RS54968B1 - Farmaceutske kompozicije koje sadrže anakinra bez citrata - Google Patents

Description

OBLAST TEHNIKE

[0001]Predstavljeni pronalazak se odnosi na farmaceutske kompozicije koje sadrže anakinra kao aktivno jedinjenje u odsustvu natrij um citrata. Navedene farmaceutske kompozicije su korisne za lečenje poremećaja posredovanih preko IL-1 i za smanjenje nociceptivnog bola u toku takvog lečenja.

OSNOVA TEHNIKE

[0002]Farmaceutske formulacije pogodne za parenteralnu primenu tipično sadrže (a) aktivni molekul; (b) puferujuće sredstvo sa dovoljnim puferujućim kapacitetom za kontrolu pfl rastvora; i (c) izotonično sredstvo da bi se obezbedila izotoničnost formulacije. Poreci toga, dodatne komponente mogu biti dodate kao što su antioksidansi. specifični stabilizatori, surfaktanti, konzervansi, itd., prema potrebi u zavisnosti od specifičnog aktivnog sredstva i njegove nameravane upotrebe.

[0003]Izbor komponenti formulacije mora biti zasnovan na temeljnim studijama koje procenjuju različite komponente u odnosu na njihovu funkciju u formulaciji i optimalan stabilizujući kapacitet. Pored toga, druge studije formulacije moraju biti izvedene za identifikaciju drugih parametara rastvora, kao što su optimalan pf l i izotonična jačina za specifičan aktivan molekul i njegovu nameravanu upotrebu. Studije su takođe izvedene za optimizaciju koncentracija odgovarajućih komponenti formulacije. U mnogim slučajevima, moraju se razmatrati dodatni aspekti krajnje formulacije i njene kliničke upotrebe, kao što su odgovarajuća injekciona zapremina, kompatibilnost sa fiziološkim tečnostima ili tkivima, viskozitet, lokalna tolerancija itd.

[0004]Jedan primer lokalne tolerancije odnosi se na selekciju vrste pufera. Poznato je da specifične vrste pufera mogu da izazovu lokalnu netoleranciju ili bol od injekcije. Objavljeno je da natrijum citrat izaziva bol posle subkutane injekcije u nekim slučajevima (Frenken. 1993, Laursen, 2006). Pored toga, koncentracija pufera bi trebalo daje minimizirana dalako da bude optimalna u odnosu ne samo na stabilnost pH u formulaciji leka u toku dugotrajnog čuvanja, već takođe da ima minimalni uticaj na fiziološke uslove na mestu injekcije (npr. Fransson and Espander-Jansson, 1996). Spisak komponenti koje se mogu dodati formulaciji za parenteralnu primenu je ograničen (Wang and Kowall, 1980; Nema, 2006). Određeni broj aspekata se mora razmatrati; bezbednost, pre iskustva na ljudima, dostupnost od nabavljača, itd. Stabilnost proteinskih lekovain vivoiin vitroje složena gde se paralelno javlja više reakcija razlaganja, kao što su oksidacija, deamidacija, agregacija, itd. Jedna glavna reakcija koja se javlja je formiranje agreagata. Proteinski agregati mogu da se formiraju preko kovalentnih ili ne-kova!entnih puteva, i mogu biti rastvorljivi ili nerastvorljivi. Prisustvo proteinskih agregata je glavni problem sa tačke gledišta bezbednosti jer ono može da utiče na sekundarnu i tercijarnu strukturu proteina. Prisustvo specifičnih ne-nativnih proteinskih struktura je povezano sa povećanom imunogenošću proteina koji potencijalno izazivaju smanjenu efikasnost ili čakin vivoimunološke reakcije nativnih proteina, sa rezu Iti raj učim stanjima koja su opasna po život.

[0005]Bolesti posredovane preko Interleukina-1 obuhvataju reumatoidni artritis (RA), inflamatornu bolest creva (IBD), sepsu, sindrom sepse, osteoporozu, ishemičnu povredu, bolest transplanta protiv domaćina, reperfuzionu povredu, astmu, insulinski dijabetes, mijelogenu i druge leukemije, psorijazu i kaheksiju. Ove i druge inllamatorne bolesti su okarakterisane proizvodnjom citokina, uključujući interleukin-1.

