TARIFNAME STEROL DERIVELERI VE DÖNÜSTÜRÜLMÜS ASTROSIT HÜCRELERI IÇEREN HASTALIKLARIN TEDAVI EDILMESINE YÖNELIK VEYA MALIGNAN HEMOPATILERIN TEDAVI EDILMESINE YÖNELIK OLARAK BUNLARIN KULLANIMI Bulus, özellikle dönüstürülmüs miyeloid hücreleri içeren malignan hemopatilerin tedavisinde kullanima yönelik veya lenfomalarin tedavi edilmesine yönelik olarak yeni sterol türevleri ile ilgilidir. Hücresel transformasyon, normal ökaryotik bir hücreden immortalize bir hücreye ve/veya kanserli ökaryotik bir hücreye geçise karsilik gelir. "Transforme hücre" veya "kanser hücresi" terimi, buradan sonra es anlamli olarak kullanilacaktir. Evre IV astrositom olarak da bilinen glioblastoma multiforme (GBM), özellikle evre I, evre II ve evre III'ün gliomalarindan geçen, astrosit hücrelerinin kanser hücrelerine transformasyonu ile karakterize edilen bir beyin tümörüdür. Onkoloji alaninda önemli bilimsel ve terapötik gelismelere ragmen GBM halen tedavi edilemeyen bir kanserdir. En iyimser görüsle arastiricilar ve doktorlar, hastalarin ortalama ömrü en fazla on bes ay olmak üzere birkaç ay uzatildiginda tatmin GBM tedavisinde karsilasilan problemlerden biri, kök hücrelerinin neden oldugu nükstür. Aslinda var olan terapiler, tümörün büyük bir kismini yok etmede basarili oldugunda kök hücreleri siklikla yeni bir tümörün gelisimine neden olur (1, Güncel terapiler her zaman için lokasyonunun buna izin vermesi halinde tümörün rezeksiyonundan ve akabinde uygun oldugu üzere radyoterapi ve/Veya kemoterapiden olusur. Kemoterapide Öncü tedavilerden biri, Avastin (VEGF'nin reseptörlerine baglanmasinin inhibisyonu) ve irinotekan (topoizomeraz I inhibitörü) uygulamasindan olusan ikili terapidir. Prokarbazin (DNA alkilleme ajani), lomustin (CCNU; spesifik olmayan alkilleme ajani) ve vinkristinin (mikrotübül polimerizasyonunun inhibisyonu) bir kombinasyonu olan PCV türündeki üçlü terapi günümüzde oldukça tartismalidir. Radyoterapi ile kombinasyon halinde bir guanin alkilleme ajani olan temozolomid, özellikle hipermetile DNA'Si olan hastalar için ortalama hayatta kalma oraninda bir artis gösterir. silengitid (bazi integrin reseptörlerinin inhibisyonu) ve talampaneli (AMPA tipi glutamat kanallarinin. bloke edilmesi) test eden klinik. çalismalar (faz Immünoterapi çalismalari ve klinik çalismalar iki türdür: o intrakraniyal olarak enjekte edilen sitotoksik T lenfositleri (CTL; faz I klinik çalismalar) veya lenfokin aktive öldürücü hücreler (LAK; faz II klinik çalismalar)gibi. in vitro aktive edilen hücrelerin. hastaya enjekte edildigi adaptif immünoterapi. Günümüzde yapilan gözlemler, en sira disi 20 ay olan bir hayatta kalma süresini gösterir. o asilarin (faz I) ve dendritik. hücrelerin (faz II) kullanilmasindan olusan aktif immünoterapi. Bu, hastanin hayatta kalma süresinde önemli bir gelisme göstermez. Bu çalismalar durdurulmustur. Anti kanser potansiyeli olan moleküllerin vektörleri olarak adenovirüsler, retrovirüsler` veya kizamik 'virüslerinden olusan gen terapileri, sadece 6 ila. 11 aylik hayatta kalma süresinde bir gelisme gösterir. GBM'lerde ilaç tasiyicilari olarak nöronal kök hücrelerin kullanimini öneren hücre terapisi, temel arastirmada hala gösterim asamasindadir. Son yillarda kismen ihmal edilen ve tekrar öngörülen bir yaklasim, glikoliz ve oksidatif fosforilasyon seviyesindeki etkiden olusur. Kanser hücreleri, oksijen tedarikinin sinirlayici bir faktör olmamasi durumunda metabolizmalarini anaerobik metabolizmaya dogru modifiye etme egiliminde olduklarindan glukoz tüketimlerini arttirirlar. Warburg (3) tarafindan gözlenen bu olay, HIF (Hipoksi ile Indüklenen Faktör) ve Myc pro-onkogenin asiri ifadesinden kaynaklanir. HIF, aerobik solunumda kritik bir enzim olan piruvat dehidrogenazi inaktive ederek piruvatin laktata anaerobik olarak dönüsümünü arttirir. Myc, anaerobik solunumda yer alan glutaminin biyosentezini Bu baglamda enerji metabolizmasi üzerinde etkili olan klinik çalismalar sürmektedir. Bunlardan örnekler (4) olarak bahsedilebilir: - metformin: hücre proliferasyonunu yavaslatan AMPK'yi indükleyen mitokondriyal respiratuar kompleks I inhibitörüdür; - foretin: glukoz importunun azaltilmasina yönelik ajandir; - fenilasetat: glutamin seviyesinin azaltilmasina yönelik ajandir; - dikloroasetat: piruvat dehidrogenazin inhibitörüdür. Dikloroasetat hariç bu moleküllerin tümü test edilmektedir (faz GBM'lerin orijinindeki hücre türü olan astrositlerin enerji metabolizmasinin spesifik bir yönünü hedefleyen sterol derivelerinin, gliobastoma multiforme tedavisi için kullanilabilir. Bulusun orijinal açisi, transformasyonunun son olarak GBM'lerin olusumuna neden oldugu astrosit hücresinin (glial orijinli) belirli enerji metabolizmasinin kullanimindan olusur. Aslinda astrosit hücresi ayni zamanda, oksidatif fosforilasyon (mitokondride elektron transportu ile birlesik Krebs döngüsü) ve glikoliz araciligiyla dATP formundaki enerji kaynagini kullanir; glikoliz durumunda piruvat Krebs döngüsüne girmez ancak tip 5 enzim laktat dehidrogenaz (LDH) ile laktata indirgenir. ATP kaynagina ek olarak astrosit, nöron olan bitisik hücreye nörotransmitter (glutamat) saglamak üzere laktat üretimi yoluyla glikolizi kullanir. Asagidaki tabloda normal veya kanserli astrositin enerji metabolizmasi, diger hücrelerinki ile sematik olarak karsilastirilir: Astrositler Diger hücreler Mitokondriyal Mitokondriyal Glikoliz Glikoliz solunum solunum Normal hücreler Kanser GBM GBM hücreleri %1 %99 Astrositin enerji metabolizmasi özeldir; aslinda Initokondriyal solunum ve glikoliz, uyum içinde fonksiyon görür. Bu, normal astrosit hücresinin bu spesifik ikili özelligidir, diger bir deyisle bulusa göre sterol derivelerinin hazirlanmasina iliskin stratejiye yönelik temeli olusturan bir yandan mitokondriyal solunum ve diger yandan ise glikolizdir. Aslinda bulusçular, bir çalisma hipotezini ileri sürerler, bu hipoteze göre bulusa göre sterol deriveleri, kanserli astrosit hücrelerinin enerji metabolizmasini, glikolizden mitokondriyal solunuma yönlendirebilir, bu da ölümlerine neden olan bir prosestir. Yüksek anti kanser potansiyeline (5, 6) sahip bir molekül olan 7ß-Hidroksikolesterol (7ß-OHCH), "in vitro" (9) olarak immortalize (kendiliginden transforme) siçan astrosit hatlari (7, 8) ve GBM'ler (siçan hatti C6) üzerinde belirgin bir sitotoksisite sergiler. Çalismalar, hücre içi yag asitleri ile C3-OH'de 7ß-OHCH esterifikasyonunun (7ß-OHCH-C3-ester olusumu), ana molekülün (7ß-OHCH) toksik etkisinde güçlü bir sekilde yer aldigini gösterir (7, 8, 10). Ancak C3-OH'de esterlestirilse de esterlestirilmese de 7ß- OHCH'nin "in vitro" GBM'ler üzerinde etki mekanizmasina açiklik getirilmemistir. Son zamanlarda C6 hatlari üzerinde gerçeklestirilen çalismalar, 7ß-OHCH'nin, raftlarin, plazma membranindaki mikro bölgeler, hücresel enerji metabolizmasinda (ll) anahtar enzim olan protein kinaz Akt'ninki de dahil bazi hücresel habercileri baslatma bölgelerinin yapisini ve dinamiklerini modüle ettigini göstermistir. Aslinda oksisterol, raftlarin yapisini bozarak özellikle normal hücrelerin kanser hücrelerine transformasyonu esnasinda Akt aktivitesini etkileyecektir: Akt, bu hücrelerdeki glukoz yakalanmasini ve glikoliz aktivitesini regüle eder. 3. pozisyonda sübstitüentler ve '7. Pozisyonda koruyucu gruplar tasiyan 7beta-hidroksikolesterol temel yapisina sahip bulusa göre sterol derivelerinin es zamanli olarak yüksek evre kanserli astrositin enerji kaynagi için önemli olan glikolizin inhibisyonuna izin verecegi ve ayni zamanda bu hücre için beklenmedik bir sekilde bulunmustur. Aslinda bu ikili etki, kanser hücresinin" asiri isinmasina" neden olur, bu da ölümüne yol açar. Ayrica bulusa göre sterol derivelerinin, kök hücrelere iliskin aktiviteye de sahip oldugu, bu sekilde glioblastom hücrelerinin toplam yikimina izin verdigi gösterilmistir. Glioblastomaya iliskin bulusa göre sterol türevlerinin aktivitesi, ayrica, astrositinki ile miyeloif hücrenin hücre metabolizmasi benzerliginden dolayi, bunlarin kullaniminin, miyeloid tipteki malignan hemopatilerin tedavisinde öngörülebilmesi anlamina gelir; nöroblastomlarin tedavisinde, nöronlar, astrosit olarak ayni embriyolojik ve hücresel orijine sahiptir; ve Helanomlarin tedavisinde, daha sonra açiklanacagi üzere, melanositler, astrositler ile ayni embriyolojik orijine sahiptir. Ayrica, miyeloid hatti ve lenfoid hattinin, pluripotent hematopoetik kök hücreler olarak adlandirilan ortak bir orijine sahip olmasi, ayrica, lenfomalarin tedavi edilmesine yönelik olarak bulusa göre sterol türevlerinin kullanimini öngörmenin mümkün olmasi anlamina gelir. Bulus dolayisiyla, malignan hemopatilerin tedavisinde kullanima yönelik olarak asagidaki bilesiklerden seçilen formülün (I) bilesikleri ile ilgilidir: 7-((tert-bütoksikarbonil)oksi)-lO,l3-dimetil-l7-(6- tetradekahidro-lH-siklopenta[a]fenantren-3-il 