sekvencijalni tretman koji uključuje najmanje jedan korak primene prvog jedinjenja formule (I) kao što je definisano u prethodnom tekstu i najmanje jedan korak primene drugog jedinjenja formule (I) kao što je definisano u prethodnom tekstu, različitog od prvog.

Sledeći primeri ilustruju pronalazak, ali ga ne ograničavaju. Odeljak I razmatra hemijsku sintezu.

Primeri 1 i 2 razmatraju pripremu intermedijara sinteze, koji se koriste za pripremanje jedinjenja formule (I). Primeri 3 do 6 razmatraju pripremu jedinjenja formule (I).

Odeljak II razmatra biološku aktivnost jedinjenja formule (I).

I/ Hemijska sinteza

Primer 1: Pripremanje 7-beta-acetilholesterola (jedinjenje 1.4)

[0063] Dijagram reakcije prikazan je na Slici 1.

1) Pripremanje jedinjenja 1.1

Korišćeni su sledeći reagensi:

Holesteril-benzoat, mešavina dioksan/voda, natrijum-hlorit i N-hidroksiftalimid stave se tim redom u 1-litarski trogrli flakon opremljen kondenzorom. Mešavina se zagreva na 50°C, 6 h. Tok reakcije prati se TLC na silicijumskoj ploči (TLC silika gel 60 F254, Merck) u heksanu/Et2O 8/2.

Kada stopa formiranja dostigne prihvatljivu vrednost, sirova reakciona mešavina se ulije u 10% rastvor natrijum-sulfita (500 ml), a zatim ekstrahuje etrom. Dobijena organska faza se ispere zasićenim rastvorom natrijum-hidrogenkarbonata, zatim vodom i na kraju zasićenim slanim rastvorom. Ova organska faza se onda suši preko natrijum-sulfata, filtrira i potom evaporiše pod sniženim pritiskom.

Dobijena obojena uljasta rezidua se zatim prečisti rekristalizacijom u etanolu. Kako dobijena bela čvrsta supstanca nije zadovoljavajuće čistoće, ponovo se prečišćava

1

hromatografijom na silika gelu (silika SDS 60A, 35-70 µm). Čvrsti talog se dobija preuzimanjem ovog ulja u dihlorometan. Prečišćavanje se obavlja u eluentu u opsegu od 98/2 do 90/10 heksana/etil-acetata. Proizvod se dobija u vidu bele čvrste supstance. Prinos: 23%

Analize: Analiza pomoću<1>H NMR u CDCl3, BRUKER 400 MHz. HPLC kolona normalno-fazna CHIRALCEL O-DH (ODH0CE-CE026 kolona), eluent 9/1 heksan/iProH, 20 min, talasna dužina 190 nm.

Vreme retencije 6.682 min, HPLC čistoća 99.2%.

<1>H NMR (CDCl3, 400.13 MHz): δ 0.71 (s, 3H, CH3), 0.89 (dd, 6H, 2CH3), 0.94 (d, 3H, CH3), 1.02-2.78 (m, 26H), 1.27 (s, 3H, CH3), 4.99 (m, 1H, CH), 5.76 (d, 1H, CH), 7.44-8.05 (m, 5H, CHAr).

2) Pripremanje jedinjenja 1.2

Korišćeni su sledeći reagensi:

Ketoholesteril-benzoat, mešavina rastvarača THF/MeOH i hidratisani cerijum-hlorid stave se u 500 ml-ski flakon. Sirova reakciona mešavina se zatim ohladi na 0°C u ledenom kupatilu, pre nego što joj se polako doda natrijum-borohidrid. Zapaža se emitovanje gasa, ledeno kupatilo se održava 1 h, zatim se vrši mešanje na temperaturi okoline, 18 h. Tok reakcije se prati pomoću TLC (TLC silika gel 60 F254, Merck) u eluentu 80/20 heksan/EtOAc. Ako je stopa formiranja nedovoljna, doda se 0.5 ekv. natrijum-borohidrida.

Sirovoj reakcionoj mešavini doda se 50 ml vode i 200 ml dihlorometana. Posle prebacivanja u separacioni levak, izdvoji se organska faza. Vodena faza se ponovo ekstrahuje sa DCM. Organske faze se kombinuju, isperu 1 N rastvorom hlorovodonične kiseline i zatim zasićenim rastvorom NaCl.

Organska faza se zatim suši preko natrijuma-sulfata, filtrira i evaporiše pod sniženim pritiskom, dajući blago obojeno ulje, koje spontano podleže kristalizaciji.

Čvrsti talog se dobija preuzimanjem rezidue u DCM. Ovaj sirovi proizvod se prečisti na koloni od silika gela (silika SDS 60A, 35-70 µm) u eluentu 9/1 heksan/EtOAc. Proizvod se dobija u vidu bele čvrste supstance.

Prinos: 89%

Analiza: Analiza pomoću<1>H NMR u CDCl3, BRUKER 400 MHz. HPLC kolona normalno-fazna CHIRALCEL O-DH (ODH0CE-CE026 kolona), eluent 9/1 heksan/iProH, 20 min, talasna dužina 190 nm.

Vreme retencije 7.076 min, HPLC čistoća 98.8%.

<1>H NMR (CDCl3, 400.13 MHz): δ 0.63 (s, 3H, CH3), 0.79 (dd, 6H, 2CH3), 0.85 (d, 3H, CH3), 0.89-2.43 (m, 27H), 1.04 (s, 3H, CH3), 3.81 (d, 1H, CH), 4.81 (m, 1H, CH), 5.29 (d, 1H, CH), 7.34-7.99 (m, 5H, CHAr).

3) Pripremanje jedinjenja 1.3

1

Korišćeni su sledeći reagensi:

7-β-hidroksiholesteril-benzoat, piridin, i zatim sirćetni anhidrid stave se u 100 ml-ski flakon. Mešavina se meša na temperaturi okoline,16 h. Tok reakcije se prati pomoću TLC (TLC silika gel 60 F254, Merck) u eluentu 9/1 heksan/EtOAc.

Sirova reakciona mešavina evaporiše pod sniženim pritiskom. Obave se dve koevaporacije sa etil-acetatom. Dobijena rezidua se preuzme u etil-acetat. Tako dobijena organska faza se ispere 1 N hlorovodoničnom kiselinom, suši preko natrijumsulfata i zatim evaporiše pod sniženim pritiskom.

Dobijena bela čvrsta supstanca uvodi se u sledeći korak direktno, bez dodatnog prečišćavanja.

Prinos: 100%

Analiza: Analiza pomoću<1>H NMR u CDCl3, BRUKER 400 MHz. HPLC kolona normalno-fazna CHIRALCEL O-DH (ODH0CE-CE026 kolona), eluent 9/1 heksan/iProH, 20 min, talasna dužina 190 nm.

Vreme retencije 4.972 min, HPLC čistoća 99.6%.

<1>H NMR (CDCl3, 400.13 MHz): δ 0.63 (s, 3H, CH3), 0.79 (dd, 6H, 2CH3), 0.84 (d, 3H, CH3), 0.91-2.41 (m, 26H), 1.06 (s, 3H, CH3), 1.95 (s, 3H, CH3acetil), 4.78 (m, 1H, CH), 4.99 (d, 1H, CH), 5.21 (s, 1H, CH), 7.33-7.98 (m, 5H, CHAr).

1

4) Pripremanje jedinjenja 1.4

Korišćeni su sledeći reagensi:

7-β-acetilholesteril-benzoat i 1% rastvor natrijum hidroksida u metanolu stave se u 100 ml-ski flakon. Mešavina se meša na temperaturi okoline do potpunog rastvaranja. Tok reakcije se prati pomoću TLC (TLC silika gel 60 F254, Merck) u eluentu 7/3 heksan/EtOAc.

Da bi se reakcija okončala, sirova mešavina može da se zagreje na 40°C, u tom slučaju praćenje pomoću TLC vrši se svakih 20 minuta.

Doda se 200 ml etil-acetata i 50 ml vode, što je praćeno prenošenjem u separacioni levak i separacijom faza. Vodena faza se ponovo ekstrahuje etil-acetatom. Organske faze se kombinuju, suše preko natrijum-sulfata, filtriraju i zatim evaporišu pod sniženim pritiskom dajući uljastu reziduu.

Rezidua se preuzme u etil-acetat da bi se pripremio čvrsti talog. Prečišćavanje se obavlja na koloni od silika gela (silika SDS 60A, 35-70 µm) u eluentu heksan/EtOAc, u opsegu od 9/1 to 7/3. Očekivani proizvod se dobija u vidu bezbojnog ulja koje se kristalizuje spontano, dajući belu čvrstu supstancu. Kolona se spira 100% etil-acetatom da bi se izdvojio formirani 7-β-hidroksiholesterol.

Prinos: 38%

1

Analiza: Analiza pomoću<1>H NMR u CDCl3, BRUKER 400 MHz. HPLC kolona normalno-fazna CHIRALCEL O-DH (ODH0CE-CE026 kolona), eluent 9/1 heksan/iProH, 20 min, talasna dužina 190nm.

Vreme retencije 6.186 min, HPLC čistoća 91.7%.

