RS55100B1

RS55100B1 - Antitela protiv aktivina a i njegove primene

Info

Publication number: RS55100B1
Application number: RS20160851A
Authority: RS
Inventors: Hq Han; Qing Chen; Keith Soo-Nyung Kwak; Xiaolan Zhou
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2006-09-08
Filing date: 2007-09-07
Publication date: 2016-12-30
Also published as: HUE030463T2; LT2559705T; US8753627B2; JP5497438B2; DK2559705T3; US20170073408A1; WO2008031061A2; JP2016146844A; EP3495388A1; TW200819466A; PL2064239T3; CY1116037T1; US20130030159A1; CL2007002567A1; PL2559705T3; SI2064239T1; WO2008031061A3; DK2064239T3; HRP20161300T1; RS53819B1

Description

PRETHODNO STANJE TEHNIKE

[0001]Veliki broj ozbiljnih bolesti prati stanje poznato kao kaheksija, koja se odnosi na gubitak telesne mase ćelije. Telesna masa ćelije (BCM) se sastoji od mase mišića, organske mase i imuna masa ćelija. BCM je najaktivnija komponenta tela ljudskog tela, koja iznosi devedeset pet procenata celokupne metaboličke aktivnosti. Pet proenta gubitka BCM dovodi do promenjene morbidnosti, gubitak jačine mišića, promenjeni metabolizam i povećani rizik od infekcije. Gubitak od četrdeset procenata može kao rezultat da da smrt.

[0002]Primeri uslova u kojma kahezija igra ulogu u određivanju ishoda fundamentalne bolesti koji obuhvataju opseg većih zravstvenih problema danas Pacijenti sa reumatoidnom kahezijom, reumatoidnim artritisom (RA) pacijent gubi trinaest do petnaest procenata BCM Dve trećine RA pacijenata ima kaheziju, i ove rezultate u dva do pet puta veći mortalitet. Drugi povezani uslovi obuhvataju reumatoidni kahezijsku gojaznost i hipercitokinaemičku kaheziju. Kahezija povezana sa kancerom doprinosi značajno morbidnosti i smrtnost, takođe utiče na sposobnost pacijenta da toieriše terpaije koje potencijalno spašavaju život.

[0003]Zbog zajedničke uloge aktivina A u broju široko rasprostranjenih bolesti, od čega svi imaju visoke stope smrtnosti, već dugo postoji potreba u tehnici da se supstance i metode spreče ili obrnu kaheziju povezanu sa bolešću. Takve kompozicije i metode su ovde obezbeđene Rabinovici et al (J Clin Endocrinol Metab. 1992 Aug:75(2):571-6) opisuje proizvodnju aktivin A antitela kod mise korišćenjem prečišćenog rekombinantnog aktivina A. Monoklonalno antitelo je reagovalo sa nedirnutim dimerom aktivina A, ali nije bilo detektibilnog spoja sa monomernom podjedinicom. Groome et al.

(Hvbridoma. 1991 Apr;10(2):309-16) opisuju pripremu monoklonalnih antitela protiv ljudskog inhibina. Sedam sintetičkih peptida inhibira je spojeno na tuberkulin i korišćeno da imunizuje miševe. Samo jedan od peptida, koji odgovara sekvencama 82-114 ljudskog inhibina, je dosledno dao dobre titre antitela kada je korišećn u ELISA ogledu sa nedirnutim goveđim inhibmom

R&D Svstems ima u prodaji mišje mAb (lgG1) protiv ljudskog aktivina A, koji je gnerisan korišćenjem rekombinantnog ljudskog aktivina A za imunizaciju miševa, za upotrebu u različitim pnmenama uključujući ELISA, vestern blot, i imunohistohemija.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0004]Ovaj je pronalazak usmeren na izolovano antitelo. ili njegov fragment za vezivanje antigena, koji se specifično vezuje na region čvora cisteina ljudskog aktivina A, pomenuti region koji obuhvata amino kiseline C11-S33 i amino kiseline C81-E111 sekvence iznete u ID BR. SEK:225, i inhibira vezivanje ljudskog aktivina A na ljudski aktivin A receptor. i njegovu upotrebu u terapiji. Polinukleotidi koji kodiraju izolovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema ovom pronalasku, i vektori ekspresije i ćelije domaćina koji obuhvataju iste su takođe dati Pored toga, date su farmaceutske supstance koje obuhvataju izolovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema ovom pronalasku.

KRATAK OPIS SLIKA NACRTA

[0005]

Slika 1 daje pramenu mišićne mase za kolagenom izazvan artritis miševa lečenih antitelom A1 protiv aktivin A

Slika 2 daje promenu mišićne masti za kolagenom izazvan artritis kod mišeava lečenih antitelom A1 protiv aktivin A

Slika 3 daje podatke koji obezbeđuju da terapija protiv aktivin A korišćenjem antitela A1, A2 i A3 sprečava gubitak telesne težine kod mladih odraslih laboratorijskih miševa sa intramuskularnim CHO/Aktivin senograftom.

Slika 4 daje NMR podatke koji pokazuju da terapija protiv aktivin A sprečava gubitak nemasne telesne

mase kod mladih odraslih laboratorijskih miševa sa intramuskularnim CHO/Aktivin ksenograftom

Slika 5 daje dejstvo antitela A1 protiv aktivina A na promene telesne težine kod miševa koji su dobili AAV aktivin A (dejstvom dobijenog AAV aktivina A preoblikovanih miševa).

Slika 6 daje masu trbušastog mišića lista za CDF1 mišji kancer debelog creva-26 na modelu kahezijskog miša sa i bez lečenja sa antitelom A1 protiv aktivina A, osamnaest dana posle inokulacije tumora.

Slika 7 pokazuje model aktivina A, sa regionom vezivanja antitela obeleženim u vidu kruga. K21, K103 i X94 se odnose na ostatke lizina na poziciji 21 i 103. i ostatak tirozma na poziciji 94

Slika 8 je grafikon koji pokazuje afinitete vezivanja antitela A1, A2 i A3 kako je određeno korišćenjem KinExA Konstanta disocijacije ravnoteže je dobijena iz nelinearne regresije krivi konkurentnih korišćenjem modela dvostruke krive na mestu homogenog vezivanja korišćenjem KinExA softvera.

Slika 9 pokazuje regione epitopa koji nisu zaštićeni od raspadanja vezivanjem antitela A1, A2 ili A3 Slika 10 je grafikon koji pokazuje afinitete vezivanja antitela A1, A2. i A3 za nedirnuti aktivin A (označen partijom 55). kao i aktivinom A koji se deli na ostatku tirozina na poziciji amino kiseline broj 94 (označeno partijom 38).

Slika 11 je grafikon koji pokazuje afinitete vezivanja antitela A1, A2. i A3, kao i dva komercijalno dostupna antitela za aktivin A ili aktivin B na imobilizovanim površinama antitela

Slika 12 pokazuje vezivanje antitela na himere aktivina A/aktivina B putem antitela A1 i A2, kao i dvakomercijalno dostupna antitela aktivina A

Slika 13 pokazuje sekvence amino kiseline himera aktivina A/aktivina B korišćenih za testriranje antitela opisano na Slici 11.

Slika 14 pokazuje vezivanje nekoliko antitela, uključujući A1, A2, i A3, na različite epitope aktivina A, dva komercijalno dostupna antitela aktivina A su takođe testirana

DETALJAN OPIS

[0006]Ovaj se pronalazak odnosi na regione ljudskog aktivina A koji sadrže domene čvora cisterna koje su prepoznala antitela koja se takođe vezuju na aktivin A pune dužine. Preciznije, ovaj pronalazak daje antitela koja se specifično vezuju na ljudski aktivin A i blokiraju ih oštećuju vezivanje ljudskog aktivina A na jedan ili više Uganda

[0007]Ovaj pronalazak je usmeren na izolovano antitelo. ili njegov fragment vezivanja antigena, koji se specifično vezuje na region čvora cisteina ljudskog aktivina A, pomenuti region koji obuhvata amino kiseline C11-S33 i amino kiseline C81-E111 sekvence iznete u ID BR SEK:225, i inhibira vezivanje ljudskog aktivina A na ljudski aktivin A receptor, i njegovu upotrebu za lečenje Polinukleotidi koji kodiraju izolovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema ovom pronalasku, i vektori ekspresije i ćelije domaćina koji obuhvataju iste su takođe dati Pored toga. date su farmaceutske supstance koje obuhvataju izolovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema ovom pronalasku

[0008]Smrtnost usled zatajenja srca usled zagušenja (CHF) se odnosi na kaheziju U jednoj studiji (Anker. S.D. and Coats, A.J. Chest 115:836-847, 1999), šesnaest procenata neizabrane populacije vanbolničkih pacijenata sa zatajenjem srca usled zagušenja (CHF) je bilo kahektićno. Ovo stanje je bilo predvidljivo u smislu nepristrasne prognoze nezavisno od starosne dobi funkcionalne klasifikacije bolesti, frakcije izbacivnaja leve srčane komore, i maksimalnu potrošnju kiseonika Smrtnost kod kahektičnj grupi je bila pedeset procenata u osamnaest meseci

[0009]Jedna putanja zajednička za napredovanje bolesti kod kancera, reumatoidnog artritisa, hroničnog zatajenja bubrega, zatajenja srca usled zagušenja, i drugih uslova kod kojih je kahezija činilac je putanja aktivina A. Gubljenje mišića i slabost su zajednički kod brojnih stanja bolesti i uslova kao što je starenje, kahezija zbog kancera, sepsa, denervacija. neupotreba, neaktivnost, opekotine. HlV-om stečen sindrom gubitka imuniteta (AIDS) hromćno zatajenje bubrega ili srca. rasterećenje/mikrogravitacija, i mišićna distrofija. Akti vini i inhibini su članovi TGF beta podfamilije. Aktivini i inhibini funkcionišu kao stimulatori i inhibitori, respektivno izlučivanje izlučivanje hormona koji stimuliše folikule hipofize i biosintezu. Aktivin A je pretežno dominantni oblik aktivina U reproduktivnoj biologiji, aktivini i inhibini su važni regulatori ciklusa jajnika i procesa ovulacije. i mogu da igraju ulogu u implantaciji embriona, i/ili održavanju trudnoće (O'Connor et al . Human Reproduction, V. 14, No 3, 827-832. March 1999; Draper et al. Endocrin., V 138, No 7: 3042-3046; Jones, et al., Endocrin. V 147. No. 2: 724-732, Feb. 2006) Identifikacija inhibina i aktivina kod velikog broja tkiva nagoveštava da ovi činioci igraju mnogo značajnije uloge nego kontrola FSH sekrecije (izlučivanja)

[0010]Ativini reaguju sa dve strukturno srodne klase receptora serin/treonm kinaze (tip l i tip II) Inhibin antagonizuje aktivin vezivanjem na proteoglikan. betaglikan. i formira stabilan kompleks i izdvajajući time receptore tipa II aktivina dok istovremeno isključuje receptore tipa I Postoje dva glavna oblika aktivina: aktivin A je homodimer |1a podjedinica i aktivin B je homodimer \] q podjedinica(Vale, et al., Recent Prog Horm Res V. 44: 1-34, 1988) Heterodimen p-podjedinice koja je različita od bilo (S-podjedinice daje kao rezultat funkcionalni antagonist inhibin

[0011]Literatura je pokazala da je aktivin A prekomerno izražen t/ili iokaltzovan u tkivima kancera. Na primer, visoki nivoi aktivina A seruma su pronađeni kod žena sa karcinomima endometrijuma i grlića materice (Petraglia, F. et al.. Jour. Clin Endocrin Metab 83 1194-1200, 1998) Aktivin A je bio prekomerno izražen u fazi IV kolorektalnog kancera (VVildi. S et al., Gut 49-409-417. 2001) Registrovana je uloga aktivina A u kanceru jajnika (Steller. M D et al., Mol Cancer Res 3:50-61, 2005).

[0012]U literaturi se takođe pominje aktivina A u bolesti bubrega (Yamashita S et al J Am Soc Nephrol, 15:91-101. 2004.) Registrovani su nivoi aktivina A u imunoreaktivnom serumu kod normalnih subjekata i pacijenata od strane Harada, K. et al in J Clin Endocrin and Metab 81 2125-2130. 1996 Aktivina a je snažan aktivator renalnih intersticijalnih fibroblasta (Harada, K et al., J Am. Soc Nephrol. 15:91-101, 2004). Glomerufarni aktivina A prekomerna ekspresija je povezana sa fibrozom u anti-Thy 1 glomerulonefritis (Gaedeke, J et al., Neph. Dial Transpl 20:319-328, 2005)

[0013]Nivoi aktivina A seruma kod pacijenata sa problemima srca su povećani u skladu sa ozbiljnošću bolesti (Yndestalet al., Circulation 109:1379-1385, 2004) Kod zatajenja srca na modelu pacova, aktivin A seruma je povišen odmah posle miokardijalnog infarkta i ostao je šest meseci, i aktivin A imunološko bojenje je lokalizovano isključivo na kardiomiocitima (Yndestad et al., 2004). Povišeni nivoi aktivina A su prijavljeni kod zatajenja srca (Yndestad, A. et al., Circulation 109:1379-1385, 2004).

[0014]Takođe su date nukleinske kiseline koje obuhvataju sekvencu nukleotida koja kodira antitelo protiv aktivina A ili fragment antitela prema ovom pronalasku, piazmide i vektore koji obuhvataju takve nukleinske kiseline, ili ćelije ili linije ćelija koje ouhvataju takve nukleinske kiseline i/ili vektore t piazmide.

[0015]Farmaceutske supstance koje obuhvataju antitela prema ovom pronalasku i njihovu upotrebu u metodama za lečenje stanja posredovanog aktivinom A, i za modulisanje biološke aktivnosti aktivina A, i za modulisanje biološke aktivnosti aktivina Ain vivoiliin vitro,su takođe dati.

[0016]Sekvence polinukleotida i polipeptida su navedene korišćenjem standardnih skraćenica od jednog ili tri slova. Osim ako nije drugačije navedeno, sekvence polipeptida imaju svoje amino završetke levo i svoje karboksi završetke desno, i jednolančane sekvence nukleinkske kiseline, njihov gornji lanac dvolančane sekvence nukleinske kiseline, ima svoj 5' završetak levo i svoj 3' završetak desno. Posebna sekvenca polipeptida ili polinukleotida može takođe biti opisana objašnjavanjem koliko se razlikuje od referentne sekvence

[0017]Osim ako nije drugačije navedeno, jasno je da sekvence polinukleotida i polipeptida obuvhataju svaka nukelinsku kiselinu ili amino kiselinu navedenu, respektivno, kao i interventne nukleinske kiseline oramino kiseline Na primer. sekvenca polipeptida R13-Y39 prikazuje sekvencu polipeptida koja obuhvata amino kiselien R13, i Y39, kao i amino kiseline pronađene između R13 i Y39 u sekvenci polipeptida. Odgovarajuće, sekvenca polinukleotida C1-T5 prikazuje sekvencu polinukleotida koja obuhvata nukleinske kiseline C1. i T5, kao i nukleinske kiseline na pozicijama 2,3, i 4 te sekvence. S tim u skladu, naznačenja ID BR SEK. 1-5 slično tome naznačava inkluzivnu grupu ID BR. SEK: 1, ID BR SEK: 2, ID BR SEK: 3, ID BR SEK 4 i ID BR SEK: 5 Najzad, grupacije amino kiseline su takođe predviđene da budu inkluzivne, osim ako nije drugači|e navedeno. Na primer, fraza "amino kiseline 1-5 ID BR. SEK: 28" obuhvata amino kiseline na pozicijama 1, 2, 3, 4, i 5 ID BR. SEK: 28.

[0018]Sekvence polinukleotida i polipeptida određenih promenljivih domena lakog i teškog lanca su prikazane dole Antitela koja obuhvataju laki lanac i teški lanac su određena kombinovanjem naziva promenljivih domena lakog lanca i naziva promenljivih domena teškog lanca. Na primer, "L4H7," označava da antitelo obuhvata promenljivi domen lakog lanca L4 i promenljivi domen teškog lanca H7.

[0019]Sekvence kapa konstantnog lakog lanca su prikazane na ID BR SEK:84, 100 i 108. i sekvence konstantnog teškog lanca su prikazane u ID BR SEK 214, 215 i 221 Polinukleotidi koji kodiraju ove sekvence su prikazani, za lake lance, respektivno. ID BR SEK:222, 223 i 239. i za teške lance, respektivno, ID BR SEK:240, 241, i 242 Dakle, pored promenljivih sekvenci kako je ovde opisano, antitelo može da obuhvati jedan ili oba ID SEK BR 84 i 214, ih ID BR. SEK 215 i 223; ili ID BR. SEK:108 i 221

[0020]Antitelo može da obuhvati specifični teški ili laki lanac, pri čemu komplementarni promenljivi domeni lakog ili teškog lanca ostaju neprecizirani Posebno, neka izvođenja obuhvataju antitela koja vezuju specifični antigen (kao što je aktivin A) putem specifičnog lakog ili teškog lanca tako da komplementarni teški ili laki lanac može biti pomešan ili čak irelevantna, ali može da bude određen putem, na primer, skrininga kombinatornih biblioteka. Portolano et al., J Immunol V 150 (3), pp 880-887 (1993); Clackson et al., Nature v 352 pp. 624-628 (1991).

[0021]Osim ako nije drugačije definisano ovde, naučni i tehnički pojmovi korišćeni u vezi sa ovim pronalaskom će imati značenja koja često razumeju oni koji su prosečni stručnjaci u ovoj oblasti Pored toga, osim ako kontekst ne zahteva drugačije pojmovi u jednini će obuhvatiti množinu i pojmovi u množini će obuhvatiti jedninu. Generalno, nomenklature koriščene u vezi sa. i tehnike, kulture ćelije i tkiva, molekularna biologija, imunologija, mikrobiologija, genetička i proteinska i hernija nukleinske kiseline i hbridizacija ovde opisane su one koje su dobro poznate i često koriščene u ovoj oblasti Ove metode i tehnike prema ovom pronalasku se generalno izvode u skaldu sa konvencionalnim metodama dobro poznatim u ovoj oblasti i kako je opisano u različitim opštim i specifičnijim referencama koje su citirane i razmatrane tokom ove specifikacije osim ako nije drugačije navedeno. Videti, npr, Sambrook et al Molekularno kloniranje A Laboratorv Manual, 2d ed., Cold Spnng Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor. NY (1989) and Ausubel et al , Current Protocols in Molecular Biologv, Greene Publishmg Associates (1992). and Harlovv and Lane Antibodies: A Laboratorv Manual Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, N Y

(1990) Enzimatske reakcije i tehnike prečišćavanja se izveode u skladu sa specifikacijama proizvođača, kao što je najčešće izvedeno u ovoj oblasti ili ovde opisano Terminologija korišćena u vezi sa, i laboratorijske procedure i tehnike, analitičke hernije, sintetičke organske hernije, i medicinske i farmaceutske hernije koje su ovde opisane su one koje su poznate i često koriščene u ovoj oblasti

Standardne tehnike je moguće koristiti za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutsku prirpemu. formulaciju, i isporuku, i lečenje pacijenata

[0022]Sledeći pojmovi, osim ako nije drugačije navedeno, treba razumeti u sledećim značenjima: Pojam "izolovani molekul" (pri čemu je molekul, na primer, polipeptid. polinukleotid. ili antitelo) jeste molekul koji zahvaljujući svom poreklu ili izvornom poreklu (1) nije povezan sa prirodno povezanim komponentama koje ga prate u njegovom prirodnom stanju, (2) je uglavnom bez drugih molekula istih vrsta (3) se ispoljava puem ćelije iz različitih vrsta, ili (4) ne javlja se u prirodi. Dakle, molekul koji se hemijski sintetiše, ili sintetiše u ćelijskom sistemu drugačijem od ćelije iz koje prirodno potiče, biće "izolovan" iz svojih komponenata sa kojima se povezuje prirodno Molekul može takođe da se dobije od prirodno povezanih komponenata uglavnom slobodan putem izolacije, korišćenjem tehnika prečišćavanja dobro poznatih u ovoj oblasti Čistoća i homogenost molekula mogu da se ispituju ogledom pomoću brojnih sredstava poznatih u ovoj oblasti. Na primer, čistoća polipeptidnog uzorka može da se ispituje korišćenjem poliaknlamidne gel elektroforeze i bojenjem gela da se vizuelno prikaže polipeptid koji koristi tehnike dobro poznate u ovoj oblasti Za izvesne svrhe, moguće je dati veću rezoluciju korišćenjem HPLC ili drugih sredstava za prečišćavanje dobro poznatih u ovoj oblasti.

[0023]Pojmovi "aktivin A inhibitor" i "aktivin A antagonist" se koriste naizmenično (u istom značenju). Svaki molekul koji detektibilno inhibira barem jednu funkciju aktivina A, Obrnuto, "aktivin A agonist" je molekul koji detektibilno povećava barem jednu funkciju aktivina A. Inhibicija prouzrokovana inhibitorom aktivina A ne mora da bude kompletna dokle god ju je ogledom moguće detektovati Moguće je koristiti ogled o funkciji aktivina A. čiji su pnmeri dati ovde Primeri funkcije aktivina A koji može biti potisnut delovanjem mhibitora aktivina A, ili povećan aktivnom A agonistom, obuhvata vezivanje aktivina A. Primeri tipova inhibitora aktivina A i agonista aktivina A obuhvataju, ali se ne ograničavaju na, polipeptide koji vezuju aktivin A kao što su proteini koji vezuju antigen (npr. proteini koji vezivanjem antigena inhibiraju aktivin A), antitela, fragmente antitela, i derivate antitela

[0024]Svaki od pojmova "peptid." "polipeptid" i "protein" se odnose na molekul koji obuhvata dva ili vije ostatka amino kiseline spojene jedan na drugi peptidnim vezama. Ovi pojmovi obuhvataju, npr. prirodne i veštačke proteine, fragmente protein i analoge polipeptida (kao što su muteini, varijante i proteini fuzije) sekvenci proteina kao i posttranslacione. ili drugačije kovalentne ili nekovalentno. modifikovane proteine Peptid, polipeptid, ili protein može da bude monomerni ili polimerni

[0025]Pojam "fragment polipeptida" kako se ovde koristi se odnosi na plipeptid koji ima amino terminal i/ili brisanje karboksi terminala u poređenju sa odgovarajućim proteinom pune dužine Fragmenti mogu biti, na primer, barem 5, 6, 7, 8. 9, 10, 11. 12, 13, 14, 15, 20, 50, 70, 80, 90, 100, 150 ili 200 amino kiselina u dužini Fragmenti mogu takođe da budu, na primer, najviše 1.000, 750, 500, 250. 200, 175, 150, 125. 100. 90, 80, 70. 60. 50. 40. 30. 20, 15, 14. 13. 12, 11 Hi 10 amino kiselina u dužini Fragment može još da obuhvati, na bilo jedan ih oba svoja kraja, jednu l vše dodatnih amino kiselina, na primer. sekvencu amino kiselina iz različitog proteina koji se prirodno javlja (npr., Fc ili domen leucinskog zatvarača) ih sekvencu veštačke amino kiselien (npr , sekvencu veštačkog linkera).

[0026]Polipeptidi prema ovom pronalasku obuhvataju polipeptide koji su modifikovani na bilo koji način i iz bilo kog razloga, na primer, da; (1) smanje podložnost proteolizi. (2) smanje podložnost oksidaciji, (3) izmene afinitet vezivanja za formranje proteinskih kompleksa. (4) promene afinitete vezivanja, i (4) daju ili modifikuju druga fizikohemijska ili funkcionalna svojstva. Analozi obuhvataju muteine polipeptida. Na primer, jedna ili višestruka supstitucija amino kiseline (npr konzervativne supstitucije amino kiseline) mogu da budu napravljene u sekvenci koja se prirodno javlja (npr, u delu polipeptida izvan domena koji formira intermolekularne kontakte) "Konzervativna supstitucija amino kisleine" je ona koja ne menja u većoj meri strukturne karakteristike roditeljske sekvence (npr, zamena amino kiseline ne treba da nastoji da slomi spiralu koja se javlja u roditeljskoj sekvenci, ili poremeti druge tipove sekundarne strukture koji karaktenšu roditeljsku sekvencu ili su neophodni za njenu funkcionalnost). Primeri sekundarnih i tercijarnih struktura polipeptida priznatih u nauci su opisani u radu Proteins. Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W H Freeman and Companv, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C Branden and J Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N Y (1991)); and Thornton et al Nature 354:105 (1991)

[0027]"Variant" polipeptida (npr, antitelo) obuhvata sekvencu amino kiseline pri čemu se jedan ili više ostataka amino kiseline ubacuje u, briše iz i/ili supstituiše u sekvencu amino kiselien u odnosu na prirodnu sekvencu polipeptida, i zadržava u suštini istu biološku aktivnost kao prirodni polipeptid Biološka aktivnost polipeptida može da se izmeri korišćenjem standardnih tehnika u ovoj oblasti (na primer, ako je varijanta antitelo, njegova aktivnost može da se testira ogledima vezivanja, kako je ovde opisano). Varijante obuhvataju fragmente, analoge, rekombinantne polipeptide. sintetičke polipeptide, i/ili proteine fuzije "Derivat" polipeptida je polipeptid (npr. antitelo) koje je hemijsi modifikovano, npr.. spajanjem n drugi hemijski deo kao što je, na primer, polietilen glikol. albumin (npr albumin ljudskog seruma), fosforilacija, i glikosilacija Osima ako nije drugačije navedeno, pojam "antitelo" obuhvata, pored antitela koja obuhvataju dva teška lanca pune dužine i dva laka lanca pune dužine, derivate, varijante, fragmente, i njihove muteine, za koje su primeri opisani dole u tekstu.

[0028]"Protein za vezivanje antigena" je protein koji obuhvata deo koji se vezuje na antigen i. opciono, potku (scaffold) ili okvirni deo koji omogućava deo za vezivanje antigena da usvoji konformaciono ustrojavanje koje pospešuje vezivanje proteina koji vezuje antigenna antigen Primeri proteina koji vezuju antigen obuhvataju antitela, fragmente antitela (nprl. deo koji vezuje antigen antitela), derivate antitela, i analoge antitela Protein koji vezuje antigen može da obuhvati, na primer, alternativnu potku ili veštaćku potku sa transplantiranim CDR (regionima konstantnog domena) li derivatima CDR. Take potke obuhvataju, ali se ne ograničavaju na, potke (okosnice) izvedene iz antitela koje obuhvataju mutacije uvedene u. na primer stabilizuje trodimenzionalnu strukturu proteina koji vezuje antigen kao i potpuno sintetičke potke koje obuhvataju, na primer, biokompatibilm polimer Videti. na primer. Korndorfer et al.. 2003. Proteins Structure, Function, and Bioinformatics, Volume 53, Issue 1:121-129; Rogue et al . 2004, Biotechnol Prog. 20:639-654 Pored toga. imitacije peptidnog antitela ("PAMs") moguće je koristiti, kao i potke na osnovu imitacija antitela koje koriste komponente vezivanja fibronektiina kao potku

[0029]Protein za vezivanje antigena može imati, na primer. strukturu imunoglobulma koji se prirodno javlja "Imunoglobulin" je tetramerni molekul U imunoglobulinu koji se prirodno javlja, svaki tetramer se sastoji od dva identična para polipeptidnih lanaca, scvaki par ima jedan "laki" (oko 25 kDa) i jedan "teški" lanac (oko 50-70 kDa). Amino-terminalni deo svakog lanca obuhvata promenljivi region od oko 100 do 110 ili više amino kiselina primarno odgoovrnih za prepoznavanje antigena. Karboksi-terminalni deo svakog lanca definiše konstantni region primarno odgovoran za funkciju efektora Ljudski laki lanci se klasifikuju kao kapa i lambda laki lanci. Teški lanci se klasifikuju kao mu, delta, gama, alfa, ili epsilon, i definišu izotip antitela kao IgM IgD, IgG, IgA, i IgE, respektivno Unutar lakih i teških lanaca, promenljivi i konstantni regioni se spajajju pomoću "J" regiona sa oko 12 ili više amino kiselina, sa teškim lancem koji takođe obuhvata "D" region od oko još 10 amino kiselina. Videti generalno, Fundamental Immunologv Ch 7 (Paul, W., ed.. 2nd ed Raven Press, N.Y (1989)) Promenljivi regioni svakog para lakog/teškog lanca formiraju mesto vezivanja antitela tako da nedirnuti imunoglobulin ima dva sajta vezivanja Lanci imunoglobulina koji se prirodno javljaju ispoljavaju istu opštu strukturu relativno konzervisanih okvirnih regiona (FR) spojenih pomoću tri hipervarijabilna regiona, je takođe nazvana regiona određivanja komplementarnost ili CDR Od N-terminusa do C-terminusa, i laki lanac i teški lanac obuhvata domene FR1 CDR1. FR2 CDR2, FR3, CDR3 i FR4 Dodela amino kiselina svakom domenu je u skladu sa definicjama koje su u svojim radovima dah Kabat et al in Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th Ed . US Dept of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no 91-3242, 1991

[0030]"Antitelo" se odnosi na nedirnuti imunoglobulin ili njegov deo koji vezuje antigen koj se takmiči sa nedirnutim antitelom za specifično vezivanje, osim ako nije drugačije navedeno Delovi koji vezuju antigen mogu da budu proizvedeni rekombinantnim DNK tehnikama ili enzimskim ili hemijskim razlaganjem nedirnutih antitela. Delovi koji vezuju antigen obuhvataju,inter alta.Fab, Fab', F(ab')2, Fv, antitela domena (dAbs). i fragmente regiona određivanja komplementarnosti (CDR). jednolančana anatitela (scFv), himerna antitela, diatela. triatela. tetratela. i polipeptide koji sadrže barem deo imunoglobulina koji je dovoljan da da specifično vezivanje antigena na polipeptid.