2-(2- (((benziloksi)karbonil)amino)-asetamido)propanoat (molekül 7-asetoksi-10,l3-dimetil-l7-(6-metilheptan-2-il)- siklopenta[a]fenantren-3-il 2-(2- (((benziloksi)karbonil)amino)-asetamido)propanoat (molekül 7-((tert-bütoksikarbonil)oksi)-lO,13-dimetil-l7-(6- tetradekahidro-lH-siklopenta[a]fenantren-3-il 2,2-dimetil- l,3-dioksolan-4-karboksilat (molekül 2.a); 7-asetoksi-10,l3-dimetil-l7-(6-metilheptan-2-il)- siklopenta[a]fenantren-3-il 2,2-dimetil-l,3-dioksolan-4- karboksilat (molekül 2.b), Formülün (I) bilesikleri, asagidaki adimlari içeren bir yöntem ile kolesterolden elde edilebilir: kolesterolün 3. pozisyonundaki hidroksil fonksiyonunun, örnegin bir asiloksi R9-C(O)- grubu gibi koruyucu bir grup ile korunmasi, burada R9 grubu, sübstitüe veya sübstitüe edilmemis bir C1-C6 alkil veya sübstitüe veya sübstitüe edilmemis aril grubu, özellikle bir arilalkoksikarbonildir, 7. pozisyona bir keton fonksiyonunun eklenmesi, o keton fonksiyonunun bir hidroksil fonksiyonuna indirgenmesi, o örnegin bir asil, aril veya alkoksikarbonil grubu veya bir asiloksi R1w%3(0) grubu gibi B grubuna karsilik gelen 7. pozisyonda hidroksil fonksiyonu üzerine koruyucu grubun eklenmesi, burada Rm, sübstitüe veya sübstitüe edilmemis bir Cyfk alkil, en az bir lineer veya dalli Cyfk alkil ile sübstitüe veya sübstitüe edilmemis bir aril veya en az bir lineer veya dalli Ci-Cg alkil veya yukarida tanimlandigi üzere, OR, NHR ve SR'den seçilen en az bir grup ile sübstitüe veya sübstitüe edilmemis bir Cs-CH heteroarildir, O 3. pozisyondaki hidroksil fonksiyonunun korumasiz birakilmasi. 3. pozisyondaki hidroksil fonksiyonunun korumasiz birakilmasindan sonra söz konusu hidroksil fonksiyonu, istenen A grubu ile sübstitue edilebilir. Bir keton fonksiyonunun, pozisyon 7'de eklenmesi, genel oksidasyon yöntemleri araciligiyla gerçeklestirilebilir. Keton fonksiyonunun, seçime bagli olarak ß pozisyonunda bir hidroksil fonksiyonuna düsmesi, örnegin seryum klorid heptahidrat (12) varliginda, NaBH4 kullanilarak Luche yöntemi araciligiyla gerçeklestirilebilir. Formülün (I) en az bir bilesigini içeren farmasötik bilesimler veya ilaçlar ve farmasötik olarak kabul edilebilir araç, formülün (I) en az bir bilesigini içeren bir lipozomal preparasyondan olusabilir. Lipozomlar, teknikte uzman bir kisi tarafindan bilinen çesitli teknikler ile üretilebilir. Lipozomlari olusturan çesitli lipidler kullanilabilir [Kunio Yagi tarafindan düzenlenen Medical Application of Liposomes (l986), Japan Scientific Societies Press, Tokyo, KargerJ. Alternatif olarak, söz konusu lipozom, agirlikli olarak 40 ile 80 nm arasinda bir boyut dagilimina sahip "gelistirilmis" lipozomdan olusabilir ve zaman içinde stabildir veya ayni boyut dagilimina sahip ancak, Özellikle "gelistirilmis" lipozomdan %50 daha yüksek olan, daha yüksek bir aktif molekül konsantrasyonu içeren "konsantre" lipozom içerir. yöntemi araciligiyla elde edilebilir: 0 lipozom içine dahil edilecek aktif molekül ve bir organik solvent içindeki fosfolipidin temasa geçirilmesi, - bir lipid film elde etmek amaciyla bir nitrojen akisi altinda solventin buharlastirilmasi, o bir organik solvent içindeki lipid filmin çözündürülmesi; - söz konusu solventin, bir nitrojen akisi altinda buharlastirilmasi ve bir aköz tampon içindeki lipid filmin içeriye alinmasi 0 bir ultrasonik banyoda sonikasyon, o ekstrüsyon araciligiyla kabarciklarin elde edilmesi. Tercihen, sonikasyon, yaklasik 20°C'lik bir sicaklikta bir dakikalik lO vurus boyunca gerçeklestirilir. Ekstrüzyon, 200 nm'lik bir gözenek boyutuna sahip olan bir PVDF-tipi membran üzerinde gerçeklestirilebilir. yöntemi araciligiyla elde edilebilir: - lipozom içine dahil edilecek aktif molekül ve genel tekniklerde kullanilandan daha yüksel olan, özellikle bir organik solventte genel miktarin iki kati bir miktarda fosfolipid ile temasa geçirilmesi, o bir lipid film elde etmek amaciyla bir nitrojen akisi altinda solventin buharlastirilmasi, . bir organik solvent içindeki lipid filmin çözündürülmesi; . söz konusu solventin, düsük. basinç altinda buharlastirilmasi ve bir aköz tampon içindeki lipid filmin içeriye alinmasi . bir ultrasonik banyoda sonikasyon, - ekstrüsyon araciligiyla kabarciklarin elde edilmesi. Tercihen, sonikasyon, yaklasik 20°C'lik bir sicaklikta bir dakikalik 20 vurus boyunca gerçeklestirilir. Ekstrüzyon, 200 nm'lik bir gözenek boyutuna sahip olan bir PVDF-tipi membran üzerinde gerçeklestirilebilir. Tercihen, buharlastirma, yaklasik 3kPa (30 mbar) altinda bir basinçta ve 25°C'lik bir banyo sicakliginda gerçeklestirilir. Bir döner buharlastirici, tercihen kullanilir. Fosfolipide göre aktif molekül miktari, örnegin agirlikça % olarak ifade edilen, yaklasik olarak %15 olabilir. Tercih edilen bir ilaç, yukarida tanimlandigi üzere formülün (I) en az bir bilesigi ile yüklenen bir lipozomdan olusur. Tercihen formülün (I) bilesik(ler)i, yukarida tanimlandigi uzere, özellikle söz konusu farmasötik bilesim bir lipozom oldugunda sadece bulusa göre farmasötik bilesimde bulunan aktif bilesen(ler)i olusturur. Yukarida tanimlandigi üzere formülün (I) en az bir bilesigini içeren söz konusu lipozom, örnegin oral yol veya parenteral yol araciligiyla uygulanabilir. Alternatif olarak formülün (I) bilesigi, yukarida tanimlandigi üzere, örnegin bir antikanser ajan, özellikle avastin, irinotekan, temozolomid. veya taksol deriveleri gibi bir* baska aktif bilesen ile kombinasyon halinde kullanilabilir. Farmasötik bilesimler, teknikte uzman bir kisi tarafindan bilindigi üzere oral uygulamaya veya özellikle enjeksiyon, infüzyon veya inhalasyon yoluyla parenteral uygulamaya, yönelik uygun herhangi bir formda olabilir. Özellikle söz konusu farmasötik. bilesim, tek. basina veya. bir hastaya transfüzyon veya infüzyon ile uygulanabilen bir baska aktif ajan ile kombinasyon halinde formülün (1) en az bir bilesiginin farmasötik olarak kabul edilebilir bir solüsyonu, yukarida tanimlandigi üzere özellikle alkolik bir solüsyon olabilir. Söz konusu farmasötik bilesim, özellikle oral veya dil alti yol araciligiyla uygulama için uygun olabilir. Tabletler, kapsüller, tozlar, granüller, solüsyonlar, emülsiyonlar, oral süspansiyonlar, damlalar, suruplar, vb. gibi genel farmasötik formlarin yani sira, bulusa göre oral farmasötik bilesimler, yukarida tanimlandigi üzere biliyer tuzlari içeren formülün (I) bilesiklerinin komplekslerini veya örnegin yukarida tanimlandigi üzere, lipozomal veya lipozomal olmayan formda, fosfatidilkolin gibi fosfolipidler içeren formülün (I) bilesiklerinin kombinasyonlarini içerebilir. Formülün (I) bilesikleri, özellikle glioblastoni multiform. veya asama IV astrositomun (GBM) tedavisinde, transforme astrosit hücrelerini içeren hastaliklarin tedavisinde kullanilabilir. Özellikle formülün (I) bilesikleri, tedavi bölgesinde direkt olarak serebral kortekse enjekte edilebilir. Bulus, miyeloid tipte malignan hemopatiler ve lenfomalar, nöroblastomlar ve melanomlar olarak adlandirilan diger kanserlerin tedavisi ile ilgilidir. Yukarida tanimlandigi üzere, miyeloid tipte malignan hemopatilerin tedavisinde kullanima yönelik olarak formülün (I) bilesikleri, bulusun bir konusudur. Bulus, yukarida tanimlandigi üzere, formülün (I) etkili miktarda en. az bir` bilesiginin *uygulanmasi araciligiyla miyeloid. tipte malignan hemopatilerin tedavisi ile ilgilidir. Miyeloid tipte malignan patolojileri, normal bir miyeloid hücresinden gelisir. Bu noktada, bu hücre tipi, normal durumda, astrositinkine oldukça benzer bir enerji metabolizmasina sahiptir: bu, enerjisini, mitokondriyal solunumdan ve glikolizden (laktat yolu; LDH) (13) üretir. Miyeloid orijinin kanserleri durumunda, kanser hücreleri, enerjilerini glikolizden üretir. GBM için, formülün (I) bilesiklerinin anti-kanser aktivitesi, LDH (glikoliz) inhibisyonu ve sonuç olarak mitokondriyal solunumun yüksek bir yakiminin neden oldugu hücrenin asiri isinmasindan dolayi olacaktir. Asagidaki bilesiklerden seçilen formülün (I) bilesikleri: - 7-((tert-bütoksikarbonil)oksi)-lO,l3-dimetil-l7-(6- tetradekahidro-lH-siklopenta[a]fenantren-B-il 2-(2- (((benziloksi)karbonil)amino)-asetamido)propanoat (molekül - 7-asetoksi-10,13-dimetil-l7-(6-metilheptan-2-il)- siklopenta[a]fenantren-3-il 2-(2- (((benziloksi)karbonil)amino)-asetamido)propanoat (molekül . 