<1>H NMR (CDCl3, 400.13 MHz): δ 0.62 (s, 3H, CH3), 0.78 (dd, 6H, 2CH3), 0.85 (d, 3H, CH3), 0.86-2.28 (m, 27H), 1.03 (s, 3H, CH3), 1.96 (s, 3H, CH3acetil), 3.47 (m, 1H, CH), 4.94 (td, 1H, CH), 5.13 (t, 1H, CH).

Primer 2: Pripremanje 7-beta-terc-butiloksikarbonilholesterola (jedinjenje 1.6)

[0086] Dijagram reakcije prikazan je na Slici 2.

[0087] Jedinjenje 1.6 priprema se od jedinjenja 1.2 iz Primera 1.

1) Pripremanje jedinjenja 1.5

Korišćeni su sledeći reagensi:

1

7-β-hidroksiholesteril-benzoat, rastvarač, 2,6-dimetilaminopiridin i zatim tercbutiloksikarbonilni anhidrid stave se u 100 ml-ski jednogrli flakon. Mešavina se meša na tempeaturi okoline do potpunog rastvaranja. Tok reakcije prati se pomoću TLC u eluentu 8/2 heksan/EtOAc.

Doda se 50 ml EtOAc i 10 ml vode. Tako dobijena organska faza suši se preko natrijum-sulfata, filtrira i zatim evaporiše pod sniženim pritiskom dajući uljastu reziduu. Rezidua se preuzme u EtOAc da bi se pripremio čvrsti talog. Prečišćavanje se obavlja na koloni od silika gela u eluentu 95/5 heksan/EtOAc.

Analiza: Analiza pomoću<1>H NMR u CDCl3.

<1>H NMR (CDCl3, 400.13 MHz): δ 0.59 (s, 3H, CH3), 0.77 (dd, 6H, 2CH3), 0.84 (d, 3H, CH3), 0.86-1.98 (m, 24H), 1.09 (s, 3H, CH3), 1.41 (s, 9H, 3CH3, t-Boc), 2.42 (m, 2H, CH2), 4.80 (m, 1H, CH), 4.91 (d, 1H, CH), 5.18 (s, 1H, CH), 7.34-7.97 (m, 5H, CHAr).

2) Pripremanje jedinjenja 1.6

[0094] Korišćeni su sledeći reagensi:

7-β-t-butiloksikarbonilholesteril-benzoat i 1% rastvor natrijum hidroksida u metanolu stave se u 50 ml-ski jednogrli flakon. Ova mešavina se meša na temperaturi okoline do potpunog rastvaranja. Tok reakcije se prati pomoću TLC u eluentu 7/3 heksan/EtOAc. Da bi se kompletirala reakcija, sirova mešavina se zagreva do 40°C.

1

Doda se 100 EtOAc i 20 ml vode. Vodena faza se ponovo ekstrahuje pomoću EtOAc. Organske faze se kombinuju, suše preko natrijum-sulfata, filtriraju i zatim evaporišu pod sniženim pritiskom dajući uljastu reziduu.

Rezidua se preuzme u EtOAc da bi se pripremio čvrsti talog. Prečišćavanje se odvija na koloni od silika gela u eluentu heksan/EtOAc u opsegu od 9/1 do 7/3. Kolona se ispira sa 100% EtOAc da bi se izdvojio formirani 7-β-hidroksiholesterol.

Analiza: Analiza pomoću<1>H NMR u CDCl3.

<1>H NMR (CDCl3, 400.13 MHz): δ 0.60 (s, 3H, CH3), 0.78 (dd, 6H, 2CH3), 0.84 (d, 3H, CH3), 0.91-2.29 (m, 27H), 0.97 (s, 3H, CH3), 1.41 (s, 9H, 3CH3, t-Boc), 3.47 (m, 1H, CHB), 4.77 (td, 1H, CHC), 5.17 (t, 1H, CHA).

Primer 3: Pripremanje 7-((terc-butoksikarbonil)oksi)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a] fenantren-3-il 2-(2-(((benziloksi)karbonil)amino)acetamido) propanoata (molekul 1.a)

Pojednostavljeno ime: 3-benziloksikarbonil-glicinil-alanil-7-β-O-terc-butiloksikarbonil-holesterol

Molekul 1.a priprema se od intermedijarnog jedinjenja 1.6.

[0099] Koriste se sledeći reagensi:

2

80 mg (0.16 mmol) 7-β-t-butiloksikarbonilholesterola, 68 mg (0.24 mmol, 1.5 ekv.) dipeptida, 6 ml mešavine rastvarača (THF/DCE 1:1), 50 mg (0.24 mmol, 1.5 ekv.) DCC i 30 mg (0.24 mmol, 1.5 ekv.) DMAP stave se u 10 ml-sku Wheaton-ovu bocu. Sirova reakciona mešavina meša se 24 h na temperaturi okoline. Tok reakcije se prati pomoću TLC u eluentu 7/3 heksan/etil-acetat.

U sirovi proizvod reakcije doda se 30 ml etil-acetata i 10 ml vode. Organska faza se izdvoji, suši preko natrijum-sulfata, filtrira i zatim evaporiše pod sniženim pritiskom. Dobijena uljasta rezidua preuzme se u etil-acetat da bi se pripremio čvrsti talog.

Prečišćavanje se obavlja na koloni od silika gela u eluentu 7/3, zatim 6/4, heksan/etilacetat.

Analiza: Analiza pomoću<1>H NMR u CDCl3.

<1>H NMR (CDCl3, 400.13 MHz): δ 0.60 (s, 3H, CH3), 0.79 (dd, 6H, 2CH3), 0.83 (d, 3H, CH3), 0.94-1.88 (m, 24H), 0.98 (s, 3H, CH3), 1.19 (s, 3H, CH3Ala), 1.40 (s, 9H, 3CH3, t-Boc), 2.27 (m, 2H, CH2), 3.83 (m, 2H, CH2), 4.47 (td, 1H, CH Ala), 4.47 (m, 1H, CH), 4.78 (td, 1H, CH), 5.07 (s, 2H, CH2Gly), 5.22 (t, 1H, CH), 5.23 (m, 1H, NH), 6.41 (sl, 1H, NH), 7.29 (m, 5H, CHAr).

Primer 4: Pripremanje 7-acetoksi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2-(2-(((benziloksi)karbonil)amino)-acetamido) propanoata (molekul 1.b)

Pojednostavljeno ime: 3-benziloksikarbonil-glicinil-alanil-7-β-O-acetilholesterol

Molekul 1.b priprema se od intermedijarnog jedinjenja 1.4.

Koriste se sledeći reagensi:

60 mg (0.13 mmol) 7-β-acetilholesterola, 70 mg (0.19 mmol, 1.5 ekv.) dipeptida, 6 ml mešavine rastvarača (THF/DCE 1:1), 42 mg (0.19 mmol, 1.5 ekv.) DCC i 25 mg (0.19 mmol, 1.5 ekv.) DMAP stave se u 10 ml-sku Wheaton-ovu bocu. Sirova reakciona mešavina meša se 24 h na temperaturi okoline.

Tok reakcije se prati pomoću TLC u eluentu 7/3 heksan/etil-acetat. U sirovi proizvod reakcije doda se 30 ml etil-acetata i 10 ml vode. Organska faza se izdvoji, suši preko natrijum-sulfata, filtrira i zatim evaporiše pod sniženim pritiskom. Dobijena uljasta rezidua preuzme se u etil-acetat da bi se pripremio čvrsti talog.

Prečišćavanje se obavlja na koloni od silika gela u eluentu 7/3, zatim 6/4, heksan/etilacetat.

Analiza: Analiza pomoću<1>H NMR u CDCl3.

<1>H NMR (CDCl3, 400.13 MHz): δ 0.62 (s, 3H, CH3), 0.78 (dd, 6H, 2CH3), 0.84 (d, 3H, CH3), 0.91-1.83 (m, 25H), 1.01 (s, 3H, CH3), 1.17 (s, 3H, CH3Ala), 1.94 (s, 3H, CH3acetil), 2.27 (m, 2H, CH2), 3.82 (m, 1H, CH), 4.47 (td, 1H, CH Ala), 4.56 (m, 1H, CH), 4.95 (td, 1H, CH), 5.06 (s, 2H, CH2Gly), 5.17 (sl, 1H, CH), 5.37 (t, 1H, CH), 6.49 (dl, 1H, NH), 7.24 (m, 5H, CHAr).

Primer 5: Pripremanje 7-((terc-butoksikarbonil)oksi)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a] fenantren-3-il 2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-karboksilata (molekul 2.a) Pojednostavljeno ime: 3-(S)-2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-karboksil-7-β-O-tercbutiloksikarbonil-holesterol

1) Pripremanje dimetil -1,3-dioksolan-4-karboksilatne grupe

Koriste se sledeći reagensi:

Acetal, metanol i zatim litijum-hidroksid stave se u 50 ml-ski flakon. Ova mešavina se meša na temperaturi okoline 16 h.

Sirova reakciona mešavina evaporiše na sniženom pritisku. Dobijena rezidua se preuzme u 75 ml vode. Ova faza se zatim acidifikuje na 0°C do pH 1, 1 N hlorovodoničnom kiselinom, zatim ekstrahuje sa 2 x 100 ml etil-acetata. Organske faze se kombinuju, suše preko natrijum-sulfata, filtriraju i zatim evaporišu pod sniženim pritiskom, dajući blago obojenu uljastu reziduu.