[0006]Za one sindrome u kojima je ustanovljena uloga IL-1 u patologiji bolesti, kliničke manifestacije bolesti mogu brzo da se ublaže tretmanom sa anli-IL-1 lekovima. Jedan takav lek je Kineret®, čija aktivna komponenta, anakinra, je rekombinantna verzija prirodnog antagonista IL-1 receptora (IL-lra). Anakinra je opisan u, npr. US 5,075,222.

[0007]Kineret® (anakinra za injekciju) je formulisan u 150 mg/ml sa 10 mM natrijum citratnim puferom (pH 6-7) i natrijum hloridom (140 mM) kao izotonićno sredstvo. Poreci toga, 0.5 mM EDTA i 0.1 % (tež./tež.) polisorbala 80 su korišćeni kao stabilizatori. Izbor natrijum citrata kao puferske komponente za anakinra zasnovan je na detaljnim studijama koje procenjuju kratku i dugotrajnu stabilnost anakinra u uslovima u realnom vremenu. Nekoliko potencijalnih puferskih komponenti je procenjivano, od kojih je jedna natrijum fosfat i natrijum citrat je identifikovan tako da obezbeđuje optimalnu stabilnost u odnosu na agregaciju anakinra (Raibekas et al., 2005). Agregacija anakinra je bila glavni problem za izbor puferske komponente. Koncentracija natrijum citrata je minimizovana što je više moguće uzimajući u obzir lokalnu tolerabilnost.

[0008]LI toku kliničke upotrebe anakinra u 10 mM natrijum citratu. nađeno je da je formulacija izazvala probleme sa lokalnom tolerancijom na mestu subkutane injekcije (Thaler, 2009). Reakcije mesta injekcije nisu retke sa subkutanom primenom proteinskih lekova i opšti su problem (Haller, 2008) i povezane su sa kliničkom upotrebom velikog broja proteinskih lekova. Više od 50% pacijenata koji koriste anakinra za injekciju ima reakcije na mestu injekcije do određenog stepena za prve injekcije. Priroda i mehanizam lokalne reakcije su ispitivani i napravljeno je nekoliko zaključaka (Bendele, 1995). Zaključeno je da reakcija mesta injekcije ima višestruke uzroke uključujući sam molekul anakinra i komponente formulacije, natrijum citrat koji ima veoma veliki uticaj. [0009JPosledično, postoji potreba za kompozicijama anakinra. pogodnim za injekciju, koje su stabilne i koje izbegavaju nedosatatke kompozicija anakinra koje sadrže natrijum citrat.

KRATAK OPIS CRTEŽA

{0010]

Slika 1 prikazuje broj sub-vidljivih čestica (veće od 5, 7.5 i 10 um u veličini) po ml različitih kompozicija anakinra (označene E, G. H, O, R, S, T i U).

Slika 2 prikazuje broj čestica kao na Slici 1, pošto su navedene kompozicije anakinra čuvane 1 mesec na +25°C.

Slika 3 prikazuje broj čestica kao na Slici 1. pošto su navedene kompozicije anakinra čuvane 3 meseca na +5°C.

Slika 4 prikazuje inflamaciju, kao što je naznačena preko povećane zapremine šape. kod mužjaka Sprague-Dawley pacova posle primene različitih kompozicija anakinra.

OPIS PRONALASKA

[0011]Prema pronalasku iznenađujuće je pokazano da anakinra. pogodan za injekciju, može biti dovoljno stabilizovan bez upotrebe natrijum citrata. Nasuprot nalazu koji su dali Raibekas et al. (2005), anakinra može biti formulisan u vodenom rastvoru sa odgovarajućim izotoničnim sredstvom i dodatnim stabilizatorima, ali bez natrijum citrata kao pufera. Pod odgovarajućim uslovima pripreme, anakinra će obavezno kontrolisati pH rastvora. Čak rastvor bez dodatog pufera može biti dovoljno stabilan.

[0012]Posledično, obezbeđena je farmaceutska formulacija koja sadrži efikasnu količinu anakinra, pri čemu je navedena farmaceutska formulacija bez citrata.