7-((tert-bütoksikarbonil)oksi)-10,lB-dimetil-l7-(6- tetradekahidro-lH-siklopenta[a]fenantren-3-il 2,2-dimetil- l,3-dioksolan-4-karboksilat (molekül 2.a); i 7-asetoksi-10,lB-dimetil-l7-(6-metilheptan-2-il)- siklopenta[a]fenantren-B-il 2,2-dimetil-l,3-dioksolan-4- karboksilat (molekül 2.b), lenfomalarin tedavisinde kullanima yönelik olarak, bulusun ayrica bir konusudur. Bulus ayrica, yukarida tanimlandigi üzere formülün (I) etkili miktarda en az bir bilesiginin uygulanmasi araciligiyla lenfomalarin tedavisi ile ile ilgilidir. Aslinda, miyeloid hat ve lenfoid hattinin, pluripotent hematopoetik kök hücre olan bir ortak orijine sahip olmasi, yukarida tanimlandigi üzere, miyeloid tipte malignan hemopatileri üzerinde formülün (I) bilesiklerinin aktivitesi nedeniyle bunlarin kullanimi, ayrica lenfomalarin tedavi edilmesine yönelik öngörülebilir. Asagidaki bilesiklerden seçilen formülün (I) bilesikleri, nöroblastomlarin tedavisinde kullanima yönelik olarak, ayrica bulusun bir konusudur: - 7-((tert-bütoksikarbonil)oksi)-lO,l3-dimetil-l7-(6- tetradekahidro-lH-siklopenta[a]fenantren-B-il 2-(2- (((benziloksi)karbonil)amino)-asetamido)propanoat (molekül 1.a); - 7-asetoksi-10,l3-dimetil-l7-(6-metilheptan-2-il)- siklopenta[a]fenantren-3-il 2-(2- (((benziloksi)karbonil)amino)-asetamido)propanoat (molekül . 7-((tert-bütoksikarbonil)oksi)-10,13-dimetil-17-(6- tetradekahidro-lH-siklopenta[a]fenantren-3-il 2,2-dimetil- l,3-dioksolan-4-karboksilat (molekül 2.a); i 7-asetoksi-lO,lB-dimetil-l7-(6-metilheptan-2-il)- siklopenta[a]fenantren-B-il 2,2-dimetil-l,3-dioksolan-4- karboksilat (molekül 2.b). Bulus ayrica, yukarida tanimlandigi üzere formülün (I) etkili miktarda en az bir bilesiginin uygulanmasi araciligiyla nöroblastomlarin tedavisi ile ilgilidir. Temelde ekstrakraniyal sempatik sinir sistemini etkileyen noroblastomlar göz önünde bulunduruldugunda, astrositte oldugu gibi, nöronun, bir taraftan ektoderni olarak. adlandirilan› ayni embriyolojik orijine ve diger taraftan nöroepitelyal hücreler (14) olarak adlandirilan hücresel orijine sahip olmasi nedeniyle bir anti-tümör aktivitesini gösterir. Kisacasi, astrosit ve nöronun her ikisi de sinir hücreleridir ve formülün (I) bilesikleri için esit olarak duyarlidir. Asagidaki bilesiklerden seçilen formülün (I) bilesikleri, melanomlarin tedavisinde kullanima yönelik olarak, bulusun ayrica bir konusudur: - 7-((tert-bütoksikarbonil)oksi)-lO,l3-dimetil-l7-(6- tetradekahidro-lH-siklopenta[a]fenantren-B-il 2-(2- (((benziloksi)karbonil)amino)-asetamido)propanoat (molekül - 7-asetoksi-10,13-dimetil-l7-(6-metilheptan-2-il)- siklopenta[a]fenantren-3-il 2-(2- (((benziloksi)karbonil)amino)-asetamido)propanoat (molekül . 7-((tert-bütoksikarbonil)oksi)-10,13-dimetil-17-(6- tetradekahidro-lH-siklopenta[a]fenantren-3-il 2,2-dimetil- l,3-dioksolan-4-karboksilat (molekül 2.a); i 7-asetoksi-10,lB-dimetil-l7-(6-metilheptan-2-il)- siklopenta[a]fenantren-B-il 2,2-dimetil-l,3-dioksolan-4- karboksilat (molekül 2.b). Bulus ayrica, yukarida tanimlandigi üzere formülün (I) etkili miktarda en az bir bilesiginin uygulanmasi araciligiyla melanomlarin tedavisi ile ilgilidir. Aslinda, melanomlarin orijini olan melanositler, ektodermden (14) türetilen nöral krestten türetilir. Astrositler ve nöronlarin, ayrica ektodermden türetilmesi ve formülün (I) bilesiklerinin, anti-GBM ve anti-nöroblastom aktivitesi göstermesi nedeniyle, bu bilesikler, ayrica, melanomlara göre muhtemelen anti-kanser özelliklerine sahip olacaktir. Bir alternatife göre söz konusu tedavi, formülün (I) bir birinci bilesiginin uygulanmasina iliskin, yukarida tanimlandigi üzere en az bir adimi ve birinciden farkli olan formülün (1) ikinci bilesiginin uygulanmasina iliskin, yukarida tanimlandigi üzere en az bir adimi içeren sirali bir tedavidir. Asagidaki örnekler, bulusu gösterir ancak bulusu sinirlandirmaz. Bölüm I, kimyasal sentez ile ilgilidir. Örnekler 1 ve 2, formülün (I) bilesiklerinin hazirlanmasi için kullanilan sentez ara ürünlerinin hazirlanisi ile ilgilidir. Örnekler 3 ila 6, formülün HH bilesiklerinin hazirlanisi ile Bölüm II, formülün (I) bilesiklerinin biyolojik aktivitesi ile Örnek 1: 7beta-asetilkolesterol (bilesik 1.4) hazirlanisi Reaksiyon diyagrami, Sekil 1'de gösterilir. NaCI02.NHPI v .. . J". l ` › Dioksani'Su 0 J "-. " [ Asagidaki reaktifler kullanilmistir: MW Nb mol. esdeger Kütle veya Kolesteril benzoat l63.l3 lO mmol l.7 g Hidroksiftalimid esdeger Dioksan/Su 3/l 500 ml Kolesteril benzoat, dioksan/su karisimi, sodyum klorit ve N- hidroksiftalimid, bu sirada bir yogusturucu içeren 1 litrelik üç boyunlu bir balona konulur. Bu karisim, 50°C'de 6 saat isitilir. Reaksiyonun ilerleyisi, hekzan/EtZO 8/2 içinde silika plaka TLC (TLC silika jel 60 F254, Merck) ile izlenir. Olusum orani kabul edilebilir bir degere ulastiginda ham reaksiyon karisimi, %10 sodyum sülfit solüsyonu (500 ml) içine dökülür ve akabinde eter ile özütlenir. Elde edilen organik faz, doymus sodyuni hidrojen karbonat solüsyonu, akabinde su ve son olarak tuzlu su ile yikanir. Bu organik. faz akabinde sodyum sülfat üzerinde kurutulur, filtrelenir ve düsük basinç altinda buharlastirilir. Renkli yagli kalinti, etanol içinde rekristalizasyon ile saflastirilir. Elde edilen beyaz kati yeteri saflikta10 olmadigindan silika jel kromatografisi (silika SDS 60A, 35-70 pm) ile tekrar saflastirilir. Kati çökelti, bu yagin diklorometan içine alinmasi ile elde edilir. Saflastirma, 9hekzan/etil asetattan 90/10'a geçen elüent içinde gerçeklestirilir. Ürün beyaz kati formunda elde edilir. Analizler: 1H NMR in CDCl3, BRUKER 400 MHZ ile analiz. HPLC kolonu normal faz CHIRALCEL O-DH (ODHOCE-CE026 kolonu), elüent 9/1 Hekzan/iProH, 20 dakika, dalga boyu 190 nm. Retansiyon süresi 6.682 dakika, HPLC safligi %99.2. NaBH4/CeCI37H20 THF/MeOH Asagidaki reaktifler kullanilmistir: Kütle veya MW Nb mol. esdeger Ketokolesteril 504.76 15.8 mmol - 8 g benzoat 0.5 esdeger THF/MeOH 1:1 200 ml Ketokolesteril benzoat, THF/MeOH solvent karisimi ve hidrate seryum klorid, 500 ml'lik bir balona yerlestirilir. Ham reaksiyon karisimi akabinde, sodyum borohidrit eklenmeden önce bir buz banyosu ile 0°C'ye sogutulur. Gaz çikisi gözlenir, buz banyosu 1 saat tutulur, akabinde 18 saat ambiyant sicakliginda karistirilir. Ilerleme, 80/20 Hekzan/EtOAc elüenti içinde TLC (TLC silika jel 60 F254, Merck) ile izlenir. Olusuni oraninin yetersiz olmasi halinde 0.5 esdeger sodyum borohidrit eklenir. 50 ml su ve 200 ml diklorometan ham reaksiyon karisimina eklenir. Bir ayirma hunisine transfer sonrasinda organik faz geri kazanilir. Aköz faz tekrar DCM ile özütlenir. Organik fazlar kombine edilir, 1N hidroklorik asit solüsyonu ve akabinde doymus NaCl solüsyonu ile yikanir. Organik faz akabinde sodyum sülfat üzerinde kurutulur, filtrelenir` ve kendiliginden kristalize olan hafif renkli bir yagi vererek düsük basinç altinda buharlastirilir. Kati çökelti, kalintinin DCM içine alinmasi ile elde edilir. Bu ham ürün, 9/1 hekzan/EtOAc elüenti içinde silika jel kolonunda (silika SDS 6OA, 35-70 um) saflastirilir. Ürün, beyaz kati formunda elde edilir. Analiz: lH NMR in CDC13, BRUKER 400 MHz ile analiz. HPLC kolonu normal faz CHIRALCEL O-DH (ODHOCE-CE026 kolonu), elüent hekzan/iProH, 20 dakika, dalga boyu 190 nm. Retansiyon süresi 7.076 dakika, HPLC safligi %98.8. (m, SH, CHAr). Asagidaki reaktifler kullanilmistir: MW Nb mol. esdeger Kütle veya 7-ß- 505.76 9.9 mmol - 5 g Hidroksikolesteril benzoat Asetik anhidrit 20 ml Piridin 20 ml 7-ß-hidroksikolesteril benzoat, piridin ve akabinde asetik anhidrit, lOO ml'lik bir balon içine konur. Bu karisim ambiyant sicakliginda 16 saat karistirilir. Ilerleme, 9/1 hekzan/EtOAc elüenti içinde TLC (TLC silika jel 60 F254, Merck) ile izlenir. Ham reaksiyon karisimi düsük basinç altinda buharlastirilir. Etil asetat ile iki buharlastirma islemi gerçeklestirilir. Elde edilen kalinti, etil asetat içine alinir. Bu sekilde elde edilen organik faz, lN hidroklorik asit ile yikanir, sodyum. sülfat üzerinde kurutulur ve akabinde düsük basinç altinda buharlastirilir. Elde edilen beyaz kati, ek saflastirma yapilmadan bir sonraki adimda kullanilir. Verim: %lOO Analiz: lH NMR in CDCl3, BRUKER 400 MHz ile analiz. HPLC kolonu normal faz CHIRALCEL O-DH (ODHOCE-CE026 kolonu), elüent hekzan/iProH, 20 dakika, dalga boyu 190 nm. Retansiyon süresi 4.972 dakika, HPLC safligi %99.6. 951Na0HnAeoH Asagidaki reaktifler kullanilmistir: 7-ß- 548.81 9.1 mmol - 5 g Asetilkolesteril benzoat Metanol içinde %1 50 ml Metanol içinde 7-ß-aseti1kolesteril benzoat ve %1 sodyum hidroksit solüsyonu 100 ml'lik balona yerlestirilir. Bu karisim tamamen çözülene kadar ambiyant sicakliginda karistirilir. Ilerleme 7/3 hekzan/EtOAc eluent içinde TLC (TLC silika jel 60 F254, Merck) ile izlenir. Reaksiyonu tamamlamak amaciyla, ham karisim 40°C'de isitilabilir, bu durumda TLC ile izleme her 20 dakikada bir gerçeklestirilir. 