Rezidua se direktno koristi u koraku kuplovanja, bez dodatnog prečišćavanja.

Analiza: Analiza pomoću<1>H NMR u DMSO, BRUKER 400 MHz.

<1>H NMR (CDCl3, 400.13 MHz): δ 1.32 (d, 3H, CH3), 1.42 (s, 3H, CH3), 4.14 (AB, 2H, CH2), 4.55 (dd, 1H, CH), 10.30 (sl, 1H, OH), 7.24 (m, 5H, CHAr).

Prinos: 94%

2

2) Pripremanje molekula 2.a

Molekul 2.a priprema se od intermedijarnog jedinjenja 1.4.

Koriste se sledeći reagensi:

50 mg (9.9 mmol) 7-β-t-butiloksikarbonilholesterola, 6 ml mešavine rastvarača (THF/DCE 1:1) i 16 mg (11.9 mmol, 1.2 ekv.) 3-(S)-2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-karboksilne kiseline stavi se u 10 ml-sku Wheaton-ovu bocu.

Mešanju sirove reakcione mešavine, 24 h na sobnoj temperaturi, prethodi dodavanje 24.5 mg (11.9 mmol, 1.2 ekv.) DCC i 14.5 mg (11.9 mmol, 1.2 ekv.) DMAP. Tok reakcije prati se pomoću TLC u eluentu 8/2 heksan/etil-acetat. Da bi se okončala reakcija, vrši se zagrevanje na 50°C, 2 h.

U sirovi proizvod reakcije doda se 30 ml etil-acetata i 10 ml vode. Organska faza se izdvoji, suši preko natrijum-sulfata, filtrira i zatim evaporiše pod sniženim pritiskom. Dobijena uljasta rezidua preuzme se u etil-acetat da bi se pripremio čvrsti talog.

Prečišćavanje se obavlja na koloni od silika gela u eluentu 95/5, zatim 9/1 heksan/etilacetat.

Analiza: Analiza pomoću<1>H NMR u CDCl3.

<1>H NMR (CDCl3, 400.13 MHz): δ 0.60 (s, 3H, CH3), 0.79 (dd, 6H, 2CH3), 0.83 (d, 3H, CH3), 0.74-1.97 (m, 25H), 0.98 (s, 3H, CH3), 1.33 (s, 3H, CH3acetal), 1.40 (s, 9H, 3CH3, t-Boc), 1.42 (s, 3H, CH3acetal), 2.29 (m, 2H, CH2), 4.08 (AB, 2H, CH2acetal), 4.48 (ddd, 1H, CH acetal), 4.63 (m, 1H, CH), 4.78 (td, 1H, CH), 5.22 (d, 1H, CH).

Primer 6: Pripremanje 7-acetoksi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-karboksilata (molekul 2.b)

Pojednostavljeno ime: 3-(S)-2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-karboksil-7-β-O-acetilholesterol

Molekul 2.b priprema se od intermedijarnog jedinjenja 1.4.

Koriste se sledeći reagensi:

2

Holesterol, mešavina rastvarača i kiselina stave se u 100 ml-ski flakon. Mešanju sirovog reakcionog proizvoda 24 h na temperaturi okoline prethodi dodavanje DCC i DMAP. Tok reakcije se prati pomoću TLC (TLC silika gel 60 F254, Merck) u eluentu 8/2 heksan/EtOAc.

U sirovu reakcionu mešavinu doda se 100 ml etil-acetata i 50 ml vode. Organska faza se izdvoji, suši preko natrijum-sulfata, filtrira i zatim evaporiše pod sniženim pritiskom. Dobijena uljasta rezidua preuzme se u etil-acetat da bi se pripremio čvrsti talog. Silika gel kolona (silica SDS 60A, 35-70µm) u eluentu 95/5, zatim 9/1 heksan/EtOAc.

Prinos: 68%

Analiza: Analiza pomoću<1>H i<13>C NMR u CDCl3BRUKER 400 MHz. HPLC kolona normalno-fazna CHIRALCEL O-DH (ODH0CE-CE026 kolona), eluent 9/1 heksan/iProH, 20 min, talasna dužina 190 nm.

Vreme retencije 5.291 min, HPLC čistoća 98.7%.

<1>H NMR (CDCl3, 400.13 MHz): δ 0.62 (s, 3H, CH3), 0.79 (dd, 6H, 2CH3), 0.84 (d, 3H, CH3), 0.91-2.30 (m, 27H), 1.01 (s, 3H, CH3), 1.33 (s, 3H, CH3acetal), 1.42 (s, 3H, CH3acetal), 1.93 (s, 3H, CH3acetil), 4.09 (AB, 2H, CH2acetal), 4.48 (dd, 1H, CH acetal), 4.62 (m, 1H, CH), 4.96 (td, 1H, CH), 5.18 (d, 1H, CH).

II/ Biološka aktivnost

A/ Protokoli

Za sve eksperimente koriste se sledeći protokoli:

1) Kulture ćelija

Koriste se plastične ploče za kulturu ćelija sa 96 bunarčića sa ravnim dnom (NUNC, USA) tretirane za ćelijsku kulturu (Sigma-Aldrich, ref. 114754); 1500 ćelija po bunarčiću zaseje se u 200 µl medijuma za kulturu. U vreme tretmana, 100 µl čistog

2

kultivacionog medijuma, 100 µl kultivacionog medijuma koji sadrži etanol, ili lipozome, ili 100 µl kultivacionog medijuma koji sadrži aktivne sastojke doda se u bunarčiće; finalna zapremina kultivacionog medijuma, posle tretmana, prema tome iznosi 300 µl za svaki bunarčić.

Kulture se inkubiraju u Sanyo inkubatoru (Japan, model MCO-19AIC-UV) na 37°C i u atmosferi sa 5% CO2i uz zasićenost vlagom. Ćelije se posmatraju invertnim mikroskopom (Nikon Eclipse TS100, Japan) i fotografišu kamerom (DIGITAL kamera sa c-mount; LABOVER, France). Komora za kulturu je mikrobiološki bezbedna komora MSC (thermo SCIENTIFIC, model HERA SAFE KS12, France).

Vreme udvostručavanja ćelija izračunava se upotrebom

Vreme udvostručavanja = (tb-ta) log(2) /( log(b) – log(a))

gde (a) i (b) predstavljaju broj ćelija u vreme a i b (b>a) (15).

Tranzicija se obavlja disocijacijom tripsinom (goveđi pankreas, tip 3, Sigma, France). Disocijacija ćelija obavlja se na temperaturi okoline, 30 minuta, uz korišćenje 0.04% (w/v) Tyrode-ovog KCl rastvora koji sadrži 0.05% (w/v) tripsin.

Posle disocijacije, ćelije se suspenduju u medijumu za kulturu pogodnom za ćelije, i broje se korišćenjem THOMA komore za brojanje ćelija i razblažuju u istom medijumu da bi se dobilo 1500 ćelija po bunarčiću.

a) Ćelijske linije

Koriste se sledeće ćelije glioblastoma:

• C6 linije.

Ćelijska linija tipa C6 dobijena je od Benda et al. (16) iz moždanih tumora pacova, indukovanih N-metilnitrozoureom. Ovaj tip ćelija koristi se kao "in vitro" i "in vivo" model za procenu anti-GBM potencijala. Linije su poreklom iz ranijeg Strasbourg Neurochemistry Centre (U44 INSERM and UPR 416 CNRS).

2

Kultivacioni medijum napravljen je od 70% minimalnog esencijalnog medijuma (Minimum Essential Medium, MEM; Fischer Scientifique, ref. 61100) i 30% Hankovog rastvora (SIGMA, ref. H 9269). U kultivacioni medijum dodaju se sledeći sastojci: fetalni teleći serum (fetal calf serum, FCS; Fischer Scientifique, ref. 10108165) u finalnoj koncentraciji od 5% (v/v), rastvor antibiotika ciprofloksacin-hidrohlorida 5 µg/mL (EUROMEDEX, ref. UC5074) i rastvor fungizona 2.5 µg/ml (INVITROGEN, ref. 15290-026). Vreme udvostručavanja za ovaj tip ćelija iznosi 17 h.

• GBM linije humanog porekla

Linije humanog glioblastoma (GBM, line U-87 MG) i njihov kultivacioni medijum (Eagle-ov minimalni esencijalni medijum, Eagle's Minimum Essential Medium ili EMEM) dobijeni su od ATCC (USA, ref. ATCC- HTB-14). Kultura ovih ćelija uspostavljena je i održavana prema preporukama ATCC. Ove linije se obično koriste "in vitro" i "in vivo" za testiranje anti-GBM potencijala. Vreme udvostručavanja za ove linije iznosi 16 h.

Korišćene su i sledeće primarne kulture humanih ćelija:

• Astrocitne ćelije

Astrocitne ćelije humanog porekla nabavljene su od ScienCell, USA (ref. 1800) kao i njihov kultivacioni medijum, napravljen od osnovnog medijuma koji sadrži 2% (v/v) FCS serum (ref. 0010), astrocitne proteine rasta (astrocyte growth proteins, AGS, ref.

1852) i rastvor penicilina/streptomicina (ref. 0503). Vreme udvostručavanja za ove humane astrocite iznosi 96 h.