[0013]Prema pronalasku navedena formulacija je stabilna u odsustvu citrata, pri čemu termin "stabilan" ukazuje, na primer, da je odsustvo agreagacije i/ili stabilnost pH, najmanje, približno jednako sličnoj formulaciji anakinra koja sadrži 10 mM natrijum citrata (pH 6-7).

[0014)Termin "anakinra" označava, naročito, antagonist receptora za IL-1 (IL-Ira) koji ima 152 aminokiselinsku sekvencti prikazanu kao položaji 26-177 u NCBI Reference Sequence NP_7762I4.1( www. ncbi. nlm. nih. gov).Pored toga, termin "anakinra" bi trebalo razumeti tako da uključuje modifikovane oblike anakinra, npr. aminokiselinske varijante koje imaju najmanje 90%, 95%, 97% ili 99% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom anakinra. Stručnjak iz date oblasti tehnike će razumeti da mnoge kombinacije đelecija. insercija, inverzija i supstitucija mogu biti napravljene unutar aminokiselinske sekvence anakinra, uz uslov da je rezultirajući molekul ("anakinra varijanta") biološki aktivan, npr. poseduje sposobnost da inhibira IL-1. Posebne varijante anakinra su opisane u npr. SAD patentima br. 5,075,222; 6,858,409 i 6,599,873.

[0015JTermin "anakinra" dalje obuhvata fuzione proteine koji sadrže anakinra. Anakinra može biti formatiran tako da ima veću hidrodinamičku veličinu, na primer, vezivanjem polialkilenglikol grupe (npr. polietilenglikol (PBG) grupe), serum albumina, transferina, receptora za transferin ili najmanje njegovog dela koji se vezuje za transferin, Fc regiona antitela ili konjugacijom za domen antitela.

[0016|Termin "efikasna količina" označava količinu koja daje terapeutski efekat na lečenog subjekta. Terapeutski efekat može biti objektivan (tj. merljiv pomoću nekog testa ili markera) ili subjektivan (tj. subjekat daje indikaciju efekta ili oseća efekat).

[0017]Poželjno, anakinra se primenjuje u dozi od 0.1 do 100 mg/kg na dan, poželjno 0.1 do 1 mg/kg na dan. Poželjna doza za lečenje bolesti posredovanih preko IL-1 bi trebalo da proizvede koncentracije anakinra u krvi između 1 i 1000 ng/ml. Prema tome, poželjno je da se, početno, doze primenjuju tako da se nivoi u cirkulaciji anakinra u cirkulaciji dovedu iznad 5 ng na ml plazme.

[0018]Farmaceutska formulacija prema pronalasku poželjno sadrži anakinra u količini između 100 i 200 mg/ml, kao što je 150 mg/ml.

[0019]Farmaceutska formulacija prema pronalasku je poželjno adaptirana za subkutanu injekciju anakinra. Poželjno, farmaceutska formulacija sadrži heiatirajuće sredstvo, kao sto je etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTA). Količina EDTA u formulaciji je poželjno od 0.05 do 1 mM, poželjnije oko 0.5 mM. Emulgator. poželjno nejonski surfaktant kao što je polisorbat 80 (takođe poznat kao polioksietilen sorbitan monooleat ili Tween 80™). može biti dodat u formulaciju da bi se smanjila agregacija i denaturacija, kao i za povećanu rastvorljivost. Količina polisorbata 80 je poželjno između 0.01 i 1%, poželjnije oko 0.1%. Posledično, poželjna oblik farmaceutske formulacije prema pronalasku sadrži 150 mg/ml anakinra, 0.5 mM EDTA i 0.1% polisorbat 80. |0020jPored toga, farmaceutska formulacija može da sadrži izotonično sredstvo, npr. NaCl. u količini koja je dovoljna da se obezbedi izotoničnost formulacije. Poželjno izotonično sredstvo je NaCl i koncentracija je između oko 120-180 mM, kao sto je oko 120-150 mM, ili najpoželjnije oko 140 mM. (0021]Alternativno, navedeno izotonično sredstvo može biti smeša NaCl i drugog izotoničnog sredstva izabranog iz grupe koja se sastoji od monosaharida, disaharida i šećernih alkohola. Poželjno, drugo izotonično sredstvo je izabrano iz grupe koja se sastoji od saharoze, manitola, sorbitola, glicerola, inozitola i trehaloze. Poželjnije, drugo izotonično sredstvo je manitol, sorbitol ili glicerol. Najpoželjnije, drugo izotonično sredstvo je manitol u količini od 5 do 50 mg/ml.

