ES2582928T3 - Composiciones farmacéuticas exentas de citrato que comprenden anakinra - Google Patents

Abstract

Una formulación farmacéutica adecuada para inyección, en donde formulación está exenta de citrato, que comprende (a) 100 - 200 mg/ml de anakinra; (b) EDTA 0,05 - 1 mM; (c) 0,01 a 1% de polisorbato 80; (d) NaCl 120 - 180 mM; (e) fosfato de sodio 1 - 50 mM, pH 6 - 7; y (f) 5 - 50 mg/ml de manitol.

Description

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DESCRIPCION

Composiciones farmaceuticas exentas de citrato que comprenden anakinra Campo tecnico

La presente invencion se refiere a composiciones farmaceuticas que comprenden anakinra como compuesto activo en ausencia de citrato de sodio. Dichas composiciones farmaceuticas son utiles para el tratamiento de trastornos mediados por IL-1 y para disminuir el dolor nociceptivo durante tal tratamiento.

Tecnica anterior

Las formulaciones farmaceuticas adecuadas para la administracion parenteral comprenden tfpicamente (a) una molecula activa; (b) un agente tamponador con suficiente capacidad tamponadora para controlar el pH de la solu- cion; y (c) un agente de tonicidad para proporcionar isotonicidad a la formulacion. Ademas, se pueden anadir otros componentes tales como antioxidantes, estabilizantes espedficos, agentes tensioactivos, conservantes, etc., segun sea necesario dependiendo de la molecula activa espedfica y de su uso previsto.

La seleccion de los componentes de una formulacion se tiene que basar en estudios rigurosos que evaluan diferen- tes componentes con respecto a su funcion en la formulacion y la capacidad estabilizante optima. Ademas, se tienen que realizar otros estudios de la formulacion para identificar otros parametros de la solucion, como el pH optimo y la fuerza ionica de la molecula activa espedfica y su uso previsto. Tambien se realizan estudios para optimizar las concentraciones de los componentes respectivos de la formulacion. En muchos casos, se tienen que considerar aspectos adicionales de la formulacion final y de su uso clmico, tales como el volumen de inyeccion apropiado, la compatibilidad con fluidos fisiologicos o tejidos, la viscosidad, la tolerancia local, etc.

Un ejemplo de tolerancia local se refiere a la seleccion de los tipos de tampon. Se conoce que tipos de tampones espedficos pueden provocar intolerancia local o dolor por inyeccion. Se ha descrito que el citrato de sodio causa dolor despues de una inyeccion subcutanea, en algunos casos (Frenken, 1993, Laursen, 2006). Ademas, la concen- tracion del tampon se debe reducir al mmimo para que sea optima con respecto no solo a la estabilidad del pH en la formulacion del farmaco durante un almacenamiento a largo plazo, sino tambien para tener un impacto mmimo sobre las condiciones fisiologicas en el lugar de la inyeccion (por ejemplo, Fransson y Espander-Jansson, 1996). La lista de componentes que se pueden anadir a una formulacion para administracion parenteral es limitado (Wang y Kowall, 1980; Nema, 2006). Se tiene que considerar una variedad de aspectos; la seguridad, la experiencia previa en seres humanos, la disponibilidad desde los proveedores, etc. La estabilidad de los farmacos proteicos in vivo e in vitro es un asunto complejo, en el que multiples reacciones de degradacion tienen lugar en paralelo, tales como oxidacion, desamidacion, agregacion etc. Una reaccion importante que tiene lugar es la formacion de agregados. Los agrega- dos de protemas se pueden formar a traves de vfas covalentes o no covalentes, y pueden ser de naturaleza soluble o insoluble. La presencia de agregados de protemas es un motivo de preocupacion desde la perspectiva de la seguridad, ya que puede afectar a la estructura secundaria y terciaria de la protema. La presencia de estructuras protei- cas no naturales espedficas se ha asociado con un aumento de la inmunogenicidad de protemas, lo que causa potencialmente una reduccion de la eficacia o incluso reacciones inmunologicas in vivo frente a protemas naturales, dando como resultado afecciones potencialmente mortales.

Las enfermedades mediadas por la interleucina-1 incluyen artritis reumatoide (AR), enfermedad inflamatoria intestinal (EII), septicemia, smdrome septico, osteoporosis, lesion isquemica, enfermedad de injerto contra huesped, lesion por reperfusion, asma, diabetes por insulina, leucemia mieloide y otras leucemias, psoriasis y caquexia. Estas y otras enfermedades inflamatorias se caracterizan por la produccion de citocinas, incluyendo la interleucina-1.

Para los smdromes en los que se ha establecido una funcion de la IL-1 en la patologfa de la enfermedad, las mani- festaciones clmicas de la enfermedad se pueden aliviar rapidamente mediante el tratamiento con medicamentos anti-IL-1. Uno de estos medicamentos es Kineret®, cuyo componente activo, anakinra, es una version recombinante del antagonista del receptor de IL-1 (IL-1ra) presente en la naturaleza. La anakinra se da a conocer, por ejemplo, en el documento US 5.075.222.