200 ml etil asetat ve 50 ml su eklenir, akabinde ayirma hunisine transfer edilir ve fazlar ayrilir. Aköz faz etil asetat ile tekrar ekstrakte edilir. Organik fazlar, kombine edilir, sodyum sülfat üzerinde kurutulur, filtrelenir ve yagli bir kalinti vererek akabinde düsük basinç altinda buharlastirilir. Kalinti, kati birikintiyi hazirlamak üzere etil asetat içerisine alinir. Saflastirma, 9/1'den 7/3'e geçen hekzan/EtOAc eluenti içinde silika jel kolonu (silika SDS 60A, 35-70 pm) üzerinde gerçeklestirilir. Beklenen ürün, beyaz bir kati vererek kendiliginden kristallesen renksiz bir yag formunda elde edilir. Kolon, olusturulan 7-ß-hidroksikolesterolü geri kazanmak amaciyla %100 etil asetat ile yikanmistir. Analiz: CDCl3 içinde lH NMR ile analiz, BRUKER 400 MHZ. HPLC kolonu normal faz CHIRALCEL O-DH (ODHOCE-CE026 kolonu), eluent 9/1 hekzan/iProH, 20 dakika, dalga boyu l90nm. Retansiyon süresi 6.186 dakika, HPLC saflik %91.7. .13 (t, lH, CH). Örnek 2: 7beta-tert-bütiloksikarbonilkolesterol (bilesik 1.6) hazirlanisi Reaksiyon semasi Sekil 2'de gösterilir. Bilesik (1.6), Örnek l'in bilesiginden (1.2) hazirlanir. BOC20iTJ LLLXP Asagidaki reaktifler kullanilmistir: Kütle veya MW Nb mol. Esdeger benzoat Hekzan/THF 5:2 42 ml 7-ß-hidroksikolesteril benzoat, solvent, 2,6-dimetilaminopiridin ve akabinde tert-bütiloksikarbonil anhidrit 100 ml'lik tek boyunlu balona yerlestirilir. Bu karisim tamamen çözülene kadar ambiyant sicakliginda karistirilir. Ilerleme 8/2 hekzan/EtOAc eluenti içinde TLC ile izlenir. 50 ml EtOAc ve 10 ml su eklenir. Bu sekilde elde edilen organik faz sodyuni sülfat üzerinde kurutulur, filtrelenir` ve akabinde yagli bir kalinti vererek düsük basinç altinda buharlastirilir. Kalinti kati çökeltiyi hazirlamak amaciyla EtOAc içerisine alinir. Saflastirma, 95/5 hekzan/EtOAc eluenti içinde silika jel kolonu üzerinde gerçeklestirilir. Analiz: CDCl3 içinde 1H NMR ile analiz. Asagidaki reaktifler kullanilmistir: Kütle veya MW Nb mol. Esdeger 7-ß-t- Bütiloksikarbonil- 606.89 1.64 mmol - l g kolesteril benzoat Metanol içinde 7-ß-t-bütiloksikarbonilkolesteril benzoat ve %1 sodyum hidroksit solüsyonu 50 ml'lik tek boyunlu balona yerlestirilir. Bu karisim tamamen çözülene kadar ambiyant sicakliginda karistirilir. Ilerleme 7/3 hekzan/EtOAC eluenti içinde TLC ile izlenir. Reaksiyonu tamamlamak amaciyla, ham karisim 40°C'ye isitilabilir. 100 ml EtOAc ve 20 ml su eklenir. Aköz faz EtOAc ile yeniden ekstrakte edilir. Organik fazlar kombine edilir, sodyum sülfat üzerinde kurutulur, filtrelenir* ve akabinde yagli bir kalinti vererek düsük basinç altinda buharlastirilir. Kalinti kati çökeltiyi hazirlamak amaciyla EtOAc içine alinir. Saflastirma 9/l'den 7/3'e geçen hekzan/EtOAc eluenti içinde silika jel kolonu üzerinde gerçeklestirilir. Kolon olusturulan 7-ß-hidroksikolesterolü geri kazanmak amaciyla %100 EtOAc ile yikanir. Analiz: CDCl3 içinde lH NMR ile analiz. tetradekahidro-lH-siklopenta[a]fenantren-S-il 2-(2- (((benziloksi)karboni1)amino)asetamido) propanoat (molekül 1.a) hazirlanisi Basitlestirilmis ismi: 3-benziloksikarboni1-glisibil-alani1-7-ß- O-tert-bütiloksikarbonil-kolesterol zewAmCOOH Molekül (1.a) ara ürün bilesiginden (1.6) hazirlanir. Asagidaki reaktifler kullanilmistir: MW Nb mol. Esdeger 'veya 7-ß-t- Bütiloksikarbonilkolesterol 502 0.16 mmol - 80 mg (bilesik 1.6) Z-Gly-Ala-COOH 1.5 206.3 0.24 mmol 50 mg THF/DCE 1:1 6 m1 80 mg (0.16 mmol) 7-ß-t-bütiloksikarbonilkolesterol, 68 mg (0.24 mmol, 1.5 esdeger) dipeptit, 6 ml solvent karisimi (THF/DCE lzl), 50 mg (0.24 mmol, 1.5 esdeger) DCC, ve 30 mg (0.24 mmol, 1.5 esdeger) DMAP 10 ml'lik Wheaton sisesine yerlestirilir. Ham reaksiyon karisimi 24 saat ambiyant sicakliginda karistirilir. Ilerleme 7/3 hekzan/etil asetat eluenti içinde TLC ile izlenir. ml etil asetat ve 10 m1 su ham reaksiyon ürününe eklenir. Organik faz ayrilir, sodyum sülfat üzerinde kurutulür, filtrelenir ve akabinde düsük. basinç altinda buharlastirilir. Elde edilen yagli kalinti kati çökeltiyi hazirlamak. amaciyla etil asetat içine alinir. Saflastirma 7/3, akabinde 6/4, hekzan/etil asetat eluenti içinde silika jel kolonu üzerinde gerçeklestirilir. Analiz: CDC13 içinde lH NMR ile analiz. 4.78 (td, lH, CH), , 5.23 siklopenta[a]fenantren-B-il 2-(2-(((benziloksi)karbonil)amino)- asetamido)propanoat (molekül 1.b) hazirlanisi Basitlestirilmis ismi: 3-benziloksikarbonil-glisinil-alani1-7-ß- O-asetilkolesterol Z-GIy -Ala- COOH THFIDCE ÂNWH Ok Molekül (1.b) ara ürün bilesiginden (1.4) hazirlanir. Asagidaki reaktifler kullanilmistir: Kütle veya MW Nb mol. Esdeger 444 0.18 mmol - 80 mg Asetilkolesterol DCC 206.3 0.27 mmol 56 mg THF/DCE lzl 6 ml esdeger) dipeptit, 6 m1 solvent karisimi (THF/DCE 1:1), 42 mg esdeger) DMAP lO ml'lik Wheaton sisesine yerlestirilir. Ham reaksiyon karisimi 24 saat ambiyant sicakliginda karistirilir. Ilerleme 7/3 hekzan/etil asetat eluenti içinde TLC ile izlenir.30 ml etil asetat ve 10 ml su ham reaksiyon ürününe eklenir. Organik faz ayrilir, sodyum sülfat üzerinde kurutulür, filtrelenir ve akabinde düsük basinç altinda buharlastirilir. Elde edilen yagli kalinti kati çökeltiyi hazirlamak amaciyla etil asetat içine alinir. Saflastirma 7/3, akabinde 6/4, hekzan/etil asetat eluenti içinde silika jel kolonu üzerinde gerçeklestirilir. Analiz: CDCl3 içinde lH NMR ile analiz. tetradekahidro-1H-siklopenta[a]fenantren-B-il 2,2-dimeti1-l,3- dioksolan-4-karboksilat (molekül 2.a) hazirlanisi Basitlestirilmis ismi: 3-(S)-2,2-dimeti1-1,3-dioksolan-4- karboksil-7-ß-0-tert-bütiloksikarbonil-kolesterol 1) Dimetil -1,3-dioksolan-4-karboksi1at grubunun hazirlanisi Asagidaki reaktifler kullanilmistir: MW Nb mol. Esdeger Kütle veya dimetil-1,3- dioksolan-4- karboksilat Metanol 25 m1 The asetal, metanol ve akabinde lityum hidroksit 50 ml'lik bir balona yerlestirilir. Bu karisim 16 saat ambiyant sicakliginda karistirilir. Ham reaksiyon karisimi düsük basinç altinda buharlastirilir. Elde edilen kalinti 75 ml su içine alinir. Bu faz akabinde, lN hidroklorik asit ile pH l'e O°C'de asitlestirilir, akabinde 2 x 100 ml etil asetat ile özütlenir. Organik fazlar kombine edilir, sodyum sülfat üzerinde kurutulur, filtrelenir ve akabinde hafif renkli yagli kalinti vererek düsük basinç altinda buharlastirilir. Kalinti ek saflastirma olmaksizin kenetleme adiminda dogrudan kullanilir. Analiz: DMSO içinde 1H NMR analiz, BRUKER 400 MHz. 1H NMR (CDC13, , 1.42 (5, 3H, CH3), , 2) Molekül (2.a) Hazirlanisi Aseîal /DCCIDMAP O THFIDCE i 040( ;10 . 0% Molekül (2.a) ara ürün bilesiginden (1.4) hazirlanir. Asagidaki reaktifler kullanilmistir: Kütle veya MW Nb mol. Esdeger 7-ß-Asetilkolesterol 444 3.4 mmol - 1.5 g 3-(S)-2,2-Dimetil- karboksilik asit DCC 206.3 10.1 mmol 2.1 g THF/DCE (lzl) 50 ml 50 mg (9.9 mmol) 7-ß-t-bütiloksikarbonilkolesterol, 6 ml solvent 2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-karboksilik asit 10 ml'lik Wheaton sisesine yerlestirilir. Ham reaksiyon karisimini 24 saat ambiyant sicakliginda karistirmadan önce, 24.5 mg (11.9 mmol, 1.2 esdeger) DCC ve 14.5 mg (11.9 mmol, 1.2 esdeger) DMAP eklenir. Ilerleme hekzan/etil asetat eluenti içinde TLC ile izlenir. Reaksiyonu bitirmek amaciyla 2 saat 50°C'de isitilir. ml etil asetat ve 10 ml su hani reaksiyon ürününe eklenir. Organik faz ayrilir, sodyum sülfat üzerinde kurutulur, filtrelenir ve akabinde düsük basinç altinda buharlastirilir. Elde edilen yagli kalinti kati çökeltiyi hazirlamak amaciyla etil asetat içine alinir. Saflastirma 95/5, akabinde 9/1 hekzan/etil asetat eluenti içinde silika jel kolonu üzerinde gerçeklestirilir. Analiz: CDCl3 içinde 1H NMR ile analiz. CH3 Asetal), 2.29 (m, 2H, CHz), , 4.48 (ddd, lH, CH Asetal), 4.63 (m, lH, CH), 4.78 (td, lH, CH), 5.22 siklopenta[a]fenantren-S-il 2,2-dimeti1-1,3-dioksolan-4- karboksilat (molekül 2.b) hazirlanisi Basitlestirilmis ismi: 3-(S)-2,2-dimeti1-1,3-dioksolan-4- karboksil-7-ß-O-asetil-kolesterol Asetal iJ'DCC DMAP Molekül (2.b) ara ürün bilesiginden (1.4) hazirlanir. Asagidaki reaktifler kullanilmistir: Kütle veya MW Nb mol. Esdeger 7-ß-Asetilkolesterol 444 3.4 mmol - 1.5 g 3-(S)-2,2-Dimetil- karboksilik asit DCC 206.3 10.1 mmol 2.1 g THF/DCE (1:1) 50 ml Kolesterol, solvent karisimi ve asit 100 ml'lik balona yerlestirilir. Ham reaksiyon ürününü 24 saat ambiyant sicakliginda karistirmadan Önce DCC ve DMAP eklenir. Ilerleme 8/2 hekzan/EtOAc eluenti içinde TLC (TLC silika jel 60 F254, Merck) ile izlenir. 100 m1 etil asetat ve 50 m1 su ham reaksiyon karisimina eklenir. Organik faz ayrilir, sodyum sülfat üzerinde kurutulür, filtrelenir ve akabinde düsük basinç altinda buharlastirilir. Elde edilen yagli kalinti kati çökeltiyi hazirlamak amaciyla etil asetat içine alinir. 