[0022]Pronalazak obuhvata farmaceutske formulacije u kojima je aktivni protein, tj. anakinra, dovoljan kao puferujuća supstanca i sposoban je da održava pH na željenom nivou, poželjno oko pH 6.5. Posledično, u formulaciju prema pronalasku ne treba dodavati dodatnu puferujuću supstancu. Međutim, pronalazak takođe obuhvata farmaceutske formulacije koje sadrže anakinra i najmanje jednu dodatnu puferujuću supstancu, uz uslov da navedena dodatna puferujuća supstanca nije citratni pufer. Navedena dodatna puferujuća supstanca može na primer biti fosfatni pufer ili histidin. Specifičnije, navedeni dodatni pufer bi mogao biti natrijum fosfat u količini od 1 do 50 mM, poželjno oko 10 mM ili histidin u količini od 5 do 50 mM, poželjno oko 10 mM.

[0023]Naročito poželjne formulacije su one koje sadrže fosfatni pufer u kombinaciji sa manitolom. U takvim formulacijama, koncentracija fosfata, kao što je natrijum fosfat, je poželjno od 1 do 50 mM (poželjnije oko 10 mM) i koncentracija manitola je poželjno od 5 do 50 mg/ml (poželjnije oko 10 mg/ml). pH navedene formulacije je poželjno između 6 i 7. kao što je između 6.3 i 6.6, ili poželjnije oko 6.5.

[0024]Posledično, poželjne formulacije prema pronalasku obuhvataju formulacije koje sadrže:

(a) anakinra 100 - 200 mg/ml:

(b) EDTA 0.05 - 1 mM,

(c) polisorbat 80 0.01 - 1 %; (d) NaCl 120- 180 mM;

(e) natrijum fosfat, pH 6 - 7 1 - 50 mM; i

(f) manitol 5-50 mg/ml.

[0025|Naročito poželjna formulacija sadrži:

(a) anakinra (150 mg/ml):

(b) EDTA (0.5 mM); (c) polisorbat 80 0.1%; (d) NaCl 120- 150 mM, poželjno 140 mM;

(e) natrijum fosfat, pH 6.3 - 6.6, poželjno pH 6.5 10 mM; i

(t) manitol 10 mg/ml.

[0026|Farmaceutska formulacija prema pronalasku može poželjno biti korišćena u lečenju najmanje jednog poremećaja posredovanog preko IL-1. U pronalazak je takođe uključen postupak za lečenje poremećaja posredovanog preko IL-1. koji sadrži primenu na sisara, uključujući ljude, kod koga postoji potreba za takvim tečenjem farmaceutske formulacije kao što je definisana ovde. Termin "lečenje" obuhvata prevenciju (profilaksu) poremećaja posredovanih preko IL-1 ili poboljšanje ili eliminaciju poremećaja posto je ono ustanovljeno.

[0027]Bolest ili medicinsko stanje se smatra "poremećajem posredovanim preko IL-1" ako je spontana ili eksperimentalna bolest ili medicinsko stanje povezano sa povišenim nivoima IL-1 u telesnim tečnostima ili tkivu ili ako ćelije ili tkiva uzeti iz tela proizvode povišene nivoe 1L-1 u kulturi. U mnogim slučajevima, takve bolesti posredovane preko interleukina-1 se takođe prepoznaju preko sledeća dodatna dva uslova: (1) patološki nalazi povezani sa bolešću ili medicinskim stanjem može biti imitirano eksperimentalno kod životinja primenom IL-1; i (2) patološki indukovano u eksperimentalnim životinjskim modelima bolesti ili medicinskog stanja može biti inhibirano ili poništeno tretmanom sa sredstvom koja inhibiraju aktivnost IL-1. Kod većine bolesti posredovanih preko inlerleukina-1 najmanje dva od tri uslova su ispunjena, i kod mnogih bolesti posredovanih preko interleukina-1 sva tri uslova su ispunjena.