Kineret® (anakinra para inyeccion) se formula a 150 mg/ml con un tampon de citrato de sodio 10 mM (pH 6-7) y clo- ruro sodico (140 mM) como agente de tonicidad. Ademas, EDTA 0,5 mM y 0,1% (p/p) de polisorbato 80 se utilizan como estabilizantes. La seleccion de citrato de sodio como componente del tampon para anakinra se baso en estudios detallados que evaluaban la estabilidad a corto y largo plazo de anakinra, en condiciones de tiempo real. Se evaluaron varios componentes potenciales del tampon, siendo uno el fosfato de sodio, y el citrato de sodio se identi- fico como el que proporcionaba una estabilidad optima con respecto a la agregacion de anakinra (Raibekas et al., 2005). La agregacion de anakinra era un problema importante para la seleccion del componente tamponador. La concentracion de citrato de sodio se redujo al maximo posible, teniendo en cuenta la tolerabilidad local.

Durante el uso clmico de anakinra en citrato de sodio 10 mM, se constato que la formulacion causaba problemas con la tolerancia local en el sitio de la inyeccion subcutanea (Thaler, 2009). Reacciones en el sitio de la inyeccion no son infrecuentes en la administracion subcutanea de farmacos proteicos y son un problema general (Haller, 2008) y estan asociadas con el uso clmico de un gran numero de farmacos proteicos. Mas del 50% de los pacientes que

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utilizan anakinra para inyeccion, experimenta reacciones en el lugar de inyeccion en cierta medida en las primeras inyecciones. La naturaleza y el mecanismo de la reaccion local se han investigado y se ha llegado a varias conclu- siones (Bendele, 1995). Se ha llegado a la conclusion de que la reaccion en el lugar de la inyeccion tiene multiples causas incluyendo la propia molecula de anakinra y los componentes de la formulacion, teniendo un efecto muy considerable el citrato de sodio.

En consecuencia, existe una necesidad de composiciones de anakinra, adecuadas para inyeccion, que sean esta- bles y que eviten los inconvenientes de las composiciones de anakinra que comprenden citrato de sodio.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 muestra el numero de partfculas subvisibles (con un tamano mayor que 5, 7,5 y 10 pm) por ml de varias composiciones de anakinra (denominadas E, G, H, O, R, S, T y U).

La Figura 2 muestra el numero de partfculas como en la Figura 1, despues de que dichas composiciones de anakinra se hubieran almacenado durante 1 mes a +25°C.

La Figura 3 muestra el numero de partfculas como en la Figura 1, despues de que dichas composiciones de anakinra se hubieran almacenado durante 3 meses a +5°C.

La Figura 4 indica inflamacion, tal y como se indica por el aumento del volumen de la pata, en ratas macho Sprague- Dawley, despues de la administracion de varias composiciones de anakinra.

Descripcion de la invencion

De acuerdo con la invencion, se ha mostrado sorprendentemente que anakinra adecuada para inyeccion, se puede estabilizar suficientemente sin el uso de citrato de sodio. En contraste con los hallazgos de Raibekas et al. (2005), anakinra se puede formular en solucion acuosa con un agente de tonicidad adecuado y estabilizantes adicionales, pero sin citrato de sodio como tampon. En condiciones adecuadas de preparacion, anakinra controlara de forma inherente el pH de la solucion. Incluso una solucion sin tampon anadido puede ser suficientemente estable.

En consecuencia, se proporciona una formulacion farmaceutica que comprende una cantidad eficaz de anakinra, en donde dicha formulacion farmaceutica no contiene citrato.

De acuerdo con la invencion, dicha formulacion es estable en ausencia de citrato, en donde el termino "estable" implica, por ejemplo, que la ausencia de agregacion y/o la estabilidad del pH es, por lo menos, aproximadamente igual a la de una formulacion de anakinra similar que comprende citrato de sodio 10 mM (pH 6-7).

El termino "anakinra" significa, en particular, el antagonista del receptor de IL-1 (IL-1ra) que tiene la secuencia de 152 aminoacidos mostrada como las posiciones 26-177 en la Secuencia de Referencia del NCBI, NP_776214.1 (
www.ncbi.nlm.nih.gov). Ademas, el termino "anakinra" se debe entender como que incluye formas modificadas de anakinra, por ejemplo, variantes de aminoacidos que tienen al menos 90%, 95%, 97% o 99% de identidad con la secuencia de aminoacidos de anakinra. El experto en la tecnica entendera que se pueden realizar muchas combina- ciones de deleciones, inserciones, inversiones y sustituciones dentro de la secuencia de aminoacidos de anakinra, siempre que la molecula resultante ("la variante de anakinra") sea biologicamente activa, por ejemplo, posea la ca- pacidad de inhibir IL-1. Variantes particulares de anakinra se describen, por ejemplo, en los documentos de patente de EE.UU. n° 5.075.222; 6.858.409 y 6.599.873.