95/5, akabinde 9/1 hekzan/EtOAc eluenti içinde silika jel kolonu (silika SDS 60A, 35-70üm). Analiz: CDC13 içinde 1H ve 13C NMR ile analiz, BRUKER 400 MHz. HPLC kolonu normal faz CHIRALCEL O-DH (ODHOCE-CE026 kolonu), eluent 9/1 hekzan/iProH, 20 dakika, dalga boyu 190 nm. Retansiyon süresi 5.291 dakika, HPLC saflik %98-7. CH3 asetil), , A/ Protokoller Asagidaki protokoller tüm deneylere yönelik kullanilmistir: 1) Hücre Kültürleri Hücre kültürü Sigma-Aldrich, ref. 114754) için islenmis plastik düz-tabanli 96-gözlü kültür plakalari (NUNC, ABD) kullanilir; 1500 hücre 200 pl kültür ortaminda her göze tohumlanmistir. Islem sirasinda, lOO ul saf kültür ortami, lOO ul etanol veya lipozomlar içeren kültür ortami veya 100 ul aktif bilesen içeren kültür ortamiher göze eklenir; islem sonrasi kültür ortaminin nihai hacmi gözlerin tamamina yönelik 300 ul'dir. Kültürler 37°C'de bir Sanyo inkübatörde (Japonya, model MCO- l9AIC-UV) ve %5 COz olan bir atmosferde inkübe edilir ve neme doyurulur. Hücreler ters mikroskop (Nikon Eclipse T8100, Japonya) ile gözlenir ve bir kamera (c-mount içeren DIJITAL kamera; LABOVER, Fransa) ile fotograf çekilir. Kültür örtüsü bir mikrobiyolojik güvenlik örtüsü MSC'dir (thermo SCIENTIFIC, model HERA SAFE KSlZ, Fransa). Hücre ikiye katlanma süresi asagidaki formüller kullanilarak hesaplanir: burada (a) ve (b), ta ve tb zamanlarinda hücrelerin sayisini (tbta) (15) temsil eder. Geçis, tripsin (bovin pankreas Tip 3, Sigma, Fransa) ayrismasi ile gerçeklestirilir. Hücre ayrismasi %0.05 (w/V) tripsin içeren sicakliginda gerçeklestirilir. Ayrismanin ardindan, hücreler hücrelere yönelik uygun kültür ortaminda süspanse edilir ve bir THOMA hücresi kullanilarak sayilir ve göz basina 1500 hücre elde etmek üzere ayni ortamda seyreltilir. a) Hücre hatlari Asagidaki glioblastom hücreleri kullanilmistir: ° C6 hatlari. Tür C6 hücre hatti, Benda Vd. (16) ile N-metilnitrozoüre ile indüklenen siçan beyin tümörlerinden elde edilmistir. Bu hücre türü, anti-GBM potansiyelinin degerlendirilmesine yönelik "in vitro" ve "in Vivo" model olarak kullanilir. Hatlar, daha önceki Strasbourg Neurochemistry Centre (U44 INSERM ve UPR kökenlidir. Kültür ortami, %70 Minimum Esas Ortam (MEM; (Fischer Scientifique, ref. 61100) ve %30 Hanks solüsyonundan (SIGMA, ref. H 9269) olusur. Asagidakiler kültür ortamina eklenir: %5 (v/v) nihai hacminde fötal dana serumu (FCS; Fischer Scientifique, ref. 10108165), siprofloksasin hidrokloridin bir antibiyotik solüsyonu 5 ug/mL (EUROMEDEX, ref. UC5074) ve Fungizone solüsyonu. Bu hücrenin ikiye katlanma süresi 17 saattir. - Insan kökenli GBM hatlari Insan glioblastom hatlari (GBM, U-87 MG hatti) ve bunlarin kültür ortami (Eagle Minimum Esas Ortani veya EMEM), ATCC'den (ABD, ref. ATCC- HTB-14) elde edilmistir. Hücrelerin kültürleri baslatilir ve ATCC tavsiyelerine göre sürdürülür. Bu hatlar, anti-GBMZ potansiyelinin test edilmesine yönelik. "in vitro" ve süresi 16 saattir. Asagidaki insan hücrelerinin primer kültürleri de kullanilmistir: o Astrosit hücreleri Kullanilan insan kökenli astrosit hücrelerinin yani sira, %2 (v/v) FCS serumu (ref. OOlO), astrosit büyüme proteinleri (AGS, ref. 1852) ve bir penisilin/streptomisinden (ref. 0503) olusan kültür ortami ScienCell, ABD'den (ref. 1800) elde edilmistir. Bu insan astrositlerin ikiye katlanma süresi 96 saattir. - Hepatik hücreler Insan kökenli olan bunlar, %10 (V/v) FCS içeren kültür ortami edilmistir. Bu hücrelere yönelik ikiye katlanma süresi 24 - Renal hücreler Insan kökenli olan bu hücreler, %10 (V/V) FCS içeren kültür ortami (ref. elde edilmistir. Ikiye katlanma süresi 96 saattir. o Kardiyak hücreler Insan kökenli olan bu hücreler, %10 (V/V) FCS içeren kültür ortami gibi ScienCell, ABD'den (ref. 6300) elde edilmistir. Ikiye katlanma süresi 72 saattir. 0 Iskelet kasi hücreleri Insan kökenli olan bunlar, %10 (V/V) FCS içeren kültür ortami (ref. elde edilmistir. Bu hücrelere yönelik ikiye katlanma süresi 72 saattir. Insan kökenli, kanser hücrelerinin asagidaki özellikleri de kullanilmistir: - Karaciger kanseri hücreleri Bunlar, ATCC'den (ref. ATCC-HB-8065) elde edilmistir. Kültür ortami, MEM (Gibco, ABD; ref. 51200) ve %10 (V/v) FCS'den olusur. Ikiye katlanma süresi 60 saattir. o Prostat kanseri hücreleri Bunlar, ATCC'den (ref. ATCC-HTB-Sl) elde edilmistir. Kültür ortami karaciger kanseri hatlarina yönelik kullanilan ile aynidir. Ikiye katlanma süresi 60 saattir. - Gögüs kanseri hücreleri Bunlar, ATCC'den (ref. ATCC-HTB-l9) elde edilmistir. Kültür ortami karaciger kanseri hatlarina yönelik kullanilan ile aynidir. Ikiye katlanma süresi 20 saattir. o Kolon karsinomu (HT29/219 hatti) Bunlar, ECACC birikiminden (Ref. ECACC-85061109) elde edilmistir. Kültür kosullari, Sigma-Aldrich bilgilendirme brosüründeki tavsiyelere baglidir. 0 Nöroblastom (SH-SYSY hatti) Bunlar, ATCC birikiminden (Ref. ATCC-CRL-2266) elde edilmistir. Kültür kosullari, ATCC bilgilendirme brosüründeki tavsiyelere baglidir. - Kronik Miyelomonositik Lösemi (CMML) Kronik Miyelomonositik Lösemiye (CMML) sahip hastalarin kan numunelerinden saflastirilan hücreler, Klinik Hematoloji Merkezi ve Saint Eloi Hastensi Biyoterapi Merkezi (CHU de Montpellier) araciligiyla elde edilmistir. Kültür, bir besleme katmani üzerinde tohumlandirma teknigi araciligiyla gerçeklestirilmistir. Hücreler, ilgili hücreler için hedeflenen tedaviler tarafindan etkilenmeyen ve ilgili hücrelerin fizyolojisini büyük oranda degistirmeyen bir besleme katmani üzerinde tohumlandirilir. CMML hücreleri, insan embriyosu spinal kordundan (17) meydana gelen hücre hatlari üzerinde kültürlenmistir. Bu kültürlerin tamamina yönelik, kültür tedarikçi tavsiyelerine göre baslatilmistir ve sürdürülmüstür. b) Kültürlerin islemi Aktif bilesenler, mutlak etanol (AnalaR, NORMAPUR, VWR, Fransa) içinde çözünür veya 990 ul içinde seyreltilen 10 ul stok solüsyon gibi bir lipozomal solüsyon formundadir ve akabinde ortami BI-GBM: 300 ül) konsantrasyonlarini vermek üzere kültür gözlerine (200 ul kültür ortami) eklenir. Aktif bilesenler etanolik solüsyonda oldugunda, kültür ortami 2) Lipozomlarin hazirlanisi a) Temel metodoloji, Werthle vd. (10) tarafindan açiklanir. Kisaca, test edilecek. bilesikler, yani bulusa göre bilesikler (aktif bilesenler) veya 7ß-OHCH-C3-ester (sentezi Rakotoarivelo vd. (18) tarafindan açiklanan ve kontrol olarak kullanilan pozisyon 3'te bir oleat grubu ile esterlenen bir 7beta- hidroksisterol derivesi), soya fosfatidilkolin (Sigma) ve kolesteril-B-sülfat (Sigma), aktif bilesenler ve 7ß-OHCH-C3- ester durumunda diklorometandan, fosfatidilkolin durumunda bir kloroform: metanol karisimindan (9:l, V/V) ve kolesteril-3- sülfat durumunda kloroformdan hazirlanan stok solüsyonlarindan alinir. Molar oranlar, fosfatidilkolin, kolesteril-3-sülfat ve 7ß-OHCH-C3-ester ve aktif bilesenler için sirasiyla l M/O.l Buharlastirmanin ardindan, CaZ+ ve Mg2+ içermeyen bir PBS salin solüsyonu pH kuru bilesige eklenir. Tampon hacmi ve ürünlerin kütlesi, 20 veya 10 ul lipozomun 90 ul kültür ortamina eklenmesinin istenilen nihai konsantrasyonlari verecegi sekilde ayarlanir. Lipozomlar Liposofast (Sodexim, SA Muizon, Fransa) ekstrüzyon teknigi ile olusturulur. Solüsyon, polikarbonat filtrasyon membranlarindan (100 nm) 41 kez geçirilir. Lipozomlar, 22 um Millipore membranlar üzerinde filtrasyon ile sterilize edilir. Diger insan hücresi tipleri üzerindeki moleküllerin "in vitro" aktivitelerinin testlerine yönelik olarak, lipozomlarin üretimi, yukarida açiklandigi üzere, bir taraftan homojen boyut dagilimina göre ve diger taraftan aktif molekülün konsantrasyonuna göre olmak üzere iki farkli sekilde optimize edilmistir. b) Ayni boyut dagilimi ve zaman içinde stabil olan bir bilesim ile lipozomlarin elde edilmesi ("gelistirilmis lipozomlar"). Solventlerin buharlastirilmasindan sonra, lipid film, dikloroetanzetanol (3.3 : 1.5; vzv) içinde tekrar çözünür ve solüsyon, bir nitrojen akimi altinda tekrar buharlastirilir. Bir ml PBS, kuvvetli bir sekilde karistirilirken eklenir, lipid kalinti, tekrar çözecek sekilde temizlenir, akabinde 5 dakika kuvvetli sekilde karistirilir ve akabinde 20°C'yi asmayan bir sicaklikta 1 dakikalik 10 vurusta sonikasyon uygulanir (Elma, S 60H, Elmasonic). Elde edilen kabarçiklar, solüsyonun, sadece filtrasyon membranlarindan iki defa geçmesi disinda yukarida açiklandigi üzere kaliptan geçirilir ve sterilize edilir. Bu lipozomlar, 40 ila 80 nm'lik bir boyut dagilimina sahiptir ve 0.086 mg/ml mülekül (2.b) içerir. c) Lipozomlarin, yüksek konsantrasyonda moleküller (2.b.) ile elde edilmesi ("konsantre lipozomlar"). Lipid filmin hazirlanmasina yönelik olarak, fosfatidilkolinin konsantrasyonu ikiye katlanir; diger bilesiklerin konsantrasyonu gelistirilmis lipozomlar için yukarida açiklanan ile ayni kalir. Bu lipozomlarin üretilmesine yönelik prosedür, (1) sonikasyonun, 1 dakikada 20 vurus olmasi ve (2) solventlerin, bir döner buharlastirici (Buchi, modeller` V 850 ve R 215) kullanilarak düsük basinç (yaklasik 3 kPa; 30 mbar) altinda buharlastirilmasi disinda gelistirilmis lipozomlara yönelik açiklanan ile aynidir. Bu lipozomlar, 40'tan 80 nm'ye kadar bir boyut dagilimina sahiptir ve 0.133 mg/ml molekül (2.b) içerir. Lipozomlari olusturan moleküllerin karakterizasyonu, stabilitenin ve lipozomlarin bilesiminin arastirmasi, özütlemeden hemen önce 500 ul lipozom solüsyonunun, 18 saat 40°C'de 10 pl %2 (vzv) Triton X-lOO (Sigma) ile inkübe edilmesinin disinda Folch v.d. (19) yöntemine öre lipid bilesiklerin özütlenmesinden sonra gerçeklestirilir. Fosfatidilkolini olusturan yag asitlerinin analizi, rutin tekniklere göre metilasyondan sonra, kütle spektrometrisine (GC/MS) eslestirilen gaz kromatografisi araciligiyla gerçeklestirilir. Fosfatidilkolinin kolin grubunun karakterizasyonu, Reineckate (20) yöntemine göre gerçeklestirilir. Molekül (2.b), yukarida açiklandigi üzere (bilesiklerin hazirlanisi) HPLC araciligiyla veya asagida 5. noktada açiklandigi üzere silika ince-katman kromatografisi araciligiyla Lipozomlarin boyut dagilimi, floresan lipozomlar üzerinde ölçülür ve morfometrik analiz, epifloresans mikroskop (Axivert, Zeiss) ile görüntüler elde edildikten sonra Sert programi araciligiyla gerçeklestirilir. Floresan lipozomlar, kullanilan fosfatidilkolinin, gelistirilmis lipozomlar olmasi durumunda %5.0 ve konsantre lipozomlar durumunda %2.5 floresan fosfatidilkolin (NBD-PC-oleil; Avanti; Eksitasyon/Emisyon = 460 nm/534 nm) içermesi disinda, gelistirilmis veya konsantre lipozomlar için açiklanan ayni miktarda fosfatidilkolin ile üretilir. Lipozomlar, ilk olarak poli-D-lizin (Sigma, su içinde %1, wzv) ve akabinde laminin (Sigma, su içinde %0.6) ile kaplanan cam kültür Slaytlari üzerinde tortuludur. Lipozomlar, görüntüler elde edilmeden önce glutaraldehid (Merck) (lipozomlar glutaraldehid: PES; 15 : 37.5 : 97.5, V:V:V) ile sabitlenir. 