[0031]Fab fragment je monovalentan fragment koji ima V|_. Vh, Cli Ch1 domene; F(ab')2fragment je bivalentan fragment koji ima dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom na region spoja (zgloba); Fd fragment ima Vjh i Ch1 domene; Fv fragment ima V|_ i Vhdomene jednog kraka antitela; i dAb fragment ima Vhdomen V|_ domen ili fragment za vezivanje antigena Vhili Vldomena (US Pat No 6,846.634, 6,696,245. US App Rub No 05/0202512, 04/0202995, 04/0038291, 04/0009507, 03/0039958, VVard et al., Nature 341:544-546. 1989)

[0032]Jednolančano antitelo (scFv) je antitelo u kom se spoje V|_ j Vhregion preko linkera( npr,sintetička sekvenca ostataka amino kiseline) da se formira kontinualni lanac proteina pri čemu je linker dovoljno dug da omogući lancu proteina da se preokrene i formira monovalentno mesto za vezivanje antigena (videti, npr, Bird et al., 1988, Science 242:423-26 and Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83). Diatela su bivalentna antitela koja obuhvataju dva polipeptidna lanca, pri čemu svaki lanac polipeptida obuhvata VH i VL domene spojene linkerom koji je previše kratak da omogući uparivanje između dva domena na istom lancu, čime se omogućava da se svaki domen upari sa komplementarnim domen na drugom polipeptidnom lancu (videti, npr. Holliger et al 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48, and Poljak et al., 1994, Structure 2 1121-23) Ako su dva lanca polipeptida diatela identična, onda će diatelo koje nastaje iz njihovog uparivanja imati dva identična mesta za vezivanje antigena Lanci polipeptida imaju različite sekvence moje mogu da se koriste da se napravi diatelo sa dva različita mesta za vezivanje antigena Slično tome. triatela i tetratela su antitela koja obuhvataju tri ili četiri lanca polipeptida, respektivno. i formiraju tri i četiri mesta za vezivanje antigena, respektivno, koja mogu da budu ista ili različita

[0033]Regioni određivanja komplementarnosti (CDRs) i okvirni regioni (FR) datog antitela mogu da se identifikuju korišćenjem sistema opisanog od strane Kabat et al in Sequences of Proteins of Immunological Interesi, 5th Ed,, US Dept of Health and Human Services. PHS. NIH, NIH Publication no. 91-3242, 1991 Jedan ili više CDR može biti ugrađen u molekul bilo kovalentno ili nekovalentno da napravi protein za vezivanje antigena Protein za vezivanje antigena može da obuhvati jedan ili više CDR kao deo većeg lanca polipeptida, može kovalentno da poveće jedan ili više CDR na drugi lanac polipeptida, ili može da ugradi jedan ili više CDR nekovalentno CDR omogućavaju da se protein za vezivanje antigena specifično veže na određeni antigen od interesa

[0034]Protein za vezivanje antigena može da ima jedno ili više mesta za vezivanje Ako postoji više od jednog mesta za vezivanje,mesta za vezivanje mogu biti identična jedno drugom ili mogu biti drugačija. Na primer, imunoglobulin koji se prirodno javlja ima dva identična mesta za vezivanje, dok "bispecifično" ili "bifunkcionalno" antitelo ima dva različita mesta za vezivanje[0035]Pojam "ljudsko antitelo," se takođe odnosi na "potpuno ljudsko antitelo." obuhvata sva antitela koja imajuu jedan ili više promenljivih ili konstantnih regiona izvedenih iz sekvenci ljudskog imunoglobulina U jednom izvođenju, svi promenljivi i konstantni domeni su izvedeni iz sekvenci ljudskog imunoglobulina (potpuno ljudsko antitelo). Ova antitela mogu da budu pripremljena na različite načine, čiji su primeri opisani dole, uključujući ptem imunizacije sa antigenom od interesa miš koji je genetski modifikovan da ispolji antitela izvedena iz ljudskih gena za kodiraje teškog i/ili lakog lanca.

[0036]Humanizovano antitelo ima sekvencu koja se razlikuje od sekvence antitela izvedenog iz neljudskih vrsta dodavanjem jedne ili više supstitucija, delecija, i/ili dodavanja amino kiselien. tako da je manje verovatno da će humanizovano antitelo da izazove odgovor imunog sistema, i/ili izaziva manje ozbiljan odgovor imunog sistema, u poređenju sa antitelom ne ljudskih vrsta kada se primeni ljudskom subjektu U jednom izvođenju, izvesne amino kiseline u okvirnim i konstantnim domenima teškog i/ili lakog lanca antitela nehumanizovanih vrsta se mutira da proizvede humanizovano antitelo U drugom izvođenju, konstantni domeni iz ljudskog antiela se spoje u promenljive đomen(e) neljudskih vrsta. U drugom izvođenju, jedan ili više ostataka amino kiseline u jednoj ili više CDR sekvenci neljudskog antitela se menja da se smanji verovatnoća imunogenosti neljudskog antitela kada se primeni na ljudskom subjektu, pri čemu promenjeni ostaci amino kiseline ili nisu od ključnog značaja za imunospecifično vezivanje antitela na njegov antigen, ili promene na sekvenci amino kiseline koje se rade su konzervativne promene. tako da vezivanje humanizovanog antitela na antigen nije značajno gore od vezivanja neljudskog antitela na antigen Primeri kako da se naprave humanizovana antitela mogu da budu pronađeni u američkim patentima br U.S Pat Nos. 6,054,297. 5,386,152 i 5,877,293.

[0037]Pojam "himerno antitelo" se odnosi na antitelo koje sadrži jedn ili više regiona od jednog antitela i jedan ili više regiona od jednog ili više drugih antitela U jednom izvođenju, jedan ili više CDR se izvodi iz ljudskog antitela protiv aktivina A U drugom izvođenju, jedan ili više CDR se izvodi iz ljudskog antitela protiv aktivina A U drugom izvođenju, CDR iz više od jednom ljudskog antitela protiv aktivina A se meša i poklapa u himernom antitelu. Na primer. himerno antielo može da obuvhati CDR1 iz lakog lanca prvog ljudskog antitela protiv aktivina A, CDR2 i CDRS iz lakog lanca drugog ljudskog anti-aktivin A antitela, i CDR iz teškog lanca iz trećeg antitela protiv aktivina A Dalje, okvirni regioni mogu da budu izvedeni iz jednog od istih antitela protiv aktivina A iz jednog ili više različitih antitela, kao što je ljudsko antitelo. ili iz humanizovanog antitela U jednom od pnmera himernog antitela, deo teškog i/ili lakog lanca je identičan sa, homologan sa, ili izveden iz antitela iz određenih vrsta ili pripada određenoj klasi ili potklasi antitela, pri čemu preostali lan(a)c(i) jeste/jesu identični sa, homologni sa, ili izvedeni iz antitela iz drugih vrsta ili pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela Takođe su obuhvaćeni fragmenti takvih antitela koji ispoljavaju željenu biološku aktivnost (t.j , sposobnost da se specifično veže aktivin A).

[0038]Fragmenti ili analozi antitela mogu lako pripremiti prosečni stručnjaci u ovoj oblasti pridržavajući se pouka iz ove specifikacije i koristeći tehnike dobro poznate u ovoj oblasti nauke. Preporučeni amino i karboksi završeci fragmenata ili analoga se javljaju blizu granica funkcionalnih domena. Strukturni i funkcionalni domeni mogu biti identifikovam poređenjem podataka sekvene nukleotida i/ili amino kiseline sa javnim ili privatnim bazama podataka sekvenci. Kompjutenzovane metode poređenja moguće je koristiti da se identifikuju motivi sekvence ili prognozirani domeni konformacije proteina koje se javljaju kod drugih proteina poznate strukture i/ili funkcije Metodi za identifikovanje sekvenci proteina koji se preokrenu u poznatu trodimenzionalnu strukturu su poznate. Videti, npr., Bowie et al.. 1991. Science 253:164

[0039]Pored toga, antitela specifična za antigen (t / aktivin A specifična) mogu da budu proizvedena metodama poznatim u ovoj oblasti korišćenjem specifičnog VL ili VH domena da se snima biblioteka komplementarnog promenljivog domena. Takvi postupci proizvodnje antitela poznati u ovoj oblasti Na primer, fragmenti antitela spojeni na drugi protein, kao što je manji protein obloge, može da se koristi da se obogati fag sa antigen. Zatim, koriščenje nausmične kombinatorne biblioteke preraspoređenih teških (VH) i laki (VL) lanci iz miševa imunih na antigen (npr aktivin A), različite biblioteke fragmenata antitela se prikažu na površini faga. Ove biblioteke mogu da budu snimljene za komplementarne promenljive domene, i domene prečišćene, na primer, stub afiniteta Videti Clackson et al.. Nature, V 352 pp. 624-628 (1991).

[0040]Na drugom pnmeru, pojedinačni VL ili VH lanci iz antitela (t.j aktivin A antitelo) može da se koristi za pretragu za druge VH ili VL lance koji bi mogli da formiraju fragmente za vezivanje antigena (ili Fab), iste specifičnosti- Dakle, nasumične kombinacije Ig gena VH i VL lanca može da ispolji kao fragmente vezivanja antigena u biblioteci baktenofaga (kao što je fd ili lambda fag). Na primer. kombmatorna biblioteka može da se genenše korišćenjem biblioteke roditeljskog VL ili VH lanca kombinovane sa bibliotekama specifičnim za vezivanje antigena VL ih VH lanca, resprektivno, Kombinatorne biblioteke mogu zatim da se skeniraju standardnim tehnikama, na pnmer korišćenjem radioaktivno označene sonde (kao što je radioaktivno označen aktivin A). Videti, na primer. Portolano et al., J- Immunol. V. 150 (3) pp. 880-887 (1993).

[0041]"CDR transplantirano antitelo" je antitelo koje obuhvata jedan ili više CDR izvedenih iz antitela određene vrste ili izotim i okvir drugog antitela iste ili različite vrste ili izotopa.

[0042]"Višestruko specifično antitelo" je antitelo koje prepoznaje više od jednog epitopa na jednom ili više antigena. A podklasa ovog tipa antitela je "bi-specifično antielo" koje prepoznaje dva đistinktivna epitopa na istim ili različitim antigenima.

[0043]"Domen za vezivanje antigena," "region za vezivanje antigena." ili "mesto za vezivanje antigena" je deo proteina za vezivanje antigena koji obuhvata ostatke amino kiseline (ili druge delove) koji inerreaguju sa antigenom i doprinose specifičnosti proteina za vezivanje antigena afiniteta za taj antigen. Za antitelo koje se specifično vezuje na njegov antigen, ovo će obuhvatiti barem deo barem jednog od CDR domena.

[0044]"Epitop" je deo molekula koji je vezan pomoću proteina za vezivanje antigena (npr pomoću antitela). Epitop može da obuhvati nedodirne delove molekula (npr u polipeptidu. ostacima amino kiseline koji nisu dodirni u primarnoj sekvenci tog polipeptida već, u kontekstu tercijarne i kvaternarne strukture polipeptida, su dovoljno blizu jedno drugom da se vežu na protein za vezivanje antigena), i obuhvata navedene amino kiseline krajnje sekvence Na primer, sekvenca polipeptida R13-Y39 obuhvata amino kiseline R13, i Y39, kao i amino kiseline koje se pronađu između R13 i Y39 u toj sekvenci. U izvođenjima u kojima epitop obuhvata nedodirne delove molekula, sekvence će biti sa tim u skladu navedene

[0045]"Procenat identičnosti" dve sekvence polinukleotida ili dva polipeptida se određuje poređenjem sekvenci korišćenjem GAP kompjuterskog programa (deo GCG VVisconsin Package verzija 10.3 (Accelrvs, San Diego, CA)) korišćenjem njegovih zadatih parametara.

[0046]Pojmovi "polinukleotid," "oligonukleotid" i "nukleinka kiselina" se koriste ravnopravno u ćelom tekstu i obuhvataju DNK molekule (npr, kDNK ili genonsku DNK), RNK molekule (npr , iRNK), analoge DNK ili RNK generisane korišćenjem analoga nukleotida (npr, nukleinske kiseline peptida i analoge nukleotida koji se ne javljaju prirodno) i njihove hibnde Molekul nukleinske kiseline može da bude jednolančani ili dvolančani.

[0047]Moleuili N nukleinske kiseline mogu da obuhvate iščitavanje otvorenog dodirnog okvira koji kodira antitelo, ili fragment prema ovom pronalasku.

[0048]Dva jednolančana polinukleotida su "komplementarni" jedan drugom ako njihove sekvence mogu da budu poravnate pri neparalelnoj orijentaciji tako da svaki nukleotid u jednom polinukleotidu jeste suprotan njegovom komplementarnom nukleotidu u drugom polinukleotidu, bez uvođenja perioda (gaps), i vez neuparenih nukleotida na 5<!>ili 3" kraju bilo koje sekvence Polinukleotid je "komplementaran" drugom polinukleotidu ako dva polinukleotida mogu da se hibridizuju jedan na drugi pod umereno strogim uslovima Dakle, polinukleotid može da bude komplementaran drugom polinukleotidu a da ne bude njegov komplement.

[0049]"Vektor" je nuklemska kiselina koja može da se koristi da se uvede druga nukleinska kiselina povezana na njega u ćeliju. Jedan tip vektora je "plazmid," koji se odnosi na linearni ili kružni DNK molekul sa dva lanca u koji je moguće vezati dodatne segmente nukleinske kiseline Još jedan tip vektora je virusni vektor (npr, replikacijom ošteženi retrovirusi. adenovirusi i adenopovezani virusi), pri čemu je moguće uvesti dodatne DNK segmente u virusni genom Izvesni vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćinu u koju mogu biti uvedeni (npr . bakterijski vektori koji obuvhataju bakterijsko poreklo replikacije i epizomm vektori sisara). Drugi vektori (npr , neepizomni vektori sisara) se integrišu u genom ćelije domaćina posle uvođenja u ćeliju domaćina, i time se umnožavaju duž genoma domaćina "Vektor ekspresije" je tip vektora koji može da usmeri ispoljavanje izabranog polinukleotida

[0050]Sekvenca nukleotida je "operativno povezana" na regulatornu sekvencu ako regulatorna sekvenca utiče na ispoljavanje (npr., nivo, izbor momenta, ili lokalizacija ispoljavanja) sekvence nukleotida. "Regulatoma sekvenca" je nukleinska kiselian koja utiče na ispoljavanje (npr. nivo, izbor momenta, ili lokalizaciju ispoljavanja) nukleinske kiselien na koju je operativno povezana. Regulatoma sekvenca može, na primer, da svoje efekte ispolji direktno na regulisanu nukleinsku kisleinu, ili putem delovanja jednog ili više drugih molekula (npr.. polipeptide koji se vezuju na regulatornu sekvencu i/ili nukleinsku kiselinu) Primeri regulatorne sekvence obuhvataju promotrere, pojačavače i druge elemente regulacije ekspresije (npr, signale poliadenilacije). Dalji primeri regulatornih sekvenci su opisani u, na primer, Goeddel, 1990, Gene Expression Technologv: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA and Baron et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-06

[0051]"Ćelija domaćin je ćelija koja može da se koristi da ispolji nukleinsku kiselinu, npr, nukleinsku kiselinu prema ovom pronalasku. Ćelija domaćin može da bude prokariot, na primer. E coli, ili može da bude eukariot, na primer, jednoćelijski eukariot (npr. kvasac ili druge gljive), ćelija biljke (npr. duvan ili ćelija biljke paradajza), ćelija životinje (npr, ćeljia čoveka, ćelija majmuna, ćelija hrčka, ćelija pacova, ćelija miša, ili ćelija insekta) ili hibridoma. Primer 3 ovde je opisao upotrebu CS-9 ćelija Primeri drugih ćelija domaćina obuhvataju COS-7 liniju ćelija bubrega majmuna (ATCC CRL 1651)

(videti Gluzman et al,, 1981. Cell 23:175), L ćelije, C127 ćelije. 3T3 ćelije (ATCC CCL 163). ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) ili njihove derivate kao što je Veggie CHO i srodne linije ćelija koje rastu u podlozi bez seruma (videti Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31), Hela ćelije, BHK (ATCC CRL 10) linije ćelije, CV1/EBNA linija ćelije izvedena iz linije ćelije bubrega afričkog zelenom majmuna CV1 (ATCC CCL 70) (videti McMahan et al.. 1991, EMBO J 10:2821), ćelije bubrega ljudskog embriona kao što su 293, 293 EBNA ili MSR 293, ćelije ljudskog epiderma A431, ćelije Colo205 čoveka, druge transformisane linije ćelija primata, normalne diploidne ćelije, sojevi ćelije izvedeni izin vitrokulture primarnog tkiva, primarnih eksplantata, HL- 60, U937, HaK ili Jurkat ćelije. Najčešće, ćelija domaćin je kultivisana ćelija koju je moguće transformisati ili transfektovati nukleinskom kiselinom koja kodira polipeptid, koja može zatim da bude ispoljena u ćeliji domaćinu Fraza "rekombinantna ćelija domaćin" može da se koristi da označi ćeliju domaćina koja je transformisana ili transfektovana sa nukleinskom kiselinom koju treba ispoljiti Ćelija domaćin može takođe da bude ćelija koja obuhvata nukleinsku kiselinu ali ne ispoljava je na željenom nivou osim ako se regulatoma sekvenca uvodi u ćeliju domaćina tako da postaje operativno povezana sa nukleinskom kiselinom. Jasno je da se pojam ćelija domaćin odnosi ne samo na određenu ćeliju subjekta već i na progen ili potencijalni progen takve ćelije. Zato što može doći do izvesnih modifikacija u generacijama koje dolaze usled, npr mutacije ikolnog uticaja. takav progen ne može, zapravo, da bude identičan roditeljskoj ćeliji, ali je ipak obuhvaćen u okviru tog pojma kao se ovde koristi

[0052]Antitela u skladu sa ovim pronalaskom inhibiraju biološku aktivnost aktivina A Na primer, oni ublažavaju kaheziju, i ova aktivnost može biti prisutna kada je antitelo u potpunosti ljudsko, kao što je potpuno ljudsko antitelo.

[0053]Antitelo ne treba potpuno da inhibira aktivnost izazvanu aktivnom A da se pronađe upotreba ovom pronalasku, umesto toga, i antitela koja smanjuju određenu aktivnost aktivina A se uzimaju u obzir za upotrebu (Ovde iznete diskusije određenih mehanizama aktivnosti za proteine za vezivanje antigena za vezivanje aktivina A za lečenje određenih bolesti su samo ilustrativne, i metode koje su ovde predstavljene nisu, prema tome, obavezujuće.)

[0054]Ovaj opis daje proteine za vezivanje antigena koji obuhvataju promenljivi region lakog lanca izabran iz grupe koja se sastoji od A1-A14 ili promenljivog regiona teškog lanca izabranog iz grupe koja se sastoji od A1-A14. i fragmenata, derivativa. muteina. i njihovih varijanti Takav protein za vezivanje antigena može da se označi korišćenjem nomenklature "LxHy". pri čemu "x" odgovara broju promenljivog regiona lakog lanca i "y" odgovara borju promenljivog regiona teškog lanca kako su označeni u sekvencama dole u tekstu To znači, na primer, da "A1HC" označava promenlivi region teškog lanca antitela A1: "A1LC" označava promenljivi region lakog lanca antitela A1. i tako dalje. Uopštenije rečeno, "L2H1" se odnosi na protein za vezivanje antigena sa promenljivim regionom lakog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiseline iz L2 i promenljivi region teškog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiseline iz H1. Pojašnjenja radi. svi opsezi označeni barem dva člana grupe obuhvataju sve članove grupe između i uključujući krajnje članove opsega članove krajnjeg opsega Dakle, opseg grupe A1-A14. obuhvata sve članove između A1 i A14, kao i same članove A1 i A14 Opseg grupe A4-A6 obuhvata članove A4, A5, i A6, itd

[0055]Takođe su prikazane dole lokacije CDR. ili regiona utvrđivanja komplementarnosti (osenčem i podvčeni) koji kreiraju deo mesta za vezivanje antigena, pri čemu su okvirni regioni (FRs) interventni segmenti ovih sekvenci promenljivog domena. U oba promenljiva regiona lakog lanca i promenljiva regiona teškog lanca postoje tri CDR (CDR 1-3) i četiri FR (FR 1-4) CDR regioni svakog lakog i teškog lanca se takođe grupišu tipom antitela (A1. A2. A3. itd.) Proteini za vezivanje antigena mogu da obuhvate, na primer, proteine za vezivanje antigena koji imaju kombinaciju promenljivih domena lakog lanca i teškog lanca izabranih iz grupe kombinacija koje obuhvataju L1H1 (antitelo A1), L2H2 (antitelo A2), L3H3 (antitelo A3), L4H4 [antitelo A4), L5H5 (antitelo A5). L6H6 (antitelo A6), L7H7 (antitelo A7), L8H8 (antitelo A8) L9H9 (antitelo A9), L10H10 (antitelo A10). L11H11 (antitelo A11). L12H12 (antitelo A12), L13H13 (antitelo A13), i L14H14 (antitelo A14). A1- A14 antitelo polinukleotida

promenljivog regiona teškog i lakog lanca ( takođe se p ominju ovde i kao H1- H14 i L1- L14),

A 1 HC

[0056]

A1 LC

[0057]

A2 HC

[0058]

A2LC

[0059]

A3 HC

[0060]

A3 LC

[0061]

A4 HC

[0062]

A4LC

[0063]

A5 HC

[0064]

A5 LC

[0065]

A6 HC

[0066]

A6LC

[0067]

A7 HC

[0068]

A7LC

[0069]

A8 HC

[0070]

A8LC

[0071]

A9 HC

[0072]

A9LC

[0073]

A10 HC

[0074]

A10 LC

[0075]

A11 HC

[0076]

A11 LC

[0077]

A12 HL

[0078]

A12 LC

[0079]

A13 HC

[0080]

A13 LC

[0081]

A14HC

[0082]

A14LC

[0083]

A1

[0084]

A2

[0085]

A3

[0086]

A4

[0087]

A5

[0088]

A6

[0089]

A7

[0090]

A8

[0091]

A9

[0092]

A10

[0093]

A11

[0094]

A12

[0095]

A13

[0096]

A14

[0097]

A1

[0098]

A2

[0099]

A3

[0100]

A4

[0101]

A5

[0102]

A6

[0103]

A7

[0104]

A8

[0105]

A9

[0106]

A10

[0107]

A11

[0108]

A12

[0109]

A13

[0110]

A14

[0111]

[0112]CDR konsenzus sekvence za antitela A1-A14.

X1j e ostatak arginina ili ostatak lizina,

X2je ostatak leucina ili ostatak izoleucina, X3je ostatak histidina ili ostatak tirozina, X4 je ostatak treonina ili ostatak serina, X5je ostatak glicina ili ostatak asparagina. Xg je ostatak tirozina ili ostatak asparagina,Xjje ostatak asparagina ili ostatak lizina, X8je ostatak lizina ili nema ostatka,

Xg je ostatak aspartata ili ostatak valina

X10je ostatak serina ili je ostatak,

Xn je ostatak serina ili je ostatak glicina,

Xi2 je ostatak serina ili je ostatak arginina,,

X13 je ostatak tirozina, ostatak aspartata, ili je ostatak asparagina, X14je ostatak aspartata, je ostatak vanilla ili je ostatak glicerina.

X15 je ostatak glutamata ili je ostatak aspartata, Xie je ostatak triptofana ili je ostatak leucina, Xt7je ostatak glutamata ili je ostatak aspartata, X-|8 je ostatak tirozina ili je ostatak fenilalanina, X-|g je ostatak alanina ili je ostatak valina,

X20 je ostatak cisteina ili ostatak fenilalanina.

X40 je sotatak alanina, triptofana ili leucina,

X4, je ostatak treonina, ili je ostatak alanina, ili je ostatak glicina, X42je ostatak serina, ostatak metionina, ili je ostatak fenilalanina. X43je ostatak leucina ili je ostatak arginina.

X44je ostatak glutamina. ostatak glutamata, ili ostatak alanina.

X45 je sotatak glutamine, ostaak leucina ili histidina,

X46 je ostatak treonina, ostatak asparagina, ili je ostatak serina

^82je ostatak prolina ili ostatak treonina., Xe3 je ostatak fenilalanina ili ostatak triptofana

X73 je ostatak metionina, ostatak glutamina, ili ostatak arginina.

X74je ostatak alanina, ostatak tirozina, ili ostatak glutamina, ili ostatak serina, X75 je ostatak leucina, ostatak tirozina, ili ostatak asparagina,

X76 je ostatak glutamina, ostatak serina, ili ostatak treonina.Xyyje ostatak treonina, ostatak tirozina, ili ostatak izoleucina,

?7s je ostatak prolina ili ostatak serina.

X,9 je ostatak cisteina, ostatak triptofana, ostatak leucina, ili ostatak prolina, X30 je ostatak serina ili ostatak treonina

X21je ostatak izoleucina ili ostatak fenilalanina

X22je ostatak asparagin ili ostatak serina

X3 je ostatak serina ili ostatak alanina,

X24je ostatak glicina ili nema ostatka

je ostatak glicina ili nema ostatka

X26je ostatak fenilalanina ili ostatak tirozina

KONSENSUS: G XzrX2eFX29XMYX31X32X33 (SEQ ID NO 139)

X27 je ostatak tirozina ili ostatak fenilalanina,

X2eje ostatak treonina ili ostatak serina,

X2$je ostatak treonina, ostatak serina ili ostatak izoleucina,

X30je ostatak glicina ili ostatak serina.,

X3ije ostatak tirozina, ostatak glicina ili ostatak triptofana,

X32 je ostatak izoleucina ili ostatak metionina,,

X33je ostatak histidina ili ostatak glicina.

X34 je ostatak tirozina ili ostatak fenilalanina,

X35je ostatak treonina ili ostatak serina X3(; je ostatak serina ili ostatak alanina,

X37 je ostatak glicina ili ostatak triptofana,

X38 je ostatak leucina, ostatak metionina, ili ostatak izoleucina.