El termino "anakinra" incluye, ademas, protemas de fusion que comprenden anakinra. Anakinra se puede preparar de modo que tenga un tamano hidrodinamico mayor, por ejemplo, mediante la fijacion de un grupo de polialquilengli- col (por ejemplo, un grupo de polietilenglicol (PEG)), seroalbumina, transferrina, receptor de transferrina o al menos la porcion del mismo que se une a transferrina, una region Fc de anticuerpo, o mediante conjugacion con un dominio de anticuerpo.

La expresion "una cantidad eficaz" se refiere a una cantidad que confiere un efecto terapeutico al sujeto tratado. El efecto terapeutico puede ser objetivo (es decir, medible con alguna prueba o marcador) o subjetivo (es decir, el sujeto da una indicacion de un efecto o de como siente un efecto).

Preferiblemente, la anakinra se administra en una dosis de 0,1 a 100 mg/kg por dfa, preferiblemente de 0,1 a 1 mg/kg por dfa. Una dosificacion preferida para el tratamiento de enfermedades mediadas por IL-1, debe producir concentraciones de anakinra en sangre entre 1 y 1000 ng/ml. Por consiguiente, se prefiere que en un principio, las dosis se administren para que los niveles circulantes de anakinra se situen por encima de 5 ng por ml de plasma.

La formulacion farmaceutica de acuerdo con la invencion comprende preferiblemente anakinra en una cantidad entre 100 y 200 mg/ml, tal como 150 mg/ml.

La formulacion farmaceutica de acuerdo con la invencion esta adaptada preferentemente para una inyeccion sub- cutanea de anakinra. Preferiblemente, la formulacion farmaceutica comprende un agente quelante, tal como acido etilendiaminotetraacetico (EDTA). La cantidad de EDTA en la formulacion es preferiblemente de 0,05 a 1 mM, mas

preferiblemente aproximadamente 0,5 mM. Un emulsionante, preferiblemente un tensioactivo no ionico, tal como polisorbato 80 (tambien conocido como monooleato de polioxietilen sorbitano o Tween 80®), se puede anadir a la formulacion para reducir la agregacion y la desnaturalizacion, ademas de para aumentar la solubilidad. La cantidad de polisorbato 80 es preferiblemente de 0,01 a 1%, mas preferiblemente aproximadamente 0,1%. En consecuencia, 5 una forma preferida de la formulacion farmaceutica de acuerdo con la invencion comprende 150 mg/ml de anakinra, EDTA 0,5 mM y 0,1% de polisorbato 80.

Ademas, la formulacion farmaceutica puede comprender un agente de tonicidad, por ejemplo, NaCl, en una cantidad suficiente para proporcionar isotonicidad a la formulacion. Un agente de tonicidad preferido es NaCl en una concentracion entre aproximadamente 120-180 mM, tal como aproximadamente 120-150 mM o mas preferiblemente

10 aproximadamente 140 mM.

Alternativamente, dicho agente de tonicidad puede ser una mezcla de NaCl y un segundo agente de tonicidad, se- leccionado a partir del grupo que consiste en monosacaridos, disacaridos y alcoholes de azucar. Preferiblemente, el segundo agente de tonicidad se selecciona a partir del grupo que consiste en sacarosa, manitol, sorbitol, glicerol, inositol y trehalosa. Mas preferiblemente, el segundo agente de tonicidad es manitol, sorbitol o glicerol. Mas preferi-

15 blemente, el segundo agente de tonicidad es manitol en una cantidad de 5 a 50 mg/ml.

La invencion incluye formulaciones farmaceuticas en las que la protema activa, es decir, anakinra, es suficiente como sustancia tamponadora y es capaz de mantener el pH a un nivel deseado, preferiblemente aproximadamente pH 6,5. En consecuencia, no se tiene que anadir ninguna sustancia tamponadora adicional a la formulacion de acuerdo con la invencion. Sin embargo, en la invencion tambien se incluyen formulaciones farmaceuticas que com-

20 prenden anakinra y al menos una sustancia tamponadora adicional, siempre que dicha sustancia tamponadora adicional no sea tampon citrato. Dicha sustancia tamponadora adicional puede ser, por ejemplo, un tampon fosfato o histidina. Mas espedficamente, dicho tampon adicional podna ser fosfato de sodio en una cantidad de 1 a 50 mM, preferiblemente aproximadamente 10 mM, o histidina en una cantidad de 5 a 50 mM, preferiblemente aproximada- mente 10 mM.

25 Las formulaciones particularmente preferidas son las que comprenden un tampon fosfato en combinacion con manitol. En tales formulaciones, la concentracion de fosfato, tal como fosfato de sodio, es preferiblemente de 1 a 50 mM (mas preferiblemente aproximadamente 10 mM) y la concentracion de manitol es preferiblemente de 5 a 50 mg/ml (mas preferiblemente aproximadamente 10 mg/ml). El pH de dicha formulacion esta preferiblemente entre 6 y 7, tal como entre 6,3 y 6,6, o mas preferiblemente aproximadamente 6,5.