3) Aktivite ve toksisite ölçümü Ayni yöntemler her iki duruma yönelik de kullanilir. Aktiviteye yönelik, test bilesiklerinin anti-GBM potansiyeli kullanilir ve toksisite, "in vitro" tutulan insan kökenli normal hücrelerde test edilir. Asagidaki ölçüm yöntemleri kullanilir: a) Hücre sazimi Fotograflar üzerinde bir hücre sayim yöntemi kullanilmistir. Örnegin, 96-gözlü plakalarda. kültürler` durumunda. ve kullanilan mikroskopun büyütmesinin (objektifler x 10 veya x 20, oküler x lO) bir islevi olarak, çekilen bir fotograf bir gözün çapinin l/5'ine esit bir çapta bir görüs alanini temsil eder. Bu nedenle, bir gözdeki hücrelerin toplam sayisi fotograf basina hücre sayisinin 5 katina esittir. Bu teknik, C6 hücreleri durumunda bir standart teknik (hücre katmaninin tripsinizasyonu, hücrelerin santrifüjlemesi, hücrelerin fizyolojik salin solüsyonunda süspansiyonu ve bir THOMA hücresi ile sayim) ile karsilastirilmistir. Elde edilen sonuçlar her iki yönteme yönelik aynidir. b) Protein analizi Kültür ortami, her gözden çekilmistir ve 50 pl Laemmli tamponu (0.1 ml Tris, 0.8 ml gliserol, 1.6 mL of %10 SDS, 8 ml q.s.f ultra-saf su) her göze eklenmistir. Kontrol gözlerinde, bovin serum albümin araliginda lO ul solüsyon (kristalize BSA, Sigma) eklenir; aralik göz basina 0 ila 20 ug'dir. Akabinde gözler 40 pl Laemmli tamponu ile desteklenir. Son olarak, 200 ul BCA reaktifi solüsyonu (Pierce, ABD; BCA Protein Analizi Kiti; ThermoScientific, Fransa) eklenir. Kültür plakalari, 37°C'de 30 dakika inkübe edilir. Her göze yönelik optik yogunluk okunur ve 570 nm'de bir plaka okuyucu (BioRad, ABD, iMark Mikroplaka okuyucu 12222) ile ölçülür. c) Hücre viyabilitesi (MTT testi) Bu test, özellikle mitokondriyal solunum olmak 'üzere hücresel solunumu saptamayi mümkün hale getirir. Tetrazolyum tuzu MTT'nin stok solüsyonu (3-(4,5-dimetilthiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolyum bromid, Sigma-Aldrich, ABD, ref. M5655) 10 mg MTT/ml PBS tamponu (fosfat tamponlanmis salin, SIGMA, ref. D 1408) ile hazirlanir. Bu solüsyon her gözdeki kültür ortamina direkt olarak eklenir; MTT'nin nihai konsantrasyonu 25 ug/ml'dir. Akabinde plaka en az 1 saat 37°C'de inkübe edilir. Esas olarak mitokondriyal elektron tasimasi tarafindan üretilen mavi formazan tanelerinin görünmesinin ardindan, yüksek yogunlukta formazan tanelerine sahip hücreleri saymak üzere fotograflar çekilmistir; bu teknik U87-MG hatlari durumunda kullanilir. Akabinde, bu hatta ve diger kültürlere yönelik, ortamlar uzaklastirilir ve 100 ul dimetilsülfoksit (DMSO, SDS CARLO ERBA, Italya) formazan depolarini çözmek üzere eklenir. Optik yogunluk okunur ve 490 nm'de plaka okuyucu (BioRad, iMark Mikroplaka okuyucu) kullanilarak ölçülmüstür. Viyabilite bazen Tripan mavisi dislama teknigi ile test edilir. 4) Hücrelerin immüno-etiketlenmesi ve görüntüler elde edilmesi Anti-CD, anti-NFL (mono, Santa Cruz) ve anti-fibroblast (ERTR7, Santa Cruz) primer antikorlari, ilk üç antikor durumunda l/lOO ve sonraki durumunda l/SO'ye seyreltilir. lDH-Rl32H (düsük dereceli gliyomlarin (21) markörü) ve CD31'in (endotelyal hücrelerin (22) markörü) saptanmasina yönelik olarak kullanilan primer antikorlar, sirasiyla Clinisciences (fare, seyreltme 1/20) ve Spring Bioscience (tavsan, seyreltme 1/250) tarafindan elde edilmistir. Primer antikorlarinin taninmasina karsilik gelen sekonder antikorlar, peroksidaza kenetlenen anti-tavsan antikorlar (keçi, Sigma), Dylight 488'e kenetlenen anti-fare (koyun, Sigma), Dylight 488'e kenetlenen anti-fare (koyun, Sigma) ve FITC'ye kenetlenen anti-tavsandir (tavsan, Sigma). Dilüzyonlar sirasiyla kullanilarak saptanir. Bunlar, sirasiyla Fischer Scientific (anti-fare, seyreltme l/lOOO) and from Sigma (anti-tavsan, seyreltme 1/500) tarafindan elde edilir. Hücreler, PBS (Fisher Scientific) içinde %O.1 Triton X-lOO (Sigma) ile 5 dakika gerçigen hale getirilir. Spesifik olmayan bölgeler, PBS içinde %2 BSA (Sigma) ile bloke edilir. Inkübasyonlar, anti-CD133, anti-GFAP, anti-NFL ve anti- Fibroblast antikorlari için sirasiyla ortam sicakliginda 1 saat, 4°C'de 48 saat, 4°C'de 24 saat ve ortam. sicakliginda 1 saat boyunca gerçeklestirilir. Sekonder antikorlar ile inkübasyon ortam sicakliginda 1 saat gerçeklestirilir. CD133 pozitif hücreler, DAB/H202 sistemi (Sigma) tarafindan saptanir ve bir optik mikroskop ile gözlenir. Floresans gözlenir ve görüntüler bir epifloresans mikroskobu (Axiovert, Zeiss, Almanya) kullanilarak elde edilir. substrat NOVARED vektörü (Eurobio) ile gerçeklestirilir. Renkli hücreler ayrica optik mikroskopi araciligiyla saptanir. Floresans gözlenir ve görüntüler bir epifloresans mikroskobu (Axiovert, Zeiss, Almanya) kullanilarak elde edilir. ) Lipidlerin ekstraksiyonu ve oksisterollerin tanimlanmasi Hücreler %O.9 NaCl ile yikanir, mekanik olarak toplanir, Tris- HCl tamponu (lO mM; pH 7.4) içinde süspanse edilir ve Potter (1000 r.p.m. ve 13 ileri geri hareket) ile homojenize edilir. Homojenlestirme buz içince gerçeklestirilir. Ekstraksiyon Folch Vd.'ye (19) göre 1 hacminde hücre süspansiyonuna yönelik 19 hacminde kloroform: metanol (221, V/V) eklenmesinden sonra 4°C'de gerçeklestirilir. Organik faz ve aköz faz 0.2 hacminde Döner buharlastiricida (Buchi, R-215, Isviçre) organik fazin buharlastirilmasindan sonra, lipid kalintisi kloroform içine alinir. TLC katmanlari kloroform: metanol (1:l, V/V) ile Ön yikamaya tabi tutulur ve 1 saat lOO°C'de aktive edilir. Lipidler asagidaki sistem ile ayristirilir: petrol eter (kaynama noktasi: standartlar kolesterol, 7-keto-kolesterol, 7beta-OHCH, 7beta- OHCH-C3-ester ve moleküldür (2.b). Lipidler ve standartlar Maccala reaktifi ile tespit edilir. Rf degerleri sirasiyla kolesterol, 7-keto-kolesterol, 7beta-OHCH, 7beta-OHCH-C3-ester Her bir standarda yönelik 0.5 ila Zug arasinda degisen kalibrasyon araliklari ayri bir sekilde gerçeklestirilir. Ilgili noktalarin yogunluklari gelistirilmis olan ince silika katmanlarinin taranmasindan sonra standartlara göre hesaplanir. Kullanilan solventler AnalAR veya HPLC safligindadir. 6) LDH'nin (laktat dehidrojenaz; EC 1.1.1.27) aktivitesi ve inhibisyonunun analizi LHD'nin. ve bunun inhibisyonunun aktivitesinin, bir rutin inhibitör, oksamat (23) araciligiyla ölçümleri, standart olarak Lactobacillus leichmannii'nin (LL) (Sigma) saflastirilmis LDH'si kullanilarak spektrometrik yöntem (24) araciligiyla dogrulanmistir. Daha sonra, LDH aktiviteleri ve bunlarin inhibisyonu, "jel içinde analiz" teknigi (25) araciligiyla saptanmistir. Kullanilan aktivitenin kaynagi, insan GBM hatlari U87-MG'den kismen saflastirilmis (LDH GBM) LDH LL ve LDH'dir. "Jel içinde analiz" saptamasi, LDH LL ve LDH GBM numunelerinin elektroforez jelleri üzerinde izoelektrigin odaklanmasindan (IEF) sonra gerçeklestirilmistir. a) LDH GBM'nin kismen saflastirilmasi Fosfat tamponu (50 mM, Ph 7.2.Pi) üzerinde biriken hücreler, birkaç dondurma (-20°C)/çözme döngüsü geçirir ve hücresel materyal, homojenize edilir. 4°C'de 45 dakika l0,000g'de santrifüjlemeden sonra, üst faz toplanir ve %10 gliserol (vzv) içeren alikotlar, -80°C'de dondurulur. Istenen sürede, alikotlar, çözüldüktan sonra, Pi'de hazirlanan filtrasyon kolonu (Biogel P-60, BioRad) üzerinde kromatografiye tabi tutulur. Jelin hacmi 9 nü'dir ve kolonun iç çapi, 0.4 cm'dir. Elüsyon, atmosferik basinçta gerçeklestirilir. 