• Ćelije jetre

Humanog porekla, dobijene su od ScienCell, USA (ref. 50200) kao i kultivacioni medijum (ref. 5201) koji sadrži 10% (v/v) FCS. Vreme udvostručavanja za ove ćelije iznosi 24 h.

2

• Ćelije bubrega

Ove ćelije, humanog porekla, dobijene su od ScienCell, USA (ref. 4120) kao i kultivacioni medijum (ref. 4101), koji sadrži 10% (v/v) FCS. Vreme udvostručavanja iznosi 96 h.

• Srčane ćelije

Ove ćelije, humanog porekla, dobijene su od ScienCell, USA (ref. 6300) kao i kultivacioni medijum, koji sadrži 10% (v/v) FCS. Vreme udvostručavanja je 72 h.

• Skeletne mišićne ćelije

Humanog porekla, dobijene su od ScienCell, USA (ref. 3500) kao i kultivacioni medijum (ref. 3501), koji sadrži 10% (v/v) FCS. Vreme udvostručavanja za ove ćelije iznosi 72 h.

Korišćene su i sledeće kulture kancerskih ćelija humanog porekla:

• Kancerske ćelije jetre

Dobijene su od ATCC (ref. ATCC-HB-8065). Kultivacioni medijum se sastoji od MEM (Gibco, USA; ref.51200) i 10% (v/v) FCS. Vreme udvostručavanja je 60 h.

• Ćelije kancera prostate

Dobijene su od ATCC (ref. ATCC-HTB-81). Kultivacioni medijum je isti kao i onaj koji se koristi za linije kancera jetre. Vreme udvostručavanja je 60 h.

• Ćelije kancera dojke

Dobijene su od ATCC (ref. ATCC-HTB-19). Kultivacioni medijum je isti kao i onaj koji se koristi za linije kancera jetre. Vreme udvostručavanja je 20 h.

2

• Karcinom debelog creva (linija HT29/219)

Dobijene su iz ECACC kolekcije (Ref. ECACC-85061109). Uslovi kulture su zasnovani na preporukama u Sigma-Aldrich informativnom letku.

• Neuroblastom (linija SH-SY5Y)

Dobijene su iz ATCC kolekcije (Ref. ATCC-CRL-2266). Uslovi kulture su zasnovani na preporukama u ATCC informativnom letku.

• Hronična mijelomonocitna leukemija (CMML)

Ćelije prečišćene iz uzoraka krvi pacijenata koji pate od hronične mijelomonocitne leukemije (CMML) dobijene su od Clinical Haematology Centre i Biotherapy Centre iz Saint Eloi Hospital (CHU de Montpellier). Kultivacija je izvedena pomoću tehnike zasejavanja hranljivog sloja. Ćelije su zasejane na hranljivom sloju koji nije pogođen tretmanima namenjenim za ćelije od interesa i koji ne menja puno fiziologiju ćelija od interesa. CMML ćelije su kultivisane na ćelijskim linijama poreklom od kičmene moćdine humanog embriona (17).

Za sve ove kulture važi da je uspostavljanje i održavanje kultura obavljeno je prema preporukama dobavljača.

b) Tretiranje kultura

Aktivni sastojci su rastvoreni u apsolutnom etanolu (AnalaR, NORMAPUR, VWR, France) ili su u obliku lipozomskog rastvora, na primer 10 µl stok-rastvora razblaži se u u 990 µl i zatim doda u bunarčiće za kulturu (200 µl kultivacionog medijuma) dajući koncentracije od 30.0, 15.0, 7.5 i 3.3 µM (finalna zapremina kultivacionog medijuma po bunarčiću BI-GBM: 300 µl).

Kada su aktivni sastojci rastvoreni u etanolu, kultivacioni medijum sadrži 3.3% etanola (v/v).

2) Pripremanje lipozoma

a) Osnovna metodologija opisana je u Werthle et al. (10).

Ukratko, jedinjenja koja će se testirati, naime, jedinjenja u skladu sa pronalaskom (aktivni sastojci) ili 7β-OHCH-C3-estar (derivat 7-beta-hidroksisterola esterifikovan na poziciji 3 oleatnom grupom, čija je sinteza opisana u Rakotoarivelo et al. (18) i služi kao kontrola), sojin fosfhatidilholin (Sigma) kao i holesteril-3-sulfat (Sigma) uzmu se iz stok rastvora pripremljenih od dihloroetana u slučaju aktivnih sastojaka i 7-β-OHCH-C3-estra, mešavine hloroform:metanol (9:1, v/v) u slučaju fosfatidilholina i hloroforma u slučaju holesteril-3-sulfata. Molarni odnosi su 1 M/0.1 M/0.25 M za fosfatidilholin, holesteril-3-sulfat i 7β-OHCH-C3-estar i aktivne sastojke, respektivno.

Posle evaporacije, suvom jedinjenju se doda rastvor PBS, bez Ca<2+>i Mg<2+>, pH 7.2 (BioRad). Zapremina pufera i masa proizvoda podešavaju se tako da se 20 ili 10 µl lipozoma dodatih u 90 µl kultivacionog medijuma daju željene finalne koncentracije. Lipozomi se formiraju tehnikom ekstruzije sa Liposofast (Sodexim, SA Muizon, France). Rastvor se propusti kroz polikarbonatne filtracione membrane (100 nm) 41 put. Lipozomi se sterilišu filtracijom na 22 µm Millipore membranama.

Za testove aktivnosti molekula na drugim humanim ćelijskim tipovima "in vitro", proizvodnja lipozoma je optimizovana na dva različita načina, kao što je opisano u prethodnom tekstu, naime u odnosu na homogenu raspodelu veličina, sa jedne strane, i u odnosu na koncentraciju aktivnog molekula, sa druge strane.

b) dobijanje lipozoma sa identičnom raspodelom veličina i sa kompozicijom koja je stabilna u vremenu ("poboljšani lipozomi").

Posle isparavanja rastvarača, lipidni film je ponovo rastvoren u dihloroetanu : etanolu (3.3 : 1.5; zapr.:zapr.) i rastvor je isparavan ponovo pod strujom azota. Jedan ml PBS je dodat uz snažno mešanje, lipidni ostatak je sastrugan tako da se ponovo rastvara, što je praćeno snažnim mešanjem u trajanju od 5 min, i zatim ultrazvučnom obradom od 10 ousleva od 1 min je primenjeno na temperaturi koja ne prelazi 20°C (Elma, S 60H, Elmasonic). Dobijene vezikule su ekstrudirane i sterilizovane kao što je opisano u prethodnom tekstu, osim što je rastvor samo propušten kroz filtracione membrane dva puta.

1

Ovi lipozomi imaju raspodelu veličinea od 40 do 80 nm i sadrže 0.086 mg/ml molekula 2.b.

c) Dobijanje lipozoma sa višom koncentracijom molekula 2.b. ("koncentrovani lipozomi").

Za pripremu lipidnog filma, koncentracija fosfatidilholina je udvostručena; koncentracija drugih jedinjenja ostaće identična onoj opisanoj u prethodnom tekstu za poboljšane lipozome.

Postupak za proizvodnju ovih lipozoma je identičan onome opisanom za poboljšane lipozome, osim što (1) ultrazvučna obrada je 20 pulseva od 1 min i (2) rastvarači su isparavani pod sniženim pritiskom (oko 3 kPa; 30 mbar) upotrebom rotacionog isparivača (Buchi, modeli V 850 i R 215).

Ovi lipozomi imaju raspodelu veličina od 40 do 80 nm i sadrže 0.133 mg/ml molekula 2.b.

Karakterizacija molekula koji grade lipozome, ispitivanje stabilnosti i kompozicije lipozoma izvedeni su posle ekstrakcije lipidnih jedinjenja prema postupku od Folch et al. (19), osim što je pre ekstrakcije, 500 µl rastvora lipozoma inkubirano sa 10 µl 2% (zapr.:zapr.) Triton X-100 (Sigma) na 40°C u trajanju od 18 časova.

Analiza masnih kiselina koje grade fosfatidilholin, posle metilacije prema rutinskim tehnikama, izvedena je pomoću gasne hromatografije sa masenom spektrometrijom (GC/MS).

Karakterizacija holinske grupe fosfatidilholina izvedena je prema postupku od Reineckate (20).

Molekul 2.b je kvantitativno određen pomoću HPLC kao što je opisano u prethodnom tekstu (priprema jedinjenja) ili pomoću hromatografije na tankom sloju silike kao što je opisano pod tačkom 5) u daljem tekstu.

Raspodela veličina lipozoma je merena na fluorescentnim lipozomima i morfometrijska analiza je izvedena pomoću Sert programa posle dobijanja slika sa epifluorescentnim mikroskopom (Axivert, Zeiss).

Fluorescentni lipozomi su proizvedeni sa istom količinom fosfatidilholina opisanom za poboljšane ili koncentrovane lipozome osim što korišćeni fosfatidilholin sadrži 5.0% fluorescentnog fosfatidilholina (NBD-PC-oleil; Avanti; ekscitacija/emisija= 460 nm/534 nm) u slučaju poboljšanih lipozoma i 2.5% u slučaju koncentrovanih lipozoma.