X39 je ostatak serina ili ostatak histidina

X47je ostatak tirozin ili ostatak glutamata,

X4Bje ostatak serina, ostatak tirozina, ili ostatak asparagina. X4g je ostatak tirozina ili ostatak histidina,

Xsoje ostatak serina ili ostatak glicina,

X5, je ostatak tirozin ili ostatak asparagina,

X52je ostatak serina ili ostatak arginina

X53 je ostatak asparagina ili ostatak valina,,

X54je ostatak triptofana ili ostatak lizina,

X55je ostatak tirozina ili ostatak glutamina,.

X56je ostatak asparagina, ostatak glutamata. ostatak senna , XS7je ostatak lizina ili ostatak glutamata

X58 je ostatak histidina ili ostatak tirozina,,

X59je ostatak alanina ili ostatak valina

X6o je ostatak triptofana ili ostatak izoleucina,

X61je ostatak asparagina. ostatak izoleucina, ostatak serina, ili ostatak tirozina, X62 je ostatak prolina ili ostatak alanina.

<X>63jeostatak asparagina, ostatak tirozina, ili ostatak glicina, X64je ostatak serina, ostatak asparagina. ili ostatak aspartata,

<*>ssje ostatak glicina ili ostatak serina,

X66 je ostatak glicina, ostatak asparagina, ili ostatak aspartata, X67je ostatak asparagina, ili ostatak arginina,

X68je ostatak tirozina ili ostatak serina,

X69 je ostatak alanina ili ostatak serina,

X/oje ostatak glutamina ili ostatak prolina.

X71je ostatak lizina ili ostatak serina,

X72je ostatak fenilalanina ili ostatak leucina

KONSENSUS: X87X8SX89Xg0X9lX92X9;iXcMFDY (SEQ ID NO 187)

X87 je ostatak valina ili nema ostatka.,

XS8je ostatak glutamina ili nema ostatka,,

XS9 je ostatak aspartata, ostatak triptofana. ili nema ostatka,

X90je ostatak serina, ostatak leucina, ili nema ostatka ,

X91je ostatak izoleucina, ostatak glutamata, ili ostatak glutamina,.

X92je ostatak alanina, ostatak leucina, ili ostatak glicina,.

X93je ostatak alanina ili ostatak leucina,

X94 je ostatak prolina, ostatak tirozina, ili ostatak glicina

*95 je ostatak aspartata ili nema ostatka.-X9Sje ostatak glutamina ili nema ostatka, X97 je ostatak aspartata ili ostatak alanina, X9eje ostatak tirozina ili ostatak glicina,

X99je ostatak serina ili ostatak tirozina, X100 je ostatak serina ili ostatak arginina, X10, je ostatak fenilalanina ili ili nema ostatka, Xio2je ostatak glicina ili ostatak aspartata.

Xio3 je ostatak histidina ili ostatak prolina

XiQ4 je ostatak glicina ili nema ostatka X105je ostatak serina, ostatak glutamata, ili nema ostatka,

Xi06je ostatak arginina, ostatak serina, ili nema ostatka.

X107je ostatak aspartata, ostatak asparagina. ostatak serina, ili ostatak glutamina.

X108je ostatak serina, ostatak arginina. ili ostatak triptofana,

X109je ostatak glicina, ostatak aspartata, ostatak asparagina, ostatak tirozina, ili ostatak leucina Xi,0je ostatak serina, ostatak glicina, ostatak aspartata, ili nema ostatka.

Xinje ostatak serina, ostatak valina, ostatak asparagina, ili je ostatak tirozina,

X1!2je ostatak serina, ostatak asparagina, ostatak tirozina, ili je ostatak histidina

Xi)3 je ostatak triptofana, ostatak tirozina, ili ostatak glutamina.

x'io je ostatak histidina, ostatak aspartata, ostatak tirosina, ili je bez ostatka.

Xn5je ostatak fenilalanina, ostatak alanina. ili je ostatak glicina

X,ieje ostatak aspartata, ostatak fenilalanina, ostatak leucina. ili je ostatak metionina X!17 je ostatak tirozina. ili ostatak aspartata,

X, 1S je ostatak izoleucina, ostatak valina, ili je bez ostatka

[0113]CDR laki lanci iz antitela A1-A14 su prikazani dole u Tabeli 1. i CDR teškog lanca antitela A1-A14 su prikazani dole u Tabeli 2

[0114]Sekvence nukleotida A1-A14. sekvenci amino kiseline A1-A14, mogu biti promenjene, na primer, proizvoljnom mutagenezom ili mutagenezom usmerenom na mesto (npr, mutagenezom specifinom za mesto usmerenu diktiranu oligonukleotidom) da se kreira izmenjeni polinukleotid koji obuhvata jednu ili više određenih supstitucija nukleotida. delecija. ili umetaka u poređenju sa nemutiranim polinukleotidom. Primeri tehnika za pravljenje takivh izmena su opisani kod VValderet al., 1986, Gene 42:133; Bauer et al 1985. Gene 37:73: Craik BioTechmques. January 1985. 12-19; Smith et al., 1981, Genetic Engineering Pnnciples and Methods. Plenum Press, and U S Patent Nos. 4,518,584 and 4.737.462 Ove i druge metode moguće je koristiti da se naprave, na primer. derivati antitela protiv aktivina A koji imaju željeno svojstvo, na primer, povećam afinitet, izraženu sklonost, ili specifičnost za aktivin A, povećanu aktivnost ili stabilnostin vivoiliin vitro,ili samnjena neželjena dejstvain vivou poređenju sa nederivatizovanim antitelom

[0115]Drugi derivati antitela protiv aktivina A mogu da obuhvate kovalentne ili agregativne konjugate antitela protiv aktivina A, ili njihove fragmente, sa drugim proteinima ili polipeptidima, kao što je ispoljavanje rekombmantne fuzije proteini obuhvataju heterologne polipeptide spojene na N terminus ili C terminus polipeptida antitela protiv aktivina A Na primer, konjugovam peptid može da bude heterologni signal (ili lider) polipeptid, npr, lider alfa faktora kvasca, ili peptid kao što je oznaka epitopa. Proteini fuzije koji sadrže protein za vezivanje antigena mogu da obuhvate peptide dodate da se olakša prečišćavanje ili identifikacija proteina za vezivanje antigena( npr,poli-His). Protein za vezivanje antigena može takođe da se poveže na FLAG peptid Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (ID BR. SEK 226) kako su opisali Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988, and U.S, Patent 5,011,912 FLAG peptid je visoko antigenski i obezbeđuje epitop reverzibilno vezan pomoću specifičnog monoklonalnog antitela (mAb). što omogućava brzo izvođenje ogleda i olakšava prečišćavanje ispoljenog rekombinantnog proteina Reagensi korisni za pripremanje proteina fuzije u kojima je FLAG peptid spojen na dati polipeptid su komercijalno dostupni (Sigma, St Louis, MO).

[0116]Dimer koji obuhvata dva proteina fuzije može da se kreira spajanjem fragmenta za vezivanje aktivina A antitela protiv aktivin A na Fc region nekog antitela Dimer može da bude urađen, na primer, ubacivanjem fuzije gena koja kodira protein fuzije u odgovarajući vektor ekspresije, koji ispoljava fuziju gena u ćelijama domaćina transformisani sa rekombmantnim vektorom ekspresije, i omogućava ispoljeni protein fuzije da skupi dosta molekula sličnih antitelu, posle čega međulančane veze disulfida formiraju između Fc dela da bi se dobio dimer kao prinos.

[0117]Pojam "Fc polipeptid" kako se ovde koristi obuhvata nativne i mutein oblike polipeptida izvedene iz Fc regiona antitela. Zarubljeni oblici takvih polipeptida sadrže region spoja koji unapređuje dimerizaciju su takođe obuhvaćeni Proteini fuzije obuhvataju Fc delove (i iz njih formirani oligomeri) nude kao prednost lako prečišćavanje afinitetnom hromatografijom iznad kolona Proteina A ili Proteina G

[0118]Jedan pogodan Fc polipeptid, opisan u PCT prijavi WO 93/10151, je jednolančani polipeptid koji se pruža od regiona spoja N završetka do prirodnog C završetka Fc regiona ljudskog lgG1 antitela Još jedan koristan Fc polipeptid je Fc mutein opisan u američkom patentu br U.S. Patent 5.457,035 i u radu Baum et al, 1994. EMBO J 13 3992-4001 Sekvenca amino kiselien ovog muteina je identična sekvenci nativnog Fc predstavljenoj u WO 93/10151. izuzev što je amino kiselina 19 promenjena iz Leu u Ala, amino kiselina 20 je promenjena iz Leu u Glu. i amino kiselina 22 je

promenjena iz Gly u Ala. Ovaj mutein ispoljava smanjeni afinitet za Fc receptore

[0119]U drugim izvođenjima, promenljivi deo teškog i/ili lakog lanca antitela protiv aktivina A može da bude supstituisan za promenljivi deo teškog i/ili iakog lanca antitela

[0120]Ovaj pronalazak daje antitela koja se mešaju sa vezivanjem aktivina A na receptor aktivina A. Takva antitela mogu da se skemraju u ustaljenim ogledima za sposobnost da se mešaju sa vezivanjem aktivina A na receptor aktivina A Primeri pogodnih ogleda su ogledi koji testiraju proteine za vezivanje antigena za njihovu sposobnost da mhibiraju vezivanje aktivina A na ćelije koje ispoljavaju receptor aktivina A. ili koje testiraju proteine za vezivanje antigena na njihovu sposobnost da smanji biološki ili ćelijski odgovor koji daje kao rezultat vezivanje aktivina A receptore aktivina A na površini ćelije. Na primer, kako je prikazano na Slici 10. kao i na pnmerima dole. antitela mogu da se snimaju prema njihovoj sposobnosti da se vežu na površine imobilizovanog antitela (aktivin A i/ili aktivin B)

[0121]Fragmenti za vezivanje antigena prema ovom pronalasku mogu da budu proizvedeni ustaljenim tehnikama. Primeri takvih fragmenata obuhvataju. ali se ne ograničavaju na, Fab i F(ab')2 fragmente. Takođe, razmatraju se fragmenti antitela proizvedeni tehnikama genetskog inženjeringa.

[0122]Dodatna izvođenja obuhvataju himerna antitela. npr., humanizovane verzije neljudskih (npr., mišjih) monoklonalnih antitela. Takva humanizovana antitela mogu da budu pripremljena poznatim tehnikama, i nude prednost smanjene imunogenosti kada se antitela primene na ljudima. U jednom izvođenju, humanizovano monokono antitelo obuhvata promenljivi domen mišjeg antitela (ili sve ili deo njegovog mesta za vezivanje antigena) i konstantni domen izveden iz ljudskog antitela Alternativno, humanizovani fragment antiela može da obuvhati mesto za vezivanje antigena mišjeg monoklonalnog antitela i fragment promenljivog domena (kome nedostaje mesto za vezivanje antigena) izvedeno iz ljudskog antitela. Postupci za proizvodnju himernih i dodatno projektovamh monoklonalnih antitela obuhvataju one koji su opisani kod Riechmann et al., 1988. Nature 332:323, Lili et al., 1987, Proc Nat Acad Sci USA 84 3439, Larnck et al..1989. Bio/Technology 7:934, and VVinter et al., 1993, TIPS 14:139 U jednom izvođenju, himerno antitelo je CDR transplantirano antitelo antitelo Tehnike za humanizovanje antitela se razmatraju u. npr., U S Pat br.s 5,869.619, 5,225,539. 5,821,337 5,859,205, 6,881,557, Padlan et al., 1995, FASEB J. 9 133-39, and Tamura et al., 2000, J. Immunol 164 1432-41

[0123]Razvijeni su postupci za generisanje ljudskog ili delimićno ljudskih antitela kod životinja koje nisu ljudi. Na primer, miševi kod kojih je inaktiviran jedan ili više endogenih gena imunoglobulina različitim sredstvima su prirpemljeni. Geni ljudskog imunoglobulina su uvedeni u miševe da zamene inaktivirane mišje gene. Antitela proizvedena u životinji obuhvataju ljudske polipeptidne lance imunoglobulina kodirane ljudskim genetskim materijalom uvedenim u tu životinju U jednom izvođenju, životinja koja nije čovek, kao što je transgenski miš, je imunizovana sa polipeptidom aktivina A. tako da su antitela usmerena protiv polipeptida aktivna A generisana u toj životinji

[0124]Primer pogodnog imunogena je rastvorljivi ljudski aktivin A. kao što je polipeptid koji obuhvata vanćelijski domen proteina ID BR SEK:225, ili drugi imunogeni fragment proteina iz ID BR SEK225 Primeri tehnika za proizvodnju i upotrebu transgenskih životinja za proizvodnju ljudskih ili delimićno ljudskih antitela su opisani u američkim patentima i radovima U S Patents 5.814,318, 5,569,825. i 5,545,806, Daviš et al., 2003. Production of human antibodies from transgenic mice in Lo, ed Antibodv Engineering: Methods and Protocols, Humana Press. NJ:191-200. Kellermann et al., 2002, Curr Open Biotechnol. 13:593-97. Russel et al 2000, Infect Immun 68:1820-26. Gallo et al.. 2000, Eur J Immun. 30:534-40, Daviš et al., 1999 Cancer Metastasis Rev 18:421-25, Green, 1999, J Immunol Methods. 231 11-23, Jakobovits. 1998, Advanced Drug Deliverv Revievvs 31:33-42, Green etal , 1998. J Exp Med 188:483-95. 50 Jakobovits A, 1998, Exp Opin Invest Drugs 7:607-14, Tsuda et al., 1997, Genomics. 42 413-21, Mendez et al 1997, Nat Genet 15 146-56, Jakobovits, 1994, Curr Biol. 4:761-63, Arbones et al., 1994. Immunitv 1 247-60, Green et al.. 1994, Nat Genet. 7:13-21, Jakobovits et al., 1993, Nature. 362:255-58, Jakobovits et al., 1993. Proc Natl Acad Sci U S 90:2551-55. Chen, J , M. Trounstine, F VV. Alt, F Young, C. Kurahara, J. Lormg. D Huszar Inter'l Immunol 5 (1993): 647-656, Choi et al 1993, Nature Genetics 4 117-23. Fishwild et al., 1996 Nature Biotech 14: 845-51, Harding et al , 1995. Annals of the New York Academv of Sciences, Lonberg et al., 1994, Nature 368: 856-59. Lonberg, 1994 Transgenic Approaches to Human Monoclonal Antibodies in Handbook of Experimenta! Pharmacology 113: 49-101. Lonberg et al. 1995, Internal Review of lmmunology 13: 65-93. Neuberger, 1996, Nature Biotechnology 14: 826 Tavlor et al 1992, Nucleic Acids Res 20 6287-95, Taylor et al . 1994. Inter'l Immunol 6 579-91 Tomizuka et al., 1997, Nature Genetics 16 133-43. Tomizuka et al., 2000. Pro. NaflAcad. Sci. USA 97. 722-27, Tuaillon et al., 1993. Pro. NaflAcad Sci. USA 90: 3720-24. and Tuaillon et al., 1994 J.Immunol. 152; 2912-20

[0125]U drugom varijantnom rešenju, ovaj pronalazak obezbeđuje monoklonalnantitela koja se vezuju na aktivin A. Monoklonalnantitela mogu da se proizvode korišćenjem tehnika poznatih u ovoj oblasti, npr, imobilizovanjem ćelija slezme prikupljenih iz transgenske životinje posle završetka plana imunizacije. Ćelije slezine mogu da budu imortalizovane korišćenjem bilo koje u ovoj oblasti poznate tehnike, npr., njihovim spajanjem sa ćelijama mijeloma da se proizvedu hibndomi. Ćelije mijeloma za upotrebu u postupcima fuzije za proizvodnju hibndoma preporučljivo su one koje ne proizvode antitelo, imaju visoku efikasnost fuzije, i nedostatke enzima koje ih čine nesposobnim za rast izvesnih selektivnih podloga koje potpomažu rast samo željenih spojenih ćelija (hibridoma) Primeri pogodnih linija ćelija za upotrebu za fuzije miša obuhvataju Sp-20. P3-X63/Ag8. P3-X63-Ag8 653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14 FO, NSO/U, MPC-11. MPC11-X45-GTG 17 i S194/5XXO Bul; primeri linija ćelija korišćenih u fuzijama pacova obuhvataju R210 RCY3, Y3-Ag 1 2 3, IR983F i 4B210 Druge linije ćelija korisne za fuzije ćelije su U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 i UC729-6

[0126]U jednom izvođenju, linija ćelije hibridoma se proizvodi imunizovanjem životinje (npr . transgenska životinja koja ima sekvence imunoglobulina čoveka) sa imunogenom aktivina A, prikupljanje ćelija slezine iz imumzovane životinje, spajanjem prikupljenih ćelija slezine na liniju ćelije mijeloma, čime se genenšu ćelije hibridoma, uspostavljanje linija ćeije hibridoma iz ćelija hibridoma, i identifikovanje linije ćelija hibridoma koje proizvode antitelo koje vezuje polipeptid aktivna A Takve linije ćelije hibridoma, i monoklonalnantiela protiv aktivina A koje i proizvode, su obuhvaćenih ovim pronalaskom

[0127]Monoklonalnantitela izlučena linijom ćelije hibridoma mogu da budu prečišćena korišćenjem bilo koje tehnike poznate u ovoj oblasti. Hibndomi ili mAbs mogu još da budu skenirani da se utvrde mAbs sa određenim svojstvima, kao što je sposobnost da se blokira aktivnost izazvana aktivinom A Primeri takvih ekrana su dati na primerima dole.

[0128]Molekularna evolucija regiona utvrđivanja komplementarnosti (CDR) u ovom centru mesta za vezivanje antitela se takođe koristi da se izoluju antitela sa povećanim afinitetom, na primer. antitela koja imaju povećani afinitet za c-erbB-2. kao što su opisali Schier et al . 1996. J Mol Bio! 263:551 Slično tome. takve tehnike korisne za pripremanje antitela za aktivin A

[0129]Proteini za vezivanje antigena usmereni protiv aktivina A mogu da budu korišćeni, na primer u ogledima za detektovanje prisustva polipeptida aktivina A, biloin vitroiliin vivo.Proteini za vezivanje antigena takođe mogu da se koriste za prečišćavanje proteina aktivina A putem imunoafmitetne hromatografije Ti proteini za vezivanje antigena koji dodatno blokiraju vezivanje aktivina A mogu da se koriste da inhibiraju biološku aktivnost koja daje kao rezultat takvo vezivanje Blokiranje proteina za vezivanje antigena može da se koristi u metodama konšćenim u ovom pronalasku. Takvi proteini za vezivanje antigena koji funkcionišu kao antagonisti aktivina A mogu da se koriste za lećenje bilo kog stanja povezanog sa aktivinom A, uključujući ali ne ograničavajući se na kaheziju. U jednom izvođenju, monoklonalno protiv aktivn A antitelo kod čoveka je generisano postupcima obuhvata imunizaciju kod transgenskih miševa se koristi za lečenje takvih stanja

[0130]lako ljudska, delimićno ljudska, ili humanizovana antitela će biti pogodna za brojne pnmene, posebno ona koja obuhvataju primenu antitela ljudskom subjektu, drugi tipovi proteina za vezivanje antigena će biti pogodni za izvesne primene Neljudska antitela prema ovom pronalasku mogu da budu, na primer, izvedena iz bilo koje životinje koja proizvodi antitelo. kao što je miš, pacov, zec, koza, magarac, ili ne ljudski primat (kao što je majmun (npr , cvnomologous (laboratorijski naziv za makaki rakojeda) ili rezus makaki) ili čovekoliki majmun(npr, šimpanza)). Neljudska antitela prema ovom pronalasku mogu da se koriste, na primer. u in vitro i pnmenama zasnovanim na kulturi ćelija, ili bilo koja druga primena gde ne postoji odgovor imunog sistema na antitelo prema ovom pronalasku ne javlja, jeste značajan, može da se spreči, nije potencijalni problem, ili se ne želi. U jednom izvođenju, neljudsko antitelo prema ovom pronalasku se primenjuje subjektu koji nije čovek. U jednom izvođenju, neljudsko antielo ne izaziva odgovor imunog sistema kod subjekta koji nije čovek U drugom izvođenju, neljudsko antitelo je od iste vrste kao kod subjekta koji nije čovek, npr, mišje antitelo prema ovom pronalasku se primeni kao lek mišu. Antitelo iz određenih vrsta može da se napravi, na primer, imunizovanjem životinje iz te vrste sa željenim imunogenom (npr, rastvorljivi polipeptid aktivina A) ili korišćenje veštačkog sistema za genensanje antitela iz tih vrsta( npr.bakterijski ili na bazi faga zasnovan sistem za generisanje antitela određenih vrsta), ili pretvaranjem antitela iz jedne vrste u antitelo iz druge vrste zamenom, npr.. konstantnog regiona antitela sa konstantnim regionom iz drugih vrsta, ili zamenom jednog ili više ostataka amino kiseline ovog antitela tako da bliže liči sekvenci antitela iz drgih vrsta. U jednom izvođenju, ovo antitelo je himerno antitelo koje obuhvata sekvence amino kiseline izvedene iz antitela iz dve ili više vrsta

[0131] Proteineza vezivanje antigena moguće je pripremiti bilo kojom od standardnih tehnika. Na primer, oni mogu da budu prečišćeni iz ćelija koje ih prirodno ispoljavaju( npr..antitelo može da bude prečišećno iz hibridoma koji ga proizvodi), ili proizvedeno iz rekombinantnih sistema ekspresije, korišćenjem bilo koje tehnike poznate u ovoj oblasti. Videti. na primer. Monoclonal Antibodies, Hvbndomas: A New Dimension in Biological Analvses Kennet et al (eds.), Plenum Press, New York

(1980); and Antibodies: A Laboratorv Manual. Harlovv and Land (eds.). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY, (1988)

[0132]Bilo koji sistem ispoljavanja poznat u ovoj oblasti može da se koristi da se naprave rekombinantni polipeptidi prema ovom pronalasku Generalno, ćelije domaćini se transformišu sa rekombinantnim vektorom ispoljavanja koji obuhvata DNK koja kodira željeni polipeptid Među ćelijama domaćina koje mogu da se koriste su prokarioti. kvasac ili više eukariotske ćelije Prokarioti obuhvataju gram negativne ili gram pozitivne organizme na primerE. colt ili Bacilli.Više eukariotske ćelije obuhvataju ćelije insekata i utvrđene linije ćelije koje potiču od sisara. Primeri pogodnih linija ćelija domaćina sisara obuhvataju COS- 7 liniju ćelija bubrega majmuna (ATCC CRL 1651)

(Gluzman et al., 1981, Cell 23:175), L ćelije, 293 ćelije, C127 ćelije, 3T3 ćelije (ATCC CCL 163), ćelije jajnika kineskog hrćka(CHO), HeLa ćelije, BHK (ATCC CRL 10) linije ćelija, i CVI/EBNA linija ćelije izvedena iz CVI linije ćelija bubrega afričkog zelenog majmuna (ATCC CCL 70) kao što je opisano od strane McMahan et al.. 1991, EMBO J 10 2821 Odgovarajuće vektore kloniranja i ekspresije za upotrebu sa ćelijama domaćinima iz bakterija, gljiva, kvasca, i sisara su opisali Pouwels et al

(Cloning Vectors: A Laboratorv Manual, Elsevier, New York, 1985)

[0133]Transformisane ćelije mogu da budu kultivisane pod uslovima koji promovišu ispoljavanje polipeptida, i polipeptida oporavljenog ustaljenim postupcima prečišćavanja proteina Jedna takva procedura prečišćavanja obuhvata upotrebu afinitetne hromatografije, npr, preko matrice koja ima sve ili deo (npr., vanćelijski domen) aktivina A vezanog na njega. Polipeptidi koji se razmatraju za upotrebu ovde obuhvataju pretežno homogene rekombinantne polipeptide antitela protiv aktivina iz sisara koji su uglavnom oslobođeni kontaminirajućih endogenih materijala

[0134]Proteini za vezivanje antigena mogu da se pripreme, i skeniraju na željena svojstva, od strane bilo kog broja poznatih tehnika Izvesne tehnike obuhvataju izolovanje nukleinske kiseline koja kodira lanac polipeptida (ili njegov deo) proteina za vezivanje antigena od interesa (npr., antitelo protiv aktivina A protiv aktivina A antitelo). i mampulisanje nukleinskom kiselinom putem rekombinantne DNK tehnologije Nukleinska kiselina može da se spoji na drugu nukleinsku kiselinu od interesa, ili izmeni (npr, mutagenezom ili drugim ustaljenim tehnikama) da se doda, obriše ili zameni jedan ili više ostataka amino kiseline, na primer[0135]U jednom varijantnom rešenju, ovaj pronalazak obezbeđjuje fragmente za vezivanje antigena antitela protiv aktivina A prema ovom pronalasku. Takvi fragmenti mogu da obuhvate u celosti sekvence izvedene iz antitela Hi može da obuhvati dodatne sekvence. Primeri fragmenata za vezivanje antigena obuhvataju Fab, F(ab')2, antitela sa jednim lancem, triatela, tetratela, i antitela domena Drugi primeri su dati u priručniku Lunde et al., 2002, Biochem. Soc Trans 30:500-06

[0136]Antitela jednog lanca mogu da se formiraju povezivanjem fragmenata promenljivog domena teškog i lakog lanca (Fv region) preko mosta amino kiseline (kratki peptidni vezivač (linker)), koji daje kao rezultat jedan polipeptidni lanac. Takva Fvs sa jednim lancem (scFvs) su prirpemljeni spajanjem DNK koja kodira peptidni veziva, između DNK koja kodira dva promenljiva domena polipeptida (VL i VH) Dobijeni polipeptidi mogu da se preokrenu na sebe same da formiraju monomere koji vezuju antigen, ili oni mogu da formiraju multimere (npr. dimere, tnmere, ili tetramere), zavisno od dužine fleksibilnog linkera između dva promenljiva domena (Kortt et al.. 1997. Prot 10423, Tomizuka et al., 2001, Pro. Eng. 18:95-108). Kombmovanjem različitih polipeptida koji obuhvataju promenljive lake (VL) i promenljive teške (VH), stručnjak može da formira multimerni scFvs koji se vezuje na različite epitope (Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng 18.31-40) Tehnike razvijene za proizvodnju antitela jednog lanca obuhvataju one koje su opisane u američkom patentu U S Patent No 4.946.778; Bird. 1988, Science 242:423; Huston et al. 1988. Proc Natl Acad. Sci USA 85 5879, VVard et al., 1989. Nature 334:544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol Biol. 178:379-87 Antitela sa jednim lancem izvedena iz ovde datih antitela obuhvataju, ali se ne ograničavaju na, scFvs koji obuhvataju kombinacije promenljivog domena L1H1, L2H2, L3H3. L4H4. L5H5 L6H6, L7H7. L8H8. L9H9. L10H10. L11H11. L12H12, L13H13. i L14H14 su obuhvaćene ovim pronalaskom.

[0137]Proteini koji vezuju antigen (antitela. fragmenti antitela) prema ovom pronalasku mogu da obuvhate bilo koji konstantni region poznat u ovoj oblasti Konstantni region lakog lanca može da bude, na primer, kapa- ili lambda- tip konstantnog regiona lakog lanca, npr., ljudski kapa- ili lambda-konstantni region lakog lanca. Konstantni region teškog lanca može da bude, na primer, alfa-, delta-, epsilon-, gama-ili mutirani tip konstantnih regiona teškog lanca, npr, ljudski alfa-, delta-, epsilon-, gama-, ili mutirani tip konstantnog regiona teškog lanca U jednom izvođenju, konstantni region lakog ili teškog lanca je fragment, derivat, varijanta, ili mutein konstantnog regiona koji se prirodno javlja.