[0028JPoremećaji posredovani preko IL-1:

• amiloidoza amiloida A

• Still-ova bolest odraslih (AOSD)

• astma

• Behcet-ova bolest

• Blau sindrom

• kaheksija

• bolest deponovanja kalcijum pirofosfat dihidrata (CPPD)

• Castleman-ova bolest

• Periodični sindromi povezani sa kriopirinom (CAPS)

• Deficijencija antagonista receptora za interleukin-1 (DIRA)

• Dermatomiozitis

• Erdheim-Chester-ova bolest

• erozivni osteoartritis

• porodična mediteranska groznica

• generalizovana pustularna psorijaza

• giht i pseuđogiht

• bolest transplanta protiv domaćina

• Hidradenitis Suppurativa

• sindrom hiper IgD (HIDS)

• Idiopatska hladna urtikarija

• Miozitis sa inkluzionim telima

• Inflamatorna bolest creva (IBD)

• IshemiČna povreda

• Sindrom aktivacije makrofaga

• Majeed sindrom

• Deficijencija mevalonat kinaze

• Mijelogena i druge leukemije

• Neutrofilni panikulitis

• Osteoporoza

• Periodična groznica sa aftoznim stomatitisom, faringitisom i adenitisom (PFAPA)

• Polimiozitis

• Psorijaza

• Pvoderma gangrenosum, acne conglobata i aseptički artritis (PAPA)

• Rekurentni idiopatski perikarditis

• Relapsirajući polihondritis

• Reperfuziona povreda

• Reumatoidni artritis (RA)

• Schnitzler-ov sindrom

• Sepsa; sindrom sepse

• Pritajeni mijelom

• sindrom Svnovitis Acne Pustulosis Hvperostosis Osteitis (SAPI IO)

• Iđiopatski juvenilni artritis sa sistemskim početkom (SoIJA)

• Periodični sindrom povezan sa receptorom za faktor nekroze tumora (TRAPS)

• dijabetes tipa I

• dijabetes tipa 2

• urtikarijski vaskulitis

• Uveitis

f0029|Farmaceutska formulacija se poželjno primenjuje subkutanom injekcijom na sisara, uključujući ljude, kod koga postoji potreba za tim. Prema pronalasku, nociceptivni bol na mestu subkutane injekcije je izbegnut ili smanjen. Termin "nociceptivni bol" ukazuje na neuronsku aktivnost započetu preko nociceptora (receptora za bol).

PR1MERI

PRIMER 1: Stabilnost u odnosu na vidljivu agregaciju

|0030|Zamrznuti anakinra „bulk" rastvor u 10 mM natrijum citratu, 140 mM NaCl i 0.5 mM EDTA, dobijen iz Amgen Manufacturing, je otopljen i diafiltriran upotrebom Millipore ProFlux™ M12 sistema, uključujući 0.1 m<2>Millipore Pellicon 2™ Mini kasetu, koja ima 10 kDa „composite regenerated cellulose PLC10 membrane™"(\\ >ww. miUipore. com).Dobijeni rastvori su koncentrovani pomoću Ultra filtracije prema standardnim postupcima.

[0031]Kompozicije opisane u Tabeli I su pripremljene od dobijenih điafiltriranih i koncentrovanih rastvora u prethodnom tekstu. Pored sastojaka prikazanih u Tabeli I, sve kompozicije su sadržale 150 mg/ml anakinra, 0.5 mM EDTA i 0.1 % polisorbata 80. Rastvori su punjeni u silikonizovane staklene špriceve (1 ml) koji su Čuvani 1 mesec (+5°C ili +25°C) ili 3 meseca (+5°C).

[0032]Rastvori u Tabeli I su testirani za sub-vidljive čestice pomoću trehnike blokade svetla prema United States Pharmacopeia - National Formularv (USP-NF), Chapter 905i mvw . nxp . ors ).ali su podešeni za male zapremine uzorka. U svakoj vremenskoj tački uzorci iz 3 šprica su sakupljeni i testirani. U svakom pulu, određivanje broj čestica većih od 5, 7.5 i 10 um. Rezultati su prikazani u Tabeli II i Slikama 1-3. Tipični rezultati za sub-vidljive čestice u parenteralnim proizvodima su u opsegu od manje od 6000 čestica većih od 10 um.