2

Lipozomi su istaloženi na staklenim pločicama za kulturu obloženim prvo sa poli-D-lizinom (Sigma, 1% u vodi, tež.:zapr.) i zatim sa lamininom (Sigma, 0.6% u vodi). Lipozomi su fiksirani sa glutaraldehidom (Merck) (lipozomi : glutaraldehid: PBS; 15 : 37.5 : 97.5, zapr.:zapr.:zapr.) pre dobijanja slika.

3) Merenje aktivnosti i toksičnosti

Isti metodi koriste se u oba slučaja. Za aktivnost, koristi se anti-GBM potencijal testnih jedinjenja, i toksičnostje testirana na normalnim ćelijama humanog porekla održavanim "in vitro".

Koriste se sledeći metodi merenja:

a) Brojanje ćelija

Koristi se metod brojanja ćelija na fotografijama.

Na primer, u slučaju kultura na pločama sa 96 bunarčića i kao funkcija uveličanja mikroskopa koje se koristi (objektivi x 10 ili x 20, okulari x 10), dobijene fotografije predstavljaju vidno polje dijametra koji je jednak 1/5 dijametra bunarčića. Prema tome, ukupan broj ćelija u bunarčiću jednak je broju ćelija po fotografiji pomnoženom sa 5. Ova tehnika je upoređena sa standardnom tehnikom (tripsinizacija ćelijskog sloja, centrifugiranje ćelija, suspendovanje ćelija u fiziološkom slanom rastvoru i brojanje uz korišćenje THOMA komore za brojanje ćelija) u slučaju C6 ćelija. Rezultati dobijeni ovim metodima su identični.

b) Proteinski test

Kultivacioni medijum se izvuče iz svakog bunarčića i 50 µl Laemmli pufera (0.1 ml Tris, 0.8 ml glicerola, 1.6 mL 10% SDS, 8 ml q.s. ultračiste vode) se doda u svaki bunarčić.

U kontrolne bunarčiće, doda se 10 µl rastvora goveđeg serum albumina, u različitom opsegu (kristalizovani BSA, Sigma); opseg je od 0 do 20 µg po bunarčiću. Bunarčići se zatim dopune sa 40 µl Laemmli pufera. Konačno, doda se 200 µl rastvora BCA reagensa (Pierce, USA; BCA Protein Assay Kit; ThermoScientific, France).

Ploče za kulturu se inkubiraju 30 min na 37°C. Optička gustina za svaki bunarčić očitava se i kvantifikuje pomoću čitača ploča (BioRad, USA, iMark Microplate reader 12222) na 570 nm.

c) Vijabilnost ćelija (MTT test)

Ovaj test omogućava detektovanje ćelijske respiracije, posebno respiracije u mitohondrijama. Stok rastvor tetrazolijumove soli MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolijum bromid, Sigma-Aldrich, USA, ref. M5655) pripremi se od 10 mg MTT/ml PBS pufera (fosfatom puferisani slani rastvor, SIGMA, ref. D 1408). Ovaj rastvor se dodaje direktno u kultivacioni medijum u svaki bunarčić; finalna koncentracijaMTT je 25 µg/ml. Ploča se zatim inkubira na 37°C najmanje 1 h.

Posle pojave plavih zrnaca formazana, proizvedenih uglavnom transportom elektrona u mitohondrijama, napravljene su fotografije da bi se izbrojale ćelije sa visokom gustinom granula formazana; ova tehnika koristi se u slučaju U87-MG linija. Zatim, za ovu liniju i za druge kulture, medijumi se uklone i doda se 100 µl dimetilsulfoksida (DMSO, SDS CARLO ERBA, Italy) da se rastvore depoziti formazana.

Optička gustina se očitava i kvantifikuje korišćenjem čitača ploča (BioRad, iMark Microplate reader) na 490 nm.

Vijabilnost se ponekad testira tehnikom izuzimanja od bojenja, uz korišćenje tripanplavog.

4) Imunoobeležavanje ćelija i dobijanje slika

Anti-CD133 (poly, Abnova), anti-GFAP (poly, Sigma), anti-NFL (mono, Santa Cruz) i anti-fibroblastna (ERTR7, Santa Cruz) primarna antitela razblaže se do 1/100 u slučaju prva tri antitela i 1/50 u slučaju poslednjeg.

Za detekciju IDH-R132H (marker glioma niskog stadijuma (21)), i CD31 (marker endotelijalnih ćelija (22)), primarna antitela su korišćena iz Clinisciences (mišje, razblaženje 1/20) i iz Spring Bioscience (zečje, razblaženje 1/250), respektivno.

4

Sekundarna antitela, odgovarajuća za prepoznavanje primarnih antitela su antizečja antitela kuplovana sa peroksidazom (kozja, Sigma), antimišja kuplovana sa Dylight 488 (ovčja, Sigma), antimišja kuplovana sa Dylight 488 (ovčja, Sigma) i antipacovska kuplovana sa FITC (zečja, Sigma). Razblaženja su 1/4000, 1/1000, 1/4000 i 1/400 respektivno.

IDH1-R132H i CD31 su detektovani upotrebom sekundarnih antitela spojenih sa peroksidazom. Omi su dobijeni iz Fischer Scientific (anti-mišje, razblaženje 1/1000) i iz Sigma (anti-zečje, razblaženje 1/500) respektivno.

Ćelije se permeabilišu 5 min pomoću 0.1% Triton X-100 (Sigma) u PBS (Fisher Scientific). Nespecifična mesta se blokiraju sa 2% BSA (Sigma) u PBS. Inkubacije traju 1 h na temperaturi okoline, 48 h na 4°C, 24 h na 4°C i 1 h na temperaturi okoline za anti-CD133, anti-GFAP, anti-NFL i anti-fibroblastna antitela respektivno. Inkubacija sa sekundarnim antitelima obavlja se 1 h na temperaturi okoline. CD133-pozitivne ćelije detektuju se pomoću DAB/H2O2sistema (Sigma) i posmatraju pod optičkim mikroskopom.

Kolorimetrijska detekcija markera IDH1-R132H i CD31 je izvedena sa supstratom NOVARED Vector (Eurobio). Obojene ćelije su takođe detektovane pomoću optičke mikroskopije. Fluorescencija se detektuje i slike dobijaju korišćenjem epifluorescentnog mikroskopa (Axiovert, Zeiss, Germany).

5) Ekstrakcija lipida i identifikacija oksisterola

Ćelije se isperu sa 0.9% NaCl, sakupe mehanički, suspenduju u Tris-HCl puferu (10 mM; pH 7.4) i homogenizuju sa Potter (1000 r.p.m. i 13 reciprokacija). Homogenizacija se obavlja u ledu. Ekstrakcija se obavlja na 4°C posle dodavanja 19 zapremina hloroforma:metanola (2:1, v/v) za 1 zapreminu ćelijske suspenzije prema Folch et al. (19). Organska faza i vodena faza se razdvoje dodavanjem 0.2 zapremine 0.74% KCl (w/v).

Posle evaporisanja organske faze u rotacionom evaporatoru (Buchi, R-215, Switzerland), lipidna rezidua se preuzme u hloroform. TLC slojevi se prethodno operu rastvorom hloroform:metanol (1:1, v/v) i aktiviraju na 100°C 1 h. Lipidi se eluiraju sledećim sistemom: petroleum-etar (tačka ključanja: 60-70°C): etar:sirćetna kiselina (80:20:1.3, v/v/v). Nataloženi standardi su holesterol, 7-keto-holesterol, 7-beta-OHCH, 7-beta-OHCH-C3-estar i molekul 2.b. Lipidi i standardi se detektuju pomoću Maccala reagensa. Rf vrednosti su 0.21, 0.09, 0.08, 0.27 i 0.23 za holesterol, 7-keto-holesterol, 7-beta-OHCH, 7-beta-OHCH-C3-estar i molekul 2.b respektivno. Kalibracioni opsezi od 0.5 do 2 µg za svaki standard urađeni su zasebno. Intenziteti tačaka od interesa izračunati su u odnosu na standarde posle skeniranja razvijenih tankih silika-slojeva. Čistoća korišćenih rastvarača je AnalAR ili HPLC stepena.

6) Analiza aktivnosti i inhibicije LDH (laktat dehidrogenaze; EC 1.1.1.27)

Merenja aktivnosti LDH i njegove inhibicije rutinskim inhibitorom, oksamatom (23), su validirani pomoću spektrometrijske metode (24) upotrebom prečišćenog LDH od Lactobacillus leichmannii (LL) (Sigma) kao standarda.