[0138]Poznate su tehnike za izvođenje antitela različite pođklase ili izotipa iz antitela prema ovom interesu, t.j. zamena pođklase. Dakle, IgG antitela moguće je izvesti iz IgM antitela. na primer, iviče versa.Takve tehnike omogućavaju pripremu novih antitela koja poseduju svojstva za vezivanje antigena datog antitela (roditeljsko antitelo). ali takođe ispoljavaju biološka svojstva povezana sa izotipom antitela ili podklasom koja se razlikuje od pođklase roditeljskog antitela Rekombinantne DNK tehnike moguće je koristiti Klonirana DNK koja kodira određene polipeptide antitela može da se koristi u takvim postupcima, npr., DNK koja kodira konstantni domen antitela željenog izotipa. Videti takođe Lantto etal., 2002, Methods Mol Biol. 178:303-16

U jednom

[0139]Izvođenje, protein za vezivanje antigena prema ovom pronalasku obuhvata i lgG1 domen teškog lanca, ili njegov fragment. A1 (L1) i kapa domen lakog lanca, ili njegov fragment, A1 (L1).

[0140]Ako se želi lgG4, može biti poželjno da se uvede mutaciju u tački (CPSCP -> CPPCP) u regionu spoja kako je opisano u Bloom et al., 1997, Protein Science 6.407) da se ublaži tendencija da se formiraju veze disulfignog intra-H lanca disulfida koje vode do heterogenosti u !gG4 antitelima.

[0141]U jednom izvođenju, protein za vezivanje antigena ima K0ffod 1x10~<4>s'<1>ili niži U drugom izvođenju, taj K0ff je 5x10_5 s~<1>ili niži

[0142]Kako se ovde korist, pojam ljudskog aktivina A treba da obuhvati protein ID BR SEK:1 i varijante njegovog alela. Aktivin A može da se prečisti iz ćelija domaćina koje su transfektovane genom koji kodira aktivin A eluiranjem filtriranog supernatanta fluida kulture ćelije domaćina korišćenjem Heparin HP stuba, korišćenjem gradijenta soli

[0143]Pojam "antitelo" se odnosi na nedirnuto antitelo ili njegove vezujuće fragmente Antitelo može da obuhvati kompletni molekul antitela (uključujući poliklonalne. monoklonalne, himerne, humanizovane. ili ljudske verzije koje imaju punu dužinu teških i/ili lakih lanaca), ili obuhvataju njegove fragmente za vezivanje antigena Fragmenti antiela obuhvataju F(ab')2, Fab, Fab'. Fv, Fc, i Fd fragmente, i mogu da budu inkorporirani u antitela jednog domena, antitela jednog lanca, maksitela, minitela, intratela, diatela, triatela, tetratela, v-NAR i bis-scFv (Videti npr.,, Hollinger and Hudson, 2005. Nature Biotech , 23,9, 1126-1136) Polipeptidi antiela su takođe opisani u U S Patent No. 6,703,199, uključujući polipeptidna monotela fibronektina Drugi polipeptidi antitela su opisani u U S Patent Publication 2005/0238646, koji su polipeptidi jednog lanca

[0144]Fragmente za vezivanje antigena izvedeni iz antitela moguće je dobiti, na primer, proteolitskom hidrolizom antitela, na primer, razlaganjem pepsina ili papama ceiih antitela prema standardnim metodama. Primera radi, fragmente antitela je moguće proizvesti enzimskim razlaganjem antitela sa pepsmom da se dobije 5S fragment pod pojmom F(ab')2. Ovaj fragment je moguće dodatno razdeliti korišćenjem agensa za smanjenje tiola da se proizvedu 3.5S Fab monovalentni fragmenti Opciono. reakciju cepanja je moguće izvesti korišćenjem grupe za blokiranje za grupe sulfhidrila koje nastaju kao rezultat razlaganja (cepanja) vezanosti disulfida Kao alternativa, enzimatsko razlaganje korišćenjem papaina proizvodi dva monovalentna Fab fragmenta i Fc fragmenta direktno. Ove metode su opisane, na primer, u Goldenberg, U.S. Patent No. 4,331,647, Nisonoff et al.. Arch. Biochem. Bioplvs 89.230. 1960; Porter. Biochem J 73:119. 1959; Edelman et al., in Methods m Enzymology 1:422 (Academic Press 1967); and by Andrevvs, S.M, and Titus, J A. in Current Protocols in lmmunology (Coligan JE. et al.. eds). John Wiley & Sons. New York (2003), pages 2.8.1-2.8 10 and 2 10A.1-2.10A.5 Druge metode za razlaganje antitela, kao što je odjanje teških lanaca da se formiraju fragementi monovalentnog lakog - teškog lanca (Fd). dalje razlaganje fragmenata, ili drugih enzimatskih. hemijskih ili genetskih tehnika moguće je takođe koristiti, tako da dok se fragmenti vezuju na antigen koji prepoznaje nedirnuto antitelo

[0145]Fragment antitela može takođe da bude sintetički ili genetski projektovan protein Na primer. fragmenti antitela obuhvataju izolovane fragmente koji se sastoje od promenljivog regiona lakog lanca, "Fv" fragmenti se sastoje od promenljivih regiona teških i lakih lanaca, rekombinantnih polipeptidnih molekula jednog lanca u kojima su laki i teški promenljivi regioni su povezani peptidnim vezivaćem (scFv proteini).

[0146]Drugi oblik fragmenta antitela je peptid koji obuhvata jedan ili više regiona utvrđivanja komplementarnosti (CDRs) nekog antitela CDR (takođe poznati pod nazivom "minimalne jedincie prepoznavanja", ili "hiperpromenljivi region") moguće je dobiti konstruisanjem polinukleotida koji kodiraju CDR od interesa. Takvi polinukleotidi su pripremljeni, na primer, korišćenjem lančane reakcije polimeraze da se sintetiše promenljivi region korišćenjem iRNK ćelija koje proizvode antitelo kao uzorak (videti, na primer, Larrick et al.. Methods A Companion to Methods in Enzymology 2:106. 1991; Courtenay-Luck. "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," in Mortoclortal Antibodies; Production, Engineering and Clinical Ap- plication, Ritter et al. (eds ). page 166 (Cambridge University Press 1995); and VVard et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Pnnciples and Applications. Birch et al , (eds ). page 137 (Wiley- Liss, Ine 1995)). Na primer, domen V regiona može biti monomerni i bilo Vhili Vi_ domen. koji je sposoban da nezavisno vezuje ljudski aktivin A sa afinitetom koji je barem jednak 1 x 10"^M ili manje kako je ovde opisano. Alternativno, domen V regiona može biti dimerni i sadržati dimere Vh-Vh, Vh-V|_. ili V|_-V[_ Dimer V regiona obuhvata barem jedan VH i barem jedan VL lanac koji može bit nekovalentno povezan (ovde u daljem tekstu se pominje kao FV) Ako se želi, ovi lanci mogu da budu kovalentno spojeni bilo direktno, na primer preko disulfidne veze između dva promenljvia domena, ili putem vezivača, na primer peptidnog vezivača. da se formira jedan lanac Fv (scFV)

[0147]Drugi promenljivi domen regiona može da bude biio koji koji promenljivi domen koji se prirodno javlja ili njegova projektovana verzija. Pod projektovanom verzijom se misli na domen promenljivog regiona koji je stvoren korišćenjem tehnika inženjeringa rekombinantne DNK. Takve projektovane verzije obuhvataju one koje su kreirane, na primer, iz specifičnog promenljivog regiona antitela umetanjem, brisanjima, ili promenama u sekvencama amino kiselina specifičnog antitela Određeni primeri obuhvataju projektovane domene promenljivog regiona koji sadrže barem jedan CDR i opciono jednu ili više amino kiseina okvira iz prvog antitela i preostatak iz domena promenljivog regiona iz drugog antitela

[0148]Domen promenljivog regiona može biti kovalentno spojena na C završetak amino kiseline na barem jedan drugi domen antitela ili njegov fragment Dakle, na primer, VH domen koji je prisutan u domenu promenljivog regiona može biti povezan na CH1 domen imunoglobulina, ili njegov fragment Slično VL domen može biti povean na CK domen ili njegov fragment Na ovaj način, na primer antitelo može da bude Fab fragment pri čemu domen za vezivanje antigena sadrži povezane VH i VL domene kovalentno povezane na njihove C završetke na CH1 i CK domen. respektivno. D CH1 domen može da se produži sa još amino kiselina, na primer da se obezbedi region spoja ili deo domea regiona spoja kao što se nalazi u Fab' fragmentu, ili da se obezbede dodatni domeni, kao što su CH2 i CH3 domeni antitela

[0149]Kako je ovde opisano, antitela obuhvataju barem jedan od ovih CDR Na primer. jedan ili više CDR moguće je ugraditi u poznate regione okvira antitela flgGl. lgG2, itd.),

[0150]Kod izvesnih preporučenih izvođenja, antitelo obuhvata jedan ili više u vodi rastvarljivih polimernih spojeva, uključujući, ali ne ograničavajući se na. polietilen glikol, polioksietilen glikol. ili polipropilen glikol. Videti. npr, U.S. Pat br. 4.640,835 4.496.689. 4,301.144, 4.670 417, 4,791.192 i 4,179,337. U izvesnim izvođenjima, agens za vezivanje derivata obuhvata jedan ili više monometoksi-polietilen glikola. dekstrana, celuloze, ili drugih na karbohidratu zasnovanih polimera, poli-(N-vinil pirolidonj-polietilen glikol, propilen glikol homopolimere, polipropilen oksid/etilen oksid ko-polimer polioksietilisane poliole (npr, glicerol) i polivmilalkohol. kao i mešavine takvih polimera U izvesnim izvođenjima, jedan ili više polimera rastvorljivih u vodi se nausmio spaja na jedan ih više bočnih lanaca. U izvesnim izvođenjima. PEG može da deluje tako da poboljša terapijsku sposobnost za vezujući agens, kao što je antitelo. Izvesne takve metode se razmatraju, na primer. u U S Pat. br 6,133,426,

[0151]Jasno je da antitelo prema ovom pronalasku može da ima barem jednu supstituciju amino kiseline, koja obezbeđuje da antitelo zadržava specifičnost vezivanja Samim tim, modifikacije na strukturama antitela su obuhvaćene obimom ovog pronalaska One mogu da obuhvate supstitucije amino kiseline, koje mogu da budu konzervativne ili nekonzervativne, koje ne uništavaju sposobnost nekog antitela za vezivanje aktivina A Konzervativne supstitucije amino kiseline mogu obuhvatiti ostatke amino kiseline koje se ne javljaju prirodno, koje su najčešće obuhvaćene hemijskom sintezom peptide pre nego sintezom u biološkim sistemima Ovi obuhvataju peptidomimetriju i druge reverzne ili inverzne oblike delova amino kiseline Konzervativna supstitucija amino kiseline može takođe da obuhvati supstituciju prirodnog ostatka amino kiseline sa normativnim ostatkom tako da postoji malo

ili nedovoljno dejstva na polaritet ili pramenu ostatka amino kiseline u tom položaju

[0152]Nekonzervativne supstitucije mogu da obuhvate promenu člana jedne klase amino kiselina ili imitacije amino kiseline imitacije kiseline za član iz druge klase sa različitim fizičkim svojstvima (npr veličina, polaritet, hidrofobičnost. naelektrisanje) Takve supstituisane ostatke moguće je uvesti u regione ljudskog antitela koji su homologni sa neljudskim anatielima, ili u nehomologne regione molekula.

[0153]Pored toga, stručnjak u ovoj oblasti može genensati probne vanjatne koje sadrže jednu supstituciju amino kiseline na svakom željenom ostatku amino kiseline Varijante mogu u tom slučaju biti analiziranje korišćenjem ogleda o aktivnost (dejstvu) poznatim stručnjacima u ovoj oblasti. Takve varijante bi se mogle koristiti za prikupljanje informacije o pogodnim varijantama. Na primer. ako je utvrđeno da je promena na ostatku određene amino kiseline dala kao rezultat uništenu, neželjeno uništenu, ili nepogodanu aktivnost, varijante sa tkavom pramenom moguće je izbeći. Drugim rečima na osnovu informacije prikupljene iz takvih rutinskih eksperimenata, stručnjak u ovoj oblasti može lako da odredi amino kiseline gde dalje supstitucije treba izbeći bilo same ili u kombinaciji sa drugim mutacijama

[0154]Stručnjak u ovoj oblasti će moći da odredi pogodne varijante polipeptida kako je izneto ovde korišćenjem poznatih tehnika. U izvesnim izvođenjima, stručnjak u ovoj oblasti može da identifikuje pogodne oblasti molekula koje mogu biti promenjene a da se ne uništi aktivnost ciljanjem regiona koji se ne smatraju značajnim za aktivnost Kod izvesnih izvođenja, moguće je odrediti ostatke i delove molekula koji su konzervisani među sličnim polipeptidima U izvesnim izvođenjima, čak i oblasti koje mogu biti značajne za biološku aktivnost ili za strukturu mogu da budu predmet konzervativnih supstitucija amino kiseline bez uništavanja biološke aktivnosti ili bez neželjenog dejstva na strukturu polipeptida.[0155]Dodatno, stručnjak u ovoj oblasti može da pregleda proučavanja funkcije strukture koji identifikuju ostatke u sličnim polipeptidima koji su važni za aktivnost ili strukturu U smislu takvog poređenja. moguće je predvideti značaj ostataka amino kiselien u proteinu koji odgovara na ostatke amino kiseline koji su važni za aktivnost ili konstrukcije u sličnim proteinima Stručnjak u ovoj oblasti može izabrati kao opciju supstitucija za takve predviđene značajne ostatke amino kiseline.

[0156]Stručnjak u ovoj oblasti može takođe da analizira trodimenzionalnu strukturu i sekvencu amino kiseline u vezi sa tom strukturom u sličnim polipeptidima U smislu takve informacije, stručnjak u ovoj oblasti može da predvidi poravnanje ostataka amino kiseline antitela u odnosu na njegovu trodimenzionalnu strukturu. U izvesnim izvođenjima, stručnjak u ovoj oblasti može da izabere da ne napravi radikalne promene na ostacima amino kiseline predviđene da budu na površini proteina, s obzirom da su takvi ostaci mogu da budu obuhvaćeni u važnim interakcijama sa drugim molekulima.

[0157]Broj naučnih publikacija koje su posvećene predviđanjem sekundarne strukture Videti Moult J., Curr Op, in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou et al , Biochem 13(2) 222-245 (1974), Chou et al., Biochem., 113(2) 211-222 (1974); Chou et al Adv Enzimol Srod Područja mol. Biol . 47;45-148

(1978); Chou et al., Ann Rev. Biochem . 47:251-276 and Chou et al., Biophys. J.. 26:367-384 (1979). Pored toga, sada su dostupni kompjuterski programi kao pomoć u predviđanju sekudnarne strukture. Jedan metod predviđanja sekundarne strukture je zasnovan na modelingu homologije. Na primer, dva polipeptida ili proteina koji imaju identičnost sekvence veću od 30%, ih sličnost veću od 40% često ima slučnu strukturnu topologiju Nedavni porast strukturne baze proteina (PDB) je obezbedio povećanu predvidljivost sekundarne strukture, uključujući potencijalni broj umnožaka sa strukturom polipeptida ili proteina. Videti Holm et al., Nucl Kiselina. Res., 27(1) 244-247 (1999). Postoji mišljenje (Brenner et al., Curr Op. Strukt. Biol., 7(3):369-376 (1997)) da postoji ograničen broj umnožavanja u datom polipeptidu ili proteinu i da je jedan ključan broj struktura rešen. strukturno predviđanje će postati dramatično preciznije.

[0158]Dodatne metode predviđanja sekundarne strukture obuhvataju stvaranje "niti" (Jones, D., Curr. Opm. Strukt Biol., 7(3):377-87 (1997), Sippl et al., Structure, 4(1 }:15-19 (1996)), "profile analvsis" (Bowie et al., Science. 253:164-170 (1991). Gribskov et al.. Meth. Enzym., 183:146-159

(1990); Gribskov et al., Proc Nat Acad Sci. 84(13):4355-4358 (1987)), and l,evolutionary linkage"

(See Holm, supra (1999), and Brenner, supra (1997))

[0159]U izvesnim izvođenjima, varijante antitela obuhvataju varijante glikosilacije pri čemu broj i/ili tip mesta glikosilacije su izmenjena u poređenju sa sekvencama amino kiseline roditeljskog polipeptida. U izvesnim izvođenjima, varijante obuhvataju veći ili manji borj N-povezanih mesta glikosilacije nego prirodni protein. N povezano mesto glikosilacije karakteriše sekvenca Asn-X-Ser ili Asn-X-Thr, pri čemu ostatak amino kiseline naznačen kao X može da bude izuzev prolina bilo koji ostatak amino kiseline. Supstitucija ostataka amino kiseline za kreiranje sekvence obezbeđuje potencijalno novo mesto za dodavanje N povezanog lanca karbohidrata Alterntativno, supstitucije koje eliminišu ovu sekvencu će ukloniti postojeći N povezan lanac karbohidrata Takođe je povezana preraspodela N povezanih lanaca karbohidrata pri čemu jedno ili više N povezanih mesta glikosilacije (najčešće ona koja se prirodno javljaju) se elimmiše i jedan ili više novih N povezanih mesta se kreira Dodatne preporučene varijante antitela obuhvataju varijante cisteina pri čemu je jedan ili više ostataka cisteina obrisan iz ili supstituisan za drugu amino kiseinu (npr serin) u poređenju sa sekvencom roditeljske amino kiseline Varijante cisteina mogu biti korisne kada je neophodno ponovo umnožiti antitela u biološki aktivnu konformaciju kao što je posle izolacije nerastvorljivih tela inkiuzije. Varijante cisteina generalno imaju manje ostataka cisteina nego nativni protein, i najčešće imaju paran broj da se svedu interakcije na minimum koje nastaju iz neuparenih cisteina

[0160]Željene supstitucije amino kiseline (bilo konzervativne ili nekonzervativne) može da utvrdi stručnjak u ovoj oblasti u vreme kada su takve supstitucije poželjne, supstitucije. Kod izvesnih izvođenja, supstitucije amino kiseline mogu da se koriste da se prepoznaju važni ostaci antitela na aktivinu A, ili da s epoveća ili smanji afinitet antitela na aktivinu A kako je ovde opisan.

[0161]Prema izvesnim izvođenjima, preporučene supstitucije amino kiseline su one koje: (1) smanjuju podložnost proteolizi. (2) smanjuju podložnost oksidaciji. (3) menjaju afinitet vezivanja za formiranje proteinskih kompleksa, (4) menjau afinitete vezivanja i/ili (4) daju ili modifikuju druge fiziohemijska ili funkcionalna svojstva na takvim polipeptidima. Prema nekim izvođenjima, jednostruke ili višestruke supstitucije amino kiseline (u izvesnim izvođenjima, konzervativne supstitucije amino kiseline) moguće je napraviti u sekvenci koja se prirodno javlja (u izvesnim izvođenjima, u delu spoljnih domena polipeptida koji formiraju mtermolekularne kontakte) U izvesnim izvođenjima, konzervativna supstitucija amino kiseline najčešće ne mora da značajno promeni strukturne karakteristike roditeljske sekvence (npr zamena amino kiseline ne treba da nastoji da prekine zavojnicu (spiralu) koja se javlja u roditeljskoj sekvenci, ili da poremeti druge tipove sekudnarne strukture koja karakteriše roditeljsku sekvencu) Primeri u ovoj oblasti priznatih sekundarnih i tercijarnih struktura polipeptida su opisani u radu Proteins. Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W H Freeman and Companv, New York (1984)): Introduction to Protein Structure (C. Branden and J Tooze, eds . Garland Publishmg, New York. N.Y. (1991)). and Thornton etal. Nature 354:105 (1991)

[0162]U izvesnim izvođenjima, antitela prema ovom pronalasku mogu da budu hemijski spojena sa polimerima, lipidima, ili drugim delovima.

[0163]Jasno je da antitela prema ovom pronalasku obuhvataju humanizovana antitela Humanizovana antitela kao što su ona koja su ovde opisana mogu biti proizvedena korišćenjem tehnika poznatih stručnja ima u ovoj oblasti (Zhang, W. et al Molecular Immunologv 42(12)1445-1451. 2005, Hwang W. et al., Methods 36(1) 35-42. 2005; Dall'Acqua vVF. et al.. Methods 36(1):43-60, 2005; and Clark, M , lmmunology Today 21 (8);397-402. 2000)

[0164]Jednom sintetisana. DNK koja kodira antielo prema ovom pronalasku ili njegov fragment može biti reprodukovan i ispoljen u skladu sa bilo kojom od velikog broja poznatih postupaka za eksciziju nukleinske kiseline, ligaciju, transformaciju, i transfekciju korišćenjem nekog borj poznatih vektora ekspresije Dakle u izvesnim izvođenjima ispoljavanje fragmenta antitela može biti poželjno u prokariotu kao domaćinu kao što jeEschehchia coli(videti.npr..Pluckthun et al.. 1989 Methods Enzymol. 178:497-515). U izvesnim izvođenjima, ispoljavanje antitela ili njegovog fragmenta može biti preporučeno u ćeliji eukariota kao domaćinu, uključujući kvasac( npr. Saccharomyces cerevisiae. Schizosaccharomyces pombe,iPichia pastoris)ćelije životinje (uključujući ćelije sisara) ili ćelije biljke Primeri pogodnih ćelija životinje obuhvataju. ali se ne ograničavaju na ćelije, mijeloma (kao što je mišja NSO linija). COS, CHO, ili ćelije hibridoma Primeri ćelija biljaka obuhvataju duvan, kukuruz sojino zrno, i ćelije pirinča.

[0165]Jedan ili više replikabilnih vektora ekspresije koji sadrže DNK koja kodira promenljivi i/ili konstantni region antitela moguće je pripremiti i koristiti da se transformiše odgovarajuća linija ćelije, na primer, linija ćelije koja ne proizvodi mijelom. kao što je mišja NSO linija ili bakterija, kao što jeE. coli,u kojoj će nastati proizvodnja antitela. Kako bi se dobila efikasna transkripcija i translacija, DNK sekvenca u svakom vektoru treba da obuhvati odgovarajuće regulatorne sekvence, posebno promoter i lider sekvencu vodeću sekvencu operativno povezane na sekvencu promenljivog domena Određene metode za proizvodnju antitela na ovaj nam su generalno dobro poznate i rutinski se koriste. Na primer. osnovne procedure molekularne biologije su opisane od strane Maniatis et al (Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2nd ed.. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989 seea/soManiatis efal.3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York. (2001)). DNK sekvencioniranje može da bude izvedeno kako je opisano kod Sanger et al (PNAS 74 5463, (1977)) i Ameršamov priručnik za sekvencioniranje Amersham International plc sequencing handbook. i mutageneza usmerena na određeno mesto može da se izvede prema metodama poznatim u ovoj oblasti (Krameret al.. Nucleic Acids Res 12 9441 (1984): Kunkel Proc Natl Acad Sci USA 82:488-92 (1985); Kunkel et al.. Methods irt Enzymol. 154 367-82 (1987), the Anglian Biotechnology Ltd handbook). Pored toga, brojne publikacij e opisuju tehnike pogodne za pripremu antitela manipulacijom DNK, kreiranjem vektora ekspresije, i transformacijom i kulturom odgovarajućih ćelija (Mountain A and Adair, J R in Biotechnology and Genetic Engmeenng Revievvs (ed Tombs, MP, 10 Chapter 1, 1992, Intercept, Andover, UK), "Current Protocois in Molecular Biology". 1999, F M

Ausubel (ed.), Wiley Interscience, New York).

[0166]Tamo gde je poželjno da se poboljša afinitet antitela prema ovom pronalasku koji sadrže jedno ili više gore pomenutih CDR moguće je dobijti putem nekih protokola afinitetnog sazrevanja uključujući održavanje CDR (Yang et al.. J Mol Biol . 254. 392-403. 1995). preslaganje lanca (Marks et al., Biotechnology, 10, 779-783, 1992). upotreba mutacije sojevaE. coli.(Low el al., J. Mol Biol., 250, 350-368, 1996), DNA shuffling (Patten et al., Curr Opm Biotechnol . 8, 724-733, 1997), phage display (Thompson et al., J Mol Biol. 256. 7-88. 1996) and sexual PCR (Cramen, et al.. Nature, 391, 288-291, 1998). Sve ove metode i sazrevanje afiniteta razmatraju Vaughan et al (Nature Biotech . 16. 535-539. 1998)

[0167]Druga antitela prema ovom pronalasku moguće je dobiti konvencionalnim postupcima imunizacije i fuzije ćelije kako je ovde opisano i poznato u ovoj oblasti Monoklonalna antitela prema ovom pronalasku moguće je generisati korišćenjem raznovrsnih poznatih tehnika Gnerelno. monoklonalnantitela koja se vezuju na specifične antigene mogu da se dobiju metodama poznatim stručnjacima u ovoj oblasti( videti.na primer. Kohler et al.. Nature 256:495, 1975; Coligan et al (eds ), Current Protocols in lmmunology. 1:2 5 12 6 7 (John Wiley & Sons 1991); U S Patent Nos. RE 32,011. 4,902.614, 4,543.439, and 4,411,993: Monoclonal Antibodies. Hybridomas; A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn, and Bechtol (eds.) (1980);andAntibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds ), Cold Spring Harbor Laboratory Press

(1988); Picksley et al., "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli," in DNA Closing 2: Expression Systems. 2nd Edition Glover et al (eds.), page 93 (Oxford University Press 1995)). Fragmenti antitela mogu biti izvedeni iz njih korišćenjem pogodnih strandardnih tehnika kao što je proteolitsko razlaganje, ili opciono. proteolitsko razlaganje (na primer, korišćenjem papaina ili pepsina) posle kog sledi blago smanjenje disulfidnih veza I alkilacija. Alternativno, takve fragmente je moguće generisati i tehnikama rekombinantnog genetičkog inženjeringa kako je ovde opisano

[0168]Monoklonalnantitela moguće je dobiti ubrizgavanjem životinji, na primer. pacovu. hrčku, zecu, ili preporučljivo mišu, uključujući na primer transgenskog ili mutiranog, kako je poznato u ovoj oblasti, sa imunogenom koji obuhvata ljudski aktivin A ID BR. SEK 66, ili njegov fragment, u skladu sa postupcima poznatim u ovoj oblasti i kako je ovde opisano, postojanje proizvodnje specifičnog antitela moguće je nadgledati posle početnog ubrizgavanja i/ili posle ubrizgavanja pobuđivača dobijanjem uzorka seruma i detektovanjem prisustva antitela koje vezuje ljudski aktivin A ili peptid korišćenjem bilo koje od nekoliko metoda imunodetekcije poznatih u ovoj oblasti i opisanih ovde Iz životinja koje proizvode željena antitela, limfoidne ćelije najčešće ćelije iz slezine ili limfnog čvora, se uklanjaju da se dobiju B limfociti. B limfociti se zatim spajaju sa partnerom fuzije mijeloma ćelije koja je senzitizovana (učinjena osetljivom pomoću leka), preporučljivo onom koja je singenička (genetski identična) sa imunizovanom životinjom i koja opciono ima druga poželjna svojstva (npr nemogućnost da ispolji endogene Ig proizvode gena. npr., P3X63 - Ag 8 653 (ATCC br CRL 1580). NSO. SP20) da se proizvedu hibridomi, koji su besmrtne eukariotske linije ćeljie

[0169]Limfoidne( npr.,sleyina) ćelije i ćelije mijeloma moguće je kombinovati na nekoliko minuta sa agensom koji promoviše fuziju membrane kao što je polietilen glikol ili nejonski deterdžent, i zatim rasporediti na ploče u maloj gustini na selektivnu podlogu koja podstiče rast ćelija hibridoma ali ne nefuzionisane ćelije hibridoma. Poželjan medij izbora je HAT (hipoksantm. aminopterin, timidin) Posle dovoljno vremena, obično oko jedne do dve nedelje, moguće je primetiti kolonije ćelija. Izoluju se pojedinačne kolonije, i antitela proizvedena pomoću ovih ćelija moguće je testirati za aktivnost vezivanja na ljudski aktivin A, korišćenjem bilo koje od velikog broja imunoogleda poznatih u ovoj oblasti i opisanih ovde Hibridomi se kloniraju (npr , ograničenim razblaživanjem kloniranjem ili umerenom agar izolacionom pločom ) i pozitivni klonovi koji proizvode antitelo specifično za aktivin A se biraju i kultivišu Monoklonalna antitela iz kultura hibridoma moguće je izdavati iz supernatanata kultura hibridoma.