[0033]Izmerena količina sub-vifdljivih čestica ukazuje na to da je vidljiva agreagacija anakinra relativno niska, malo se povećava tokom vremena i nije zavisna od prisustva pufera. Podaci pokazuju da anakinra može biti formulisan bez natrijum citrata i sa ekvivalentnom stabilnošću.

PRIMER 2: Stabilnost agregacije

[0034]Kompozicije anakinra su pripremljene i Čuvane kao stoje opisano u Primeru 1. Sadržaj monomeraje meren pomoću ekskluzione hromatografije (SEC). Svaki uzorak je razblažen sa 10 mM natrijum citrata, 140 mM NaCl, 0.5 mM EDTA do koncentracije anakinra od 5 mg/mL. Razblaženi uzorak je sipan na TSK-Gel G2000 SWXL kolonu, 7.8 mm x 30 cm

(ToSoh Biosciences 08450) i eluiran sa 10 mM natrijum citratom, 140 mM NaCl i 0.5 mM EDTA na protoku od 0.5 mL/min. Apsorbanca na 280 nm je beležena i % monomera je izračunavan iz respektivne površine pika.

[0035| Rezultati (Tabela III) pokazuju daje nivo monomera anakinra ostao stabilan 3 meseca u svim studiranim kompozicijama anakinra.

PRIMER3: stabilnost pH

[0036] Kompozicije anakinra su pripremljene i čuvane kao što je opisano u Primeru 1. pH je merena prema standardnim postupcima. Rezultati (Tabela IV) pokazuju da je pH ostala stabilna 3 meseca u svim studiranim kompozicijama anakinra.

PRIMER 4: Stabilnost kompozicija anakinra koje sadrže fosfat i manitol

J0037)Zamrnuti ,,bulk"' rastvor anakinra u 10 mM natrijum citratu, 140 mM NaCl i 0.5 mM EDTA, dobijen ,,in-house", je otopljen i diafiltriran upotrebom Millipore ProFlux™ M12 sistema, uključujući 0.1 m<2>Millipore Pellicon 2™ Mini kasetu, koja ima 10 kDa „eomposile regenerated cellulose PLC10 membrane™"( wmv. miIlipore. com).Dobijeni rastvori su koncentrovani upotrebom Ultra filtracije prema standardnim postupcima.

[0038]Kompozicije opisane u Tabeli V su pripremljene iz dobijen ih diafiltriranih i koncentrovanih rastvora u prethodnom tekstu. Pored sastojaka prikazanih u Tabeli V. sve kompozicije su sadržale 150 mg/ml anakinra. Rastvori su punjeni u silikonizovane staklene špriceve (1 ml) koji su čuvani na različitim temperaturama da bi se testirala stabilnost anakinra u ovim formulacijama. Uzorci su čuvani 1 mesec na +30°C. 2 i 4 meseca na +25°C.

[0039]Sadržaj monomera je meren pomoću ekskluzione hromatografije (SEC) posle čuvanja na svakoj temperaturi. Svaki uzorak je razblažen sa 10 mM natrijum citratom. 140 mM NaCl, 0.5 mM EDTA do koncentracije anakinra od 5 mg/tnL. Razblaženi uzorak je sipan na TSK-Gel G2000 SWXL kolonu, 7.8 mm x 30 cm (ToSoh Biosciences 08450) i eluiran sa 10 mM natrijum citratom, 140 mM NaCl i 0.5 mM EDTA na protoku od 0.5 mL/min. Apsorbanca na 280 nm je beležena i % monomera je izračunat iz odgovarajuće površine pika. Rezultati analize pomoću ekskluzione hromatografije (SEC) prikazane u Tabeli VI pokazuju da je nivo monomera anakinra ostao stabilan do 4 meseca u svim studiranim kompozicijama anakinra.

[0040J Pored toga, proteini kao što je anakinra su tipično osetljivi na promene u pH. Da bi se procenio bilo koji efekat pH na anakinra u izvedenim studijama su beležene pll vrednosti u formulacijama. Rezultati su prikazani u Tabeli VII i pokazuju povećanje u pH u vremenu, ali ova promena je nezavisna od formulacije i ispoljene razlike u sadržaju monomera u Tabeli

Table VI nisu uzrokovane razlikom u pH.