Sledeće, aktivnosti LDH i njihova inhibicija detektovani si pomoću tehnike "analize u gelu" (25). Izvor aktivnosti koji je korišćen je LDH LL i LDH, delimično prečišćen, iz humanih GBM linija U87-MG (LDH GBM). Detekcija "analize u gelu" je izvedena posle izoelektričnog fokusiranja (IEF) na elektroforetskim gelovima LDH LL i LDH GBM uzoraka.

a) Delimično prečišćavanje LDH GBM

Ćelije sakupljene u fosfatnom puferu (50 mM, Ph 7.2.Pi) podvrgavaju se nekoliko ciklusa zamrzavanja (-20°C)/odmrzavanja i ćelijski material je homogenizovan. Posle centrifugiranja na 10,000g u trajanju od 45 min na 4°C, supernatant je sakupljen i alikvote koje sadrže 10% glycerol (v:v) su zamrznute na -80°C. U željeno vreme, alikvote, posle odmrzavanja, su podvrgnute hromatografiji na filtracionoj koloni (Biogel P-60, BioRad) pripremljenoj u Pi. Zapremina gela je 9 ml i unutrašnji prečnik kolone je 0.4 cm. Eluiranje je izvedeno na atmosferskom pritisku. Prva frakcija od 1.4 ml je uklonjena i aktivnost LDH je sakupljena u sledeća 2 ml. Proteinske komponente ove frakcije (LDH GBM) su okarakterisane pomoću SDS PAGE tehnike, nakon čega sledi bojenje srebro nitratom, ili pomoću Western blot-a. Zabeležene su molekulske težine karakteristične za LDH (31 kDa, za podjedinicu, ili 62 kDa za njenu asocijaciju u dimer).

b) IEF

Mini-gelovi od 7.5 (T%) i od 2.6 (C%) su sipani u Pi sa amfolinima (BioRad) omogućavajući formiranje pH gradijenta u opsegu od 7 do 5 posle pre-fokusiranja u hladnoj komori. Korišćeni spremnici su od miniprotean 3 tipa (BioRad). Anodni pufer ima pH od 2.0 i katodni pufer ima pH od 10.0. LDH LL i LDH GBM uzorci su deponovani bez denaturacije i fokusiranje je izvedeno za 210 min povećavajući voltažu od 100V do 300V u hladnoj komori.

c) Aktivnost LDH

Aktivnost LDH je detektovana pomoću sistema laktat/NAD/MTT/fenazin metosulfata (formiranje taloga formazan tipa u IEF gelu); ovaj sistem je opisan u referenci (25).

Dodavanje oksamata (18 mM) ili molekula 2.b, u etanolskom obliku (36 mM) omogućava merenje stepena inhibicije aktivnosti LDH LL i LDH GBM.

B/ Anti-GBM aktivnost "in vitro"

Sledeći primeri 7 do 11 su predstavljeni ne kao primeri izvođenja pronalaska, već kao primeri koji su korisni za razumevanje pronalaska.

B.1. Životinjski model

Kulture C6 ćelija (pacov) korišćene su pod radnim uslovima pomenutim ranije u ovom tesktu (odeljak II, A).

Primer 7: Anti-GBM aktivnost "in vitro" na kulturama C6 ćelija (pacov)

[0189] Dobijeni rezultati zbirno su prikazani u Tabeli 1, dole, kao i na Slici 3.

Tabela 1.

Slika 3 (uveličanje 20 x 10) pokazuje izgled kultura C6 ćelija pod radnim uslovima pomenutim ranije u ovom tekstu (odeljak II, A) u prisustvu molekula 1.a (Pr.3) ili posle sekvencijalnog tretmana molekulom 1.a i molekulom 2.a (Pr. 5), posle 19 dana i 35 dana.

Rezultati (Tabela 1) pokazuju da je molekul 1.a, u etanolskoj formi citotoksičan, posle 19 dana tretmana. Pri 15 µM 1.a i posle 14 dana tretmana, broj ćelija, nivo proteina i MTT test redukuju se za 30% i dostiže se 97% redukcija, najmanje, posle 19 dana. Posle 19 dana tretmana, zapažena je i dozna zavisnost za 7.5 i 3.3 µM 1.a, a pri 15 µM zapaža se porast odnosa MTT/ćelije od 20% u odnosu na kontrolne kulture.

Da bi se uklonile rezidualne ćelije, koristi se sekvencijalni tretman. Ćelije se prvo tretiraju sa 15 µM molekula 1.a, a zatim se 19. dana tretmana doda molekul 2.a u koncentraciji od 7.5 µM.

Nisu zapažene vijabilne ćelije; samo ćelijski "kadaveri" adheriraju za čvrsti supstrat ćelijske kulture (dno bunarčića), kako je pokazano na Slici 3.

Zbirno, sekvencijalni tretman molekulom 1.a i zatim molekulom 2.a pokazuje potpunu efikasnost protiv ovog tipa ćelija. Zapažanja ukazuju na porast ukupne respiracije ćelija pre njihove destrukcije.

B.2. Humani model: anti-GBM aktivnost "in vitro" na kulturama humanih ćelija (linija U-87 GM)

B.2.1 Definicija modela "in vitro" i izražavanja rezultata

a) Karakterizacija različitih tipova ćelija

U-87GM ćelije kultivišu se pod radnim uslovima opisanim ranije u ovom tekstu (odeljak II, A).

Kulture su napravljene od dve ćelijske komponente: ćelijski sloj sačinjen od ćelija koje se ponašaju kao nomalne (nekancerske) ćelije i ćelijski agregati sastavljeni od GBM tipa ćelija.

Slika 4 pokazuje optičku sliku (10 x 10) koja je karakteristična za kulturu. Može se videti ćelijski sloj (CL), na kojem su fiksirani agregati ćelija (CA) oblika polulopte. Slika 5 (20 x 10) pokazuje imunoobeležavanjem da se CD133+ ćelije (matične ćelije), opisane u humanim GBM, nalaze u ćelijskim agregatima, a ne nalaze se u CL. Imunofluorescentno obeležavanje pokazuje prisustvo GFAP, markera normalnih astrocita (Slike 6 i 7; 20 x 10) (26) u CL i CA (Slike 6 i 7; 20 x 10) i neurofilamenata u CL i CA. Međutim, specifično obeležavanje fibroblasta, ćelija sa visokim potencijalom za umnožavanje nađeno je jedino u slučaju CA. Veoma malo IDH1-R132H-pozitivnih ćelija zabeleženo je u CL i CA. Suprotno tome, CD31-pozitivne ćelije su zabeležene u CL i CA.

Posmatranje optičkom mikroskopijom jasno pokazuje da se ćelije CA dele veoma brzo (vreme udvostručavanja od najviše 16h), dok ćelije koje čine CL imaju vreme udvostručavanja od 96 h.

Ova zapažanja opravdavaju metod brojanja ćelija (ćelije obeležene ili neobeležene zrncima formazana), koji je razvijen; u stvari, brojanje posle tripsinizacije ne može da napravi razliku između ćelija CL i CA. Slike takođe pokazuju da samo CA imaju GBM karakter (kratko vreme udvostručavanja, prisustvo matičnih ćelija i fibroblasta). Dobijeni rezultati dakle pokazuju efekat testiranih molekula na CA.

b) Iskazivanje rezultata

Rezultati se iskazuju prema sledećim parametrima:

(i) Efikasnost molekula prema pronalasku

- Kvantifikacija rezidualnih ćelija, posebno matičnih ćelija.

- Efikasnost molekula prema pronalasku tokom vremena

Kultivacioni medijum koji sadrži molekule prema pronalasku zameni se svežim medijumom i ispituje se "de novo" multiplikacija ćelija: odsustvo "de novo" multiplikacije označava potpunu destrukciju GBM ćelija, uključujući matične ćelije.

(ii) Efekat molekula na ukupnu respiraciju GBM ćelija.

(iii) Upoređivanje rezultata dobijenih sa molekulima prema pronalasku i onih dobijenih sa 7β-OHCH-C3-estrom (kontrola).

B.2.2 Rezultati

Kulture U87-MG (humanih) ćelija koriste se pod radnim uslovima pomenutim ranije u ovom tekstu (odeljak II, A).

7beta-OHCH-C3-estar koristi se kao kontrola.

Primer 8: izučavanje "in vitro" anti-GBM aktivnosti molekula 2.a (Pr. 5) u lipozomskoj formi

Dobijeni rezultati prikazani su u Tabeli 2, dole.

Tabela 2

Ovi rezultati predstavljaju srednju vrednost tri nezavisna eksperimenta sprovedena u triplikatu. Rezultati su iskazani kao procenat u odnosu na kontrolu.

Zapažanja pokazuju da 15 µM molekula 2.a, u lipozomskoj formi, smanjuje prisustvo GBM ćelija (CA) na nulu posle 15 dana tretmana.

4

Preostaju samo ćelije koje se sporo dele (CL). Efekat nije dozno-zavisan. 7β-OHCH-C3-estar u etanolskoj formi ne deluje na GBM (CA) (vidi i Primer 9), deluje samo u lipozomskoj formi, i to pri 80 µM. Njegova efikasnost nije bolja, ili čak opada posle povećavanja doze 7β-OHCH-C3-estra u lipozomskoj formi.

Međutim, ako se 13. dana tretmana kultivacioni medijum koji sadrži 7β-OHCH-C3-estar ukloni i zameni svežim kultivacionim medijumom koji ne sadrži ovaj lek, zapaža se multiplikacija ćelija, paralelno sa porastom vrednosti u MTT testu posle dva dana; ovaj porast iznosi 40%. Ovo nije slučaj sa molekulom 2.a: u odsustvu ovo molekula, ne zapaža se multiplikacija ćelija.

Tabela 2 pokazuje i veliki porast u MTT/ćeliji (140% u odnosu na kontrole) u vreme kada većina ćelija nestaje (8 dana tretmana). Ovo nije slučaj kod lipozomskog 7β-OHCH-C3-estra: čak i pri 80 µM, odnos MTT/ćeliji ne varira.

Ovo zapažanje pokazuje različito dejstvo dva molekula: ukupna ćelijska respiracija se povećava pre masivne smrti ćelija. Ovo nije slučaj sa 7β-OHCH-C3-estrom.