[0170]Alternativni metod za proizvodnju mišjeg monoklonalnog antiela je da se ubrizgaju ćelije hibridoma u peritonealnu šupljinu singeničkog miša, na primer. miš koji se leći (npr , pristanom premazani) da se poboljša formiranje ascita fluida koji sadrži monoklonalno antielo Monoklonalnantitela moguće je izolovati i prečistiti raznovrsnih dobro utvrđenim tehnikama Takve tehnike izolacije obuvhataju afinitetnu hromatografiju sa proteinom A kompanije Sepharose, hromatografijom za isključivanje veličine, i hromatografijom za izmenu jona (videti, na primer sledeće stranice radova, Coligan at pages 2.7 1-2 7.12 and pages 2.9.1-2 9 3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in Methods in Molecular Biologv Vol 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)) Monoklonaln antitela moguće je prečistiti afmitetnom hromatografijom korišćenjem odgovarajućeg liganda izabranog na osnovu određenih svojstava antitela (npr teški ili laki izotip lanca, specifičnost vezivanja, itd ) Primeri pogodnog liganda, imobilizovanog na čvrstoj podlozi, obuhvataju Protein A, Protein G, antikonstantni region (laki lanac ili teški lanac) antitela. protiv idiotipno antitelo. i TGF beta vezujući protein, ili njegov fragment ili varijantu

[0171]Antitelo prema ovom pronalasku moguće je koristiti i kao potpuno ljudsko monoklonalno antitelo Ovde se obezbeđuje izolovano potpuno ljudsko antitelo koje se specifično vezuje na region cisteinskog čvora (amino kiselien C11-S33 i/ili amino kiseline C81- E111) aktivina A, pri čemu protein za vezivanje antigena procesira barem jedanuin vivobiološku aktivnost ljudskog protiv aktivin A antitela. Ova biološka aktivnost može biti ublažavanje kahezije. na primer kahezija u kanceru debelog creva, kao što je na modelu miša kancera debelog creva, opisanog ovde Kahezija pgodna za takvu terapiju se povezuje sa gubitkom telesne težine, gubitkom mišićne mase, i/ili gubitkom masne mase Kahezija može da se povezuje sa reumatoidnim artritisom, kao što je na modelu životinje sa reumatoidnim artritisom izazvanim kolagenom Lečenje sa potpuno ljudskim antitelom opisano ovde poboljšava gubitak telesne težine, gubitak mićišne mase, i/ili gubitak mase masnoće in vivo na modelu životinje sa reumatoidnim artritiom izazvanim kolagenom. Potpuno ljudsko antitelo opisano ovde poboljšava gubitak telesne težine na AAV-aktivmom A transfektovanom modelu životinje Potpuno ljudsko antitelo opisano ovde. koje se specifično veže na region cisteinskog čvora (amino kiseline C11-S33 i/ili amino kiseline C81-E111) aktivina A inhibira vezivanje aktivina A na aktivin A receptorin vitroPotpuno ljudsko izolovano antitelo koje se specifično veže na region cisteinskog čvora (amino kiseline C11-S33 i/ili amino kiseline C81-E111) aktivina A, inhibira vezivanje aktivina A na aktivin A receptorin vivo.

[0172]Potpuno ljudska monoklonalnantitela moguće je generisati bilo kojim tehnikama sa kojima je upoznat prosečan stručnjak u ovoj oblasti Takve metode obuhvataju, ali se ne ograničavaju na Epstein Bar Virus (EBV) transformacija ljudskih ćelija periferne krvi (npr., sadrži B limfocite).in vitroimunizaciju ljudskih B ćelija, fuziju ćelija slezine iz imunizovamh transgenskih miševa koji nose umetnute ljudske gene imunoglobulina, izolaciju iz ljudskih biblioteka faga V regiona imunoglobulina. ili druge procedure kao što je poznato u ovoj oblasti i zasnovane su na ovde datom opisu Na primer, potpuno ljudska monoklonalnantitela moguće je dobiti iz transgenskih miševa koji su projektovani da proizvedu specifična ljudska antiela kao odgovor na antigenski izazov Metode za dobijanje potpuno ljudskih antitela iz transgenskih miševa su opisane na primer, kod Green et al., Nature Genet. 7 13, 1994; Lonberg et al., Nature 368:856, 1994; Tavlor et al., Int. Immun. 6:579, 1994; U.S. Patent No 5,877,397, Bruggemann et al,, 1997 Curr Opm. Biotechnol. 8:455-58; Jakobovits et al , 1995 Ann. N Y. Acad Sci. 764:525-35 U ovoj tehnici, elementi ljudskog lokusa teškog i lakog lanca se uvode u sojeve miševa izvedenih iz embionskih linija matičnih ćelija koje sadrže ciljane prekide endogenih lokusa teškog lanca i lakog lanca (seealsoBruggemann et al., Curr Opin Biotechnol 8:455-58

(1997)). Na primer, transgeni imunoglobulina čoveka ogu da budu konstrukti mini gena, ili translokusi na veštačkim hromozomima kvasca, koji prolaze reraspoređivanje DNK specifično za B ćeliju i hipermutaciju u limfoidnom tkivu miša. Potpuno ljudska monoklonalnantitela moguće je dobiti imunizovanjem transgenskih miševa, koji mogu zatim da proizvode ljudska antiela specifična za aktivin A Limofoidne ćelije imunizovanih transgenskih miševa moguće je koristiti da proizvode ljudske hibridome za izlučivanje antitela u skladu sa ovde opisanim metodama. Poliklone serume koji sadrže potpuno ljudska antitela moguće je takođe dobiti iz krvi imunizovanih životinja

[0173]Još jedan metod za generisanje ljudskih antitela prema ovom pronalasku obuvhata imortalizovanje ljudskih ćelija periferne krvi pomoću EBV transformacije Videti, npr, U S Patent No 4,464,456. Takva imortalizovana linija B ćelije (ili linija ćelije iimfoblastoida) koja proizvodi monoklonalno antitelo koje se specifično vezuje na aktivin A moguće je identifikovati metodama imunodetekcije kako je ovde dato, na primer, ELISA, i zatim izolovano standardnim tehnikama kloniranja. Stabilnost linije ćeliije Iimfoblastoida koja proizvodi protiv aktivin A antitelo moguće je poboljšati fuzijom transformisane linije ćelije sa mišjim mijelomom da se proizvede mišja-ljudka hibridna linija ćelije u skladu sa metodama poznatim u ovoj oblasti( videti. npr..Glaskv et al., Hvbridoma 8:377-89 (1989)) Još jedan metod za generisanje ljudskih monoklonalnih antitela je in vitro imunizacija, koja obuhvata pripremanje začetnicom ljudskih B ćelija slezine sa ljudskim aktivinom A, posle čega sledi fuzija začetnicom pripremljenih B ćelija sa heterohibridnim partnerom fuzije Videti, npr.. Boerner et al., 1991 J Immunol 147:86-95

[0174]Kod izvesnih izvođenja, B ćelija koja proizvodi antitelo protiv ljudskog aktivina A se bira i promenljivi regioni lakog lanca i teškog lanca se kloniraju iz 8 ćelije prema tehnikama molekularne biologije poznatim u ovoj oblasti (WO 92/02551, U S Patent 5,627,052; Babcook et al.. Proc. Natl Acad. Sci. USA 93:7843-48 (1996)) i opisane su ovde B ćelije iz imunizovane životinje moguće je izolovati iz slezine, limfnog čvora, ili uzorka periferne krvi izborom ćelije koja proizvodi antitelo koje se specifično vezuje na aktivin A. B ćelije mogu takođe da budu izolovane iz ljudi, na primer, iz uzorka periferne krvi Metode za detektovanje pojedinačnih B ćelija koje proizvode antitelo poželjne specifičnosti su dobro poznate u ovoj oblasti, na primer, formiranje plaka, razvrstavanje fluorescencijom aktiviranih ćelija, in vitro stimulacija posle čega je usledila detekcija specifičnog antitela. i slično. Metode za odabir specifičnih B ćelija koje proizvode antielo obuhvataju, na primer, pripremu suspenzije jedne ćelije iz B ćelija u blagom agaru koji sadrži ljudski aktivin A Vezivanje specifičnog antiela proizvedenog pomoću B ćelije na antigen daje kao rezultat formiranje kompleksa, koji može biti vidljiv kao imunoprecipitat. Pošto se izaberu B ćelije koje proizvode željeno antitelo. specifične gene antitela moguće je klonirati izolovanjem i pojačavanjem DNK ili iRNK prema metodama poznatim u ovoj oblasti i opisanim ovde.

[0175]Dodatni metod za dobijanje antitela prema ovom pronalasku je prikaz faga. Videti.npr.,l/Vinter et al.. 1994 Annu. Rev Immunol 12:433-55. Burton et al., 1994 Adv Immunol 57 191-280. Ljudske ili mišje kombinatorne bibilioteke gena promenljivog regiona imunoglobulina moguće je kreirati u vektorima faga koje je moguće analizirati za izbor Ig fragmenata (Fab, Fv, sFv. ili njihovih multimera) koji se specifično vezuju na TGF-beta vezujući protein ili njegovu varijantu ili njegov fragment Videti.npr,U S. Patent No. 5,223,409; Huse et al., 1989 Science 246:1275-81; Sastry et al,, Proc, Natl Acad. Sci USA 86:5728-32 (1989), Alting-Mees et al , Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990); Kang et al., 1991 Proc. Natl Acad Sci USA 88:4363-66 Hoogenboom et al., 1992 J Molec. Biol. 227:381-388; Schlebusch et al., 1997 Hybndoma 16.47-52 i ovde citirane reference. Na primer, biblioteka koja sadrži više sekvenci polinukleotida koje kodiraju Ig fragmente promenljivog regiona moguće je ubaciti u genom filamentoznog(vlaknastog) bakteriofaga, kao što je M13 ili neka njegova varijanta u okviru sa sekvencom koja kodira protein koji oblaže fag Proein fuzije može biti fuzija omotača proteina sa domenom promenljivog regiona lakog lanca i/ili sa domenom promenljivog regiona teškog lanca U skladu sa nekim izvođenjima, fragmente Fab imunoglobulina moguće je takođe prikazati na čestici faga (videti.npr ,U S Patent No 5.698.426).

[0176]Biblioteke ispoljavanja kDNK imunoglobulina teškog i lakog lanca moguće je takođe pripremiti u lambda fagu, na primer, korišćenjem >.lmmunoZap™(H) i / lmmunoZap™(L) vektori (Stratagene, La Jolla, California) Ukratko. iRNK se izoluju iz populacije B ćelije, i koriste za kreiranje biblioteka ispoljavanja kDNK imunoglobulina teškog i lakog lanca u / ImmunoZap(H) i/.ImmunoZap(L) vektorima. Ove vektore je moguće analizirati pojedinačno ili ispoljene zajedno da formiraju Fab fragmente ili antitela (videti Huseet al., supra, videti takođeSastryef al., supra).Pozitivne ploče mogu naknadno da budu pretvorene u nelitički plazmid koji omogućava visok nivo ekspresije fragmenata monoklonalnog antiela iz E coli.

[0177]U jednom izvođenju, u hibridomu promenljivi regioni gena koji ispoljava monoklonalno antitelo koje je predmet interesovanja su pojačani korišćenjem začetnica (prajmera) nukleotida. Ove začetnice može sintetisati i prosečan stručnjak u ovoj oblasti, ili ih je moguće kuptii iz komercijalno dostupnih izvora. (Videti,npr.Stratagene (La Jolla, California). koji prodaje začetnice (prajmere) za mišje i ljudske promenljive regione uključujući, između ostalog, začetnice za VHa. Vnb. VHo vHd. Chl Vj_ i Clregione ) Ove prajmere je moguće koristiti da se pojačaju promenljivi regioni teškog ili lakog lanca, koje je zatim moguće ubaciti u vektore kao što su lmmunoZAP™H ili lmmunoZAP™L (Stratagene), respektivno Ove vektore je zatim moguće ubaciti uE coli.kvasac, ili na bazi sisara zasnovane sisteme radi ispoljavanja. Velike količine jednolančanog proteina koji sadrži fuziju Vhi Vldomena moguće je proizvesti korišćenjem ovih metoda (videti Bird et al , Science 242:423-426. 1988).

[0178]Jednom kada se dobiju ćelije koje proizvode antitela prema ovom pronalasku korišćenjem bilo koje od gore opisanih tehnika imunizacije i drugih tehnika, specifični geni antitela mogu biti klonirani izolovanjem i pojačavanjem DNK ili iRNK iz njih u skladu sa standardnim procedurama kako je ovde opisano. Antitela proizvedena iz njih mogu biti sekvencionisana i CDR identifikovani i DNK kodiranje za CDR može biti manipulisano kako je opisano prethodno da se generišu druga antitela prema ovom pronalasku

[0179]Stručnjaku u ovoj oblasti je jasno da neki proteini, kao što su antitela. mogu da prođu kroz raznovrsne posttranslatione modifikacije. Tip i nivo ovih modifikacija često zavisi od linije ćelije domaćina koriščene za ispoljavanje proteina kao i uslova kulture Takvi modifikacije može obuhvatiti varijacije u glikosilaciji. oksidaciju metionina, formiranje diketopipenzma, aspartat izomerizacija i deamidacija asparagina Česte modifikacija je gubitak ostatak osnovnog karboksi-terminala (kao što je lizin ili arginin) zbog aktivnosti karboksipeptidaze (kako je opisano u Harris, R J. Journal of Chromatograplv 705:129-134, 1995).

Nukleinske kiseline

[0180]U jednom varijantnom rešenju, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovane molekule nukleinske kiseline. Nukleinske kiseline obuhvataju polinukleotide koji kodiraju protein koji vezuje antigen, na primer, jedan ili oba lanca antitela prema ovom pronalasku

[0181]Oni obuvhataju jednu ili više dodatnih sekvenci, na primer, regulatornih sekvenci, i/ili deo veće nukleinske kiseline, na primer, vektor Nukleinska kiselina može da bude jednolančane ili dvolančane i mogu da obuhvata RNK i/ili DNK nukleotide. i veštačke varijante njihove (npr, kiseline nukleinske kiseline).

[0182]Nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptide antite (npr, teški ih laki lanac, promenljivi domen samo, ili puna težina) može biti izolovan iz B ćelije miševa koji su imunizovani sa aktivinom A Nukleinska kiselina može da bude izolovana konvencionalnim postupcima kao što je lančana reakcija polimeraze (PCR).

[0183]Sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju promenljive regione promenljive regione teškog i lakog lanca su već prikazane gore u tekstu Vešti stručnjak će uvažiti da. usled degeneracije genetskog koda, svaka od sekvenci polipeptida opisanih ovde se kodira velikim brojem drugih sekvenci nukleinske kiseline Ovaj pronalazak obezbeđuje svaku degenensanu sekvencu nukleotida koja kodira svaki protein koji vezuje antigen prema ovom pronalasku

[0184]Promene je moguće uvesti mutacijom u nukleinsku kiselinu, čime se vodi do pramena u sekvenci amino kiseline polipeptida (npr, protein za vezivanje antigena) koji enkodira. Mutacije moguće je uvesti korišćenjem tehnika poznatih u ovoj oblasti. U jednom izvođenju, jedan ili više određenih ostataka amino kiseline su promenjeni korišćenjem. na primer, protokola mutageneze usmerene mestom U jednom drugom izvođenju, jedan ili više nasumično izabranih ostataka su promenjeni korišćenjem. na pnmer. protokola mutageneze slučajno izabrano Međutim pravi se mutant polipeptid može biti ispoljen i analiziran na željeno svojstvo (npr, vezivanje na aktivin A).

[0185]Mutacije je moguće uvesti u nukleinsku kiselinu bez značajnog menjanja biološke aktivnosti polipeptida koji kodira. Na primer, čovek može da napravi supstitucije nukleotida koji vode do supstitucija amino kiselina na ostacima neesencijalne amino kiseline U jednom izvođenju, ovde obezbeđena sekvenca nukleotida za A1, ili željeni fragment, varijanta, ili njen derivat, s emutira tako da kodira sekvencu amino kiseline obuhvata jednu ili više delecija ili supstitucija ostataka amino kiseline koji su pokazani ovde za A1 da budu ostaci gde se razlikuju dve ili više sekvenci

[0186]U jednom izvođenju, umeci mutageneze amino kiseline susedni jednom ili više ostataka amino kiseline prikazanim ovde za A1 da bi bili ostaci gde se razlikuju ostaci dve ili više sekvenci Alternativno, jedna li više mutacija može biti uvedena u nukleinsku kiselinu koja selektivno menja biološku aktivnost (npr.. vezivanje aktivina A) polipeptida koji kodira IMa primer, mutacija može kvantitativno ili kvalitativno da promeni biološku aktivnost Primeri kvantitativne promene obuhvataju povećanje, smanjenje ili eliminisanje aktivnosti Primeri kvalitativnih promena obuhvataju promenu specifičnosti antigena proteina za vezivanje antigena

[0187]U drugom vanjantnom rešenju. ovaj pronalazak obezbeđuje vektore koji obuhvataju nukleinsku kisleinu koja kodira polipeptid prema ovom pronalasku Primeri vektora obuhvataju. ali se ne ograničavaju na, piazmide, virusne vektore, neepizomalne vektore sisara i vektore ekspresije, na primer, rekombinantni vektori ispoljavanja

[0188]Rekombinantni vektori ispoljavanja prema ovom pronalasku mogu da obuhvate nukleinsku kiselinu prema ovom pronalasku u obliku pogodnom za ispoljavanje nukleinske kiseline u ćeliji domaćinu. Rekombinantni vektori ispoljavanja obuhvataju jednu ili više regulatornih sekvenci, izabranih na bazi ćelija domaćina koje treba koristiti za ispoljavanje. koja je operativno povezana na sekvencu nukleinske kiseline koja treba da se ispolji Regulatorne sekvence obuvhataju one koje usmeravaju konstitutivno ispoljavanje sekvence nukleotida kod velikog broja tipova ćelija domaćina (npr.. SV40 rani pojačavač gena. promoter Rous sarkoma virusa i promoter citomegalovirusa), oni koji usmeravaju ispoljavanje sekvence nukleotida samo u izvesnim ćelijama domaćina (npr., regulatornim sekvencama specifičnim za tkiva, videti Voss et a!. 1986, Trends Biochem. Sci 11 287, Maniatis et al., 1987, Science 236:1237 , i onima koji usmeravaju ispoljavanje sekvence nukleotida koje je moguće izazvati kao odgovor na određenu terapiju ili stanje (npr . promoter metalotionma u ćelijama sisa i tet-responsivni i/ili streptomicin responsivni promoter i kod prokanotskih i kod eukariotskih sistema (videtiid.)Jasno je stručnjacima u ovoj oblasti da projektovanje vektora ispoljavanja može zavisiti od takvih faktora kao što je izbor ćelije domaćina koju treba transformisati, nivo ispoljavanja željenog proteina, itd. Vektori ispoljavanja prema ovom pronalasku mogu biti uvedeni u ćelije domaćin da time proizvedu proteine ili peptide, uključujući proteine fuzije ili peptide fuzije, kodirane nuklemskim kiselinama kako je ovde opisano.

[0189]U drugom vanjantnom rešenju. ovaj pronalazak obezbeđuje ćelije domaćina u koje je uveden rekombinantni vektor ispoljavanja prema ovom pronalasku Ćelija domaćin može da bude bilo koja prokariotska ćelija (na primer,E coli)ili eukanotska ćelija (na primer. kvasac, insekt. ili ćelije sisara (npr., CHO ćelije)), DNK vektor moguće je uvesti u prokanotske ili eukariotske ćelije preko konvencionalnih tehnika transformacije ili transfekcije. Za stabilnu transfekciju ćelija sisara, poznato je da, zavisno od korišćenih vektora ispoljavanja i tehnike transfekcije. samo mala frakcija ćelija može integrisati stranu DNK u njihov genom. Kako bi se identifikovali i odabrali ovi integranti. gen koji kodira selektivni (koji je moguće izabrati) marker (npr, za otpornost na antibiotike) se generalno uvodi u ćelije domaćine zajedno sa genom koji je predmet interesovanja. Poželjni selektivni markeri obuhvataju one koji daju otpornost na lekove, kao što je G418. higromicin i metotreksat Ćelije stabilno transfektovane sa uvedenom nukleinskom kiselinom mogu da budu identifikovane izborom leka (npr., ćelije koje su ugrađene u selektivni gen markera će opstati, dok druge ćelije umiru), jedna je od metoda.

Indikacije

[0190]U jednom varijantnom rešenju, razmatraju se metode za lećenje subjekta.

[0191]Ovaj metod može, na primer, da ima generalno korisno dejstvo na zdravlje subjekta, npr, može povećati očekivanu dugovečnost subjekta. Alternativno, ovaj metod može, na primer, da tretira, spreči, leči, ublaži ili poboljša ("tretira") bolest, poremećaj, stanje ili bolest ("stanje") Među stanjima koje treba lečiti u skladu sa ovim pronalskom su stanja koja karakterište neodgovarajuće ispoljavanje ili aktivnost aktivina A. U nekim takvim uslovima nivo ispoljavanja ili aktivnosti je previše visok, i terapija obuhvata primenu antagonista aktivina A kako je ovde opisano

[0192]Jedan primer tipa stanja koje je moguće lečiti korišćenjem jedinjenja prema ovom pronalasku je stanje koje obuhvata rast ćelije, na primer, kanceroznog stanja koje prati kahezija Dakle, u jednom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenja za lećenje kanceroznog stanja Preciznije, kancerozno stanje je gonadalni kancer. koji obuhvata tumore jajnika i testisa (Fujii Y et al.. Am. J. Plys. Endocrin. Metab., 286:E927-E931, 2004; Reis, F M. et al., J Clin Endocrin. 87:2277-2282. 2005.) Aktivin A je poznat po svojoj aktivnosti u stimulisanju FSH biosinteze i izlučivanja u hipofizi, i ima fiziološku ulogu u regulaciji gonadalne funkcije Aktivin A se povezuje sa brojnim vrstama kancera kod čoveka i posebno sa tumorima reproduktivnog sistema. Specifično, prekomerno ispoljavanje ili deregulacija aktivina A ukazuje na kancer jajnika, (Menon U. et al , BJOG: An International Journal of Obstetrics & Gynaecology; 107(9): 1069-74. 2000. Choi KC. et al,, Molecular & Cellular Endocrinology, 174(1-2)99-110,2001; Zheng VV. et al., American Journal of Reproductive lmmunology. 44(2): 104-13,2000; Lambert-Messerlian GM, et al., Gynecologic Oncology. 74(1):93-7, 1999; Steller MD, et al., Molecular 55 Cancer Research: MCR 3(1):50-61, 2005, Corbellis L, et al., Journal of the Sociey for Gynecologic Investigation 11(4):203-6. 2004. VVelt CK, et al., Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 82(11 ):3720-7, 1997, and Harada K . et al., Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 81(6) 2125-30. 1996. endometrial adenocarcinoma Otani, T. et a , Gynecologic Oncology. 83(1):31-8, 2001. Tanaka T, et al., International Journal of Oncology 23(3): 657-63, 2003 and prostate cancer (Thomas TZ, et al., Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 82(11 ):3851-8, 1997. Zhang, Z, et al., Biochemical & Biophysical Research Communication. 234(2) 362-5, 1997; and Risblidger GP, et al., Molecular & Cellular Endocrinology. 180(1-2):149-53, 2001

[0193]Kancerozno stanje može da bude bilo koje kancerozno stanje koje je moguće lečiti korišćenjem ovde sadržanih jedinjenja , na primer. antitela protiv aktivin A ili fragmenti antitela, Primeri kanceroznih stanja obuhvataju, na pnmer, akutnu limfoblastičnu leukemiju, adrenokortikalni karcinom, kancere povezane sa HIV virusom, limfome povezane sa HIV virusom, kancer anusa, cerebralni astrocitom u detinjstvu, cerebralni astrocitom u detinjstvu. karcinom bazalnih ćelija, kancer ekstrahepatičkog žučnog kanala, kancer bešike, kancer osteosarkomnog/malignog vlaknastog histiocitoma kosti, tumori mozga (npr , gliom moždanog stabla, cerebralni astrocitom, cerebralni astrocitom/maligni gliom, ependimom, meduloblastom, supratorial primitivni neuroektodermalni tumori, vizuelna putanja i hipotalamićki gliom), kancer dojke, adenomi/karcmoidi bronhija. Burkitov limfom, karcinoidni tumor gastrointestinalni karcinoidni tumor, karcinom nepoznatog primara, primarni centralni nervni sistem, cerebralni astrocitom, cerebralni astrocitom/maligni gliom, kancer grlića materice, kanceri u detinjstvu, hronićna limfocitna leukemija, hronična mijelogena leukemija, hronični mijeloproliferativni poremećaji, kancer debelog creva, kolorektalni kancer, limfom kutane t-ćelije, kancer endometrijuma, ependimom, kancer ezofaga. tumori iz familije Juinogvih sarkoma ekstrakranijalni tumor klicine ćelije, ekstragonadalni tumor klicine ćelije, ekstrahepatićni kancer žučnog voda, kancer intraokularnog melanoma oka, kancer retinoblastoma oka, kancer žučne kese. gastrični (želudačni) kancer , tumor gastrointestinalnog karcinida, tumori ćelije klice (npr, ekstrakranijalni, ekstragonadalni, i tumor janika). gestacioni trofoblastični tumor, gliom (npr, odrasli stuba mozga u detinjstvu, cerebrali astrocitom u detinjstvu, vizuelna putanja u detinjstvu i hipotalamićki). leukemija dlakave ćelije, kancer glave i vrata, hepatoćelijski (jetra) kancer, Hodžkinov limfom, hipofaringealni kancer, hipotalamićki gliom I gliom putanje vida, intraokularni melanom, karcinom ćelije ostrvca (endorini pankeas), Kapošijev sarkom, kancer bubrega (renalna ćelija) kancer grkljana, leukemija (npr., akutni limfoblastični, akutni mijeloid, hronični limfocitni kancer, hronični mijelogeni, i dlakave ćelije), kancer usta i usne duplje, kancer jetre, nesitonćelijski kancer pluća, sitnoćelijski kancer pluća, limfom (npr , HIV povezan, Burkitove kutane t-ćelije. Hodžkinov, ne-Hodžkinov, i primarnog centralnog nervnog sistema) Valdenstromova makroglobulinemija, maligni vlaknasti histiocitom kosti/osteosarko, medulobiastom melanom, intraokularni (oko) melanom, karcinom Merkelove ćelije, mezoteliom, metastazirani kancer vrata skvamozne ćelije čiji je primarni tumor nepoznat, sindrom višestrke endokrine neoplazije, višestruki mijelom/plazma ćelja neoplazme, mukozni fungoidi, mijelodisplazmični sindromi, mijelodisplazmične/mijeloproliferativne bolesti, mijelogna leukemija, hronična mijeloidna leukemija, višestrui mijelom, hronični mijeloproliferativni poremećaji, sinus nazalne šupljine i paranazalnog sinusa, nazofaringalni kancer, neuroblastom, oralni kancer, orofaringealni kancer, osteosarkomni/maligni fibrozni histocitom kosti, kancer jajnika, kancer epiteta jajnika, tumor ćelije klice jajnika, tumor jajnika sa niskim malignim potencijalom, kancer (Langerhansovih) ostrvaca pankreasa, kancer paranazalnog sinusa i nazalne šupljine, paratiroidni kancer, kancer penisa, kancer feohromocitom, pineoblastom tumor hipofize, neoplazam/višestruki mijelom, pleuropulmonarni blastom, limfom primarnog centralnog nervnog sistema, kancer prostate, kancer rektuma, kancer renalne ćelije (bubrega) kancer renalne karlice i tranzicione ćelije uretre, retinoblastom, rabdomiosarkom, kancer pljuvačne žlezde. sarkom mekog tkiva, sarkom materice , Sezarijev sindrom, nemelanomni kancer kože, karcinom kože merkelove ćelije, kancer tankog creva, sarkom mekog tkiva, karcinom skvamozne ćelije, limfom kutane t-ćelije, kancer testisa, timom, karcinom grudne žlezde. karcinom tiroidne žlezde. gestacioni trofoblastični tumor, karcinom nepoznatog primarnog stanja, kancer nepoznatog primarnog stanja kancer uretre, kancer endometrijuma materice, sarkom materice, vaginalni kancer, gliom putanje vida i hipotalamusa, kancer vulve, Valdenstromova makroglobulinemija, i Vilmsov tumor

[0194]Terapijska antitela moguće je koristiti da se specifično vežu na nedirnuti aktivin A, u kom sekvence u ovom regionu od približno C11-S33 (prva petlja) i približno C81-E111 (druga petlja) zadržavaju konformaciju nativnog aktivina A Takvo mapiranje i vezivanje je opisano u Primeru 6. dole.