PRIMER 5: Efekat kompozicija anakinra na Hargreaves test

[00411 Cilj ovih studija je bio da se uporedi efekat različitih formulacija anakinra {citratni pufer ili fosfatni/manitol pufer) na prag termalne nocicepcije i zaprem inu zadnje šape kod mužjaka Sprague-Dawley pacova (Hargreaves et al, 1988 ).

[0042] Intraplantarna primena histamina (50 ul/šapi. 3 mg/ml), citratnog pufera (10 mM pl l 6.3) ili fosfatnog pufera (10 mM. pH 6.3, plus manitol 10 mg/ml) sa ili bez anakinra (150 mg/ml), izvedena je u desnu zadnju šapu. Formiranje edema, mereno kao povećanje u zapremini šape posle 2 časa ukazalo je na to da su citratni pufer i citratno puferisani anakinra kao i fosfatno/manitolom puferisani anakinra uzrokovali akutnu inflamaciju (SI. 4). Fosaftni/manitol pufer nije uzrokovao akutnu inflamaciju. Histamin (0.15 mg/šapi), korišćen kao pozitvna kontrola, indukovao je termalnu hiperalgeziju i formiranje edema.

(0043)U zaključku, postojala je jasna razlika u oticanju šape posle 2 časa između samog citratnog pufera i fosfatnog/manitol pufera. Pored toga, merenja zaprem i ne šape 2 časa posle injekcije pokazala su tendenciju da fosfatno/manitolom puferisani anakinra uzrokuje manje formiranje edema u poređenju sa citratno-puferisanim anakinra.

PRIMER 6: Efekat kompozicija anakinra na permeabitnost Evans Blue kod pacova

[0044|Mužjaci pacova su anestezirani sa izofluranom, i krzno na leđima i bokovima je pažljivo obrijano makazama, pažljivo izbegavajući traumatizaciju. Mreža sa 8 kvadrata je nacrtana na izloženoj koži na leđima i stranama sa olovkom za obeležavanje. Rastvor Evans Blue (1 mg/kg; Sigma-Aldrich) je primenjen pomoću injekcije u lateralnu repnu venu. pre subkutane injekcije test rastvora anakinra (1000 pl) u slučajnom obrascu unutar kvadrata mreže. Posle injekcije, životinje su vraćene u njihove kaveze i ostavljene da se oporave od anestezije. 6 časova posle injekcije, životinje su eutanizirane izlaganjem ugljen dioksidu. Koža je uklonjena sa leđa i očišćena od adipoznog i vezivnog tkiva, i postavljena na tablu sa krznom okrenutim na dole. Veličina zone ekstravazatirane Evans Blue boje u milimetrima je merena pomoću centimetskog lenjira, i subjektivna ocena u opsegu od 0 do 4 je dođeljena reakciji ekstravazacije, na bazi intenziteta bojenja.

[0045|Primenjene su različite kompozicije anakinra, uključujući anakinra u "CSEP" (10 mM natrijum citrat; 0.5 mM EDTA, 0.1% polisorbat 80, i 140 mM NaCl. pH 6.5). kao i fosfatno puferisani slani rastvor (PBS) kao kontrola. Izmerene promene permeabilnosti ukazuju na to da sama injekcija od 1 ml PBS rezultira u samo manjem curenju Evans Blue boje sa mesta injekcije. Nasuprot tome, injekcija anakinra, rastvorenog u 100 mg/mi u CSEP. snažno povećava permeabilnost.

PRIMER 7: Efekat kompozicija anakinra na nociceptivno ponašanje miša

[0046]U cilju procene algeziogenog delovanja različitih kompozicija anakinra na mestu injekcije, korišćen je model lizanja zadnje Šape miša (Piovezan el a!., 1998). Životinje su postavljene pojedinačno u komore (providni stakleni cilindri) i aklimatizovane su najmanje 20 min pre sub-plantarne injekcije različitih test kompozicija anakinra, uključujući anakinra n CSEP (videti Primer 6) kao i PBS kao kontrolu. Posle izlaganja, miševi su posmatrani pojedinačno u trajanju od 15-30 min. Dužina vremena provedenog u lizanju injektirane šape je merena sa štopericom i smatra se indikativnim za nociceptivno ponašanje.