Primer 9: Izučavanje"in vitro" anti-GBM aktivnosti molekula 2.b (Pr. 6) u etanolskoj formi

Dobijeni rezultati prikazani su u Tabeli 3 dole.

Tabela 3

Ovi rezultati predstavljaju srednju vrednost tri nezavisna eksperimenta od kojih je svaki sproveden u triplikatu. Rezultati su iskazani kao procenat u odnosu na kontrolu. Pri više od 30 µM, 7β-OHCH-C3-estar se više ne rastvara u etanolu.

Zapažanja pokazuju da je molekul 2.b potpuno efikasan pri 30 μM u etanolskoj formi: nema preostalih GBM ćelija, čak ni posle uklanjanja aktivnog sastojka. Kao i za molekul 2.a, u lipozomskoj formi, ćelijska respiracija se povećava pre ćelijske smrti. Ovo nije slučaj sa etanolskim 7β-OHCH-C3-estrom za koji nije zapažena antitumorska aktivnost.

Pored toga, zamena kultivacionog medijuma svežim medijumom koji ne sadrži jedinjenje 2.b 22. dana ne dovodi do umnožavanja ćelija.

Primer 10: imunoobeležavanje CD133+ matičnih ćelija A/B peroksidaznim sistemom

Imunoobeležavanje se obavlja kako je opisano ranije u ovom tekstu (odeljak II, A). Dobijeni rezultati prikazani su u Tabeli 4 dole.

Tabela 4

Ovi rezultati predstavljaju srednju vrednost dva nezavisna eksperimenta od kojih je svaki sproveden u triplikatu. Rezultati su iskazani kao procenat CD133-pozitivnih ćelija u odnosu na kontrole. Ovi eksperimenti su nezavisni od onih opisanih u Primerima 8 i 9.

Kao u zapažanjima opisanim u Tabelama 2 i 3, 7β-OHCH-C3-estar u lipozomskoj formi i molekul 2.b u etanolskoj formi redukuju nivo proteina za 85% i 100% u odnosu na netretirane kontrolne ćelije.

Rezultati pokazuju da su matične ćelije potpuno uništene molekulom 2.b. Ovo nije slučaj sa 7β-OHCH-C3-estrom, čak ni kada se primeni u lipozomskoj formi.

Slika 9 (imunoobeležavanje CD133<+>ćelija) jasno pokazuje njihov nestanak posle 22 dana tretmana. Ovo nije slučaj sa 7 β-OHCH-C3-estrom u lipozomskoj formi (Slika 10, imunoobeležavanje CD133<+>ćelija); u ovom slučaju, 50% CD133<+>ćelija još uvek je prisutno među rezidualnim ćelijama. Zamena kultivacionog medijuma svežim medijumom koji ne sadrži jedinjenje 2.b posle 22 dana ne dovodi do pojave CD133+ matičnih ćelija.

Primer 11: Izučavanje "in vitro" sudbine molekula 2.b (Pr. 6) u etanolskoj formi u GBM humanog porekla

Ekstrakcija i analiza lipida iz GBM tretiranih sa 30 µM molekula 2.b u etanolskoj formi ne pokazuje prisustvo 7beta-OHCH-C3-estra posle 24 h ili 10 dana tretmana, ovo drugo vreme je vreme početka ćelijske smrti. Međutim, zapaža se da se 0.12% i 0.18% molekula 2.b transformisalo u 7beta-OHCH posle 1 dana i 10 dana tretmana, respektivno. Kontrolni eksperimenti pokazuju da ovi vrlo niski nivoi 7-beta-OHCH ne indukuju smrt GBM.

Primer 12: Izučavanje toksičnosti

Toksičnost je ispitivana "in vitro" na različitim tipovima normalnih ćelija humanog porekla.

a) Na astrocitima

Upotrebljene ćelije su ćelije humanog porekla (ScienCell, USA, ref. 1800), pomenute ranije u ovom tekstu (odeljak II, A).

4

Astrocitni tip je potvrđen prisustvom GFAP, standardnog markera normalnih astrocita (Slika 11; uveličanje x 200).

Molekuli 2.a (lipozomska forma) i 2.b (etanolska forma) nisu toksični za primarne kulture normalnih (nekancerskih) humanih astrocita pri 30 µM, posle 30 dana tretmana.

b) Na drugim ćelijama

Upotrebljene ćelije su ćelije jetre (ScienCell, USA, ref. 50200), ćelije bubrega (ScienCell, USA, ref. 4120), skeletne mišićne ćelije (ScienCell, USA, ref. 3500) i srčane ćelije (ScienCell, USA, ref. 6300), humanog porekla, pomenute ranije u ovom tekstu (odeljak II, A).

Molekuli 2.a (lipozomska forma) i 2.b (etanolska forma) nisu toksični pri 30 µM i posle najmanje 30 dana tretmana, za primarne kulture ćelija jetre, ćelija bubrega, skeletne mišićne ćelije i srčane ćelije humanog porekla.

Primer 13: Izučavanje "in vitro" aktivnosti molekula 2.b (Pr. 6) prema drugim kancerima

Korišćene su kancerske ćelije iz jetre (ref. ATCC-HB-8065), prostate (ref. ATCC-HTB-81), dojke (ref. ATCC-HTB-19), i ćelije kancera debelog creva (ECACC-HT29/219) humanog porekla, pomenute ranije u ovom tesktu.

Pri 30 µM i u etanolskoj formi, molekul 2.b ne pokazuje efekat na ćelijsku deobu i respiraciju kancerskih ćelija jetre, prostate ili dojke, humanog porekla.

U 15 µM, molekul 2.b u poboljšanom lipozomalnom obliku nije toksičan za ćelije kancera debelog creva.

Primer 14. Studija aktivnosti molekula 2.b u poboljšanom lipozomalnom obliku "in vitro" na hroničnu mijelomonocitnu leukemiju (CMML)

Leukociti su izolovani iz uzorka krvi sakupljenog iz pacijenta koji pati od CMML. Ćelije su tretirani jednom sa 10 µM molekula 2.b u poboljšanom lipozomalnom obliku 24 časa posle kultivacije zasejavanjem na hranljivom sloju (17).

Rezultati su prikazani na fotografijama na Slici 12 (uveličanje 20 x 10).

Kontrole su ćelije tretirane sa praznim lipozomima: gornja leva fotografija označena slovom A je fotografisana posle 48 časova od tretmana i donja leva fotografija sa slovom B je fotografisana posle 72 časa od tretmana.

Za ćelije tretirane sa 2.b, gornja desna fotografija označena slovom C je fotografisana posle 48 časova od tretmana i donja desna forografija je označena slovom D je fotografisana posle 72 časa od tretmana.

Rezultati pokazuju izuzetak efekat molekula 2.b posle 72 časa od tretmana. Umnožavanje ćelija je značajno usporeno u odnosu na kontrolu i zabeležene su mnoge ćelije sa nekrotičkim izlgledom.

Primer 15. Studija aktivnosti molekula 1.b i 2.b "in vitro" na humane neuroblastome (ATCC-CRL-2266)

Neuroblastomi su tretirani praznim lipozomima (kontrole) ili sa lipozomima koji sadrže molekul 1.b ili 2.b, 24 časa posle početka kulture. Ćelije su tretirane jednom sa 22 µM molekula 1.b ili 22 µM molekula 2.b. Lipozomalni oblik je koncentrovan.

Rezultati su prikazani na fotografijama na Slici 13 (uveličanje 10 x10).

Za kontrolne ćelije, gornja leva fotografija označena slovom A fotografisana je posle 7 dana od tretmana; donja leva fotografija označena slovom B je fotografisana posle 28 dana od tretmana.

Za ćelije tretirane koncentrovanim lipozomalnim molekulom 1.b, fotografija označena slovom C (u sredini, na vrhu) fotografisana je posle 7 dana od tretmana i fotografija označena slovom D (u sredini, na dnu) fotografisana je posle 28 dana od tretmana. Za ćelije tretirane koncentrovanim lipozomalnim molekulom 2.b, gornja desna fotografija označena slovom E fotografisana je posle 7 dana od tretmana.

Rezultati prikazuju izuzetnu aktivnost molekula 2.b u odnosu na molekul 1.b. Posle 28 dana tretmana, molekul 1.b je toksičan za skoro sve ćelije, u poređenju sa kontrolnim ćelijama. Za molekul 2.b, radikalan toksični efekat je već zabeležen posle 7 dana od tretmana; nioje zabeležena nijedna vijabilna ćelija.

4

Primer 16. Studija inhibicije aktivnosti LDH ekstrahovanog iz humanog GBH "in vitro" (U87-MG linije) pomoću molekula 2.b

Ovaj primer je predstavljen ne kao primer izvođenja pronalaska, već kao primer koji je koristan za razumevanje pronalaska.

Cilj ovih eksperimenata bio je da se pokaže potencijal za inhibiciju enzimatske aktivnosti LDH serije 2 molekula. Studija je izvedena sa molekulom 2.b i njegov inhibitorni potencijal je testiran na LDH iz Lactobacillus leichmannii (LL) i delimično prečišćenom LDH iz humanih GBM linija (U87-MG) kao što je opisano u prethodnom tekstu u delu "A/ PROTOKOLI 6)".