[0195]Antitela prema ovom pronalasku mogu imati afinitet vezivanja na ljudski aktivin A sa manje od ili jednako sa 1 x 10"<7>M, manje od ili jednako sa 1 x ICC^M. manje od ili jednako sa 1 x lO'^M, manje od li jednako sa 1 x 10"10|v1, manje od ili jednako sa 1 x 10"<11>M, ili manje od ili jednako sa 1 x 10-12m.

[0196]Afinitet antitela ili partnera vezivanja, kao i nivoa do kog antitelo inhibira vezivanje, može odrediti i prosečan stručnjak u ovoj oblasti korišćenjem ustaljenih tehnika, na primer onih koje su opisali Scatchard et al. (Ann. N.Y. Acad Sci 51:660-672 (1949)) ili površinskom plasmonskom rezonancom (SPR; BlAcore, Biosensor, Piscataway, NJ). Za površinsku plazmonsku rezonancu, ciljani molekuli se imobilišu na tvrdoj fazi i izlažu ligandima u mobilnoj fazi koji se kreću duž ćelije protoka Ako dođe do vezivanja liganda na imobilizovani cilj, menja se lokalni refraktivni indeks, to vodi promeni u SPR uglu, koja može da se nadgleda u realnom vremenu detektovanjem pramena u intenzitetu reflektovanog svetla. Brzine promene SPR signala moguće je analizirati da bi se dobio prinos očiglednih konstanti brzine za faze asocijacjei disasocijacije reakcije vezivanja. Stepen ovih vrednosti daje očiglednu konstantu ravnoteže (afinitet) (videti. npr, VVolff et al.. Cancer Res 53:2560-65 (1993)).

[0197]Antitelo prema ovom pronlasku može da pripada bilo kojoj klasi imunoglobulina, na primer IgG, tgE, IgM, IgD, ili IgA. Može se dobiti iz ili izvesti iz životinje, na primer, pernate (npr., pile) i sisara, što obuhvata ali se ne ograničava na miša, pacova, hrčka. zeca. ili drugog glodara, kravu, konja, ovcu, kozu, kamilu, čoveka, ili drugog primata Ovo antitelo može da bude internalizujuće antitelo Proizvodnja antitela je uopšteno opisana u američkoj objavi patenta U S Patent Publication No. 2004/0146888

A1. Ogledi karakterizacije

[0198]U gore opisanim metodama za generisanje antitela prema ovom pronalasku, uključujui manipulaciju specifičnih A1 CDR u nove oblike i/ili konstantne regione, odgovarajući ogledi su dostupni da se izaberu željena antiela (t.j ogledi za određivanje vezujućeg afiniteta afiniteta vezivanja na aktivin A: ogledi unakrsnog blokiranja, konkurentni ogled o vezivanju na bazi Biacore:"in vivoogledi).

Terapijske metode i primena proteina za vezivanje antigena

[0199]Izvesne ovde date metode obuhvataju pnmenu vezivanja proteina za vezivanje antigena aktivina A subjektu, čime se smanjuje aktivinom A izazvan biološki odgovor koji igra ulogu u određenom stanju. Ovo može da obuhvati endogeni aktivin A sa vezivanjem proteina za vezivanje antigena aktivina A, npr., putem pnmene subjektu ili u ex vivo postupku.

[0200]Pojam "tretman" obuhvata ubla\avanje ili spre avanje barem jednog simptoma ili drugog aspekta nekog poremećaja, ili smanjenje ozbiljnosti bolesti, i slično. Pored toga, "tretman" se još odnosi na primenu ovde opisanog terapijskog agensa za sprečavanje ili ublažavanje barem jednog simptoma ili drugog aspekta poremećaja kod subjekta kom je potrebno. Protein za vezivanje antigena ne treba da utiče na potopuno lećenje, ili iskoreni svaki simptom I manifestaciju bolesti da čini održivi terapijski agens Kako je priznat u oblasti na koju se odnosi, tekovi korišćeni kao terapijski agensi mogu smanjiti ozbiljnost datog stanja bolesti, ali ne treba da ponište svaku manifestaciju bolesti da bi se posmatrali kao korisni terapijski agensi. Slično, profilaktirčni primenjena terapija ne treba da bude potpuno delotvorna za sprečavanje pojave stanja kako bi bila održiv profilaktički agens Jednostavno smanjenje uticaja bolesti (na primer, smanjenjem broja ili ozbiljnosti njenih simptoma, ili poveanjem dejstva druge terapije, ili proivvodnjom drugog korisnog dejstvaj, ili smanjenjem verovatnoe da će se bolest pojaviti ili pogoršati kod subjekta, je dovoljna Jedno izvođenje ovog pronalaska je usmereno na primenu leka pacijentu aktivin A antagonista prema ovom pronalasku u količini i za vreme dovoljno da se izazove održano poboljšanje nad osnovnom linijom indikatora koja održava ozbiljnost određenog poremećaja.

[0201]Kao što je jasno o ovoj oblasti, farmaceutske supstance koje obuhvataju antitela prema ovom pronalasku se primenjuju subjektu kom su potrebne na naćm koji je adekvatan indikaciji. Farmaceutske supstance moguće je primeniti bilo kojom pogodnom tehnikom, uključujući ali ne ograničavajući se na parenteralnu primenu. topikalnu primenu, ili primenu udisanjem. Ako se ubrizga, farmaceutska susptanca može biti primenjena, na primer, preko intra-artikularne, intravenske, intramuskularne, intralezione, intreperitonealne ili potkožne putanje u vidu bolusne injekcije ili kontinualne infuzije. Lokalizovana primena. npr. na mestu bolesti ili povrede se uzima u obzir, kao što je transdermalna isporuka i zadržano ispuštanje iz implanta Isporuka putem inhalacije obuhvata, na primer, nazalnu ili oralnu inhalaciju, upotrebu nebulizera. inhalaciju antagonsta u obliku aerosola, i slično. Druge alternative obuhvataju kapi za oči. oralne preparante uključujući pilule, sirupe, lozenge ili gumu za žvakanje, i topikalne preparate kao što su losioni, gelovi, sprejevi. i masti

[0202]Upotreba proteina za vezivanje antigena uex vivoprocedurama se takođe razmatra Na primer, krv pacijenta ili druga telesna tečnost može biti dovedena u kontakt sa proteinom za vezivanje antigena koji vezuje aktivin A pune dužine, jednu ili više izoformi aktivina A, ili drugi aktivin A delimične dužine exvivo.Protein za vezivanje antigena može biti vezan na pogodnu nerastvorljivu matricu ili čvrsti nosač.

[0203]Preporučljivo, proteini za vezivanje antigena se primenjuju u obliku supstance koja obuhvata jednu ili više dodatnih komponenata kao što je fiziološki prihvatljiv nosač, escipijent ili razblaživač Opciono, supstanca dodatno obuhvata jedan ili više fiziološki aktivnih agenasa, na primer, drugu supstancu za inhibiranje receptora aktivina A, anti-angiogensku supstancu, hemoterapijsku supstancu, analgetičku supstancu, itd., čiji su neekskluzivni primeri ovde dati. U različitim određenim izvođenjima, supstanca obuhvata jedan, dva, tri, četiri, pet. ili šest fiziološki aktivnih agenasa pored proteina za vezivanje antigena vezivanja aktivina A

[0204]U jednom izvođenju, farmaceutska supstanca obuvhata protein za vezivanje antigena prema ovom pronalasku zajedno sa jednom ii više supstanci izabranih iz grupe koja se sastoji od puferskog sredstva, antioksidansa kao što je askorbinska kiselina, polipeptid male molekularne težine (kao što su oni koji imaju manje od 10 amino ksielina), protein, amino ksielina, karbohidrat kao što je glukoza, saharoza ili dekstnni, helirajući agens kao što je EDTA. glutation. stabilizator, i ekscipijent Neutralni puferovani slani rastvor ili slani rastvor pomešan sa albumin serumom iste vrste su primeri odgovarajućih razblaživača. U skladu sa odgovarajućim standardima industrije, konzervansi kao što je benzil alkohol mogu takođe biti dodati Jedinjenje može biti formulisano kao liofilizat korišćenjem odgovarajućih rastvora ekscipijenta (npr saharoza) kao razbiaživača Pogodne komponente su netoksične po primaoce u dozama i koncentacijama koje su koriščene. Dalji primeri komponenata koje mogu biti koriščene u farmaceutskim formulacijama su predstavljeni u Remington's Pharmaceutical Sciences. 16th Ed. (1980) and 20th Ed. (2000). Mack Publishing Company. Easton.

PA

[0205]Kompleti za upotrebu od stane zdravstvenog osoblja mogu obuhvatiti protein za vezivanje antigena prema ovom pronalasku i nalepnici ili druga uputstva za upotrebu za lećenje bilo kog stanja razmatranog ovde. U jednom izvođenju, ovaj komplet obuhvata sterilni preparat jednog ili više proteina za vezivanje antigena, koji mogu biti u obliku supstance kako je ovde opsiano, i mogu da budu u jednoj ili više bočica.

[0206]Doze i učestalost primene mogu varirati u skladu sa tim faktorima kao što je ruta priemne, konkretni korišćeni proteini za vezivanje antigena, priroda i ozbiljnost bolesti koju treba lečiti, da li je stanje akutno ili hronično, i veličina i opšte stanje subjekta Odgovarajuće doze moguće je odrediti postupcima poznatim u odgovarajućoj oblasti, npr u kliničkim ispitivanjima koja mogu da obuvhate studije za povećanje doze

[0207]Protein za vezivanje antigena prema ovom pronalasku može biti primenjen, na primer. jednom ili više od jednom, npr u redovnim intervalima tokom nekog vremenskog perioda. U određenim izvođenjima, protein za vezivanje antigena je primenjen tokom perioda od barem jednog meseca ili duže, npr, tokom jednog, dva. ili tri meseca ili čak neograničeno. Za iečenje hroničnih uslova, dugotrajna terapija je generalno najdelotvornija Međutim za Iečenje akutnih stanja, primena na kraće periode, od jedne do šest nedelja, može biti dovoljna. Generalno, protein za vezivanje antigena je primenjen sve dok pacijet manifestuje medicinski relevantan stepen poboljšanja nad osnovnom linijom za izabrani indikator ili indikatore

[0208]Određena izvođenja ovog pronalaska obuhvataju primenu proteina za vezivanje antigena u dozi od oko 1 ng proteina za vezivanje antigena po kg telesne težine subjekta na dan ("1 ng/kg/day") do oko 10 mg/kg/day, još preporučljivije od oko 500 ng/kg/dnevno do oko 5 mg/kg/dnevno, i najpreporučljivije od oko 5 pg/kg/dnevno do oko 2 mg/kg/dnevno, subjektu. Kod dodatnih izvođenja, protein za vezivanje antigena se primenjuje kao lek odraslim osobama jednom nedeljno. dva puta nedeljno, ili tri ili više puta nedeljno, da se leći bolest posredovana aktivinom A, stanje ili poremećaj, npr., medicinski poremećaj ovde opisan Ako se ubrizga, delotvorna količina proteina za vezivanje antigena po dozi odrasle osobe može biti u opsegu od 1-20 mg/m<2>, i preporučljivo je oko 5-12 mg/m<2>. Alternativno, moguće je dati fiksnu dozu, količina može da se kreće u opsegu od 5-100 mg/dozi. Jedan ospeg za fiksnu dozu je oko 20-30 mg po dozi. U jednom izvođenju, fiksna doza od 25 mg/dozi se primenjuje ponovljeno putem injekcije Ako se kao ruta primene leka ne koristi injekcija doza se odgovarajuće pnlagođava u skladu sa standardnim zdravstvenim praksama. Jedan primer terapijskog režima obuhvata ubrizgavanje doze od oko 20-30 mg proteina za vezivanje antigena jednom do tri puta nedeljno tokom perioda od barem tri nedelje , iako tretman u dužim periodima može biti neophodan za uvođenje željenog stepena poboljšanja. Za pedijatrijske subjekte (starost 4-17), izuzetno pogodan režim obuhvata potkožnu injekciju od 0,4 mg/kg, sve do maksimalne doze od

25 mg proteina za vezivanje antigena pnmenjenog dva ili tri puta nedeljno.

[0209]Posebna izvođenja ovde obezbeđenih metoda obuhvata potkožnu injekciju od 0,5 mg do 10 mg, preporučljivo od 3 do 5 mg, proteina za vezivanje antigena, jednom ili dva puta nedeljno Jedno drugo izvođenje je usmereno na primenu u pluća (npr . nebulizerom) 3 ili više mg proteina za vezivanje antigena jednom nedeljno

[0210]Primeri terapijskih režima objašnjenih ovde obuhvataju potkožno ubrizgavanje proteina za vezivanje antigena jednom nedeljno, u dozi od 1,5 do 3 mg, za Iečenje stanja u komk signaliziranje aktivina A igra nekakvu ulogu. Primeri takvih stanja su ovde dati i obuhvataju, na primer, kaheziju. kancer, reumatoidni artritis, i sve uslove u kojima gubitak telesne težine, mase tela, masnoće tela. ili nesposobnost da se održi telesna težina, telesna masa. masnoća tela, igra nekakvu ulogu. Nedeljna primena proteina za vezivanje antigena se nastavlja sve dok se ne postigne željeni rezultat, npr, opadanje simptoma kod subjekta Terapija može da se produži po potrebi, ili. alterntivno, moguće je primeniti doze za održavanje.

[0211]Svi drugi primeri terapijskih režima ovde dati obuhvataju potkožnu i mtravensku primenu doze 1, 3, 5, 6, 7 8, 9, 10. 11, 12, 15, ili 20 miligrama inhibitora aktivina A prema ovom pronalasku po kilogramu telesne mase subjekta (mg/kg) Ovu dozu je moguće jednom dati subjektu, ili više od jednom u izvesnom intervalu, na primer jednom dnevno, tri puta nedeljno, dva puta nedlejno, jednom nedeljno, tri puta mesečno, jednom mesečno, jednom svaka dva meseca, jednom svaka tri meseca jednom svakih šest meseci, ili jednom godišnje Trajanje terapije, i sve promene u dozi i/ili učestalosti terapije, moguće je promeniti ili varirati tokom lečenja kako bi se zadovoljile određene potrebe subjekta.

[0212]U drugom izvođenju, protein za vezivanje antigena se primenjuje subjektu u količini i na vremenski period dovoljan da se izaove poboljšanje, preporučljivo održavno poboljšanje, kod barem jedno indikatora koji odražava ozbiljnost poremećaja koji se leči Različiti indikatori koji odražavaju nivo bolesti subjekta, bolest ili stanje može biti procenjeno za određivanje da li je dovoljna ta količina i to vreme tretamna Takvi indikatori obuhvataju, na primer. klinički prepoznate indikatore ozbiljnosti bolesti, simptoma, ili manifestacija poremećaja o kom se radi U jednom izvođenju smatra se da je poboljšanje održano ako subjekat ispoljava poboljšanje u barem dve situacije odvojene periodom od dve do četiri nedelje. Stepeni poboljšanja generalno određuje lekar, koji može ovu odluku da donese na osnovu znakova, simptoma, biopsija, ili drugih rezultata testiranja, i koji može takođe da koristi upitnike koji se primenjuju subjektu, kao što su upitinici razvijeni za tu bolest a koji se odnose na kvalitet života.[0213]Nivoi aktivina A kod subjekta mogu biti nadgledani pre, tokom i/ili posle terapije sa proteinom za vezivanje antigena, da se detektuju promene. ako ih ima. u njihovim nivoima Za neke poremećaje, pojava povišenih noa aktivina A može da varira u skladu sa takvim faktorima kao što je faza bolesti ili određeni oblik bolesti Poznate tehnike moguće je koristiti za merenje nivoa aktivina A, npr. u subjektovom serumu Nivoe aktivina A u uzorcima krvi moguće je izmeriti korišćenjem pogodne tehnike, na primer, ELISA.

[0214]Određena izvođenja supstanci prema ovom pronalasku obuhvataju upotrebu proteina za vezivanje antigena i jedan ili više dodatnih antagonista aktivina A, na primer. dva ili više proteina za vezivanje antigena prema ovom pronalasku, ili protein za vezivanje antigena prema ovom pronalasku i jedann ili više drugih antagonista aktivina A. U daljim izvođenjima, protein za vezivanje antigena se primenjuje zajedno ili u kombinaciji sa drugim agensima korisnim za Iečenje stana kojim je pacijent pogođen, Primen takvih agenasa obuhvataju i belančevinaste i nebelančevinaste lekove Kada se više lekova zajedno primeni, doze mogu da budu prilagođene sa tim u skladu, kao što je prepoznato u ovoj oblasti "Zajedniča primena" i kombinovana terapija se ne ograničavaju na istovremenu primenu, već takođe obuhvataju režime tretmana u kojima se protein za vezivanje antignea primeni barem jednom tokom tretmana koji obuvhata primenu barem još jednog terapijskog agensa pacijentu.

[0215]Primeri drugih agenasa koji mogu biti primenjeni zajedno sa proteinom za vezivanje antigena su drugi proteini za vezivanje antigena ili terapijski polipeptidi koji su izabrani u skladu sa određenim stanjem koje teba lečiti Alternativno, nebelančevinasti tekovi koji mogu biti korisni za Iečenje jednog od određenih stanja razmatranih gore mogu da budu zajedno primejeni sa antagonistom aktivina A.

Kombinovana terapija

[0216]Metod za Iečenje subjekta sa proteinom za vezivanje antigena koji inhibira aktivin A i jednim ili više drugih tretmana se opisuje Takva kombinovana terapija može da postigne sinergiju ili aditivno dejstvo putem, na primer, napada više mesta ili molekularnih ciljeva u tumoru. Tipovi kombinovanih terapija koje je moguće koristiti u vezi sa ovim pronalaskom obuhvataju inhibiranje ili aktiviranje (kako je prikladno) više čvorova u jednoj sa bolešću povezanoj putanji, višestruke putanje u ciljnoj ćeliji, i više tipova ćelije u ciljnom tikvu (npr , unutar tumora) Na primer inhibitor aktivina A prema ovom pronalasku može biti kombinovan sa terapijom koja unapređuje apoptozu ili inhibira angiogenezu U drugom izvođenju, ciljani agens, onaj, koji kada se koristi sam, ne izaziva terapijski željeno dejstvo. bi mogao da se koristi, na primer da se senzitizuju ćelije kancera ili da se poveća dejstvo tretmana drugih agenasa. U drugom izvođenju, inhibitor aktivina A prema ovom pronalasku se koristi u kombinaciji sa citotoksičnim lekom ili drugim ciljanim agensom koji izaziva apoptozu U drugom izvođenju, inhibitor aktivina A se koristi u kombinaciji sa jednim ili više agenasa koji inhibiraju različite ciljeve koji su uključeni u opstanak ćelije (npr.. PKB, mTOR). drugi receptor tirozin kinaza (npr., ErbB1, ErbB2, c-Met, c-kit), ili različiti tipovi ćelije (npr, KDR inhibitori, c-fms). U drugom izvođenju, inhibitor aktivina A prema ovom pronalasku se dodaje postojećem standardu nege za određeno stanje. Primeri terapijskih agenasa obuhvataju, ali se ne ograničavaju na, gemcitabin, taksol, taksoter, i CPT-11.

[0217]U drugom izvođenju, ovaj postupak obuhvata primenu jednog ili više ovde opisanih antagonista aktivina A i jednog ili više tretmana(npr ,terapijska ili palijativna terapija), na primer, terapija protiv kancera (kao što je hirurška operacija, ultrazvuk, radioterapija, hemoterapija, ili terapija sa drugim agensom protiv kancernim). Tamo gde metod obuhvata primenu više od jednog tretmana subjektu, jasno je da je redosled, izbor momenta, broj. koncentracija, i količina pnmenjenih doza ograničen samo medicinskim zahtevima i ograničenjima tretmana, t.j , dva tretmana moguće je dati subjektu, npr., istovremeno, konsekutivno, alternativno, ili u skladu sa bilo kojim drugim režimom Primeri ovde opisanih agenasa koje je moguće primeniti u kombinaciji sa antagonistima aktivina A obuhvataju, ali se ne ograničavaju na, neutrofi pojačavajuće agense, irmotekan, SN-38, gemcitabin, herstatin, ili derivat herstatina za vezivanje aktivina A (kako je ovde opisano, na primer, u U S Pat App. No. 05/0272637), AVASTIN® (Genentech, South San Francisco, CA), HERCEPTIN®

(Genentech), RITUXAN® (Genentech), ARIMIDEX® (Astra- Zeneca, vVilmington. DE), IRESSA®

(AstraZeneca), BEXXAR® (Corixa. Seattle, WA), ZEVALIN® (Biogen Idec, Cam- bridge, MA), ERBITUX® (Imclone Systems Inc. New York NY). GEMZAR® (Eli Lilly and Co , Indianapolis, IN), CAMP- TOSAR® (Pfizer, New York. NY) GLEEVEC® (Novartis), SU-11248 (Pfizer), BMS-354825 (Bristol-Myers Squibb). panitumumab (Abgenix, Fremont. CA/Amgen Ine . Thousand Oaks, CA), and denosumab (Amgen Inc., Thousand Oaks, CA).

[0218]Razvoj pogodnih režima doziranja i tretmana za upotrebu određenih ovde opisanih supstanci na raznovrsnim režimima tretmana, uključujući npr . potkožnu, oralnu, parenteralnu. intravensku, intranazalnu, i intramuskularnu primenu i formulaciju, je dobro poznat u ovoj oblasti, neke od njih se kratko razmatraju ispod za potrebe opšte ilustracije

[0219]U nekim primenama, farmaceutske supstance opisane ovde mogu da budu isporučene u vidu oralne primene doze životinji . Kao takva, ove jedinjeja mogu da budu formulisana sa inertnim razblaživačem ili sa jestivim nosačem koji se može asimilovati, ili oni mogu biti obuhvaćeni u kapsuli želatina sa tvrdim ili mekim oklopom, ili mogu da budu sabijeni u tablete, ili mogu da budu ugrađen direktno sa namirnicama za ishranu

[0220]U nekim okolnostima biće poželjno dati farmaceutske supstance ovde opisano potkožno parenteralno, intravenski, intramišićno, ili čak intraperitoneaino. Takvi pristupi su dobro poznati stručnjaku u ovoj oblasti, neki od ovih pristupa su opisani u daljem tekstu, na primer, u U S Patent No. 5,543,158; U.S. Patent No. 5,641,515 and U S Patent No 5.399.363 U takvim izvođenjima, rastvori aktivnih jedinjenja kao slobodna baa ili farmakološki prihvatljive soli mogu da budu pripremljeni u vodi pogodno pomešanoj sa površinski aktivnim sredstvom (surfaktantom), kao što je hidroksipropil celuloza. Disperzije mogu takođe biti pripremljene u glicerolu, tečnim polietilenskim glikolima, i njihovim mešavinama u uljima. Pri običnim uslovima skladištenje i upotreba, ovih preparata obično će sadržati konzervans da se spreči rast mikroorganizama.

[0221]Ilustrativni farmaceutski oblici pogodni za upotrebu kao injekcije obuhvataju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne prahove za improvizovanu pripremu sterilnih rastvora za ubrizgavanje ili disperzija (na primer, videti U S Patent No 5,466,468) U svim slučajevima ovaj oblik mora biti sterilan i mora biti tečan do mere da se lako šprica iglom Mora biti stabilno pod uslovima proizvodnje i skladitšenja i mora biti sačuvano od kontaminiranja od strane mikroorganizama, kao što su bakterije i gljive. Nosač mora biti rastvarač ili disperziona podloga koja sadrži, na primer, vodu, etanoi, poliol (npr., glicerol, propilen glikol, i tečni polietilen glikol, i slično), njihove pogodne mešavine, i/ili biljna ulja. Odgovarajuća fluidnost mora biti održana, na primer, upotrebom obloga, kao što je lecitiin, održavanjem potrebne veličine čestice u slučaju disperzije i/ili upotrebom surfaktanata. Sprečavanje aktivnosti mikroorganizama moguće je olakšati različitim antibakterijskim i antigunicidnim agensima, na primer, parebnima, hlorobutanolom, fenolom, askorbinskom kiselinom, timerosalom, i sličnim. U brojnim slučajevima, preporučljivo je obuhvatiti izotonične agense na primer šećere ili natrijum hlorid. Produžena apsorpcija jedinjenja koja se ubrizgavaju može biti obezbešena uptorebom jedinjenja agenasa koji odlažu apsorpciju, na primer aluminijum monostearat i želatin

[0222]U jednom izvođenju, za parenteralnu primenu u vodenom rastvoru, rastvor treba da bude pogodno puferovan ako je neophodno i tečan razblaživač prvo učinjen izotoničnim sa dovoljnim slanim rastvorom ili glukozom Ovi određeni vodeni rastvori su posebno pogodni za intravensku, intramišićnu, potkožnu i intraperitonealnu primenu U vezi sa ovim sterilna vodena podloga koja se može koristiti će biti poznata stručnjaku u ovoj oblasti u svetlu ovog opisa Na primer, jedna doza može biti rastvorena u 1 ml izotoničnogNaCI rastvora i bilo dodata u 1000 ml tečnosti za hipodermoklizu ili ubrigano na predloženo mesto infuzije, (videti na primer. Remington's Pharmaceutical Sci- ences, 15th ed , pp 1035-1038 and 1570-1580) Neke varijacije doze će obavezno nastati zavisno od stanja subjekta koji se leći, Pored toga, za prmenu čoveku. preprarati će naravno preporučljivo zadovoljiti standarde sterilnosti, pirogenosti. i opšte bezbednosti i čistoće kako propisuje Ured za biološke standarde Američke agencije za hranu i lekove (FDA Office of Biologics standards).