PRIMER 8: Efekat kompozicija anakinra u testu vrele ploče

[0047]U cilju procene algeziogenog delovanja različitih kompozicija anakinra na mestu injekcije, korišćen je mišji model termalne hiperalgezija (Kanaan et al., 1996). Životinje su aklimatizovane na instrument vrele ploče (Ugo Basil, Italy), koji je prethodno zagrejan do 30°C, 1-2 dana pre testiranja. Na dan testiranja, životinje su primale sub-plantarnu injekciju različitih test kompozicija anakinra, uključujući anakinra u CSEP (videti Primer 6) kao i PBS kao kontrolu. Sa eksperimentatorom koji nije bio upoznat sa tretmanom, miševi su testirani na vreloj ploči podešenoj do +52°C. Latencija odgovora je određena kao vretne potrebno da se poliže Šapa ili da se skoči.

PRIMER 9: Efekat različitih formulacija anakinra na degranulaciju mastocita.in vitro

[0048]A23I87 (kalcijum jonofora) i odgovor na dozu IgE-anti-IgE služe kao pozitvne kontrole za aktivaciju mastocita. Izolovani su mastociti iz 10 različitih individua (5 iz krvi pupčane vipce i 5 iz odraslih individua). Mastociti su izolovani preko CD34-selekcije (protočna citometrija) hematopoetskih ćelija, koji su zatim uzgajani na 37°C. 5% COi pod uslovima bez seruma, u prisustvu humanog rekombinantnog faktora matičnih ćelija (Stemgen®) i IL-6 u toku 6-8 nedelja (Gulliksson. M. et al.. 2010). Stepen degranulacije mastocita, posle podvrgavanja ćelija različitim formulacijama anakinra. procenjen preko merenja histamina i PGD2. Promena u degranulaciji mastocita je mera izmene nivoa aktivacije mastocita, koja je marker za mehanizme akutnog inllamatornog bola.

PRIMER 10: Efekat subkutanih kompozicija anakinra na ekstracelularne medijatore bola na mestu injekcije upotrebom metode mikrodijalize

[0049]Da bi se ispitao akutni efekat injekcije različitih kompozicija anakinra uključujući anakinra u CSEP (videti Primer 6) kao i PBS kao kontrole, korišćena je dobro poznata metoda mikrodijalize za određivanje ekstracelularnih koncentracija biohemijskih medijatora bola (npr. neurotransmitera, neuromodulatora i akutnog inflamatornog cilokina i hemokina). Životinje su anestezirane inhalacijom izoflurana u toku eksperimenta. Sonda za mikrodijalizu je umetnuta u dermis kože na gornjem delu vrata svake životinje. Ulazna cev sonde za mikrodijalizu je povezana sa mikroinfuzionom pumpom i Krebs-Ringer rastvor je pumpan pri stopi protoka od 1-10 ml/min. Uzorci su sakupljeni i medijator bola je analiziran (npr. pomoću ELISA) za svaki pojedinačni eksperiment (AVeidner C, et al., 2000 and Yoshitake T. et al., 2012).

Claims (4)

1. Farmaceutska formulacija pogodna za injekciju, pri čemu je formulacija bez citrata, i sadrži (a) 100 - 200 mg/ml anakinra: (b) 0.05 -1 mM EDTA; (c) O.Ol -1 % polisorbata 80; (d) 120- 180 mM NaCl; (e) 1-50 mM natrijum fosfata, pH 6-7; i (f) 5 - 50 mg/ml manitola.

2. Farmaceutska formulacija prema patentnom zahtevu 1 koja je prilagođena za subkutanu injekciju anakinra.

3. Farmaceutska formulacija prema patentnom zahtevu 1 ili 2, koja sadrži: (a) 150 mg/ml anakinra : (b) 0.5 mM EDTA; (c) 0.1% polisorbata 80; (d) 145 mMNaCl; (e) 10 mM natrijum fosfata, pH 6.5; i (f) 10 mg/ml manitola.

4. Farmaceutska formulacija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, za upotrebu u lečenju reumatoidnog artritisa.