30 En consecuencia, las formulaciones preferidas de acuerdo con la invencion incluyen formulaciones que comprenden:

(a) 100 - 200 mg/ml de anakinra;

(b) EDTA 0,05 -1 mM;

(c) 0,01 a 1% de polisorbato 80;

(d) NaCl 120 - 180 mM;

35 (e) fosfato de sodio 1 - 50 mM, pH 6 - 7; y

(f) 5-50 mg/ml de manitol.

Una formulacion particularmente preferida comprende:

(a) anakinra (150 mg/ml);

(b) EDTA (0,5 mM);

40 (c) 0,1% de polisorbato 80;

(d) NaCl 120 - 150 mM, preferentemente 140 mM;

(e) fosfato de sodio 10 mM, pH 6,3 - 6,6, preferentemente pH 6,5; y

(f) 10 mg/ml de manitol.

La formulacion farmaceutica de acuerdo con la invencion se puede emplear preferiblemente en el tratamiento de al

45 menos un trastorno mediado por IL-1. Tambien se incluye en la invencion un metodo para el tratamiento de un tras- torno mediado por IL-1, que comprende administrar a un mairnfero, incluyendo el ser humano, que requiere dicho tratamiento una formulacion farmaceutica como se define en esta memoria. El termino "tratamiento" incluye la pre- vencion (profilaxis) de trastornos mediados por IL-1, o la mejora o la eliminacion de la enfermedad una vez que se ha establecido.

50 Una enfermedad o una afeccion medica se considera que es un "trastorno mediado por IL-1" si la enfermedad o la

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afeccion medica espontanea o experimental esta asociada con niveles elevados de IL-1 en fluidos o tejidos corpora- les, o si las celulas o los tejidos tornados del organismo producen niveles elevados de IL-1 en cultivo. En muchos casos, este tipo de enfermedades mediadas por interleucina-1 tambien son reconocidas por las dos condiciones adicionales siguientes: (1) los hallazgos patologicos asociados con la enfermedad o la afeccion medica se pueden imitar experimentalmente en animales mediante la administracion de IL-1; y (2) la patologfa inducida en modelos animales experimentales de la enfermedad o la afeccion medica se puede inhibir o suprimir mediante un tratamiento con agentes que inhiben la accion de IL-1. En la mayona de las enfermedades mediadas por interleucina-1 se cum- plen al menos dos de las tres condiciones, y en muchas enfermedades mediadas por interleucina-1 se cumplen las tres condiciones.

Los trastornos mediados por IL-1 incluyen:

Amiloidosis de amiloide A

Enfermedad de Still de inicio en el adulto (AOSD)

Asma

Enfermedad de Behget Smdrome de Blau Caquexia

Enfermedad de dihidrato de pirofosfato calcico (CPPD)

Enfermedad de Castleman

Smdromes periodicos asociados a la criopirina (CAPS)

Deficiencia del antagonista del receptor de la interleucina-1 (DIRA)

Dermatomiositis

Enfermedad de Erdheim-Chester Osteoartritis erosiva Fiebre mediterranea familiar Psoriasis pustulosa generalizada Gota y seudogota

Enfermedad de injerto contra huesped Hidradenitis supurativa Smdrome de hiper IgD (HIDS)

Urticaria idiopatica por frio Miositis por cuerpos de inclusion Enfermedad inflamatoria intestinal (EII)

Lesion isquemica

Smdrome de activacion de macrofagos Smdrome de Majeed Deficiencia de mevalonato quinasa Leucemia mielogena y otras leucemias Paniculitis neutrofflica

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Osteoporosis

Fiebres periodicas con estomatitis aftosa, faringitis y adenitis (PFAPA)

Polimiositis

Psoriasis

Pioderma gangrenoso, acne conglobata y artritis aseptica (PAPA)

Pericarditis idiopatica recurrente Policondritis recidivante Lesion por reperfusion Artritis reumatoide (AR)

Smdrome de Schnitzler Septicemia; smdrome septico Mieloma latente

Smdrome de sinovitis, acne, pustulosis, hiperostosis, osteitis (SAPHO)

Artritis idiopatica juvenil de inicio sistemico (SolJA)

Smdrome periodico asociado al receptor del factor de necrosis tumoral (TRAPS)

Diabetes de tipo 1 Diabetes de tipo 2 Vasculitis urticarial Uveitis

La formulacion farmaceutica se administra preferiblemente mediante inyeccion subcutanea a un mairnfero, incluyen- do el ser humano, que tiene necesidad de la misma. De acuerdo con la invencion, se evita o se reduce el dolor noci- ceptivo en el sitio de la inyeccion subcutanea. La expresion "dolor nociceptivo" implica una actividad neuronal inicia- da por nociceptores (receptores del dolor).

Ejemplos

EJEMPLO 1: Estabilidad con respecto a la agregacion visible

Una solucion a granel de anakinra congelada en citrato de sodio 10 mM, NaCl 140 mM y EDTA 0,5 mM, obtenida de Amgen Manufacturing, se descongelo y se diafiltro usando un sistema Millipore ProFlux® M12, que incluia una mini casete de 0,1 m2 de Millipore Pellicon 2®, que tema una membrana de celulosa regenerada compuesta PLC10® de 10 kDa (
www.millipore.com). Las soluciones obtenidas se concentraron por ultrafiltracion de acuerdo con metodos convencionales.

Las composiciones descritas en la Tabla I se prepararon a partir de las soluciones anteriores obtenidas, diafiltradas y concentradas. Ademas de los ingredientes mostrados en la Tabla I, todas las composiciones conteman 150 mg/ml de anakinra, EDTA 0,5 mM y 0,1% de polisorbato 80. Las soluciones se cargaron en jeringas de vidrio siliconizado (1 ml) que se almacenaron durante 1 mes (+5°C o +25°C) o durante 3 meses (+5°C).

Tabla I: Composiciones de anakinra investigadas

Composicion

NaCl (mM) Tampon (10 mM) PH

E

120 Citrato de sodio 6,2

G

120 Fosfato de sodio 6,2

H

120 Histidina 6,2

Composicion

NaCl (mM) Tampon (10 mM) pH

O

120 - 6,5

R

120 Citrato de sodio 6,5

S

240 Citrato de sodio 6,5

T

120 Fosfato de sodio 6,5

U

120 Fosfato de sodio 6,8

Las soluciones de la Tabla I se sometieron a ensayo para analizar las partfculas subvisibles a traves de una tecnica de bloqueo de la luz, de acuerdo con la Farmacopea de los Estados Unidos - Formulario Nacional (USP-NF), capftu- lo 905 (
www.usp.org) pero ajustada a un volumen de muestra pequeno. En cada punto temporal se agruparon y se 5 analizaron muestras procedentes de 3 jeringas. En cada grupo, se determino el numero de partfculas con un tamano mayor que 5, 7,5 y 10 pm. Los resultados se muestran en la Tabla II y las Figuras 1-3. Los resultados tipicos para las partfculas subvisibles en productos parenterales estan en el intervalo de menos de 6000 partfculas mayores de 10 pm.

Tabla II: Partfculas subvisibles en formulaciones de anakinra

Composicion

Inicio 1 mes +5°C 1 mes +25°C 3 meses +5°C

Partfculas (>5 pm)/ml

E

221 282 562 477

G

229 113 270 324

H

162 323 418 476

O

223 249 386 584

R

270 528 771 373

S

136 266 524 421

T

272 451 517 533

U

154 456 468 549

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La cantidad medida de partfculas subvisibles indica que la agregacion visible de anakinra es relativamente baja, aumenta ligeramente con el tiempo y no depende de la presencia de tampon. Los datos muestran que anakinra se puede formular sin citrato de sodio y con una estabilidad equivalente.

EJEMPLO 2: Estabilidad de la agregacion

15 Las composiciones de anakinra se prepararon y se almacenaron tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. El conteni- do en monomeros se midio por cromatograffa de exclusion por tamano (SEC). Cada muestra se diluyo con citrato de sodio 10 mM, NaCl 140 mM, EDTA 0,5 mM hasta una concentracion de anakinra de 5 mg/mL. La muestra diluida se cargo en una columna de TSK-Gel G2000 SWXL, de 7,8 mm x 30 cm (Tosoh Biosciences 08450) y se eluyo con citrato de sodio 10 mM, NaCl 140 mM y EDTA 0,5 mM, con un caudal de 0,5 ml/min. Se registro la absorbancia a 20 280 nm y se calculo el % de monomeros a partir del area del pico respectivo.

Los resultados (Tabla III) muestran que el nivel de monomeros de anakinra se mantuvo estable durante 3 meses en todas las composiciones de anakinra estudiadas.

Tabla III: Estabilidad de diversas formulaciones de anakinra

Composicion

Inicio 1 mes +5°C 1 mes +25°C 3 meses +5°C

% de monomeros mediante SEC

E

99,8 99,8 99,2 99,7

G

99,9 99,8 99,1 99,7

H

99,8 99,8 99,1 99,7

O

99,9 99,8 99,0 99,7

Composicion

Inicio 1 mes +5°C 1 mes +25°C 3 meses +5°C

% de monomeros mediante SEC

R

99,8 99,8 99,0 99,7

S

99,9 99,8 99,2 99,7

T

99,9 99,8 98,7 99,7

U

99,8 99,8 98,6 99,6

EJEMPLO 3: Estabilidad del pH

Las composiciones de anakinra se prepararon y se almacenaron tal como se describe en el Ejemplo 1. El pH se midio de acuerdo con procedimientos convencionales. Los resultados (Tabla IV) muestran que el pH se mantuvo 5 estable durante 3 meses en todas las composiciones de anakinra estudiadas.

Tabla IV: Estabilidad del pH de diversas formulaciones de anakinra

Composicion

Inicio 1 mes +5°C 1 mes +25°C 3 meses +5°C

PH

E

6,1 6,1 6,1 6,1

G

6,1 6,0 6,0 6,1

H

6,1 6,1 6,1 6,2

O

6,1 6,0 6,0 6,1

R

6,2 6,2 6,2 6,2

S

6,1 6,0 6,0 6,1

T

6,4 6,4 6,4 6,5

U

6,7 6,7 6,7 6,7

EJEMPLO 4: Estabilidad de composiciones de anakinra que comprenden fosfato y manitol

Una solucion a granel de anakinra congelada en citrato de sodio 10 mM, NaCl 140 mM y EDTA 0,5 mM, de fabrica- 10 cion propia, se descongelo y se diafiltro usando un sistema Millipore ProFlux® M12, que inclma una mini casete de 0,1 m2 de Millipore Pellicon 2®, que tema una membrana de celulosa regenerada compuesta PLC10® de 10 kDa (
www.millipore.com). Las soluciones obtenidas se concentraron por ultrafiltracion de acuerdo con metodos conven- cionales.

Las composiciones descritas en la Tabla V se prepararon a partir de las soluciones anteriores obtenidas, diafiltradas 15 y concentradas. Ademas de los ingredientes mostrados en la Tabla V, todas las composiciones conteman 150 mg/ml de anakinra. Las soluciones se cargaron en jeringas de vidrio siliconizado (1 ml) que se almacenaron a diferentes temperaturas para someter a ensayo la estabilidad de anakinra en estas formulaciones. Las muestras se almacenaron durante 1 mes a +30°C, 2 y 4 meses a +25°C.

Tabla V: Composiciones de anakinra investigadas

Composicion

NaCl (mM) Tampon Manitol Polisorbato 80 EDTA pH

A

145 citrato de sodio 10 mM 0 (0,1%) 0,5 mM 6,3

C

145 fosfato de sodio 10 mM 10 mg/mL (0,1%) 0,5 mM 6,3

D

145 fosfato de sodio 10 mM 0 (0,1%) 0,5 mM 6,3

D2

145 fosfato de sodio 10 mM 10 mg/mL (0,01%) 0,1 mM 6,3

El contenido en monomeros se midio por cromatograffa de exclusion por tamano (SEC) despues de un almacena- miento a cada temperatura. Cada muestra se diluyo con citrato de sodio 10 mM, NaCl 140 mM, EDTA 0,5 mM hasta una concentracion de anakinra de 5 mg/mL. La muestra diluida se cargo en una columna de TSK-Gel G2000 SWXL, de 7,8 mm x 30 cm (Tosoh Biosciences 08450) y se eluyo con citrato de sodio 10 mM, NaCl 140 mM y EDTA 0,5 mM

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con un caudal de 0,5 ml/min. La absorbancia a 280 nm se registro y el % de monomero se calculo a partir del area del pico respectivo. Los resultados del analisis de la cromatograffa de exclusion por tamano (SEC) presentados en la Tabla VI, muestran que el nivel de monomeros de anakinra se mantema estable durante un periodo de hasta 4 me- ses en todas las composiciones de anakinra estudiadas.

Tabla VI: Estabilidad de las formulaciones de anakinra investigadas

Composicion

Inicio 1 mes +30°C 2 meses +25°C 4 meses +25°C

% de monomeros mediante SEC

A

99,8 95,3 96,8 92,9

C

99,8 95,5 96,9 93,1

D

99,8 95,0 96,6 92,3

D2

99,8 95,7 97,0 93,2

Ademas, protemas tales como anakinra son normalmente sensibles a los cambios en el pH. Para evaluar cualquier efecto del pH sobre la anakinra en los estudios realizados, se registraron los valores de pH en las formulaciones. Los resultados se muestran en la Tabla VII y muestran un incremento en el pH con el tiempo, pero este cambio es inde- pendiente de la formulacion y las diferencias expuestas en el contenido de monomero en la Tabla VI no son debidas a una diferencia en el pH.

Tabla VII: pH de la solucion de las formulaciones de anakinra investigadas

Composicion

Inicio 1 mes +30°C 2 meses +25°C 6 meses +5°C

PH

A

6,3 6,3 6,5 6,5

C

6,3 6,3 6,5 6,4

D

6,3 6,3 6,5 6,5

D2

6,3 6,3 6,5 6,5

EJEMPLO 5: Efecto de composiciones de anakinra en la prueba de Hargreaves

El objetivo de estos estudios era comparar el efecto de diferentes formulaciones de anakinra (tampon citrato o tampon fosfato/manitol) sobre el umbral de nocicepcion termica y el volumen de la pata trasera de ratas Sprague- Dawley macho (Hargreaves et al., 1988).

Se realizo una administracion intraplantar de histamina (50 pl/pata, 3 mg/ml), tampon citrato (10 mM pH 6,3) o tampon fosfato (10 mM, pH 6,3, mas manitol 10 mg/ml) con o sin anakinra (150 mg/ml), en la pata trasera derecha. La formacion de edema, medida como un aumento del volumen de la pata despues de 2 horas, indicaba que el tampon citrato y la anakinra tamponada con citrato, asf como la anakinra tamponada con fosfato/manitol causaban inflamacion aguda (Fig 4). El tampon fosfato/manitol no causaba inflamacion aguda. Histamina (0,15 mg/pata), utili- zada como control positivo, inducfa hiperalgesia termica y formacion de edema.

En conclusion, existfa una clara diferencia en la inflamacion de la pata despues de 2 h entre el tampon citrato y el tampon fosfato/manitol solo. Ademas, las mediciones del volumen de la pata 2 h despues de la inyeccion, mostraron una tendencia de la anakinra tamponada con fosfato/manitol a causar menos formacion de edema, en comparacion con la anakinra tamponada con citrato.

EJEMPLO 6: Efecto de composiciones anakinra sobre la permeabilidad de azul de Evans en ratas

Las ratas macho se anestesian con isoflurano, y el pelo de la parte posterior y de los lados se elimina mediante un afeitado cuidadoso con una maquinilla, evitando cuidadosamente una lesion. Se dibuja una rejilla con 8 cuadrados sobre la piel expuesta en la parte posterior y los lados, con un bolfgrafo marcador. Se administra solucion de azul de Evans (1 mg/kg; Sigma-Aldrich) mediante inyeccion en la vena lateral de la cola, antes de la inyeccion subcutanea de las soluciones del ensayo de anakinra (1000 pl), con un patron aleatorio dentro de los cuadrados de la rejilla. Despues de la inyeccion, los animales se devuelven a sus jaulas y se les permite recuperarse de la anestesia. Seis horas despues de la inyeccion, los animales son sacrificados mediante exposicion a dioxido de carbono. La piel de la parte posterior se retira y se limpia de tejido adiposo y conectivo, y se monta sobre una placa con el lado del pelo hacia abajo. El tamano de la zona con colorante azul de Evans extravasado en milfmetros se mide con una regla de centfmetros, y se asigna a la reaccion de extravasacion una puntuacion subjetiva que vana de 0 a 4, basandose en

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

la intensidad de la tincion con colorante.

Se administran varias composiciones de anakinra, incluyendo anakinra en "CSEP" (citrato de sodio 10 mM; EDTA 0,5 mM, 0,1% de polisorbato 80 y NaCl 140 mM, pH 6,5), asf como solucion salina tamponada con fosfato (PBS) como control. Los cambios medidos de la permeabilidad indican que la inyeccion de solo 1 ml de PBS, da como resultado solo pequenas fugas de colorante azul de Evans en el sitio de la inyeccion. En contraste, la inyeccion de anakinra, disuelta hasta 100 mg/ml en CSEP, aumenta fuertemente la permeabilidad.

EJEMPLO 7: Efecto de composiciones de anakinra sobre el comportamiento nociceptivo en raton

Con el fin de evaluar la accion algesiogenica de diferentes composiciones de anakinra en el sitio de la inyeccion, se emplea el modelo de raton que se lame la pata trasera (Piovezan et al., 1998). Los animales se colocan individual- mente en camaras (cilindros de vidrio transparente) y se aclimatan durante al menos 20 min antes de la inyeccion subplantar de varias composiciones de anakinra del ensayo, incluyendo anakinra en CSEP (vease el Ejemplo 6), asf como PBS como control. Despues del estfmulo, los ratones se observan individualmente durante 15-30 min. La cantidad de tiempo que pasan lamiendo la pata inyectada se mide con un cronometro y se considera indicativa de un comportamiento nociceptivo.

EJEMPLO 8: Efecto de las composiciones de anakinra en la prueba de placa caliente

Con el fin de evaluar las acciones algesiogenicas de diferentes composiciones de anakinra en el sitio de la inyeccion, se emplea el modelo de hiperalgesia termica en raton (Kanaan et al., 1996). Los animales se aclimatan a un instrumento de placa caliente (Ugo Basil, Italia), precalentada a 30°C, 1-2 dfas antes de la prueba. El dfa del ensayo, los animales reciben una inyeccion subplantar de varias composiciones de anakinra del ensayo, incluyendo anakinra en CSEP (vease el Ejemplo 6), asf como PBS como control. Empleando un procedimiento ciego del experimentador para el tratamiento, los ratones se someten al ensayo en la placa caliente ajustada a +52°C. Una latencia de la res- puesta se determina como el tiempo necesario para lamer una pata trasera o para saltar.

EJEMPLO 9: Efecto de diferentes formulaciones de anakinra sobre la desgranulacion de mastocitos, in vitro

A23187 (un ionoforo de calcio) y la dosis-respuesta de IgE-anti-IgE sirven como controles positivos para la activa- cion de mastocitos. Se afslan los mastocitos procedentes de 10 individuos diferentes (5 procedentes de sangre del cordon umbilical y 5 de individuos adultos). Los mastocitos se afslan mediante seleccion con CD34 (citometna de flujo) de celulas hematopoyeticas, que se cultivan posteriormente a 37°C, 5% de CO2 en condiciones de privacion de suero, en presencia de factor de celulas madre humanas recombinantes (Stemgen®) e IL-6 durante 6-8 semanas (Gulliksson, M. et al., 2010). El grado de desgranulacion de los mastocitos, despues de someter las celulas a las diferentes formulaciones de anakinra, se evalua mediante mediciones de la histamina y PGD2. Un cambio en la desgranulacion de los mastocitos es una medida de una alteracion en los niveles de activacion de los mastocitos, que es un marcador de los mecanismos del dolor inflamatorio agudo.

EJEMPLO 10: Efecto de composiciones de anakinra subcutaneas sobre la liberacion de mediadores extracelulares del dolor en el sitio de la inyeccion usando el metodo de microdialisis

Para investigar el efecto agudo de la inyeccion de varias composiciones de anakinra, incluyendo anakinra en CSEP (vease el Ejemplo 6), asf como PBS como control, se emplea un metodo de microdialisis bien conocido, para la determinacion de concentraciones extracelulares de mediadores bioqmmicos del dolor (por ejemplo, neurotransmi- sores, neuromoduladores y citocina y quimiocina inflamatoria aguda). Los animales se anestesian mediante inhala- cion de isoflourano durante el experimento. La sonda de microdialisis se inserta en la dermis de la piel en la parte superior del cuello de cada animal. El tubo de entrada de la sonda de microdialisis se conecta a una bomba de microinfusion y se puede bombear una solucion de Krebs-Ringer con un caudal de 1-10 ml/min. Las muestras se recogen y se analiza el mediador del dolor (por ejemplo, mediante ELISA) para cada experimento individual (Weidner C., et al., 2000 y Yoshitake T. et al., 2012).

Referencias

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• Fransson J. y Espander-Jansson A. (1996): Local tolerance of subcutaneous injections. J. Pharm. Pharmacol. 48: 1012-1015.

• Frenken, L.A., van Lier, H.J., Jordans, J.G., Leunissen, K.M., van Leusen, R., Verstappen, V.M., Koene, R.A. (1993): Identification of the component part in an epoetin alfa preparation that causes pain after subcutaneous injection. Am. J. Kidney Dis. 22: 553-556.

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5 • Kanaan S.A. et al: (1996): Endotoxin-induced local inflammation and hyperalgesia in rats and mice: a new

model for inflammatory pain. Pain 66: 373-379.

• Laursen T., Hansen B y Fisker S. (2006): Pain Perception after Subcutaneous Injections of Media Containing Different Buffers. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology 98: 218-221.

• Nema S., Brendel R. y Washkuhn R.: Excipients: Parenteral Dosage Forms and Their Role. En: Swarbrick, 10 J. (compilador) Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, tercera edicion. Informa Healthcare, 2006.

• Piovezan A.P. et al. (1998): Effects of endothelin-1 on capsaicin-induced nociception in mice. European Journal of Pharmacology 351: 15-22

• Raibekas A, Bures E., Siska C., Kohno T., Latypov R. y Kerwin B. (2005): Anion Binding and Controlled Aggregation of Human Interleukin-1 Receptor Antagonist. Biochemistry 44: 9871-9879.

15 • Thaler K., Chandiramani D., Hansen R. y Gartlehner G. (2009): Efficacy and safety of anakinra for the tre

atment of rheumatoid arthritis: an update of the Oregon Drug Effectiveness Review Project. Biologics 3: 485-498.

• Wang J., Kowall R. (1980): Review of excipients and pH's for parenteral products used in the United States. Journal of Parenteral Drugs 34: 452-462.

• Winder C., et al. (2000): Acute effect of substance P and calcitonin gene-related peptide in human skin - A 20 microdialysis study. The Journal of Investigative Dermatology. 115: 1015-1020.

• Yoshitake T., et al. (2012): Determination of histamine in microdialysis samples from Guinea pig skin by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. Skin Pharmacology Physiology 25:65-72.

Claims (4)

1. 10

   15

   20

   REIVINDICACIONES

   1. Una formulacion farmaceutica adecuada para inyeccion, en donde formulacion esta exenta de citrato, que com- prende

   (a) 100 - 200 mg/ml de anakinra;

   (b) EDTA 0,05 -1 mM;

   (c) 0,01 a 1% de polisorbato 80;

   (d) NaCl 120 - 180 mM;

   (e) fosfato de sodio 1 - 50 mM, pH 6 - 7; y

   (f) 5 - 50 mg/ml de manitol.
2. 2. La formulacion farmaceutica segun la reivindicacion 1, que esta adaptada para la inyeccion subcutanea de anakinra.
3. 3. La formulacion farmaceutica segun la reivindicacion 1 o 2, que comprende:

   (a) 150 mg/ml de anakinra;

   (b) EDTA 0,5 mM;

   (c) 0,1% de polisorbato 80;

   (d) NaCl 145 mM;

   (e) fosfato de sodio 10 mM, pH 6,5; y

   (f) 10 mg/ml de manitol.
4. 4. La formulacion farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para uso en el tratamiento de la artritis reumatoide.