[0223]U drugom izvođenju ovog pronalaska, ovde opisana jedinjenja mogu biti formulisana uu neutralnom ili slanom obliku. Ilustrativno farmaceutski prihvatljive soli obuhvataju kisele adicione soli (formirane sa slobodnim amino grupama proteina) i koje se formiraju sa neorganskim kiselinama kao što je, na primer. hlorovodonična kisleina ili fosforna kiselina, ili takve organske kiseline kao što je sirćetna, oksalna, tartarna, bademova, i slične Soli formirane sa slobodnim karboksilnim grupama mogu takođe da budu izvedene iz neorganskih baza kao što je, na primer. natrijum, kalijum, amonijak, kalcijum, ili gvožđe hidroksidi, i takve organske baze kao što je izopropilamin, trimetilamin, histidin, prokaine i slične Posle formlacije. rastvori će biti primenjeni na način kompatibilan sa formulacijama doze u takvoj količini da su terapijski delotvorni

[0224]Nosači mogu još da obuhvate bilo koji ili sve rastvarače, disperzione podloge, pomoćna farmaceutska sredstva, obloge, razblaživače antibakterijske i antifungicidne agense, izotonične i agense za odlaganje apsorpcije, puferska sredstva, rastvore nosača, suspenzije, koloide, i slično Upotreba takvih medija i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je dobro poznata u ovoj oblasti Osim ukoliko je kao bilo koja konvencionalna podloga ili agens nekompatibilan sa aktivnim sastojkom, njegova upotreba u terapijskim jedinjenjima se razmatra Dopunski aktivni sastojci mogu takođe da budu ugrađeni u ove supstance Fraza "farmaceutski prihvatljivo" se odnosi na molekularne entitete na molekularne entitete i kompozicije koje ne proizvode alergijsku ili sličnu neželjenu reakciju kada se primenjuje na čoveku

[0225]U nekim izvođenjima, lipozomi, nanokapsule, mikročestice. čestice lipida, vezikule, i slično, su korišćeni za uvod jedinjenja prema ovom pronalasku u pogodne ćelije/organizme domaćina Posebno, jedinjenja prema ovom pronalasku mogu da budu formulisani za isporuku bilo u obliku kapsule u čestici lipida, lipozoma, vezikulu, nanosferu, ili nanočesticu ili slično. Alternativno, jedinjenja prema ovom pronalasku mogu da se pronađu, bilo kovalentno ili nekovalentno, na površinu takvih pomoćnih sredstava nosača

[0226]Formiranje i upotreba lipozoma i priprema sličnih lipozomu kao potencijalnih nosača leka je generalno poznat onim koji su stručni u oboj oblasti (videti na primer. Lasic. Trends Biotechnol. 16(7):307-21, 1998; Takakura, Nippon Rinsho 56(3) 691-95, 1998; Chandran et al., Indian J Exp Biol. 35(8):801-09. 1997, Margalit, Crit Rev. Ther Drug Carrier Syst 12(2-3) 233-61, 1995; U.S. Patent No 5,567,434; U.S. Patent No 5.552.157; U S Patent No 5,565,213; U S Patent No 5,738,868 and U.S. Patent No 5,795,587, ) Upotreba lipozoma ne izgleda da se povezuje sa autoimunim odgovorima ili neprihvatljivom toksićnošću posle sistemske isporuke U nekim izvođenjima, lipozomima su formiane iz fosfolipida koji se raspršuju u vodenom medijumu i spontano formiraju multilamelarne koncentrične đvoslojne vezikuie (takođe poznate pod pojmovima višelamelarne vezikuie (MLV)).

[0227]Alternativno, u drugim izvođenjima ovaj pronalak obezbeđuje farmaceutski prihvatljivu nanokapsulu za mutacije jedinjenja prema ovom pronalasku Nanokapsule mogu generalno da obuhvate zahvaćena jedinjenja na stabilan i reproduktivan način (videti. na primer, Quintanar-Guerrero et al , Drug Dev Ind Pharm. 24(12) 1113-28, 1998). Da se izbegnu neželjena dejstva usled intraćelijskog polimernog preopterećenja, takve ultrafine čestice (veličina oko 0,1 um) može biti projektovano korišćenjem polimera koji mogu da budu degradiraniin vivo.Takve čestice mogu da se naprave kako je ovde opisano, na priemr, od strane Couvreur et al Crit. Rev Ther. Drug Carrier Syst 5(1)1-20, 1988; zur Muhlen et al . Eur J Pharm Biopharm 45(2) 149-55, 1998; Zambaux et al., J. Controlled Release 50(1-3):31-40. 1998; and U S Patent No 5,145,684

[0228]Pored toga, farmaceutske supstance prema ovom pronalasku može da se postavi u posudama, duž ambalažnih materijala koji obezbeđuju uputstva u vezi sa upotrebom takvih farmaceutskih supstanci. Generalno, takva uputstva će obuhvatiti opipljivo ispoljavanje koje opisuje koncentraciju reagensa, kao i u izvesnim izvođenjima, relativne količine sastojaka ili razblaživača ekscipijenata (npr , voda, slani rastvor ili PBS) koji može biti neophodan da se rekonstruiše farmaceutska supstanca.

[0229]Doza koja se primeni kao lek može biti u opsegu od 0,01 mg/kg do 100 mg/kg telesne težine Kako je očigledno stručnjaku u ovoj oblasti, količina i učestalost primene će zavisiti, naravno, od takvih faktora kao što je priroda i ozbiljnost indikacije koja se leci, željenog odgovora, stanja pacijenta, tako dalje Najčešće, jedinjenja mogu da se primene različitim tehnikama, kako je navedeno gore.

[0230]Dijagnostički komplet obuhvata barem jedan agens za vezivanje anti-aktivma A prema ovom pronalasku se takođe opisuje,

[0231]Pored toga, takav komplet može opciono obuhvata jedan ili više sledećeg;

(1) uputstva za upotrebu jednog ili više agenasa za vezivanje za analiziranje, dijagnostikovanje, prognozu, terapijski monitoring

ili u kombinaciji ovih pnmena;

(2) nalepnicom označeni partner za vezivanja na agens(e) za vezivanje anti-aktivina A; (3) čvrsta faza (kao što je reagensna traka) posle koje se imobilišu agens(i) za vezivanje anti-aktivina A; i (4) nalepnica ili umetak koji označava validno odobrenje za upotrebu za analizu, dijagnostiku, prognostiku ili terapijsku upotrebu ili njihove bilo koje kombinacije.

Ako nije dat nikakav nalepnicom označen partner za vezivanje, agensi za vezivanje sami mogu da budu označeni jednim ili više detektibilnih markera. npr , hemiluminisccentnih, enzimskih, fluorescentnih, ili radioaktivnih delova.

[0232]Sledeći pnemri se nude samo kao ilustracija, a ne kao ograničenje

PRIMERI

PRIMER 1

REKOMBINANTNA EKSPRESIJA AKTIVINA A

[0233]Ultra filtracija i diafiltraciia ( UF/ DF) podloga stavljenih pod kontrolisane uslove. R-HuAktivinA je ispoljen u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO) Niz koraka je razvijen da se generiše aktivan, prečišćen materijal. Proces prečišćavanja je počeo koncentrovanjem (diafiltracijom) podloge stavljene pod kontrolisane uslove (CM ) između 15 do 20 ponavljanja korišćenjem Amicon S10Y10 spiralne patrone. Podloga je često puferski izmejena (diafiltnrana) korišćenjem 5 zapremina 10 mM tris pufera Ph 7,0, filtrirana i skladištena skladištena

[0234]Hromatografija za zamenu katjona Primenjen je r-HuActivin A u dozi od 5 ml/minuti na 4-80C na 2,6 X 7 cm (Pharmacia) S-Sepharose Fast Flow stubu sa brzim protokom uravnotežen u 10 mM Tris pufera Ph 7,0 Stub je opran sa puferom za dovođenje u ravnotežu Iz stuba je r-HuActivin A eluiran sa gradijentom povećanja koncentracije natrijum hlorida do 0,4 M iznad 20 zapremina stuba puferovanih sa 10 Mm Tris Ph 7,0. Odgovarajuće frakcije su ostavljene za zalihe I čuvane na 4-80C.

[0235]Reverzna faza HPLC C4 Hromatografija PH zaliha S-Sepharose stuba je podešena na 2.0 sa triflurosirćetnom kiselinom (TFA). Zaliha je zatim spojena na 1 X 25 cm Vydac C4 kolona na sobnoj temperaturi izjednačenoj sa 75% A puferskim sredstvom (0.1% TFA u vodi), i 25% B puferskog sredstva (90% acetonitril, 0,1% TFA, 9.9% vode) Stub je zatim opran sa puferom za dovođenje u ravnotežu R-HuAktivin A je ispran sa gradijentom od 25% B pufera na 50% B pufera tokom 50 minuta pri brzini protoka od 5 ml/minuti Odgovarajuće frakcije su ostavljene za zalihe i liofilisane.

[0236]Hromatografija visoke performanse za zamenu kationa 5ml S Sepharose High Performance stuba visoke performanse je dovedeno u ravnotežu sa 8 M uree. 10 mM natirjum fosfata, Ph 7,0 (A pufersko sredstvo) na sobnoj temperaturi. Liofilisana C4 zaliha je vraćena u suspenziju u A puferu i primenjena na 5 ml/minuta, i oprana sa A puferskim srestvom. r-HuActivin A je eluiran iz stuba sa gradijentom povećanja koncentracije natrijum hlorida na 0.15 M iznad 30 zapremine stuba su puferovane sa 8M uree. 10 mM natrijum fosfata, pH 7.0 Odgovarajuće frakcije su ostavljene za zalihe i čuvane na 4-80 'C

[0237]Reverzna faza HPLC C4 Hromatografiia PH zaliha S-Sepharose stuba je podešena na 2,0 sa triflurosirćetnom kiselinom (TFA) Zaliha je zatim spojena na 1 X 25 cm Vydac C4 kolona na sobnoj temperaturi izjednačenoj sa 75% A puferskim sredstvom (0 1% TFA u vodi), i 25% B puferskog sredstva (90% acetonitril, 0.1% TFA, 9.9% vode) Stub je zatim detaljno opran da se uklone urea i soli sa puferskim sredstvom za postizanje ravnoteže. R-HuActivin A je eluiran sa gradijentom o 25% B puferskog sredstva do 50% B puferskog sredstva tokom 50 minuta pri brzini protoka od 5 ml/minuta. Odgovarajuće frakcije su ostavljene za zalihe, i finalno prečišćen r-HuAktivin A je liofilisan i čuvan u alikvotima -80 °C ID BR SEK:225 obezbeđuje sekvencu amino kiseline za aktivin A

PRIMER 2;

PROIZVODNJA HIBRIDOMA PROTIV AKTIVINA A

[0238]Antitela na aktivinu A su podignuta u XenoMouse® miševa (Abgemx, Fremont, Calif.), to su miševi kojadrže ljudske gene imunoglobulina. XenoMouse® soj XMG2 je korišćen da proizvede potpuno ljudska lgG2 kapa antitela. Drugi soj je korišćen za proizvodnju potpuno ljudskih lgG4 kapa antitela. Miševi su imunizovani sa aktivinom A

[0239]Miševima je ubrizgan antigen (aktivin A) prema standardnim protokolima (US 2005/0118643: WO 2005/694879) u stopala pozadi (5 ug po stopalu) Početne injekcije sadržane u ađuvansu TiterMax® Gold (Sigma. Cat # T2684) U naknadnim injekcijama, svakom mišu je ubrizgano ukupno 5 ug antigena u ađuvansm alum gel (aluminijum-fosfatni gel ađuvans; Superfos Biosector a/s, koji prodaje E. M. Sargent Pulp and Chemical Co . Clifton NJ, kat # 1452-250). Poslednja injekcija je sadržala ukupno 10 ug antigena po mišu i nije sadržala ađuvans

[0240]Svaki miš je krvario dva dana posle svake šeste injekcije. Uzorci krvi iz onih koji su krvarili su ogledom ispitani putem ELISA da se odredi titrar antitela za aktivin A Četiri dana posle finalne injekcije, miševi su žrtvovani i njihovi pražnjenje limfnih čvorova je prikupljeno i limfosciti su oporavljeni. Limfociti iz miševa svake od tri grupe su odvojeno ostavljeni u zalihe Da bi se obogatili uzorci limfocita za B ćelije, T ćelije su brisane dodavanjem magnetnih perlica protiv CD90 (Miltenvi Biotech kat. # 491-01) i zatim su provučeni limfociti kroz LS<+>stub (Miltenvi Biotech kat. # 424-01).

[0241]Svaki od uzoraka limfocita obogaćenih B ćelijom je bio zatim fuzionisan sa ćelijama P3 mijeloma korišćenjem electrocell fusion uređaja za fuziju (Genetronic, Inc., Model ECM 2001) da se kreiraju hibridomi. Tri grupe fuzionisanih linija hibridoma su zatim raspoređene na ploče sa 96 pregrada podloge hibrodoma kao što je opisano u (WO 2005/094879) iako druge pogodne podloge mogu da se koriste u ovoj oblasti Linije hibridoma su kultivisane tokom 14 dana na 37"C, u 15% C02.

[0242]Posle 14 dana, kultura supernatanta su ispitivane u ogledu ELISA da se detektuje prisustvo ljudskih IgG antitela u aktivinu A Kulture supernatanta su zatim testirane pozitivno u tome što je ELISA bila testirana za prisustvo ljudskog kapa lanca u drugom ELISA U tom drugom ELISA, uslovi su bili identični prvom ELISA, izuzev što je sekundarno antitelo bilo kozje antitelo protiv ljudskog kapa lanca konjugovano u peroksidazi iz rena. Hibndomi koji su testirani kao pozitivni u oba ELISA ogleda su dalje prošireni da proizvedu 5 ml supernatanta za naknadno testiranje.

[0243]Ukupno 160 uzoraka hibridoma protiv aktivina A je izvedeno iz kseno miševa je skenirano korišćenjem na bazi ćelije funkcionalnog ogleda i BlAcore analize vezivanja kako je opisano u Primerima dole u tekstu. Dvadesettri hibridoma je još karakterizovano na svojstva koja se odnose na ekspresiju, pročišćavanje, ogled na bazi ćelije, analize vezivanje, analize sekvence. MS, i SEC Iz ovoga je tri jaka Mabs. A1, A2. i A3, identifikovano za dalje testiranje kako je dole opisano Sekvence amino kiselina za ova antitela su sledeče A1 ID BR SEK 9 (promenljivi laki lanac). ID BR SEK:84 (konstantni laki lanac), ID BR SEK: 10 (promenljivi teški lanac); i ID BR SEK 214 {konstantni teški lanac). A2: ID BR. SEK:25 (promenljivi laki lanac); ID BR SEK100 (konstantni laki lanac); ID BR SEK:26 (promenljivi teški lanac); i ID BR SEK 215 (konstantni teški lanac). A3 ID BR SEK 41 (promenljivi laki lanac); ID BR SEK; 108 (konstantni laki lanac): ID BR SEK 42 (promenljivi teški

lanac); i ID BR SEK:221 (konstantni teški lanac)

PRIMER 3:

ISPOLJAVANJE I PREČIŠĆAVANJE LJUDSKIH ANTITELA PROTIV LJUDSKOG AKTIVINA A U CHO ĆELIJE

[0244]CS-9 ćelije koriščene za transfekoju plazmida ekspresije anti-huAktivina A su bili u suspenziji bez seruma CHO linije ćelije. CS-9 klon je izabran kao linija ćelije domaćina za ispoljavanje rekombinantnih proteina i vraćen u podlogu bez seruma Banka je testirana na neplanirane agense i sterilnost i utvrđeno je da nema virusne, mikoplazmne i mikrobne agense.

[0245]Linije ćelija koje ispoljavaju anti-hu aktivin A su uvećane u razmeri korišćenjem uobičajenog postupka šaržnog dopremanja (fedbatch). Ćelije su inokulisane u bioreaktoru VVave posle ekspanzije. Kultura je zatim dovedena tri puta i to približno 3 dana, 5. dana i 9 dana sa bolusnim dovodima i prikupljena 11 dana. Ćelije su vrtložene i podloga je držana u kontrolisanim uslovima je filtrirana kroz desetoinčni 0,45/0,2 mikron po filteru, posle čega je usledila filtracija kroz šestoinčni 0,2 mikronski filter. Prečišćavanje Mab iz hibridoma podloge držane u kontrolisanim uslovima

[0246]U između 7 do 10 ml je dodato od C M u količini od 100 ul taloga 12 Mab Select smole dovedene u ravnotežu u PBS. Cevi su postavljene na rotatore na 4-8°C tokom noći. Cevi su centrifugirane na 1.000 X g tokom 5 minuta i nevezana frakcija je prerućena. Smola je oprana sa 5m! PBS, i centrifugirana i prerućena kao gore Smola je zatim transfektovana u SPlN-X. 0,45 um, 2ml cev Smola je oprana još dva puta sa 0,5 ml PBS i centrifugirana Mab su eluirana sa 0,2 ml 0,1 M sirćetne kiseline inkubiranjem na sobnoj temperaturi sa povremenim mešanjem tokom 10 minuta Cevi su centrifugirane, i 30 ul 1M Tris pufera Ph 8,0 je dodato u eluat Prečišćeni Mab su skladišteni 4-8°C.

PRIMER 4:

OGLED O AKTIVNOSTI AKTIVINA ZASNOVAN NA C2C12 ĆELIJI

[0247]Ovaj ogled pokazuje neutrališuću sposobnost aktivina A antitela koje se testira merenjem nivoa koji vezuje aktivin A na nejgov receptor se inhibira Linija ćelije reportera koja odgovara na aktivin je generisana putem transfekcije C2C12 ćelija mioblasta (ATCC br: CRL-1772) sa pMARE-luc konstruktom pMARE-luc konstrukt je napravljen kloniranjem dvanaest ponavljanja CAGA sekvence. što predstavlja elemente odgovora aktivina (Dennler et al EMBO 17 3091-3100 (1998)) u pLuc-MCS reporter vektor (Stratagene cat # 219087) uzvodno od TATA kutije Ćelije mioblasta C2C12 prirodno ispoljavaju receptore aktivina IIB (actRIIB) na površini ćelije. Kada aktivin veže receptore ćelije, Smad putanja se aktivira, i fosforilisani Smad se vezuje na element odgovora (Macias- Silva et al. Cell 87:1215 (1996)). daje kao rezultat ispoljavanje gena luciferaze Aktivnost luciferaze se zatim meri korišćenjem komercijalnog kompleta za ogled reportera luciferaze (kat # E4550, Promega, Madison, VVI) u skladu sa proizvođačevim protokolom

[0248]Stabilna linija C2C12 ćelija koje su transfektovane sa pMARE-luc (C2C12/pMARE klon #44)

je korišćen da se izmeri aktivnost aktivina u skladu sa sledećim postupkom

[0249]Jednaki borjevi ćelija reportera (C2C12/pMARE klon #44) su postavljeni u kulture ćelija sa 96 pregrada Prva runda analize koristila je dva razblažeja podloge držane u kontrolisanim uslovima koja sadrži antitela je izvedena sa koncentracijom aktivina A fiksiranom na 4 nM. Rekombinantni zreli aktivin A je prethodno inkubiran tokom 1 sat na sobnoj temperaturi sa podlogom držanom u kontrolisanim uslovima na 2 x i 5 x razblaženja respektivno Kultura reporter ćeije je tretirana aktivinom sa ili bez antitela tokom šest sati Aktivnost aktivina A je izmerena određivanjem aktivnosti luciferaze u tretiranim kulturama Ovaj ogled je korišćen da se početno identifikuju antitela koja su inhibirala signalnu aktivnost aktivina A u ogledu sa reporterom Naknadno, kriva titracije u devet taćaka je generisana sa koncentracijom aktivina A na 4 nM Aktivin A je prethodno inkubiran sa svakom od sledećih devet koncentracija prečišćenih antitela 0.004 nM, 0,04 nM, 0,4 nM, 4 nM, 20 nM, 40 nM, 200 nM, 400 nM i 2 uM tokom jedan sat pre dodavanja mešavine u kulturu ćelije reportera. Vrednosti IC50su bile za broj antitela A1. A2 i A3 su date u Tabeli 3

PRIMER 5:

BIACORE® ASSAY

[0250]Analiza afiniteta antitela aktivina A A1. A2 i A3 je izvedena na BIAcore®3000 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ), aparatu korišćenjem senzorskog čipa CMS.10,005 procenta P20 surfaktanta (Biacore, Inc.) kao tečnog pufera. Rekombinantni zreli protein aktivina A je imobilisan da se ispita stepen CM5 senzorskog čipa (Biacore, Inc.) preko primarnih grupa amina korišćenjem kompleta za spajanje Amine Coupling Kit (Biacore. Ine ) u skladu sa od strane proizvođača predloženim protokolom.

[0251]Ogledi sa direktnim vezivanjem su korišćeni za analizu antitela prema njihovoj sposobnosti da se vežu na imobilizovani aktivin A Ogledi vezivanja su izvedeni ubrizgavanjem dve koncentracije (40 i 400 nM) antitela svakog kandidata na površinu imobilizovanog aktivina A niskom brzinom od 50 pl/min tokom 3 minuta. Posle vremena disasocije od 3 minuta površina je regenerisana. Krive vezivanja su poređene kvalitativno za intenziteta signala vezivanja, kao i brzina disasocijacije. Kinetički parametri vezivanja antitela obuhvataju ka (association rate constant), kd (konstanta brzine disasocijacije) i KD (konstanta ravnoteže disasocijacije) su određeni korišćenjem kompjuterskog programa BIA procena 3.1 (Biacore, Inc.) Donje konstante ravnoteže disasocijacije (izražene u nM), veći afinitet antitela za aktivin A

PRIMER 6:

MAPIRANJE REGIONA ZA VEZIVANJE AKTIVINA A ZA_MONOKLONALNA ANTITELA

[0252]Regopmo za vezivanje antitela na aktivin A su određeni korišćenjem višestrukih biohemijskih metoda, korišćenjem western pod redukovanimli neredukovanim uslovima. ograničeno razlaganje protezae korišćenjem LysC, analize peptida MS, i konkurenta peptidu korišćenjem BlAcore

[0253]Cis-čvorovi su ključne strukturne karakteristike za TGF- članove familije Prekidanje S-S sa redukujućim gensom je pogoršalo struktruru aktivina A i smanjio vezivanje aktivina A na neutrališuča antiela, uključujući A-1 Ovi podaci su pokazali da su Cys čvorovi važni za vezivanje aktivina A sa ovim neutrališućim agensima koji se specifično vezuju na aktivin A u poređenju sa aktivinom B. Cys čvorovi prave dve udaljene petlje sekvenci strukturno susedne jedna drugoj. Ova dva regiona su sekvenca u regionu približno C11-S33 (prva petlja) i približno C81-E111 (druga petlja) aktivin A (Slika 7). Ograničeno razlaganje LysC je otkrilo da su ova dva regiona zaštićena antitelom A-1. što označava da međusobno reaguju sa neutrališućim antitelima direktno Ova neutrališuča antiela su osetljvia na konformacione promene aktivina A, što nagoveštava da se vezuju na nelinearne epitope antigena Dalja analiza peptida je označila da fragmenti G-1 do K7 i S57-F74 u aktivinu A nisu obavezni za njegovo vezivanje sa neutrališućim antitelima direktno. Poređenej sekvence aktivina A u poređenju sda aktivinom B pokazuje da dolazi do nekih razlika sekvenci u ovom regionu

PRIMER 7

OGLEDI SELEKTIVNOSTI

[0254]Ovi ogledi su izvedeni korišćenjem BlAcore® tehnologije, da se odredi selektrivnost vezivanja antitela A1, A2 i A3 na različite aktivine i druge TGF-fJ članove familije, uključujući aktivn A, aktivin B, aktivin AB, inhibin A, GDF-8, GDF-11, TGF-IM, TGF-U-3, i BMP4 (svi iz R & D Systems). ActRIIB/Fc je kovalentno spojen na čipove senzora klase za istraživanje u skladu sa protokolom koji je predložio proizvođač. Zato što BlAcore ogledi detektuju promene u refraktivnom indeksu, razlika između odgovora detektovan as ubrizgavanjem preko irnobilizovanih površina receptora u poređenju sa odgovorom detektovanim sa ubrizgavanjem preko kontrolne površine u odsustvu bilo kakvog antiela predstavlja starno vezivanje različitih liganda na ovaj receptor Sa prethodno mkubiranim antitrelima i aktivinom i TGF- mol- ekulima, promena (povećanje ili smanjenje) u vezujućem odgovoru označava vezivanje antitela na TGF familiju molekula Ova antitela se vezuju na aktivin A ali ne na aktivin B, GDF-8, GDF-11. TGF-li-1, TGF-E-3, i BMP4, tako ukazuju na specifičnost za aktivin A

PRIMER 8

KINEX A™ OGLEDI SA USPOSTAVLJANJEM RAVNOTEŽE

[0255]Korišćeni su ogledi vezivanja za uspostavljanje ravnoteže na bazi rastvora korišćenjem KinExA™ tehnologije (Sapidyne Instruments. Ine ) da se odredi ravnoteža disasocijacije (KD) aktivina A vezivanjem na molekule antitela. Ogled na bazi rastvora se smatra mnogo osetljivijim nego što je BlAcore ogled u nekim primerima Reacti-Gel™ 6X je bio prethodno obložen sa oko 50 ug/ml aktivina A tokom noći. i zatim blokiran sa BSA. 30 pM i 100 pM uzoraka antitela je inkubirano sa različitim koncentracijama (0,5 pM do 5 nM) aktivina A u uzorku puferskog sredstva na sobnoj temperaturi tokom 8 sati pre nego što je provučen kroz aktivinom A obložene perlice Količina antitela vezanog perlicom je kvantifikovana fluorescentno (Cy5) označenim kozjim antitelom protiv Ijudskog-Fc na 1 mg/ml u superbloku. Signal vezivanja je bio proprcionalan koncentraciji slobodnog antitela pri ravnoteži sa datom koncentracijom aktivina A KD je dobijen od nelinearne regreje konkurentnih krivulja korišćenjem modela homogenog vezivanja na sa dve krive jednom mestu koji je dat u KinEx A™ softveru (Sapidyne Instruments, Inc.). Rezultati su prikazani na Slici 8 A1 pokazuje najjači afinitet vezivanja za aktivin A (Kq~3

pM). A2 i A3 vezani na aktivin A pri -15 pM i~8 pM, respektivno

PRIMER 9:

ZAŠTITNA DEJSTVA ANTI-AKTIVINA NA GUBITAK TELESNE TEŽINE I MIŠIĆNE MASE NA KOLAGENOM IZAZVANOM MODELU ARTRITISA

[0256]Ovaj primer je projektovan da ispita da li inhibitori aktivina mogu da spasu stanje gubitka mišića primećeno kod artritisa izazvanog kolagenom. Kolagenom izazvan artritis (CIA) je široko korišćen model miša koji deli nekoliko kliničkih i patoloških karakteristika sa reumatoidnim artritisom (RA). Preizan mehanizam za CIA nije poznat, međutim, postoji značajan dokaz da se zaključi da CIA jeste Th-1 posredovano inflamatorno oboljenje Reumatoidn artritis je česta autoimuna bolest koja vodi do upale zglobova, i progresivne erozije hrskavice/kosti Ćak ako je napredovanje RA pod kontrolom, gubitak BCM nije ispravljen bez dodatne,, direktne intervencije

[0257]Kolagenom izazvan model artritisa je pripremljen kako je opisano u nastavku Korišćeni su DBA/1 J mujaci miševa (The Jackson Laboratory. Bar Harbor. ME), 8 nedelja starosti (20-23g). Imunizacija je izvedena 1. dana i 21 dana ubrizgavanjem 1000 g Bovme Collagen II (Chondrex, Redmond, WA) emulzifikovane u 100 ul CFA ili ICFA. intradermalno u osnovu repa Koriščene su tri grupe po deset mišava u svakoj. Grupa 1 (kontrola) je primila samo pomoćno sredstvo Grupa 2 (eksperimentalna, injekcija kolagena) je primila pomoćno sredstvo samo kao tretman. Grupi 3 je ubrizgan kolagen i tretirana je sa antitelom A1 protiv aktivina A

[0258]Korišćeni klinički indeks za artritis je bio.

0-normalni zglob bez znakova artritisa

1=oticanje i/ili crvenilo jednog prsta

2=dva zgloba obuhvaćena 3= više od dva zgloba

A-ozbiljan artritis cele šape i stopala

[0259]Tretman se sastoji od ubrizgavanja antitela antivina (s c ) početak 8 dana. 5 mg/kg, s c dvaput nedeljno Krajnje izmerene tačke su bile telesna težia. masa mišića/masti, unos hrane i

inflamatorni citokini

[0260]Telesna težina. Netretirane CIA životinje su izgubile dvadeset pet procenata svoje telesne težine i mišićne mase u poređenju sa normalnim životinjama, koje su dale dokaz o reumatoidnoj kaheziji, terapije protiv aktivina A (A-1) su značajno povećali (o<0.05) telesnu težinu u poređenju sa dejstvom CIA kontrole ali ne kod normalno kontrolnih životinja.