1.4 ml'lik ilk fraksiyon uzaklastirilir ve LDH aktivitesi, sonraki 2 ml'de toplanir. Bu fraksiyonun (LDH GBM) protein bilesenleri, SDS PAGE teknigi ile, akabinde gümüs nitrat lekeleme veya Western blot ile karakterize edilmistir. LDH'nin moleküler agirlik karakteristikleri bulunur (alt-birim için 31 kDa veya bunun bir çaptaki baglantisi için 62 7.5 (%T) ve 2.6'lik (%C) mini-jeller, soguk. bir hazne içinde önceden odaklandiktan sonra 7'den 5'e kadar olan araliktaki bir pH gradyani olusturmayi mümkün hale getirerek, Amfolinler (BioRad) ile Pi içine dökülür. Kullanilan konteynerler, mini- protean 3 tipe (BioRad) sahiptir. Anot tamponu, 2.0'lik bir pH'ye sahiptir ve katot tamponu, l0.0'lik bir pH`ye sahiptir. LDH LL ve LDH GBM numuneleri, denatürasyon olmaksizin tortulasir ve odaklanma, soguk hazne içinde voltaj lOOV'den 300V'ye çikarilarak 210 dakikada gerçeklestirilir. c) LDH activity LDH aktivitesi, laktat/NAD/MTT/fenazin metosülfat sistemi (IEF jelindeki formazan türünün bir çökeltisinin olusumu) araciligiyla saptanir; bu sistem, referans (25) ile belirtilir. Etanolik formda (36 mM) oksamat (18 mM) veya molekül (2.b) eklenmesi, LDH LL ve LDH GBM aktivitelerinin inhibisyon derecesini ölçmeyi mümkün hale getirir. B/ "In vitro" anti-GEM aktivitesi Asagidaki örnekler 7 ila 11, bulusun düzenlemeleri olarak degil, ancak bulusun anlasilmasi için faydali örnekler olarak gösterilir. B.1. Hayvan modeli C6 hücrelerinin kültürleri (siçan) yukarida bahsedilen (bölüm ll, A) çalisma kosullari altinda kullanilmistir. Örnek 7: C6 hücrelerinin (siçan) kültürleri üzerinde "in vitro" anti-GEM aktivitesi Elde edilen sonuçlar asagida Tablo 1'de ve Sekil 3'te özetlenir. Test edilen moleküller 1.a 2.a 1.a akabinde um 15 um 15 um +7.5 um Canli rezidüel hücreler Sekil 3 (büyütme 20 X 10) molekül (1.a) (Örnek 3) varliginda 19 gün ve 35 günde molekül (1.a) ve akabinde molekül (2.a) (Örnek ) ile sirali muameleden sonra veya yukarida bahsedilen (bölüm görünümünü gösterir. Sonuçlar (Tablo 1) 19 gün muameleden sonra molekülün (1.a) etanolik formda sitotoksik oldugunu gösterir. 15 uM 1.a'da ve 14 günlük muameleden sonra, hücrelerin sayisi, proteinlerin seviyesi ve MTT analizi en az 19 günde %97'1ik bir indirgemeye ulasmak amaciyla %30 indirgenir. 19 günlük muamelede, doza bagimlilik` da 7.5 ve 3.3 uM 1.a içine gözlenir` ve 15 uM'de kontrol kültürlerine göre MTT/hücre oraninda %20'lik bir artis gözlenir. Rezidüel hücreleri uzaklastirmak amaciyla, sirali muamele kullanilmistir. Hücreler ilk olarak 15 uM molekül (1.a) ile muamele edilir` ve muamelenin 19. gününde molekül (2.a) 7.5 uMZlik konsantrasyonda eklenir. Herhangi bir canli hücre gözlenmez; yalnizca hücre "kadavralari" Sekil 3'te gösterildigi üzere hücre kültürünün kati substratina (gözün tabani) yapisir. Özetle, molekül (1.a), ve akabinde molekül (2.a) ile sirali muamele, bu hücre tipine göre bütün bir etkinlik gösterir. Gözlemler, yikimdan önce hücrelerin genel solunumundaki artisi gösterir. B.2. Insan modeli: insan hücrelerinin (U-87 GM hatti) kültürleri üzerinde "in vitro" anti-GEM aktivitesi B.2.1 "In vitro" modelin ve sonuçlarin ifadesinin tanimi a) Farkli hücre tiplerinin karakterizasyonu U-87GM hücreleri yukarida açiklanan (bölüm 11, A) çalisma kosullari altinda kültürlenmistir. Kültürler, iki hücresel bilesenden olusur: normal (kanseröz olmayan) hücreler gibi davranan hücrelerden olusan bir hücre katmani ve GBM tipi hücrelerden olusan hücre agregalari. Sekil 4, kültürün karakteristigi olan bir fotonik görüntüyü (x 100) gösterir. Yarim küre seklinde hücre agregalarinin (CA) sabitlendigi bir hücre katmani (CL) görülebilir. Sekil 5 (x 200), immüno etiketleme yoluyla insan GBM'lerde açiklanan CD133+ hücrelerinin (kök hücreler) hücre agregalarinda bulundugunu ve CL'de bulunmadigini gösterir. Immünofloresans etiketleme (Il ve CA'da (Sekiller 6 ve 7; x 200) (26) normal astrositlerin (Sekiller 6 ve 7; x 200) ve CL ve CA'da nörofilamentlerin markörü olan GFAP varligini gösterir. Ancak, fibroblastlarin, çogalmaya yönelik yüksek potansiyele sahip hücrelerin spesifik etiketlemesi yalnizca CA durumunda bulunur. Oldukça az IDHl- Rl32H-positif hücre, CL ve CA'da gözlemlenir. Tersine, CD31- pozitif hücreler, CL ve CA'da mevcuttur. Optik mikroskopi araciligiyla gözlem açikça, CA'larin hücreleri oldukça hizli bir sekilde bölünürken (en çok 16 saatlik ikiye katlanma süresi), CL'yi olusturan hücrelerin 96 saatlik ikiye katlanma süresinin oldugunu gösterir. Bu gözlemler, gelistirilmis olan hücre sayim yöntemini (etiketlenmis veya formazan tanelerini içermeyen hücreler) dogrular; aslinda tripsinizasyon sonrasindaki sayim CL ve CA hücreleri arasinda ayrim yapamaz. Görüntüler ayrica, yalnizca CA'larin bir GBM karakterine (kisa ikiye katlanma süresi, kök hücrelerin ve fibroblastlarin varligi) sahip oldugunu gösterir. Elde edilen sonuçlar bu nedenle CA üzerinde test edilen moleküllerin etkisinde olanlardir. b) Sonuçlarin ifadesi Sonuçlar asagidaki parametrelere göre ifade edilir: (i) Moleküllerin etkinligi, bulusa göre o Rezidüel hücrelerin, özellikle kök hücrelerin ölçülmesi. o Bulusa göre moleküllerin zamana göre etkinligi Bulusa göre molekülleri içeren kültür ortami taze ortam ile degistirilir` ve "de novo" hücre çogalmasi incelenir: herhangi bir "de novo" çogalma kök hücreler dahil olmak üzere GBM hücrelerinin toplam yikimini göstermez. (ii) GBM hücrelerinin toplam solunumu üzerinde moleküllerin (iii) Bulusa göre moleküller ile elde edilen sonuçlarin ?ß- OHCH-C3-ester (kontrol) ile elde edilenler ile karsilastirilmasi. B.2.2 Sonuçlar U87-MG (insan) hücreleri kültürü yukarida bahsedilen (bölüm II, A) çalisma kosullari altinda kullanilmistir. 7beta-OHCH-C3-ester kontrol olarak kullanilmistir. Örnek 8: Lipozomal formda molekül 2.a'nin (Örnek 5) "in vitro" anti-GEM aktivitesinin çalismasi Elde edilen sonuçlar asagidaki Tablo 2'de sunulur. Lipozomal formda Lipozomal formda 7ß- molekül 2.a (15 üM) OHCH-C3-ester (80 üM) Islem Günü Proteinler MTT/hücre Proteinler MTT/hücre 0 O 15 100 Bu sonuçlar, üç kopya halinde gerçeklestirilen üç bagimsiz deneyin ortalama degeridir. Sonuçlar kontrollere göre yüzde cinsinden ifade edilir. Gözlemler, lipozomal formda 15 uM molekül 2.a'nin 15 günlük tedavi sonrasi GBM hücreler (CA) varligini sifira düsürdügünü gösterir. Yalnizca yavas bölünmeli (CL) hücreler kalir. Etki, doz-bagimli degildir. 7ß-OHCH-C3-ester GBM'ler (CA) üzerinde etanolik formda etki etmez (ayrica bakiniz, Örnek 9) ve yalnizca lipozomal formda, yani 80 uM'de etki gösterir. Etkinligi daha iyi degildir veya lipozomal formda 7ß-OHCH-C3-ester dozunu azaltir veya Ancak, 13. islem gününde 7ß-OHCH-C3-ester içeren kültür ortami uzaklastirildiginda ve bu ilaci içermeyen taze kültür ortami ile degistirildiginde, hücre çogalmasi ve buna. paralel olarak iki gün sonra MTT testinde bir artis gözlenir, bu artis %40'tir. Bu molekül yoklugunda bu, molekül 2.a'ya yönelik durum degildir, sifir hücre çogalmasi gözlenir. (8 günlük islem) Tablo 2 ayrica, hücrelerin çogu yok oldugunda bu zamanda MTT/hücrede büyük bir artis (kontrollere göre gösterir. Bu, 80 uM'de bile lipozomal 7ß-OHCH-C3-estere yönelik durum degildir, MTT/hücre orani degisiklik göstermez. Bu gözlem, iki molekül arasinda farkli bir etki gösterir; genel hücresel solunum hücrelerin kitlesel ölümünden önce artar. Bu, 7ß-OHCH-C3-ester için geçerli degildir. Örnek 9: Etanolik formda molekül 2.b'nin (Örnek 6) "in vitro" anti-GEM aktivitesi çalismasi Elde edilen sonuçlar, asagidaki Tablo 3'te sunulur. Etanolik formda 7ß- Etanolik formda OHCH-CS-ester (30 uM) molekül 2.b (30 uM) Islem Günü Proteinler MTT/hücre Proteinler MTT/hücre 22 O 0 100 100 Bu sonuçlar, her biri üç kopya halinde gerçeklestirilen üç bagimsiz deneyin ortalama degeridir. Sonuçlar, kontrollere göre yüzde olarak ifade edilir. 30 uM üzerinde, 7ß-OHCH-C3-ester etanol içinde daha fazla çözünür degildir. Gözlemler, molekül oldugunu gösterir; 2.b'nin ardindan sifir GBM hücresi kalir. 