Aktivnost LDH je detektovana pomoću tehnike "analize u gelu" na IEF elektroforetskim gelovima, koji su opisani u delu "A/ PROTOKOLI 6)" (25); preciznost ove tehnike je 0.2 jedinice pH. Aktivnost LDH je detektovana pomoću tamno plavog taloga, formazan tipa, mesta gde je locirana aktivnost LDH.

Slika 14 (A) prikazuje aktivnost LDH za LDH LL na pHi 6.2 i za LDH GBM na pHi 6.4.

Rezultati pokazuju da dodavanje oksamata, u vodenom obliku (18 mM), ili molekula 2.b, u etanolskom obliku (36 mM), inhibira enzimatsku aktivnost LDH LL skoro potpuno i enzimatsku aktivnost LDH GBM (B) inhibira delimično.

Potencijal za inhibiciju enzimatske aktivnosti LDH GBM pomoću molekula 2.b kombinovan sa povećanjem u MTT bojenju pre ćelijske smrti GBM (Tabele 2 i 3; Slike 8 i 9) potvrđuje hipotezu mehanizma delovanja jedinjenja formule (I): molekuli pronalaska bi inhibirali aktivnost LDH i, posledično, izazvali bi eksploziju mitohondrijalne respiracije.

Bibliografija

1. Kando T, Setoguchi T, Taga T.PNAS.2004, 101 : 781-786.

2. Zhou Y, Zhou Y, Shingu T, Feng L, Chen Z, Ogasawara M, Keating MJ. J. Biol. Chem. 2011, 286 : 32843-32853).

3. Warburg O.Biochemische Zeitschrift. 1923, 142: 317-333.

4. Tennant DA, Duran RV, Gottlieb E.Nature Reviews Cancer. 2010, 10: 267-277.

4

5. Cheng KP, Nagano H, Bang L, Ourisson G, Beck JP.Journal of Chemistry Research (M). 1977, 217:2501-2521.

6. Carvalho JFS, Cruz Silva MM, Moreira JN, Simoes S, Sa e Melo ML. Journal of Medicinal Chemistry. 2011, 54: 6375-6393.

7. Kupferberg A, Teller G, Behr P, Leray C, Urban PF, Vincendon G, Mersel M. Biochim Biophys Acta.1989, 1013: 231-23.

8. Kupferberg A, Behr P, Mersel M.Biochim Biophys Acta.1990, 1046: 106-109.

9. Adamczyck M, Scherrer E, Kupferberg A, Malviya AN, Mersel M.Journal of Neuroscience Research. 1988,53:38-50.

10. Werthle M, Bochelen D, Adamczyck M, Kupferberg A, Poulet P, Chambron J, Lutz P, Privat A, Mersel M.Cancer Research.1994, 54: 998-1003.

11. Clarion L, Schindler M, de Weille J, Lolmède K, Laroche-Clary A, Uro-Coste E, Robert J, Mersel M, Bakalara N.12. El Kihel L et al. J. Org. Chem.2002, : 4075-4078.

13. Yusuf RZ, Wang YH, Sccaden DT.Nature Medicine 2012, 18: 865-867.

14. Langman J.Embryologie Médicale [Medical Embryology], Publ. Masson 1974, 66-70. Biochemical Pharmacology. 2012, 83: 37-46.

15. Manford K, Patterson JR.Methods in Enzymology. 1979, 58: 150.

16. Benda P, Lightbody J, Sato G, Levine L, Sweet W.Science.1968, 161: 370-371.

17. Rouleau C, Mersel M, de Weille J, Rakotoarivelo C, Fabre C, Privat A, Langley K, Petite D.J of Neurosc.2000, 87 : 50-60.

18. Rakotoarivelo C, Adamczyck M, Desgeorges M, Langley K, Lorentz JG, Mann A, Ricard D, Scherrer E, Privat A, Mersel M.Anticancer Res.2006, 26: 2053-2062.

19. Folch J, Lees M, Sloane-Stanley GH. J Biol Chem.1957, 226: 5497-5509.

20. Kates M.Techniques of Lipidology, Work TS and Work E editors Elsevier Publishing 1975, 368-369.

21. Balss J, Meyer J, Mueller W, Korshunov A, Hartmann C, Von Deimling A.Acta Neuropathol. 2008, 116: 597-602.

22. Bogen SA, Baldwin HS, Watkins SC, Albelda SM, Abbas AK.Am J Pathol. 1992, 141: 843-854.

23. Schurr A, Payne RS.Neuroscience 2007, 147: 613-619.

24. Scientific Committee. Recommandations pour la mesure de la concentration catalytique de la lactate dehydrogenase dans le serum humain a 30°C.

4

[Recommendations for measuring the catalytic concentration of lactate dehydrogenase in human serum at 30°C]. Ann Biol Clin 1982, 40 : 87-164.

25. Seger J., Lucotte G.La Pratique de l’électrophorèse appliquée a la detection des polymorphismes humains. [The electrophoresis technique applied to the detection of human polymorphisms]. Masson Ed., 1982, 68-69

26. Sensenbrenner M, Devilliers G, Bock E, Porte A.Differentiation, 1980, 17: 51-61.

4

Claims (11)

1. PATENTNI ZAHTEVI 1. Jedinjenje formule (I) koje ima osnovnu strukturu beta-hidroksiholesterola

   , naznačeno time, što je izabrano od sledećih jedinjenja: - 7-((terc-butoksikarbonil)oksi)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2-(2-(((benziloksi)karbonil)amino)-acetamido)propanoat (molekul 1.a); - 7-acetoksi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2-(2-(((benziloksi)karbonil)amino)-acetamido)propanoat (molekul 1.b); - 7-((terc-butoksikarbonil)oksi)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-karboksilat (molekul 2.a); - 7-acetoksi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-karboksilat (molekul 2.b), za upotrebu u lečenju malignih hemopatija.
2. 2. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 1, naznačeno time, što maligne hemopatije su mijeloidnog tipa.
3. 3. Jedinjenje za upotrebu prema zahtevu 1, naznačeno time, što maligne hemopatije su limfomi. 4
4. 4. Jedinjenje formule (I) koje ima osnovnu strukturu beta-hidroksiholesterola

   naznačeno time što je izabrano od sledećih jedinjenja: - 7-((terc-butoksikarbonil)oksi)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2-(2-(((benziloksi)karbonil)amino)-acetamido)propanoat (molekul 1.a); - 7-acetoksi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2-(2-(((benziloksi)karbonil)amino)-acetamido)propanoat (molekul 1.b); - 7-((terc-butoksikarbonil)oksi)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-karboksilat (molekul 2.a); - 7-acetoksi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-karboksilat (molekul 2.b), za upotrebu u lečenju neuroblastoma.
5. 5. Jedinjenje formule (I) koje ima osnovnu strukturu beta-hidroksiholesterola

   naznačeno time, što je izabrano od sledećih jedinjenja: - 7-((terc-butoksikarbonil)oksil)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10, 11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2-(2-(((benzil-oksi) karbonil)amino)-acetamido)propanoat (molekul 1.a); - 7-acetoksi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2-(2-(((benziloksi)karbonil)amino)-acetamido)propanoat (molekul 1.b); - 7-((terc-butoksikarbonil)oksi)-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2,2-dimetil-1,3-dio-ksolan-4-karboksilat (molekul 2.a); - 7-acetoksi-10,13-dimetil-17-(6-metilheptan-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-karboksilat (molekul 2.b) za upotrebu u lečenju melanoma.
6. 6. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kojem od zahteva 1 do 5, koje je u obliku farmaceutske smeše koja sadrži najmanje jedno jedinjenje kao što je definisano u patentnim zahtevima 1, 4 i 5 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
7. 7. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kojem od zahteva 1 do 5, koje je u obliku farmaceutske smeše koja se sastoji od lipozoma koji sadrži najmanje jedno jedinjenje kao što je definisano u patentnim zahtevima 1, 4 i 5 pojedinačno ili u kombinaciji sa drugim aktivnim sastojkom.
8. 8. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kojem od zahteva 1 do 5, koje je u obliku farmaceutske smeše koja se sastoji od alkoholnog rastvora koji sadrži najmanje jedno jedinjenje kao što je definisano u patentnim zahtevima 1, 4 i 5 pojedinačno ili u kombinaciji sa drugim aktivnim sastojkom.
9. 9. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kojem od zahteva 1 do 5, koje je u obliku farmaceutske smeše koja je pogodna za primenu oralnim putem. 1
10. 10. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kojem od zahteva 1 do 5, koje je u obliku farmaceutske smeše za primenu oralnim putem, izabranom od tableta, kapsula, praškova, granula, rastvora, emulzija, oralnih suspenzija, kapi, sirupa, kompleksa jedinjenja kao što je definisano u patentnim zahtevima 1, 4 i 5 sa žučnim solima i kombinacija jedinjenja formule (I) sa fosfolipidima, u lipozomalnom ili nelipozomalnom obliku.
11. 11. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kojem od zahteva 1 do 5, koje je u obliku farmaceutske smeše u kojoj je navedeno jedinjenje kao što je definisano u patentnim zahtevima 1, 4 i 5 korišćeno kao jedini aktivni sastojak, ili u kombinaciji sa antikancerskim sredstvom. 2