[0261]Mišićna masa Lećenje sa monoklonalnim antitelom A1 je značajno povećalo masu mišića (p<0.05) kod CIA

životinja, u poređenju sa rezultatima kod netretiranim CIA životinjama U CIA kontrolama, mišićna masa na 95 dana je bila 1,5 g; pri čemu je kod antitelom lečenih CIA životinja, mišićna masa na 95 dana bila 2,5 g. Rezultati su prikazani na Slici 1

[0262]Masa masnoće Antitelo protiv aktivina A nije prouzrokovalo reverzni proces gubitka masnoće kod CIA životinja. Rezultati su prikazani na Slici 2.[0263]Očuvanje telesne težine i mišićne mase kod lečenih životinja je dalo podršku za aktivin A antitela kao terapijsko sredstvo za poboljšanje kvaliteta života i spuštanje smrtnaosti kod onih sa reumatoidnim artritisom

PRIMER 10:

INTRAMIŠlCNI CHO/AKTIVIN KSENOGRAFT KOD MLADNIH ODRASLIH LABORATORIJSKIH MIŠEVA

[0264]CHO ćelije su stabilno transfektovan sa aktivinom A (CHO/Activin) su ugrađene u mlade odrasle CD1 nu/nu miševe preko intramišićne injekcije pri različitim dozama, 1x10^, 5x106 i 10x10^ Iste doze netansfektovanih CHO ćelija su ubrizgane u odvojene grupe miševa kao kontrole. Implantacija CHO/aktivina je izazvala brz i drastičan gubitak telesne težine u poređenju sa kontrolama.

[0265]12. dana, CHO/kontrolna grupa za 1x106 ćellJeJe imala gubitak od10%telesne težine, pri čemu je CHO/anti-aktivin A grupa imala 10% pnnos u telesnoj težini 5x10^ i 10x10^ grupe ćelije protiv aktivina A su takođe pokazale povećanje telesne težine od oko 10%. pri čemu je kontrola 5x10^ i 10x10<6>grupe ćelija izgubila 25-30% telesne težine

[0266] Nivoiseruma aktivina A kod miševa su izmereni 12 dana posle implantacije ksenografta. Nivoi seruma aktivina A u roditeljskoj CHO ugrađenoj kontroli kod mišieva su bili < 2 ng/ml. Nasuprot tome, miševi koji nose CHO/aktivin ksenograft je pokazao dramatično podignut serum aktivina A. Postojala je značajna korelacija između nivoa aktivina A seruma i ozbiljnost gubitka telesne težine kako je navedeno putem statističke analize, koja označava da je prekomerno ispoljavanje aktivina A je odgovorno za gubitak telesne težine viđen kod CHO/aktivin ksenograft miševa

[0267]Miševima (n=14 po grupi) je ugrađen CHO/Aktivin ksenograft i naknadno ubrizgan sa bilo pomoćnim sredstvom ili svakim od tri monoklonalna antitela protiv aktivina A, A1, A2 i A3 Dvanaest od četrnaest miševa u grupi pomoćnog sredstva je umrlo 25 dana posle ugradnje CHO/Aktivina, dok je samo četrdeset-dva CHO/Aktivin ugrađenih miševa u terapijskoj grupi anti-aktivm A Mab umrlo u to vreme. Do 38 dana, većina mišea u grupama sa Mab terapijom je nastavila da dobro preživljava, sa stopama sledećim opstanka: trinaest od četrnaest za Al grupu i deset od četrnaest za bilo A2 ili A3

grupu.

[0268]Podaci o telesnoj težino pokazuju da terapija sa anti-aktivinom A Mab, A1 ili A2, je potpuno sprečila gubitak telesne težine kod CHO/Aktivin miševa koji su nosili ksenograft. što je ukazalo na to da su anti-aktivin A Mab bila delotvorna u aktivnosti neutralisanja aktivnosti aktivina Ain vivo.Kako je prikazano na 3, NMR podaci su otkrili da je terapija sa anti-aktivinom A Mab, A1 sprečila progresivan gubitak nemasne telesne mase kod miševa koji su nosili CHO/aktivin Lećenje sa ovim antitelom je takođe prouzrokovalo povećan unos hrane

[0269]Podaci o nekropsiji ukazuju da je terapija sa anti-aktivin A Mab. A1 i A2, sprečila ozbiljno smanjenje nemasne težine životinjskog tela koje je utvrđeno kod miševa koji su nosili CHO/aktivin (Tabela 5) Terminalni podaci nekropsije ukazuju da je terapija protiv aktivina A sa Mab, A1 i A2, sprečila ozbiljno smanjenje mase masnoće utvrđeno kod miševa koji su nosili CHO/Aktivin ksenograft (Tabela 5).

[0270]Procenat vidljivog tumora koji su nosile životinje na mestu ksenografta je analiziran tokom terminalne nekropsije 12. dana posle implantacije CHO/Aktivina Kao što je prikazano u Tabeli 5, podaci su otkrili da je 80% miševa u grupi tretiranoj pomoćnim (farmaceutskim) sredstvom razvilo vidljivo identifikovane ksenograft tumore na mestu ubrizgavanja Primećeno je značajno smanjenje stope vidljivog formiranja tumora u terapijskim grupama protiv aktivina A sa Mab

[0271]Posle nekropsije. svi vizuelno prepoznatljivi tumori na mestima CHO/Aktivin ksenografta su disekcionirani iz životinja i izmereni Značajno smanjenje u masi tumora je primećeno u aktivin A Mab terapijskoj grupi u poređenju sa grupom koja je primala pomoćno (farmaceutsko) sredstvo (Tabela 5).

[0272]Prethodni eksperimenti o razvoju tumora ksenografa su doveli do nekoliko zaključaka u vezi sa upotrebom antitela protiv aktivina A da se poboljša opstanak od kancera, Aktivin A je igrao uzročnu ulogu u razvoju sindroma kahezije kod laboratorijskih miševa koji su nosili CHO/Aktivin ksenograft Gubitak telesne težine je dovođen u vezu u priličnoj men sa povećanjem nivoa aktivina seruma u ovom modelu. Mab antitela protiv aktivina A su sprečila gubitak telesne težine i sindrom kahezije koji je primećen kod miševa koji su nosili CHO/Aktivin ksenograft tumora Mab antitela protiv aktivina A su potisla rast ksenografta, čime je značajno smanjen procenat miševa koji su nosili vidljive tumore ksenografta kao i smanjenje veličina tumora ksenografta Mab antitela protiv aktivina A su sprečila smrt koja nastaje kao rezultat iz CHO/Aktivin eksografta, značajno promovišući opstanak životinje.

PRIMER 11

ANTI-AKTIVIN MONOKLONALNO ANTITELO Al KOD AAV-AKTIViN MIŠEVA

[0273]Postnatalno prekomerno ispoljavanje aktivina A je dovelo do ozbiljnog kaheziji sličnog sindroma gubitka kod C57B1/6 miševa Telesna težina je smanjena tokom dana 1, 4, 9 i 11. počinje od 16 grama do 14, 12.5. i najzad 10,5 grama 11. dana. Bilo je takođe i gubitka težine masnoće, nemasne težine tela životinje, i težine trbušastog mišića lista

[0274]Da bi se odredilo da li bi antitelo usmereno na aktivin A moglo ublažiti ili sprečiti dejstvo aktivina A, izvedeni su sledeći eksperimenti. AAV-aktivin ili prazni AAV vektor (kontrola) su ubrizgani na 1 x 10^<3>pfu/miš u 8 nedelja stare mužjake C57B1/6 miševa (n=10-12) preko repnih vena. Slika 5 pokazuje dejstvo monoklonalnog tela A1 protiv aktivina A na promenu telesne težine kod preoblikovanih miševa 1 , 5., 8. i 12. dana. Antitelo je sprečilo promenu telesne težine primećenu kod kontrolnih miševa. Terapija antitelom je poboljšala unos hrane za ovaj model životinje.

PRIMER 12:

ZAŠTITNO DEJSTVO ANTI-AKTIVIN-A MAB A1 PROTIV GUBITKA TELESNE TEŽINE I NMASNE MASE NA MODELU KAHEZIJE DEBELO CREVO- 26

[0275]Ovaj primer pokazuje dejstvo očuvanja mišića monoklonalnog antiela A-1 protiv aktivina A na modelu kancerne kahezije kod miša Ovaj model kancerne kahezije je uspostavljen korišćenjem sinergeničnog mišjeg debelog creva 26 inokulacije ćelija adenokarcinoma na 8.5 nedelja starim mužjacima CDF1 miševa (0,5 x 10^ ćelije/miša) na dan 0 Terapija monoklonalnim antitelom A-1 protiv aktivina- A (10 mg/kg. sc) je pokrenuta 4 dana i data je 3 puta nedeljno tokom 18. dana. Pufersko sredstvo natrijum acetata (10 nm natrijum acetat, 5% saharoza, pH 5.0) je korišćena kao pomoćno (farmaceutsko) sredstvo je korišćeno u kontrolnoj grupi miševa koji su nosili tumor Jedna grupa starosti i težina koja odgovara normalnim CDF1 miševima bez tumora je korišćena kao paralelna osnovna kontrola. Telesna težina i unos hrane je nadgledan tri puta nedeljno Veličina tumora je izmerena tri puta nedeljno digitalnim šestarima Telesni sastav je izmeren korišćenjem NMR na početku i na kraju studije da se nadgledaju promene u nemasnoj i masnoj masi Na kraju ovog eksperimenta, miševi su eutanizirani u CO2komori. Uzorci krajnjeg bloka su prikupljeni i analizirani su niovi seruma Aktivina A pomoću ELISA. Nemasno telo životinje je izmereno i upisano, i izmereni su trbušasti mišići lista i tumora i propisno sačuvani.

[0276]Svi rezultati su ispoljeni kao srednja + standardna grejka srednjeg (SEM) Ne-parni T test je izveden da se odredi statistička razlika između grupa korišćenjem softvera Graph Pad Prizm, Statistički značaj iz pomoćnog (farmaceutskog) sredstva je predstavljen putem p vrednosti manje od 0,05.

[0277]Podaci pokazuju da sa A-1 lečem miševi su imali značajno povišenu telesnu težinu nego miševi lečeni pomoćnim sredstvom (21,30 ± 0.54 g naspram 19.21 ± 0.38 g. P<0,05. 15 dan119,66 ± 0,22 g naspram 18,11 + 0.19 g, P<0,05. 18 dana) Bilo je značajno smanjenje telesne težine kod miševa lečenih koji nose tumor sa pomoćnim sredstvom u poređenju sa starosno kompatibilnim miševima koji ne nose tumor (25,48 + 0,35 g naspram 18,11 ± 0,19 g. p<0,005) Dakle, terapija aktivin A antitelo je pomogla da se održi telesna težina

[0278]Rast tumora je nadziran merenjem za digitalizovane šestare i veličinu tumora je izračunata jednačinom: equation of: Dimenzije (mm<3>= L (mm)<*>W (mm)<*>VV (mm)<*>0.5. Veličina tumora nije drugačija između

antiela A1 tretiranog i pomoćnog farmaceutskog sredstva tretiranog u dve grupe.

[0279]Posle C-26 ćelije tumora, miševi u pomoćnom sredstvu su tretirali grupa je imala dramatičan gubitak telesne težine u poređenju sa miševima koji nisu nosili tumor (25,48 ± 0 35 g naspram 18,11 ± 0,19 g, p<0,01). Međutim, A-1 Iečenje je ublažilo prosečan gubitak težine (19,66 ± 0,22 g naspram 18,11 + 0,19g, PO,05).

[0280]A-1 terapija je dala značajno očuvanje skeletne mišićne mase A-1 tretiranim miševi su imali veću težinu mase trbušastog mišića lista (0,099 ± 0,002 g naspram 0,093 + 0,001, p<0,05) nego ono što je C26 pomoćnim farmaceutkim sredstvom tretirana grupa

[0281]Na kraju eksperimenta, terminalna disekcija tkiva je izvedena Kontrolno C-26 miševi koji nose tumor ad significantlv lower lean carcass weight (6.75 ± 0,11 g) nego ono što je antitelom A1 tretirani miševi (7,20 ± 0.16 g, p<0,05 naspram C-26 + grupa sa pomoćnim farmaceutskim sredstvom).

[0282]Nemasna telesna masa je značajno izgubila C-26 pomoćno (farmaceutsko) sredstvo (-1,85 ± 0,24 g u poređenju njihovoj inicijalnoj nemasnoj masi tela). Terapija sa A-1 u C-26 miševima koji nose tumor značajno su ublažili gubitak nemasne telesne mase (-0.60 + 0,26 g, p<0.05 naspram grupe C26 pomoćno farmaceutsko sredstvo)

[0283]Terapija monoklonalnim antitelom A1 protiv aktivina A je delotvorna za ublaženje kancernom kahezijom izazvana ceo gubitak telesne težine Zaštitno dejstvo antiela A1 se povezuje sa očuvanom masom mišića skeleta, nemasna masa tela životinje i ukupna nemasna masa tela životinje na dobro utvrđenom modelu životinje sa mišjom kancernom kahezijom

[0284]Ova studija obezbeđuje preklinički dokaz da je neutralizacija aktivina A korišćenjem monoklonalnog antitela A1 značajno ublažila gubitak telesne težine i sačuvala mišić skeleta i nemasnu telesnu masu.

PRIMER 13

AKTIVIN A ELISA

[0285]Antitela na aktivinu A moguće je koristiti za ogled i kvantitativnu procenu aktivina A u uzorcima, kao što su biološki uzorci. Rekombinantni ljudski aktivin A (100 ng/ml, kat #10-85106) i ogledno razblažujuće pufersko sredstvo (0 mg/ml. kat #10-85101) su kupljeni od DSLabs (VVebster, Texas) i skiadišteni na 4"C Standardi su pripremljeni sveži pre ovog eksperimenta razblaživanjem u puferskom sredstvu ogleda.

[0286]Ljudski serumi su dobijei od kompanije Bioreclamation Ine (Hicksville, NY) Serumi za merenje aktivina A su alikvotirani u 110 pl da se svede na minimum varijacija usled zamrzaanja-otapanja. Uzorci su razblaženi 1/3 sa puferskim sredstvom iz ogleda i izmereni u ELISA.

[0287]Aktivin A ELISA (ELISA iz jednog koraka) se izvodi korišćenjem sledećih koraka

Corning Costar 3590 ploće sa 96 pregrada su obložene sa 100 ul od 4 pg/mL monoklonalno antitelo (Mab) (A2) protiv aktivina A tokom noći na sobnoj temperaturi uz nežno mešanje na 500-600 ob /min. Pregrade (400 pl/pregradi) su oprane tri puta sa PBS

koji sadrži 0,02% (v/v) Tween 20. Pregrade su blokirane u 300 ul I puferskog sredstva za blokiranje tokom dva sata na sobnoj temperaturi, zatim je blokirajuče pufersko sredstvo uklonjeno

[0288]100 ul standardnog aktivina A / ili 100 ul razblaženih uzoraka je dodato. i 25 ul od 0,5 ug/mL mAb-HRP protiv aktivina A oznaćeno (A1/HRP) je dodato u pufersko sredstvo ogleda Za merenja slobodnog aktivina A. serumi su razblaženi u 1/3 sa puferskims redstvom iz ogleda. Za sva merenja aktivina A, serumi su bili (1) acidifikovani (pH 4-5) sa 20%> HCL (2 pl po 110 u I seruma), inkubiranog tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi, (3) neutralizovanog dodavanjem 2 pi 5 N NaOH (2 pl po 110 ul seruma), i (4) razblaženog u 1/3 sa puferskim sredstvom iz ogleda.

[0289]Inkubacija je izvedena tokom 2 sata na sobnoj temperaturi dok je mućkana na 600-700 ob./min Pregrade (400 pl/pregradi) su oprane tri puta sa PBS koji je sadržao 0,02% (v/v) Tween-20. 100 pl od TMB (R&D Svstem, Minneapolis. MN) je dodato, posle čega je usledila inkubacija tokom dvadeset minuta na sobnoj temperaturi 50 pl rastvora za zaustavljanje (R&D Svstem, Minneapolis, MN) je dodato. OD merenje je izvedeno korišćenjen 450 nm u molekularnom uređaju kompanije Molecular Device model SpectraMax M5.

[0290]Standardna krivulja je genensana iscrtavanjem apsorcije na 450 nm naspram log koncentracije rh aktivina. korišćenjem log-log (ili logistike pet parametara) krivulja prikladnosti programa Molecular Device. Vrednosti za uzorke koncentracija su dobijene interpolacijom njihove apsorbance iz ovog standarda

[0291]Registrujuće antitelo je bilo A-3 mAb protiv aktivina A, 20.78 mg/ml. Antitelo detekcije je bilo A-1 mAb-HRP protiv aktivin A, 0,65 HRP/Ab. 12,05 mg/ml Blokirajuče pufersko sredstvo je bilo I-blokirajuće pufersko sredstvo. Pufersko sredstvo ispiranja je bilo PBS / 0.1% Tween-20 ASSAY BUFFER (Pufersko sredstvo za ogledno ispitivanje) (Reagent Diluent) je bilo 0 mg/ml aktivin A pufersko sredstvo

PRIMER 14;

ANALIZA ZAŠTITE PROTEAZE AKTIVINA A

[0292]Ogledi zaštite proteaze su sprovedeni kako bi se identifikovalo vezivanje epitopa antitela aktivina A. Razgradnja preparata rekombinantnog ljudskog aktivina A je analizirana putem tri metode. Prvi metod je ispitao pnparat aktivina A koja je razgrađen tokom prečišćavanja. Drugi metod je obuhvatio proteolizu preparata aktivina A sa lizinom C. himotipsmom, pepsinom i termolizinom Treći postupak je obuhatio hemijsku razgradnju preparata korišćenjem cijanogen bromida

[0293]Dakle, za proteolizu kompleksa ljudskog aktivina i antitela, 5 mikrograma aktivina A i 90 mikrograma antitela je umešano u 100 mikrolitara 0,1 M amonijak bikarbonata (pH 7,8) i držan na sobnoj temperaturi tokom približno 20 minuta pre tretiranja sa 2% telesne težine određene izabrane proteaze. Razlagan proteina je ostavljeno da se odvija na 3? stepeni celzijusove skale tokom 90 minuta Kontrolni uzorci koji sadrže aktivin A sam ili samo antitelo su izvođeni na identičan način. Uzorci su acidifikovani pre RP-HPLC analize

[0294]Za cijanogen bromidno razlaganje aktivina A, CNBr fragmenti aktivina A su generisani inkubiranjem 10 mikrograma proteina sa CNBr u 100 microlitara 90% TFA tokom noći na sobnoj temperaturi Uzorak je čuvan na tamnom mestu tokom inkubacije i osušen je u vakuumu pre RP-HPLC analize

[0295]RP-HPLC je korišćen da se analiziraju fragmenti generisani kako je gore opisano. Ukratko, stub je uravnotežen sa rastvaračem, uzorak je ubrizgan i stub je opran sa rastvaračem pre nego što je linearni gradijent nanet. Otpadne vode stuba su nadgledane brzinom apsorbovanja od 215 nm. Eluirani uzorci su ručno prikupljeni i analizirani Edman razgradnojom i spektrometnjom.

[0296]Preparat koji razgrađen tokom prečišćavanja je sadržao sledeće vrste; 1. Gly1-His59 (6,456,2 Da) 2. Ser60-Tyr94 (4,102.9 Da) 3. Asp<9>5-Ser116 (2,452.8 Da) 4 Gly1-Tyr94 (10,541.1 Da)

[0297]Ovaj preparat koji je razložen aktivnošću koja je slična aktivnosti himotnpsina je imao sledeće vrste razdeljene na lokacijama naznačenim u ID BR. SEK: 225:

1 iGLECDGKVNICCKKQFFVSFKDIGWNDvVII<30>

2 31 APSGYHANYCEGECPSHIAGTSGSSLSFH-Sgo

3gjTVINHYRMRGHSPFANLKSCCVPTKLRPMSgo

4.9iMLYY DDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS116

[0298]Vrste prikazane na Slici 9 označavaju lokacije mesta deljenja kada je preparat aktivina A razložen aktivnošću himotripsina, Lizina C (LysC) ili cijanogenog bromida (CNBr)

PRIMER 15

OGLED VEZIVANJA AKTIVINA A

[0299]Monoklonalna antitela A1, A2, i A3 se vezuju na aktivin A ali ne na aktivin B. prema afinitetima vezivanja popisanim u Tabeli 6. Dakle, analiza afiniteta antitela aktivina A, i to A1 A2, i A3 je izvedena da bi se odredio region ili struktura potrebna za neutralisanje vezivanja antitela Nekoliko proteina za vezivanje aktivina A su poznati, uključujući ActRII (AB), ActRI (A/B)(Alt4), folistatin. i sa folistatinom

povezanim gen (FLRG).

[0300]Ogledi vezivanja su sprovedeni za analiziranje antitela da se proceni njihova sposobnost da se vežu na imobilizovane površine antitela (aktivin A i/ili aktivin B). Ogledi vezivanja su izdeni korišćenjem 2 nM rhAktivina A i 20 nM svakog antitela imobilizovanog na nekoj površini Sledeća antitela su imobilizovana na površini i testirana. AKA1 (komercijalno dostupno), AKA2 (komercijalno dostupno) A1, i A3. Rezultati ogleda sa antitelom su navedeni na Slici 10

PRIMER 16:

MAPIRANJE REGIONA OGLEDA ZA VEZIVANJE AKTIVINA A (BIACORE)

[0301]Ogledi blokiranja su sprovedeni na imobilizovanim rekombinantnim ljudskim aktivin RIB-Fc površinama himere, rekombinantne ljudske aktivin RIIB-Fc površine himere, i rekombinantne ljudske RIIA-Fc površine rekombinantne himere kako je opisano u Pnmeru 5. Monoklonalna antitela A1, A2. AKA1, i AKA2 na svakoj površini himere su inkubirane sa InM aktivinom A. i relativni odgovor vezivanja (%) su izmereni. Povećanje odgovora vezivanja u prisustvu antitela označava da aktivin A može da se veže na imobiliozvane površine receptora i antitela u rastvoru istovremeno, što se pominje kao "nastavak". Rezultati su prikazani u Tabeli 7 i Slici 11. gde EC50 znači

delotvornu koncentraicju koja daje kao prinos 50% vezivanja

PRIMER 17:

HIMERE A/B AKTIVINA

[0302]Himere aktivina A/B su generisane da se bolje procene sposobnosti za vezivanje na epitop monoklonalnih antitela A1, A2, i A3, kako je opisano u Primerima 5 i 16. Kao što se vidi na Slici 12, testirane su dve himere Aktivin A 13/39 B (koji sadrži amino kiseline 1-116 aktivina A izuzev da su amino kiseline na pozicijama 13-39 aktivina A supstituisane sa odgovarajućim amino kiselinama na pozicijama 13-39 iz aktivina B ID R. SEK: 243), i aktivin A 82/107 B (sadrži amino kiseline 1-116 aktivina A izuzev amino kiselina na pozicijama 82-107 aktivina A su supstituisane sa odgovarajućim amino kiselinama na pozicijama 82-107 iz aktivina B ID BR SEK: 244).

[0303]Ukratko, korišćen je klon aktivina A pune dužine kao uzorak za pojačavanje pomoću PCR korišćenjem Pfu ultra polimeraze (Stratagene) i začetnica (ID BR SEK 245 i ID BR SEK: 246) na početku sekvence zrelog proteina što daje kao rezultat da je PCR proizvod prvo bio prečišćen (GJagen), rastvoren sa Sali i Xbal restrikcionim enzimima (Roche) i izolovani gelom (OJagen) Kasete sintetičkog gena koje su sadržale modifikovane sekvence zrelog proteina su projektovane korišćenjem sekvenci amino kiselien iz aktivina A i aktivina B pune dužine i povratnom translacijom u DNK sekvence optimizovane kodonom za ispoljavanje u ćeliji domaćina sisara korišćenjem programa Gene Designer (Version 1.0 4, DNA 2.0, Inc.) (BMC Bioinformattcs. 7 285 (2006)). Sekvence su rastvorene sa Xbal i Noti i gel su izolovani. Aktivin PCR proizvod je product vezan u standardnim uslovima reakcije korišćenjem T4 DNK ligaze (New England Biolabs, Inc.) sa bilo 13-39 fragmenta sintetičkog gena (ID BR. SEK: 247) ili 82-107 fragmenta sintetičkog gena (ID BR SEK: 213) i Sall/Notl rastvorenim vektorom ekspresije (pDRSalpha 24) da se proizvedu konstrukti ispoljavnaja pune dužine. Konstrukt sintetičkog gena aktivina A sa amino kiselianma 13-39 je zamenjen sekvencom aktivina B (ID BR SEK: 247) i konstruktom sintetičkog gena aktivina A sa amino kiselinama 82-107 je zamenjen sekvencom aktivina B (ID BR. SEK: 248) su zatim korišćeni u eksperimentima mapiranja epitopa (rezultati su pokazani na Slici 12).

[0304]Iz gore navednog, iako su ovde opisana specifična izvođenja ovog pronalaska namenjena u svrhe ilustracije, različite modifikacije moguće je koristiti bez narušavanja obima ovog pronalaska prema onome što je izneto u patentnom zahtevima

Claims

1. Izolovano antitelo, ili njegov fragment zaveizivanje antigena koje se specifično vezuje na cisteinski region čvora ljudskog aktivina A, u pomenutom regionu su obuhvaćene amino kiseline C11-S33 i amino kiseline C81-E111 sekvence iznete u ID BR SEK225, i inhibira vezivanje ljudskog aktivina A na receptor aktivina A kod čoveka.

2. Izolovano antitelo ili fragment za vezivanje antigena prema patentnom zahtevu 1, pri čemu pomenuto antitelo ili fragment za vezivanje antigena poseduje barem jednuin vivobiološku aktivnost izabranu iz ublažavanja kahezije, ublažavanje kahezije kod miševa koji nose tumor debelog creva, poboljšavanje gubitka telesne težine kod miševa koji nose tumor debelog creva, poboljšavanje gubitka telesne težine na modelu reumatoidnog artritisa kod životinja sa izazvanim kolagenom, pogoršavanje gubitka mišićne mase na modelu životinja sa reumatoidnim artritisom izazvanim kolagenom, poboljšanje gubitka mišićne mase na modelu životinja sa reumatoidnm artritisom izazvanom kolagenom, i ublažavanje gubitka telesne težine AAV-aktivinom A transfektovanom modelu životinja.

3. Izolovano antitelo ili fragment za vezivanje antigena prema patentnom zahtevu 1 ili 2, koji je potpuno ljudski.

4. Izolovano antitelo ili fragment za vezivanje antigena prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva za upotrebu u terapiji

5. Izolovani polinukleotid koji kodira izolovano antitelo ili fragmenz za vezivanje antigena prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3.

6. Vektor koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira polinukleotid prema patentnom zahtevu 5

7. Vektor prema patentnom zahtevu 6, koji se bira iz grupe koja obuhvata plazmid, virusni vektor, neepizomalni vektor sisara, vektor ekspresije i rekombinanntni vektor ekspresije

8. Ćeliju domaćina u koju se uvodi rekombinantni vektor ekspresije prema patentnom zahtevu 7

9. Ćeliju domaćina prema patentnom zahteuv 8, koja je prokanotska ili eukariotska ćelija, npr. ćelija sisara, opciono ćelija jajnika kineksog hrčka (CHO)

10. Farmaceutsku supstancu koja obuhvata izolovano antitelo ili fragment za vezivanje antigena prema jednom od patentnih zahteva 1 do 3 zajedno sa jednom ili više supstanci izabranih iz grupe koja se sastoji od puferskog sredstva, antioksidansa, polipeptida male molekularne težine, proteina, amino kiseline, karbohidrata, helirajućeg agensa, stabilizatora, i eksopijenta

11. Farmaceutsku supstancu koja obuhvata izolovano antitelo ili fragment za vezivanje antigena prema jednom od patentnih zahteva 1 do 3 za upotrebu u lečenju.