7ß-OHCH-C3-estere aktivitesi gözlenir. yönelik aktif bilesenin etanolik formda hücresel solunum hücre ölümünden önce artar. degildir, uzaklastirilmasinin etanolik anti-tümör Ayrica, 22 günde bilesik 2.b'yi içermeyen kültür ortaminin taze ortaHL ile degistirilmesi herhangi bir hücre çogalmasina neden Örnek 10: A/B peroksidaz sistemi ile CD133+ kök hücrelerin immüno-etiketlemesi Immüno etiketleme yukarida açiklandigi üzere (bölüm II, A) gerçeklestirilir. Elde edilen sonuçlar asagidaki Tablo 4'te sunulur. CD133+ hücreler ISLEM Islenmeyen Etanolik formdar Lipozomal formda GÜNÜ kültürler molekül 2.b 7ß-OHCH-C3-ester (Kontroller) (30 uM) (80 uM) 4 l00 100 100 22 100 O 50 Bu sonuçlar, üç kopya halinde gerçeklestirilen üç bagimsiz deneyin ortalama degeridir. Sonuçlar, kontrollere göre CDl33 pozitif hücrelerin yüzdesi olarak ifade edilir. Bu deneyler Örnekler 8 ve 9'da açiklananlardan bagimsizdir. Tablolar 2 ve 3'te açiklanan gözlemlerdeki gibi, lipozomal formdaki 7ß-OHCH-C3-ester ve etanolik formdaki molekül 2.b islenmemis kontrol hücrelerine göre proteinlerin seviyesini %85 ve %100 azaltir. Sonuçlar, kök hücrelerinin molekül 2.b ile tamamen yok oldugunu gösterir. Bu, lipozomal formda uygulandiginda bile 7ß-OHCH-C3- Sekil 9 (CD133+ hücreleri ile immüno-etiketleme), açik bir sekilde 22 günlük islem sonrasi yok olmalarini gösterir. Bu, lipozomal formda 7ß-OHCH-C3-estere yönelik durum degildir (Sekil , CD133+ hücreleri ile immüno-etiketleme); bu durumda CD133+ hücrelerinin %SO'si halen kalinti hücrelerinde bulunur. Kültür ortaminin 22. günde bilesik 2.b içermeyen taze ortam ile degistirilmesi CD133+ kök hücrelerinin görünmesine neden olmaz. Örnek 11: Insan kökenli GBM'lerde "in vitro" etanolik formda molekülün (2.b) (Örnek 6) gidisatina iliskin çalisma Etanolik formda 30 uM molekül (2.b) ile muamele edilen GBM'den lipidlerin özütlenmesi ve analizi, muameleden 24 saat veya 10 gün sonra 7beta-OHCH-C3-ester varligini göstermez, bu ikinci süre, hücre Ölümünün tetiklendigi zamandir. Ancak 7beta-OHCH'ye transforme edilen %0.12 ve %O.l8 molekül (2.b), muameleden sirasiyla 1 gün ve 10 gün sonra gözlenir. Kontrol deneyleri, 7beta-OHCH'nin bu çok düsük seviyelerinin GBM'lerin ölümünü indüklemedigini gösterir. Örnek 12: Toksisite çalismasi Toksisite, insan kökenli çesitli normal hücre türlerinde "in a) Astrositler üzerinde Kullanilan hücreler, yukarida bahsedildigi üzere (Bölüm II, A) insan kökenli hücrelerdir (ScienCell, ABD, ref. 1800). Astrosit türü, normal astrositlerin standart markörü olan GFAP varligi ile dogrulanir (Sekil 11; büyütme x 200). Moleküller 2.a (lipozomal form) ve 2.b (etanolik form), muameleden 30 gün sonra 30 üM'de normal (kanserli olmayan) insan astrositlerinin primer kültürleri üzerinde toksik degildir. b) Diger hücreler üzerinde Kullanilan hücreler, yukarida bahsedildigi üzere (bölüm II, A) insan kökenli karaciger hücreleri (ScienCell, ABD, ref. 50200), böbrek hücreleri (ScienCell, ABD, ref. 4120), iskelet kasi hücreleri (ScienCell, ABD, ref. 3500) ve kalp hücreleridir (ScienCell, ABD, ref. 6300). Moleküller 2.a (lipozomal form) ve 2.b (etanolik form), 30 üM'de ve muameleden en az 30 gün sonra insan kökenli karaciger hücreleri, böbrek hücreleri, iskeley kasi hücreleri ve kalp hücrelerinin primer kültürleri üzerinde toksik degildir. Örnek 13: Molekülün (2.b) (Örnek 6) "in vitro" diger kanserler üzerindeki aktivitesine iliskin çalisma Kullanilan kanser hücreleri, yukarida bahsedildigi üzere insan kökenli karaciger (ref. ATCC-HB-8065), prostat (ref. ATCC-HTB- 81), gögüs (ref. ATCC-HTB-19) kanseri hücrelerinden ve kolon kanseri hücrelerinden (ECACC-HT29/219) elde edilir. üM'de ve etanolik formda molekül (2.b), hücre bölünmesi ve insan kökenli karaciger, prostat veya gögüs kanseri hücrelerinin solunumu üzerinde hiçbir etki göstermez. üM'de, gelistirilmis lipozomal formdaki molekül (2.b), kolon kanseri hücreleri için toksik degildir. Örnek 14. Kronik Miyelomonositik Lösemi (CMML) üzerinde gelistirilmis lipozomal formdaki molekülün (2.b) "in vitro" aktivitesinin çalismasi Beyaz kan hücreleri, CMML sikintisi çeken bir hastadan toplanan bir kan örneginden izole edilir. Hücreler, bir besleme katmani (17) üzerinde tohumlandirma araciligiyla kültürlendikten sonra 24 saat gelistirilmis lipozomal formda 10 üM molekül (2.b) ile tedavi edilir. Sonuçlar, Sekil lZ'deki fotograflarda gösterilir (büyütme 20 x Kontroller, bos lipozomlar ile tedavi edilen hücrelerdir: A harfi ile isaretli üst sol el fotografi, 48 saat tedaviden sonra ve B harfi ile isaretli alt sol el fotografi, 72 saat tedaviden sonra çekilmistir. 2.b ile tedavi edilen hücreler için, C harfi ile isaretli üst sag el fotografi 48 saat tedaviden sonra ve D harfi ile isaretli alt sag el fotografi, 72 saat tedaviden sonra çekilmistir. Sonuçlar, 72 saat tedaviden sonra dikkate deger bir molekül (2.b) etkisi gösterir. Hücre çogaltma, kontrol ile karsilastirildiginda önemli derecede yavaslatilir` ve nektrotik görünüme sahip birçok hücre gözlemlenir. Örnek 15. Insan nöroblastomlari (ATCC-CRL-2266) üzerinde moleküllerin (1.b ve 2.b) "in vitro" aktivitesinin çalismasi Nöroblastomlar, bos lipozomlar (kontroller) ile veya kültür basladiktan 24 saat sonra, molekül (1.b ve 2.b) içeren lipozomlar ile tedavi edilmistir. Hücreler, 22 uM molekül (1.b) veya 22 uM molekül (2.b) ile tedavi edilir. Lipozomal form, konsantre edilir. Sonuçlar, Sekil l3'teki (büyütme 10 x 10) fotograflarda gösterilir. Kontrol hücreleri için, A harfi ile isaretli üst sol el fotografi, 7 gün tedaviden sonra çekilmistir* ve B harfi ile isaretli alt sol el fotografi, 28 gün tedaviden sonra çekilmistir. Konsantre lipozomal molekül (l.b) ile tedavi edilen hücreler için, C harfi ile isaretli fotograf (ortada, üstte), 7 gün tedaviden sonra ve D harfi ile isaretli fotograf (ortada, altta), 28 gün tedaviden sonra çekilmistir. Konsantre molekül (2.b) ile tedavi edilen hücreler için, E harfi ile isaretli üst sag el fotografi, 7 gün tedaviden sonra çekilmistir. Sonuçlar, moleküle (l.b) iliskin dikkate deger molekül (2.b) aktivitesini gösterir. 28 gün tedaviden sonra, molekük (l.b), kontrol hücreleri ile karsilastirildiginda, neredeyse tüm hücreler için toksiktir. Molekül (2.b) için, radikal bir toksik etki, halihazirda '7 gün tedaviden sonra gözlemlenir; herhangi bir yasayabilir hücre gözlemlenmez. Örnek 16. Molekül (2.b) araciligiyla insan GBH'sinden "in vitro" (U87-MG hatlari) özütlenen LDH aktivitesinin inhibisyonunun çalismasi Bu örnek, bulusun bir düzenlemesi olarak degil, ancak bulusun anlasilmasi için faydali bir örnek olarak gösterilir. Bu deneylerin amaci, 2 dizi molekülün LDH'sinin enzimatik aktivitesinin inhibisyonuna yönelik potansiyeli göstermek olmustur. Çalisma, molekül (2.b) ile gerçeklestirilmistir ve bunun inhibe edici potansiyeli, Lactobacillus leichmannii'den (LL) LDH ve "A/ PROTOCOLS 6)" bölümünde yukarida açiklandigi üzere GBM hatlarindan (U87-MG) kismen saflastirilmis LDH üzerinde test edilmistir. LDH aktivitesi, IEF elektroforez jeller üzerinde "jel içinde analiz" teknigi araciligiyla saptanir, bunlar "A/ PROTOCOLS 6)" (25) bölümünde açiklanmistir, bu teknigin kesinligi, pH'nin 0.2 birimidir. LDH aktivitesi, LDH aktivitesinin konumlandirildigi yerde formazan türde koyu mavi bir çökelti araciligiyla saptanir. Sekil 14 (A), pHi 6.2'de LDH için ve pHi 6.4'te LDH GBM için LDH LL aktivitesini gösterir. Sonuçlar, aköz formda (18 mM) oksamat veya etanolik formda (36 mM) molekül (2.b) eklenmesinin, LDH LL'nin enzimatik aktivitesini neredeyse tamamen ve LDH GBM'ninkini (B) kismen inhibe ettigini gösterir. GBM'nin hücre ölümünden önce (Tablolar 2 ve 3; Sekiller 8 ve 9) MTT lekelemedeki artis ile kombine edilen molekül (2.b) araciligiyla LDH GMB'nin enzimatik. aktivitesinin inhibisyonuna yönelik potansiyel, formülün (I) bilesiklerinin eylem mekanizmasinin hipotezini geçerli kilar: bulusa ait moleküller, LDH aktivitesini inhibe edecektir ve sonuç olarak mitokondriyal solunum yanmasina neden olacaktir. Bibliografi 2. Zhou Y, Zhou Y, Shingu T, Feng L, Chen Z, Ogasawara M, 4. Tennant DA, Duran RV, Gottlieb E. Nature Reviews Cancer. . Cheng KP, Nagano H, Bang L, Ourisson G, Beck JP. Journal 6. Carvalho JFS, Cruz Silva MM, Moreira JN, Simoes 8, Sa e 6393. 7. Kupferberg A, Teller G, Behr P, Leray C, Urban PF, Vincendon G, Mersel M. Biochim Biophys Acta. 1989, 1013: 231-23. 8. Kupferberg' A, Behr` P, Mersel M. Biochini Biophys Acta. 9. Adamczyck M, Scherrer E, Kupferberg A, Malviya AN, . Werthle M, Bochelen D, Adamczyck M, Kupferberg A, Poulet P, Chambron J, Lutz P, Privat A, Mersel M. Cancer 11. Clarion L, Schindler M, de Weille J, Lolméde K, Laroche-Clary A, Uro-Coste E, Robert J, Mersel M, Bakalara 13. Yusuf RZ, Wang YH, Sccaden DT. Nature Medicine 2012, 18: 865-867. 14. Langman J. Embryologie Médicale [Medical Embryology], 83: 37-46. . Manford K, Patterson JR. Methods in Enzymology. 1979, 58: 150. 16. Benda P, Lightbody J, Sato G, Levine L, Sweet W. 17. Rouleau C, Mersel M, de Weille J, Rakotoarivelo C, Fabre C, Privat A, Langley K, Petite D. J of Neurosc. 2000, 87 : 50-60. 18. Rakotoarivelo C, Adamczyck M, Desgeorges M, Langley K, Lorentz JG, Mann A, Ricard D, Scherrer E, Privat A, Mersel 19. Folch J, Lees M, Sloane-Stanley GH. J Biol Chem. 1957, . Kates M. Techniques of Lipidology, Work TS and Work E 21. Balss J, Meyer J, Mueller W, Korshunov A, Hartmann C, 22. Bogen SA, Baldwin HS, Watkins SC, Albelda SM, Abbas AK. 24. Scientific Committee. Recommandations pour la mesure de la concentration catalytique de la lactate dehydrogenase dans le serum humain a 30°C. [Recommendations for measuring the catalytic concentration of lactate dehydrogenase in human serum at 30°C]. . Seger J., Lucotte G. La Pratique de 1'é1ectrophorêse appliquée a la detection des polymorphismes humains. [The electrophoresis technique applied to the detection of human polymorphisms]. Masson Ed., 1982, 68-69 26. Sensenbrenner M, Devilliers G, Bock E, Porte A. TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR