RS57852B1 - Postupci za smanjenje agregacije il-1ra - Google Patents

Description

Opis pronalaska

Oblast tehnike

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na postupke za smanjenje agregacije agregirajućeg antagonista interleukin-1 receptora (IL-1ra). Otkrivanjem su takođe realizovani postupci za poboljšanje formulacija lekova koji sadrže smanjenje agregacije IL-1ra. Takođe su otkrivene metode lečenja bolesti korišćenjem IL-1ra čija agregacija je smanjena. Konačno, predmetno otkrivanje se odnosi na kompozicije i kitove koji sadrži IL-1ra čija agregacija je smanjena.

STANJE TEHNIKE

[0002] Interleukin-1 alfa (IL-1α), interleukin-1 beta (IL-1β), i antagonist interleukin-1 receptora (IL-1ra) se svi vezuju za tip 1 IL-1 receptora (IL-1RI), koji se nalazi na površini izvesnih tipova ćelija. IL-1α i IL-1β imaju fiziološke efekte na više različitih ciljnih ćelija, uključujući izvesne ćelije koje su uključene u zapaljenske i imune reakcije. Nasuprot tome, IL-1ra se vezuje za IL-1RI, ali ne pobuđuje uporedive nizvodne biološke reakcije. Umesto toga, IL-1ra kompetitivno inhibira vezivanje IL-1α i IL-1β za IL-1RI. Anakinra, verzija IL-1ra proizvedena od strane E. coli, se plasira na tržištu za lečenje reumatoidnog artritisa.

[0003] Chang B.S. et al., ("Physical factors affecting the storage stability of freeze-dried interleukin-1 receptor antagonist: Glass transition and protein conformation", Archives of Biochemistry and Biophysics, Njujork, US. tom 331, br.2, 1996, str.249-258, ISSN: 0003-9861) i Chang B.S. et al., (Development of a stable freeze-dried formulation of recombinant human interleukin-1 receptor antagonist, Pharmaceutical Research, Njujork, US, tom 13, br.

2, 1996, str.243-249, ISSN: 0724-8741) opisuju postupke stabilizacije zamrzavanjem osušenih, liofilizovanih formulacija IL-1ra.

[0004] Chang B.S. et al., (Development of a stable freeze-dried formulation of recombinant human interleukin-1 receptor antagonist, Pharmaceutical Research, Njujork, US, tom 13, br.

2, 1996, str.243-249)

SUŠTINA PRONALASKA

[0005] Obim pronalaska je definisan patentnim zahtevima. Bilo koja pozivanja u opisu na metode lečenja se odnose na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove prema predmetnom pronalasku za primenu u metodu lečenja ljudskog (ili životinjskog) tela terapijom. Predmetni pronalazak se odnosi na postupak za smanjenje agregacije agregirajućeg antagonista interleukin-1 receptora (IL-1ra) ili smanjenje brzine agregacije IL-1ra u vodenoj kompoziciji inkubacijom vodene kompozicije koja sadrži IL-1ra sa najmanje jednim aksesornim molekulom u koncentraciji dovoljnoj za smanjenje agregacije ili smanjenje brzine agregacije IL-1ra u vodenoj kompoziciji, pri čemu je najmanje jedan od najmanje jednog aksesornog molekula efektivan za smanjenje agregacije između 20°C i 45°C i izabran je između šećera u koncentraciji od 1 do 3 procenta i višestruko naelektrisanog anjona.

[0006] Takođe je otkriven postupak za dobijanje formulacije leka sa antagonistom interleukin-1 receptora (IL-1ra). Ovaj postupak sadrži inkubaciju agregirajućeg IL-1ra sa najmanje jednim aksesornim molekulom. U izvesnim slučajevima, agregacija je smanjena.

[0007] Otkriven je metod lečenja pacijenta. Otkriven je metod lečenja pacijenta koji ima artritis. Otkriven je metod lečenja pacijenta koji ima reumatoidni artritis. Otkriven je metod lečenja pacijenta koji ima osteoartritis. Otkriven je metod lečenja pacijenta koji ima najmanje jedno od Kronove bolesti, ulcerativnog kolitisa, glomerulonefritisa, ili leukemije. Otkriven je metod lečenja pacijenta koji ima nepoželjni efekat IL-1. Metod lečenja pacijenta obuhvata davanje pacijentu kompozicije koja sadrži (i) terapeutski efektivnu količinu agregirajućeg antagonista interleukin-1 receptora (IL-1ra) i (ii) najmanje jedan aksesorni molekul.

[0008] U izvesnim primerima izvođenja, najmanje jedan aksesorni molekul je u koncentraciji koja smanjuje agregaciju agregirajućeg IL-1ra. U izvesnim primerima izvođenja, najmanje jedan aksesorni molekul je u koncentraciji koja smanjuje brzinu agregacije agregirajućeg IL-1ra. U izvesnim primerima izvođenja, najmanje jedan aksesorni molekul je izabran između šećera i višestruko naelektrisanog anjona. U izvesnim primerima izvođenja, najmanje jedan aksesorni molekul je višestruko naelektrisani anjon. U izvesnim primerima izvođenja, najmanje jedan aksesorni molekul je od 1 do 20 mM pirofosfata. U izvesnim primerima izvođenja, najmanje jedan aksesorni molekul je od 1 do 20 mM citrata. U izvesnim primerima izvođenja, najmanje jedan aksesorni molekul je najmanje jedan šećer. U izvesnim primerima izvođenja, najmanje jedan od pomenutih šećera je glicerol, sorbitol, ili saharoza. Šećer je u koncentraciji od 1 do 3 procenta.

[0009] U izvesnim primerima izvođenja, najmanje jedan aksesorni molekul je izabran između aksesornog molekula reaktivnog sa lizinom i aksesornog molekula reaktivnog sa argininom. U izvesnim primerima izvođenja, najmanje jedan aksesorni molekul je izabran između 6-(N-(7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-il)amino)heksanske kiseline (NBD-X), metil acetil fosfata (MAP), i anhidrida citrakonske kiseline.

KRATKI OPIS SLIKA NACRTA

[0010]

Slika 1 prikazuje profil agregacije IL-1ra proteina prirodnog tipa tokom vremena u PSE (10 mM fosfata, pH 6.5, 140 mM NaCl, 0.5 mM EDTA) ili CSE (10 mM citrata, pH 6.5, 140 mM NaCl, 0.5 mM EDTA) razmotren u Primeru 2.

Slika 2 prikazuje reverzno-faznu tečnu hromatografiju visokih performansi (RP-HPLC) IL-1ra proteina prirodnog tipa derivatizovanog sa NBD-X razmotrenu u Primeru 3. Gornji deo prikazuje apsorbansu NBD-X obeleženog IL-1ra na 215 nm. Donji deo prikazuje fluorescentnu emisiju na 535 nm posle pobude na 480 nm.

Slika 3 prikazuje brzine agregacije za IL-1ra protein prirodnog tipa u prisustvu rastućih koncentracija anjona fosfata, pirofosfata, i citrata razmotrene u Primeru 4.

Slika 4 prikazuje brzine agregacije za IL-1ra protein prirodnog tipa u prisustvu rastućih koncentracija glicerola, sorbitola, ili saharoze razmotrene u Primeru 5.

Slika 5 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 1) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 2) prekursora humanog IL-1ra, koji sadrži sekretornu vodeću sekvencu.

Slika 6 prikazuje aminokiselinsku sekvencu humanog IL-1ra kome nedostaje sekretorna vodeća sekvenca (SEQ ID NO: 3). Tačka (•) označava lizin na poziciji 93. Plus (+) označava arginin na poziciji 97. Takođe su označene lokacije triptofana-16 (Δ) i tirozina-34 (o).

Slika 7 prikazuje ilustrativnu kristalnu strukturu IL-1ra dobijenu rentgenskim zracima. Slika 8 prikazuje deo međupovršine između dve podjedinice asimetričnog IL-1ra dimera u kristalnoj strukturi dobijenoj rentgenskim zracima opisanoj za Sliku 1.

Slika 9 prikazuje ureom-indukovano ravnotežno razvijanje IL-1ra detektovano cirkularnim dihroizmom razmotreno u Primeru 6.

Slika 10 prikazuje ureom-indukovano ravnotežno razvijanje IL-1ra detektovano intrinsičnom fluorescencijom razmotreno u Primeru 6.

Slika 11 prikazuje gvanidinijum hidrohloridom indukovano razvijanje IL-1ra sa cirkularnim dihroizmom razmotreno u Primeru 6.

Slika 12 prikazuje gvanidinijum hidrohloridom indukovano razvijanje IL-1ra sa intrinsičnom fluorescencijom razmotreno u Primeru 6.

Slika 13 prikazuje reverzno-faznu HPLC za IL-1ra afinitetno obeležen sa metil acetil fosfatom (MAP) u prisustvu 10 mM citrata, pH 6.5, što je razmotreno u Primeru 7.

Slika 14 prikazuje reverzno-faznu HPLC za IL-1ra afinitetno obeležen sa metil acetil fosfatom (MAP) u prisustvu 10 mM fosfata, pH 6.5, što je razmotreno u Primeru 7.

Slika 15 prikazuje preklapanje reverzno-faznih HPLC profila za IL-1ra afinitetno obeležen sa metil acetil fosfatom za 4.5 sata (270 minuta) u prisustvu 10 mM citrata, pH 6.5, 10 mM fosfata, pH 6.5, ili 10 mM pirofosfata, pH 6.4, što je razmotreno u Primeru 7. Četiri slabo izražena pika su označena sa 1, 2, 3, i 4.

Slika 16 prikazuje brzinu derivatizacije IL-1ra sa metil acetil fosfatom u prisustvu 10 mM citrata, pH 6.5, što je razmotreno u Primeru 7. Slika 16A prikazuje reprodukciju hromatograma sa Slike 13. Slika 16B prikazuje rezultate dekonvolucije svakog hromatograma sa Slike 16A. Slika 16C prikazuje dijagram integracije svakog od razvijenih pikova sa Slike 16B prema vremenu.

Slika 17 prikazuje poređenje brzine derivatizacije IL-1ra sa MAP u prisustvu različitih pufera za različite pH, što je razmotreno u Primeru 7.

Slika 18 prikazuje preklapanje profila reverzno-fazne HPLC za IL-1ra afinitetno obeležen sa metil acetil fosfatom za 5.5 sati u prisustvu 10 mM citrata ili 10 mM fosfata za različite pH nivoe, što je razmotreno u Primeru 7.

Slika 19 prikazuje profil agregacije IL-1ra proteina prirodnog tipa tokom vremena u različitim koncentracijama fosfata u puferu sa 100 mM NaCl, pH 6.5, što je razmotreno u Primeru 8.

Slika 20 prikazuje vezivanje citrata za IL-1ra kao funkciju povećanja koncentracije citrata, što je razmotreno u Primeru 9.

Slika 21 prikazuje nametanje za vezivanje citrata za IL-1ra povećanjem koncentracija pirofosfata ili fosfata, što je razmotreno u Primeru 10.

Slika 22 prikazuje dijagram K<d>Lapp za vezivanje citrata za IL-1ra kao funkciju koncentracije pirofosfata u rastvoru, što je razmotreno u Primeru 10. Bilo je izračunato da je K<d>xza vezivanje pirofosfata za mesto vezivanja anjona na IL-1ra jednako 2.994 mM. Slika 23 prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 4) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 5) ilustrativnog IL-1ra.

Slika 24 prikazuje aminokiselinsku sekvencu ilustrativnog IL-1ra, koji je označen sa icIL-1ra (SEQ ID NO: 6). SEQ ID NO: 6 ima istu sekvencu kao SEQ ID NO: 3, ali sa dodatnih 7 aminokiselina na N-terminusu.

DETALJNI OPIS IZVESNIH ILUSTRATIVNIH PRIMERA IZVOĐENJA

[0011] U ovoj prijavi, korišćenje jednine obuhvata i množinu, osim ako nije posebno specifikovano drugačije. U ovoj prijavi, korišćenje "ili" znači "i/ili", osim ako nije navedeno drugačije. Pored toga, korišćenje izraza "sadrži", kao i drugih oblika, kao što su "obuhvata" i "uključuje", nije ograničavajuće. Takođe, izrazi kao što su "element" ili "komponenta" obuhvataju i elemente, i komponente koje sadrže jednu jedinicu, i elemente i komponente koje sadrže više od jedne podjedinice, osim ako specifično nije drugačije navedeno.

[0012] U različitim primerima izvođenja se mogu primeniti standardne tehnike za rekombinantnu DNK, sintezu oligonukleotida, kulture tkiva, transformaciju i transfekciju. U različitim primerima izvođenja, enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja se mogu izvoditi u skladu sa specifikacijama proizvođača ili kao što se obično izvodi u odgovarajućoj oblasti ili kao što je ovde opisano. U različitim primerima izvođenja, tehnike i procedure se mogu generalno izvoditi u skladu sa uobičajenim postupcima poznatim u odgovarajućoj oblasti i kao što je opisano u različitim generalnim i specifičnijim referencama koje su citirane i razmotrene u okviru predmetnog opisa i/ili koje su poznate stručnjaku iz odgovarajuće oblasti. Vidi npr. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. izd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Osim ako nisu obezbeđene specifične definicije, nomenklature korišćene u vezi sa, i laboratorijske procedure i tehnike analitičke hemije, sintetičke organske hemije, i medicinske i farmaceutske hemije koje su ovde opisane su one koje su poznate i uobičajeno se upotrebljavaju u odgovarajućoj oblasti. U različitim primerima izvođenja, standardne tehnike se mogu koristiti za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutske preparate, formulacije, isporuku i lečenje pacijenata. U izvesnim primerima izvođenja gde je aminokiselina "zamenjena" drugom aminokiselinom, ta zamena se može izvesti rekombinantno, npr. mutacijom kodona u polinukleotidu koji kodira aminokiselinu u kodon koji kodira drugu aminokiselinu. U izvesnim primerima izvođenja, mutacija kodona se može izvesti bilo kojim metodom koji je poznat u odgovarajućoj oblasti.

Definicije

[0013] Kada se koriste u skladu sa predmetnimm pronalaskom, smatra se da sledeći izrazi, osim ako nije drugačije naznačeno, imaju sledeća značenja:

[0014] Izraz "izolovani polinukleotid" će značiti polinukleotid genomske, kDNK, ili sintetičkog porekla, ili neku njihovu kombinaciju, koji (1) nije povezan bar sa delom polinukleotida u kome se nalazi u prirodi, ili (2) je povezan sa polinukleotidom sa kojim nije povezan u prirodi, ili (3) ne pojavljuje se u prirodi.

[0015] Izraz "operativno povezane" se odnosi na komponente koje su u takvom odnosu koji im dozvoljava da funkcionišu na njihov ciljni način. Na primer, kontrolna sekvenca koja je "operativno povezana" sa kodirajućom sekvencom je ligatirana tako da se ostvaruje ekspresija kodirajuće sekvence pod uslovima koji su uporedivi sa funkcionisanjem kontrolnih sekvenci.

[0016] Izraz "kontrolna sekvenca" se odnosi na polinukleotidne sekvence koje mogu ostvariti ekspresiju i preradu kodirajućih sekvenci za koje su ligatirane. Priroda takvih kontrolnih sekvenci se može razlikovati u zavisnosti od organizma domaćina. Prema izvesnim primerima izvođenja, kontrolne sekvence za prokariote mogu sadržati promotere, ribozomska mesta vezivanja, i sekvence za prekid transkripcije. Prema izvesnim primerima izvođenja, kontrolne sekvence za eukariote mogu sadržati promotere i sekvencu za prekid transkripcije. U izvesnim primerima izvođenja, "kontrolne sekvence" mogu sadržati vodeće sekvence i/ili fuzione partnerske sekvence.

[0017] Izraz "polinukleotid" označava polimerni oblik nukleotida koji ima prirodne i/ili modifikovane ribonukleotide i/ili deoksiribonukleotide koji su međusobno povezani prirodnim i/ili neprirodnim vezama. U izvesnim primerima izvođenja, polinukleotid ima dužinu od najmanje 10 baza. Izraz obuhvata jednolančane i dvolančane oblike DNK/RNK, i hibrid DNK/RNK, ili njihove modifikovane oblike.

[0018] Izraz "oligonukleotid" obuhvata polimere koji imaju prirodne i/ili modifikovane ribonukleotide i/ili deoksiribonukleotide, koji su međusobno povezani prirodnim i/ili neprirodnim vezama. Oligonukleotidi su podskup polinukleotida i generalno sadrže oko 200 baza ili manje. U izvesnim primerima izvođenja, oligonukleotidi imaju dužinu od oko 10 do oko 60 baza. U izvesnim primerima izvođenja, oligonukleotidi imaju dužinu od 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ili 21 do 40 baza. Oligonukleotidi mogu biti jednolančani ili dvolančani. Oligonukleotidi mogu biti sensni ili antisensni oligonukleotidi.

[0019] Izraz "prirodni nukleotidi" obuhvata deoksiribonukleotide i ribonukleotide. Izraz "modifikovani nukleotidi" obuhvata nukleotide sa modifikovanim ili supstituisanim šećernim grupama i/ili modifikovanim ili supstituisanim grupama nukleotidnih baza ili slično. Izrazi "oligonukleotidna veza" i "polinukleotidna veza" obuhvata veze kao što su fosforotioat, fosforoditioat, fosforoselenoat, fosforodiselenoat, fosforoanilotioat, fosforaniladat, fosforoamidat i slično. Vidi, npr. LaPlanche et al. Nucl. Acids Res.14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc.106:6077 (1984); Stein et al. Nucl. Acids Res.16:3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, str.87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oksford Engleska (1991)); Stec et al. US pat. br.5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990). U izvesnim primerima izvođenja, oligonukleotid ili polinukleotid mogu sadržati marker.

[0020] Izraz "prirodni" kada se primeni na objekat se odnosi na objekat koji se može naći u prirodi. Na primer, polipeptid ili polinukleotidna sekvenca koji su prisutni u organizmu (uključujući viruse) koji mogu biti izolovani iz izvora u prirodi i koji nisu modifikovani od strane čoveka u laboratoriji ili na neki drugi način su prirodni.

[0021] Izraz "izolovani protein" znači da je protein napravljen putem sinteze ili je protein kodiran genomskom DNK, kDNK, RNK, ili drugim polinukleotidom, koji (1) ne sadrži bar neke proteine sa kojima bi se normalno našao; ili (2) u suštini je slobodan od drugih proteina iz istog izvora, npr. od istih vrsta; ili (3) izražen je od strane ćelije od drugačije vrste; ili (4) ne pojavljuje se u prirodi. U notaciji za polipeptide koja se ovde upotrebljava, smer sa leve strane je amino-terminalni smer, a smer sa desne strane je karboksi-terminalni smer, u skladu sa standardnim korišćenjem i konvencijom, osim ako nije specifično navedeno drugačije.

[0022] Slično tome, osim ako posebno nije navedeno drugačije, levi kraj jednolančanih polinukleotidnih sekvenci je 5’ kraj; levi smer dvolančanih polinukleotidnih sekvenci se navodi kao 5’ smer. Smer od 5’ do 3’ dodavanja nastajućih RNK transkripata se navodi kao smer transkripcije; regioni sekvenci na DNK lancu koji su na 5’ do 5’ kraju RNK transkripta se navode kao "uzvodne sekvence" i "uzvodno su od kodirajućeg regiona"; regioni sekvenci na DNK lancu koji su 3’ do 3’ kraj RNK transkripta se navode kao "nizvodne sekvence" i "nizvodno su od kodirajućeg regiona".

[0023] Kada se ovde koriste, izrazi "marker" ili "obeleženi" se odnose na prisustvo detektabilnog radikala. Detektabilni radikal može biti inkorporiran u toku sinteze polinukleotida ili polipeptida ili može biti vezan, bilo kovalentno ili nekovalentno, posle sinteze. Obeležavanje može biti, npr. inkorporiranje radioobeležene aminokiseline, vezivanje biotinskih radikala koji se mogu detektovati obeleženim avidinom (npr. streptavidin koji sadrži fluorescentni radikal ili enzimska aktivnost koja se može detektovati optičkim ili kolorimetrijskim postupcima). U izvesnim primerima izvođenja, marker ili detektabilni radikal može biti terapeutski. Različiti postupci obeležavanja polipeptida i/ili polinukleotida su poznati u odgovarajućoj oblasti. Primeri markera za polipeptide i/ili polinukleotide obuhvataju, ali nisu ograničeni na: radioizotope ili radionuklide (npr.<3>H,<14>C,<15>N,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<125>I,<131>I), fluorescentne markere (npr. FITC, rodamin, lantanid fosfore), enzimske markere (npr. ren peroksidaza, β-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza), hemiluminescentne markere, biotinil grupe, unapred određene polipeptidne epitope koje prepoznaje sekundarni reporter (npr. sekvence leucinskog zatvaračkog para, mesta vezivanja za sekundarna antitela, domeni za vezivanje metala, tagovi epitopa). U izvesnim primerima izvođenja, markeri su vezani za spejserske krake različitih dužina da bi se smanjio potencijal za prostorni poremećaj.

[0024] Kada se ovde koriste, dvadeset uobičajenih aminokiselina i njihove skraćenice slede uobičajen način korišćenja. Vidi Immunology--A Synthesis (2. izdanje, E. S. Golub i D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Stereoizomeri (npr. D-aminokiseline) od dvadeset uobičajenih aminokiselina, neprirodne aminokiseline, kao što su α-, α-disupstituisane aminokiseline, N-alkil aminokiseline, mlečna kiselina, i druge nekonvencionalne aminokiseline, mogu takođe biti podesne komponente za polipeptide prema predmetnom pronalasku. Neograničavajuće ilustrativne nekonvencionalne aminokiseline obuhvataju 4-hidroksiprolin, γ-karboksiglutamat, ε-N,N,N-trimetillizin, ε-N-acetillizin, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, α-N-metilarginin, i druge slične aminokiseline i iminokiseline.

[0025] Stručnjak iz odgovarajuće oblasti je sposoban da identifikuje podesne varijante polipeptida dobro poznatim tehnikama. U izvesnim primerima izvođenja, stručnjak iz odgovarajuće oblasti može identifikovati podesne regione polipeptida koji mogu biti promenjeni bez poništavanja aktivnosti od strane ciljajućih regiona za koje se ne veruje da su važni za aktivnost. U izvesnim primerima izvođenja, mogu se identifikovati ostaci i delovi polipeptida koji su sačuvani među sličnim polipeptidima. U izvesnim primerima izvođenja, parne površine koje mogu biti važne za biološku aktivnost ili za strukturu mogu biti podložne konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama bez poništavanja biološke aktivnosti ili bez negativnog uticaja na strukturu polipeptida.

[0026] Dodatno tome, u izvesnim primerima izvođenja, stručnjak iz odgovarajuće oblasti može razmotriti studije strukture-funkcije i identifikovati ostatke u sličnim polipeptidima koji su važni za aktivnost ili strukturu. U svetlosti takvog poređenja, može se predvideti važnost aminokiselinskih ostataka u proteinu koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima koji su važni za aktivnost ili strukturu u sličnim proteinima. U izvesnim primerima izvođenja, stručnjak iz odgovarajuće oblasti može izabrati hemijski slične aminokiselinske supstitucije za predviđene važne aminokiselinske ostatke.

[0027] U izvesnim primerima izvođenja, stručnjak iz odgovarajuće oblasti može analizirati trodimenzionalnu strukturu i aminokiselinsku sekvencu u odnosu na poznate strukture u sličnim polipeptidima. Pored toga, u izvesnim primerima izvođenja, stručnjak iz odgovarajuće oblasti može generisati testne varijante koje sadrže samo jednu aminokiselinsku supstituciju na svakom željenom aminokiselinskom ostatku. U izvesnim primerima izvođenja, varijante onda mogu biti podvrgnute trijaži korišćenjem testova aktivnosti koji su poznati stručnjacima iz odgovarajuće oblasti. Takve varijante bi se mogle upotrebiti za sakupljanje informacija o podesnim varijantama. Na primer, u izvesnim primerima izvođenja, ako se otkrije da je promena specifičnog aminokiselinskog ostatka rezultovala poništenom, nepoželjno smanjenom ili nepodesnom aktivnosti, onda varijante sa takvom promenom mogu biti izbegnute. Drugim rečima, na bazi informacija sakupljenih iz takvih rutinskih eksperimenata, stručnjak iz odgovarajuće oblasti može lako odrediti aminokiseline gde bi dalje supstitucije trebalo da budu izbegnute bilo same ili u kombinaciji sa drugim mutacijama.

[0028] U izvesnim primerima izvođenja, delecije, insercije, i/ili supstitucije (koje se pojedinačno ili kolektivno nazivaju "varijanta, odnosno varijante") se izvode u okviru aminokiselinske sekvence IL-1ra proteina prirodnog tipa. Kada se ovde koristi, "IL-1ra protein prirodnog tipa" se odnosi na protein koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3, opciono koji ima dodatni metioninski ostatak na svom N-terminusu, tako da je N-terminalna sekvenca MRPSGR.... Terapeutski protein koji ima generički naziv "anakinra" spada u okvir definicije IL-1ra proteina prirodnog tipa. Anakinra ima sekvencu SEQ ID NO: 5, koja je identična sa SEQ ID NO: 3, ali sa N-terminalnim metioninom. U izvesnim primerima izvođenja, izmene na IL-1ra proteinu prirodnog tipa, kao što je hemijska ili enzimska modifikacija se vrše posle translacije ili sinteze proteina. Takvi izmenjeni IL-1ra proteini se pojedinačno ili kolektivno nazivaju "derivat, odnosno derivati". Izraz IL-1ra obuhvata IL-1ra proteine prirodnog tipa, kao što su prirodne i neprirodne varijante i derivati IL-1ra koji imaju antagonističku aktivnost za IL-1ra receptor.

[0029] U izvesnim primerima izvođenja, "aminokiselina koja nema pozitivno naelektrisanje" je izabrana između alanina, cisteina, asparaginske kiseline, glutaminske kiseline, fenilalanina, glicina, histidina, izoleucina, leucina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, serina, treonina, valina, triptofana, i tirozina. Aminokiseline koje nemaju pozitivno naelektrisanje takođe obuhvataju, ali nisu ograničene na nekonvencionalne aminokiseline koje nemaju pozitivno naelektrisanje. Stručnjak iz odgovarajuće oblasti može odrediti da li ili ne specifična varijanta aminokiseline ima pozitivno naelektrisanje kada se ugradi u polipeptid.

[0030] U izvesnim primerima izvođenja, "aminokiselina koja nema naelektrisanje" je izabrana između alanina, cisteina, fenilalanina, glicina, histidina, izoleucina, leucina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, serina, treonina, valina, triptofana, i tirozina. Aminokiseline koje nemaju naelektrisanje takođe obuhvataju, ali nisu ograničene na nekonvencionalne aminokiseline koje nemaju naelektrisanje. Stručnjak iz odgovarajuće oblasti može odrediti da li ili ne specifična varijanta nekonvencionalne aminokiseline ima naelektrisanje kada se ugradi u polipeptid.

[0031] U izvesnim primerima izvođenja, "polarna aminokiselina koja nema naelektrisanje" je izabrana između cisteina, glicina, glutamina, asparagina, serina, treonina, i tirozina. Polarne aminokiseline koje nemaju naelektrisanje takođe obuhvataju, ali nisu ograničene na nekonvencionalne aminokiseline koje su polarne, ali nemaju naelektrisanje. Stručnjak iz odgovarajuće oblasti može odrediti da li je ili ne specifična varijanta nekonvencionalne aminokiseline polarna i da li ima naelektrisanje kada se ugradi u polipeptid.

[0032] U izvesnim primerima izvođenja, "nearomatična aminokiselina" je izabrana između alanina, arginina, cisteina, asparaginske kiseline, glutaminske kiseline, glicina, histidina, izoleucina, leucina, lizina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, serina, treonina, i valina. Nearomatične aminokiseline takođe obuhvataju, ali nisu ograničene na nekonvencionalne aminokiseline koje nisu aromatične. Stručnjak iz odgovarajuće oblasti može odrediti da li je specifična varijanta nekonvencionalne aminokiseline aromatična kada se ugradi u polipeptid.

[0033] Izraz "katjon-pi interakcija" se odnosi na nekovalentnu interakciju između katjonske aminokiseline i aromatične aminokiseline. U izvesnim primerima izvođenja, katjonska aminokiselina može biti lizin. U izvesnim primerima izvođenja, katjonska aminokiselina može biti arginin. U izvesnim primerima izvođenja, aromatična aminokiselina može biti fenilalanin. U izvesnim primerima izvođenja, aromatična aminokiselina može biti tirozin. U izvesnim primerima izvođenja, aromatična aminokiselina može biti triptofan. Katjon-pi interakcija može biti u okviru pojedinačnog polipeptida (tj. intramolekulska) ili katjon-pi interakcija može biti između dva ili više polipeptida (tj. intermolekulska).

[0034] U izvesnim primerima izvođenja, izvesni aminokiselinski ostaci IL-1ra su uključeni u katjon-pi interakciju. Slika 1 prikazuje rentgensku kristalnu strukturu IL-1ra. Kristalna struktura je bila dobijena korišćenjem 1ILR.pdb fajla i Vector NTI 3D Molecular Viewer (InforMax). IL-1ra se kristalizovao kao asimetrični dimer. Vidi, npr. Vigers et al., J. Biol. Chem., 269: 12874-12879 (1994). Slika 2 prikazuje deo kristalne strukture sa Slike 1. U toj kristalnoj strukturi, lizin-93 na jednoj IL-1ra podjedinici izgleda da je uključen u katjon-pi interakciju sa triptofanom-16 na drugoj IL-1ra podjedinici. Slično tome, arginin-97 na jednoj IL-1ra podjedinici izgleda da je uključen u katjon-pi interakciju sa tirozinom-34 na drugoj IL-1ra podjedinici.

[0035] Izraz "polipeptidni fragment", kada se ovde koristi, se odnosi na polipeptid koji ima amino-terminalnu i/ili karboksi-terminalnu deleciju. U izvesnim primerima izvođenja, fragmenti imaju dužinu od najmanje 5 do 201 aminokiselina. Razumljivo je da u izvesnim primerima izvođenja, fragmenti imaju dužinu od najmanje 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 170, 175, 176, 177, 180, 185, 190, ili 200 aminokiselina.

[0036] Izraz "biološki uzorak", kada se ovde koristi, obuhvata, ali nije ograničen na bilo koju količinu supstance od živog bića ili prethodno živog bića. Takva živa bića obuhvataju, ali nisu ograničena na ljude, miševe, majmune, pacove, zečeve i druge životinje. Takve supstance obuhvataju, ali nisu ograničene na krv, serum, urin, ćelije, organe, tkiva, kosti, koštanu srž, limfne čvorove i kožu.

[0037] Kada se ovde koristi, "u suštini čista" znači da je predmetna makromolekulska vrsta preovlađujuće prisutna makromolekulska vrsta (tj. ona je obilnija, na molskoj bazi, nego bila koja druga pojedinačna makromolekulska vrsta u kompoziciji). U izvesnim primerima izvođenja, u suštini prečišćena frakcija je kompozicija pri čemu predmetna makromolekulska vrsta sadrži najmanje oko 50 procenata (na bazi težine) svih prisutnih makromolekulskih vrsta. U izvesnim primerima izvođenja, u suštini čista kompozicija, predmetna makromolekulska vrsta će sadržati više od 80%, 85%, 90%, 95%, ili 99% tež. svih makromolekulskih vrsta prisutnih u kompoziciji. U izvesnim primerima izvođenja, predmetna makromolekulska vrsta se prečišćava u suštini do homogenosti (tj. zagađujuća vrsta se ne može detektovati u kompoziciji uobičajenim postupcima detekcije). U izvesnim primerima izvođenja, kompozicija se u suštini sastoji samo od jedne makromolekulske vrste.

[0038] Izraz pacijent obuhvata humane i životinjske subjekte.

[0039] Antagonist interleukin-1 receptora (IL-1ra) je humani protein koji deluje kao inhibitor aktivnosti interleukina-1 i član je porodice IL-1, koja takođe obuhvata IL-1α i IL-1β.

Neisključiva, neograničavajuća, neiscrpljujuća lista antagonista IL-1 receptora sadrži Kineret® (anakinra) (npr. protein koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5), IL-1ra protein prirodnog tipa (uključujući, ali bez ograničavanja na protein koji ima sekvencu SEQ ID NO: 3 ili protein koji ima sekvencu SEQ ID NO: 5), intracelularni IL-1ra (icIL-1ra) (uključujući, ali bez ograničavanja na protein koji ima sekvencu SEQ ID NO: 6), IL-1ra β (vidi, npr. PCT objavu br. WO 99/36541), IL-1ra varijante, i IL-1ra derivate. Izvesni antagonisti IL-1ra receptora, uključujući IL-1ra i njegove varijante i derivate, kao i postupci za njihovo dobijanje i primenu, su opisani npr. u US patentu br.5,075,222; US patentu br.6,599,873 B1; US patentu br.5,863,769; US patentu br.5,858,355; US patentu br.5,739,282; US patentu br.

5,922,573; US patentu br.6,054,559; WO 91/08285; WO 91/17184; WO 91/17249; AU 9173636; WO 92/16221; WO 93/21946; WO 94/06457; WO 94/21275; FR 2706772; WO 94/21235; DE 4219626, WO 94/20517; WO 96/22793; WO 96/12022; WO 97/28828; WO 99/36541; WO 99/51744. Antagonist IL-1 receptora može biti glikozilovan ili neglikozilovan.

[0040] Primeri IL-1ras obuhvataju, ali nisu ograničeni na polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 2 i fragmente, varijante, i derivate takvog polipeptida koji imaju antagonističku aktivnost za interleukin-1 receptor; polipeptide koji sadrže aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 3 i fragmente, varijante, i derivate takvog polipeptida koji imaju antagonističku aktivnost za interleukin-1 receptor; polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 5 i fragmente, varijante, i derivate takvog polipeptida koji imaju antagonističku aktivnost za interleukin-1 receptor; i polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 6 i fragmente, varijante, i derivate takvog polipeptida koji ima antagonističku aktivnost za interleukin-1 receptor.

[0041] U izvesnim primerima izvođenja, izraz IL-1ra obuhvata, ali nije ograničen na, IL-1ra varijante koje imaju antagonističku aktivnost za interleukin-1 receptor. U izvesnim primerima izvođenja, IL-1ra varijante su prirodne. U izvesnim primerima izvođenja, IL-1ra varijante su konstruisane veštački. Primeri IL-1ra varijanti obuhvataju, ali nisu ograničeni na aminokiselinske sekvence koje imaju jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija, i/ili adicija u poređenju sa SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ili SEQ ID NO: 6. U izvesnim primerima izvođenja, IL-1ra varijante sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je 95% identična sa aminokiselinskom sekvencom sa SEQ ID NO: 3. U izvesnim primerima izvođenja, IL-1ra varijante sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je 90% identična sa aminokiselinskom sekvencom sa SEQ ID NO: 3. U izvesnim primerima izvođenja, IL-1ra varijante sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je 85% identična sa aminokiselinskom sekvencom sa SEQ ID NO: 3. U izvesnim primerima izvođenja, IL-1ra varijante sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je 75% identična sa aminokiselinskom sekvencom sa SEQ ID NO: 3.

[0042] U izvesnim primerima izvođenja, izraz IL-1ra obuhvata, ali nije ograničen na, IL-1ra fragmente koji imaju antagonističku aktivnost za interleukin-1 receptor. U izvesnim primerima izvođenja, IL-1ra fragmenti su prirodni. U izvesnim primerima izvođenja, IL-1ra fragmenti su konstruisani veštački. Primeri IL-1ra fragmenata obuhvataju, ali nisu ograničeni na fragmente sekvence navedene u SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ili SEQ ID NO: 6. IL-1ra fragmenti su podskup IL-1ra varijanti.

[0043] U izvesnim primerima izvođenja, izraz IL-1ra obuhvata, ali nije ograničen na, IL-1ra derivate koji imaju antagonističku aktivnost za interleukin-1 receptor. U izvesnim primerima izvođenja, IL-1ra derivati su prirodni. U izvesnim primerima izvođenja, IL-1ra derivati su konstruisani veštački. Primeri IL-1ra derivata obuhvataju, ali nisu ograničeni na hemijski ili enzimski modifikovane oblike sekvence navedene u SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ili SEQ ID NO: 6. Primeri IL-1ra derivata takođe obuhvataju, ali nisu ograničeni na hemijski ili enzimski modifikovane oblike varijanti sekvence navedene u SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ili SEQ ID NO: 6.

[0044] U izvesnim primerima izvođenja, izraz IL-1ra obuhvata, ali nije ograničen na, IL-1ra koji ima sekretornu vodeću sekvencu. U izvesnim primerima izvođenja, IL-1ra koji ima sekretornu vodeću sekvencu se naziva "prekursor IL-1ra." Primer aminokiselinska sekvenca prekursora IL-1ra je naveden u SEQ ID NO: 2. Izraz "prekursor IL-1ra" obuhvata fragmente, varijante, i derivate SEQ ID NO: 2 koji mogu da se izluče i prerade u oblik koji ima antagonističku aktivnost za interleukin-1 receptor.

[0045] Izraz IL-1ra obuhvata i agregirajući IL-1ra, i IL-1ra koji ima smanjenu agregaciju. Agregirajući IL-1ra proteini imaju lizin na poziciji 93 i arginin na poziciji 97, ali nisu svi IL-1ra proteini sa lizinom na poziciji 93 i argininom na poziciji 97 agregirajući IL-1ra. "Agregirajući IL-1ra" obuhvata IL-1ra prirodnog tipa, varijantu, i derivat proteina koji agregiraju na 39°C prema sledećem testu. Rastvor 100 mg/ml subjektove IL-1ra se inkubira na 39°C u 10 mM fosfata, 140 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, pH 6.5 (PSE). Kao referenca, rastvor od 100 mg/ml IL-1ra proteina prirodnog tipa koji ima sekvencu SEQ ID NO: 5, se inkubira u PSE na 39°C. Optička gustina za svaki rastvor se meri na 405 nm posle 2 sata inkubacije na 39°C. Ako subjektova IL-1ra ima optičku gustinu posle 2 sata inkubacije koja je najmanje 60% optičke gustine IL-1ra proteina prirodnog tipa posle 2 sata inkubacije, onda je subjektova IL-1ra agregirajuća IL-1ra.

[0046] "IL-1ra koji ima smanjenu agregaciju" obuhvata IL-1ra varijantu i derivat proteina koji imaju optičku gustinu koja je manja od 60% optičke gustine IL-1ra proteina prirodnog tipa u gore opisanom testu.

[0047] U izvesnim primerima izvođenja, izraz " IL-1ra koji ima antagonističku aktivnost za interleukin-1 receptor" se odnosi na IL-1ra prirodnog tipa, varijantu, ili derivat proteina koji je najmanje 50% aktivan kao IL-1ra protein prirodnog tipa koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, u testu formiranja IL-1ra signalnog kompleksa opisanom u Primeru 3.

"Najmanje 50% aktivan" se određuje upoređivanjem EC50 subjektovog IL-1ra sa EC50 za IL-1ra protein prirodnog tipa.

[0048] Izraz "Arginin-97" se odnosi na aminokiselinski ostatak na 97. poziciji u SEQ ID NO: 3 ili na aminokiselinskoj poziciji u IL-1ra koji odgovara aminokiselinskom ostatku na 97. poziciji u SEQ ID NO: 3. Na primer, aminokiselina koja odgovara argininu-97 u SEQ ID NO: 3 je arginin na 98. poziciji u SEQ ID NO: 5. Taj arginin se još uvek navodi kao arginin-97 u IL-1ra. U izvesnim primerima izvođenja, arginin-97 se navodi kao "R97," pri čemu je R jednoslovna oznaka za arginin, a 97 se odnosi na njegovu poziciju u SEQ ID NO: 3. U izvesnim primerima izvođenja, ako se R97 zameni sa drugom aminokiselinom, onda ta mutacija može biti označena sa R97X, pri čemu je X jednoslovna oznaka za zamensku aminokiselinu.

Shodno tome, kao neograničavajući primer, ako se R97 zameni alaninom, onda se ta mutacija može označiti kao R97A.

[0049] Izraz "Lizin-93" se odnosi na aminokiselinski ostatak na 93. poziciji u SEQ ID NO: 3 ili na aminokiselinskoj poziciji u IL-1ra koja odgovara aminokiselinskom ostatku na 93. poziciji u SEQ ID NO: 3. Na primer, aminokiselina koja odgovara lizinu-93 u SEQ ID NO: 3 je lizin na 94. poziciji u SEQ ID NO: 5. Taj lizin se još uvek navodi kao lizin-93 u IL-1ra. U izvesnim primerima izvođenja, lizin-93 se navodi kao "K93," pri čemu je K jednoslovna oznaka za lizin i 93 se odnosi na njegovu poziciju u SEQ ID NO: 3. U izvesnim primerima izvođenja, ako se K93 zameni sa drugom aminokiselinom, ta mutacija se može označiti sa K93X, pri čemu je X jednoslovna oznaka za zamensku aminokiselinu. Shodno tome, kao neograničavajući primer, ako se K93 zameni alaninom, ta mutacija se može označiti kao K93A.

[0050] Izraz "triptofan-16" se odnosi na aminokiselinski ostatak na 16. poziciji u SEQ ID NO: 3 ili na aminokiselinskoj poziciji u IL-1ra koji odgovara aminokiselinskom ostatku na 16. poziciji u SEQ ID NO: 3. Na primer, aminokiselina koja odgovara triptofanu-16 u SEQ ID NO: 3 je triptofan na 17. poziciji u SEQ ID NO: 5. Taj triptofan se još uvek navodi kao triptofan-16 u IL-1ra. U izvesnim primerima izvođenja, triptofan-16 se označava sa "W16," pri čemu je W jednoslovna oznaka za triptofan i 16 se odnosi na njegovu poziciju u SEQ ID NO: 3. U izvesnim primerima izvođenja, ako se W16 zameni sa drugom aminokiselinom, ta mutacija se može označiti sa W16X, pri čemu je X jednoslovna oznaka za zamensku aminokiselinu. Shodno tome, kao neograničavajući primer, ako se W16 zameni alaninom, onda se ta mutacija može označiti sa W16A.

[0051] Izraz "tirozin-34" se odnosi na aminokiselinski ostatak na 34. poziciji u SEQ ID NO: 3 ili na aminokiselinskoj poziciji u IL-1ra koji odgovara aminokiselinskom ostatku na 34. poziciji u SEQ ID NO: 3. Na primer, aminokiselina koja odgovara tirozin-34 u SEQ ID NO: 3 je tirozin na 35. poziciji SEQ ID NO: 5. Taj tirozin se još uvek navodi kao tirozin -35 u IL-1ra. U izvesnim primerima izvođenja, tirozin-34 se označava sa "Y34," pri čemu je Y jednoslovna oznaka za tirozin i 34 se odnosi na njegovu poziciju u SEQ ID NO: 3. U izvesnim primerima izvođenja, ako se Y34 zameni sa drugom aminokiselinom, ta mutacija se može označiti sa Y34X, pri čemu je X jednoslovna oznaka za zamensku aminokiselinu. Shodno tome, kao neograničavajući primer, ako se Y34 zameni alaninom, ta mutacija se može označiti sa Y34A.

[0052] U izvesnim primerima izvođenja, "smanjena agregacija" je definisana kao (1) agregacija polipeptida pod uslovom A koja je smanjena u odnosu na agregaciju polipeptida pod uslovom B; i/ili (2) agregacija varijante polipeptida pod uslovom A koja je smanjena u odnosu na agregaciju prirodnog tipa polipeptida pod istim uslovom A; i/ili (3) agregacija varijante polipeptida pod uslovom A koja je smanjena u odnosu na agregaciju drugačije varijante polipeptida pod istim uslovom A. Kao neograničavajući primer, relativna agregacija se može odrediti za slučaj (1) kao što sledi. Optička gustina na 405 nm polipeptida pod uslovom A se meri u različitim vremenskim trenucima. Optička gustina na 405 nm polipeptida pod uslovom B se onda meri u istim vremenskim trenucima. Kriva agregacije za predmetni polipeptid pod svakim od uslova se onda grafički prikazuje sa optičkom gustinom na y-osi i vremenom na x-osi. Ako polipeptid pod uslovom A ima manju optičku gustinu u vremenskom trenutku t od polipeptida pod uslovom B u istom vremenskom trenutku t, onda se smatra da polipeptid pod uslovom A ima smanjenu agregaciju u odnosu na polipeptid pod uslovom B.

[0053] Primeri različitih uslova obuhvataju, ali nisu ograničeni na razlike u kompoziciji pufera, razlike u temperaturi, razlike u koncentraciji polipeptida, prisustvo i odsustvo aksesornih molekula, razlike u koncentraciji aksesornih molekula, itd.

[0054] Izraz "aksesorni molekul" se odnosi na molekul koji smanjuje agregaciju jednog ili više polipeptida. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul smanjuje agregaciju jednog ili više polipeptida nespecifično. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul smanjuje agregaciju interakcijom sa jednom ili više aminokiselina polipeptida. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul sadejstvuje kovalentno sa jednom ili više aminokiselina polipeptida i naziva se "kovalentni aksesorni molekul." U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul sadejstvuje nekovalentno sa jednom ili više aminokiselina polipeptida i naziva se "nekovalentni aksesorni molekul."

[0055] U izvesnim primerima izvođenja, smanjenje agregacije polipeptida je u vezi sa koncentracijom aksesornog molekula. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul može u suštini eliminisati agregaciju polipeptida. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul smanjuje agregaciju polipeptida za najmanje 10%. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul smanjuje agregaciju polipeptida za najmanje 20%. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul smanjuje agregaciju polipeptida za najmanje 30%. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul smanjuje agregaciju polipeptida za najmanje 40%. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul smanjuje agregaciju polipeptida za najmanje 50%. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul smanjuje agregaciju polipeptida za najmanje 60%. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul smanjuje agregaciju polipeptida za najmanje 70%. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul smanjuje agregaciju polipeptida za najmanje 75%. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul smanjuje agregaciju polipeptida za najmanje 80%. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul smanjuje agregaciju polipeptida za najmanje 85%. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul smanjuje agregaciju polipeptida za najmanje 90%. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul smanjuje agregaciju polipeptida za najmanje 95%.

[0056] U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul smanjuje brzinu agregacije polipeptida. U izvesnim primerima izvođenja, smanjenje brzine agregacije polipeptida zavisi od koncentracije aksesornog molekula. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul u suštini eliminiše agregaciju polipeptida. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul smanjuje brzinu agregacije polipeptida za najmanje 10%. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul smanjuje brzinu agregacije polipeptida za najmanje 20%. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul smanjuje brzinu agregacije polipeptida za najmanje 30%. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul smanjuje brzinu agregacije polipeptida za najmanje 40%. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul smanjuje brzinu agregacije polipeptida za najmanje 50%. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul smanjuje brzinu agregacije polipeptida za najmanje 60%. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul smanjuje brzinu agregacije polipeptida za najmanje 70%. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul smanjuje brzinu agregacije polipeptida za najmanje 75%. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul smanjuje brzinu agregacije polipeptida za najmanje 80%. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul smanjuje brzinu agregacije polipeptida za najmanje 85%. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul smanjuje brzinu agregacije polipeptida za najmanje 90%. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul smanjuje brzinu agregacije polipeptida za najmanje 95%.

[0057] U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul sadejstvuje kovalentno ili nekovalentno sa polipeptidom na jednom ili više aminokiselinskih ostataka. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul sadejstvuje sa jednim ili više specifičnih aminokiselinskih ostataka. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul u suštini ne smanjuje aktivnost polipeptida. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul ne smanjuje aktivnost polipeptida za više od 10%. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekuli ne smanjuju aktivnost polipeptida za više od 20%. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul ne smanjuje aktivnost polipeptida za više od 30%. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul ne smanjuje aktivnost polipeptida za više od 50%. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul ne smanjuje aktivnost polipeptida za više od 75%.

[0058] U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul uklanja naelektrisanje koje je prisutno na aminokiselinskom ostatku. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul uklanja naelektrisanje kovalentnim modifikovanjem aminokiselinskog ostatka. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul uklanja naelektrisanje nekovalentnim sadejstvom sa aminokiselinskim ostatkom, čime "maskira" naelektrisanje.

[0059] Primeri kovalentnih aksesornih molekula obuhvataju, ali nisu ograničeni na 6-(N-(7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-il)amino)heksansku kiselinu (NBD-X), metil acetil fosfat (MAP), i anhidrid citrakonske kiseline.

[0060] Primeri nekovalentnih aksesornih molekula obuhvataju, ali nisu ograničeni na šećere, jednostruko naelektrisane anjone, i višestruko naelektrisane anjone. Primeri šećera koji mogu biti aksesorni molekuli obuhvataju, ali nisu ograničeni na glicerol, saharozu, manitol, i sorbitol. Primeri jednostruko naelektrisanih anjona koji mogu biti aksesorni molekuli obuhvataju, ali nisu ograničeni na fosfat i hlorid. Primeri višestruko naelektrisanih anjona koji mogu biti aksesorni molekuli obuhvataju, ali nisu ograničeni na pirofosfat i citrat.

[0061] Izraz "aksesorni molekul reaktivan sa argininom" se odnosi na aksesorni molekul koji specifično sadejstvuje sa argininskim ostacima. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul reaktivan sa argininom sadejstvuje isključivo sa argininom. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul reaktivan sa argininom sadejstvuje sa argininom pored drugih aminokiselina. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul reaktivan sa argininom sadejstvuje kovalentno sa argininom. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul reaktivan sa argininom sadejstvuje nekovalentno sa argininom. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul reaktivan sa argininom u suštini ne smanjuje aktivnost polipeptida koji sadrži arginin.

[0062] Izraz "aksesorni molekul reaktivan sa lizinom" se odnosi na aksesorni molekul koji specifično sadejstvuje sa lizinskim ostacima. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul reaktivan sa lizinom sadejstvuje isključivo sa lizinom. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul reaktivan sa lizinom sadejstvuje sa lizinom pored drugih aminokiselina. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul reaktivan sa lizinom sadejstvuje kovalentno sa lizinom. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul reaktivan sa lizinom sadejstvuje nekovalentno sa lizinom. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul reaktivan sa lizinom u suštini ne smanjuje aktivnost polipeptida koji sadrži lizin.

[0063] Izraz "višestruko naelektrisani anjoni" se odnosi na molekule koji sadrže više od jednog negativnog naelektrisanja za pH 6.5 i 25°C. U izvesnim primerima izvođenja, višestruko naelektrisani anjoni imaju u proseku više od jednog, ali manje od dva negativna naelektrisanja za pH 6.5 i 25°C. U izvesnim primerima izvođenja, višestruko naelektrisani anjoni imaju u proseku dva ili više negativnih naelektrisanja za pH 6.5 i 25°C. U izvesnim primerima izvođenja, višestruko naelektrisani anjoni imaju u proseku između dva i četiri negativna naelektrisanja za pH 6.5 i 25°C. U različitim primerima izvođenja, stručnjak iz odgovarajuće oblasti može odrediti da li je specifični anjon višestruko naelektrisani anjon za pH 6.5 i 25°C, npr. na osnovu publikovanih pKa vrednosti za anjon. Izraz "jednostruko naelektrisani anjon" se odnosi na anjon koji u proseku ima jedno, ili manje od jednog negativnog naelektrisanja za pH 6.5 i 25°C. U različitim primerima izvođenja, stručnjak iz odgovarajuće oblasti može odrediti da li je specifični anjon jednostruko naelektrisani anjon za pH 6.5 i 25°C, npr. na osnovu publikovanih pKa vrednosti za anjon.

[0064] Izraz "šećer" se odnosi na ugljeni hidrat. Primeri šećera obuhvataju, ali nisu ograničeni na monosaharide, disaharide, i trisaharide. Neograničavajući primeri šećera obuhvataju, ali nisu ograničeni na glicerol, saharozu, manitol, i sorbitol.

[0065] Za bolest ili medicinsko stanje se smatra da je " bolest posredovana sa interleukinom-1" kada je spontana ili eksperimentalna bolest ili medicinsko stanje povezano sa povišenim nivoima IL-1 u telesnim tečnostima ili tkivu i/ili ako ćelije ili tkiva uzeti iz tela proizvode povišene nivoe IL-1 u kulturi. U izvesnim primerima izvođenja, takve bolesti posredovane sa interleukinom-1 se određuju na osnovu jednog ili više od sledeća dva uslova: (1) patološki nalazi povezani sa bolešću ili medicinskim stanjem se mogu podražavati eksperimentalno kod životinja administracijom IL-1 ili prekomernom regulacijom ekspresije IL-1; i/ili (2) patologija indukovana u eksperimentalnim životinjskim modelima bolesti ili medicinskog stanja može biti inhibirana ili eliminisana lečenjem sa agensima koji inhibiraju dejstvo IL-1. U izvesnim primerima izvođenja, jedan ili više od gornjih uslova su ispunjeni kod bolesti posredovane sa IL-1. U izvesnim primerima izvođenja, svi uslovi su ispunjeni kod bolesti posredovane sa IL-1.

[0066] Akutne i hronične bolesti posredovane sa interleukinom-1 (IL-1) obuhvataju, ali nisu ograničene na akutni pankreatitis; amiotrofnu lateralnu sklerozu (ALS, ili Lu Gerigovu bolest); Alchajmerovu bolest; kaheksiju/anoreksiju, uključujući, ali bez ograničavanja na kaheksiju indukovanu AIDS-om; astmu i druge plućne bolesti; aterosklerozu; autoimuni vaskulitis; sindrom hroničnog zamora; bolesti povezane sa klostridijom, uključujući, ali bez ograničavanja na dijareju povezanu sa klostridijom; koronarna stanja i indikacije, uključujući, ali bez ograničavanja na kongestivnu srčanu insuficijenciju, koronarnu restenozu, infarkt miokarda, disfunkciju miokarda (npr. povezanu sa sepsom), i koronarni arterijski bajpas graft; kancer, uključujući, ali bez ograničavanja na leukemije, uključujući, ali bez ograničavanja na multipli mijelom leukemiju i mijelogenu (npr. AML i CML), i metastaze tumora; dijabetes (uključujući, ali bez ograničavanja na dijabetes zavisan od insulina); endometriozu; groznicu; fibromijalgiju; glomerulonefritis; bolest graft protiv domaćina i/ili odbacivanje transplanta; hemoragijski šok; hiperalgeziju; zapaljensku bolest creva; zapaljenska stanja zglobova, uključujući, ali bez ograničavanja na osteoartritis, psorijatični artritis, i reumatoidni artritis; zapaljensku očnu bolest, uključujući, ali bez ograničavanja na one povezane, na primer, sa transplantacijom rožnjače; ishemiju, uključujući, ali bez ograničavanja na cerebralnu ishemiju (uključujući, ali bez ograničavanja na povredu mozga kao rezultat, npr. traume, epilepsije, hemoragije ili moždanog udara, od kojih svaki može dovesti do neurodegeneracije);

Kavasakijevu bolest; poremećaje učenja; plućne bolesti (uključujući, ali bez ograničavanja na akutni respiratorni distres sindrom, ili ARDS); multiplu sklerozu; miopatije (npr. metabolizam mišićnih proteina, uključujući, ali bez ograničavanja na metabolizam mišićnih proteina u sepsi); neurotoksičnost (uključujući, ali bez ograničavanja na takvo stanje indukovano HIV-om); osteoporozu; bol, uključujući, ali bez ograničavanja na bol povezan sa kancerom;

Parkinsonovu bolest; periodontalnu bolest; prevremeni porođaj; psorijazu; reperfuzionu povredu; septički šok; nuspojave zračne terapije; temporalnu mandibularnu bolest zglobova; poremećaj spavanja; uveitis; i zapaljenska stanja koja nastaju usled, npr. istegnuća, uganuća, oštećenja hrskavice, traume, ortopedske hirurgije, infekcije, ili drugih bolesnih procesa.

Detaljni opis izvesnih ilustrativnih primera izvođenja

[0067] Realizovani su postupci za smanjenje agregacije agregirajući IL-1ra. U izvesnim primerima izvođenja, agregirajući IL-1ra čija agregacija treba da bude smanjena sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ili SEQ ID NO: 6. U izvesnim primerima izvođenja, agregirajući IL-1ra čija agregacija treba da bude smanjena sadrži fragment, varijantu, ili derivat polipeptida koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ili SEQ ID NO: 6, gde taj fragment, varijanta, ili derivat ima antagonističku aktivnost za interleukin-1 receptor.

[0068] Agregacija IL-1ra može nastati zbog jedne ili više katjon-pi interakcija između površinskih ostataka dva IL-1ra polipeptida. Na primer, kao što je prikazano na Slici 2, lizin-93 iz jednog IL-1 polipeptida može formirati katjon-pi interakciju sa triptofanom-16 iz drugog IL-1 polipeptida. Slično tome, arginin-97 iz jednog polipeptida može formirati katjon-pi interakciju sa tirozinom-34 iz drugog polipeptida. Ove interakcije mogu izazvati to da se dva IL-1ra polipeptida vežu jedan za drugi. Pored toga, pošto je ovo vezivanje asimetrično, što znači da ne dolazi do vezivanja između iste strane na oba polipeptida, svaki polipeptid može biti u stanju da se veže za dva IL-1ra polipeptida istovremeno. U stvari, ako su mogući dodatni kontakti za asimetrično vezivanje između IL-1ra polipeptida, onda IL-1ra polipeptid može biti u stanju da se veže za više od dva IL-1ra polipeptida istovremeno. Ako svaki od IL-1ra polipeptida može da se veže za najmanje dva druga IL-1ra polipeptida, npr. putem asimetrične katjon-pi interakcije prikazane na Slici 8, onda ove interakcije mogu dovesti do agregacije IL-1ra u rastvoru.

[0069] U izvesnim primerima izvođenja, agregacija agregirajućeg IL-1ra može biti smanjena smanjenjem pozitivnog naelektrisanja na lizinu-93, na argininu-97, ili na lizinu-93 i na argininu-97. U izvesnim primerima izvođenja, ako je pozitivno naelektrisanje na jednom ili obe od ovih pozicija dovoljno smanjeno, onda se katjon-pi interakcija ne mora formirati, ili može biti oslabljena tako da više nije dovoljno stabilna da izazove agregaciju IL-1ra. U izvesnim primerima izvođenja, agregacija agregirajućeg IL-1ra može biti smanjena drugim mehanizmima. Postupak nije ograničen mehanizmom smanjenja agregacije. Bilo koji od opisanih postupaka za smanjenje agregacija se može desiti zahvaljujući ilustrativnom predloženom mehanizmu koji je gore razmotren ili bilo kojim drugim mehanizmom kojim se ostvaruje opisani rezultat. Molekuli koji mogu da smanje agregaciju agregirajućeg IL-1ra se zajednički nazivaju "aksesorni molekuli," bez obzira na njihov mehanizam za smanjenje agregacije i bez obzira da li oni deluju kovalentno ili nekovalentno.

[0070] U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul može smanjiti agregaciju agregirajućeg IL-1ra smanjenjem pozitivnog naelektrisanja na jednom ili oba od lizina-93 ili arginina-97. U različitim primerima izvođenja, aksesorni molekul može smanjiti pozitivno naelektrisanje na lizinu-93, na argininu-97, ili i na lizinu-93, i na argininu-97 kovalentno ili nekovalentno. Aksesorni molekul za koji je pretpostavljeno da smanjuje pozitivno naelektrisanje na jednoj ili obe ove aminokiseline takođe može smanjiti agregaciju drugim mehanizmima, ili može delovati u potpunosti drugim mehanizmima.

[0071] U izvesnim primerima izvođenja, inkubacija agregirajućeg IL-1ra sa jednostruko naelektrisanim anjonskim ili višestruko naelektrisanim anjonskim molekulima može smanjiti agregaciju IL-1ra. U izvesnim primerima izvođenja, inkubacija IL-1ra koji ima smanjenu agregaciju sa jednostruko naelektrisanim anjonskim ili višestruko naelektrisanim anjonskim molekulima može dalje smanjiti agregaciju IL-1ra. U izvesnim primerima izvođenja, to smanjenje agregacije može nastati zbog toga što jednostruko naelektrisani anjonski ili višestruko naelektrisani anjonski molekul sadejstvuje sa pozitivnim naelektrisanjem na lizinu-93, na argininu-97, ili na lizinu-93 i argininu-97. Kao što je razmotreno u radu opisanom u Primeru 2 i prikazanom na Slici 1, inkubacija agregirajućeg IL-1ra u CSE koji sadrži 10 mM citrata je smanjila agregaciju (merenu optičkom gustinom na 405 nm) tokom dužeg vremena od inkubacije agregirajućeg IL-1ra u PSE, koji sadrži 10 mM fosfata. U tom eksperimentu, agregacija u CSE dostigla je OD405od oko 0.55, dok je agregaciju PSE dostigla OD405od oko 1.2. Shodno tome, inkubacija u CSE smanjila je agregaciju za više od 50% u odnosu na agregaciju u PSE u ovom eksperimentu.

[0072] Slično tome, u radu opisanom u Primeru 2, brzina agregacije agregirajućeg IL-1ra u CSE je bila manja od brzine agregacije agregirajućeg IL-1ra u PSE. Brzina agregacije u PSE na Slici 1 je predstavljena nagibom linije označene sa Kagg. Slična linija može biti povučena za CSE na Slici 1, i ta linija bi imala blaži nagib, što ukazuje na smanjenje brzine agregacije u CSE u odnosu na PSE.

[0073] U izvesnim primerima izvođenja, citrat može biti efektivniji za smanjenje agregacije, jer ima veće negativno naelektrisanje od fosfata za pH 6.5. U izvesnim primerima izvođenja, izvesne količine negativnog naelektrisanja mogu biti efektivnije od drugih za smanjenje agregacije. Pored toga, u izvesnim primerima izvođenja, izvesne konfiguracije negativnog naelektrisanja, npr. rastojanje između negativnih naelektrisanja na aksesornom molekulu i to koliko su "fiksna" ta negativna naelektrisanja u prostoru može takođe uticati na efektivnost aksesornih molekula. Shodno tome, u izvesnim primerima izvođenja, na efektivnost različitih aksesornih molekula može uticati količina negativnog naelektrisanja, ali količina negativnog naelektrisanja ne mora uvek biti determinišuća. U izvesnim primerima izvođenja, višestruko naelektrisani anjon može biti efektivniji za smanjenje agregacije od jednostruko naelektrisanog anjona. U različitim primerima izvođenja, stručnjak iz odgovarajuće oblasti može izabrati aksesorne molekule i odrediti koji je odgovarajući za specifičnu predviđenu primenu. Na primer, izvesni aksesorni molekuli mogu biti više ili manje efektivni na izvesnim temperaturama. U različitim primerima izvođenja, stručnjak iz odgovarajuće oblasti može izabrati aksesorni molekul koji je efektivan na specifičnoj temperaturi na kojoj će agregirajući IL-1ra biti inkubiran ili čuvan. Prema pronalasku, bira se aksesorni molekul koji je efektivan za smanjenje agregacije između oko 20°C i 45°C. U izvesnim primerima izvođenja, bira se aksesorni molekul koji je efektivan za smanjenje agregacije između oko 25°C i 45°C. U izvesnim primerima izvođenja, izabran je aksesorni molekul koji je efektivan za smanjenje agregacije između oko 30°C i 45°C. U izvesnim primerima izvođenja, bira se aksesorni molekul koji je efektivan za smanjenje agregacije između oko 35°C i 45°C.

[0074] U izvesnim primerima izvođenja, promena koncentracije aksesornog molekula može uticati na smanjenje agregacije ili smanjenje brzine agregacije agregirajućeg IL-1ra. Rad razmotren u Primeru 4 i prikazan na Slici 3 razmatra brzinu agregacije agregirajućeg IL-1ra inkubiranog u različitim koncentracijama fosfata, citrata, ili pirofosfata. U ovom eksperimentu, citrat i pirofosfat su pokazali sličnu korelaciju između smanjenja brzine agregacije i koncentracije aksesornog molekula. I citrat, i pirofosfat su pokazali skoro 90% smanjenja brzine agregacije za 10 mM aksesornog molekula. Ovo smanjenje se povećalo i za citrat, i za pirofosfat za 20 mM, a onda su se ustalili za preko 100 mM. Nasuprot tome, fosfat je pokazao samo oko 20% smanjenja brzine agregacije za 10 mM, a smanjenje se nije ustalilo sve do oko 80 mM. Rezultati eksperimenta razmotrenog u Primeru 4 sugerišu da su pirofosfat i citrat u suštini podjednako efektivni za smanjenje brzine agregacije agregirajućeg IL-1ra na 29°C. I citrat, i pirofosfat imaju veće negativno naelektrisanje od fosfata za pH 6.5, što sugeriše da, u izvesnim primerima izvođenja, količina negativnog naelektrisanja može uticati na efikasnost izvesnih aksesornih molekula.

[0075] U izvesnim primerima izvođenja, šećer može biti aksesorni molekul. Primeri šećera koji mogu biti aksesorni molekuli obuhvataju, ali nisu ograničeni na saharozu, glicerol, manitol, i sorbitol. Primer 5 opisuje ilustrativni eksperiment u kome je povećanje koncentracija saharoze, glicerola, ili sorbitola smanjilo brzinu agregacije agregirajućeg IL-1ra (vidi Sliku 4). Za 3%, svaki od tri šećera je smanjio brzinu agregacije za manje od 5 jedinica agregacije (engl. aggregation units, skr. a.u.; 1 a.u. je jednaka povećanju od 1 jedinice milioptičke gustine na 405 nm u minuti uz korišćenje zapremine od 200 μl i SpectroMax™ čitača ploča spektrofotometra), u poređenju sa brzinom agregacije većom od 20 a.u. za 0% šećera.

[0076] U različitim primerima izvođenja, stručnjak iz odgovarajuće oblasti može odrediti odgovarajuću koncentraciju nekovalentnog aksesornog molekula za specifičnu namenu korišćenjem, npr. postupaka iz Primera 4 ili Primera 5. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul može biti prisutan u koncentraciji od 1 do 100 mM. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul može biti prisutan u koncentraciji od 1 do 50 mM. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul može biti prisutan u koncentraciji od 1 do 20 mM. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul može biti prisutan u koncentraciji od 10 mM.

[0077] U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul može biti prisutan u koncentraciji između 0 i 10%. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul može biti prisutan u koncentraciji između 0 i 5%. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul može biti prisutan u koncentraciji od 1%, 2%, ili 3%.

[0078] U izvesnim primerima izvođenja, Kdnekovalentnog aksesornog molekula za IL-1ra je manji od 10 mM. U izvesnim primerima izvođenja, Kdnekovalentnog aksesornog molekula za IL-1ra je manji od 7 mM. U izvesnim primerima izvođenja, Kdnekovalentnog aksesornog molekula za IL-1ra je manji od 5 mM. U izvesnim primerima izvođenja, Kdnekovalentnog aksesornog molekula za IL-1ra je manji od 4 mM. U izvesnim primerima izvođenja, Kdnekovalentnog aksesornog molekula za IL-1ra je manji od 3 mM. U izvesnim primerima izvođenja, Kdnekovalentnog aksesornog molekula za IL-1ra je između 0.1 mM i 5 mM. U izvesnim primerima izvođenja, Kdnekovalentnog aksesornog molekula za IL-1ra je između 1 mM i 5 mM. U izvesnim primerima izvođenja, Kdnekovalentnog aksesornog molekula za IL-1ra je između 0.1 mM i 4 mM. U izvesnim primerima izvođenja, Kdnekovalentnog aksesornog molekula za IL-1ra je između 1 mM i 4 mM. U izvesnim primerima izvođenja, Kdnekovalentnog aksesornog molekula za IL-1ra je između 2 mM i 4 mM.

[0079] U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul može smanjiti agregaciju kovalentnim modifikovanjem agregirajućeg IL-1ra. U izvesnim primerima izvođenja, aksesorni molekul može dalje smanjiti agregaciju kovalentnim modifikovanjem IL-1ra koji ima smanjenu agregaciju. U izvesnim primerima izvođenja, kovalentna modifikacija uklanja pozitivno naelektrisanje na lizinu-93, na argininu-97, ili na lizinu-93 i na argininu-97. U izvesnim primerima izvođenja kovalentni aksesorni molekul može smanjiti agregaciju drugim mehanizmom, npr. prostornim inhibiranjem formiranja jedne ili više katjon-pi interakcija ili drugih interakcija između agregirajućih IL-1ra polipeptida.

[0080] Neograničavajući primeri aksesornih molekula koji mogu kovalentno modifikovati IL-1ra obuhvataju, ali nisu ograničeni na NBD-X, MAP, i anhidrid citrakonske kiseline. U izvesnim primerima izvođenja, NBD-X formira derivat sa primarnim aminima. U radu razmotrenom u Primeru 3 i prikazanom na Slici 2, inkubacija IL-1ra proteina prirodnog tipa sa NBD-X, SE rezultovala je derivatizacijom amino-terminalne amino grupe polipeptida i lizina-93. U izvesnim primerima izvođenja, derivatizacija sa NBD-X može ukloniti pozitivno naelektrisanje na lizinu-93 i može rezultovati smanjenom agregacijom derivatizovanog IL-1ra. U izvesnim primerima izvođenja, MAP acetiluje lizinske ostatke i N-terminalne amino grupe polipeptida. U radu razmotrenom u Primeru 7 i prikazanom na Slikama 13-15, inkubacija IL-1ra sa MAP za različita vremena inkubacije, rezultuje derivatizacijom N-terminalne amino grupe IL-1ra; derivatizacijom N-terminalne amino grupe i lizina-6 u IL-1ra; derivatizacijom N-terminalne amino grupe, lizina-6, i lizina-93 u IL-1ra; ili derivatizacijom N-terminalne amino grupe, lizina-6, lizina-93, i lizina-96 u IL-1ra. U izvesnim primerima izvođenja, derivatizacija sa MAP može ukloniti pozitivno naelektrisanje na lizinu-93 i može rezultovati smanjenjem agregacije derivatizovanog IL-1ra.

[0081] U izvesnim primerima izvođenja, drugi amino-reaktivni molekuli mogu redukovati agregaciju agregirajućeg IL-1ra uklanjanjem jednog ili više pozitivnih naelektrisanja ili nekim drugim mehanizmom. U izvesnim primerima izvođenja, IL-1ra koji se derivatizovao sa kovalentnim aksesornim molekulima je 90% aktivan kao IL-1ra protein prirodnog tipa koji nije bio slično derivatizovan. U izvesnim primerima izvođenja, IL-1ra koji se derivatizovao sa kovalentnim aksesornim molekulima je najmanje 80% aktivan kao IL-1ra protein prirodnog tipa koji nije bio slično derivatizovan. U izvesnim primerima izvođenja, IL-1ra koji se derivatizovao sa kovalentnim aksesornim molekulima je najmanje 75% aktivan kao IL-1ra protein prirodnog tipa koji nije bio slično derivatizovan. U izvesnim primerima izvođenja, IL-1ra koji se derivatizovao sa kovalentnim aksesornim molekulima je najmanje 50% aktivan kao IL-1ra protein prirodnog tipa koji nije bio slično derivatizovan.

[0082] U nastavku su opisani kitovi koji sadrže IL-1ra i najmanje jedan aksesorni molekul. Kitovi mogu opciono sadržati uputstva za sjedinjavanje IL-1ra i najmanje jednog aksesornog molekula, ako su komponente pripremljene odvojeno. Kitovi mogu sadržati uputstva za upotrebu IL-1ra i najmanje jednog aksesornog molekula. Kitovi mogu sadržati najmanje jedan kovalentni aksesorni molekul i/ili najmanje jedan nekovalentni aksesorni molekul. Kada kit sadrži najmanje jedan kovalentni aksesorni molekul, onda kit može dalje sadržati uputstva za uklanjanje eventualno preostalog neizreagovalog aksesornog molekula iz derivatizovanog IL-1ra posle inkubacije IL-1ra sa kovalentnim aksesornim molekulom. Kitovi mogu sadržati IL-1ra koji se već derivatizovao sa najmanje jednim kovalentnim aksesornim molekulom. Slično tome, u izvesnim primerima izvođenja, kit može sadržati IL-1ra koji je već u kompoziciji sa najmanje jednim nekovalentnim aksesornim molekulom.

[0083] Kao što je opisano dole, realizovane su farmaceutske kompozicije koje sadrže terapeutski efektivnu količinu IL-1ra zajedno sa farmaceutski prihvatljivim razređivačem, nosačem, poboljšavačem rastvaranja, emulgatorom, konzervansom i/ili adjuvans.

[0084] Prihvatljivi materijali za formulacije mogu biti netoksični za primaoca u upotrebljenim dozama i koncentracijama.

[0085] Farmaceutska kompozicija može sadržati materijale za formulacije za modifikaciju, održavanje i/ili konzerviranje, na primer, pH, osmolarnosti, viskoznosti, bistrine, boje, izotoničnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, brzine rastvaranja ili oslobađanja, adsorpcije, i/ili penetracije kompozicije. Primeri materijala za formulacije obuhvataju, ali nisu ograničeni na aminokiseline (kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin, i lizin); antimikrobne agense; antioksidanse (kao što je askorbinska kiselina, natrijum sulfit, i natrijum hidrogen-sulfit); pufere (kao što su borat, bikarbonat, Tris-HCI, citrati, fosfati, i druge organske kiseline); agense za povećanje zapremine (kao što su manitol i glicin); helatirajuće agense (kao što je etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTA)); kompleksirajuće agense (kao što su kafein, polivinilpirolidon, beta-ciklodekstrin, i hidroksipropil-betaciklodekstrin); punioce; monosaharide; disaharide; i druge ugljene hidrate (kao što su glukoza, manoza, i dekstrini); proteine (kao što su serumski albumin, želatin, i imunoglobulini); boje, arome i razređivače; emulgatore; hidrofilne polimere (kao što je polivinilpirolidon); polipeptide male molekulske težine; kontrajone za formiranje soli (kao što je natrijum); konzervanse (kao što su benzalkonijum hlorid, benzojeva kiselina, salicilna kiselina, timerosal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbinska kiselina i vodonik peroksid); rastvarače (kao što su glicerin, propilen glikol, i polietilen glikol); šećerne alkohole (kao što su manitol i sorbitol); agense za suspendovanje; surfaktante ili agense za ovlaživanje (kao što su pluronici, PEG, sorbitan estri, polisorbati, kao što su polisorbat 20, polisorbat 80, triton, trometamine, lecitin, holesterol, tiloksapal); agense za povećanje stabilnosti (kao što su saharoza i sorbitol); agense za povećanje toničnosti (kao što su halidi alkalnih metala, kao što su natrijum i kalijum hlorid, manitol, sorbitol); nosače za isporuku; razređivače; ekscipijense i farmaceutske adjuvanse. (Vidi, npr. Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18. izdanje, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1990).

[0086] IL-1ra i/ili jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa mogu biti povezani sa nosačem koji produžava poluživot. Primeri nosača obuhvataju, ali nisu ograničeni na Fc domen, polietilen glikol, i dekstran. Izvesni primeri nosača su opisani, npr. u US prijavi red. br.

09/428,082 i objavljenoj PCT prijavi br. WO 99/25044.

[0087] Optimalnu farmaceutsku kompoziciju će odrediti stručnjak iz odgovarajuće oblasti u zavisnosti, na primer, od predviđenog načina administracije, formata isporuke i željene doze. Vidi, na primer, Remington’s Pharmaceutical Sciences, supra. U izvesnim primerima izvođenja, takve kompozicije mogu uticati na fizičko stanje, stabilnost, brzinu oslobađanja in vivo, i brzinu klirensa IL-1ra in vivo.

[0088] Primarni nosač ili pomoćna materija u farmaceutskoj kompoziciji može biti po svojoj prirodi vodeni ili nevodeni. Na primer, u izvesnim primerima izvođenja, podesni nosač ili pomoćna materija mogu biti voda za injekcije, fiziološki slani rastvor ili veštački cerebrospinalni fluid, eventualno dopunjeni drugim materijalima uobičajenim u kompozicijama za parenteralnu administraciju. Neutralni puferovani slani rastvor ili slani rastvor pomešani sa serumskim albuminom su sledeći primeri nosača. Farmaceutske kompozicije mogu sadržati Tris pufer od oko pH 7.0-8.5, ili acetatni pufer od oko pH 4.0-5.5, koji dalje može sadržati sorbitol ili podesnu zamenu za njega. Kompozicija koja sadrži IL-1ra, sa ili bez najmanje jednog aksesornog molekula i/ili jednog ili više dodatnih terapeutskih agenasa, može se pripremiti za čuvanje mešanjem sa izabranom kompozicijom koja ima željeni stepen čistoće sa opcionim agensima za formulacije (Remington’s Pharmaceutical Sciences, supra) u obliku liofilizovanog kolača ili vodenog rastvora. Dalje, kompozicija koja sadrži IL-1ra, sa ili bez najmanje jednog aksesornog molekula i/ili jednog ili više dodatnih terapeutskih agenasa, može biti formulisana kao liofilizat korišćenjem odgovarajućih ekscipijenasa kao što je saharoza.

[0089] Farmaceutske kompozicije mogu biti izabrane za parenteralnu administraciju.

Kompozicije mogu biti izabrane za inhalaciju ili za isporuku preko digestivnog trakta, kao što je oralnim putem. Priprema takvih farmaceutski prihvatljivih kompozicija je u okviru sposobnosti u odgovarajućoj oblasti.

[0090] Kada se razmatra parenteralna administracija, terapeutska kompozicija može biti u obliku parenteralno prihvatljivog vodenog rastvora bez patogena koji sadrži željeni IL-1ra, sa ili bez najmanje jednog aksesornog molekula i/ili jednog ili više dodatnih terapeutskih agenasa, u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Nosač za parenteralnu injekciju može biti sterilna destilovana voda u kojoj je IL-1ra, sa ili bez najmanje jednog aksesornog molekula i/ili jednog ili više dodatnih terapeutskih agenasa, formulisan kao sterilni, izotonični rastvor, adekvatno konzervisan. Priprema može uključivati formulaciju željenog molekula sa agensom, kao što su injektabilne mikrosfere, bioerodibilne čestice, polimerna jedinjenja (kao što su polilmlečna kiselina ili poliglikolna kiselina), perle ili lipozomi, koji može obezbediti kontrolisano ili odloženo oslobađanje proizvoda koji se onda može isporučiti putem depo injekcije. Takođe se može koristiti hijaluronska kiselina koja može imati efekat na podsticanje produženog trajanja u cirkulaciji. Za uvođenje željenog molekula se mogu koristiti implantabilni uređaji za isporuku leka.

[0091] Farmaceutska kompozicija može biti formulisana za inhalaciju. IL-1ra, sa ili bez najmanje jednog aksesornog molekula i/ili jednog ili više dodatnih terapeutskih agenasa, može biti formulisan kao suvi prašak za inhalaciju. Rastvor za inhalaciju koji sadrži IL-1ra, sa ili bez najmanje jednog aksesornog molekula i/ili jednog ili više dodatnih terapeutskih agenasa, može biti formulisan sa pogonskim gasom za isporuku aerosola. Rastvori mogu biti razmagljeni. Pulmonarna administracija je dalje opisana u PCT prijavi br. PCT/US94/001875, koja opisuje pulmonarnu isporuku hemijski modifikovanih proteina.

[0092] Pored toga, razmotreno je da se formulacije mogu davati oralno. IL-1ra, sa ili bez najmanje jednog aksesornog molekula i/ili jednog ili više dodatnih terapeutskih agenasa, koji se daje na ovaj način može biti formulisan sa ili bez onih nosača koji se uobičajeno upotrebljavaju u pripremi čvrstih farmaceutskih oblika, kao što su tablete i kapsule. Kapsula može biti prilagođena za oslobađanje aktivnog dela formulacije u tački u gastrointestinalnom traktu kada je bioraspoloživost maksimizirana, dok je pre-sistemska degradacija minimizirana. Najmanje jedan dodatni agent može biti uključen da bi se olakšala apsorpcija IL-1ra i/ili bilo kakvih aksesornih molekula i/ili bilo kakvih dodatnih terapeutskih agenasa. Razređivači, arome, voskovi sa niskom tačkom topljenja, biljna ulja, lubrikansi, agensi za suspendovanje, agensi za raspadanje tableta, i veziva se takođe mogu upotrebiti.

[0093] Farmaceutska kompozicija može sadržati efektivnu količinu IL-1ra, sa ili bez najmanje jednog aksesornog molekula i/ili jednog ili više dodatnih terapeutskih agenasa, u smeši sa netoksičnim ekscipijensima koji su podesni za proizvodnju tableta. Rastvaranjem tableta u sterilnoj vodi, ili drugom podesnom nosaču, mogu se pripremiti rastvori u obliku pojedinačne doze. Podesni ekscipijensi obuhvataju, ali nisu ograničeni na inertne razređivače, kao što su kalcijum karbonat, natrijum karbonat ili bikarbonat, laktoza, ili kalcijum fosfat; ili veziva, kao što su skrob, želatin, ili akacija; ili lubrikanti, kao što su magnezijum stearat, stearinska kiselina, ili talk.

[0094] Dodatne farmaceutske kompozicije će biti očigledne stručnjacima iz odgovarajuće oblasti, uključujući formulacije koje sadrže IL-1ra, sa ili bez najmanje jednog aksesornog molekula i/ili jednog ili više dodatnih terapeutskih agenasa, u formulacijama za odloženo ili kontrolisano oslobađanje. U izvesnim primerima izvođenja, tehnike za formulisanje različitih proizvoda sa odloženim ili kontrolisanim oslobađanjem, kao što su lipozomni nosači, bioerodibilne mikročestice ili porozne perle i depo injekcije, takođe su poznate stručnjacima iz odgovarajuće oblasti. Vidi, na primer, PCT prijavu br. PCT/US93/00829 koja opisuje kontrolisano oslobađanje poroznih polimernih mikročestica za isporuku farmaceutskih kompozicija. Preparati sa odloženim oslobađanjem mogu obuhvatati polupropustljive polimerne matrice u vidu oblikovanih artikala, npr. filmova, ili mikrokapsula. Matrice sa odloženim oslobađanjem mogu obuhvatati poliestere, hidrogelove, polilaktide (vidi, npr. US 3,773,919 i EP 058,481), kopolimere L-glutaminske kiseline i gama etil-L-glutamat (Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983)), poli (2-hidroksietil-metakrilat) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981) i Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)), etilen vinil acetat (Langer et al., supra) ili poli-D(-)-3-hidroksibuternu kiselinu (EP 133,988).

Kompozicije sa odloženim oslobađanjem mogu obuhvatati lipozome, koji se mogu pripremiti bilo kojim od nekoliko postupaka poznatih u odgovarajućoj oblasti. Vidi npr. Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985); EP 036,676; EP 088,046 i EP 143,949.

[0095] Farmaceutska kompozicija koja treba da se upotrebi za administraciju in vivo je obično sterilna. Ovo se može ostvariti filtriranjem kroz sterilne filtrirajuće membrane. Kada je kompozicija liofilizovana, onda se sterilizacija korišćenjem ovog metoda može izvesti bilo pre ili posle liofilizacije i rekonstitucije. Kompozicija za parenteralnu administraciju može biti čuvana u liofilizovanom obliku ili u rastvoru. Parenteralne kompozicije se generalno stavljaju u kontejner koji ima sterilni pristupni port, na primer, u kesu za intravenski rastvor ili bočicu koja ima čep koji se može probiti iglom za hipodermičnu injekciju.

[0096] Pošto se farmaceutska kompozicija formuliše, ona se može čuvati u sterilnim bočicama kao rastvor, suspenzija, gel, emulzija, čvrsta materija, ili dehidrirani ili liofilizovani prašak. Takve formulacije se mogu čuvati bilo u obliku spremnom za upotrebu ili u obliku (npr. liofilizovanom) koji se rekonstituiše pre administracije.

[0097] Mogu biti realizovani kitovi za proizvodnju jedinice za administraciju pojedinačne doze. Svaki od kitova može sadržati prvi kontejner koji ima osušeni protein i drugi kontejner koji ima vodenu formulaciju. Mogu biti obuhvaćeni kitovi koji sadrže prethodno napunjene špriceve sa jednom i više komora (npr. špriceve za tečnost i liošpriceve).

[0098] Efektivna količina farmaceutske kompozicije koja sadrži IL-1ra, sa ili bez najmanje jednog aksesornog molekula i/ili jednog ili više dodatnih terapeutskih agenasa koja treba da se upotrebi terapeutski zavisiće, na primer, od terapeutskog konteksta i ciljeva. Stručnjak iz odgovarajuće oblasti će shvatiti da će odgovarajući nivoi doza za lečenje, prema izvesnim primerima izvođenja, shodno tome varirati u zavisnosti od molekula koji se daje, indikacije za koju se upotrebljava IL-1ra, sa ili bez najmanje jednog aksesornog molekula i/ili jednog ili više dodatnih terapeutskih agenasa, načina administracije, i veličine (telesne težine, površine tela ili veličine organa) i/ili stanja (starosti i opšteg zdravlja) pacijenta. U izvesnim primerima izvođenja, nadležni lekar može titrirati doziranje i modifikovati način administracije da bi dobio optimalni terapeutski efekat. Tipično doziranje može biti u opsegu od oko 0.1 μg/kg do oko 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gore navedenih faktora. Doziranje može biti u opsegu od 0.1 μg/kg do oko 100 mg/kg; ili od 1 μg/kg do oko 100 mg/kg; ili od 5 μg/kg do oko 100 mg/kg.

[0099] Učestanost doziranja može uzeti u obzir farmakokinetičke parametre IL-1ra i/ili bilo kojih aksesornih molekula i/ili bilo kojih dodatnih terapeutskih agenasa u upotrebljenoj formulaciji. Nadležni lekar može davati kompoziciju sve dok se ne dostigne doziranje kojim se ostvaruje željeni efekat. Zbog toga se kompozicija može davati kao pojedinačna doza, ili kao dve ili više doza (koje mogu ili ne moraju sadržati istu količinu željenog molekula) tokom vremena, ili kao kontinualna infuzija pomoću uređaja za implantaciju ili katetera. Dalje razmatranje odgovarajućeg doziranja rutinski izvode prosečni stručnjaci iz odgovarajuće oblasti i ono se nalazi u okviru zadataka koje oni rutinski izvode. Odgovarajuča doziranja se mogu odrediti korišćenjem odgovarajućih podataka o dozi-reakciji.

[0100] Način administracije farmaceutske kompozicije je u skladu sa poznatim postupcima, npr. oralno, putem injekcije intravenski, intraperitonealno, intracerebralno (intraparenhimalno), intracerebroventrikularno, intramuskularno, intra-okularno, intraarterijski, intraportalno, ili intraleziono; pomoću sistema sa odloženim oslobađanjem ili uređaja za implantaciju. Kompozicije se mogu davati bolus injekcijom ili kontinualno infuzijom, ili uređajem za implantaciju.

[0101] Kompozicija se može davati lokalno putem implantacije membrane, sunđera ili drugog podesnog materijala na kome je željeni molekul apsorbovan ili kapsuliran. Kada se upotrebljava uređaj za implantaciju, taj uređaj se može implantirati u bilo koje podesno tkivo ili organ, a isporuka željenog molekula može biti putem difuzije, bolusa sa vremenski proračunatim oslobađanjem, ili kontinualne administracije.

[0102] Može biti poželjno da se koristi farmaceutska kompozicija koja sadrži IL-1ra, sa ili bez najmanje jednog aksesornog molekula i/ili jednog ili više dodatnih terapeutskih agenasa, na ex vivo način. U takvim slučajevima, ćelije, tkiva i/ili organi koji su uklonjeni sa pacijenta se izlažu farmaceutskoj kompoziciji koja sadrži IL-1ra, sa ili bez najmanje jednog aksesornog molekula i/ili jednog ili više dodatnih terapeutskih agenasa, posle čega se ćelije, tkiva i/ili organi sledstveno implantiraju nazad u pacijenta.

[0103] U izvesnim slučajevima, IL-1ra koji ima smanjenu agregaciju i/ili bilo koji aksesorni molekuli i/ili bilo koji dodatni terapeutski agensi se mogu isporučivati implantacijom izvesnih ćelija koje su dobijene genetskim inženjeringom, uz korišćenje postupaka koji su poznati u odgovarajućoj oblasti, da bi izrazile i izlučile polipeptide. Takve ćelije mogu biti životinjske ili ljudske ćelije, i mogu biti autologe, heterologe, ili ksenogene. Ćelije mogu biti imortalizovane. Da bi se smanjila šansa imunološke reakcije, ćelije mogu biti kapsulirane da bi se izbegla infiltracija okolnih tkiva. Materijali za kapsuliranje su obično biokompatibilni, polupropustljivi polimerni omotači ili membrane koje omogućavaju oslobađanje proteinskog, odnosno proteinskih proizvoda, ali sprečavaju uništenje ćelija od strane pacijentovog imunog sistema ili drugih škodljivih faktora iz okolnih tkiva.

PRIMERI

[0104] Sledeći primeri, uključujući izvedene eksperimente i dobijene rezultate, su pripremljeni za ilustrativne svrhe.

Primer 1

Proizvodnja IL-1ra proteina prirodnog tipa

[0105] Humani rekombinantni antagonist interleukin-1 receptora (IL-1ra) koji ima sekvencu SEQ ID NO: 5 se može pripremiti u Amgen proizvodnim postrojenjima prema metodu koji je razmotren u evropskom patentu br. EP 0502956 B1, u kome je korak ponovnog dobijanja ćelija opcioni. Alternativno tome, anakinra, koja ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5 se može dobiti od Amgen Inc., Thousand Oaks, CA. Prečišćeni humani IL-1ra koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5 je bio upotrebljen u ovde opisanim primerima.

Primer 2

Agregacija IL-1ra

[0106] Agregacija IL-1ra u fosfatnom puferu i citratnom puferu na 39°C je bila određena kao što sledi. Deset ml IL-1ra osnovnog rastvora (200-220 mg/ml proteina u 10 mM natrijum citrata, 140 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, pH 6.5 (CSE)) je bilo dijalizirano preko noći na 4°C protiv 2 x 2L 10 mM fosfata, 140 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, pH 6.5 (PSE) ili 2 x 2L CSE. Dijalizirani rastvor je bio isfiltriran kroz filter od 0.2 μm, pa je koncentracija IL-1ra proteina bila podešena na 140 mg/ml razređivanjem sa podesnim puferom.

[0107] Agregacija IL-1ra u svakom puferu je bila merena korišćenjem staklene ploče sa 96 bunarčića (Zissner) i temperaturski kontrolisanog spektrofotometra čitača ploča, SpectraMax Plus (Molecular Devices). Veličina uzorka po bunarčiću je bila 180 μlμl. Ploče su bile inkubirane u spektrofotometru na 39°C, a onde je merena optička gustina na 405 nm svakih 1 minut. Slika 1 prikazuje optičku gustinu na 405 nm prikazanu kao funkcija vremena za ovaj eksperiment. Brzina agregacije je bila određena kao nagib inicijalnog linearnog regiona krive zasićenja korišćenjem SoftMax Pro programa (Molecular Devices). Brzina agregacije IL-1ra inkubiranog u CSE se smanjila u odnosu na brzinu agregacije IL-1ra inkubiranog u PSE. Pored toga, stepen agregacije IL-1ra inkubiranog u CSE se smanjio u odnosu na stepen agregacije IL-1ra inkubiranog u PSE.

Primer 3

NBD-X obeležavanje IL-1ra

[0108] Površinski izložene amino grupe su bile identifikovane obeležavanjem IL-1ra sa NBD-X, SE (sukcinimidil 6-(N-(7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4il)amino)heksanoat, Molecular Probes). NBD-X postaje fluorescentan posle derivatizacije sa amino grupama. Dvadeset μlμl 0.2 mM IL-1ra u PSE je bilo razređeno sa 480 μlμl PSE. Osam μl 50 μg/μlμl NBD-X, SE rastvor u dimetil formamidu je bilo dodato u IL-1ra rastvor u inkrementima od 2 μlμl na sobnoj temperaturi. Reakcija je bila inkubirana jedan sat na sobnoj temperaturi, pa je onda zaustavljena dodavanjem 50 μlμl 1.5 M rastvora hidroksilamina, pH 8.5. Reakciona smeša je propuštena kroz desalinizujuću gel filtracionu kolonu koja je bila prethodno uravnotežena sa PSE. Pik proteina je bio sakupljen i dalje je analiziran pomoću RP-HPLC i LC-MS/MS kao što sledi.

[0109] Reverzno-fazna HPLC je bila izvedena uz korišćenje Phenomenex Jupiter™ 5μ C4 kolone (300Å, 250x4.6 mm) i HP1100 HPLC sistema opremljenog sa on-lajn detektorima apsorbanse i fluorescencije. Apsorbansa je bila izmerena na 215 nm da bi se detektovalo prisustvo polipeptida. Fluorescentna emisija je bila izmerena na 535 nm, što je pratilo pobudu na 480 nm da bi se detektovalo prisustvo aminom-derivatizovanog NBD-X. Eluiranje je bilo izvršeno sa linearnim 30-45% gradijentom metanola u 0.1% trifluorosirćetnoj kiselini (TFA) i vodi (v/v/v). Slika 2 prikazuje apsorbansu sa NBD-X obeleženog IL-1ra na 215 nm i fluorescentnu emisiju sa NBD-X obeleženog IL-1ra na 535 nm posle pobude na 480 nm za ovaj eksperiment. Identitet fluorescentnih pikova je bio određen kao što sledi.

[0110] Dva glavna fluorescentna pika su bila identifikovana, jedan rano-eluirajući pik na 16.75 minuta i jedan kasno-eluirajući pik na 17.5 minuta. Vidi Sliku 2, donji deo. Pikovi su bili sakupljeni ručno, pa je izvršena digestija sa Lys-C endoproteinazom kao što sledi. Svaki pik je bio sakupljen iz pet odvojenih HPLC testova. Sve frakcije koje su primarno sadržale 16.75 pik su bile zajedno objedinjene. Sve frakcije koje su primarno sadržale pik na 17.5 minuta su bile zajedno objedinjene. Dva objedinjena uzorka su onda bila osušena centrifugiranjem uz korišćenje SpeedVac koncentratora. Svaki od objedinjenih uzoraka je onda bio rastvoren u 490 μlμl pufera za digestiju, koji je sadržao 10 mM Tris, 0.8 M gvinidinijum hidrohlorida, pH 8.0. Deset μl rastvora Lys-C proteinaze, pripremljenih rastvaranjem 5 μg Lys-C proteinaze (kvaliteta za sekvenciranje, Roche Diagnostics) u 50 μl pufera za digestiju, je onda bilo dodato svakom objedinjenom uzorku. Uzorci su bili digestirani preko noći na 37°C. Posle digestije, generisani peptidi su bili podvrgnuti LC-MS/MS uz korišćenje Finnegan LCQ Deca opremljenog sa Beckman System Gold HPLC prema standardnom protokolu proizvođača.

[0111] Za rano-eluirajući pik (16.75 min), digestija je dala jedinstveni peptid mase od 1107.8 m/z, koji odgovara amino-terminalnom peptidu IL-1ra sa dodatom masom od 276 amu, što sugeriše prisustvo NBD derivata. MS/MS analiza fragmenata proizvedenog peptida koja je konzistentna sa aminokiselinskom sekvencom MRPSGRK plus ekstra masom od 276 amu metioninskog ostatka, sugeriše da je amino-terminalni metionin IL-1ra bio derivatizovan sa NBD-X.

[0112] Digestija kasnije-eluirajućeg pika (17.5 min) je dala jedinstveni peptid mase od 1145.9 m/z, što sugeriše IL-1ra peptid koji odgovara ostacima 72-96 koji sadrže NBD derivat.

MS/MS analiza fragmenata proizvedenog peptida je konzistentna sa aminokiselinskom sekvencom koja odgovara ostacima 72-96 sa NBD-derivatizovanim lizinom na poziciji 93.

[0113] Na osnovu gore navedenih rezultata, lizin na poziciji 93 IL-1ra može da se derivatizuje sa NBD-X pod uslovima upotrebljenim u ovom eksperimentu. Ovi rezultati takođe sugerišu da je lizin na poziciji 93 isložen i da je ostatak dostupan rastvaraču u intaktnom IL-1ra proteinu.

Primer 4

Brzina agregacije IL-1ra u prisustvu fosfata, citrata, ili pirofosfata

[0114] Brzina agregacije IL-1ra je bila određena u nekoliko različitih puferskih kompozicija. Deset ml IL-1ra osnovnog rastvora (220 mg/ml u CSE) je bilo dijalizirano protiv 2 x 4L 140 mM NaCl uz korišćenje Pierce Snakeskin cevovoda za dijalizu (3.5 kDa granična vrednost) na 4°C. Alikvoti dijaliziranog IL-1ra rastvora su bili dovedeni u različite koncentracije citrata, fosfata, ili pirofosfata dodavanjem 0.45M citrata, 0.5M fosfata, ili 0.45M pirofosfata osnovnim rastvorima (svi pH 6.5) i odgovarajuće zapremine 140 mM NaCl da bi se dobila finalna koncentracija IL-1ra u svakom uzorku od 140 mg/ml. Finalna koncentracija citrata, fosfata, ili pirofosfata u svakom uzorku se nalazila u opsegu od 1 do 125 mM.

[0115] Agregacija IL-1ra u svakom uzorku je bila praćena tokom 4 sata na 29°C merenjem rasipanja svetlosti na 405 nm u jednominutnim intervalima kao što je opisano gore u Primeru 2. Brzina agregacije je bila određena kao nagib linearnog regiona krive zasićenja izračunat korišćenjem SoftMax Pro programa (Molecular Devices). Slika 3 prikazuje da se u ovom eksperimentu brzina agregacije IL-1ra smanjila sa povećanjem koncentracija citrata, fosfata, ili pirofosfata. Značajno je da se brzina agregacije IL-1ra u citratnom ili pirofosfatnom puferu smanjila brže nego brzina agregacije u fosfatnom puferu.

[0116] Procenjeni pKa’s za sva tri vodonika koji se mogu jonizovati na fosfatu su 2.148, 7.198, i 12.35 za pH 6.5 i 39°C. Procenjeni pKa’s za tri vodonika koji se mogu jonizovati na citratu su 3.128, 4.761, i 6.396 za pH 6.5 i 39°C. Procenjeni pKa’s za četiri vodonika koji se mogu jonizovati na pirofosfatu su 0.83, 2.26, 6.72, i 9.46 za pH 6.5 i 39°C. Vidi, npr.

Goldberg et al., Thermodynamic quantities for the ionization reactions of buffers. J. Phys. Chem. Ref. Data, 31(2):231-370 (2002). Shodno tome, bilo je predviđeno da fosfat ima preovlađujuće jedno negativno naelektrisanje za pH 6.5 i 39°C, dok je bilo predviđeno da citrat ima tri negativna naelektrisanja za pH 6.5 i 39°C i bilo je predviđeno da pirofosfat ima između dva i tri negativna naelektrisanja za pH 6.5 i 39°C, kao što je procenjeno na osnovu gore razmotrenih pKas navedenih u literaturi.

[0117] Shodno tome, ovi rezultati sugerišu da višestruko naelektrisani anjoni mogu smanjiti brzinu agregacije IL-1ra efektivnije od jednostruko naelektrisanih anjona za specifični pH. Konzistentno sa ovim zaključkom, za NaCl, koji je jednostruko naelektrisani anjon, je utvrđeno da ima sličan profil brzine agregacije kao fosfat (podaci nisu prikazani).

Primer 5

Brzina agregacije IL-1ra u prisustvu saharoze, glicerola, ili sorbitola

[0118] Brzina agregacije IL-1ra je bila određena u prisustvu nekoliko različitih šećera. Deset ml IL-1ra osnovnog rastvora (220 mg/ml u CSE) je bilo dijalizirano protiv 2 x 4L 140 mM NaCl uz korišćenje Pierce Snakeskin cevovoda za dijalizu (3.5 kDa granična vrednost) na 4°C. Alikvoti dijaliziranog IL-1ra rastvora su bili dovedeni u različite koncentracije saharoze, glicerola, ili sorbitola dodavanjem 25% saharoze, 25% glicerola, ili 25% sorbitola osnovnim rastvorima i odgovarajuće zapremine 140 mM NaCl da bi se dobila finalna koncentracija IL-1ra u svakom uzorku od 140 mg/ml. Finalna koncentracija saharoze, glicerola, ili sorbitola u svakom uzorku je bila 0%, 1%, 2%, ili 3%. Brzina agregacije je bila određena merenjem optičke gustine svakog IL-1ra rastvora na 39°C korišćenjem metoda opisanog u Primeru 2. Slika 4 prikazuje da je u ovom eksperimentu povećanje koncentracija šećera rezultovalo smanjenjem brzine agregacije IL-1ra. Za 0% šećera, brzina agregacije IL-1ra u ovom eksperimentu je bila oko 22 jedinice agregacije (engl. aggregation unit, skr. a.u., mereno kao povećanje mili-optičke gustine na 405 nm u minutu). Za 3% saharoze, glicerola, ili sorbitola, brzina agregacije IL-1ra je bila smanjena na između 0 i 5 a.u.

Primer 6

Ureom- i gvanidinijum hidrohloridom-indukovano razvijanje IL-1ra

[0119] Ravnotežno ureom-indukovano razvijanje IL-1ra je bilo izvedeno kao što sledi. Za studije daljeg-UV cirkularnog dihroizma, po 1-1.5 ml uzoraka od 0.86 mg/ml IL-1ra i različitih koncentracija uree (između oko 0 i 10M) su bili umotani u foliju da bi bili zaštićeni od svetlosti, pa su inkubirani preko noći (> 12 sati) na sobnoj temperaturi. Onda je bio određen cirkularni dihroizam na 230 nm za svaki uzorak na 23°C. Slika 9 prikazuje signal cirkularnog dihroizma na 230 nm za IL-1ra inkubiran u različitim koncentracijama uree za ovaj eksperiment. Podaci su bili prikazani grafički, pa je kriva razvijanja bila fitovana na modelu sa 3-stanja, prirodno stanje <-> međustanje <-> razvijeno stanje. U ovom modelu, bili su ograničeni m1, koji je nagib prvog prelaza, i Cm1, koji je srednja tačka prvog prelaza. Ovi parametri su bili ograničeni, jer dalja-UV CD nije mogla da razlikuje prirodno stanje i međustanje. Ograničene vrednosti za m1 i Cm1su bile dobijene uprosečavanjem vrednosti iz nekoliko merenja fluorescencije, koja su mogla da razlikuju prirodno stanje od međustanja. Kao što je prikazano na Slici 9, IL-1ra je bio podvrgnut globalnom prelazu na razvijanje za između oko 4 i 6 M uree u ovom eksperimentu.

[0120] Za studije fluorescencije, 1-1.5 ml uzoraka od 0.086 mg/ml IL-1ra i različitih koncentracija uree (između oko 0 i 10M) su bili umotani u foliju da bi bili zaštićeni od svetlosti, pa su inkubirani preko noći (> 12 sati) na sobnoj temperaturi. Slika 10 prikazuje intrinsičnu fluorescenciju na 353 nm IL-1ra inkubiranog u različitim koncentracijama uree. Ovi podaci su bili grafički prikazani, pa je kriva razvijanja bila fitovana na model sa 3-stanja kao što je razmotreno gore. U ovom eksperimentu nisu bila primenjena ograničenja. Kao što je prikazano na Slici 10, eksperiment sa fluorescencijom ukazuje na prisustvo prelaza na razvijanje između 0 i oko 1.5 M uree. Pošto ovaj prelaz nije bio uočen u eksperimentu sa daljim-UV CD, on može odražavati akumulaciju međustanja sa sekundarnom strukturom sličnom prirodnom stanju. Ovo međustanje može obuhvatati više lokalnih promena strukture, npr. destabilizaciju površinskih petlji, dok hidrofobno jezgro IL-1ra može ostati u suštini neporemećeno.

[0121] Ravnotežno razvijanje indukovano gvanidinijum hidrohloridom (GuHCI) je bilo izvedeno kao što sledi. Za studije cirkularnog dihroizma daljim-UV, 1-1.5 ml uzoraka od 0.86 mg/ml IL-1ra i različitih koncentracija GuHCl (između oko 0 i 5M) su bili umotani u foliju da bi bili zaštićeni od svetlosti, pa su inkubirani preko noći (> 12 sati) na sobnoj temperaturi. Onda je bio određen cirkularni dihroizam na 230 nm za svaki uzorak na 23°C. Slika 11 prikazuje signal cirkularnog dihroizma na 230 nm za IL-1ra inkubiran u različitim koncentracijama GuHCl. Podaci su bili prikazani grafički, pa je kriva razvijanja bila fitovana na modelu sa 3-stanja, prirodno stanje <-> međustanje <-> razvijeno stanje. U ovom modelu su bili ograničeni m1, Cm1, "ns", koji je nagib osnovne linije prirodnog stanja, i "is", koji je nagib osnovne linije međustanja. Ograničene vrednosti m1 i Cm1za razvijanje indukovano sa GuHCI su bile određene u suštini kao što je opisano gore za razvijanje indukovano ureom. "Ns" i "is" su bili ograničeni tako da budu veći od nule. Ovi parametri su bili ograničeni, jer dalja-UV CD nije mogla da razlikuje prirodno stanje i međustanje. Kao što je prikazano na Slici 11, IL-1ra je bio podvrgnut globalnom prelazu na razvijanje za između oko 1 i 2 M GuHCl u ovom eksperimentu.

[0122] Za studije fluorescencije, 1-1.5 ml uzoraka od 0.086 mg/ml IL-1ra i različitih koncentracija GuHCl (između oko 0 i 5M) su bili umotani u foliju da bi bili zaštićeni od svetlosti, pa su inkubirani preko noći (> 12 sati) na sobnoj temperaturi. Slika 12 prikazuje intrinsičnu fluorescenciju na 353 nm za IL-1ra inhibiran u različitim koncentracijama uree. Ovi podaci su bili grafički prikazani, pa je kriva razvijanja bila fitovana na model sa 3-stanja kao što je razmotreno gore. U ovom eksperimentu nisu bila primenjena ograničenja. Slika 12 prikazuje intrinsičnu fluorescenciju na 353 nm za IL-1ra inkubiran u različitim koncentracijama GuHCl. Ovi podaci su bili grafički prikazani, pa je kriva razvijanja bila fitovana na model sa 3-stanja kao što je razmotreno gore. U ovom eksperimentu nisu bila primenjena ograničenja. Kao što je prikazano na Slici 12, podaci dobijeni fluorescencijom sugerišu prisustvo prelaza na razvijanje između oko 0 i 0.6 M GuHCl. Pošto ovaj prelaz nije bio uočen u eksperimentu sa daljim-UV CD, on može odražavati akumulaciju međustanja sa sekundarnom strukturom sličnom prirodnom stanju. Ovo međustanje može obuhvatati više lokalnih promena strukture i/ili uključivati destabilizaciju površinskih petlji, dok hidrofobno jezgro IL-1ra može ostati u suštini neporemećeno.

[0123] Razlika između podataka dobijenih fluorescencijom za razvijanje indukovano ureom i razvijanje indukovano GuHCI može rezultovati usled različitih efekata dva denaturanta na intrinsičnu fluorescenciju IL-1ra.

[0124] Pored toga, razlika između CD podataka i podataka dobijenih fluorescencijom za svaki denaturant može biti zbog sposobnosti triptofanske intrinsične fluorescencije da detektuje lokalne promene u tercijarnoj strukturi proteina, dok CD detektuje promene u sekundarnoj strukturi proteina.

Primer 7

Derivatizacija IL-1ra sa metil acetil fosfatom (MAP)

[0125] U izvesnim primerima izvođenja, metil acetil fosfat (MAP) acetiluje lizinske ostatke i N-terminalne amine polipeptida. MAP je bio pripremljen kao što je opisano u Kluger et al.

(1980) J. Org. Chem., 45: 2723. Identitet proizvoda je bio potvrđen sa NMR i masenom spektrometrijom.

[0126] IL-1ra je bio derivatizovan sa MAP u prisustvu citrata ili fosfata kao što sledi. Za derivatizaciju u prisustvu citrata, 20 μl MAP (10 mM osnovni u vodi) i 20 μl IL-1ra (10 mM osnovnog u CSE) su bili dodati u 160 μl 10 mM citrata, pH 6.5 u HPLC bočici. Reakcija je bila inkubirana na 37°C, pa su bili uzeti alikvoti od 25 ml korišćenjem HPLC autosemplera posle 0, 45, 90, 135, 180, 225, i 270 minuta. Svaki alikvot je bio analiziran reverzno-faznom HPLC uz korišćenje Agilent 110 HPLC opremljenog sa Jupiter 5u C4300A reverzno-faznom HPLC kolonom (4.6 x 250 mm, Phenomenex, Torrance, CA), on-lajn UV detektora i temperaturski kontrolisana polica za uzorke sa 100-bunarčića je bila podešena na 37°C. Protok je bio podešen na 1 ml/min, a kolona je bila održavana na temperaturi od 50°C. Kolona je bila prethodno uravnotežavana 15 min (protok 1ml/min) sa 65% pufera A (0.1% trifluorosirćetne kiseline (TFA) u vodi) i 35% pufera B (90% acetonitril, 0.1% TFA u vodi). Posle stavljanja, analiti su bili eluirani korišćenjem porasta gradijenta od 35% do 50% pufera B (90% acetonitril, 0.1% TFA u vodi) preko 25 minuta.

[0127] Za derivatizaciju u prisustvu fosfata je bilo dodato 20 μl MAP (10 mM osnovnog rastvora u vodi) i 20 μl IL-1ra (10 mM osnovnog rastvora u CSE) u 160 μl 10 mM fosfata, pH 6.5 u HPLC bočici. Reakcija je bila inkubirana na 37°C, pa su bili uzeti alikvoti od 25 μl korišćenjem HPLC autosemplera posle 0, 45, 90, 135, 180, 225, i 270 minuta. Svaki alikvot je bio analiziran reverzno-faznom HPLC kao što je gore opisano za derivatizaciju u prisustvu citrata.

[0128] Rezultati derivatizacije u prisustvu citrata su prikazani na Slici 13. Rezultati derivatizacije u prisustvu fosfata su prikazani na Slici 14. Oba HPLC profila otkrivaju četiri nova, slabo izražena IL-1ra pika koji potiču od derivatizacije sa MAP u ovom eksperimentu.

[0129] IL-1ra se takođe derivatizovao sa MAP u prisustvu 10 mM pirofosfata, pH 6.4.

Dvadeset μl MAP (10 mM osnovnog rastvora u vodi) i 20 μl IL-1ra (10 mM osnovnog rastvora u CSE) je bilo dodato u 160 μl 10 mM pirofosfata, pH 6.4 u HPLC bočici. Reakcija je bila inkubirana na 37°C, pa su bili uzeti alikvoti od 25 μl korišćenjem HPLC autosemplera posle 0, 45, 90, 135, 180, 225, i 270 minuta. Svaki alikvot je bio analiziran reverzno-faznom HPLC kao što je opisano gore za derivatizaciju u prisustvu citrata. Slika 15 prikazuje preklapanje rezultata reverzno-fazne HPLC za derivatizaciju IL-1ra sa MAP za 4.5 sati (270 minuta) u prisustvu citrata, u prisustvu fosfata, i u prisustvu pirofosfata. Četiri slabo izražena pika su bila identifikovana u ovom eksperimentu, a označeni su na Slici 15.

[0130] Svaki od pikova iz vremenske tačke posle 270 minuta za derivatizaciju u prisustvu citrata, prikazanih na Slici 15, bio je dalje analiziran da bi se odredio identitet svakog od njih, kao što sledi. Četiri glavna pika su bila sakupljena iz HPLC testa kao što je gore razmotreno. Uzorci su bili koncentrovani na SpeedVac do finalne zapremine od 5-10 μl. Onda je bilo dodato devedeset μl pufera za digestiju (50 mM tris, 0.8 M gvanidinijum-HCI, pH 8.0) svakom uzorku, što je bilo praćeno sa 10 ml endoproteinaze lys-C (1 μg u 10 μl pufera za digestiju). Uzorci su bili inkubirani na 37°C tokom 16 sati. Rezultujući peptidi su bili analizirani pomoću LC-MS/MS korišćenjem Agilent 110 HPLC opremljenog sa on-lajn MS detekcijom sa Finnegan-ovom jonskom zamkom. Upotrebljena HPLC kolona je bila Jupiter 5u C18100A reverzno-fazna HPLC kolona (2 x 150 mm, Phenomenex, Torrance, CA). Protok je bio podešen na 0.2 ml u minuti, a kolona je održavana na temperaturi od 50°C. Kolona je bila prethodno uravnotežavana 22 minuta sa 98% pufera A ((0.1% TFA u vodi) i 2% pufera B (90% acetonitril, 0.1% TFA u vodi). Posle stavljanja, analiti su bili eluirani iz HPLC kolone korišćenjem porasta gradijenta od 2% do 45% pufera B preko 50 minuta. Deset procenata eluenta iz HPLC kolone je bilo podvrgnuto MS analizi. Prisustvo dodatne acetil grupe na peptidu je rezultovalo povećanjem od 42 m/z na MS profilu u odnosu na nemodifikovani peptid. Identitet detektovanih peptida i specifičnih aminokiselinskih ostataka koji su bili modifikovani je bio verifikovan pomoću MS/MS.

[0131] Izgleda da se IL-1ra polipeptid pika 1 derivatizovao samo na svom N-terminalnom aminu. Izgleda da se IL-1ra polipeptid pika 2 derivatizovao na svom N-terminalnom aminu i na lizinu-6. Izgleda da se IL-1ra polipeptid pika 3 derivatizovao na svom N-terminalnom aminu, na lizinu-6, i na lizinu-93. Konačno, izgleda da se IL-1ra polipeptid pika 4 derivatizovao na svom N-terminalnom aminu, na lizinu-6, na lizinu-93, i na lizinu-96.

[0132] Nivo derivatizacije na svim pozicijama osim za N-terminalni amin izgleda da je veći u prisustvu fosfata nego u prisustvu citrata ili pirofosfata. Ovi rezultati sugerišu da citrat i/ili pirofosfat mogu zaštititi pozitivno naelektrisane lizinske grupe u IL-1ra od derivatizacije sa MAP bolje nego fosfat. Ovi rezultati mogu sugerisati da citrat i/ili pirofosfat ima jači afinitet za pozitivno naelektrisane lizinske ostatke nego fosfat.

[0133] Brzina derivatizacije IL-1ra sa MAP je bila određena korišćenjem podataka prikazanih na Slici 13 (i reprodukovanih na Slici 16A) za derivatizaciju IL-1ra u prisustvu citrata.

Naročito, svaki hromatogram sa Slike 16A je bio razvijen korišćenjem PeakFit™ (Systat Software Inc.). Onda je bila integrisana površina ispod svakog od razvijenih pikova (pikovi 1-4) za svaki vremenski trenutak (0, 45, 90, 135, 180, 225, i 270 minuta). Ilustrativni razvijeni profil za jedan vremenski trenutak je prikazan na Slici 16B. Razvijeni pikovi 1-4 su označeni na Slici 16B, a integrisana površina ispod svakog od njih je prikazana dole. Pik 1 je imao integrisanu površinu od 160.28590. Pik 2 je imao integrisanu površinu od 190.41964. Pik 3 je imao integrisanu površinu od 181.76548. Pik 4 je imao integrisanu površinu od 178.18844. Integrisana površina razvijenog pika 4 u vremenskim trenucima posle 0, 45, 90, 135, 180 minuta je onda bila grafički prikazana prema vremenu inkubacije reakcije koja je proizvela taj pik. Taj dijagram je prikazan na Slici 16C. Rezultujuća linija ima nagib od 68.931 sati<-1>.

[0134] Onda je bila izračunata brzina derivatizacije IL-1ra sa MAP za različite eksperimente u prisustvu različitih pufera i za različite pH, u skladu sa gore razmotrenim postupcima. Različite brzine su onda grafički prikazane na trakastom dijagramu, prikazanom na Slici 17. Specifično, brzina derivatizacije IL-1ra sa MAP je bila određena u prisustvu 10 mM fosfata, pH 6.3; 10 mM citrata, pH 6.3; 10 mM pirofosfata, pH 6.3; 10 mM fosfata, pH 6.5; 20 mM fosfata, pH 6.5; 10 mM citrata, pH 6.5; 20 mM citrata, pH 6.5; 10 mM pirofosfata, pH 6.5; 20 mM pirofosfata, pH 6.5; 10 mM fosfata, pH 6.7; 10 mM citrata, pH 6.7; i 10 mM pirofosfata, pH 6.7.

[0135] Za svaki pH, brzina derivatizacije IL-1ra sa MAP je bila manja u citratnom ili pirofosfatnom puferu nego u fosfatnom puferu. Vidi Sliku 17. Pored toga, brzina derivatizacije u prisustvu 20 mM citrata ili pirofosfata je bila manja nego brzina derivatizacije u prisustvu 10 mM citrata ili pirofosfata. Ovi rezultati sugerišu da citrat i/ili pirofosfat mogu zaštititi lizinske ostatke IL-1ra od derivatizacije sa MAP efektivnije nego fosfat. Shodno tome, brzina derivatizacije IL-1ra sa MAP je manja u prisustvu citratnog pufera ili pirofosfatnog pufera nego u prisustvu fosfatnog pufera.

[0136] Konačno, IL-1ra se takođe derivatizovao sa MAP u prisustvu 10 mM citrata za pH 6.3, pH 6.5, ili pH 6.7; ili u prisustvu 10 mM fosfata, pH 6.3, pH 6.5, ili pH 6.7, za 5.5 sati, u skladu sa gore razmotrenim postupcima. Slika 18 prikazuje preklapanje rezultata reverzno-fazne HPLC za derivatizaciju IL-1ra sa MAP za 5.5 sati u prisustvu svakog od ovih pufera. Ova slika prikazuje da se IL-1ra derivatizovao u većem stepenu u prisustvu fosfata nego u prisustvu citrata za sve testirane nivoe pH. Ovi rezultati sugerišu da citrat može zaštititi lizinske ostatke IL-1ra od derivatizacije sa MAP efektivnije nego fosfat.

[0137] Podaci prikazani na Slici 18 takođe sugerišu da se IL-1ra derivatizovao u većem stepenu kada se pH povećao.

Primer 8

Agregacija IL-1ra u prisustvu različitih koncentracija fosfata

[0138] Deset ml IL-1ra osnovnog rastvora (220 mg/ml u CSE) je bilo dijalizirano na 4°C tokom 48 sati protiv ukupno 8L (2L sa tri promene pufera od po 2L svaka) 10 mM fosfata, 100 mM NaCl, pH 6.5. Koncentracija IL-1ra je bila podešena na 167 mg/ml sa 10 mM fosfata, 100 mM NaCl, pH 6.5. Bilo je pripremljeno 1M osnovnog rastvora fosfata rastvaranjem odgovarajuće količine natrijum fosfata u 10 mM fosfata, pH 6.5, 100 mM NaCl. Dvadeset mM, 60 mM, 110 mM, 210 mM, 310 mM, 410 mM, 510 mM, 610 mM, 710 mM, 810 mM, 910 mM, i 1 M radnih osnovnih rastvora fosfata, pH 6.5 je bilo napravljeno od 1M osnovnog rastvora razređivanjem sa 10 mM fosfata, pH 6.5, 100 mM NaCl.

[0139] Agregacija IL-1ra u različitim koncentracijama fosfata je bila izmerena korišćenjem staklene ploče sa 96-bunarčića (Zissner) i temperaturski kontrolisanog spektrofotometra čitača ploča, SpectraMax Plus (Molecular Devices). Stoosamdeset mikrolitara od 167 mg/ml osnovnog rastvora IL-1ra je bilo dodato u svaki bunarčić. Dvadeset μl fosfatnog radnog osnovnog rastvora je onda bilo dodato u svaki bunarčić (jedan radni osnovni rastvor po bunarčiću). Finalna koncentracija fosfata u bunarčićima je bila 0 mM, 2 mM, 6 mM, 11 mM, 21 mM, 31 mM, 41 mM, 51 mM, 61 mM, 71 mM, 81 mM, 91 mM, 100 mM. Ploča je bila inkubirana u spektrofotometru na 39°C, pa je bila merena optička gustina na 405 nm svakih 1 minut. Slika 19 prikazuje optičku gustinu na 405 nm grafički prikazanu kao funkcija vremena za svaku koncentraciju fosfata za ovaj eksperiment. Podaci na Slici 19 sugerišu da se stepen agregacije IL-1ra smanjuje sa povećanjem koncentracije fosfata.

Primer 9

Merenje vezivanja citrata za IL-1ra

[0140] Brojevi mesta za vezivanje citratnih jona i Kdza vezivanje citrata za IL-1ra su bili određeni kao što sledi. Rastvori od 1 ml 1 mM IL-1ra su bili pripremljeni u puferima koji su imali različite koncentracije citrata, pH 6.5 razređivanjem IL-1ra osnovnog rastvora (220 mg/ml u CSE) u odgovarajućim puferima. Konkretno, bilo je pripremljeno 1 ml 1 mM rastvora IL-1ra u po 5 mM, 10 mM, i 20 mM citrata, pH 6.5. Svaki rastvor je takođe sadržao 70 mM NaCl. Četiri stotine mikrolitara svakog rastvora je bilo stavljeno u Microsep™-10 obrtnu kolonu (Pall Corporation; jedan rastvor po koloni). Kolone su bile obrtane na 18°C tokom 35 minuta na 4000 xg. Posle obrtanja IL-1ra ostaje u retentatu, vezan za deo citrata, dok deo pufera koji sadrži nevezani citrat prolazi kroz filter kao filtrat. Posle obrtanja, oko polovine rastvora je prošlo kroz filter kao filtrat.

[0141] Količina citrata u svakom retentatu i filtratu je bila određena kao što sledi. Dvadeset μl filtrata ili retentata je bilo stavljeno na reverzno-faznu HPLC kolonu (Supelcosil™ LC-18 kolona, 15 cm x 4.6 mm, Sigma-Aldrich kat. br.58985). Protok je bio 1 ml u minuti sa 0.1 M fosforne kiseline kao tekućeg pufera (izokratsko eluiranje). Eluiranje je bilo izvedeno na sobnoj temperaturi. Količina limunske kiseline eluirane iz kolone je bila izmerena na 215 nm. Koncentracija citrata u uzorku koji je testiran (retentat ili filtrat) je onda bila izračunata na osnovu merenja (sistem je bio kalibrisan sa standardima citratnog rastvora od 0-10 mM, pH 6.5).

[0142] Slika 20 prikazuje dijagram koncentracije citrata vezanog za IL-1ra (određena kao koncentracija citrata u retentatu minus koncentracija citrata u filtratu) prema koncentraciji ukupnog citrata u rastvoru. Maksimalna koncentracija vezanog citrata, Bmax, koje je ekstrapolirana iz tih podataka je bila 1.8218 mM. Podaci sa Slike 20 su bili upotrebljeni za kreiranje Scatchard-ovog dijagrama da bi se odredio Kdza vezivanje citrata za IL-1ra. Kdje bio izračuat kao 3.846 mM za ovaj eksperiment (podaci nisu prikazani). Pored toga je bio određen broj mesta vezivanja za citrat na IL-1ra na osnovu x-odsečka na Scatchard-ovom dijagramu. Broj mesta vezivanja je bio 0.94 za ovaj eksperiment (podaci nisu prikazani). Ovi podaci sugerišu da postoji jedno mesto vezivanja za citrat u IL-1ra.

Primer 10

Nadmetanje za mesto vezivanja anjona na IL-1ra

[0143] Nadmetanje za mesto vezivanja citrata na IL-1ra od strane pirofosfata je bilo određeno kao što sledi. Četiri stotine mikrolitara rastvora koji sadrži 1 mM IL-1ra, 10 mM citrata, pH 6.5, 70 mM NaCl, i testiranu koncentraciju pirofosfata je stavljeno u Microsep™-10 obrtne kolone (Pall Corporation), pa je obrtano na 18°C tokom 35 minuta na 4000 xg. Koncentracije pirofosfata koje su testirane su bile 0 mM, 5 mM, 10 mM, i 20 mM. Posle obrtanja, oko polovine rastvora je prošlo kroz filter kao filtrat, dok je ostatak rastvora ostao iznad filtera kao retentat. IL-1ra ostaje u retentatu, vezan za deo citrata i/ili pirofosfata, dok će deo pufera koji sadrži nevezani citrat i pirofosfat proći kroz filter kao filtrat. Koncentracija citrata i u retentatu, i u filtratu je bila određena kao što je razmotreno gore u Primeru 9.

Nadmetanje za mesto vezivanja za citrat na IL-1ra od strane fosfata je bilo određeno kao što je gore opisano za pirofosfat.

[0144] Slika 21 prikazuje dijagram koncentracije citrata vezanog za IL-1ra prema odnosu ukupne koncentracije anjona koji se nadmeću (pirofosfat ili fosfat) prema ukupnoj koncentraciji citrata u rastvoru. Podaci sugerišu da je pirofosfat efektivniji u nadmetanju sa citratom za mesto vezivanja za citrat na IL-1ra od fosfata. Zbog toga što i pirofosfat, i fosfat izgleda da mogu da se nadmeću za mesto vezivanja na IL-1ra (tj. mesto nije specifično za citrat), nazivamo mesto vezivanja za citrat na IL-1ra mestom vezivanja za anjon.

[0145] Iz podataka prikazanih na Slici 21, Kdza pirofosfat koji se vezuje za mesto vezivanja za anjon na IL-1ra je bio određen primenom sledećih proračuna. Vidi, npr. Stinson i Holbrook, Biochem. J. (1973) 131: 719-728. Nadmetanje za vezivanje između citrata i pirofosfata može se izraziti u vidu dve posebne ravnotežne jednačine:

gde je P = protein, koji je IL-1ra u ovom slučaju; L = ligand, koji je citrat u ovom slučaju; i X = anjon koji se nadmeće, koji je pirofosfat u ovom slučaju. K<d>Lje Kdza vezivanje liganda za protein i jednak je koncentraciji P (slobodnog proteina) puta koncentracija L (slobodni ligand), podeljeno sa koncentracijom PL (proteina vezanog za ligand). K<d>Xje Kdza anjon koji se nadmeće za vezivanje za protein i jednak je koncentraciji P (slobodnog proteina) puta koncentracija X (slobodni anjon koji se nadmeće), podeljeno sa koncentracijom PX (proteina vezanog za anjon koji se nadmeće).

[0146] Očigledni, ili uočeni Kdcitrata (K<d>Lapp) može biti izražen kao što sledi:

gde je Lfreekoncentracija slobodnog liganda (citrat), Pfreeje koncentracija slobodnog proteina (IL-1ra), PX je koncentracija proteina vezanog za anjon koji se nadmeće (pirofosfat), i PL je koncentracija proteina vezanog za ligand. Zamenom (PX) izraza sa (Xfree)(Pfree)/K<d>X, koji je izveden iz gore pokazane ravnotežne jednačine, izraz za KdLapp se može redukovati/svesti na:

Shodno tome, ako se K<d>Lapp prikaže grafički prema Xfree, onda će y-odsečak biti jednak K<d>L, a nagib će biti jednak K<d>L/K<d>X. Sređivanjem će K<d>Xbiti jednak y-odsečku podeljenom sa nagibom.

[0147] K<d>Lapp za vezivanje citrata je izračunat za svaku koncentraciju anjona koji se nadmeće kao koncentracija slobodnog proteina (IL-1ra) puta koncentracija slobodnog liganda (citrat), podeljen koncentracijom vezanog liganda (citrata vezanog za IL-1ra).

Izačunato je da je koncentracija slobodnog proteina ukupna koncentracija proteina u uzorku minus koncentracija vezanog proteina (koja je jednaka koncentraciji vezanog liganda). Xfree, ili koncentracija slobodnog anjona koji se nadmeće je jednaka ukupnoj koncentraciji anjona koji se nadmeće minus promena koncentracije vezanog liganda (citrata vezanog za IL-1ra) pošto je ukupna koncentracija anjona koji se nadmeće povećana (tj. pošto je citrat zamenjen na mestima vezivanja na IL-1ra za anjon sa anjonom koji se nadmeće). Drugim rečima,

[0148] Slika 22 prikazuje dijagram K<d>Lapp za citrat prema količini slobodnog pirofosfata, što je izračunato korišćenjem podataka sa Slike 20 i proračunima koji su razmotreni gore. K<d>Xza pirofosfat je bio izračunat kao 2.994 mM za ovaj eksperiment. Kao što je gore navedeno, yodsečak bi trebalo da bude jednak K<d>L, koja je Kdcitrata. U ovom eksperimentu, K<d>Lje bio 3.894 mM, što se dobro slaže sa prethodnim eksperimentalnim određivanjem Kdza vezivanje citrata za IL-1ra, od 3.846 mM, razmotrenim u Primeru 9.

[0149] Sličan dijagram (podaci nisu prikazani) je bio kreiran za podatke za fosfat prikazane na Slici 21. U ovom eksperimentu je bilo izračunato da je K<d>Xza fosfat bio 12.641 mM. K<d>Lza citrat, koji je određen na osnovu y-odsečka dijagrama za ovaj eksperiment (podaci nisu prikazani), je bio 4.996 mM.

[0150] Ovi podaci sugerišu da citrat i pirofosfat imaju niži KdS za mesto vezivanja anjona za IL-1ra. Pored toga, pirofosfat može imati neznatno niži Kdod citrata za mesto za vezivanje anjona. Niži KdS viđen u ovom eksperimentu koreliše sa većom sposobnosti pirofosfata i citrata da smanje agregaciju IL-1ra, kao što je prikazano u Primerima 2 i 4.

Claims (12)

Patentni zahtevi

1. Postupak za smanjenje agregacije agregirajućeg antagonista interleukin-1 receptora (IL-1ra), ili smanjenje brzine agregacije IL-1ra, u vodenoj kompoziciji, pri čemu postupak sadrži smanjenje agregacije ili smanjenje brzine agregacije IL-1ra u vodenoj kompoziciji inkubacijom vodene kompozicije koja sadrži IL-1ra sa najmanje jednim aksesornim molekulom u koncentraciji dovoljnoj za smanjenje agregacije ili smanjenje brzine agregacije IL-1ra u vodenoj kompoziciji, pri čemu je najmanje jedan od najmanje jednog aksesornog molekula efektivan za smanjenje agregacije između 20°C i 45°C i izabran je između šećera u koncentraciji od 1 do 3 procenta i višestruko naelektrisanog anjona.

2. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu je najmanje jedan aksesorni molekul višestruko naelektrisani anjon.

3. Postupak prema zahtevu 2, pri čemu je pomenuti višestruko naelektrisani anjon od 1 do 20 mM pirofosfata.

4. Postupak prema zahtevu 2, pri čemu je pomenuti višestruko naelektrisani anjon od 1 do 20 mM citrata.

5. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu je najmanje jedan aksesorni molekul šećer.

6. Postupak prema zahtevu 5, pri čemu je pomenuti šećer glicerol, sorbitol, ili saharoza.

7. Postupak za dobijanje formulacije leka sa antagonistom interleukin-1 receptora koji sadrži smanjenje agregacije agregirajućeg antagonista interleukin-1 receptora (IL-1ra), ili smanjenje brzine agregacije IL-1ra, u vodenoj kompoziciji inkubacijom vodene kompozicije koja sadrži IL-1ra sa najmanje jednim aksesornim molekulom u koncentraciji dovoljnoj za smanjenje agregacije ili smanjenje brzine agregacije IL-1ra u vodenoj kompoziciji, pri čemu je najmanje jedan od najmanje jednog aksesornog molekula efektivan za smanjenje agregacije između 20°C i 45°C i izabran je između šećera u koncentraciji od 1 do 3 procenata i višestruko naelektrisanog anjona, pri čemu je agregacija smanjena.

8. Postupak prema zahtevu 7, pri čemu je najmanje jedan aksesorni molekul višestruko naelektrisani anjon.

9. Postupak prema zahtevu 8, pri čemu je pomenuti višestruko naelektrisani anjon od 1 do 20 mM pirofosfata.

10. Postupak prema zahtevu 8, pri čemu je pomenuti višestruko naelektrisani anjon od 1 do 20 mM citrata.

11. Postupak prema zahtevu 7, pri čemu je najmanje jedan aksesorni molekul šećer.

12. Postupak prema zahtevu 11, pri čemu je pomenuti šećer glicerol, sorbitol, ili saharoza.